ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ. «Διερεύνηση λοιμώξεων από πηκτάση-αρνητικά στελέχη του γένους Staphylococcus σε ασθενείς με προσθετικά υλικά»

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ : ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ε.Δ. ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «Διερεύνηση λοιμώξεων από πηκτάση-αρνητικά στελέχη του γένους Staphylococcus σε ασθενείς με προσθετικά υλικά» Νικόλαος Δ. Γιορμέζης Ιατρός Βιοπαθολόγος ΠΑΤΡΑ 2015

2 2

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ : ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ε.Δ. ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «Διερεύνηση λοιμώξεων από πηκτάση-αρνητικά στελέχη του γένους Staphylococcus σε ασθενείς με προσθετικά υλικά» Νικόλαος Δ. Γιορμέζης Ιατρός Βιοπαθολόγος ΠΑΤΡΑ

4 4

5 Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Τμήματος Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Ίρις Σπηλιοπούλου, Καθηγήτρια, Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Επιβλέπουσα. 2. Ευάγγελος Δ. Αναστασίου, Καθηγητής, Διευθυντής Εργαστηρίου Μικροβιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής. 3. Μυρτώ Χριστοφίδου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής. 4. Φεβρονία Κολονίτσιου, Επίκουρη Καθηγήτρια, Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής. 5. Φωτεινή Παληογιάννη, Καθηγήτρια, Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής. 6. Μάρκος Μαραγκός, Καθηγητής Λοιμωξιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής. 7. Γαβριήλ Δημητρίου, Καθηγητής Παιδιατρικής και Νεογνολογίας Πανεπιστημίου Πατρών, Διευθυντής Παιδιατρικής Κλινικής, ΜΕΝ Νεογνών και ΜΕΘ Παίδων, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής. 5

6 6

7 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ Dimitriou G., S. Fouzas, N. Giormezis, I. Giannakopoulos, S. Tzifas, A. Foka, ED Anastassiou, I. Spiliopoulou, S. Mantagos. Clinical and microbiological profile of persistent coagulase-negative staphylococcal bacteraemia in a neonatal intensive care unit. Clin Microbiol Infect Nov;17 (11): doi: /j x. Papadimitriou-Olivgeris M., Giormezis N., Fligou F., Liakopoulos A., Marangos M., Anastassiou E.D., Petinaki E., Filos K.S., Spiliopoulou I. Factors influencing Linezolid-Nonsusceptible Coagulase-Negative staphylococci dissemination among patients in the Intensive Care Unit: A Retrospective Cohort Study. Chemotherapy 2014 Jul 18; 59(6): Giormezis N, Kolonitsiou F, Foka A, Drougka E, Liakopoulos A, Makri A, Papanastasiou AD, Vogiatzi A, Dimitriou G, Marangos M, Christofidou M, Anastassiou ED, Petinaki E, Spiliopoulou I. Coagulase-negative staphylococcal bloodstream and prosthetic device-associated infections: the role of biofilm formation, adhesin and toxin genes distribution. J Med Microbiol Nov; 63 (Pt 11): doi: /jmm Giormezis N, Kolonitsiou F, Makri A, Vogiatzi A, Christofidou M, Anastassiou ED, Spiliopoulou I. Virulence factors among Staphylococcus lugdunensis are associated with infection sites and clonal spread. Eur J Clin Microbiol Infect Dis Dec 4. 7

8 8

9 ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΔΙΕΘΝΗ ΣΥΝΕΔΡΙΑ 1. N. Giormezis, F. Kolonitsiou, A. Foka, V. Hondrou, K. Drosopoulou, S. Mantagos, G. Dimitriou, E.D. Anastassiou, I. Spiliopoulou. Clones and toxin's genes carriage of coagulase-negative staphylococci isolated from bacteraemic infants hospitalized in an intensive care unit. Poster presentation, 19 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, May 2009, Helsinki, Finland. 2. E. Drougka, O. Koureli, E. Petinaki, O. Obasuyi, A. Foka, V. Chini, N. Giormezis, A. Athanassiadou, E.D. Anastassiou, I. Spiliopoulou. Clones and toxin genes profiles of methicillin-resistant Staphylococcus aureus causing infections among children and adults. Poster presentation, 19 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, May 2009, Helsinki, Finland. 3. N. Giormezis, A. Foka, A. Papanastassiou, E. Drougka, A. Spiliopoulou, F. Kolonitsiou, E. Petinaki, E.D. Anastassiou, I. Spiliopoulou. Phenotypic and genotypic characterization of Coagulase-Negative staphylococci isolated from device-associated infections. Poster presentation, International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, 6-9 September 2010, Bath, UK. 4. N. Giormezis, F. Kolonitsiou, A. Foka, E. Drougka, G. Dimitriou, A. Spiliopoulou, E.D. Anastassiou, I. Spiliopoulou. Pathogenic elements among staphylococci isolated from bloodstream and prosthetic devices-associated infections. Poster presentation, 21 st European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 7-10 May 2011, Milan, Italy. Η εργασία αυτή επιλέχθηκε για δωρεάν εγγραφή στο συνέδριο. 5. E. Drougka, A. Foka, E. Jelastopoulou, E. Lebessi, A. Doudoulakakis, Th. Panagea, A. Voyiatzi, D. Garatziotou, C. Gartzonika, S. Levidiotou, N. Giormezis, F. Kolonitsiou, A. Spiliopoulou, E.D. Anastassiou. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in Greece: spread of ST80 over nine years. Poster presentation, European Scientific Conference on Applied Infectious Disease Epidemiology, 6-8 November 2011, Stockholm, Sweden. 9

10 6. N. Giormezis, A. Foka, E. Drougka, S. Fouzas, G. Dimitriou, E.D. Anastassiou, I. Spiliopoulou. Virulence determinants among coagulase-negative staphylococci recovered from bacteraemias and device-related infections. Poster presentation, 22 nd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 31 March-3 April 2012, London, U.K. 7. I. Spiliopoulou, Z. Florou, M. Papadimitriou- Olivgeris, M. Economou, E. Drougka, K. Ziva, N. Giormezis, E. Petinaki. Activity of vancomycin, linezolid and daptomycin against staphylococci and enterococci isolated in Greek hospitals, Poster presentation, 22 nd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 31 March-3 April 2012, London, U.K. 8. N. Giormezis, E. Drougka, A. Foka, A. Makri, A. Vogiatzi,, F. Kolonitsiou, E.D. Anastassiou, I. Spiliopoulou. Pathogenic elements in coagulase- negative staphylococci from prosthetic device-related infections in two greek hospitals. Poster presentation, International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, August 2012, Lyon, France. 9. I. Spiliopoulou, Z. Florou, M. Papadimitriou- Olivgeris, M. Economou, E. Drougka, D. Kairis, N. Giormezis, M. Marangos, C. Koutsia-Carouzou, E. Petinaki. Susceptibility of staphylococci to vancomycin, linezolid and daptomycin in greek hospitals during a four- year period ( ). Poster presentation, International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections, August 2012, Lyon, France. 10. M. Papadimitriou-Olivgeris, N. Giormezis, F. Fligou, A. Liakopoulos, M. Marangos, E. Anastassiou, K. Filos, E. Petinaki, I. Spiliopoulou. Linezolidresistant coagulase-negative staphylococci: epidemiology and risk factors for colonisation during hospitalisation in the intensive care unit. Oral presentation, 23 rd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, April 2013, Berlin, Germany. 11. N. Giormezis, F. Kolonitsiou, A. Makri, A. Vogiatzi, E.D. Anastassiou, I. Spiliopoulou. Clonal dissemination and virulence factors among Staphylococcus lugdunensis from two Greek hospitals during a six-year period. Poster presentation, 24 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, May 2014, Barcelona, Spain. 12. Papadimitriou Olivgeri I., Giormezis N., Papadimitriou Olivgeris M., Fligou F., Liakopoulos A., Filos K., Marangos M., Petinaki E., Anastassiou E., Spiliopoulou 10

11 I. Staphylococcus epidermidis catheter-related bloodstream infection in critically ill patients: epidemiology, biofilm formation and risk factors. Poster presentation, 24 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, May 2014, Barcelona, Spain. ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΣΥΝΕΔΡΙΑ 1. Ε. Δρούγκα, Α. Φωκά, Ε. Λεμπέση, Ν. Γιορμέζης, Α. Δουδουλακάκης, Α. Λιακόπουλος, Δ. Γαραντζιώτη, Α. Σπηλιοπούλου, Φ. Κολονίτσιου, Ε.Δ. Αναστασίου, Ε. Πετεινάκη, Ι. Σπηλιοπούλου. Ο Ευρωπαϊκός κλώνος ST80 επικρατεί σε λοιμώξεις παιδιών από ανθεκτικά στη methicillin στελέχη Staphylococcus aureus. Προφορική ανακοίνωση, 5 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκομειακών Λοιμώξεων, Φεβρουαρίου 2011, Αθήνα. 2. Π. Λυγούρα, Β. Γραμμένου, Ν. Γιορμέζης, Α. Χαραλάμπου, Χ. Νταβέλου, Α. Σπηλιοπούλου, Ι. Σπηλιοπούλου, Ε.Δ. Αναστασίου. Παρουσίαση δύο περιστατικών λοίμωξης από Strongyloides stercoralis. Αναρτημένη ανακοίνωση, 5 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκομειακών Λοιμώξεων, Φεβρουαρίου 2011, Αθήνα. 3. Ν. Γιορμέζης, Α. Σπηλιοπούλου, Φ. Κολονίτσιου, Α. Παπαναστασίου, Ε.Δ. Αναστασίου, Ι. Σπηλιοπούλου. Φαινοτυπική και γονοτυπική ανάλυση πηκτάση- αρνητικών σταφυλοκόκκων από λοιμώξεις ασθενών με προσθετικά υλικά. Προφορική ανακοίνωση, 5 ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκομειακών Λοιμώξεων, Φεβρουαρίου 2011, Αθήνα. 4. Ν. Γιορμέζης, Ε. Δρούγκα, Α. Φωκά, Α. Μακρή, Α. Βογιατζή, Φ. Κολονίτσιου, Ε.Δ. Αναστασίου, Ι. Σπηλιοπούλου. Σύνθεση βιομεμβράνης και γονίδια προσκολλητινών σε πηκτάση-αρνητικούς σταφυλοκόκκους από λοιμώξεις σχετιζόμενες με προσθετικά υλικά σε δύο νοσοκομεία. Προφορική ανακοίνωση, 7 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, Μαρτίου 2012, Αθήνα. 11

12 5. Κ. Παπακωνσταντίνου, Α. Φωκά, Ε. Δρούγκα, Ν. Γιορμέζης, Φ. Κολονίτσιου, Ε.Δ. Αναστασίου, Ι. Σπηλιοπούλου. Γονίδια σύνθεσης βιομεμβράνης και προσκολλητινών σε methicillin-ανθεκτικά στελέχη Staphylococcus aureus. Αναρτημένη ανακοίνωση, 7 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, Μαρτίου 2012, Αθήνα. 6. Ν. Γιορμέζης, Φ. Κολονίτσιου, Κ. Παπακωνσταντίνου, Α. Φωκά, Ε. Δρούγκα, Ε.Δ. Αναστασίου, Ι. Σπηλιοπούλου. Έλεγχος αντοχής, biofilm και προσκολλητινών σε μεθικιλλίνη-ανθεκτικούς Staphylococcus aureus και S. epidermidis. Προφορική ανακοίνωση, 7 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας, Φεβρουαρίου 2015, Αθήνα. 7. Ν. Γιορμέζης, Φ. Κολονίτσιου, Α. Μακρή, Α. Βογιατζή, Μ. Χριστοφίδου, Ε.Δ. Αναστασίου, Ι. Σπηλιοπούλου. Έλεγχος κλώνων και λοιμογόνων παραγόντων Staphylococcus lugdunensis. Προφορική ανακοίνωση, 7 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας, Φεβρουαρίου 2015, Αθήνα. 12

13 Στην Γεωργία, την Ηρώ, την Αναστασία, τον Ζήση, τη Φαίη, τη Γιολάντα και τον Δημήτρη... 13

14 14

15 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ Γενικά χαρακτηριστικά Κυτταρικό τοίχωμα Κυτταροπλασματική μεμβράνη Γλυκοκάλυκας (έλυτρο) Γενετικό υλικό ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ CNS ΜΕΘΟΔΟΙ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗΣ CNS ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Βιότυπος Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά Τυποποίηση με βακτηριοφάγους (Phage Typing) Ανοσοαποτύπωση Western blot (immunoblotting) Πολυτοπική ενζυμική ηλεκτροφόρηση (Multilocus enzyme electrophoresis, MLEE) ΓΟΝΟΤΥΠΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) Repetitive-element Polymerase Chain Reaction (Rep-PCR) Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed- Field Gel Electrophoresis, PFGE) Πολυτοπική ανάλυση αλληλουχίας (Multilocus Sequence Typing, MLST)

16 Μονοτοπική ανάλυση αλληλουχίας (Single Locus Sequence Typing, SLST) Άλλες μοριακές μέθοδοι τυποποίησης ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΑΠΟ CNS Λοιμώξεις από S. epidermidis Λοιμώξεις από S. haemolyticus Λοιμώξεις από S. lugdunensis ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ β-λακταμικά αντιβιοτικά Γλυκοπεπτίδια Λιποπεπτίδια (Daptomycin) Μακρολίδες- Λινκοζαμίδες- Στρεπτογραμμίνη Β (MLSB) Οξαζολιδινόνες (Linezolid) Αμινογλυκοσίδες Τετρακυκλίνες Φουσιδικό οξύ Ριφαμπικίνη Κινολόνες Σουλφοναμίδες Τριμεθοπρίμη ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΒΙΟΜΕΜΒΡΑΝΗ (BIOFILM) ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ/ΣΥΣΣΩΡΕΥΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ MSCRAMMs FnbA-FnbB Aap Bap Fbe

17 Embp ΑΥΤΟΛΥΣΙΝΕΣ ΤΕΙΧΟÏΚΑ ΟΞΕΑ ΑΠΟΚΟΛΛΗΣΗ ΤΟΥ BIOFILM ΤΟΞΙΝΕΣ ΕΙΔΙΚΟΙ ΛΟΙΜΟΓΟΝΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΤΟΥ S. lugdunensis ΈΛΕΓΧΟΣ ΛΟΙΜΟΓΟΝΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ agr (accessory gene regulator) luxs/aι Άλλα ρυθμιστικά συστήματα σταφυλοκόκκων ΒΙΟΫΛΙΚΑ ΜΕΤΑΛΛΙΚΑ ΒΙΟΫΛΙΚΑ ΠΟΛΥΜΕΡΗ ΒΙΟΫΛΙΚΑ Πολυαιθυλένιο Πολυτετραφθοροαιθυλένιο Πολυακρυλικές ρητίνες ΚΕΡΑΜΙΚΑ ΒΙΟΫΛΙΚΑ ΒΙΟΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΣΥΝΘΕΤΑ ΒΙΟΫΛΙΚΑ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΤΑ ΠΡΟΣΘΕΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α. ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ ΣΤΕΛΕΧΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΥ Ταυτοποίηση βακτηρίων σε επίπεδο είδους

18 3.2. Έλεγχος παραγωγής βιομεμβράνης (biofilm) Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά Μέθοδος διάχυσης του αντιμικροβιακού στο άγαρ (μέθοδος δίσκων) Μέθοδος προσδιορισμού MIC (E-test) Έλεγχος παραγωγής β-λακταμάσης Έλεγχος παραγωγής τροποποιημένης πενικιλλινοδεσμευτικής πρωτεΐνης (PBP2a) ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΓΟΝΟΤΥΠΟΥ Παρασκευή χρωμοσωμικού DNA Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Έλεγχος ποιότητας παραγόμενου DNA με PCR Έλεγχος ύπαρξης γονιδίου meca Ανίχνευση των υπεύθυνων γονιδίων για την παραγωγή biofilm Ανίχνευση των γονιδίων σύνθεσης προσκολλητινών/ αυτολυσινών Ανίχνευση των γονιδίων παραγωγής τοξινών Ανίχνευση των γονιδίων λοιπών λοιμογόνων παραγόντων S. lugdunensis Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) Απομόνωση DNA και εγκλεισμός σε δίσκους αγαρόζης Πέψη με περιοριστικό ένζυμο και ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο Πολυτοπική νουκλεοτιδική ανάλυση- Multi Locus Sequence Typing (MLST) ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Β. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ταξινόμηση Πηκτάση-αρνητικών Σταφυλοκόκκων ανά είδος και προέλευση

19 2. Έλεγχος ευαισθησίας των CNS στα αντιμικροβιακά Έλεγχος παραγωγής β-λακταμάσης Έλεγχος παραγωγής βιομεμβράνης (biofilm) Χαρακτηρισμός κλώνων με PFGE Χαρακτηρισμός κλώνων S. epidermidis με MLST Συσχετισμός αντοχής στα αντιμικροβιακά με κλώνους και προέλευση δείγματος Συσχετισμός biofilm με κλώνους και προέλευση δείγματος Φορεία οπερονίου ica και συσχέτιση με biofilm και κλώνους Φορεία γονιδίων σύνθεσης προσκολλητινών σε S. epidermidis και S. haemolyticus και συσχέτιση με προέλευση δείγματος και κλώνους Φορεία γονιδίων σύνθεσης τοξινών σε S. epidermidis και S. haemolyticus και συσχέτιση με προέλευση δείγματος και κλώνους Φορεία γονιδίων σύνθεσης λοιμογόνων παραγόντων S. lugdunensis και συσχέτιση με προέλευση δείγματος και κλώνους Γ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

20 20

21 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Οι πηκτάση αρνητικοί σταφυλοκόκκοι (CNS) έχουν αναδειχθεί τα τελευταία χρόνια ως σημαντικό αίτιο λοιμώξεων. Ο Staphylococcus epidermidis και ο S. haemolyticus είναι τα κυρίαρχα είδη CNS που σχετίζονται με ενδονοσοκομειακές κυρίως λοιμώξεις σε ειδικές κατηγορίες ασθενών, όπως τα πρόωρα νεογνά, οι ανοσοκατεσταλμένοι και οι ασθενείς που φέρουν προσθετικά υλικά. Η χρήση των υλικών αυτών, που αυξάνεται συνεχώς με την πρόοδο της Ιατρικής, έχει συντελέσει στην ανάδειξη φαινομενικά μη λοιμογόνων μικροοργανισμών, όπως οι CNS, σε δυνητικά παθογόνους. Η λοιμογόνος ικανότητα των CNS σχετίζεται άμεσα με την ικανότητά τους να προσκολλώνται σε αδρανείς επιφάνειες και ιστούς και να σχηματίζουν βιομεμβράνη. Ένα άλλο είδος της οικογένειας των CNS που απασχολεί την επιστημονική κοινότητα τα τελευταία χρόνια είναι ο S. lugdunensis, ο οποίος, σε χαμηλότερη συχνότητα, μπορεί να προκαλέσει σοβαρές λοιμώξεις. Στα πλαίσια μιας τέτοιας συνολικής θεώρησης της επιδημιολογίας των CNS διερευνήσαμε το μοριακό υπόβαθρο στελεχών S. epidermidis και S. haemolyticus από ασθενείς με προσθετικά υλικά σε σύγκριση με CNS από νοσηλευόμενους με βακτηριαιμία, ώστε να αναγνωριστούν οι παράγοντες εκείνοι που συμβάλλουν στην παθογένεια κάθε κατηγορίας λοιμώξεων. Επιπρόσθετα, μελετήσαμε έναν πληθυσμό S. lugdunensis που απομονώθηκαν από ασθενείς στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών και στο Νοσοκομείο Παίδων Πεντέλης. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών και καλύφθηκε οικονομικά σε μεγάλο μέρος από χρηματοδοτήσεις του Εθνικού Κέντρου Αναφοράς Σταφυλοκόκκων (Κέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων/ΚΕΕΛΠΝΟ, ΕΛΚΕ πρόγραμμα C954). Στην προσπάθεια αυτή βρήκα συμπαραστάτες τους Καθηγητές μου και τους συναδέλφους μου, τους οποίους και αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή και Διευθυντή του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας κ. Ευάγγελο Δ. Αναστασίου για την ανάθεση του θέματος αυτού και για την επιστημονική συνδρομή του. Ιδιαίτερα αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα Καθηγήτρια κ. Ίριδα Σπηλιοπούλου για την άψογη και αποδοτική συνεργασία μας, την επιστημονική καθοδήγηση και την αμέριστη συμπαράστασή της καθ όλη τη διάρκεια 21

22 της παρούσας μελέτης. Την ευχαριστώ θερμά για τη δυνατότητα που μου προσέφερε να εκπαιδευτώ στο εργαστήριό της σε σύγχρονες τεχνικές Μικροβιολογίας και Μοριακής Βιολογίας, την εμπιστοσύνη που μου παρείχε, τις πολύτιμες γνώσεις που μου μετέδωσε στην πορεία μου ως φοιτητής Ιατρικής και ως ειδικευόμενος Ιατρικής Βιοπαθολογίας και για την ουσιαστική συμβολή της στην συγγραφή της παρούσας εργασίας. Αξίζει επίσης να αναφερθώ στην Καθηγήτρια κ. Μυρτώ Χριστοφίδου για την άψογη συνεργασία που είχαμε, τις πολύτιμες συμβουλές της κατά τη συνεργασία μας καθώς και για το χρόνο που αφιέρωσε στην κριτική διόρθωση του κειμένου. Θα ήταν σημαντική παράλειψη αν δεν ανέφερα την Καθηγήτρια κ. Φεβρονία Κολονίτσιου για τη σημαντική συμβολή της στο πειραματικό μέρος της μελέτης και τον πολύτιμο χρόνο που αφιέρωσε στην επιμέλεια των εργασιών. Την Καθηγήτρια κ. Φωτεινή Παληογιάννη ευχαριστώ θερμά για τις εύστοχες υποδείξεις της και την αρμονική συνεργασία μας τόσο στο Πανεπιστήμιο όσο και στο Νοσοκομείο. Τους Καθηγητές κ. Μάρκο Μαραγκό και κ. Γαβριήλ Δημητρίου τους ευχαριστώ βαθιά για τις εύστοχες υποδείξεις τους. Ομοίως την Καθηγήτρια κ. Ευθυμία Πετεινάκη και τον κ. Απόστολο Λιακόπουλο για την πολύτιμη συμβολή τους στο πειραματικό μέρος της μελέτης και στη διόρθωση των εργασιών, όπως και την κ. Αναστασία Σπηλιοπούλου, την κ. Αλίκη Βογιατζή και την κ. Αντωνία Μακρή για τη βοήθειά τους στην συλλογή των κλινικών στελεχών. Ιδιαίτερα θέλω να ευχαριστήσω την κ. Αντιγόνη Φωκά και την κ. Ελεάννα Δρούγκα, για το ευχάριστο κλίμα που δημιουργούσαν στο εργαστήριο, τις γνώσεις που μου προσέφεραν, τη βοήθεια στα πειράματα και την πολύτιμη συμπαράστασή τους στις επιτυχημένες -και μη- στιγμές στο εργαστήριο. Την κ. Κασσιανή Λιόπεττα, που με ανέχεται από το Λύκειο ακόμα. Αλλά και τον κ. Τάσο Παπαναστασίου, την κ. Μαρία Κρεββατά, την κ. Μαρία Κουτσογιάννου, τον κ. Ματθαίο Παπαδημητρίου- Ολιβγέρη, τον κ. Οδυσσέα Δημητρακόπουλο και την κ. Χριστίνα Μπαρτζάβαλη για τις όμορφες στιγμές που περάσαμε. Τέλος, πολύτιμη υπήρξε η συμπαράσταση της οικογένειας μου και των φίλων μου, οι οποίοι ήταν δίπλα μου καθ' όλη τη διάρκεια αυτής της προσπάθειας. 22

23 Γενικό Μέρος 23

24 24

25 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι (Coagulase-Negative Staphylococci, CNS) αποτελούν μία ετερογενή ομάδα μικροοργανισμών που έχουν τις τελευταίες δεκαετίες αναδειχθεί σε σημαντικά νοσοκομειακά παθογόνα, με τον Staphylococcus epidermidis και τον S. haemolyticus ως τους κύριους εκπροσώπους. Αποτελούν μείζον αίτιο λοιμώξεων που σχετίζονται με προσθετικά υλικά και βακτηριαιμιών σε νεογνά. Μεταξύ των υπολοίπων ειδών CNS, ιδιαίτερη θέση κατέχει ο S. lugdunensis, ο οποίος απομονώνεται κυρίως ως αίτιο ενδοκαρδίτιδας και έχει ομοιότητες με το πιο λοιμογόνο είδος, S. aureus. Οι CNS απομονώνονται συχνά από διάφορα τρόφιμα, ενώ πολλά είδη αποικίζουν το δέρμα και τους βλεννογόνους ανθρώπων και ζώων χωρίς να προκαλούν λοιμώξεις. Η διφορούμενη συμπεριφορά τους από άποψη παθογένειας οφείλεται σε λοιμογόνους παράγοντες που μπορεί να διαφέρουν από είδος σε είδος. Αν και οι CNS φέρουν λιγότερους λοιμογόνους παράγοντες σε σύγκριση με τον S. aureus, μπορεί να προκαλέσουν προβλήματα σε άτομα με μειωμένους αμυντικούς μηχανισμούς. Η πρόοδος της ιατρικής με την ολοένα αυξανόμενη χρήση προσθετικών υλικών, μαζί με την αύξηση του προσδόκιμου επιβίωσης των ασθενών και τη χρήση φαρμάκων που καταστέλλουν το ανοσοποιητικό, έφεραν στο προσκήνιο τους CNS ως μείζονα αίτια λοιμώξεων σε ιδιαίτερες κατηγορίες ασθενών. Στο επίπεδο της θεραπείας, οι λοιμώξεις από CNS αποτελούν πραγματική πρόκληση λόγω του μεγάλου ποσοστού ανθεκτικών στη μεθικιλλίνη στελεχών και της συνεχούς αύξησης της αντοχής ακόμα και στα νεότερα αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται στην κλινική πράξη. Στις μέρες μας οι CNS αποτελούν τυπικά ευκαιριακά παθογόνα που σχετίζονται με τη χρήση προσθετικών υλικών, τα οποία έχουν πλέον γίνει αναπόσπαστο τμήμα της ιατρικής πράξης. Ο αποικισμός του δέρματος και τον βλεννογόνων του ασθενούς είναι το έναυσμα για τη δημιουργία ενδογενών λοιμώξεων, ενώ οι εξωγενείς λοιμώξεις μπορεί να προέλθουν από μετάδοση μικροβίων μέσω των ιατρικών πρακτικών. Ο αποικισμός των βιοϋλικών από μικροοργανισμούς πολλές φορές οδηγεί σε διαταραχές της λειτουργίας τους, με όλες τις ιατρικές και οικονομικές συνέπειες που αυτό συνεπάγεται. 25

26 2. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 2.1. Γενικά χαρακτηριστικά Οι σταφυλόκοκκοι είναι Gram θετικοί κόκκοι (Εικόνα 1). Έχουν διάμετρο 0.5 έως 1.5 μm και ανήκουν στην οικογένεια Micrococcaceae. Τα γένη των οικογενειών Micrococcaceae και Streptococcaceae διαχωρίζονται με τη δοκιμασία παραγωγής της καταλάσης. Το ένζυμο καταλάση βρίσκεται σε όλα τα βακτήρια που έχουν κυτοχρώματα. Διασπά το H 2 O 2, που παράγεται ως προϊόν μεταβολισμού των κυττάρων και είναι τοξικό για τα βακτήρια, σε H 2 O και O 2 (Δημητρακόπουλος, 1986). Η οικογένεια Micrococcaceae περιλαμβάνει τα γένη Staphylococcus, Planococcus, Rothia και Micrococcus. Ο διαχωρισμός του γένους Staphylococcus από το γένος Micrococcus, που και αυτό αποτελεί μέρος της φυσιολογικής μικροβιακής χλωρίδας του ανθρώπου βασίζεται στο γεγονός ότι οι σταφυλόκοκκοι διασπούν τη γλυκόζη αεροβίως και αναεροβίως και είναι ανθεκτικοί στη bacitracin, ενώ οι μικρόκοκκοι διασπούν τη γλυκόζη μόνο αεροβίως και είναι ευαίσθητοι στη bacitracin (Δημητρακόπουλος, 1986). Εικόνα 1. Gram χρώση σταφυλοκόκκου. 26

27 Γενικά, οι σταφυλόκοκκοι είναι ακίνητοι, μη σπορογόνοι, αερόβιοι και προαιρετικά αναερόβιοι μικροοργανισμοί που διατάσσονται σε ακανόνιστους σχηματισμούς σαν τσαμπιά σταφυλιού. Καλλιεργούνται εύκολα αερόβια, αλλά και σε όλες τις συνθήκες. Οι αποικίες τους είναι λευκές ή κίτρινες, με ελαφριά υπέγερση από το υλικό. Η μορφολογία, το χρώμα των αποικιών και η αιμόλυση σε αιματούχο άγαρ ποικίλουν μεταξύ των διαφόρων ειδών. Παράγουν καταλάση. Στο κυτταρικό τους τοίχωμα έχουν πεπτιδογλυκάνη συνδεδεμένη με τειχοϊκά οξέα. Διασπούν τη γλυκόζη και πολλά άλλα σάκχαρα οξειδωτικά, χωρίς την παραγωγή αερίου. Διασπούν κάποια σάκχαρα και σε αναερόβιες συνθήκες με ζύμωση. Δεν λύονται με λυσοζύμη, αλλά λύονται από τη λυσοσταφίνη (Δημητρακόπουλος, 1986). Εικόνα 2. Καλλιέργεια S. epidermidis σε τρυβλίο με αιματούχο άγαρ. Ο Staphylococcus lugdunensis είναι ένα ιδιαίτερο μέλος της οικογένειας των CNS με παθογόνο δράση που μοιάζει με αυτήν του S. aureus. Δεν παράγει ελεύθερη πηκτάση αλλά κάποια στελέχη βγαίνουν θετικά για παράγοντα συγκόλλησης (clumping factor) σε δοκιμασίες όπου χρησιμοποιείται το ανθρώπινο πλάσμα. Δεν παράγει πρωτεΐνη Α και δίνει θετική τη δοκιμασία πυριδονυλο-αρυλαμιδάσης (PYRtest). Η ταυτοποίηση αυτού του είδους στο κλινικό εργαστήριο δεν είναι εύκολη, γιατί μπορεί να ταυτοποιηθεί λανθασμένα ως S. aureus, αν χρησιμοποιηθεί μόνο η δοκιμασία συγκόλλησης με σωματίδια latex, καθώς η παραγωγή του παράγοντα συγκόλλησης από τον S. lugdunensis μπορεί να θεωρηθεί ως θετικό αποτέλεσμα 27

28 (Frank et al., 2008). Είναι ευαίσθητος στην νοβοβιοσίνη και στα περισσότερα αντιβιοτικά, καθώς παραγωγή β-λακταμασών έχει βρεθεί μόνο στο 25% περίπου των στελεχών και η ανθεκτικότητα στη μεθικιλλίνη είναι, ακόμα, αρκετά σπάνια (Frank et al., 2008) Κυτταρικό τοίχωμα Το κυτταρικό τοίχωμα των σταφυλοκόκκων αποτελείται από πολλές στιβάδες πεπτιδογλυκάνης (μουρεΐνης), ενός σύνθετου πολυμερούς από μεγάλες αλυσίδες επαναλαμβανόμενων μορίων Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης και Ν-ακετυλομουραμικού οξέος, με μικρές πλάγιες πενταπεπτιδικές αλυσίδες αλληλοσυνδεόμενες με πεπτιδικούς δεσμούς μεταξύ μορίων λυσίνης και D-αλανίνης. Επιπλέον, στο κυτταρικό τοίχωμα βρίσκονται τειχοϊκά οξέα, τα οποία είναι πολυμερή από επαναλαμβανόμενες μονάδες ριβιτόλης ή γλυκερόλης συνδεόμενες μεταξύ τους με φωσφοδιεστερικούς δεσμούς. Τα τειχοϊκά οξέα συμμετέχουν στη μεταφορά φωσφόρου και ιόντων μαγνησίου στο βακτήριο και αποτελούν κύρια αντιγόνα της κυτταρικής επιφάνειας (Αναστασίου, 2009). Το κυτταρικό τοίχωμα προστατεύει την κυτταρική μεμβράνη του βακτηρίου από μηχανική ή ωσμωτική λύση και του προσδίδει σταθερό σχήμα. Περιέχει πολλά χαρακτηριστικά αντιγόνα, σημαντικά τόσο για τη λοιμογόνο δράση των βακτηρίων όσο και για το σχηματισμό αντισωμάτων από τον ξενιστή Κυτταροπλασματική μεμβράνη Η κυτταροπλασματική μεμβράνη βρίσκεται μεταξύ κυτταροπλάσματος και κυτταρικού τοιχώματος και έχει πάχος Α 0. Η κυτταρική μεμβράνη των CNS αποτελείται από πρωτεΐνες, λιπίδια και ένα μικρό ποσοστό σακχάρων όπως γλυκόζη, γλυκοζαμίνη και μαννόζη, ενώ απουσιάζουν οι στερόλες των ευκαρυωτικών κυττάρων. Αποτελεί ωσμωτικό φραγμό μεταξύ του βακτηρίου και του περιβάλλοντος, συμμετέχει στην μεταφορά διαλυμένων ουσιών και κυτταρικών προϊόντων, ενώ περιέχει και ενζυμικά συστήματα παρόμοια με αυτά των μιτοχονδρίων των ευκαρυωτικών κυττάρων (Spicer, 2008). 28

29 2.4. Γλυκοκάλυκας (έλυτρο) Ορισμένα βακτήρια, υπό κατάλληλες συνθήκες ανάπτυξης, περιβάλλονται από μία στιβάδα ιξώδους, άμορφου και αδρά χρωματιζόμενου υλικού, για το οποίο τα τελευταία χρόνια επικρατεί ο όρος γλυκοκάλυκας. Γενικώς, η παρουσία γλυκοκάλυκα σε ένα στέλεχος είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με υψηλή λοιμογόνο ικανότητα. Η συγκεκριμένη ιδιότητα δεν οφείλεται σε κάποιο ιδιαίτερο ρόλο του γλυκοκάλυκα στον κυτταρικό μεταβολισμό, αλλά στο γεγονός οτι αυξάνεται η ανθεκτικότητα στη φαγοκυττάρωση και η αντοχή σε αντιμικροβιακούς παράγοντες, καθώς εμποδίζει τη διάχυσή τους. Στους μικροοργανισμούς που ο γλυκοκάλυκας είναι οργανωμένος σε συγκεκριμένη δομή και προσκολλάται στέρεα στο κυτταρικό τοίχωμα, χρησιμοποιείται πλέον ο όρος έλυτρο (Αναστασίου, 2009) Γενετικό υλικό Το σταφυλοκοκκικό γονιδίωμα αποτελείται από ένα κυκλικό χρωμόσωμα μεγέθους 2.62 Mbp. Επιπρόσθετα, εξωχρωμοσωμικό γενετικό υλικό απαντάται συχνά στα βακτήρια. Αυτό προσδίδει στους μικροοργανισμούς τη δυνατότητα επιβίωσης σε ποικίλες αλλαγές των συνθηκών του περιβάλλοντος, περιλαμβανομένης της αντίστασης στα αντιβιοτικά και της παραγωγής τοξινών. Στο εξωχρωμοσωμικό γενετικό υλικό περιλαμβάνονται τα πλασμίδια, οι βακτηριοφάγοι και τα μεταθετά τμήματα DNA ή τρανσποζόνια (Σπηλιοπούλου, 2008). Το γονιδίωμα των CNS κωδικοποιεί λιγότερους λοιμογόνους παράγοντες σε σχέση με τον S. aureus και αυτή είναι η αιτία για την μικρότερη παθογόνο δράση τους. Το γονιδίωμα του S. epidermidis κωδικοποιεί οκτώ διαύλους ανταλλαγής νατρίου και έξι ωσμωπροστατευτικά συστήματα μεταφοράς. Θεωρείται ότι τα συστήματα αυτά βοηθούν στην επιβίωση του S. epidermidis στην επιφάνεια του δέρματος, καθώς αντιπαρέρχονται την ωσμωτική πίεση και την υψηλή συγκέντρωση αλάτων, γεγονός που εξηγεί την επιτυχία των μικροοργανισμών αυτών στον αποικισμό του δέρματος ανθρώπων και ζώων (Gill et al., 2005). 29

30 3. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ CNS Η ταξινόμηση των CNS αποτέλεσε πεδίο διαμάχης μεταξύ των επιστημόνων, με πολλές ανακατατάξεις κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών. Η ονομασία Staphylococcus χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1882 από τον Sir Alexander Ogston, για να περιγράψει σφαιρικά βακτήρια τα οποία σχημάτιζαν αθροίσματα που έμοιαζαν με τσαμπιά από σταφύλια. Η έρευνά του ήταν από τις πρώτες που συνέδεσαν τους μικροοργανισμούς αυτούς με λοιμώξεις τραυμάτων. Ο Rosenbach, το 1884, διαχώρισε τους σταφυλοκόκκους σε παθογόνους και μη παθογόνους. Το 1940 ο Fairbrother εισήγαγε τον έλεγχο παραγωγής πηκτάσης ως ιδιότητα διάκρισης των διαφόρων ειδών. Αν και αρχικά περιγράφησαν μόνο λίγα είδη CNS, στα τέλη της δεκαετίας του 1970 η οικογένεια των πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων μεγάλωσε με την ανακάλυψη 10 νέων ειδών (περιλαμβανομένων των S. haemolyticus και S. hominis), ενώ ακολούθησε μία ακόμα μεγαλύτερη αύξηση τα μεταγενέστερα χρόνια (Becker et al., 2014). Εικόνα 3. Κατηγοριοποίηση σταφυλοκόκκων με βάση την παραγωγή πηκτάσης ως λοιμογόνου παράγοντα και την ικανότητα προσβολής του ανθρώπου (Becker et al., 2014). 30

31 Το 2014 το γένος Staphylococcus περιλαμβάνει 47 είδη και 23 υποείδη, με 38 είδη να ανήκουν αποκλειστικά στην ομάδα των πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων, ενώ ένα ακόμη είδος, ο S. schleiferi, περιλαμβάνει ένα πηκτάση-αρνητικό (S. schleiferi subsp. schleiferi) και ένα πηκτάση-θετικό υποείδος (S. schleiferi subsp. coagulans). Οι CNS που έχουν περιγραφεί πιο πρόσφατα σε ανθρώπινα δείγματα είναι οι S. jettensis, S. massiliensis, S. pettenkoferi και S. petrasii, ενώ έχει προταθεί και ένα νέο είδος, ο S. pseudolugdunensis (Becker et al., 2014). Δύο είδη που έχουν αφαιρεθεί από την ομάδα των CNS είναι ο S. pulvereri, που είχε περιγραφεί το 1995 αλλά τελικά βρέθηκε πανομοιότυπος με τον προγενέστερο S. vitulinus και ο S. caseolyticus, που μεταφέρθηκε στο γένος Macrococcus (de la Fuente et al., 1992). Οι CNS αποτελούν μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του δέρματος και των βλεννογόνων ανθρώπου και ζώων. Οι σταφυλόκοκκοι προτιμούν περιοχές του σώματος με αυξημένη υγρασία όπως οι μασχάλες, η βουβωνική χώρα, οι γλουτοί, ο ομφαλός, οι επιπεφυκότες, η ιγνυακή χώρα και τα πέλματα. Τα μικρόβια της φυσιολογικής χλωρίδας φαίνεται ότι παρέχουν κάποια οφέλη στον ξενιστή. Για παράδειγμα, έχει αναφερθεί ότι μία πρωτεάση που παράγεται από πληθυσμούς στελεχών S. epidermidis καταστρέφει τα biofilms που σχηματίζονται από τον S. aureus αποτρέποντας τον αποικισμό των ρινικών κοιλοτήτων από αυτόν (Iwase et al., 2010). Ο S. epidermidis είναι το είδος που απομονώνεται συχνότερα από τον άνθρωπο μεταξύ των CNS. Αποικίζει την επιφάνεια του σώματος με προτίμηση στις μασχαλιαίες περιοχές, στις ρινικές κοιλότητες, στο περίνεο, στη βουβωνική χώρα, στους επιπεφυκότες και στα μεσοδιαστήματα μεταξύ των δακτύλων του ποδιού. Ο S. haemolyticus και ο S. hominis αποικίζουν κυρίως τις μασχάλες και την ηβική περιοχή ενώ ο S. capitis προτιμά την περιοχή γύρω από τους σμηγματογόνους αδένες στο μέτωπο και το τριχωτό της κεφαλής μετά την εφηβεία. Ο S. auricularis είναι μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του έξω ωτός, αποικίζοντας αποκλειστικά την περιοχή αυτή. Ο S. lugdunensis απαντάται συχνότερα στην περιοχή της πυέλου και του περινέου, στη βουβωνική χώρα, στα κάτω άκρα και στις μασχάλες, ενώ ο S. saprophyticus στο ορθό και στο ουρογεννητικό σύστημα (Becker et al., 2014). 31

32 4. ΜΕΘΟΔΟΙ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ Οι παραδοσιακές μέθοδοι τυποποίησης των βακτηρίων, όπως ο βιότυπος και η αντοχή στα αντιμικροβιακά, έχουν χρησιμοποιηθεί για δεκαετίες. Παρόλα αυτά, οι τεχνικές που ελέγχουν τη συγγένεια των στελεχών σε μοριακό επίπεδο έφεραν πραγματική επανάσταση στη διαφοροποίηση μεταξύ βακτηριακών υποτύπων. Οι παθογόνοι για τον άνθρωπο μικροοργανισμοί χαρακτηρίζονται από τεράστια ποικιλομορφία και οι τεχνικές τυποποίησης πρέπει να μπορούν να ανταπεξέλθουν στο γεγονός αυτό. Η επιλογή της κατάλληλης μεθόδου εξαρτάται από τον ερευνητικό στόχο και το επιδημιολογικό και γεωγραφικό πλαίσιο της μελέτης. Σε μελέτες επιδημικών εξάρσεων οι τεχνικές που θα χρησιμοποιηθούν πρέπει να έχουν ικανοποιητική διακριτική ικανότητα ώστε να αποκλειστούν τα επιδημιολογικά άσχετα στελέχη και να αναδειχθούν αυτά που μεταδίδονται από άνθρωπο σε άνθρωπο, ενώ παράλληλα πρέπει να είναι ταχείες, με χαμηλό κόστος, επαναληψιμότητα και με αποτελέσματα εύκολα στην ερμηνεία. Σε μελέτες σε διεθνές επίπεδο τα αποτελέσματα πρέπει να είναι προσβάσιμα μέσω μίας ανοιχτής βάσης δεδομένων και να βασίζονται σε μία διεθνώς αναγνωρισμένη ταξινόμηση ώστε να μπορούν να ερμηνευτούν από εργαστήρια σε διαφορετικές χώρες (Sabat et al., 2013) ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Βιότυπος Η συγγένεια των στελεχών με βάση το βιότυπο καθορίζεται από το σύνολο των μεταβολικών ιδιοτήτων που εκφράζονται από ένα βακτήριο. Στις ιδιότητες αυτές περιλαμβάνονται η μορφολογία των αποικιών (χρώμα, υφή, αιμόλυση), βιοχημικές αντιδράσεις και ιδιότητες που σχετίζονται με το περιβάλλον (όπως η ικανότητα ανάπτυξης σε συγκεκριμένο θρεπτικό υλικό, ph ή θερμοκρασία). Στελέχη τα οποία παράγουν biofilm σε μεγάλο βαθμό μπορεί να σχηματίζουν αποικίες με βλεννώδη εμφάνιση. Οι αποικίες των CNS μετά από επώαση δύο ημερών έχουν διάμετρο 3-6 mm. Αποικίες με κίτρινο ή κίτρινο-πορτοκαλί χρωματισμό είναι χαρακτηριστικές 32

33 κάποιων ειδών όπως οι S. chromogenes, S. lugdunensis, S. devriesei, S. sciuri, S. vitulinus, S. warneri και S. xylosus (Becker et al., 2014). Μειονέκτημα των μεθόδων αυτών είναι η χαμηλή επαναληψιμότητα και διαχωριστική ικανότητα Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά Στα εργαστήρια των νοσοκομείων χρησιμοποιείται σε επίπεδο ρουτίνας ένα σύνολο αντιμικροβιακών για τον έλεγχο της ευαισθησίας των απομονωθέντων στελεχών. Όμως, ο έλεγχος ευαισθησίας έχει περιορισμένη αξία σε επιδημιολογικές μελέτες λόγω της ύπαρξης ανθεκτικών φαινοτύπων. Η αλόγιστη χρήση αντιβιοτικών και η εκτεταμένη πίεση επιλογής έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη πολυανθεκτικών στελεχών, ιδιαίτερα όσον αφορά τα ενδονοσοκομειακά στελέχη, με αποτέλεσμα ο έλεγχος φαινοτύπου να μην βοηθάει επιδημιολογικά. Υπάρχουν διάφοροι μηχανισμοί μέσω των οποίων ένα στέλεχος μπορεί να γίνει ανθεκτικό σε κάποιο αντιβιοτικό, όπως οι σημειακές μεταλλάξεις (π.χ. η αντοχή του S. aureus στις κινολόνες) ή η πρόσληψη ειδικών γονιδίων αντοχής μέσω πλασμιδίων και τρανσποζονίων από άλλα στελέχη ή ακόμα και από άλλα είδη (π.χ. η παραγωγή των ενζύμων που τροποποιούν τις αμινογλυκοσίδες). Όταν δεν υπάρχει ειδική επιλεκτική πίεση, τα μεταθετά στοιχεία αντοχής μπορεί να χαθούν. Έτσι, διαφορετικά στελέχη μπορεί να έχουν παρόμοιο φαινότυπο αντοχής στα αντιμικροβιακά και αντίστροφα, δηλαδή, η ευαισθησία διαδοχικών κλινικών στελεχών, που αντιπροσωπεύουν το ίδιο στέλεχος (κλώνο), μπορεί να διαφέρει σε περισσότερα από ένα αντιβιοτικά. Στην καθημερινή πρακτική χρησιμοποιείται ο έλεγχος ευαισθησίας στην νοβοβιοσίνη για την ταυτοποίηση CNS που προέρχονται από δείγματα ουροποιητικού. Εκτός από τον S. saprophyticus που αποτελεί συχνό αίτιο ουρολοιμώξεων, άλλοι ανθεκτικοί στην νοβοβιοσίνη CNS είναι ο S. cohnii, o S. sciuri, και o S. xylosus Τυποποίηση με βακτηριοφάγους (Phage Typing) Στην μέθοδο αυτή βακτηριακό εναιώρημα ενοφθαλμισμένο ως τάπητας σε τρυβλίο με κατάλληλο θρεπτικό υλικό εκτίθεται σε εναιώρημα διαφόρων φάγων και ελέγχεται η ανάπτυξή τους μετά από 24 ώρες επώασης. Ένα στέλεχος θεωρείται ευαίσθητο σε έναν φάγο εάν λυθούν τα αναπτυσσόμενα βακτηριακά κύτταρα, 33

34 αφήνοντας περιοχή μειωμένης ανάπτυξης στο τάπητα, ενώ ανθεκτικό θεωρείται όταν δεν επηρεάζεται η ανάπτυξή του. Για πολλές δεκαετίες η βακτηριοφαγική τυποποίηση αποτέλεσε χρήσιμο εργαλείο για τον προσδιορισμό πληθυσμιακών χαρακτηριστικών καθώς και τρόπων διασποράς βακτηριακών στελεχών. Δεν έχει εφαρμογή όμως στην τυποποίηση των ανθεκτικών στη methicillin σταφυλοκόκκων, διότι τα περισσότερα στελέχη εμφανίζονται ανθεκτικά σε λύση από φάγους, ακόμη και σε υψηλές συγκεντρώσεις αυτών (Wildemauwe et al., 2004) Ανοσοαποτύπωση Western blot (immunoblotting) Στη μέθοδο αυτή γίνεται εκχύλιση των πρωτεϊνών ενός βακτηρίου, ηλεκτροφόρησή τους σε gel πολυακρυλαμίδης και αποτύπωση σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης με μεταφορά κατά Western. Ακολούθως οι μεμβράνες εμβαπτίζονται σε αντι-σταφυλοκοκκικό ορό και αξιολογούνται τα πρότυπα που θα σχηματισθούν από την ένωση του πρωτεϊνικού αντιγόνου με τα αντισώματα του ορού. Η τεχνική αποδείχθηκε αποδοτική στις επιδημιολογικές μελέτες του S. aureus. Όμως, μολονότι η μέθοδος θεωρείται αποτελεσματική στη διάκριση σχετιζόμενων με μία επιδημική έξαρση στελεχών, η χρησιμότητά της είναι περιορισμένη, λόγω της εμπειρίας που απαιτείται για την ανάγνωση των αποτελεσμάτων και της ανάγκης χρήσης ανθρώπινου αντιορού (Towbin et al., 1992) Πολυτοπική ενζυμική ηλεκτροφόρηση (Multilocus enzyme electrophoresis, MLEE) Η πολυτοπική ενζυμική ηλεκτροφόρηση (MLEE) ελέγχει τον πολυμορφισμό των ενζύμων που παράγονται από ένα βακτήριο με βάση τη διαφορετική κινητικότητα κατά την ηλεκτροφόρηση και καθορίζει διάφορες σταθερές κυτταρικές πρωτεΐνες μεταβολισμού (housekeeping proteins). Ελέγχει τη γενετική ετερογένεια και παρέχει στοιχεία που εξυπηρετούν τη μελέτη της δομής του πληθυσμού των βακτηριακών ειδών (Lindsay, 2008). 34

35 4.2. ΓΟΝΟΤΥΠΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στον παράλληλο πολλαπλασιασμό διαφόρων τμημάτων DNA με τη χρήση ως εκκινητών μικρών αλληλουχιών (μεγέθους 6-10 bp), οι οποίες συνδέονται σε μη ειδικές γενετικές αλληλουχίες και υβριδοποιούνται με υψηλή απόδοση σε επαναλαμβανόμενες χρωμοσωμικές θέσεις. Ο πολλαπλασιασμός επιτελείται σε χαμηλή, μη ειδική θερμοκρασία που επιτρέπει τον υβριδισμό σε πολλαπλές περιοχές. Όταν η απόσταση μεταξύ των σημείων σύνδεσης δύο εκκινητών είναι μεταξύ 0.1 και 3 kb, το προϊόν της PCR είναι ένα τμήμα DNA που καλύπτει την αλληλουχία μεταξύ των σημείων σύνδεσης. Τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύονται με ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη ή αλληλούχιση DNA. Ο αριθμός και η θέση των σημείων σύνδεσης είναι χαρακτηριστικός για κάθε βακτηριακό στέλεχος. Το βασικό μειονέκτημα της είναι η μικρή επαναληψιμότητα, λόγω των χαμηλών θερμοκρασιών που χρησιμοποιούνται στο στάδιο της σύνδεσης των εκκινητών και του γεγονότος ότι επηρεάζεται από μικρές διαφορές σε αντιδραστήρια, πρωτόκολλα και μηχανήματα (Sabat et al., 2013) Repetitive-element Polymerase Chain Reaction (Rep-PCR) Στη REP-PCR χρησιμοποιούνται εκκινητές συμπληρωματικοί προς επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες μεταξύ των γονιδίων, οι οποίες είναι διάσπαρτες στο βακτηριακό χρωμόσωμα. Η αλληλουχία DNA μεταξύ γειτονικών επαναλαμβανόμενων στοιχείων ενισχύεται με PCR και ο αριθμός των προϊόντων εξαρτάται από τη διασπορά των στοιχείων αυτών στο γενετικό υλικό του βακτηρίου. Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη και σύγκριση των αποτελεσμάτων για την εντόπιση συγγενών στελεχών. Από τη στιγμή που ο αριθμός και η τοποθεσία των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών ποικίλλει, παρομοίως διαφέρει ο αριθμός και το μέγεθος των ενδο-επαναλαμβανόμενων τμημάτων από στέλεχος σε στέλεχος (van Belkum et al., 1995). Πρόκειται για γρήγορη και με χαμηλό κόστος μέθοδο, με υψηλή διακριτική ικανότητα για κάποια είδη βακτηρίων. Ο κύριος περιορισμός είναι η μικρή επαναληψιμότητα λόγω μεταβολών στα αντιδραστήρια και τις συνθήκες της ηλεκτροφόρησης (Sabat et al., 2013). 35

36 Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE) Η PFGE αναπτύχθηκε το 1984 και έγινε γρήγορα μεθοδος αναφοράς ("gold standard") για την μοριακή τυποποίηση βακτηρίων. Χρησιμοποιήθηκε έκτοτε ευρέως σε ερευνητικά εργαστήρια για την ανάλυση νοσοκομειακών δειγμάτων. Αποτελεί χρήσιμο εργαλείο στην επιδημιολογική μελέτη επιδημικών εξάρσεων και στην προσπάθεια εύρεσης της πηγής της επιδημίας. Η τεχνική βασίζεται στη διαφοροποίηση της γωνίας εφαρμογής του ηλεκτρικού πεδίου κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης θραυσμάτων DNA που έχουν προκύψει μετά από κατάτμηση του γενετικού υλικού του βακτηρίου με κάποιο περιοριστικό ένζυμο. Αυτό εξυπηρετεί το διαχωρισμό πολύ μεγάλων μορίων. Πολύ σύντομα η τεχνική χρησιμοποιήθηκε για τον απευθείας διαχωρισμό βακτηριακών χρωμοσωμάτων. Όταν χρωμόσωμα σταφυλοκόκκου, μεγέθους Kb περίπου και περιεκτικότητας 34% σε G+C, πέπτεται με το περιοριστικό ένζυμο SmaI (το οποίο αναγνωρίζει την αλληλουχία CCCGGG), η ανάλυση με PFGE έχει ως προϊόν πολύ καλά διαχωρισμένα θραύσματα μεγέθους από 10 έως 800 Kb. Σύμφωνα με τον Tenover, στελέχη με το ίδιο αποτύπωμα στην PFGE ανήκουν στον ίδιο κλώνο, ενώ διαφορά σε 1-3 ζώνες υποδηλώνει στενή συγγένεια. Πάνω από έξι διαφορές στο μοριακό αποτύπωμα της PFGE σημαίνει ότι τα στελέχη δεν είναι γενετικά συγγενή (Tenover et al., 1995). Η PFGE είναι από τις κύριες μοριακές μεθόδους για την τυποποίηση βακτηριακών κλώνων σε επιδημικές εξάρσεις. Έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε επιδημιολογικές μελέτες λόγω της υψηλής διακριτικής της ικανότητας, του σχετικά χαμηλού κόστους και της επαναληψιμότητας μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων. Ένα άλλο πλεονέκτημα της PFGE είναι ότι ελέγχει ένα μεγάλο μέρος του γονιδιώματος (>90%). Επομένως, εισαγωγή ή εξάλειψη μεταθετών γενετικών στοιχείων και ανασυνδυασμοί του γενετικού υλικού μπορούν να εντοπιστούν, καθώς έχουν ως αποτέλεσμα αλλαγές στο αποτύπωμα της PFGE. Τις τελευταίες δεκαετίες έχουν τελειοποιηθεί διάφορα πρωτόκολλα και έχουν δημιουργηθεί βάσεις δεδομένων που επέτρεψαν την ταχεία αναγνώριση αναδυόμενων κλώνων. Στους περιορισμούς της μεθόδου περιλαμβάνονται ο ακριβός εξοπλισμός και ο χρόνος που απαιτεί, καθώς η προετοιμασία του DNA και ο εγκλεισμός του σε δίσκους αγαρόζης διαρκεί τρεις ημέρες. Επιπλέον, η δυσκολία σύγκρισης των αποτελεσμάτων μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων καθώς δεν μπορεί να γίνει σύγκριση αποτελεσμάτων διαφορετικών 36

37 μελετών και συσχέτιση των κλώνων. Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων είναι σε κάποιο βαθμό υποκειμενική, ενώ είναι δύσκολη και η διάκριση μεταξύ ζωνών με παρόμοιο μέγεθος που διαφέρουν σε ποσοστό <5% (Sabat et al., 2013) Πολυτοπική ανάλυση αλληλουχίας (Multilocus Sequence Typing, MLST) Η MLST βασίζεται στις αρχές της MLEE, όπου ελέγχεται ο πολυμορφισμός των βακτηριακών ενζύμων με βάση την κινητικότητά τους στην ηλεκτροφόρηση. Το πρώτο σχήμα MLST αναπτύχθηκε το 1998 για την Neisseria meningitidis (Maiden et al., 1998). Έκτοτε, η MLST επεκτάθηκε για τη μελέτη και άλλων ειδών και αποτέλεσε χρήσιμο εργαλείο για τη μοριακή τυποποίηση βακτηρίων σε επιδημιολογικές μελέτες. Η μέθοδος βασίζεται στην ενίσχυση με PCR, αλληλουχιών bp από συνήθως επτά συντηρημένα γονίδια μεταβολισμού (housekeeping genes) και στην εύρεση της νουκλεοτιδικής τους αλληλουχίας (nucleotide sequence). Για κάθε γονιδιακό τμήμα οι διαφορετικές αλληλουχίες προσδιορίζονται ως ξεχωριστά αλληλόμορφα γονίδια (alleles) και κάθε στέλεχος καθορίζεται από τα αλληλόμορφα των επτά χρησιμοποιούμενων γονιδίων (allelic profile ή sequence type, ST). Ο αριθμός των διαφορών μεταξύ των αλληλομόρφων δεν λαμβάνεται υπόψη. Το κύριο πλεονέκτημα της MLST είναι ότι τα αποτελέσματα είναι ξεκάθαρα λόγω ενός διεθνούς συστήματος ορολογίας και με μεγάλη επαναληψιμότητα. Οι αλληλουχίες των αλληλόμορφων και οι συνδυασμοί των αλληλίων είναι διαθέσιμα σε κεντρικές βάσεις δεδομένων ( που επιτρέπουν την άμεση σύγκριση των βακτηριακών στελεχών, χωρίς να απαιτείται η δαπανηρή και προβληματική, ίσως, ανταλλαγή στελεχών ή αντιδραστηρίων. Επιπλέον παρέχονται διαδικτυακά προγράμματα (eburst) για τον καθορισμό της συγγένειας μεταξύ κλώνων και χάρτες για την εντόπιση κλώνων σε διάφορες χώρες. 37

38 Εικόνα 4. Απεικόνιση συνολικού πληθυσμού του είδους S. epidermidis με τον αλγόριθμο eburst. 38

39 Το κύριο μειονέκτημα της MLST είναι το υψηλό κόστος, που εξαρτάται από τον αριθμό των γενετικών τόπων που ελέγχονται και τη χώρα στην οποία γίνεται η έρευνα. Είναι μέθοδος που απαιτεί εργασία από το προσωπικό και αρκετό χρόνο (Sabat et al., 2013). Για την αύξηση της διακριτικής ικανότητας μπορούν να συμπεριληφθούν στο κλασσικό σχήμα της MLST και αποτελέσματα αλληλούχισης γονιδίων που κωδικοποιούν συγκεκριμένα αντιγόνα, ενώ έχουν αναπτυχθεί και σχήματα MLST που βασίζονται στον έλεγχο γονιδίων λοιμογόνων παραγόντων (Multi-Virulence-Locus Sequence Typing. MVLST). Εικόνα 5. Σχηματική αναπαράσταση MLST ( Μονοτοπική ανάλυση αλληλουχίας (Single Locus Sequence Typing, SLST) Ο καθορισμός της συγγένειας των βακτηρίων στη μέθοδο αυτή βασίζεται στην σύγκριση της αλληλουχίας ενός γονιδίου-στόχου. Αυτή είναι και η διαφορά της από την MLST, όπου χρησιμοποιούνται περισσότερα γονίδια-στόχοι. Η πιο συνήθης εφαρμογή της SLST είναι η ανάλυση του γονιδίου της πρωτεΐνης Α του S. aureus (spa-typing). Αν και έχει μικρότερη διακριτική ικανότητα από την PFGE, 39

40 χρησιμοποιείται λόγω του χαμηλού κόστους, της ευκολίας, της ταχύτητας και της επαναληψιμότητάς της. Το κυριότερο μειονέκτημα της μεθόδου αυτής είναι η λανθασμένη κατηγοριοποίηση τύπων που έχουν προκύψει από ανασυνδυασμό του γονιδιώματος των βακτηρίων (Sabat et al., 2013) Άλλες μοριακές μέθοδοι τυποποίησης Μία άλλη τεχνική για την μελέτη των βακτηρίων σε μοριακό επίπεδο είναι η AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Σε αυτήν γίνεται πέψη του βακτηριακού DNA με δύο περιοριστικά ένζυμα και αλληλουχίες διπλής έλικας συνδέονται ειδικά στα άκρα των θραυσμάτων. Ακολουθεί PCR με εκκινητές συμπληρωματικούς των αλληλουχιών σύνδεσης, των αλληλουχιών αναγνώρισης των περιοριστικών ενζύμων και κάποιων επιπλέον νουκλεοτιδίων. Η AFLP έχει παρόμοια διακριτική ικανότητα με την PFGE, όμως είναι χρονοβόρα και με υψηλό κόστος μέθοδος. Η MLVA (Multilocus Variable-number tandem repeats Analysis) ελέγχει τον αριθμό των γειτονικών επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών (variable-number tandem repeats) στο γενετικό υλικό των στελεχών. Δεν χρησιμοποιείται όμως ευρέως σε επιδημιολογικές μελέτες λόγω της ανάγκης σχεδιασμού εκκινητών ειδικών για κάθε είδος. Χρησιμοποιείται επίσης ο υβριδισμός με ειδικούς DNA-ανιχνευτές προσκολλημένους σε μία στερεή επιφάνεια (DNA microarrays), ενώ αναπτύσσεται και το πεδίο της αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος βακτηρίων (Whole Genome Sequencing) που μελλοντικά θα αποτελέσει χρήσιμη τεχνική στη μελέτη επιδημικών εξάρσεων και σε πρωτόκολλα επιτήρησης (Sabat et al., 2013). 40

41 5. ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΑΠΟ CNS Οι πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι αποτελούν μέρος της φυσιολογικής μικροβιακής χλωρίδας του ανθρώπινου δέρματος και των βλεννογόνων. Σπανίως προκαλούν λοιμώξεις και συχνά αποτελούν επιμολύνσεις σε μικροβιακές καλλιέργειες των κλινικών διαγνωστικών εργαστηρίων (Boyce, 2004). Όμως, οι CNS έχουν αναδειχθεί σταδιακά ως σημαντικό αίτιο λοιμώξεων. Εκτός από τον παθογόνο S. aureus, υπάρχουν και άλλοι σταφυλόκοκκοι "μετρίως" παθογόνοι όπως οι S. epidermidis, S. haemolyticus και S. lugdunensis, καθώς και σταφυλόκοκκοι οι οποίοι δεν είναι παθογόνοι αλλά σαπροφυτούν σε ζώα και τροφές φυτικής ή ζωικής προέλευσης. Πίνακας 1. CNS που έχει αναφερθεί ότι προκαλούν λοιμώξεις στον άνθρωπο (John and Harvin, 2007). Είδος Εστίες λοίμωξης S. epidermidis Ευρεία κατανομή, τραύματα, συσκευές πρόσβασης S. haemolyticus Φυσικές βαλβίδες, τραύματα, οστά, αρθρώσεις S. saprophyticus Ουροποιητικό S. hominis Αίμα, πνεύμονες, μαστός S. lugdunensis Ενδοθήλιο, βαλβίδες καρδιάς S. capitis Ουροποιητικό, δέρμα, αίμα, αναστομώσεις ΚΝΣ S. warneri Ευρεία κατανομή, Μονάδες Εντατικής Νοσηλείας Νεογνών S. caprae Ουροποιητικό, αίμα, προσθετικά υλικά S. cohnii Τραύματα, αρθρώσεις, μήνιγγες S. schleiferi Νοσοκομειακές λοιμώξεις, αναστομώσεις ΚΝΣ, βηματοδότες S. pasteurii Ορθοπεδικά εμφυτεύματα S. xylosus Αίμα 41

42 Ο κυριότερος λόγος για τη μεταστροφή των CNS από συμβιωτικούς σε παθογόνους οργανισμούς σχετίζεται με τη χρήση ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων και προσθετικών υλικών στην Ιατρική (Rupp, 1997). Συγκεκριμένα χαρακτηριστικά παθογένειας στα διάφορα υποείδη και παράγοντες που επιτρέπουν τη σύνδεση σε ιστούς του ξενιστή, συνδυαζόμενα με ευνοϊκές συνθήκες όπως η ύπαρξη ξένων υλικών και η καταστολή του ανοσοποιητικού, μπορεί να οδηγήσουν σε σοβαρές λοιμώξεις ακόμα και από φαινομενικά "αθώους" CNS. Τα είδη που σχετίζονται συχνότερα με λοιμώξεις είναι ο S. epidermidis και ο S. haemolyticus και ακολουθούν ο S. saprophyticus και ο S. lugdunensis (Boyce, 2004). Τα άλλα είδη της ομάδας των CNS προκαλούν μόνο σποραδικές λοιμώξεις. Η πρόκληση μετά την απομόνωση CNS σε ένα κλινικό δείγμα είναι η απόφαση για το αν πρόκειται για πραγματική λοίμωξη, επιμόλυνση κατά τη λήψη και μεταφορά του δείγματος ή αν αφορά βακτήρια της φυσιολογικής μικροβιακής χλωρίδας που αποικίζουν τον ασθενή ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΑΠΟ S. epidermidis Λοιμώξεις ενδαγγειακών καθετήρων. Ο S. epidermidis είναι ο συχνότερος από τους CNS που μπορεί να προσβάλλει κεντρικές και περιφερικές ενδοφλέβιες γραμμές, καθετήρες τεχνητής διατροφής, υποκλείδιους καθετήρες αιμοκάθαρσης, αλλά και καθετήρες Hickman, Broviac και Swan-Ganz (Raad and Bodey, 1992). Συχνή επιπλοκή είναι η βακτηριαιμία, η οποία με τη σειρά της μπορεί να προκαλέσει εστίες λοίμωξης σε απομακρυσμένες περιοχές του σώματος. Οι καθετήρες και τα σημεία εισόδου τους συχνά δεν εμφανίζουν σημεία φλεγμονής (όπως πύον ή ερύθημα) και η βακτηριαιμία μπορεί να έχει ήπια συμπτωματολογία. Η διάγνωση γίνεται με καλλιέργειες περιφερικού αίματος, αίματος από τον καθετήρα και ημιποσοτική καλλιέργεια του άκρου του καθετήρα. Πρέπει να γίνουν τουλάχιστον δύο διαφορετικές καλλιέργειες σε διαφορετικούς χρόνους. Αν ο ασθενής έχει καθετήρα κεντρικής αρτηρίας, η μία καλλιέργεια πρέπει να προέρχεται από τον καθετήρα. Επίσης, απαραίτητο είναι το πρότυπο ζωνώσεων μετά από ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο και/ή το αντιβιόγραμμα των βακτηριακών στελεχών που θα απομονωθούν να έχουν το ίδιο αποτέλεσμα (Garcia et 42

43 al., 2004). Αν και η προσεκτική χρήση των καθετήρων μπορεί να μειώσει την εμφάνιση βακτηριαιμίας μετά από λοίμωξη καθετήρα, νέες μέθοδοι όπως η εμπότιση καθετήρων με αντιβιοτικά τύπου μινοκυκλίνης ή ριφαμπικίνης μπορούν να μειώσουν σημαντικά την επίπτωση των λοιμώξεων αυτών. Συχνά, η αντιμετώπιση τους απαιτεί, εκτός από την συστηματική αντιβιοτική αγωγή, αφαίρεση του καθετήρα Λοιμώξεις εγκεφαλονωτιαίας παροχέτευσης. Ο S. epidermidis είναι ο πηκτάση-αρνητικός σταφυλόκοκκος που σχετίζεται συχνότερα με λοιμώξεις του κεντρικού νευρικού συστήματος (Mayhall et al., 1984). Οι λοιμώξεις αυτές συμβαίνουν συνήθως λίγες εβδομάδες μετά την τοποθέτηση της παροχέτευσης. Ο κίνδυνος της μόλυνσης αυξάνεται από την παρουσία ανατομικών ανωμαλιών κατά τη διάρκεια της διάνοιξης του κρανίου και την τοποθέτηση της παροχέτευσης, την ηλικία του ασθενούς, προηγούμενη μόλυνση κατά την ίδια εγχείρηση και τη διάρκεια του χειρουργείου (Boyce, 2004). Οι ασθενείς μπορεί να είναι ασυμπτωματικοί ή να παρουσιάζονται με εικόνα μηνιγγίτιδας. Εξέταση του εγκεφαλονωτιαίου υγρού δείχνει ήπια λευκοκυττάρωση και μικρή μείωση των επιπέδων του σακχάρου. Η θεραπεία συχνά απαιτεί αφαίρεση της παροχέτευσης, αν και μερικές φορές η λοίμωξη αντιμετωπίζεται με συστηματική αντιβιοτική αγωγή. Συνήθως χορηγείται βανκομυκίνη, ριφαμπικίνη και μία αμινογλυκοσίδη ενδοκοιλιακά, καθώς οι σταφυλόκοκκοι που προκαλούν τέτοιου τύπου λοιμώξεις προέρχονται από το περιβάλλον του νοσοκομείου και είναι ανθεκτικοί στα αντιβιοτικά (Gombert et al., 1981) Λοιμώξεις καθετήρων περιτοναϊκής διάλυσης. Ο S. epidermidis είναι το συχνότερο αίτιο περιτονίτιδας σε ασθενείς που υποβάλλονται σε περιτοναϊκή διάλυση (Sieradzki et al., 1999). Εμφανίζεται κλινικά με κοιλιακό πόνο, ναυτία, έμετους, πυρετό και θολερότητα των υγρών αποβλήτων της αιμοδιάλυσης, αν και κάποιοι ασθενείς έχουν πιο ήπια συμπτωματολογία. Το περιτοναϊκό υγρό είναι θολερό με >100 λευκά/ml. Η Gram χρώση του ιζήματος μετά από φυγοκέντρηση του περιτοναϊκού υγρού μπορεί να βοηθήσει στη διάγνωση 43

44 (Dawson et al., 1985). Η θεραπεία μπορεί να χορηγηθεί παρεντερικά ή και ενδοπεριτοναϊκά Μολύνσεις χειρουργικών θέσεων Οι μολύνσεις χειρουργικών θέσεων που οφείλονται σε CNS έρχονται δεύτερες κατά σειρά συχνότητας σε σχέση με αυτές που οφείλονται στον S. aureus (Boyce, 2004). Οι CNS απομονώνονται συχνότερα από επιφανειακές χειρουργικές τομές παρά από βαθύτερες και προκαλούν συχνότερα μολύνσεις σε στείρες μικροβίων περιοχές παρά σε αυτές όπου φυσιολογικά υπάρχει πληθώρα μικροοργανισμών, όπως το γαστρεντερικό και το ουρογεννητικό σύστημα. Οι μολύνσεις στις επιφανειακές χειρουργικές τομές εμφανίζονται μέσα σε μία έως δέκα ημέρες μετά το χειρουργείο και απομονώνονται στελέχη από την μικροβιακή χλωρίδα του ασθενούς ή λιγότερο συχνά από το προσωπικό που συμμετείχε στην εγχείρηση ή το περιβάλλον στο οποίο έγινε η επέμβαση. Περιστασιακά, η μόλυνση του οργάνου ή του ιστού είναι αποτέλεσμα της επιμόλυνσης τη στιγμή του χειρουργείου. Παράγοντες κινδύνου είναι η διάρκεια του χειρουργείου, η ηλικία και η διατροφή του ασθενούς, η εμπειρία του προσωπικού που συμμετέχει στο χειρουργείο και το νοσοκομείο που γίνεται η επέμβαση. H διάγνωση γίνεται με καλλιέργεια υλικού από την τομή και απομόνωση των CNS είτε με καθαρή καλλιέργεια ενός στελέχους, είτε αν πρόκειται για το κυρίαρχο στέλεχος, επαναλαμβανόμενη απομόνωση του ίδιου στελέχους από μικτές καλλιέργειες της περιοχής (Horan et al., 1992). Η θεραπεία περιλαμβάνει αντιβιοτικά, χειρουργικό καθαρισμό της περιοχής και παροχέτευση του τραύματος Λοιμώξεις αγγειακών μοσχευμάτων. Τα περιστατικά λοιμώξεων από εμφύτευση αγγείων κυμαίνονται από 1 έως 6% και εξαρτώνται από την περιοχή της εμφύτευσης. Οι μεταμοσχεύσεις της βουβωνικής χώρας έχουν τα υψηλότερα ποσοστά μόλυνσης. Ο S. epidermidis είναι το είδος που απομονώνεται συχνότερα μεταξύ των CNS και συνήθως προσβάλλει το μόσχευμα κατά την τοποθέτηση του, ενώ τα συμπτώματα εμφανίζονται μήνες ή και χρόνια αργότερα (Koneman, 2006). Τα στελέχη που απομονώνονται είναι συνήθως 44

45 πολυανθεκτικά, δεδομένου ότι έχουν προσβάλλει το ίδιο το μόσχευμα. Η διάγνωση γίνεται με ψηλάφιση της περιοχής και ακτινογραφικό έλεγχο για την ανίχνευση ψευδοανευρύσματος στην περιοχή αναστόμωσης του αγγείου (O'Brien et al., 1992) Βακτηριαιμία. Σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς, κυρίως ο S. epidermidis μπορεί να προκαλέσει βακτηριαιμία, συνήθως μετά από λοίμωξη κάποιου ενδαγγειακού προσθετικού υλικού (Fidalgo et al., 1990). Οι ασθενείς συνήθως φέρουν καθετήρες για τη χορήγηση χημειοθεραπείας για την αντιμετώπιση κακοηθειών. Ο S. haemolyticus είναι το δεύτερο σε συχνότητα αίτιο Παιδιατρικές λοιμώξεις. Οι περισσότερες από τις λοιμώξεις του τύπου αυτού είναι βακτηριαιμίες σε βρέφη νοσηλευόμενα στην Μονάδα Εντατικής Νοσηλείας Νεογνών. Προδιαθεσικοί παράγοντες είναι η προωρότητα, η παρουσία περιφερικών καθετήρων ή κεντρικών γραμμών, η υποβοήθηση του αναπνευστικού και η χορήγηση παρεντερικής διατροφής (Freeman et al., 1990). Αν και ο S. epidermidis είναι το συχνότερο αίτιο, και άλλοι CNS όπως ο S. haemolyticus εμπλέκονται συχνά σε τέτοιες λοιμώξεις Οφθαλμικές λοιμώξεις. Η μετεγχειρητική ενδοφθαλμίτιδα προκαλείται κυρίως από S. epidermidis. Οι επεμβάσεις που σχετίζονται με τις λοιμώξεις αυτές είναι η εμφύτευση τεχνητών φακών και η διόρθωση καταρράκτη (Weber et al., 1986). Η διάγνωση γίνεται με αναρρόφηση και καλλιέργεια υαλοειδούς υγρού. Η θεραπεία απαιτεί παρεντερική και ενδοφθαλμική χορήγηση αντιβιοτικών. Άλλες οφθαλμικές λοιμώξεις είναι η βλεφαρίτιδα, η πυώδης επιπεφυκίτιδα και η πυώδης κερατίτιδα από S. epidermidis, S. warneri, S. capitis, S. hominis, S. simulans, S. lugdunensis και S. xylosus (Pinna et al., 1999). 45

46 Λοιμώξεις δέρματος. Οι πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι μπορεί να προκαλέσουν μόνοι, ή σε συνδυασμό με άλλα βακτήρια όπως ο S. aureus και οι β-αιμολυτικοί στρεπτόκοκκοι, κύστεις, δοθιήνες και αποστήματα. Τα συνηθέστερα αίτια ανάμεσα στους CNS είναι ο S. epidermidis, ο S. haemolyticus, ο S. lugdunensis και ο S. hominis (Akiyama et al., 1998). Μία άλλη ασυνήθης λοίμωξη από S. epidermidis είναι η κακοήθης εξωτερική ωτίτιδα (Soldati et al., 1999) Λοιμώξεις ουροποιητικού. Ο S. epidermidis προκαλεί σπάνια λοιμώξεις ουροποιητικού. Οι λοιμώξεις από CNS σχετίζονται συνήθως με τη χρήση καθετήρων και αφορούν ηλικιωμένους ασθενείς μετά από χειρουργείο, ουρολιθίαση, μεταμόσχευση νεφρών ή άλλες παθήσεις του ουροποιητικού. Πυουρία και νόσος ανώτερου ουροποιητικού απαντάται σε περίπου 10% των ασθενών αυτών (Koneman, 2006). Οι μικροοργανισμοί που απομονώνονται από αυτούς τους ασθενείς συνήθως είναι ενδονοσοκομειακά πολυανθεκτικά παθογόνα στελέχη. Ο πηκτάση-αρνητικός S. saprophyticus είναι ένα ιδιαίτερο μέλος της ομάδας των CNS, καθώς είναι ένα αναγνωρισμένο παθογόνο που προκαλεί κυρίως οξείες ουρολοιμώξεις σε νεαρές, υγιείς, σεξουαλικά ενεργείς γυναίκες (Schneider and Riley, 1996) και αποτελεί το δεύτερο σε συχνότητα αίτιο κυστίτιδας μετά την E. coli (Gupta et al., 1999) Οστεομυελίτιδα. Η λοίμωξη αυτή μπορεί να συμβεί ως επιπλοκή μετά από καρδιοθωρακική επέμβαση ή εμφύτευση προσθετικού υλικού, όπως σε αρθροπλαστική ισχίου ή γόνατος. Η καρδιοθωρακική επέμβαση μπορεί να επιπλακεί με τραύμα και λοίμωξη στερνοειδούς που απαιτεί χειρουργικό καθαρισμό (Grossi et al., 1985). Η διάγνωση της λοίμωξης γίνεται με καλλιέργεια υλικού αναρρόφησης από την φλεγμαίνουσα περιοχή, βιοψία οστού ή αφαίρεση και καλλιέργεια του εμφυτεύματος. Η αιματογενής οστεομυελίτιδα είναι αποτέλεσμα βακτηριαιμίας μετά από λοίμωξη που σχετίζεται με την εφαρμογή προσθετικών υλικών. 46

47 Ενδοκαρδίτιδα φυσικών βαλβίδων. Οι πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι σπανίως προκαλούν ενδοκαρδίτιδα φυσικών βαλβίδων και ενδοκαρδίτιδα σε ασθενείς που φέρουν βηματοδότη, αποτελώντας το 5% του συνόλου αυτών των λοιμώξεων (Caputo et al., 1987). Οι περισσότεροι ασθενείς εμφανίζουν επιπλοκές όπως συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια ή εμβολή. Περίπου οι μισές περιπτώσεις αφορούν άλλους CNS πλην του S. epidermidis Ενδοκαρδίτιδα προσθετικών βαλβίδων. Σε αντίθεση με την ενδοκαρδίτιδα φυσικών βαλβίδων, οι CNS αποτελούν τον πιο κοινό αιτιολογικό παράγοντα ενδοκαρδίτιδας προσθετικών βαλβίδων, με τον S. epidermidis να είναι το μοναδικό σχεδόν αίτιο (Karchmer et al., 1983). Τα βακτήρια προσβάλλουν την περιοχή των ραμμάτων που κρατούν τη βαλβίδα στη θέση της, προκαλώντας την δημιουργία μικροαποστημάτων όπου τα μικρόβια είναι σχετικά προστατευμένα από τη δράση των αντιβιοτικών. Ο ασθενής εμφανίζεται με πυρετό και ενδείξεις δυσλειτουργίας των βαλβίδων. Οι επιπλοκές περιλαμβάνουν ρήξη της βαλβίδας, σχηματισμό εκβλαστήσεων και αρρυθμίες. Οι λοιμώξεις αυτές συνήθως οφείλονται σε ενοφθαλμισμό μικρού αριθμού βακτηρίων κατά την τοποθέτηση της βαλβίδας και τα συμπτώματα της ενδοκαρδίτιδας εμφανίζονται σταδιακά σε διάστημα μηνών. Εκτός από τις προσθετικές βαλβίδες, οι σταφυλόκοκκοι μπορούν επίσης να προσβάλλουν καλώδια βηματοδότη και αγγειακά μοσχεύματα ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΑΠΟ S. haemolyticus Εκτός από το είδος S. epidermidis υπάρχουν και αρκετά άλλα είδη της οικογένειας των πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων που μπορούν να προκαλέσουν σοβαρές λοιμώξεις. Ο S. haemolyticus είναι ο δεύτερος κατά σειρά συχνότητας CNS μετά τον S. epidermidis που απομονώνεται από καλλιέργειες αίματος, κυρίως από βρέφη νοσηλευόμενα στη Μονάδα Εντατικής Νοσηλείας Νεογνών (von Eiff et al., 2005). Έχουν αναφερθεί διάφορα περιστατικά λοιμώξεων από S. haemolyticus, 47

48 περιλαμβανομένων περιπτώσεων βακτηριαιμίας, περιτονίτιδας, λοιμώξεων τραυμάτων, οστών και αρθρώσεων και ουρολοιμώξεων, ενώ σπανιότερη είναι η εμφάνιση λοιμώδους ενδοκαρδίτιδας που μπορεί να οδηγήσει σε καρδιακή ανεπάρκεια και θάνατο. Το είδος S. haemolyticus συνθέτει λιπάση, πρωτεάση και λυάση και συχνά περιλαμβάνει πολυανθεκτικά στελέχη (Takeuchi et al., 2005). Ο συνδυασμός παθογόνων παραγόντων και ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά θεωρείται ότι είναι το αποτέλεσμα εισδοχής πολλών αλληλουχιών στο γονιδίωμά του και της ανασυγκρότησης των γονιδίων καθώς το βακτήριο προσαρμόζεται στις εκάστοτε περιβαλλοντικές συνθήκες (Takeuchi et al., 2005). Ο μικροοργανισμός ήταν ο πρώτος μεταξύ των CNS που παρουσίασε μειωμένη ευαισθησία στα γλυκοπεπτίδια τεϊκοπλανίνη και βανκομυκίνη. Η μειωμένη ευαισθησία οφείλεται κυρίως σε αλλαγές της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώματος παρά σε οριζόντια μεταφορά γονιδίων (Nunes et al., 2006) ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΑΠΟ S. lugdunensis Βακτηριαιμία. Σε μία παγκόσμια μελέτη διάρκειας ενός έτους, ο S. lugdunensis ήταν ο έβδομος σε σειρά πηκτάση-αρνητικός σταφυλόκοκκος που απομονώθηκε, προκαλώντας ποσοστό 0.3% των βακτηριαιμιών από CNS (Pfaller et al., 1999). Δωδεκαετής μελέτη σε νοσοκομεία των Ηνωμένων Πολιτειών αποκάλυψε ότι μόνο έξι ασθενείς είχαν κλινικά σημαντική βακτηριαιμία από S. lugdunensis κατά το διάστημα αυτό. Όλοι οι ασθενείς είχαν κάποιο υποκείμενο νόσημα και το κύριο σύμπτωμα ήταν ο πυρετός (Ebright et al., 2004) Λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων. Οι λοιμώξεις αυτές αποτελούν σημαντικό μέρος των νόσων από S. lugdunensis. Περιλαμβάνουν τραύματα, αποστήματα και περιστατικά κυτταρίτιδας. Είναι πιθανότερο σε σχέση με άλλους CNS να προξενεί σοβαρή λοίμωξη καθώς ο σταφυλόκοκκος αυτός προκαλεί συχνότερα πυώδη εξανθήματα, δοθιήνες και φλεγμονή σμηγματογόνων κύστεων. Τα περισσότερα περιστατικά λοιμώξεων από S. 48

49 lugdunensis απαντώνται στην περινεϊκή, βουβωνική περιοχή ή στην πυελική χώρα (Hellbacher et al., 2006) Ενδοκαρδίτιδα φυσικών βαλβίδων. Η ενδοκαρδίτιδα που οφείλεται στο βακτήριο αυτό είναι επιθετική και συχνά σχετίζεται με καταστροφή βαλβίδων και σχηματισμό αποστήματος που οδηγεί σε θάνατο με συχνότητα 50% έως 70% (Frank et al., 2008). O πρωταρχικός παράγοντας που ευθύνεται για την εμφάνιση ενδοκαρδίτιδας από S. lugdunensis ίσως είναι η παραγωγή μίας πρωτεΐνης προσκόλλησης του παράγοντα von Willebrand, που επιτρέπει στο βακτήριο να προσδένεται σε μικροσκοπικές βλάβες του ενδοθηλίου (Nilsson et al., 2004) Οφθαλμικές λοιμώξεις. Ο S. lugdunensis είναι σπάνιο αλλά σημαντικό αίτιο οφθαλμικών λοιμώξεων. Σε μία μελέτη ασθενών με μετεγχειρητική ενδοφθαλμίτιδα, ο δεύτερος σε συχνότητα CNS, μετά τον S. epidermidis, ήταν ο S. lugdunensis, αποτελώντας το 6% των CNS που απομονώθηκαν από τα βλέφαρα, το υγρό του πρόσθιου θαλάμου και του υαλώδους σώματος. Όλα τα ζεύγη ενδοφθαλμικών στελεχών και στελεχών από τα βλέφαρα της μελέτης είχαν ταυτόσημα αποτυπώματα στην PFGE, υποδεικνύοντας ότι η χλωρίδα του δέρματος του ασθενούς ήταν η πηγή της λοίμωξης (Bannerman et al., 1997) Περιτονίτιδα. Έχουν αναφερθεί περιπτώσεις περιτονίτιδας από S. lugdunensis σε ασθενείς που υποβάλλονται σε περιτοναϊκή διάλυση ή μετά από καισαρική τομή (Fleurette et al., 1989). Η λοίμωξη αυτή μοιάζει κλινικά με αυτήν που προκαλείται από τον S. aureus, καθώς κοινή επιπλοκή είναι η εμφάνιση αποστήματων στην περιοχή του καθετήρα. 49

50 Ουρολοιμώξεις. Οι λοιμώξεις αυτές παρατηρούνται σπανίως σε παιδιά ή ενήλικες. Σε μία εργασία από τον Haile και τους συνεργάτες του καλλιεργήθηκαν 4652 δείγματα ούρων από ασθενείς σε μία περίοδο τριών μηνών και από τους 500 CNS που απομονώθηκαν, οι 31 (6%) ταυτοποιήθηκαν ως S. lugdunensis, χωρίς όμως να είναι γνωστό εάν επρόκειτο για νόσο ή επιμόλυνση (Haile et al., 2002) Λοιμώξεις στόματος. Ο S. lugdunensis, όπως ο συγγενικός S. aureus, έχει απομονωθεί από ασθενείς με οξεία στοματίτιδα και αποστήματα (Frank et al., 2008) Λοιμώξεις κεντρικού νευρικού συστήματος. Ο S. lugdunensis μπορεί να προκαλέσει μηνιγγίτιδα και αποστήματα εγκεφάλου μετά από οδοντική λοίμωξη ή εμβολή στα πλαίσια ενδοκαρδίτιδας. Έχουν αναφερθεί περιστατικά λοίμωξης κοιλιο-περιτοναϊκής αναστόμωσης που μοιάζουν κλινικά με παρόμοιες λοιμώξεις από S. aureus (Sandoe and Longshaw, 2001) Λοιμώξεις οστών και αρθρώσεων. Σε μία τετραετή μελέτη της επίπτωσης των CNS σε ασθενείς με λοιμώξεις αρθρώσεων μετά από ορθοπεδικό χειρουργείο, ο S. lugdunensis ταυτοποιήθηκε σε 3% από τους 212 CNS που απομονώθηκαν από 104 ασθενείς (Sivadon et al., 2005). Μπορεί να προκαλέσει οστεομυελίτιδα σπονδυλικής στήλης και λοιμώξεις μεσοσπονδύλιων χώρων και προσθετικών αρθρώσεων, κυρίως μετά από αρθροπλαστικές ισχίου ή γόνατος. 50

51 6. ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ Τα αντιβιοτικά και οι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες αποτελούν χημικές ουσίες, που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία λοιμωδών νοσημάτων. Παρασκευάζονται χημικά ή παραλαμβάνονται από τη φύση, όπου κυρίως συντίθενται από μικροοργανισμούς. Γενικά, οι φυσικές παραλαμβανόμενες ουσίες χαρακτηρίζονται ως αντιβιοτικά, σε αντίθεση με τις συνθετικές ουσίες, για τις οποίες χρησιμοποιείται ο όρος χημειοθεραπευτικά. Η λέξη «αντιβιοτικό» υποδηλώνει μεταβολικό προϊόν ενός οργανισμού το οποίο είναι καταστρεπτικό ή ανασταλτικό για την ανάπτυξη άλλων οργανισμών σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις. Οι μικροοργανισμοί που παράγουν το μεγαλύτερο αριθμό χρήσιμων αντιβιοτικών ανήκουν στα γένη Bacillus, Penicillium και Streptomyces (Hoel and Williams, 1997). Συνολικά οι φυσικοί αντιβιοτικοί παράγοντες και τα χημειοθεραπευτικά αποτελούν την ομάδα των αντιμικροβιακών ουσιών. Η θεραπεία διάφορων νοσημάτων με αντιμικροβιακά ήταν γνωστή από τις αρχές του 16 ου αιώνα, αλλά η ευρεία χρήση τους ξεκίνησε μόλις το Η ανθεκτικότητα των CNS άρχισε να συζητείται στη δεκαετία του 1970, όταν απομονώθηκαν παθογόνα στελέχη από λοιμώξεις σχετιζόμενες με προσθετικές βαλβίδες, ενδοκαρδίτιδες και κοιλιοπεριτοναϊκές αναστομώσεις (Schoenbaum et al., 1975). Υπήρχαν ενδείξεις ότι νέα γονίδια ανθεκτικότητας έκαναν την εμφάνισή τους, κυρίως αυτά που ανέστελλαν την πρόσδεση στις ημισυνθετικές πενικιλλίνες, παράγοντες που είχαν δημιουργηθεί για να αντιμετωπ'ισουν τις εξωκυττάριες β-λακταμάσες των σταφυλοκόκκων. Η methicillin ήταν η κύρια ημισυνθετική πενικιλλίνη που χρησιμοποιήθηκε αρχικά, και για το λόγο αυτό ο όρος «μεθικιλλίνη-ανθεκτικά» (methicillin-resistant, MR) έγινε ο γενικός όρος για την ανθεκτικότητα στα β- λακταμικά αντιβιοτικά. Κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 1970, έγινε φανερό ότι η ανθεκτικότητα στη methicillin ήταν επικρατέστερη στους CNS (MR-CNS), παρά στον S. aureus (MRSA), κάτι που ισχύει μέχρι και σήμερα. Το πρόβλημα με τη διασπορά των πολυανθεκτικών CNS κατά τη διάρκεια της δεκαετίας 70 και στις αρχές της δεκαετίας του 80, αναφέρθηκε αρχικά σε περιπτώσεις λοιμώξεων που σχετίζονταν με τη χρήση προσθετικών υλικών. Σε μία συλλογή S. epidermidis από λοιμώξεις προσθετικών υλικών, 56% ήταν ανθεκτικοί στη methicillin και 70% στην cefoxitin και cepharide (Archer, 1978). Η ανθεκτικότητα των CNS τα τελευταία χρόνια συνεχίζει να παρουσιάζει μία κλιμάκωση στη συχνότητα και έκφραση των 51

52 λοιμογόνων παραγόντων. Η ανθεκτικότητα στα β-λακταμικά αντιβιοτικά (MR-CNS) αποτελεί τον κύριο παράγοντα έκφρασης αυτής της τάσης. Στελέχη MR-CNS συχνά συνδέονται με πολυανθεκτικότητα και αποτελούν συνεχή θεραπευτική πρόκληση. Ο Cuevas και οι συνεργάτες του το 2004, σε μελέτη κλινικών στελεχών από νοσοκομεία της Ισπανίας από το 1986 έως το 2002, ανέφεραν ότι 28% των στελεχών προέρχονταν από την κοινότητα, ενώ το 72% από το περιβάλλον του νοσοκομείου. Παρατηρήθηκε σταδιακή αύξηση της ανθεκτικότητας στην oxacillin από 32.5% το 1986 σε 61.3% το 2002, ενώ η ανθεκτικότητα στη gentamicin παρουσίασε ένα μέγιστο το 1994 (41.4%) αλλά μειώθηκε στο 27.85% το Αντίθετα, η ανθεκτικότητα στην ciprofloxacin από 1.1% το 1986 αυξήθηκε σε 44.9% το 'Oλα τα στελέχη της μελέτης ήταν ευαίσθητα στην vancomycin. Τα νοσοκομειακά στελέχη είχαν γενικά υψηλότερα ποσοστά ανθεκτικότητας από τα στελέχη της κοινότητας (Cuevas et al., 2004). Πολλές μελέτες συνδυάζουν αυτοματοποιημένες μεθόδους τυποποίησης των CNS με τον έλεγχο ανθεκτικότητας στα αντιμικροβιακά. Για παράδειγμα, στην Ιταλία μελετήθηκε η αντοχή στα 5 συνηθέστερα, μετά τον S. epidermidis, είδη CNS: S. hominis, S. haemolyticus, S. capitis, S. warneri και S. cohnii. H ανθεκτικότητα στην penicillin ήταν παρόμοια (51%-66%) για όλα τα στελέχη της μελέτης, κάτι που δεν ίσχυε για τα υπόλοιπα αντιβιοτικά. Η αντοχή των στελεχών S. haemolyticus στην oxacillin, imipenem, erythromycin και στις αμινογλυκοσίδες ήταν υψηλότερη από ότι στους υπόλοιπους CNS, ενώ τα στελέχη S. warneri έδειξαν τα μεγαλύτερα ποσοστά ευαισθησίας (Arciola et al., 2006). Από τη συγκεκριμένη μελέτη γίνεται φανερό ότι ο συνδυασμός της ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά και ο καθορισμός του είδους είναι χρήσιμος στη διερεύνηση λοιμώξεων που σχετίζονται με προσθετικά υλικά β-λακταμικά αντιβιοτικά Τα β-λακταμικά αντιβιοτικά αποτελούν μία μεγάλη κατηγορία αντιβιοτικών που αναστέλλουν τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων. Περιλαμβάνουν τις πενικιλλίνες (όπως η αμοξικιλλίνη, η μεθικιλλίνη και η αμπικιλλίνη), τις κεφαλοσπορίνες (όπου ανήκουν η κεφουροξίμη, κεφακλόρη, κεφταζιδίμη, κεφεπίμη), τις μονοβακτάμες (με κύριο εκπρόσωπο την αζτρεονάμη), τις 52

53 πενέμες και καρβαπενέμες (όπως η ιμιπενέμη και η μεροπενέμη). Οι σταφυλόκοκκοι φέρουν στην κυτταρική τους μεμβράνη πρωτεΐνες που έχουν την ιδιότητα να δεσμεύουν τις πενικιλλίνες και ονομάζονται πενικιλλινοδεσμευτικές πρωτεΐνες (penicillin-binding proteins, PBPs). Οι πρωτεΐνες αυτές έχουν δράση καρβοξυπεπτιδάσης και τρανσπεπτιδάσης, καταλύοντας τη διάσπαση του διπεπτιδίου D-αλανίνη-D-αλανίνη (D-ala-D-ala), που αποτελεί το τελικό άκρο του πενταπεπτιδίου που συνδέεται με την πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος και τη σύνδεση με το γειτονικό πενταπεπτίδιο. Η δράση τους συμβάλλει στη σταθεροποίηση του κυτταρικού τοιχώματος και είναι απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό του βακτηρίου. Οι β-λακτάμες είναι δομικά ανάλογα του διπεπτιδίου D-ala-D-ala, με αποτέλεσμα να δεσμεύονται από τις PBPs. Αρχικά σχηματίζεται ένα ασταθές σύμπλοκο β-λακτάμης- PBP και ακολούθως προσβάλλεται ο β-λακταμικός δακτύλιος από τη σερίνη του ενεργού κέντρου της PBP, με αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση του συμπλόκου και την αδρανοποίηση των PBPs. Αυτό οδηγεί σε αναστολή σύνθεσης της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώματος, ενεργοποίηση των αυτολυσινών του μικροβιακού κυττάρου, λύση του κυτταρικού τοιχώματος και θάνατο του βακτηρίου (Chambers, 1999). Η αντοχή των σταφυλοκόκκων στα β-λακταμικά αντιβιοτικά οφείλεται σε παραγωγή πενικιλλινάσης (β-λακταμάση) που υδρολύει το αντιβιοτικό, νέας πενικιλλινο-δεσμευτικής πρωτεΐνης (όπως η PBP2α) ή σε τροποποίηση των φυσιολογικών PBPs που αποτελούν τον στόχο του αντιβιοτικού. Η έναρξη χρήσης της μεθικιλλίνης και άλλων ημισυνθετικών πενικιλλινών όπως η οξακιλλίνη το 1959 αποτέλεσε ένα σημαντικό βήμα στην αντιμετώπιση των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων. Η πρώτη αναφορά αντοχής στη μεθικιλλίνη έγινε δύο μόλις χρόνια αργότερα, το Το 1962 αναφέρθηκε για πρώτη φορά αντοχή στη μεθικιλλίνη στο Ηνωμένο Βασίλειο και ακολούθησαν άλλες Ευρωπαϊκές και μη χώρες. Σήμερα η αντοχή των σταφυλοκόκκων στη μεθικιλλίνη αποτελεί παγκόσμιο πρόβλημα. Σε μελέτη από 143 νοσοκομεία στην Ισπανία από τον Cuevas και τους συνεργάτες του, εκτιμήθηκε η αντοχή διαφόρων ειδών σταφυλοκόκκων σε διάφορα αντιμικροβιακά. Παρατηρήθηκε αντοχή στην οξακιλλίνη (31.7% για τον S. aureus και 67% για τους CNS), στην ερυθρομυκίνη (31.7% και 63%) και στη γενταμυκίνη (16.9% και 27.8% αντίστοιχα). Από τα είδη που ταυτοποιήθηκαν, ο S. aureus αποτελούσε το 54.3% ενώ οι CNS το 45.7%, με τον S. epidermidis ως το πιο συχνό είδος μεταξύ των CNS 53

54 (56%) (Cuevas et al., 2008). Αρκετοί ανθεκτικοί στη μεθικιλλίνη σταφυλόκοκκοι έχουν απομονωθεί από ενδοφλέβιους καθετήρες. Ο Bouza και οι συνεργάτες του, μελετώντας τα χαρακτηριστικά μικροοργανισμών που απομονώθηκαν από καθετήρες από 151 νοσοκομεία σε διάφορες περιοχές της Ευρώπης διαπίστωσε ότι 63.4% των CNS ήταν ανθεκτικοί στην οξακιλλίνη (Bouza et al., 2004). Η αντοχή στη μεθικιλλίνη οφείλεται κυρίως στην παραγωγή της PBP2α και σπανιότερα στην τροποποίηση των φυσιολογικών PBPs, με αποτέλεσμα μειωμένη συγγένεια προς την πενικιλλίνη (Chambers, 1999). Η PBP2α είναι μία πρωτεΐνη 78 kda που δεν δημιουργεί σταθερό σύμπλοκο με τις β-λακτάμες, με αποτέλεσμα να παραμένει λειτουργική για τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος παρουσία των αντιβιοτικών, τα οποία αδρανοποιούν τις φυσιολογικές PBPs. Κωδικοποιείται από το γονίδιο meca, το οποίο ελέγχεται από δύο άλλα γονίδια, το meci και το mecr1. Η πρωτεΐνη MecI καταστέλλει την μεταγραφή των meca και mecr1, ενώ η MecR1 είναι μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη-ανιχνευτής των β-λακταμών (Chambers, 1997). Το σύμπλεγμα mec εδρεύει σε ένα μεταθετό γενετικό στοιχείο, την σταφυλοκοκκική χρωμοσωμική κασέτα SCCmec, που αποτελείται από δύο μέρη: το mec, που είναι υπεύθυνο για την αντοχή στη μεθικιλλίνη και το σύμπλεγμα ccr, το οποίο είναι υπεύθυνο για την αποκοπή και την ενσωμάτωση της κασέτας στο βακτηριακό γονιδίωμα. Έντεκα διαφορετικοί τύποι SCCmec έχουν χαρακτηριστεί έως σήμερα. Στους CNS, οι τύποι SCCmec III, IV και V είναι οι επικρατέστεροι. Ιδιαίτερα στους MR-CNS υπάρχει μεγάλη ποικιλομορφία στην κασέτα SCCmec και θεωρείται δεδομένη η μελλοντική αύξηση του αριθμού των τύπων SCCmec (Becker et al., 2014) Γλυκοπεπτίδια Τα γλυκοπεπτίδια (όπως η βανκομυκίνη και η τεϊκοπλανίνη) συνδέονται στο τελικό D-ala-D-ala της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώματος και αναστέλλουν τον πολυμερισμό της. Η μειωμένη ευαισθησία στη βανκομυκίνη οφείλεται σε πάχυνση και μείωση του πολυμερισμού της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώματος, με αποτέλεσμα την αύξηση των διμερών D-ala-D-ala και την κατάληψη της εξωτερικής επιφάνειας από τα συμπλέγματα D-ala-D-ala και 54

55 γλυκοπεπτιδίων με αποτέλεσμα την παρεμπόδιση των υπόλοιπων μορίων του αντιβιοτικού να προσεγγίσουν τον στόχο τους. Η μείωση της ευαισθησίας των σταφυλοκόκκων στη βανκομυκίνη είναι δυνατόν φαινοτυπικά να εκδηλώνεται ως ενδιάμεση αντοχή ή ετεροαντοχή (Appelbaum, 2006). Κλινικά στελέχη S. aureus με πλήρη αντοχή στη βανκομυκίνη έχουν αναφερθεί και φέρουν το γονίδιο vana, το οποίο ευθύνεται για την αντοχή των εντεροκόκκων στα γλυκοπεπτίδια λόγω μεταφοράς τρανσποζονίου που φέρει το γονίδιο από το ένα είδος στο άλλο. Η αντοχή λόγω του vana οφείλεται στην αντικατάσταση του διπεπτιδίου D-ala-D-ala από D-ala-D-lactate με αποτέλεσμα τα γλυκοπεπτίδια να μην μπορούν να συνδεθούν στο στόχο τους. Οι CNS ήταν οι πρώτοι οργανισμοί στους οποίους αναγνωρίστηκε η εμφάνιση επίκτητης αντοχής στα γλυκοπεπτίδια. Τα πρώτα ανθεκτικά κλινικά στελέχη εμφανίστηκαν το 1979, 20 χρόνια και περισσότερο μετά από την πρώτη χρήση της βανκομυκίνης. Η ανθεκτικότητα στην τεϊκοπλανίνη είναι συχνότερη από αυτή στην βανκομυκίνη και απαντάται κυρίως στα είδη S. epidermidis και S. haemolyticus Λιποπεπτίδια (Daptomycin) Η daptomycin αποτελεί παλαιότερο κυκλικό λιποπεπτίδιο το οποίο, μετά από δεκαετίες, επανήλθε πρόσφατα στην κλινική πράξη. Αρχικά εφαρμόστηκε το 2003 για τη θεραπεία λοιμώξεων δέρματος και μαλακών μορίων και αποδείχθηκε ότι η δράση της δεν υστερεί έναντι της vancomycin σε σταφυλοκοκκικές βακτηριαιμίες (Fowler et al., 2006). Η daptomycin έχει χαρακτηριστικό μηχανισμό δράσης, διαταράσσοντας με διάφορους τρόπους τη λειτουργία της κυτταρικής μεμβράνης των βακτηρίων. Αλλάζει τη δομή της κυτταρικής μεμβράνης και δημιουργεί πόρους από τους οποίους εξέρχονται ιόντα. Αυτό έχει επίδραση στην πολικότητα της μεμβράνης, με αποτέλεσμα απώλεια του δυναμικού της, διαταραχές στη σύνθεση πρωτεϊνών, RNA και DNA και κυτταρικό θάνατο. Μία μελέτη που αφορά τη δράση της daptomycin, περιελάμβανε 1040 CNS μεταξύ 5948 Gram-θετικών μικροοργανισμών που συλλέχθησαν από νοσηλευόμενους ασθενείς σε 15 χώρες της Ευρώπης, περιλαμβανομένης και της Ελλάδας. Όλοι οι CNS που εξετάστηκαν ήταν ευαίσθητοι στην daptomycin, της οποίας η MIC κυμάνθηκε μεταξύ 0.03 και 1.0 μg/ml. Η daptomycin ήταν εξαιρετικά δραστική κατά των Gram-θετικών μικροοργανισμών της 55

56 μελέτης, ακόμα και όσον αφορά στελέχη ανθεκτικά σε άλλα αντιβιοτικά (Critchley et al., 2003). Σε μία άλλη πολυκεντρική μελέτη της δραστικότητας της daptomycin έναντι Gram-θετικών κόκκων που απομονώθηκαν από δέκα νοσοκομεία στην Ελλάδα τα έτη , η daptomycin ήταν αποτελεσματική έναντι των ανθεκτικών στη methicillin CNS (MIC 50 =0.24 mg/l και MIC 90 =0.44 mg/l) και του ανθεκτικoύ στη methicillin S. aureus (MIC 50 =0.44 mg/l και MIC 90 =0.78 mg/l), ενώ ένα ποσοστό 0.9% των σταφυλοκόκκων είχαν MIC>1 mg/l, που αποτελεί το όριο ευαισθησίας στην daptomycin (Malli et al., 2008) Μακρολίδες- Λινκοζαμίδες- Στρεπτογραμμίνη Β (MLSB) Οι μακρολίδες αποτελούνται από τουλάχιστον δύο αμινοσάκχαρα ή ουδέτερα σάκχαρα συνδεδεμένα σε δακτύλιο λακτόνης ποικίλου μεγέθους. Χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: 14μελείς (ερυθρομυκίνη, κλαριθρομυκίνη, διρυθρομυκίνη, ροξυθρομυκίνη), 15μελείς (αζιθρομυκίμη) 16μελείς (γιοσαμυκίνη, μιντεκαμυκίνη, μιοκαμυκίνη, ροκιταμυκίνη, σπιραμυκίνη, τυλοσίνη). Οι λινκοζαμίδες (κλινδαμυκίνη, λινκομυκίνη) δεν έχουν δακτύλιο λακτόνης. Οι στρεπτογραμμίνες αποτελούνται από μακρολακτόνη και κυκλικό πεπτίδιο. Τα παραπάνω αντιβιοτικά δρουν αναστέλλοντας την πρωτεϊνοσύνθεση συνδεόμενα στην 50S υπομονάδα του ριβοσώματος. Το πρώτο ανθεκτικό στην ερυθρομυκίνη στέλεχος εμφανίστηκε το 1956, αμέσως μετά την εισαγωγή του αντιβιοτικού στην κλινική πράξη. Η αντοχή στις μακρολίδες συνδέεται με τρεις μηχανισμούς: τροποποίηση του στόχου του αντιβιοτικού, αποβολή του με αντλία εκροής και αδρανοποίηση του (Leclercq, 2002). Η τροποποίηση του στόχου του αντιβιοτικού οφείλεται στην ύπαρξη των γονιδίων erm (erythromycin ribosome methylase). Τα γονίδια αυτά κωδικοποιούν την παραγωγή των πρωτεϊνών Erm, οι οποίες έχουν δράση μεθυλάσης στην αδενίνη 2058 του 23SrRNA της 50S 56

57 υπομονάδας του ριβοσώματος, με αποτέλεσμα τα αντιβιοτικά να μην μπορούν να συνδεθούν στο στόχο τους (MLS B φαινότυπος). Η αντοχή αυτή είναι συνήθως επαγώγιμη και σπανιότερα ιδιοσυστασιακή και εμφανίζεται μόνο στις 14μελείς και 15μελείς μακρολίδες. Οι 16μελείς μακρολίδες, οι λινκοζαμίδες και οι στρεπτογραμμίνες δεν αποτελούν επαγωγείς και αναμένεται να είναι δραστικές. Παρόλα αυτά η χορήγηση τους αποφεύγεται λόγω του κινδύνου εμφάνισης μεταλλαγμένων στελεχών με σταθερή παραγωγή πρωτεϊνών Erm (Spiliopoulou et al., 2004). Η ικανότητα αποβολής του αντιβιοτικού με αντλία εκροής επάγεται μόνο από τις 14μελείς και 15μελείς μακρολίδες. Η αντλία απομακρύνει τα αντιβιοτικά αυτά αλλά και την στρεπτογραμμίνη Β, ενώ η κλινδαμυκίνη παραμένει σταθερή (MS B φαινότυπος). Η αδρανοποίηση του αντιβιοτικού οφείλεται στην υδρόλυση του δακτυλίου λακτόνης (γονίδια erea και ereβ) και σπανίως στην παραγωγή φωσφοτρανσφερασών από τα γονίδια mphc που προκαλούν αντοχή στις 14μελείς και 15μελείς μακρολίδες ή σε παραγωγή νουκλεοτιδυλοτρανσφερασών από τα γονίδια lnua που αδρανοποιούν τις λινκοζαμίδες και μειώνουν την βακτηριοκτόνο δράση της κλινδαμυκίνης (Leclercq, 2002) Οξαζολιδινόνες (Linezolid) Οι οξαζολιδινόνες αποτελούν μία κατηγορία βακτηριοστατικών αντιβιοτικών που αναστέλλουν την πρωτεϊνοσύνθεση δεσμευόμενα στην 50S υπομονάδα του ριβοσώματος. Η δέσμευση αναστέλλεται από τη χλωραμφενικόλη και τη λινκομυκίνη, γεγονός που υποδεικνύει ότι τα αντιβιοτικά αυτά έχουν κοινές θέσεις σύνδεσης. Οι οξαζολιδινόνες, όμως, δεν παρεμβαίνουν στην επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας ή στον τερματισμό της μετάφρασης. Πιστεύεται ότι δεσμεύονται σε περιοχή της 50S υπομονάδας κοντά στην 30S υπομονάδα και προκαλούν μεταβολές που αναστέλλουν την πρωτεϊνοσύνθεση σε πρώιμο στάδιο. Ο κύριος εκπρόσωπος της ομάδας αυτής είναι το linezolid, που χρησιμοποιείται στην κλινική πράξη από το 2000 στις ΗΠΑ. Με MIC 90 =1-4 μg/ml, το αντιβιοτικό αυτό αποτελεί σημαντικό παράγοντα θεραπείας σε λοιμώξεις από πολυανθεκτικά στελέχη, περιλαμβανομένων και αυτών που προκαλούνται από CNS (Mory et al., 2005). Η ανθεκτικότητα στο linezolid σχετίζεται με συγκεκριμένες μεταλλάξεις στο 23S rrna, από τις οποίες συχνότερες είναι οι G2576T και T2500A (που έχουν 57

58 περιγραφεί σε κλινικά στελέχη) και G2444T, G2447T, A2503G, T2504C, ενώ και η μετάλλαξη T2504A έχει αναφερθεί σε ανθεκτικό στο linezolid κλινικό στέλεχος S. epidermidis που απομονώθηκε από καλλιέργειες αίματος ασθενούς νοσηλευόμενου στην Μονάδα Εντατικής Νοσηλείας του Σισμανόγλειου Γενικού Νοσοκομείου Αττικής το 2008 (Liakopoulos et al., 2009). Σε μία μελέτη σε ασθενείς νοσηλευόμενους στη ΜΕΘ του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών τη διετία , 33 ασθενείς είχαν καλλιέργειες αίματος ή άκρων καθετήρων στις οποίες απομονώθηκαν CNS (29 S. epidermidis και 4 S. capitis) ανθεκτικοί στο linezolid (Papadimitriou-Olivgeris et al., 2013) Αμινογλυκοσίδες Οι αμινογλυκοσίδες αποτελούν μία μεγάλη ομάδα αντιβιοτικών με πρώτο εκπρόσωπο τους την στρεπτομυκίνη, που σχηματίζονται από δύο ή περισσότερα αμινοσάκχαρα συνδεδεμένα σε ένα κεντρικό πυρήνα αμινοκυκλιτόλης (Vakulenko and Mobashery, 2003). Είναι προϊόντα μικροοργανισμών του γένους Streptomyces (kanamycin, tobramycin) και Micromonospora (gentamicin), ενώ άλλες είναι ημισυνθετικά παράγωγα (amikacin, netilmicin). Δρουν εισερχόμενες στο βακτηριακό κύτταρο σε δύο φάσεις. Αρχικά εισέρχεται περιορισμένος αριθμός μορίων που συνδέονται στην 30S υπομονάδα των ριβοσωμάτων και προκαλούν λανθασμένη εισαγωγή αμινοξέων κατά την επιμήκυνση της πρωτεϊνικής αλυσίδας. Οι πρωτεΐνες που παράγονται ενσωματώνονται στην κυτταρική μεμβράνη διαταράσσοντας τη δομή της, με αποτέλεσμα αθρόα είσοδο μορίων αμινογλυκοσίδης, κορεσμό των ριβοσωμάτων και θάνατο του βακτηρίου (Mingeot-Leclercq et al., 1999). Οι σταφυλόκοκκοι παράγουν ένζυμα που τροποποιούν τις αμινογλυκοσίδες με αποτέλεσμα να αναστέλλεται η σύνδεση τους στα ριβοσώματα. Κάθε αντιβιοτικό μπορεί να αδρανοποιείται από περισσότερα του ενός ένζυμα και κάθε ένζυμο μπορεί να αδρανοποιεί περισσότερα από ένα αντιβιοτικά. Τα ένζυμα αυτά, που κωδικοποιούνται από γονίδια που εδράζονται σε τρανσποζόνια ή πλασμίδια, ανήκουν σε τρεις κατηγορίες: Ακετυλοτρανσφεράσες (AAC), που καταλύουν τη μεταφορά ακετυλομάδας απο το ακετυλοσυνένζυμο Α σε αμινομάδες του φαρμάκου 58

59 Αδενυλοτρανφεράσες ή νουκλεοτιδυλοτρασφεράσες (ANT), που μεταφέρουν AMP σε υδροξυλομάδες Φωσφοτρανφεράσες (APH), που φωσφορυλιώνουν υδροξυλομάδες των αντιβιοτικών Τα κυριότερα ένζυμα είναι τα ANT(4')-Ia, APH (3')-III, AAC(6')-Ie-APH(2'')-Ia (Vakulenko and Mobashery, 2003). Εκτός από την παραγωγή τροποποιητικών ενζύμων έχουν περιγραφεί χρωμοσωμικές μεταλλάξεις στελεχών S. aureus που επηρεάζουν το ηλεκτρικό δυναμικό της κυτταρικής μεμβράνης και προκαλούν αντοχή σε αμινογλυκοσίδες Τετρακυκλίνες Τα αντιβιοτικά της ομάδας αυτής αποτελούνται από τέσσερεις συγχωνευμένους φαινολικούς δακτυλίους ενωμένους με διάφορες προσθετικές ομάδες. Παράγονται από μύκητες, ενώ υπάρχουν και ημισυνθετικά παράγωγα όπως η τετρακυκλίνη και η δοξυκυκλίνη. Οι τετρακυκλίνες δεσμεύονται ειδικά στην 30S υπομονάδα του ριβοσώματος στη θέση υποδοχής των αμινοακυλο-trna στο ριβοσωματικό σύμπλεγμα του mrna, με αποτέλεσμα να αναστέλλουν την προσθήκη αμινοξέων στην αναπτυσσόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα και κατ' επέκταση την πρωτεϊνοσύνθεση. Οι τετρακυκλίνες εμφανίζουν βακτηριοστατική δράση. Η αντοχή στις τετρακυκλίνες εδράζεται κυρίως σε μεταφερόμενα τρανσποζόνια. Ειδικότερα, η ανθεκτικότητα αναπτύσσεται λόγω τροποποίησης του ριβοσωματικού στόχου δράσης, ελάττωσης της διαπερατότητας της κυτταροπλασματικής μεμβράνης ή λόγω ανεπαρκούς ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του αντιβιοτικού μετά από ενεργητική εξώθησή του με αντλίες εκροής (Chopra and Roberts, 2001) Φουσιδικό οξύ Το φουσιδικό οξύ παράγεται από το μύκητα Fucidium coccineum και είναι το μόνο αντιβιοτικό της οικογένειας των στεροειδών που χρησιμοποιείται σήμερα. Είναι βακτηριοκτόνο αντιβιοτικό που δρα αναστέλλοντας την πρωτεϊνοσύνθεση των βακτηρίων. Ειδικότερα, επιτρέπει τη μεταφορά του πεπτιδυλο-trna από την Α θέση 59

60 στην Ρ θέση του ριβοσώματος και την υδρόλυση του GTP, αλλά σταθεροποιεί το σύμπλεγμα EF-G-GDP (παράγοντας επιμήκυνσης- G -διφωσφορική γουανοσίνη) στο ριβόσωμα με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η σύνδεση του επόμενου αμινο-ακυλοtrna στο ριβόσωμα. Η χορήγησή του συνήθως συνδυάζεται με έναν δεύτερο αντισταφυλοκοκκικό παράγοντα, λόγω της συχνής εμφάνισης ανθεκτικών στελεχών. Η αντοχή σχετίζεται με μεταλλάξεις στο γονίδιο fusa που κωδικοποιεί τον EF-G με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η πρόσδεση του φουσιδικού οξέος στον παράγοντα (Αναστασίου, 2009) Ριφαμπικίνη Το αντιβιοτικό αυτό αναστέλλει την βακτηριακή RNA-πολυμεράση, συνδεόμενη σε μία θέση κοντά στο ενεργό κέντρο του ενζύμου, στην β-υπομονάδα του ενζύμου. Χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1967 ως συμπλήρωμα στη θεραπεία της φυματίωσης, είναι όμως αποτελεσματική και έναντι ανθεκτικών σε άλλα αντιβιοτικά σταφυλοκόκκων, ιδίως σε περιστατικά οστεομυελίτιδας και λοιμώξεων προσθετικών αρθρώσεων (Wehrli, 1983) Κινολόνες Το πρώτο μέλος της οικογένειας αυτής απομονώθηκε το 1962 και είναι το ναλιδιξικό οξύ. Τη δεκαετία του 1980 δημιουργήθηκαν φθοριωμένα και πιπεραζινυλικά παράγωγα με μεγαλύτερη αντιβακτηριακή δραστικότητα που ονομάστηκαν φθοριοκινολόνες (όπως για παράδειγμα τα ciprofloxacin και norfloxacin). Η διείσδυση των κινολονών στα βακτηριακά κύτταρα επιτυγχάνεται παθητικά με διάχυση και δεν παρατηρείται κορεσμός. Οι κινολόνες αναστέλλουν τη σύνθεση του βακτηριακού DNA με αποτέλεσμα το θάνατο του μικροβίου. Η δράση τους εντοπίζεται στην αναστολή της δραστηριότητας δύο ενζύμων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της υπερελίκωσης του DNA, της DNA-γυράσης και της τοποισομεράσης IV. Τα βακτήρια αναπτύσσουν αντοχή στις κινολόνες με μεταλλάξεις σε γονίδια που οδηγούν σε αλλαγές των ενζύμων-στόχων ή σε αλλαγές στη διαπερατότητα και τα συστήματα εξώθησης της κυτταρικής τους μεμβράνης (Hooper, 1995). 60

61 6.11. Σουλφοναμίδες Οι σουλφοναμίδες αποτελούν συνθετικά παράγωγα της σουλφανιλαμίδης, η οποία είναι δομικά ανάλογη του π-αμινοβενζοϊκού οξέος, απαραίτητου παράγοντα για τη σύνθεση του φολλικού οξέος. Οι σουλφοναμίδες είναι βακτηριοστατικά χημειοθεραπευτικά που αναστέλλουν την ανάπτυξη των βακτηρίων παρεμβαίνοντας στη σύνθεση του φολλικού οξέος, ενώ δεν επηρεάζουν την ανάπτυξη κυττάρων που δεν συνθέτουν φολλικό οξύ, όπως τα κύτταρα των θηλαστικών. Η ελάττωση της σύνθεσης φολλικού οδηγεί σε μείωση του σχηματισμού νουκλεοτιδίων από το βακτήριο και, συνεπώς, σε αναστολή της ανάπτυξης του. Η αντοχή των βακτηρίων στις σουλφοναμίδες είναι πολύ συχνή, ενώ παρατηρείται και διασταυρούμενη αντοχή μεταξύ διαφορετικών σκευασμάτων. Η αντοχή οφείλεται σε μεταλλάξεις που οδηγούν σε υπερπαραγωγή π-αμινοβενζοικού οξέος ή σε μείωση της συγγένειας των ενζύμων που μετέχουν στη σύνθεση του φολλικού οξέος προς τις σουλφοναμίδες. Επιπλέον, η ανθεκτικότητα μπορεί να οφείλεται σε παραγωγή ανθεκτικών στη δράση της σουλφοναμίδης ενζύμων ή σε μείωση της διαπερατότητας του κυτταρικού τοιχώματος (Αναστασίου, 2009) Τριμεθοπρίμη Η τριμεθοπρίμη είναι μία διαμινο-τριμεθυλο-βενζυλο-πυριμιδίνη με αντιβακτηριακή δράση, η οποία χρησιμοποιείται ως συμπλήρωμα των σουλφοναμιδών. Ο συνδυασμός τριμεθοπρίμης και σουλφαμεθοξαζόλης, γνωστός και ως κοτριμοξαζόλη εμφανίζει ισχυρή συνεργική αντιβακτηριακή δράση και χρησιμοποιείται ευρέως στην κλινική πράξη. Η τριμεθοπρίμη αναστέλλει τη δράση της διυδροφολλικής αναγωγάσης, ενζύμου που συμμετέχει στη σύνθεση φολλικού οξέος από τα βακτήρια. Η αναστολή αυτή παρεμποδίζει τη σύνθεση του βακτηριακού DNA. Τα ανθρώπινα κύτταρα προσλαμβάνουν φολλικό οξύ απευθείας από τις τροφές με αποτέλεσμα να μην επηρεάζονται από τη δράση του φαρμάκου. Τα βακτήρια αναπτύσσουν αντοχή στην τριμεθοπρίμη μέσω χρωμοσωμικών μεταλλάξεων ή με απόκτηση πλασμιδίων αντοχής. Η αντοχή συνήθως προέρχεται από ελαττωμένη κυτταρική διαπερατότητα, ανικανότητα σύνδεσης του φαρμάκου στο στόχο του ή υπερπαραγωγή της διυδροφολλικής αναγωγάσης. Κλινικά, ο πλέον διαδεδομένος 61

62 μηχανισμός ανθεκτικότητας οφείλεται σε πλασμιδιακή έκφραση ενζύμου που είναι ανθεκτικό στη δράση της τριμεθοπρίμης (Gleckman et al., 1981). 62

63 7. ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Κάθε είδος σταφυλοκόκκων διαθέτει ποικίλους μηχανισμούς που συμβάλλουν στη λοιμογόνο τους ικανότητα, την προσκόλληση, τη διείσδυση στους ιστούς και την διαφυγή από τους μηχανισμούς άμυνας του ξενιστή. Σε σύγκριση με τον S. aureus, λίγα είναι γνωστά για τους λοιμογόνους παράγοντες των CNS. Οι CNS υστερούν στους παράγοντες εκείνους που είναι υπεύθυνοι για την ισχυρή λοιμογόνο ικανότητα του S. aureus. Παρόλα αυτά, αποτελούν σημαντικό μέρος της φυσιολογικής μικροβιακής χλωρίδας του ανθρώπου και μπορούν υπό κατάλληλες προϋποθέσεις, να προκαλέσουν σοβαρές λοιμώξεις ΒΙΟΜΕΜΒΡΑΝΗ (BIOFILM) O S. epidermidis, αλλά και άλλα είδη CNS, έχουν την ικανότητα παραγωγής βιομεμβράνης. Το biofilm είναι μία οργανωμένη κοινότητα μικροβίων που είναι προσκολλημένα σε μία επιφάνεια και βρίσκονται μέσα σε ένα εξωκυττάριο στρώμα που παρέχει προστασία από τους μηχανισμούς άμυνας του ξενιστή και τα αντιβιοτικά (Costerton et al., 1995). Για πολλούς αντιμικροβιακούς παράγοντες, οι συγκεντρώσεις που απαιτούνται για την καταπολέμηση βακτηρίων σε biofilm είναι αρκετά υψηλότερες από αυτές που είναι δραστικές κατά ελεύθερων (πλαγκτονικών) μικροοργανισμών. Οι μηχανισμοί μέσω των οποίων ο σχηματισμός biofilm παρέχει προστασία στα μικρόβια είναι πολλοί και μπορεί να διαφέρουν για κάθε κατηγορία αντιβιοτικών ή για τους διάφορους μηχανισμούς άμυνας του ξενιστή. Το εξωκυττάριο στρώμα αποτελεί έναν μηχανικό φραγμό που αποτρέπει τη διείσδυση των κυττάρων του ανοσολογικού συστήματος. Εν τούτοις, έχει αναφερθεί ότι τα ουδετερόφιλα μπορούν να εισέρχονται εις βάθος διαμέσω πόρων στα βακτηριακά biofilms (Leid et al., 2002). Η δράση των φαγοκυττάρων, αντίθετα, αναστέλλεται σε μεγάλο βαθμό από το biofilm. Στον S. aureus, αυτό έχει αναφερθεί από τον Thurlow και τους συνεργάτες του (Thurlow et al., 2011). Επιπλέον, η μειωμένη διάχυση μέσα από το εξωκυττάριο στρώμα συμβάλλει στην αντοχή των μικροοργανισμών στα αντιβιοτικά. Αυτό δεν ισχύει για όλα τα αντιβιοτικά, καθώς υπάρχουν ουσίες όπως η ριφαμπικίνη, η 63

64 βανκομυκίνη και η δαπτομυκίνη που μπορούν να εισέρχονται μέσα στα σταφυλοκοκκικά biofilms (Leite et al., 2011). Επιπρόσθετα, οι μικροοργανισμοί μέσα στα biofilms είναι σχετικά αδρανείς, εμφανίζοντας μειωμένη δραστηριότητα όσον αφορά κυτταρικές λειτουργίες όπως πρωτεϊνοσύνθεση, διπλασιασμός του DNA και κυτταρική διαίρεση (Mah and O'Toole, 2001). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την μειωμένη δράση αντιβιοτικών που έχουν ως στόχο τη διατάραξη των φυσιολογικών αυτών λειτουργιών των μικροβίων, όπως, για παράδειγμα, τα αντιβιοτικά που αναστέλλουν την πρωτεϊνοσύνθεση ή την σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος. Επιπλέον, μέσα στη βιομεμβράνη συχνά υπάρχει μεγάλος υποπληθυσμός μικροβίων που έχουν μεγαλύτερη αντοχή στα αντιβιοτικά (Keren et al., 2004). Ο σχηματισμός biofilm λαμβάνει χώρα σε τέσσερα στάδια: την αρχική προσκόλληση των βακτηρίων σε μία επιφάνεια. Η προσκόλληση μπορεί να γίνει σε μία αβιοτική επιφάνεια, όπως η πλαστική κάλυψη ενός προσθετικού υλικού, ή σε ζώσες επιφάνειες, περιλαμβανομένων των ιστών αλλά και πρωτεϊνών του ξενιστή που έχουν επικαλύψει το ξένο προς τον οργανισμό υλικό. Ειδικές πρωτεΐνες έχουν αναγνωριστεί, οι οποίες μεσολαβούν για την πρόσδεση στις αβιοτικές επιφάνειες, όπως η AtlE που έχει διπλό ρόλο προσκολλητίνης και αυτολυσίνης (Heilmann et al., 1997). Οι αυτολυσίνες συμμετέχουν τόσο στην προσκόλληση, αφού προσδένονται στη βιτρονεκτίνη, αλλά και στην απελευθέρωση εξωκυττάριου DNA, που πρόσφατα αναγνωρίστηκε ως ένας σημαντικός παράγοντας για την προσκόλληση και την αύξηση του αριθμού των βακτηρίων. Επιπρόσθετα, τα βιοϋλικά σε μικρό χρονικό διάστημα επικαλύπτονται από ανθρώπινες πρωτεΐνες, όπως η ινωδονεκτίνη, το κολλαγόνο και το ινωδογόνο. Οι σταφυλόκοκκοι διαθέτουν πολλούς παράγοντες επιφανείας που βοηθούν στην προσκόλληση, γνωστούς ως microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules (MSCRAMMs), που αναγνωρίζουν πρωτεΐνες του ορού. την συσσώρευση των κυττάρων και παραγωγή biofilm. Η συσσώρευση των βακτηριακών κυττάρων και η διασύνδεσή τους επιτυγχάνεται με μια σειρά πρωτεϊνών του στρώματος καθώς και μη-πρωτεϊνικών πολυμερών. Μετά την 64

65 προσκόλληση του βακτηρίου ακολουθεί ο σχηματισμός βιομεμβράνης που αποτελείται από πολυσακχαρίτες και πρωτεΐνες. Το κύριο συστατικό του biofilm είναι ο PIA (Polysaccharide Intercellular Adhesin), μία προσκολλητίνη πολυσακχαριδικής φύσεως, ενώ σημαντικό ρόλο παίζει και ο 20 kda-πολυσακχαρίτης, που αποτελείται κυρίως από γλυκόζη και Ν- ακετυλογλυκοζαμίνη (Spiliopoulou et al., 2012) την ωρίμανση του biofilm. το τελικό στάδιο της αποκόλλησης και αποδέσμευσης μικροβίων (O'Toole et al., 2000). Καθώς οι σταφυλοκοκκικές βιομεμβράνες ωριμάζουν, βακτηριακά κύτταρα, μεμονωμένα ή σε ομάδες, αποκολλώνται και διασπείρονται σε άλλα σημεία του σώματος του ξενιστή. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το ρυθμιστικό σύστημα agr διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη διαδικασία αυτή (Vuong et al., 2003). Εικόνα 6. Ο κύκλος ζωής του biofilm. 1,2: μεμονωμένα βακτήρια προσκολλώνται σε μία επιφάνεια. 3,4: παραγωγή και ωρίμανση biofilm. 5: απελευθέρωση βακτηρίων (Biofilm_hypertextbook). 65

66 Ο πολυσακχαρίτης PIA (polysaccharide intercellular adhesin) ή αλλιώς PNAG (poly-n-acetylglucosamine) αναγνωρίστηκε ως το κύριο συστατικό της εξωκυττάριας ουσίας στον S. epidermidis το 1996 από τον Mack και τους συνεργάτες του στο Hamburg της Γερμανίας (Mack et al., 1996). Ο πολυσακχαρίτης αυτός είναι μία ομογλυκάνη που αποτελείται από β-1,6-2-αμινο-2-δεοξυ-d-pyranosyl επαναλήψεις (Rohde et al., 2010). Έχει αλυσίδα με κατά μέσο όρο πάνω από 130 υποομάδες. Σε αντίθεση με την χιτίνη, που είναι η πιο διαδεδομένη πολυγλυκοζαμίνη στη φύση με β1-4 συνδέσεις μεταξύ των τμημάτων της, ο πολυσακχαρίτης PIA περιλαμβάνει β1-6 συνδέσεις. Ο πολυσακχαρίτης αυτός κωδικοποιείται από το οπερόνιο ica, το οποίο αποτελείται από τα γονίδια icaa (1238 bp), icad (305 bp), icab (869 bp) και icac (1067 bp) (Heilmann et al., 1996). Παρακείμενο στο οπερόνιο ica είναι το ρυθμιστικό γονίδιο icar (557 bp), το οποίο δρα ως μεταφραστικός καταστολέας του ica. Το τμήμα icaa είναι μία γλυκοζαμινική τρανσφεράση η οποία μεταφέρει τμήματα γλυκοζαμίνης από την UDP-γλυκοζαμίνη στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα του PIA. Το γονίδιο icad είναι απαραίτητο για την παραγωγή του πλήρως λειτουργικού πολυσακχαρίτη, αν και ο ρόλος του δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως. Τα προϊόντα των γονιδίων icaa και icad εκφράζονται στην κυτταρική μεμβράνη. Η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο icac βρίσκεται επίσης στην κυτταρική μεμβράνη και συμμετέχει στην έξοδο του προδρόμου μορίου pre-pia από το βακτηριακό κύτταρο. Μετά την έξοδο από το κύτταρο, το pre-pia απο-ν-ακετυλιώνεται από το ένζυμο που κωδικοποιείται από το icab, που βρίσκεται στην επιφάνεια του κυττάρου. Η επεξεργασία αυτή είναι σημαντική για τη δράση του PIA και την αύξηση της ανοσογονικότητας του. Η αποακετυλίωση του ΡΙΑ απαιτείται για την πρόσδεσή του στην κυτταρική επιφάνεια, καθώς και το σχηματισμό του biofilm, τον αποικισμό της επιφάνειας και την αναστολή του ανοσοποιητικού συστήματος στις σταφυλοκοκκικές λοιμώξεις, όπως έχει αποδειχθεί σε πειραματικά μοντέλα ποντικών (Kristian et al., 2008). 66

67 Εικόνα 7. Παραγωγή του PIA και ica: a) ο πολυσακχαρίτης poly-nacetylglucosamine (PNAG; γνωστός ως PIA), ο οποίος ενέχεται στο σχηματισμό της βιομεμβράνης και στη διαφυγή του ανοσολογικού συστήματος. Συντίθεται από την μεμβρανική πρωτεΐνη GlcNAc transferase IcaA, με τη βοήθεια της μεμβρανικής IcaD πρωτεΐνης (βήμα 1). Μεταφέρεται εξωκυττάρια με την IcaC μεμβρανική πρωτεΐνη (βήμα 2). Στη συνέχεια η IcaB de-acetylase η οποία βρίσκεται στην επιφάνεια του κυττάρου απομακρύνει ορισμένες N-acetyl ομάδες, δίνοντας στο πολυμερές κατιονικές ιδιότητες οι οποίες είναι απαραίτητες για την προσκόλληση (βήμα 3). b) Οι Ica πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από το οπερόνιο ica που αποτελείται από το icaadbc οπερόνιο και το icar γονίδιο, το οποίο κωδικοποιεί τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες (Otto, 2009). Όπως ήταν αναμενόμενο, η σχέση μεταξύ PIA και σχηματισμού biofilm σε κλινικά στελέχη S. epidermidis αναφέρθηκε λίγο μετά την ανακάλυψη του πρώτου (Mack et al., 1996) και για καιρό ο πολυσακχαρίτης αυτός θεωρείτο απαραίτητος για την παραγωγή βιομεμβράνης. Εν τούτοις, πιο πρόσφατα περιγράφηκαν στελέχη σταφυλοκόκκων όπου ο σχηματισμός biofilm είναι δυνατός παρά την απουσία του PIA και συνδέεται περισσότερο με την παρουσία πρωτεϊνών (Rohde et al., 2007). Έχει αναφερθεί ότι τα biofilms που συνδέονται με τον PIA είναι πιο ανθεκτικά σε 67

68 σχέση με αυτά που σχηματίζονται από πρωτεΐνες (Rohde et al., 2007). Ο PIA παίζει σημαντικό ρόλο όχι μόνο στην συσσώρευση των κυττάρων, αλλά και στην διαφυγή από το ανοσολογικό σύστημα του ξενιστή. Ο πολυσακχαρίτης μειώνει τη δραστικότητα αντιμικροβιακών ουσιών, πιθανώς αποκρύπτοντας τον στόχο τους, τις κυτταρικές μεμβράνες των βακτηρίων. Επιπλέον, προστατεύει τα μικρόβια από τα ουδετερόφιλα κύτταρα (Vuong et al., 2004), ενώ έχει επίσης αναφερθεί ότι μειώνει την έκφραση ιντερλευκίνης 8 από τα ανθρώπινα αστροκύτταρα (Stevens et al., 2009). Ο πολυσακχαρίτης 20kDa-PS αποτελεί διαφορετικό μόριο από τον PIA και η παραγωγή του δεν εξαρτάται από το οπερόνιο ica, ενώ και οι αντιγονικές του ιδιότητες δεν αναστέλλονται από τη δράση της πρωτεϊνάσης Κ. Ο 20kDa-PS προάγει την προσκόλληση των βακτηρίων στα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα και αναστέλλει τη φαγοκυττάρωση από τα μακροφάγα (Spiliopoulou et al., 2012) ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ- ΣΥΣΣΩΡΕΥΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Εκτός από αβλαβείς κάτοικοι του ανθρώπινου δέρματος και των βλεννογόνων, οι πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι αποτελούν και σημαντικά παθογόνα ικανά να προκαλέσουν λοιμώξεις που ποικίλουν από ήπιες δερματίτιδες μέχρι απειλητικές για τη ζωή καταστάσεις όπως ενδοκαρδίτιδα, οστεομυελίτιδα, πνευμονία και σήψη (Ziebuhr, 2001). Οι λοιμώξεις από CNS είναι συνήθως ήπιες ή και χρόνιες και συνήθως λαμβάνουν χώρα σε ανοσοκατεσταλμένα άτομα ή ασθενείς με προδιαθεσικούς παράγοντες, όπως η ύπαρξη προσθετικών υλικών. Ο S. epidermidis είναι το είδος που απομονώνεται πιο συχνά από λοιμώξεις που σχετίζονται με την εφαρμογή προσθετικών υλικών, όπως καρδιακών βαλβίδων και ορθοπεδικών εμφυτευμάτων (Lentino, 2003). Αν και οι CNS υστερούν στην παραγωγή λοιμογόνων παραγόντων σε σχέση με τον S. aureus, εντούτοις συνθέτουν, έστω και σε μικρότερο βαθμό, μία σειρά από προσκολλητίνες, ένζυμα και τοξίνες που υπό κατάλληλες συνθήκες μπορεί να προκαλέσουν προβλήματα στον ξενιστή. Προκειμένου να καταστούν παθογόνοι, οι σταφυλόκοκκοι πρέπει να αποκτήσουν πρόσβαση στον ανθρώπινο οργανισμό. Αυτό συνήθως συμβαίνει με προσκόλληση των μικροβίων σε ζώσες επιφάνειες, όπως τα συστατικά του εξωκυττάριου χώρου 68

69 στους ιστούς του ανθρώπου, αλλά και μη ζώσες επιφάνειες, όπως τα προσθετικά υλικά. Μετά την προσκόλληση, τα βακτήρια πολλαπλασιάζονται και αποικίζουν την επιφάνεια σχηματίζοντας biofilm. Η παραγωγή biofilm περιλαμβάνει δύο φάσεις: την αρχική προσκόλληση και την επικείμενη συσσώρευση των μικροβίων. Η συσσώρευση γίνεται μέσω συγκόλλησης των βακτηρίων μεταξύ τους ώστε να σχηματιστούν τα πολλά στρώματα της βιομεμβράνης. Η σύνδεση των μικροβίων γίνεται μέσω πολυσακχαριδικών ή πρωτεϊνικών παραγόντων. Μέσα στο biofilm οι σταφυλόκοκκοι περιβάλλονται από ένα πολυσακχαριδικό ή και πρωτεϊνικό στρώμα μαζί με τοιχωματικά τειχοϊκά οξέα, εξωκυτταρικό DNA και παράγοντες του ξενιστή. Όλα αυτά προστατεύουν τα βακτήρια από το ανοσολογικό σύστημα και τα αντιβιοτικά, ώστε συχνά απαιτείται η αφαίρεση του προσθετικού υλικού για την καταπολέμηση της λοίμωξης. Κάποιες από τις σταφυλοκοκκικές προσκολλητίνες δεν συμβάλλουν μόνο στην προσκόλληση και τον αποικισμό των προσθετικών υλικών, αλλά και στην είσοδο των μικροβίων στα κύτταρα του ξενιστή. Οι σταφυλόκοκκοι μέσα στα κύτταρα προστατεύονται από το ανοσολογικό σύστημα και σχηματίζουν ένα ρεζερβουάρ μικροβίων που είναι ικανά να προκαλούν υποτροπιάζουσες λοιμώξεις (Linke, 2011) MSCRAMMs Οι περισσότερες προσκολλητίνες των σταφυλοκόκκων συνδέονται με ομοιοπολικό δεσμό με την πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος και ανήκουν στην οικογένεια των MSCRAMMs (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) (Clarke and Foster, 2006). Οι MSCRAMMs μπορούν να συνδέονται σε μία ή περισσότερες πρωτεΐνες του πλάσματος και του εξωκυττάριου χώρου, ενώ και ένας παράγοντας του ξενιστή μπορεί να συνδέεται με περισσότερες από μία προσκολλητίνες (Linke, 2011). Τα μόρια αυτά έχουν παρόμοια οργάνωση, που περιλαμβάνει ένα Ν-τελικό πεπτίδιο σήματος, μια εκτεθειμένη περιοχή για την πρόσδεση τους σε άλλα μόρια (που συχνά περιλαμβάνει ή ακολουθείται από επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες), μία χαρακτηριστική υδρόφοβη περιοχή σύνδεσης με την κυτταρική μεμβράνη ή το κυτταρικό τοίχωμα, μία C-τελική περιοχή LPXTG που είναι υπεύθυνη για τη σύνδεση στο κυτταρικό τοίχωμα και πολλές φορές, ένα θετικά φορτισμένο άκρο. Συχνά η σύνδεση με το κυτταρικό τοίχωμα του βακτηρίου 69

70 επιτυγχάνεται με τη δράση μίας μεμβρανικής τρανσπεπτιδάσης, η οποία ονομάζεται SrtA και διασπά τον πεπτιδικό δεσμό μεταξύ των αμινοξέων θρεονίνη και γλυκίνη της περιοχής LPXTG, ενώ παράλληλα συνδέει ομοιοπολικά την καρβοξυλική ομάδα της θρεονίνης με αμινομάδες της πεπτιδογλυκάνης του τοιχώματος (Schneewind et al., 1993). Έχουν περιγραφεί 12 γονίδια που κωδικοποιούν προσκολλητίνες της ομάδας MSCRAMMs στο γονιδίωμα του στελέχους S. epidermidis RP62A (Linke, 2011) Πρωτεΐνες που δεσμεύουν την ινωδονεκτίνη (FnbA/FnbB) Ο S. aureus παράγει δύο πρωτεΐνες που ανήκουν στην οικογένεια των MSCRAMMs, δεσμεύουν την ινωδονεκτίνη και κωδικοποιούνται από τα γονίδια fnba και fnbb (Jonsson et al., 1991). Η ικανότητα σύνδεσης των μορίων αυτών στην ινωδονεκτίνη εδράζεται σε μία C-τελική και σε μεγάλο βαθμό διατηρημένη περιοχή του γονιδιώματος που περιλαμβάνει επαναλήψεις μίας αλληλουχίας 40 αμινοξέων. Τα περισσότερα στελέχη S. aureus φέρουν και τα δύο γονίδια, αν και δεν φαίνεται να υπάρχει διαφορά στην ικανότητα σύνδεσης στην ινωδονεκτίνη σε σχέση με στελέχη που φέρουν μόνο το ένα γονίδιο (Greene et al., 1995). Εν τούτοις, μία μελέτη ενός μεγάλου πληθυσμού κλινικών στελεχών S. aureus έδειξε ότι τα βακτήρια που προκαλούσαν σοβαρότερη λοίμωξη έφεραν συχνότερα και τα δύο γονίδια (Peacock et al., 2000). Εκτός από το ρόλο τους στην προσκόλληση, οι πρωτεΐνες FnbA και FnbB μεσολαβούν στην είσοδο των μικροοργανισμών μέσα στα κύτταρα του ξενιστή. Οι σταφυλόκοκκοι είναι κλασσικά εξωκυττάρια παθογόνα. Μπορούν όμως να εισέρχονται και να πολλαπλασιάζονται στα κύτταρα του μεγαλοοργανισμού. Για την είσοδο του S. aureus στα κύτταρα απαιτείται η ινωδονεκτίνη ως μέσο γεφύρωσης και οι ιντεγκρίνες α 5 β 1 ως υποδοχείς των κυττάρων, μέσω των οποίων γίνεται η μετάδοση του σήματος, η ενεργοποίηση της οδού της τυροσινικής κινάσης και οι μεταβολές στον κυτταροσκελετό (Chavakis et al., 2005). Έχουν υπάρξει διάφορες αντικρουόμενες μελέτες σχετικά με τον ρόλο των πρωτεϊνών που δεσμεύουν την ινωδονεκτίνη στην παθογένεια των λοιμώξεων (Clarke and Foster, 2006). Έχει αναφερθεί ότι έκφραση των προσκολλητινών FnbA και FnbB στον πηκτάση-αρνητικό S. carnosus αυξάνει την προσκόλληση στο ενδοθήλιο in vivo (Linke, 2011). Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι οι πρωτεΐνες αυτές υποβοηθούν την 70

71 προσκόλληση στα αιμοπετάλια με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση τους. Η FnbA και η FnbB επίσης παίζουν σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της συστηματικής φλεγμονώδους απάντησης (Clarke and Foster, 2006) Aap Το 1997 ο Hussain και οι συνεργάτες του περιέγραψαν μία εξωκυττάρια πρωτεΐνη που περιέχει Ν-αμινοτελικές περιοχές Α και Β με ποικίλου αριθμού επαναλήψεις των 128 bp (Hussain et al., 1997) και είναι στοιχειώδης για την συσσώρευση των βακτηρίων του είδους S. epidermidis σε μία επιφάνεια. Η πρωτεΐνη αυτή ονομάστηκε Accumulation-Associated Protein (Aap) και έχει μεγάλου βαθμού ομολογία με την πρωτεΐνη SasG του S. aureus, η οποία επίσης παίζει ρόλο στην συσσώρευση των βακτηρίων στη βιομεμβράνη. Αργότερα βρέθηκε ότι η Aap σχηματίζει ινίδια στην επιφάνεια των μικροβιακών κυττάρων, συμμετέχοντας έτσι στη διασύνδεση των κυττάρων μεταξύ τους. Ο σχηματισμός των ινιδίων αυτών εξαρτάται από την ύπαρξη ψευδαργύρου (Zn +2 ) και το διμερισμό των Β-περιοχών γειτονικών κυττάρων, ενώ οι Α-περιοχές μεσολαβούν στην προσκόλληση στα κύτταρα της κεράτινης στιβάδας, και έτσι παίζουν σπουδαίο ρόλο στην προσκόλληση στο δέρμα (Conrady et al., 2008). Η επαναλαμβανόμενη αλληλουχία Β, η οποία καθίσταται ενεργής μετά από πρωτεολυτική επεξεργασία της Ν-τελικής Α περιοχής, συμμετέχει στην διακυτταρική προσκόλληση. Πρόσφατα, οι Β επαναλήψεις (οι οποίες αναφέρονται και ως G5 περιοχές) αναγνωρίστηκαν ως εξαρτώμενα από ψευδάργυρο μόρια προσκόλλησης και προτάθηκε ένας μηχανισμός δίκην φερμουάρ για την διακυτταρική προσκόλληση μέσω των G5 περιοχών της Aap (Linke, 2011). Η πρωτεΐνη αυτή θεωρείται ο σημαντικότερος παράγοντας στα πρωτεϊνικής φύσης μη εξαρτώμενα από τον PIA biofilms. 71

72 Εικόνα 8. Μόρια τα οποία συμμετέχουν στην αρχική φάση της προσκόλλησης του S. epidermidis σε ξένες επιφάνειες για το σχηματισμό βιομεμβράνης. Πρωτεΐνες, όπως η SdrG και Aap, είναι προσκολλημένες στην επιφάνεια του βακτηριακού κυττάρου και ενώνονται ομοιοπολικά μέσω μορίων θρεονίνης με την πεπτιδογλυκάνη. Αυτολυσίνες, όπως η AtlE, προσδένονται μη ομοιοπολικά με τα τειχοϊκά οξέα. Η αυτολυσίνη AtlE συμμετέχει στο σχηματισμό της βιομεμβράνης με τη δέσμευσή της σε πρωτεΐνες του εξωκυττάριου χώρου (Otto, 2009) Bap Η πρωτεΐνη Bap (biofilm-associated protein) είναι ένα επιφανειακό πολυπεπτίδιο μεγέθους 239 kda που εμπλέκεται στην προσκόλληση και στην συσσώρευση των βακτηρίων κατά το σχηματισμό του biofilm (Cucarella et al., 2001). Αν και στον S. aureus η πρωτεΐνη αυτή βρίσκεται μόνο σε λίγα στελέχη, στον S. epidermidis απαντάται συχνότερα. Το γονίδιο bap βρίσκεται σε ένα νησίδιο παθογονικότητας, το οποίο είναι μεταθετό γενετικό στοιχείο (pathogenicity island) και έχει κυρίως αναφερθεί σε στελέχη S. aureus που έχουν απομονωθεί από βοοειδή με μαστίτιδα (Cucarella et al., 2001). Η παρουσία της πρωτεΐνης αυτής αυξάνει σημαντικά την ικανότητα των μικροβίων να αποικίζουν τους γαλακτοφόρους αδένες των ζώων in 72

73 vivo, ενώ bap-θετικά στελέχη εμφανίζουν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά όταν σχηματίζουν biofilm in vitro (Cucarella et al., 2004). Ανάλυση της δομής του γονιδίου bap έδειξε πως υπάρχουν διάφορες εναλλακτικές μορφές της πρωτεΐνης που κωδικοποιεί, με διαφορετικές επαναλήψεις αλληλουχιών, σε στελέχη S. aureus που απομονώνονται κατά τη διάρκεια της ζωής του ξενιστή. Η παρουσία ειδικών αντι-bap αντισωμάτων στον ορό ζώων κατά τη διάρκεια σταφυλοκοκκικής λοίμωξης ενισχύει την άποψη ότι η πρωτεΐνη Bap παράγεται κατά τη διάρκεια της λοίμωξης. Συμπερασματικά, έχει αποδειχθεί ότι η πρωτεΐνη Bap σχετίζεται με την παραγωγή biofilm που έχει σαν αποτέλεσμα επιμένουσες σταφυλοκοκκικές λοιμώξεις. Εικόνα 9. Ανάλυση δομής πρωτεΐνης Bap από διάφορα είδη σταφυλοκόκκων (Tormo et al., 2005). 73

74 Μία πρωτεΐνη με παρόμοια δομή και λειτουργία (bap homologue protein, Bhp) έχει περιγραφεί και στους πηκτάση-αρνητικούς σταφυλοκόκκους, ιδίως σε στελέχη S. epidermidis (Tormo et al., 2005). Πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι που έφεραν το γονίδιο bap αλλά όχι και το οπερόνιο ica ήταν ισχυροί παραγωγοί biofilm, ενώ διατάραξη της λειτουργίας του bap σε στέλεχος S. epidermidis είχε ως αποτέλεσμα απώλεια της ικανότητας παραγωγής βιομεμβράνης. Σύμφωνα με τον Tormo και τους συνεργάτες του, οι ομόλογες της Bap πρωτεΐνες στους πηκτάση-αρνητικούς σταφυλοκόκκους αποτελούν έναν εναλλακτικό μηχανισμό σχηματισμού biofilm, ανεξάρτητο της παραγωγής του πολυσακχαρίτη PIA (Tormo et al., 2005) Fbe Η πρωτεΐνη του S. epidermidis που συνδέει το ινωδογόνο (Fbe), η οποία αναφέρεται και ως SdrG, έχει ομοιότητες με τον clumping factor A του S. aureus. Πρόσφατα διατυπώθηκε η άποψη ότι η Fbe συμβάλλει και στην προσκόλληση και συσσώρευση αιμοπεταλίων. Η περιοχή αναγνώρισης των ιστών του ξενιστή εδράζεται στο Ν-τελικό άκρο της πρωτεΐνης. Το μοντέλο "dock, lock and latch" έχει προταθεί για το μηχανισμό δράσης της Fbe και άλλων συνθετικών πεπτιδίων που συνδέονται με το ινωδογόνο (Becker et al., 2014). Σύμφωνα με αυτό, το ινωδογόνο "προσαράζει" σε μία θέση που σχηματίζεται από δύο περιοχές της Fbe που αναδιπλώνονται με τρόπο παρόμοιο της IgG. Κατόπιν η πρωτεΐνη αλλάζει διαμόρφωση "κλειδώνοντας" τη σύνδεση με το ινωδογόνο, ενώ το σύμπλοκο σταθεροποιείται με μία C-τελική περιοχή-"σύρτη". Όπως και άλλες πρωτεΐνες του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων, η Fbe έχει μία περιοχή με πολλές SD επαναλήψεις που τη συνδέει με το κυτταρικό τοίχωμα. Αντισώματα κατά της Fbe έχουν βρεθεί στον ορό ασθενών, υποδηλώνοντας ότι η πρωτεΐνη αυτή παράγεται κατά τη διάρκεια λοίμωξης (McCrea et al., 2000). 74

75 Embp Η εξωκυτταρική πρωτεΐνη Embp είναι ένα μεγάλου μεγέθους επιφανειακό μόριο μεγέθους 1 MDa. Ένα υποπροϊόν της, μεγέθους 460 kda, συμμετέχει στην δημιουργία πρωτεϊνικών biofilm από τον S. epidermidis. Επιπρόσθετα, το μόριο αυτό μεσολαβεί στη σύνδεση των κυττάρων στην ινωδονεκτίνη και επομένως παίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην προσκόλληση όσο και στη συσσώρευση των βακτηρίων κατά το σχηματισμό βιομεμβράνης (Otto, 2012) ΑΥΤΟΛΥΣΙΝΕΣ Μία ακόμη κατηγορία προσκολλητινών που παράγονται από τους σταφυλοκόκκους είναι οι αυτολυσίνες. Αυτές οι μη ομοιοπολικά συνδεδεμένες πρωτεΐνες συνδέονται με την επιφάνεια του βακτηρίου με ιοντικές ή υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και έχουν τόσο ενζυματική όσο και προσκολλητική ικανότητα. Γενικότερα, οι αυτολυσίνες θεωρείται ότι παίζουν ρόλο στην ανακύκλωση του κυτταρικού τοιχώματος, την κυτταρική διαίρεση και την λύση των βακτηρίων μετά την επίδραση αντιβιοτικών. Το εξωκυττάριο DNA που απελευθερώνεται από τη δράση των αυτολυσινών αποτελεί βασικό συστατικό του στρώματος μεταξύ των βακτηρίων μέσα στις βιομεμβράνες, ιδίως σε PIA-ανεξάρτητα biofilms. Η αυτολυσίνη AtlE του S. epidermidis είναι ένα επιφανειακό μόριο μεγέθους 148 kda που μεσολαβεί στην προσκόλληση στο πολυστυρένιο, αλλά και στο σχηματισμό biofilm (Linke, 2011). Μία ομόλογη αυτολυσίνη Atl μεγέθους 137 kda με παρόμοια δράση έχει περιγραφεί και στον S. aureus (Biswas et al., 2006). Η AtlE και η Atl έχουν παρόμοια δομή και μετά από πρωτεολυτική επεξεργασία δίνουν δύο ενεργά μόρια με βακτηριολυτική δράση, μία Ν-τελική αμιδάση και μία C-τελική γλυκοζαμινιδάση. Τα μόρια αυτά συνδέονται με τρεις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (R1,R2,R3) που συμμετέχουν στην δέσμευση στην πεπτιδογλυκάνη. Κάθε αλληλουχία αποτελείται από περίπου 170 υπομονάδες με επαναλαμβανόμενα μοτίβα διπεπτιδίων γλυκίνης-τρυπτοφάνης. Παρόμοιες δομές έχουν περιγραφεί και σε επιφανειακές πρωτεΐνες του βακτηρίου Listeria monocytogenes που μεσολαβούν στην προσκόλληση και είσοδο στα ευκαρυωτικά κύτταρα. 75

76 Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι οι αυτολυσίνες συνδέονται με το ινωδογόνο, την ινωδονεκτίνη και τα ενδοθηλιακά κύτταρα του ανθρώπου. Επιπλέον, η AtlE συμμετέχει στην είσοδο των μικροβίων στα ενδοθηλιακά κύτταρα χρησιμοποιώντας ως υποδοχέα την πρωτεΐνη θερμικής καταπληξίας Hsc70 των κυττάρων (Hirschhausen et al., 2010). Αυτός ίσως είναι ο σημαντικότερος μηχανισμός εισόδου των πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Άλλες πολυλειτουργικές αυτολυσίνες είναι η Aaa του S. aureus και η ομόλογη Aae του S. epidermidis. Και οι δύο έχουν βακτηριολυτική δράση και ικανότητα σύνδεσης στο ινωδογόνο και την ινωδονεκτίνη με υψηλή συγγένεια (Heilmann et al., 2005) ΤΕΙΧΟÏΚΑ ΟΞΕΑ Τα τειχοϊκά οξέα είναι χαρακτηριστικά συστατικά του κυτταρικού τοιχώματος των Gram-θετικών βακτηρίων, το οποίο αποτελείται κυρίως (50%-90%) από πεπτιδογλυκάνη (μουκοπεπτίδιο). Σε αυτήν προστίθενται τα τειχοϊκά οξέα και οι πολυσακχαρίτες. Τα τειχοϊκά οξέα είναι πολυμερή γλυκερίνης και ριβιτόλης που ενώνονται μεταξύ τους με φωσφορικές ομάδες. Οι υδροξυλομάδες της γλυκερίνης ή ριβιτόλης συνδέονται με αμινοξέα ή αμινοσάκχαρα. Διακρίνονται σε λιποτειχοϊκά οξέα, τα οποία συνδέονται με την κυτταρική μεμβράνη μέσω ενός λιπιδικού τμήματος και σε τοιχωματικά τειχοϊκά οξέα, τα οποία συνδέονται ομοιοπολικά με την πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος. Τα τειχοϊκά οξέα παίζουν διάφορους ρόλους στην φυσιολογία και παθογένεια των σταφυλοκόκκων, συμβάλλοντας στην προσκόλληση των βακτηρίων, στον αποικισμό και στην ανάπτυξη φλεγμονής (Gross et al., 2001, Weidenmaier and Peschel, 2008). Στον S. epidermidis, τα τειχοϊκά οξέα διευκολύνουν την προσκόλληση στην ινωδονεκτίνη (Hussain et al., 2001). Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες επιβεβαίωσαν τον ρόλο των τειχοϊκών οξέων του κυτταρικού τοιχώματος στο σχηματισμό biofilm από στελέχη του είδους S. epidermidis (Holland et al., 2011). Αν και δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως η συμβολή τους στη διαφυγή από το ανοσολογικό σύστημα, ο ρόλος τους στο σχηματισμό biofilm τα καθιστά σημαντικά στην επιβίωση από τους αμυντικούς μηχανισμούς του ξενιστή. 76

77 Επιπρόσθετα, ο S. epidermidis έχει γονίδια υπεύθυνα για την προσθήκη D-αλανίνης στα τειχοϊκά οξέα, μία τροποποίηση που σε άλλα βακτήρια, όπως ο S. aureus, φαίνεται να προστατεύει από τη δράση αντιμικροβιακών πεπτιδίων ΑΠΟΚΟΛΛΗΣΗ ΤΟΥ BIOFILM Μετά την ωρίμανση του biofilm, βακτήρια μόνα τους ή σε ομάδες μπορούν να αποκολληθούν και να διασπαρούν μέσω της κυκλοφορίας του αίματος. Με τον τρόπο αυτό αποικίζουν διάφορες περιοχές του σώματος με τελικό αποτέλεσμα την εμφάνιση δευτεροπαθών ή μεταστατικών λοιμώξεων. Η αποκόλληση των βακτηρίων επιτυγχάνεται με διάφορους μηχανισμούς, περιλαμβανομένων εξωκυττάριων ενζύμων και των phenol-soluble modulins (PSMs) (Becker et al., 2014). Ανάλογα με τα μακρομόρια που συνδέουν τα βακτήρια μεταξύ τους μέσα στη βιομεμβράνη, συμμετέχουν διαφορετικά εξωκυττάρια ένζυμα όπως πρωτεάσες (που διασπούν πρωτεΐνες περιλαμβανομένων των Bap, Aap και Embp), υδρολάσες σακχάρων (που διασπούν τον πολυσακχαρίτη PIA) και νουκλεάσες (που διασπούν το εξωκυττάριο DNA). Στον S. epidermidis, το ένζυμο DNAase I μειώνει το σχηματισμό biofilm, αλλά δεν μπορεί να αποσυνθέσει τις ήδη σχηματισμένες βιομεμβράνες, υποδηλώνοντας ότι στο είδος αυτό οι νουκλεάσες παίζουν μεγαλύτερο ρόλο στην αρχική προσκόλληση των βακτηρίων και στην αποσύνθεση μόνο νεοσύστατων biofilms (Izano et al., 2008). Σε πολλά σταφυλοκοκκικά biofilms η σύνδεση των βακτηρίων γίνεται με πρωτεΐνες και τειχοϊκά οξέα και όχι με τον πολυσακχαρίτη PIA. Στις περιπτώσεις αυτές, επώαση με DNAase I και πρωτεάσες καταστρέφει, έστω εν μέρει, τα biofilms. Ως εκ τούτου, το εξωκυττάριο DNA φαίνεται να παίζει σταθεροποιητικό ρόλο ελλείψει του PIA και τότε η δράση των νουκλεασών είναι σημαντική. Οι PSMs είναι μικρά, αμφιφιλικά πεπτίδια που ελέγχονται από το agr. Διακρίνονται σε α-πεπτίδια με μήκος αμινοξέων και β-πεπτίδια, που αποτελούνται από αμινοξέα. Στον S. epidermidis έχουν περιγραφεί επτά PSMs. Είναι πιθανό, λόγω της αμφιφιλικής τους φύσης, να δρουν ως surfactants με τελικό αποτέλεσμα τη διάσπαση των biofilms και την απελευθέρωση βακτηρίων (Yao et al., 2005). 77

78 7.4. ΤΟΞΙΝΕΣ Σημαντική θέση ανάμεσα στους μεταβολίτες που παράγονται από τα διάφορα είδη σταφυλοκόκκων κατέχουν οι εντεροτοξίνες, οι οποίες είναι τοξικές για τον άνθρωπο μετά από κατανάλωση μολυσμένων τροφών (Bergdoll et al., 1974). Οι σταφυλόκοκκοι παράγουν μια ποικιλία από εντεροτοξίνες (Α έως U, Sea-Seu), οι οποίες είναι βασικές πρωτεΐνες, σε διάφορα υποστρώματα, περιλαμβανομένων και διαφόρων τροφίμων. Αυτές οι δομικά παρόμοιες τοξίνες παράγονται κυρίως από τον S. aureus αλλά και διάφορα είδη πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων όπως ο S. epidermidis, ο S. intermedius και ο S. hyicus. Αν και θεωρείται κτηνιατρικό παθογόνο, ο S. intermedius έχει απομονωθεί από δείγματα βουτύρου και μαργαρίνης κατά τη διάρκεια έξαρσης κρουσμάτων τροφικής δηλητηρίασης (Talan et al., 1989). Παρόμοια και ο S. epidermidis έχει συσχετιστεί με περιπτώσεις γαστρεντερίτιδας. Διάφοροι σταφυλόκοκκοι, πλην του πλέον παθογόνου S. aureus, έχουν ενοχοποιηθεί ως εντεροτοξινογόνοι όταν βρίσκονται σε μεγάλους πληθυσμούς σε τρόφιμα ύποπτα για τροφικές δηλητηριάσεις. Όταν οι μικροοργανισμοί αυτοί πολλαπλασιάζονται μέσα στις τροφές μπορεί να παράγουν τοξίνες σε επίπεδα ικανά να προκαλέσουν νόσο σε όποιον τις καταναλώσει. Τα συμπτώματα ξεκινούν συνήθως 2-6 ώρες μετά την κατανάλωση του μολυσμένου τροφίμου και περιλαμβάνουν ναυτία, έμετους, κοιλιακές κράμπες και εξάντληση. Υπάρχουν διάφοροι τύποι σταφυλοκοκκικών εντεροτοξινών που έχουν παρόμοια δομή και βιολογική δράση αλλά διαφέρουν στην ανοσογονικότητα και αναγνωρίζονται με ορολογικές μεθόδους ως ξεχωριστά μόρια. Είναι πρωτεΐνες με μονή πολυπεπτιδική αλυσίδα και μοριακά βάρη Εμφανίζουν ανθεκτικότητα στα πρωτεολυτικά ένζυμα, όπως η θρυψίνη και η πεψίνη, με αποτέλεσμα να διέρχονται ακέραιες από το γαστρεντερικό σύστημα. Η συγκέντρωση εντεροτοξίνης που απαιτείται για την πρόκληση συμπτωμάτων δεν είναι γνωστή. Δεδομένα από μελέτες εξάρσεων κρουσμάτων γαστρεντερίτιδας ενισχύουν την άποψη ότι απαιτείται κατανάλωση τουλάχιστον 100 ng εντεροτοξίνης Α (του τύπου που απαντάται συχνότερα) για την πρόκληση νόσου. Αν και υπάρχουν διαφορές μεταξύ των σταφυλοκοκκικών εντεροτοξινών και των στρεπτοκοκκικών τοξινών, έχουν παρόμοια δομή και σημεία σύνδεσης στους υποδοχείς. Κατατάσσονται σε πέντε ομάδες με βάση την αλληλουχία των αμινοξέων και τον τρόπο σύνδεσης στο Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας τύπου 2 (MHC II) (Fraser and Proft, 2008). 78

79 Μεταξύ των διαφόρων ορολογικών τύπων, οι εντεροτοξίνες Sea, Sed και See έχουν την μεγαλύτερη ομολογία στην αλληλουχία των αμινοξέων, που κυμαίνεται από 53 έως 81%, ενώ η εντεροτοξίνη Seb έχει ομοιότητα 50-66% με την Sec. Η τοξίνη του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας TSST-1 έχει μικρή ομολογία με τις εντεροτοξίνες, καθώς έχει μικρότερη αλληλουχία αμινοξέων, χωρίς κυστεϊνη και διαφορετικό τρόπο σύνδεσης στον υποδοχέα TCR (McCormick et al., 2003). Από την TSST-1 απουσιάζει μία δισουλφιδική αγκύλη (disulfide loop), η οποία ίσως είναι υπεύθυνη για την εμετογόνο δράση των εντεροτοξινών, καθώς έχει βρεθεί ότι μετάλλαξη στην περιοχή αυτή καταργεί την αντίστοιχη δράση της εντεροτοξίνης Sec (Wang et al., 2009). Η TSST-1 κωδικοποιείται από το γονίδιο tst, το οποίο βρίσκεται σε ένα μεταθετό γενετικό στοιχείο του βακτηριακού χρωμοσώματος (Blomster- Hautamaa et al., 1986). Αρχικά παράγεται ένα πρόδρομο μόριο με 234 αμινοξέα και ακολουθεί αποκοπή ενός τμήματος μήκους 40 αμινοξέων από το αμινοτελικό άκρο και έκκριση της ώριμης πρωτεΐνης, η οποία αποτελείται από μία πολυπεπτιδική αλυσίδα με μοριακό βάρος και ισοηλεκτρικό σημείο 7.2. Αν και η TSST-1 περιέχει αρκετά υδρόφοβα αμινοξέα, είναι διαλυτή στο νερό και ανθεκτική στην υψηλή θερμοκρασία και στην πρωτεόλυση. Διατηρεί την δραστικότητα της ακόμα και μετά από βρασμό επί μία ώρα και δεν επηρεάζεται από τη θρυψίνη (Dinges et al., 2000). Το σύνδρομο τοξικής καταπληξίας που προκαλείται από την τοξίνη αυτή εκδηλώνεται με μία ποικιλία συμπτωμάτων όπως πυρετό, υπόταση, απολέπιση σε παλάμες και πέλματα, εξάνθημα, ανεπάρκεια πολλαπλών οργάνων και τελικά θάνατο (Bannerman et al., 1997, CDC, 1997). Συχνές επιπλοκές είναι η εμφάνιση συνδρόμου αναπνευστικής ανεπάρκειας και διάχυτης ενδαγγειακής πήξης. Περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1978 από τον Todd και τους συνεργάτες του σε παιδιά με λοίμωξη από S. aureus (Todd et al., 1978), ενώ αργότερα συσχετίστηκε με την έμμηνο ρύση και την χρήση ταμπόν (Kass and Parsonnet, 1987). Οι σταφυλοκοκκικές εντεροτοξίνες και η TSST-1 έχουν δράση υπεραντιγόνου (Krakauer, 2013). Συνδέονται στο MHC II των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων και σε συγκεκριμένες περιοχές της β αλυσίδας (Vβ) του TCR υποδοχέα των Τ- λεμφοκυττάρων του ανθρώπου με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση αυτών (Proft and Fraser, 2003). Τα υπεραντιγόνα δεσμεύονται σε κοινές, διατηρημένες περιοχές του MHC II με σχετικά υψηλή συγγένεια ( Μ). Υπάρχουν τουλάχιστον δύο διακριτές περιοχές σύνδεσης στο MHC II, μία κοινή, χαμηλής συγγένειας θέση στην 79

80 σταθερή αλυσίδα α του MHC II και μία υψηλότερης συγγένειας θέση στην β αλυσίδα (Mollick et al., 1991). Η εντεροτοξίνη Sea δημιουργεί μία διασύνδεση δεσμευόμενη ταυτόχρονα και στις δύο αυτές θέσεις του MHC II των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, με αποτέλεσμα να παραμένει εκεί για περισσότερο χρόνο ενισχύοντας τις βιολογικές δράσεις των κυττάρων αυτών (Pless et al., 2005). Ο όρος υπεραντιγόνο χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά από τον Kappler και τους συνεργάτες του το 1989 για να περιγράψουν την ικανότητα των συγκεκριμένων τοξινών να διεγείρουν σε μεγάλο βαθμό το ανοσολογικό σύστημα (Choi et al., 1989). Μία δεκαετία μελετών αποκάλυψε τα κοινά δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών αυτών και τον τρόπο με τον οποίο εξασκούν την ισχυρή ανοσολογική τους δράση. Σε αντίθεση με τα κοινά αντιγόνα, τα υπεραντιγόνα παρακάμπτουν την φυσιολογική επεξεργασία από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και καθιστούν ένα μεγάλο ποσοστό (5-30%) των Τ-λεμφοκυττάρων ικανά να πολλαπλασιάζονται σε μεγάλο βαθμό (Kotzin et al., 1993). Η επακόλουθη αυξημένη απελευθέρωση προφλεγμονωδών κυτταροκινών και χημειοκινών από τα αντιγονοπαρουσιαστικά, τα Τ-λεμφοκύτταρα και άλλους τύπους κυττάρων έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση των συμπτωμάτων. Ο παράγων νέκρωσης όγκου a (TNF-a), η ιντερφερόνη γ (IFN-γ) και η ιντερλευκίνη 1 (IL-1) προκαλούν καταστροφή των ιστών και μαζί με μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) και ιστικό παράγοντα που απελευθερώνονται από τα ενεργοποιημένα κύτταρα ενεργοποιούν τις οδούς της φλεγμονής και της πήξης στον ξενιστή (Mattsson et al., 2003). Η αυξημένη έκφραση μορίων προσκόλλησης και χημειοκινών μεσολαβούν στην μετακίνηση λευκοκυττάρων στα σημεία ιστικής βλάβης, ενώ η ιντερλευκίνη 2 (IL-2) που παράγεται από τα ενεργοποιημένα Τ- λεμφοκύτταρα προκαλεί αγγειοδιαστολή και οίδημα (Neumann et al., 1997). Οι ενεργείς ρίζες οξυγόνου που παράγονται από τα ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα αυξάνουν την διαπερατότητα των αγγείων και προκαλούν οξεία βλάβη στους πνεύμονες (Mattsson et al., 2003). Οι παραπάνω αντιδράσεις λαμβάνουν χώρα ταχέως μετά την έκθεση στο υπεραντιγόνο και ακολουθεί υπόταση, ανεπάρκεια πολλαπλών οργάνων και θάνατος. Μέχρι και σήμερα δεν έχει βρεθεί αποτελεσματική θεραπεία για την αντιμετώπιση των συμπτωμάτων που προκαλούνται από τις τοξίνες που δρουν ως υπεραντιγόνα, με εξαίρεση την ενδοφλέβια ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη (Darenberg et al., 2004). Μελλοντικός στόχος είναι η δημιουργία αντισωμάτων κατά των τοξινών, 80

81 που μπορεί να έχουν και διασταυρούμενη δράση όντας αποτελεσματικά έναντι περισσότερων του ενός αντιγόνου. Τέτοια αντισώματα έχουν βρεθεί στον ορό ασθενών με βακτηριαιμία από S. aureus κατά την ανάρρωση τους (Grumann et al., 2011). Βέβαια, η χρήση αντισωμάτων είναι αποτελεσματική μόνο στα αρχικά στάδια της έκθεσης, καθώς δρουν πριν τη δέσμευση του υπεραντιγόνου στον υποδοχέα και την ενεργοποίηση των κυττάρων. Άλλοι θεραπευτικοί στόχοι είναι η δημιουργία πεπτιδίων που να έχουν ομοιότητες με διατηρημένες περιοχές των μορίων των τοξινών, ώστε να δεσμεύουν τις θέσεις σύνδεσης τους στους υποδοχείς των κυττάρων, όπως επίσης και η παραγωγή αναστολέων της μετάδοσης του σήματος ενεργοποίησης των κυττάρων μετά τη σύνδεση αντιγόνου-υποδοχέα, αναστολέων των παραγόμενων κυτταροκινών και ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων που μπλοκάρουν την ενεργοποίηση των κυττάρων του ανοσολογικού συστήματος, περιλαμβανομένων των μακροφάγων και των Τ-λεμφοκυττάρων (Krakauer, 2013) ΕΙΔΙΚΟΙ ΛΟΙΜΟΓΟΝΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΤΟΥ S. lugdunensis Ο S. lugdunensis θεωρείται περισσότερο παθογόνο είδος από τους άλλους CNS, καθώς παράγει αρκετούς λοιμογόνους παράγοντες, όπως θερμοανθεκτική DNάση, παράγοντα συγκόλλησης, έναν εξωκυττάριο γλυκοκάλυκα, λιπάση, αιμολυσίνη και ένζυμο τροποποίησης των λιπαρών οξέων. Επίσης, είναι ικανός να προσδένεται με το ανθρώπινο κολλαγόνο, την ινωδονεκτίνη, το ινωδογόνο, την ανθρώπινη IgG, τις λαμινίνη και βιτρονεκτίνη (Lambe et al., 1990) Αντοχή στα αντιβιοτικά. Σε αντίθεση με τους άλλους CNS, ο S. lugdunensis παραμένει σε μεγάλο βαθμό ευαίσθητος σε πολλές ομάδες αντιβιοτικών (Frank et al., 2008). Η ευαισθησία αυτή δεν εξαρτάται από την ανατομική περιοχή της λοίμωξης. Σε μελέτη ασθενών με ορθοπεδικές λοιμώξεις από CNS πλην του S. epidermidis, μεγάλο ποσοστό αντοχής παρατηρήθηκε σε στελέχη των ειδών S. haemolyticus, S. hominis, S. warneri, S. capitis, όχι όμως και στα στελέχη S. lugdunensis που ελέγχθησαν (Arciola et al., 81

82 2006). Ο S. lugdunensis παράγει β-λακταμάση, όμως η συχνότητα παραγωγής της διαφέρει σε στελέχη από την Βόρεια Αμερική και την Ευρώπη. Σε συμφωνία με την γενική ευαισθησία του μικροοργανισμού, η ανθεκτικότητα στην οξακιλλίνη παραμένει χαμηλή και ο έλεγχος για φορεία του γονιδίου meca στις περισσότερες μελέτες έχει αποβεί αρνητικός (Frank et al., 2008). Παρά τη γενικότερη ευαισθησία του μικροοργανισμού στα αντιβιοτικά, έχουν αναφερθεί στελέχη με αντοχή στα γλυκοπεπτίδια όπως η βανκομυκίνη και η τεϊκοπλανίνη. Αν και η χορήγηση βανκομυκίνης συνήθως δεν είναι απαραίτητη λόγω της μεγάλης ευαισθησίας του S. lugdunensis στα β-λακταμικά, η εμφάνιση αντοχής στα γλυκοπεπτίδια παγκοσμίως απαιτεί περαιτέρω έρευνα (Frank et al., 2008) Σχηματισμός biofilm. Λίγο μετά την περιγραφή του S. lugdunensis, ο Lambe και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι ένας γλυκοκάλυκας, που περιγράφηκε ως ένα αρνητικά φορτισμένο πολυσακχαριδικό στρώμα που περιέβαλλε αποικίες των βακτηρίων, ήταν ορατός με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετά από χρώση των κυττάρων με ruthenium red (Lambe et al., 1990). Η φορεία του οπερονίου ica, που είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση του πολυσακχαρίτη PIA στους σταφυλοκόκκους, περιγράφηκε για πρώτη φορά στον S. lugdunensis από τον Longshaw το 2001 (Sandoe and Longshaw, 2001). Το οπερόνιο icaadbc έχει ομολογία 30-60% με αυτό των S. aureus, S. epidermidis και S. caprae. Η ρυθμιστική περιοχή icar δεν έχει βρεθεί στο γονιδίωμα του S. lugdunensis. Σε μία μελέτη (Pereira et al., 2012) μεταξύ των 23 κλινικών στελεχών S. lugdunensis που απομονώθηκαν από επτά νοσοκομεία της Βραζιλίας, μόνο τα 14 (60.9%) παρήγαγαν biofilm αν και όλα έφεραν το οπερόνιο ica. Επιπλέον, ανάλυση της σύνθεσης της βιομεμβράνης με τη χρήση πρωτεολυτικών ενζύμων έδειξε ότι το biofilm είναι κυρίως πρωτεϊνικής φύσης. 82

83 Αντίσταση στη λυσοζύμη. Η λυσοζύμη είναι σημαντικό ένζυμο του ανοσοποιητικού του ανθρώπου κατά των μικροβιακών λοιμώξεων. Ο S. lugdunensis είναι ανθεκτικός σε 400 mg/ml λυσοζύμης. Διάφοροι παθογόνοι σταφυλόκοκκοι, όπως ο S. aureus, παρουσιάζουν αντοχή σε υψηλές συγκεντρώσεις του ενζύμου. Στον S. aureus η ιδιότητα οφείλεται σε μία μεμβρανική Ο-ακετυλοτρανσφεράση πεπτιδογλυκάνης (OatA), η οποία συμβάλλει στην ακετυλίωση του Ν-ακετυλομουραμικού του κυτταρικού τοιχώματος, αποτρέποντας την σύνδεση της λυσοζύμης. Ο S. lugdunensis φέρει ένα ομόλογο γονίδιο oata με παρόμοια λειτουργία (Bera et al., 2006) Πρωτεΐνη που δεσμεύει τον vwf. Ο παράγοντας von Willebrand (vwf) είναι μία γλυκοπρωτεΐνη του πλάσματος που παράγεται από τα αιμοπετάλια και τα ενδοθηλιακά κύτταρα και συμμετέχει σε διάφορα στάδια της πήξης του αίματος, όπως στη σύνδεση στα αιμοπετάλια και το υπενδοθηλιακό κολλαγόνο μετά από βλάβη του αγγείου και στη σταθεροποίηση του παράγοντα VIII του καταρράκτη της πήξης. Το γονίδιο vwbl κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη 2060 αμινοξέων (vwbl) που δεσμεύει τον παράγοντα vwf (Nilsson et al., 2004) Συνεργιστική αιμολυσίνη (Slush) Ο Donvito και οι συνεργάτες του απομόνωσαν τρεις μικρές πρωτεΐνες 43 αμινοξέων οι οποίες είχαν συνδυαστική αιμολυτική δράση με την β-τοξίνη του S. aureus σε τρυβλία με αιματούχο άγαρ (Donvito et al., 1997). Η μελέτη της αλληλουχίας τους μετά από επεξεργασία με θρυψίνη έδειξε ομόλογες περιοχές 10 και 23 αμινοξέων. Οι πρωτεΐνες αυτές κωδικοποιούνται από τον γενετικό τόπο slush, ο οποίος περιλαμβάνει τρία ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης που ονομάστηκαν Slush-A, Slush-B, Slush-C (S. lugdunensis synergistic hemolysin). Η αιμόλυση των ερυθρών αιμοσφαιρίων είναι σημαντικός λοιμογόνος παράγοντας. Η έκφραση του slush ελέγχεται από το σύστημα agr, όμως η ρυθμιστική περιοχή είναι εκτός του agr (Donvito et al., 1997). 83

84 Εικόνα 10. Συνεργιστική αιμόλυση σε αιματούχο άγαρ με αίμα προβάτου. Οι αιμολυσίνες του S. lugdunensis (οριζόντιες αποικίες) που παράγονται από την περιοχή slush δρουν συνεργικά με την β-αιμολυσίνη του S. aureus (κάθετες αποικίες) και προκαλούν ζώνη πλήρους αιμόλυσης στο αιματούχο άγαρ (Frank et al., 2008) Πρωτεΐνη που δεσμεύει το ινωδογόνο. Η πρωτεΐνη που δεσμεύει το ινωδογόνο (fibrinogen-binding protein, Fbl) αποτελείται από 881 αμινοξέα και ανήκει στην οικογένεια των Sdr πρωτεϊνών επιφανείας. Αποτελείται από ένα Ν-τελικό πεπτίδιο που ακολουθείται από τις περιοχές Ν1, Ν2, Ν3 που έχουν σημαντική ομολογία (περίπου 60%) με τον clumping factor A (ClfA) του S. aureus. Η περιοχή που δεσμεύει την γ-αλυσίδα του ινωδογόνου εδράζεται μεταξύ των περιοχών Ν2 και Ν3. Τα αντισώματα εναντίον του ClfA του S. aureus αναστέλλουν την δέσμευση του ινωδογόνου από την Fbl, γεγονός που επιβεβαιώνει την ομοιότητα της με τον ClfA. Οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με την ίδια περιοχή του ινωδογόνου, αν και ο ClfA δεσμεύει το ινωδογόνο με 84

85 δεκαπλάσια συγγένεια (Mitchell et al., 2004). Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι η ανίχνευση του γονιδίου fbl μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση του S. lugdunensis, καθώς το γονίδιο αυτό είναι διατηρημένο σε όλα τα στελέχη του είδους (Chatzigeorgiou et al., 2010). Εικόνα 11. Σχηματική αναπαράσταση της δομής των πρωτεϊνών Fbl του S. lugdunensis και ClfA του S. aureus. Αναγράφονται τα ποσοστά ομολογίας των περιοχών. Από την Fbl απουσιάζει η περιοχή SLAAVA, ενώ και η επαναλαμβανόμενη περιοχή R διαφέρει από αυτή του ClfA (Mitchell et al., 2004) Αυτολυσίνη (AtlL). Το γονίδιο atll έχει μέγεθος 3837 bp και είναι υπεύθυνο για την παραγωγή μίας υδρολάσης της πεπτιδογλυκάνης του S. lugdunensis (Bourgeois et al., 2009). Η AtlL, όπως ονομάζεται, είναι μία αυτολυσίνη με δύο λειτουργίες. Τα δύο ενζυματικά κέντρα έχουν δραστικότητες αμιδάσης (N-acetylmuramoyl-l-alanine amidase) και Ν- ακετυλογλυκοζαμινιδάσης στην πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος και συνδέονται με τρεις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες που περιέχουν μοτίβα διπεπτιδίων γλυκίνης-τρυπτοφάνης. Οι αλληλουχίες αυτές συμβάλλουν στην αλληλεπίδραση με στοιχεία του κυτταρικού τοιχώματος του βακτηρίου όπως τα 85

86 τειχοϊκά και λιποτειχοϊκά οξέα έτσι ώστε οι δραστικές ενζυμικές περιοχές να έρθουν κοντά στο υπόστρωμα τους, την πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος (Bourgeois et al., 2009). Η AtlL παράγεται καθ' όλη τη διάρκεια ζωής του σταφυλοκόκκου, κυρίως όμως στα πρώιμα στάδια της εκθετικής ανάπτυξης του βακτηρίου, παίζοντας προφανώς ρόλο στην κυτταρική διαίρεση. Υπάρχουν αρκετές ομοιότητες με τις αυτολυσίνες Atl του S. aureus (Oshida et al., 1995) και AtlE του S. epidermidis (Heilmann et al., 1997), γεγονός που υποδηλώνει ότι η AtlL είναι η κύρια αυτολυσίνη του S. lugdunensis. Οι αυτολυσίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ διάσπασης και σύνθεσης της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώματος και στη διαίρεση των κυττάρων (Smith et al., 2000). Εικόνα 12. Δομή των αυτολυσινών AtlL του Staphylococcus lugdunensis, Atl του S. aureus και AtlE του S. epidermidis. Τα ποσοστά ομοιότητας μεταξύ της AtlL και των άλλων δύο αυτολυσινών φαίνονται στην εικόνα. SP: signal peptide, PP: propeptide, AM: N-acetylmuramoyl-l-alanine amidase, R: repeated sequence, GL: N-acetylglucosaminidase, βέλη:glycine tryptophane (GW) dipeptide (Bourgeois et al., 2009). 86

87 8. ΕΛΕΓΧΟΣ ΛΟΙΜΟΓΟΝΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ Η ρύθμιση της παθογένειας των σταφυλοκόκκων βασίζεται σε δύο συστήματα, το agr και το σύστημα luxs/a1-2. Ένα άλλο παγκόσμιο ρυθμιστικό σύστημα είναι το sar. Η έκφραση του agr και του sar επηρεάζεται από τον μεταγραφικό παράγοντα σ β, ο οποίος ρυθμίζει την ανταπόκριση πολλών βακτηριακών ειδών στο stress. Tα agr και luxs/aι-2 ανήκουν στα quorum-sensing systems, τα οποία είναι συστήματα διακυτταρικής επικοινωνίας των βακτηρίων με τη διαμεσολάβηση μικρών αυτοεπαγώμενων πεπτιδίων. Σε μικρές πυκνότητες βακτηρίων η συγκέντρωση των πεπτιδίων αυτών είναι χαμηλή. Με την αύξηση της συγκέντρωσης των βακτηρίων αυξάνει και η έκφραση των πεπτιδίων αυτών και μόλις ξεπεραστεί κάποιος ουδός, συνήθως στην εκθετική φάση ανάπτυξης, ενεργοποιούνται μεταγραφικοί παράγοντες οι οποίοι προάγουν ή αναστέλλουν την έκφραση γονιδίων-στόχων (Becker et al., 2014) Accessory gene regulator system (agr) Το οπερόνιο agr είναι σημαντικό για τη ρύθμιση των λειτουργιών των σταφυλοκόκκων και αποτελείται από τέσσερα γονίδια (agra, agrc, agrd, agrb) τα οποία μεταγράφονται μαζί και ένα γονίδιο το οποίο μεταγράφεται αντίστροφα (Εικόνα 13). Ο έλεγχος του συστήματος γίνεται μέσω ενός αυτο-επαγόμενου πεπτιδίου (AIP), το οποίο παράγεται από τα βακτήρια. Ο αυτοεπαγωγέας είναι ένα οκταπεπτίδιο με λακτονικό δακτύλιο το οποίο κωδικοποιείται από το γονίδιο agrd. Συντίθεται ως ένα μεγαλύτερο πολυπεπτίδιο και στη συνέχεια τροποποιείται από την πρωτεΐνη ΑgrB και εκκρίνεται στον εξωκυττάριο χώρο. Όταν ο πληθυσμός των βακτηρίων αυξηθεί αρκετά και η συγκέντρωση του AIP ξεπεράσει έναν συγκεκριμένο ουδό, το πεπτίδιο συνδέεται στον διαμεμβρανικό υποδοχέα AgrC στην επιφάνεια του κυττάρου. Ακολουθεί φωσφορυλίωση του AgrA που με τη σειρά της οδηγεί στην μεταγραφή επαγωγέων του agr. Ο παράγοντας P2 προάγει τη μεταγραφή των agra, agrb, agrc, και agrd, ενώ ο P3 αυξάνει την παραγωγή του RNAIII το οποίο δρα ως εκτελεστικό μόριο του agr οπερονίου και οδηγεί στη μεταγραφή λοιμογόνων παραγόντων (Kong et al., 2006). Το RNAIII ελέγχει τη μεταγραφή άλλων γονιδίων-στόχων, όπως το γονίδιο της δ-τοξίνης και άλλων παραγόντων παθογένειας και προάγει την παραγωγή πρωτεασών, λιπασών και νουκλεασών που 87

88 συμβάλλουν στην αποκόλληση του biofilm και την επιμονή της λοίμωξης. Έχει βρεθεί ότι όταν η βακτηριακή πυκνότητα είναι χαμηλή και δεν λειτουργεί το σύστημα agr παράγονται κυρίως προσκολλητίνες όπως η AtlE. Αντίθετα, όταν αυξηθεί η πυκνότητα των βακτηρίων, και αναλόγως η συγκέντρωση του αυτοεπαγωγέα, ενεργοποιείται το σύστημα agr και η παραγωγή των λοιμογόνων παραγόντων, ενώ αναστέλλεται η παραγωγή των παραγόντων προσκόλλησης και η παραγωγή biofilm (Kong et al., 2006). Εικόνα 13. Διάταξη του συστήματος ελέγχου agr των σταφυλοκόκκων (Cegelski et al., 2008). 88

89 Τα πεπτίδια που ενεργοποιούν το σύστημα agr ενός είδους αναστέλλουν το σύστημα άλλων ειδών και για το λόγο αυτό θεωρούνται παράγοντες βακτηριακού ανταγωνισμού. Έχει βρεθεί ότι το πεπτίδιο του agr του S. epidermidis είναι ισχυρός αναστολέας των υποτύπων agr 1 έως 3 του S. aureus. Γενικώς, θεωρείται ότι η αναστολή που ασκεί ο S. epidermidis στον S. aureus είναι ισχυρότερη από ότι το αντίθετο. Αυτό μπορεί να είναι και ο λόγος που ο S. epidermidis είναι το επικρατέστερο από τα δύο είδη στις λοιμώξεις που σχετίζονται με προσθετικά υλικά (Otto et al., 2001) Σύστημα luxs/aι-2 Πολλά Gram-θετικά και Gram-αρνητικά βακτήρια φέρουν το σύστημα luxs/aι-2. Στον S. epidermidis και τον S. aureus το γονίδιο luxs είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση ενός παραγώγου φουρανόνης που ονομάζεται αυτο-επαγωγέας AΙ-2. Η παραγωγή του AΙ-2 είναι ανάλογη της ανάπτυξης των βακτηρίων και φτάνει στο μέγιστο στην εκθετική φάση ανάπτυξης των μικροβίων. Το σύστημα luxs/aι-2 αναστέλλει την παραγωγή biofilm από τον S. epidermidis μέσω καταστολής του οπερονίου icaadbc. Επιπλέον, ελέγχει τη σύνθεση λιπασών και PSMs (phenol-soluble modulins) που συμβάλλουν στην αποκόλληση του biofilm (Becker et al., 2014) Άλλα ρυθμιστικά συστήματα σταφυλοκόκκων Το μεταθετό στοιχείο IS256, έχει πολλαπλές θέσεις εισδοχής στο οπερόνιο ica, και επομένως, ανάλογα με την περιοχή ενσωμάτωσης, ίσως να αναστέλλει την παραγωγή του πολυσακχαρίτη ΡΙΑ. Έχει αναφερθεί ότι η πολλαπλή εισδοχή του IS256 στο icac μπορεί να οδηγήσει σε σύνθεση πρωτεϊνικής σύστασης βιομεμβράνης μέσω αύξησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Aap (Ziebuhr et al., 1999). Πιθανώς το IS256 συμβάλλει στην παθογένεια μέσω ενός μηχανισμού-δέκτη των περιβαλλοντικών αλλαγών κατά τη διάρκεια της λοίμωξης. Το σύστημα sar (staphylococal accessory regulator) είναι μία οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων. Ο παράγοντας SarΑ ελέγχει τη σύνθεση εξωπρωτεϊνών μεταβάλλοντας την έκφραση του agr και έχει 84% ομολογία μεταξύ των S. 89

90 epidermidis και S. aureus (Fluckiger et al., 1998). Προάγει την παραγωγή biofilm από τον S. epidermidis αφού συνδέεται με το icaa και αυξάνει την έκφραση του οπερονίου icaadbc και επομένως την παραγωγή PIA. Ο παράγοντας SarZ επάγει την φάση προσκόλλησης και το σχηματισμό PIA-εξαρτώμενου biofilm. Επιπλέον, επηρεάζει την έκφραση και άλλων λοιμογόνων παραγόντων, περιλαμβανομένων πρωτεασών και λιπασών που συμβάλλουν στην παθογένεια των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων. Σύνθεση του πολυσακχαρίτη PIA επάγεται και από τον παράγοντα SarΧ, μέσω αύξησης της μεταγραφής του icaadbc (Becker et al., 2014). Ο παράγοντας σ β (sigb) κωδικοποιείται από ένα γονίδιο του sigb οπερονίου. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι σε μεταλλαγμένα στελέχη S. epidermidis που δεν φέρουν το οπερόνιο αυτό παρατηρείται αύξηση της έκφρασης του icar με αποτέλεσμα μειωμένη έκφραση του οπερονίου icaadbc και επομένως ελάττωση της παραγωγής PIA και του σχηματισμού PIA-εξαρτώμενου biofilm (Handke et al., 2007). 90

91 9. ΒΙΟΫΛΙΚΑ Η επιστήμη των βιοϋλικών μελετά υλικά φυσικής ή τεχνητής προέλευσης που χρησιμοποιούνται ως πρόσθετα ή για να αντικαταστήσουν δυσλειτουργίες σε ιστούς του ανθρωπίνου σώματος. Με το πέρασμα των αιώνων, η βελτίωση των συνθετικών υλικών, των χειρουργικών τεχνικών και των μεθόδων αποστείρωσης, επέτρεψαν τη χρήση των βιοϋλικών με περισσότερους τρόπους. Υλικά όπως καθετήρες, χειρουργικά ράμματα, τεχνητές αρθρώσεις και σύνδεσμοι, βαλβίδες καρδιάς, βηματοδότες κ.α. χρησιμοποιούνται ευρέως για να αντικαταστήσουν ή να βελτιώσουν τη λειτουργία τραυματισμένων ή εκφυλισμένων ιστών ή οργάνων, να βοηθήσουν στη θεραπεία, να διορθώσουν μη φυσιολογικές αποκρίσεις και επομένως να βελτιώσουν την ποιότητα ζωής των ανθρώπων (Ratner and Bryant, 2004). Εικόνα 14. Χρήσεις προσθετικών υλικών στην ιατρική ( 91

92 Παρότι τα περισσότερα βιοϋλικά και οι ιατρικές συσκευές εκπληρώνουν ικανοποιητικά το σκοπό τους, συχνά δημιουργούν επιπλοκές και προβλήματα, οδηγώντας στην ανάγκη απομάκρυνσής το υς από το ανθρώπινο σώμα. Τα σημαντικότερα προβλήματα που σχετίζονται με τη χρήση εμφυτευμάτων και ιατρικών συσκευών και αυξάνουν τη νοσηρότητα, το κόστος νοσηλείας, αλλά και τη θνησιμότητα προκύπτουν από μηχανική αστοχία του βιοϋλικού (Ratner and Bryant, 2004), θρόμβωση περιοχών όπου αυτό έχει εμφυτευτεί, αλλά και την εμφάνιση λοιμώξεων που προκαλούνται από μικροοργανισμούς που αλληλεπιδρούν με τα προσθετικά υλικά (Ratner, 2004) ΜΕΤΑΛΛΙΚΑ ΒΙΟΫΛΙΚΑ Τα μέταλλα είναι τα συχνότερα χρησιμοποιούμενα βιοϋλικά, κυρίως λόγω της ικανότητας τους να αντέχουν το βάρος μεγάλων φορτίων. Αυτό τα καθιστά ιδανικά για χρήση σε αρθροπλαστικές ισχίου και γόνατος. Τα μεταλλικά προσθετικά υλικά έχουν ποικίλα σχήματα και μεγέθη, από απλά καλώδια και βίδες μέχρι ολόκληρες προσθετικές αρθρώσεις (Davis, 2003). Αν και μπορεί να χρησιμοποιηθούν και καθαρά μέταλλα, πολλές φορές χρησιμοποιούνται κράματα μετάλλων με βελτιωμένες ιδιότητες, όπως μεγαλύτερη δύναμη και ανθεκτικότητα στη διάβρωση. Χρησιμοποιούνται κυρίως τρία είδη: τιτάνιο και κράματα τιτανίου, ανοξείδωτος χάλυβας και κράμα κοβαλτίου-χρωμίου-μολυβδενίου (Patel, 2012). Το μεγάλο πλεονέκτημα των μετάλλων η άριστη θερμική και ηλεκτρική αγωγιμότητά τους, αλλά και οι μηχανικές τους ιδιότητες (Γεωργιλέ, 2007). Ο λόγος είναι η ύπαρξη αδέσμευτων ηλεκτρονίων, τα οποία μπορούν να μεταφέρουν γρήγορα ηλεκτρικό φορτίο και θερμική ενέργεια. Τα κινούμενα ελεύθερα ηλεκτρόνια δρουν ως συνδετική δύναμη που συγκρατεί τα θετικά μεταλλικά ιόντα μαζί. Η θέση των μεταλλικών ιόντων μπορεί να τροποποιηθεί χωρίς να καταστραφεί η κρυσταλλική δομή οδηγώντας σε ένα στερεό που παραμορφώνεται πλαστικά. Τα μεταλλικά βιοϋλικά πρέπει να μιμούνται λειτουργικά όσο γίνεται καλύτερα τον ιστό που αντικαθιστούν, καθώς αν φέρουν περισσότερο φορτίο θα ατροφήσει ο περιβάλλων ιστός, ενώ αν δεν αντέχουν πολύ φορτίο δεν θα είναι λειτουργικά (Bauer and Schils, 1999). Τα μέταλλα έχουν διάφορες χρήσεις, όπως ως παθητικά υποκατάστατα σκληρών ιστών, ως εμφυτεύματα στην ολική αρθροπλαστική ισχίου και γόνατος, στην υποστήριξη της επούλωσης καταγμάτων με τη μορφή οστεοσυνθετικών πλακών ή κοχλιών αλλά και στα οδοντικά εμφυτεύματα χάρη στις 92

93 άριστες μηχανικές τους ιδιότητες και την αντοχή στη διάβρωση. Άλλα μεταλλικά κράματα χρησιμοποιούνται με πιο ενεργό ρόλο σε συσκευές, όπως οι αγγειακές ενδοπροθέσεις (stents), τα σύρματα καθοδήγησης σε καθετηριασμούς και τα κοχλιακά εμφυτεύματα. Το μέταλλο που χρησιμοποιείται περισσότερο είναι το τιτάνιο, λόγω της μηχανικής αντοχής και της σχετικά υψηλής συμβατότητας του (Gardin et al., 2012) ΠΟΛΥΜΕΡΗ ΒΙΟΫΛΙΚΑ Τα πολυμερή είναι τα πιο ευέλικτα βιοϋλικά, καθώς μπορούν να τροποποιηθούν ώστε να πάρουν οποιοδήποτε σχήμα και μέγεθος. Πρόκειται για οργανικά υλικά που αποτελούνται από πολύ μεγάλες αλυσίδες με επαναλαμβανόμενες ομάδες (Patel, 2012). Το μοριακό τους βάρος είναι πολύ υψηλό, υπερβαίνοντας κάποιες φορές το ένα εκατομμύριο. Οι αλυσίδες τους δεν είναι πάντα γραμμικές, αλλά συχνά διακλαδίζονται σχηματίζοντας τρισδιάστατες δομές, με αποτέλεσμα μεταβολές στα φυσικά χαρακτηριστικά και τη συμπεριφορά του υλικού. Τα τεχνητά πολυμερή χρησιμοποιούνται εκτενώς ως προσθετικά υλικά λόγω της ευκολίας μορφοποίησής τους. Έχουν διάφορες εφαρμογές, όπως στις συνθετικές αρθρώσεις, στη γναθοπροσωπική προσθετική, στην οδοντιατρική και στα αρτηριακά μοσχεύματα (Γεωργιλέ, 2007). Η εκτεταμένη χρήση τους οφείλεται στην ικανότητά τους να μορφοποιούνται εύκολα και σε διάφορες μορφές, όπως νήματα, ράβδοι, και υμένια (Navarro et al., 2008). Ένα παράδειγμα τέτοιου υλικού είναι το PLGA (Poly Lactic Glycolic Acid), το οποίο αποτελείται από μονομερή γλυκολικού και γαλακτικού οξέος. Τα δύο αυτά συστατικά, μεμονωμένα, διασπώνται βραδέως. Σε συνδυασμό όμως, ο ρυθμός διάσπασης αυξάνεται σε αναλογία με την σχέση γλυκολικό/γαλακτικό στο πολυμερές. Αυτή η ιδιότητα είναι πολύ χρήσιμη στη δημιουργία υλικών με κατάλληλο ρυθμό διάσπασης ώστε να αντισταθμίζουν το ρυθμό αναγέννησης του κατεστραμμένου ιστού Πολυαιθυλένιο Το πολυαιθυλένιο διατίθεται στο εμπόριο σε πέντε μορφές: πολύ χαμηλής πυκνότητας (VLDPE), γραμμικό χαμηλής πυκνότητας (LLDPE), χαμηλής πυκνότητας (LDPE), υψηλής πυκνότητας (HDPE) και υπερυψηλής πυκνότητας (UHMWPE) (Navarro et al., 2008). Το 93

94 UHDPE είναι ένα γραμμικό πολυμερές με μοριακό βάρος μέχρι και 4x10 6 g/mol. Εμφανίζει εξαιρετικά υψηλή αντίσταση στην κρούση και στη φθορά, έχει χαμηλό συντελεστή τριβής και καλή χημική αντίσταση στους κοινούς διαλύτες (Γεωργιλέ, 2007). Τα χαρακτηριστικά αυτά το καθιστούν χρήσιμο σε πολυάριθμες εφαρμογές όπως η κατασκευή ορθοπεδικών προσθετικών υλικών και εμφυτευμάτων σε περιοχές που φέρουν φορτία, όπως το κυπέλλιο της κοτύλης για τις περιπτώσεις αρθροπλαστικής ισχίου ή οι επιγονατιδικές επιφάνειες στην αρθροπλαστική γόνατος (Collier et al., 1996) Πολυτετραφθοροαιθυλένιο Το πολυτετραφθοροαιθυλένιο (PTFE, Teflon) είναι ένα από τα ευρύτερα χρησιμοποιούμενα πολυμερή στον τομέα των βιοϋλικών. Προκύπτει από το τετραφθοροαιθυλένιο υπό πίεση με υπεροξειδικό καταλύτη παρουσία περίσσειας νερού για την αφαίρεση της θερμότητας. Χρησιμοποιείται για την επικάλυψη προσθετικών υλικών και την κατασκευή αρτηριακών μοσχευμάτων (Donati et al., 2014) Πολυακρυλικές ρητίνες Ο πολυμεθακρυλικός μεθυλεστέρας (PMMA) και ο πολυμεθακρυλικός υδροξυαιθέρας (poly-hema) είναι τα κυριότερα ακρυλικά πολυμερή που χρησιμoποιούνται ως βιοϋλικά (Navarro et al., 2008). Ο πολυμεθακρυλικός μεθυλεστέρας (PMMA) χρησιμοποιήθηκε αρχικά το 1937 σαν υλικό κατασκευής βάσεων οδοντοστοιχιών. Σήμερα χρησιμοποιείται και για την κατασκευή συνθετικών δοντιών, φακών επαφής, την αποκατάσταση οστικών ελλειμμάτων στη γναθοπροσωπική προσθετική και ως οστικό τσιμέντο σε επεμβάσεις αρθροπλαστικής (Charnley, 1960). Το PMMA δεν αποτελεί συνήθως αίτιο αλλεργικών αντιδράσεων. Παρά τη δεδομένη καλή βιοσυμβατότητα του υλικού, οι τελευταίες εξελίξεις στον τομέα των ενδοφακών από PMMA με την επίστρωσή τους με κολλαγόνο και ηπαρίνη βελτίωσαν ακόμη περισσότερο αυτήν την παράμετρο, αναστέλλοντας σε μεγάλο βαθμό την εναπόθεση θρόμβων. Ο πολυμεθακρυλικός υδροξυαιθέρας (poly-hema) βρίσκει εφαρμογή στην κατασκευή μαλακών φακών επαφής (Γεωργιλέ, 2007). 94

95 9.3. ΚΕΡΑΜΙΚΑ ΒΙΟΫΛΙΚΑ Τα κεραμικά υλικά προέρχονται από θερμική κατεργασία αργιλικών πρώτων υλών και καλύπτουν μεγάλο εύρος εφαρμογών στην ιατρική. Η πορσελάνη χρησιμοποιείται στην οδοντιατρική, ενώ η αλουμίνα (Al 2 O 3 ) και η ζιρκονία (ZrO 2 ) στην ορθοπεδική (Navarro et al., 2008). Τα βασικά πλεονεκτήματα τους έναντι των μετάλλων είναι η αυξημένη αντίσταση στη διάβρωση, η σχετικά χαμηλή πυκνότητα, το υψηλό μέτρο ελαστικότητας και η καλή αντοχή στη σύνθλιψη (Patel, 2012). Όμως παρουσιάζουν μικρή αντοχή στον εφελκυσμό και την κόπωση, ευθραυστότητα και εύκολη διάδοση των ρωγμών (Γεωργιλέ, 2007) ΒΙΟΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Τα υλικά αυτά κατασκευάζονται από ένα βιοδιασπώμενο υπόστρωμα με φυσικές ίνες για ενίσχυση. Η κατηγορία αυτή προσθετικών υλικών έχει αναδειχθεί τα τελευταία χρόνια λόγω της καλής απόδοσής τους και του περιβαλλοντικού οφέλους (Mallick, 1997). Χρησιμοποιούνται στην ορθοδοντική και σε συστήματα διανομής φαρμάκων ΣΥΝΘΕΤΑ ΒΙΟΫΛΙΚΑ Τα σύνθετα υλικά χρησιμοποιούνται στην Ορθοπεδική και στην Οδοντιατρική. Αποτελούνται από δύο ή περισσότερα συστατικά, τα οποία συνδυάζονται για να επιτευχθούν ειδικές ιδιότητες που καθένα από τα επιμέρους συστατικά δεν μπορεί από μόνο του να επιτύχει. Χαρακτηρίζονται από τη συνύπαρξη δύο τουλάχιστον μακροσκοπικά διακρινόμενων συστατικών, μήτρα και ενισχυτική φάση, με το συστατικό ενίσχυσης να προσδίδει στο υλικό βελτιωμένες μηχανικές, κυρίως, ιδιότητες. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η αξιοποίηση του υδροξυαπατίτη στα σύνθετα υλικά με στόχο τη μίμηση της δομής και των ιδιοτήτων των οστών, με προοπτική τη δυνατότητα αξιοποίησης τέτοιων σύνθετων υλικών ως οστικών υποκατάστατων (Γεωργιλέ, 2007). 95

96 10. ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΤΑ ΠΡΟΣΘΕΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Η στρατηγική αποφυγής του σχηματισμού biofilm ποικίλλει από τη συστηματική αποφυγή της εισόδου των βακτηρίων στον οργανισμό μέχρι την τοπική αναστολή του σχηματισμού βιομεμβράνης πάνω στο προσθετικό υλικό με καταστροφή των ελεύθερων πλαγκτονικών βακτηρίων πριν την προσκόλληση πάνω στην επιφάνεια του. Η προσκόλληση αυτή εξαρτάται τόσο από τις ιδιότητες του υλικού κατασκευής του εμφυτεύματος όσο και από παράγοντες του ξενιστή. Για παράδειγμα, η προσκόλληση των βακτηρίων στη σιλικόνη είναι αρκετά υψηλότερη από αυτή στο πολυουρεθάνιο ή στο Teflon (Lopez-Lopez et al., 1991). Παράγοντες του ξενιστή όπως το ινωδογόνο, η ινωδονεκτίνη και τα αιμοπετάλια επικαλύπτουν το προσθετικό υλικό και παρέχουν θέσεις σύνδεσης για τις προσκολλητίνες των μικροβίων (Shenkman et al., 2002). Έχει αναφερθεί ότι η έκφραση του οπερονίου ica επηρεάζεται από τις συνθήκες ροής και τα χαρακτηριστικά της επιφάνειας των βιοϋλικών. Πιο αναλυτικά, οι μεθυλιωμένες επιφάνειες επάγουν την έκφραση μεγαλύτερων biofilms με περισσότερο πολυσακχαρίτη PIA από στελέχη του είδους S. epidermidis μέσω αύξησης της έκφρασης των γονιδίων icaa και icad. Αντιθέτως, η υδροξυλίωση των επιφανειών μπορεί να μειώσει την προσκόλληση των βακτηρίων και το σχηματισμό biofilm πάνω στο προσθετικό υλικό (Foka et al., 2012). Διάφορες μέθοδοι έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικές στην αναστολή της προσκόλλησης των βακτηρίων, όπως η επικάλυψη των προσθετικών υλικών με ειδικές ουσίες ή με αντιβιοτικά. Η προφυλακτική χρήση αντιβιοτικών μπορεί να μειώσει την επίπτωση των λοιμώξεων προσθετικών υλικών. Μία μέθοδος περιλαμβάνει έγχυση διαλύματος αντιβιοτικού και αντιπηκτικού (όπως βανκομυκίνη και ηπαρίνη ή μινοκυκλίνη και EDTA) σε ολόκληρο τον αυλό του καθετήρα και τοποθέτηση του στο σώμα του ασθενούς χωρίς να χρησιμοποιηθεί για κάποιο διάστημα, με σκοπό την αποφυγή του αποικισμού και, κατ επέκταση, της λοίμωξης (Carratala et al., 1999). Σύμφωνα με τον Manierski και τους συνεργάτες του η μέθοδος αυτή είχε ως αποτέλεσμα μείωση κατά % της εμφάνισης βακτηριαιμίας σχετιζόμενης με προσθετικά υλικά σε ασθενείς υπό αιμοκάθαρση (Manierski and Besarab, 2006). Έχει αναφερθεί επίσης ότι παθητική επικάλυψη της επιφάνειας του προσθετικού υλικού με αντιβιοτικά ή αντισηπτικά μπορεί να καθυστερήσει τον αποικισμό από μικροοργανισμούς. Αν και η προφυλακτική 96

97 χορήγηση αντιβιοτικών είναι αμφιλεγόμενη λόγω του κινδύνου ανάδειξης ανθεκτικών στελεχών, ενδείκνυται για ομάδες ασθενών υψηλού κινδύνου. Ο Falagas και οι συνεργάτες του σε μία μελέτη απέδειξαν ότι η χρήση κεντρικών φλεβικών καθετήρων στους οποίους είχε γίνει επικάλυψη με ριφαμπικίνη ήταν αποτελεσματική στην μείωση του αποικισμού των καθετήρων και των περιστατικών βακτηριαιμίας σχετιζόμενης με προσθετικά υλικά (Falagas et al., 2007). Η δημιουργία προσθετικών υλικών με αντιβακτηριακές και αντι-προσκολλητικές ιδιότητες περιλαμβάνει μηχανικό ανασχεδιασμό των εμφυτευμάτων, μεταβολή της επιφάνειας των υλικών με τη χρήση υλικών όπως ο άργυρος, συνθετικά αντιβιοτικά και biosusfactants, και απελευθέρωση τοξικών για τα βακτήρια παραγόντων στον περιβάλλοντα χώρο. Έχουν αναπτυχθεί επικαλύψεις προσθετικών υλικών που μειώνουν την προσκόλληση των βακτηρίων μεταβάλλοντας τις φυσικοχημικές ιδιότητες της επιφάνειας έτσι ώστε να μην είναι δυνατή η αλληλεπίδραση με τα βακτήρια και ο σχηματισμός βιομεμβράνης. Τέτοιες τροποποιήσεις περιλαμβάνουν επικάλυψη του εμφυτεύματος με πολυαιθυλενογλυκόλη ή πολυουρεθάνιο (Nagel et al., 1996). Δυστυχώς, η αποτελεσματικότητα της μεθόδου αυτής είναι περιορισμένη και εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το είδος των μικροοργανισμών. Το τροποποιημένο προσθετικό υλικό μετά την είσοδο του στον οργανισμό περιβάλλεται από ένα στρώμα πρωτεϊνών του ξενιστή, με αποτέλεσμα να μειώνεται η αποτελεσματικότητα του. Επιπλέον, οι αντιβακτηριακοί παράγοντες στην επιφάνεια των εμφυτευμάτων είναι αποτελεσματικοί κυρίως κατά του αρχικού κύματος των εισβαλόντων βακτηρίων, καθώς τα νεκρά βακτήρια συσσωρεύονται σχηματίζοντας ένα στρώμα γύρω από το προσθετικό υλικό που προστατεύει τα επόμενα μικρόβια από τη δράση των τοξικών παραγόντων (Bryers, 2008). Μία εναλλακτική μέθοδος κατά της προσκόλλησης των βακτηρίων είναι η δημιουργία "ενεργητικών" επικαλύψεων των προσθετικών υλικών που απελευθερώνουν αντιβακτηριακές ουσίες στον περιβάλλοντα χώρο. Ο σχεδιασμός τους είναι τέτοιος ώστε να απελευθερώνουν αρχικά μεγάλες ποσότητες τοξικών παραγόντων κατά το κρίσιμο διάστημα αμέσως μετά την είσοδο του ξένου σώματος στον οργανισμό ώστε να ανασταλεί η προσκόλληση των βακτηρίων. Ακολουθεί συνεχής μικρότερου βαθμού απελευθέρωση των αντιβακτηριακών. Για παράδειγμα, το οστικό τσιμέντο (bone cement) που χρησιμοποιείται στην ορθοπεδική για την σταθεροποίηση των τεχνητών αρθρώσεων στο υπάρχον οστό κατασκευάζεται κυρίως 97

98 από polymethylmethacrylate (PPMA, πλεξιγκλάς), ενώ μπορεί να περιέχει και αντιβιοτικά τα οποία απελευθερώνονται αργά από το στερεοποιημένο πλέον υλικό που περιβάλλει το εμφύτευμα (Webb and Spencer, 2007). Επίσης υπάρχουν ενδαγγειακά υλικά και αγγειακά μοσχεύματα που περιέχουν αντιβιοτικά. Η λοίμωξη που σχετίζεται με ενδαγγειακά stent και αγγεικά μοσχεύματα που χρησιμοποιούνται σε ασθενείς με bypass ή κατεστραμμένες αρτηρίες είναι σπάνια, αλλά απειλητική για τη ζωή του ασθενούς. Όταν μολυνθεί ένα τέτοιο μόσχευμα, σχεδόν πάντα πρέπει να αφαιρεθεί προκειμένου να αντιμετωπιστεί η λοίμωξη. Η παραγωγή επομένως αγγειακών εμφυτευμάτων που εμποδίζουν την ανάπτυξη λοίμωξης μπορεί να προλάβει σοβαρές επιπλοκές. Υπάρχουν σήμερα αγγειακά προσθετικά υλικά από υλικά όπως PET (polyethyleneterephtalate) και eptfe (expanded polytetrafluorethylene) που απελευθερώνουν αντιβιοτικά μερικά λεπτά μετά την τοποθέτηση τους και κάποια έχουν παρατεταμένη δράση για ημέρες ή εβδομάδες (Blanchemain et al., 2005). Τέλος, ανεξαρτήτως του τρόπου απελευθέρωσης του αντιβιοτικού (παθητική κάλυψη του υλικού ή ενεργητική απελευθέρωση από το προσθετικό υλικό), είναι αναπόφευκτη η εξάντληση των αποθεμάτων του αντιμικροβιακού παράγοντα με την πάροδο του χρόνου. Επιπλέον, η συχνή χρήση αντιβιοτικών μπορεί να οδηγήσει στην επιλογή βακτηρίων με αυξημένη ικανότητα σχηματισμού biofilm και να επάγει την έκφραση επιπρόσθετων παθογόνων παραγόντων από τα μικρόβια Biosurfactants Οι biosurfactants είναι οργανικές αμφιφιλικές ουσίες που παράγονται από τα μικρόβια, οι οποίες περιέχουν και υδρόφιλα και υδρόφοβα τμήματα και έχουν την χαρακτηριστική ικανότητα να συσσωρεύονται στα σημεία σύνδεσης δύο φάσεων (Linke, 2011). Είναι γνωστό ότι σε τέτοια σημεία τα οργανικά μόρια από την υγρή φάση έχουν την τάση να ακινητοποιούνται πάνω στην στερεή. Εκεί δημιουργούν μία μεμβράνη που μεταβάλλει τις ιδιότητες της αρχικής επιφάνειας (Neu, 1996). Παρομοίως, οι biosurfactants αλληλεπιδρούν σε σημεία μεταξύ δύο φάσεων και επηρεάζουν την προσκόλληση και αποκόλληση των βακτηρίων. Η απορρόφηση των φορτισμένων biosurfactants γίνεται με μία ποικιλία αλληλεπιδράσεων, υδρόφοβων και μη. Οι biosurfactants αποτελούν μία ανομοιόμορφη ομάδα επιφανειακά ενεργών 98

99 μορίων που περιλαμβάνει μία ποικιλία χημικών ενώσεων, όπως γλυκολιπίδια, λιποπρωτεΐνες, λιπαρά οξέα, φωσφολιπίδια και διάφορα πολυμερή. Η χρήση τους και η προσπάθεια για εμπορική εφαρμογή τους στον ιατρικό χώρο έχουν γίνει αντικείμενο μελέτης την τελευταία δεκαετία, εξαιτίας των αντιβακτηριακών, αντιμυκητιασικών και αντιιικών ιδιοτήτων τους. Επιπλέον, η ικανότητα τους να αναστέλλουν την προσκόλληση των μικροβίων αναδεικνύει τη χρησιμότητα τους στην επικάλυψη εμφυτευμάτων για την αναστολή του αποικισμού από παθογόνους μικροοργανισμούς χωρίς τη χρήση αντιβιοτικών. Ο Mireles και οι συνεργάτες του χρησιμοποίησαν ουροκαθετήρες που είχαν υποστεί επεξεργασία με biosurfactants και παρατήρησαν μείωση του σχηματισμού biofilm από βακτήρια όπως E. coli, S. typhimurium. S. Enterica και P. mirabilis (Mireles et al., 2001). Ο Velraeds και οι συνεργάτες του το 1998 ανέφεραν αναστολή του σχηματισμού biofilm από ουροπαθογόνους μικροοργανισμούς με τη χρήση καθετήρων σιλικόνης με biosurfactants που προέρχονταν από τον Lactobacillus acidophilus (Velraeds et al., 1998). Σε μία εργασία από τον Gudina και τους συνεργάτες του μελετήθηκε η παραγωγή biosurfactants από λακτοβάκιλλους, καθώς επίσης και η ικανότητά τους να αναστέλλουν την προσκόλληση διαφόρων ειδών μικροβίων, όπως S. aureus (76.8%) και S. epidermidis (72.9%) (Gudina et al., 2010). Με βάση τα παραπάνω, γίνεται κατανοητό ότι οι biosurfactants μπορούν να παίξουν σημαντικό ρόλο στην παραγωγή αντιπροσκολλητικών επικαλύψεων των προσθετικών υλικών, καθώς αναστέλλουν επιτυχώς την προσκόλληση των βακτηρίων και τον επακόλουθο σχηματισμό biofilm. Ερευνώνται διάφορες τεχνικές σύνδεσης των ουσιών αυτών στην επιφάνεια των εμφυτευμάτων, καθώς αποτελούν μία καλή εναλλακτική λύση στη χρήση αντιβιοτικών, η παρατεταμένη χρήση των οποίων ενδέχεται να οδηγήσει στην εμφάνιση πολυανθεκτικών στελεχών. Μειονέκτημα αποτελεί το υψηλό κόστος παραγωγής τους. Η μείωση του κόστους μπορεί να προκύψει από την επιλεκτική εκμετάλλευση μικροοργανισμών που παράγουν biosurfactants σε μεγάλες ποσότητες, είτε μέσω screening από το περιβάλλον ή με τη δημιουργία γενετικά ανασυνδυασμένων στελεχών στους οποίους έχουν εισαχθεί τα κατάλληλα γονίδια. Με τον τρόπο αυτό μπορεί να δημιουργηθούν και νέες biosurfactants με διαφορετικό αντιμικροβιακό φάσμα και μικρότερη τοξικότητα προς τα ανθρώπινα κύτταρα. 99

100 100

101 Ειδικό Μέρος Α. Υλικά & Μέθοδοι 101

102 102

103 1. ΣΤΕΛΕΧΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 264 στελέχη πηκτάσηαρνητικών σταφυλοκόκκων που απομονώθηκαν από ασθενείς νοσηλευόμενους στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Πατρών και στο Νοσοκομείο Παίδων Πεντέλης. Από τα στελέχη αυτά, τα 226 ανήκαν στα είδη S.epidermidis (168) και S. haemolyticus (58) και απομονώθηκαν από ασθενείς με βακτηριαιμία ή εντοπισμένες λοιμώξεις σχετιζόμενες με προσθετικά υλικά κατά το χρονικό διάστημα Ειδικότερα, 168 S. epidermidis και 58 S. haemolyticus απομονώθηκαν από ασθενείς νοσηλευόμενους στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Πατρών (204 στελέχη) και στο Νοσοκομείο Παίδων Πεντέλης (22 στελέχη), στο οποίο νοσηλεύονται ασθενείς ηλικίας έως 14 ετών. Από τα στελέχη αυτά, 100 προήλθαν από καλλιέργειες αίματος διαφορετικών ασθενών με βακτηριαιμία επιβεβαιωμένη σύμφωνα με διεθνώς αναγνωρισμένα κριτήρια, δηλαδή κλινική συμπτωματολογία και δύο ή περισσότερες θετικές καλλιέργειες αίματος με απομόνωση του ίδιου μικροοργανισμού, με μεσοδιάστημα έως 48 ωρών (Horan et al., 2008). Εκατόν είκοσι έξι (126) στελέχη απομονώθηκαν από καλλιέργειες προσθετικών υλικών (βηματοδότες, προσθετικά υλικά χρησιμοποιούμενα στην ορθοπεδική, ενδαγγειακοί καθετήρες) ασθενών με τοπικά σημεία φλεγμονής, χωρίς συνοδό βακτηριαιμία. Βακτηριαιμίες Λοιμώξεις προσθετικών υλικών S. epidermidis S. haemolyticus Τέλος, μελετήθηκαν 38 στελέχη S. lugdunensis που απομονώθηκαν από ασθενείς νοσηλευόμενους στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Πατρών (37) και στο Νοσοκομείο Παίδων Πεντέλης (1) κατά το χρονικό διάστημα Η πλειοψηφία των στελεχών (22/38, 57.9%) απομονώθηκαν από ασθενείς με λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων, εννέα στελέχη (23.7%) από εν τω βάθει λοιμώξεις 103

104 (περιλαμβανομένων τριών ασθενών με βακτηριαιμία) και επτά S. lugdunensis (18.4%) από λοιμώξεις σχετιζόμενες με προσθετικά υλικά. Δύο S. lugdunensis απομονώθηκαν από παιδιά. 2. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ Τα παραπάνω στελέχη πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων καλλιεργήθηκαν σε αιματούχο άγαρ (Tryptic Soy Agar με 5% αίμα), μετά από επώαση στους 37 C σε περιβάλλον με 5% CO 2 για 24 ώρες. Η καλλιέργεια των άκρων ενδοφλεβίων καθετήρων έγινε με επικύλιση του καθετήρα σε όλη την επιφάνεια του τρυβλίου με το αιματούχο άγαρ τουλάχιστον τέσσερις φορές (ημι-ποσοτική καλλιέργεια, roll plate) και επώαση ως ανωτέρω. Θετικές θεωρήθηκαν οι καλλιέργειες καθετήρα με αριθμό αποικιών του μικροοργανισμού >15 cfu μετά από 48 ώρες επώασης στους 37 C. 3. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΥ 3.1. Ταυτοποίηση βακτηρίων σε επίπεδο είδους Τα στελέχη ταυτοποιήθηκαν ως σταφυλόκοκκοι με βάση την μορφολογία των αποικιών στο αιματούχο άγαρ, την Gram χρώση (Gram θετικοί κόκκοι) και την παραγωγή καταλάσης. Η καταλάση είναι ένζυμο πουβρίσκεται σε όλα σχεδόν τα αερόβια και προαιρετικά αναερόβια βακτήρια που έχουν κυτοχρώματα και βοηθά στην απομάκρυνση του υπεροξειδίου του υδρογόνου (H 2 O 2 ), το οποίο θα είχε τοξική επίδραση για τον μικροοργανισμό. Το H 2 O 2 παράγεται ως προϊόν της αερόβιας διάσπασης των σακχάρων και προκαλεί τον θάνατο των βακτηρίων. Με την επίδραση της καταλάσης, ένα μόριο H 2 O 2 δρα ως υπόστρωμα και ένα δεύτερο ως δότης ηλεκτρονίων, με αποτέλεσμα την παραγωγή δύο μορίων H 2 O και O 2 (Δημητρακόπουλος, 1982). Το παραγόμενο O 2 προκαλεί την παραγωγή φυσαλίδων σε εναιώρημα βακτηρίων σε H 2 O 2, γεγονός που υποδεικνύει την παρουσία καταλάσης στο υπό εξέταση βακτηριακό στέλεχος. 104

105 Έλεγχος παραγωγής πηκτάσης. Η πηκτάση είναι μία πρωτεΐνη με μοριακό βάρος , η οποία έχει την χαρακτηριστική ιδιότητα να προκαλεί πήξη του πλάσματος του αίματος του ανθρώπου και των ζώων με την μετατροπή του ινωδογόνου σε ινώδες, χωρίς να απαιτείται η παρουσία ιόντων Ca ++ ή των παραγόντων πήξης V και VII. Διακρίνεται σε ελεύθερη πηκτάση, η οποία διαχέεται στο υλικό της καλλιέργειας και συνδεδεμένη, η οποία είναι προσκολλημένη στην επιφάνεια του μικροβιακού κυττάρου. Η παραγωγή πηκτάσης αποτελεί χαρακτηριστικό του είδους S. aureus και χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη για τον αποκλεισμό των στελεχών του είδους αυτού. Ειδικότερα, χρησιμοποιήθηκε το PASTOREX STAPH-PLUS (BIO-RAD, France) για τον έλεγχο παραγωγής συνδεδεμένης πηκτάσης. Πρόκειται για μία συγκολλητινοαντίδραση που γίνεται με σωματίδια latex επικαλυμμένα με ινωδογόνο, IgG και μονοκλωνικά αντισώματα κατά πολυσακχαριτών της κάψας του S. aureus. Τα στελέχη που έδωσαν αρνητική την παραπάνω συγκολλητινοαντίδραση χαρακτηρίστηκαν ως CNS, ενώ τα υπόλοιπα αποκλείστηκαν από τη μελέτη ως S. aureus. Εικόνα 15. Αρνητικό και θετικό αποτέλεσμα ελέγχου παραγωγής πηκτάσης. Ο χαρακτηρισμός των στελεχών σε επίπεδο είδους έγινε με το API ID32 Staph (biomerieux, Marcy l Etoile, France), το οποίο είναι σύστημα τυποποίησης των ειδών του γένους Staphylococcus και Micrococcus. Η ταυτοποίηση πραγματοποιείται με μία σειρά από βιοχημικές αντιδράσεις, οι οποίες λαμβάνουν χώρα σε μια ταινία από αφυδατωμένα υποστρώματα σε μεμονωμένες θέσεις. Για τη δοκιμασία αυτή, εναιώρημα του βακτηρίου θολερότητας 0.5 McFarland εμβολιάζεται στις ειδικές θέσεις της ταινίας. Ακολουθεί επώαση στους 37 C σε υγρή ατμόσφαιρα για

106 ώρες. Θετική αντίδραση έχει σαν αποτέλεσμα αλλαγή του ph, η οποία γίνεται εμφανής από την αλλαγή χρώματος λόγω της ύπαρξης δεικτών ph στις θέσεις της ταινίας όπου λαμβάνουν χώρα οι βιοχημικές αντιδράσεις. Ο χαρακτηρισμός του είδους έγινε με το λογισμικό APIweb (biomerieux, France). Οι βιοχημικές δοκιμασίες που ελέγχονται με το API ID32 Staph είναι οι εξής: 1) Δοκιμασία της διασπάσεως του μονοσακχαρίτη D(+)- γλυκόζη 2) Δοκιμασία διασπάσεως του μονοσακχαρίτη D(-)- φρουκτόζη 3) Δοκιμασία διασπάσεως του μονοσακχαρίτη D- μαννόζη 4) Δοκιμασία διασπάσεως του δισακχαρίτη μαλτόζη 5) Δοκιμασία διασπάσεως του δισακχαρίτη λακτόζη 6) Δοκιμασία διασπάσεως D-trehalose 7) Δοκιμασία διασπάσεως της αλκοόλης μονοσακχαριτών D- μαννιτόλη 8) Δοκιμασία διασπάσεως Xylitol 9) Δοκιμασία διασπάσεως D-melοbiose 10) Δοκιμασία παραγωγής ακετυλομεθυλοκαρβινόλης 11) Δοκιμασία αναγωγής νιτρικών σε νιτρώδη 12) Δοκιμασία παραγωγής αλκαλικής φωσφατάσης 13) Δοκιμασία διασπάσεως ραφινόζης 14) Δοκιμασία διασπάσεως ξυλόζης 15) Δοκιμασία διασπάσεως σουκρόζης 16) Δοκιμασία διασπάσεως α-μέθυλο-d-γλυκοσιδίου 17) Δοκιμασία διασπάσεως Ν-ακέτυλο-γλυκοσαμίνης 18) Δοκιμασία υδρολύσεως της αργινίνης 19) Δοκιμασία παραγωγής ουρεάσης. Για τις δοκιμασίες 10, 11 και 12 απαιτούνται αντίστοιχα τα αντιδραστήρια VP, NIT και PAL. Με το API Stαph είναι δυνατό να ταυτοποιηθεί επιτυχώς σε επίπεδο είδους ένας Gram θετικός κόκκος. Η ειδικότητα της μεθόδου ανέρχεται σε %. 106

107 Εικόνα 16. Ταινίες τυποποίησης σταφυλοκόκκων API Stαph. Η ταυτοποίηση των στελεχών σε επίπεδο είδους επιβεβαιώθηκε με το Vitek 2 Advanced Expert System (biomérieux), το οποίο αποτελεί ένα αυτοματοποιημένο σύστημα τυποποίησης βακτηρίων με βάση βιοχημικές δοκιμασίες. Βακτηριακό εναιώρημα θολερότητας McFarland εισάγεται στο μηχάνημα, σε συνδυασμό με κάρτα αναγνώρισης Gram-θετικών μικροοργανισμών, η οποία περιέχει 64 microwells με υποστρώματα ταυτοποίησης ή αντιμικροβιακούς παράγοντες, για ταυτόχρονη ταυτοποίηση του είδους του βακτηρίου και της αντοχής του στα αντιβιοτικά Έλεγχος παραγωγής βιομεμβράνης (biofilm) Όλα τα υπό μελέτη στελέχη ελέχθησαν για την παραγωγή biofilm με δύο μεθόδους. Σύμφωνα με την μέθοδο ποιοτικού ελέγχου που περιγράφηκε από τον Christensen (Christensen et al., 1985), αρχικά γίνεται καλλιέργεια των στελεχών σε αιματούχο άγαρ και ακολουθεί επώαση στους 37 C για 24 ώρες. Κατόπιν 2-3 αποικίες προστίθενται σε γυάλινο σωληνάριο που περιέχει 7 ml TSB (Tryptic Soy 107

108 Broth). Ακολουθεί επώαση για 18 ώρες στους 37 C με κλίση 45 μοιρών. Μετά από προσεκτικό ξέπλυμα με απεσταγμένο H 2 O και σταθεροποίηση της σχηματισθείσας βιομεμβράνης με επώαση στους 60 C για 1 ώρα, γίνεται χρώση με διάλυμα 0,1% σαφρανίνης για 10 δευτερόλεπτα. Ακολουθεί ξέπλυμα με απεσταγμένο H 2 O και στέγνωμα του σωληναρίου σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ο έλεγχος παραγωγής biofilm θεωρείται θετικός όταν ένα ορατό υμένιο καλύπτει πλήρως τα τοιχώματα του σωλήνα, ενώ η απουσία υμενίου ή η δημιουργία μόνο ενός δακτυλίου στο σημείο επαφής του υγρού αποτελεί ένδειξη αρνητικού αποτελέσματος. Εικόνα 17. Ποιοτικός έλεγχος παραγωγής βιομεμβράνης (μέθοδος Christensen). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της παραγωγής βιομεμβράνης, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος ελέγχου σε microtiter plates που περιγράφηκε από τον Stepanovic (Stepanovic et al., 2007). Αρχικά γίνεται καλλιέργεια των στελεχών σε αιματούχο άγαρ. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 C, 2-3 αποικίες μεταφέρονται σε 2 ml TSB+0.25% γλυκόζη για άλλες 24 ώρες στους 37 C. Από το εναιώρημα αυτό, γίνεται αραίωση 1/100 σε TSB με 1% γλυκόζη και 200 μl προστίθενται σε microtiter plates (3 πηγαδάκια ανά στέλεχος) με επίπεδη βάση. Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το στέλεχος S. epidermidis ATCC35984, το οποίο είναι ισχυρός παραγωγός βιομεμβράνης και ως αρνητικός μάρτυρας το στέλεχος S. epidermidis ATCC

109 Ακολουθεί επώαση overnight στους 37 C, κατόπιν προσεκτική απόρριψη του εναιωρήματος, ξέπλυμα με 200 μl PBS, σταθεροποίηση της σχηματισθείσας βιομεμβράνης με επώαση στους 60 C για 1 ώρα και χρώση με 195 μl διαλύματος Crystal Violet για 15 λεπτά. Μετά από ξέπλυμα της χρωστικής με H 2 O ακολουθεί ρευστοποίηση της βιομεμβράνης με 195 μl διαλύματος 95% αιθανόλης για 30 λεπτά. Ο έλεγχος της παραγωγής biofilm γίνεται με φωτομέτρηση στα 570 nm. Η οπτική απορρόφηση του cut-off προκύπτει από το άθροισμα αυτής του αρνητικού μάρτυρα και τριών σταθερών αποκλίσεων. Θετικό αποτέλεσμα θεωρείται αυτό που είναι μεγαλύτερο της τιμής του cut-off Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται κυρίως για τον έλεγχο της ευαισθησίας των βακτηρίων στα αντιμικροβιακά είναι οι εξής: η μέθοδος αραίωσης των αντιβιοτικών σε υγρά ή στερεά θρεπτικά υλικά η μέθοδος διάχυσης του αντιβιοτικού στο άγαρ (μέθοδος δίσκων, Kirby- Bauer) η μέθοδος διάχυσης του αντιβιοτικού στο άγαρ με ταινίες διαβαθμισμένης συγκέντρωσης αντιμικροβιακού (E-test) Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι διάχυσης με δίσκους αντιβιοτικών και το E-test Μέθοδος διάχυσης του αντιμικροβιακού στο άγαρ (μέθοδος δίσκων) Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην αρχή διάχυσης του αντιβιοτικού στο άγαρ, σύμφωνα με την οποία η συγκέντρωση του αντιβιοτικού μειώνεται όσο η απόσταση από το δισκίο αυξάνεται. Ταυτόχρονα με τη διάχυση του αντιβιοτικού, τα βακτήρια που έχουν τοποθετηθεί στο θρεπτικό υλικό αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται. Η ζώνη αναστολής σχηματίζεται όταν η συγκέντρωση του αντιβιοτικού επιδρά σε ένα αρκετά μεγάλο βακτηριακό πληθυσμό για να επιτύχει την αναστολή του. Αυτό εξηγεί και την εξάρτηση της ζώνης αναστολής από το ρυθμό ανάπτυξης του μικροοργανισμού και από την ταχύτητα διάχυσης του αντιβιοτικού στο άγαρ. Καθοριστικός παράγοντας για 109

110 την ακρίβεια των αποτελεσμάτων είναι το πάχος του θρεπτικού υλικού στο τρυβλίο. Σύμφωνα με τις διεθνείς οδηγίες, χρησιμοποιούνται τρυβλία Mueller-Hinton με ομοιόμορφο πάχος θρεπτικού υλικού 4 mm. Εάν το πάχος του υλικού είναι πολύ μικρό (<4 mm), η διάχυση του αντιβιοτικού στο άγαρ γίνεται σε δύο διευθύνσεις, με αποτέλεσμα να διαμορφώνεται τελικά ζώνη αναστολής με μεγαλύτερη διάμετρο. Όταν το πάχος του θρεπτικού υλικού είναι μεγαλύτερο από 4 mm γίνεται μεγαλύτερη διάχυση του αντιβιοτικού προς το βάθος, με αποτέλεσμα μικρότερες ζώνες αναστολής. Κατά την χρήση τους τα τρυβλία πρέπει να είναι στεγνά, ώστε να μην επηρεάζεται η διάχυση των αντιβιοτικών. Το υλικό Mueller-Hinton που χρησιμοποιείται στη μελέτη αντοχής των σταφυλοκόκκων σε αντιμικροβιακούς παράγοντες περιέχει εκχύλισμα κρέατος, καζεΐνη, άμυλο, άγαρ και έχει ph Έχει αποδεκτή επαναληψιμότητα και χαμηλή περιεκτικότητα αναστολέων σουλφοναμίδης, τριμεθοπρίμης και τετρακυκλίνης. Επιπλέον το υλικό είναι ισότονο με το αίμα και το ph του δεν μεταβάλλεται σημαντικά κατά την ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Η πυκνότητα του βακτηριακού ενοφθαλμίσματος αποτελεί επίσης σημαντικό παράγοντα για τη διαμόρφωση της ζώνης αναστολής. Αν οι δίσκοι και το θρεπτικό υλικό είναι σταθερά, ο κυριότερος παράγοντας για την αναπαραγωγιμότητα της μεθόδου είναι η πυκνότητα του ενοφθαλμίσματος. Μεγάλη πυκνότητα εναιωρήματος έχει σαν αποτέλεσμα να διαμορφώνονται ζώνες αναστολής μικρότερης διαμέτρου. Η πυκνότητα του ενοφθαλμίσματος καθορίζεται σύμφωνα με τη θολοσιμετρική μέθοδο McFarland. Σύμφωνα με τις οδηγίες από την European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), το βακτηριακό εναιώρημα πρέπει να έχει θολερότητα 0.5 McFarland (EUCAST 2014). Οι δίσκοι αποτελούνται από διηθητικό χαρτί διαμέτρου 6 mm και είναι εμποτισμένοι με διάφορους αντιμικροβιακούς παράγοντες. Η περιεκτικότητα του δίσκου σε αντιβιοτικό είναι προκαθορισμένη και στη συγκεκριμένη περίπτωση οι δίσκοι που χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται στον Πίνακα 3. Τοποθετούνται με αποστειρωμένη λαβίδα, αφού περάσουν λιγότερο από 10 λεπτά μετά τον ενοφθαλμισμό του βακτηρίου και σε απόσταση όχι μικρότερη των 24 mm από κέντρο σε κέντρο των δίσκων, ώστε να μην αλληλεπικαλύπτονται οι ζώνες αναστολής (Δημητρακόπουλος 1982). 110

111 Εικόνα 18. Έλεγχος ευαισθησίας με δίσκους αντιβιοτικών. Τεχνική της μεθόδου 4-5 αποικίες καθαρού καλλιεργήματος του μικροοργανισμού διαλύονται σε σωληνάριο που περιέχει 4 ml TSB. Η θολερότητα του καλλιεργήματος στο τέλος πρέπει να είναι ίση με την θολερότητα του προτύπου θολοσιμετρικού διαλύματος της κλίμακας Μc Farland 0.5. Εμβαπτίζεται βαμβακοφόρος στυλεός στο σωληνάριο για την παραλαβή του καλλιεργήματος. Ο βαμβακοφόρος στυλεός σύρεται στη συνέχεια σε τρυβλίο με MHA σε τρεις διευθύνσεις, ώστε να επιτευχθεί ομοιόμορφη διασπορά του υλικού. Γίνεται και μια τελική κίνηση του στυλεού κυκλικά στη περιφέρεια του τρυβλίου. Έτσι επιτυγχάνεται συρρέουσα ανάπτυξη του μικροβίου. Τοποθετούνται με αποστειρωμένη λαβίδα οι δίσκοι αντιβιοτικών (BD BBL TM Sensi-Disc TM, Becton Dickinson and Co) και τα τρυβλία επωάζονται σε αερόβιες συνθήκες (χωρίς CO 2 ) για 24 ώρες. Η ανάγνωση των αποτελεσμάτων γίνεται μετά την επώαση και αφού μετρηθεί ακριβώς η διάμετρος της ζώνης αναστολής. Σαν όριο της ζώνης αναστολής θεωρείται το σημείο όπου δεν παρατηρείται μικροβιακή ανάπτυξη με γυμνό μάτι. Η διάμετρος της ζώνης αναστολής για τα επιμέρους αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη περιλαμβάνονται στον Πίνακα

112 Πίνακαs 3. Συνοπτικός ερμηνευτικός πίνακας των ζωνών αναστολής με την μέθοδο των δίσκων που ισχύουν για τους πηκτάση-αρνητικούς σταφυλόκοκκους (EUCAST 2014). Αντιμικροβιακά Περιεχόμενο δίσκου (μg) Ανθεκτικά (mm) Cefoxitin 30 <22 (S.lugdunensis, S. saprophyticus) <25 ( λοιποί CNS ) Μετρίως Ευαίσθητα (mm) ευαίσθητα (mm) Gentamicin 10 <22-22 Amikacin 30 < Netilmicin 10 <22-22 Tetracycline 30 < Ciprofloxacin 5 <20-20 Clindamycin 2 < Erythromycin 15 < Trimethoprim/ 1.25/ < sulfamethoxazole Rifampicin 5 < (S. lugdunensis, S. saprophyticus) 25 ( λοιποί CNS ) Τα στελέχη που είναι ανθεκτικά στις μακρολίδες, όπως erythromycin, μπορεί να έχουν ιδιοσυστασιακή ή επαγώγιμη αντοχή στη clindamycin (λόγω μεθυλίωσης του 23SrRNA που κωδικοποιείται από το γονίδιο erm, με αποτέλεσμα αντοχή σε μακρολίδες, λινκοζαμίδες και στρεπτογραμμίνη Β) ή μπορεί να είναι ανθεκτικά μόνο στις μακρολίδες (μέσω μηχανισμού αντλίας εκροής ελεγχόμενου από το γονίδιο msra). Για τον έλεγχο ύπαρξης επαγώγιμης αντοχής στη clindamycin, οι δίσκοι ελέγχου ευαισθησίας στην erythromycin και στη clindamycin τοποθετούνται σε απόσταση mm. Κατά την ερμηνεία του αντιβιογράμματος μετά την επώαση, στελέχη που εμφανίζουν ευθειασμό της ζώνης ευαισθησίας γύρω από τη clindamycin 112

113 προς την μεριά που βρίσκεται η erythromycin (D-test) θεωρούνται ανθεκτικά και στις λινκοζαμίδες Μέθοδος προσδιορισμού MIC (E-test) Η μικρότερη συγκέντρωση του αντιβιοτικού που δεν επιτρέπει την ορατή ανάπτυξη του μικροοργανισμού καλείται ελάχιστη ανασταλτική πυκνότητα του αντιβιοτικού (Minimum Inhibitory Concentration, MIC). H τιμή της MIC θεωρείται κριτήριο αναφοράς ώστε να ορισθεί η ευαισθησία ενός μικροοργανισμού. Ο προσδιορισμός της MIC γίνεται με ειδικές ταινίες διαστάσεων 0.5 mm x 6 cm που περιλαμβάνουν μία σειρά υποδιπλάσιων συγκεντρώσεων του αντιβιοτικού. Επειδή οι τιμές MIC στο E-test (biomerieux) ορίζονται από μία προκαθορισμένη και συνεχή σταθερά συγκέντρωσης του αντιβιοτικού, η συγκεκριμένη μέθοδος είναι πιο ακριβής από τη μέθοδο των διαδοχικών αραιώσεων στο άγαρ για τον προσδιορισμό της MIC. Με βάση τις πυκνότητες των αντιμικροβιακών στο αίμα και των τιμών της MIC, καθορίζονται 4 κατηγορίες ευαισθησίας: ευαίσθητα, όπου η ανάπτυξη των βακτηριακών στελεχών αναστέλλεται από πυκνότητες αντιμικροβιακών που επιτυγχάνονται στο αίμα κατά τη συνήθη θεραπευτική χρήση. μετρίως ευαίσθητα, όπου περιλαμβάνονται στελέχη με MICs αντιμικροβιακών στο αίμα και στους ιστούς μεγαλύτερες από αυτές των ευαίσθητων στελεχών. Η κατηγορία αυτή συνεπάγεται κλινική αποτελεσματικότητα σε ιστούς του σώματος όπου φυσιολογικά συγκεντρώνονται οι αντιμικροβιακές ουσίες (π.χ. οι β-λακτάμες και οι κινολόνες στα ούρα) ή όταν χορηγείται η μέγιστη ανεκτή δοσολογία. ανθεκτικά, όταν η ανάπτυξη των βακτηριακών στελεχών δεν αναστέλλεται από τις πυκνότητες αντιμικροβιακών που επιτυγχάνονται στο αίμα κατά τη συνήθη θεραπευτική χορήγηση. Οι MICs και οι ζώνες αναστολής των αντιμικροβιακών υποδεικνύουν πιθανή δράση μηχανισμών αντοχής στα αντιμικροβιακά. 113

114 μη ευαίσθητα (non susceptible), όπου κατατάσσονται στελέχη μικροοργανισμών για τους οποίους έχει προσδιοριστεί μόνο ένα σημείο (breakpoint) ευαισθησίας λόγω της απουσίας ή σπάνιας ύπαρξης ανθεκτικών στελεχών. Στελέχη των οποίων οι MICs είναι μεγαλύτερες ή οι ζώνες αναστολής είναι μικρότερες από την τιμή που έχει ορισθεί ως όριο ευαισθησίας συνιστάται να αναφέρονται ως μη ευαίσθητα. Με την μέθοδο αυτή έγινε ο έλεγχος ευαισθησίας των πηκτάση- αρνητικών σταφυλοκόκκων στα εξής αντιβιοτικά: οξακιλλίνη, βανκομυκίνη, τεϊκοπλανίνη, λινεζολίδη και δαπτομυκίνη. Σύμφωνα με τις διεθνείς οδηγίες, για τον έλεγχο ευαισθησίας στα παραπάνω αντιβιοτικά χρησιμοποιούνται τρυβλία με Mueller- Hinton agar (ΜΗΑ) και ομοιόμορφο πάχος θρεπτικού υλικού 4 mm, με εξαίρεση την οξακιλλίνη, όπου χρησιμοποιούνται τρυβλία με ΜHA εμπλουτισμένο με 2% NaCl (Difco). Εικόνα 19. Έλεγχος ευαισθησίας στη βανκομυκίνη με E-test. Τεχνική της μεθόδου 4-5 αποικίες καθαρού καλλιεργήματος του μικροοργανισμού διαλύονται σε σωλήναριο που περιέχει 4 ml TSB. Η θολερότητα του καλλιεργήματος στο τέλος πρέπει να είναι ίση με την θολερότητα του προτύπου θολοσιμετρικού διαλύματος της κλίμακαs Μc Farland 0.5. Εμβαπτίζεται βαμβακοφόρος στυλεός στο σωληνάριο για την παραλαβή του καλλιεργήματος. 114

115 Ο βαμβακοφόρος στυλεός σύρεται στη συνέχεια σε τρυβλίο με το κατάλληλο θρεπτικό υλικό σε τρεις διευθύνσεις, ώστε να επιτευχθεί ομοιόμορφη διασπορά του υλικού. Γίνεται και μια τελική κίνηση του στυλεού κυκλικά στη περιφέρεια του τρυβλίου. Τοποθετούνται με αποστειρωμένη λαβίδα οι ταινίες αντιβιοτικών και τα τρυβλία επωάζονται σε αερόβιες συνθήκες (χωρίς CO 2 ) στους 37 C για 24 ώρες. Η ανάγνωση των αποτελεσμάτων γίνεται μετά την επώαση. Σαν όριο της ζώνης αναστολής θεωρείται το σημείο όπου δεν παρατηρείται μικροβιακή ανάπτυξη με γυμνό μάτι. Oι MICs για τα επιμέρους αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη περιλαμβάνονται στον πίνακα. Πίνακαs 4. Συνοπτικός ερμηνευτικός πίνακας των MIC με την μέθοδο E-test που ισχύουν για τους πηκτάση-αρνητικούς σταφυλόκοκκους (EUCAST 2014). Αντιβιοτικά Ευαίσθητα Ανθεκτικά Oxacillin 2 (S. lugdunensis) 0.25 (λοιποί CNS) >2 (S. lugdunensis) >0.25 (λοιποί CNS) Vancomycin 4 >4 Teicoplanin 4 >4 Linezolid 4 >4 Daptomycin 1 > Έλεγχος παραγωγής β-λακταμάσης Ο έλεγχος της παραγωγής β-λακταμάσης έγινε χρησιμοποιώντας Nitrocefin (BD BBL TM Dryslide TM Nitrocefin Slide, Becton Dickinson), μία χρωμογόνο κεφαλοσπορίνη. Η μέθοδος βασίζεται στην αλλαγή χρώματος από την υδρόλυση του β-λακταμικού δακτυλίου της νιτροσεφίνης. Πάνω στο δίσκο, εμποτισμένο με nitrocefin, προστίθεται μία σταγόνα αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού και 4-5 αποικίες του προς μελέτη μικροοργανισμού με κρίκο. Μετά από 1 ώρα εξετάζεται η αλλαγή του χρώματος του δίσκου από κίτρινο σε βαθύ ερυθρό που δείχνει την παραγωγή της β-λακταμάσης. 115

116 3.5. Έλεγχος παραγωγής τροποποιημένης πενικιλλινοδεσμευτικής πρωτεΐνης (PBP2a) Η φαινοτυπική μέθοδος ανίχνευσης PBP2a εφαρμόσθηκε στα βακτηριακά στελέχη που βρέθηκαν ανθεκτικά στην οξακιλλίνη με την μέθοδο E-test. Η ανίχνευσή της βασίζεται σε αντίδραση συγκόλλησης με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της PBP2a, μονιμοποιημένων πάνω σε σωματίδια latex. Ειδικότερα, χρησιμοποιήθηκε το SLIDEX MRSA Detection kit (biomerieux SA, Marcy-l Etoile, Lyon, France). Τεχνική της μεθόδου Με κρίκο παραλαμβάνουμε 4-5 αποικίες από την περιοχή ανάπτυξης κοντά στην οξακιλλίνη και τις διαλύουμε σε αντιδραστήριο εκχύλισης 1 (0.1M NaOH), ώστε να σχηματιστεί πυκνό εναιώρημα Επωάζουμε σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 95 C για 4 λεπτά Αφού το εναιώρημα έρθει σε θερμοκρασία δωματίου προστίθεται μία σταγόνα αντιδραστηρίου εκχύλισης 2 (0.5 M KH 2 PO 4 ) και ομογενοποιείται καλά Φυγοκέντρηση 4500 rpm (rounds per minute) για 5 λεπτά Στην ειδική καρτέλα αναμιγνύουμε 50 μl υπερκείμενου με μία σταγόνα latex και περιστρέφουμε κυκλικά για 3 λεπτά. Η παρουσία PBP2a υποδεικνύεται από την εμφάνιση συγκολλήσεων. Εικόνα 20. Αρνητικό και θετικό αποτέλεσμα ελέγχου παραγωγής PBP2a. 116

117 4. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΓΟΝΟΤΥΠΟΥ 4.1. Παρασκευή χρωμοσωμικού DNA Η παρασκευή χρωμοσωμικού DNA επιτυγχάνεται συνήθως με μεθόδους που στηρίζονται στη λύση κυττάρων με πρωτεϊνάση Κ υπό την παρουσία EDTA και ενός απορρυπαντικού διαλύτη (όπως SDS). Οι μέθοδοι ποικίλουν ανάλογα με το μοριακό βάρος του DNA και την τεχνική που θα χρησιμοποιηθεί για τον χαρακτηρισμό του γονοτύπου. Οι μέθοδοι απομόνωσης χρωμοσωμικού DNA που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη είναι οι εξής: απομόνωση σε ρυθμιστικό διάλυμα (Sambrook, 1989) και σε δίσκους αγαρόζης (de Lencastre et al., 1994). Απομόνωση χρωμοσωμικού DNA σε ρυθμιστικό διάλυμα Με την μέθοδο αυτή απομονώθηκε το χρωμοσωμικό DNA από τα βακτήρια ώστε να χρησιμοποιηθεί κατόπιν στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Τεχνική της μεθόδου Αρχικά γίνεται καλλιέργεια των βακτηριακών στελεχών σε αιματούχο άγαρ και τα τρυβλία επωάζονται για ώρες στους 37 C Σε 1 ml απεσταγμένου H 2 0 προστίθενται αποικίες βακτηρίου ώστε να δημιουργηθεί εναιώρημα θολερότητας 2 της κλίμακας McFarland Φυγοκέντρηση rpm για 10 λεπτά Απόρριψη υπερκειμένου και επαναδιάλυση του ιζήματος σε 100 μl λυτικού ρυθμιστικού διαλύματος ( το οποίο περιέχει 50 mm Tris-HCl ph 7.5, 1% Triton X-100 και 1 mm EDTA ph 8.0) και 1 μl πρωτεϊνάση Κ Επώαση στους 56 C για 1 ώρα Επώαση στους 95 C για 10 λεπτά, ώστε να αδρανοποιηθεί η πρωτεϊνάση Κ Ακολουθεί PCR ή φύλαξη των δειγμάτων σε θερμοκρασία -20 C. 117

118 4.2. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) είναι μια μέθοδος που αναπτύχθηκε το 1985 από τους Mullis και Silverstein και άρχισε να χρησιμοποιείται ευρέως το 1987 με την χρήση θερμοανθεκτικών DNA πολυμερασών. Με τη μέθοδο αυτή συντίθεται μεγάλος αριθμός αντιγράφων ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA σε μια ενζυματική αντίδραση in vitro. Η ευαισθησία και ταχύτητα της μεθόδου έχει επιφέρει επανάσταση στη Μοριακή Γενετική δίνοντας καινούργιες προοπτικές για τη μελέτη και ανάλυση γονιδίων. Η PCR βασίζεται στον ενζυμικό πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA που οριοθετείται δεξιά και αριστερά από δύο ολιγoνουκλεοτίδια. Τα δύο αυτά ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιούνται ως εκκινητές (primers) για μια σειρά συνθετικών αντιδράσεων που καταλύονται από την DNA πολυμεράση (Saiki et al., 1988). Οι εκκινητές τυπικά έχουν διαφορετικές αλληλουχίες, οι οποίες είναι συμπληρωματικές των αλληλουχιών οι οποίες βρίσκονται στις απέναντι αλυσίδες δίκλωνου μορίου DNA. Η αντίδραση συνήθως περιλαμβάνει επαναλαμβανόμενους κύκλους. Κάθε κύκλος αποτελείται από τρία στάδια: 1. Αρχικά το δίκλωνο DNA αποδιατάσσεται σε υψηλή θερμοκρασία (συνήθως 94 o C- 96 o C) υπό την παρουσία περίσσειας από κάθε ένα από τα δύο ολιγονουκλεοτίδια (primers) και τεσσάρων τριφωσφονουκλεοτιδίων, (Deoxyribonucleoside triphosphates, dntps, 2 -deoxynucleoside 5 - Triphosphate, datp, dttp, dctp, dgtp, Pharmacia Biotech). 2. Το μίγμα της αντίδρασης ψύχεται σε μια θερμοκρασία που επιτρέπει την πρόσδεση των εκκινητών με τις συμπληρωματικές προς αυτούς ακολουθίες (primer annealing). 3. Οι αναδιαταγμένοι εκκινητές προεκτείνονται με την δράση τηs DNA πολυμεράσης συμπληρωματικά με την μία αλυσίδα του DNA στόχου με κατεύθυνση 5' 3' (elongation), συνήθως στους 72 o C Ο κύκλος της αποδιάταξης, αναδιάταξης και της σύνθεσης του DNA επαναλαμβάνεται αρκετές φορές. Επειδή τα προϊόντα ενός κύκλου λειτουργούν ωs μητρικά τμήματα για τα επόμενα, κάθε κύκλος διπλασιάζει το ποσό του επιθυμητού προϊόντος του DNA. Το τελικό προϊόν αυτής της εκθετικής αντίδρασης είναι ένα τμήμα διπλής έλικας DNA του οποίου το τελευταίο άκρο ορίζεται από το 5- τελικό άκρο των ολιγονουκλεοτιδίων και το μήκος του είναι η απόσταση ανάμεσα στους 118

119 εκκινητές. Το μεγαλύτερο μήκος που πολλαπλασιάζεται δεν μπορεί να υπερβεί τις βάσεις (Saiki et al., 1988). Αφού σε κάθε κύκλο διπλασιάζεται το ποσό του επιθυμητού προϊόντος του DNA, μετά από ν κύκλους η ποσότητα του τελικού προϊόντος είναι 2 ν. Όταν η απόδοση του συστήματος είναι 100%, η ποσότητα του επιθυμητού DNA μετά από κύκλους θα αυξηθεί κατά 33.6 εκατομμύρια έως 1 δισεκατομμύριο φορές περίπου, αντίστοιχα. Στην πραγματικότητα όμως, λόγω της προοδευτικής μείωσης της δραστικότητας του ενζύμου και άλλων παραγόντων, η απόδοση του συστήματος είναι μικρότερη. Το ένζυμο που χρησιμοποιείται είναι η θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση που απομονώθηκε από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus (Taq DNA polymerase) (Chien et al., 1976). Η Taq πολυμεράση έχει μοριακό βάρος 94 kda και ειδική ενεργότητα μονάδες/mg ενζύμου. Το ένζυμο αυτό διαθέτει μόνο 5 3 και όχι 3 5 εξωνουκλεοτιδική δ ράση. Η Taq πολυμεράση εξυπηρετεί την παρατεταμένη επώαση στους 95 C, δεν καταστρέφεται στο στάδιο της αποδιάταξης και δεν χρειάζεται να αντικαθίσταται σε κάθε κύκλο της αντίδρασης. Κάτω από τις συνηθισμένες συνθήκες το ποσό τηs Taq Polymerase περιορίζεται μετά από τουs κύκλους (Saiki et al., 1988). Ο ρυθμός επιμήκυνσης είναι >60 νουκλεοτίδια /sec στους 70 C χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο το DNA του Μ13 φάγου. Η πιστότητα (fidelity) του ενζύμου, δηλαδή η σύνθεση DNA απόλυτα συμπληρωματικού προς το εκμαγείο, εξαρτάται από τη συγκέντρωση των νουκλεοτιδίων στην αντίδραση, από τη συγκέντρωση Mg 2+, το μήκος του τμήματος DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε, τον αριθμό των κύκλων της PCR και τη θερμοκρασία σύνδεσης εκκινητή-μήτρας. Τα ολιγονουκλεοτίδια (primers) που χρησιμοποιούνται στην PCR συνήθως έχουν μήκος βάσεις. Συνήθως, χρησιμοποιούνται στην PCR σε μια συγκέντρωση μμ. Η παρουσία υψηλής συγκέντρωσης ολιγονουκλεοτιδίων μπορεί να προκαλέσει ενεργοποίηση έκτοπων θέσεων, με αποτέλεσμα την ενίσχυση μη-θεμιτών αλληλουχιών. Η PCR είναι μη αποδοτική όταν η συγκέντρωση των εκκινητών είναι περιορισμένη (Oste, 1988). Επίσης η καθαρότητα αλλά και η ποιότητα των εκκινητών επηρεάζει τα προϊόντα της αντίδρασης. Κάθε στάδιο του κύκλου της αντίδρασης ξεκινά όταν επιτευχθεί η επιθυμητή θερμοκρασία. Σε χαμηλότερες θερμοκρασίες το ποσοστό αποτυχίας σύνδεσης των εκκινητών αυξάνεται σημαντικά, ενώ σε υψηλές θερμοκρασίες αυξάνεται μεν η ειδικότητα της σύνδεσης των εκκινητών, ενώ η όλη απόδοση μειώνεται. Ο συνολικός 119

120 αριθμός των κύκλων της αντίδρασης εξαρτάται από την συγκέντρωση των μορίων DNA στο αρχικό μίγμα. Συνήθως κύκλοι είναι αρκετοί για την παραγωγή ικανοποιητικής ποσότητας του επιθυμητού προϊόντος. Συνολικά, τα υλικά που χρησιμοποιούνται στην PCR είναι τα εξής: 1. Ρυθμιστικό διάλυμα 10x: 200 mm Tris-HCl ph 8.4, 500 mm KCl mm MgCl 2 3. Taq DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad, USA) 4. Ζεύγος συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων- εκκινητών (primers), ειδικών για κάθε γονίδιο, συγκέντρωσης 100 pmol/μl 5. Μίγμα 25 mm των τεσσάρων τριφωσφονουκλεοτιδίων (Deoxyribonucleoside triphosphates, dntps, 2 -deoxynucleoside 5 -Triphosphate, datp, dttp, dctp, dgtp) 6. Βακτηριακό DNA Οι παράμετροι που παίζουν σημαντικό ρόλο στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμερισμού (PCR) είναι: Η συγκέντρωση των εκκινητών πρέπει να είναι αρκετά υψηλή ώστε η σύνδεσή τους με την αντίστοιχη μονόκλωνη αλυσίδα να γίνεται γρήγορα και κατά την εξέλιξη της αντίδρασης η σύνδεση αυτή να είναι γρηγορότερη από την επανασύνδεση εκμαγείουεκμαγείου. Η εκλογή κατάλληλης θερμοκρασίας και χρόνου σε κάθε στάδιο της αντίδρασης βοηθά την ειδικότητα της αντίδρασης. Η ειδικότητα και απόδοση της μεθόδου αυξήθηκε με τη χρήση της Taq πολυμεράσης, αφού χρησιμοποιούνται υψηλότερες θερμοκρασίες στα στάδια σύνδεσης και επιμήκυνσης. Μετά το πέρας των κύκλων της αντίδρασης, δείγμα 15 μl από το DNA προϊόν της PCR αναμιγνύεται με 4 μl loading buffer (50% Glucerol, Life Technologies, 25 mm EDTA ph 8.0, 0.25% bromophenol blue, Merck) και αναλύεται σε πήκτωμα αγαρόζης 1% σε ρυθμιστικό διάλυμα 0.5xTBE στα 60 Volts για 1 ώρα. Τα αποτελέσματα φωτογραφήθηκαν σε υπεριώδες φως (UV). 120

121 Έλεγχος ποιότητας παραγόμενου DNA με PCR Ο έλεγχος της ποιότητας του DNA έγινε με ενίσχυση της περιοχής V του γονιδίου που κωδικοποιεί το 23SrRΝΑ, μεγέθους 420 bp (Rahim et al., 2003) με PCR. Τόσο το 16S όσο και το 23SrRΝΑ χαρακτηρίζονται από υψηλό βαθμό έκφρασης και σταθερότητας. Το γονίδιο του 23SrRΝΑ είναι σταθερός δείκτης και έχει χρησιμοποιηθεί στην ταυτοποίηση βακτηρίων (Straub et al., 1999). Οι αλληλουχίες των εκκινητών, οι συνθήκες της αντίδρασης, καθώς και η σύνθεση του μίγματος παρουσιάζονται στους Πίνακες 5, 6 και 7. Πίνακας 5. Αλληλουχία νουκλεοτιδίων εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της ποιότητας του DNA. Εκκινητές Αλληλουχία νουκλεοτιδίων Βιβλ/κή αναφορά 23SrRNA-F 5 -GCGGTCGCCTCCTAAAAG-3 (Rahim et al., 2003) 23SrRNA-R 5 -ATCCCGGTCCTCTCGTACTA-3 Πίνακας 6. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για τον έλεγχο ποιότητας του DNA. Μίγμα αντίδρασης Ποσότητα (μl) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης 5 (χωρίς MgCl 2 ) MgCl 2 (50 mm) 1.5 Εκκινητής 1 (10 pmol/μl) 0.5 Εκκινητής 2 (10 pmol/μl) 0.5 Μίγμα dntps (25 mm) 0.4 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.4 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 3 Τελικός όγκος

122 Πίνακας 7. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για τον έλεγχο ποιότητας του DNA. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 95 C 5 min 94 C 30 sec 55 C 30 sec 72 C 30 sec 72 C 10 min x 35 κύκλοι Έλεγχος ύπαρξης γονιδίου meca Η επιβεβαίωση αντοχής στη μεθικιλλίνη μελετήθηκε με ειδικούς εκκινητές και την εφαρμογή PCR για τον έλεγχο της παρουσίας του γονιδίου meca. Χρησιμοποιήθηκαν ο ευθύς εκκινητής (sense) P2 και ο αντίστροφος (antisense) P3 (Murakami et al., 1991). Η αντίδραση με τους εκκινητές αυτούς έδωσε προϊόν μεγέθους 530 bp. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία των εκκινητών, το μίγμα αντιδράσεων και οι θερμικές συνθήκες κυκλοποίησης αναφέρονται στους Πίνακες 8, 9 και 10. Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το ανθεκτικό στη μεθικιλλίνη πρότυπο στέλεχος S. epidermidis ATCC Πίνακας 8. Νουκλεοτιδική αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR για την ανίχνευση του γονιδίου meca. Εκκινητές Αλληλουχία νουκλεοτιδίων Βιβλ/κή αναφορά P2 5 -ATCGATGGTAAAGGTTGGC-3 Murakami et al, 1991 P3 5 -AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3 Murakami et al,

123 Πίνακας 9. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου meca. Μίγμα αντίδρασης Ποσότητα (μl) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης 5 (χωρίς MgCl 2 ) MgCl 2 (50 mm) 1.5 Εκκινητής P2 (10 pmol/μl) 4 Εκκινητής P3 (10 pmol/μl) 4.5 Μίγμα dntps (25 mm) 0.5 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.5 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 3 Τελικός όγκος 50 Πίνακας 10. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου meca. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 95 C 10 min 95 C 2 min 58 C 1 min 72 C 2 min 72 C 4 min x 30 κύκλοι Ανίχνευση των υπεύθυνων γονιδίων για την παραγωγή biofilm Για την ανίχνευση του οπερονίου ica, ερευνήθηκε με PCR η ύπαρξη των γονιδίων icaa και icad. Οι αλληλουχίες των εκκινητών των γονιδίων που διερευνήθηκαν και τα πρότυπα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες 123

124 αναφέρονται στον Πίνακα 11. Οι συνθήκες αποδιάταξης, επαναδιάταξης και επιμήκυνσης, καθώς και η σύνθεση των μιγμάτων αντίδρασης παρουσιάζονται στους Πίνακες 12 και 13. Εικόνα 21: Σχηματική αναπαράσταση του οπερονίου ica και των ρυθμιστικών γονιδίων sara, sigb, luxs και icar (Otto, 2009). Πίνακας 11. Νουκλεοτιδική αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση των γονιδίων του οπερονίου ica στα στελέχη S. epidermidis και S. haemolyticus. Γονίδιο Εκκινητές Αλληλουχία (5-3 ) Μέγεθος προϊόντος (bp) Στέλεχος αναφοράς Βιβλιογραφική αναφορά icaa icaa1 TCTCTTGCAGGAGC ATCC35984 (Cafiso et al., icaa2 AATCAA TCAGGCACTAACAT ) CCAGCA icad icad 1 -F ATGGTCAAGCCCAG (Cafiso et al., icad 1 -R ACAGAG CGTGTTTTCAACAT 198 ATCC ) TTAATGCAA 124

125 Πίνακας 12. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση των γονιδίων icaa, icad στα στελέχη S. epidermidis και S. haemolyticus. Μίγμα αντίδρασης Ποσότητα (μl) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης 5 (χωρίς MgCl 2 ) MgCl 2 (50 mm) 2.5 Εκκινητής 1 (10 pmol/μl) 0.5 Εκκινητής 2 (10 pmol/μl) 0.5 Μίγμα dntps (25 mm) 0.4 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.4 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 3 Τελικός όγκος 50 Πίνακας 13. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση των γονιδίων icaa, icad. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 94 C 5 min 94 C 30 sec 60 C 1 min 72 C 30 sec 72 C 2 min x 50 κύκλοι 125

126 Ο S. lugdunensis έχει την ικανότητα παραγωγής biofilm, όμως το οπερόνιο ica εμφανίζει διαφορές σε σχέση με αυτό των άλλων CNS. Για το λόγο αυτό, στην ανίχνευση του ica στα στελέχη S. lugdunensis χρησιμοποιήθηκε ένα ειδικό ζεύγος εκκινητών, όπως φαίνεται στον Πίνακα 14. Πίνακας 14. Νουκλεοτιδική αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση των γονιδίων του οπερονίου ica στα στελέχη S. lugdunensis. Γονίδιο Εκκινητές Νουκλεοτιδική αλληλουχία Μέγεθος προϊόντος (bp) Βιβλ/κή αναφορά icaa icaa-f GATGGAAGTTCTGATAATAC 973 (Sandoe and icaa-r CCTCTGTCTGGGCTTGACC Longshaw, 2001) Πίνακας 15. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου icaa στα στελέχη S. lugdunensis. Μίγμα αντίδρασης 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης (χωρίς MgCl 2 ) Ποσότητα (μl) 5 MgCl 2 (50 mm) 1.5 Εκκινητής 1 (10 pmol/μl) 0.5 Εκκινητής 2 (10 pmol/μl) 0.5 Μίγμα dntps (25 mm) 0.5 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.5 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 2.5 Τελικός όγκος

127 Πίνακας 16. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου icaa στα στελέχη S. lugdunensis. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 94 C 5 min 94 C 30 sec 52 C 1 min 72 C 1 min 72 C 7 min x 35 κύκλοι Ανίχνευση των γονιδίων σύνθεσης προσκολλητινών/αυτολυσινών Ο έλεγχος για την παρουσία προσκολλητινών έγινε με PCR με κατάλληλους εκκινητές για την ανίχνευση των γονιδίων aap (accumulation associated protein), bap (biofilm associated protein), fnba (fibronectin binding protein A), atle (major cell wall autolysin epidermidis) και fbe (fibrinogen binding protein epidermidis), καθώς και των fbl (fibrinogen-binding factor lugdunensis) και atll (autolysin lugdunensis) στα στελέχη S. lugdunensis. Για τη σύνθεση των εκκινητών για την ανίχνευση του γονιδίου fbe χρησιμοποιήθηκαν τα προγράμματα OligoExplorer και OligoAnalyzer. Στους παρακάτω πίνακες (17-29) φαίνονται οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των εκκινητών, η σύνθεση του μίγματος αντίδρασης για κάθε γονίδιο και οι θερμικές συνθήκες των αντιδράσεων PCR. 127

128 Πίνακας 17. Αλληλουχία νουκλεοτιδίων των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των γονιδίων παραγωγής προσκολλητινών και αυτολυσινών. Γονίδιο Εκκινητές Νουκλεοτιδική αλληλουχία Μέγεθος προϊόντος (bp) Βιβλ/κή αναφορά aap aapf ATACAACTGGTGCAGATGGTTG 399 (Vandecasteele et aapr GTAGCCGTCCAAGTTTTACCAG al., 2003) bap bapf GAGCCAGATAAACCACAAGAAG 598 (Potter et al., bapr CATGCTCAGCAATAATTGGATC 2009) fnba fnbf1 TAGGAACTGAAAATGGTCAC 1026 (Gomes et al., fnbar GAAGCAATCAGAAAAACACTC 2005) atle atlef CAACTGCTCAACCGAGAACA 500 (Vandecasteele et atler CATCGTTTTCAGCGCTATCA al., 2003) fbe fbef GAAACCAAATCGGCATCTAC 400 Παρούσα μελέτη fber GTTGATGGCGATTTTGTAGG fbl fblf ACATCATCTGGGGCTTGG 390 (Chatzigeorgiou fblr CCGATGTATCACCTGCAACG et al.,2010) atll atll-f CCATCAACACCTACAAATCC 449 Παρούσα μελέτη atll-r CAGCCAGATTTACCATTCAC 128

129 Πίνακας 18. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση των γονιδίων aap, atle. Μίγμα αντίδρασης Ποσότητα (μl) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης 5 (χωρίς MgCl 2 ) MgCl 2 (50 mm) 1.5 Εκκινητής 1 (10 pmol/μl) 1 Εκκινητής 2 (10 pmol/μl) 1 Μίγμα dntps (25 mm) 0.5 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.5 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 3 Τελικός όγκος 50 Πίνακας 19. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση των γονιδίων aap, atle. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 94 C 5 min 94 C 30 sec 55 C 1 min 72 C 1 min 72 C 7 min x 25 κύκλοι 129

130 Πίνακας 20. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου bap. Μίγμα αντίδρασης Ποσότητα (μl) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης 5 (χωρίς MgCl 2 ) MgCl 2 (50 mm) 1.5 Εκκινητής 1 (10 pmol/μl) 1 Εκκινητής 2 (10 pmol/μl) 1 Μίγμα dntps (25 mm) 0.5 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.5 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 3 Τελικός όγκος 50 Πίνακας 21. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου bap. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 92 C 3 min 92 C 1 min 53 C 1 min 72 C 1 min 72 C 5 min x 35 κύκλοι 130

131 Πίνακας 22. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου fnba. Μίγμα αντίδρασης Ποσότητα (μl) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης 5 (χωρίς MgCl 2 ) MgCl 2 (50 mm) 2 Εκκινητής 1 (10 pmol/μl) 1 Εκκινητής 2 (10 pmol/μl) 1 Μίγμα dntps (25 mm) 0.5 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.5 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 3 Τελικός όγκος 50 Πίνακας 23. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου fnba. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 94 C 5 min 94 C 30 sec 53 C 1 min 72 C 1 min 72 C 10 min x 35 κύκλοι 131

132 Πίνακας 24. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου fbe. Μίγμα αντίδρασης Ποσότητα (μl) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης 5 (χωρίς MgCl 2 ) MgCl 2 (50 mm) 1.5 Εκκινητής 1 (10 pmol/μl) 1 Εκκινητής 2 (10 pmol/μl) 1 Μίγμα dntps (25 mm) 0.5 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.5 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 3 Τελικός όγκος 50 Πίνακας 25. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου fbe. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 94 C 5 min 94 C 30 sec 56 C 1 min 72 C 1 min 72 C 7 min x 30 κύκλοι 132

133 Πίνακας 26. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου fbl. Μίγμα αντίδρασης Ποσότητα (μl) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης 5 (χωρίς MgCl 2 ) MgCl 2 (50 mm) 2 Εκκινητής 1 (10 pmol/μl) 0.5 Εκκινητής 2 (10 pmol/μl) 0.5 Μίγμα dntps (25 mm) 0.5 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.5 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 2.5 Τελικός όγκος 50 Πίνακας 27. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου fbl. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 94 C 10 min 95 C 30 sec 58 C 30 sec 72 C 30 sec 72 C 10 min x 35 κύκλοι 133

134 Πίνακας 28. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση των γονιδίων atll. Μίγμα αντίδρασης Ποσότητα (μl) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης 5 (χωρίς MgCl 2 ) MgCl 2 (50 mm) 1.5 Εκκινητής 1 (10 pmol/μl) 0.5 Εκκινητής 2 (10 pmol/μl) 0.5 Μίγμα dntps (25 mm) 0.5 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.5 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 2.5 Τελικός όγκος 50 Πίνακας 29. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου atll. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 94 C 10 min 95 C 30 sec 56 C 30 sec 72 C 30 sec 72 C 10 min x 35 κύκλοι 134

135 Ανίχνευση των γονιδίων παραγωγής τοξινών Οι πηκτάση- αρνητικοί σταφυλόκοκκοι παράγουν ένα μεγάλο εύρος τοξινών, μεταξύ των οποίων εντεροτοξίνες, καθώς και την τοξίνη του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας TSST-1. Στην παρούσα μελέτη, έγινε ανίχνευση των γονιδίων παραγωγής εντεροτοξινών sea, seb, sec, sed, καθώς και του γονιδίου tst που κωδικοποιεί την TSST-1. Ως θετικοί μάρτυρες στην PCR χρησιμοποιήθηκαν τα πρότυπα στελέχη S. aureus FRI913, CCM5757, FRI137 και FRI1151m (για την ανίχνευση των γονιδίων tst και sea, seb, sec και sed, αντίστοιχα). Στους παρακάτω πίνακες (30, 31 και 32) φαίνονται οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των εκκινητών, η σύνθεση του μίγματος αντίδρασης για κάθε γονίδιο και οι θερμικές συνθήκες των αντιδράσεων PCR για την ανίχνευση των γονιδίων τοξινών. Πίνακας 30. Αλληλουχία νουκλεοτιδίων των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των γονιδίων παραγωγής τοξινών. Γονίδιο Εκκινητές Νουκλεοτιδική αλληλουχία Μέγεθος προϊόντος (bp) Θετικός μάρτυρας Βιβλ/κή αναφορά sea seaf TTGGAAACGGTTAAAACGAA 120 FRI913 (Johnson sear GAACCTTCCCATCAAAAACA et al., 1991) seb sebf TCGCATTCAAACTGACAAACG 478 CCM5757 (Johnson sebr GCAGGTACTCTATAAGTGCC et al., 1991) sec secf GACATAAAAGCTAGGAATTT 257 FRI137 (Johnson secr AAATCGGATTAACATTATCC et al., 1991) sed sedf CTAGTTTGGTAATATCTCT 317 FRI1151m (Johnson sedr TAATGCTATATCTTATAGGG et al., 1991) tst tst1 ATGGCAGCATCAGCTTGATA 350 FRI913 (Johnson tst2 TTTCCAATAACCACCCGTTT et al., 1991) 135

136 Πίνακας 31. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση των γονιδίων παραγωγής τοξινών. Μίγμα αντίδρασης Ποσότητα (μl) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης 5 (χωρίς MgCl 2 ) MgCl 2 (50 mm) 2.5 Εκκινητής 1 (10 pmol/μl) 0.5 Εκκινητής 2 (10 pmol/μl) 0.5 Μίγμα dntps (25 mm) 0.4 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.5 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 3 Τελικός όγκος 50 Πίνακας 32. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση των γονιδίων παραγωγής τοξινών. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 94 C 5 min 94 C 2 min 55 C 1.5 min 72 C 1.5 min 94 C 2 min 53 C 1.5 min 72 C 1.5 min 94 C 2 min 51 C 1.5 min 72 C 1.5 min 72 C 7 min 1 κύκλος 1 κύκλος 37 κύκλοι 136

137 Ανίχνευση των γονιδίων λοιπών λοιμογόνων παραγόντων S. lugdunensis Εκτός από την παραγωγή biofilm, προσκολλητινών και αυτολυσινών, ο S. lugdunensis διαθέτει μία ποικιλία άλλων λοιμογόνων παραγόντων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια των λοιμώξεων που προκαλεί. Σε αυτούς συγκαταλέγονται η πρωτεΐνη που δεσμεύει τον παράγοντα von Willebrand (vwbl), η συνεργιστική αιμολυσίνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο slush και το γονίδιο ermc που παίζει ρόλο στην αντοχή στην ερυθρομυκίνη. Στους παρακάτω πίνακες (33-37) φαίνονται οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των εκκινητών, η σύνθεση του μίγματος αντίδρασης για κάθε γονίδιο και οι θερμικές συνθήκες των αντιδράσεων PCR για την ανίχνευση των παραπάνω γονιδίων. Πίνακας 33. Αλληλουχία νουκλεοτιδίων των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των παραγόντων παθογένειας του S. lugdunensis. Γονίδιο Εκκινητές Νουκλεοτιδική αλληλουχία Μέγεθος προϊόντος Βιβλ/κή αναφορά (bp) slush slushf TTTCGTCTTTGCACACACATTTCC 977 (Szabados et slushr ACAGCACAAAGCCTTAACTATCTCA al., 2011) vwbl vwbp-f TGGCGGGATGATTTGGACGGG 858 (Szabados et vwbp-r TCGCCTTCTTGCCCTGATGGT al., 2011) ermc ermc-f GCTAATGTTTAAATCGTCAATTCC 572 (Spiliopoulou ermc-r GGATCAGGAAAAGGACATTTTAC et al., 2004) 137

138 Πίνακας 34. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου ermc. Μίγμα αντίδρασης Ποσότητα (μl) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης 5 (χωρίς MgCl 2 ) MgCl 2 (50 mm) 1.5 Εκκινητής 1 (10 pmol/μl) 0.5 Εκκινητής 2 (10 pmol/μl) 0.5 Μίγμα dntps (25 mm) 0.5 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.5 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 2.5 Τελικός όγκος 50 Πίνακας 35. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση του γονιδίου ermc. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 94 C 10 min 94 C 30 sec 52 C 30 sec 72 C 1 min 72 C 10 min x 30 κύκλοι 138

139 Πίνακας 36. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση των γονιδίων vwbl, slush. Μίγμα αντίδρασης Ποσότητα (μl) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης 5 (χωρίς MgCl 2 ) MgCl 2 (50 mm) 1.5 Εκκινητής 1 (10 pmol/μl) 0.5 Εκκινητής 2 (10 pmol/μl) 0.5 Μίγμα dntps (25 mm) 0.5 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.5 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 3 Τελικός όγκος 50 Πίνακας 37. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση των γονιδίων vwbl, slush. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 94 C 5 min 94 C 30 sec 55 C 1 min 72 C 30 sec 72 C 10 min x 35 κύκλοι 139

140 4.3. Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) Η ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) αποτελεί μία μοριακή μέθοδο τυποποίησης βακτηρίων που βασίζεται στην πέψη του χρωμοσώματος των υπό μελέτη μικροοργανισμών με περιοριστικές ενδονουκλεάσες και την ηλεκτροφόρηση των θραυσμάτων που προκύπτουν σε πήκτωμα αγαρόζης. Η τεχνική εστιάζει στη διαφοροποίηση της γωνίας του ηλεκτρικού πεδίου κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης, επιτρέποντας τον διαχωρισμό μεγάλων μορίων DNA. Οι διαφορές των ηλεκτροφορημάτων που απεικονίζουν τις διαφορετικές θέσεις που δρουν οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες στο χρωμόσωμα κάθε στελέχους, είναι γνωστές ως restriction pattern lengh polymorphisms (RFLPs). Οι κοινές περιοριστικές ενδονουκλεάσες αναγνωρίζουν θέσεις που επαναλαμβάνονται συχνά στο μικροβιακό χρωμόσωμα, με αποτέλεσμα να το κόβουν σε πολυάριθμα κομμάτια και η σύγκριση ηλεκτροφορημάτων να είναι από δύσκολη έως αδύνατη. Αν όμως χρησιμοποιηθεί μια περιοριστική ενδονουκλεάση που αναγνωρίζει σπάνιες θέσεις του χρωμοσώματος, προκύπτουν λιγότερα θραύσματα και, συνεπώς, πιο «ευανάγνωστο» ηλεκτροφορητικό πρότυπο. Επειδή τα θραύσματα που προκύπτουν στην τελευταία περίπτωση είναι πολύ μεγάλα, είναι αδύνατο να διαχωριστούν με συμβατική ηλεκτροφόρηση. Η ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) επιτρέπει το διαχωρισμό τμημάτων DNA μεγαλύτερων των 1000 kbp. Για την τυποποίηση των πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων, το ένζυμο SmaI επιδρά στο απομονωμένο και έγκλειστο σε δίσκους αγαρόζης DNA. Tα Gram θετικά βακτήρια και ιδιαίτερα οι σταφυλόκοκκοι έχουν χρωμοσωμικό DNA πλούσιο σε αδενίνη (Α, Αdenine) και θυμίνη (T, Thymine), Επομένως, τα ένζυμα περιορισμού που αναγνωρίζουν αλληλουχίες πλούσιες σε γουανίνη (G, Gouanine) και κυτοσίνη (C, Cytocine), όπως το ένζυμο SmaI (CCCGGG: 5 -CCC GGG-3 /3 -GGG CCC-5 ), αποδίδουν σχετικά μικρό αριθμό θραυσμάτων DNA, μεγάλου μοριακού βάρους, ιδανικά για ανάλυση με PFGE (Kreiswirth et al., 1993). 140

141 Απομόνωση DNA και εγκλεισμός σε δίσκους αγαρόζης Με την μέθοδο αυτή απομονώθηκε το χρωμοσωμικό DNA από τα βακτήρια μέσα σε δίσκους αγαρόζης ώστε να χρησιμοποιηθεί στην PFGE για την κατάταξη των βακτηριακών στελεχών σε κλώνους. Υλικά 1. Tryptic Soy Broth (TSB) (BBL) 2. Low Melting Temperature Agarose (Sea Plaque, FMC Bioproducts) 3. Διάλυμα PIV (10 mm Tris, 1 M NaCl) 4. Λυτικό ρυθμιστικό διάλυμα EC (6 mm Tris-HCl ph 8.0, 1 M NaCl, 100 mm EDTA ph 8.0, 0.2% Na-deoxycolate, 0.5% Na-laurysarcosine, Sigma, 50 μg/ml RNAase A, 100 μg/ml Lysozyme, 50 μg/ml Lysostaphin, Sigma) 5. Διάλυμα ESP (0.5M EDTA ph 9.0, 1% Na-laurysarcosine, 1mg/ml Proteinase K (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 6. Διάλυμα TE (10 mm Tris-HCl ph 7.5, 1 mm EDTA ph 8.0) Τεχνική της μεθόδου Επωάζουμε 4-5 αποικίες σε 5 ml TSB - Vortex - Επώαση overnight στους 37 C με ανακίνηση. Vortex- Σε eppendorf βάζουμε 500 μl από το βακτηριακό εναιώρημα- Φυγοκέντρηση rpm για 2 min. Απομακρύνουμε το υπερκείμενο - Προσθέτουμε 500 μl PIV- Φυγοκέντρηση rpm για 2 min - Απομακρύνουμε το υπερκείμενο. Ανασύσταση με 200 μl PIV Vortex - Βάζουμε 5 μl από το εναιώρημα σε κυβέττα μίας χρήσης που περιέχει 1 ml PIV. Καλύπτουμε την κυβέττα με parafilm. Φωτομέτρηση στα 620 nm χρησιμοποιώντας ως τυφλό κυβέττα που περιέχει 1 ml PIV. Η οπτική απορρόφηση (OD 620 ) πρέπει να είναι μεταξύ 0.05 και Στο εναιώρημα του βήματος 4 προσθέτουμε PIV σύμφωνα με τον τύπο: Όγκος PIV= (40 x OD 620 x 210) Σε κενό eppendorf βάζουμε 200 μl από το εναιώρημα (μετά από Vortex) και 200 μl low melting agarose - Vortex - Σε γυάλινη πλάκα διαστάσεων (20 cm x 20 cm) καλυμμένη με parafilm ρίχνουμε σταγόνες 20 μl, με προσοχή να μην 141

142 έχουν φυσαλίδες. Καλύπτουμε με αντικειμενοφόρο πλάκα, ώστε οι σταγόνες να πάρουν τη μορφή δίσκου. Τοποθετούμε την πλάκα στους -20 C για 5 min. Κατόπιν αφήνουμε την πλάκα για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου. Αφαιρούμε προσεκτικά τις αντικειμενοφόρους πλάκες και με κρίκο ρίχνουμε τα δισκάκια σε σωληνάριο που περιέχει 1 ml EC lysis solution. Επωάζουμε στους 37 C για 5 ώρες. Απορρίπτουμε το EC lysis solution και προσθέτουμε 1 ml ESP που περιέχει πρωτεϊνάση Κ. Επωάζουμε στους 50 C overnight (τουλάχιστον για 17 ώρες). Απορρίπτουμε το ESP.Προσθέτουμε 13 ml ΤΕ και πλένουμε τα δισκάκια με ανάδευση για 30 min σε θερμοκρασία δωματίου. Απορρίπτουμε το ΤΕ, προσθέτουμε άλλα 13 ml ΤΕ και επαναλαμβάνουμε τη διαδικασία του πλυσίματος 5 φορές. Ο στόχος μας είναι η απομάκρυνση της πρωτεϊνάσης Κ. Μετά τα πλυσίματα τα δισκάκια αποθηκεύονται σε 1 ml ΤΕ στους 4 C Πέψη με περιοριστικό ένζυμο και ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο Υλικά Restriction buffer : buffer 10x : 10 μl/ disc b-mercaptoehanole : μl/ disc dh20: 90 μl/ disc Restriction mix : buffer 10x : 4.5 μl/ disc b-mercaptoehanole : μl/ disc dh20: 38.5 μl/ disc SmaI : 20 U/ disc Buffer ηλεκτροφόρησης : 125 ml 10xTBE buffer + dh20 έως τελικό όγκο 2,5 lt. 142

143 Τεχνική της μεθόδου Μοιράζουμε σε eppendorfs 100 μl restriction buffer Βάζουμε 1 δισκάκι αγαρόζης σε κάθε eppendorf. Αφήνουμε 1 ώρα σε υδατόλουτρο 25 C Αναρρόφηση του υγρού από τα eppendorfs με τα δισκάκια Μοιράζουμε στα eppendorfs από 45 μl restriction mix Overnight υδατόλουτρο 25 C Μετά την επώαση, η αντίδραση τερματίζεται προσθέτοντας 4 μl loading buffer Φτιάχνουμε το gel : 150 ml buffer gr agarose Φορτώνουμε στο gel τα δισκάκια- κλείνουμε τα πηγαδάκια με αγαρόζη. Φορτώνουμε το gel στο μηχάνημα υπό ηλεκτρικό πεδίο για 23 ώρες. Χρησιμοποιήθηκε το εξής πρόγραμμα: Αρχικός χρόνος: 5 sec Τελικός χρόνος: 5 sec Χρόνος ηλεκτροφόρησης: 23 ώρες Γωνία: 120 o Δυναμικό πεδίου: 6 V/cm Ένταση ηλεκτρικού ρεύματος: 120 ma Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε η συσκευή PFGE CHEF DR III apparatus (Bio-Rad). Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, το πήκτωμα αγαρόζης υφίσταται χρώση σε 500 ml dh 2 O με 25 μl ethidium bromide (5 mg/ml, Sigma) και ήπια ανάδευση για 20 λεπτά φωτογράφιση με UV 143

144 Εικόνα 22. Σχηματική απεικόνιση της έγκλεισης DNA σε αγαρόζη, πέψη με SmaI και ανάλυση των θραυσμάτων με PFGE ( Επειδή η ικανότητα να διαχωρίζονται τα μεγάλα μόρια DNA στην PFGE απαιτεί δείκτες με υψηλό μοριακό βάρος, αυτοί προέρχονται από απομόνωση DNA από βακτηριοφάγους (Kreswirth et al, 1993). Ο δείκτης μοριακού βάρους που χρησιμοποιήθηκε ήταν ο Lambda Ladder PFGE Marker (BioLabs) ο οποίος έχει απομονωθεί από το βακτηριοφάγο λ (cl 857 ind 1 Sam 7), και παρέχεται εγκλωβισμένος σε 1 % LMP αγαρόζη σε GelSyringe. Είναι ειδικά σχεδιασμένος για PFGE και το μέγεθός του κυμαίνεται στις Kb (Kreiswirth et al., 1993). Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με παρατήρηση και με την αποδοχή ότι 1-6 διαφορές στα τμήματα DNA υποδεικνύουν υπότυπους του ίδιου κλώνου, ενώ πάνω από 7 διαφορές σημαίνουν νέο κλώνο (Tenover et al., 1995). Το δενδρόγραμμα σχεδιάστηκε συγκρίνοντας τα μοριακά βάρη των θραυσμάτων DNA χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα FPQuest (Bio-Rad, Cat.Num: ). Η ομαδοποίηση βασίστηκε σε ομοιότητα 80%. 144

145 Η τεχνική αυτή έχει δύο περιορισμούς: Ο πρώτος είναι η χρονική διάρκεια της όλης διαδικασίας (εγκλεισμός χρωμοσωμικού DNA σε δίσκους αγαρόζης, πέψη με το περιοριστικό ένζυμο και ηλεκτροφόρηση), που απαιτεί συνολικά έξι ημέρες και ο δεύτερος ο ακριβός εξοπλισμός που απαιτείται. Εντούτοις, αποτελεί τεχνική με υψηλή διακριτική ικανότητα και μεγάλη απόδοση στην τυποποίηση επιδημιολογικά σχετιζόμενων στελεχών, καθώς με την εφαρμογή της είναι δυνατή η αναγνώριση μιας επιδημικής έξαρσης και ο εντοπισμός του υπεύθυνου γονότυπου Πολυτοπική νουκλεοτιδική ανάλυση- Multi Locus Sequence Typing (MLST) Η MLST είναι μεθοδολογία αποτύπωσης μέσω της ανάλυσης της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας πολλαπλών γενομικών περιοχών διατηρημένων γονιδίων των βακτηρίων (housekeeping genes) και χρησιμοποιείται για την τυποποίηση βακτηριακών κλώνων (Maiden, 2006). Τα γονίδια αυτά είναι απαραίτητα για την διατήρηση των βασικών κυτταρικών λειτουργιών και εκφράζονται σε όλα τα βακτήρια ενός είδους υπό φυσιολογικές και μη συνθήκες. Κάθε στέλεχος καθορίζεται από την ύπαρξη επτά διατηρημένων γονιδίων, τα οποία απαρτίζουν το προφίλ αλληλίων (allelic profile ή sequence type, ST). Η κύρια ιδέα της MLST είναι η παροχή ενημερωμένων βάσεων δεδομένων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών, στις οποίες υπάρχει ελεύθερη πρόσβαση (Chan et al., 2001). Αποτελεί μέθοδο με υψηλή διακριτική ικανότητα και επαναληψιμότητα. Όσον αφορά τα στελέχη Staphylococcus epidermidis, βασίζεται στην εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (nucleotide sequence) επτά γονιδίων μεταβολισμού (housekeeping genes): arc (Carbamate Kinase) aroe (Shikimate dehydrogenase) gtr (ABC transporter) muts (DNA mismatch repair protein) pyrr (Pyrimidine operon regulatory protein) tpia (Triosephosphate isomerase) yqil (Acetyl-coenzyme-A-acetyltransferase) Στην παρούσα μελέτη, αντιπροσωπευτικά στελέχη των κύριων PFGE τύπων του είδους S. epidermidis αναλύθηκαν με MLST. Τα στελέχη αυτά διατηρήθηκαν στους 145

146 -70 C σε διάλυμα Trypticase Soy Broth και Glucerol 50% (σε αναλογία 70/30). Κατόπιν έγινε ανακαλλιέργεια σε αιματούχο άγαρ και επώαση στους 37 C για 24 ώρες. Ακολούθησε απομόνωση του DNA των βακτηρίων σε ρυθμιστικό διάλυμα και ενίσχυση των παραπάνω διατηρημένων γονιδίων με PCR. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν, καθώς και το μέγεθος του παραγόμενου προϊόντος για κάθε γονίδιο και οι συνθήκες των αντιδράσεων ενίσχυσης φαίνονται στους Πίνακες 38, 39 και 40. Πίνακας 38. Αλληλουχία νουκλεοτιδίων των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των γονιδίων arc, aroe,gtr, muts, pyrr, tpia yqil. Γονίδια Αλληλουχία εκκινητών (5'-3') Μέγεθος προϊόντος PCR (bp) Carbamate Kinase (arcc) arcc-f TGTGATGAGCACGCTACCGTTAG 465 arcc-r TCCAAGTAAACCCATCGGTCTG Shikimate dehydrogenase (aroe) aroe-f CATTGGATTACCTCTTTGTTCAGC 420 aroe-r CAAGCGAAATCTGTTGGGG ABC transporter (gtr) gtr-f CAGCCAATTCTTTTATGACTTTT 438 gtr-r GTGATTAAAGGTATTGATTTGAAT DNA mismatch repair protein (muts) muts-f3 GATATAAGAATAAGGGTTGTGAA 412 muts-r3 GTAATCGTCTCAGTTATCATGTT 146

147 Pyrimidine operon regulatory protein (pyrr) pyr-f2 GTTACTAATACTTTTGCTGTGTTT 428 pyr-r4 GTAGAATGTAAAGAGACTAAAATGAA Triosephosphate isomerase (tpia) tpi-f2 ATCCAATTAGACGCTTTAGTAAC 424 tpi-r2 TTAATGATGCGCCACCTACA Acetyl coenzyme A acetyltransferase (yqil) yqil-f2 CACGCATAGTATTAGCTGAAG 416 yqil-r2 CTAATGCCTTCATCTTGAGAAATAA Πίνακας 39. Σύνθεση του μίγματος αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση των γονιδίων arc, aroe,gtr, muts, pyrr, tpia yqil. Μίγμα αντίδρασης Ποσότητα (μl) 10x ρυθμιστικό διάλυμα ενίσχυσης 5 (χωρίς MgCl 2 ) MgCl 2 (50 mm) 1.5 Εκκινητής 1 (10 pmol/μl) 0.5 Εκκινητής 2 (10 pmol/μl) 0.5 Μίγμα dntps (25 mm) 0.5 Taq DNA polymerase (5IU/μl) 0.5 Αποστειρωμένο d H DNA (100 ng/μl) 2.5 Τελικός όγκος

148 Πίνακας 40. Συνθήκες αντίδρασης της PCR για την ανίχνευση των γονιδίων arc, aroe,gtr, muts, pyrr, tpia yqil. Στάδιο αντίδρασης Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Αναδιάταξη Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση Συνθήκες 95 C 3 min 95 C 30 sec 50 C 1 min 72 C 1 min 72 C 10 min x 34 κύκλοι Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων, χρησιμοποιήθηκαν οι βάσεις δεδομένων για το είδος S. epidermidis που υπάρχουν στο διαδίκτυο ( Η νουκλεοτιδική αλληλουχία κάθε τμήματος των γονιδίων που αναλύθηκαν συγκρίνεται με αλληλουχίες αναφοράς και ανάλογα με τις διαφορές τους προκύπτει ένας αριθμός που αντιστοιχεί στο κάθε αλληλόμορφο. Έτσι στο τέλος προκύπτει ένας επαψήφιος αριθμός (allelic profile) για κάθε στέλεχος. Στελέχη με το ίδιο allelic profile ανήκουν στον ίδιο κλώνο (Sequence Type, ST). Η σύγκριση του προφίλ αλληλίων των στελεχών έγινε με τον αλγόριθμο eburst, σε αντιδιαστολή με όλη την προϋπάρχουσα βάση δεδομένων για τον S. epidermidis ( Με το πρόγραμμα αυτό είναι δυνατός ο καθορισμός πιθανής συγγένειας μεταξύ του Sequence Type (ST) των υπό μελέτη στελεχών και αυτών που υπάρχουν στην παγκόσμια βάση δεδομένων. Τα συμπλέγματα κλώνων (Clonal Complexes) καθορίστηκαν με τις αρχικές ρυθμίσεις, όπου όλοι οι STs σε ένα σύμπλεγμα διαφέρουν μόνο σε ένα αλλήλιο. 148

149 5. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Η ανάλυση των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης έγινε με το Pearson s chisquare test και το Fisher s exact test του προγράμματος IBM SPSS Statistics version 20 (SPSS, Inc., Chicago, IL). Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικά όταν το p ήταν μικρότερο του Η κατηγοριοποίηση των υπό μελέτη στελεχών έγινε με βάση την προέλευση του στελέχους (βακτηριαιμία- λοιμώξεις σχετιζόμενες με την εφαρμογή προσθετικών υλικών), την παραγωγή βιομεμβράνης, την ύπαρξη του οπερονίου ica και του γονιδίου meca (ευαίσθητοι και ανθεκτικοί στην μεθικιλλίνη πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι). 149

150 150

151 Β. Αποτελέσματα 151

152 152

153 1. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΠΗΚΤΑΣΗ-ΑΡΝΗΤΙΚΩΝ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ ΑΝΑ ΕΙΔΟΣ ΚΑΙ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν συνολικά 264 στελέχη πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων που απομονώθηκαν από ασθενείς νοσηλευόμενους στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών (ΠΓΝΠ: 241) και στο Νοσοκομείο Παίδων Πεντέλης (ΝΠΠ: 23 στελέχη). Ο καθορισμός του είδους με το API ID32 Staph και το Vitek 2 Advanced Expert System (biomérieux, Marcy l'etoile, France) κατέταξε τους μικροοργανισμούς στα παρακάτω είδη: Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Σύνολο Νοσοκομείο Πατρών Παίδων Πεντέλης S. epidermidis S. haemolyticus S. lugdunensis Εκατόν εξήντα οκτώ (168) στελέχη S. epidermidis και 58 S. haemolyticus απομονώθηκαν από ασθενείς νοσηλευόμενους στο ΠΓΝΠ (204 στελέχη) και στο ΝΠΠ (22 στελέχη). Από τα στελέχη αυτά, 100 αναπτύχθηκαν σε καλλιέργειες αίματος διαφορετικών ασθενών με βακτηριαιμία (Blood Stream Infections: BSIs) επιβεβαιωμένη σύμφωνα με διεθνώς αναγνωρισμένα κριτήρια (Horan et al., 2008), ενώ 126 στελέχη απομονώθηκαν από καλλιέργειες προσθετικών υλικών (βηματοδότες, προσθετικά υλικά χρησιμοποιούμενα στην ορθοπεδική, ενδαγγειακοί καθετήρες με >15 cfu σε ημιποσοτική καλλιέργεια άκρου καθετήρα) ασθενών με τοπικά σημεία φλεγμονής (Prosthetic Device Associated Infections: PDAIs). Τα στελέχη του είδους S. epidermidis κυριαρχούν τόσο στις βακτηριαιμίες όσο και στις λοιμώξεις προσθετικών υλικών, αφού 71/100 CNS (71%) που απομονώθηκαν από ασθενείς με BSIs και 97/126 CNS (77%) από ασθενείς με PDAIs ανήκαν στο είδος αυτό. 153

154 Βακτηριαιμίες Λοιμώξεις προσθετικών υλικών S. epidermidis S. haemolyticus Ειδικότερα τα στελέχη από λοιμώξεις σχετιζόμενες με την εφαρμογή προσθετικών υλικών, προέρχονταν κυρίως από λοιμώξεις σχετιζόμενες με ενδαγγειακούς καθετήρες. Η πλειοψηφία των στελεχών προήλθε από περιφερικούς καθετήρες (φλεβικούς και αρτηριακούς), ενώ ανάμεσα στους καθετήρες κεντρικών αγγείων κυριαρχούσαν οι υποκλείδιοι. Ακολουθούν τα στελέχη που απομονώθηκαν από ασθενείς νοσηλευόμενους στην Ορθοπεδική Κλινική, όπως φαίνεται στον Πίνακα 43. Πίνακας 43. Κατηγορίες προσθετικών υλικών από τα οποία απομονώθηκαν S. epidermidis και S. haemolyticus. Προσθετικά υλικά S. epidermidis S. haemolyticus Σύνολο περιφερικοί καθετήρες υποκλείδιοι καθετήρες ορθοπεδικά υλικά περιτοναϊκοί καθετήρες 6-6 καθετήρες παροχέτευσης ομφαλικοί καθετήρες 3-3 σφαγιτιδικοί καθετήρες βηματοδότες 2-2 νεφρολογικοί καθετήρες 1-1 σπιράλ 1-1 billau 1-1 ουροκαθετήρες

155 Μελετήθηκαν 38 S. lugdunensis που απομονώθηκαν στο ΠΓΝΠ (37) και στο ΝΠΠ (1) κατά την εξαετία Είκοσι δύο S. lugdunensis απομονώθηκαν από ασθενείς με λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων (Skin and Soft Tissue Infections: SSTIs), εννέα από εν τω βάθει λοιμώξεις (Deep Sited Infections: DSIs), περιλαμβανομένων τριών από ασθενείς με βακτηριαιμία, και επτά στελέχη από λοιμώξεις σχετιζόμενες με προσθετικά υλικά, κυρίως ενδαγγειακούς καθετήρες, (PDAIs). Δύο S. lugdunensis απομονώθηκαν από παιδιά. Τα περισσότερα στελέχη προήλθαν από ασθενείς που προσήλθαν στα εξωτερικά ιατρεία. 18% 24% 58% λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων εν τω βάθει λοιμώξεις λοιμώξεις σχετιζόμενες με προσθετικά υλικά Γράφημα 1. Κλινικά δείγματα από τα οποία απομονώθηκε S. lugdunensis. 29% 8% 13% 5% 21% 8% 16% ΜΕΘ Ορθοπεδική Εξωτερικά Ιατρεία Νεφρολογική Δερματολογική Πρόωρα Άλλες Γράφημα 2. Κλινικές στις οποίες απομονώθηκε S. lugdunensis. 155

156 2. ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΤΩΝ CNS ΣΤΑ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ Τα αποτελέσματα ελέγχου ευαισθησίας των στελεχών S. epidermidis και S. haemolyticus που απομονώθηκαν από ασθενείς με BSIs και PDAIs στα αντιβιοτικά φαίνονται στο Γράφημα 3. Συνολικά, 203/226 στελέχη (89.8%) ήταν ανθεκτικά στην μεθικιλλίνη (MR-CNS). Όλα τα στελέχη που ήταν ανθεκτικά στο cefoxitin, ήταν επίσης ανθεκτικά στην οξακιλλίνη και έφεραν το γονίδιο meca. Όλοι οι πηκτάσηαρνητικοί σταφυλόκοκκοι που μελετήθηκαν ήταν ευαίσθητοι στα: linezolid (MICs mg/l), daptomycin (MICs mg/l) και vancomycin (MICs 1-4 mg/l). Ο έλεγχος ευαισθησίας των σταφυλοκόκκων στην teicoplanin, ανέδειξε ένα με μειωμένη ευαισθησία (MIC: 16 mg/l), ενώ στα υπόλοιπα το εύρος της MIC ήταν από 0.5 μέχρι 4 mg/l. Γράφημα 3. Αντοχή των S. epidermidis και S. haemolyticus στους αντιμικροβιακούς παράγοντες oxacillin (OX), erythromycin (E), clindamycin (CC), kanamycin (KAN), tobramycin (NN), gentamicin (GM), ciprofloxacin (CIP), fusidic acid (FA), sulfamethoxazole/trimethoprim (SXT), vancomycin (VA), teicoplanin (TEC), linezolid (LNZ) και daptomycin (DAP). *Στέλεχος με μειωμένη ευαισθησία στον αντιμικροβιακό παράγοντα. 156

157 Μεταξύ των 226 S. epidermidis και S. haemolyticus, τα 205 στελέχη (90.7%) χαρακτηρίστηκαν πολυανθεκτικά, καθώς εμφάνισαν αντοχή σε τουλάχιστον τρεις ομάδες αντιβιοτικών. Ειδικότερα, 99/100 (99%) στελέχη από BSIs ήταν πολυανθεκτικά, ενώ στις λοιμώξεις προσθετικών υλικών το ποσοστό ήταν 84.1% (106/126, P<0.001). Επιπλέον, τα στελέχη που προέρχονταν από βακτηριαιμίες εμφάνισαν υψηλότερα ποσοστά αντοχής στους αντιμικροβιακούς παράγοντες σε σύγκριση με αυτά που απομονώθηκαν από εντοπισμένες λοιμώξεις σχετιζόμενες με την εφαρμοή προσθετικών υλικών (P<0.05), όπως φαίνεται στον Πίνακα 44. Πίνακας 44. Αντοχή των S. epidermidis και S. haemolyticus που απομονώθηκαν από βακτηριαιμίες (BSIs) και λοιμώξεις σχετιζόμενες με προσθετικά υλικά (PDAIs) στους αντιμικροβιακούς παράγοντες. BSIs N=100 (%) PDAIs N=126 (%) P-value Αντοχή σε methicillin 99/100 (99) 104/126 (82.5) <0.001 Αντοχή σε clindamycin 93/100 (93) 94/126 (74.6) <0.001 Αντοχή σε erythromycin 96/100 (96) 110/126 (87.3) Αντοχή σε kanamycin 93/100 (93) 89/126 (70.6) <0.001 Αντοχή σε tobramycin 98/100 (98) 90/126 (71.4) <0.001 Αντοχή σε gentamicin 82/100 (82) 81/126 (64.3) Αντοχή σε ciprofloxacin 82/100 (82) 66/126 (52.4) <0.001 Αντοχή σε fusidic acid 97/100 (97) 109/126 (86.5) Αντοχή σε SXT 79/100 (79) 83/126 (65.9)

158 Γράφημα 4. Αντοχή των S. epidermidis και S. haemolyticus που απομονώθηκαν από βακτηριαιμίες (BSIs) και λοιμώξεις σχετιζόμενες με προσθετικά υλικά (PDAIs) στους αντιμικροβιακούς παράγοντες. Oxacillin (OX), erythromycin (E), clindamycin (CC), kanamycin (KAN), tobramycin (NN), gentamicin (GM), ciprofloxacin (CIP), fusidic acid (FA), sulfamethoxazole/trimethoprim (SXT), vancomycin (VA), teicoplanin (TEC), linezolid (LNZ) και daptomycin (DAP). *Στέλεχος με μειωμένη ευαισθησία στον αντιμικροβιακό παράγοντα. Όλα τα στελέχη S. lugdunensis, ήταν ευαίσθητα στην οξακιλλίνη (methicillinsusceptible CNS, MS-CNS), στις αμινογλυκοσίδες (kanamycin, gentamicin), καθώς και στα: ciprofloxacin, rifampicin, teicoplanin (MICs mg/l), vancomycin (MICs mg/l), linezolid (MICs mg/l) και daptomycin (MICs mg/l). Το υψηλότερο ποσοστό αντοχής εμφάνισαν στην ampicillin (50%) και ακολουθούσαν με φθίνουσα σειρά τα erythromycin (18.4%), clindamycin (18.4%), fusidic acid (10.5%), tetracycline (5.3%) και SXT (2.6%), όπως φαίνεται στο Γράφημα

159 AMP 50 αντιμικροβιακά E CC FA TE SXT VA GM DAP LNZ RIF TEC KAN CIP OX 2,6 5,3 10,5 18,4 18, % αντοχή Γράφημα 5. Αντοχή των στελεχών S. lugdunensis στα αντιμικροβιακά ampicillin (AMP), erythromycin (E), clindamycin (CC), fusidic acid (FA), tetracycline (TE), sulfamethoxazole/trimethoprim (SXT), vancomycin (VA), gentamicin (GM), daptomycin (DAP), linezolid (LNZ) rifampicin (RIF,) teicoplanin (TEC), kanamycin (KAN), ciprofloxacin (CIP) και oxacillin (OX). Από τα 38 στελέχη S. lugdunensis που μελετήθηκαν, τα 19 (50%) ήταν ανθεκττικά στην ampicillin. Επτά στελέχη S. lugdunensis τα οποία ήταν ανθεκτικά στην erythromycin έφεραν το γονίδιο ermc. Παρά τον υψηλό βαθμό ευαισθησίας, τέσσερα στελέχη (τρία από SSTIs και ένα από PDAI) ήταν πολυανθεκτικά εκφράζοντας αντοχή σε erythromycin, clindamycin, ampicillin και SXT ή tetracycline. 159

160 3. ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ β-λακταμασησ Από τα 226 στελέχη S. epidermidis και S. haemolyticus που μελετήθηκαν συνολικά, τα 208 (92%) παρήγαγαν β-λακταμάση. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των στελεχών από BSIs και PDAIs (91% και 92.9% αντίστοιχα, P=0.629). PDAIs 7,1 92,9 BSIs β-λακταμάση (+) β-λακταμάση (-) Γράφημα 6. Ποσοστά παραγωγής β-λακταμάσης από S. epidermidis και S. haemolyticus. Από τα 38 στελέχη S. lugdunensis της συλλογής μας, η παραγωγή β-λακταμάσης ανιχνεύθηκε μόνο σε 19 στελέχη (50%). 4. ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΙΟΜΕΜΒΡΑΝΗΣ (BIOFILM) Ο έλεγχος για την παραγωγή βιομεμβράνης (biofilm) από τους πηκτάσηαρνητικούς σταφυλοκόκκους έγινε με δύο μεθόδους: την ποιοτική μέθοδο που περιγράφηκε από τον Christensen (Christensen et al., 1985) και την ποσοτική μέθοδο ανίχνευσης σε πλάκες μικροτιτλοποίησης (Stepanovic et al., 2007). Στην τελευταία μέθοδο, η τιμή του cut-off καθορίστηκε ως το άθροισμα της οπτικής απορρόφησης του αρνητικού μάρτυρα και τριών σταθερών αποκλίσεων. Τα biofilm-θετικά στελέχη S. epidermidis και S. haemolyticus εμφάνισαν οπτικές απορροφήσεις

161 Με την ποιοτική μέθοδο ανεδείχθησαν 87 στελέχη θετικά για την παραγωγή βιομεμβράνης. Από τα στελέχη αυτά, τα 30 ήταν ισχυροί παραγωγοί biofilm (υψηλές τιμές ODs>0.40). Η ποσοτική μέθοδος αποδείχθηκε πιο ευαίσθητη στην ανίχνευση των biofilm-θετικών σταφυλοκόκκων, καθώς 19 στελέχη S. epidermidis και S. haemolyticus που ήταν αρνητικά με την ποιοτική μέθοδο έδωσαν οπτικές απορροφήσεις μεγαλύτερες του cut-off και κατατάχτηκαν στα θετικά για σύνθεση βιομεμβράνης στελέχη. Συγκρίνοντας τα στελέχη που απομονώθηκαν από βακτηριαιμίες και αυτά από εντοπισμένες λοιμώξεις σχετιζόμενες με την εφαρμογή προσθετικών υλικών, διαπιστώθηκε ότι τα πρώτα υπερέχουν στατιστικά σημαντικά στην παραγωγή biofilm (58% έναντι 38.1%, P=0.003). Πίνακας 45. Παραγωγή biofilm από S. epidermidis και S. haemolyticus. Biofilm Είδος BSIs (100) PDAIs (126) Θετικά S. epidermidis S. haemolyticus Σύνολο Αρνητικά S. epidermidis S. haemolyticus Σύνολο Η ποσοτική μέθοδος ανίχνευσης του biofilm αποδείχθηκε επίσης πιο ευαίσθητη στην περίπτωση των στελεχών S. lugdunensis. Δεκατέσσερα στελέχη (36.8%) S. lugdunensis έδωσαν με την ανωτέρα μέθοδο οπτικές απορροφήσεις έως και κατατάχτηκαν στα biofilm-θετικά στελέχη (τιμή cut-off 2.222). 161

162 37% biofilm(+) biofilm(-) 63% Γράφημα 7. Ποσοστιαία αναλογία biofilm(+)/ biofilm(-) S. lugdunensis 5. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΚΛΩΝΩΝ ΜΕ PFGE Η ανάλυση των S. epidermidis και S. haemolyticus με PFGE ανέδειξε έναν πληθυσμό με μεγάλη γενετική ποικιλομορφία. Πιο αναλυτικά, εκατόν εξήντα οκτώ στελέχη S. epidermidis και 58 S. haemolyticus ταξινομήθηκαν σε 67 και δώδεκα PFGE τύπους, αντίστοιχα. Μεταξύ των στελεχών του είδους S. epidermidis, ανεδείχθησαν δυο κύριοι τύποι (a και b) που αποτελούν το 51.2% του συνολικού πληθυσμού. Ο κυρίαρχος τύπος a περιελάμβανε 50 στελέχη, ενώ ο τύπος b 36. Οι πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι που ταυτοποιήθηκαν ως S. haemolyticus έδειξαν μικρότερη ποικιλομορφία, με έναν κύριο PFGE τύπο (h), που περιελάμβανε 44/58 στελέχη (75.9% του συνολικού πληθυσμού). Είναι επιδημιολογικά σημαντικό το γεγονός ότι οι τύποι b και h απομονώθηκαν και στα δυο νοσοκομεία που συμμετείχαν στη μελέτη (ΠΓΝΠ και ΝΠΠ). Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με την αποδοχή ότι 1-6 διαφορές στα θραύσματα DNA υποδεικνύουν υποτύπους του ίδιου κλώνου, ενώ πάνω από 7 διαφορές σημαίνουν νέο κλώνο. Το δενδρόγραμμα σχεδιάστηκε συγκρίνοντας τα μοριακά βάρη των θραυσμάτων DNA χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα FPQuest (Bio-Rad). Η ομαδοποίηση βασίστηκε σε ομοιότητα 80%. 162

163 0.00% 48.80% 29.80% 21.40% a b Άλλοι Γράφημα 8. Κατανομή των στελεχών S. epidermidis σε κλώνους με PFGE. Εικόνα 23. Ζωνώσεις θραυσμάτων DNA των S. epidermidis που αναλύθηκαν με PFGE, σύμφωνα με τα οποίες καθορίστηκαν οι χαρακτηριστικοί κλώνοι. MWM: δείκτης μοριακού βάρους (λ ladder). 163

164 Εικόνα 24. Δενδρόγραμμα κύριων PFGE τύπων S. epidermidis Η κλίμακα υποδηλώνει ποσοστό ομοιότητας. Αντιθέτως, τα στελέχη S. lugdunensis της συλλογής μας έδειξαν μικρή γενετική ποικιλομορφία. Τα 38 στελέχη κατατάχτηκαν σε επτά κλώνους. Τα 31/38 στελέχη (81.6%) ανήκουν σε δύο κύριους PFGE τύπους (C και D), οι οποίοι περιελάμβαναν 22 και εννέα στελέχη αντίστοιχα. Στις παρακάτω εικόνες φαίνονται τα αποτελέσματα 164

165 της PFGE και το δενδρόγραμμα ομοιότητας των κλώνων. Ο κλώνος C επικράτησε ανεξαρτήτως της εστίας λοίμωξης, ενώ ο κλώνος D απομονώθηκε από SSTIs και DSIs, αλλά όχι PDAIs. Επιπρόσθετα, ο κλώνος C απομονώθηκε και στα δύο νοσοκομεία, που βρίσκονται σε διαφορετικές περιοχές της χώρας. Εικόνα 25. Ηλεκτροφόρηση θραυσμάτων DNA S. lugdunensis σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο μετά από επίδραση SmaI. MWM: δείκτης μοριακού βάρους (λ ladder). 165

166 Εικόνα 26. Δενδρόγραμμα κλώνων S. lugdunensis μετά από PFGE. Η κλίμακα υποδηλώνει ποσοστό ομοιότητας. 166

167 6. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΚΛΩΝΩΝ S. epidermidis ΜΕ MLST Στην παρούσα μελέτη, αντιπροσωπευτικά στελέχη των κύριων PFGE τύπων του είδους Staphylococcus epidermidis αναλύθηκαν με MLST. Η συγκεκριμένη μέθοδος, που εφαρμόζεται στα στελέχη S. epidermidis, βασίζεται στην εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (nucleotide sequence) επτά διατηρημένων γονιδίων μεταβολισμού (housekeeping genes): arcc, aroe, gtr, muts, pyrr, tpia και yqil. Η ανάλυση των στελεχών ανέδειξε τρεις κύριους τύπους (sequence types, STs): ST2, ST5 και ST16. Ο κύριος τύπος PFGE a, ο οποίος περιελάμβανε 50 στελέχη, ταυτοποιήθηκε ως ST2, ενώ τα 36 στελέχη του τύπου b ανήκαν στους τύπους ST5 και ST16 (σε αναλογία 59.6% και 40.4%, αντίστοιχα). Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τον αλγόριθμο eburst. Η ανάλυση έδειξε ότι και οι τρεις τύποι που επικρατούν στον πληθυσμό S. epidermidis της μελέτης μας ανήκουν στο ίδιο σύμπλεγμα κλώνων (clonal complex, CC2), όπου ο κλώνος ST2 είναι ο κύριος τύπος (primary group founder). Εικόνα 27. Κλωνικό σύμπλεγμα 2 (clonal complex CC2) S. epidermidis μετά από ανάλυση με τον αλγόριθμο eburst. Οι κλώνοι ST2, ST5 και ST16 κυριάρχησαν στη συλλογή μας. 167

168 7. ΣΥΣΧΕΤΙΣΜΟΣ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ ΜΕ ΚΛΩΝΟΥΣ ΚΑΙ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Υπάρχει σαφής συσχέτιση της αντοχής των στελεχών S. epidermidis στα αντιμικροβιακά με τους τύπους PFGE. Οι κλώνοι a και b είναι πολυανθεκτικοί με φαινότυπο αντοχής σε β-λακταμικά, clindamycin, erythromycin, kanamycin, tobramycin, gentamicin, ciprofloxacin, fusidic acid, SXT. Υπάρχει στατιστικά σημαντική υπεροχή του κλώνου a έναντι του b ως προς την αντοχή σε clindamycin, kanamycin, tobramycin, gentamicin, ciprofloxacin, fusidic acid, SXT. (p<0.05), όπως φαίνεται στον Πίνακα 46. Πίνακας 46. Ποσοστά αντοχής κύριων κλώνων S. epidermidis στα αντιμικροβιακά. PFGE τύποι Τύπος a Τύπος b P-value N= 50 (%) N= 36 (%) Αντοχή σε methicillin 48 (96) 34 (94.4) Αντοχή σε clindamycin 47 (94) 26 (72.2) Αντοχή σε erythromycin 47 (94) 33 (91.7) Αντοχή σε kanamycin 48 (96) 23 (63.9) <0.001 Αντοχή σε tobramycin 48 (96) 28 (77.8) Αντοχή σε gentamicin 45 (90) 16 (44.4) <0.001 Αντοχή σε ciprofloxacin 50 (100) 21 (58.3) <0.001 Αντοχή σε fusidic acid 49 (98) 29 (80.6) Αντοχή σε SXT 47 (94) 17 (47.2) <

169 Ως προς την αντοχή των στελεχών S. haemolyticus, δεν βρέθηκε κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στον κύριο PFGE τύπο h και τους υπόλοιπους τύπους στα περισσότερα αντιμικροβιακά, αν και παρατηρήθηκαν υψηλά ποσοστά αντοχής (p>0.05). Εξαίρεση αποτελεί το SXT, όπου ο κλώνος h έδειξε στατιστικά υψηλότερα ποσοστά αντοχής (p=0.040). Όλα τα στελέχη που μελετήθηκαν ήταν ανθεκτικά στην μεθικιλλίνη (MR-CNS, Πίνακας 47). Πίνακας 47. Ποσοστά αντοχής κύριων κλώνων S. haemolyticus στα αντιμικροβιακά. PFGE τύποι Type h Άλλοι P-value N=44 (%) N=14 (%) Αντοχή σε methicillin 44 (100) 14 (100) - Αντοχή σε clindamycin 42 (95.5) 12 (85.7) Αντοχή σε erythromycin 43 (97.7) 14 (100) Αντοχή σε kanamycin 43 (97.7) 14 (100) Αντοχή σε tobramycin 43 (97.7) 13 (92.9) Αντοχή σε gentamicin 42 (95.5) 13 (92.9) Αντοχή σε ciprofloxacin 43 (97.7) 12 (85.7) Αντοχή σε fusidic acid 42 (95.5) 12 (85.7) Αντοχή σε SXT 43 (97.7) 11 (78.6) Τα στελέχη S. lugdunensis ήταν πιο ευαίσθητα στους αντιμικροβιακούς παράγοντες σε σχέση με τους υπόλοιπους CNS. Ο κλώνος C ήταν πιο ανθεκτικός σε erythromycin, clindamycin, fusidic acid, tetracycline και SXT σε σχέση με τον κλώνο D (Πίνακας 48). 169

170 Πίνακας 48. Ποσοστά αντοχής των στελεχών S. lugdunensis σε σχέση με τους κύριους κλώνους. PFGE τύποι Τύπος C N=22 (%) Τύπος D N=9 (%) Άλλοι N=7 (%) Αντοχή σε methicillin Αντοχή σε ampicillin 11 (50) 4 (44.4) 4 (57.1) Αντοχή σε erythromycin 5 (22.7) 1 (11.1) 1 (14.3) Αντοχή σε clindamycin 5 (22.7) 1 (11.1) 1 (14.3) Αντοχή σε fusidic acid 3 (13.6) - 1 (14.3) Αντοχή σε tetracycline 2 (9.1) - - Αντοχή σε SXT 1 (4.5) - - Αντοχή σε gentamicin Αντοχή σε kanamycin Αντοχή σε ciprofloxacin Αντοχή σε rifampicin

171 8. ΣΥΣΧΕΤΙΣΜΟΣ BIOFILM ΜΕ ΚΛΩΝΟΥΣ ΚΑΙ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Συνολικά 106/226 S. epidermidis (78) και S. haemolyticus (28) ήταν biofilmθετικά. Τα στελέχη που απομονώθηκαν από BSIs υπερείχαν σημαντικά στην παραγωγή biofilm σε σχέση με αυτά που σχετίζονταν με PDAIs (p=0.003, Πίνακας 49). Αντιθέτως, δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά ως προς την παραγωγή βιομεμβράνης σε κάποιον από τους κύριους κλώνους των στελεχών αυτών, καθώς οι τρεις κύριοι κλώνοι (a, b, h) ήταν biofilm-θετικοί σε παρόμοια ποσοστά, όπως φαίνεται στον Πίνακα 50 (p>0.05). Αντιθέτως, στα στελέχη S. lugdunensis ο κύριος κλώνος C παρήγαγε biofilm σε μεγαλύτερο ποσοστό από τον δεύτερο σε συχνότητα κλώνο D (Πίνακας 51, Γράφημα 9). Οι S. lugdunensis από PDAIs ήταν biofilmθετικοί σε μεγαλύτερο ποσοστό σε σχέση με τα στελέχη από SSTIs και DSIs (Πίνακας 52). Πίνακας 49. Παραγωγή biofilm και φορεία οπερονίου ica σε στελέχη S. epidermidis και S. haemolyticus από βακτηριαιμίες (BSIs) και λοιμώξεις σχετιζόμενες με προσθετικά υλικά (PDAIs). BSIs N=100 (%) PDAIs N=126 (%) P-value Παραγωγή biofilm 58/100 (58) 48/126 (38.1) ica 72/100 (72) 78/126 (61.9)

172 Πίνακας 50. Παραγωγή biofilm, φορεία οπερονίου ica και συσχέτιση με κύριους κλώνους S. epidermidis και S. haemolyticus. S. epidermidis S. haemolyticus PFGE τύποι Τύπος a N= 50 Τύπος b N= 36 P- value Τύπος h N=44 Άλλοι N=14 P- value (%) (%) (%) (%) Παραγωγή biofilm 22 (44) 18 (50) (45.5) 8 (57.1) ica 46 (92) 26 (72.2) (38.6) 3 (21.4) Πίνακας 51. Παραγωγή biofilm και φορεία ica σε σχέση με κλώνους S. lugdunensis. PFGE τύποι Τύπος C N=22 (%) Τύπος D N=9 (%) Άλλοι N=7 (%) Παραγωγή biofilm 9 (40.9) 2 (22.2) 3 (42.9) ica 15 (68.2) 6 (66.7) 5 (71.4) Πίνακας 52. Παραγωγή biofilm και φορεία ica σε στελέχη S. lugdunensis από λοιμώξεις σχετιζόμενες με προσθετικά υλικά (PDAIs), λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων (SSTIs) και εν τω βάθει λοιμώξεις (DSIs). PDAIs SSTIs DSIs Σύνολο N=7 (%) N=22 (%) N=9 (%) N=38 Κλώνοι 5C, M, G 11C, 7D, 2K, M, E 6C, 2D, F 38 Παραγωγή biofilm 4 (57.1) 8 (36.4) 2 (22.2) 14 ica 3 (42.9) 20 (90.9) 3 (33.3)

173 C D Άλλοι κλώνοι Γράφημα 9. Ποσοστά παραγωγής βιομεμβράνης από τους κύριους PFGE τύπους S. lugdunensis. 9. ΦΟΡΕΙΑ ΟΠΕΡΟΝΙΟΥ ica ΚΑΙ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ BIOFILM ΚΑΙ ΚΛΩΝΟΥΣ Για την ανίχνευση του οπερονίου ica στα στελέχη S. epidermidis και S. haemolyticus, διερευνήθηκε με PCR η ύπαρξη των γονιδίων icaa και icad. Συνολικά, 150/226 (66.4%) στελέχη ήταν ica-θετικά. Υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των στελεχών που παράγουν biofilm και αυτών που είναι biofilm-αρνητικά ως προς τη φορεία του οπερονίου ica, 75.5% έναντι 58.3%, αντίστοιχα (P<0.05) ica(+) ica(-) 20 0 biofilm(+) biofilm(-) Γράφημα 10. Φορεία οπερονίου ica και συσχέτιση με παραγωγή biofilm στα στελέχη S. epidermidis και S. haemolyticus. 173

174 Ως προς την προέλευση των στελεχών, δεν βρέθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά ανάμεσα στα στελέχη CNS που απομονώθηκαν από βακτηριαιμίες και προσθετικά υλικά ως προς τη φορεία οπερονίου ica (72% και 61.9% αντίστοιχα, Πίνακας 49). Αντίθετα, η κατανομή σε κλώνους φαίνεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο μεταξύ των στελεχών S. epidermidis, όχι όμως και στον S. haemolyticus, όπως φαίνεται στον Πίνακα 50. Ο κύριος PFGE τύπος a υπερτερεί στην φορεία του ica σε σχέση με τον τύπο b (P=0.019). Μεταξύ των στελεχών S. lugdunensis, 26/38 στελέχη έφεραν το οπερόνιο ica, ενώ συνολικά 14 ήταν biofilm-θετικά. Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση της παρουσίας του ica με κάποιο κλώνο (Πίνακας 51), αλλά ούτε και με την παραγωγή βιομεμβράνης (71.4% των biofilm-θετικών και 66.7% των biofilm-αρνητικών S. lugdunensis έφεραν το ica). Ως προς την προέλευση των στελεχών, παρότι οι S. lugdunensis από PDAIs παρήγαγαν biofilm σε μεγαλύτερο ποσοστό, εν τούτοις τα στελέχη από SSTIs υπερείχαν στη φορεία του ica (Πίνακας 52). 10. ΦΟΡΕΙΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΤΙΝΩΝ ΣΕ S. epidermidis και S. haemolyticus ΚΑΙ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΚΛΩΝΟΥΣ Ο έλεγχος για την παρουσία προσκολλητινών στα στελέχη S. epidermidis και S. haemolyticus έγινε με PCR με κατάλληλους εκκινητές για την ανίχνευση των γονιδίων aap (accumulation associated protein), bap (biofilm associated protein), fnba (fibronectin binding protein A), atle (major cell wall autolysin epidermidis) και fbe (fibrinogen binding protein). Τα στελέχη του είδους S. haemolyticus αποκλείστηκαν από την στατιστική ανάλυση όσον αφορά τα γονίδια fbe και atle, τα οποία έχουν ταυτοποιηθεί μόνο στον S. epidermidis. Από τις τρεις άλλες προσκολλητίνες, η συχνότερη στον συνολικό πληθυσμό ήταν η Aap (40.3%), ακολουθούμενη από την FnbA (35.8%, Γράφημα 11). 174

175 aap bap fnba Γράφημα 11. Ποσοστά φορείας γονιδίων σύνθεσης προσκολλητινών στον συνολικό πληθυσμό S. epidermidis και S. haemolyticus. Μεταξύ των στελεχών του είδους S. epidermidis, το γονίδιο atle ανιχνεύθηκε σε 148/168 στελέχη (88.1%), ενώ το fbe σε 136 στελέχη (81%, Γράφημα 12) fbe atle Γράφημα 12. Ποσοστά φορείας γονιδίων σύνθεσης προσκολλητινών στον συνολικό πληθυσμό S. epidermidis. 175

176 Η συσχέτιση της φορείας των γονιδίων σύνθεσης προσκολλητινών με την κατανομή των σταφυλοκόκκων σε κλώνους φαίνεται στον Πίνακα 53. Ο κλώνος b των S. epidermidis υπερέχει στην φορεία του aap (p=0.049). Αν και όλα τα στελέχη του κλώνου αυτού έφεραν το γονίδιο atle, δεν βρέθηκε κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με τον κλώνο a (p>0.05). Επίσης, καμία στατιστικά σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε και στη φορεία των γονιδίων αυτών στα στελέχη S. haemolyticus. Πίνακας 53. Φορεία γονιδίων σύνθεσης προσκολλητινών σε σχέση με την κατανομή των CNS σε κλώνους. S. epidermidis S. haemolyticus PFGE τύποι Τύπος a N= 50 Τύπος b N= 36 P- value Τύπος h N=44 Άλλοι N=14 P- value (%) (%) (%) (%) aap 22 (44) 24 (66.7) (2.3) 1 (7.1) atle 46 (92) 36 (100) fbe 44 (88) 33 (91.7) bap 11 (22) 10 (27.8) (2.3) fnba 19 (38) 13 (36.1) (43.2) 5 (35.7) Ως προς την προέλευση των CNS, τα στελέχη από λοιμώξεις που σχετίζονται με την εφαρμογή προσθετικών υλικών υπερέχουν στατιστικά στην φορεία των γονιδίων aap και bap (p=0.006 και p=0.045 αντίστοιχα) σε σχέση με αυτά που απομονώθηκαν από καλλιέργειες αίματος ασθενών με βακτηριαιμία. Δεν βρέθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά στην φορεία των γονιδίων fnba, fbe, atle (p>0.005, Πίνακας 54). 176

177 Πίνακας 54. Φορεία γονιδίων προσκολλητινών σε σχέση με την προέλευση των CNS. BSIs N=100 (%) PDAIs N=126 (%) P-value aap σε σύνολο 30/100 (30) 61/126 (48.4) aap σε biofilm (+) 20/58 (34.5) 26/48 (54.2) aap σε biofilm (-) 10/42 (23.8) 35/78 (44.9) bap σε σύνολο 14/100 (14) 32/126 (25.4) bap σε biofilm (+) 7/58 (12.1) 10/48 (20.8) bap σε biofilm (-) 7/42 (16.7) 22/78 (28.2) fnba σε σύνολο 43/100 (43) 38/126 (30.2) fnba σε biofilm (+) 24/58 (41.4) 14/48 (29.2) fnba σε biofilm (-) 19/42 (45.2). 24/78 (30.8) atle σε S. epidermidis 61/71 (85.9) 87/97 (89.7) atle σε biofilm (+) S. epidermidis 36/42 (85.7) 35/36 (97.2) atle σε biofilm (-) S. epidermidis 25/29 (86.2) 52/61 (85.2) fbe σε S. epidermidis 61/71 (85.9) 75/97 (77.3) fbe σε biofilm (+) S. epidermidis 37/42 (88.1) 29/36 (80.6) fbe σε biofilm (-) S. epidermidis 24/29 (82.8) 46/61 (75.4)

178 11. ΦΟΡΕΙΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΤΟΞΙΝΩΝ ΣΕ S. epidermidis και S. haemolyticus ΚΑΙ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΚΛΩΝΟΥΣ Οι πηκτάση- αρνητικοί σταφυλόκοκκοι παράγουν διάφορες τοξίνες, μεταξύ των οποίων εντεροτοξίνες, καθώς και την τοξίνη του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας. Στην παρούσα μελέτη, έγινε ανίχνευση των γονιδίων παραγωγής εντεροτοξινών sea, seb, sec, sed, καθώς και του γονιδίου tst που κωδικοποιεί την τοξίνη του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας TSST-1 (Εικόνα 28). Η TSST-1είναι η συχνότερη τοξίνη που ανιχνεύθηκε στα υπό μελέτη στελέχη, ενώ ακολούθησαν η Sea και η Sec. Οι εντεροτοξίνες Seb και Sed δεν ανιχνεύθηκαν σε κανένα από τα στελέχη της παρούσας εργασίας (Γράφημα 13). Όπως φαίνεται στους παρακάτω πίνακες (55,56), δεν βρέθηκε συσχέτιση της παραγωγής τοξινών με την προέλευση του στελέχους ή την κατανομή του πληθυσμού σε κλώνους. Εικόνα 28. Ηλεκτροφόρηση προϊόντων PCR για την ανίχνευση των γονιδίων tst, sea και sec. 178

179 tst sea seb sec sed Γράφημα 13. Ποσοστά φορείας γονιδίων σύνθεσης τοξινών στον συνολικό πληθυσμό S. epidermidis και S. haemolyticus. Πίνακας 55. Φορεία γονιδίων σύνθεσης τοξινών σε σχέση με την προέλευση των CNS. BSIs N=100 (%) PDAIs N=126 (%) P-value S. epidermidis 71/100 (71) 97/126 (77) S. haemolyticus 29/100 (29) 29/126 (23) tst σε σύνολο 9/100 (9) 10/126 (7.9) tst σε MR-CNS 9/99 (9.1) 10/104 (9.6) tst σε MS-CNS sea σε σύνολο 8/100 (8) 4/126 (3.2) sea σε MR-CNS 8/99 (8.1) 3/104 (2.9) sea σε MS-CNS - 1/22 (2.5) sec σε σύνολο 3/100 (3) 4/126 (3.2) sec σε MR-CNS 3/99 (3) 4/104 (3.8) sec σε MS-CNS

180 Πίνακας 56. Φορεία γονιδίων σύνθεσης τοξινών στους κύριους κλώνους S. epidermidis και S. haemolyticus. S. epidermidis S. haemolyticus PFGE τύποι Τύπος a N= 50 Τύπος b N= 36 P- value Τύπος h N=44 Άλλοι N=14 P- value (%) (%) (%) (%) tst 6 (12) 1 (2.8) (9.1) 1 (7.1) sea 4 (8) 2 (5.6) (4.5) 1 (7.1) sec 1 (2) 2 (5.6) (2.3) seb sed ΦΟΡΕΙΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΛΟΙΜΟΓΟΝΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ S. lugdunensis ΚΑΙ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΚΛΩΝΟΥΣ Το γονίδιο fbl ανιχνεύθηκε σε όλα τα στελέχη S. lugdunensis που εξετάστηκαν, επιβεβαιώνοντας την φαινοτυπική ταυτοποίηση των στελεχών. Ο επόμενος κατά σειρά συχνότητας παράγοντας παθογένειας που ανιχνεύθηκε ήταν το γονίδιο atll, το οποίο βρέθηκε σε 36 από τα 38 στελέχη (94.7%). Ακολουθούν οι παράγοντες vwbl και slush, που βρέθηκαν σε 31 (81.6%) και 15 (39.5%) S. lugdunensis, αντίστοιχα (Γράφημα 14, Εικόνα 29). 180

181 fbl atll vwbl slush Γράφημα 14. Ποσοστά φορείας γονιδίων σύνθεσης λοιμογόνων παραγόντων S. lugdunensis. Εικόνα 29. Ηλεκτροφόρηση προϊόντων PCR για την ανίχνευση των γονιδίων vwbl, slush, ermc. Τα στελέχη από εν τω βάθει λοιμώξεις (DSIs) έφεραν σε μεγαλύτερο ποσοστό τα γονίδια vwbl και slush σε σχέση με αυτά από PDAIs και SSTIs (Πίνακας 57). Κανένα από τα στελέχη της ομάδας αυτής, όμως, δεν είχε το γονίδιο ermc. Ο κλώνος C υπερείχε στη φορεία του ermc, ενώ τα στελέχη που ανήκαν στον κλώνο D έφεραν σε μεγαλύτερο ποσοστό τα γονίδια vwbl και slush (Πίνακας 58), καθώς επίσης και τον 181