Arak Medical University Journal (AMUJ) 2014; 17(86): 31-40

Transcript

1 Arak Medical University Journal (AMUJ) 2014; 17(86): Original Article Relation of β-defensin 126 gene () alteration and protein expression with unexplained male infertility in Iranian population Rostami Chayjan M 1, Sabbaghian M 2, Alikhani M 3, Sahraneshin Samani F 4, Salman Yazdi R 2, Almadani N 5, Mohseni Meybodi A 5* 1- Department of Biology, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran. 2- Department of Andrology at Reproductive Biomedicine Research Center, Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran. 3- Department of Molecular Systems Biology at Cell Science Research Center, Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran. 4- Department of Stem Cells and Developmental Biology at Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran. 5- Department of Genetic at Reproductive Biomedicine Research Center, Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran. Received: 21 May 2014, Accepted: 11 Jun 2014 Abstract Background: Human β-defensin 126 (12kDa) is a small cationic glycoprotein that is highly rich of cysteine. gene is located on the subtelomeric end of 20p1.3 in human. High expression of this protein is reported in epididymis. This polypeptide coats the plasma membrane of sperm during epididymal transit. It is likely that β -defensin 126 might have role in unexplained male infertility since it involves in sperm maturation and capacitation. The current research designed to investigate if there is relation between β-defensin 126 gene mutation and unexplained male infertility. Materials and Methods: In this case- control study we followed a two cytosine nucleotides deletion of β-defensin 126 gene in 35 Iranian men with unexplained infertility and 40 fertile men with normal spermogeram as control group. Standard PCR, SSCP(Single strand conformational polymorphism), and sequencing were used to detect genetic alteration of β-defensin 126. ELISA was performed for the assessment of the protein expression on sperm cells. Results: Analysis of genetic data revealed 28.6% homozygote deletion in unexplained infertile men while this deletion was detected in 7.5% of controls. The deletion frequency was statistically higher in infertile patients than normal control group (p<0.05). The protein expression was less in men with del/del genotype compare to the other genotypes (p<0.005). Conclusion: Our study shows that this common sequence variation of β-defensin 126 takes part in impairment of male reproductive function. Consequently, men with the del/del genotype are significantly less fertile than men who carry the wild type allele. Keywords: β-defensin 126, unexplained male infertility, glycocalyx, Spermatogenesis, Mutation. *Corresponding Author: Address: Department of Genetic at Reproductive Biomedicine Research Center, Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran. anahitamohseni@gmail.com 31 31

2 مقاله پژهشی مجله علمی پژهشی دانشگاه علم پزشکی اراك سال 17 شماره 5 (شماره پیاپی 86 ) مرداد ارتباط بین جهش ژن بیان پرتي ین بتادفنسین- 126 با نابارري ناشناخته مردان ایرانی مارال رستمی چایجان مرجان صباغیان مهدي علیخانی فاضل صحرانشین سامانی رضا سلمان یزدي سید نید المدنی 1- دانشگاه آزاد اسلامی احد دامغان گره زیست شناسی دامغان ایران ایران *5 آناهیتا محسنی میبدي 2- پژهشگاه ریان پژهشکده زیست شناسی علم پزشکی تلید مثل جهاد دانشگاهی مرکز تحقیقات پزشکی تلید مثل گره آنلژي تهران 3- پژهشگاه ریان پژهشکده زیست شناسی فناري سللهاي بنیادي جهاد دانشگاهی مرکز تحقیقات علم سللی گره زیست شناسی سامانه هاي ملکلی تهران ایران 4- پژهشگاه ریان پژهشکده زیست شناسی فناري سللهاي بنیادي جهاد دانشگاهی مرکز تحقیقات علم سللی گره سللهاي بنیادي زیست شناسی تکینی تهران ایران 5- پژهشگاه ریان پژهشکده زیست شناسی علم پزشکی تلید مثل جهاد دانشگاهی مرکز تحقیقات پزشکی تلید مثل مرکز تحقیقات پزشکی تلید مثل گره ژنتیک تهران ایران چکیده ماد تاریخ یافت: 93/2/31 تاریخ پذیرش: 93/3/21 زمینه هدف: بتا دفنسین 126 انسانی یک گلیکپرتي ین کچک کاتینی ( 12 کیل دالتن) بسیار غنی از سیستي ین است. ژن این پرتي ین انسان بر ري انتهاي تلمري بازي کتاه کرمزم 20 قرار دارد. بیان بالایی از این پرتي ین اپیدیدیم گزارش شده است. این پلیپپتید سطح سللهاي اسپرم را حین عبر از اپیدیدیم پشش میدهد. از آنجا که بتا دفنسین 126 بلغ ظرفیتپذیري اسپرم مثر است میتاند نقش مهمی نابارري ناشناخته مردان ایفا نماید. پژهش حاضر براي بررسی رابطه بین جهش ژن بتا دفنسین 126 نابارري ناشناخته مردان طراحی شده است. نکلي تیدي د جهش شاهد مرد- مطالعه این رشها: سیتزین ژن 2 اگزن 35 مرد ایرانی با نابارري ناشناخته 40 مرد بارر با اسپرمگرام طبیعی به عنان گره کنترل مراجعه کننده به پژهشگاه ریان بررسی شد. این مطالعه رشهاي SSCP تعیین تالی براي یافتن تغییر ژن مرد استفاده قرار گرفت. رش الایزا براي ارزیابی بیان این پرتي ین سطح سللهاي اسپرم انجام شد. یافتهها: بررسی دادهه يا ژنتیکی نشان داد که 28/6 صد از مردان با نابارري ناشناخته 7/5 صد از گره کنترل ژنتیپ همزیگت جهش دارdel/del میباشند. فراانی جهش به طر معنیداري گره بیمار بیشتر از گره کنترل بد (p0/05 >). بیان این پرتي ین مردان با ژنتیپ همزیگت del/del نسبت به سایر ژنتیپها کمتر است( p0/005 >). نتیجه گیري: مطالعه حاضر نشان میدهد که این تغییر رایج تالی ژن عامل مثري بر عملکرد سیستم تلید مثلی میباشد. نتیجه مردان با ژنتیپ همزیگت جهش دار نسبت به مردانی که آلل همزیگت طبیعی را دارا میباشند قت بارري کمتري دارند. اژگان کلیدي: بتا دفنسین 126 نابارري ناشناخته مردان گلیککالیکس اسپرماتژنز جهش 32 نیسنده مسي ل: تهران پژهشگاه ریان پژهشکده زیست شناسی علم پزشکی تلید مثل جهاد دانشگاهی مرکز تحقیقات پزشکی تلید مثل گره ژنتیک anahitamohseni@gmail.com

3 ارتباط بین جهش ژن بیان پردنین بتادفنسین -126 با... مارال رستمی ایجان همکاران مقدمه بر اساس جدیدترین تعریف سازمان جهانی بهداشت نابارري به صرت عدم مفقیت حاملگی زجهایی که رش هیچ بدن پیشگیري مقاربت سال یک مدت به داشتهاند تعریف میشد( 1 ). حدد 15 صد زجها نابارري از دنیا سرتاسر رنج میبرند( 2 ). تعداد این از اختلال شاخصهاي بارري مردان زنان هرکدام 30 صد مارد اختلالات هر د طرف 10 صد مارد نهایتا عامل ناشناخته 30 صد مارد نابارري را شامل میشد( 3 ). مردان علل با نابارر فاقد ناشناخته اختلالات غدد ن ریز گرچه اسپرم فاکترهاي اسپرمگرام (تحرك مرفلژي غلظت) طبیعی میباشد لی به دلایلی قا به رسیدن به تخمک بارري آن نیست( 4 ). میباشد( 5 ). این نع نابارري عمما به دلایل ایمنی ژنتیکی اسپرم بلغ طی پرتي ینهاي اپیدیدیمی متعددي مانند دفنسین که تحت کنترل آنژنها تلید میگردند به سطح سللهاي اسپرم اضافه میشند (6 7). دفنسینها ایمنی حاي ز ذاتی بدن پریماتها بسیاري از گنههاي دیگر بسیار اهمیت میباشند( 8 ). دفنسینهاي انسانی پپتیدهاي کاتینی کچکی هستند که تسط نترفیلها سللهاي اپیتلیالی تلید میشند به د زیر خاناده ژنتیکی مشخص بتادفنسین آلفا تقسیمبندي میشند. دفنسین بتا الین انسانی ) 1 (hbd سال 1995 شناسایی شد( 9 ). بین بتا دفنسینها بتادفنسین یک گلیکپرتي ین ترشحی سرشار از سیستي ین بنام مجله علمی پژهشی دانشگاه علم پزشکی اراك سال هفدهم شماره 5 مرداد تسط که دارد جد 126 سللهاي اصلی اپیتلیم اپیدیدم ترشح شده کل سطح اسپرم را پشش میدهد( 10 11). این پرتي ین یکی از مهمترین اجزاي تشکیل دهنده پشش گلیککالیکس اسپرم پریماتها انسان میباشد از اسپرم برابر میکربهاي عفنتزا سیستم ایمنی زنان محافظت میکند همچنین به نفذ اسپرم به سریکس گلیکزیله رحم بدن کمک میکند. منفی بار بتادفنسین میباشد 126 با به بار دلیل منفی سریکس دافعه ایجاد کرده حرکت اسپرمها را این مجرا تسهیل میکند( 12 ). ژن این پرتي ین بر ري بخش انتهایی تلمري بازي کتاه کرمزم (20p1.3) 20 قرار دارد( 13 ). اینترن یک اگزن د ژن این میباشد( 11 ). حذف د نکلي تید سیتزین از اگزن 2 ژن mrna سبب تغییر قالب خانش شده یک غیر طبیعی فاقد کدن پایان تلید میگردد. بررسی ري 638 زج به صرت تصادفی بدن نظر گرفتن هر گنه سابقه بارري یا نابارري کشر چین مفقیت ژنتیپ کمتري همزیگت لقاح این بارري نشان داد که مردان جهش هستند( 14 ). شانس پژهش حاضر راستاي یافتن هرگنه ارتباط بین جهش ژن نابارري ناشناخته جمعیت مردان ایرانی پژهشگاه ریان طراحی گردید. بر همین اساس با تجه به نقش پرتي ین دفنسین عملکرد اسپرم همچنین نتایج تحقیق فق این تحقیق این پرتي ین مردان نابارر با علت گرفت. ناشناخته ماد رشها که اسپرمگرام مرد طبیعی قرار بررسی مطالعه حاضر به صرت مرد شاهد طراحی شد. این مطالعه پس از اخذ رضایت آگاهانه از شرکت کنندگان طرح نمنه خن منی گرفته شد. 35 مرد با نابارري ناشناخته به عنان گره مرد 40 مرد بارر که گذشته هیچ گنه سابقه نابارري سقط جنین استفاده از رشهاي کمک بارري نداشتهاند به عنان گره شاهد هر د گره نتیجه اسپرمگرام بر سازمان جهانی بهداشت طبیعی نظر گرفته شد. که اساس استانداردهاي براي بررسی تغییرات ژنتیکی ژن افراد مرد مطالعه استخراج DNA به رش نمکی صرت گرفت. گام ال جهت تعیین ژنتیپ انجام رش PCR بد تکثیر یک قطعه 258bp از نمنه DNA تمام افراد تحت مطالعه صرت گرفت. جهت انجام این رش از پرایمر رفت 5 -AAGAATGGTTGGGCAATGTGC-3 پرایمر برگشت 5 -

4 ارتباط بین جهش ژن بیان پردنین بتادفنسین -126 با... مارال رستمی ایجان همکاران مجله علمی پژهشی دانشگاه علم پزشکی اراك سال هفدهم شماره 5 مرداد CCACAATGCTTTAATGAGTCGGG-3 استفاده گردید که پیشتر تسط تلنر سال 2011 طراحی شده بد. براي انجام PCR 2 میکرلیتر از نمنه DNA به 48 میکرلیتر ازMaster PCR افزده شد. شرایط PCR شامل مرحله سرشتا الیه 94 جه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه سپس انجام 30 چرخه به صرت مراحل اسرشت 94 جه سانتیگراد براي 45 ثانیه اتصال 59 جه سانتیگراد براي 45 ثانیه بازآرایی 72 جه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه بد. (SSCP) Single-Strand Conformation Polymorphism این رش با استفاده از شرایط استاندارد به شرح زیر انجام شد: ابتدا ژل پلی آکریل آمید 10 صد تهیه شد (ماد محلل آکریل آمید: بیس آکریل آمید (29:1) 5 ddh 2 O TBE Buffer گلیسرل 50 صد آمنیم پرسلفات 10 صد (TEMED محصلهاي PCR تسط بافر فرمامید دماي 95 جه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه دناتره شد سپس ژل پلی آکریل آمید به دستگاه ساعت 18 مدت الکترفرز عمدي (پایا پژهش پارس) با شدت جریان 20 میلی آمپر بارگذاري گردید. رنگ آمیزي ژل پلی آکریل آمید تسط نیترات نقره سه مرحله صرت گرفت: ابتدا ژل به مدت سه دقیقه سینی متحرك حاي 50 میلیلیتر محلل اتانل 96 صد 2 میلیلیتر اسید استیک 99 صد که نهایت به حجم 250 میلیلیتر رسیده بد قرار گرفت. سپس 25 میلیلیتر از محلل نیترات نقره 1 صد با آب د بار تقطیر به حجم 250 میلیلیتر رسانده شد ژل به مدت 15 دقیقه ن محلل قرار گرفت. سرانجام 10 میلیلیتر از محلل سد 37/5 صد با آب د بار تقطیر به حجم 250 میلیلیتر رسانده شد سپس 1 میلیلیتر فرمالدهید 36/5 صد به آن اضافه شد ژل به مدت 10 دقیقه تا ظهر باندها ن آن قرار داده شد. شایان ذکر است که پس از مرحله ال دم ژل تسط آب د بار تقطیر شستش داده شد مرحله دم تاریکی صرت گرفت. تعیین تالی (Sequencing) باندهاي محصل PCRهایی SSCP انجام طی که مشابهی را بر ري ژل پلی آکریل آمید نشان دادند گرههاي مجزا دستهبندي شدند از هر گره چند نمنه جهت تعیین تالی (شرکت - FAZA Biotec آمریکا) فرستاده شد. تعیین تالی قطعات مرد نظر با استفاده از رش تعیین تالی سنگر سیستم 3730 ABI XLcapillary sequencer صرت پذیرفت. سپس تالیها تسط نرم افزارهايBLAST Align SequencesNucleotide Finch TV آنالیز شدند. استخراج پرتي ین تسط استن -Acetone) (TCA تريکلر ابتدا نمنه منی با استفاده از استیک اسید- بافر فسفات شستش شد. براي این منظر 2 میلیلیتر از مایع منی به همراه 2 میلی لیتر PBS مخلط شده با سرعت 643g به مدت 5 دقیقه سانتریفیژ گرفت. گردید. محلل فرایند سطحی شستش شده خارج براي به بار د پلیت صرت 2 زیري میلیلیتر از محلل TCA Acetone اضافه پیپتاژ شد یک ساعت فریزر 20- جه سانتیگراد قرار داده شد. پس از یک ساعت محلل 19000g به مدت 30 دقیقه دماي 4 جه سانتریفژ شد. به رسب حاصل 2 میلیلیتر استن اضافه پس از رتکس به مدت یک ساعت فریزر 20- جه سانتیگراد قرار داده شد. پس از یک ساعت محلل 6000g به مدت 5 دقیقه دماي 4 جه سانتیگراد سانتریفژ شد. محلل ریی زیر هد شیمیایی ریخته به پلت 2 میلیلیتر استن اضافه شد کاملا رتکس به مدت 30 دقیقه فریزر 20- جه سانتیگراد قرار داده شد. پس از 1 ساعت 2 مرحله آخر تکرار شده محلل ریی خارج گردید یالها زیر هد قرار داده شد تا قبل از افزدن بافر لیزکننده رسب کف آن به خبی خشک شد. به رسب کف یال بافر لیز کننده همراه با مهار کننده پرتي یناز اضافه شد رسب کاملا ن بافر حل گردید. فرد جهت تعیین غلظت نمنه پرتي ین از آزمن براد حضر پرتي ین استاندارد گاماگلبلین با

5 ارتباط بین جهش ژن بیان پردنین بتادفنسین -126 با... مارال رستمی ایجان همکاران غلظتهاي 3 پرتي ین 6 طل 9 میلیگرم بر میلیلیتر استفاده شد. غلظت نانمتر 595 مج ری( Scientific (Termo خانده شد. رش الایزا 25 تسط دستگاه الایزا میکرلیتر از نمنه پرتي ین( 50ng/ml )همراه با 75 میکرلیتر از بافر کربنات بیکربنات ن هر چاهک از پلیت 96 خانه مخصص الایزا ریخته شد یالها یخچال دماي 4 جه سانتیگراد براي یک شبانه رز قرار داده شد تا به کف پلیت کت شد. پس از این مرحله محلل ن هر چاهک خارج شد چاهکها به مدت 10 دقیقه با + PBST با د بار تکرار شستش داده شد. 100 ماکرلیتر به از محلل 5 صد BSA ن هر چاهک ریخته ب پلیت بسته شد به مدت 1 ساعت دماي اتاق باقی ماند. محلل ن هر چاهک خارج چاهکها به مدت 10 دقیقه با PBST با د بار تکرار شستش داده شد. آنتیبادي الیه Goat Anti rabbit به نسبت 1 به 20 رقیق شد ن هر چاهک 100 میکر لیتر از آنتی بادي رقیق شده اضافه گردید دماي اتاق ري شیکر به مدت یک ساعت نیم قرار گرفت. سپس مایع ن هر چاهک خارج گردیده 200 میکر لیتر از PBST ري هر چاهک ریخته تکرار بار د با دقیقه 10 مدت شد. داده شستش آنتیبادي ثانیه (HRP) Horseradish Peroxidase به نسبت 1 به 1000 ن PBST رقیق شد 100 میکرلیتر از آن به هر چاهک اضافه شد به مدت یک ساعت دماي اتاق قرار گرفت. محلل ن هر چاهک خارج شد چاهکها به مدت 10 دقیقه با PBST با د بار تکرار شستش داده شد. اتاق تاریک 100 میکرلیتر سبستراي تترامتیل ن به بنزیدین (Tetranethyl benzidine-tmb) به هر چاهک اضافه شد به مدت 10 دقیقه صبر کرده مکان تاریک قرار داده شد زمانی که رنگ آبی مشاهده گردید 100 میکرلیتر اسید سلفریک 0/5 ملار عنان متقف کننده اکنش چاهک هر ري اضافه گردید پایان تسط دستگاه الایزا ری غلظت پرتي ین هر کدام از چاهکها طل مج 450 نانمتر خانده شد. جهت تجزیه تحلیل دادهها از نرم افزار SPSS نسخه 16 تستهاي آماري کاي اسکي ر براي مقایسه تغییرات ژنتیکی مشاهده استفاده شده سطح گردید معنیداري نیز کمتر از 0/05 نظر گرفته شد. د گره آزمن از مطالعه مرد بررسی براي آنا آماري آنالیز دادههاي حاصل از اندازهگیري پرتي ینی استفاده شد. سطح معنیداري نیز کمتر از 0/005 آنالیز link)plink هاپلتایپینگ نظر گرفته شد. جهت انجام از سایت (x.shtml استفاده شد. یافته ها به دنبال بررسی کیفیت DNA مرد استفاده به لحاظ خلص غلظت با استفاده از دستگاه ناناپ مشخص شد که کیفیت نمنه DNA تمام مردان مرد مطالعه حد مطلبی است به نحي که نسبت 280 OD به 260 نانمتر بین 1/8 تا 1/92 بد که نشان دهنده عدم RNA میباشد. غلظت آنها نیز میکرلیتر بد. بررسی حذف با هترزیگت از استفاده DNA بر ري نمنه آلدگی با پرتي ین بین نانگرم عملکرد همزیگت جفت ژن پرایمر جمعیت مرد مطالعه (نمنه DNAهاي 35 فرد بیمار 40 فرد کنترل) PCR بر ري کلیه نمنهها انجام گردید. این پرایمرها بیماران افراد کنترل قا به تکثیر قطعه 258 جفت بازي گردید که نشان دهنده حضر قطعه مرد نظر ژنم افراد مرد مطالعه میباشد(شکل 1 ). 35 مجله علمی پژهشی دانشگاه علم پزشکی اراك سال هفدهم شماره 5 مرداد 1393

6 ارتباط بین جهش ژن بیان پردنین بتادفنسین -126 با... مارال رستمی ایجان همکاران شکل 1. عملکرد جفت پرایمر بر ري نمنه DNA افراد مرد مطالعه بررسی تغییرات ژنتیکی ناحیه ژنمی اگزن 2 از ژن DEFB-126 استفاده از تکنیکSSCP با مطالعه مرد گره د رش SSCP براي مشاهده تغییرات ژنتیکی قطعه DNA مرد نظر با استفاده از محصلات اکنش SSCP صرت میگیرد. مطالعه حاضر بررسی PCR براي محصلات ژنمی ناحیه PCR اگزن 2 بارر شاهد 40 بیمار 35 ژن از باندهاي متفاتی را نشان داد. پس از رنگ آمیزي با نیترات نقره بر اساس الگهاي بانددهی 3 گره مختلف تقسیمبندي شدند که از هر د گره بیمار کنترل تعدادي از نمنهها هر الگ جاي گرفتند(شکل 2 ) (جدل 1). شکل 2. تصیر ژل پلی آکریل آمید دناتره پس از رنگ آمیزي با نیترات نقره جدل 1. دسته بندي نتایج رش SSCP مقایسه تالی خانش شده اگزن 2 با تالی مرجع بیماران تالیهاي خانش شده مربط به اگزن 2 ژن تمامی تالی با بیماران مرجع ( NC_ ) سایت NCBI-Gene مرد مقایسه قرار گرفت. نتایج خانش تالی 258 جفت بازي حاي اگزن 2 ژن نشان داد که افرادي که الگي باند شماره 1 ژل پلی آکریل آمید بدند ست ناحیه مرد مطالعه 5 سیتزین بده ژنتیپ آنها به صرت همزیگت سالم wt/wt نظر گرفته شد. افرادي که الگي باند شماره 2 بدند ناحیه مرد نظر یک پیک اضافه بدند به طري که یک سیتزین آلل دیگر 3 سیتزین بد آلل 5 ژنتیپ آنها به صرت هترزیگت wt/del نظر گرفته شد خانش تالی از د س نتایج را تاي ید کرد. جمعیت مرد مطالعه از 40 فرد گره کنترل 21 نفر از 35 فرد گره بیمار 19 نفر این ژنتیپ بدند. افرادي که نمنه آنها ژل پلی آکریل آمید الگي 3 بدند ناحیه مرد نظر یک جهش د نکلي تیدي سیتزین بده تنها 3 سیتزین را دارا بدند ژنتیپ آنها به صرت همزیگت جهش دار del/del نظر گرفته شد(شکل 3 ) جمعیت مرد مطالعه از 40 فرد گره کنترل 3 فرد از 35 فرد گره بیمار 10 نفر این ژنتیپ بدند. نتایج حاصل از تعیین تالی افراد با ژنتیپ همزیگت سالم نشان داد که این افراد ژن منطقه نکلي تیدي همزیگت سالم بده این ناحیه ژنی 5 سیتزین هستند هر د آلل این ژن این افراد wt میباشد ژنتیپ آنها به صرت همزیگت جمعیت مرد مطالعه از 40 wt/wt است فرد گره کنترل 16 نفر از 35 فرد گره بیمار 6 نفر ژنتیپ همزیگت سالم بدند. 36 مجله علمی پژهشی دانشگاه علم پزشکی اراك سال هفدهم شماره 5 مرداد 1393

7 ارتباط بین جهش ژن بیان پردنین بتادفنسین -126 با... مارال رستمی ایجان همکاران شکل. 3 تالی خانش شده از اگزن 2 ژن افراد مرد مطالعه مجله علمی پژهشی دانشگاه علم پزشکی اراك سال هفدهم شماره 5 مرداد A ژنتیپ همزیگت سالم B) ژنتیپ هترزیگت C) همزیگت جهش دار انجام از پس رشهاي Standard PCR SSCP تعیین تالی جهت بررسی جهش د نکلي تیدي سیتزین اگزن 2 ژن 35 فرد با نابارري ناشناخته با بارر فرد 40 بیمار گره تحت اسپرمگرام طبیعی به عنان گره کنترل مراجعه کننده به پژهشگاه ریان نشان داده شد که گره بیمار از 35 نفر 6 فرد ژنتیپ همزیگت (17/1 wt/wt صد) 19 فرد ژنتیپ هترزیگت (54/3 wt/del صد) فرد 10 ژنتیپ همزیگت 28/6) del/del صد) بدند. گره کنترل از 40 فرد مرد مطالعه 16 فرد ژنتیپ همزیگت (40 wt/wt صد) 21 فرد ژنتیپ هترزیگت (52/5 wt/del صد) 3 فرد ژنتیپ همزیگت ) del/del 7/5 صد) بدند. بر اساس آنالیز آماري انجام شده به رش کاي اسکي ر با نظر گرفتن > p0/05 فراانی جهش به طر معنیداري گره بیمار بیشتر از گره کنترل بد(شکل 4 ). شکل 4. مقایسه صد فراانی ژنتیپهاي مختلف ژن ( *p 0.05) نتایج بیان بررسی 126 دفنسین بتا پرتي ین سطح سللهاي اسپرم با استفاده از رش الایزا براي سطح اسپرم بررسی مقایسه میزان آن پرتي ین ژنتیپهاي بتادفنسین 126 مختلف ژن از رش الایزا استفاده گردید. همانطر که بخش رش کار اشاره شد پس از انجام مراحل مختلف مقدار جذب هر یک از نمنهها طل مج 450 نانمتر تسط دستگاه الایزا ری خانده شد که میانگین نتایج حاصل از خانش طل مج 450 نانمتر تسط دستگاه جدل 2 آرده شده است. جدل 2. میانگین نتایج حاصل از خانش جذب پرتي ین نمنههاي بیماران ژنتیپهاي مختلف wt/wt wt/del del/del 0/7069±0/08211(SE) 0/3966±0/01944(SE) 0/2697±0/01562(SE) نتایج به دست آمده از رش الایزا نشان داد که تفات معنیداري میزان پرتي ین بتادفنسین 126 سطح اسپرم بین گرههاي مرد مطالعه جد دارد میزان این پرتي ین افراد ژنتیپ همزیگت سالم افراد هترزیگت افراد از بیشتر همزیگت بد دار جهش میزان پرتي ین افراد ژنتیپ همزیگت سالم با ژنتیپ هترزیگت اختلاف معنیداري نشان داد (0/003 < p) همچنین افراد ژنتیپ همزیگت سالم هترزیگت به نسبت ژنتیپ همزیگت جهشدار تفات معنیداري مشاهده شد( 0/0001 > Anova p< 0/005).( p (between group (جدل 3 )(شکل 5 ).

8 ارتباط بین جهش ژن بیان پردنین بتادفنسین -126 با... مارال رستمی ایجان همکاران 95%Confidence Interval Upper Bound Lower Bound Sig *The mean difference is significant at the level. جدل 3. نتایج بررسی آماري رش الایزا با استفاده از آزمنANOVA Std.Error Mean Difference(I-J) (I)group2 (J)group2 wt/del wt/wt del/del wt/wtwt/del del/del del/del wt/del wt/wt شکل 5. مقایسه بیان پرتي ین سه ژنتیپ حرف A,B,C ج شده بالاي ستنها نشان دهنده تفات معنیدار سطح بیان پرتي ین ژنتیپهاي سالم هترزیگت جهشدار است. (0.005 p* ( بحث براساس تسط یافته انتشار آمار سازمان جهانی بهداشت شیع نابارري دنیا بیش از 15 صد برآرد میشد نابارري مردان به صرت سنمی چند عاملی تعریف میشد که سبب برز ناتانیهایی مانند عدم تلید اسپرم تعداد کم اسپرم یا کیفیت بد اسپرمهاي تلید شده میگردد. احتمال میرد دلایل ناشناخته بیش از 30 صد عامل نابارري مردان باشد( 15 ). با تجه به نقش مهم پرتي ین بتا دفنسین 126 تسهیل حرکت اسپرم مجراي تناسلی ماده حفاظت اسپرم مقابل آنتی باديهاي ضد اسپرم افزایش پتانسیل لقاح اسپرم با تخمک میتان انتظار داشت که قع جهش ژن این پرتي ین میتاند یکی از عامل کاهش شانس دست یابی به بارري مردان باشد. مطالعه حاضر گام ال بررسی جهت تکثیر قطعه مرد مطالعه از ژن پرایمر با استفاده از مطالعه تلنر همکاران سال 2011 بررسی پس از تایید مرد استفاده قرار گرفت( 13 ). نتایج بررسی حاضر بررسی انجام شده تسط تلنر حضر قطعه مرد ژن از نظر DNA را افراد نمنه جمعیتهاي مرد مطالعه تایید کرد. ادامه براي الین بار از رش SSCP براي بررسی الگي تغییرات ژنتیپ ژن به مربط بیانگر ما نتایج شد. استفاده الگهاي متفات ژنتیپ همزیگت هترزیگت نمنههاي مرد بررسی بد. به علاه این الگها هر د گره بیمار کنترل مشاهده شد. ادامه براي تایید نتایج حاصل از رش SSCP نمنههاي DNA براي تعیین تالی فرستاده شد. نتایج به دست آمده این بخش به طر کامل نتایج حاصل از سایر مطالعات تایید قرار داد. این مطالعه براي الین بار حذف همزیگت ژنتیکی صرت گرفته را مرد هترزیگت ژن ایران بررسی مردان نابارري ناشناخته مردان بارر انجام شد. نتایج نشان داد که حذف این ژن به طر معنیداري نابارري با مردان گره ناشناخته کنترل گره از بیشتر میباشد. به طري که صد شیع حذف همزیگت گره بیمار 28/6 صد گره کنترل 7/5 صد محاسبه گردید (p0/05 >). پیش مطالعه تنها صرت گرفته از این نیز تلنر همکاران زمینه این حذف د 38 مجله علمی پژهشی دانشگاه علم پزشکی اراك سال هفدهم شماره 5 مرداد 1393

9 ارتباط بین جهش ژن بیان پردنین بتادفنسین -126 با... مارال رستمی جایجان همکاران نکلي تیدي ژنتیپ 638 مرد چینی را مرد بررسی قرار داده صد افراد بدند. ژنتیپ ژنتیپ هترزیگت همزیگت سالم مجله علمی پژهشی دانشگاه علم پزشکی اراك سال هفدهم شماره 5 مرداد ژنتیپ صد 52 همزیگت جهش دار 19 صد از افراد مرد مطالعه را تشکیل دادند( 13 ). مطالعه حاضر نیز افراد با نابارري ناشناخته شیع ژنتیپ همزیگت جهش دار بیش از گره کنترل محاسبه گردید. 75 فرد مرد مطالعه شامل گره بیمار کنترل 29/3 صد افراد ژنتیپ همزیگت سالم صد صد 53/3 ژنتیپ ژنتیپ هترزیگت همزیگت 17/3 میباشند( p0/05 >) نسبت به که مطالعه گذشته جهشدار صد مشابهی را به خد اختصاص داد ژنتیپ همزیگت سالم هترزیگت با مطالعه گذشته همخانی داشت. بررسی این مطالعه براي الین بار از رش الایزا براي میزان اسپرم استفاده شد. ژن بررسیهاي پرتي ین قبلی بتادفنسین داده نشان 126 بر سطح سللهاي د حذف که است نکلي تید سیتزین از نکلي تیدهاي اگزن 2 سبب تلید یک mrna فاقد کدن پایان میگردد. همچنین ایمنفلي رسنت ثابت استفاده با که گردید از رنگ که افرادي آمیزي این ژنتیپ را به صرت همزیگت del/del دارا بدند پشش o- الیگساکاریدي سطح اسپرم دچار نقص بده جالب صرت میزان کمتري از پشش پرتي ین بتادفنسین 126 بدند. اینجاست گرفته که کیفیت این مایع مطالعه منی (دانسیته مطالعهاي اسپرم قبلا که صد اسپرمهاي متحرك تحرك پیشرنده اسپرم مرفلژي اسپرم) این افراد با نظر گرفتن استانداردهاي سازمان جهانی بهداشت همانند ژن سالم آلل افراد طبیعی به نظر میرسید( 14 ). از آنجا که افراد ژنتیپ ژنتیپهاي همزیگت هترزیگت del/del wt/del از تجهی قابل میزان به wt/wt به قت نسبت همزیگت بارري با افراد سالم کمتري برخردارند بنابراین ژنتیپ میتاند پارامتر مفیدي ارزیابی نابارري مردان محسب گردد. با تجه به اهمیت یافتن رشهایی جهت تشخیص دلایل نابارري ناشناخته مردان همچنین اهمیت پشش گلیککالیکس قابلیت اسپرم جهت انجام لقاح حضر بالقه پرتي ین بتادفنسین 126 این پشش مطالعه حاضر راستاي یافتن هرگنه بین ارتباط ژنتیپ ژن نابارري ناشناخته مردان طراحی شد. نتیجه گیري این مطالعه نرخ بالایی از جهش ژن بین جمعیت مردان نابارر با دلایل نامعلم را تایید کرد احتمال آن را این افراد بیمار به صرت معنیداري بالاتر از افراد طبیعی نشان داد. این جهش سبب تغییر سطح بیان همچنین عملکرد پرتیین بتا دفنسین سطح اسپرم شده که بر عملکرد اسپرم نتیجه شانس بارري تاثیر میگذرد. صرت انجام مطالعات بیشتر این زمینه میتان این ژنتیپ را به عنان معیاري جهت تعیین پیش بینی نتایج مان نابارري مرد استفاده قرار داد. تشکر قدانی مقاله حاضر مستخرج از پایانامه کارشناسی ارشد خانم مارال رستمی چایجان تحت عنان " بررسی ارتباط جهش ژن بیان پرتي ین بتادفنسین- 126 با نابارري ناشناخته مردان" میباشد که پژهشگاه ریان جهاد دانشگاهی از سیله بدین شد. انجام پژهشگاه ریان تقدیر تشکر منابع معانت میشد. پرسنل پژهشی 1. Hamada AJ, Montgomery B, Agarwal A. Male infertility: a critical review of pharmacologic management. Expert opinion on pharmacotherapy. 2012;13(17): Hamada A, Esteves SC, Agarwal A. The role of contemporary andrology in unraveling the

10 ارتباط بین جهش ژن بیان پردنین بتادفنسین -126 با... مارال رستمی جایجان همکاران mystery of unexplained male infertility. Open Reprod Sci J. 2011;3: Cooper TG, Noonan E, Von Eckardstein S, Auger J, Baker HG, Behre HM, et al. World Health Organization reference values for human semen characteristics. Human reproduction update. 2010: 16(3): Hamada A, Esteves SC, Nizza M, Agarwal A. Unexplained male infertility: diagnosis and management. International braz j urol. 2012;38(5): Kamath MS, Bhattacharya S. Demographics of infertility and management of unexplained infertility. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 2012;26(6): Dunkel-Schetter C, Stanton AL. Psychological adjustment to infertility. Infertility: Springer; p Heininger U, Kleemann WJ, Cherry JD. A controlled study of the relationship between Bordetella pertussis infections and sudden unexpected deaths among German infants. Pediatrics. 2004;114(1):e9-e Palladino M, Mallonga T, Mishra M. Messenger RNA (mrna) expression for the antimicrobial peptides β-defensin-1 and β- defensin-2 in the male rat reproductive tract: β- defensin-1 mrna in initial segment and caput epididymidis is regulated by androgens and not bacterial lipopolysaccharides. Biology of reproduction. 2003;68(2): Droin N, Hendra J-B, Ducoroy P, Solary E. Human defensins as cancer biomarkers and antitumour molecules. Journal of proteomics. 2009;72(6): Tollner TL, Bevins CL, Cherr GN. Multifunctional glycoprotein A curious story of defensin-clad spermatozoa. Nature Reviews Urology. 2012;9(7): Yamaguchi Y, Nagase T, Makita R, Fukuhara S, Tomita T, Tominaga T, et al. Identification of multiple novel epididymisspecific β-defensin isoforms in humans and mice. The Journal of Immunology. 2002;169(5): Yudin A, Treece C, Tollner T, Overstreet J, Cherr G. The carbohydrate structure of, the major component of the cynomolgus Macaque sperm plasma membrane glycocalyx. The Journal of membrane biology. 2005;207(3): Tollner TL, Venners SA, Hollox EJ, Yudin AI, Liu X, Tang G, et al. A common mutation in the defensin causes impaired sperm function and subfertility. Science translational medicine. 2011;3(92):92ra65-92ra Rozen S. Defending male fertility. Science translational medicine. 2011;3(92):92ps31-92ps Matzuk MM, Lamb DJ. The biology of infertility: research advances and clinical challenges. Nature medicine. 2008; 14(11): مجله علمی پژهشی دانشگاه علم پزشکی اراك سال هفدهم شماره 5 مرداد 1393