ΚΛΙΝΙΚΟ ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ Η Μοριακή Επιδημιολογία στην Κλινική Μικροβιολογία και τη Μικροβιολογία της Δημόσιας Υγείας: Σταφυλόκοκκοι

Transcript

1 ΚΛΙΝΙΚΟ ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ Η Μοριακή Επιδημιολογία στην Κλινική Μικροβιολογία και τη Μικροβιολογία της Δημόσιας Υγείας: Σταφυλόκοκκοι Ίρις Σπηλιοπούλου Καθηγήτρια Εργαστήριο Μικροβιολογίας Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Σταφυλοκόκκων Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών

2 Διάσπαρτα περιστατικά λοιμώξεων/επιδημικών εξάρσεων: πώς θα συνδεθούν;; Επιδημιολογική μελέτη-καθορισμός κλώνων: εύρεση της πηγής διασποράς Ο ρόλος του Κέντρου Αναφοράς??? Ο γονότυπος πρέπει να συμβάλλει και στην κατανόηση της εξέλιξης των βακτηρίων και στην ταξινόμησή τους

3

4 MLST, SCCmec, spa typing, agr typing, τοξίνες S. aureus Carbamate kinase (arcc) Shikimate dehydrogenase (aroe) Glycerol kinase (glpf) Guanylate kinase (gmk) Phosphate acetyltransferase (pta) Triosephosphate isomerase (tpi) Acetyl coenzyme A acetyltransferase (yqil) SCCmec I-XIΙ Spa: ανάλυση αλληλουχίας και πολυμορφισμός της περιοχής Χ του γονιδίου Γονίδια τοξινών Agr: accessory gene regulator system

5 Τύποι SCCmec I-ΧII

6 Ποια είναι η σχέση μεταξύ στελεχών MRSA που απομονώνονται στο νοσοκομείο και στην κοινότητα; CA-MRSA Κοινότητα Ζώα LA-MRSA: Livestock- Associated Nοσοκομείο Παραγωγή HA-MRSA Παράγοντες ανάπτυξης και αντιβιοτικά χορηγούμενα στα ζώα

7 Μελέτη σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων με: PFGE, MLST, spa typing SmaI

8 Διαχωρισμός στελεχών που ανήκουν στον ίδιο τύπο MLST (A) και διαχωρισμός στελεχών που ανήκουν στον ίδιο τύπο PFGE (B) JCM:40:3764

9 Επιλογή μεθόδου Σε περιορισμένη έκταση: PCR Σε μεγαλύτερη περιοχή: PCR και PFGE Διεθνώς: ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας πολλαπλών γονιδίων.

10 1. Προβληματισμοί Αύξηση σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων στο διάστημα Νοσοκομεία: ΠΓΝΠ, ΠΓΝΛ, ΠΓΝΙ, ΚΝΠΠ, ΑΚΠΝ, ΠΓΝΠ. Συλλογή στελέχη MRSA Πιθανή επιδημική έξαρση; Υπάρχει γενετική σχέση των στελεχών; Διαφορετικές περιοχές της χώρας. Τι αντιμετωπίζουμε;

11 MRSA στην Ελλάδα: 6 νοσοκομεία

12

13 Φορεία τοξινών των CA-MRSA και HA-MRSA ,00% 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% 90,42% 53,96% 19,42% 0,59% 5,03% 8,15% PVL TSST-1 egc CA-MRSA HA-MRSA

14 Κλώνοι MRSA MWM MWM Kb A A A A B B B B C C C C E E E E F F F F G G G G PVL-θετικά

15 Δενδρόγραμμα

16 Κλώνοι HΑ-MRSA από το στην Ελλάδα (6 νοσοκομεία*) HA-MRSA 6,06% 4,92% 4,55% 53,03% 24,24% *ΠΓΝΠ, ΚΝΠ, ΠΓΝΛ, ΠΓΝΙ, ΑΚΠΝ, ΝΠΠ ST30 ST80 ST121 ST239 ST377 ST770 ST1 ST5 ST22 ST7 ST97 ST217 ST225 ST585

17 Κλώνοι CΑ-MRSA από το στην Ελλάδα (6 νοσοκομεία)

18 STs σε ενήλικες/παιδιά και CA-MRSA/HA-MRSA Ενήλικες (25 κλώνοι) ST1-IV, ST5-IV, ST7-IV, ST8-IVc, ST10-V, ST22-IV, ST30-IV, ST80-IV, ST97-V, ST217-IV, ST225-II, ST239-III, ST377-V, ST583-IVc, ST585-III, ST714-IV, ST728-IVc, ST770- NT, ST842-NT, ST935-V, ST1659-II, ST1713-III, ST2092- NT, ST2486-IV, ST2487-IV CA- MRSA (23 κλώνοι) ST1-IV, ST5-IV, ST7- IV, ST8-IVc, ST10-V, ST22-IV, ST30-IV, ST80-IV, ST97-V, ST121-V, ST225-II, ST239-III, ST377-V, ST461-NT, ST583- IVc, ST728-IVc, ST842-NT, ST935-V, ST1659-II, ST1713- III, ST2092-NT, ST2486-IV, ST2487- IV Παιδιά (9 κλώνοι) ST7-IV, ST22-IV, ST30-IV, ST80-IV, ST121-V, ST225-II, ST239-III, ST377-V, ST461-NT HA- MRSA (15 κλώνοι) ST1-IV, ST5-IV, ST7- IV, ST22-IV, ST30- IV, ST80-IV, ST97-V, ST217-IV, ST225-II, ST239-III, ST377-V, ST585-III, ST714-IV, ST770-NT, ST1713- III

19 ST377 Κλωνικά σύμπλοκα S. aureus ST239 CC22 CC30 CC5 CC8 CC80 CC25

20

21 Ποια είναι τα συμπεράσματα; Επικράτηση και διασπορά του PVL-θετικού κλώνου ST80-IV (61.6% στο σύνολο και 88.8% στα CA-MRSA) Αίτιο και HA-MRSA λοιμώξεων Επιδημική έξαρση; Αίτιο HA-MRSA λοιμώξεων ο κλώνος ST239-III, πολυανθεκτικός (22.5% στο σύνολο και 60.8% στα HA-MRSA) Ο ST30-IV φέρει τα γονίδια της PVL σπάνια (1.8%), και πιο συχνά την tst (16.8%). Ο ST8-IV (USA300), μόνο σποραδικά κρούσματα

22 2. Προβληματισμοί Τι συμβαίνει με τα ζώα συντροφιάς στην Ελλάδα;;; Μπορεί να αποτελούν πηγή διασποράς στελεχών S. aureus/mrsa???? Ο κίνδυνος εμφάνισης λοίμωξης στους φορείς S. aureus είναι 24 φορές μεγαλύτερος σε σχέση με τους μη-φορείς Συνεργασία με την Κτηνιατρική Σχολή ΑΠΘ και την Κλινική Ζώων Συντροφιάς

23 Τι συμβαίνει στα ζώα συντροφιάς; Επιδημία το 1988 από γάτα σε οίκο ευγηρίας. Το 1994 αίτιο λοιμώξεων σε σκύλους Διασπορά σε ανθρώπους και κτηνιάτρους Κλώνοι ανθρώπινης προέλευσης Γερμανία HA-MRSA κλώνος ST22-IV Σπάνια κλώνοι ζωικής Γαλλία CC398 Χρήση αντιβιοτικών

24 Φαινότυποι αντοχής στα αντιμικροβιακά: 60 S. aureus

25 Δενδρόγραμμα αντιπροσωπευτικών προτύπων ζωνών της PFGE των απομονωμένων στελεχών S. aureus και των αντίστοιχων τύπων MLST και spa Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] COMPANION ANIMALS COMPANION ANIMALS P14H P18H P86N P96H P100H P52N DOG DOG DOG DOG DOG CAT B D Q Q M M t034 t094 t5559 t034 t2049 t στελέχη:16 MRSA (26.7%), 12 mecα (+), 4 mecc(+) 15 διαφορετικοί τύποι 57.8 P14N DOG U 15 t P44H P49H DOG DOG U U t011 t C4 P13N HUMAN DOG C C t044 t C15 C17 C5 HUMAN HUMAN HUMAN C C C t5559 t114 t053 Παλαιοί και νέοι τύποι P98H P99N P78N DOG DOG DOG S S Z t094 t7558 t P79N P88N DOG DOG Y Y t240 t P89N C16 P13S DOG HUMAN DOG X A A t5559 t095 t P75H P97H DOG DOG V V t2516 t P79H C3 P77H DOG HUMAN DOG T G G t094 t5559 t5559 C8 HUMAN W 15 t094

26 Μοριακή διερεύνηση: καθορισμός κλώνων 13 STs 7 CCs 20 ST80 13 ST15 MRSA: ST80-IV: 5/16 (31.3%), meca, 4 Tet ST398-XI: 4/16 (25%), mecc, 2 Tet MSSA: ST80: 15/44 (34%), 6 Tet ST15: 11/44 (25%), 1 MDR 2 Fus 2 Kan spa types: t5559 (9 στελέχη)/ t7558 (10 στελέχη)

27 Γενετική ομοιογένεια στελεχών PVL(+): 30/44 MSSA (68.2%) και 8/16 MRSA (50%)

28 Ταυτοποίηση και μοριακός χαρακτηρισμός στελεχών S. aureus που απομονώθηκαν από άτομα του κτηνιατρικού προσωπικού και των κατοικιδίων ζώων τους Στέλεχος Είδος Γένος S. aureus Α/Μ MRSA meca mecc MLST PFGE spa PVL Ομοιότητα C14 Άνθρωπος Θ A P32 Σκύλος Α A C16 Άνθρωπος Θ Θ Α A A A ST30 A t095 Θ - P94 Σκύλος Α A C17 Άνθρωπος Α Θ Α A A A ST80 C t114 Θ - P102 Σκύλος Θ A C18 Άνθρωπος Θ A P103 Γάτα Α A C15 Άνθρωπος Θ Θ Α A A A ST80 C t5559 Θ Μη P74 Σκύλος Α Θ Μ A A A ST15 U t7558 A συσχετιζόμενα Θ Α A A A ST328 V t053 A

29 Ποια είναι τα συμπεράσματα; PVL-θετικοί S. aureus έχουν αποικίσει και σπανιότερα αποτελούν αίτιο λοιμώξεων στα κατοικίδια, με αρκετά ανθεκτικά στα αντιμικροβιακά στελέχη. Η πλειονότητα των PVL-θετικών στελεχών και στα ζώα συντροφιάς ανήκει στον κλώνο ST80 (agr3/pfge-c). Tα ζώα έχουν αποικιστεί με στελέχη ανθρώπινης προέλευσης. Η μετάδοση γίνεται κυρίως στο περιβάλλον της Κλινικής

30 3. Προβληματισμοί: Αγοράκι 6 ετών με επανειλημμένες λοιμώξεις δέρματος (δοθιήνες). Λήψη δείγματος από τις βλάβες Λήψη δειγμάτων από ρώθωνες και φάρυγγα του παιδιού Έλεγχος φορείας S. aureus και στα μέλη της οικογένειας: μητέρα, πατέρας, μεγαλύτερη αδελφή.

31 Αποτελέσματα καλλιεργειών: Από το αγόρι απομονώθηκε από τις βλάβες και το ρινικό S. aureus, cefoxitin-ευαίσθητος και ανθεκτικός σε fusidic acid, mupirocin (MIC>1024 mg/l), penicillin. Οι καλλιέργειες φορείας ήταν αρνητικές για τη μητέρα και θετικές από τον πατέρα και τη μεγαλύτερη αδερφή Τα στελέχη είχαν τον ίδιο φαινότυπο αντοχής στα αντιμικροβιακά.

32 Γενετική ανάλυση στελεχών: PCR για γονίδια τοξινών, agr typing, fusb, mupa. PFGE, MLST Όλα τα στελέχη ήταν fusb και mupa-θετικά Όλα τα στελέχη έφεραν τα γονίδια της PVL Όλα τα στελέχη ανήκαν στον τύπο agriv

33 PFGE: type MSSA1. MLST: ST121 Ερωτήσεις: 1. Ήταν απαραίτητη η PFGE?? 2. Ήταν απαραίτητη η MLST?? 3. Πώς θα αντιμετωπίσετε τα περιστατικά;; 4. Χρειάζεται θεραπεία εκρίζωσης;;

34 Livestock-associated MRSA: LA-MRSA 1972 και 1975: μαστίτιδα σε ζώα (Βέλγιο) Εκτροφεία παραγωγικών ζώων (φάρμες) στην Κ. Ευρώπη Μη τυποποιήσιμα με PFGE (SmaI) Ανήκουν στο σύμπλοκο CC398, CC9 (Ασία), ST49, CC97 με MLST Διαφορετικοί τύποι SCCmec (mecc) Πολυανθεκτικά σε μεγάλο εύρος αντιβιοτικών Η πλειονότητα των στελεχών δεν φέρει γονίδια τοξινών Μετάδοση σε εκτροφείς και κτηνιάτρους

35 PFGE S. aureus: SmaI MWM MWM Kb A A A A B B B B C C C C E E E E F F F F G G G G PVL-θετικά?

36

37 ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ CO-HA-MRSA, HA-MRSA, CΑ-MRSA ανθρωπονόσος ΚΟΙΝΟΤΗΤΑ LA-MRSA Ζώα-διατροφική αλυσίδα ζωονόσος

38 Συμπεράσματα O S. aureus εξελίσσεται συνεχώς! Υπάρχει κλωνική διασπορά των MRSA! Μετάδοση ανθρώπινων κλώνων (ST80) σε ζώα συντροφιάς Ανάδυση νέων κλώνων στα παραγωγικά ζώα (ST398) Επιλογή ανθεκτικού πληθυσμού S. aureus υπό την πίεση των αντιβιοτικών? Ανάδυση ή μετάδοση των ζωικής προέλευσης στελεχών στους ανθρώπους Άγνωστο το ποσοστό φορείας στα ζώα αποθηκευτικοί ξενιστές;;

39 4. Προβληματισμοί: Οι πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι έχουν αναδειχθεί ως σημαντικό αίτιο λοιμώξεων, ιδιαίτερα σε ειδικές κατηγορίες ασθενών: Ανοσοκατεσταλμένοι ασθενείς Πρόωρα Ασθενείς που φέρουν προσθετικά υλικά (ενδαγγειακοί καθετήρες, καθετήρες παροχέτευσης, βηματοδότες, ορθοπεδικά εμφυτεύματα )

40

41 ΔΥΝΗΤΙΚΑ ΠΑΘΟΓΟΝΟΙ CNS S. epidermidis S. haemolyticus S. lugdunensis S. saprophyticus Τραύματα, ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις (προσθετικά υλικά) Φυσικές βαλβίδες καρδιάς, 2 ο αίτιο ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων (προσθετικά υλικά) Ενδοκαρδίτιδα, λοιμώξεις δέρματος/ μαλακών μορίων Λοιμώξεις ουροποιητικού S. hominis Βακτηριαιμία, πνευμονία + S. capitis, S. warneri, S. caprae, S. cohnii, S. schleiferi, S. pasteurii, S. xylosus

42 BIOFILM Οργανωμένη κοινότητα μικροβίων, που είναι προσκολλημένα σε μία επιφάνεια και περιβάλλονται από ένα εξωκυττάριο στρώμα που παρέχει προστασία. Αποτελεί προσομοίωση μικρής πόλης, όπου τα βακτηριακά κύτταρα, μήκους 1-2 μm, σχηματίζουν πύργους >100 μm. Οι δρόμοι ανάμεσα στους πύργους είναι σαν υγρά κανάλια, που μεταφέρουν θρεπτικά συστατικά για την διατήρηση της κοινότητας.

43 Βακτηριαιμίες ΠΓΝΠ: έξαρση στη Μονάδα Νεογνών-προώρων, ΜΕΝΝ;;

44 168 S. epidermidis 58 S. haemolyticus 100 Βακτηριαιμίες (BSIs) 126 Λοιμώξεις προσθετικών υλικών (PDAIs) Προσθετικά υλικά S. epidermidis S. haemolyticus Σύνολο Περιφερικοί καθετήρες Υποκλείδιοι Ορθοπεδικά υλικά Περιτοναϊκοί καθετήρες 6-6 Καθετήρες παροχέτευσης Ομφαλικοί καθετήρες 3-3 Σφαγιτιδικοί καθετήρες Βηματοδότες 2-2 Νεφρολογικοί καθετήρες 1-1 Σπιράλ 1-1 Billau 1-1 Ουροκαθετήρες

45 Χαρακτηρισμός κλώνων S. epidermidis S. epidermidis μεγάλη γενετική ποικιλομορφία 67 PFGE τύποι 2 κύριοι κλώνοι a και b (51,2 % του πληθυσμού)

46 Τρεις κύριοι Sequence Types (STs) ST2 --- PFGE type a (50 στελέχη) ST5, ST PFGE type b (36 στελέχη)

47 S. epidermidis PFGE τύποι Τύπος a N= 50 (%) Τύπος b N= 36 (%) P-value Παραγωγή biofilm 22 (44) 18 (50) ica 46 (92) 26 (72.2) ica(+) ica(-) 20 0 biofilm(+) biofilm(-) Τα biofilm(+) στελέχη φέρουν συχνότερα το οπερόνιο ica (P=0.007)

48 ΦΟΡΕΙΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΤΙΝΩΝ PFGE τύποι Τύπος a N= 50 (%) S. epidermidis Τύπος b N= 36 (%) P-value aap 22 (44) 24 (66.7) atle 46 (92) 36 (100) fbe 44 (88) 33 (91.7) bap 11 (22) 10 (27.8) fnba 19 (38) 13 (36.1) 1.000

49 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η πλειοψηφία των στελεχών S. epidermidis ήταν ανθεκτικά στην methicillin (MR-CNS) και πολυανθεκτικά. Η παραγωγή biofilm στα στελέχη S. epidermidis σχετίζεται με την φορεία του οπερονίου ica. Διαπιστώθηκε κλωνική διασπορά στη ΜΕΝΝ με την επικράτηση δύο κύριων PFGE τύπων στα στελέχη S. epidermidis που αποτελούσαν το 51.2% του συνολικού πληθυσμού. Ο κύριος τύπος a ταυτοποιήθηκε ως ST2 με MLST, ενώ τα στελέχη του τύπου b ανήκαν στους τύπους ST5 και ST16. Στον πληθυσμό S. epidermidis, τα στελέχη του τύπου a έδειξαν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στα αντιμικροβιακά, ενώ τα στελέχη του τύπου b έφεραν συχνότερα το γονίδιο aap.

50 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Επιδημιολογικές μελέτες σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων περιορισμένης έκτασης μπορούν να βασισθούν σε μεθόδους PCR και PFGE Η PFGE έχει μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα Σύγκριση με διεθνή δεδομένα και ευρείες μελέτες (σε εθνικό επίπεδο) βασίζονται σε αναλύσεις αλληλουχίας του γονιδιώματος

51 Ε. Δρούγκα Α. Φωκά Ν. Γιορμέζης Φ. Κολονίτσιου Ε. Λεμπέση Α. Δουδουλακάκης Ε. Πετεινάκη Ε.Δ. Αναστασίου Και όλους τους συναδέλφους που έχουμε συνεργαστεί και μας έχουν βοηθήσει στη συλλογή των στελεχών!!!