ΜΑΖΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΥΠΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥΣ ΣΤΙΣ Υ ΑΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟ ΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΩΚΕΑΝΟΓΡΑΦΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΘΑΛΑΣΣΙΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΟΙΚΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΤΑΞΙΝΟΜΙΚΗΣ ΜΑΖΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΥΠΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥΣ ΣΤΙΣ Υ ΑΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Μεταπτυχιακή ιπλωµατική Εργασία Επιµέλεια: Ιωάννα Τσιόνκη Α.Μ Υπεύθυνη Καθηγήτρια: Αθηνά Οικονόµου Αµίλλη ΑΘΗΝΑ ΙΟΥΛΙΟΣ 2013

2 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟ ΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΩΚΕΑΝΟΓΡΑΦΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΘΑΛΑΣΣΙΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΟΙΚΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΤΑΞΙΝΟΜΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΑΖΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΙΚΡΟΦΥΚΩΝ ΥΠΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥΣ ΣΤΙΣ Υ ΑΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΤΣΙΟΝΚΗ ΙΩΑΝΝΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΟΙΚΟΝΟΜΟΥ-ΑΜΙΛΛΗ Α. (Καθηγήτρια, ΕΚΠΑ) ΑΝΗΙΛΙ ΗΣ. (Αναπληρωτής Καθηγητή, ΕΚΠΑ) ΦΟΥΝΤΟΥΛΑΚΗ Ε. (Ερευνήτρια B, ΕΛΚΕΘΕ)

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 7 Α.1. Σηµασία και εφαρµογές των µικροφυκών... 7 Α.2. Ο ρόλος των ζωντανών οργανισµών και ιδιαίτερα των µικροφυκών στην εκτροφή των ψαριών... 9 Α.3. Η βιοσύνθεση λιπιδίων στα µικροφύκη Α.4. Ο ανταγωνισµός των µικροφυκών στις µικτές καλλιέργειες Α.5. Οι υδατοκαλλιέργειες στην Ελλάδα Α.6. Υδατοκαλλιέργειες τροχοζώων Α.7. Υδατοκαλλιέργειες γαρίδων Α.8. Υδατοκαλλιέργειες διθύρων µαλακίων Α.9. Κατάταξη συστηµάτων εκτροφής Α.9.1. Εκτατικές µέθοδοι Α.9.2. Ηµιεντατικές τεχνικές Α.9.3. Τεχνικές µεσοκόσµων Α.9.4. Εντατικές-Υπερεντατικές τεχνικές Α.10. Τύποι Καλλιέργειας Φυκών Α Εσωτερικού/Εξωτερικού χώρου Α.10.2 Αξενική/Ξενική καλλιέργεια Α Ασυνεχής/Συνεχής/Ηµισυνεχής καλλιέργεια Α.11. Ασυνεχής καλλιέργεια Α.12. ιαδοχική Αναβάθµιση Α.13. Συνεχής καλλιέργεια Α.14. Φωτοβιοαντιδραστήρες Α.15. Ηµισυνεχής καλλιέργεια Α.16. υναµική των πληθυσµών στις καλλιέργειες Α Λανθάνουσα Φάση (lag phase) Α Φάση θανάτου (death phase) Α.17. Κύριες καλλιεργούµενες ταξινοµικές οµάδες Α.18. Ρυθµιστικές παράµετροι κατά την ανάπτυξη του ΝΑΒ Α Φως Α ph Α Αερισµός και διοξείδιο του άνθρακα Α Θρεπτικά συστατικά Α Μέσο καλλιέργειας Α Χρόνος παραµονής της καλλιέργειας Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Β.1. Εργαστηριακή µέθοδος καλλιέργειας φυκών Β.2. Εργαστηριακή µέθοδος για την άµεση εστεροποίηση των λιπαρών οξέων Β.3. Παρασκευή θρεπτικού µέσου Walne Β.4. Παρασκευή διαλύµατος βιταµινών Β.5. Εργαστηριακή µέθοδος παρακολούθησης φυτοπλαγκτού... 36

4 Β.5.1. Ποιοτική µελέτη φυτοπλαγκτού Β.5.2. Ποσοτική µελέτη φυτοπλαγκτού Β.6. Συνοπτικά οι µέθοδοι της ποσοτικής µελέτης του φυτοπλαγκτού Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.1. Πείραµα καλλιέργειας σε τρεις διαφορετικές αλατότητες (20, 25, 30 ppt) και σε τρεις διαφορετικές αναλογίες θρεπτικών (4 Ν:P, 2 x 4 Ν:P, 3 x 4 Ν:P) Γ.2. Πείραµα ηµισυνεχούς καλλιέργειας σε 3 διαφορετικούς ρυθµούς αραίωσης (25% 50% 75%) Γ.3. Περιγραφή του γένους ephroselmis Γ.4. Περιγραφή του γένους Chlorococcum Γ.5. Περιγραφή του γένους Rhodomonas Γ.6. Χηµική Ανάλυση του Προφίλ Λιπαρών Οξέων FAME (Fatty Acids Methylesters) ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Ανάπτυξη µικτής καλλιέργειας και διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών αλατότητας και αναλογίας θρεπτικών Σύνθεση της βιοκοινωνίας των καλλιεργειών και εναλλαγή των ειδών Σύγκριση της παραγωγικότητας των καλλιεργειών Ηµισυνεχής καλλιέργεια µε τρεις ρυθµούς αραίωσης Προφίλ λιπαρών οξέων Συµπεράσµατα... 61

5 Ευχαριστίες Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά της επιβλέπουσα καθηγήτρια Οικονόµου- Αµίλλη Αθηνά, για την ανάθεση της παρούσας µελέτης, καθώς και για τη στήριξη και τη συµβολή της στη συγγραφή και τη παρουσίαση της. Ευχαριστώ θερµά τον ρ. Ιωάννη Τζοβενή για τη συνεχή επιστηµονική καθοδήγηση, τη στήριξη, τις συµβουλές και την υποµονή του. Ευχαριστώ την ερευνήτρια του ΕΛΚΕΘΕ Φουντουλάκη Ελένη για τη βοήθεια της στην ανάλυση των λιπαρών οξέων και τον αναπληρωτή καθηγητή ανιηλίδη ανιήλ για τις συµβουλές του. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τη µεταπτυχιακή φοιτήτρια Χατζηστρούντζιου Ξανθή για την άψογη συνεργασία και την ανεκτίµητη βοήθειά της στην ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας, καθώς και τις µεταπτυχιακές φοιτήτριες Σερετίδου Γεωργία, Καρλοβασίτη Παρασκευή και τον προπτυχιακό φοιτητή Παπαχαραλάµπους Παναγιώτη για την γενικότερη βοήθεια.

6 Περίληψη Στόχος της εργασίας είναι η παραγωγή βιοµάζας θαλάσσιων µικροφυκών από µικτή καλλιέργεια φυτοπλαγκτού. Οι µικτές καλλιέργειες είναι κατάλληλες για την αντιµετώπιση των προβληµάτων του κόστους και των µολύνσεων που εµφανίζει η διατήρηση των µονοκαλλιεργειών, επίσης, η µεγάλη ποικιλία των ανθίσεων στις µικτές καλλιέργειες είναι χρήσιµη για την εκτροφή διαφορετικών ειδών. Η χρήση υφιστάµενης µεθοδολογίας για την επιτυχή ανάπτυξη θαλάσσιου ΝΑΒ (Natural Algal Bloom) και των κατάλληλων τεχνικών για τη βέλτιστη παραγωγή βιοµάζας αποσκοπεί κυρίως στην εφαρµογή τους στο κλάδο της υδατοκαλλιέργειας για την εκτροφή ιχθυονυµφών αλλά και στην κοσµετολογία και τη διατροφή. Η δειγµατοληψία του θαλασσινού νερού πραγµατοποιήθηκε στο λιµανάκι του Αγ. Κοσµά στον Σαρωνικό κόλπο και στη συνέχεια ελέγχονται εργαστηριακά οι βέλτιστες συνθήκες της καλλιέργειας. Το νερό φιλτράρεται στα 100µm για ν αποµακρυνθεί το µεσο/µακρο-φυτο/ζωο-πλαγκτόν. Ο έλεγχος των καλλιεργειών πραγµατοποιείται σε θάλαµο µε σταθερές συνθήκες θερµοκρασίας και φωτισµού. Αρχικά γίνεται ο έλεγχος των καλλιεργειών σε τρεις διαφορετικές αλατότητες (30, 25, 20 ppt) και σε τρία διαφορετικά επίπεδα θρεπτικών αζώτου-φωσφόρου. Η καθηµερινή παρακολούθηση των καλλιεργειών πραγµατοποιείται µε ποιοτικό και ποσοτικό έλεγχο. Η καλλιέργεια µε τον βέλτιστο ρυθµό ανάπτυξης και την µεγαλύτερη πυκνότητα βιοµάζας ήταν αυτή µε αλατότητα 25ppt και επίπεδα θρεπτικών της τυπικής αναλογίας του θρεπτικού µέσου walne, 4 N:P. Μετά τους εντατικούς ρυθµούς καλλιέργειας παρέµεινε ένα κυρίαρχο είδος, το πρασινοφύκος του γένους Νephroselmis µε µέγιστο αριθµό κυττάρων 1.70 x 10 7 cell/ml, ειδικό ρυθµό αύξησης µmax 0.27 d -1, µtotal 0.34 d -1, απόδοση 1.62 x 10 7 cells/ml, παραγωγικότητα 1.8 x 10 6 cells/ml/day. Την ένατη ηµέρα, ενώ η καλλιέργεια παρέµενε στο µέγιστο της ανάπτυξής της, πραγµατοποιήθηκε ηµισυνεχής καλλιέργεια. Η διαδικασία της ηµισυνεχούς καλλιέργειας επιδιώκει τη διατήρηση των καλλιεργειών πολύ κοντά στο µέγιστο ρυθµό ανάπτυξης. Χρησιµοποιήθηκαν τρεις διαφορετικοί ρυθµοί αραίωσης (25% 50% 75%). Η παρακολούθηση των καλλιεργειών γινόταν καθηµερινά µε ποιοτικό και ποσοτικό έλεγχο. Το γένος Νephroselmis παρέµεινε κυρίαρχο στην καλλιέργεια. Ως βέλτιστος ρυθµός αραίωσης εµφανίζεται ο 25% µε το γένος Νephroselmis να παραµένει το µόνο κυρίαρχο

7 µε παραγωγικότητα 5.98 x 10 5 cells/ml/day. Ακολούθησε η διήθηση των δειγµάτων υπό κενό σε φίλτρα γνωστού βάρους CF/C και πραγµατοποιήθηκε η µέτρηση του ξηρού βάρους σε ζυγό ακριβείας. Το ξηρό βάρος της καλλιέργειας ήταν mg/l. Στη συνέχεια έγινε ποσοτικός προσδιορισµός των ολικών λιποειδών και η ανάλυση της σύστασής τους σε λιπαρά οξέα µε την άµεση εστεροποίηση των λιπαρών οξέων. Το προφίλ των λιπαρών οξέων των µικροφυκών της καλλιέργειας έδειξε ότι τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFAs) έχουν ποσοστό 50.36%. Κυριαρχούν τα λιπαρά οξέα 16:0 (παλµιτικό οξύ), 16:4n-3 και 18:3n-3 (λινολενικό οξύ) µε ποσοστά %. Απ αυτά, το ΕΡΑ µε ποσοστό 3.27% ανήκει στην οικογένεια ω-3. Λέξεις-κλειδιά µικτή καλλιέργεια θαλάσσιων µικροφυκών, υδατοκαλλιέργειες, NAB (natural algal bloom), Νephroselmis Σκοπός Ο σκοπός της εργασίας είναι η παραγωγή βιοµάζας θαλάσσιων µικροφυκών µε τις κατάλληλες τεχνικές ανάπτυξης µικτής καλλιέργειας φυτοπλαγκτού (natural algal bloom, ΝΑΒ) και η διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών ανάπτυξης. Οι βασικοί στόχοι για τη διεξαγωγή του πειράµατος είναι: -Η προσαρµογή υφιστάµενης µεθοδολογίας για την επιτυχή ανάπτυξη του θαλάσσιου ΝΑΒ -Ο έλεγχος της σύνθεσης των ειδών της βιοκοινωνίας του ΝΑΒ ρυθµίζοντας τις αναλογίες των θρεπτικών ουσιών, της αλατότητας και τους ρυθµούς αραίωσης -Η διαχείριση του ΝΑΒ σε σχέση µε την πυκνότητα της καλλιέργειας, ρυθµίζοντας τις αναλογίες των θρεπτικών ουσιών, της αλατότητας και τους ρυθµούς αραίωσης -Η διατήρηση του ΝΑΒ σε σταθερά επίπεδα µε την πραγµατοποίηση ηµισυνεχούς καλλιέργειας -Η χηµική ανάλυση του προφίλ των λιπαρών οξέων

8 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο σηµαντικός ρόλος των µικροφυκών και η πληθώρα εφαρµογών τους οδήγησαν στην ανάπτυξη ποικίλων τεχνικών καλλιέργειάς τους. Η καλλιέργεια των µακρο- και µικροφυκών παγκοσµίως αποτελεί µια σηµαντική οικονοµική δραστηριότητα. Στις υδατοκαλλιέργειες χρησιµοποιείται ευρέως η παραγωγή φυτοπλαγκτού για την εκτροφή ζωοπλαγκτού, το οποίο αποτελεί τη ζωντανή φυσική τροφή για τις προνύµφες των ψαριών. Επίσης, τα µικροφύκη χρησιµοποιούνται σε καλλιέργειες «πράσινων νερών» για τη συντήρηση της ποιότητας του νερού των δεξαµενών εκτροφής των προνυµφών των ψαριών (Papandroulakis et al. 2002, Shields 2001, Theodorou 2002). Τα µικροφύκη είναι µια µεγάλη και διακριτή οµάδα ευκαρυωτικών φωτοσυνθετικών οργανισµών µε απλή κυτταρική δοµή, τα οποία απαντώνται τόσο σε µονοκύτταρες όσο και σε πολυκύτταρες µορφές. Α.1. Σηµασία και εφαρµογές των µικροφυκών Τα φύκη αποτελούν τη βάση των τροφικών αλυσίδων στα θαλάσσια οικοσυστήµατα. Συµβάλλουν στην παγκόσµια παραγωγή οξυγόνου και περιορίζουν το φαινόµενο του θερµοκηπίου λόγω της απορρόφησης του CO2. Είναι ευρεία η εφαρµογή τους στη βιοµηχανία καλλυντικών και την κοσµετολογία (Richmond 2004, Spolaore et al. 2006, Volkman & Brown 2005). Τα µικροφύκη παρουσιάζουν αντιοξειδωτική και αντιγηραντική δράση (Spirulina, Chlorela). Η εφαρµογή τους είναι σηµαντική στη φαρµακοβιοµηχανία µε τη παραγωγή αντιικών φαρµάκων, την αντιµετώπιση καρδιαγγειακών παθήσεων (διάτοµα, χλωροφύκη) και µε την επιπλέον αντιοξειδωτική, αντιφλεγµονώδη και αντιµικροβιακή δράση τους. Χρησιµοποιούνται στη βιοµηχανία τροφίµων ως συµπληρώµατα διατροφής (Spirulina) και πρόσθετα τροφίµων (στερεωτικοί παράγοντες, πηκτικά, χρωστικές όπως τα καρωτίνια). Χρησιµοποιούνται ως ανανεώσιµες πηγές ενέργειας. Παράγουν βιοαιθανόλη, βιοέλαια και αποτελούν κατάλληλη πηγή βιοκαυσίµων. Τα µικροφύκη παρουσιάζουν χαµηλό κόστος παραγωγής, απαιτούν µόνο φως και ανόργανο άνθρακα για τη παραγωγή µεγάλης ποσότητας βιοµάζας σε σύντοµο χρονικό διάστηµα χωρίς να απαιτούν καλλιεργήσιµες εκτάσεις γης. O ρόλος τους στην επιστήµη είναι αξιοσηµείωτος. Χρησιµοποιούνται σε µελέτες οικολογίας, 7

9 βιοποικιλότητας, βιοχηµείας, εξελικτικής βιολογίας, βιοτεχνολογίας, τοξικολογίας. Τέλος, µεγάλη είναι η εφαρµογή τους στη βιοµηχανία των υδατοκαλλιεργειών. Τα µικροφύκη έχουν σηµαντικό διατροφικό ρόλο στα θαλάσσια ζώα του ανοικτού ωκεανού και συνεπώς αποτελούν τη φυσική τροφή πολλών εκτρεφόµενων ειδών µε υψηλή θρεπτική αξία και ειδικά θρεπτικά συστατικά (λιπαρά οξέα, βιταµίνες). Ορισµένα µικροφύκη παράγουν καρωτινοειδή (β-καρωτίνιο, ασταξανθίνη) που έχουν αντιοξειδωτική δράση. Η τυπική θρεπτική αξία των µικροφυκών είναι: 30-40% πρωτεΐνες, 10-20% λιπαρά, 5-15% υδατάνθρακες. Φυτοπλαγκτόν µε συγκεκριµένα είδη µικροφυκών χρησιµοποιείται άµεσα στις υδατοκαλλιέργειες ως ζωντανή φυσική τροφή για Artemia (e.g. Fabregas et al. 2001), κλαδοκεραιωτά (De la Peña et al. 1998), αχιβάδες (Caers et al. 1999, Delaporte et al. 2005), στρείδια (Laing & Millican 198, RiveroRodríguez et al. 2007), χτένια (Velasco 2007), µύδια (Cordero-Esquivel & Voltolina-Lobina 1994), γαρίδες (D Souza & Kelly 2000, Ronquillo et al. 1997), κωπήποδα (e.g. Lee et al. 2006, Thor et al. 2002), τροχόζωα (Dhert et al. 2001, Okauchi & Fukusho 1984). Επίσης, χρησιµοποιούνται ως «πράσινα νερά» για τη διατροφή των προνυµφών των ψαριών (Reitan et al. 1993, 1997). Επιπλέον κάποια είδη χρησιµοποιούνται ως ξηρά τροφή στη διατροφή διθύρων µαλακίων (Laing & Gil Vertugo 1991, Papandroulakis et al. 1996). Τα τροχόζωα χρησιµοποιούνται για την εκτροφή των προνυµφών των ψαριών και των καρκινοειδών. Τα µικροφύκη αποτελούν τη φυσική τροφή των τροχοζώων και η δυνατότητα της µαζικής τους παραγωγής επιτρέπει τη γρήγορη ανάπτυξη των καλλιεργειών τους. Στις νυµφικές καλλιέργειες των θαλασσινών ψαριών (καλλιέργειες σε «πράσινα νερά») τα µικροφύκη λειτουργούν ως ρυθµιστές της ποιότητας του περιβάλλοντος νερού και ως εµπλουτιστικός παράγοντας των ζωοπλαγκτικών θηραµάτων που διανέµονται στις νύµφες. Η επιλογή των φυτοπλαγκτικών ειδών που χρησιµοποιούνται για τους σκοπούς αυτούς εξαρτάται από τη θρεπτική τους αξία, το µέγεθός τους, την έλλειψη τοξικότητας και την ευκολία της καλλιέργειάς τους. Οι συνεχώς αυξανόµενες ανάγκες, στις νυµφικές καλλιέργειες των θαλασσινών ψαριών για τη χρήση µικροφυκών οδήγησαν τους παραγωγούς, στις µεσογειακές κυρίως χώρες, να υιοθετήσουν υπαίθριες τεχνικές µαζικής παραγωγής τους ανάλογες µε αυτές που έχουν αναπτυχθεί σε τροπικά κλίµατα. Με τις τεχνικές αυτές αξιοποιείται η άφθονη ηλιακή ενέργεια κατά το µεγαλύτερο διάστηµα του χρόνου. 8

10 Μεγάλοι όγκοι µικροφυκών παράγονται είτε αποκλειστικά µε αυτόν τον τρόπο (π.χ. Ισραήλ) είτε συµπληρωµατικά µε τις καλλιέργειες σε κλειστούς χώρους (π.χ. Ιταλία, Ισπανία και Ελλάδα). Τέλος, τα µικροφύκη µπορούν να χρησιµοποιηθούν στις υδατοκαλλιέργειες ως βιοφίλτρα για την αποµάκρυνση των θρεπτικών µικροοργανισµών. Υπάρχουν δύο κατηγορίες µικροφυκών που χρησιµοποιούνται ως βιοφίλτρα: 1) Μικροφύκη αιωρούµενα στο επεξεργασµένο λύµα. Το µειονέκτηµα της χρήσης αυτής είναι η δυσκολία περισυλλογής αιωρούµενων µικροφυκών (διήθηση ή φυγοκέντρηση). 2) Μικροφύκη προσκολληµένα σε υπόστρωµα. Η µέθοδος καλλιέργειας µικροφυκών σε υπόστρωµα έχει τεράστιο κόστος. Α.2. Ο ρόλος των ζωντανών οργανισµών και ιδιαίτερα των µικροφυκών στην εκτροφή των ψαριών Τα µικροφύκη διαδραµατίζουν πολύ σηµαντικό ρόλο στις υδατοκαλλιέργειες καθώς αποτελούν το µέσο εµπλουτισµού του ζωοπλαγκτού, που χρησιµοποιείται για την εκτροφή υδρόβιων οργανισµών. Πέρα από τις πρωτεΐνες και την ενέργεια τα µικροφύκη, µέσω της τροφικής αλυσίδας, µεταφέρουν βιταµίνες, χρωστικές, στερόλες, πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Με την προσθήκη καλλιέργειας µικροφυκών στις δεξαµενές εκτροφής ψαριών, η παραγωγή αυξάνεται. Αυτό γίνεται µέσω ενός συνδυασµού διαφόρων µηχανισµών που σχετίζονται µε τη διατήρηση της θρεπτικής ποιότητας του ζωοπλαγκτού, την έκκριση διάφορων βιταµινών από τα µικροφύκη και την προβιοτική τους επίδραση στα ψάρια. Οι βιοµηχανικές τροφές, σε γενικές γραµµές, δεν µπορούν να καλύψουν επαρκώς τις διατροφικές ανάγκες των περισσότερων ψαριών, ιδιαίτερα των θαλάσσιων ειδών, είτε διότι οι ανάγκες αυτές δεν είναι επαρκώς γνωστές (τα τεχνητά σιτηρέσια είναι ελλιπή σε κάποια θρεπτικά στοιχεία), είτε διότι είναι τεχνολογικά δύσκολο έως αδύνατο να ενσωµατωθούν όλα τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά σε τόσο µικρούς κόκκους. Αντίθετα, οι ζωντανοί τροφικοί οργανισµοί ικανοποιούν πλήρως τις διατροφικές ανάγκες των ιχθυονυµφών και µπορούν να εµπλουτισθούν περαιτέρω µε διάφορα θρεπτικά συστατικά που κρίνονται απαραίτητα για τη σωστή ανάπτυξη των ψαριών. Κάποια είδη χρειάζονται ζωντανούς πλαγκτικούς οργανισµούς στην αρχή της διατροφής τους, µέχρι την ωρίµανση του πεπτικού τους συστήµατος. Για παράδειγµα, η τσιπούρα δεν έχει λειτουργικό στοµάχι στην αρχή της εξωγενούς διατροφής και η 9

11 ενζυµική δραστηριότητα είναι περιορισµένη µε αποτέλεσµα να µην µπορεί να πέψει τη βιοµηχανική τροφή πριν από την 20η-25η ηµέρα ενεργού διατροφής. Έτσι, χρειάζεται ζωντανούς πλαγκτικούς οργανισµούς που πέπτονται εύκολα και εµπεριέχουν όλα τα απαραίτητα συστατικά για την επιβίωση. Τα τελευταία τριάντα χρόνια τα εκκολαπτήρια, µαζί µε τις νύµφες των ψαριών ή άλλων οργανισµών που εκτρέφουν, παράγουν µαζικά τρεις διακριτούς τύπους πλαγκτικών οργανισµών τους οποίους χρησιµοποιούν για τη διατροφή τους: Μικροφύκη (2-20µm) για την εκτροφή ψαριών, δεκαπόδων, τροχοζώων, διθύρων Τροχόζωα (50-200µm) για την εκτροφή καρκινοειδών και θαλάσσιων ψαριών Artemia ( µm) για την εκτροφή καρκινοειδών και ψαριών Α.3. Η βιοσύνθεση λιπιδίων στα µικροφύκη Η βιοµηχανική παραγωγή µικροβιακών λιπιδίων (Single Cell Oils, SCO) κατέστη δυνατή τη τελευταία δεκαετία (Harwood & Gushina, 2009) και αποτελεί µια εναλλακτική λύση για τη παραγωγή λιπιδίων των οποίων η δοµή παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Τα λιπίδια που συντίθενται από τους µικροοργανισµούς αποτελούν είτε δοµικά είτε αποθηκευτικά µόρια των κυττάρων (Behrens & Kyle, 1996). Τα µικροφύκη που συσσωρεύουν λιπίδια σε ποσοστό µεγαλύτερο του % της κυτταρικής τους βιοµάζας χαρακτηρίζονται ως ελαιογόνα. Η περιεκτικότητα των µικροφυκών σε λιπίδια κυµαίνεται από 1-70 % της κυτταρικής τους βιοµάζας και σε ορισµένα είδη µπορεί να φτάσει το 90 % της ξηρής βιοµάζας τους (Mata et al., 2010). Τα λιπίδια στα µικροφύκη συσσωρεύονται υπό τη µορφή τριγλυκεριδίων (Ratledge, 2004). Η βιοσύνθεση των λιπιδίων, όπως σε όλους τους µικροργανισµούς, έτσι και στα φύκη γίνεται όταν η καλλιέργεια γίνεται σε θρεπτικό µέσο το οποίο είναι περιοριστικό ως προς ένα παράγοντα. Ο παράγοντας αυτός, που συνήθως είναι ο περιοριστικός παράγοντας της αύξησης, είναι το άζωτο. Σε συνθήκες έλλειψης αζώτου η συσσώρευση των λιπιδίων αυξάνεται σηµαντικά (Hsieh & Wu, 2009). Μετά την εξάντληση του περιοριστικού παράγοντα, ο άνθρακας που αφοµοιώνεται χρησιµοποιείται για τη βιοσύνθεση λιπιδίων (Ratledge, 2004). Τα λιπίδια των µικροφυκών χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη ασυνήθιστων λιπαρών οξέων, µε µεγάλες αλειφατικές αλυσίδες (>18C) και PUFAs 10

12 (πολυακόρεστα λιπαρά οξέα). Η ικανότητα των µικροφυκών να βιοσυνθέτουν πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (> 20%), όπως το εικοσιπεντανοϊκό οξύ (ΕΡΑ), το εικοσιδυεξανοϊκό (DHA) και το αραχιδονικό οξύ (ΑRΑ), καθιστά τα µικροφύκη τόσο σηµαντικά στην τροφική αλυσίδα (Harwood & Gushina, 2009). Τα ΕΡΑ και DHA ανήκουν στην οικογένεια των ω-3 λιπαρών οξέων. Το ΕΡΑ είναι ένα πολυακόρεστο λιπαρό οξύ µε είκοσι άτοµα άνθρακα και πέντε διπλούς δεσµούς. Οι διπλοί δεσµοί τοποθετούνται έτσι ώστε ο τελευταίος να απέχει τρία άτοµα από το µεθυλικό ή ωµέγα άκρο της αλειφατικής αλυσίδας κι αυτό το καθιστά ω-3 λιπαρό οξύ (Milledge, 2011). Τα οξέα τις οικογένειας αυτής είναι πολύ σηµαντικά τόσο για τις κλινικές και φαρµακευτικές τους εφαρµογές, όσο και για τη διατροφική τους αξία. Οι υψηλές ποσότητες των ω-3 πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFAs) στα θαλάσσια ψάρια και τα οστρακοειδή διατηρούνται από το φυτοπλαγκτόν, που αποτελεί τη βάση της τροφικής τους αλυσίδας (Ackman 1989, Sargent et al. 1989). Επιπλέον, το ΕΡΑ αποτελεί πρόδροµο µόριο των εικοσανοειδών. Τα εικοσανοειδή είναι πρόδροµα µόρια διάφορων ορµονών όπως οι προσταγλανδίνες, οι προστακυκλίνες, τα λευκοτριένια και οι θροµβοξάνες. Το DHA αποτελεί κύριο δοµικό συστατικό της φαιάς ουσίας του εγκεφάλου, του αµφιβληστροειδούς χιτώνα των µατιών και σηµαντικό συστατικό του καρδιακού ιστού. Η πρόσληψη του είναι σηµαντική για τη σωστή ανάπτυξη του εγκεφάλου. Στα διάφορα είδη των µικροφυκών παρατηρούνται µεγάλες διαφορές, όσον αφορά στη σύσταση σε λιπαρά οξέα των λιπιδίων. Η σύσταση είναι εξειδικευµένη ανά είδος και επηρεάζεται από τις συνθήκες καλλιέργειας και από φυσικούς παράγοντες. Τα µικροφύκη προσαρµόζονται στις νέες περιβαλλοντικές συνθήκες και αυτό αντικατοπτρίζεται στη ποικιλία των λιπιδίων τους και στην ικανότητά τους να συνθέτουν σπάνιες ενώσεις (Guschina & Harwood, 2006). Ο κύριος παράγοντας που επηρεάζει τη σύσταση των µικροφυκών σε λιπαρά οξέα είναι η θερµοκρασία, γιατί ορίζει τη µεταβολική οδό της σύνθεσης των λιπαρών οξέων της ω-3 οικογένειας. Γενικά, η ακορεστότητα των λιπαρών οξέων αυξάνει µε την πτώση της θερµοκρασίας και αυτό αποτελεί τον κύριο µηχανισµό της ρευστότητας των µεµβρανών στα µικροφύκη (Guschina & Harwood, 2009). 11

13 Α.4. Ο ανταγωνισµός των µικροφυκών στις µικτές καλλιέργειες Το ενδιαφέρον για τη µαζική καλλιέργεια µικροφυκών ως πηγή πρωτεΐνης ξεκίνησε τη δεκαετία του 50. Το έργο αυτό συνεχίστηκε από τον Oswald ο οποίος ανέπτυξε δεξαµενές υψηλής απόδοσης (high-rate ponds) ως µέσο για την παραγωγή πρωτεϊνών από φύκη και την ταυτόχρονη επεξεργασία λυµάτων. Ο Goldman συνέχισε την προσπάθεια αυτή χρησιµοποιώντας νερά από λύµατα αναµεµιγµένα µε θαλασσινό νερό για την ανάπτυξη θαλάσσιων µικροφυκών, που χρησιµοποιούνταν ως πηγή τροφής για την καλλιέργεια εκτρεφόµενων θαλάσσιων ζώων. Επειδή, δεν έχουν όλα τα είδη των φυκών την ίδια διατροφική αξία για τα ζώα που εκτρέφονται, τα είδη που κυριαρχούν στις ανοικτές καλλιέργειες είναι τόσο σηµαντικά όσο και η παραγωγικότητα της βιοµάζας των µικροφυκών. Η ανάγκη για την καλλιέργεια συγκεκριµένων ειδών θαλάσσιων µικροφυκών στις υδατοκαλλιέργειες έχει οδηγήσει σε µελέτες σχετικά µε τους παράγοντες που επηρεάζουν τον ανταγωνισµό των ειδών σε µια µικτή καλλιέργεια. Το αυξανόµενο ενδιαφέρον για την εµπορική καλλιέργεια συγκεκριµένων ειδών µικροφυκών απαιτεί τη µεγιστοποίηση της παραγωγικότητας της βιοµάζας αλλά επιπλέον απαιτεί να παραµένουν κυρίαρχα τα επιθυµητά είδη στις καλλιέργειες. Ο µόνος πρακτικός και οικονοµικός τρόπος για τον έλεγχο των κυρίαρχων ειδών στις ανοιχτές καλλιέργειες είναι να δηµιουργηθούν οι συνθήκες που δίνουν το πλεονέκτηµα σε συγκεκριµένα είδη να κυριαρχούν. Μερικοί από τους παράγοντες που αναµένεται να επηρεάσουν την κυριαρχία των ειδών είναι: ο θρεπτικός περιορισµός, η µέση θερµοκρασία, η αλατότητα, και η µέση ένταση του φωτός. Τα τελευταία χρόνια γίνονται προσπάθειες για την πρόβλεψη των αποτελεσµάτων του ανταγωνισµού µεταξύ των ειδών για τις διαφορετικές απαιτήσεις των ανταγωνιστικών ειδών στους περιοριστικούς παράγοντες. Η απαίτηση ενός είδους στους πόρους ορίζεται ως το ποσό που ένα είδος χρειάζεται προκειµένου να έχει έναν ρυθµό ανάπτυξης ίσο µε το ποσοστό απώλειάς του σε µια συνεχή καλλιέργεια. Όταν πολλά είδη ανταγωνίζονται για τον ίδιο περιοριστικό παράγοντα µειώνεται το επίπεδο αυτού στο περιβάλλον µέχρι να επιζήσουν µόνο τα είδη µε τις χαµηλότερες απαιτήσεις στον παράγοντα αυτό. Τα κυρίαρχα είδη σε µια καλλιέργεια µπορεί να είναι 1-3 και κυριαρχούν σε σταθερή κατάσταση ανεξάρτητα από 12

14 τις αρχικές συνθήκες. Ο πιο καθοριστικός παράγοντας για τη κυριαρχία των ειδών είναι η θερµοκρασία. Οι διάφοροι ρυθµοί αραίωσης δεν έχουν επίδραση στην κυριαρχία των ειδών. Α.5. Οι υδατοκαλλιέργειες στην Ελλάδα Στην Ελλάδα οι υδατοκαλλιέργειες ξεκίνησαν το 1951 στον Ιχθυογεννητικό Σταθµό στις πηγές του Λούρου και αρχικά πραγµατοποιούσαν εκκόλαψη εισαγόµενων γονιµοποιηµένων αυγών. Το 1965 ιδρύθηκε ο κρατικός Ιχθυογεννητικός Σταθµός στην Έδεσσα, όπου σκοπό είχε την παραγωγή γόνου πέστροφας, τον εµπλουτισµό λιµνών και ποταµών και την εκπόνηση ερευνητικών προγραµµάτων σχετικά µε τη διατροφή. Στη συνέχεια, κατασκευάστηκαν µικρές ιδιωτικές ιχθυοκαλλιεργητικές µονάδες, και µε την πάροδο του χρόνου υπήρξε µεγαλύτερη ανάπτυξη και δηµιουργήθηκε πλήθος µονάδων που χαρακτηρίζονταν από τον εξαγωγικό τους χαρακτήρα (το 70-80% της παραγωγής εξάγεται σε αγορές της Ευρώπης). Τη δεκαετία του 80 άρχισαν να δηµιουργούνται οι πρώτες µονάδες εκτροφής ψαριών στη θάλασσα και να κατασκευάζονται οι πρώτοι ιχθυογεννητικοί σταθµοί, και από τη δεκαετία του 90 αυξάνεται η παραγωγή της τσιπούρας, του λαβρακιού και του γόνου µέχρι που έφτασε να κατέχει την πρώτη θέση στην ευρωπαϊκή αγορά. Τα κυριότερα είδη που εκτρέφονται σε αλµυρά νερά είναι τα τροχόζωα (ζωοπλαγκτόν), οι γαρίδες, και τα δίθυρα µαλάκια (στρείδια, µύδια). Τα περισσότερα ζώα συλλέγονται από το φυσικό τους περιβάλλον και µετά εκτρέφονται σε υδατοκαλλιέργειες για το υπόλοιπο της ζωής τους. Επιπλέον, τα ζώα που εκτρέφονται σε υδατοκαλλιέργειες µπορεί να αφεθούν ελεύθερα στο φυσικό τους περιβάλλον και στη συνέχεια να επανασυλληφθούν σε µονάδες εκτροφής. Η µέση κατανάλωση ιχθύων στη Μεσόγειο είναι ανάλογη της παγκόσµιας κατανάλωσης (18 kg/ανά άτοµο/ανά έτος), αλλά µε σηµαντικές διαφορές κατά τόπους. Η συνολική κατανάλωση στη Μεσόγειο αντιστοιχεί σε τιµή της τάξης των 3 εκατ. τόνων. Α.6. Υδατοκαλλιέργειες τροχοζώων Τα τροχόζωα παρέχονται ως τροφή στις προνύµφες των ψαριών. Επιλέγονται λόγω της διαθεσιµότητάς τους σε µεγάλες ποσότητες, του µεγέθους τους, που είναι όσο το άνοιγµα 13

15 του στόµατος των προνυµφών των ψαριών (Lubzens et al., 2001), της περιορισµένης µετατόπισης και της αδιάκοπης κίνησης που εξυπηρετεί τις προνύµφες οι οποίες παρουσιάζουν περιορισµένη κινητικότητα (Κladas, 2006). Η βιοσύνθεση των λιπιδίων των τροχοζώων εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από την τροφή που καταναλώνουν, υποδεικνύοντας ότι τα λιπαρά οξέα, αφού απελευθερωθούν µέσω υδρόλυσης των τριγλυκεριδίων στο έντερο, απορροφώνται, καταβολίζονται και τέλος ενσωµατώνονται στο µόριο των φωσφολιπιδίων. Οι κλασικές εντατικές καλλιέργειες τροχοζώων, που χρησιµοποιούν ως θρεπτικό µέσο βιοµηχανική τροφή, υφίστανται συχνά µη προβλέψιµες και ολικές θνησιµότητες που προκαλούν σοβαρά προβλήµατα στη διαχείριση της θρέψης των ιχθυονυµφών. Οι καλλιέργειες τροχοζώων (Kentouri et al. 1993, Bengoa-Ruigomez et al. 1995, Bengoa-Ruigomez et al. 1997) σε συνθήκες "άνθισης" φυτοπλαγκτού δεν υφίστανται τέτοιου είδους προβλήµατα και επιπλέον η ποιότητα αυτής της τροφικής αλυσίδας θεωρείται άριστη για τις νύµφες. Όµως, τόσο η παραγωγή όσο και ο απαιτούµενος χρόνος ενδέχεται να αποτελέσουν περιοριστικό παράγοντα στην οικονοµική αποτελεσµατικότητα των µονάδων εκτροφής. Έχουν αναπτυχθεί νέες τεχνολογίες καλλιέργειας τροχοζώων βασισµένες αποκλειστικά σε µικροφύκη προερχόµενα από ηλιακό φωτοβιοαντιδραστήρα, η οποία παράγει 800 λίτρα καλλιέργειας, συγκέντρωσης 600 τροχοζώων/ml σε χρονικό διάστηµα µικρότερο των 11 ηµερών, χωρίς ουδεµία προσθήκη τεχνητής τροφής. O µηχανισµός και οι συνθήκες παραγωγής των τροχοζώων περιγράφονται σε σχέση µε την αξιοπιστία, τη µέγιστη παραγωγή, το ελάχιστο κόστος και τη διάρκεια της "άνθισης". H ανάπτυξη νέων τεχνολογιών, όπως της παραγωγής φυτοπλαγκτού σε ηλιακούς φωτοβιοαντιδραστήρες (Bengoa-Ruigomez et al., 1999), η οποία συνδυάζει την υπερεντατική παραγωγή µικροφυκών (πυκνότητα κυττάρων δεκαπλάσια αυτής που επιτυγχάνεται µε τις κλασικές µεθόδους) και τη σηµαντική µείωση του κόστους παραγωγής του, φέρει στο προσκήνιο νέα δεδοµένα για την ταχεία και µαζική παραγωγή τροχοζώων υψηλής ποιότητας. Α.7. Υδατοκαλλιέργειες γαρίδων Αρχικά η καλλιέργεια γίνεται σε εσωτερικό χώρο µε ελεγχόµενες συνθήκες. Μετά την ανάπτυξη των προνυµφών, τα νεαρά άτοµα µεταφέρονται σε εξωτερικούς χώρους (λίµνη). Το 50% της τροφής που καταναλώνεται από τις γαρίδες προέρχεται από τη 14

16 πρωτογενή παραγωγικότητα της υδατοδεξαµενής αυτής. Σε εντατικές υδατοκαλλιέργειες, η λίπανση µε θρεπτικά συστατικά ενισχύει τις ανθίσεις των φυκών. Η αύξηση της παραγωγικότητας των µικροφυκών µπορεί να προκαλέσει ανοξικό περιβάλλον και θνησιµότητα στα ζώα. Επίσης, τα αποξηραµένα φύκη αποτελούν µια καλή και φθηνή διατροφική επιλογή. Α.8. Υδατοκαλλιέργειες διθύρων µαλακίων Η καλλιέργεια των νεαρών διθύρων πραγµατοποιείται µε ελεγχόµενες συνθήκες σε εκβολές ή σε παράκτια περιβάλλοντα. Ο φυσικός πληθυσµός του φυτοπλαγκτού παρέχει τροφή στα δίθυρα µέχρι να φτάσουν σε εµπορικό µέγεθος (περίπου πέντε χρόνια ανάλογα µε το είδος και την τοποθεσία). Τα µικρά ζώα πρέπει να προστατεύονται από τους θηρευτές είτε σε κλωβούς είτε σε δίχτυα είτε σε περιφραγµένες περιοχές χωρίς θηρευτές. Η τεχνολογία επώασης, γέννησης και εκτροφής των µικρών νεαρών στρειδιών και µυδιών είναι επαρκώς ανεπτυγµένη. Κατά την εκκόλαψη η προνύµφη τρέφεται µε µικροφύκη σε ελεγχόµενες συνθήκες. Καθώς τα ζώα αυξάνονται σε µέγεθος, η κατανάλωση των µικροφυκών αυξάνεται εκθετικά. Α.9. Κατάταξη συστηµάτων εκτροφής Ανάλογα µε την πυκνότητα εκτροφής (ιχθυοφόρτιση) τα συστήµατα εκτροφής κατατάσσονται σε: α. Εκτατικά β. Ηµιεκτατικά (µεσόκοσµοι) (2-8 νύµφες/λίτρο) γ. Ηµιεντατικά (30-50 νύµφες/λίτρο) δ. Εντατικά ( νύµφες/λίτρο) e.υπερεντατικά ( νύµφες/λίτρο). Τα υπερεντατικά συστήµατα αποτελούν το 90% της συνολικής παραγωγής (Kentouri et al. 1993). Τα εκτατικά και οι µεσόκοσµοι είναι συστήµατα για είδη ψαριών που δεν είναι γνωστές οι διατροφικές προτιµήσεις και απαιτήσεις τους. Ανάλογα µε το µέσο εκτροφής, τα συστήµατα εκτροφής κατατάσσονται σε: Φυσικά: Φυσική Φωτοπερίοδος και Θερµοπερίοδος 15

17 Ελεγχόµενα: Απόλυτος έλεγχος της θερµοκρασίας και του φωτός Μικτά: Συνδυασµός φυσικών και ελεγχόµενων συνθηκών Ανάλογα µε την προέλευση της τροφής, τα συστήµατα εκτροφής κατατάσσονται σε: Ενδογενή: Η τροφική αλυσίδα αναπτύσσεται µέσα στη δεξαµενή Εξωγενή: Προσθήκη εκτρεφόµενου πλαγκτού σε ηµερήσια βάση Μικτά (2 τύποι): - µε ενδογενή τροφική αλυσίδα και µε καθηµερινή προσθήκη εξωγενούς τροφής - µε καθηµερινή προσθήκη εξωγενούς τροφής που αναπαράγεται µέσα στη δεξαµενή εκτροφής των νυµφών και καταναλώνεται από αυτές Ανάλογα µε τον τύπο του περιβάλλοντος (νερού), τα συστήµατα εκτροφής κατατάσσονται σε: Συστήµατα µε διαυγές νερό: Χρήση φυσικού θαλασσινού νερού χωρίς την προσθήκη µικροφυκών. Συστήµατα µε πράσινο νερό (green water): Χρήση ενδογενούς άνθισης µικροφυκών του τοπικού φυτοπλαγκτού. Συστήµατα µε ψευδοπράσινο νερό (pseudogreen water): Καθηµερινή προσθήκη φυτοπλαγκτού από καθαρά στελέχη µικροφυκών εντατικής καλλιέργειας. Συστήµατα µε νεοπράσινο νερό: Καθηµερινή προσθήκη «πάστας» συντηρηµένων µικροφυκών ((Kentouri et al. 1993). Ανάλογα µε τον τύπο του κυκλώµατος του νερού, τα συστήµατα εκτροφής κατατάσσονται σε: Κλειστά: Ανανέωση < 2% κάθε ηµέρα Ανοικτά: Ανανέωση > 5% ανά ώρα Ανακυκλούµενα: Ανακύκλωση του 10-30% ανά ώρα. Ανανέωση < 2% κάθε ηµέρα. Α.9.1. Εκτατικές µέθοδοι Η παραγωγικότητα (0.1-1νύµφες /λίτρο) εξελίσσεται µε φυσικό τρόπο και βασίζεται στη δυναµική των συστηµάτων εκτροφής. Υπάρχουν δύο τύποι, ανάλογα µε τη προέλευση της τροφικής αλυσίδας (Kentouri et al. 1993): Η θαλάσσια τροφική αλυσίδα, που είναι ικανοποιητική για όλα τα είδη, αλλά απαιτεί µεγάλους όγκους νερού και παρουσιάζει χαµηλή παραγωγικότητα, και το «πράσινο νερό», που είναι ικανοποιητικό για πολλά 16

18 είδη. Η µέθοδος µε το «πράσινο νερό» αρχικά λειτουργεί εύκολα, αλλά µετά την 25 η µέρα αρχίζουν λειτουργικά προβλήµατα. Είναι χρήσιµη κυρίως σε περιπτώσεις έλλειψης τροχοζώων. Α.9.2. Ηµιεντατικές τεχνικές Μπορούν να εφαρµοστούν µε διαυγές νερό σε ανοιχτό ή κλειστό κύκλωµα, που είναι κατάλληλο για περιορισµένο αριθµό ειδών, µε ψευδοπράσινο νερό σε ηµίκλειστο κύκλωµα κατάλληλο για πολλά είδη ή µε πράσινο νερό σε κλειστό κύκλωµα, που είναι κατάλληλο για πολλά είδη στην αρχή, αλλά από την η ηµέρα υπάρχουν λειτουργικά προβλήµατα (Kentouri et al. 1993). Α.9.3. Τεχνικές µεσοκόσµων Υπάρχουν δύο φιλοσοφίες τεχνικών: Τεχνικές εκτατικής καλλιέργειας που χρησιµοποιούν φυσική τροφική αλυσίδα ή πράσινο νερό, και τεχνικές εντατικής καλλιέργειας µε διαυγές νερό ή ψευδοπράσινο νερό. Στην πρώτη περίπτωση η παραγωγικότητα είναι χαµηλή και υπάρχει εξάρτηση από το κλίµα και την εποχή, ενώ στη δεύτερη είναι αποτελεσµατική και µη εξαρτώµενη. Το πλεονέκτηµα είναι ότι αµφότερες οι τεχνικές είναι κατάλληλες για νέα και δύσκολα είδη και επιτυγχάνουν υψηλή επιβίωση (30-70%) και υψηλή ποιότητα γόνου (Kentouri, 1993). Α.9.4. Εντατικές-Υπερεντατικές τεχνικές Χρησιµοποιείται είτε διαυγές νερό, είτε ψευδοπράσινο. Ορισµένες φορές παρουσιάζονται σκελετικές παραµορφώσεις στα ψάρια εκτροφής (Kentouri et al. 1993). Α.10. Τύποι Καλλιέργειας Φυκών Τα συστήµατα καλλιέργειας φυκών µπορεί να είναι µαζικά σε πολύπλοκα συστήµατα µεγάλης έκτασης ή να είναι µικρής έκτασης. Στα µικρής έκτασης περιλαµβάνονται τα κλειστά συστήµατα (δοκιµαστικοί σωλήνες, φλάσκες, κύλινδροι, σακούλες) ή τα ανοικτά (σακούλες, δεξαµενές). Οι καλλιέργειες µπορεί να είναι µονοκαλλιέργειες και να αποτελούνται µόνο από ένα στέλεχος ή πολυκαλλιέργειες µε πολλά στελέχη. 17

19 Α Εσωτερικού/Εξωτερικού χώρου Σχετικά µε την καλλιέργεια µικροφυκών, ο πιο συνηθισµένος τρόπος είναι εσωτερικά στο εργαστήριο σε απόλυτα ελεγχόµενες και ασηπτικές συνθήκες (θερµοκρασία, θρεπτικά επίπεδα, φωτισµός, µόλυνση µε θηρευτές και ανταγωνιστικά φύκη). Η µέθοδος αυτή προσφέρει τη µέγιστη παραγωγικότητα ανά µονάδα επιφάνειας λόγω του ελέγχου των συνθηκών της δεξαµενής (Hanisak 1987, Oliveira et al. 2000). Οι καλλιέργειες εξωτερικού χώρου µπορεί να είναι µαζικές µεγάλης κλίµακας, σε πολύπλοκα συστήµατα σηµαντικής έκτασης. Οι υπαίθριες δεξαµενές είναι ανοιχτά συστήµατα συνεχούς καλλιέργειας µε ταχεία και φθηνή παραγωγή τεράστιας βιοµάζας. Το µειονέκτηµα είναι η αδυναµία αποφυγής µολύνσεων και ο περιορισµένος έλεγχος των αβιοτικών παραγόντων. εικ.1: καλλιέργειες εξωτερικού χώρου (πηγή: Α.10.2 Αξενική/Ξενική καλλιέργεια Οι αξενικές καλλιέργειες περιέχουν µόνο ένα στέλεχος και δεν έχουν ξένους οργανισµούς, π.χ. βακτήρια και άλλες µολύνσεις. Η µέθοδος αυτή απαιτεί αυστηρή αποστείρωση της κωνικής φιάλης, του µέσου καλλιέργειας και των σωλήνων για την αποφυγή µολύνσεων κατά τη διάρκεια της ανακαλλιέργειας. Ορισµένες φορές γίνεται και χρήση αντιβιοτικών. Α Ασυνεχής/Συνεχής/Ηµισυνεχής καλλιέργεια 18

20 Η ασυνεχής καλλιέργεια είναι η πιο εύκολη κι η πιο αξιόπιστη, αλλά δεν είναι ιδιαιτέρως αποδοτική και η ποιότητα των αποτελεσµάτων της µπορεί να µην είναι σταθερή. Η συνεχής καλλιέργεια είναι η πιο αποδοτική, παρέχει σταθερά κύτταρα υψηλής ποιότητας και αυτοµατισµό. Οι ρυθµοί παραγωγής είναι αυξηµένοι για µεγάλη χρονική περίοδο. Παρά ταύτα είναι η πιο δύσκολη τεχνική καλλιέργειας, το κόστος και η πολυπλοκότητα είναι αυξηµένα, και καλλιεργούνται µόνο µικρές ποσότητες φυκών. Η ηµισυνεχής καλλιέργεια είναι αρκετά αποδοτική και εύκολη, αλλά είναι λιγότερο αξιόπιστη από τη συνεχή. Α.11. Ασυνεχής καλλιέργεια Η ασυνεχής καλλιέργεια αποτελείται από µια συγκεκριµένη ποσότητα στελέχους (εµβόλιο) και συγκεκριµένη ποσότητα θρεπτικού µέσου. Ακολουθεί µια περίοδος ανάπτυξης αρκετών ηµερών χωρίς την προσθήκη θρεπτικών ή την ανανέωση του µέσου. Η συγκοµιδή πραγµατοποιείται όταν ο πληθυσµός των φυκών φθάσει στη µέγιστη πυκνότητα, κατά την έναρξη της στατικής φάσης. Τα φύκη µεταφέρονται σε µεγαλύτερες ποσότητες καλλιέργειας πριν φτάσουν στη στατική φάση. Ύψιστης σηµασίας είναι η σταθερότητα των αβιοτικών παραµέτρων και η πυκνότητα των κυττάρων. Σύµφωνα µε τη συγκέντρωση των φυκών, ο όγκος του εµβολίου, ο οποίος αντιστοιχεί γενικά µε τον όγκο του προηγούµενου σταδίου της διαδικασίας αναβάθµισης, ανέρχεται σε 2-10% του τελικού όγκου της καλλιέργειας. Αν απαιτούνται µικρές ποσότητες φυκών, υπάρχει ένας απλός τύπος εσωτερικής καλλιέργειας που χρησιµοποιεί γυάλινες ή πλαστικές δεξαµενές λίτρων, οι οποίες στερεώνονται σε ράφια και φωτίζονται µε οπίσθιο φωτισµό φθορισµού (εικ.2). εικ.2: Σύστηµα µε γυάλινες δεξαµενές καλλιέργειας σε ράφια, µε οπίσθιο φωτισµό και αερισµό (Fox, 1983) 19

21 Τα συστήµατα ασυνεχούς καλλιέργειας εφαρµόζονται ευρέως λόγω της απλότητας και της ευελιξίας τους. Επιτρέπουν την εναλλαγή των ειδών και την ταχεία αποκατάσταση των µειονεκτηµάτων του συστήµατος. Παρόλο που συχνά θεωρείται ως η πλέον αξιόπιστη µέθοδος, δεν είναι απαραίτητα και η πιο αποτελεσµατική. Οι ασυνεχείς καλλιέργειες συλλέγονται αµέσως πριν την έναρξη της στατικής φάσης και έτσι πρέπει να διατηρούνται για µεγάλο χρονικό διάστηµα πέρα από τον µέγιστο ειδικό ρυθµό ανάπτυξης. Επίσης, η ποιότητα των κυττάρων που συλλέγονται µπορεί να είναι λιγότερο προβλέψιµη από ό,τι σε συστήµατα συνεχούς καλλιέργειας. Ενδέχεται, για παράδειγµα, να ποικίλουν ανάλογα µε τη χρονική στιγµή της συγκοµιδής (ώρα συγκοµιδής και φάση ανάπτυξης). Ένα άλλο µειονέκτηµα είναι η ανάγκη αποφυγής της µόλυνσης κατά τη διάρκεια του αρχικού εµβολιασµού και της πρώιµης περιόδου ανάπτυξης. Επίσης, οι συγκεντρώσεις των θρεπτικών ουσιών κυµαίνονται από επίπεδα λιµού (πείνας), µόλις πριν τη συγκοµιδή, σε επίπεδα που αναφέρονται ως τοξικά, τη στιγµή του εµπλουτισµού µε νέο µέσο (Guillard και Ryther, 1962). Συνεπώς, η ασυνεχής διαδικασία συγκοµιδής δεν είναι απαραίτητα ευνοϊκή για τη βέλτιστη παραγωγικότητα των φυκών. Τέλος, η ασυνεχής καλλιέργεια απαιτεί κόπο για τη συγκοµιδή, τον καθαρισµό, την αποστείρωση, την αναπλήρωση και τον εµβολιασµό. α β εικ.3: α. Συστήµατα ασυνεχούς καλλιέργειας για τη µαζική παραγωγή µικροφυκών σε κυλινδρικές δεξαµενές των 150 λίτρων( πηγή: ) β. Συστήµατα ασυνεχούς καλλιέργειας για τη µαζική παραγωγή µικροφυκών σε δεξαµενές των λίτρων ( πηγή: ) 20

22 Α.12. ιαδοχική Αναβάθµιση Αν όλοι οι παράγοντες παραµένουν υπό άριστες συνθήκες τότε το σύστηµα της καλλιέργειας αποδίδει τη µέγιστη παραγωγή βιοµάζας. Αν το σύστηµα περιορίζεται τότε τα κύτταρα επιβραδύνουν την αύξηση τους είτε την ελαχιστοποιούν. Αυτό έχει επιπτώσεις και στη ταχύτητα αύξησης και στη φυσιολογική κατάσταση (αντοχή). Αν οι συνθήκες είναι οι πλέον άριστες τότε τα κύτταρα είτε µεγεθύνονται λόγω αποταµίευσης και συνεπώς επιβραδύνεται η αύξηση και µεταβάλλεται η βιοχηµική τους σύσταση, είτε απεκκρίνουν στο καλλιεργητικό µέσο το επιπλέον προϊόν της φωτοσύνθεσης. Αυτό έχει ως συνέπεια την επιβράδυνση και τη µετατροπή του περιβάλλοντος σε ακατάλληλο. Οι καλλιέργειες που αναπτύσσονται υπό άριστες συνθήκες σε συστήµατα που προάγουν υψηλές συγκεντρώσεις, είναι σε οριακή φυσιολογική κατάσταση. Η παραµικρή απόκλιση κάποιου παράγοντα οδηγεί σε κατάρρευση. Για να αποκτηθούν καλλιέργειες µεγάλου όγκου γίνεται διαδοχική αναβάθµιση µικρότερων όγκων (εικ. 4). Η κατάλληλη στιγµή για την αναβάθµιση εξαρτάται από την ανεκτικότητα του στελέχους. Ο εκάστοτε όγκος του εµβολίου κυµαίνεται από 5-25% του τελικού όγκου. Με τα µικρά εµβόλια αποφεύγονται οι λανθάνουσες φάσεις, ενώ µε τα µεγάλα εµβόλια αποφεύγονται οι καταρρεύσεις. Σε όλα τα στάδια απαιτούνται κατάλληλα θρεπτικά µέσα (Walne medium σε καθαρό νερό) και ηµιασηπτικές συνθήκες. εικ.4: ιαδοχική αναβάθµιση από 250ml εώς και περισσότερο από 50l (πηγή: 21

23 Α.13. Συνεχής καλλιέργεια Η µέθοδος της συνεχούς καλλιέργειας επιτρέπει τη διατήρηση των καλλιεργειών πολύ κοντά στον µέγιστο ρυθµό ανάπτυξης. Ο όγκος της δεξαµενής παραµένει σταθερός, ενώ το µέσο ανανεώνεται συνεχώς µε διάφορους ρυθµούς επιτυγχάνοντας έτσι και την ανανέωση των θρεπτικών. Στη συνεχή καλλιέργεια, η παροχή του εµπλουτισµένου θαλασσινού νερού διοχετεύεται συνεχώς σε έναν θάλαµο ανάπτυξης, ταυτόχρονα η περίσσεια της καλλιέργειας εκπλύνεται και γίνεται η συγκοµιδή της βιοµάζας. Όταν επιτυγχάνεται δυναµική ισορροπία, όλο το νέο υλικό µετατρέπεται σε βιοµάζα και η συγκέντρωση στο δοχείο της καλλιέργειας παραµένει σταθερή. Ο Laing (1991) περιγράφει την κατασκευή και τη λειτουργία ενός συστήµατος συνεχούς καλλιέργειας κατάλληλο για τα είδη Tetraselmis suecica και Isochrysis galbana. Οι δεξαµενές καλλιέργειας αποτελούνται από σωλήνες πολυαιθυλενίου εσωτερικού φωτισµού που υποστηρίζονται από ένα µεταλλικό πλαίσιο. Αυτό το σύστηµα παράγει λίτρα ηµερησίως σε πυκνότητες κυττάρων που παρέχουν τη βέλτιστη απόδοση για κάθε είδος. Ένα σύστηµα που είναι σχετικά φθηνό και εύκολο στη κατασκευή χρησιµοποιείται από την Seasalter Shellfish Co. (εικ. 5). Η κατασκευή αυτή µπορεί ν απασχολεί κατακόρυφους πολυαιθυλενικούς σάκους 400 λίτρων για την ανάπτυξη ειδών όπως τα Pavlova lutheri, Isochrysis galbana, Tetraselmis suecica, Phaeodactylum tricornutum, Dunaliella tertiolecta, Skeletonema costatum. Ένα µειονέκτηµα του συστήµατος είναι η µεγάλη διάµετρος των πολυαιθυλενικών σάκων (60 cm), που οδηγεί στην αυτο-σκίαση και ως εκ τούτου, στη σχετικά χαµηλή πυκνότητα των φυκών. εικ.5: Συνεχής καλλιέργεια µικροφυκών σε πλαστικά δοχεία. Στα δεξιά της εικόνας φαίνεται η εισροή του εµπλουτισµένου θαλασσινού νερού και η εκροή της καλλιέργειας (πηγή: 22

24 εικ.6: ιαδικασία συνεχούς καλλιέργειας µικροφυκών (πηγή: pirun.ku.ac.th) Τα µειονεκτήµατα του συστήµατος συνεχούς καλλιέργειας είναι το σχετικά υψηλό κόστος και η πολυπλοκότητά του. Οι απαιτήσεις για σταθερό φωτισµό και θερµοκρασία περιορίζουν ως επί το πλείστον τα συνεχή συστήµατα εσωτερικού χώρου και αυτό είναι εφικτό µόνο για σχετικά µικρές κλίµακες παραγωγής. Ωστόσο, η συνεχής καλλιέργεια έχει το πλεονέκτηµα της παραγωγής φυκών προβλέψιµης ποιότητας. Επιπλέον, είναι δεκτική µέθοδος στον τεχνολογικό έλεγχο και τον αυτοµατισµό, γεγονός που αυξάνει την αξιοπιστία του συστήµατος και µειώνει την ανάγκη για εργασία. Α.14. Φωτοβιοαντιδραστήρες Είναι κλειστά συστήµατα συνεχούς καλλιέργειας. Πραγµατοποιούνται µεγάλες συγκεντρώσεις κυττάρων και υπάρχει η δυνατότητα µαζικής παραγωγής συγκεκριµένων βιοενεργών ουσιών χωρίς απώλειες CO 2. Γίνεται έλεγχος των συνθηκών καλλιέργειας και ελαχιστοποιούνται οι µολύνσεις των καλλιεργειών. Ένας τυπικός βιοαντιδραστήρας χωρίζεται σε τρία µέρη: την υγρή φάση που αποτελείται από το θρεπτικό µέσο, τη στερεά φάση που αποτελείται από τα κύτταρα της καλλιέργειας, και την αέρια φάση. Το φως ίσως να αποτελεί την τέταρτη φάση. Οι διαφορετικές απαιτήσεις των κυττάρων ως προς τις συνθήκες καλλιέργειας και την αξία των προϊόντων που παράγονται, είχε ως αποτέλεσµα την ανάπτυξη διαφόρων τύπων βιοαντιδραστήρων (σωληνοειδείς, επίπεδοι, αεροαναδευόµενοι). Ένας άλλος τύπος βιοαντιδραστήρα είναι της πλήρους αναµίξεως µε σκοπό την καλλιέργεια µικροφυκών αυτοτροφικά µε τεχνητές πηγές φωτισµού (Xu et al., 2009). Τέλος, υπάρχουν ο βιοαντιδραστήρες πολυαιθυλενίου µιας χρήσης µε χαµηλό κόστος για κλειστές καλλιέργειες (Scott et al., 2010). O φωτισµός των βιοαντιδραστήρων βιοµηχανικής κλίµακας γίνεται είτε µε ηλιακό φως, είτε µε φθορίζουσες ή άλλου τύπου 23

25 λάµπες. Το µειονέκτηµα των συστηµάτων αυτών είναι το υψηλό κόστος παραγωγής και λειτουργίας. Τα πλεονεκτήµατα είναι: -η ελαχιστοποίηση των µολύνσεων -ο έλεγχος των συνθηκών καλλιέργειας -η αποφυγή της εξάτµισης -η αποφυγή των απωλειών του CO2 -οι υψηλές συγκεντρώσεις κυττάρων -η δυνατότητα µαζικής παραγωγής συγκεκριµένων βιοενεργών ουσιών εικ.7: Βιοαντιδραστήρες πολυαιθυλενίου µίας χρήσης 300 L. Plagton S.A. Α.15. Ηµισυνεχής καλλιέργεια Στην ηµισυνεχή καλλιέργεια, ένα µέρος του όγκου ανανεώνεται συνεχώς µε φρέσκο υλικό σε διαφορετικούς ρυθµούς επιτυγχάνοντας έτσι και την ανανέωση των θρεπτικών. Η καλλιέργεια εµβολιάζεται σε σταθερό όγκο κι όταν αποκτήσει ικανοποιητική συγκέντρωση ένα µέρος ανανεώνεται µε φρέσκο θρεπτικό µέσο σε ηµερήσια βάση. Όταν επιτευχθεί δυναµική ισορροπία όλο το νέο υλικό µετατρέπεται σε βιοµάζα και η συγκέντρωση στο δοχείο καλλιέργειας τη στιγµή της συγκοµιδής είναι ίση µε αυτή της προηγούµενης συγκοµιδής. Η συγκοµιδή υφίσταται διαχείριση όπως και στην ασυνεχή καλλιέργεια. Οι ηµισυνεχείς καλλιέργειες µπορεί να πραγµατοποιούνται σε εσωτερικό ή εξωτερικό χώρο, αλλά συνήθως η διάρκειά τους είναι απρόβλεπτη. Μετά από κάποιο χρονικό διάστηµα, ανταγωνιστές, θηρευτές, προσµείξεις και µεταβολίτες καθιστούν τη καλλιέργεια ακατάλληλη για περαιτέρω χρήση. 24

26 Α.16. υναµική των πληθυσµών στις καλλιέργειες εικ.8: ιάγραµµα δυναµικής πληθυσµού των κυττάρων µιας καλλιέργειας Α Λανθάνουσα Φάση (lag phase) Η φάση αυτή, κατά την οποία συµβαίνει µικρή αύξηση της πυκνότητας των κυττάρων, είναι σχετικά µεγάλη όταν µια καλλιέργεια φυκών µεταφέρεται σε υγρή καλλιέργεια. Οι καλλιέργειες που εµβολιάζονται µε εκθετικά αυξανόµενα φύκη έχουν µικρής διάρκειας λανθάνουσες φάσεις, γεγονός που µπορεί να µειώσει τον απαιτούµενο χρόνο για την αναβάθµιση των καλλιεργειών. Η επαγωγή της αύξησης οφείλεται στη φυσιολογική προσαρµογή του κυτταρικού µεταβολισµού στην ανάπτυξη, όπως στην αύξηση των επιπέδων των ενζύµων και των µεταβολιτών που εµπλέκονται στην κυτταρική διαίρεση. Α Εκθετική φάση (exponential phase) Κατά τη δεύτερη φάση, η πυκνότητα των κυττάρων αυξάνεται ως συνάρτηση του χρόνου t, σύµφωνα µε µια λογαριθµική συνάρτηση: C t = C 0.e mt όπου C t και C 0 είναι οι συγκεντρώσεις των κυττάρων κατά τη χρονική στιγµή t και 0 αντιστοίχως και m ο ειδικός ρυθµός ανάπτυξης. Ο ειδικός ρυθµός ανάπτυξης εξαρτάται κυρίως από τα είδη των φυκών, την ένταση του φωτός, και τη θερµοκρασία. Α Φάση επιβράδυνσης (phase of declining relative growth) Η διαίρεση των κυττάρων επιβραδύνεται όταν τα θρεπτικά συστατικά, το φως, το ph, το διοξείδιο του άνθρακα ή άλλοι φυσικοί και χηµικοί παράγοντες αρχίζουν να περιορίζουν την ανάπτυξή τους. 25

27 Α Στατική φάση (stationary) Η πυκνότητα των κυττάρων είναι σχετικώς σταθερή. Ο περιοριστικός παράγοντας και ο ρυθµός ανάπτυξης είναι σε ισορροπία. Α Φάση θανάτου (death phase) Η φάση θανάτου µπορεί να προκληθεί από διάφορους παράγοντες όπως µείωση των θρεπτικών συστατικών, έλλειψη οξυγόνου, υπερθέρµανση, διαταραχή του ph, επιµόλυνση. Το κλειδί για την επιτυχία της παραγωγής φυκών είναι η διατήρηση των καλλιεργειών στην εκθετική φάση ανάπτυξης. Καθώς η καλλιέργεια είναι πέραν της φάσης επιβράδυνσης, η θρεπτική αξία των παραγόµενων φυκών είναι κατώτερη, λόγω της µειωµένης πεπτικής ικανότητας, της ανεπαρκούς σύνθεσης, και της πιθανής παραγωγής τοξικών µεταβολιτών. Α.17. Κύριες καλλιεργούµενες ταξινοµικές οµάδες Οι καλλιεργούµενοι οργανισµοί µπορεί να είναι θαλάσσιοι, λιµναίοι, µεταβατικών και υφάλµυρων υδάτων, αλλά και ακραιόφιλοι (θερµόφιλοι, ψυχρόφιλοι, οξεόφιλοι, αλκαλίφιλοι, αλόφιλοι). Οι κύριες ταξινοµικές οµάδες που µπορούν να καλλιεργηθούν είναι: Χλωροφύκη (Dunaliella, Tetraselmis, Chlorella) ιάτοµα (Phaeodactylum, Nitschia) ινοµαστιγωτά (Prorocentrum, Gymnodilium) Απτοφύκη (Pavlova) Ευστιγµατοφύκη Κυανοβακτήρια (Spirulina, Anabaena, Nostoc) Κρυπτοφύκη (Rhodomonas) Α.18. Ρυθµιστικές παράµετροι κατά την ανάπτυξη του ΝΑΒ Οι διάφορες παράµετροι που σχετίζονται µε την ανάπτυξη του ΝΑΒ µπορεί να είναι αλληλοεξαρτώµενες. Για παράδειγµα, µια παράµετρος που είναι βέλτιστη για ένα σύνολο 26

28 προϋποθέσεων δεν είναι απαραίτητα η βέλτιστη για ένα άλλο σύνολο. Οι πιο σηµαντικές παράµετροι για τη ρύθµιση της ανάπτυξης των φυκών είναι η ποσότητα και η ποιότητα των θρεπτικών, το φως, το ph, η αλατότητα, ο αερισµός και η θερµοκρασία. Παράµετροι Εύρος Βέλτιστη τιµή ph T ( C ) S (g/l) Lux (ένταση φωτός) L:D (φωτοπερίοδος h) 16:8 Α Φως Η ένταση του φωτός διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο, αλλά οι απαιτήσεις ποικίλλουν σε µεγάλο βαθµό σε σχέση µε το βάθος και την πυκνότητα της καλλιέργειας των µικροφυκών. Σε µεγαλύτερα βάθη και συγκεντρώσεις κυττάρων, η ένταση του φωτός πρέπει να αυξηθεί για να διεισδύσει στην καλλιέργεια (π.χ lux είναι κατάλληλη για φιάλες Erlenmeyer, απαιτείται για µεγαλύτερες ποσότητες). Το φως µπορεί να είναι φυσικό ή να παρέχεται τεχνητά από λαµπτήρες φθορισµού. Οι ευρύτερα χρησιµοποιούµενοι λαµπτήρες είναι συνήθως τύπου βιοµηχανικό άσπρο ή Warm white. Χρησιµοποιείται επίσης µε επιτυχία, ιδιαίτερα για τις καλλιέργειες σε µικρούς όγκους (0,5-50 λίτρα), φωτισµός τύπου flora. Σηµαντικοί παράγοντες στον φωτισµό είναι η ένταση του φωτός, η γωνία πρόσπτωσης, και το φάσµα εκπεµπόµενης ακτινοβολίας. Υπερβολικά υψηλή ένταση φωτός (π.χ. άµεσο ηλιακό φως, µικρό δοχείο κοντά στο τεχνητό φως) µπορεί να οδηγήσει σε φωτο-αναστολή. Πρέπει να αποφεύγεται η υπερθέρµανση που προκύπτει από συνδυασµό φυσικού και τεχνητού φωτισµού. Είναι σηµαντικός ο συνδυασµός µε τη θερµοκρασία για την αποφυγή της φωτοοξείδωσης (δυνατό φως και χαµηλή θερµοκρασία = καταστροφή). Υπό φυσιολογικές συνθήκες, η βέλτιστη ανάπτυξη του κάθε είδους αντιστοιχεί σε συγκεκριµένο φωτοπεριοδικό κύκλο. Ωστόσο, σε συνθήκες µαζικής παραγωγής, για να επιτευχθεί µια µέγιστη παραγωγή υπό σταθερές συνθήκες, η φωτεινή ενέργεια παρέχεται 24 ώρες την ηµέρα. To πολύ φως δεν ευνοεί τις καλλιέργειες στα πρώτα τους στάδια (τις 2-3 πρώτες ηµέρες) και πολύ περισσότερο όταν οι θερµοκρασίες είναι χαµηλές (< 20 C). Έτσι προτείνεται αρχικά η κάλυψη του φωτισµού µε κατάλληλη σίτα στις περιοχές που τοποθετούνται οι νέες 27

29 καλλιέργειες και η µετέπειτα αποκάλυψή τους όταν η καλλιέργεια γίνει πυκνότερη (2η- 3η ηµέρα). Α ph Το ph πρέπει να σταθεροποιείται σε επίπεδα όπου αποφεύγεται η καθίζηση και η αφαίρεση των θρεπτικών. Για τα περισσότερα καλλιεργούµενα είδη φυκών, το εύρος του ph είναι 7-9, µε τη βέλτιστη περιοχή να είναι Στην περίπτωση της υψηλής πυκνότητας της καλλιέργειας των µικροφυκών, η προσθήκη του διοξειδίου του άνθρακα επιτρέπει την αύξηση του ph, το οποίο µπορεί να φθάσει στις οριακές τιµές του 9, κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των φυκών. Το ph ρυθµίζεται µε ρυθµιστικά διαλύµατα (NaOH, HCl, Tris, HEPES). Α Αερισµός και διοξείδιο του άνθρακα Η παροχή αέρος εξυπηρετεί την ανάδευση του υγρού καλλιέργειας και τη µετατόπιση των φυκών ώστε να δέχεται ηλιακή ενέργεια όλη η βιοµάζα (Santelices & Doty 1989, Bird 1990, Oliveira & Alveal 1990). Η συνεχής ανακίνηση των καλλιεργειών γίνεται µε αντλία αερισµού που είναι τοποθετηµένη στο κέντρο του πυθµένα και µε ρυθµό 9 L/m ή L/m. Ο ρόλος της ανάµιξης µέσω αερισµού είναι η πρόληψη της καθίζησης των κυττάρων, η εξασφάλιση ότι όλα τα κύτταρα του πληθυσµού είναι εξίσου εκτεθειµένα στο φως και τα θρεπτικά συστατικά, η αποφυγή της θερµικής στρωµάτωσης (στις εξωτερικές καλλιέργειες), καθώς και η βελτίωση της ανταλλαγής αερίων µεταξύ του µέσου καλλιέργειας και του αέρος. Ο αέρας, µε τη µορφή του διοξειδίου του άνθρακα, περιέχει την πηγή άνθρακα για τη σωµατική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασµό των φυκών. Σε πολύ πυκνές καλλιέργειες, το CO 2 του αέρος (0,03% CO 2 ) που διοχετεύεται µέσω της καλλιέργειας περιορίζει την ανάπτυξη των φυκών, ενώ το καθαρό διοξείδιο του άνθρακα µπορεί να συµπληρωθεί µε την παροχή αέρος (π.χ. σε ποσοστό 15% του όγκου του αέρος). Η επιπλέον προσθήκη CO 2 ουδετεροποιεί το νερό από τις αλλαγές του ph ως αποτέλεσµα της CO 2 /HCO - 3 ισορροπίας. Ωστόσο, πρέπει να σηµειωθεί ότι δεν ανέχονται όλα τα είδη των φυκών έντονη ανάµειξη. Στην αρχή του δικτύου του αέρος είναι καλό να υπάρχει ένα φίλτρο µε «φυσίγγια» (cartridge filters) 0,45 µέτρα, για τον περιορισµό της βακτηριακής µόλυνσης. Η παροχή αέρος στο δίκτυο γίνεται υπό πίεση 28

30 0,4 bars. Ο αέρας εµπλουτίζεται µε CO2 σε ποσότητα ίση µε 2-3% επί της παροχής και εισάγεται στις καλλιέργειες µε τη βοήθεια γυάλινων σωλήνων µικρής διαµέτρου (συνήθως 4 mm). εδοµένων των συνθηκών καλλιέργειας, η προσθήκη του CO2 είναι απαραίτητη για την επίτευξη µεγάλων συγκεντρώσεων. Α Θερµοκρασία Η επιλογή υψηλής θερµοκρασίας (εντός των ορίων του κάθε είδους), αυξάνει την παραγωγικότητα, µειώνει όµως την αντοχή της καλλιέργειας στον χρόνο εξ αιτίας της ταυτόχρονης αύξησης των βακτηρίων. Οι υψηλές θερµοκρασίες απαιτούν λίγο µεγαλύτερη ένταση φωτός και το αντίστροφο. Φως και θερµοκρασία πρέπει να είναι σε ισορροπία µεταξύ τους. Η βέλτιστη θερµοκρασία για τις καλλιέργειες του φυτοπλαγκτού είναι µεταξύ 20 C και 24 C, αν και αυτό µπορεί να ποικίλλει ανάλογα µε τη σύνθεση του µέσου, των ειδών και των στελεχών της καλλιέργειας. Πιο συχνά καλλιεργούνται είδη µικροφυκών που ανέχονται θερµοκρασίες µεταξύ 16 C και 27 C. Οι θερµοκρασίες < 16 C επιβραδύνουν την ανάπτυξη, ενώ οι > 35 C είναι θανατηφόρες για ορισµένα είδη. Για τον αποτελεσµατικό έλεγχο της θερµοκρασίας, ο χώρος καλλιέργειας του φυτοπλαγκτού πρέπει να είναι θερµικά µονωµένος. Α Αλατότητα Το θαλάσσιο φυτοπλαγκτόν είναι εξαιρετικά ανεκτικό στις αλλαγές της αλατότητας. Τα περισσότερα είδη αναπτύσσονται καλύτερα σε ένα επίπεδο αλατότητας ελαφρώς χαµηλότερο από αυτό των βιοτόπων τους, το οποίο επιτυγχάνεται µε την αραίωση θαλασσινού νερού µε νερό βρύσης. Η βέλτιστη αλατότητα που αναγράφεται στη βιβλιογραφία είναι 25 ppt. Α Θρεπτικά συστατικά Παρά το διαφορετικό µέγεθος των µικροφυκών και των µακροφυκών, τα θρεπτικά στοιχεία που απαιτούνται για την ανάπτυξή τους είναι περίπου τα ίδια. Τα στοιχεία (σε σειρά σηµαντικότητας) C, H, O, N, P, Mg, Cu, Mn, Zn και Mo χαρακτηρίζονται ως απαραίτητα για την ανάπτυξη οποιουδήποτε φύκους (O Kelley 1974, DeBoer 1981). 29

31 Ύψιστης σηµασίας για την ανάπτυξη των φυκών είναι τα επίπεδα και οι αναλογίες των ανόργανων θρεπτικών (Ν:P:S) και κυρίως οι συγκεντρώσεις του αζώτου. Για τα διάτοµα σηµαντική είναι η πηγή πυριτίου. Τα θρεπτικά πρέπει να είναι ευκόλως διαλυτά, να προσλαµβάνονται άµεσα από τα φύκη και να υφίστανται σε µη περιοριστικές συγκεντρώσεις. Ορισµένα φύκη απαιτούν µικρές ποσότητες οργανικών ενώσεων για την ανάπτυξή τους, δηλ. βιταµίνες B12, B6, B1 (θειαµίνη), βιοτίνη. Το άζωτο, συνήθως, προστίθεται υπό µορφή ΝaΝΟ3 ή ΚΝΟ3. Ορισµένες φορές χρησιµοποιούνται άλλες πηγές αζώτου: 1- χλωριούχο αµµώνιο NH4Cl. 2- ουρία NH2CONH2 3- κρυσταλλικό θειικό αµµώνιο NH4HSO4 Οι προτεινόµενες αναλογίες των ανόργανων θρεπτικών σύµφωνα µε τις βιβλιογραφικές πηγές (De Pauw 1985, Mann & Ryther 1981, Dunstan & Tenore, 1972 ) είναι N: P: Si 6.5: 3.4: 1 ή 10:10:1 Υπάρχουν πολλά διαφορετικά θρεπτικά µέσα καλλιέργειας, τα οποία χρησιµοποιούνται για τον εµπλουτισµό (λίπανση) του φυσικού θαλασσινού νερού. Όλα χαρακτηρίζονται από την περιεκτικότητά τους κυρίως σε νιτρικά και φωσφορικά άλατα, σε µέταλλα και βιταµίνες. Κάθε διαφορετικό θρεπτικό µέσο έχει επινοηθεί για την κάλυψη των διαφορετικών αναγκών των διάφορων καλλιεργoύµενων ειδών πλαγκτού. Στη παρούσα εργασία χρησιµοποιείται το θρεπτικό µέσο Walne. Επιπρόσθετες παράµετροι που έχουν σηµασία για τη ρύθµιση της ανάπτυξης των φυκών: Α Μέσο καλλιέργειας Στις υγρές καλλιέργειες, ως µέσο καλλιέργειας χρησιµοποιείται γλυκό ή θαλασσινό νερό. Συνήθως χρησιµοποιείται δις απεσταγµένο νερό ή φιλτραρισµένο και αποστειρωµένο φυσικό νερό από την περιοχή της δειγµατοληψίας, διαλύµατα εµπλουτισµού µακροθρεπτικών (Ν,P,Si) και µικροθρεπτκών, καθώς και ρυθµιστικά διαλύµατα για τη ρύθµιση του ph (HCl, NaOH). Ως µέσο καλλιέργειας για τα φύκη επιλέγονται ειδικά κατασκευασµένες δεξαµενές, ή δοχεία καλλιέργειας για µικρότερης έκτασης 30

32 καλλιέργειες. Χρησιµοποιούνται γυάλινες φιάλες, κωνικές φιάλες, πλαστικές φιάλες, τρυβλία Petri, δοκιµαστικοί σωλήνες. Α Χρόνος παραµονής της καλλιέργειας O χρόνος παραµονής στην καλλιέργεια είναι µια ευµετάβλητη παράµετρος. Για να µεγιστοποιηθεί η αποδοτικότητα της µετατροπής της φωτεινής ενέργειας χρειάζεται να προσαρµοστεί η συγκέντρωση των φυκών στην αλλαγή της φωτεινής ακτινοβολίας. Συνήθως απαιτούνται ηµέρες ώστε να φτάσει η καλλιέργεια στην κατάλληλη πυκνότητα για διατροφή των οργανισµών στις υδατοκαλλιέργειες. 31

33 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Α. ειγµατοληψία πεδίου. Β. Ανάπτυξη των µικτών καλλιεργειών στο εργαστήριο σε διαφορετικές συνθήκες και παρακολούθηση των ποιοτικών και ποσοτικών αλλαγών. Γ. Σύγκριση της παραγωγικότητας των καλλιεργειών.. Προσδιορισµός των χαρακτηριστικών της βιοµάζας: -Ανάλυση ξηρού βάρους -Προφίλ λιπαρών Β.1. Εργαστηριακή µέθοδος καλλιέργειας φυκών Για την ανάπτυξη της µικτής καλλιέργειας µικροφυκών πραγµατοποιείται δειγµατοληψία θαλασσινού νερού, µε κατάλληλες φιάλες δειγµατοληψίας, στις 11:00 το πρωί από το λιµανάκι του Αγ. Κοσµά της Αττικής στον Σαρωνικό κόλπο. Το θαλασσινό νερό φιλτράρεται στα 100µm ώστε να αποµακρυνθεί το µεσο/µακρο-φυτο/ζωο-πλαγκτόν. Στο δείγµα παραµένει νανοπλαγκτόν (< 20µm) και µικροπλαγκτόν (<100µm). Στόχος του πειράµατος, αρχικά, είναι η ανάπτυξη κι η άνθιση των µικτών καλλιεργειών στο εργαστήριο και στη συνέχεια η παρακολούθηση αυτών σε διαφορετικές συνθήκες. Τα φύκη καλλιεργούνται εργαστηριακά σε τρεις διαφορετικές αλατότητες (20ppt 25ppt 30ppt) και σε τρεις διαφορετικές αναλογίες θρεπτικών. Το µέσο της καλλιέργειας παρασκευάζεται µε θαλασσινό νερό και µε την αντίστοιχη ποσότητα νερού βρύσης για την κάθε διαφορετική αλατότητα. Ο εµπλουτισµός γίνεται µε το θρεπτικό µέσο Walne, την προσθήκη νιτρικών για να επιτευχθεί η αντίστοιχη αναλογία θρεπτικών και την τελική προσθήκη βιταµινών. Αρχικά, η ανάπτυξη των καλλιεργειών γίνεται σε κωνικές φιάλες των 250ml. Σε κάθε φιάλη προστίθεται αντλία συνεχόµενης παροχής αέρος. και στη συνέχεια οι φιάλες κλείνουν µε βαµβάκι-πώµα και τοποθετούνται στο θάλαµο καλλιεργειών. Οι συνθήκες στον θάλαµο είναι τεχνητός φωτισµός µε φωτοπερίοδο 8: 16 ώρες σκοτάδι: φως και θερµοκρασία 20 0 C. Συνολικά στον θάλαµο καλλιεργειών αναπτύσσονται 9 διαφορετικές καλλιέργειες. Για να αποκτηθούν καλλιέργειες µεγαλύτερου όγκου γίνεται διαδοχική αναβάθµιση των µικρότερων όγκων. Ο όγκος του εµβολίου κυµαίνεται από 5-25% του τελικού όγκου. Ο τελικός όγκος των καλλιεργειών 32

34 φτάνει το ένα λίτρο και χρησιµοποιούνται γυάλινες κωνικές φιάλες του λίτρου. Μετά από τον καθηµερινό ποσοτικό και ποιοτικό έλεγχο των καλλιεργειών ως βέλτιστη καλλιέργεια παρουσιάζεται αυτή µε αλατότητα 25ppt και µε την τυπική αναλογία των επιπέδων των θρεπτικών (4 Ν:Ρ). Για την επανάληψη του πειράµατος χρησιµοποιούνται οι προηγούµενες καλλιέργειες ως µητρικές και γίνεται η ανανέωση µε την προσθήκη 100 ml µητρικής καλλιέργειας σε 900 ml νερού αντίστοιχης αλατότητας. Οι ανανεωµένες καλλιέργειες εµπλουτίζονται µε τις αντίστοιχες αναλογίες θρεπτικών και βιταµινών. Σε όλα τα στάδια απαιτούνται ηµιασηπτικές συνθήκες. Στη συνέχεια µε µητρική την καλλιέργεια αυτή, ανανεώνονται οι καλλιέργειες σε νέες µονόλιτρες κωνικές φιάλες και πραγµατοποιείται ηµισυνεχής καλλιέργεια σε 3 διαφορετικούς ρυθµούς διάλυσης (25% 50% 75%). Καθηµερινά την ίδια ώρα, πραγµατοποιείται δειγµατοληψία, ανανέωση των καλλιεργειών και ποιοτικός και ποσοτικός έλεγχος του δείγµατος. Οι ανανεώσεις γίνονται ως εξής: Για τον ρυθµό διάλυσης 25% αφαιρούνται καθηµερινά 250 ml καλλιέργειας και αντικαθίστανται από 250 ml νερού αλατότητας 25ppt εµπλουτισµένου µε 0,25 ml walne. Αντίστοιχα, για τον ρυθµό διάλυσης 50% αφαιρούνται 500ml καλλιέργειας και αντικαθίστανται από 500 ml νερού εµπλουτισµένου µε 0,5 ml walne, και για τον ρυθµό διάλυσης 75% αφαιρούνται 750ml καλλιέργειας και αντικαθίστανται από 750 ml νερού εµπλουτισµένου µε 0,75 ml walne. Σε όλες τις ανανεωµένες καλλιέργειες γίνεται η προσθήκη βιταµινών. Με το πέρας της πειραµατικής διαδικασίας, τέσσερα δείγµατα από κάθε καλλιέργεια διηθούνται υπό κενό µε σκοπό να γίνει η µέτρηση του ξηρού τους βάρους. Η διήθηση γίνεται πάνω σε φίλτρα γνωστού βάρους CF/C. Τα GF/C φίλτρα που συλλέγουν το δείγµα τοποθετούνται σε φούρνο ξηρής θερµότητας στους 60 C για όλη τη νύχτα. Αφού έρθουν σε θερµοκρασία περιβάλλοντος µε ξηραντήρα κενού, ζυγίζονται σε αναλυτικό ζυγό 4 ή 5 δεκαδικών στοιχείων (Mettler Toledo XS105, Germany). Συγκεκριµένα, φιλτράρονται 4 δείγµατα των 65ml από τις καλλιέργειες µε ρυθµό διάλυσης 25%, 4 δείγµατα των 200ml από τις καλλιέργειες µε ρυθµό διάλυσης 50% και 4 δείγµατα των 300ml από τις καλλιέργειες µε ρυθµό διάλυσης 75%. Τέλος, µε τον ίδιο τρόπο διηθούνται τρία επιπλέον δείγµατα των 65ml από την καλλιέργεια µε ρυθµό διάλυσης 25% και τοποθετούνται στην κατάψυξη, ώστε να γίνει η άµεση εστεροποίηση των λιπαρών οξέων (Lepage & Roy 1986) και η ανάλυση του προφίλ τους. 33

35 Η περιεκτικότητα σε λιπαρά προσδιορίζεται µε εκχύλιση µεθανόλης/τολουολίου (3:2 v/v; Folch et al. 1957), εξάτµιση του διαλύτη, αντίδραση του εκχυλίσµατος µε φωσφοβανιλλίνη, και µέτρηση απορρόφησης στα 530 nm (Nengas & Alexis 1995). Μετά την εξάτµιση του διαλύτη, οι µεθυλεστέρες των λιπαρών οξέων (FAMEs: Fatty Acid Methylesters) είναι έτοιµοι για ένεση (0,2 ml) µε την επαναδιάλυσή τους σε ισοοκτάνιο. Ο διαχωρισµός των FAMEs διεξάγεται σε ένα σύστηµα υγρής χρωµατογραφίας (GLC Varian 3300, Sugar Land, TX, USA). Β.2. Εργαστηριακή µέθοδος για την άµεση εστεροποίηση των λιπαρών οξέων Αντιδραστήρια που χρησιµοποιούνται a.. Μεθανόλη/τολουόλιο (3:2 v/v) b. ακετυλοχλωρίδιο/µεθανόλη (1/20 v/v) c. εξάνιο AR d. θειικό νάτριο (άνυδρο sodiumsulphate) e. ισοοκτάνιο f. Internal standard 19:0 (συγκέντρωση 1mg/ml stock solution) Γυαλικά και µηχανήµατα που χρησιµοποιούνται Σωλήνες των 35ml µε τεφλόν βιδωτό καπάκι (SIGMA) Σωλήνες φυγοκέντρου των 35-50ml, και απλοί σωλήνες των 35ml Προχοϊδες εξάτµισης των ml Περιστροφικός εξατµιστής κενού Σύστηµα διήθησης υπό κενό Υδατόλουτρο ρυθµισµένο στους C Εργαστηριακή διαδικασία 1. Το δείγµα ζυγίζεται στους ειδικούς σωλήνες µε το βιδωτό καπάκι. 2. Γίνεται η προσθήκη 5ml αντιδραστηρίου a και 5ml αντιδραστηρίου b (που παρασκευάζεται αυθηµερόν) ως παράγων εστεροποίησης και 100µl internal standard (εσωτερικό πρότυπο διάλυµα) από συµπυκνωµένο διάλυµα καλλιεργητικού µέσου. 34

36 3. Σε κάθε σωλήνα διοχετεύουµε άζωτο και τον κλείνουµε ερµητικά (αντίδραση σε ατµόσφαιρα αζώτου προς αποφυγή οξείδωσης). 4. Γίνεται προσεχτική ανάδευση έτσι ώστε να µην κολλήσει το δείγµα ψηλά στο σωλήνα και να µην έρθει σε επαφή µε το διάλυµα. 5. Ο σωλήνας τοποθετείται σε υδατόλουτρο των C για 1 ώρα και αναδεύεται προσεχτικά κάθε 10 λεπτά. 6. Με το πέρας της 1 ώρας προστίθεται στο δείγµα 5ml HPLC νερό και 5ml εξάνιο και γίνεται καλή ανάδευση. 7. Το δείγµα µεταφέρεται σε σωλήνες φυγοκέντρου των 35-50ml και πραγµατοποιείται φυγοκέντρηση στις 3000 rpm για 5 λεπτά. 8. Η ανώτερη φάση του εξανίου µεταφέρεται πολύ προσεχτικά σε απλούς σωλήνες των 35ml. 9. Το στάδιο του καθαρισµού επαναλαµβάνεται άλλες δύο φορές. 10. Αφαιρείται η υγρασία της φάσης του εξανίου φιλτράροντας το δείγµα στην ειδική συσκευή διήθησης έχοντας προσθέσει 1-2gr αντιδραστήριο d και το δείγµα συλλέγεται στην προχοϊδα εξάτµισης. 11. Γίνεται εξάτµιση σε περιστροφικό εξατµιστή υπό κενό και στη συνέχεια διοχετεύουµε άζωτο µέχρι πλήρους εξάτµισης. 12. Οι µεθυλεστέρες συλλέγονται µε 1ml αντιδραστηρίου e και φυλάσσονται στους C µέχρι να διέλθουν στον αέριο χρωµατογράφο (3-5µl) Β.3. Παρασκευή θρεπτικού µέσου Walne ιάλυµα 1 Σε 1L απεσταγµένου νερού προστίθενται: Na2EDTA - 45g H3BO3-33.6g NaNO 3 ή ΚΝΟ 3-100g NaH2PO4.H2O - 20g MnCl2.4H2O g FeCl3.6H2 O 1.3g 35

37 ιάλυµα 2 Σε 100L απεσταγµένου νερού προστίθενται: ZnCl2-2.1g CoCl2.6H 2O - 2g (NH4) 6M O7 O2H 2 O - 0.9g CuSO4.5H2O - 2g HCl- 10ml ιάλυµα 3 Σε 100L απεσταγµένου νερού προστίθενται: Na2SiO3.5H2O - 4g Σε όλα τα διαλύµατα γίνεται θέρµανση και ανάδευση µε µαγνητικό αναδευτήρα έως την τελική διάλυση. Στο διάλυµα 1 προστίθενται: 1ml από το διάλυµα 2 και 2ml από το διάλυµα 3. Β.4. Παρασκευή διαλύµατος βιταµινών Σε 100ml απεσταγµένου νερού προστίθενται (υπό ασηπτικές συνθήκες): Χλωροενυδατωµένη θειαµίνη - 200mg Κυανοκοβαλαµίνη - 10mg Πραγµατοποιείται αποστείρωση, είτε στο αυτόκαυστο, είτε σε ακτινοβολία (10Kgy), είτε µε διήθηση 0.2µm. Β.5. Εργαστηριακή µέθοδος παρακολούθησης φυτοπλαγκτού Β.5.1. Ποιοτική µελέτη φυτοπλαγκτού Μεθοδολογία ταυτοποίησης και αναγνώρισης ειδών Κατά τη διάρκεια της διαδοχικής ανάπτυξης του ΝΑΒ επιλέγονται διαδοχικά δείγµατα για ποιοτική παρακολούθηση στο οπτικό µικροσκόπιο, ώστε να καταγραφεί µια σταδιακή διαδοχή των ειδών και της αφθονίας τους µε το πέρας του χρόνου. Για την ποιοτική παρακολούθηση τα δείγµατα µονιµοποιούνται άµεσα µε την προσθήκη διαλύµατος Lugol (Lugol: 10gr ουδέτερου ΚΙ διαλυµένου σε 20 ml νερού). Η στερέωση 36

38 και η διατήρηση των δειγµάτων γίνεται µε την παρακάτω διαδικασία: 100 ml του δείγµατος τοποθετούνται σε δοκιµαστικό σωλήνα µε γυάλινο πώµα και προστίθενται 2-3 σταγόνες συµπυκνωµένου διαλύµατος Lugol + 10% οξικό οξύ. Το ιώδιο στερεώνει και διατηρεί τους οργανισµούς και ταυτόχρονα τους χρωµατίζει, ενώ το οξικό οξύ διατηρεί τα µαστίγια και τις βλεφαρίδες. Επιπλέον, οι οργανισµοί που λαµβάνουν ιώδιο καθίστανται βαρύτεροι και καθιζάνουν ταχύτερα, ώστε να γίνεται ευκολότερη η µέτρησή τους. H κύρια διεργασία για τη µέτρηση δειγµάτων πλαγκτού στερεωµένου σε Lugol και οξικό οξύ είναι: 1- Πλήρωση των θαλαµίσκων πλαγκτού και καθίζηση 2- Τοποθέτηση των καθιζανόντων δειγµάτων στο µικροσκόπιο 3- Μέτρηση των δειγµάτων Η ταξινόµηση των φυτοπλαγκτικών οργανισµών πραγµατοποιείται µε απλό και µε ανάστροφο µικροσκόπιο (Zeiss IDO 3) σε ζωντανό και σε συντηρηµένο υλικό. Η καθίζηση των κυττάρων γίνεται σε ειδικούς θαλάµους στο ανάστροφο µικροσκόπιο Χρησιµοποιούνται διαφορετικού όγκου θάλαµοι (10, 25, 50 ml) και η καταµέτρηση αρχίζει µετά το πέρας του χρόνου καθίζησης. Για την ταυτοποίηση των ειδών του φυτοπλαγκτού χρησιµοποιούνται κυρίως µορφοµετρικά χαρακτηριστικά από µικροσκοπικές παρατηρήσεις µε τη βοήθεια κλειδών (π.χ. Schiller, 1933 και Βutcher, Β.5.2. Ποσοτική µελέτη φυτοπλαγκτού Ποσοτικοποίηση βιοµάζας φυκών Οταν το ΝΑΒ επιτύχει τα επιθυµητά αποτελέσµατα βιοµάζας γίνονται οι ποσοτικές µετρήσεις της αφθονίας των φυτοπλαγκτικών οργανισµών. Η ποσότητα της βιοµάζας των φυκών µιας καλλιέργειας αξιολογείται, είτε µετρώντας τον αριθµό των κυττάρων, είτε µε τον καθορισµό του βιοόγκου, της οπτικής πυκνότητας και του ξηρού βάρους. Τα κύτταρα µπορούν να µετρηθούν είτε µε ηλεκτρονικό καταµετρητή µεριδίων (electronic particle counter) ή άµεσα µε µικροσκόπιο, χρησιµοποιώντας ένα αιµοκυτταρόµετρο Neubauer. Η µέτρηση µε το µικροσκόπιο έχει το πλεονέκτηµα ότι επιτρέπει τον ταυτόχρονο ποιοτικό έλεγχο της καλλιέργειας. Η µεγαλύτερη δυσκολία στη 37

39 µικροσκοπική µέτρηση είναι η επαναληψιµότητα, η οποία είναι συνάρτηση της δειγµατοληψίας, της αραίωσης, και του εύρους της συγκέντρωσης των κυττάρων. Με τη χρήση φασµατοµέτρου µπορεί να καθοριστεί η σχέση µεταξύ οπτικής πυκνότητας και κυτταρικής συγκέντρωσης. Ωστόσο, µπορεί να υπάρχουν διακυµάνσεις λόγω του ότι η συγκέντρωση της χλωροφύλλης στα κύτταρα των φυκών διαφέρουν ανάλογα µε τις συνθήκες καλλιέργειας. Με τον τρόπο αυτό, µια καλλιέργεια σε συνθήκες χαµηλού φωτισµού θα είναι συγκριτικά πιο έγχρωµη και θα οδηγεί τελικά σε µετρήσεις µεγαλύτερης οπτικής πυκνότητας. Β.6. Συνοπτικά οι µέθοδοι της ποσοτικής µελέτης του φυτοπλαγκτού Ο έλεγχος της αύξησης γίνεται είτε µε την παρακολούθηση της κυτταρικής συγκέντρωσης είτε µε την παρακολούθηση της αύξησης της βιοµάζας. Κυτταρική συγκέντρωση µε αιµοκυτταρόµετρο (neubauer). Αρχικά η καλλιέργεια πρέπει να είναι οµοιογενής. Σε περίπτωση που δεν αερίζεται, γίνεται ανάδευση χειροκίνητα ή µε vortex. Γίνεται δειγµατοληψία σε δοκιµαστικό σωλήνα και τα κύτταρα αφήνονται να κατακαθίσουν. Χρησιµοποιούντα καθαρές καλυπτρίδες και αιµοκυτταρόµετρα. Το αιµοκυτταρόµετρο έχει δύο θαλάµους µέτρησης για καλύτερα στατιστικά αποτελέσµατα. Η ικανότητα µέτρησης είναι έως cells/ml, διαφορετικά απαιτείται αραίωση. Σε αραιό δείγµα, πρέπει να µετρηθούν και τα εννιά τετράγωνα (fig.5). Σε πυκνό δείγµα, θα µετρηθούν τρία τετράγωνα, συµπεριλαµβανοµένου του κεντρικού. Η καλυπτρίδα προσαρµόζεται µε πίεση στο αιµοκυτταρόµετρο και στη συνέχεια µε πιπέτα Pasteur µεταφέρεται το δείγµα από τον δοκιµαστικό σωλήνα, αποφεύγοντας τις φυσαλίδες. Μετά από ένα λεπτό, αφότου καθιζάνουν τα κύτταρα, γίνεται η µέτρηση των κυττάρων. Αν η διαφορά στις µετρήσεις των δύο θαλάµων είναι > 10%, τότε το δείγµα απορρίπτεται. Οι µετρήσεις καταγράφονται και γίνεται η αναγωγή στην αρχική συγκέντρωση της καλλιέργειας. Με τις µετρήσεις κατασκευάζονται οι γραφικές παραστάσεις της αύξησης της καλλιέργειας σε σχέση µε τον χρόνο και υπολογίζεται ο ειδικός ρυθµός αύξησης µ. 38

40 Ξηρό βάρος συγκεκριµένου όγκου καλλιέργειας. Αρχικά γίνεται µε ακρίβεια η µέτρηση της κυτταρικής συγκέντρωσης. Στη συνέχεια πραγµατοποιείται λήψη αντιπροσωπευτικών δειγµάτων και διήθηση. Η διήθηση (τριών τουλάχιστον δειγµάτων για κάθε καλλιέργεια) γίνεται επάνω σε φίλτρα γνωστού βάρους CF/C. Τα φίλτρα τοποθετούνται σε ειδικά χωνιά υπό συνθήκες κενού. Τα κύτταρα πλένονται επάνω στο φίλτρο µε ισοτονικό φορµικό αµµώνιο για την αποµάκρυνση των αλάτων. Τα φίλτρα τοποθετούνται σε πλαστικά δοχεία ζύγισης ή σε σκεπασµένα τρυβλία Petri. Στη συνέχεια τοποθετούνται σε κλίβανο στους 60 C για όλη τη νύχτα. Αφού έλθουν σε θερµοκρασία περιβάλλοντος, ζυγίζονται σε αναλυτικό ζυγό 4 ή 5 δεκαδικών στοιχείων. Τα φίλτρα τοποθετούνται πάντα µε καθαρές λαβίδες για την αποφυγή οποιασδήποτε φθοράς και αύξησης βάρους από το λίπος των δακτύλων. Οι αναλυτικοί ζυγοί απαιτούν περαιτέρω προσοχή στη χρήση τους επειδή επηρεάζονται από ρεύµατα αέρος, ηλεκτρονικό θόρυβο και θερµοκρασία. Με γνωστή την κυτταρική συγκέντρωση, µπορεί να υπολογιστεί και το µέσο κυτταρικό βάρος. Μετρητής σωµατιδίων Coulter Counter. Μηχάνηµα µέτρησης κυτταρικού όγκου και ανάλυσης µεγεθών. Απαιτεί εξειδίκευση και βαθµονόµηση για κάθε είδος. Οπτική πυκνότητα σε φασµατοφωτόµετρο (OD) Μέθοδος βασισµένη στη φωτοµετρική εκτίµηση των αιωρούµενων σωµατιδίων. Το κύριο πρόβληµα είναι ότι οι χρωστικές είναι σταθερές µόνο στην εκθετική φάση που έχουµε ισορροπηµένη αύξηση. 39

41 Κυτταρική συγκέντρωση µε κυτταρόµετρο ροής (flow cytometer). Άλλες µέθοδοι ποσοτικής µελέτης: 1- Μέθοδος καθίζησης. 2- Μέθοδος σωληνοειδών θαλαµίσκων µε ανάστροφο µικροσκόπιο. Κατάλληλη µέθοδος για µελέτη νανο-πλαγκτού και υπερ-πλαγκτού. Απαιτούνται επίπεδοι θαλαµίσκοι ακριβείας (0.5, 1, 2 ml). 3- Μέθοδος φυγοκέντρισης µε ηλεκτρική φυγόκεντρο. Είναι δυνατή η µελέτη ολόκληρου του πλαγκτού σε ζωντανή κατάσταση. 4- Μέθοδος µεµβρανωδών ηθµών. Συλλέγεται όλο το πλαγκτό αλλά αποδοµούνται οι λεπτοφυείς οργανισµοί. 5- Προσδιορισµός φωτοσύνθεσης. Επίπονη µέθοδος, κατάλληλη µόνο για προσδιορισµό πρωτογενούς παραγωγής. 6- Προσδιορισµός χλωροφύλλης. Συλλέγεται όλο το πλαγκτόν. Είναι κατάλληλη µέθοδος για µελέτη παραγωγικότητας. Οι φωτοσυνθετικές χρωστικές αποµονώνονται σε 80% ακετόνης. Η απορρόφηση µετράται στα 649nm και 665nm όπου παρατηρείται η µέγιστη απορρόφηση χλωροφύλλης µε τη χρήση κυψελίδων quartz και φωτοφασµατογράφου Hitachi

42 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.1. Πείραµα καλλιέργειας σε τρεις διαφορετικές αλατότητες (20, 25, 30 ppt) και σε τρεις διαφορετικές αναλογίες θρεπτικών (4 Ν:P, 2 x 4 Ν:P, 3 x 4 Ν:P) Αλατότητα 20 ppt - Aναλογία θρεπτικών 4 N:P Στην καλλιέργεια που αναπτύσσεται σε νερό αλατότητας 20ppt και είναι εµπλουτισµένη µε θρεπτικά αναλογίας 1Ν:Ρ, εµφανίζονται δύο διαφορετικά κυρίαρχα είδη. Το sp1 ανήκει στο γένος Νephroselmis και το sp2 στο γένος Rhodomonas. 41

43 Αλατότητα 20ppt - Αναλογία θρεπτικών 2 x 4 N:P Στην καλλιέργεια που αναπτύσσεται σε νερό αλατότητας 20ppt και είναι εµπλουτισµένη µε θρεπτικά αναλογίας 2 x 4 Ν:Ρ, εµφανίζονται δύο διαφορετικά κυρίαρχα είδη. Το sp1 ανήκει στο γένος Nephroselmis και το sp2 δεν κατέστει δυνατό να αναγνωριστεί. Αλατότητα 20ppt - Αναλογία θρεπτικών 3 x 4 N:P Στην καλλιέργεια που αναπτύσσεται σε νερό αλατότητας 20ppt και είναι εµπλουτισµένη µε θρεπτικά αναλογίας 3 x 4 Ν:Ρ, εµφανίζονται δύο διαφορετικά κυρίαρχα είδη. Το sp1 ανήκει στο γένος Νephroselmis και το sp2 στο γένος Chlorococcum. 42

44 Αλατότητα 25ppt Τρεις αναλογίες θρεπτικών Ν:Ρ Στις καλλιέργειες που αναπτύσσονται σε νερό αλατότητας 25ppt, εµφανίζεται ένα κυρίαρχο είδος του γένους Νephroselmis σε κάθε διαφορετικό επίπεδο θρεπτικών. 43

45 44

46 Αλατότητα 30ppt Τρεις αναλογίες θρεπτικών Ν:Ρ Στις καλλιέργειες που αναπτύσσονται σε νερό αλατότητας 30ppt, εµφανίζονται δύο ίδια κυρίαρχα είδη σε κάθε διαφορετικό επίπεδο θρεπτικών. Το sp1 ανήκει στο γένος Νephroselmis και το sp2 στο γένος Rhodomonas. 45

47 πίνακας 1: Τα είδη που κυριαρχούν στις καλλιέργειες Αριθµός Καλλιέργειας Καλλιέργειες Sp1 Sp2 1 20ppt 1N/P Nephroselmis Rhodomonas 2 20ppt 2N/P Nephroselmis? 3 20ppt 3N/P Nephroselmis Chlorococcum 4 25ppt 1N/P Nephroselmis ppt 2N/P Nephroselmis ppt 3N/P Nephroselmis ppt 1N/P Nephroselmis Rhodomonas 8 30ppt 2N/P Nephroselmis Rhodomonas 9 30ppt 3N/P Nephroselmis Rhodomonas 46

48 πίνακας 2 Αριθµός Καλλιέργειας Είδος ανά καλλιέργεια µmax (d -1 ) µtotal (d -1 ) Yield (cells/ml) P (cells/ml/day) 1 20ppt x 1N/P sp x x ppt x 1N/P sp x x ppt x 2N/P sp x x ppt x 2N/P sp x x ppt x 3N/P sp x x ppt x 3N/P sp x x ppt x 1N/P sp x x ppt x 2N/P sp x x ppt x 3N/P sp x x ppt x 1N/P sp x x ppt x 1N/P sp x x ppt x 2N/P sp x x ppt x 2N/P sp x x ppt x 3N/P sp x x ppt x 3N/P sp x x 10 4 πίνακας 3: Αφθονία κυττάρων Καλλιέργειες sp1 cells sp2 cells 20ppt 1N/P 1.93 x x ppt 2N/P 1.99 x x ppt 3N/P 5.56 x x ppt 1N/P 1.7 x ppt 2N/P 4.04 x ppt 3N/P 3.01 x ppt 1N/P 4.3 x x ppt 2N/P 4.25 x x ppt 3N/P 2 x x

49 πίνακας 4: Μέσος βιοόγκος για κάθε διαφορετικό είδος κυττάρου Καλλιέργειες Avg biovolume sp1 per individual Avg biovolume sp2 per individual 20ppt 1N/P ppt 2N/P ppt 3N/P ppt 1N/P ppt 2N/P ppt 3N/P ppt 1N/P ppt 2N/P ppt 3N/P πίνακας 5: Συνολικός βιοόγκος κάθε καλλιέργειας Καλλιέργειες Avg biovolume sp1 Avg biovolume sp2 Συνολικός Βιοόγκος (sp1+sp2) 20ppt 1N/P x x x ppt 2N/P x x x ppt 3N/P 80.6 x x x ppt 1N/P x x ppt 2N/P x x ppt 3N/P x x ppt 1N/P x x x ppt 2N/P x x x ppt 3N/P x x x 10 6 Γ.2. Πείραµα ηµισυνεχούς καλλιέργειας σε 3 διαφορετικούς ρυθµούς αραίωσης (25% 50% 75%) Για τη συνέχεια του πειράµατος χρησιµοποιήθηκε η καλλιέργεια µε αλατότητα 25ppt και αναλογία θρεπτικών 4 Ν:Ρ που παρουσίασε τη µεγαλύτερη παραγωγικότητα. Στην καλλιέργεια αυτή υπάρχει ένα κυρίαρχο είδος του γένους Νephroselmis. Παρακάτω φαίνονται τα διαγράµµατα της ηµισυνεχούς καλλιέργειας σε 3 διαφορετικούς ρυθµούς αραίωσης και σε δύο επαναλήψεις για το καθένα. Στο τέλος υπάρχει το διάγραµµα της καλλιέργειας µε ρυθµό αραίωσης 0%. 48

50 25% A α sp1 1.20E E E E E E E day 25% B β sp1 1.20E E E E E E E day 50% A γ sp1 1.20E E E E E E E day 49

51 50% B 1.20E E E+06 sp1 6.00E+06 δ 4.00E E E day 75% A ε sp1 1.20E E E E E E E day 75% B ζ sp1 1.20E E E E E E E day ιάγραµµα αφθονίας σε καλλιέργεια µε ρυθµό αραίωσης 0% 50

52 0% A sp1 2.00E E E E E E E E E E E day πίνακας 6: Μέση απόδοση καλλιεργειών σε 3 ρυθµούς αραίωσης κα µετρήσεις ξηρού βάρους 3 καλλιέργειες/ 3 ρυθµοί αραίωσης Παραγωγή (κύτταρα//ml/ηµέρα) Ξηρό βάρος (mg/l) Παραγωγή (mg/l/ηµέρα) 25% x % 4.98 x % x Γραφική παράσταση µέτρησης ξηρού βάρους για τους τρεις διαφορετικούς ρυθµούς αραίωσης 51

53 Γ.3. Περιγραφή του γένους ephroselmis ephroselmis ταξινόµηση 1 Επικράτεια: Eukaryota Βασίλειο: Plantae Φύλο: Chlorophyta Κλάση: Prasinophyceae Τάξη: Pseudoscourfieldiales Οικογένεια: Pycnococcaceae Γένος: ephroselmis ephroselmis ταξινόµηση 2 Επικράτεια: Eukaryota Βασίλειο: Plantae Φύλο: Chlorophyta Κλάση: Nephriselmidophyceae Τάξη: Nephroselmidales Οικογένεια: Nephroselmidaceae Γένος: ephroselmis Το γένος Nephroselmis ταξινοµικά ανήκει στην οικογένεια Pycnococcaceae, αν και από µελέτες του 2009 θεωρείται ότι ανήκει σε µια αυτόνοµη τάξη την Nephroselmidophyceae. Το κύτταρο έχει σχήµα νεφροειδές µε δύο άνισα µαστίγια που εκφύονται από την πλευρική εγκόλπωση. Το µικρότερο µαστίγιο κατευθύνεται εµπρός, κατά τη διάρκεια της κολύµβησης, ενώ το µεγαλύτερο προς τα πίσω. Έχει έναν µόνο πλευρικό χλωροπλάστη πινακοειδή µε πυρηνοειδές. Ο χλωροπλάστης καλύπτει το µεγαλύτερο µέρος της επιφάνειας του κυττάρου και περιέχει µια οφθαλµική κηλίδα κάτω από το µικρότερο µαστίγιο. Στα είδη των γλυκών νερών εµφανίζεται συσταλτό κενοτόπιο. Το κυτταρικό τοίχωµα λείπει. Σε παρατήρηση µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο τα είδη διαφέρουν ως προς το µέγεθος των κυττάρων τους, το σχήµα, το µήκος των µαστιγίων και την παρουσία ή απουσία στίγµατος. οµικά τα είδη εύκολα διακρίνονται από τη µορφολογία της φολιδωτής επικάλυψης του µαστιγίου και της 52

54 κυτταρικής τους επιφάνειας. Η εγγενής αναπαραγωγή γίνεται µε ολογαµία. Αρκετά είδη παρατηρούνται στο θαλάσσιο πλαγκτόν και µερικά ενδιαιτούν σε όλο τον κόσµο (Manton, 1965) (Stewart Mattox, 1977) (Moestrup Ettl, 1979) (Moestrup, 1983) (Suda et al. 1989). Γ.4. Περιγραφή του γένους Chlorococcum Chlorococcum ταξινόµηση Επικράτεια: Eukaryota Βασίλειο: Plantae ιαίρεση: Chlorophyta Κλάση: Chlorophyceae Τάξη: Chlorococcales Οικογένεια: Chlorococcaceae Γένος: Chlorococcum Η δοµή των φυκών αυτών είναι πολύ απλή. Είναι µονοκυτταρικά σφαιρικά φύκη µε πολυσακχαριτικό τοίχωµα. Το σχήµα των κυττάρων είναι ελλειψοειδές ή σφαιρικό και παρουσιάζει ποικιλία µεγεθών. Τα κύτταρα φέρουν λείο κυτταρικό τοίχωµα. Τα βλαστικά κύτταρα δεν φέρουν µαστίγιο και εµφανίζονται µεµονωµένα ή οµαδικά. Περιέχουν πλευρικό κυαθοειδή χλωροπλάστη, έναντι του κυτταρικού τοιχώµατος. Ο χλωροπλάστης εµφανίζεται µε ή χωρίς περιµετρικό άνοιγµα και περιέχει ένα ή περισσότερα πυρηνοειδή. Τα περισσότερα είδη δεν έχουν συσταλτά κενοτόπια. Τα κύτταρά τους µοιάζουν µε αυτά των Chlamydomonas. Η αναπαραγωγή τους γίνεται µε ζωοσπόρια ή µε ισογαµέτες. Είναι κοσµοπολιτικά. Ορισµένα είδη επιβιώνουν σε ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες. Έχουν αποµονωθεί από αµµώδεις και βραχώδεις περιοχές ερήµων, ενώ άλλα είδη δύνανται να επιβιώσουν σε θερµοκρασία 100 C µέχρι και µια ώρα. Έχουν καταγραφεί σε ποικίλα ενδιαιτήµατα, όπως σε θερµές πηγές στην Κεντρική Ασία, και σε εδάφη της Ανταρκτικής. Φυσιολογικές µελέτες έχουν προσδιορίσει την επίδραση των διαφόρων θρεπτικών ουσιών και αναστολέων στην ανάπτυξη διαφόρων 53

55 ειδών. Επίσης, έχει προσδιοριστεί η ικανότητα αυτών να παράγουν συγκεκριµένα ένζυµα και καρωτινοειδή. Γ.5. Περιγραφή του γένους Rhodomonas Rhodomonas Rhodomonas salina Scientific classification Επικράτεια: Eukaryota Βασίλειο: Chromalveolata Φύλο: Cryptophyta Κλάση: Cryptophyceae Τάξη: Pyrenomonadales Οικογένεια: Pyrenomonadaceae Γένος: Rhodomonas Πραγµατοποιούν ελεύθερη κολύµβηση. Έχουν ωοειδές σχήµα, και φέρουν δύο µαστίγια Συνήθως έχουν έναν χλωροπλάστη, πυρηνοειδές και πυρηνόµορφο, αλλά για κάποια είδη αυτά διαχωρίζονται λίγο µετά την κυτταρική διαίρεση έτσι ώστε να εµφανίζουν δύο χλωροπλάστες για το µεγαλύτερο µέρος του κυτταρικού τους κύκλου. Ο περιπλάστης πιέζει την πλασµατική µεµβράνη µε µία εσωτερική στρώση πλακών και ένα επιφανειακό στρώµα από αδρό ινιδικό υλικό. Οι εσωτερικές πλάκες του περιπλάστη έχουν περίπου ορθογώνιο σχήµα µε ισχυρές θέσεις σύνδεσης στην πλασµατική µεµβράνη. Το πυρηνόµορφο εµφανίζεται σε µια εγκόλπωση του περιπλαστιδιακού διαµερίσµατος µέσα στο πυρηνοειδές. Η µήτρα του πυρηνοειδούς δεν διασχίζεται από θυλακοειδή. Η αναπαραγωγή τους πραγµατοποιείται µε απλή κυτταρική διαίρεση. Συχνά σχηµατίζουν αποικίες. εν είναι γνωστή η εγγενής αναπαραγωγή. Το Rhodomonas είναι κοσµοπολιτικό και πολύ διαδεδοµένο, αν και σπανίως παρατηρείται σε µεγάλη αφθονία. Ενδιαιτεί, κυρίως, σε θαλάσσια και υφάλµυρα νερά. Υπάρχουν δύο γνωστά γλυκέων- 54

56 υδάτων είδη στην Ευρώπη. Το γένος εύκολα αναγνωρίζεται µε το οπτικό µικροσκόπιο και τα είδη του καλλιεργούνται εύκολα (Ηemend H. & Wetherbee, 1989, Novarino, 1991). Γ.6. Χηµική Ανάλυση του Προφίλ Λιπαρών Οξέων FAME (Fatty Acids Methylesters) Η χηµική ανάλυση του προφίλ των λιπαρών οξέων έδωσε τα παρακάτω αποτελέσµατα. Το ποσοστό των λιπαρών οξέων προκύπτει από τον µέσο όρο των µετρήσεων για τα τρία δείγµατα. FAME Λιπαρά Οξέα % STD 14:00 3,11 0,09 16:00 34,86 1,12 16:1n-7 0,79 0,02 16:4n-3 8,81 0,43 18:00 1,68 0,02 18:1n-9 5,74 0,60 18:2n-9 3,35 0,49 18:2n-6 3,27 0,15 18:3n-3 22,84 0,50 18:4n-3 5,78 0,25 20:1n-9 3,45 0,29 20:4n-6 3,04 0,18 20:5n-3 3,27 0,45 TFA 100 SAFA 39,65 MUFA 9,99 PUFA 50,36 ω3 40,70 ω6 6,31 ω6/ω3 0,16 ω3 HUFA 3,27 SAFA(saturated fatty acids): Κορεσµένα λιπαρά οξέα MUFA(monounsaturated fatty acids): Μονοακόρεστα λιπαρά οξέα PUFA(polyunsaturated fatty acids): Πολυακόρεστα λιπαρά οξέα 55

57 HUFA(highly unsaturated fatty acids): Ακόρεστα λιπαρά οξέα (µε περισσότερα από 20 άτοµα άνθρακα) Το προφίλ των µικροφυκών της καλλιέργειας κυριαρχείται από τα λιπαρά οξέα 16:00 (παλµιτικό οξύ), 16:4n-3, 18:3n-3 (α-λινολενικό οξύ) µε ποσοστά %. Ακολουθούν τα 18:1n-9 και 18:4n-3 µε ποσοστά 5.74% και 5.78% αντιστοίχως. Τα λιπαρά οξέα 14:00 18:2n-9 18:2n-6 20:1n-9 20:4n-6 (ARA αραχιδονικό) 20:5n-3 εµφανίζουν ποσοστά εύρους %. Η περιεκτικότητα σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα είναι µεγάλη µε ποσοστό 50.36%. Το ΕΡΑ (20:5n-3) που ανήκει στην οικογένεια των ω-3 λιπαρών οξέων εµφανίζει ποσοστό 3.27%. Το µεγαλύτερο ποσοστό στο προφίλ των λιπαρών οξέων παρατηρείται στο παλµιτικό οξύ µε 34,86% κι ακολουθεί το α- λινολενικό οξύ (18:3n-3) µε ποσοστό 22,84%. Στα λιπαρά οξέα του προφίλ δεν φαίνεται να περιέχεται ποσότητα DHA. Τέλος, τα κορεσµένα λιπαρά οξέα εµφανίζουν µεγάλο ποσοστό 39.65%. 56

58 . ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ.1. Ανάπτυξη µικτής καλλιέργειας και διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών αλατότητας και αναλογίας θρεπτικών Σύνθεση της βιοκοινωνίας των καλλιεργειών και εναλλαγή των ειδών Η µεθοδολογία και οι τεχνικές που χρησιµοποιήθηκαν για την ανάπτυξη της µικτής καλλιέργειας των µικροφυκών εφαρµόστηκαν µε επιτυχία. Αρχικά, πραγµατοποιήθηκε η φυσική άνθιση του φυτοπλαγκτού και στη συνέχεια διατηρήθηκε σε σταθερά επίπεδα. Επί µία έως δύο ηµέρες, οι καλλιέργειες παρέµεναν σε λανθάνουσα φάση. Στη συνέχεια άρχισε να αυξάνεται η πυκνότητα των κυττάρων καθώς εισήλθαν στην εκθετική φάση ανάπτυξης. Μετά από δέκα ηµέρες, η πυκνότητα των κυττάρων στις καλλιέργειες έφτασε σε ένα µέγιστο επίπεδο ανάπτυξης. Η βιοµάζα των καλλιεργειών αυξήθηκε και ταυτόχρονα σηµειώθηκε αλλαγή της σύνθεσης της βιοκοινωνίας µε την εναλλαγή των ειδών. Η σύνθεση των ειδών των καλλιεργειών εναλλασσόταν ανάλογα µε τις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας µέχρι να επιτευχθεί η κυριαρχία ενός ή δύο ειδών σε κάθε καλλιέργεια. Το κυρίαρχο είδος που επικράτησε σε όλες τις καλλιέργειες, µε το πέρας των δέκα ηµερών, ανήκει στο γένος Nephroselmis. Στην επακόλουθη διερεύνηση των συνθηκών καλλιέργειας παρατηρήθηκε ότι τόσο η διαφορετική αλατότητα όσο και τα διαφορετικά επίπεδα θρεπτικών επηρεάζουν τη σύνθεση των βιοκοινωνιών στις καλλιέργειες και καθορίζουν τον ανταγωνισµό και την τελική κυριαρχία των ειδών. Συγκεκριµένα, οι καλλιέργειες µε αλατότητα 25ppt εµφανίζουν σχεδόν την εικόνα µονοκαλλιέργειας καθώς δεν παρατηρείται άλλο κυρίαρχο είδος, εκτός του γένους Nephroselmis. Οι καλλιέργειες µε αλατότητες 20ppt και 30 ppt εµφανίζουν και δεύτερα κυρίαρχα είδη. Στην περίπτωση της αλατότητας 30ppt, η σύνθεση των ειδών ήταν ίδια και στα τρία διαφορετικά επίπεδα θρεπτικών µε το είδος του γένους Rhodomonas να κυριαρχεί µετά το Νephroselmis. Στη περίπτωση της αλατότητας 20ppt, η αναλογία των θρεπτικών φαίνεται να επηρεάζει τη σύνθεση των ειδών καθώς το δεύτερο κυρίαρχο είδος που εµφανίζεται είναι διαφορετικό σε κάθε περίπτωση. Συγκεκριµένα, στις καλλιέργειες µε την τυπική αναλογία των θρεπτικών Ν:Ρ ως δεύτερο κυρίαρχο είδος 57

59 παρουσιάζεται αυτό του γένους Rhodomonas, ενώ στις καλλιέργειες µε αναλογία θρεπτικών 3 επί την τυπική αναλογία του walne medium το δεύτερο κυρίαρχο είδος είναι του γένους Chlorococcum. Παρακάτω φαίνονται κάποια από τα είδη των µικροφυκών που εµφανίστηκαν στις καλλιέργειες κατά την εναλλαγή των ειδών. Τα είδη αυτά δεν παρατηρήθηκαν σε κυρίαρχες ποσότητες κι έγινε µόνο η ποιοτική καταγραφή τους. 58

60 .1.2. Σύγκριση της παραγωγικότητας των καλλιεργειών Όλες οι καλλιέργειες έφτασαν σε επίπεδα κυτταρικής πυκνότητας της τάξης του 10 6 µέσα στις 3-4 πρώτες µέρες καλλιέργειας, σύµφωνα µε το πρωτόκολλο που χρησιµοποιείται στις θαλάσσιες καλλιέργειες. Επίσης, µέσα σε 3-4 µέρες οι καλλιέργειες έφτασαν στη µετα-εκθετική φάση ανάπτυξης (post-exponential phase). Η διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών ανάπτυξης οδήγησε στο συµπέρασµα ότι η καλλιέργεια που αναπτύσσεται σε αλατότητα 25ppt και την τυπική αναλογία θρεπτικών (4 Ν:Ρ) παρουσιάζει τη µεγαλύτερη παραγωγικότητα κυττάρων, µε 1.8 x 10 6 κύτταρα ανά ml ανά ηµέρα, συνολικό βιοόγκο x 10 7 και κανονικοποιηµένη απόδοσηυ 0 ((Nt No)/No) 1.62 x 10 7 κύτταρα ανά ml. H απόδοση Υ 0 επιτρέπει συγκρίσεις σε κυτταρική βάση. Στη συνέχεια, ακολουθούν οι καλλιέργειες µε αλατότητα 30ppt και επίπεδο θρεπτικών της τυπικής αναλογίας 4 Ν:Ρ και η 2 x 4 Ν:Ρ, µετά η καλλιέργεια µε 25ppt αλατότητα και αναλογία θρεπτικών 3 x 4 Ν:Ρ, και τέλος οι καλλιέργειες µε 20ppt αλατότητα. Το 59