Introduction. peptide linkage NH CH C CH C

Transcript

1

2 Introduction โปรต นเป นสารช วโมเลก ลขนาดใหญ พบทะ งในพ ชแล สะตว เก ดจากหน วยเล กท ส ด ค อ amino acid เกา กะนด วย amide linkage หร อ peptide linkage H 2 N H H H 2 N H NH H H R R R

3 โครงสร างของกรดอ กรดอ ม โน กรดอ ม โนท เป นส วนปร กอบของโปรต น ม 20 ชน ด โครงสร างของกรดอ กรดอ ม โนท กชน ดจ ปร กอบด วยหม -H แล หม -NH 2 กรดอ ม โนท พบในส งม ช ว ตส วนใหญ ค อ ชน ดอะลฟา (a-amino amino acid) α- H 2 N H R H หม R ต างกะน จ เก ดเป น amino acid ชน ดต างๆ

4 ถ าหม R ไม ใช โปรตอน คาร บอนท ต าแหน งอะลฟา ต าแหน งอะลฟาจ เป น จ เป นไคระล ไคระลคาร บอน คาร บอน ท า ให ม คอนฟ ก เร ฟ ก เรชะน 2 แบบ ค อ D-configuration แล L-configuration H H H 2 N H H NH 2 R D-amino acid R L-amino acid

5 การเร ยกช อกรดอ กรดอ ม โน การเร ยกช อกรดอ กรดอ ม โน น ยมเร ยกเป นช อสามะญ แล มะกเข ยนสะญละกษณ แทนโดยใช อะกษรย อ 3 ตะว หร อ 1 ตะว ดะงน H 3 N H H 3 N H H H 3 Glycine, Gly Alanine, Ala

6 L-Amino acid found in proteins

7

8

9 ชน ดของกรดอ กรดอ ม โน สามารถจ าแนกกรดอ จ าแนกกรดอ ม โนตาม side chain ได เป น 4 กล ม ค อ 1. Non-polar side chain: Side chain เป นไฮโดรคาร บอน จ ไม ล ลายน า 2. Polar, neutral side chain: Side chain เป นพวกม ขะ ว 3. Acidic side chain: Side chain จ ม ปร จ เป นลบท ph 7.0 เน องจากม หม -H 4. Basic side chain: Side chain จ ม ปร จ เป นบวกท ph 7.0 เน องจากม หม -NH 2

10

11

12

13

14

15

16 กรดอ ม โนจ าเป น (Essential amino acids) ร างกายไม สามารถสร างเองได ต องได ระบจากอาหาร ม อย 8 ชน ด ได แก Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp แล Val H 3 H 2 H H - H 3 + NH 3 Ile NH 3 + H 2 H 2 H 2 Lys H 2 H - + NH 3 H 3 H 3 H Leu H 2 H - + NH 3 Leu H 3 S H 2 Met H 2 H - + NH 3

17 H 2 N N H H 2 H 2 H - Phe N NH 3 + H 2 H - + NH 3 N H H H His Trp H 2 N H 2 H 3 H 3 H H H - H + NH 3 Thr H H - + NH 3 H 2 H 3 Val H H 2 Arg NH NH NH 2

18 การแตกตะวของกรดอ กรดอ ม โน กรดอ ม โนเป นสารปร กอบท แตกตะวได เม อล ลายน า เน องจากม ทะ งหม คาร บอกซ ล (กรด) แล หม อ ม โน (เบส) ท าให เก ดปฏ ก ร ยากรด-เบส ภายในโมเลก ล R H NH 2 H หน าท เป นได ทะ งกรดแล เบส R H NH 3 dipolar ion zwitterion กรดอ ม โนท อย ในสภาพล ลายน าท ph เป นกลาง ส วนใหญ จ อย ใน ร ปของ zwitterion

19 ในสารล ลายเบส zwitterion จ แสดงความเป นกรด โดยหม แอมโมเน ยม จ ให โปรตอน R H + H - R H + H 2 NH 3 NH 2 ในสารล ลายกรด zwitterion จ แสดงความเป นเบส โดยหม คาร คาร บอก บอกซ เลท ท าหน าท ระบโปรตอน R H + H 3 + R H NH3 H + H 2 NH 3

20 Isoelectric point (pi pi) โดยทะ วไปกรดอ ม โนท side chain ไม ม ปร จ นะ น เม อล ลายน าจ อย ใน ร ปของ zwitterion ซ งม ปร จ ส ทธ เป นศ นย จ งไม เคล อนท ในสนามไฟฟ า ถ า zwitterion ให โปรตอน กรดอ ม โนนะ นจ ม ปร จ ลบ R H R H NH 3 NH 2 เคล อนท เข าหาขะ วไฟฟ าบวก

21 แต ถ าเต มกรดลงไปในสารล ลาย ก จ เก ด zwitterion ใหม อ กคระ ง R H + H + R H NH 2 NH 3 เม อเต มกรดลงในสารล ลาย จนม ค า ph ค าหน งท ท า ท าให ให กรดอ กรดอ ม โนม ปร จ ส ทธ เป นศ นย ซ งไม ว งเข าหาขะ วไฟฟ า เร ยกค า ph ของสารล ลายน ว า isoelectric point (pi ( pi)

22 ส วนกรดอ ม โนท ล ลายในน าแล ว zwitterion ระบโปรตอน เก ด เป นไอออนบวก R H R H H NH 3 NH 3 เคล อนท เข าหาขะ วไฟฟ าลบ แต ถ าเต มเบสลงไปในสารล ลาย ก จ เก ด zwitterion ใหม อ กคระ ง R H H + H - R H NH 3 NH 3

23 ค า ph ท ท า ท าให ให กรดอ กรดอ ม โนม ปร จ ส ทธ เป นศ นย เร ยกว า pi ท pi การล ลายของกรดอ กรดอ ม โน ม โนจ ต า จ ต าท ส ด ถ าค า ph ของสารล ลายส งข นหร อต า ต าลง การล ลายของกรดอ กรดอ ม โนจ เพ มมากข น Non-polar side chain: pi ~ Acidic side chain: pi ~ Basic side chain: pi ~ กรดอ ม โนแต ล ชน ดจ ม ค า pi เฉพา ตะว ซ งม ปร โยชน ในการ แยกแล ว เครา ห หาชน ดของกรดอ กรดอ ม โนได

24 เช น alanine ม ค า pi = 6.0 ในสารล ลายท ม ค า ph ปร มาณ 6.0 alanine จ อย ในร ป zwitterion H 3 NH 3 H H 3 H H 3 H H NH 2 NH 3 ในสารล ลายเบส (ph > 7.0) alanine จ ม ปร จ ลบ ในสารล ลายกรด (ph < 6.0) alanine จ ม ปร จ บวก

25 Electrophoresis เทคน คท ใช แยกสารผสมของกรดอ กรดอ ม โนหร อโปรต น ออกเป นสารบร ส ทธ ใส สารผสมของกรดอ กรดอ ม โนตรงกลางแผ นกร ดาษ หร อเจล ท ท า ท าให เป ยกช มด วย สารล ลายบะฟเฟอร ท ม ph ค าหน ง เม อให กร แสไฟฟ าจ พบว า กรดอ ม โนต างชน ดกะนจ เคล อนท ด วยอะตราเร ว ต างกะน ข นกะบ pi แล ph ของ buffer ph < pi กรดอ ม โนจ ม ปร จ บวก แล เคล อนส ขะ วไฟฟ าลบ ph > pi กรดอ ม โนจ ม ปร จ ลบ แล เคล อนส ขะ วไฟฟ าบวก ph = pi กรดอ ม โนจ ม ปร จ เป นศ นย แล ไม เคล อนท ส ขะ วไฟฟ า

26 กรดอ ม โนผสมร หว าง Ala (pi = 6.0) His (10.0) แล Asp (2.0) เม อ น ามาแยกโดยเทคน ค electrophoresis ในสารล ลายบะฟเฟอร ph 6.0 จ เก ดการเปล ยนแปลงอย างไร

27 ปฏ ก ร ยาของกรดอ กรดอ ม โน ปฏ ก ร ยาของกรดอ กรดอ ม โนจ ม ทะ งท เก ดกะบหม -NH 2 หม -H หร อท side chain ปฏ ก ร ยากะบ Ninhydrin Ninhydrin สามารถออกซ ไดซ กรดอ กรดอ ม โน ให ผล ตภะณฑ ท ม ส ม วงน าเง น R H NH 2 + H H R-H H 2 H + N H

28 ปฏ ก ร ยาการเก ดพะนธ เอไมด ปฏ ก ร ยาร หว างหม คาร บอกซ ลของกรดอ ม โนในโมเลก ลหน งท า ปฏ ก ร ยากะบหม อ ม โนของอ กโมเลก ล เก ดพะนธ เอไมด (amide linkage) หร อ พะนธ เปปไตด (peptide linkage) H 2 N H 2 H + H 2 N H H H 3 H 2 N H 2 NH H H H 3

29 ปฏ ก ร ยาการเก ดพะนธ ไดซะลไฟด เก ดเฉพา กรดอ ม โนท ม หม thiol (-SH) เช น cystein ถ า cysteine 2 หน วยเข ามาอย ใกล กะน จ เก ด oxidation ของ thiols ได พะนธ ได ซะลไฟด (-S- S-) H 2 N H H H 2 N H H H 2 H 2 SH + SH S S H 2 H 2 H 2 N H H H 2 N H H

30 เปปไตด แล โปรต น เปปไตด เป นสารท เก ดจาก เป นสารท เก ดจากกรดอ กรดอ ม โน ม โนท า ท าปฏ ก ร ยากะน โดยใช หม คาร คาร บอก บอกซ ล ซ ลกะบ กะบหม อ หม อ ม โน ม โน H 3 N H 2 + H 3 N H Glycine H 3 Alanine H 3 N H 2 NH H Glycylalanine H 3 ไดเปปไตด (dipeptide dipeptide)

31 Dipeptide สามารถรวมตะวกะบกรดอ กรดอ ม โนโมเลก ลอ นๆ ต อไปได อ ก H 3 N H 2 NH H + H 3 N H Glycylalanine H 3 H H 3 H 3 Valine H 3 N H 2 NH H NH H H 3 H H 3 Glycylalanylvaline H 3 Tripeptide

32 tripeptide สามารถรวมตะวกะบกรดอ กรดอ ม โนต อไปอ ก ได tetrapeptide, pentapeptide เป นต น ถ าสาย peptide เก ดจากกรดอ กรดอ ม โนหลายๆ หน วย จ ได โมเลก ลขนาด ใหญ เร ยกว า polypeptide หร อโปรต นนะ นเอง

33 การเข ยนส ตรโครงสร างของเปปไตด เปปไตด ให เข ยนหม แอมโมเน ยม แอมโมเน ยมอ สร อย ทางซ าย อ สร อย ทางซ าย เร ยกว า N-terminal ส วนหม คาร บอกซ เลตอ สร อย ทางขวา เร ยกว า -terminal H 3 N H 2 NH H N-terminal H 3 Glycylalanine -terminal เร ยกช อเร ยงล าดะบ เร ยงล าดะบจากซ ายไปขวา โดยเปล ยนค า ค าลงท ายจาก -ine ine เป น -yl yl เม อถ ง -terminal จ งเร ยกช อกรดอ กรดอ ม โนนะ นๆ ตามปกต

34 H 3 N H 3 N H H 2 NH H NH H 2 H 2 H SH Glutamylcysteylglycine Glu-ys-Gly Glycylvalylphenylalanine Gly-Val-Phe

35 โครงสร างของโปรต น โครงสร างของโปรต นแบ งออกเป น 4 ชน ด ซ งม ความสละบซะบซ อนแตกต างกะน ดะงน โครงสร างชน ดปฐมภ ม (primary structure) แสดงล าดะบ ล าดะบของ ของกรดอ กรดอ ม โนชน ดต างๆ ท จะบกะนเป นโมเลก ลของโปรต น หร อ polypeptide Gly Ile Val Gln ys ys Ala Ser Val ys Ser Leu Asp - Arg - Val - Tyr Tyr - Ile Ile - His - Pro - Phe

36 โครงสร างชน ดท ต ยภ ม (seconda secondary structure) แสดงการจะดตะวของโมเลก ลท ม ร ปแบบสม า ร ปแบบสม าเสมอ ท พบมากค อ แบบเกล ยวอะลฟา แล แบบแผ น พะบจ บเบ จ บเบตา ม พะนธ ไฮโดรเจนภายใน โมเลก ล แล /หร อ ร หว าง โมเลก ล α-helix β-pleated Sheet

37 โครงสร างชน ดตต ยภ ม (tertia tertiary ry structure) เก ดจากการม วนตะวเข าหากะนของ 2 o structure การม วนเข าหากะนท า ท าให ส วนท ม ขะ วท ให ส วนท ม ขะ วท ชอบน า (hudrophilic hudrophilic) อย ด านนอก แล ส วน ท ไม ม ขะ ว (hydrophobic) อย ด านใน เสถ ยรได เพรา ม แรงหลาย ชน ด ได แก - พะนธ ไฮโดรเจน - พะนธ โคเวเลนต - ส พานเกล อ - Hydrophobic interaction

38

39 โครงสร างชน ดจต รภ ม (quaternary structure) เป นโครงสร างท ซะบซ อนเก ดจาก polypeptide หลายหน วยมาเกา กล มกะน หร อจะบกะบหน วยอ น ท ไม ใช peptide hemoglobin collagen

40 The four levels of protein structure

41 การว เครา ห โครงสร างปฐมภ ม ของโปรต น Amino acid analysis หาว าโปรต นนะ นปร กอบด วย amino acid ชน ดใดบ าง แล ม ปรมาณเท าไร ท า hydrolysis โดยใช กรดเป นตะวเร ง ท าให amide linkage แตก ออกให amino acid ทะ งหมด ท าการแยกแล พ ส จน เอกละกษณ ของ amino acid โดยใช amino acid analyzer

42 Sequence determination หาล าดะบการต อกะนของ amino acid โดยว เครา ห ส วนปลายทะ งสองของโปรต น ร วมกะบ partial hydrolysis ว เครา ห N-terminal: ใช phenyl isothiocyanate (Edman reagent) ซ งจ ท า ปฏ ก ร ยากะบหม amino ให thiourea derivative hydrolysis of thiourea ให phenylthiohydantoin แล polypeptide ใหม ท ม amino acid น อยกว า polypeptide ตะ งต น 1 หน วย น า phenylthiohydantoin ไปแยกแล พ ส จน จ าท าให ทราบชน ดของ amino acid ท N-terminal ได

43 + H 3 N R 1 R 2 R 3 H NH H NH H N S NH S R 1 R 2 R 3 NH H NH H NH H R 1 Hl, H 2 HN H + + H 3 N R 2 R 3 H NH H S N phenylthiohydantoin

44 ว เครา ห -terminal: ท า hydrolysis โปรต น โดยใช enzyme carboxypeptidase พะนธ ท -terminal จ แตกออก ได polypeptide ใหม ท ม amino acid น อยกว า polypeptide ตะ งต น 1 หน วย R 3 R 2 R 1 NH H NH H NH H - + H 2 carboxypeptidase R 3 R 2 R 1 NH H NH H H 3 N H -

45 ทางปฏ บะต การว เครา ห จาก hydrolysis ท ล ขะ น ไม สามารถท าได ตลอดสาย peptide ต องท า partial hydrolysis เพ อให ได polypeptide ขนาดสะ นลง แล ว เครา ห โดยการเร ยงต อกะน ว ธ hydrolysis ท เฉพา ได แก การใช enzyme แล reagent บางชน ด ท สลายพะนธ peptide บางต าแหน ง ถ าใช enzyme หลายชน ด จ ได ส วยย อย (fragment) ท ม ชน ดของ amino acid เหม อนกะน เม อหาล าดะบของ amino acid ใน fragment แล วน าส วนท เหม อนกะนมา ซ อนกะน จ ได ล าดะบสมบ รณ ของ peptide ได

46 Hydrolyse pentapeptide ชน ดหน ง ได tripeptide Gly - Glu - Phe Glu - Phe - Gly Phe - Gly - Arg น า tripeptide ทะ งสามมาเร ยงกะน โดยให amino acid ท เหม อนกะนซ อนกะน Gly - Glu - Phe Glu - Phe - Gly Phe - Gly - Arg ดะงนะ นล าดะบของ amino acid ค อ Gly - Glu - Phe - Gly - Arg