Πανεπιστήμιο Πατρών Διατμηματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Πληροφορική Επιστημών Ζωής»

Transcript

1 Πανεπιστήμιο Πατρών Διατμηματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Πληροφορική Επιστημών Ζωής» Κλεφτογιάννης Δημήτριος Πρόβλεψη microrna γονιδίων: «Σχεδιασμός και Ανάπτυξη ολοκληρωμένου δικτυακού εργαλείου εξαγωγής χαρακτηριστικών και ταξινόμησης με χρήση καινοτόμων τεχνικών Υπολογιστικής Νοημοσύνης» Επιβλέπων Τσακαλίδης Αθανάσιος, Kαθηγητής Πάτρα Αύγουστος 2011

2 Επιβλέπων Τσακαλίδης Αθανάσιος, Καθηγητής,Τμήμα Μηχανικών Η/Υ και Πληροφορικής Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή 1. Τσακαλίδης Αθανάσιος, Καθηγητής,Τμήμα Μηχανικών Η/Υ και Πληροφορικής 2. Λυκοθανάσης Σπυρίδων, Καθηγητής,Τμήμα Μηχανικών Η/Υ και Πληροφορικής 3. Μακρής Χρήστος, Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Μηχανικών Η/Υ και Πληροφορικής 2 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

3 Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε σε συνεργασία με το Εργαστήριο Γραφικών πολυμέσων και Γεωγραφικών Συστημάτων του Τμήματος Μηχανικών Η/Υ & Πληροφορικής. 3 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

4 4 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624

5 Ευχαριστίες Στο σημείο αυτό νιώθω την ανάγκη να ευχαριστήσω τους ανθρώπους που με έχουν βοηθήσει και χωρίς την συμβολή τους θα ήτανε αδύνατη η εκπόνηση της συγκεκριμένης Διπλωματικής Εργασίας. Αρχικά θέλω να πω ένα μεγάλο ευχαριστώ στον Επιβλέποντα Καθηγητή Αθανάσιο Τσακαλίδη. Και αυτό γιατί όχι μόνο μου έδωσε την ευκαιρία να υλοποιήσω την παρούσα εργασία, αλλά και γιατί όλη μου η πορεία μέχρι στιγμής έχει στηριχθεί από την παρουσία του και τις συμβουλές του. Από τα προπτυχιακά μου χρόνια έχω δεχτεί την πολύτιμη καθοδήγησή του σε ακαδημαϊκά θέματα αλλά και την υποστήριξη του όποτε τον χρειάστηκα επιβεβαιώνοντας για πολλοστή φορά το ότι είναι ένας πραγματικός «δάσκαλος» που σκύβει πάνω από τα προβλήματα των φοιτητών του. Επιπλέον θέλω να ευχαριστήσω θερμά τον Καθηγητή Λυκοθανάση Σπυρίδωνα καθώς δέχτηκε να συμμετάσχει στην εξεταστική επιτροπή μου αλλά και με εμπιστεύτηκε στο εργαστήριο του από το οποίο αποκόμισα τεράστιες γνώσεις. Επίσης ευχαριστώ θερμά και τον Επίκουρο Καθηγητή Μακρή Χρήστο καθώς πάντα οι συμβουλές του και οι παρατηρήσεις τους μου ήταν χρήσιμες. Νιώθω επίσης την ανάγκη να ευχαριστήσω και τους πιο άμεσους συνεργάτες μου που μαζί τους δούλεψα σε ένα περιβάλλον που αποτελεί πρότυπο για τα Πανεπιστημιακά δεδομένα της χώρας μας. Αρχικά ευχαριστώ την Δρ. Σεφερίνα Μαυρουδή για την καθοδήγηση της καθώς με την ερευνητική εμπειρία της με κατεύθυνε στην ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας. Επίσης σαν συντονίστρια της ερευνητικής ομάδας Βιοπληροφορικής του Τμήματος Μηχανικών Η/Υ μου μεταλαμπάδευσε γνώσεις που θα μου είναι χρήσιμες και για τα επόμενα χρόνια των σπουδών μου. Ένα ευχαριστώ επιπλέον χρωστάω στην υποψήφια Διδάκτορα Ραψομανίκη Μαρία-Άννα καθώς με τη βοήθεια της μπήκα στον κόσμο της Βιοπληροφορικής και γνώρισα αρκετά ανοιχτά ερευνητικά ζητήματα. Χρωστάω επίσης ένα μεγάλο ευχαριστώ στον υποψήφιο Διδάκτορα Θεοφιλάτο Κώσταντίνο για την όλη εποπτεία της παρούσας εργασίας αλλά και την υποστήριξη του. Πάντα με χαμόγελο και υπομονή με κατεύθυνε να λύνω όποιο πρόβλημα προέκυπτε και πραγματικά του είμαι ευγνώμων για τη συνεργασία που είχαμε. Τέλος δε θα μπορούσα να παραλείψω και την οικογένεια μου καθώς η αγάπη της και η υποστήριξη της σε ότι κάνω δε σταματάει ποτέ. 5 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

6 6 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ευχαριστίες... 5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... 7 Ευρετήριο Πινάκων... 9 Ευρετήριο Εικόνων Περίληψη Abstract Εισαγωγή Κεφάλαιο 1: Τα microrna γονίδια Η ΑΝΑΚΆΛΥΨΗ ΤΩΝ MICRORNA ΓΟΝΙΔΊΩΝ Η MICRORNA ΈΚΦΡΑΣΗ ΒΙΟΓΈΝΕΣΗ ΤΩΝ MICRORNA ΓΟΝΙΔΊΩΝ Ο ΜΗΧΑΝΙΣΜΌΣ ΔΡΆΣΗΣ ΟΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΊΕΣ ΤΩΝ MICRORNAS ΣΧΕΤΙΖΌΜΕΝΕΣ ΑΣΘΈΝΕΙΕΣ Κεφάλαιο 2 :Υπάρχουσες Βάσεις Δεδομένων και χρήσιμα Εργαλεία Ανάλυσης ΒΆΣΕΙΣ ΔΕΔΟΜΈΝΩΝ GENOME BROWSERS & ΠΡΟΓΡΆΜΜΑΤΑ ΓΙΑ ΣΤΟΊΧΙΣΗ ΑΚΟΛΟΥΘΙΏΝ ΠΡΟΓΡΆΜΜΑΤΑ ΠΡΌΒΛΕΨΗΣ ΔΕΥΤΕΡΟΤΑΓΟΎΣ ΔΟΜΉΣ Κεφάλαιο 3: Περιγραφή χαρακτηριστικών πρόβλεψης ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΆ ΣΧΕΤΙΚΆ ΜΕ ΤΗΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΊΑ VIENNA RNA PACKAGE ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΆ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΆ UNAFOLD ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΆ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΆ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΆ ΣΧΕΤΙΚΆ ΜΕ ΤΑ ΖΕΎΓΗ ΒΆΣΕΩΝ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΆ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΆ ΝΈΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΆ Κεφάλαιο 4: Υπάρχουσες μεθοδολογίες πρόβλεψης ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΈΣ ΜΈΘΟΔΟΙ ΜΗ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΈΣ ΜΈΘΟΔΟΙ Support Vector Machine ταξινομητές Πιθανοτικά μοντέλα πρόβλεψης Κεφάλαιο 5: Προτεινόμενη μεθοδολογία πρόβλεψης SUPPORT VECTOR MACHINE ΤΑΞΙΝΟΜΗΤΉΣ ΕΞΕΛΙΚΤΙΚΟΊ ΑΛΓΌΡΙΘΜΟΙ Εισαγωγή στους Γενετικούς Αλγόριθμους ΠΡΟΤΕΙΝΌΜΕΝΗ ΥΒΡΙΔΙΚΉ ΜΈΘΟΔΟΣ ΤΑΞΙΝΌΜΗΣΗΣ ΚΑΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΆ ΑΠΟΤΕΛΈΣΜΑΤΑ Σύνολο Δεδομένων Υπολογισμένα Χαρακτηριστικά Μεθοδολογία Αποτελέσματα Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

8 Κεφάλαιο 6: Υλοποίηση εργαλείου πρόβλεψης ΛΕΠΤΟΜΈΡΕΙΕΣ ΥΛΟΠΟΊΗΣΗΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΌΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΏΝ ΠΡΌΒΛΕΨΗΣ ΥΛΟΠΟΊΗΣΗ ΤΟΥ ΜΟΝΤΈΛΟΥ ΠΡΌΒΛΕΨΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΏΝ ΠΑΡΟΥΣΊΑΣΗ ΕΡΓΑΛΕΊΟΥ Κεφάλαιο 7: Επίλογος Παράρτημα 1: Υπάρχοντα on line εργαλεία πρόβλεψης Παράρτημα 2: Παραπομπές Βιβλιογραφία Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

9 Ευρετήριο Πινάκων ΠΙΝΑΚΑΣ 1:ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ MICRORNAS ΣΤΑ ΘΗΛΑΣΤΙΚΑ ΠΙΝΑΚΑΣ 2: ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΑ MICRORNAS ΚΑΙ ΣΤΟΧΟΙ ΠΙΝΑΚΑΣ 3: MIRNAS ΜΕ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΣΕ ΚΑΚΟΗΘΕΙΕΣ ΠΙΝΑΚΑΣ 4:Ο ΨΕΥΔΟΚΩΔΙΚΑΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΓΑ ΤΟΥ HOLLAND ΠΙΝΑΚΑΣ 5: ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΤΗΣ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗΣ ΠΙΝΑΚΑΣ 6: ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΜΕ ΤΑ 7 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΠΙΝΑΚΑΣ 7:ΤΥΠΙΚΗ ΜΟΡΦΗ ΑΡΧΕΙΟΥ.DG Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

10 Ευρετήριο Εικόνων Εικόνα 1:Το πρόδρομο microrna και το ώριμο για το γονίδιο lin Εικόνα 2:MicroRNA σε intergenic DNA περιοχές Εικόνα 3:Μια τυπική δομή Pol IΙ Εικόνα 4: Μεταγραφή του γονιδίου από την Pol II και παραγωγή του pri-mirna Εικόνα 5: Tο πρώτο βήμα επεξεργασίας του pri-mirna και η παραγωγή του pre-mirna Εικόνα 6: Το συνολικό μοντέλο βιογένεσης και δράσης των micrornas Εικόνα 7: Κρυσταλλικές δομές για hs Drosha, Expo5 και Dicer Εικόνα 8: Προβλεπόμενες δομές για τα mir-1 mir-34 kai mir Εικόνα 9: Οι λειτουργικές περιοχές των argonaute πρωτεϊνών Εικόνα 10: Οι μηχανισμοί δράσης των micrornas Εικόνα 11:Μια αναλυτική αναπαράσταση του μηχανισμού δράσης Εικόνα 12 :Οι σημαντικότερες mirna θεραπευτικές στρατηγικές Εικόνα 13 :Μια τυπική mirbase registry Εικόνα 14 :Τα χαρακτηριστικά που χρησιμοποιεί η μέθοδος mirscan Εικόνα 15 :Το διάγραμμα ροής της mirseeker Εικόνα 16 :Το διάγραμμα ροής της μεθόδου MiRcheck Εικόνα 17 :Το διάγραμμα ροής της μεθόδου MirAlign Εικόνα 18 :Το διάγραμμα ροής της μεθόδου ProMiR Εικόνα 19 :Το διάγραμμα ροής της μεθόδου BayesMiRNAFind Εικόνα 20 :Γραμμικά διαχωρίσιμα δεδομένα Εικόνα 21 :Εύρεση του βέλτιστου επιπέδου διαχωρισμού Εικόνα 22 :Το βέλτιστο επίπεδο διαχωρισμού Εικόνα 23 :Αναγωγή σε χώρο υψηλότερων διαστάσεων Εικόνα 24 : Γραμμικός διαχωρισμός με training error Εικόνα 25 : One versus All και One versus One multiclass classification Εικόνα 26 : Σχηματική απεικόνιση γονότυπου Εικόνα 27 : Διάγραμμα ροής ενός βασικού Γενετικού Αλγορίθμου Εικόνα 28 : Προτεινόμενη μεθοδολογία ταξινόμησης & βελτιστοποίησης Εικόνα 29 : Απόδοση καλύτερου μέλους ανά γενιά Εικόνα 30 : Άθροισμα της απόδοση των μελών ανά γενιά Εικόνα 31 : Το.NET Framework stack Εικόνα 32 : Εκτέλεση της Vienna fold συνάρτησης Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

11 Εικόνα 33 : Διάγραμμα ροής της διαδικασίας υπολογισμού των χαρακτηριστικών Εικόνα 34 : Διάγραμμα ροής της διαδικασίας πρόβλεψης για νέες ακολουθίες Εικόνα 35 : Η αρχική σελίδα του εργαλείου Εικόνα 36 : Τα μενού επιλογών για τις 3 κατηγορίες χρηστών Εικόνα 37 : Η φόρμα υπολογισμού των χαρακτηριστικών Εικόνα 38 : Η φόρμα πρόβλεψης για mirna ακολουθίες Εικόνα 39 : Η βασική φόρμα αναζήτησης Εικόνα 40 : Ενδεικτικά αποτελέσματα αναζήτησης Εικόνα 41 : Χρήσιμοι σύνδεσμοι άλλων εργαλείων Εικόνα 42 : Στοιχεία επικοινωνίας Εικόνα 43 : Εισάγοντας όνομα και κωδικό χρήστη Εικόνα 44 : Φόρμα δημιουργίας νέου χρήστη Εικόνα 45 : Η επιλογή εισαγωγής αρχείου με δεδομένα Εικόνα 46 : Οι ακολουθίες που έχει ανεβάσει ένας χρήστης στο σύστημα Εικόνα 47 : Οι επιλογές του διαχειριστή στο σύστημα Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

12 12 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624

13 Περίληψη Η ανακάλυψη των microrna γονιδίων το 1993 έφερε επανάσταση στα όσα γνωρίζαμε από το κεντρικό δόγμα της Βιολογίας για τη σύνθεση των πρωτεϊνών και τη ρύθμιση της πρωτεϊνικής έκφρασης. Αυτό γιατί τα microrna γονίδια δεν κωδικοποιούν κάποια πρωτεΐνη αλλά αντί αυτού παράγουν μικρά μόρια μεγέθους περίπου 22 νουκλεοτιδιών. Τα μόρια αυτά αλληλεπιδρούν με το mrna και συγκεκριμένα βρίσκουν στόχους στις 3 UTR περιοχές άλλων γονιδίων και αλληλεπιδρούν με βάση την αρχή της συμπληρωματικότητας Watson-Crick. Αποτέλεσμα αυτής της πρόσδεσης είναι η καταστολή της πρωτεϊνικής έκφρασης του γονιδίου στόχου μέσω αναστολής της μετάφρασης ή μέσω της υποβάθμισης του mrna. Μετά την ανακάλυψη των microrna και του τρόπου αλληλεπίδρασης τους ήταν φυσικό να ακολουθήσουν εκτεταμένες έρευνες για τις κυτταρικές διεργασίες τις οποίες ρυθμίζουν αλλά και σε ποιών γονίδιων τη ρύθμιση λαμβάνουν μέρος. Ως αποτέλεσμα προέκυψε ότι σε πολλές γνωστές ασθένειες παρουσιάζεται άμεση συσχέτιση με ρύθμιση από microrna. Τέτοια περίπτωση αποτελεί και η ασθένεια του καρκίνου η οποία σε συνδυασμό με την «λεπτή» ρύθμιση που προκαλούν τα microrna δίνει ελπίδες για νέες μοριακές θεραπείες. Αυτά είναι μερικά παραδείγματα από τα οποία μπορούμε να καταλάβουμε τη μεγάλη σημασία των microrna και την ανάγκη για αποδοτική πρόβλεψη τους. Εξαιτίας του μικρού τους μεγέθους αλλά και του μικρού τους ποσοστού σε σχέση με το μέγεθος του γονιδιώματος (περίπου 3%) ο πειραματικός τους εντοπισμός χαρακτηρίζεται εξαιρετικά δύσκολος. Για το λόγο αυτό έχουν επιστρατευτεί αρκετές μέθοδοι Υπολογιστικής Νοημοσύνης και Αλγόριθμοι οι οποίοι μπορούν να «ξεχωρίσουν» τα πραγματικά γονίδια από τα ψεύτικα γονίδια δημιουργώντας έτσι μοντέλα πρόβλεψης. Μέχρι στιγμής έχουν χρησιμοποιηθεί σαν μέθοδοι ταξινόμησης, Support Vector Machine, δίκτυα Bayes και άλλες πιθανοτικές μέθοδοι όπως τα Hidden Markov μοντέλα.όλες οι μέθοδοι αυτού του είδους βασίζονται στον υπολογισμό αρκετών χαρακτηριστικών για τα microrna που σχετίζονται με το ακολουθιακό περιεχόμενο, με τη δομή τους στο χώρο αλλά και με θερμοδυναμικά στοιχεία των μορίων. Σε μεγάλο βαθμό η αποδοτικότητα πρόβλεψης βασίζεται στην επιλογή των πιο αντιπροσωπευτικών χαρακτηριστικών και στη βελτιστοποίηση των παραμέτρων της υπολογιστικής μεθόδου που χρησιμοποιείται χωρίς μέχρι τώρα να έχει βρεθεί μια αξιόπιστη λύση. Στην παρούσα διπλωματική εργασία αρχικά προτείναμε μια νέα υβριδική μεθοδολογία για ταυτόχρονη ταξινόμηση microrna γονιδίων, εξαγωγή χαρακτηριστικών και υπολογισμό παραμέτρων. Η προτεινόμενη μεθοδολογία χρησιμοποιεί τις καινοτόμες τεχνικές του Εξελικτικού Προγραμματισμού και συγκεκριμένα τους Γενετικούς Αλγορίθμους για την εξαγωγή χαρακτηριστικών και βελτιστοποίηση παραμέτρων καθώς και Support Vector Machine για ταξινόμηση. Απώτερος στόχος της παρούσας 13 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

14 εργασίας ήταν να αναπτυχθεί μια ολοκληρωμένη διαδικτυακή πλατφόρμα η οποία επιτρέπει αρχικά υπολογισμό χαρακτηριστικών για τις γονιδιακές ακολουθίες που θα εισάγει ο χρήστης και κατά δεύτερον δίνει την πρόβλεψη του ταξινομητή για το αν είναι ή όχι microrna γονίδια μέσω ενός φιλικού περιβάλλοντος. Επιπλέον, ενσωματώθηκαν τα περισσότερα microrna χαρακτηριστικά που έχουν προταθεί στη βιβλιογραφία και η αποδοτικότητα πρόβλεψης του ταξινομητή βελτιώθηκε μέσω της προτεινόμενης υβριδικής μεθόδου. Ενσωματώσαμε διάφορα πακέτα για τον υπολογισμό των χαρακτηριστικών όπως το Vienna RNA Package και το UnaFold και αυτό το κομμάτι της εργασίας σχετίζεται με την έρευνα για τη θερμοδυναμική και φυσικοχημική συμπεριφορά των μικρών RNA μορίων. Καινοτόμο στοιχείο αποτελεί το γεγονός ότι ο υπολογισμός των χαρακτηριστικών γίνεται με τέτοιο τρόπο ώστε να ευνοείται στη συνέχεια η εφαρμογή μεθόδων Υπολογιστικής Νοημοσύνης. Επιπλέον στο σύστημα ενσωματώσαμε βάση δεδομένων η οποία αποθηκεύει τις επεξεργασμένες ακολουθίες και τα υπολογισμένα χαρακτηριστικά δίνοντας ώθηση για την κατασκευή νέων συνόλων δεδομένων. Τέλος αυτή η δυνατότητα ανάκτησης πληροφορίας κάνει το σύστημα μας μια ολοκληρωμένη πλατφόρμα μελέτης μικρών RNA μορίων και πρόβλεψης microrna γονιδίων. 14 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624

15 Abstract The discovery of microrna genes in 1993 challenged the view of the Central Dogma of Biology and introduced a new layer of complexity in which RNA is not only a carrier of gene information but also a mediator of gene expression and protein synthesis. Typically, microrna genes are short noncoding (~20-22 nt) RNAs that do not encode proteins, but instead they produce small RNA molecules. These molecules can regulate mrna target genes by binding to the 3 UTR of mrna in accordance to Watson-Crick complementarity for cleavage or translational repression. MicroRNAs have been a major object of study as they have been found to be involved in some basic biological processes. These observations underline the importance of normal microrna homeostasis on functions such as development, differentiation, apoptosis and proliferation. Dysregulation of mirna is fundamental to the pathogenesis of many diseases and it has been long suspected that mirna expression can be deregulated in cancer and abnormal mirna activity may lead to tumorgenesis. From all the above, it is obvious that the better understanding of mirna mechanism and function may lead to new and more sophisticated design of clinical therapies. Consequently, the identification of novel microrna genes is a challenging bioinformatics problem. The experimental identification has some important drawbacks: the small size of microrna genes in comparison to the size of the genome, cost and time, and low sensitivity. To overcome these technical problems a lot of computational methods have been proposed and several Artificial Intelligence techniques have been applied to distinguish real pre-mirnas from pseudo hairpins. Support Vector Machines, Naïve Bayes and other probabilistic algorithms such as Hidden Markov Models have been successfully developed as classification methods. All these computational methods rely on the computation of several sequential, structural and thermodynamical microrna features. In addition, the prediction efficiency is related to the extraction of the most discriminative features and to the optimization of the parameters. At first, this thesis presents a hybrid approach for simultaneous microrna classification, feature extraction and parameters optimization. We took advantage of the innovative techniques of Evolutionary Programming and we introduced an embedded classification method, which combines the efficiency and robustness of Support Vector Machines with Genetic Algorithms for feature selection and parameters optimization. Secondly, objective of this thesis was the development of an online platform for effective microrna genes prediction. The prediction model is based on our classification model and we used a significant feature subset that the 15 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

16 proposed methodology revealed to be consistent. Also, we provided the opportunity to calculate all the microrna features that have been proposed in the literature. We incorporated different packages such as the Vienna RNA package and UnaFold package and we introduced some new features with high discriminative power. This work is related to biophysics and thermodynamics of small RNA molecules and it can be applied to other categories of regulatory molecules. Also, the provided service in accordance to the feature calculation will encourage the application of other Artificial Intelligence Techniques in identifying micrornas. We hope that the construction of new datasets will contribute to the Development of new Machine Learning methodologies. Furthermore, our tool maintains a Database about predicted microrna sequences plus some informating metadata about them. Finally it can act as an integraded system and the usage of metadata enables information retrieval. 16 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

17 Εισαγωγή Η παρούσα εργασία αποτελείται από 7 κεφάλαια τα οποία πραγματεύονται τη φύση του προβλήματος και των δεδομένων καθώς και ειδικότερες λεπτομέρειες για την υλοποίηση του εργαλείου υπολογισμού χαρακτηριστικών και πρόβλεψης. Στο πρώτο κεφάλαιο της παρούσας εργασίας γίνεται μια αναδρομή στην ανακάλυψη των microrna γονιδίων και στον τυχαίο τρόπο με τον οποίο βρέθηκε οτι αλληλεπιδρούν με τα τους mrna στόχους τους. Στην συνέχεια του κεφαλαίου περιγράφουμε τις ιδιαιτερότητες στην έκφραση τους,τον μηχανισμό παραγωγής των ώριμων mirna, τον μηχανισμό δράσης τους και την εμπλοκή τους σε κυτταρικές διεργασίες και τέλος το κεφάλαιο κλείνει με περιγραφή των σημαντικότερων ασθενειών στις οποίες έχει βρεθεί ότι εμπλέκονται. Το δεύτερο κεφάλαιο πραγματεύεται την περιγραφή των βασικότερων βάσεων δεδομένων και εργαλείων μελέτης γονιδιωμάτων που υπάρχουν στο διαδίκτυο όπως επίσης και των βασικών προγραμμάτων μελέτης της δευτεροταγούς δομής μορίων που είναι ζωτικής σημασίας για κάθε μελέτη παρόμοιου τύπου. Στο τρίτο κεφάλαιο έχουμε συμπεριλάβει μια αναλυτική περιγραφή των σημαντικότερων χαρακτηριστικών που συγκεντρώσαμε από τη βιβλιογραφία και τα οποία είναι αντιπροσωπευτικά όχι μόνο για τα mirna αλλά και για τις υπόλοιπες κατηγορίες μικρών μορίων RNA (ncrna). Το τέταρτο κεφάλαιο αφορά στην περιγραφή υπαρχόντων προσεγγίσεων πρόβλεψης microrna γονιδίων ώστε να φανερωθούν οι ατέλειες και οι αδυναμίες που κληθήκαμε να συμπληρώσουμε. To πέμπτο κεφάλαιο αφορά στην περιγραφή της μεθοδολογίας πρόβλεψης που υλοποιήσαμε. Eν συντομία είναι μια υβριδική μέθοδος ταξινόμησης που ενσωματώνει την αποδοτικότητα των Support Vector Machines μαζί με Γενετικούς Αλγορίθμους για βελτιστοποίηση παραμέτρων αλλά και εξαγωγή χαρακτηριστικών με διακριτική ικανότητα. Το κεφάλαιο έξι έχει αφιερωθεί στην περιγραφή του δικτυακού εργαλείου, σε λεπτομέρειες υλοποίησης καθώς και στην παρουσίαση των δυνατοτήτων του και το τελευταίο κεφάλαιο αποτελεί τον επίλογο της εργασίας μαζί με τα σχέδια μας για το μέλλον. Τέλος στο παράρτημα 1 υπάρχει μια σύντομη παρουσίαση των υπαρχόντων μεθοδολογιών πρόβλεψης που έχουν υλοποιηθεί σε εργαλεία και τέλος το παράρτημα 2 περιέχει χρήσιμες παραπομπές και επεξηγήσεις. 17 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

18 Μακάρι εγω μαζί να μην ήμουνα με τους πέμπτους ανθρώπους, αλλά ή πριν να είχα πεθάνει ή μετά να γενιόμουν, γιατί τώρα το γένος είναι σιδερένιο ώστε την ημέρα δε θα πάψουν απ τον κόπο και τον πόνο ουτε τη νύχτα να σβήνουν κι οι θεοί θα τους δίνουν βαριά βάσανα αλλά όμως και σ αυτούς θα είναι ενωμένα τα καλα στα κακά. Και ο Δίας θα αφανίσει και αυτό το γένος των λαλούμενων ανθρώπων, όταν φτάσουν να έχουν γκρίζους κροτάφους στη γέννησή τους. Ησίοδος Έργα και Ημέραι 7 ος αιώνας π.χ. 18 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

19 Κεφάλαιο 1: Τα microrna γονίδια Η ανακάλυψη των microrna γονιδίων Η ανακάλυψη των microrna γονιδίων μας πηγαίνει στο 1993 όταν ο Victor Ambros και οι συνεργάτες του μελετούσαν τη ρύθμιση του κύκλου ανάπτυξη των νυμφών στον οργανισμό C.elegans. Οι μελέτες τους οδήγησαν στην διαπίστωση ότι το γονίδιο lin-4 δεν παρήγαγε κάποια πρωτεΐνη όπως ήτανε το αναμενόμενο σύμφωνα με το Κεντρικό Δόγμα της Βιολογίας 1, αλλά αντί αυτού το συγκεκριμένο γονίδιο παρήγαγε μικρά μόρια RNA μήκους περίπου 22 νουκλεοτιδίων με αδιευκρίνιστο μηχανισμό λειτουργίας [1] [2]. Για αρκετά μεγάλο διάστημα το lin-4 ήταν το μόνο παράδειγμα ενδογενούς ρυθμιστικού μορίου RNA. Επτά χρόνια αργότερα η κατάσταση άλλαξε δραματικά όταν διαπιστώθηκε από το εργαστήριο του Rukvun ότι και ένα άλλο γονίδιο του C.elegans το γονίδιο let-7 είχε παρόμοια συμπεριφορά με το προηγούμενο και παρήγαγε ένα παρόμοιο μικρό μόριο περίπου 22 νουκλεοτιδίων [3]. Μέχρι το 2000 ομόλογα των προηγούμενων γονιδίων είχαν εντοπιστεί στον άνθρωπο, στη Drosophila και σε άλλα 11 διμερή ζώα [5]. Εξαιτίας της κοινής τους εμπλοκής στη χρονική ρύθμιση της ανάπτυξης τα γονίδια lin-4 και let-7 πήραν την ονομασία μικρής διάρκειας-rna (small temporal RNA,stRNA). Τα επόμενα χρόνια η ραγδαία πρόοδος στον τομέα των Βιοεπιστημών οδήγησε στην ανακάλυψη αρκετών νέων γονιδίων τα οποία δεν παρήγαγαν πρωτεΐνες αλλά μικρά μόρια μεγέθους περίπου 22 νουκλεοτιδίων [6]. Οι εκτεταμένες έρευνες έδειξαν ότι υπήρξε συντήρηση αυτών των γονιδίων ανάμεσα στα είδη και ότι πολλά από τα νέα γονίδια που ανακαλύφθηκαν δεν σχετίζονταν με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της ανάπτυξης αλλά με άλλες σημαντικές κυτταρικές διεργασίες [7]. Έτσι τη θέση του όρου strna πήρε η ονομασία microrna για να περιγράψει μια νέα ευρύτερη κατηγορία γονιδίων με παρόμοια χαρακτηριστικά αλλά αδιευκρίνιστο μηχανισμό δράσης. Έτσι μπορούμε να δώσουμε έναν πιο τυπικό ορισμό για τα microrna (mirna) αναφέροντας ότι πρόκειται για μεγέθους νουκλεοτιδικά ενδογενή και μη κωδικά μόρια RNA τα οποία προέρχονται από μεγαλύτερα πρόδρομα μέσω μιας διαδικασίας ωρίμανσης που θα αναλυθεί στις επόμενες σελίδες. Επειδή ο ακριβής τους αριθμός είναι ακόμα άγνωστος υπολογίζεται ότι αποτελούν το 1-3 % των γονιδίων κάθε οργανισμού [8].Σε ότι αφορά στη συντήρηση ανάμεσα στα είδη όλα τα γονίδια που έχουν εντοπισθεί στον άνθρωπο συντηρούνται στον ποντικό [6] και το 1/3 περίπου των γονιδίων του C.elegans έχει ομόλογα στα σπονδυλωτά. Μέχρι το 2010 είχαν ταυτοποιηθεί περισσότερα από 800 microrna στον άνθρωπο και 700 στο ποντίκι με τα περισσότερα να έχουν άγνωστο βιολογικό 19 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

20 ρόλο αλλά με την παρουσία τους να εμπλέκεται σε σημαντικές λειτουργίες αποδεικνύοντας ότι η μελέτη των συγκεκριμένων γονιδίων άπτεται των πιο σύγχρονων ζητημάτων Βιοιατρικής έρευνας [9]. Η microrna έκφραση Για τη μελέτη της έκφρασης των microrna γονιδίων έχουν πραγματοποιηθεί εκτεταμένες μελέτες. Η κοινώς αποδεκτή άποψη είναι ότι τα microrna γονίδια έχουν πολύ διαφορετικά και εξαιρετικά ενδιαφέροντα προφίλ έκφρασης [10][15]. Αυτή η ποικιλία στην έκφραση των συγκεκριμένων γονιδίων είναι και μια πρώτη ένδειξη για τον πολύ σημαντικό ρόλο τους στη «λεπτή» ρύθμιση που προκαλούν στα υπόλοιπα γονίδια, θέμα που θα αναλύσουμε με μεγαλύτερη λεπτομέρεια στις επόμενες σελίδες. Χαρακτηριστικά παραδείγματα έκφρασης αποτελούν τo microrna γονίδιo mir-1 που εκφράζεται στα κύτταρα της καρδιάς των θηλαστικών [7], το mir- 122 που εκφράζεται στο συκώτι (12),τα γονίδια της ομάδας mir-35 που τα συναντάμε στο έμβρυο του C.elegans ή τα mir-290 που εντοπίζονται στα βλαστοκύτταρα του εμβρύου του ποντικού [13][14]. Ένα άλλο σημαντικό χαρακτηριστικό έχει να κάνει και με την ποσοτικοποίηση της έκφρασης. Αυτό γιατί παρατηρήσεις έχουν δείξει ότι συγκεκριμένα microrna σε συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους μπορούν να εκφράζονται σε πολύ μεγάλο ποσό ενώ αλλά γονίδια σε πολύ μικρότερο. Για παράδειγμα το γονίδιο mir-58 στο σκουλήκι εκφράζεται σε ποσό της τάξης των μορίων ανά ώριμο κύτταρο ενώ το mir-124 του ίδιου οργανισμού σε ποσό των 800 μορίων ανά κύτταρο [16]. Ακόμα δεν έχει καταστεί σαφές το που οφείλονται αυτά τα διαφορετικά υψηλά ή χαμηλά επίπεδα έκφρασης. Επιπλέον παρατηρούνται διαφοροποιημένα προφίλ έκφρασης σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις τονίζοντας τη σημασία της «ισορροπίας» αυτών των προφίλ για διάφορες ασθένειες. Επιπρόσθετα, άγνωστος παραμένει και ο ακριβής μηχανισμός ρύθμισης της έκφρασης των microrna γονιδίων. Μια επικρατούσα άποψη εμπλέκει φαινόμενα αυτορύθμισης των microrna γονιδίων ή ρύθμισης μεταγραφικών παραγόντων οι οποίοι με τι σειρά τους επηρεάζουν τη ρύθμιση των ίδιων των γονιδίων δημιουργώντας μοτίβα ανάδρασης [17][18]. Οι περισσότερες λεπτομέρειες για τη ρύθμιση των microrna γονιδίων είναι πέρα από το θέμα της παρούσας εργασίας. 20 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624

21 Ο επόμενος πίνακας συνοψίζει αρκετά από τα προφίλ έκφρασης των microrna στα θηλαστικά και για διάφορους κυτταρικούς τύπους. Προφίλ Έκφρασης microrna ES-cell specific Expressed in ES cells, but upreguated on differentiation Expressed in both ES cells and various adult tissues Enriched during mouse brain development Enriched in adult brain Enriched in lung Enriched in spleen Haemetopoietic tissues Enriched in liver Enriched in heart Enriched in kidney Ubiquitously expressed mir-296 mir-21 and mir-22 mir-15a, mir-16, mir-19,b, mir-92, mir-93, mir-96, mir-130 and mir-130b mir-128, mir-19b, mir-9, mir-125b, mir-131, 26,miR-178, mir-124a, mir-266 and mir-103 mir-9*, mir-125a, mir-125b, mir-128, mir-132, mir-137,,mir-139, mir-7, mir- 9, mir-124a, mir-124b, mir-135,mir-153, mir-149, mir-183, mir-190, mir-219 mir-18, mir-19a, mir-24, mir-32, mir-130, mir-213,,mir-20, mir -141, mir-193 and mir-200b mir-99a, mir-127, mir-142-a, mir-142-s, mir-151,,mir-189 and mir-212 mir-181, mir-223 and mir-142 mir-122a, mir-152, mir-194, mir-199 and mir-215 mir-1b, mir-1d, mir-133, mir-206, mir-208 and mir-143 mir-30b, mir-30c, mir-18, mir-20, mir-24, mir-32,,mir-141, mir-193 and mir- 200b mir-16, mir-26a, mir-27a, mir143a, mir-21, let-7a, mir-7b, mir-30b and mir- 30c Πίνακας 1:Μελέτη έκφρασης micrornas στα θηλαστικά [14] Βιογένεση των microrna γονιδίων Με τον όρο βιογένεση των microrna γονιδίων αναφερόμαστε στη διαδικασία που συμβαίνει ώστε να φτάσουμε από το αρχικό γονίδιο στο ώριμο microrna μόριο που έχει βιολογική δραστικότητα. Κάθε ώριμο microrna προέρχεται από ένα μεγαλύτερο στέλεχος (stem) που ονομάζεται πρόδρομο microrna (pre-mirna),έχει τη χαρακτηριστική δομή φουρκέτας (hairpin), μέγεθος περίπου 75 νουκλεοτίδια, και συνήθως βρίσκεται σε ένα μόνο αντίγραφο στο γονιδίωμα [1][15]. Εικόνα 1:Το πρόδρομο microrna και το ώριμο για το γονίδιο lin-4 [14] Στα φυτά κατά κύριο λόγο η δομή φουρκέτας είναι μεγαλύτερη από τα θηλαστικά ενώ κάποια που υπάρχουν σε περισσότερα του ενός αντιγράφου στο γονιδίωμα μπορεί να βρίσκονται και σε διαφορετικά χρωμοσώματα. 21 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624

22 Τυπικά τα microrna εντοπίζονται σε περιοχές ανάμεσα σε άλλα γονίδια (intergenic areas) όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα: Εικόνα 2:MicroRNA σε intergenic DNA περιοχές Αρκετά microrna βρίσκονται ανάμεσα στα ιντρόνια γνωστών γονιδίων. Σε ότι αφορά στη μεταγραφή τους μπορεί να πραγματοποιείται πολυκιστρονικά (polycistronically)[15] με δικό τους εκκινητή ή σαν μέρος άλλων γνωστών γονιδίων. Το πρώτο βήμα της διαδικασίας ξεκινά με τη μεταγραφή του microrna γονιδίου από το ένζυμο RNA πολυμεράση ΙΙ (Pol II) 2. Εικόνα 3:Μια τυπική δομή Pol II [ Αποτέλεσμα αυτής της επεξεργασίας είναι η δημιουργία του πρώιμου microrna μετάγραφου που έχει την ονομασία pri-mirna και μέγεθος πάνω από εκατό νουκλεοτίδια [19]. Τα πρώιμα microrna μετάγραφα φέρουν το χαρακτηριστικό 5 καπέλο (5 cap),είναι πολυαδενυλιωμένα (poly A tail) και αρκετές φορές φέρουν ιντρόνια όπως δηλαδή και τα κανονικά μετάγραφα. 22 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

23 Εικόνα 4: Μεταγραφή του γονιδίου από την Pol II και παραγωγή του pri-mirna [18] Σε αρκετές περιπτώσεις συντελείται φαινόμενο συναρμογής (splicing) καθώς το microrna γονίδιο μπορεί να προέρχεται από περιοχή ιντρονίου κάποιου άλλου γονιδίου που κωδικοποιεί πρωτεΐνη [20][21]. Επιπρόσθετα σε πιο σπάνιες περιπτώσεις έχει παρατηρηθεί microrna γονίδια να μεταγράφονται από RNA πολυμεράση ΙΙΙ (pol III ) 3 [22]. Το πρώιμο microrna τυπικά περιέχει μια ατελή δίκλωνη δομή που αποτελείται από 33 ζεύγη βάσεων. Για να πάρουμε το τελικό ώριμο microrna από το πρώιμο μετάγραφο πρέπει να πραγματοποιηθούν 2 βήματα ριβονουκλεικών αντιδράσεων. Το πρώτο βήμα συντελείται στον πυρήνα και αποτέλεσμα του είναι να παραχθεί από το pri-mirna το πρόδρομο μόριο μεγέθους περίπου 70 νουκλεοτιδίων (pre-mirna). Η διαδικασία καταλύεται από το ένζυμο Drosha που ανήκει στην κατηγορία των ριβονουκλεασών τύπου ΙΙΙ (RNase III type) [23]. O ακριβής μηχανισμός δράσης της ριβονουκλεάσης Drosha είναι αδιευκρίνιστος αλλά πολλές μελέτες καταλήγουν ότι η ρύθμιση της επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό την παραγωγή του πρόδρομου microrna.επιπλέον η επεξεργασία του pri-mirna εκτός από τη Drosha απαιτεί και την ύπαρξη του συμπαράγοντα DGCR8 ο οποίος είναι μια πρωτεΐνη που «δένει» στο DNA και βοηθά τη Drosha να πραγματοποιήσει το «κόψιμο» [19]. Η σημαντικότητα του συμπαράγοντα DGCR8 είναι μεγάλη και αυτό αποδεικνύεται από πειράματα που έγιναν σε βλαστοκύτταρα εμβρύων ποντικού όπου η έλλειψη αυτού του παράγοντα οδηγούσε σε μη παραγωγή mirna και στη συνέχεια σε μη διαφοροποίηση των κυττάρων [20]. 23 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

24 Εικόνα 5: Tο πρώτο βήμα επεξεργασίας του pri-mirna και η παραγωγή του pre-mirna [18] Μόλις η Drosha ολοκληρώσει τη δράση της και παραχθεί το πρόδρομο microrna πραγματοποιείται μεταφορά του στο κυτταρόπλασμα με τη βοήθεια της μεταφορικής πρωτεΐνης Exportin 5 μέσω υδρόλυσης GTP 4. Μετά τη πραγματοποίηση της μεταφοράς στο κυτταρόπλασμα σειρά έχει η διαδικασία ωρίμανσης του πρόδρομου microrna ώστε τελικά να παραχθεί το ενεργό μόριο. Η διαδικασία της ωρίμανσης πραγματοποιείται με δράση της ενδοριβονουκλεάσης Dicher.H Dicher είναι μια πολύ καλά συντηρημένη RNase III ανάμεσα στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Η Dicher με την ιδιότητα ελικάσης που έχει επεξεργάζεται το πρόδρομο microrna και παράγει ένα μόριο περίπου 22 νουκλεοτιδίων που είναι το τελικό ώριμο microrna. Συγκεντρωτικά η διαδικασία συνοψίζεται στην παρακάτω εικόνα: 24 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

25 Εικόνα 6: Το συνολικό μοντέλο βιογένεσης και δράσης των micrornas [58] Τα ώριμα microrna μόρια είναι αρκετά ευπαθή και χαρακτηρίζονται από μικρό χρόνο ημιζωής. Ο μικρός χρόνος ημιζωής είναι σε συμφωνία με τη θεωρία που προβλέπει ότι τα microrna προκαλούν εξειδικευμένη ρύθμιση όταν και όπου χρειάζεται [30]. Αποτελούνται από 2 σκέλη (strands). Το ένα σκέλος που ονομάζεται σκέλος-οδηγός (guide strand) ή απλά mirna είναι αυτό που προσδένεται στην κατηγορία των πρωτεινών Argonaute 5 και προκαλεί τη ρύθμιση που θα συζητήσουμε στη συνέχεια. Το άλλο σκέλος που ονομάζεται σκέλος-επιβάτης (passenger strand) ή πιο απλά mirna* αποικοδομείται. H επόμενες εικόνες μας δείχνουν τις τρισδιάστατες δομές των τριών σημαντικών μορίων που εμπλέκονται στη βιογένεση των microrna: 25 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

26 Εικόνα 7: Κρυσταλλικές δομές για homo sapiens Drosha, Expo5 και Dicer [ Επιπλέον, η επόμενη εικόνα απεικονίζει ένα παράδειγμα δομών micrornas όπου με κόκκινο αναπαριστάται το ώριμο mirna και με μπλε το mirna* στέλεχος Εικόνα 8: Προβλεπόμενες δομές για τα mir-1 mir-34 kai mir-124 [1] Ο μηχανισμός δράσης Όπως προαναφέρθηκε τα ώριμα mirna προσδένονται στις πρωτείνες της κατηγορίας Argonaute που είναι τα βασικά συστατικά του συμπλέγματος RISC. To σύμπλεγμα RISC παίρνει την ονομασία του από τον αγγλικό τίτλο RNA induced silencing complex και σχετίζεται με την αναγνώριση και καταστολή στόχων mrna [31]. Είναι υπεύθυνο επομένως για την ρύθμιση 26 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624

27 της έκφρασης και άρα τα micrornas μέσω του συμπλέγματος αυτού μπορούν μετά-μεταγραφικά να καταστείλουν την έκφραση άλλων γονιδίων όπως και τα μόρια sirna 6. Για τον άνθρωπο δυο πολύ γνωστές Argonaute πρωτεΐνες είναι οι παράγοντες eif2c1 και eif2c2 [32]. Στην παρακάτω εικόνα φαίνονται οι λειτουργικές περιοχές αυτών: Εικόνα 9: Οι λειτουργικές περιοχές των argonaute πρωτεϊνών H περιοχή PAZ χρησιμοποιείται για πρόσδεση με το 3 άκρο του mirna, η περιοχή MID για σύνδεση με το 5 άκρο και η περιοχή PIWI έχει ενεργότητα RNase H και μπορεί να καταλύσει τη διχοτόμηση του mrna [32]. Επομένως βλέπουμε ότι τα microrna μπορούν επιλεκτικά να βρίσκουν στόχους σε μετάγραφα mrna. Η ειδικότητα στην επιλογή των στόχων βασίζεται στη συμπληρωματικότητα των βάσεων μεταξύ του mrna και της περιοχής 2-8 του 5 άκρου του microrna (η περιοχή αυτή φέρει την ονομασία seed). Στις περισσότερες περιπτώσεις η πρόσδεση συμβαίνει στην 3 UTR 7 του mrna ενώ πιο πρόσφατες έρευνες εντόπισαν και πρόσδεση στην 5 UTR όπως και μέσα στην κωδική περιοχή [33][34]. Η σύνδεση του microrna στο mrna στόχο τυπικά οδηγεί σε μεταφραστική καταστολή ή εξωνουκλεολυτική καταστροφή του mrna.αυτό που καθορίζει το τι ακριβώς θα συμβεί είναι ο βαθμός συμπληρωματικότητας της πρόσδεσης μεταξύ του mrna και του microrna. Έχει παρατηρηθεί ότι η πλήρης συμπληρωματικότητα,που συμβαίνει συχνότερα στα φυτά και όχι στα ζώα, έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή του mrna. Αντίθετα οι αναντιστοιχίες (mismatches) ανάμεσα στις βάσεις που συμβαίνουν λόγω ελλιπούς συμπληρωματικότητας προάγουν την καταστολή της μετάφρασης. 27 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

28 Οι επόμενες εικόνες συνοψίζουν τους μηχανισμούς δράσης των mirnas. H εικόνα 10c δείχνει επίδραση και στο επίπεδο της χρωματίνης: Εικόνα 10: Οι μηχανισμοί δράσης των micrornas [1] Εικόνα 11:Μια πιο αναλυτική αναπαράσταση του μηχανισμού δράσης [35] Οι λειτουργίες των micrornas Είδαμε στην προηγούμενη ενότητα ότι τα microrna έχουν την δυνατότητα να ρυθμίσουν την έκφραση άλλων γονιδίων. Οι εκτεταμένες 28 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

29 έρευνες έχουν δείξει ότι εν δυνάμει το 30% των γονιδίων ενός οργανισμού ρυθμίζεται μέσω επίδρασης microrna μορίων [19]. Ακόμα κάθε microrna μπορεί να ρυθμίζει πολλούς στόχους αλλά και διαφορετικοί στόχοι μπορούν να συνδέονται και να ρυθμίζονται από διαφορετικά microrna. Γενικά οι στόχοι των micrornas ποικίλουν. Μπορεί να είναι μεταβολικά ένζυμα, σηματοδοτικές πρωτεΐνες ή και μεταγραφικοί παράγοντες. Επομένως καταλαβαίνουμε ότι τα μικρά αυτά μόρια έχουν τεράστια επίδραση σε διάφορες κυτταρικές διεργασίες. Ο επόμενος πίνακας περιλαμβάνει μερικά παραδείγματα microrna και στόχων και τις σχετιζόμενες λειτουργίες: microrna Στόχος Λειτουργία Τρόπος δράσης Caenorhabditis elegans lin-4 lin-14, lin-28 Regulation of developmental transition between the first two larval stages, L1 and L2 let-7 lin-14, lin-28 Regulation of developmental transition between the last larval stage (L4) and the adult stage lsy-6 lin-41, hbl-1 Determination of left/right asymmetry of neuronal development Translational repression Translational repression Unknown Drosophila melanogaster Bantam hid Promotion of cell proliferation and suppression of apoptosis mir-14 Unknown Suppression of apoptosis and regulation of fat metabolism Translational repression Unknown Mus musculus mir-181 Unknown Promotion of haematopoietic differentiation Unknown towards the B-cell lineage mir-196 Hoxb8 Unknown Post Transcriptional Gene Silencing Arabidopsis thaliana mir-165 PHB, PHV and REV Regulation of leaf morphogenesis Post Transcriptional Gene Silencing mir-166 AP2 Regulation of flowering time and floral-organ identity mir-172 TCP Regulation of leaf development and embryogenesis Translational repression Post Transcriptional Gene Silencing mir-jaw TF Unknown Post Transcriptional Gene Silencing mir-39 SCLfamily proteins Regulation of leaf morphogenesis mir-159 MYB33 family TF Regulation of leaf morphogenesis Post Transcriptional Gene Silencing Zea mays mir-166 rld1 Regulation of leaf morphogenesis Post Transcriptional Gene Silencing Πίνακας 2: Ενδεικτικά micrornas και στόχοι [14] 29 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624

30 Πιο αναλυτικά μελέτες σε διάφορους τύπους οργανισμών εμπλέκει τα microrna γονίδια σε μονοπάτια ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου, την απόπτωση, στην ανάπτυξη του νευρικού και μυϊκού συστήματος, την εμβρυογένεση και τη μορφογένεση [38][39]. Επιπλέον πειράματα σε ποντίκια έδειξαν εμπλοκή των microrna στη ρύθμιση των βλαστοκυττάρων (stem cells) [36][37]. Ένα ακόμα σημαντικό μονοπάτι ρύθμισης εμπλέκει τα microrna με τις βασικές αρχές λειτουργίας του ανοσοποιητικού συστήματος [40]. Σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις ρύθμισης παρατηρείται ένα συγκεκριμένο προφίλ έκφρασης. Η διατήρηση αυτού του προφίλ ή αλλιώς της mirna ομοιόστασης κρίνεται ζωτικής σημασίας για τη σωστή λειτουργία του οργανισμού. Πάρα πολλές περιπτώσεις ασθενειών συνοδεύονται από «διαταραγμένο» προφίλ έκφρασης των micrornas γονιδίων γεγονός που αποκαλύπτει τη σημαντικότητα της λεπτής ρύθμισης που προκαλούν στην πρόγνωση και τη διάγνωση αλλά και τις δυνατότητες για θεραπευτική που θα εξηγήσουμε στην επόμενη ενότητα [43]. Πέρα όμως από τη ρύθμιση βασικών λειτουργιών του οργανισμού ο μηχανισμός δράσης αυτών των μορίων χρησιμοποιείται και από αρκετούς ιούς [41]. Οι ιοί σαν παρασιτικοί οργανισμοί κωδικοποιούν micrornas για να καταλάβουν τα κύτταρα του ξενιστή και να επιβιώσουν. Είναι γνωστά περισσότερα από 120 virus mirna συμπεριλαμβανομένων και κάποιων που έχουν συνδεθεί με tumor viruses [42]. Σχετιζόμενες Ασθένειες Η σημαντικότητα της ρύθμισης από microrna γίνεται μεγαλύτερη από την εντυπωσιακή λίστα ασθενειών που έχουν συσχετίσει οι ερευνητές με αυτά. Όπως φάνηκε από την προηγούμενη ενότητα τα micrornas εμπλέκονται στις περισσότερες κυτταρικές διεργασίες. Και θα ήτανε λογικό η απορύθμιση τους,που όπως είπαμε απεικονίζεται με διαταραγμένο προφίλ έκφρασης, να επιφέρει σημαντικές παθολογικές καταστάσεις. Σε γενικές γραμμές τα micrornas έχουν συσχετισθεί με τις παρακάτω ασθένειες: 1. Καρκίνος Η πιο σημαντική συσχετιζόμενη ασθένεια είναι φυσικά ο καρκίνος. Οι υποψίες που οδήγησαν στην έρευνα της συγκεκριμένης ασθένειας ήταν η αρχική σύνδεση των micrornas με τον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση. Σήμερα γνωρίζουμε με βεβαιότητα ότι σε περιπτώσεις καρκίνου η mirna έκφραση είναι απορυθμισμένη αλλά και αντίστροφα ότι η απορύθμιση της mirna έκφρασης μπορεί να προκαλέσει καρκίνο. Έχει πιστοποιηθεί ότι η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (CLL) έχει διαφοροποιημένη mirna έκφραση όπως και το 50% των περιπτώσεων των πολλαπλών λεμφωμάτων. 30 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624

31 Συγκαταλέγεται στη λίστα και ο καρκίνος του προστάτη, ο καρκίνος του μαστού, οι κακοήθειες του παγκρέατος και του ήπατος όπως και το γλοιοβλάστωμα [44][45][46]. Ακόμα πολλά microrna γονίδια έχουν πάρει την ονομασία oncogenes καθώς βρέθηκε ότι η δράση τους ενισχύει την δημιουργία και τη μετάσταση του καρκίνου αλλά και tumor suppressors στην αντίθετη περίπτωση όταν δηλαδή η έκφραση τους είναι μειωμένη στις κακοήθειες και καταστέλλουν γονίδια που προκαλούν τον καρκίνο. Στον επόμενο πίνακα φαίνεται μια λίστα με αρκετά mirna που έχουν διαφοροποιημένη έκφραση σε διάφορες περιπτώσεις καρκίνου. Τύπος καρκίνου Αυξημένη Έκφραση Μειωμένη Έκφραση Breast [26, 27] mir-21, mir-29b-2 mir-125b, mir-145 mir-10b, mir-155, mir-17-5p, mir-27b Ovarian [28, 29] mir-141, mir-200(a-c), mir-221 let-7f, mir-140, mir-145, mir199a, mir-424 Endometrial [29] mir-103, mir-107, mir-185, mir-205, mir-210, mir-449 mir-99b, mir-152, mir-193, mir-204, mir-221, let-7i Glioblastoma [4, 25] mir-221, mir-21 mir-181a, mir-181b, mir-181c Chronic lymphocytic leukaemia [24] mir-15, mir-16 Lymphoma [4, 11] mir-155, mir-17-92cluster mir-15a mir-10a, mir cluster, Colorectal [4, 11, 25] mir-20a, mir-24-1, mir-143, mir-145, let-7 mir-29b-2, mir-31 Thyroid [4, 25] mir-221, mir-222, mir-146, mir-181b, mir-197, mir-346 Hepatocellular [4, 25] mir-18, mir-224 mir-199a, mir-195, mir-200a, mir-125a Testicular [11] mir-372, mir-373 mir-221, mir-376a, mir301, Pancreatic [4, 11, 25] mir-21, mir-24-2, mir-100, mir-375 mir-103-1,2, mir-107, mir-125b-1 Cholangiocarcinoma [25] mir-21, mir-141, mir-200b Prostate [11] let-7d, mir-195, mir-203 mir-128a Gastric [4, 11, 25] mir-223, mir-21, mir mir Lung [4, 11, 25] mir cluster, mir-17-5p let-7 family Πίνακας 3: mirnas με διαφοροποιημένη έκφραση σε κακοήθειες [10] Πέρα από τη συσχέτιση των συγκεκριμένων γονιδίων με την συγκεκριμένη ασθένεια και τη προφανή χρήση τους ως biomarkers το πιο σημαντικό είναι ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν καινοτόμες θεραπευτικές στρατηγικές και να πάρουμε νέα και πραγματικά αποδοτικά γονιδιακά φάρμακα. Οι περισσότερες λεπτομέρειες είναι πέρα από το θέμα της παρούσας διπλωματικής και ενδεικτικά το παρακάτω σχήμα συνοψίζει τις επικρατούσες θεραπευτικές στρατηγικές που έχουν προταθεί μέχρι στιγμής. 31 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624

32 Εικόνα 12 :Οι σημαντικότερες microrna θεραπευτικές στρατηγικές [19] 2. Καρδιακές παθήσεις Για την επίδραση των microrna σε καρδιαγγειακές παθήσεις έχουν γίνει πειράματα σε ποντίκια [47]. Συγκεκριμένα το γονίδο mir-208 έχει συσχετισθεί με περιπτώσεις καρδιακών παθήσεων κάτω από την επίδραση άγχους. Άλλο παράδειγμα είναι το mir-1 το οποίο συνδέεται με την καρδιακή αρρυθμία [49].Συνολικά τα αποτελέσματα και άλλων ερευνών έχουν δείξει ότι η συγκριτική μελέτη της επίδραση των mirna σε καρδιακές παθήσεις θα δώσει ώθηση για καλύτερη διάγνωση. 3. Νευρολογικές παθήσεις Μια άλλη κατηγορία ασθενειών είναι σχετικές με παθήσεις του νευρικού συστήματος. Έχουν γίνει πάρα πολλές αναφορές για τη σημαντικότητα των mirna στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος και ως εκ τούτου έχουν μελετηθεί αρκετές ασθένειες. Μια από τις σημαντικότερες είναι η μυϊκή ατροφία (Spinal Muscular Atrophy SMA) μια παιδιατρική νευροεκφυλιστική νόσος που προκαλείται από μειωμένα πρωτεΐνικά επίπεδα των γονιδίων των κινητικών νευρώνων [50]. Μια άλλη σημαντική ασθένεια είναι η Χ νοητική υστέρηση (fragile mental retardation FXMR) που 32 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624

33 προέρχεται από απώλεια ή μεταλλάξεις στην πρωτεΐνης FMRP [51]. Το σχετιζόμενο mirna γονίδιο είναι το mir-224 το οποίο έχει συσχετισθεί και με μια άλλη γνωστή νευρολογική εκφυλιστικό νόσο που είναι η νόσος του Parkinson [52]. 4. Ασθένειες του ανοσοποιητικού Τα microrna έχουν αναδειχθεί σαν κύριοι ρυθμιστές του ανοσοποιητικού συστήματος για τα θηλαστικά. Πειράματα που εμπεριείχαν απορύθμιση mirna ή και απώλεια συγκεκριμένων γονιδίων είχαν ως αποτέλεσμα προβλήματα στην ανάπτυξη του ανοσοποιητικού, προβλήματα απόκρισης σε ασθένειες και ανάπτυξη αυτοάνοσων νοσημάτων [48][53]. Αξιοσημείωτα παραδείγματα είναι τα γονίδια mir-146, mir -155 και mir-181 που έχουν συσχετισθεί με απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος σε μολύνσεις από παθογόνους μικροοργανισμούς (βακτήρια), την προσαρμοστική ανοσία και τον έλεγχο των Τ κυττάρων. [54]. 5. Μόλυνση από ιούς Τέλος δεν είναι και λίγες οι περιπτώσεις μολύνσεων από ιούς μέσω δράσης microrna γονιδίων. Όπως προαναφέρθηκε έχουν εντοπισθεί πάνω από 120 είδη ιικών mirna με πιο σημαντικό παράδειγμα την κατηγορία ιών herpes virus [19]. Άλλο σημαντικό παράδειγμα είναι ο μεγαλοκυτταροιός (cytomegalovirus HCMV) που κωδικοποιεί το mir-ul112 [55], ο herpes virus με το γονίδιο mir-k12-11, ο simmian virus 40 που εκφράζει ένα πρόδρομο mirna που παράγει 2 ώριμα και με τη δράση τους καταστέλλει το ανοσοποιητικό σύστημα,όπως και ο Epstein-Barr virus που με τα mirnas που κωδικοποιεί επηρεάζει τα γονίδια που κυττάρου ξενιστή που σχετίζονται με τη σηματοδότηση και την αντιγραφή [56][57]. Όλες οι παραπάνω μελέτες όχι μόνο βελτιώνουν τις γνώσεις μας για τη δράση διαφόρων ιών αλλά δίνουν και νέες οπτικές στα ρυθμιστικά και εξελικτικά mirna μονοπάτια. Από όλα τα παραπάνω καταλαβαίνουμε ότι τα micrornas εμπλέκονται στην αρχικοποίηση και την εξέλιξη αρκετών σημαντικών ασθενειών. Για το λόγο αυτό και προκειμένου να βελτιώσουμε υπάρχουσες μεθόδους διάγνωσης και θεραπευτικής είναι αναγκαία η συνεχής μελέτη και έρευνα αυτών των μορίων. Έτσι ενισχύεται η ανάγκη για αποδοτικές υπολογιστικές μεθόδους πρόβλεψης και χαρακτηρισμού της δράσης τους που θα εξηγήσουμε στο επόμενο κεφάλαιο. 33 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

34 34 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624

35 Κεφάλαιο 2 :Υπάρχουσες Βάσεις Δεδομένων και χρήσιμα Εργαλεία Ανάλυσης Βάσεις Δεδομένων mirbase Όπως θα δούμε καις την αναδρομή στις υπάρχουσες μεθόδους πρόβλεψης οι περισσότερες από αυτές χρησιμοποιούν ακολουθίες από αρνητικά και θετικά mirna που έχουν δημοσιευτεί σε βάσεις δεδομένων. Η σημαντικότερη και η πιο εξειδικευμένη ονομάζεται mirbase [92].H συγκεκριμένη βάση είναι η πλέον χρησιμοποιούμενη κυρίως από μεθόδους που χρησιμοποιούν τεχνικές Υπολογιστικής Νοημοσύνης και αποτελεί μια ολοκληρωμένη δικτυακή αποθήκη για ταυτοποιημένες mirna ακολουθίες και για προβλεπόμενους mrna στόχους. Παρέχει πληροφορίες όπως η περιγραφή του γονιδίου, η τυπική δομή του stem loop, το ακολουθιακό περιεχόμενο τόσο για το mirna όσο και για το mirna* καθώς και αναφορά στη μελέτη που το εντόπισε. Μια τυπική mirbase registry φαίνεται στην επόμενη εικόνα: Εικόνα 13 :Μια τυπική mirbase registry [92] 35 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

36 Πέρα από τις χρήσιμες πληροφορίες που παρέχει, η βάση δίνει τη δυνατότητα για εύκολη περιήγηση και ανάκτηση πληροφορίας. Έχει ταξινομημένες τις ακολουθίες ανά οργανισμό και μέσω μιας εύχρηστης μηχανής αναζήτησης επιτρέπει το κατέβασμα των ακολουθιών για τα πρόδρομα mirna σε fasta 12 μορφή. Η mirbase ανανεώνεται ανά τακτά χρονικά διαστήματα και χρόνο με το χρόνο έχει όλο και περισσότερες ακολουθίες καθώς προχωρά η έρευνα στον τομέα των mirna. Επιπλέον στις τελευταίες εκδόσεις τις έχει ενσωματώσει και δεδομένα από Deep Sequencing ενώ την περίοδο που γράφονταν η παρούσα εργασία περιείχε πάνω από 5000 καταχωρήσεις. RefSeq [93] Αρκετές μέθοδοι εκτός από τη mirbase έχουν χρησιμοποιήσει δεδομένα και από την βάση RefSeq.Η συγκεκριμένη βάση αποτελεί κομμάτι της μεγάλης «βιολογικής αποθήκης» δεδομένων του NCBI και παίρνει το όνομα της από το Reference Sequence.Η συγκεκριμένη ονομασία χρησιμοποιείται για να αποδώσει το χαρακτηριστικό της βάσης να περιέχει ακολουθίες «αναφοράς» για γονιδιώματα, μετάγραφα και πρωτεΐνες από τον ποντικό, τον αρουραίο και τον άνθρωπο. Η βάση επομένως δεν είναι εξειδικευμένη στα mirna όπως η προηγούμενη αλλά παρόλο αυτά έχει χρησιμοποιηθεί καθώς από αυτή προέρχεται το dataset με τα 8494 «ψεύτικα» hairpins από τα οποία έχουν προκύψει τα περισσότερα negative σετ εκπαίδευσης των μεθόδων πρόβλεψης. Βάσεις για πρόβλεψη mrna στόχων Επειδή όπως είδαμε αρκετές μεθοδολογίες είναι target based δηλαδή χρησιμοποιούν το κριτήριο το υποψήφιο mirna να μπορεί να «δένει» στο στόχο με βάση τη συμπληρωματικότητα θα αναφερθούμε ονομαστικά και στις σημαντικότερες βάσεις δεδομένων για στόχους. i. Argonaute [ ii. mirnamap [ iii. TarBase [ Genome Browsers & Προγράμματα για Στοίχιση Ακολουθιών Στην ενότητα αυτή θα παρουσιαστούνε συνοπτικά χρήσιμα εργαλεία που έχουν χρησιμοποιηθεί κυρίως από την ομάδα των comparative μεθόδων. Οι genome browsers αφορούν σε εργαλεία που επιτρέπουν την περιήγηση σε διάφορα γονιδιώματα και είναι χρήσιμοι όταν ψάχνουμε ακολουθίες για διάφορους οργανισμούς προκειμένου να εφαρμόσουμε κάποιο κριτήριο φυλογενετικής συντήρησης Οι σημαντικότεροι genome browsers που μπορεί να χρησιμοποιήσει κάποιος για την ανάλυση του είναι οι: 36 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624

37 UCSC Genome Browser [ Ensembl [ Επιπλέον πολλές μέθοδοι χρησιμοποιούν κριτήρια ομολογίας ή στοίχισης των ακολουθιών που λαμβάνουν υπόψη τους. Για το λόγο αυτό θα παραθέσουμε τα 2 σημαντικότερα προγράμματα για στοίχιση ακολουθιών τα οποία είναι τα ακόλουθα: Blat [ Blast [ Προγράμματα Πρόβλεψης Δευτεροταγούς Δομής Τέλος θα κλείσουμε την παρούσα ενότητα με τα δυο πιο σημαντικά προγράμματα πρόβλεψης δευτεροταγούς δομής για τα μόρια RNA. Πρόκειται για 2 πολύ σημαντικές πλατφόρμες οι οποίες έχουν συνεισφέρει τα μέγιστα στην ανάπτυξη σχεδόν όλων των μεθόδων που παρουσιάσαμε προηγουμένως. Κατατάσσονται στην κατηγορία της έρευνας για molecular thermodynamics και στοχεύουν χρησιμοποιώντας προηγμένους αλγορίθμους δυναμικού προγραμματισμού στην εκτεταμένη ανάλυση της δευτεροταγούς δομής η οποία στηρίζεται και στην πρόβλεψη της ελεύθερης ενέργειας που έχει το μόριο RNA στο χώρο. Το συγκεκριμένο κριτήριο γρήγορα εφαρμόστηκε στα mirna και μάλιστα έρευνες έδειξαν ότι η ελεύθερη ενέργεια και κάποιοι άλλοι δείκτες που προκύπτουν από αυτή έχουν τεράστια διακριτική ικανότητα πρόβλεψης [95]. Περισσότερες λεπτομέρειες θα αναφερθούν στην επόμενη ενότητα με την περιγραφή όλων των χαρακτηριστικών που ενσωμάτωσε η μέθοδος μας. Mfold [97][ Η παρούσα δουλεία είναι αποτέλεσμα χρόνιων ερευνών του καθηγητή Μ.Zuker πάνω στην πρόβλεψη της δομής που παίρνουν τα μόρια RNA και DNA με τη χρήση θερμοδυναμικών μεθόδων.τα προγράμματα του πριν χρησιμοποιηθούν και σε μεθόδους για την πρόβλεψη των microrna γονιδίων έχουν επιτυχώς εφαρμοστεί σχεδόν σε όλους τους τομείς της Βιοιατρικής έρευνας. Τώρα σχετικά με την εφαρμογή τους στις υπολογιστικές μεθόδους πρόβλεψης mirna έχει ευρέως χρησιμοποιηθεί το πρόγραμμα UNAfold για RNA ανάλυση [96]. Δέχεται σαν είσοδο τις νουκλεοτιδικές ακολουθίες και μετά την επιλογή αρκετών παραμέτρων του περιβάλλοντος όπως περιεκτικότητα ιόντων και θερμοκρασία επιστρέφει την ελάχιστη ενέργεια όπως και άλλα θερμοδυναμικά χαρακτηριστικά όπως η melting θερμοκρασία ή εντροπία και η ενθαλπία.τα χαρακτηριστικά αυτά έχει δειχθεί ότι έχουν μεγάλη διακριτική ικανότητα και ανήκουν στην κατηγορία 37 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr

38 των θερμοδυναμικών χαρακτηριστικών που θα δούμε στην πορεία. Όλοι οι υπολογισμοί έχουνε γίνει ενσωματώνοντας εκτεταμένη γνώση από τον τομέα των thermodynamics με εφαρμογή έξυπνων αλγορίθμων για ανάλυση των ακολουθιών. Οι περισσότερες λεπτομέρειες για θέματα υλοποίησης αυτών των αλγορίθμων είναι περά από το σκοπό της παρούσας εργασίας. Vienna RNA Package [94] [ Το δεύτερο πιο σημαντικό πρόγραμμα ανάλυσης της RNA δομής είναι το Vienna RNA package που υλοποιήθηκε από τον καθηγητή I.Hofacker. Η συγκεκριμένη πλατφόρμα αποτελεί μια ομάδα προγραμμάτων για εκτεταμένη ανάλυση ακολουθιών RNA. Αυτή είναι και μια σημαντική διαφορά με το προηγούμενο πρόγραμμα το οποίο μπορεί να εφαρμοστεί και στους δυο τύπους ριβονουκλεικών οξέων. Ενσωματώνει αρκετούς αλγορίθμους είτε με τη μορφή command line προγραμμάτων, είτε με τη μορφή συναρτήσεων σε γλώσσα C ή Perl επιτρέποντας την χρήση τους και σε άλλες εφαρμογές. Παρέχει τον υπολογισμό της ελάχιστης ενέργειας σύμφωνα με τον αλγόριθμο των Zuker-Stiegler, υλοποιεί τον partition function algorithm του McCaskill και τον suboptimal folding algorithm του Wuchty. Επιπλέον παρέχει αρκετά standalone προγράμματα για σύγκριση δομών όπως και διάφορες μετρικές για αποδοτική εύρεση ομοιοτήτων μεταξύ των μορίων στο χώρο. Από το 2010 το πακέτο διαθέτει και server στον οποίο μπορεί να γίνει on line αναπαράσταση της δευτεροταγούς δομής μορίων μέσω ενός φιλικού περιβάλλοντος και αυτός είναι ένας ακόμα λόγος για τον οποίο το πακέτο Vienna είναι τόσο δημοφιλές. Το πρόγραμμα του πακέτου με τη μεγαλύτερη χρήση στην περίπτωση των μεθόδων πρόβλεψης που μελετάμε είναι το RNAFold. Αυτό γιατί πρόκειται για ένα πρόγραμμα που με είσοδο την ακολουθία του mirna μας επιστρέφει την ελάχιστη ενέργεια της δομής (mfe) καθώς και την dot bracket annotation.η δεύτερη αποτελεί έναν τρόπο αναπαράστασης των δεσμών μεταξύ των βάσεων όπως και των πιθανών αναντιστοιχιών που μπορεί να δημιουργούν loops ή άλλα «εξογκώματα» στη δομή. Ειδικότερα τα ζεύγη βάσεων αναπαριστούνται με «(» και «)» και οι αζευγάρωτες βάσεις απεικονίζονται με «.». Τέλος επειδή οι συνθήκες του περιβάλλοντος είναι πολύ σημαντικές ενσωματώνει παρόμοιες με το UnaFold επιλογές συνθηκών με τη θερμοκρασία να είναι ίσως η πιο σημαντική που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη. 38 Κλεφτογιάννης Δημήτριος AM 1624 kleftogi@ceid.upatras.gr