Ανάπτυξη των οργάνων ενδοδερμικής προέλευσης

Transcript

1 Αναπτυξιακή βιολογία και ιστολογία Ενότητα 3: Οργανογένεση Ανάπτυξη των οργάνων ενδοδερμικής προέλευσης (J.M.W. Slack, Βασικές Αρχές Βιολογίας Ανάπτυξης, Aκαδημαϊκές Εκδόσεις 2007) Δρ. Μαριάννα Χ. Αντωνέλου ΑΒΙ-Οκτ-2012

2 Εισαγωγή Ενδόδερμα: εσώτερη από τις τρεις βλαστικές στιβάδες εμβρύου προκύπτει από την επιβλάστη κατά τη διάρκεια της γαστριδίωσης Εισβάλει από την αρχική λωρίδα και εκτοπίζει τα κύτταρα της υποβλάστης στην περιφέρεια του βλαστοδέρματος

3 Εισαγωγή Λειτουργίες ενδοδέρματος: επαγωγή σχηματισμού διάφορων μεσοδερμικών οργάνων (νωτοχορδή, καρδιά, αγγεία κλπ) κατασκευή επιθηλίων ΓΣ και καταβολών (ήπαρ, πάγκρεας κλπ) και αναπνευστικού σωλήνα (πνεύμονες) Ο αυλός του γαστρεντερικού σωλήνα προέρχεται από το χώρο κάτω από το βλαστόδερμα

4 Εισαγωγή Το ενδόδερμα αρχίζει να καταλαμβάνει τις «ενδοδερμικές περιοχές» κατά μήκος του εμπροσθοπίσθιου και ραχιοκοιλιακού άξονα μετά τη γαστριδίωση Τελικά υποδιαιρείται σε μορφολογικά και λειτουργικά διαφοροποιημένες περιοχές και στα όργανα του πεπτικού και αναπνευστικού συστήματος επιθήλιο γαστρεντερικού σωλήνα αποφύσεις: 1. αναπνευστικό σύστημα 2. ήπαρ 3. πάγκρεας Εξωτερικά περιβλήματα οργάνων: λείος μυικός ιστός, συνδετικός ιστός, αιμοφόρα αγγεία σπλαχνικό μεσόδερμα

5 Εισαγωγή 45h chick embryo Σωματοπλευρά: Ο συνδυασμός επιδερμίδας-σωματικού μεσοδέρματος Σπλαχνοπλευρά: Ο συνδυασμός ενδοδέρματος-σπλαχνικού μεσοδέρματος

6 Εισαγωγή Πολλές μελέτες σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην «εγκαθίδρυση» του ενδοδέρματος κατά τη διάρκεια της γαστριδίωσης και στη διαφοροποίηση συγκεκριμένων οργάνων του πεπτικού συστήματος: (Stainier, 2002; Tam et al., 2003; Yasugi, 1994; Wells and Melton, 1999; Duncan, 2000; Grapin- Botton and Melton, 2000; Yasugi, 2000; Fukuda and Yasugi, 2002) λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με το πώς διαχωρίζεται το ενδόδερμα από τις άλλες βλαστικές στιβάδες και πως κατανέμεται σε ειδικές περιοχές. (Κimura et al., Developmental Biology 289:283, 2006)

7 Φυσιολογική ανάπτυξη Σχηματισμός γαστρεντερικού σωλήνα στα αμνιωτά αυγά Μελέτες: οι περισσότερες στο έμβρυο της όρνιθας (επιτελείται με παρόμοιο τρόπο σε άλλα ανώτερα σπονδυλωτά) έμβρυο Πεπτικός σωλήνας εμβρύων σπίνος ποντικός ορτύκι Composite photo courtesy of N. Kurpios. όρνιθα

8 Φυσιολογική ανάπτυξη Caspar Friedrich Wolff (1769) (embryologist, St. Petersburg): έδειξε ότι ο ΓΣ σχηματίζεται από την καμπύλωση μιας αρχικά επίπεδης επιφάνειας. Πρώτη πειραματική (μικροσκοπική) απόδειξη ότι το έμβρυο σχηματίζεται από την αρχή κι ότι δεν υπάρχουν μικροσκοπικά, προσχηματισμένα άτομα μέσα στους γαμέτες.

9 Φυσιολογική ανάπτυξη Η ανάπτυξη του ΓΣ ξεκινάει σε δύο θέσεις οι οποίες συγκλίνουν η μία προς την άλλη προτού συντηχθούν σε μία κεντρική θέση Στο πρόσθιο αρχέντερο: κύτταρα από τα πλευρικά τμήματα του εμπρόσθιου ενδοδέρματος κινούνται κοιλιακά για να σχηματίζουν το θύλακα του εμπρόσθιου αρχεντερικού ανοίγματος Οπίσθιο ενδόδερμα: οπίσθιο αρχεντερικό άνοιγμα Καθώς συγκλίνουν το ένα προς το άλλο σχηματίζεται το μέσο αρχέντερο

10 Φυσιολογική ανάπτυξη Πρόσθιο αρχέντερο (θύλακας) Ο γαστρεντερικός σωλήνας σχηματίζεται από μία αναδίπλωση του βλαστοδέρματος (εγκόλπωση) στην οποία συμμετέχουν και οι τρεις βλαστικές στιβάδες.

11 Φυσιολογική ανάπτυξη Στο οπίσθιο άκρο εμβρύου (ουραία πτυχή βλαστοδέρματος): οπίσθιο αρχεντερικό άνοιγμα Σχηματισμός του οπίσθιου εντέρου (όψιμο στάδιο). (Κατά Bellairs and Osmond The Atlas of Chick Development. Academic Press, figures 31, 32 and 33).

12 Φυσιολογική ανάπτυξη Κλείσιμο του γαστρεντερικού σωλήνα και του σώματος στο έμβρυο της όρνιθας. Το εμπρόσθιο και το οπίσθιο αρχεντερικό άνοιγμα συγκλίνουν και συντήκονται Το σπλαχνικό μεσόδερμα εκατέρωθεν της μέσης γραμμής συγκλίνει (εγκάρσιες τομές ανάμεσα στα επίπεδα του μέσου και του οπίσθιου εντέρου κατά την ημέρα 3). (Κατά Bellairs and Osmond The Atlas of Chick Development. Academic Press, figures 31, 32 and 33).

13 Φυσιολογική ανάπτυξη και συντήκεται σχηματίζοντας το ραχιαίο και κοιλιακό μεσεντέριο που περικλείει το αρχέντερο. (εγκάρσιες τομές ανάμεσα στα επίπεδα του μέσου και του οπίσθιου εντέρου κατά την ημέρα 3). (Κατά Bellairs and Osmond The Atlas of Chick Development. Academic Press, figures 31, 32 and 33).

14 Φυσιολογική ανάπτυξη Το ραχιαίο μεσεντέριο (συγκρατεί το αρχέντερο/έντερο) παραμένει στο ενήλικο άτομο ενώ το μεγαλύτερο μέρος του κοιλιακού μεσεντερίου χάνεται (εγκάρσιες τομές ανάμεσα στα επίπεδα του μέσου και του οπίσθιου εντέρου κατά την ημέρα 3). (Κατά Bellairs and Osmond The Atlas of Chick Development. Academic Press, figures 31, 32 and 33).

15 Φυσιολογική ανάπτυξη Ημέρα 4 η : ολοκλήρωση σχηματισμού γαστρεντερικού σωλήνα εμβρύου 1. Ασύμμετρη συσπείρωση (ρύθμιση από μηχανισμό εγκαθίδρυσης ασυμμετρίας άξονα δεξιά-αριστερά) 2. Σχηματισμός καταβολών διαφόρων οργάνων που αναπτύσσονται από το γαστρεντερικό σωλήνα (ανάπτυξη τοπικού προτύπου οργάνωσης ΓΣ)

16 Photo courtesy of L. Mahadevan Φυσιολογική ανάπτυξη 1. Ασύμμετρη συσπείρωση γαστρεντερικού σωλήνα Όλα τα άτομα ενός είδους ίδιας ηλικίας εμφανίζουν τον ίδιο αριθμό και μέγεθος συσπειρώσεων του εντερικού σωλήνα Γαστρεντερικός σωλήνας (έντερο) εμβρύου όρνιθας στάδιο E16.

17 Φυσιολογική ανάπτυξη 2. Σχηματισμός των τμημάτων και καταβολών του γαστρεντερικού σωλήνα στο έμβρυο των αμνιωτών (Κατά Hildebrand Analysis of Vertebrate Structure. 4th edn. Wiley, figure 12.1).

18 Φυσιολογική ανάπτυξη Σχηματισμός των τμημάτων του γαστρεντερικού σωλήνα στο έμβρυο των αμνιωτών Τυμπανική κοιλότητα μέσου ωτός Ευσταχιανή σάλπιγγα Αμυγδαλές Θύμος Παραθυροειδείς αδένες (Κατά Hildebrand Analysis of Vertebrate Structure. 4th edn. Wiley, figure 12.1).

19 Η οργάνωση του ΓΣ είναι ίδια σε όλα τα σπονδυλωτά. Φυσιολογική ανάπτυξη Πυλωρικός σφιγκτήρας HCl πεψίνη κυλινδρικό πολύστιβο πλακώδες επιθήλιο αδενικό επιθήλιο κυλινδρικό (εμβρυικό στάδιο ) με κρύπτες και λάχνες (ώριμο στάδιο) Τοπική διαφοροποίηση γαστρεντερικού σωλήνα (Κυτταρική διαφοροποίηση των τμημάτων του εντερικού σωλήνα στο έμβρυο της όρνιθας).

20 Φυσιολογική ανάπτυξη HCl πεψίνη Οι διαφορετικοί τύποι επιθηλιακού ιστού προέρχονται από την ίδια στιβάδα ενδοδερμικών κυττάρων.

21 Φυσιολογική ανάπτυξη Λεπτό έντερο: δωδεκαδάκτυλο, νηστίδα, ειλεός. Δωδεκαδάκτυλο: με βρόγχο προσάρτησης ήπατος και παγκρέατος

22 Φυσιολογική ανάπτυξη Ήπαρ: αναπτύσσεται λίγο μετά το σχηματισμό του πρόσθιου αρχεντέρου από μία κοιλιακή απόφυση του τελευταίου. περιοχή πρόσθιου αρχεντέρου περιοχή πρόσθιου αρχεντέρου περιοχή μέσου αρχεντέρου Ανάπτυξη ήπατος στον ποντικό. (ενδόδερμα: κίτρινο, πράσινο: χοληδόχος κύστη) fg, mg, hg: πρόσθιο, μέσο και οπίσθιο αρχέντερο. Zorn, A.M., Liver development (October 31, 2008), StemBook, ed. The Stem Cell Research Community, StemBook, doi/ /stembook ,

23 Φυσιολογική ανάπτυξη Πάγκρεας: αναπτύσσεται και αυτό από το πρόσθιο αρχέντερο (μία μεγάλη ραχιαία καταβολή και μία μικρότερη κοιλιακή (έμβρυο ποντικού) ή από ζεύγος κοιλιακών καταβολών (έμβρυο όρνιθας) ραχιαία καταβολή Με την ανάπτυξη του εμβρύου οι καταβολές συγκλίνουν και σε όψιμα στάδια συντήκονται κοιλιακή καταβολή Suckale et al., Frontiers in Bioscience 13, , 2008.

24 Φυσιολογική ανάπτυξη Κοιλιακό πάγκρεας: συνδέεται στενά με το ήπαρ μέσω αγωγών (παγκρεατικός και ηπατικός που συντήκονται) που σχηματίζουν τον κοινό χοληφόρο πόρο. ραχιαία καταβολή κοιλιακή καταβολή Suckale et al., Frontiers in Bioscience 13, , 2008.

25 Ώριμο έντερο: «πρόσθιο», «μέσο» και οπίσθιο έντερο. Φυσιολογική ανάπτυξη Αυτά τα τμήματα δε σχετίζονται απόλυτα με τα αντίστοιχα του αρχεντέρου γιατί τα τελευταία συνιστούν κινούμενα όρια κατά το σχηματισμό του γαστρεντερικού σωλήνα. Συμβατικά: Όψιμα στάδια «πρόσθιο» Μέχρι το πάγκρεας και το ήπαρ «μέσο» Μέχρι την ένωση ανάμεσα στο λεπτό και στο παχύ έντερο

26 Φυσιολογική ανάπτυξη Πώς γνωρίζει το ενδόδερμα του ΓΣ ότι θα μετασχηματιστεί σε αυτούς τους ιστούς στις συγκεκριμένες θέσεις του? Γιατί δεν συναντάμε ποτέ ένα στόμα σε σύνδεση με το στομάχι? 1. Γενική εξειδίκευση ενδοδέρματος από κλίση συγκέντρωσης ρετινοϊκού οξέος: προκαλεί έκφραση εξειδικευμένων ως προς διάφορες περιοχές μεταγραφικών παραγόντων στο ενδόδερμα 2. Επαγωγικά σήματα (πχ. FGF) από τα μεσεγχυματικά κύτταρα σπλαχνικού μεσοδέρματος βοηθούν στην τοπική εξειδίκευση του ενδοδέρματος

27 Φυσιολογική ανάπτυξη Χάρτης Πεπρωμένου Ενδοδέρματος 1. Ο πρώτος πληθυσμός ενδοδερμικών κυττάρων που εισέρχεται στο κατώτερο στρώμα συμβάλλει μόνο στο σχηματισμό του μέσου/οπίσθιου αρχεντέρου 2. Τα επόμενα κύτταρα που εισάγονται συμβάλλουν στο ραχιαίο πρόσθιο αρχέντερο και τελευταία αυτά του κοιλιακού πρόσθιου αρχέντερου.

28 Φυσιολογική ανάπτυξη Χάρτης Πεπρωμένου Ενδοδέρματος Διατηρούνται οι σχέσεις ανάμεσα στο ενδόδερμα και στα παράγωγά του κατά μήκος του εμπροσθοπίσθιου (ΕΟ) άξονα Εμπρόσθιο ενδόδερμα Πρόσθιο αρχέντερο Μέσο ενδόδερμα Μέσο αρχέντερο Οπίσθιο ενδόδερμα Οπίσθιο αρχέντερο Χάρτης πεπρωμένου του ενδοδέρματος της όρνιθας. (Κατά Grapin-Botton).

29 Χάρτης Πεπρωμένου Ενδοδέρματος Φυσιολογική ανάπτυξη Συγκριτική μελέτη χαρτών πεπρωμένου περιοχών ενδοδέρματος και μεσοδέρματος οι οποίες συγκροτούν από κοινού τα επιμέρους τμήματα του ΓΣ σπλαχνικού (ημέρα 1,5 Κατά Matsushita) Το ενδόδερμα και το μεσέγχυμα των επιμέρους τμημάτων του ΓΣ αναπτύσσονται από διαφορετικά τμήματα του εμβρύου, καθώς, για κάθε συγκεκριμένη δομή ΓΣ τα συμβαλλόμενα τμήματα ενδοδέρματος και μεσοδέρματος εντοπίζονται σε διαφορετική περιοχή του χάρτη. (Ωστόσο, η διάταξη των τμημάτων κατά μήκος του ΕΟ άξονα είναι η ίδια)

30 Φυσιολογική ανάπτυξη Σχετική μετακίνηση των δύο βλαστικών στιβάδων κατά τη διαδικασία κλεισίματος του αρχεντέρου (και του κοιλιακού τοιχώματος του σώματος) Επαγωγικές αλληλεπιδράσεις ενδοδέρματος-μεσοδέρματος κατά την ανάπτυξη του ΓΣ Χάρτες πεπρωμένου: μια συγκεκριμένη περιοχή ενδοδέρματος εφάπτεται με διαφορετικές περιοχές του μεσοδέρματος κατά τα στάδια ανάπτυξης του ΓΣ. Η εξειδίκευση του ενδοδέρματος μπορεί να μεταβάλλεται καθώς αυτό έρχεται σε επαφή με μεσέγχυμα από διαφορετικές περιοχές του εμβρύου

31 Καθορισμός του ενδοδέρματος Καθορισμός Ενδοδέρματος Μεταγραφικοί παράγοντες που ενέχονται σε σχηματισμό ενδοδέρματος: 1. Κάποιοι καθορίζουν το ενδόδερμα συνολικά, ως βλαστική στιβάδα 2. Κάποιοι καθορίζουν το ενδόδερμα ως εξειδικευμένο επιθήλιο ή όργανο και εκφράζονται σε διακριτές περιοχές ενδοδέρματος. Η έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων που ενέχονται στον καθορισμό του ενδοδέρματος χαρακτηρίζεται από αμοιβαία αλληλεξάρτηση μεταξύ τους (πχ. με πειραματική υπερέκφραση ενός ενεργοποίηση υπολοίπων)

32 Καθορισμός του ενδοδέρματος Παράγοντες που καθορίζουν το ενδόδερμα συνολικά, ως βλαστική στιβάδα Το μονοπάτι nodal είναι απαραίτητο για την ενεργοποίηση στο ενδόδερμα (στα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης του ΓΣ) της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες όπως ο Sox17 και ο mixer

33 Καθορισμός Ενδοδέρματος Καθορισμός του ενδοδέρματος Παράγοντες που καθορίζουν το ενδόδερμα συνολικά, ως βλαστική στιβάδα Xenopus Eνδόδερμα: από το τμήμα του εμβρύου σταδίου 32 κυττάρων που αντιστοιχεί στα 8 βλαστομερίδια φυτικού πόλου Εξώδ. Μεσόδ. Ενδόδ. mrna μεταγραφικού παράγοντα vegt: ενεργοποιεί (άμεσα ή όχι, πχ. nodal*) έκφραση των: Sox17α Sox17β Mix1 Mixer* GATA1, GATA2, GATA3, GATA4*

34 Καθορισμός Ενδοδέρματος Καθορισμός του ενδοδέρματος Zebrafish Εξώδερμα Μεσοενδόδερμα Σηματοδότηση nodal Ελέγχει έκφραση casanova (sox family) και spiel-ohne-grenzen Απώλεια λειτουργίας αυτών των γονιδίων απουσία ενδοδέρματος (Grapin-Botton and Constam, Mechanisms of Development 124:253, 2007)

35 Καθορισμός του ενδοδέρματος Παράγοντες που καθορίζουν το ενδόδερμα ως εξειδικευμένο επιθήλιο ή όργανο και εκφράζονται σε διακριτές περιοχές ενδοδέρματος γονίδιο έμβρυο έκφραση Συνέπεια στοχευμένης αδρανοποίησης pax9 ποντικός Φαρυγγικοί θύλακες Απουσία θύμου, παραθυρεοειδούς Nkx2.1 ποντικός Καταβολή θυρεοειδούς και στο τραχειοοισοφαγικό διάφραγμα pdx1 ποντικός Κεντρικό τμήμα ΓΣ με μελλοντικές καταβολές παγκρέατος cdx2 ποντικός Όρνιθα Οπίσθιο τμήμα ΓΣ Απουσία θυρεοειδούς και πνευμόνων Απουσία παγκρέατος Πρόωρος θάνατος (μετασχηματισμό τύπου επιθηλίου εντέρου σε οισοφάγου cdx2 + διαφοροποίηση ενδοδέρματος) foxa2 Ενδόδερμα Απώλεια πρόσθιου και μέσου αρχεντέρου Ο ρόλος τους στην τοπική εξειδίκευση αποδεικνύεται από το φαινότυπο των εκμηδενιστικών μεταλλαγμάτων τους

36 Καθορισμός του ενδοδέρματος Οι επικράτειες έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες σημαντικούς για την ανάπτυξη του γαστρεντερικού σωλήνα, στις στιβάδες του ενδοδέρματος και του μεσοδέρματος του πρώιμου εντέρου της όρνιθας. (Κατά Roberts).

37 Καθορισμός του ενδοδέρματος Η ανάπτυξη των προτύπων έκφρασης αυτών των γονιδίων φαίνεται να καθοδηγείται από το σύστημα εγκαθίδρυσης προτύπου κατά μήκος του ΕΟ άξονα κατά την πρώιμη ανάπτυξη εμβρύου Aρκετοί από αυτούς τους παράγοντες εκφράζονται και σε πιο όψιμα στάδια ανάπτυξης ΓΣ (τελική διαφοροποίηση ΓΣ) Γονίδιο Πρώιμο στάδιο Όψιμο στάδιο pdx1 Σχηματισμός παγκρέατος Εκφράζεται ειδικά σε κύτταρα β, ελέγχει έκφραση insulin Nkx2.1 Σχηματισμός θυρεοειδούς Ρυθμίζει έκφραση θυρεοειδικών γονιδίων thyroglobulin, thyroperoxidase

38 Καθορισμός του ενδοδέρματος ΜΤΓΦ παράγοντες Τοπική έκφραση Περιοχή ελέγχου πχ. Hoxd13 Μεσόδερμα Ρυθμίζουν μέσω επαγωγής το τοπικό πρότυπο ενδοδέρματος Έκτοπη έκφραση Hoxd13 στο μεσέγχυμα του μέσου (vs. nl οπίσθιου) αρχεντέρου το αντίστοιχο επιθήλιο του μέσου αρχεντέρου δεν διαφοροποιείται ως επιθήλιο λεπτού αλλά ως επιθήλιο παχέος εντέρου

39 Καθορισμός του ενδοδέρματος Transcription factor network in endoderm induction Οι παράγοντες FoxΑ περιορίζονται στα ενδοδερμικά κύτταρα οριακά πριν ή κατά τη διάρκεια της γαστριδίωσης και είναι απαραίτητοι για την εξειδίκευση και διαφοροποίηση των ενδοδερμικών δομών. Αnne Grapin-Botton Endoderm specification

40 Σύστημα ΕΟ προτύπου πρώιμης ανάπτυξης: εξαρτάται από ένα σήμα επαγωγής «οπίσθιων δομών» που παράγεται κατά την γαστριδίωση (FGFs, Wnts, retinoic acid) Στόχοι «οπίσθιου» σήματος: οικογένεια cdx Ενεργοποίηση Hox

41 Καθορισμός του ενδοδέρματος cdxa: εκφράζεται στο οπίσθιο τμήμα αρχικής λωρίδας εμβρύου όρνιθας (στάδιο 3 έως στάδιο 10 = περίοδος πρώιμης έκφρασης γονιδίου) Το γονίδιο εκφράζεται πολύ αργότερα εκ νέου, σε όψιμα στάδια ανάπτυξης στο οπίσθιο ενδόδερμα (περιοχή από την οποία προκύπτει το μεγαλύτερο τμήμα μελλοντικού εντέρου)

42 Καθορισμός του ενδοδέρματος Ανάπτυξη παραγώγων ενδοδέρματος: αμοιβαίες επαγωγικές αλληλεπιδράσεις ενδόδερμα σπλαχνικό μεσόδερμα* (*μεσέγχυμα: μετά το κλείσιμο του αρχεντέρου, στιβάδα αδιαφοροποίητου μεσεγχύματος που περικλείει το επιθήλιο ΓΣ) Επαγωγικά σήματα 1. Παράγονται στο ενδόδερμα (πχ. Shh) Δρουν στο μεσέγχυμα 2. Παράγονται στο μεσέγχυμα Δρουν στο ενδόδερμα

43 Καθορισμός του ενδοδέρματος Παράγονται στο ενδόδερμα αρχεντέρου (πχ. Shh) Δρουν στο μεσέγχυμα Shh ενδοδέρματος αρχεντέρου: ακτινωτή διαβάθμιση [Shh] στο μεσέγχυμα ελέγχει διαφοροποίηση στιβάδων ώριμου ΓΣ lamina propria- ίδιος υμένας Muscularis mucosa- μυοβλεννογόνος Submucosa-Υποβλεννογόνος smooth muscle-λείος μυϊκός ιστός Κυκλοπαμίνη (καταστολέας μονοπατιού Shh): παρεμπόδιση σχηματισμού τοπικού προτύπου μεσεγχύματος (Heath JK. Current Topics in Developmental Biology 90:159, 2010)

44 Καθορισμός του ενδοδέρματος Παράγονται στο μεσέγχυμα Δρουν στο ενδόδερμα Ωρίμανση και διαφοροποίηση ενδοδέρματος: απαιτεί δράση επιτρεπτικού επαγωγικού σήματος που παράγεται στο μεσέγχυμα Ανασυνδυασμός: Μεσέγχυμα + Επιθήλιο (από διαφορετικές περιοχές αναπτυσσόμενου ΓΣ εμβρύου όρνιθας) Επαναπρογραμματισμός διαφοροποίησης ενδοδέρματος (ταυτόσημος της θέσης προέλευσης μεσοδέρματος) (ΙΣΧΥΕΙ ΓΙΑ ΣΥΝΟΛΙΚΗ ΑΡΧΙΤΕΚΤΟΝΙΚΗ ΙΣΤΩΝ)

45 Καθορισμός του ενδοδέρματος Ανασυνδυασμένο τμήμα Ανάπτυξη in vitro σε σε μία ουδέτερη θέση Πειράματα ανασυνδυασμού ανάμεσα στο ενδόδερμα και στο μεσέγχυμα του εντέρου του εμβρύου της όρνιθας.

46 Καθορισμός του ενδοδέρματος Αν όμως η ανάλυση περιλαμβάνει και κυτταρική διαφοροποίηση και αρχιτεκτονική ιστών: Μεταμόσχευση in ovo : Εμπρόσθιο ενδόδερμα + οπίσθιο μεσόδερμα επαναπρογραμματισμός σε οπίσθιο ενδόδερμα Οπίσθιο ενδόδερμα + εμπρόσθιο μεσόδερμα ΌΧΙ ΕΠΑΝΑΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΟΣ

47 Καθορισμός του ενδοδέρματος Η μελλοντική περιοχή του εντέρου που εκφράζει cdxa (οπίσθιο ενδόδερμα): αποκτά μηαντιστρεπτή δέσμευση ως την ημέρα 1.5 Οι περιοχές του μελλοντικού οισοφάγου/στομάχου (εμπρόσθιο ενδόδερμα): δεκτικές στο σχηματισμό εντερικού επιθηλίου μέχρι την ημέρα 4,5.

48 Καθορισμός του ενδοδέρματος Στόμαχος εμβρύου όρνιθας: προστόμαχος + μυϊκός στόμαχος προστόμαχος μυϊκός στόμαχος (Ε8) πρόλοβος προστόμαχος μυϊκός στόμαχος (Sohal et al., International Journal of Developmental Neuroscience 20:619, 2002) Αδενικό επιθήλιο (όπως στα θηλαστικά) Πλακώδες επιθήλιο (και παχύ μυϊκό τοίχωμα)

49 Καθορισμός του ενδοδέρματος Πειράματα ανασυνδυασμού επιθηλίου-μεσεγχύματος στην όρνιθα την ημέρα 9: Επιθήλιο προστομάχου + Μεσέγχυμα μυϊκού στομάχου διαφοροποίηση επιθηλίου προστομάχου σε επιθήλιο μυϊκού στομάχου Επιθήλιο μυϊκού στομάχου + Μεσέγχυμα προστομάχου διαφοροποίηση επιθηλίου μυϊκού στομάχου σε επιθήλιο προστομάχου προστόμαχος μυϊκός στόμαχος Οι δύο περιοχές του στομάχου μπορούν να υποκαταστήσουν η μία την άλλη, διαφοροποιούμενες μέσω επαγωγής από σήματα του μεσεγχύματος

50 Καθορισμός του ενδοδέρματος Οι παράγοντες ΒΜΡ του μεσεγχύματος του προστομάχου δρουν επαγωγικά στην ανάπτυξη αδενικού επιθηλίου αδενικού τύπου επιθήλιο ΒΜΡ noggin + ΒΜΡ διαφοροποίηση σε αδενικού τύπου επιθήλιο (όπως του προστομάχου) Νkx2.3 (Yasugi and Fukuda, Zoological Science 17:1, 2000) Shh * (ενδόδερμα) ΒΜΡ (μεσέγχυμα)

51 Καθορισμός του ενδοδέρματος Συμπερασματικά: Στο ΓΣ η τοπική εξειδίκευση βασίζεται σε επαγωγικά σήματα που παράγονται στο μεσόδερμα Το ίδιο ισχύει και για το ήπαρ ο σχηματισμός του οποίου προυποθέτει σηματοδότηση FGF από το καρδιακό μεσόδερμα Πώς??

52 Καθορισμός του ενδοδέρματος Σχηματισμός του ήπατος Από μία κοιλιακή καταβολή του πρόσθιου αρχεντέρου το οποίο αναπτύσσεται σε μέγεθος μέσα στο κοιλιακό μεσέγχυμα (καλείται ενδιάμεσο διάφραγμα, septum transversum, στα έμβρυα των θηλαστικών)

53 Καθορισμός του ενδοδέρματος Η καταβολή του ήπατος δημιουργείται ύστερα από επαγωγή FGF από το παρακείμενο καρδιογενικό μεσόδερμα. Επαγωγικό σήμα σχηματισμού ήπατος: 1. Παράγοντες FGF από το παρακείμενο καρδιογενικό μεσόδερμα 2. Παράγοντες ΒΜΡ από το παρακείμενο κοιλιακό μεσέγχυμα 3. Άγνωστα μόρια που παράγονται από τα αιμοφόρα αγγεία Zong Υ and Stanger BZ, Developmental Biology 1(5), 2012 Published Online: Apr DOI: /wdev.47

54 Καθορισμός του ενδοδέρματος Καταστολή μονοπατιού FGF παρεμπόδιση επαγωγής ήπατος Απομονωμένο ηπατικό ενδόδερμα + FGF In vitro επαγωγή σχηματισμού ήπατος Πειράματα ανασυνδυασμού: Μεσέγχυμα από έμβρυο: Χωρίς BMP4 (στοχευμένη αδρανοποίηση bmp4) Χωρίς αιμοφόρα αγγεία ΜΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΗΠΑΤΙΚΟΥ ΕΝΔΟΔΕΡΜΑΤΟΣ Zong Υ and Stanger BZ, Developmental Biology 1(5), 2012 Published Online: Apr DOI: /wdev.47

55 Καθορισμός του ενδοδέρματος Παράγοντες FGF: πρώιμη τοπική εξειδίκευση ενδοδέρματος στο στάδιο αρχικής λωρίδας Παράγοντες FGF: επαγωγή σχηματισμού ηπατικού εγκολπώματος από το πρόσθιο αρχέντερο σε πιο όψιμο στάδιο ανάπτυξης Το ίδιο σήμα είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί σε διαφορετικά επαγωγικά φαινόμενα κατά την ανάπτυξη (FGF10: εμπλέκεται σε σχηματισμό πνευμόνων και τυφλού εντέρου)

56 Αφού σχηματιστεί η καταβολή του ήπατος: Καθορισμός του ενδοδέρματος Η μετέπειτα αύξησή του προϋποθέτει τη δράση πολλών παραγόντων, ανάμεσα στους οποίους και αυτούς του μονοπατιού Wnt. Υπερέκφραση β-κατενίνης σε ήπαρ εμβρύου όρνιθας προαγωγή αύξησης οργάνου Υπερέκφραση καταστολέων μονοπατιού Wnt περιορισμός της αύξησης του οργάνου

57 (Konoshita and Miyajima BBA (Biochimica et Biophysica Acta) -Molecular Cell Research 1592:303, 2002) Κοιλιακό μεσέγχυμα (ενδιάμεσο διάφραγμα) A possible model for the mechanism of early hepatic specification. Generation of the hepatic primordium from the foregut endoderm requires at least two different signals, i.e., BMP and FGF family proteins. These proteins are produced by mesenchymal cells in septum transversum and cardiac organ, respectively. Although intracellular signaling mechanisms are yet unclear, several lines of evidence indicated that GATA and HNF3 transcription factors play critical roles in inducing liver-specific or enriched proteins including albumin and HNF4.

58 Πάγκρεας Έντονο ενδιαφέρον για λόγους υγείας Πάγκρεας cancer

59 Πάγκρεας Εξωκρινή κύτταρα (διατεταγμένα σε κυψελίδες, acini) Σύνθεση πεπτικών ενζύμων δίκτυο αγωγών δωδεκαδάκτυλο ΚΑΙ ΟΙ ΔΥΟ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙ ΑΝΑΠΤΥΣΣΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟ ΕΝΔΟΔΕΡΜΑ Ενδοκρινή κύτταρα (διατεταγμένα σε νησίδες Langerhans, Islet) Σύνθεση ορμονών αίμα Stimulus-Secretion Coupling in the Pancreatic Beta-Cell, Juhl K. and Hutton J. From: Immunology of Type 1 Diabetes, Eisenbarth GS Ed, Sprinder, 2004, ISBN: , 2 nd Edition

60 Πάγκρεας κυψελίδες, acini νησίδες Langerhans, Islet)

61 Πάγκρεας Δομή εξωκρινούς ιστού παγκρέατος (κυψελίδες, acini) (A) Δομή του ιστού του παγκρέατος που παράγει ένζυμα. Μία κυψελίδα συνιστά μία εκκριτική μονάδα. Στις άκρες των εξωκρινών κυττάρων διακρίνονται άφθονα κοκκία ζυμογόνου (προ-ένζυμα). (Β) Φωτομικρογραφία κυψελιδωτού ιστού παγκρέατος (x200) Marieb E.N & Hoehn K, (2005), Human Anatomy & Physiology Seventh Edition, Pearson Benjamin Cummings, San Francisco, USA

62 Πάγκρεας Ενδοκρινής μοίρα παγκρέατος (10% στο έμβρυο, 1-2% στο ενήλικο άτομο) Νησίδες Langerhans: Σύνθεση ορμονών αίμα National Institutes of Health (NIH), Department of Health and Human Services (DHHS), (2009), 7. Stem Cells and Diabetes

63 Πάγκρεας Φωτομικρογραφία παγκρεατικού ιστού Γκριζομπλέ: κυψελιδωτά εξωκρινή κύτταρα που παράγουν ένζυμα και περιβάλλουν μία νησίδα ενδοκρινών κυττάρων. Διακρίνονται με διαφορική χρώση τα κύτταρα β που παράγουν ινσουλίνη και τα κύτταρα α που εκκρίνουν γλυκογόνο (x150) Marieb E.N & Hoehn K, (2005), Human Anatomy & Physiology Seventh Edition, Pearson Benjamin Cummings, San Francisco, USA

64 Πάγκρεας Πάγκρεας ΕΝΔΟΔΕΡΜΑ Επιθηλιακά κύτταρα ΠΑΓΚΡΕΑΤΙΚΟ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑ Σπλήνας Αιμοφόρα αγγεία και παγκρεατικός συνδετικός ιστός

65 Πάγκρεας Η ανάπτυξη των παγκρεατικών καταβολών στο ανθρώπινο έμβρυο. Το πάγκρεας αναπτύσσεται από μία ραχιαία και μία κοιλιακή καταβολή του δωδεκαδακτύλου (ζεύγος κοιλιακών στην όρνιθα) Οι καταβολές επεκτείνονται, συγκλίνουν. Larsen Human Embryology. Churchill Livingstone, fig. 9.6

66 Πάγκρεας..και συντήκονται ραχιαία Παγκρεατικοί αγωγοί: Κοιλιακή καταβολή: κύριος παγκρεατικός αγωγός Ραχιαία καταβολή: βοηθητικός παγκρεατικός αγωγός κοιλιακή Στον άνθρωπο, μόνο ο κοιλιακός αγωγός χρησιμοποιείται για να μεταφέρει τα πεπτικά ένζυμα στο έντερο, ενώ σε άλλα είδη (πχ. σκύλος) χρησιμοποιούνται τόσο ο ραχιαίος όσο και ο κοιλιακός αγωγός. Larsen Human Embryology. Churchill Livingstone, fig. 9.6

67 Πάγκρεας Ποντικός Ε9,5: ραχιαία καταβολή, κοιλιακή 2 ημέρες αργότερα Ενδοκρινή κύτταρα: παρόντα στις πρώιμες καταβολές-παράγουν περισσότερες από μία ορμόνες (σε αντίθεση με τα ώριμα ενδοκρινή κύτταρα, άρα δεν αποτελούν προγόνους τους) Έμβρυα ποντικού σταδίου E9.5 και E10.5 Χρώση για το γονίδιο Pdx, το οποίο εκφράζεται στις περιοχές του εμβρυικού γαστρεντερικού σωλήνα από τις οποίες αναπτύσσεται το πάγκρεας Ε14,5-Ε18,5: ταχεία αύξηση καταβολών, αριθμού ενδοκρινών κυττάρων και διαφοροποίηση εξωκρινών κυττάρων

68 Πάγκρεας Aνάπτυξη του παγκρέατος στον ποντικό Collombat et al., Mechanisms of Development 123(7):501, 2006

69 Πάγκρεας Το τμήμα του ενδοδέρματος με πεπρωμένο για ραχιαίο και κοιλιακό πάγκρεας διαμορφώνεται και εξειδικεύεται υπό την επίδραση εκκρινόμενων μορίων και σηματοδοτικών μονοπατιών που παρέχονται από γειτονικά κύτταρα και ιστούς.

70 Πάγκρεας Απουσία σηματοδότησης FGF (fibroblast growth factor) από το καρδιακό μεσόδερμα και BMP (bone morphogenetic protein) από το κοιλιακό μεσέγχυμα (ενδιάμεσο διάφραγμα, septum transversum mesenchyme): επηρεάζουν τη διαμόρφωση του κοιλιακού παγκρεατικού ενδοδέρματος (γειτνιάζει με ήπαρ). Σηματοδότηση ρετινοϊκού οξέος (RA), sonic hedgehog (SHH), FGF και ACTIVIN από το παραξονικό μεσόδερμα και τη νωτοχορδή: επιτρέπουν τη διαμόρφωση του ραχιαίου παγκρεατικού ενδοδέρματος. Στάδια E9.5- E12.5: πρωτογενής μετάβαση (εξειδίκευση παγκρεατικών προγονικών κυττάρων, παρουσία πρώτων ενδοκρινών κυττάρων, αρχή μορφογένεσης διακλαδωτού επιθηλίου) Στάδια E12.5 και μετά: δευτερογενής μετάβαση: μαζική εξειδίκευση και ανάπτυξη ενδοκρινούς παγκρέατος, μορφογένεση αγωγών, διαφοροποίηση εξωκρινούς σειράς) (Mastracci TL and Sussel L. WIREs Dev Biol doi: /wdev.44)

71 Πάγκρεας Η επαγωγή του παγκρέατος είναι η αντιδιαμετρική όψη του σχηματισμού του ήπατος. Επαφή με καρδιά αλλά όχι με νωτοχορδή επαγωγή ήπατος. Επαφή με νωτοχορδή αλλά όχι με την καρδιά επαγωγή παγκρέατος. Νωτοχορδή: ενεργοποιεί την ανάπτυξη του παγκρέατος καταστέλλοντας την έκφραση του shh στο ενδόδερμα. Η shh εκφράζεται σε όλο το ενδόδερμα του γαστρεντερικού σωλήνα εκτός από την περιοχή που θα σχηματίσει το πάγκρεας. Αυτό συμβαίνει γιατί η νωτοχορδή σε αυτό το σημείο της επαφής με το αρχέντερο εκκρίνει Fgf2 και activin οι οποίες καταστέλουν την έκφραση του shh. Aν (με διάφορους πειραματικούς χειρισμούς) εκφραστεί το γονίδιο shh σε αυτήν την περιοχή, τότε δημιουργείται εντερικό επιθήλιο κι όχι παγκρεατικό. Ωστόσο, ο ρόλος της νωτοχορδής στην επαγωγή της ραχιαίας παγκρεατικής καταβολής είναι επιτρεπτικός (δεν προκαλεί επαγωγή σε πιο οπίσθιες θέσεις) κι όχι καθοδηγητικός.

72 Κοιλιακή καταβολή: αναπτύσσεται λόγω απουσίας σηματοδότησης FGF Πάγκρεας Επαφή με ήπαρ (FGF*) Κατά τη φυσιολογική ανάπτυξη μετακινείται το κοιλιακό πρόσθιο αρχέντερο έτσι ώστε η περιοχή που θα σχηματίζει το κοιλιακό πάγκρεας να μην εκτίθεται σε παράγοντες FGF (hex-/- απουσία κοιλιακού παγκρέατος λόγω απουσίας αύξησης και μετακίνησης κοιλιακού πρόσθιου αρχεντέρου) Ραχιαία καταβολή παγκρέατος: επάγεται από σηματοδότηση FGF Κοιλιακή: αναπτύσσεται λόγω απουσίας σηματοδότησης FGF Και οι 2 καταβολές: προαπαιτούν καταστολή έκφρασης shh

73 Πάγκρεας Αύξηση και διαφοροποίηση παγκρεατικών καταβολών: παγκρεατικό μεσέγχυμα Islet-1, FGF 1. Επιτρεπτική επαγωγική επίδραση 2. Επηρεάζουν αναλογίες κυτταρικών τύπων που αναπτύσσονται κατά τη διαφοροποίηση ενδοδέρματος (πχ. αριθμό ή διαφοροποίηση ενδοκρινών κυττάρων) Ανάπτυξη ενδοκρινούς μοίρας παγκρέατος: ευνοείται από ένα άγνωστο σήμα που παράγεται από τα αιμοφόρα αγγεία Πειράματα ανασυνδυασμού Παγκρεατικές καταβολές + αιμοφόρα αγγεία αύξηση % ενδοκρινών κυττάρων

74 Πάγκρεας Η απουσία πρωτεΐνης Shh σε αυτό το σημείο του γαστρεντερικού σωλήνα τον κάνει επιδεκτικό σε σήματα που έρχονται από το ενδοθήλιο των κύριων αιμοφόρων αγγείων. ραχιαία κοιλιακή Η ανάπτυξη των παγκρεατικών καταβολών ξεκινάει από αυτά ακριβώς τα σημεία της επαφής του ενδοδέρματος του πρόσθιου αρχεντέρου με το ενδοθήλιο της αορτής και της λεκιθικής φλέβας, σημεία του αρχεντέρου στα οποία εκφράζονται (επάγονται) οι μεταγραφικοί παράγοντες Pdx1 και Ptf1. Mouse embryo Απομάκρυνση αιμοφόρων αγγείων από αυτήν την περιοχή καταστολή έκφρασης Pdx1 και Ptf1 δεν σχηματίζονται παγκρεατικές καταβολές Σχηματισμός περισσότερων αγγείων σε αυτήν την περιοχή περισσότερο εκτεταμένη περιοχή του ενδοδέρματος του γαστρεντερικού σωλήνα σχηματίζει παγκρεατικούς ιστούς. (Gilbert SF, Developmental Biology 9 th Ed, Sinauer Associates, Inc. 2010)

75 Πάγκρεας ραχιαία 2 κοιλιακές καταβολές Chick embryo Στο έμβρυο της όρνιθας στο οποίο υπάρχουν και οι δύο λεκιθικές φλέβες, στα σημεία της επαφής τους με το πρόσθιο αρχέντερο σχηματίζονται δύο κοιλιακές παγκρεατικές καταβολές. Η επαφή παγκρεατικών ιστών με αιμοφόρα αγγεία: κρίσιμη για το σχηματισμό κυττάρων-β. Pdx1: δρα σε συνεργασία με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες για το σχηματισμό των νησίδων του Langerhans (ενδοκρινή κύτταρα) (Gilbert SF, Developmental Biology 9 th Ed, Sinauer Associates, Inc. 2010)

76 Πάγκρεας Γενεαλογία παγκρεατικών κυττάρων και μεταγραφικοί παράγοντες Pdx1: απαραίτητος για σχηματισμό όλων των κυτταρικών τύπων παγκρέατος κύριος ΜΓΦΡ παράγοντας για το πάγκρεας εκφράζεται στο τμήμα δωδεκαδακτύλου από το οποίο μελλοντικά θα προκύψουν οι παγκρ. καταβολές Αρχικά εκφράζεται σε ολόκληρη την καταβολή ***(έκτοπη έκφρασή του σε άλλη περιοχή αναπτυσσόμενου ΓΣ δεν επάγει σχηματισμό παγκρέατος) Hb9 (Hlxb9): εκφράζεται σε ελαφρά πρωιμότερο στάδιο και σε ευρύτερη περιοχή Hlxb9 -/-: απουσία ραχιαίας καταβολής Pdx1 Insulin gene*

77 Πάγκρεας Εξωκρινή και ενδοκρινή κύτταρα: έχουν τον ίδιο κυτταρικό πρόγονο. Τα επίπεδα του παράγοντα Ptf1a ρυθμίζουν την αναλογία των κυττάρων σε κάθε σειρά. Εξωκρινή κύτταρα (παράγουν πεπτικά ένζυμα): έχουν υψηλότερα επίπεδα Ptf1a (* γονιδίων που ενέχονται σε εξωκρινή δράση- 3υπομονάδες). Εκφράζεται σε παγκρεατικές καταβολές PTF p48(-): απουσία κοιλιακής καταβολής

78 Πάγκρεας Νeurogenin 3: ο κύριος παράγοντας που προάγει διαφοροποίηση ενδοκρινούς σειράς Εκφράζεται σε μερικά διάσπαρτα κύτταρα των παγκρεατικών καταβολών Οι πρόδρομοι των ενδοκρινών κυττάρων που εκφράζουν ngn3 καταστέλλουν την ανάπτυξη των παρακείμενων κυττάρων μέσω πλευρικής αναστολής που βασίζεται στο σύστημα Delta-Notch Pax4, Pax6: απαραίτητοι για σχηματισμό ενδοκρινών κυττάρων Στοχευμένη αδρανοποίηση Pax4: έλλειψη κυττάρων β και δ Στοχευμένη αδρανοποίηση Pax6: έλλειψη κυττάρων α Nkx6.1, Nkx2.2: απαραίτητοι για ανάπτυξη κυττάρων β σε πιο όψιμα στάδια ανάπτυξης Ενδοκρινή κύτταρα νησίδων: εκκρίνουν VEGF για να προσελκύσουν αιμοφόρα αγγεία τα οποία στη συνέχεια περιβάλουν τη νησίδα.

79 Σύνοψη 1. Το ενδόδερμα συνιστά την εσώτερη από τις 3 βλαστικές στοιβάδες που σχηματίζονται κατά τη γαστριδίωση 2. Από το ενδόδερμα προκύπτει το επιθήλιο του γαστρεντερικού σωλήνα (ΓΣ) και οι αποφύσεις από τις οποίες σχηματίζονται το ήπαρ, το πάγκρεας και το αναπνευστικό σύστημα 3. Η οργάνωση του ΓΣ είναι ίδια σε όλα τα σπονδυλωτά (φάρυγγας, οισοφάγος, στόμαχος, ήπαρ, πάγκρεας, λεπτό και παχύ έντερο) 4. Το ενδόδερμα και το μεσέγχυμα των επιμέρους τμημάτων του ΓΣ αναπτύσσονται από διαφορετικά τμήματα του εμβρύου 5. Στα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης του ΓΣ απαιτείται σηματοδότηση nodal για την έκφραση γονιδίων όπως τα Sox17 και mixer στο ενδόδερμα 6. Η τοπική εξειδδίκευση στο ΓΣ βασίζεται σε επαγωγικά σήματα που παράγονται στο μεσέγχυμα. 7. Ο σχηματισμός ήπατος προϋποθέτει σηματοδότηση FGF από το καρδιακό μεσέγχυμα 8. Η καταστολή της έκφρασης του shh στο ενδόδερμα είναι απαραίτητη για το σχηματισμό των παγκρεατικών καταβολών ενώ το μονοπάτι FGF απαιτείται για την αύξησή τους 9. Ο παράγοντας Pdx1 απαιτείται για την ανάπτυξη όλων των τύπων παγκρεατικών κυττάρων. Τα εξωκρινή κύτταρα έχουν ύψηλότερα επίπεδα PTF1. O παράγοντας neurogenin 3 είναι απαραίτητος για την ανάπτυξη των ενδοκρινών κυττάρων.