PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. SK εξετάσεις για χρήση με το Autostainer Link 48

Transcript

1 PD-L1 IHC 28-8 pharmdx SK εξετάσεις για χρήση με το Autostainer Link 48 Πίνακας περιεχομένων 1. Προβλεπόμενη χρήση Περίληψη και επεξήγηση Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων της κεφαλής και του αυχένα (ΚΠΚΚΑ) Ουροθηλιακό καρκίνωμα Μελάνωμα Αρχή της διαδικασίας Υλικά που παρέχονται Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται Προφυλάξεις Φύλαξη Παρασκευή δειγμάτων Τομές εγκλεισμένες σε παραφίνη Χρήση απασβεστωμένων ιστών Σύσταση φύλαξης τομών Προετοιμασία αντιδραστηρίων Διαδικασία χρώσης στο Autostainer Link Ποιοτικός έλεγχος Επαλήθευση δοκιμασίας προσδιορισμού Ερμηνεία της χρώσης Ερμηνεία χρώσης: Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Ερμηνεία χρώσης: Καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων της κεφαλής και του αυχένα (ΚΠΚΚΑ) Ερμηνεία χρώσης: Ουροθηλιακό καρκίνωμα Ερμηνεία χρώσης: Μελάνωμα Αξιολόγηση αντικειμενοφόρας πλάκας Περιορισμοί Γενικοί περιορισμοί Ειδικοί περιορισμοί προϊόντος Αξιολόγηση μη κλινικής απόδοσης Αναλυτική ειδικότητα για το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Φυσιολογικοί και νεοπλασματικοί ιστοί Αξιολόγηση απόδοσης Αξιολόγηση απόδοσης: Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Αξιολόγηση απόδοσης: ΚΠΚΚΑ Αξιολόγηση απόδοσης: Ουροθηλιακό καρκίνωμα Αξιολόγηση απόδοσης: Μελάνωμα Αντιμετώπιση προβλημάτων Βιβλιογραφικές αναφορές...23 P03914GR_04/SK / σελ. 1/24

2 1. Προβλεπόμενη χρήση Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx είναι μια ποιοτική ανοσοϊστοχημική δοκιμασία που χρησιμοποιεί το Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 που προορίζεται για την ανίχνευση της πρωτεΐνης PD-L1 σε μονιμοποιημένους σε φορμαλίνη, εγκλεισμένους σε παραφίνη (FFPE) ιστούς μη πλακώδους, μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (ΜΜΚΠ), ιστούς καρκινώματος πλακωδών κυττάρων της κεφαλής και του αυχένα (ΚΠΚΚΑ), ιστούς ουροθηλιακού καρκινώματος (ΟΚ) και ιστούς μελανώματος, με χρήση του συστήματος οπτικοποίησης EnVision FLEX στο Autostainer Link 48. Η έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1 ορίζεται ως το ποσοστό των προς αξιολόγηση ογκοκυττάρων που εμφανίζουν μερική ή πλήρη μεμβρανική χρώση σε οποιαδήποτε ένταση, όπως ορίζεται από τις οδηγίες ερμηνείας χρώσης όγκου ανάλογα με την ένδειξη. Η έκφραση της PD-L1, που ανιχνεύεται με το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx στον μη πλακώδη ΜΜΚΠ και στο ΚΠΚΚΑ, ενδέχεται να συσχετίζεται με ενισχυμένη επιβίωση με τη λήψη του OPDIVO (νιβολουμάμπη). Η έκφραση της PD-L1, που ανιχνεύεται με το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx στο ουροθηλιακό καρκίνωμα, ενδέχεται να συσχετίζεται με ενισχυμένο ποσοστό ανταπόκρισης από το OPDIVO. Η έκφραση της PD-L1, που ανιχνεύεται με το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx στο μελάνωμα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βοήθημα στην αξιολόγηση ασθενών για τους οποίους εξετάζεται το ενδεχόμενο υποβολής τους σε συνδυαστική θεραπεία με OPDIVO (νιβολουμάμπη) και YERVOY (ιπιλιμουμάμπη). 2. Περίληψη και επεξήγηση Η πρόσδεση των προσδεμάτων PD-1, PD-L1 και PD-L2 στον υποδοχέα PD-1 που βρίσκεται στα T κύτταρα, αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των T κυττάρων και την παραγωγή κυτοκίνης. Σε ορισμένους όγκους παρατηρείται αυξορρύθμιση των προσδεμάτων PD-1. Η σηματοδότηση μέσω αυτής της οδού μπορεί να συμβάλει στην αναστολή της ανοσοεπιτήρησης των ενεργών T κυττάρων των όγκων (1). Το OPDIVO (νιβολουμάμπη) είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης G4 (IgG4) που δεσμεύεται στον υποδοχέα PD-1 και εμποδίζει την αλληλεπίδρασή του με τα PD-L1 και PD-L2, απελευθερώνοντας διαμεσολαβούμενη από την οδό PD-1 αναστολή της ανοσοαπόκρισης, συμπεριλαμβανομένης της αντιογκικής ανοσοαπόκρισης (2). Σε συγγενή μοντέλα όγκων ποντικών, ο αποκλεισμός της δραστηριότητας του PD-1 είχε ως αποτέλεσμα τη μειωμένη ανάπτυξη όγκων (3). Το κλινικό όφελος του OPDIVO και η κλινική χρησιμότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx έχουν διερευνηθεί για τον ΜΜΚΠ, το ΚΠΚΚΑ και το ουροθηλιακό καρκίνωμα. 2.1 Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Η ανίχνευση κυττάρων όγκων με έκφραση του PD-L1 σε δείγμα ασθενών με μη πλακώδη, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ενδέχεται να υποδεικνύει όφελος ενισχυμένης επιβίωσης με τη θεραπεία με OPDIVO (νιβολουμάμπη) για τον ασθενή. Εξετάστηκαν δείγματα ασθενών σε κλινικές μελέτες με το OPDIVO που χρηματοδοτήθηκαν από την Bristol-Myers Squibb, με χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Στην κλινική μελέτη CA διερευνήθηκε η κλινική εγκυρότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx για την αξιολόγηση της κατάστασης του PDL1 σε ασθενείς με μη πλακώδη ΜΜΚΠ που έλαβαν θεραπεία με OPDIVO (5,11). 2.2 Καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων της κεφαλής και του αυχένα (ΚΠΚΚΑ) Η ανίχνευση κυττάρων όγκων με έκφραση του PD-L1 σε δείγματα ασθενών με ΚΠΚΚΑ ενδέχεται να υποδεικνύει όφελος ενισχυμένης επιβίωσης με τη θεραπεία με OPDIVO (νιβολουμάμπη) για τον ασθενή. Εξετάστηκαν δείγματα ασθενών σε κλινικές μελέτες με το OPDIVO που χρηματοδοτήθηκαν από την Bristol-Myers Squibb, με χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Στην κλινική μελέτη CA διερευνήθηκε η κλινική εγκυρότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx για την αξιολόγηση της κατάστασης του PDL1 σε ασθενείς με ΚΠΚΚΑ που έλαβαν θεραπεία με OPDIVO (16). 2.3 Ουροθηλιακό καρκίνωμα Η ανίχνευση κυττάρων όγκων με έκφραση του PD-L1 σε δείγματα ασθενών με ουροθηλιακό καρκίνωμα ενδέχεται να υποδεικνύει ενισχυμένο ποσοστό ανταπόκρισης με τη θεραπεία με OPDIVO (νιβολουμάμπη) για τον ασθενή. Εξετάστηκαν δείγματα ασθενών σε κλινικές μελέτες με το OPDIVO που χρηματοδοτήθηκαν από την Bristol-Myers Squibb, με χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Στην κλινική μελέτη CA διερευνήθηκε η κλινική εγκυρότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx για την αξιολόγηση της κατάστασης του PD L1 σε ασθενείς με ουροθηλιακό καρκίνωμα που έλαβαν θεραπεία με OPDIVO. 2.4 Μελάνωμα Το κυτταροτοξικό αντιγόνο 4 που σχετίζεται με τα T-λεμφοκύτταρα (CTLA-4) είναι αρνητικός ρυθμιστής της δραστηριότητας των T κυττάρων. Το YERVOY (ιπιλιμουμάμπη) είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που δεσμεύεται στο CTLA-4 και εμποδίζει την αλληλεπίδραση του CTLA-4 με τα προσδέματά του, CD80/CD86. Ο αποκλεισμός του CTLA-4 έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει τη δραστηριότητα και τον πολλαπλασιασμό των T κυττάρων, γεγονός που συμβάλλει στη γενική αύξηση της αντιογκικής ανοσοαπόκρισης (4). Τα PD-1 και CTLA-4 αναστέλλουν την αντιογκική ανοσοαπόκριση μέσω συμπληρωματικών και μη πλεοναζόντων μηχανισμών. Η μονοθεραπεία με το OPDIVO και η συνδυαστική θεραπεία με το OPDIVO και το YERVOY έχει καταδείξει σημαντικά μεγαλύτερη βελτίωση της επιβίωσης χωρίς εξέλιξη της νόσου σε σύγκριση με τη μονοθεραπεία με το YERVOY σε ασθενείς με προχωρημένο μελάνωμα, οι οποίοι δεν είχαν λάβει στο παρελθόν θεραπεία (8-10). Εξετάστηκαν δείγματα ιστών μελανώματος από ασθενείς που είχαν λάβει θεραπεία με OPDIVO σε κλινικές μελέτες που χρηματοδοτήθηκαν από την Bristol-Myers Squibb, με χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Στην κλινική μελέτη CA διερευνήθηκε η κλινική εγκυρότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx για την αξιολόγηση της έκφρασης του PDL1 σε ασθενείς με μελάνωμα που έλαβαν μονοθεραπεία με το OPDIVO, συνδυαστική θεραπεία με το OPDIVO και το YERVOY και μονοθεραπεία με το YERVOY. Το OPDIVO και το YERVOY αποτελούν εμπορικά σήματα της Bristol-Myers Squibb. 3. Αρχή της διαδικασίας Το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx περιέχει βελτιστοποιημένα αντιδραστήρια και το απαιτούμενο πρωτόκολλο για την ολοκλήρωση μιας διαδικασίας χρώσης IHC δειγμάτων FFPE χρησιμοποιώντας το Autostainer Link 48 και τη μονάδα προεπεξεργασίας PT Link (6). Μετά την επώαση με το πρωτοταγές μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του PD-L1 ή του αντιδραστηρίου αρνητικού μάρτυρα (NCR), τα δείγματα επωάζονται με ένα συνδετικό αντίσωμα ειδικό προς το είδος του ξενιστή του πρωτοταγούς αντισώματος και, στη συνέχεια, επωάζονται με ένα έτοιμο προς χρήση αντιδραστήριο οπτικοποίησης που αποτελείται από μόρια δευτεροταγών αντισωμάτων και μόρια υπεροξειδάσης χρένου συζευγμένα με μια κύρια αλυσίδα πολυμερούς δεξτράνης. Η ενζυμική μετατροπή του χρωμογόνου που προστίθεται στη συνέχεια έχει ως αποτέλεσμα την κατακρήμνιση ενός ορατού προϊόντος αντίδρασης στη θέση του αντιγόνου. Το χρώμα της χρωμογόνου αντίδρασης τροποποιείται από ένα αντιδραστήριο ενίσχυσης χρωμογόνου. Στη συνέχεια, το δείγμα είναι δυνατό να υποβληθεί σε επίχρωση και να καλυφθεί με καλυπτρίδα. Τα αποτελέσματα ερμηνεύονται με τη βοήθεια μικροσκοπίου φωτός. Για την επικύρωση των αναλύσεων χρώσης, παρέχονται αντικειμενοφόροι πλάκες μάρτυρα που περιέχουν δύο μονιμοποιημένες σε φορμαλίνη και εγκλεισμένες σε παραφίνη ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. P03914GR_04/SK / σελ. 2/24

3 4. Υλικά που παρέχονται PD-L1 IHC 28-8 pharmdx (Κωδικός SK005) Τα υλικά που αναφέρονται ακολούθως επαρκούν για 50 εξετάσεις (50 αντικειμενοφόροι πλάκες επωασμένες με πρωτοταγές αντίσωμα για το PD-L1 και 50 αντικειμενοφόροι πλάκες επωασμένες με το αντίστοιχο αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα, συνολικά 100 πλάκες εξέτασης). Το συμπληρωματικό πρωτοταγές αντίσωμα για το PD-L1 παρέχεται στο κιτ για τη χρώση 15 αντικειμενοφόρων πλακών κυτταρικής σειράς μάρτυρα. Ο αριθμός των εξετάσεων βασίζεται στη χρήση 2 x 150 µl ανά αντικειμενοφόρα κάθε αντιδραστηρίου, εκτός του DAB+ και του διαλύματος ανάκτησης στόχου. Το κιτ περιλαμβάνει υλικά που επαρκούν για έως και 15 ανεξάρτητες αναλύσεις χρώσης. Ποσότητα Περιγραφή 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου, απορρυπαντικό και 0,015 mol/l νατραζίδιο. 1 x 19,5 ml Πρωτοταγές αντίσωμα: Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 MONOCLONAL RABBIT ANTI-PD-L1 CLONE 28-8 Μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι του PD-L1 σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και 0,015 mol/l νατραζίδιο. 1 x 15 ml Negative Control Reagent* NEGATIVE CONTROL REAGENT Μονοκλωνικό αντίσωμα IgG μάρτυρα κουνελιού σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και 0,015 mol/l νατραζίδιο. *Το μονοκλωνικό IgG μάρτυρα κουνελιού πωλείται με εκχώρηση άδειας από τη Cell Signaling Technology. 1 x 34,5 ml LINKER, Anti-Rabbit LINKER, ANTI-RABBIT ευτεροταγές αντίσωμα ποντικού έναντι ανοσοσφαιρινών κουνελιού σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και 0,015 mol/l νατραζίδιο. 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP εξτράνη συζευγμένη με μόρια υπεροξειδάσης και μόρια δευτεροταγών αντισωμάτων αίγας έναντι ανοσοσφαιρινών κουνελιού και ποντικού σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και αντιμικροβιακό παράγοντα. 15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου και αντιμικροβιακό παράγοντα. 1 x 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3 -τετραϋδροχλωρική διαμινοβενζιδίνη σε οργανικό διαλύτη. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Θειικός χαλκός σε νερό. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Ρυθμιστικό διάλυμα, ph 6,1, που περιέχει απορρυπαντικό και αντιμικροβιακό παράγοντα. 15 αντικειμενοφόρες πλάκες Αντικειμενοφόροι πλάκες μάρτυρα PD-L1 IHC 28-8 pharmdx CONTROL SLIDES Κάθε αντικειμενοφόρος πλάκα περιέχει τομές δύο πεπιεσμένων, μονιμοποιημένων σε φορμαλίνη και εγκλεισμένων σε παραφίνη κυτταρικών σειρών: NCI-H226** με θετική έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1 (προερχόμενη από καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων ανθρώπινου πνεύμονα με θετική έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1) και MCF-7 με αρνητική έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1 (προερχόμενη από αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου μαστού με αρνητική έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1). P03914GR_04/SK / σελ. 3/24

4 PD-L1, SK005 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1 αρνητικό NCI-H226: PD-L1 θετικό **Οι Δρ. Οι AF Gazdar και Δρ. JD Minna στο Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) αναγνωρίζονται για τη συνεισφορά τους στην ανάπτυξη του NCI-H226 (Αρ. ATCC: CRL-5826 ) (7) Σημείωση: Όλα τα αντιδραστήρια που περιλαμβάνονται έχουν παρασκευαστεί για χρήση ειδικά με το κιτ αυτό. Για να γίνει η δοκιμή, δεν πρέπει να γίνει καμία αντικατάσταση, με εξαίρεση το EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (Κωδικός K8005). Το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx έχει προσαρμοστεί για χρήση με το Autostainer Link 48. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στις Οδηγίες χρήσης για το Autostainer Link 48 και το PT Link. 5. Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται PT Link Pre-treatment Module (Κωδικός PT100/PT101/PT200) Autostainer Link 48 (Κωδικός AS480) EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (Κωδικός K8007) EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (Κωδικός K8008) Απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό (νερό ποιότητας αντιδραστηρίου) Χρονόμετρο Θετικοί και αρνητικοί ιστοί για χρήση ως μάρτυρες επεξεργασίας (βλ. ενότητα Έλεγχος ποιότητας και Πίνακα 5) Αντικειμενοφόροι πλάκες μικροσκοπίου: Dako FLEX IHC Microscope Slides (Κωδικός K8020) ή φορτισμένες αντικειμενοφόροι πλάκες Fisherbrand Superfrost Plus. Καλυπτρίδες Για την επικάλυψη με καλυπτρίδες απαιτούνται βοηθητικά αντιδραστήρια και μέσο μόνιμης επικάλυψης Κοινό μικροσκόπιο (με αντικειμενικούς φακούς μεγέθυνσης 4x-40x) 6. Προφυλάξεις 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Για επαγγελματίες χρήστες. 3. Το προϊόν αυτό περιέχει νατραζίδιο (NaN 3 ), μια χημική ουσία που είναι ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή μορφή. Σε συγκεντρώσεις του προϊόντος, αν και δεν έχει ταξινομηθεί ως επικίνδυνο, το NaN 3 ενδέχεται να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες υδραυλικές σωληνώσεις και να δημιουργήσει ιδιαίτερα εκρηκτικές εναποθέσεις μεταλλικών αζιδίων. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε με άφθονη ποσότητα νερού για την πρόληψη συσσώρευσης αζιδίων μετάλλων στις υδραυλικές σωληνώσεις (12). 4. Το πρωτοταγές αντίσωμα, το αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα, το συνδετικό αντίσωμα Linker και το αντιδραστήριο οπτικοποίησης περιέχουν υλικό ζωικής προέλευσης. 5. Πριν από και μετά τη μονιμοποίηση, πρέπει να χειρίζεστε τα δείγματα και όλα τα υλικά που έχουν εκτεθεί σε αυτά, ως ικανά για τη μετάδοση λοιμώξεων και επομένως πρέπει να τα απορρίπτετε με τις κατάλληλες προφυλάξεις (13). 6. Τυχόν εφαρμογή χρόνων, θερμοκρασιών ή μεθόδων επώασης διαφορετικών από εκείνα που καθορίζονται στις οδηγίες ενδέχεται να δώσει εσφαλμένα αποτελέσματα. 7. Τα αντιδραστήρια έχουν αραιωθεί με βέλτιστο τρόπο. Κάθε περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να προκαλέσει μείωση της αντιγονικής χρώσης. 8. Το αντιδραστήριο οπτικοποίησης, το υγρό DAB+ χρωμογόνο και το παρασκευασμένο διάλυμα χρωμογόνου-υποστρώματος DAB+ μπορεί να επηρεαστεί αρνητικά εάν εκτεθεί σε έντονο φως. Μη φυλάσσετε τα μέρη του συστήματος και μην εκτελείτε χρώση σε έντονο φως, όπως π.χ. το άμεσο ηλιακό φως. 9. Τα υπολείμματα παραφίνης μπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αρνητικά αποτελέσματα. 10. Η χρήση όγκων αντιδραστηρίων διαφορετικών από τους συνιστώμενους ενδέχεται να οδηγήσει σε απώλεια της ορατής ανοσοαντιδραστικότητας του PD-L Για μεγάλες τομές ιστού που καλύπτουν 2/3 της αντικειμενοφόρου πλάκας, μπορεί να απαιτούνται 3x150 µl αντιδραστηρίου. 12. Ως γενικός κανόνας, άτομα ηλικίας κάτω των 18 ετών δεν επιτρέπεται να εργάζονται με το προϊόν αυτό. Οι χρήστες πρέπει να λαμβάνουν οδηγίες για τις σωστές διαδικασίες εργασίας, τις επικίνδυνες ιδιότητες του προϊόντος και τις απαραίτητες οδηγίες ασφαλείας. Ανατρέξτε στο Φύλλο δεδομένων ασφαλείας (SDS) για πρόσθετες πληροφορίες. 13. Πρέπει να φοράτε κατάλληλα Μέσα ατομικής προστασίας για να αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 14. Το αχρησιμοποίητο διάλυμα θα πρέπει να απορρίπτεται σύμφωνα με τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισμούς. 15. Το Φύλλο δεδομένων ασφαλείας διατίθεται σε επαγγελματίες χρήστες κατόπιν αίτησης. Κίνδυνος DAB+ χρωμογόνο: 1 5% διφαινυλο-3,3',4,4'-τετραχλωριούχο τετραϋλοτετραμμώνιο H350 Μπορεί να προκαλέσει καρκίνο. H341 Υπάρχει υποψία ότι προκαλεί γενετικές βλάβες. P201 Λάβετε ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. P202 Μην το χρησιμοποιείτε μέχρι να διαβάσετε και κατανοήσετε όλες τις προφυλάξεις ασφαλείας. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια ή το πρόσωπο. Να φοράτε προστατευτική ενδυμασία. P308 + P313 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ έκθεσης ή ανησυχίας: Ζητήστε ιατρική φροντίδα. P405 Να φυλάσσεται κλειδωμένο. P501 Απορρίψτε τα περιεχόμενα και τον περιέκτη σύμφωνα με όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισμούς. P03914GR_04/SK / σελ. 4/24

5 Προειδοποίηση EnVision FLEX Target Retrieval Solution, χαμηλό ph (50x): 1-5% κιτρικό οξύ H319 Προκαλεί σοβαρό οφθαλμικό ερεθισμό. H411 Τοξικό για τους υδρόβιους οργανισμούς, με μακροχρόνιες επιπτώσεις. P280 Να φοράτε μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια ή το πρόσωπο. P273 Αποφύγετε την απελευθέρωσή του στο περιβάλλον. P264 Πλύνετε τα χέρια σας σχολαστικά μετά το χειρισμό. P305 + P351 + P338 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΠΟΥ ΕΡΘΕΙ ΣΕ ΕΠΑΦΗ ΜΕ ΤΟΥΣ ΟΦΘΑΛΜΟΥΣ: Ξεπλύνετε προσεκτικά με νερό για αρκετά λεπτά. Αφαιρέστε τους φακούς επαφής, εάν φοράτε και εάν είναι εύκολη η αφαίρεσή τους. Συνεχίστε την έκπλυση. P337 + P313 Εάν ο ερεθισμός των οφθαλμών παραμένει: Ζητήστε ιατρική φροντίδα. P501 Απορρίψτε τα περιεχόμενα και τον περιέκτη σύμφωνα με όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισμούς. 7. Φύλαξη Αποθηκεύετε όλα τα συστατικά του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, συμπεριλαμβανομένων των αντικειμενοφόρων πλακών μάρτυρα, στο αρχικό δοχείο σε σκοτεινό χώρο, σε θερμοκρασία 2-8 C, όταν δεν χρησιμοποιούνται στο Autostainer Link 48. Μην χρησιμοποιείτε το κιτ μετά την ημερομηνία λήξης που βρίσκεται εκτυπωμένη στο εξωτερικό της συσκευασίας του κιτ. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται σε διαφορετικές συνθήκες από εκείνες που προδιαγράφονται στο παρόν ένθετο συσκευασίας, η καταλληλότητά τους πρέπει να επικυρώνεται από το χρήστη. Δεν υπάρχουν εμφανείς ενδείξεις που υποδηλώνουν αστάθεια του προϊόντος αυτού. Επομένως, οι θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες θα πρέπει να εξετάζονται ταυτόχρονα με τα δείγματα του ασθενούς. 8. Παρασκευή δειγμάτων Ο χειρισμός των δειγμάτων πρέπει να είναι τέτοιος ώστε να διατηρούν τον ιστό για τη χρώση IHC. Οι τυπικές μέθοδοι επεξεργασίας ιστών πρέπει να χρησιμοποιούνται σε όλα τα δείγματα. 8.1 Τομές εγκλεισμένες σε παραφίνη Ιστοί μονιμοποιημένοι σε φορμαλίνη και εγκλεισμένοι σε παραφίνη είναι κατάλληλοι προς χρήση. Οι συνιστώμενες συνθήκες χειρισμού και επεξεργασίας είναι οι εξής: Χρόνος ισχαιμίας <30 λεπτά πριν από τη βύθιση σε μέσο μονιμοποίησης και χρόνος μονιμοποίησης ώρες σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 10%. Εναλλακτικά μονιμοποιητικά δεν έχουν επικυρωθεί και ενδέχεται να δώσουν λανθασμένα αποτελέσματα. Τα δείγματα θα πρέπει να τεμαχίζονται σε πάχος 3 ή 4 mm, να μονιμοποιούνται σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 10%, καθώς και να αφυδατώνονται και να καθαρίζονται σε μια σειρά διαλυμάτων αλκοόλης και ξυλενίου και, στη συνέχεια, να εμποτίζονται με τηγμένη παραφίνη. Η θερμοκρασία παραφίνης δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τους 60 C. 8.2 Χρήση απασβεστωμένων ιστών Η χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx σε απασβεστωμένους ιστούς δεν έχει επικυρωθεί και δεν συνιστάται. 8.3 Σύσταση φύλαξης τομών Τα δείγματα ιστού πρέπει να κόβονται σε τομές 4-5 µm. Μετά τον τεμαχισμό, οι ιστοί θα πρέπει να τοποθετούνται σε φορτισμένες αντικειμενοφόρες πλάκες Fisherbrand Superfrost Plus ή αντικειμενοφόρες πλάκες μικροσκοπίου Dako FLEX IHC (Κωδικός K8020) και, στη συνέχεια, να τοποθετούνται σε φούρνο στους 58 ± 2 C για 1 ώρα. Για να διατηρηθεί η αντιγονικότητα, οι τομές ιστών, μόλις τοποθετηθούν σε αντικειμενοφόρες πλάκες, θα πρέπει να αποθηκεύονται σε σκοτεινό χώρο, σε θερμοκρασία 2-8 C ή σε θερμοκρασία δωματίου έως και 25 C και να χρωματίζονται εντός 4 μηνών από τον τεμαχισμό. Οι συνθήκες χειρισμού και φύλαξης των αντικειμενοφόρων πλακών δεν θα πρέπει να υπερβαίνουν τους 25 C ανά πάσα στιγμή μετά την επικάλυψη, προκειμένου να διασφαλίζεται η αντιγονικότητα και η ακεραιότητα των ιστών. 9. Προετοιμασία αντιδραστηρίων Πριν από τη χρώση πρέπει να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Παρασκευάστε επαρκή ποσότητα Target Retrieval Solution, Low ph αραιώνοντας το Target Retrieval Solution, Low ph (50x) σε αναλογία 1:50 χρησιμοποιώντας νερό ποιότητας αντιδραστηρίου. Το ph του 1x Target Retrieval Solution θα πρέπει να είναι 6,1 ± 0,2. Μία φιάλη 30 ml του Target Retrieval Solution, χαμηλό ph (50x) αραιωμένη σε αναλογία 1:50, θα παρέχει 1,5 L 1x αντιδραστηρίου, επαρκούς για την πλήρωση ενός δοχείου PT Link, το οποίο θα χρησιμοποιηθεί σε έως και 24 αντικειμενοφόρες πλάκες ανά χρήση. Απορρίψτε 1x Target Retrieval Solution μετά από τρεις χρήσεις και όχι αργότερα από 5 ημέρες μετά την αραίωση. Επιπλέον διάλυμα EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) εάν απαιτείται, διατίθεται με τον Κωδικό K8005. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Για τα στάδια της πλύσης, παρασκευάστε μια επαρκή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης, αραιώνοντας το Wash Buffer (20x) σε αναλογία 1:20 χρησιμοποιώντας νερό ποιότητας αντιδραστηρίου για τα βήματα πλύσης. Φυλάσσετε όσο ρυθμιστικό διάλυμα δεν χρησιμοποιηθεί στους 2-8 C για διάστημα όχι μεγαλύτερο από ένα μήνα. Εάν το ρυθμιστικό διάλυμα παρουσιάζει νεφέλωση, απορρίψτε το. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στις Οδηγίες χρήσης για το Autostainer Link 48. Το EnVision FLEX Wash Buffer (20x) διατίθεται με τον Κωδικό K8007. Διάλυμα υποστρώματος-χρωμογόνου DAB+ Το διάλυμα αυτό πρέπει να αναμειγνύεται σχολαστικά πριν από τη χρήση. Τυχόν ίζημα που έχει σχηματιστεί στο διάλυμα δεν επηρεάζει δυσμενώς την ποιότητα της χρώσης. Για την παρασκευή του διαλύματος χρωμογόνου-υποστρώματος DAB+, προσθέστε 1 σταγόνα υγρού DAB+ Chromogen ανά ml ρυθμιστικού διαλύματος DAB+ Substrate Buffer και αναδεύστε. Το παρασκευασμένο διάλυμα υποστρώματος-χρωμογόνου είναι σταθερό για 5 ημέρες εάν αποθηκευτεί σε σκοτεινό χώρο, σε θερμοκρασία 2-8 C. P03914GR_04/SK / σελ. 5/24

6 Σημαντικές σημειώσεις: Εάν χρησιμοποιείτε μία ολόκληρη φιάλη ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος DAB+, προσθέστε 9 σταγόνες χρωμογόνου DAB+. Παρόλο που στην ετικέτα αναγράφεται η ένδειξη 7,2 ml, αυτός είναι ο μη χρησιμοποιήσιμος όγκος και δεν προσμετράται στο "νεκρό όγκο" της φιάλης. Το χρώμα του υγρού χρωμογόνου DAB+ στη φιάλη ενδέχεται να ποικίλλει από διαυγές έως ανοιχτό μοβ-καφέ. Αυτό δεν επηρεάζει δυσμενώς την απόδοση του προϊόντος αυτού. Αραιώστε σύμφωνα με τις παραπάνω οδηγίες. Η προσθήκη επιπλέον υγρού DAB+ χρωμογόνο στο DAB+ ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος έχει ως αποτέλεσμα τη χειροτέρευση του θετικού σήματος. 10. Διαδικασία χρώσης στο Autostainer Link 48 Σημειώσεις διαδικασίας Ο χρήστης πρέπει να μελετήσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί με όλα τα συστατικά μέρη και όργανα, πριν από τη χρήση (βλ. ενότητα Προφυλάξεις). Όλα τα αντιδραστήρια πριν από την ανοσοχρώση, πρέπει να ισορροπούν σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C). Με παρόμοιο τρόπο, όλες οι επωάσεις πρέπει να εκτελεστούν σε θερμοκρασία δωματίου. Μην επιτρέπετε το στέγνωμα των ιστικών τομών κατά τη διαδικασία χρώσης. Οι στεγνές τομές ιστών ενδέχεται να παρουσιάσουν αυξημένη μη ειδική χρώση. Όλα τα απαιτούμενα βήματα και οι χρόνοι επώασης για τη χρώση έχουν προγραμματιστεί εκ των προτέρων στο λογισμικό του Dako Link. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα πρωτόκολλα προγραμματισμού και την τοποθέτηση των αντικειμενοφόρων πλακών και των αντιδραστηρίων, ανατρέξτε στις Οδηγίες χρήσης για το Autostainer Link 48 και το PT Link. Σημείωση: Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται με το παρόν σύστημα έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση με χρήση των συνιστώμενων αντιδραστηρίων και υλικών. Η περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή η αλλαγή στους χρόνους επώασης ή στις θερμοκρασίες, μπορεί δώσουν εσφαλμένα ή αντικρουόμενα αποτελέσματα. Πρωτόκολλο χρώσης Επιλέξτε το πρωτόκολλο χρώσης PD-L1 IHC 28-8 pharmdx από τις επιλογές στο αναπτυσσόμενο μενού του DakoLink. Όλα τα απαιτούμενα βήματα και οι χρόνοι επώασης για τη χρώση έχουν προγραμματιστεί εκ των προτέρων στο Dako Link. Εάν τα κατάλληλα πρωτόκολλα PD-L1 IHC 28-8 pharmdx δεν βρίσκονται στον διακομιστή σας, επικοινωνήστε με τον τοπικό αντιπρόσωπο της τεχνικής υπηρεσίας. Βήμα 1: Διαδικασία αποπαραφίνωσης, επανυδάτωσης και ανάκτησης στόχου (3 σε 1) Συνιστώμενη διαδικασία: Για λεπτομέρειες, ανατρέξτε στον οδηγό χρήσης του PT Link. Ορίστε τη θερμοκρασία προθέρμανσης (Preheat) και ψύξης (Cool) του PT Link (Κωδικός PT100/PT101/PT200) στους 65 C. Ορίστε τη θέρμανση στους 97 C για 20 λεπτά. Γεμίστε τα δοχεία PT Link με 1,5 L ανά δοχείο από το Target Retrieval Solution, Low ph, 1x διάλυμα εργασίας, για να καλύψετε τις τομές των ιστών. Προθερμάνετε το Target Retrieval Solution στους 65 C. Εμβαπτίστε τους υποδοχείς Autostainer που περιέχουν τις τοποθετημένες τομές ιστών FFPE στο προθερμασμένο Target Retrieval Solution, Low ph (1x διάλυμα εργασίας) στο δοχείο PT Link. Επωάστε επί 20 λεπτά σε θερμοκρασία 97 C. Μόλις ολοκληρωθεί ο χρόνος επώασης ανάκτησης στόχου και η θερμοκρασία μειωθεί στους 65 C, αφαιρέστε κάθε υποδοχέα αντικειμενοφόρων πλακών Autostainer με τις αντικειμενοφόρες πλάκες από το δοχείο PT Link και τοποθετήστε αμέσως τον υποδοχέα Autostainer με τις αντικειμενοφόρες πλάκες μέσα σε ένα δοχείο (π.χ., PT Link Rinse Station, Κωδικός PT109) που περιέχει αραιωμένο Wash Buffer (Κωδικός K8007) σε θερμοκρασία δωματίου. Αφήστε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε αραιωμένο, σε θερμοκρασία δωματίου, ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης για 5 λεπτά. Βήμα 2: Διαδικασία χρώσης Μετά τη διαδικασία αποπαραφίνωσης, επανυδάτωσης και ανάκτησης στόχου (3 σε 1), οι υποδοχείς Autostainer με τις αντικειμενοφόρες πλάκες τοποθετούνται στο Autostainer Link 48. Ενώ φορτώνετε και πριν από την έναρξη του κύκλου, βεβαιωθείτε ότι οι αντικειμενοφόρες παραμένουν υγρές με ρυθμιστικό διάλυμα. Το όργανο διεξάγει τη διαδικασία χρώσης χρησιμοποιώντας το κατάλληλο αντιδραστήριο, παρακολουθώντας το χρόνο επώασης και εκπλένοντας τις αντικειμενοφόρες πλάκες μεταξύ των αντιδραστηρίων. Οι χρόνοι αντιδραστηρίων έχουν προγραμματιστεί εκ των προτέρων στο λογισμικό του Dako Link. Βήμα 3: Αντίχρωση Οι αντικειμενοφόρες πλάκες θα πρέπει να υποβληθούν σε αντίχρωση με αιματοξυλίνη για 7 λεπτά, με χρήση του EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (Κωδικός K8008). Ο χρόνος επώασης του Hematoxylin έχει προγραμματιστεί εκ των προτέρων στο πρωτόκολλο. Βήμα 4: Επικάλυψη Απαιτείται μη υδατικό μέσο μόνιμης επικάλυψης. Σημείωση: Ωστόσο, μπορεί να παρατηρηθεί κάποιος αποχρωματισμός των χρωματισμένων αντικειμενοφόρων πλακών με την πάροδο του χρόνου, ο οποίος εξαρτάται από αρκετούς παράγοντες που περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, την αντίχρωση, τα υλικά και τις μεθόδους επικάλυψης και τις συνθήκες αποθήκευσης των αντικειμενοφόρων πλακών. Για να ελαχιστοποιήσετε τον αποχρωματισμό, αποθηκεύστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες σε σκοτεινό μέρος και σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C). 11. Ποιοτικός έλεγχος Τα αντιδραστήρια στο PD-L1 IHC 28-8 pharmdx έχουν υποβληθεί σε ποιοτικό έλεγχο ανοσοϊστοχημικώς, χρησιμοποιώντας τις διαδικασίες χρώσης και ανάκτησης στόχου που περιγράφονται παραπάνω. Οι αποκλίσεις του εργαστηρίου του χρήστη από τις προτεινόμενες διαδικασίες μονιμοποίησης, επεξεργασίας και εγκλεισμού του ιστού ενδέχεται να προκαλούν σημαντικές διακυμάνσεις στα αποτελέσματα. Θα πρέπει να πραγματοποιούνται έλεγχοι ποιότητας σε κάθε κύκλο χρώσης. Αυτοί οι έλεγχοι ποιότητας καθορίζονται στον Πίνακα 5 και περιλαμβάνουν τα εξής: ένα δείγμα ιστού ασθενούς κεχρωσμένο με H&E, ιστούς αρνητικού και θετικού μάρτυρα παρεχόμενους από το εργαστήριο, καθώς και μια αντικειμενοφόρο πλάκα μάρτυρα που παρέχεται από την Dako (15). Στις Η.Π.Α., συμβουλευτείτε τις οδηγίες ποιοτικού ελέγχου του College of American Pathologists (CAP) Accreditation Program for Immunohistochemistry (Πρόγραμμα πιστοποίησης για την ανοσοϊστοχημεία από το Σύλλογο Αμερικανών Παθολογοανατόμων). Για περισσότερες πληροφορίες, βλ. επίσης το CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (14) (Εγκεκριμένη κατευθυντήρια οδηγία διασφάλισης ποιότητας για την ανοσοϊστοχημεία του CLSI). P03914GR_04/SK / σελ. 6/24

7 12. Επαλήθευση δοκιμασίας προσδιορισμού Πριν το σύστημα χρώσης χρησιμοποιηθεί σε διαγνωστικές διαδικασίες, ο χρήστης θα πρέπει να επαληθεύσει την απόδοση της δοκιμασίας, εξετάζοντάς την με μια σειρά ιστών του εργαστηρίου που έχουν γνωστά χαρακτηριστικά απόδοσης σε τεχνικές IHC και οι οποίοι να αντιπροσωπεύουν γνωστούς θετικούς και αρνητικούς ιστούς. Ανατρέξτε στις διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου που περιγράφηκαν προηγουμένως στην ενότητα αυτή του ένθετου προϊόντος. Αυτές οι διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου πρέπει να επαναλαμβάνονται για κάθε νέο κιτ ή σε κάθε περίπτωση μεταβολής των παραμέτρων του προσδιορισμού. Οι επιλογές αντιμετώπισης προβλημάτων για ενδεχόμενα προβλήματα, οι αιτίες τους και οι προτεινόμενες διορθωτικές ενέργειες περιγράφονται στον Πίνακα Ερμηνεία της χρώσης Η αξιολόγηση της αντικειμενοφόρας πρέπει να πραγματοποιείται από παθολόγο με χρήση κοινού μικροσκοπίου. Για την αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης και της βαθμολόγησης του PD-L1, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένας φακός αντικειμενικής μεγέθυνσης 4x για την αρχική αξιολόγηση ολόκληρου του δείγματος, και κατόπιν μπορούν να χρησιμοποιηθούν φακοί αντικειμενικής μεγέθυνσης 10-20x για τη βαθμολόγηση (εάν είναι απαραίτητο, μπορούν να χρησιμοποιηθούν φακοί μεγέθυνσης 40x για επιβεβαίωση). Η χρώση του PD-L1 υποδεικνύεται με ένα καφέ προϊόν αντίδρασης (3,3 -διαμινοβενζιδίνη, DAB). Η θετική χρώση του PD-L1 ορίζεται ως πλήρης περιφερειακή ή/και μερική γραμμική χρώση της πλασματικής μεμβράνης των κυττάρων όγκων σε οποιαδήποτε ένταση. Πρέπει να αξιολογηθεί ολόκληρο το δείγμα. Όλα τα βιώσιμα κύτταρα όγκων σε ολόκληρη την κεχρωσμένη αντικειμενοφόρα πλάκα ασθενούς PD-L1 πρέπει να αξιολογηθούν και να συμπεριληφθούν στην αξιολόγηση βαθμολόγησης PD-L1. Θα πρέπει να υπάρχουν τουλάχιστον 100 βιώσιμα κύτταρα όγκων στην κεχρωσμένη αντικειμενοφόρο πλάκα ασθενούς PD-L1, προκειμένου να προσδιοριστεί το ποσοστό των κεχρωσμένων κυττάρων. Ανατρέξτε στις ενότητες ερμηνείας χρώσης ανάλογα με την ένδειξη στο παρόν έγγραφο για λεπτομερείς οδηγίες. Τυχόν κυτταροπλασματική χρώση, εάν παρατηρηθεί, δεν λαμβάνεται υπόψη για σκοπούς βαθμολόγησης. Μη κακοήθη κύτταρα και ανοσοκύτταρα (π.χ., διηθητικά λεμφοκύτταρα ή μακροφάγα) μπορεί επίσης να παρουσιάσουν χρώση με το PD-L1. Ωστόσο, δεν θα πρέπει να συμπεριληφθούν στη βαθμολογία για τον προσδιορισμό της θετικότητας του PD-L1. Για κάθε κύκλο χρώσης, οι αντικειμενοφόρες πλάκες θα πρέπει να εξετάζονται με τη σειρά που αναφέρεται στον Πίνακα 5, για τον προσδιορισμό της εγκυρότητας του κύκλου χρώσης και την αξιολόγηση της χρώσης στον ιστό του δείγματος. Για πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τη βαθμολόγηση του PD-L1, ανατρέξτε στους πίνακες ερμηνείας χρώσης ανάλογα με την ένδειξη στο παρόν έγγραφο και στο σχετικό PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Interpretation Manual (Εγχειρίδιο ερμηνειών του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx) για την αντίστοιχη ένδειξη Ερμηνεία χρώσης: Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Πρέπει να αξιολογηθεί ολόκληρο το δείγμα. Όλα τα βιώσιμα κύτταρα όγκων σε ολόκληρη την κεχρωσμένη αντικειμενοφόρα πλάκα ασθενούς PD-L1 πρέπει να αξιολογηθούν και να συμπεριληφθούν στην αξιολόγηση βαθμολόγησης PD-L1. Θα πρέπει να υπάρχουν τουλάχιστον 100 βιώσιμα κύτταρα όγκων στην κεχρωσμένη αντικειμενοφόρο πλάκα ασθενούς PD-L1, προκειμένου να προσδιοριστεί το ποσοστό των κεχρωσμένων κυττάρων. Για τα δείγματα μη πλακώδους ΜΜΚΠ, καταγράψτε το ποσοστό βιώσιμων ογκοκυττάρων που εμφανίζουν περιφερειακή ή/και μερική γραμμική χρώση της πλασματικής μεμβράνης του PD-L1 σε οποιαδήποτε ένταση. Πίνακας 1: Ερμηνεία χρώσης: Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Ένδειξη Ελάχιστα βιώσιμα ογκοκύτταρα που απαιτούνται για τη βαθμολόγηση Μη κακοήθη κύτταρα και ανοσοκύτταρα Κυτταροπλασματική χρώση, στρωματικά κύτταρα, νεκρωτικά κύτταρα και κυτταρικά κατάλοιπα Άλλα στοιχεία Μη πλακώδης ΜΜΚΠ 100 Δεν συμπεριλαμβάνονται στη βαθμολόγηση Δεν λαμβάνονται υπόψη για σκοπούς βαθμολόγησης ΜΔ 13.2 Ερμηνεία χρώσης: Καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων της κεφαλής και του αυχένα (ΚΠΚΚΑ) Αυτή η δοκιμασία επικυρώθηκε για δείγματα διηθητικού ιστού ΚΠΚΚΑ και όχι για αλλοιώσεις με εστίες δυσπλασίας ή καρκίνωμα in situ. Οι κεχρωσμένες με H&E αντικειμενοφόροι πλάκες θα πρέπει να συνοδεύουν κάθε δείγμα κεχρωσμένου PD-L1 για να είναι δυνατή η κατάλληλη αξιολόγηση του διηθητικού καρκινώματος, του καρκινώματος in situ και του προσκείμενου φυσιολογικού επιθηλίου. Πρέπει να αξιολογηθεί ολόκληρο το δείγμα. Όλα τα βιώσιμα κύτταρα όγκων σε ολόκληρη την κεχρωσμένη αντικειμενοφόρο πλάκα ασθενούς PD-L1 πρέπει να συμπεριληφθούν στην αξιολόγηση βαθμολόγησης PD-L1. Θα πρέπει να υπάρχουν τουλάχιστον 100 βιώσιμα κύτταρα όγκων στην κεχρωσμένη αντικειμενοφόρο πλάκα ασθενούς PD-L1, προκειμένου να προσδιοριστεί το ποσοστό των κεχρωσμένων κυττάρων. Για τα δείγματα ΚΠΚΚΑ, καταγράψτε το ποσοστό βιώσιμων ογκοκυττάρων που εμφανίζουν περιφερειακή ή/και μερική γραμμική χρώση της πλασματικής μεμβράνης του PD-L1 σε οποιαδήποτε ένταση. Πίνακας 2: Ερμηνεία χρώσης: ΚΠΚΚΑ Ελάχιστα βιώσιμα ογκοκύτταρα που Ένδειξη απαιτούνται για τη βαθμολόγηση ΚΠΚΚΑ 100 Μη κακοήθη κύτταρα και ανοσοκύτταρα Δεν συμπεριλαμβάνονται στη βαθμολόγηση Κυτταροπλασματική χρώση, στρωματικά κύτταρα, νεκρωτικά κύτταρα και κυτταρικά κατάλοιπα Δεν λαμβάνονται υπόψη για σκοπούς βαθμολόγησης Άλλα στοιχεία Τα κύτταρα εντός εστιών δυσπλασίας και καρκινώματος in situ δεν περιλαμβάνονται στη βαθμολόγηση. Οι συνοδευτικές αντικειμενοφόροι πλάκες H&E επιτρέπουν την κατάλληλη αξιολόγηση του διηθητικού καρκινώματος, του καρκινώματος in situ και του προσκείμενου φυσιολογικού επιθηλίου. P03914GR_04/SK / σελ. 7/24

8 13.3 Ερμηνεία χρώσης: Ουροθηλιακό καρκίνωμα Αυτή η δοκιμασία επικυρώθηκε για δείγματα διηθητικού ιστού ουροθηλιακού καρκινώματος και όχι για αλλοιώσεις με εστίες δυσπλασίας ή καρκίνωμα in situ. Οι κεχρωσμένες με H&E αντικειμενοφόροι πλάκες θα πρέπει να συνοδεύουν κάθε δείγμα κεχρωσμένου PD-L1 για να είναι δυνατή η κατάλληλη αξιολόγηση του διηθητικού καρκινώματος, του καρκινώματος in situ και του προσκείμενου φυσιολογικού επιθηλίου. Πρέπει να αξιολογηθεί ολόκληρο το δείγμα. Όλα τα βιώσιμα κύτταρα όγκων σε ολόκληρη την κεχρωσμένη αντικειμενοφόρο πλάκα ασθενούς PD-L1 πρέπει να συμπεριληφθούν στην αξιολόγηση βαθμολόγησης PD-L1. Θα πρέπει να υπάρχουν τουλάχιστον 100 βιώσιμα ογκοκύτταρα στην κεχρωσμένη αντικειμενοφόρα πλάκα ασθενούς PD-L1, προκειμένου να προσδιοριστεί το ποσοστό των κεχρωσμένων κυττάρων. Για τα δείγματα ουροθηλιακού καρκινώματος, καταγράψτε το ποσοστό βιώσιμων ογκοκυττάρων που εμφανίζουν περιφερειακή ή/και μερική γραμμική χρώση της πλασματικής μεμβράνης του PD-L1 σε οποιαδήποτε ένταση. Πίνακας 3: Ερμηνεία χρώσης: Ουροθηλιακό καρκίνωμα Ελάχιστα βιώσιμα Μη κακοήθη ογκοκύτταρα που Ένδειξη κύτταρα και απαιτούνται για τη ανοσοκύτταρα βαθμολόγηση Ουροθηλιακό καρκίνωμα 100 Δεν συμπεριλαμβάνονται στη βαθμολόγηση Κυτταροπλασματική χρώση, στρωματικά κύτταρα, νεκρωτικά κύτταρα και κυτταρικά κατάλοιπα Δεν λαμβάνονται υπόψη για σκοπούς βαθμολόγησης Άλλα στοιχεία Τα κύτταρα εντός εστιών δυσπλασίας και καρκινώματος in situ δεν περιλαμβάνονται στη βαθμολόγηση. Οι συνοδευτικές αντικειμενοφόροι πλάκες H&E επιτρέπουν την κατάλληλη αξιολόγηση του διηθητικού καρκινώματος, του καρκινώματος in situ και του προσκείμενου φυσιολογικού επιθηλίου Ερμηνεία χρώσης: Μελάνωμα Πρέπει να αξιολογηθεί ολόκληρο το δείγμα. Όλα τα βιώσιμα κύτταρα όγκων σε ολόκληρη την κεχρωσμένη αντικειμενοφόρα πλάκα ασθενούς PD-L1 πρέπει να αξιολογηθούν και να συμπεριληφθούν στην αξιολόγηση βαθμολόγησης PD-L1. Θα πρέπει να υπάρχουν τουλάχιστον 100 βιώσιμα κύτταρα όγκων στην κεχρωσμένη αντικειμενοφόρο πλάκα ασθενούς PD-L1, προκειμένου να προσδιοριστεί το ποσοστό των κεχρωσμένων κυττάρων. Τα δείγματα θεωρείται ότι είναι θετικά για PD-L1 εάν 1% των κυττάρων μελανώματος εμφανίζουν περιφερειακή ή/και μερική γραμμική χρώση της πλασματικής μεμβράνης του PD-L1 των ογκοκυττάρων σε οποιαδήποτε ένταση. Τα δείγματα θεωρείται ότι είναι αρνητικά για PD-L1 εάν <1% των κυττάρων μελανώματος εμφανίζουν περιφερειακή ή/και μερική γραμμική χρώση της πλασματικής μεμβράνης του PD-L1 των ογκοκυττάρων σε οποιαδήποτε ένταση. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κατά την ερμηνεία των δειγμάτων μελανωμάτων των ασθενών, ενδέχεται να υπάρχει χρώση μελανίνης καστανού χρώματος. Η μελανίνη δεν θα πρέπει να περιλαμβάνεται στη βαθμολογία της χρώσης πλασματικής μεμβράνης. Η σύγκριση με μια διαδοχική αντικειμενοφόρο πλάκα κεχρωσμένη με το NCR ενδέχεται να είναι χρήσιμη για τον προσδιορισμό και τον αποκλεισμό του περιεχομένου μελανίνης. Εάν τα εξαιρετικά αυξημένα επίπεδα μελανίνης αποκλείουν τη βαθμολογία της χρώσης πλασματικής μεμβράνης των κυττάρων όγκων, το δείγμα ενδέχεται να μην συμπεριληφθεί στην ερμηνεία και να θεωρηθεί ότι είναι απροσδιόριστο. Πίνακας 4: Ερμηνεία χρώσης: Μελάνωμα Ελάχιστα βιώσιμα ογκοκύτταρα που Μη κακοήθη κύτταρα Ένδειξη απαιτούνται για τη και ανοσοκύτταρα βαθμολόγηση Μελάνωμα 100 Δεν συμπεριλαμβάνονται στη βαθμολόγηση Κυτταροπλασματική χρώση, στρωματικά κύτταρα, νεκρωτικά κύτταρα και κυτταρικά κατάλοιπα Δεν λαμβάνονται υπόψη για σκοπούς βαθμολόγησης Άλλα στοιχεία Η μελανίνη δεν θα πρέπει να περιλαμβάνεται στη βαθμολόγηση της χρώσης πλασματικής μεμβράνης. Η σύγκριση με μια διαδοχική αντικειμενοφόρο πλάκα κεχρωσμένη με το NCR ενδέχεται να είναι χρήσιμη για τον προσδιορισμό και τον αποκλεισμό του περιεχομένου μελανίνης. 14. Αξιολόγηση αντικειμενοφόρας πλάκας Πίνακας 5: Προτεινόμενη σειρά αξιολόγησης των αντικειμενοφόρων πλακών Δείγματα Αιτιολογία Απαιτήσεις 1. Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (H&E) (Παρέχεται από το εργαστήριο) Αρχικά αξιολογείται μια χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης (H&E) του ιστικού δείγματος, προκειμένου να αξιολογηθεί η ποιότητα της ιστολογικής επεξεργασίας και της διατήρησης του ιστού. Η χρώση H&E και του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx θα πρέπει να πραγματοποιούνται σε διαδοχικές τομές από το ίδιο μπλοκ παραφίνης του δείγματος. Τα δείγματα ιστού θα πρέπει να είναι ακέραια, κατάλληλα διατηρημένα και θα πρέπει να επιβεβαιώνουν την ένδειξη όγκου. P03914GR_04/SK / σελ. 8/24

9 2. Αντικειμενοφόρος πλάκα μάρτυρα (Παρέχεται από την Dako) 3. Αντικειμενοφόρες πλάκες ιστού θετικού μάρτυρα (Παρέχεται από το εργαστήριο) 4. Αντικειμενοφόρες πλάκες ιστού αρνητικού μάρτυρα (Παρέχεται από το εργαστήριο) Η αντικειμενοφόρος πλάκα μάρτυρα, που είναι κεχρωσμένη με το πρωτοταγές αντίσωμα PD- L1 από το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, θα πρέπει να εξετάζεται για να διασφαλιστεί ότι όλα τα αντιδραστήρια λειτουργούν σωστά. Η αντικειμενοφόρα πλάκα μάρτυρα περιέχει το συμπύκνωμα κυτταρικών σειρών θετικών για PD-L1 και το συμπύκνωμα κυτταρικών σειρών αρνητικών για PD-L1. Στη συνέχεια, θα πρέπει να εξεταστούν οι αντικειμενοφόροι πλάκες με ιστό θετικού μάρτυρα, οι οποίες έχουν υποβληθεί σε χρώση με το πρωτοταγές αντίσωμα κατά του PD-L1 και με το αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα. Αυτές οι αντικειμενοφόροι πλάκες επαληθεύουν ότι η μέθοδος μονιμοποίησης και η διαδικασία ανάκτησης στόχου είναι αποτελεσματικές. Γνωστοί ιστοί θετικού μάρτυρα θα πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο για την παρακολούθηση της σωστής απόδοσης των επεξεργασμένων ιστών και των αντιδραστηρίων της εξέτασης, και ΟΧΙ ως βοήθημα στο σχηματισμό κάποιας συγκεκριμένης διάγνωσης των δειγμάτων του ασθενούς. Στη συνέχεια, θα πρέπει να εξεταστούν οι αντικειμενοφόροι πλάκες με ιστό αρνητικού μάρτυρα (που είναι γνωστό ότι είναι αρνητικός για PD-L1), οι οποίες έχουν υποβληθεί σε χρώση με το πρωτοταγές αντίσωμα κατά του PD-L1 και με το αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα, για επαλήθευση της ειδικότητας της σήμανσης του αντιγόνου-στόχου από το πρωτοταγές αντίσωμα. Εναλλακτικά, αρνητικά τμήματα του ιστού αρνητικού-μάρτυρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ιστός αρνητικός-μάρτυρας, αλλά αυτό πρέπει να επαληθεύεται από το χρήστη. Θα πρέπει να πραγματοποιηθεί χρώση μίας αντικειμενοφόρου πλάκας μάρτυρα με το πρωτοταγές αντίσωμα έναντι του PD-L1 σε κάθε κύκλο χρώσης. Κριτήρια αποδοχής του NCI-H226 (κυτταρική σειρά θετικού μάρτυρα για PD-L1, προερχόμενη από καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων ανθρώπινου πνεύμονα με θετική έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1): Χρώση πλασματικής μεμβράνης σε ποσοστό 80% των κυττάρων σε μέση ένταση χρώσης 2+. Μη ειδική χρώση σε ένταση <1+. Κριτήρια αποδοχής του MCF-7 (κυτταρική σειρά αρνητικού μάρτυρα για PD-L1, προερχόμενη από αδενοκαρκίνωμα ανθρώπινου μαστού με αρνητική έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1): Μη ειδική χρώση. Μη ειδική χρώση σε ένταση <1+. Λάβετε υπόψη ότι ενδέχεται περιστασιακά να παρατηρείται χρώση λίγων κυττάρων στο συμπύκνωμα κυττάρων MCF-7. Ισχύουν τα ακόλουθα κριτήρια αποδοχής: Η παρουσία 10 συνολικών κυττάρων με διακριτή χρώση πλασματικής μεμβράνης ή κυτταροπλασματική χρώση με ένταση 1+ εντός των ορίων του συμπυκνώματος κυττάρων MCF-7 είναι αποδεκτή. Εάν οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές μάρτυρα δεν πληροί τα κριτήρια αυτά, όλα τα αποτελέσματα για τα δείγματα ασθενών θα πρέπει να θεωρούνται μη έγκυρα. Οι μάρτυρες θα πρέπει να είναι δείγματα από βιοψίες/χειρουργικές επεμβάσεις με την ίδια ένδειξη όγκου με το δείγμα του ασθενούς, που έχουν μονιμοποιηθεί, επεξεργαστεί και εγκλειστεί το συντομότερο δυνατό και με τον ίδιο τρόπο όπως το(τα) δείγμα(τα) ασθενούς. Για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της χρώσης, χρησιμοποιείτε άθικτα δείγματα, διότι τα νεκρωτικά ή εκφυλισμένα κύτταρα συχνά εμφανίζουν μη ειδική χρώση. Οι ιστοί που επιλέγονται για χρήση ως ιστοί θετικού μάρτυρα θα πρέπει να δίνουν ασθενή έως μέτρια θετική χρώση όταν υποβάλλονται σε χρώση με το PD-L1, ώστε να συμβάλλουν στην ανίχνευση ανεπαίσθητων μεταβολών στην ευαισθησία της δοκιμασίας. Σε κάθε κύκλο χρώσης θα πρέπει να περιλαμβάνονται δύο αντικειμενοφόρες πλάκες με ιστό θετικού μάρτυρα. Αντικειμενοφόρος πλάκα κεχρωσμένη με PD-L1: Πρέπει να παρατηρηθεί παρουσία καφέ χρώσης της πλασματικής μεμβράνης. Η μη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι έντασης 1+. Αντικειμενοφόρος πλάκα κεχρωσμένη με αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα: Απουσία χρώσης μεμβράνης. Η μη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι έντασης 1+. Αν οι ιστοί θετικού μάρτυρα δεν επιτύχουν να παρουσιάσουν κατάλληλη θετική χρώση, τα αποτελέσματα με τα δείγματα της εξέτασης πρέπει να θεωρούνται άκυρα. Οι μάρτυρες θα πρέπει να είναι δείγματα από βιοψίες/χειρουργικές επεμβάσεις με την ίδια ένδειξη όγκου με το δείγμα του ασθενούς, που έχουν μονιμοποιηθεί, επεξεργαστεί και εγκλειστεί το συντομότερο δυνατό και με τον ίδιο τρόπο όπως το(τα) δείγμα(τα) ασθενούς. Σε κάθε κύκλο χρώσης θα πρέπει να περιλαμβάνονται δύο αντικειμενοφόροι πλάκες με ιστό αρνητικού μάρτυρα. Αντικειμενοφόρος πλάκα κεχρωσμένη με PD-L1: Απουσία χρώσης μεμβράνης στα ογκοκύτταρα. Η μη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι έντασης 1+. Αντικειμενοφόρος πλάκα κεχρωσμένη με αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα: Απουσία χρώσης μεμβράνης. Η μη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι έντασης 1+. Εάν παρατηρηθεί ειδική χρώση πλασματικής μεμβράνης στις αντικειμενοφόρους πλάκες με ιστό αρνητικού μάρτυρα, τα αποτελέσματα των δειγμάτων ασθενούς θα πρέπει να θεωρηθούν μη έγκυρα. P03914GR_04/SK / σελ. 9/24

10 5. Αντικειμενοφόρος πλάκα με ιστό ασθενούς που έχει υποβληθεί σε χρώση με χρήση του αντιδραστηρίου αρνητικού μάρτυρα 6. Αντικειμενοφόρος πλάκα με ιστό ασθενούς που έχει υποβληθεί σε χρώση με χρήση του πρωτοταγούς αντισώματος κατά του PD-L1 15. Περιορισμοί Εξετάστε τα δείγματα ασθενούς που έχουν υποβληθεί σε χρώση με το αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα από το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Το αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα χρησιμοποιείται αντί του πρωτοταγούς αντισώματος και συμβάλλει στην ερμηνεία της ειδικής χρώσης στη θέση του αντιγόνου. Εξετάστε στο τέλος ολόκληρη την αντικειμενοφόρο πλάκα των δειγμάτων ασθενών με το πρωτοταγές αντίσωμα κατά του PD-L1 από το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Ανατρέξτε στην Περίληψη και επεξήγηση, τους Περιορισμούς και την Αξιολόγηση μη κλινικής απόδοσης για ειδικές πληροφορίες σχετικά με την ανοσοδραστικότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Η απουσία χρώσης πλασματικής μεμβράνης επαληθεύει την ειδική σήμανση του αντιγόνου-στόχου από το πρωτοταγές αντίσωμα PD-L1. Η μη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι έντασης 1+. Θα πρέπει να αξιολογηθεί η ένταση της θετικής χρώσης στο πλαίσιο μη ειδικής χρώσης υποβάθρου που παρατηρείται στην αντικειμενοφόρο πλάκα του αντιδραστηρίου αρνητικού μάρτυρα στον ίδιο κύκλο χρώσης. Όπως συμβαίνει με κάθε ανοσοϊστοχημική εξέταση, ένα αρνητικό αποτέλεσμα σημαίνει ότι δεν ανιχνεύτηκε αντιγόνο και όχι απαραίτητα ότι δεν υπήρχε αντιγόνο στα κύτταρα/στον ιστό που υποβλήθηκε στον προσδιορισμό. Για οδηγίες ερμηνείας χρώσης, ανατρέξτε στην ενότητα Γενικοί περιορισμοί 1. Η ανοσοϊστοχημεία είναι μια πολυβάθμια διαγνωστική διαδικασία για την οποία απαιτείται εξειδικευμένη εκπαίδευση στην επιλογή των κατάλληλων αντιδραστηρίων, την επιλογή, μονιμοποίηση και επεξεργασία των ιστών, την προετοιμασία της αντικειμενοφόρου πλάκας ανοσοϊστοχημείας και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων χρώσης. 2. Η ιστική χρώση εξαρτάται από το χειρισμό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Τυχόν εσφαλμένη καθήλωση, κατάψυξη, απόψυξη, πλύση, ξήρανση, θέρμανση, τομή ή μόλυνση από άλλους ιστούς ή υγρά είναι δυνατό να προκαλέσει τεχνήματα, παγίδευση αντισώματος ή εσφαλμένως αρνητικά αποτελέσματα. Τυχόν ασυνεπή αποτελέσματα ενδέχεται να οφείλονται σε παραλλαγές των μεθόδων μονιμοποίησης και ενσωμάτωσης ή σε εγγενείς ανωμαλίες εντός του ιστού. 3. Τυχόν υπερβολική ή ατελής επίχρωση ενδέχεται να διακυβεύσει την ορθότητα της ερμηνείας των αποτελεσμάτων. 4. Η κλινική ερμηνεία τυχόν θετικής χρώσης ή η απουσία της πρέπει να αξιολογείται στα πλαίσια της κλινικής παρουσίασης, της μορφολογίας και άλλων ιστοπαθολογικών κριτηρίων. Η κλινική ερμηνεία κάθε θετικής χρώσης ή η απουσία της θετικής χρώσης πρέπει να συμπληρώνεται από μελέτες της μορφολογίας και τους σωστούς μάρτυρες όπως επίσης και άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. Η ερμηνεία της κεχρωσμένης αντικειμενοφόρου πλάκας αποτελεί ευθύνη κατάλληλα εκπαιδευμένου παθολόγου, που είναι εξοικειωμένος με τα χρησιμοποιούμενα αντισώματα και αντιδραστήρια και τις εφαρμοζόμενες μεθόδους. Η χρώση πρέπει να εφαρμόζεται σε εργαστήριο που διαθέτει τις κατάλληλες πιστοποιήσεις και άδειες λειτουργίας, υπό την επίβλεψη παθολόγου που θα φέρει την ευθύνη της εξέτασης των κεχρωσμένων αντικειμενοφόρων πλακών και θα διασφαλίζει την επάρκεια των θετικών και των αρνητικών μαρτύρων. 5. Ιστοί από άτομα μολυσμένα από τον ιό της ηπατίτιδας Β, που περιέχουν επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας B (HBsAg), ενδέχεται να παρουσιάσουν μη ειδική χρώση με την υπεροξειδάση του χρένου (17). 6. Η πιθανότητα να λάβουν χώρα απροσδόκητες αντιδράσεις σε τύπους ιστών που έχουν υποβληθεί σε εξέταση στο παρελθόν δεν είναι δυνατό να εξαλειφθεί τελείως, λόγω της βιολογικής παραλλακτικότητας της έκφρασης αντιγόνου στα νεοπλάσματα ή σε άλλους παθολογικούς ιστούς. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τεκμηριωμένες μη αναμενόμενες αντιδράσεις, απευθυνθείτε στο Τμήμα τεχνικής υποστήριξης της Dako. 7. Ψευδώς θετικά αποτελέσματα είναι δυνατό να προκύψουν λόγω μη ανοσολογικής δέσμευσης πρωτεϊνών ή προϊόντων αντίδρασης του υποστρώματος. Επίσης, είναι δυνατό να προκύψουν από δραστηριότητα ψευδο-υπεροξειδάσης (ερυθροκύτταρα) και ενδογενούς υπεροξειδάσης (κυτόχρωμα C) (14). 8. Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται στο σύστημα αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Η περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή η αλλαγή στους χρόνους επώασης ή στις θερμοκρασίες, μπορεί δώσουν εσφαλμένα ή αντικρουόμενα αποτελέσματα Ειδικοί περιορισμοί προϊόντος 1. Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα είναι δυνατό να οφείλονται στην αποδόμηση του αντιγόνου στους ιστούς με την πάροδο του χρόνου. Οι τομές ιστών, μόλις τοποθετηθούν σε αντικειμενοφόρες πλάκες, θα πρέπει να αποθηκεύονται σε σκοτεινό χώρο, σε θερμοκρασία 2-8 C ή σε θερμοκρασία δωματίου έως και 25 C και να χρωματίζονται εντός 4 μηνών από τον τεμαχισμό. Οι συνθήκες χειρισμού και φύλαξης των αντικειμενοφόρων πλακών δεν θα πρέπει να υπερβαίνουν τους 25 C ανά πάσα στιγμή μετά την επικάλυψη, προκειμένου να διασφαλίζεται η αντιγονικότητα και η ακεραιότητα των ιστών. 2. Για βέλτιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα, η πρωτεΐνη PD-L1 απαιτεί προεπεξεργασία ανάκτησης στόχου όταν οι ιστοί μονιμοποιούνται με το συνήθη τρόπο (ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης) και εγκλείονται σε παραφίνη. 3. Μην υποκαθιστάτε αντιδραστήρια από άλλους αριθμούς παρτίδας αυτού του προϊόντος ή από κιτ άλλων κατασκευαστών. Η μοναδική εξαίρεση είναι το EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), το οποίο, εάν απαιτείται, διατίθεται με τον Κωδικό K Οι χρωματισμένες κυτταρικές σειρές μάρτυρες πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο για την επικύρωση του κύκλου χρώσης και δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται ως οδηγός για τη βαθμολόγηση της αντίδρασης χρώσης σε τομές ιστών. 5. Δεν έχει επικυρωθεί η χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx σε ιστούς με μονιμοποιητικά διαφορετικά του ουδέτερου ρυθμιστικού διαλύματος φορμαλίνης 10%. 6. Οι βιοψίες με χειρουργική εξαίρεση, κατόπιν διάνοιξης ιστού, κυλινδρικής ολικού πάχους δέρματος ή δια λεπτής βελόνης, θεωρήθηκαν αποδεκτοί τύποι δειγμάτων για τις κλινικές δοκιμές, με χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Οι αναρροφήσεις δια λεπτής βελόνης ή άλλα κυτταρολογικά δείγματα ήταν ανεπαρκή για την ανάλυση βιοδεικτών και αποκλείστηκαν από τις κλινικές δοκιμές, με χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. P03914GR_04/SK / σελ. 10/24

11 16. Αξιολόγηση μη κλινικής απόδοσης 16.1 Αναλυτική ειδικότητα για το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Το πρωτοταγές αντίσωμα για το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι του ανθρώπινου PD-L1, κλώνος Το ανοσογόνο που χρησιμοποιείται για τη δημιουργία του αντισώματος είναι ένα ανασυνδυασμένο και κεκαθαρμένο ανθρώπινο PD-L1 που περιέχει την εξωκυτταρική περιοχή (Phe19-Thr239) του ανθρώπινου PD-L1. Η χρώση IHC με το πρωτοταγές αντίσωμα PD-L1 δεν παρουσίασε διασταυρούμενη αντίδραση για το PD-L2 μέσω εξωγενούς έκφρασης σε κύτταρα ωοθηκών κινέζικου χάμστερ (CHO). Το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx ανιχνεύει ειδικά τη μεμβρανική πρωτεΐνη PD-L1 που εκφράζεται σε κύτταρα όγκων σε ιστούς FFPE, που μπορεί να εξαλειφθεί εντελώς με την προσθήκη του αντιγόνου PD-L1. Το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx δεν ανιχνεύει μεμβρανική πρωτεΐνη PD-L1 σε κύτταρα όγκων επιλεκτικώς αδρανοποιημένου (knock-out) PD-L1 στα οποία το γονίδιο PD-L1 έχει διαγραφεί γενετικά Φυσιολογικοί και νεοπλασματικοί ιστοί Στον Πίνακα 6 συνοψίζεται η ανοσοαντιδραστικότητα του μονοκλωνικού αντισώματος κουνελιού έναντι του ανθρώπινου PD-L1 στην προτεινόμενη σειρά φυσιολογικών ιστών. Στον Πίνακα 7 συνοψίζεται η ανοσοαντιδραστικότητα του μονοκλωνικού αντισώματος κουνελιού έναντι του ανθρώπινου PD-L1 σε νεοπλασματικούς ιστούς σε μικροσυστοιχίες ιστών πολλαπλών όγκων. Όλοι οι ιστοί είχαν μονιμοποιηθεί σε φορμαλίνη και εγκλειστεί σε παραφίνη και κατόπιν υποβλήθηκαν σε χρώση με το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, σύμφωνα με τις οδηγίες αυτού του ένθετου συσκευασίας. Το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx ανίχνευσε την πρωτεΐνη PD-L1 που ήταν εντοπισμένη στην πλασματική μεμβράνη κυτταρικών τύπων οι οποίοι είναι γνωστό ότι εκφράζουν το αντιγόνο PD-L1, π.χ. ανοσοκύτταρα και κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης, κυρίως κύτταρα όγκων. Πίνακας 6: Σύνοψη της αντιδραστικότητας φυσιολογικών ιστών με το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Τύπος ιστού (πλήθος που εξετάστηκε) Θετική χρώση πλασματικής μεμβράνης: Στοιχεία ιστού Θετική κυτταροπλασματική χρώση: Στοιχεία ιστού Αμυγδαλές (3) 3/3 Επιθήλιο της κρύπτης 0/3 3/3 Ανοσοκύτταρα του βλαστικού κέντρου Δέρμα (3) 0/3 1/3 Επιθήλιο Επινεφρίδια (3) 3/3 Κύτταρα του μυελού 3/3 Κύτταρα του μυελού Ήπαρ (3) 2/3 Ανοσοκύτταρα 2/3 Ανοσοκύτταρα Θύμος αδένας (3) 3/3 Επιθήλιο του μυελού 0/3 Θυρεοειδής (3) 0/3 0/3 Κυρίως εγκέφαλος (3) 0/3 0/3 Λεπτό έντερο (2) 0/2 0/2 Μαστός (3) 0/3 0/3 Μεσοθηλιακά κύτταρα (3) 0/3 0/3 Μήτρα (3) 0/3 0/3 Μυελός των οστών (3) 3/3 Μεγακαρυοκύτταρα 3/3 Μεγακαρυοκύτταρα Μυς, καρδιακός (3) 0/2 0/2 Μυς, σκελετικός (3) 0/2 0/2 Νεύρο, περιφερικό (3) 0/3 0/3 Νεφρός (3) 3/3 Επιθήλιο σωληναρίων 3/3 Επιθήλιο σωληναρίων Οισοφάγος (3) 0/3 0/3 Όρχις (3) 0/3 1/3 Κύτταρα Leydig Πάγκρεας (3) 3/3 Επιθήλιο (κυρίως κύτταρα νησιδίων) 3/3 Επιθήλιο (κυρίως κύτταρα νησιδίων) Παραθυρεοειδής (3) 3/3 Επιθήλιο 0/3 Παρεγκεφαλίδα (3) 0/3 0/3 Παχύ έντερο (3) 2/3 Μακροφάγα 0/3 Πνεύμονας (3) 3/3 Κυψελιδικά μακροφάγα 0/3 Προστάτης (2) 0/2 0/2 Σιελογόνος αδένας (3) 0/3 0/3 Σπλήνας (3) 1/3 Μακροφάγα 0/3 3/3 Δικτυοενδοθηλιακά κύτταρα κοιλοτήτων Στόμαχος (3) 0/3 0/3 Τράχηλος (3) 1/3 Επιθήλιο 1/3 Επιθήλιο Υπόφυση (3) 1/3 Πρόσθια αδενοϋπόφυση 1/3 Πρόσθια αδενοϋπόφυση 3/3 Οπίσθια νευροϋπόφυση Ωοθήκη (3) 0/3 0/3 Πίνακας 7: Σύνοψη της αντιδραστικότητας νεοπλασματικών ιστών με το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Τύπος όγκου Θέση / Όργανο Θετικά για PD-L1/σύνολο (N=162) Γαστρεντερικό σύστημα, μεταστατικό στον πνεύμονα 0/1 Θυρεοειδής, θηλωματικό 0/3 Θυρεοειδής, θυλακιώδες 0/1 Θυρεοειδής, θυλακιώδες-θηλωματικό 0/1 Αδενοκαρκίνωμα Καρκίνωμα βρογχοκυψελίδων, πνεύμονας 0/1 Κεφαλή και αυχένας, σκληρή υπερώα 0/1 Λεπτό έντερο 0/2 Μαστός, DCIS 0/2 Μαστός, πορογενές διηθητικό 3/7 Μαστός, πορογενές διηθητικό μεταστατικό στο λεμφαδένα 1/1 Μήτρα, διαυγοκυτταρικό 1/1 P03914GR_04/SK / σελ. 11/24

12 Τύπος όγκου Θέση / Όργανο Θετικά για PD-L1/σύνολο (N=162) Μήτρα, ενδομητρίου 1/3 Οισοφάγος 1/1 Ορθό 2/4 Πάγκρεας 1/2 Πάγκρεας, πορογενές 0/3 Παχύ έντερο 2/5 Παχύ έντερο, βλεννώδες 0/1 Παχύ έντερο, μεταστατικό στο ήπαρ 1/1 Πνεύμονες 2/5 Προστάτης 2/4 Σιελογόνος/παρωτιδικός αδένας 0/2 Σκωληκοειδής απόφυση 1/1 Στόμαχος 1/6 Στόμαχος, βλεννώδες 0/1 Τράχηλος, ενδοτραχηλικός τύπος 0/1 Χοληδόχος κύστη 2/4 Ωοθήκη 0/1 Ωοθήκη, βλεννώδες 0/1 Ωοθήκη, ενδομητριοειδές 0/1 Ωοθήκη, ορώδες 0/1 Αρχέγονο νευροεκτόδερμα Οπισθοπεριτοναϊκό 0/1 Αστροκύτωμα Εγκέφαλος 0/3 Βασικοκυτταρικό καρκίνωμα Δέρμα 0/1 Γλοιοβλάστωμα Εγκέφαλος 0/1 Εμβρυϊκό καρκίνωμα Όρχεις 0/1 Ενδιάμεσων κυττάρων Λεπτό έντερο 0/1 Ορθό 0/1 Παχύ έντερο 0/1 Επενδύμωμα Εγκέφαλος 0/1 Ηπατοβλάστωμα Ήπαρ 0/1 Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα Ήπαρ 1/5 Θύμωμα Μεσοθωράκιο 1/1 Καρκίνωμα Ρινοφαρυγγικό, NPC 0/1 Μεταστατικό καρκίνωμα του παχέος εντέρου με κύτταρα Καρκίνωμα με κύτταρα δίκην 0/1 δίκην σφραγιστήρος δακτυλίου στην ωοθήκη σφραγιστήρος δακτυλίου Παχύ έντερο 0/1 Καρκίνωμα μεγάλων κυττάρων Πνεύμονες 1/1 Καρκίνωμα μεταβατικών κυττάρων Νεφρός 0/1 Ουροδόχος κύστη 3/6 Καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων Διαυγοκυτταρικό Νεφρός 0/6 Θηλωματικό Νεφρός 0/1 Δέρμα 1/2 Κεφαλή και αυχένας 0/2 Μεταστατικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων του 1/1 οισοφάγου στο λεμφαδένα Καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων Μήτρα 1/1 Οισοφάγος 4/7 Πνεύμονες 1/3 Τράχηλος της μήτρας 2/4 Κυτταρικοί όγκοι των νησίδων Πάγκρεας 0/1 Λέμφωμα Hodgkin Λεμφαδένας 2/2 Αναπλαστικό μεγάλο κύτταρο Λεμφαδένας 1/1 Διάχυτο B-κύτταρο Λεμφαδένας 2/4 Μη Hodgkin Λεμφαδένας 1/1 Λιποσάρκωμα Κοιλιακή κοιλότητα, βλεννώδες 0/1 Μελάνωμα Ορθό 0/1 Ρινική κοιλότητα 0/1 Μεσοθηλίωμα Περιτόναιο 0/1 Μηνιγγείωμα Εγκέφαλος 0/2 Μικροκυτταρικό καρκίνωμα Πνεύμονες 1/2 Μυελοβλάστωμα Εγκέφαλος 0/1 Μυελοειδές καρκίνωμα Θυρεοειδής 0/1 Νευροβλάστωμα Οπισθοπεριτοναϊκό 0/1 Νευροΐνωμα Μαλακός ιστός, οσφυϊκή μοίρα 0/1 Σάρκωμα Αρθρικό σάρκωμα Πυελική κοιλότητα 0/1 Διαυγοκυτταρικό Κοιλιακό τοίχωμα 0/1 P03914GR_04/SK / σελ. 12/24

13 Τύπος όγκου Θέση / Όργανο Θετικά για PD-L1/σύνολο (N=162) Λειομυοσάρκωμα Μαλακός ιστός, θωρακικό τοίχωμα 0/1 Ουροδόχος κύστη 0/1 Λιποσάρκωμα Κοιλιακή κοιλότητα, βλεννώδες 0/1 Οστεοσάρκωμα Οστό 0/2 Μαλακός ιστός, εμβρυϊκό 0/1 Ραβδομυοσάρκωμα Οπισθοπεριτοναϊκό 0/1 Προστάτης 0/1 Χονδροσάρκωμα Οστό 0/1 Σεμίνωμα Όρχεις 0/2 Σπερματοκκύτωμα Όρχεις 0/2 Φλοιοεπινεφριδιακό καρκίνωμα Επινεφρίδια 0/1 Χόνδρωμα Πυελική κοιλότητα 0/1 17. Αξιολόγηση απόδοσης 17.1 Αξιολόγηση απόδοσης: Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Αναλυτική ευαισθησία: Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Η αναλυτική ευαισθησία του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx εξετάστηκε σε 112 μοναδικά περιστατικά μη πλακώδους ΜΜΚΠ, σε δείγματα FFPE, σταδίου I έως IV με τη χρήση κατασκευασμένης παρτίδας παραγωγής. Η αξιολόγηση της έκφρασης του PD-L1 υπέδειξε χρώση στο εύρος 0-100% θετικών κυττάρων όγκου και σε ένταση χρώσης Επαναληψιμότητα/Εξωτερική αναπαραγωγιμότητα: Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Η επαναληψιμότητα και η εξωτερική αναπαραγωγιμότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx αξιολογήθηκε στην Dako και σε τρία εξωτερικά κέντρα εξέτασης αντίστοιχα. Τα δεδομένα απόδοσης παρέχονται στους Πίνακες 8 και 9. Η επί τοις εκατό αρνητική συμφωνία (NPA), η επί τοις εκατό θετική συμφωνία (PPA) και η επί τοις εκατό συνολική συμφωνία (OA) της ανεξάρτητης σύγκρισης ζευγών των εξετάσεων προσδιορίστηκαν για κάθε επίπεδο έκφρασης του PD-L1 που αξιολογήθηκε. Η πιο συχνή παρατήρηση εφαρμόστηκε ως αναφορά για τον υπολογισμό των NPA, PPA, OA και των αντίστοιχων διαστημάτων εμπιστοσύνης 95% κατά τη βαθμολογία Wilson. Επομένως, ένα από τα αποτελέσματα αυτής της παρατήρησης αποκλείστηκε από τις συγκρίσεις ζευγών. Πίνακας 8: Επαναληψιμότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx - Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Επί τοις εκατό συμφωνία (95% ΔΕ) Επαναληψιμότητα Μέθοδος Επίπεδο έκφρασης 1% Επίπεδο έκφρασης 5% Μεταξύ οργάνων Κάθε ένα από τα 10 δείγματα μη πλακώδους ΜΜΚΠ με εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε με τρεις NPA 100 (82,4, 100) NPA 100 (86,2, 100) επαναλήψεις σε κάθε ένα από τα τρία PPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (90,4, 100) όργανα Autostainer Link 48. Συνολικά OA 100 (94,0, 100) OA 100 (94,0, 100) πραγματοποιήθηκαν 60 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Μεταξύ αναλυτών Μεταξύ ημερών Μεταξύ παρτίδων Εντός κύκλου ανάλυσης Κάθε ένα από τα 12 δείγματα μη πλακώδους ΜΜΚΠ με εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε με τρεις επαναλήψεις από τρεις αναλυτές σε ένα όργανο Autostainer Link 48. Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 72 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Κάθε ένα από τα 10 δείγματα μη πλακώδους ΜΜΚΠ με εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε με τρεις επαναλήψεις σε διάστημα πέντε μη διαδοχικών ημερών στο όργανο Autostainer Link 48. Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 80 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Κάθε ένα από τα 20 δείγματα μη πλακώδους ΜΜΚΠ με εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε με δύο επαναλήψεις με κάθε μία από τις πέντε παρτίδες αντιδραστηρίου στο όργανο Autostainer Link 48. Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 160 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Κάθε ένα από τα 10 δείγματα μη πλακώδους ΜΜΚΠ με εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε με οχτώ επαναλήψεις εντός ενός κύκλου ανάλυσης στο όργανο Autostainer Link 48. Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 70 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (96,2, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (84,5, 100) PPA 100 (92,7, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (88,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (89,3, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (95,4, 100) PPA 100 (95,4, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (87,9, 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,8, 100) Επίπεδο έκφρασης 10% NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (93,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 98,2 (90,6, 99,7) PPA 100 (86,2, 100) OA 98,8 (93,3, 99,8) NPA 100 (96,4, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (92,7, 100) PPA 100 (84,5, 100) OA 100 (94,8, 100) P03914GR_04/SK / σελ. 13/24

14 Πίνακας 9: Αναπαραγωγιμότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx - Μη πλακώδης ΜΜΚΠ, βάσει εξέτασης σε τρία εξωτερικά κέντρα Αναπαραγωγιμότητα Επίπεδο έκφρασης 1% Επίπεδο έκφρασης 5% Επί τοις εκατό συμφωνία (95% CI) Μέθοδος Δοκιμασία μεταξύ κέντρων (τρία κέντρα) Ανάλυση εντός κέντρου Μεταξύ παρατηρητών (ένας παρατηρητής σε κάθε ένα από τρία κέντρα) Εντός παρατηρητή (ένας παρατηρητής σε κάθε ένα από τα τρία κέντρα) Κάθε ένα από τα 10 δείγματα μη πλακώδους ΜΜΚΠ με εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε διάστημα πέντε μη διαδοχικών ημερών. Η ανάλυση μεταξύ κέντρων πραγματοποιήθηκε μεταξύ τριών κέντρων σε συνολικά 140 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Κάθε ένα από τα 10 δείγματα μη πλακώδους ΜΜΚΠ με εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε διάστημα πέντε μη διαδοχικών ημερών σε κάθε ένα από τρία κέντρα μελέτης. Η ανάλυση εντός κέντρου πραγματοποιήθηκε για τρία κέντρα σε συνολικά 120 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Η βαθμολογία 15 δειγμάτων μη πλακώδους ΜΜΚΠ με εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC, κεχρωσμένων με το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, πραγματοποιήθηκε από τρεις παθολογοανατόμους, ένας σε κάθε ένα από τρία κέντρα μελέτης, σε τρεις μη διαδοχικές ημέρες. Η ανάλυση μεταξύ παρατηρητών πραγματοποιήθηκε μεταξύ τριών κέντρων σε συνολικά 120 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Η βαθμολογία 15 δειγμάτων μη πλακώδους ΜΜΚΠ με εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC, κεχρωσμένων με το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, πραγματοποιήθηκε από τρεις παθολογοανατόμους, ένας σε κάθε ένα από τρία κέντρα μελέτης, σε τρεις μη διαδοχικές ημέρες. Η ανάλυση εντός παρατηρητή πραγματοποιήθηκε για τρία κέντρα σε συνολικά 90 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. NPA 100 (93,6, 100) PPA 98,8 (93,6, 99,8) OA 99,3 (96,1, 99,9) NPA 100 (92,6, 100) PPA 98,6 (92,5, 99,8) OA 99,2 (95,4, 99,9) NPA 96,9 (89,3, 99,1) PPA 100 (93,6, 100) OA 98,3 (94,1, 99,5) NPA 95,8 (86,0, 98,8) PPA 100 (91,6, 100) OA 97,8 (92,3, 99,4) NPA 91,4 (82,5, 96,0) PPA 97,1 (90,2, 99,2) OA 94,3 (89,1, 97,1) NPA 96,4 (87,9, 99,0) PPA 95,3 (87,1, 98,4) OA 95,8 (90,6, 98,2) NPA 100 (94,3, 100) PPA 89,3 (78,5, 95,0) OA 95,0 (89,5, 97,7) NPA 100 (93,1, 100) PPA 100 (90,8, 100) OA 100 (95,9, 100) Αξιολόγηση κλινικής απόδοσης: Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Το κλινικό όφελος του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx αξιολογήθηκε στη μελέτη CA209057, μια τυχαιοποιημένη, ανοικτή μελέτη φάσης 3 της νιβολουμάμπης έναντι της δοσεταξέλης σε ενήλικες ( 18 ετών) συμμετέχοντες με προχωρημένο ή μεταστατικό μη πλακώδη ΜΜΚΠ μετά από αποτυχία προηγούμενης χημειοθεραπείας με βάση ένα ζεύγος πλατίνης. Συνολικά 582 άτομα τυχαιοποιήθηκαν σε 112 κέντρα σε 22 χώρες (Αργεντινή, Αυστραλία, Αυστρία, Βραζιλία, Καναδάς, Χιλή, Δημοκρατία της Τσεχίας, Γαλλία, Γερμανία, Χονγκ Κονγκ, Ουγγαρία, Ιταλία, Μεξικό, Νορβηγία, Περού, Πολωνία, Ρουμανία, Ρωσική Ομοσπονδία, Σινγκαπούρη, Ισπανία, Ελβετία και Ηνωμένες Πολιτείες). Οι συμμετέχοντες τυχαιοποιήθηκαν σε αναλογία 1:1 και στρωματοποιήθηκαν σύμφωνα με 1) την προγενέστερη λήψη συντηρητικής θεραπείας έναντι της απουσίας λήψης συντηρητικής θεραπείας και 2) τη θεραπεία δεύτερης έναντι τρίτης γραμμής. Συλλέχθηκαν δείγματα ιστού πριν από τη μελέτη (γραμμή βάσης), πριν από την τυχαιοποίηση και πριν από την πρώτη θεραπεία, για τη διεξαγωγή εκ των προτέρων προγραμματισμένων αναλύσεων αποτελεσματικότητας σύμφωνα με τα προκαθορισμένα επίπεδα έκφρασης του PD-L1 της γραμμής βάσης (δευτερεύων στόχος). Το κύριο καταληκτικό σημείο ήταν η συνολική επιβίωση (OS). Άλλα δευτερεύοντα καταληκτικά σημεία ήταν το ποσοστό αντικειμενικής ανταπόκρισης (ORR), η επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (PFS) και η βελτίωση των συμπτωμάτων που σχετίζονται με τη νόσο σε διάστημα 12 εβδομάδων, σύμφωνα με μετρήσεις της κλίμακας συμπτωμάτων καρκίνου του πνεύμονα (LCSS- Lung Cancer Symptom Scale). Τα δημογραφικά στοιχεία γραμμής βάσης και τα χαρακτηριστικά της νόσου ήταν σε γενικές γραμμές ισορροπημένα μεταξύ των τυχαιοποιημένων συμμετεχόντων στις ομάδες νιβολουμάμπης και δοσεταξέλης. Η μέση ηλικία ήταν 62 έτη (εύρος: 21 έως 85) με 34% 65 ετών και 7% 75 ετών. Η πλειοψηφία των ασθενών ήταν λευκοί (92%) και άνδρες (55%). Η κατάσταση απόδοσης γραμμής βάσης κατά ECOG ήταν 0 (31%) ή 1 (69%). Το 79% των ασθενών ήταν πρώην/νυν καπνιστές. Τα δείγματα όγκων συλλέχθηκαν από όγκους μη πλακώδους ΜΜΚΠ, σύμφωνα με τις απαιτήσεις συμπερίληψης για τη μελέτη. Οι συχνότητες της έκφρασης του PD-L1 σε κάθε ένα από τα προκαθορισμένα επίπεδα έκφρασης της γραμμής βάσης σε όλους τους τυχαιοποιημένους συμμετέχοντες στη μελέτη CA παρουσιάζονται στον Πίνακα 10. Πίνακας 10: Συχνότητα έκφρασης του PD-L1 πριν από τη μελέτη σε όλους τους τυχαιοποιημένους συμμετέχοντες με μη πλακώδη ΜΜΚΠ - CA Κατηγορία έκφρασης του PD-L1 στον πληθυσμό Νιβολουμάμπη 3 mg/kg Δοσεταξέλη Σύνολο Σύνολο Μετρήσιμο PD-L1 στη γραμμή βάσης, N (%) 231 (79,1) 224 (77,2) 455 (78,2) Έκφραση του PD-L1 στη γραμμή βάσης 1% 123/231 (53,2) 123/224 (54,9) 246/455 (54,1) Έκφραση του PD-L1 στη γραμμή βάσης <1% 108/231 (46,8) 101/224 (45,1) 209/455 (45,9) Έκφραση του PD-L1 στη γραμμή βάσης 5% 95/231 (41,1) 86/224 (38,4) 181/455 (39,8) Έκφραση του PD-L1 στη γραμμή βάσης <5% 136/231 (58,9) 138/224 (61,6) 274/455 (60,2) Έκφραση του PD-L1 στη γραμμή βάσης 10% 86/231 (37,2) 79/224 (35,3) 165/455 (36,3) Έκφραση του PD-L1 στη γραμμή βάσης <10% 145/231 (62,8) 145/224 (64,7) 290/455 (63,7) Μη μετρήσιμο PD-L1, N (%) 61 (20,9) 66 (22,8) 127 (21,8) Οι ασθενείς με έκφραση του PD-L1 από όλα τα προκαθορισμένα επίπεδα έκφρασης στην ομάδα του OPDIVO συσχετίστηκαν με ενισχυμένη επιβίωση σε σύγκριση με τη δοσεταξέλη, ενώ η επιβίωση ήταν παρόμοια με της δοσεταξέλης σε ασθενείς χωρίς έκφραση του PD-L1. Παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στη διάμεση συνολική επιβίωση (OS) στην υποομάδα νιβολουμάμπης έναντι της υποομάδας δοσεταξέλης, στην ανάλυση κατά επίπεδο έκφρασης του PD-L1. Η διάμεση συνολική επιβίωση (OS) ήταν 17,1, 18,2 και 19,4 μήνες για τους συμμετέχοντες που έλαβαν νιβολουμάμπη σε σύγκριση με 9,0, 8,1 και 8,0 μήνες για τους συμμετέχοντες που έλαβαν δοσεταξέλη, με επίπεδα έκφρασης 1%, 5% και 10% του PD-L1, αντίστοιχα. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στη συνολική επιβίωση (OS) μεταξύ των ομάδων θεραπείας στους συμμετέχοντες με επίπεδα έκφρασης <1%, <5%, και <10% με εύρος τιμών διάμεσης συνολικής επιβίωσης (OS) 9,7 έως 10,4 μήνες για τη νιβολουμάμπη και 10,1 έως 10,3 μήνες για τη δοσεταξέλη. Οι μη στρωματοποιημένες αναλογίες κινδύνου (HR) και η διάμεση συνολική επιβίωση (OS) παρουσιάζονται στην Εικόνα 1. Το διάγραμμα Kaplan-Meier για τις υποομάδες κατά επίπεδο έκφρασης του PD-L1 παρουσιάζεται στις Εικόνες 2 και 3. P03914GR_04/SK / σελ. 14/24

15 Εικόνα 1: Δενδρόγραμμα (Forest Plot) - Συνολική επιβίωση (OS) βάσει της έκφρασης του PD-L1 σε ασθενείς με μη πλακώδη ΜΜΚΠ - CA Διάμεση συνολική επιβίωση (OS) (μήνες) Επίπεδο έκφρασης του PD-L1 Μη στρωματοποιημένες αναλογίες κινδύνου (HR) OPDIVO Δοσεταξέλη 1% (n = 246) 0,59 17,1 9,0 <1% (n = 209) 0,90 10,4 10,1 5% (n = 181) 0,43 18,2 8,1 <5% (n = 274) 1,01 9,7 10,1 10% (n = 165) <10% (n = 290) 0,40 19,4 8,0 1,00 9,9 10,3 0,25 0,5 1,0 2,0 Όφελος υπέρ του OPDIVO Σημείωση: Η μη στρωματοποιημένη αναλογία κινδύνου και το αντίστοιχο 95% ΔΕ εκτιμήθηκαν σε ένα μοντέλο αναλογικού κινδύνου Cox με χρήση του τυχαιοποιημένου σκέλους ως μεμονωμένης συμμεταβλητής Εικόνα 2: Συνολική επιβίωση - Ασθενείς με μη πλακώδη ΜΜΚΠ με έκφραση του PD-L1 1% - CA ,0 0,9 0,8 0,7 Πιθανότητα επιβίωσης 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 OPDIVO Δοσεταξέλη 0, Συνολική επιβίωση (Μήνες) Αριθμός κινδύνου OPDIVO Δοσεταξέλη P03914GR_04/SK / σελ. 15/24