ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ ΣΤΕΡΕΩΝ ΠΑΡΑΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΟΙΝΟΠΟΙΙΑΣ

Transcript

1 ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ ΣΤΕΡΕΩΝ ΠΑΡΑΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΟΙΝΟΠΟΙΙΑΣ Δημήτριος Π. Ζάγκλης, Χριστάκης Α. Παρασκευά Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Πατρών, Τ.Κ 2654, Πάτρα και ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ, Ινστιτούτο Επιστημών Χημικής Μηχανικής, Τ.Κ 2654, Πάτρα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το σταφύλι αποτελεί ένα από τα πλέον ευρέως καλλιεργούμενα φρούτα στον κόσμο, ειδικά στις μεσογειακές χώρες, όπου η καλλιέργεια του είναι συνυφασμένη με την παράδοση και την ιστορία τους. Κατά τη διάρκεια της οινοποίησης, παράγονται μεγάλες ποσότητες στερεών υπολειμμάτων, τα λεγόμενα στέμφυλα, που αποτελούνται από τη φλούδα, τα κουκούτσια και τους μίσχους των σταφυλιών μετά την εξαγωγή του χυμού τους. Πολλές μελέτες έχουν δείξει την ευεργετική επίδραση της μέτριας κατανάλωσης κρασιού στην ανθρώπινη υγεία, φαινόμενο γνωστό και ως το γαλλικό παράδοξο, μειώνοντας τις πιθανότητες θανάτου από καρδιαγγειακές παθήσεις. Οι περισσότεροι ερευνητές συγκλίνουν στην άποψη ότι για τις ιδιότητες αυτές ευθύνεται το μη αλκοολούχο μέρος του κρασιού και πιθανότατα το φαινολικό του περιεχόμενο. Οι φαινόλες είναι ενώσεις που περιέχουν τουλάχιστον ένα βενζολικό δακτύλιο συνδεδεμένο με μία ομάδα υδροξυλίου, συναντώνται συχνά στη φύση (άλλο ένα παράδειγμα είναι οι ευεργετικές ιδιότητες του ελαιολάδου) και έχουν αντιμικροβιακές, αντιοξειδωτικές και αντικαρκινικές ιδιότητες. Στην περίπτωση του σταφυλιού, το μεγαλύτερο μέρος τους περιέχεται στη φλούδα και τα κουκούτσια, παραμένοντας έτσι στα στερεά υπολείμματα της οινοποίησης. Στην παρούσα εργασία εξετάστηκε η εξαγωγή και η απομόνωση των ενώσεων αυτών. Το πρώτο μέρος της διεργασίας περιελάμβανε την εκχύλιση των στεμφύλων και βελτιστοποίηση των συνθηκών (σύσταση διαλύτη, διάρκεια εκχύλισης, αναλογία στερεού/διαλύτη) για την μέγιστη εξαγωγή των φαινολών. Το παραγόμενο εκχύλισμα στη συνέχεια διηθήθηκε μέσω μεμβρανών υπερδιήθησης και νανοδιήθησης σε σειρά, με σκοπό την απομάκρυνση των μεγάλων οργανικών ενώσεων και τη συμπύκνωση των φαινολών στο στάδιο της νανοδιήθησης. Επόμενο βήμα ήταν ο διαχωρισμός των συμπυκνωμένων φαινολών από τα υπόλοιπα συστατικά, μέσω μίας διεργασίας προσρόφησης/εκρόφησης σε προσροφητικές ρητίνες. Εξετάστηκαν τρεις διαφορετικές ρητίνες (XAD4, XAD16N και XAD7HP) τόσο σε πειράματα διαλείποντος έργου όσο και σε κινητικά πειράματα σε στήλες. Το προϊόν της τελικής διεργασίας των ρητινών αποτελούσε ένα αιθανολικό διάλυμα φαινολών το οποίο τελικά συμπυκνώθηκε με εξάτμιση υπό κενό, με τελική συγκέντρωση 19 g/l φαινολών σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Από τα αρχαία χρόνια μέχρι σήμερα, η παραγωγή σταφυλιών έχει εξελιχθεί σε μια από τις σημαντικότερες δραστηριότητες παραγωγής φρέσκων φρούτων, που καλλιεργούνται σε όλο τον κόσμο. Η παγκόσμια παραγωγή σταφυλιών το 28 ήταν περίπου 3 εκατομμύρια μετρικοί τόνοι, με το 61% των αμπελώνων του κόσμου να βρίσκεται στην Ευρώπη. Αυτό σε σύγκριση με περίπου 57, 5, και 43 εκατομμύρια μετρικούς τόνους για τα πορτοκάλια, μπανάνες και μήλα, αντίστοιχα. Περίπου το 66% της παραγωγής σταφυλιών έχει υποστεί ζύμωση για παραγωγή κρασιού [1]. Τα στερεά υπολείμματα από την επεξεργασία των σταφυλιών, που σήμερα διατίθενται ως στερεά απόβλητα αποτελούνται από τα στέμφυλα σταφυλιών, τα κοτσάνια και την οινολάσπη, που συσσωρεύεται στο κάτω μέρος των ανοξείδωτων δεξαμενών, στις οποίες παράγεται ο οίνος. Τα συσσωρευμένα στερεά απόβλητα, με υψηλή περιεκτικότητα σε νερό, δεν μπορούν να διατεθούν απευθείας σε χώρους υγειονομικής ταφής εξαιτίας της δυσάρεστων οσμών και των τοξικών επιπτώσεων στο έδαφος. Το πρόβλημα διάθεσης των αποβλήτων, δημιουργεί έντονο προβληματισμό για τους οινοπαραγωγούς και μια επιτυχημένη λύση στην διαχείριση τους θα μπορούσε να παρέχει ένα πολύτιμο εργαλείο στους οινοποιούς για να βελτιώσουν τα οφέλη τους. Ο κύριος στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η ανάκτηση πολύτιμων συστατικών από τα στερεά υπολείμματα που παράγονται κατά την διάρκεια της οινοποίησης. Τα στερεά παραπροϊόντα περιέχουν σημαντικές ποσότητες πολυφαινολών [2-5], αντιοξειδωτικών ενώσεων με σημαντικά οφέλη για τον άνθρωπο [6]. Πιο συγκεκριμένα, τρανσ-ρεσβερατρόλη καθώς και κατεχίνες. Εκτός από τις θετικές επιπτώσεις στην υγεία, οι πολυφαινόλες έχουν υψηλή προστιθέμενη αξία. Σε αρκετά υψηλή καθαρότητα μπορεί να φτάσουν και 1.5 ευρώ/mg. Ενδεικτικά, σε ένα κιλό στέμφυλα περιέχονται περίπου 2.5 g κατεχινών και.1 g ρεσβερατρόλης [7], η σωστή τους απομόνωση μπορεί να υπερκαλύψει το κόστος επεξεργασίας με πιθανόν σημαντικό περιθώριο κέρδους, λύνοντας ταυτόχρονα το πρόβλημα της διάθεσης των στερεών αποβλήτων οινοποιίας.

2 Για το σκοπό αυτό έχουν χρησιμοποιηθεί αρκετές τεχνικές. Η πρωτοτυπία της παρούσας εργασίας έγκειται στο συνδυασμό δοκιμασμένων τεχνικών για επίτευξη του καλύτερου δυνατού αποτελέσματος. Οι τεχνικές που θα χρησιμοποιήθηκαν περιλαμβάνουν την εκχύλιση των στέμφυλων με διαλύτες [5, 8-1], μεθόδους διαχωρισμού μέσω διήθησης μεμβρανών [2, 11] και προσρόφηση σε ειδικά σχεδιασμένες ρητίνες [12, 13]. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εκχύλιση Το πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας αφορούσε την βελτιστοποίηση της εκχύλησης των φαινολικών ενώσεων από τα στέμφυλα. Ελέχθηκε η περιεκτικότητα του διαλύτη σε νερο αιθανόλη και διάλυμα υδροχλωρικού οξέος, η διάρκεια της εκχύλησης και η αναλογία στερεού/διαλύτη. Τα αποτελέσμετα αυτού του βήματος παρουσιάζονται στο Σχήμα 1. Αποδείχθηκε πως μίγματα αιθανόλης-νερού ήταν πιο αποδοτικά από τη χρήση καθαρών διαλυτών. Οι συνθήκες που αποδείχθηκαν ως βέλτιστες ήταν 5% αιθανόλη, 1% HCl 1Ν και 49% νερό, διάρκεια εκχύλισης 15 min και αναλογία στερεού/διαλύτη, 2 g/l. Υπό αυτές τις συνθήκες εκχυλίστηκαν 2 kg στέμφυλων και παράχθηκε εκχύλισμα όγκου 5 L. Πριν την εφαρμογή των μεμβρανών, το εκχύλισμα αυτό διηθήθηκε μέσω ανοξείδωτων κόσκινων με διάμετρο πόρων.125 mm και για την αφαίρεση της αιθανόλης αποστάχθηκε υπό κενό με τελικό όγκο υπολείμματος 15 L και τέλος αραιώθηκε στα 8 L με τη προσθήκη νερού. Η τελική περιεκτικότητα σε αιθανόλη ήταν 2.6% v/v, ποσοστό αποδεκτό για τη χρήση πολυμερικών μεμβρανών ευαίσθητων σε οργανικούς διαλύτες. Σχήμα 1: Βελτιστοποίηση συνθηκών εκχύλισης των φαινολικών ενώσεων από στέμφυλα Ethanol % (v/v) (a) HCl 1N (%) (b) Time (min) (c) Solid (g/l) (d)

3 Διήθηση μέσω μεμβρανών Το δεύτερο βήμα του διαχωρισμού των φαινολικών ενώσεων, ήταν ο διαχωρισμός τους βάση του μοριακού τους βάρους. Αυτό πραγματοποιήθηκε με διαδοχική διήθηση μέσω μεμβρανών, UF και NF. Στο Σχήμα 2 παρουσιάζονται, το ισοζύγιο όγκων της διεργασίας, καθώς και φωτογραφίες από τα δείγματα που ελήφθησαν σε κάθε βήμα. Βάση του μοριακού βάρους των στοχευόμενων ενώσεων, αναμένεται αυτές να συσσωρευτούν στο συμπύκνωμα της νανοδιήθησης. Από παλιότερες εργασίες των συγγραφέων [14], έχει αποδειχθεί πως ταυτόχρονα με τις φαινολικές ενώσεις, στο ίδιο κλάσμα συσσωρεύονται και σημαντικές ποσότητες υδατανθράκων. Αυτό οφείλεται στην παρόμοια κατανομή μοριακών βαρώ ανάμεσα στις δύο ομάδες ενώσεων. Η παρουσία υψηλών ποσοτήτων υδατανθράκων δυσχεραίνει την συμπύκνωση του φαινολικού διαλύματος μέσω απόσταξης, καθώς το ιξώδες του μίγματος αυξάνεται πολύ γρήγορα με την αφαίρεση νερού. Για το διαχωρισμό των φαινολών από τους υδατάνθρακες, και γενικά από τις μη-πολικές ενώσεις που περιέχονται στο συμπύκνωμα της νανοδιήθησης χρησιμοποιήθηκαν ειδικά σχεδιασμένες προσροφητικές ρητίνες. Σχήμα 2: Ισοζύγιο όγκων της προτεινόμενης διεργασίας μεμβρανών και απεικόνιση των δειγμάτων που ελήφθησαν σε κάθε βήμα.

4 Προσρόφηση/εκρόφηση σε ρητίνες Τρεις ρητίνες αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να διαχωρίζουν τις φαινολικές ενώσεις από τους υδατάνθρακες, οι XAD4, XAD16N και XAD7HP. Η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε με πειράματα διαλείποντος έργου, όπου σε 1 ml συμπυκνώματος προστέθηκαν διαφορετικές ποσότητες ρητίνης και η προσρόφηση λάμβανε χώρα υπό μηχανική ανάδευση για μία ώρα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 3. Η πιο αποδοτική ρητίνη αποδείχθηκε πως ήταν η XAD16N, η οποία και χρησιμοποιήθηκε και στα υπόλοιπα πειράματα. Αφού καθορίστηκε η καλύτερη ρητίνη, πραγματοποιήθηκαν κινητικά πειράματα σε στήλες πληρωμένες με ρητίνη, για τον καθορισμό των βέλτιστων παροχών και συνολικών όγκων διήθησης για τα τρία προτεινόμενα στάδια της διεργασίας ρητινών. Τα τρία στάδια ήταν, η προσρόφηση, η έκπλυση της στήλης με νερό για την απομάκρυνση των μη προσροφημένων ενώσεων και απομάκρυνση μέρους των προσροφημένων υδατανθράκων και τέλος διήθηση αιθανόλης για την εκρόφηση των φαινολών. Η διεργασία που προέκυψε συνοψίζεται στο Σχήμα 4. Όλοι οι όγκοι εκφράζονται σε rv (resin volume) που αντιστοιχεί στον ξηρό όγκο ρητίνης με την οποία ήταν πληρωμένη η στήλη. Σχήμα 3: Αξιολόγηση Διαχωριστικής ικανότητας φαινολών υδατανθράκων, των ρητινών XAD4, XAD16N και XAD7HP. 1 XAD4 XAD7HP XAD16N 1 XAD4 XAD7HP XAD16N 8 8 % adsorption % Carbohydrate adsorption resin (g/l) (a) resin (g/l) (b) Σχήμα 4: Προτεινόμενη διεργασία ρητινών για τον διαχωρισμό φαινολών υδατανθράκων από το συμπύκνωμα της νανοδιήθησης.

5 Τελική συμπύκνωση Μετά τη βελτιστοποίηση της διεργασίας προσρόφησης/εκρόφησης, αυτή εφαρμόστηκε σε μεγάλο όγκο συμπυκνώματος νανοδιήθησης. Το τελικό αιθανολικό διάλυμα, απαλλαγμένο από την πλειοψηφία των αρχικά περιεχόμενων υδατανθράκων καθιστούσε δυνατή τη μεγάλη συμπύκνωση των φαινολών μέσω απόσταξης υπό κενό (Σχήμα 5). Τα χαρακτηριστικά όλων των μέχρι τώρα βημάτων της διεργασίας καθώς και του τελικού συμπυκνώματος παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Από τα αποτελέσματα της συνολικής διεργασίας που παρουσιάζονται στον Πίνακα 1, είναι εμφανής η σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης των φαινολών που πραγματοποιήθηκε με την προτεινόμενη διεργασία, καθώς και ο πολύ μικρός όγκος του τελικού συμπυκνώματος που προκύπτει σε σύγκριση με την αρχική ποσότητα εκχυλίσματος. Σχήμα 5: Τελικό συμπύκνωμα της προτεινόμενης διεργασίας. Πίνακας 1: Κατανομή υδατανθράκων ολικών φαινολικών και απλών φαινολικών ουσιών κατά μήκος της διεργασίας. Δείγμα Όγκος Υδατάνθρακες a Φαινόλες b Catechin c Quercetin c Epicatechin c Rutin c ml Αρχικό < UF f < NF c < NF f <1 1.7 N/D Εκροφημένο * < Απόσταξη * * Η διεργασία των ρητινών δεν εφαρμόστηκε σε όλο τον όγκο του συμπυκνώματος της νανοδιήθησης. Οι όγκοι που παρουσιάζονται έχουν προκύψει με αναγωγή. a Οι υδατάνθρακες μετρήθηκαν με αντιδραστήριο L-τρυπτοφάνης και γλυκόζη σαν στανταρντ. b Τα ολικά φαινολικά μετρήθηκαν με αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος. c Οι απλές φαινολικές ενώσεις μετρήθηκαν με χρήση HPLC.

6 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Μέσω της προτεινόμενης διεργασίας, επιτεύχθηκε σημαντικός διαχωρισμού του φαινολικού περιεχομένου των στέμφυλων. Μετά τη βελτιστοποίηση της εξαγωγής των φαινολών, όσον αφορά τη σύσταση του διαλύτη, τη διάρκεια εκχύλιση και την αναλογία στερεού/υγρού, οι εκχυλισμένες ενώσεις διαχωρίστηκαν βάση του μοριακού τους βάρους μέσω διαδοχικής διήθησης μεμβρανών (UF, NF). Το επόμενη βήμα ήταν ο διαχωρισμός των πολικών ενώσεων από τους μη-πολικούς υδατάνθρακες μέσω προσρόφησης/εκρόφησης σε ρητίνες. Σε αυτό το στάδιο, εκτός του διαχωρισμού φαινολών-υδατανθράκων, πραγματοποιήθηκε και συμπύκνωση του διαλύματος των φαινολών καθώς και αλλαγή του διαλύτη από νερό σε αιθανόλη. Όλα τα παραπάνω καθιστούν πολύ πιο εύκολη και λιγότερο ενεργοβόρα την συμπύκνωση υπό κενό των φαινολών. Το τελικό προϊόν περιείχε 19 g/l φαινόλες σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος με 4.7 g/l κατεχίνη, σε σύγκριση με το αρχικό εκχύλισμα που περιείχε.44 g/l φαινόλες σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος και.7 g/l κατεχίνη. Τέλος, μπορούμε να πούμε πως πραγματοποιήθηκε διαχωρισμός και εμπλουτισμός των φαινολικών ενώσεων που περιέχονται στα στέμφυλα, καθώς στο τελικό προϊόν περιέχονται το 51% των αρχικών φαινολών και μόνο το 6% των αρχικά περιεχόμενων υδατανθράκων σε μόλις.1% του αρχικού όγκου. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. Jackson R.S., Wine Science: Principles and Applications, Elsevier/Academic Press, 28. [2]. Galanakis C.M., Markouli E., Gekas V. Sep. Purif. Technol. 17.(213) [3]. Kallithraka S., Tsoutsouras E., Tzourou E., Lanaridis P. Food Chem. 99:4.(26) [4]. Anastasiadi M., Chorianopoulos N.G., Nychas G.-J.E., Haroutounian S.A. J. Agric. Food Chem. 57:2.(28) [5]. Yilmaz Y., Toledo R.T. J. Food Comp. Analysis. 19:1.(26) [6]. Yu S., Cheung K.L., Li W., Kong A.-N., Plant Phenolic Compounds: Biochemistry, Nutrition, and Pharmacology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA, 29. [7]. Crespo J.G., Brazinha C. Filtr. Sep., 47:2.(21) [8]. Kallithraka S., Garcia Viguera C., Bridle P., Bakker J. Phytochemical Analysis, 6:5.(1995) [9]. Makris D.P., Boskou G., Andrikopoulos N.K. Bioresour. Technol., 98:15.(27) [1]. Spigno G., Tramelli L., De Faveri D.M. J. Food Engin. 81:1.(27) [11]. Zagklis D.P., Paraskeva C.A. Water Sci. Technol., 69:1.(214) [12]. Soto M.L., Moure A., Domínguez H., Parajó J.C. J. Food Engin. 15:1.(211) [13]. Kammerer D., Gajdos Kljusuric J., Carle R., Schieber A. Eur. Food Res. Technol. 22:3-4.(25) [14]. Zagklis D.P., Vavouraki A.I., Kornaros M.E., Paraskeva C.A. J. Hazard. Mater. 285:.(215)