ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ. Μελέτη των περιοχών της απολιποπρωτεΐνης Ε που διαµεσολαβούν τη de novo βιοσύνθεση HDL σε πειραµατικά µοντέλα ποντικών

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Μ.Π.Σ. ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Μελέτη των περιοχών της απολιποπρωτεΐνης Ε που Βιολόγος Επιβλέπων καθηγητής Κυριάκος Η. Κυπραίος, Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρµακολογίας Πάτρα, 2011

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Μ.Π.Σ. ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ Η παρούσα µεταπτυχιακή εργασία παρουσιάστηκε επιτυχώς Από την Α.Μ την 20 η Ιουλίου 2011 Η τριµελής επιτροπή Κυπραίος Η. Κυριάκος (Επιβλέπων), Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρµακολογίας, Τµήµατος Ιατρικής, Σχολής Επιστηµών Υγείας, Πανεπιστηµίου Πατρών Παληογιάννη Φωτεινή (Μέλος), Καθηγήτρια Μικροβιολογίας, Τµήµατος Ιατρικής, Σχολής Επιστηµών Υγείας, Πανεπιστηµίου Πατρών Παπαχρήστου ιονύσιος (Μέλος), Επίκουρος Καθηγητής Ανατοµίας-Ιστολογίας- Εµβρυολογίας Τµήµατος Ιατρικής, Σχολής Επιστηµών Υγείας, Πανεπιστηµίου Πατρών Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 1

3 Στον παππού µου, Γιάννη + Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 2

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η µεταπτυχιακή αυτή εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρµακολογίας του Τµήµατος Ιατρικής του Πανεπιστηµίου Πατρών, κατά την περίοδο , στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράµµατος Σπουδών «Βασικές Ιατρικές Επιστήµες». Πρόκειται για µια µελέτη η οποία στοχεύει στην ανάδειξη της περιοχής εκείνης της απολιποπρωτεΐνης Ε που αλληλεπιδρά λειτουργικά µε τον µεταφορέα λιπιδίων ABCA1 για τον de novo σχηµατισµό HDL σωµατιδίων. Καταρχήν, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά, τον επιβλέποντα καθηγητή µου, κύριο Κυπραίο Κυριάκο, για την άψογη συνεργασία που είχαµε και την ευκαιρία που µου έδωσε να δουλέψω ερευνητικά στο εργαστήριό του µε ένα τόσο ενδιαφέρον και καινοτόµο θέµα. Τον ευχαριστώ επίσης, για την υποµονετική και γεµάτη κατανόηση καθοδήγησή του στα πρώτα µου βήµατα στον χώρο της έρευνας, καθώς και για τη συνεχή ενθάρρυνσή του και τις πολύτιµες συµβουλές και υποδείξεις του, που εµπλούτισαν τον τρόπο σκέψης µου και διαµόρφωσαν την επιστηµονική µου υπόσταση. + Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω την κυρία Παληογιάννη Φωτεινή, Καθηγήτρια Μικροβιολογίας και τον κύριο Παπαχρήστου ιονύσιο, Επίκουρο Καθηγητή Ανατοµίας Ιστολογίας Εµβρυολογίας τόσο για την τιµή που µου έκαναν να συµµετάσχουν ως µέλη στην τριµελή µου επιτροπή, όσο και για τις γόνιµες παρατηρήσεις τους. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους µεταπτυχιακούς φοιτητές και υποψήφιους διδάκτορες του εργαστηρίου Φαρµακολογίας καθώς και των εργαστηρίων Βιοχηµείας και Μικροβιολογίας για την πολύτιµη βοήθειά τους. Ευχαριστώ πολύ την οικογένειά µου για την υποµονή, τη βοήθεια και την αγάπη τους. Τέλος, ένα µεγάλο ευχαριστώ θα ήθελα να δώσω στο φίλο µου Λουκά, για τη συνεχή εµψύχωση και πίστη στις δυνατότητές µου. Του είµαι ευγνώµων γιατί είναι πάντα δίπλα µου και µε βοηθάει, πολλές φορές χωρίς καν να του το ζητήσω. Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 3

5 Μελέτη των περιοχών της απολιποπρωτεΐνης Ε που διαµεσολαβούν τη de novo βιοσύνθεση HDL σε ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η HDL είναι ένα µείγµα λιποπρωτεϊνικών σωµατιδίων υψηλής πυκνότητας, που ανάλογα µε τη σύσταση τους σε λιπίδια µπορούν να είναι δισκοειδή ή σφαιρικά. Η κύρια αθηροπροστατευτική δράση της HDL, οφείλεται στο γεγονός ότι η συγκεκριµένη λιποπρωτεΐνη συλλέγει την περίσσεια χοληστερόλης από τους περιφερικούς ιστούς και τη µεταφέρει στο ήπαρ όπου καταβολίζεται. Επιπλέον, έχει αντιφλεγµονώδη και αντιοξειδωτική δράση. Η κύρια πρωτεΐνη της HDL είναι η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoa-i). Ωστόσο, πρόσφατα αποδείχθηκε ότι σε πειραµατόζωα µε έλλειψη στην apoa-i και κατά συνέπεια στην κλασσική HDL, η απολιποπρωτεΐνη Ε (apoe) αλληλεπιδρά µε τον µεταφορέα λιπιδίων ABCA1 προάγοντας την de novo σύνθεση HDL + σωµατιδίων. Στην παρούσα µελέτη, στόχος ήταν η εύρεση της περιοχής της apoe που είναι υπεύθυνη για την λειτουργική αλληλεπίδραση µε τον ABCA1 για το σχηµατισµό HDL. Για το σκοπό αυτό, ανασυνδυασµένοι αδενοϊοί που εξέφραζαν καρβοξυ-τελικές συντετµηµένες µορφές της apoe4 (AdGFP-E4[1-259], AdGFP- E4[1-229], AdGFP-E4[1-202], AdGFP-E4[1-185]), χορηγήθηκαν σε ποντίκια µε έλλειψη στην ApoA-I σε δόση 8x10 8 pfu και πέντε µέρες µετά τη µόλυνση δείγµατα πλάσµατος αναλύθηκαν για το σχηµατισµό HDL. Κλασµατοποίηση των λιποπρωτεϊνών του πλάσµατος µε υπερφυγοκέντρηση σε διαβάθµιση πυκνότητας καθώς και FPLC χρωµατογραφία αποκάλυψε ότι όλες οι συντετµηµένες µορφές της apoe4 προάγουν το σχηµατισµό HDL. Ανάλυση ηλεκτρονικής µικροσκοπίας µε αρνητική χρώση των HDL κλασµάτων, επιβεβαίωσε ότι όλες οι συντετµηµένες µορφές της apoe4 είναι ικανές να προάγουν το σχηµατισµό σωµατιδίων µε διάµετρο στην περιοχή της HDL. Τα δεδοµένα αυτά οδηγούν στο συµπέρασµα ότι η αµινοτελική περιοχή της apoe που εκτείνεται από τα αµινοξέα 1 έως 185 αρκεί για το σχηµατισµό HDL σωµατιδίων in vivo. Αυτά τα ευρήµατα, ανοίγουν το δρόµο στην έρευνα για το σχεδιασµό βιολογικών φαρµάκων µε βάση την apoe για τη θεραπεία της δυσλιπιδαιµίας, της αθηροσκλήρωσης και της στεφανιαίας νόσου. Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 4

6 Study of the domains of apolipoprotein E that promote the de novo biosynthesis of HDL in experimental mouse models Peristera-Ioanna A. Petropoulou ABSTRACT HDL is a mixture of high density lipoprotein particles that depending on the lipid composition may be discoidal or spherical. The main atheroprotective property of HDL is reverse cholesterol transport, a process that unloads excess cholesterol from peripheral tissues and transports it to the liver for catabolism. HDL has also anti-inflammatory and antioxidant properties. The main protein of HDL is apolipoprotein A-I (apoa-i). However, recently it was shown that in the absence of apoa-i and consequently classical HDL, apolipoprotein E (apoe) interacts functionally with the lipid transporter ABCA1, promoting the de novo synthesis of HDL-like particles. The present study focused on the identification of the domain of apoe that is responsible for the functional interaction + with ABCA1 and the formation of apoecontaining HDL. Recombinant attenuated adenoviruses expressing carboxy-terminal truncated forms of apoe4 (apoe4[1-259], apoe4[1-229], apoe4[1-202], and apoe4[1-185]) were administered to apoa-i-deficient mice at a low dose of 8x10 8 pfu and five days postinfection plasma samples were isolated and analyzed for HDL formation. Fractionation of plasma lipoproteins of the infected mice by density gradient ultracentrifugation and FPLC revealed that all forms were capable of promoting HDL formation. Negative staining electron microscopy analysis of the HDL density fractions confirmed that all C-terminal truncated forms of apoe4 promoted the formation of particles with diameters in the HDL region. Taken together, these data establish that the aminoterminal 1 to 185 region of apoe suffices for the formation of HDL particles in vivo. These findings may have important ramifications in the design of apoe-based biological drugs for the treatment of dyslipidemia, atherosclerosis and coronary heart disease. Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 5

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 4 ABSTRACT... 5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... 6 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΕΙΚΟΝΩΝ... 9 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΥΝΤΜΗΣΕΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Χυλοµικρά VLDL λιποπρωτεΐνες IDL λιποπρωτεΐνες LDL λιποπρωτεΐνες HDL λιποπρωτεΐνες Λιποπρωτεΐνη Lp(a) ιατροφικά λιπίδια ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Το µονοπάτι καταβολισµού των χυλοµικρών Το µονοπάτι καταβολισµού των VLDL σε IDL και LDL Το µονοπάτι των HDL σωµατιδίων ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Η απολιποπρωτεΐνη Ε Υποδοχείς της apoe ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΗΣ ΑΘΗΡΩΜΑΤΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ HDL ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΗ ΑΘΗΡΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑ Η αντίστροφη µεταφορά της χοληστερόλης Η αντιοξειδωτική δράση της HDL Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 6

8 1.5.3 Η αντιφλεγµονώδης δράση της HDL Επιπλέον δράσεις της HDL Παρουσία οιστρογόνων στην HDL Ρυθµιστική δράση στην κατανοµή των απολιποπρωτεϊνών στις λιποπρωτεΐνες του πλάσµατος Ρόλος της HDL στην οµοιόσταση της γλυκόζης HDL: ποσότητα ή ποιότητα; ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Απόψυξη κυττάρων Τρυψινοποίηση και ανακαλλιέργεια κυττάρων Ψύξη κυττάρων ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΤΙΤΛΟ ΟΤΗΣΗ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΩΝ Α ΕΝΟΙΩΝ Καλλιέργεια τριπλών φλασκών Επιµόλυνση τριπλών φλασκών µε τους αδενοϊούς AdGFP-E4wt, AdGFP-E4[1-259], AdGFP-E4[1-229], AdGFP-E4[1-202], AdGFP-E4[1-185] και AdGFP Συλλογή των µολυσµένων µε τους ιούς κυττάρων Καθαρισµός των αδενοϊών Τιτλοδότηση αδενοϊών Τιτλοδότηση αδενοϊών µε καταµέτρηση πλακών Τιτλοδότηση αδενοϊών µε φασµατοφωτοµέτρηση IN VITRO ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΓΡΙΟΥ ΤΥΠΟΥ APOΕ4 ΚΑΙ ΤΩΝ ΣΥΝΤΕΤΜΗΜΕΝΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΤΗΣ ΣΕ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΗΤΒ Ανάλυση πρωτεϊνών µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου (SDS-PAGE Electrophoresis) Χρώση πρωτεϊνών ακινητοποιηµένων σε ακρυλαµίδιο µε coomassie stain Προσδιορισµός της απολιποπρωτεΐνης Ε4 και των συντετµηµένων µορφών της µε την τεχνική της ανοσοαποτύπωσης κατά Western (Western blotting) ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ Χειρισµοί σε πειραµατόζωα Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 7

9 2.5 ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΜΕ ΥΠΕΡΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΗ ΙΑΒΑΘΜΙΣΜΕΝΗΣ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑΣ ΙΑΠΙ ΥΣΗ (DIALYSIS) ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΜΕ FPLC ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΛΙΠΙ ΙΩΝ Προσδιορισµός επιπέδων ολικής χοληστερόλης Προσδιορισµός επιπέδων ελεύθερης χοληστερόλης Προσδιορισµός επιπέδων φωσφολιπιδίων Προσδιορισµός επιπέδων τριγλυκεριδίων ΑΝΟΣΟΠΡΟΣΡΟΦΗΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΕΡΕΑΣ ΦΑΣΗΣ ΜΕ ΣΥΝ ΕΣΗ ΕΝZΥΜΟΥ (ELISA) ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ HDL ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΕΚΚΡΙΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΛΙΠΟΡΩΤΕΪΝΗΣ Ε ΚΑΙ ΤΩΝ + ΣΥΝΤΕΤΜΗΜΕΝΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΤΗΣ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΗΤΒ-13 ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΟΛΥΝΣΗ ΠΟΝΤΙΚΙΩΝ ΜΕ ΕΛΛΕΙΨΗ ΣΤΗΝ ΑPOA-I ΜΕ ΤΟΥΣ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΟΥΣ Α ΕΝΟΙΟΥΣ ADGFP-E4WT, ADGFP-E4[1-259], ADGFP-E4[1-229], ADGFP-E4[1-202], ADGFP-E4[1-185] ΚΑΙ ADGFP ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕ FPLC ΤΩΝ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΤΩΝ ΜΟΛΥΣΜΕΝΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ HDL ΚΛΑΣΜΑΤΩΝ ΤΩΝ ΜΟΛΥΣΜΕΝΩΝ ΠΟΝΤΙΚΙΩΝ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Α Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 8

10 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 1.1. Σχηµατική αναπαράσταση της τυπικής δοµής των λιποπρωτεϊνών Εικόνα 1.2. Προτεινόµενα µοριακά µοντέλα για την apoa-i [11] Εικόνα 1.3. Ενεργητική µεταφορά της χοληστερόλης από τα µικκύλια στο εντερικό κύτταρο και ο µηχανισµός απέκκρισής της µε τη µορφή χυλοµικρών [19] Εικόνα 1.4. Μονοπάτι καταβολισµού των χυλοµικρών Εικόνα 1.5. Μονοπάτι καταβολισµού των VLDL σε IDL και LDL Εικόνα 1.6. Χωροπληρωτική απεικόνιση του µοντέλου των δισκοειδών µορφών της HDL [10] Εικόνα 1.7. Μονοπάτι βιοσύνθεσης της HDL µε τη συµµετοχή των ABCA1 και LCAT [27] Εικόνα 1.8. Η δοµή της απολιποπρωτεΐνης Ε µε τις κύριες λειτουργικές περιοχές της Εικόνα 1.9. Γεγονότα που οδηγούν στην αθηρογένεση Εικόνα Χρονολογική εξέλιξη της αθηρωµάτωσης Εικόνα Το µονοπάτι της αντίστροφης µεταφοράς χοληστερόλης [31] Εικόνα Σχηµατική αναπαράσταση των καθοριστικών στοιχείων που προσδιορίζουν την ισορροπία µεταξύ των αθηροπροστατευτικών και µη αθηροπροστατευτικών ιδιοτήτων της HDL [7] Εικόνα 2.1. Τρόπος χειρισµού της τριπλής φλάσκας Εικόνα 2.2. Σχηµατική αναπαράσταση ανάπτυξης και αποµόνωσης αδενοϊών Εικόνα 2.3. Σχηµατική απεικόνιση της αποµόνωσης αδενοϊών Εικόνα 2.5. Σχηµατική αναπαράσταση της τιτλοδότησης µε καταµέτρηση πλακών Εικόνα 2.6. Σχηµατική αναπαράσταση της in vitro έκφρασης των αδενοϊών σε ΗΤΒ-13 κύτταρα Εικόνα 2.7. Γραφική απεικόνιση της πορείας της SDS-PAGE Εικόνα 2.9. Σωληνάρια για την τριχοειδική λήψη αίµατος από την ουρά των ποντικιών Εικόνα Ενδοφλέβια χορήγηση διαλύµατος αδενοϊού σε ακινητοποιηµένο ποντίκι µέσω του Εικόνα Σχηµατική αναπαράσταση της διαδικασίας κλασµατοποίησης των λιποπρωτεϊνών Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 9

11 Εικόνα Μικροπλάκα µέτρησης ολικής χοληστερόλης Εικόνα Μικροπλάκα µέτρησης ελεύθερης χοληστερόλης Εικόνα Μικροπλάκα µέτρησης των φωσφολιπιδίων Εικόνα Μικροπλάκα µέτρησης τριγλυκεριδίων Εικόνα Αρχή της µεθόδου σάντουιτς ELISA Εικόνα 3.1. In vitro έκφραση της αγρίου τύπου apoe4 και των συντετµηµένων µορφών της σε κύτταρα HTB-13 ύστερα από χρώση Coomassie Εικόνα 3.2. In vitro έκφραση της αγρίου τύπου apoe4 και των συντετµηµένων µορφών της σε κύτταρα HTB-13 µε Western blotting Εικόνα 3.3. In vivo έκφραση και κατανοµή της apoe στα λιποπρωτεϊνικά κλάσµατα των πειραµατικών οµάδων µε Western blotting Εικόνα 3.4. Συγκέντρωση και κατανοµή της apoe στα λιποπρωτεϊνικά κλάσµατα των διαφόρων οµάδων (για µεγαλύτερη ευκρίνεια δείτε Παράρτηµα Α) Εικόνα 3.5. Επίπεδα ολικής και εστεροποιηµένης χοληστερόλης καθώς και φωσφολιπιδίων στα λιποπρωτεϊνικά κλάσµατα των πειραµατικών οµάδων (για µεγαλύτερη ευκρίνεια δείτε Παράρτηµα Α) Εικόνα 3.6. Προφίλ χοληστερόλης των πειραµατικών οµάδων ύστερα από κλασµατοποίηση µε FPLC (για µεγαλύτερη ευκρίνεια δείτε Παράρτηµα Α) Εικόνα 3.7. Αρνητική χρώση των HDL κλασµάτων των πειραµατικών οµάδων και παρατήρηση των λιποπρωτεϊνικών σωµατιδίων µε ηλεκτρονική µικροσκοπία Εικόνα 4.1. Οι ιδιότητες της αµινοτελικής και καρβοξυτελικής περιοχής της apoe Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 10

12 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1.1. Ποιοτική και ποσοτική σύσταση των HDL σωµατιδίων Πίνακας 2.1. Φλάσκες που χρησιµοποιούνται στις κυτταροκαλλιέργειες Πίνακας 2.2. Παρασκευή του ρυθµιστικού διαλύµατος PBS 10X Πίνακας 2.3. Παρασκευή του θρεπτικού υλικού Leibovitz 10% FBS Πίνακας 2.4. Παρασκευή του διαλύµατος τρυψίνης 1Χ Πίνακας 2.5. Παρασκευή του θρεπτικού υλικού Leibovitz 20% FBS Πίνακας 2.6. Παρασκευή του θρεπτικού υλικού Leibovitz 20% FBS-20% DMSO Πίνακας 2.7. Παρασκευή του θρεπτικού υλικού Leibovitz 2% HIHS Πίνακας 2.8. Παρασκευή του ρυθµιστικού διαλύµατος TE 1X Πίνακας 2.9. Παρασκευή του διαλύµατος TD 10X Πίνακας Παρασκευή του ρυθµιστικού διαλύµατος Ca2+/Mg2+ 200Χ Πίνακας Παρασκευή του ρυθµιστικού διαλύµατος TD 1Χ µε Ca 2+ /Mg Πίνακας Παρασκευή του ρυθµιστικού διαλύµατος αλάτων 10Χ Πίνακας Παρασκευή του ρυθµιστικού διαλύµατος σουκρόζης 1Χ Πίνακας Παρασκευή του θρεπτικού επικάλυψης για την τιτλοδότηση των αδενοϊών Πίνακας Παρασκευή του πηκτώµατος επιστοίβαξης της SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης Πίνακας Παρασκευή του πηκτώµατος διαχωρισµού της SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης Πίνακας Παρασκευή του διαλύµατος ηλεκτροφόρησης 10Χ Πίνακας Παρασκευή του διαλύµατος ηλεκτροφόρησης PAGE-fix/destain Πίνακας Παρασκευή του διαλύµατος χρώσης Coomassie Πίνακας Παρασκευή του ρυθµιστικού διαλύµατος µεταφοράς 10X Πίνακας Παρασκευή του blocking buffer 5% Πίνακας Παρασκευή του πρωτοταγούς αντισώµατος για Western blotting Πίνακας Παρασκευή του δευτεροταγούς αντισώµατος για Western blotting Πίνακας Παρασκευή του διαλύµατος πλύσεων για Western blotting Πίνακας Παρασκευή του διαλύµατος ECL Πίνακας Παρασκευή του διαλύµατος διαπίδυσης ηλεκτρονικής µικροσκοπίας Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 11

13 Πίνακας Παρασκευή του διαλύµατος πρωτοταγούς αντισώµατος για ELISA Πίνακας Παρασκευή του διαλύµατος πλύσεων για ELISA Πίνακας Παρασκευή του blocking buffer για ELISA Πίνακας Παρασκευή του διαλύµατος δευτεροταγούς αντισώµατος για ELISA Πίνακας Παρασκευή του διαλύµατος εµφάνισης TMB για ELISA Πίνακας Παρασκευή των πρότυπων διαλυµάτων γνωστής συγκέντρωσης apoe Πίνακας 3.1. Λιπιδικό προφίλ των πειραµατικών οµάδων Πίνακας 3.2. Συγκέντρωση της apoe στα λιποπρωτεϊνικά κλάσµατα των πειραµατικών οµάδων Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 12

14 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΥΝΤΜΗΣΕΩΝ ABCA1 ABCA1 -/- Ad AMPK Apo ΑpoA-I ΑpoA-I -/- ApoE ApoE -/- apoe-hdl ApoE4[1-259] ApoE4[1-229] ApoE4[1-202] ApoE4[1-185] APS Arg ATP BSA CE CETP CM CRP Cys ATP-binding cassette transporter A1 Ανεπάρκεια στον ABCA1 Αδενοϊός (Adenovirus) AMP Activated Protein Kinase Απολιποπρωτεΐνη (Apolipoprotein) Απολιποπρωτεΐνη A-I Ανεπάρκεια στην απολιποπρωτεΐνη A-I Απολιποπρωτεΐνη Ε Ανεπάρκεια στην απολιποπρωτεΐνη Ε Σωµατίδια HDL που σχηµατίζονται από λιπιδίωση της apoe µέσω του ABCA1 Συντετµηµένη µορφή της απολιποπρωτεΐνης Ε4 που εκτείνεται από τα αµινοξέα 1 έως 259 Συντετµηµένη µορφή της απολιποπρωτεΐνης Ε4 που εκτείνεται από + τα αµινοξέα 1έως 229 Συντετµηµένη µορφή της απολιποπρωτεΐνης Ε4 που εκτείνεται από τα αµινοξέα 1έως 202 Συντετµηµένη µορφή της απολιποπρωτεΐνης Ε4 που εκτείνεται από τα αµινοξέα 1έως 185 Υπερθειϊκό Αµµώνιο (Ammonium Persulfate) Αργινίνη (Arginine) Τριφωσφορική Αδενοσίνη (Adenosine Triphosphate) Αλβουµίνη Ορού Βοδιού (Bovine Serum Albumin) Εστέρες χοληστερόλης (Cholesteryl Esters) Πρωτεΐνη Μεταφοράς Εστέρων Χοληστερόλης (Cholesteryl Ester Transfer Protein) Χυλοµικρά (Chylomicrons) C Αντιδρώσα πρωτεΐνη (C Reactive Protein) Κυστεΐνη (Cystein) Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 13

15 ddh 2 O EDTA EL ELISA EM enos FBS FPLC GFP GK HDL HIHS HL ICAM-1 IDL IRE KBr KCl kda LCAT LDL LDLr ισαπεσταγµένο Νερό (double distilled water) Αιθυλενο-διαµινο-τετρα-οξικό οξύ (Ethylene-diamino-tetra-acetic acid) Ενδοθηλιακή Λιπάση (Endothelial Lipase) Ανοσοπροσροφητική Ανάλυση Στερεάς Φάσης Με Σύνδεση Ενζύµου (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay ) Ηλεκτρονική Μικροσκοπία (Electron Microscopy) Ενδοθηλιακή Συνθετάση του Οξειδίου του Αζώτου (Endothelial Nitric Oxide Synthetase Βόειος Εµβρυικός Ορός (Fetal Bovine Serum) Υγρή Χρωµατογραφία Ταχείας Πίεσης (Fast Pressure Liquid Chromatography) Πράσινη Φθορίζουσα Πρωτεΐνη (Green Fluorescent Protein) Κινάση της Γλυκερόλης (Glycerol Kinase) Λιποπρωτεΐνη Υψηλής Πυκνότητας (High Density Lipoprotein) Θερµικά Απενεργοποιηµένος Ορός Αλόγου (Heat Inactivated Horse + Serum) Ηπατική Λιπάση (Hepatic Lipase) Ενδοκυττάριο Μόριο Προσκόλλησης (Intercellular Adhesion Molecule-1) Λιποπρωτεΐνη Ενδιάµεσης Πυκνότητας (Intermediate Density Lipoprotein) Στοιχείο Aπόκρισης στην Iνσουλίνη (Insulin-Response element) Βρωµιούχο Κάλιο (Potassium bromide) Χλωριούχο Κάλιο (Potassium Chloride) kilodalton, µονάδα µέτρησης µεγέθους πρωτεϊνών Λεκιθινο-Χοληστερολο-Ακυλοτρανσφεράση (Lecithin-Cholesterol Acyltransferase) Λιποπρωτεΐνη Χαµηλής Πυκνότητας (Low Density Lipoprotein) Υποδοχέας της Xαµηλής Πυκνότητας Λιποπρωτεΐνης (LDL Receptor) Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 14

16 LPL Λιποπρωτεϊνική Λιπάση (Lipoprotein Lipase) MCP-1 Χηµειοτακτική Πρωτεΐνη των Μονοκυττάρων (Monocyte Chemotactic Protein 1) MTP Πρωτεΐνη Μικροσωµιακής Μεταφοράς (Microsomal Transfer Protein) NaCl Χλωριούχο Νάτριο (Sodium Chloride) NaN 3 Αζίδιο του Νατρίου (Sodium Azide) NF-kβ Nuclear Factor of kappa light chain gene enhancer in B cells NO Νιτρικό Οξείδιο (Nitric oxide) PBS Φωσφορικό Ρυθµιστικό ιάλυµα Άλατος (Phosphate Buffer Saline) PKCα Πρωτεϊνική Κινάση α PL Φωσφολιπίδια (Phospholipids) PON Παραοξονάση (Paraoxonase) PPARs Peroxisome-Proliferator-Activated receptors SDS ωδέκυλοθειϊκό Νάτριο (Sodium Dodecyl Sulfate) SR-BI rpm TEMED ΤΜΒ Υποδοχέας Εκκαθαριστής Τάξης Β, Τύπου 1 (Scavenger Receptor, + Class B, Type 1) στροφές ανά λεπτό (rounds per minute) Τετρα-µεθυλο-αιθυλενο-διαµίνη (N,N,N,N Τetra-methyl-ethylene-diamine) Τετρα-µεθυλο-βενζιδίνη (3,3,5,5 -Tetra-methyl-benzidine) TNFa Παράγοντας Νέκρωσης Όγκων-α (Tumor Necrosis Factor a) TRLs Λιποπρωτεΐνες Πλούσιες σε Τριγλυκερίδια (Triglyceride-rich lipoproteins) VCAM-1 Μόριο Προσκόλλησης στο Ενδοθήλιο (Vascular Adhesion Molecule- 1) VLDL Λιποπρωτεΐνη Πολύ Χαµηλής Πυκνότητας (Very Low Density Lipoprotein) VLDLr Υποδοχέας Λιποπρωτεϊνών Πολύ Χαµηλής Πυκνότητας (Very Low Density Lipoprotein receptor) wt αγρίου τύπου (wild type) Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 15

17 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Η µεταφορά των λιπιδίων στην κυκλοφορία καθώς και η ανταλλαγή τους µεταξύ των ιστών επιτυγχάνεται µε την οργάνωσή τους σε µακροµοριακά συσσωµατώµατα λιπιδίων και πρωτεϊνών µε πολική επιφάνεια και υδρόφοβο πυρήνα. Τα πρωτεϊνικά συστατικά των λιποπρωτεϊνών ονοµάζονται απολιποπρωτεΐνες. Οι λιποπρωτεΐνες δοµικά αποτελούν σφαιρικά σωµατίδια, που ο πυρήνας τους περιέχει υδρόφοβα λιπίδια, ενώ οι πρωτεΐνες διατάσσονται στην επιφάνειά τους [1], (Εικόνα 1.1). Τα πρωτεϊνικά στοιχεία αυτών των µακροµοριακών συσσωµατωµάτων έχουν δύο ρόλους: διαλυτοποιούν τα υδρόφοβα λίπη και περιέχουν σήµατα κυτταρικής στόχευσης. Οι λιποπρωτεΐνες είναι λοιπόν σταθερές κολλοειδείς µορφές χάρη στις οποίες µεταφέρονται στo αίµα τα αδιάλυτα υδρόφοβα λιπίδια. Οι διαφορές στη σύσταση των λιποπρωτεϊνών σε πρωτεΐνες και λιπίδια τις κάνει να διαφέρουν σε µέγεθος και πυκνότητα. Πιο συγκεκριµένα, η περιεκτικότητα σε λιπίδια είναι ανάλογη µε το µέγεθος και αντιστρόφως ανάλογη µε την πυκνότητα που χαρακτηρίζει τα σωµατίδια των λιποπρωτεϊνών. Επίσης λόγω της υψηλής περιεκτικότητάς τους σε λιπίδια έχουν µικρότερη πυκνότητα από τις άλλες πρωτεΐνες. Το γεγονός αυτό επιτρέπει τόσο το διαχωρισµό τους από τα υπόλοιπα µόρια όσο και µεταξύ τους µε µεθόδους υπερφυγοκέντρησης και ηλεκτροφόρησης [1]. Εικόνα 1.1. Σχηµατική αναπαράσταση της τυπικής δοµής των λιποπρωτεϊνών. Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 16

18 Με τις παραπάνω µεθόδους και σύµφωνα µε την αυξανόµενη πυκνότητα ταξινοµούνται ως εξής: χυλοµικρά, λιποπρωτεΐνες πολύ χαµηλής πυκνότητας (VLDL), λιποπρωτεΐνες ενδιάµεσης πυκνότητας (IDL), λιποπρωτεΐνες χαµηλής πυκνότητας (LDL) και λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας (HDL) Χυλοµικρά Τα χυλοµικρά είναι µεγαλοµοριακά συµπλέγµατα που αποτελούνται κατά 98% από λιπίδια. Περιέχουν κυρίως τριακυλογλυκερόλες (τριγλυκερίδια) και µικρές ποσότητες χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων. Η πυκνότητα τους είναι µικρότερη από 0.94g/mL διότι οι τριακυλογλυκερόλες απαρτίζουν το ~99% του περιεχοµένου τους. Η απολιποπρωτεΐνη Β-48, µια µεγάλη πρωτεΐνη (240 kda), σχηµατίζει ένα αµφίφιλο σφαιρικό κέλυφος, η εξωτερική επιφάνεια του οποίου είναι υδρόφιλη, γύρω από το λιποσφαίριο. Τα χυλοµικρά διαµεσολαβούν στη µεταφορά των διατροφικών λιπιδίων από το έντερο προς τους περιφερικούς ιστούς. Στην κυκλοφορία µεταβολίζονται µερικώς από τη λιποπρωτεϊνική λιπάση, που βρίσκεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων των τριχοειδών και + ακολούθως καταβολίζονται από ηπατικές λιπάσες σε υπολείµµατα χυλοµικρών, που προσλαµβάνονται από το ήπαρ. Εάν ο µηχανισµός ηπατικής κάθαρσης είναι ανεπαρκής τότε τα κατάλοιπα αθροίζονται στο αίµα και εκδηλώνεται µια µορφή λιπιδικής διαταραχής, γνωστή ως Υπερλιποπρωτεϊναιµία Τύπου ΙΙΙ [1] VLDL λιποπρωτεΐνες Οι λιποπρωτεΐνες πολύ χαµηλής πυκνότητας είναι µεγάλα σωµάτια µε διάµετρο nm και η πυκνότητα κυµαίνεται στα επίπεδα g/ml. Η λιπιδική τους σύσταση τους είναι: 45-65% τριγλυκερίδια, 15-20% φωσφολιπίδια και 20-30% χοληστερόλη (ελεύθερη και εστεροποιηµένη) [2]. Τα σωµάτια αυτά συντίθενται και εκκρίνονται από το ήπαρ κυρίως κατά την περίοδο νηστείας και η σύνθεσή τους εξαρτάται από τις ανάγκες των περιφερικών ιστών, στους οποίους και ανακατανέµονται [2]. Τα σωµάτια αυτά σταθεροποιούνται από δύο απολιποπρωτεΐνες: την απολιποπρωτεΐνη Β-100 και την απολιποπρωτεΐνη Ε. Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 17

19 1.1.3 IDL λιποπρωτεΐνες Οι λιποπρωτεΐνες ενδιάµεσης πυκνότητας προκύπτουν από τον καταβολισµό των VLDL. Η πυκνότητά τους κυµαίνεται στα επίπεδα g/ml. Η αύξηση της πυκνότητας οφείλεται στην υδρόλυση των τριγλυκεριδίων που υπάρχουν σε αφθονία στα VLDL. Τα σωµάτια αυτά που είναι πλούσια σε εστέρες χοληστερόλης, έχουν δύο προορισµούς: Τα µισά από αυτά µεταφέρουν τα λιπίδια στο ήπαρ και σε άλλους περιφερικούς ιστούς για περαιτέρω επεξεργασία και τα άλλα µισά µετατρέπονται µε την αφαίρεση περισσότερων τριακυλογλυκερολών σε λιποπρωτεΐνες χαµηλής πυκνότητας LDL [2] LDL λιποπρωτεΐνες Οι λιποπρωτεΐνες χαµηλής πυκνότητας προκύπτουν από τον περαιτέρω καταβολισµό των IDL και αποτελούν τον κύριο φορέα χοληστερόλης στο αίµα. Αυτό το σωµάτιο λιποπρωτεΐνης έχει διάµετρο 22 nm και πυκνότητα που κυµαίνεται στα επίπεδα g/ml. Περιέχει έναν πυρήνα περίπου 1500 εστεροποιηµένων µορίων χοληστερόλης. Αυτός ο εξαιρετικά υδρόφοβος πυρήνας περιβάλλεται από ένα κέλυφος από φωσφολιπίδια και µη + εστεροποιηµένη χοληστερόλη. Το κέλυφος περιέχει επίσης ένα µοναδικό αντίγραφο της απολιποπρωτεΐνης Β-100, το οποίο αναγνωρίζεται από τα κύτταρα-στόχους. Κύριος ρόλος των LDL είναι να µεταφέρουν χοληστερόλη από το ήπαρ στα κύτταρα των περιφερικών ιστών για την εξυπηρέτηση των βιοσυνθετικών αναγκών τους και να ρυθµίζουν τη de novo σύνθεση της χοληστερόλης αλλά και στεροειδών ορµονών σε αυτούς τους ιστούς HDL λιποπρωτεΐνες Η HDL είναι ένα µείγµα λιποπρωτεϊνών, των οποίων οι πυκνότητες ποικίλουν από 1,063 ως 1,21 g/ml [3]. Η λιπιδική σύστασή της είναι αυτή που καθορίζει το σχήµα της, το οποίο θα είναι σφαιρικό ή δισκοειδές και το οποίο ενδεχοµένως επηρεάζει τη λειτουργικότητα του µορίου [4]. Η ώριµη σφαιρική HDL περιέχει 45-55% απολιποπρωτεΐνες, 26-32% φωσφολιπίδια, 15-20% εστεροποιηµένη χοληστερόλη, 3-5% ελεύθερη χοληστερόλη, και περίπου 5% τριγλυκερίδια. Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 18

20 Ποσοτικές και ποιοτικές διαφορές των λιπιδίων, των πρωτεϊνών και των ενζύµων των HDL έχουν ως αποτέλεσµα την ύπαρξη διαφόρων κλασµάτων που διαφέρουν στο σχήµα, την πυκνότητα, στο µέγεθος και το φορτίο. Με υπερφυγοκέντρηση διακρίνονται δύο κλάσµατα HDL: οι HDL 2 µε πυκνότητα 1,063 1,125 g/ml και οι HDL 3 µε πυκνότητα 1,125 1,210 g/ml [5], (Πίνακας 1.1). Ονοµασία HDL 3 (αριθµός µορίων ανά σωµατίδιο) HDL 2 (αριθµός µορίων ανά σωµατίδιο) Φωσφολιπίδια Χοληστερόλη (ελεύθερη) Χοληστερόλη (εστέρες) Τριγλυκερίδια 9 18 ApoA-I 3 4 ApoA-IΙ Πίνακας 1.1. Ποιοτική και ποσοτική σύσταση των HDL σωµατιδίων. Στη συνέχεια τα σωµατίδια της HDL διαχωρίζονται µε βάση το µέγεθός τους, µε ηλεκτροφόρηση διαβάθµισης σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου, υπό µη αποδιατακτικές συνθήκες [6]. Η HDL 2 υποδιαιρείται σε δύο υποπληθυσµούς: HDL 2a (1,1 1,125 g/ml) και HDL 2b (1,063 1,1 g/ml). Με παρόµοιο τρόπο η HDL 3 υποδιαιρείται σε τρεις υποπληθυσµούς: HDL 3a (1,125 1,147 g/ml), HDL 3b (1,147 1,167 g/ml) και HDL 3c (1,167 1,21 g/ml). Όταν διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά σε πήκτωµα αγαρόζης, οι HDL 2 και οι HDL 3 µετακινούνται στη θέση της α-λιποπρωτεΐνης. Οι πρόδροµες µορφές της HDL στερούνται του κεντρικού πυρήνα και έχουν προ-β ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Τα προ-β HDL σωµατίδια είναι είτε δισκοειδή σύµπλοκα της apoa-i µε φωσφολιπίδια και ελεύθερη χοληστερόλη είτε µονοµοριακή απολιπιδιωµένη apoa-i. Ένα ποσοστό 5-15% της apoa-i στο ανθρώπινο πλάσµα σχετίζεται µε σωµατίδια που παρουσιάζουν προ-β ηλεκτροφορητική κινητικότητα [7]. Με ηλεκτροφόρηση σε τζελ πολυακρυλαµιδίου, οι προ-β µορφές µπορούν Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 19

21 να διαχωριστούν σε προ-β-1, προ-β-2 και προ-β-3. Υπάρχουν επίσης σωµατίδια της HDL µε µοναδική απολιποπρωτεΐνη την apoe ή την apoa-iv µε γ ή προ-β κινητικότητα. Τα ώριµα σφαιρικά σωµατίδια τα οποία και αποτελούν την πλειοψηφία των HDL στο πλάσµα, παρουσιάζουν α ηλεκτροφορητική κινητικότητα και διακρίνονται σε α-1, α-2, α-3 και α-4 [8]. Ένας µικρότερος υποπληθυσµός των α-hdl αποτελείται από µεγάλα σφαιρικά σωµατίδια που περιέχουν apoe και φωσφολιπίδια. Η κύρια απολιποπρωτεΐνη της HDL είναι η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoa-i), η οποία παίζει σηµαντικό ρόλο στη βιογένεση και στη λειτουργικότητα της HDL. Απουσία της apoa-i η κλασσική HDL δεν σχηµατίζεται [9]. Επίσης ελλείµµατα στο καρβοξυτελικό άκρο της αποτρέπουν τη λιπιδίωσή της γεγονός που παρεµποδίζει το πρώτο στάδιο βιογένεσης της HDL [10]. Η ώριµη πολυπεπτιδική αλυσίδα της apoa-i αποτελείται από 243 αµινοξέα. Περιλαµβάνει επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες 22 και 11 αµινοξέων, οι οποίες είναι οργανωµένες σε αµφιπαθείς α-έλικες. Το υδρόφιλο τµήµα της έλικας αλληλεπιδρά µε την υδατική φάση, ενώ το υδροφοβικό, µη πολικό λιπιδικό τµήµα βρίσκεται προς το εσωτερικό του µορίου. Η χαλαρή διάταξη των α-ελίκων επιτρέπει τη γρήγορη αλληλεπίδραση των 㣰 ѡ εκτιθέµενων υδροφοβικών περιοχών της πρωτεΐνης µε το λιπίδιο. Έχουν προταθεί δύο κύρια µοντέλα που περιγράφουν τους τρόπους πρόσδεσης της apoa-i στα δισκοειδή και σφαιρικά σωµατίδια HDL. Όσον αφορά στο µοντέλο µορφής ζώνης (Εικόνα 1.2-Β), δύο µόρια apoα-ι προσδένονται γύρω από µια δισκοειδή διπλοστιβάδα 160 λιπιδίων, µέσω υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων [1]. Η apoa-i πραγµατοποιεί τρεις πλήρεις στροφές σε κάθε 11 επαναλήψεις, δίνοντας έτσι λειτουργική σηµασία στις επαναλαµβανόµενες αυτές αλληλουχίες. Όταν η χοληστερόλη εστεροποιείται, τα δισκοειδή σωµατίδια µετατρέπονται σε σφαιρικά και η δοµή της έλικας της apoa-i επαναρρυθµίζεται. Οι επικράτειες που εντοπίζονται στις έλικες της apoa-i φαίνεται ότι παίζουν καθοριστικό ρόλο στην πρόσδεση της µε τα λιπίδια, µε τα οποία συνδέονται µε µη οµοιοπολικούς δεσµούς (Εικόνα 1.2-Γ). Τα σωµατίδια αυτά έχουν περίπου 10 nm διάµετρο και αποτελούνται από έναν µη πολικό πυρήνα από τριγλυκερίδια και εστέρες χοληστερόλης περιβαλλόµενο από µονόστιβη επιφάνεια αµφιπαθών α-ελίκων και φωσφολιπιδίων [11]. Η πρόσδεση της apoa-i µε τα λιπίδια ενεργοποιεί το ένζυµο λεκιθινο-χοληστερολοακυλοτρανσφεράση (LCAT) ώστε η δισκοειδής HDL να µετατραπεί τελικά σε σφαιρική. Η Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 20

22 apoa-i τόσο στα δισκοειδή όσο και στα σφαιρικά σωµατίδια αλληλεπιδρά µε τον υποδοχέα εκκαθαριστή (SR-BI), ο οποίος είναι γνωστός και ως ο υποδοχέας της HDL. Μελέτες σε πειραµατόζωα έχουν δείξει ότι η αλληλεπίδραση της apoa-i µε τον SR-BI είναι σηµαντική για την αθηροπροστατευτική δράση της HDL [3]. Η apoa-ii είναι η δεύτερη σε αφθονία απολιποπρωτεΐνη της HDL [10], αλλά ο φυσιολογικός της ρόλος δεν έχει ακόµα εξακριβωθεί. Ωστόσο, µαζί µε την apoa-i είναι απαραίτητες για τη βιοσύνθεση της κλασσικής HDL. Εικόνα 1.2. Προτεινόµενα µοριακά µοντέλα για την apoa-i [11]. Η HDL περιέχει επίσης µια ποικιλία άλλων πρωτεϊνών, συµπεριλαµβανοµένων τις apoa-iv, apoc-i, apoc-ii, apoc-iii, apod, apoe, apoj, apol-i, apom, τρανσφερίνη, σερουλοπλασµίνη και ένζυµα [12]. Πρόσφατες µελέτες πρωτεοµικής [13], έχουν συσχετίσει την αποµονωµένη µε υπερφυγοκέντρηση HDL µε περισσότερες από 75 πρωτεΐνες. Η ύπαρξη αυτών των ξεχωριστών υποπληθυσµών των σωµατιδίων είναι σε συνάρτηση µε τους πολλαπλούς βιολογικούς ρόλους της HDL Λιποπρωτεΐνη Lp(a) Στην τελευταία κατηγορία ανήκουν οι λιποπρωτεΐνες a, Lp(a). Πρόκειται για σωµάτια τύπου LDL που συνδέονται µε την απολιποπρωτεΐνη a. Ο µηχανισµός καταβολισµού τους δεν είναι Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 21

23 πλήρως εξακριβωµένος, αλλά έχει αποδειχτεί ότι συµµετέχει ο νεφρικός ιστός [14,15]. Έχουν, επιπλέον, χαρακτηριστεί ως µόρια που προάγουν την αθηρωµάτωση, όταν τα επίπεδά τους υπερβαίνουν τα φυσιολογικά όρια [ ιατροφικά λιπίδια Τα περισσότερα λιπίδια προσλαµβάνονται µε τη µορφή τριακυλογλυκερολών (τριγλυκεριδίων) και χοληστερόλης µέσω της διατροφής. Τα τριγλυκερίδια απορροφώνται από το εντερικό επιθήλιο, αφού αποικοδοµηθούν σε λιπαρά οξέα και η πέψη τους ξεκινά από τον στόµαχο µε τις γαστρικές λιπάσες. Στον αυλό του λεπτού εντέρου ενσωµατώνονται σε µικκύλια µε τη βοήθεια των χολικών αλάτων, τα οποία είναι αµφιπαθή µόρια που συντίθενται στο ήπαρ και εκκρίνονται από τη χοληδόχο κύστη. Η διάταξη των τριγλυκεριδίων στην επιφάνεια των µικκυλίων διευκολύνει την πρόσβαση των παγκρεατικών λιπασών, ώστε αυτές να υδρολύσουν τους εστερικούς δεσµούς τους. Η πέψη τους σε ελεύθερα λιπαρά οξέα και σε 2-µονοακυλογλυκερόλη επιτυγχάνεται µε τη βοήθεια λιπασών και τα οποία στη συνέχεια µεταφέρονται στα εντερικά κύτταρα. Στα κύτταρα αυτά τα τριγλυκερίδια ανασυντίθενται και 贐 Ѡ συσκευάζονται σε λιποπρωτεϊνικά σωµατίδια µεταφοράς, τα χυλοµικρά. Η χοληστερόλη στους ανθρώπους προέρχεται από δύο πηγές, είτε προσλαµβάνεται µε τη διατροφή είτε συντίθεται ενδογενώς εκ νέου (de novo). Το µεγαλύτερο ποσοστό προέρχεται κυρίως από τη de novo σύνθεση της, αλλά γενικά διαφέρει από άνθρωπο σε άνθρωπο ανάλογα µε τους γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες [17]. Μόνο το 50% της προσλαµβανόµενης χοληστερόλης απορροφάται από το έντερο, ενώ το υπόλοιπο αποβάλλεται από τον οργανισµό µέσω κοπράνων. Οµοίως µε τα τριγλυκερίδια, η εξωγενής χοληστερόλη συνδέεται µε τα µικκύλια στον εντερικό αυλό. Απαραίτητη προϋπόθεση για τη µικκυλιοποίησή της είναι να βρίσκεται σε µη εστεροποιηµένη µορφή. Έπεται η πρόσληψή της από τα κύτταρα του εντέρου µε µηχανισµό ο οποίος δεν είναι ακόµη πλήρως εξακριβωµένος. Στην όλη διαδικασία φαίνεται πως συµµετέχει ένας ενεργητικός µεταφορέας, καθώς και η παθητική διάχυση και µεταφορά [18]. Πρόσφατες µελέτες έχουν δείξει ότι στην ενεργητική µεταφορά της χοληστερόλης διαµεσολαβούν ο µεταφορέας NPC1-L1 (Niemann- Pick C1 like 1) και οι πρωτεΐνες ABCG5 και ABCG8 (ATP-binding cassette ABCproteins). Στο εσωτερικό πλέον των κυττάρων του εντέρου η χοληστερόλη µετατρέπεται σε Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 22

24 εστέρες µε τη βοήθεια του ενζύµου ACAT2 (Acyl CoA cholesterol acyltransferase isoform- 2) και µε τη δοµή αυτή µπορεί να εισέλθει στα νεοσυντιθέµενα χυλοµικρά και να εκκριθεί στη λεµφική κυκλοφορία µε τα υπόλοιπα λιπίδια [19], (Εικόνα 1.3). Όταν υπάρχει ανάγκη για ενέργεια από τους περιφερικούς ιστούς τότε κινητοποιούνται οι αποθήκες λιπιδίων µέσα από µια διαδικασία τριών σταδίων. Αρχικά, οι τριακυλογλυκερόλες µετά από ενδοκυττάρια σηµατοδότηση αποικοδοµούνται και µεταφέρονται στους ιστούς που τις έχουν ανάγκη µε τη µορφή λιπαρών οξέων και γλυκερόλης. Στη συνέχεια, τα λιπαρά οξέα ενεργοποιούνται και µεταφέρονται στα µιτοχόνδρια για οξείδωση [20]. Τέλος, τα λιπαρά οξέα καταβολίζονται σε µόρια του ακετυλο-συνενζύµου Α, που εισέρχονται στον κύκλο του κιτρικού οξέος. Σε περίοδο νηστείας τα επίπεδα των ελεύθερων λιπαρών οξέων αυξάνουν λόγω των εκκρινόµενων ορµονών - επινεφρίνη και γλυκαγόνη - που προάγουν τη λιπόλυση. Αντίθετα, η ινσουλίνη δρα ανασταλτικά στο µονοπάτι της λιπόλυσης [21]. Εικόνα 1.3. Ενεργητική µεταφορά της χοληστερόλης από τα µικκύλια στο εντερικό κύτταρο και ο µηχανισµός απέκκρισής της µε τη µορφή χυλοµικρών [19]. Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 23

25 Τα παραπάνω λιποπρωτεϊνικά σωµατίδια αλληλεπιδρούν µεταξύ τους και η δράση τους συνοψίζεται σε τρία κυρίως µεταβολικά µονοπάτια. Η σύνθεση των χυλοµικρών ξεκινάει από το έντερο, ενώ η βιογένεση της LDL και της HDL λαµβάνει χώρα στο πλάσµα. ιάφορες πρωτεΐνες συµπεριλαµβανοµένου των απολιποπρωτεϊνών, των ενζύµων του πλάσµατος, των υποδοχέων των λιποπρωτεϊνών, των λιπιδικών πρωτεϊνικών µεταφορέων και των λιπιδικών µεταφορέων συµµετέχουν στα παραπάνω µεταβολικά µονοπάτια και συµβάλλουν στη λιπιδική οµοιόσταση. 襰 Ѡ Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 24

26 1.2 ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Το µονοπάτι καταβολισµού των χυλοµικρών Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, τα τριγλυκερίδια κατά την απορρόφησή τους από το εντερικό επιθήλιο υδρολύονται σε λιπαρά οξέα και γλυκερόλη. Στη συνέχεια, τα κύτταρα του εντέρου επανεστεροποιούν τα λιπαρά οξέα και τα µονογλυκερίδια προς σχηµατισµό τριγλυκεριδίων και φωσφολιπιδίων. Οµοίως, η απορροφηθείσα χοληστερόλη εστεροποιείται δηλαδή µετατρέπεται σε εστέρες χοληστερόλης. Συνήθως, ο πυρήνας των χυλοµικρών είναι πλούσιος σε τριγλυκερίδια, ενώ µετά από ένα γεύµα πλούσιο σε χοληστερόλη αυξάνουν τα επίπεδα εστεροποιηµένης χοληστερόλης σε αυτά. Στη συνέχεια, τα χυλοµικρά εκκρίνονται στο λεµφικό σύστηµα και εισάγονται στην κεντρική κυκλοφορία µέσω του θωρακικού πόρου. Ο κύκλος αυτός επιτρέπει στο ήπαρ, το λιπώδη ιστό και τους µύες να προσλάβουν διατροφικά λιπίδια από τα χυλοµικρά [22]. Η πρόσληψη αυτή γίνεται χάρη στην υδρόλυση η οποία καταλύεται από τη λιποπρωτεϊνική λιπάση (LPL) των ενδοθηλιακών κυττάρων των τριχοειδών στα όργανα αυτά. Απαραίτητος συνεργικός παράγοντας για την υδρόλυση είναι η απολιποπρωτεΐνη C-II (ApoC-II) [23]. Η LPL δρα στα τριγλυκερίδια των χυλοµικρών, τα 襰 Ѡ οποία µετατρέπονται, ακολούθως σε υπολείµµατα χυλοµικρών, τα οποία προσλαµβάνουν ApoE, είναι πλέον πλούσια σε χοληστερόλη και περιέχουν λιγότερα τριγλυκερίδια. Αυτά αποµακρύνονται στη συνέχεια από την κυκλοφορία µέσω της πρόσληψής τους από το ήπαρ µέσω των υποδοχέων LDLr. Εικόνα 1.4. Μονοπάτι καταβολισµού των χυλοµικρών. Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 25

27 Για την ταχεία αυτή αποµάκρυνση είναι απαραίτητη η παρουσία της ApoE, ενώ αντίθετη δράση έχει η ApoC-I, η οποία αναστέλλει την πρόσληψη των υπολειµµάτων από το ήπαρ. Ο υποδοχέας LDLr είναι ο διαµεσολαβητής αυτής της πρόσληψης. Καθοριστικό ρόλο στο µεταβολισµό των χυλοµικρών αλλά και των VLDL διαδραµατίζει η πρωτεΐνη µικροσωµιακής µεταφοράς (MTP), η οποία επάγει την ταχεία ανταλλαγή τριγλυκεριδίων µεταξύ των διάφορων µεµβρανικών συστηµάτων και εκφράζεται τόσο στο ήπαρ όσο και στα εντερικά κύτταρα. Η έλλειψή της συνδέεται µε τη εκδήλωση της λιπιδαιµικής διαταραχής αβηταλιποπρωτεϊναιµία και συνοδεύεται από διαταραγµένη απορρόφηση των λιπιδίων από το έντερο και ελαττωµατική µεταφορά των τριγλυκεριδίων µεταξύ των κυττάρων [24] Το µονοπάτι καταβολισµού των VLDL σε IDL και LDL Τα σωµάτια VLDL χρησιµοποιούν παρόµοιο µεταβολικό µονοπάτι µε τα χυλοµικρά στα οποία συµµετέχουν πολλά κοινά µόρια. Τα VLDL συντίθενται στο ήπαρ και εκκρίνονται απευθείας στην κυκλοφορία καταλήγοντας στους περιφερικούς ιστούς (κυρίως στο λιπώδη ιστό και στους µύες). ιαφέρουν δοµικά από τα χυλοµικρά διότι περιέχουν κατά την > απέκκρισή τους από το ήπαρ τις απολιποπρωτεΐνες ApoB-100 και ApoE. Με ένα µηχανισµό ανάλογο µε αυτό του µεταβολισµού των χυλοµικρών τα τριγλυκερίδια των VLDL υδρολύονται από τη λιποπρωτεϊνική λιπάση και τα VLDL µετατρέπονται σε IDL σωµάτια στους ανθρώπους. Τα IDL διαθέτουν δύο εναλλακτικά µονοπάτια είτε καταβολίζονται περαιτέρω σε LDL είτε αποµακρύνονται από το πλάσµα µέσω της πρόσληψής τους από το ήπαρ. Εικόνα 1.5. Μονοπάτι καταβολισµού των VLDL σε IDL και LDL Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 26

28 Τα µονοπάτια αυτά δρουν ανταγωνιστικά και συµπληρωµατικά. Συνεπώς, όταν υπάρξει κάποιο πρόβληµα στο ρυθµό κάθαρσης από το ήπαρ αυξάνονται τα επίπεδα των αθηρογενετικών LDL σωµατίων [25]. Στα ποντίκια τα VLDL σωµάτια υδρολύονται σε IDL τα οποία απορροφούνται ταχύτατα από τους LDLr και δεν προλαβαίνουν να µεταβολιστούν σε LDL. Αποτέλεσµα αυτού είναι ότι τα ποντίκια έχουν πολύ χαµηλά, µη ανιχνεύσιµα ποσά LDL στο πλάσµα τους Το µονοπάτι των HDL σωµατιδίων Ουσιαστικά, το πρώτο βήµα για το σχηµατισµό της HDL είναι η βιοσύνθεση της apoa-i και η έκκρισή της από το ήπαρ κυρίως σε απολιπιδιωµένη µορφή. Στα ηπατικά και εντερικά κύτταρα προσλαµβάνει φωσφολιπίδια οπότε και µετατρέπεται σε λιπιδιωµένη apoa-i. Τα σωµατίδια που προκύπτουν είναι µικρά και δισκοειδή, περιέχουν δύο µόρια apoa-i που περιβάλλουν σαν «ζώνη» τα φωσφολιπίδια και ονοµάζονται pre-β-hdl. Η λιπιδιωµένη apoα-ι προσλαµβάνει ελεύθερη (µη εστεροποιηµένη) χοληστερόλη από κύτταρα περιφερικών ιστών διαµέσου της µεµβρανικής πρωτεΐνης µεταφοράς λιπιδίων ABCA1 και 跠 Ѡ σχηµατίζει µεγαλύτερα δισκοειδή σωµάτια, τα α-4 HDL. Ο ABCA1 λοιπόν είναι ένα από τα απαραίτητα µόρια για το σχηµατισµό της HDL. Αυτό διαπιστώθηκε από µελέτες ασθενών που έπασχαν από τη νόσο Tangier, οι οποίοι έχουν µια µετάλλαξη στο γονίδιο του ABCA1 και εκδηλώνουν πρώιµη αθηρωµάτωση. Ποντίκια µε την ίδια µετάλλαξη έχουν ανεπάρκεια της HDL, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο ABCA1 αλληλεπιδρά µε λιποπρωτεΐνες για το σχηµατισµό της HDL [26]. Εικόνα 1.6. Χωροπληρωτική απεικόνιση του µοντέλου των δισκοειδών µορφών της HDL [10]. Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 27

29 Πρόσφατες µελέτες έδειξαν πως τόσο η απολιποπρωτεΐνη Ε όσο και η απολιποπρωτεΐνη C-III προάγουν τη de novo βιοσύνθεση της HDL απουσία απολιποπρωτεΐνης A-Ι [27,28]. Η πρόδροµη λοιπόν µορφή της HDL υφίσταται ως δισκοειδή σωµατίδια, τα οποία είτε εκκρίνονται από το ήπαρ και τον εντερικό βλεννογόνο ως νεογενείς HDL, είτε προέρχονται από την µετατροπή της HDL µε τη δράση της πρωτεΐνης µεταφοράς των εστέρων χοληστερόλης (CETP), της πρωτεΐνης µεταφοράς των φωσφολιπιδίων (PLTP), της ηπατικής λιπάσης HL και της ενδοθηλιακής λιπάσης (EL) [29]. Με την προσθήκη απολιποπρωτεϊνών, φωσφολιπιδίων και χοληστερόλης, που προέρχονται είτε από κύτταρα, είτε από τις λιποπρωτεΐνες που περιέχουν απολιποπρωτεΐνη Β, τα σωµατίδια αυξάνουν σε µέγεθος. Η χοληστερόλη που βρίσκεται στην επιφάνεια της HDL εστεροποιείται µε την µεταφορά ενός λιπαρού οξέος από τη λεκιθίνη (φωσφατιδυλοχολίνη) µέσω της δράσης του ενζύµου LCAT. Η χοληστερόλη µετά την εστεροποίησή της, µετακινείται από την επιφάνεια των νεογενώνδισκοειδών σωµατιδίων της HDL, ως πιο υδρόφοβο µόριο, προς το εσωτερικό τους, και αυτά µετατρέπονται σε µικρά σφαιρικά HDL 3. Περαιτέρω δράση του ενζύµου LCAT αλλά και της PLTP, έχουν ως αποτέλεσµα την µετατροπή των HDL 3 σε HDL 2, συµβάλλοντας έτσι στην Ơѝ ωρίµανση και τον µεταβολισµό της HDL [30]. Επιπλέον, ενσωµατώνονται και άλλες λιποπρωτεΐνες στα HDL σωµατίδια, µέσω αποµάκρυνσής τους από άλλα κλάσµατα λιποπρωτεϊνών. Εικόνα 1.7. Μονοπάτι βιοσύνθεσης της HDL µε τη συµµετοχή των ABCA1 και LCAT [27]. Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 28

30 Τα λιπίδια και οι πρωτεΐνες της HDL αποµακρύνονται από την κυκλοφορία µε δύο µηχανισµούς [32]: Την εκλεκτική αποµάκρυνση των λιπιδίων µέσω του υποδοχέα SR-BI. Ο υποδοχέας αυτός εκφράζεται στα ηπατικά κύτταρα και στους στεροειδοπαραγωγικούς ιστούς (επινεφρίδια, ωοθήκες, όρχεις). Συνδέεται µε την HDL µέσω των apoa-i και apoa-ii, προσλαµβάνει τους εστέρες χοληστερόλης και τους µεταφέρει ενδοκυττάρια, χωρίς να αποδοµείται το σωµατίδιο της HDL. Με την αποµάκρυνση όλου του σωµατιδίου µέσω των υποδοχέων της apoe ή της apoa-i στα κύτταρα του ήπατος. Η CETP συµβάλλει έµµεσα στην αποµάκρυνση της χοληστερόλης της HDL, ανταλλάσσοντας τους εστέρες χοληστερόλης της HDL µε τα τριγλυκερίδια των λιποπρωτεϊνών που περιέχουν apob (χυλοµικρά, VLDL, LDL, IDL). Οι εστέρες χοληστερόλης αποµακρύνονται στη συνέχεια πίσω στο ήπαρ, µέσω του υποδοχέα της LDL (LDLr). Η ενδοθηλιακή λιπάση και η ηπατική λιπάση υδρολύουν τα τριγλυκερίδια της HDL σε ελεύθερα λιπαρά οξέα, τα οποία προσλαµβάνονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα Ơѝ ηπατοκύτταρα. Η αποµάκρυνση των λιπιδίων από την HDL έχει ως αποτέλεσµα τη δηµιουργία νέων πρόδροµων µορφών HDL. Τα σωµατίδια αυτά προσλαµβάνουν λιπίδια από τα κύτταρα και ξανασχηµατίζουν ώριµα σωµατίδια HDL. Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 29

31 1.3 ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Οι πρωτεΐνες που αποτελούν το περίβληµα των λιποπρωτεϊνών, οι απολιποπρωτεΐνες, συντίθενται στο ήπαρ κυρίως καθώς και στο επιθήλιο του λεπτού εντέρου. Οι κύριες κατηγορίες και οι πιο συχνά απαντώµενες είναι οι Α, Β, C, Ε και a. Εκτός από τη σύνδεσή τους µε τα λιπίδια επιτελούν και περαιτέρω λειτουργίες. Η ικανότητά τους να δεσµεύουν λιπίδια οφείλεται στις αµφιπαθείς α-έλικες και στις β-επιφάνειες [33,34]. Παρακάτω παρατίθενται ορισµένες από τις πιο σηµαντικές απολιποπρωτεΐνες και οι ιδιότητες τους. Η ApoA-I αποτελεί δοµική µονάδα της HDL και είναι υπεύθυνη για τη βιοσύνθεση της HDL, την ενεργοποίηση της LCAT και την αλληλεπίδραση των λιποπρωτεϊνών HDL µε τους υποδοχείς SR-B1 [35,36]. Λόγω των παραπάνω λειτουργιών θεωρείται ότι έχει αθηροπροστατευτική δράση. Οι πιο σηµαντικές απολιποπρωτεΐνες της οικογένειας ApoΒ είναι οι Β-48 και Β-100. Συµµετέχουν στον καταβολισµό των λιποπρωτεϊνών LDL, VLDL και Lp(a). Ειδικότερα, η ApoB-48 συντίθεται στα κύτταρα του εντέρου και είναι απαραίτητη για τη δόµηση των χυλοµικρών κατά την απορρόφηση των διατροφικών λιπιδίων µετά από κάθε γεύµα. Αντίθετα, η ApoB-100 συντίθεται στο ήπαρ και είναι απαραίτητη για τη σύνθεση ѝ και την απέκκριση των VLDL και αποτελεί την κύρια πρωτεΐνη των LDL λιποπρωτεϊνών [37]. Η υποκατηγορία των ApoC συµβάλλει τόσο στη διαµόρφωση των LDL και VLDL όσο και των HDL. Η ApoC-I ενεργοποιεί την LCAT και αναστέλλει το ένζυµο CETP [38] ενώ η ApoC-IΙ ενεργοποιεί την LPL (Lipoprotein Lipase). Η δράση της προσφέρει µερική προστασία έναντι της αθηρωµάτωσης. Η ApoC-IΙΙ και η ApoC-IV προκαλούν σε περίπτωση υπερέκφρασής τους αύξηση των τριγλυκεριδίων του πλάσµατος, ενώ πρόσφατη µελέτη έδειξε ότι η ApoC-III προάγει και τον de novo σχηµατισµό HDL µέσω του ABCA1 [28]. Η λιποπρωτεΐνη Lp(a) σχηµατίζεται µε την απολιποπρωτεΐνη Apo(a). H Apo(a) εντοπίζεται στο ενδοθήλιο των αγγείων και προκαλεί φλεγµονώδη και πολλαπλασιαστικά φαινόµενα. Τα υψηλά επίπεδά της στο πλάσµα έχουν συσχετιστεί µε καρδιαγγειακά και θροµβωτικά νοσήµατα [39]. Τέλος η απολιποπρωτεΐνη Ε (ApoE) αποτελεί τον κύριο προσδέτη των αθηρογενετικών λιποπρωτεϊνών µε τον LDLr και επάγει την ενεργή αποµάκρυνσή τους από το πλάσµα. Ενεργοποιεί την LCAT και είναι απαραίτητη για την κάθαρση των λιποπρωτεϊνικών Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 30

32 υπολειµµάτων. Έχει χαρακτηριστική αθηροπροστατευτική δράση. Μεταλλαγµένες µορφές της έχουν συσχετιστεί µε την πρώιµη εκδήλωση της νόσου Alzheimer και η υπερέκφρασή της προκαλεί υπερτριγλυκεριδαιµία. Πρόκειται για µια ευρέως µελετηθείσα απολιποπρωτεΐνη µε τελικό στόχο την θεραπεία διαταραχών των λιπιδίων στο αίµα [1] Η απολιποπρωτεΐνη Ε Η απολιποπρωτεΐνη Ε είναι κύριο συστατικό των µορίων VLDL, IDL, HDL, των χυλοµικρών και των υπολειµµάτων των χυλοµικρών. Παίζει καθοριστικό ρόλο στην κάθαρση των λιποπρωτεϊνών αυτών από την κυκλοφορία, διότι αποτελεί το µεσολαβητικό µόριοπροσδέτη των LDL υποδοχέων και των υποδοχέων VLDL, ApoER2 και LRP-1 [40-44]. In vivo και in vitro µελέτες έχουν δείξει ότι µεταλλάξεις στην απολιποπρωτεΐνη Ε που εµποδίζουν την πρόσδεση των λιποπρωτεϊνών που περιέχουν την απολιποπρωτεΐνη Ε στον LDL υποδοχέα, συνδέονται µε υψηλά επίπεδα χοληστερόλης στο πλάσµα και προκαλούν πρώιµη αθηροσκλήρωση σε ανθρώπους και πειραµατόζωα [45, 46]. Η apoε εµπλέκεται επίσης στους µηχανισµούς Ѧ αναρρόφησης χοληστερόλης από τους περιφερικούς ιστούς και είναι αθηροπροστατευτική [47-49]. Η apoε ρυθµίζει την µακροφαγική και τη Τ-λεµφοκυτταρική ανοσοποιητική απάντηση στο αθήρωµα. Στους ανθρώπους υπάρχουν τρία κοινά αλληλόµορφα σε ένα µόνο γενετικό τόπο τα οποία κωδικοποιούν την apoe. Αυτά τα αλληλόµορφα αναγνωρισµένα ως e2, e3, e4 δίνουν 3 οµόζυγους (E2/E2, E3/E3, E4/E4) και 3 ετερόζυγους (E3/E2, E4/E3, E4/E2) apoε φαινοτύπους [50,51]. Αυτές οι τρεις διαφορετικές ανθρώπινες ισοµορφές apoe4, apoe3, apoe2 είναι αποτέλεσµα µεταλλάξεων στα αµινοξικά κατάλοιπα 112 και 158. Συγκεκριµένα η apoe4 περιέχει Arg στη θέση 112 και Arg στη θέση 158. Η apoe3 περιέχει Cys στη θέση 112 και Arg στη θέση 158 και τέλος η apoe2 περιέχει Cys στη θέση 112 και Cys στη θέση 158 [51]. Ο φαινότυπος Ε2/2 σχετίζεται µε καρδιαγγειακά νοσήµατα [52] και ο φαινότυπος Ε4/4 αποτελεί παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη της νόσου Alzheimer [53]. Παρόµοια µε την apoα-i και apoα-iv και µέσα από µελέτες κρυσταλλογραφίας έχει αποδειχτεί ότι η apo Ε αποτελείται από αλληλουχίες 11 και 22 αµινοξέων που σχηµατίζουν αµφιπαθείς α-έλικες. Η δοµή αυτή επιτρέπει την πρόσδεση της σε λιπίδια και τον µετέπειτα σχηµατισµό λιποπρωτεϊνών. Η κρυσταλλογραφία µε ακτίνες- Χ του αµινοτελικού κοµµατιού Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 31

33 22 KDa της apoe έδειξε ότι αυτή η περιοχή σχηµατίζει ένα τετραελικοειδές δέµα (bundle) το οποίο σταθεροποιείται από υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις και γέφυρες αλάτων [54]. Είναι πιθανό ότι διαταραχές στη λιπιδική οµοιόσταση [43] όπως επίσης και αλληλεπιδράσεις της apoe µε άλλες εγκεφαλικές πρωτεΐνες, ίσως να συνεισφέρουν στο νευροεκφυλισµό που παρατηρείται στη νόσο Alzheimer [55]. 훀Ѧ Εικόνα 1.8. Η δοµή της απολιποπρωτεΐνης Ε µε τις κύριες λειτουργικές περιοχές της Υποδοχείς της apoe Η δράση της apoe διαµεσολαβείται µέσω πολλαπλών υποδοχέων όπως είναι οι LDLr, LRP- 1, ApoER2, VLDLr, SR-BI. Ο LDLr είναι µια διαµεµβρανική γλυκοπρωτεΐνη. Πρόκειται για τον βασικό υποδοχέα των LDL σωµατιδίων. Μετά την πρόσδεσή τους γίνεται ενδοκυττάρωση του συµπλόκου υποδοχέα-ldl και στη συνέχεια ο υποδοχέας ανακυκλώνεται και επανέρχεται στην επιφάνεια των κυττάρων. Η παραπάνω ενδοκυττάρωση προάγεται από τις απολιποπρωτεΐνες Β και Ε. Μεταλλάξεις στο γονίδιο του υποδοχέα οδηγούν σε διαταραχή των επιπέδων χοληστερόλης γνωστή ως Οικογενής Υπερχοληστερολαιµία Τύπου III. Ανάλογα µε την µη Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 32

34 έκφραση ή την έκφραση µη λειτουργικής πρωτεΐνης διαχωρίζεται η νόσος σε πέντε διαφορετικούς τύπους µε την αντίστοιχη βαρύτητα. Ακόµη, διακρίνεται σε οµόζυγη ή ετερόζυγη ανάλογα µε τον αριθµό των µεταλλαγµένων αλληλοµόρφων γονιδίων. Ο αριθµός των µεταλλάξεων που έχουν ως τώρα ταυτοποιηθεί ανέρχονται στις 1000 [56]. Tο πλήθος των υποδοχέων και άρα η πρόσληψη χοληστερόλης από τα κύτταρα ρυθµίζεται µε αρνητική ανάδραση (negative feedback) µέσω ειδικών πυρηνικών πρωτεϊνών που επηρεάζουν την έκφραση των γονιδίων του LDLr. Το ρυθµιστικό αυτό σύστηµα περιλαµβάνει τις πρωτεΐνες SCAP (SREPB Cleavage Activating Protein) και SREBP (Sterol Regulatory Element-Binding Protein) οι οποίες βρίσκονται στο ενδοπλασµατικό δίκτυο και είναι µεταξύ τους συνδεδεµένες. Όταν τα επίπεδα στερολών στο κύτταρο είναι χαµηλά η SCAP ενεργοποιεί άµεσα και έµµεσα την SREBΡ [9]. Το αµινοτελικό άκρο της δεύτερης µεταφέρεται στον πυρήνα του κυττάρου προσδένεται στο DNA στις θέσεις SRE (sterol response elements) και επηρεάζει την έκφραση τουλάχιστον 20 γονιδίων, ένα εκ των οποίων είναι το γονίδιο που εκφράζει τον LDLr [57]. Ο LRP-1 (LDLr Related Protein 1) είναι µια πρωτεΐνη-υποδοχέας µε ποικίλες λειτουργίες. ѧ Ανήκει στην οικογένεια των LDLr υποδοχέων λόγω της εκτεταµένης οµολογίας του µε τον LDLr. Αποτελείται από 4525 αµινοξέα και εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ, τον εγκέφαλο και τους πνεύµονες. Έχει διαπιστωθεί ότι είναι απαραίτητη κατά την εµβρυογένεση, καθώς πειραµατόζωα µε γενετική έλλειψη του αντίστοιχου γονιδίου είναι θνησιγενή. Γενικά αποτελεί τον µεσολαβητή για την ενδοκυττάρωση ετερογενών ενώσεων όπως διάφορες πρωτεϊνάσες, αναστολείς πρωτεϊνασών ακόµη και βακτηριακές τοξίνες. Αναφορικά µε τη δράση του στην καταβολισµό των λιπιδίων έχει σχεδόν επιβεβαιωθεί ότι έχει µια συµµετοχή στην κάθαρση των υπολειµµάτων χυλοµικρών καθώς και των LDL απουσία των LDLr [58]. Επιπλέον είναι γνωστό ότι η δράση του επάγεται µε τη σύνδεση της απολιποπρωτεΐνης Ε και δείχνει εκλεκτικότητα ως προς τις ισοµορφές apoe3 και apoe4, ενώ η apoe2 συνδέεται ελάχιστα. Με την παραπάνω σύνδεση διαµεσολαβείται εµµέσως και η εστεροποίηση της χοληστερόλης στα β-vldl σωµάτια [59]. Τέλος, η απολιποπρωτεΐνη C δρα ανασταλτικά στη δράση του LRP-1 [60]. Ένας άλλος γνωστός συναγωνιστικός αναστολέας του υποδοχέα LRP-1 είναι η υποδοχεο-σχετιζόµενη πρωτεΐνη (Receptor Related Protein) RAP. Τµήµα Ιατρικής Μ.Π.Σ. στις Βασικές Ιατρικές Επιστήµες 33