Iranian Journal of Medical Microbiology

Transcript

1 Original Article Iranian Journal of Medical Microbiology Iran J Med Microbiol: Volume 9, Number 3 ( ) Journal homepage: The Antimicrobial and Co-aggregation effects of probiotic lactobacilli against some pathogenic bacteria Maliheh Ershadian 1, Nazila Arbab Soleimani 1, Hatef Ajoudanifar 1, Mohammad Reza Vaezi Khakhki 2 1. Department of Micribiology, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran. 2. Department of Biology, Hakim Sabzevari University, Sabzevar, Iran Article Information Article history: Received: 2014/07/07 Accepted: 2015/02/04 Available online:2015/06/10 Article Subject: Medical Bacteriolgy IJMM 1394; 9(3): Corresponding author at: Maliheh Ershadian Department of Micribiology, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran. ershadianmaliheh@yahoo.com Abstract Background and Aim: Nowadays, probiotic Lactobacilli are as suitable candidate to control and treat diseases, due to their microbial characteristics and especially coaggregation which prevent attachment and colonization of pathogenic bacteria. The aim of this study is investigation of antimicrobial and co-aggregation of probiotic bacteria, Lactobacillus.plantarum PTCC 1601, Lactobacillus casei PTCC 1801, and isolated Lactobacilli from dairy products of Sabzevar city against some pathogenic bacteria. Materials and Methods: Isolation and purification of probiotic lactobacilli from Sabsevar traditional dairy products was done by common methods. Among 10 isolated probiotic lactobacilli,two of them which had more probiotic potentail were selected and their phylogenetic and molecular characteristics was investigated by 16s rdna sequencing technique. Antimicrobial and anti-adhesive effect of probiotic bacteria was examined by Modified Double Layer, co-culture and co-aggregation methods. Co-aggregation of probotic bacteria with pathogens was seen by ATM microscope. Results: In this study, isolated probotic lactobacilli from Sabsevar traditional dairy products and standard bacteria, L.plantarum and L.casei shown the most antimicrobial effect and co-aggregation with pathogenic bacteria, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Staphylococcus aureus, respectively. Inhibition of pathogenic bacteria in the presence of probotic bacteria was seen by co-culture method. Conclusions: According to this study, all used probiotic bacteria in this research inhibited the growth of pathogenic bacteria, among them L.casei had spectacular antimicrobial effect and co-aggregation with pathogenic bacteria and it may be used as a suitable candidate to control diseases. Key Words: lactobacillus, Co-culture, Co-Aggregation, AFM microscopy, Probiotic Copyright 2015 Iranian Journal of Medical Microbiology. All rights reserved. How to cite this article: Ershadian M, Arbab Soleimani N, Ajodani Far H, Vaezi Khakhki M. The Co-aggregation effects of probiotic lactobacillus against some pathogenic bacteria. Iran J Med Microbiol. 2015; 9 (3) :14-22 Īrān. Majallah-i mīkrub/shināsī-i pizishkī-i مجله میکرب شناسی پزشکی ایران

2 مجله میکربشناسی پزشکی ایران سال 1 شماره 3 پاییز 6314 مقاله پژهشی Journal homepage: اثر ضدمیکربی تجمع سللی الکتباسیلس ه یا پربیتیکی با برخی از باکتری ه یا بیماری زا 3 2 ملیحه ارشادیان 4 نازیال ارباب سلیمانی هاتف آجدانی فر 2 محمد رضا اعظی کاخکی.4.2 گره میکربیلژی دانشگاه آزاد اسالمی احد دامغان دامغان ایران گره زیست شناسی دانشگاه حکیم سبزاری سبزار ایران. اطالعات مقاله تاریخچه مقاله دریافت: 6313/04/61 پذیرش: 6313/66/61 انتشار مضع: آنالین: 6314/01/01 باکتری شناسی پزشکی IJMM 1394; 9(3): نیسنده مسئل: ملیحه ارشادیان گره میکربیلژی دانشگاه آزاد اسالمی ایران احد دامغان دامغان چکیده زمینه اهداف: امرزه الکتباسیلس های پربیتیکی به علت داشتن خصصیات ضد میکربی به یژه تجمع پذیری که از اتصال الیه استقرار باکتری های بیماری زا در بدن میزبان جلگیری می کنند. هدف از این مطالعه بررسی اثر ضدمیکربی تجمع پذیری باکتری های پربیتیکی الکتباسیلس پالنتارم PTCC 1058 الکتباسیلس کازه ای PTCC 1608 نیز جدایه های الکتباسیلسی محصالت لبنی شهرستان سبزار بر ری برخی از باکتری های بیماری زا است. ماد رش کار: الکتباسیلسهای پربیتیکی با رشهای استاندارد از نمنههای لبنی سنتی جداسازی خالص سازی شدند. از ده جدایه الکتباسیلس های پربیتیکی د جدایه که بیشترین تان پربیتیکی را داشتند انتخاب شدند یژگی های فیلژنی ملکلی آن هابه کمک تکنیک 16s rrna sequencing بررسی شد. اثر ضد میکربی ضد اتصالی باکتری های پربیتیک با استفاده از رش های تلفن: پست الکترنیک: ershadianmaliheh@yahoo.com Co-Culture Modified Double Layer Co-aggregation مرد بررسی قرار گرفت سپس با استفاده از میکرسکپ نیری اتمی AFM تجمع پذیری باکتری های پربیتیک با باکتری بیماری زا مشاهده شد. یافتهها: در این تحقیق الکتباسیلسهای پربیتیکی جدا شده از ماست سنتی شهرستان سبزار نیز باکتریهای استاندارد الکتباسیلس پالنتارم الکتباسیلی کازه ئی بیشترین اثر ضد میکربی در کشت دالیه تجمع سللی با باکتری های بیماریزای سدمناس آئرژینزا اشریشیاکلی استافیلککس ارئس را به ترتیب نشان دادند اثر مهار رشد باکتری های بیماریزا در حضر باکتریهای پربیتیک با استفاده از رش کشت همزمان مشاهده شد. نتیجهگیری: آزمایش های انجام شده نشان داد که باکتری های پربیتیکی در این تحقیق تانایی جلگیری از رشد باکتری های بیماریزا را داشتند دراین میان الکتباسیلس کازهئی اثر ضد میکربی نیز تجمع پذیری قابل مالحظه ای با باکتری های بیماریزا داشت شاید بتان از آن بعنان کاندیدای مناسب جهت کنترل بیماری استفاده کرد. کلمات کلیدی الکتباسیلس Co-Aggregation Co-Culture میکرسکپ نیری اتمی AFM پربیتیک ک یپ رایت : حق چاپ نشر استفاده علمی از این مقاله برای مجله میکربشناسی پزشکی ایران محفظ است. مقدمه 41 افزایش بیماریهای میکربی پیدایش سیهه یا مقام به آنتی رشه یا کنترل بیماری بیتیکها امرزه محققین را بر آن داشته جدید بکارگیری ها را میسر سازند. میکرارگانیسمه یا سال ها از باکتری تا با مفید درمان مصرف پیش میکرارگانیسم های زنده )پربیتیک ها( در ماد غذایی به منظر داشتن اثر سالمت بخشی در انسان در کشرهای مختلف جهان ریجا بده است )2 6(. باکتری های پربیتیک میکرارگانیسمهای زنده ای هستند که قتی در مقادیر متعادل مرد استفاده قرار گیرند در سالمتی میزبان مفید خاهند بد. این باکتری ها با استقرار در بخش های مختلف بدن سبب ایجاد خاص سالمت بخشی برای میزبان می شند باید بر حسب کاربردشان به میزان کافی بکار رند )3(. خصصیات یژه ای در پربیتیکها سبب شده که قابل اهمیت

3 مجله میکرب شناسی پزشکی ایران سال 2 شماره 3 پاییز باشند از جمله اینکه این میکرارگانیسم ها غیر بیماریزا هستند عارضی مشابه عارض ناشی از مصرف آنتی بیتیکهارا ندارند به آنزیمه یا هضم کننده مقام میباشند دارای خاصیت ضد سرطانی ضد تمری هستند قدرت کاهش کلسترل چربی ه یا را دارند پربیتیکها عمدتا )4-1(. خن از جنس الکتباسیلس بیفیدیباکتریمها میباشند شبیه به میکرارگانیسمهای دستگاه گارش انسان هستند از این ر دارای خصصیاتی چن تحمل اسید امالح صفرای ضد میکربی ترکیبات تلید اسیدهای ارگانیک پراکسیدهیدرژن با باکتری های سللی پذیری تجمع بیماریزا ممانعت از اتصال باکتری های بیماری زا به سطح دستگاه گارشی... می باشند )7-60(. باکتریهای پربیتیک با تانایی تجمع سللی با میکرب های بیماری زا اثرات ضد اتصالی خد مانع از رسیدن اتصال باکتریهای بیماری زا به سلل هدف در میزبان شان شده آن ها را با تلید ترکیبات ضد میکربی از بین می برند از شرع رند بیماری جلگیری می کنند )66(. مطالعات کمی درارتباط با تجمع سللی میان باکتری های پربیتیک باکتری های بیماریزا انجام شده است که نشان می دهد پرتئین های مجد در مایع ریی باکتریهای پربیتیکی در تجمع سللی نقش دارند اغلب پرتئینهای سطحی میباشند )7(. یکی از این پرتئینها پرتئین APF است که اخیرا به عنان پرتئین سطحی مثر در تجمع سللی الکتباسیلسها شناسایی شده است )62(. پربیتیکهای مرد مطالعه در این تحقیق از جنس الکتباسیلس میباشند که باکتریهای گرم مثبت کاتاالز منفی غیر متحرک فاقد اسپر هستند.)63( هدف از این تحقیق بررسی اثر ضدمیکربی اثر تجمع سللی الکتباسیلس های پربیتیکی جدا شده از محصالت لبنی الکتباسیلسهای خریداری الکتباسیلس پالنتارم PTCC 1058 PTCC 1608 بر علیه شده الکتباسیلس کازهئی باکتری های بیماریزا شایع نظیر اشربشیا کلی PTCC 1396 سدمناس آئرژینزا PTCC 1310 استافیلککس ارئس کلبسیال پنمنیه انترککس فیکالیس بد. ماد رشها جداسازی خالص سازی پربیتیکی از ماست سنتی شهرستان سبزار الکتباسیلس های ابتدا نمنه هایی از ماست های محلی شهرستان سبزار با شرایط استریل جمع آری شد 4 گرم از هر نمنه با مقطر رقیق از آن 53ml محیط کشت 53ml به 4ml MRS آب براث Germany( )Merck, انتقال داده شد به مدت 10 ساعت در 35 ϲ در جار بی هازی گرماگذاری شدند. سپس خالص سازی نمنه ها با رش کشت خطی برری محیط کشت آگار MRS Merck, ( )Germany انجام با استفاده از رنگ آمیزی گرم باسیل های گرم مثبت نازک زنجیره ای برای تایید الکتباسیلس از سایرین جدا شدند. انجام گردید آزمایش های استاندارد بیشیمیایی برای شناسایی بیشتر )64(. ده جدایه الکتباسیلس از نظر میزان پتانسیل پربیتیکی با آزمایشاتی نظیرتحمل شرایط محیط با ph اسیدی 0-2 تحمل نمک صفرای )Merck, Germany(XGAL بررسی شدند د جدایه که نتایج بهتری نسبت به سایرین داشتند انتخاب از آنها برای انجام آزمایشات بعدی ذخیره گلیسرل تهیه در ϲ 23- نگهداری شدند )61(. شناسایی ملکلی الکتباسیلس پربیتیکی بر اساس تعیین ترادف ژن 16SrRNA مراحل استخراج DNA های با خاصیت با استفاده از کیت استخراج DNP TM )High yield DNA purification( در شرایط استریل انجام شد برای بررسی کیفیت DNA استخراج شده از ژل آگارز یک درصد الکترفرز استفاده شد. غلظت DNA با دستگاه نان اسپکترفتمتری Conc از رابطه DNA(μg/ml)=50.d.A260 )Termo nonodrap 1000( اندازه گیری شد DNAهای ژنمی با استفاده از PCR از نظر تکثیر 16SrRNA DNA مرد بررسی قرار گرفتند. اکنش PCR به منظر تکثیر استخراج شده در حجم نهایی 53 میکرلیتر )بافر PCR 10x 4/5 از هر µl )2/5mM ( dntps 5µl 4 آنزیم )2mM(Mgcl 2 5µl پرایمر )43pMol( µl DNA Taqپلیمراز )5u( 3 میکرلیتر الگ تا حجم نهایی )53 میکرلیتر آب مقطر( در 35 سیکل تکثیر مرحله الیه جداسازی درشته در 25 ⁰ C به مدت 2 دقیقه مرحله اسرشت شدن در 25 ⁰ C به مدت 33 ثانیه مرحله اتصال پرایمرها 52 ⁰ C به مدت 15 ثانیه مرحله طیل شدن رشته هدف درC 52 ⁰ به مدت 4 دقیقه مرحله طیل شدن نهایی در 52 ⁰ C به مدت 5 دقیقه انجام شد. از مخلط اکنشگر PCR فاقد DNA الگ به عنان شاهد منفی الکتباسیلسس پالنتارم استاندارد PTCC 1058) تهیه شده از بانک میکربی سازمان پژهش های علمی صنعتی ایران) به عنان سیه کنترل مثبت استفاده گردید. برای اکنش از PCR یک جفت پرایمر جهانی fd1 )5 CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ( rd1 )5 -CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3 ( )سیناژن-ایران( استفاده شد. محصالت پس از الکترفرز PCR

4 ارشادیان همکاران اثر ضدمیکربی تجمع سللی الکتباسیلس ه یا پربیتیکی تسط دستگاه Gel documentation (Cambridge U.K) شد نمنه ها برای تعیین تالی به شرکت فرستاده شدند )61(. BioNeer آماده سازی باکتری ها شرایط کشت آن ها مشاهده کره جنبی باکتری های پربیتیکی الکتباسیلس پالنتارم PTCC 1058 الکتباسیلس کازهئی PTCC 1608 سدمناس آئرژینزا PTCC 1310 باکتری های بیماریزا اشریشیا کلی PTCC 1396 از سازمان پژهش های علمی صنعتی ایران به صرت لیفیلیزه تهیه شدند. باکتری های پربیتیکی خریداری شده در 53ml محیط MRS براث تلقیح به مدت 10 ساعت در 35 درجه سلسیس در جار بی هازی گرماگذاری شدند سپس از آن ها کشت جامد تهیه شد. باکتری های بیماریزای سدمناس آئرژینزا اشریشیا کلی خریداری شده هر کدام محیط 53ml در Merck, BHI براث ( )Germany گرماگذاری شدند. پنمنیه تلقیح به مدت 21 ساعت در 35 درجه سلسیس سیه های استافیلککس ارئس باکتری های بیماریزای کلبسیال انترککس فکالیس از بیمارستان تهران تهیه شدند از صحت باکتری بیماری زا با استفاده از رش تست حساسیت به آنتیبیتیک ها آزمنهای بیشیمیایی متدال استاندارد اطمینان حاصل گردید. از نمنه های باکتریهای بیماریزا باکتری های پربیتیک ذخیره گلیسرل 33 درصد تهیه در 23- درجه نگهداری شدند )8(. رش کشت د الیه ای اصالح شده ابتدا باکتری های پربیتیک در محیط کشت MRS مایع براث Germany( ph=1/5 (Merck, تحت شرایط استریل کشت داده شدند پس از گرماگذاری سلسیس در جار بی هازی حای محیط 35 ساعت در 21 به مدت 53 μl آگار MRS درجه از هر پربیتیک در سط پلیت Germany( )Merck, ریخته اجازه داده شد تا رطبت حاصل از مایع میکربی کامال جذب محیط شد پلیت های مجددا آگار MRS )Merck, Germany( 21 به مدت ساعت در 35 درجه در جار بی هازی گرما گذاری گذاری شدند. محیط سپس )Merck, Germany( MHA آگار MRS )Merck, Germany( مذاب برری محیط حای پربیتیک ریخته اجازه داده شد تا کامال محیط ببندد. سسپانسین معادل نیم مک فارلند از کشت شبانه باکتری های بیماریزا تهیه بصرت متراکم بر ری محیط )Merck, Germany( MHA کشت داده شدند. پلیت ها به مدت 21 ساعت در 35 درجه گرماگذاری سپس از نظر قطر هاله عدم رشد بررسی شدند. آزمایش برای هر باکتری سه بار تکرار شد میانگین قطر هاله عدم رشد باکتری های بیماریزا درحضرباکتری های پربیتیک گزارش گردید )61 8(. تأثیر کشت همزمان بر مهار رشد باکتریهای بیماریزا ابتدا کشت شبانه باکتری های پربیتیک در محیط MRS براث Germany( )Merck, در جار بی هازی دمای 35 درجه سلسیس تهیه شد. باکتری های بیماری زا به مدت 21 ساعت در 35 درجه سلسیس در محیط کشت )Merck, Germany( BHI 43 گرماگذاری شدند. سپس باکتریهای پربیتیک بیماریزا به مدت دقیقه با در rpm )ph=5/2( شستش داده شدند. با بافرفسفات سانتریفیژ PBS 433 میکرلیتر از باکتری های پربیتیک بیماریزا در بافر فسفات حل بطر همزمان (cfu /ml( از از باکتری های پربیتیک /ml( )cfu باکتری های بیماریزا به محیط کشت )Merck, Germany( BHI تلقیح شدند )6(. در ساعت ال همچنین پس از 41 ساعت 4 میلی لیتر از کشت تأم را خارج از آن سری رقت در محیط کشت اختصاصی هر باکتری با استفاده ازرش pour plate تهیه شد. پلیت ها به مدت 21 ساعت در 35 درجه گرماگذاری شده تعداد cfu بررسی شد. جهت کنترل مقایسه از هر باکتری بیماریزا به تنهایی در محیط کشت )Merck, Germany( BHI کشت داده شد مطابق رش باال آزمایش بر ری آن ها انجام شد. درصد مهار رشد باکتری های بیماریزا در حضرباکتری های پربیتیک از طریق فرمل زیر محاسبه گردید )67 8(. بررسی تجمع یافتن باکتری های پربیتیک با باکتری های بیماریزا دراین آزمن میزان درصد اتصال باکتری های پربیتیک به باکتری های بیماری زا بر اساس رش باکتری های ابتدا پربیتیک در محیط Collado MRS بررسی شد )68(. براث Merck, ( )Germany کشت داده شدند به مدت 21 ساعت در دمای 35 درجه سلسیس در جار بی هازی گرماگذاری شدند. کشت شبانه از باکتریهای بیماریزا در محیط )Merck, Germany( BHI تحت شرایط 35 درجه سلسیس بدست آمد. باکتری های پربیتیک 41

5 مجله میکرب شناسی پزشکی ایران سال 2 شماره 3 پاییز 4321 باکتریهای مرد آزمایش در دمای 23 درجه سلسیس به مدت 5 دقیقه با در rpm سانتریفیژ تسط بافر فسفات شستش داده شدند. مایع ریی خارج شده از رسب باقی مانده در انتهای لله سسپانسین باکتریایی در درصد در طل مج میکرلیتر از نمنه PBS 113nm باکتری های با میزان جذب نری 1 برای هر نمنه تهیه شد. پربیتیک 533 میکرلیتر از 533 باکتریهای بیماریزا با یکدیگر مخلط شده به مدت 1 ساعت در 35 درجه سلسیس گرماگذاری شدند. پس از 1 ساعت هر لله اپندرف حای مخلط باکتری های پربیتیک بیماریزا سانتریفیژ شدند. مایع ریی از نظر میزان جذب نری در طل مج 133 nm بررسی شدند میزان تجمع یافتن براساس فرمل زیر محاسبه شد. A A-1 2 =درصد تجمع یافتن /A A 1 میزان جذب نری بالفاصله پس از مخلط کردن باکتری های پربیتیک باکتری های مرد نظر است Aمیزان 2 جذب نری مایع ریی پس از 1 ساعت است در این آزمایش به عنان کنترل هر باکتری به تنهایی بررسی شد )61 68(. بررسی تجمع یافتن باکتری های پربیتیک با باکتری های بیماریزا با استفاده از میکرسکپAFM نیری اتمی آئرژینزا طبق رش در این آزمایش برای الین بار با استفاده از میکرسکپ تجمع سللی الکتباسیلس کازه ئی با سدمناس مرد مطالعه قرار گرفت. ابتدا تجمع پذیری باکتری ها بر Collado انجام شد )68(. سپس از نمنه تسط سمپلر بر ری المل استریل به ابعاد 4 4 میلی متر یک قطره قرار داده شد پس از خشک شدن کامل در دمای اتاق تسط میکرسکپ نیری اتمی( AFM ) ازآن عکس برداری شد )20(. محاسبات آماری تجزیه تحلیل آماری نتایجبا آزمن تسط نرم افزارSPSS یافتهها نسخه 16 محاسبه گردید. T-test در این مطالعه پس از تعیین ترادف 16S rrna جدایه ها هم ترازی ترادف های به دست آمده با ترادف های معتبر تطابق )Blast( گردید به منظر رسم درخت فیلژنی سیه های ترادف یابی شده از نرم افزار )Phylodrow Version 0.80) نرم افزار (1.82 version) Clustal رش Neighbour joining تسط شرکت BioNeer استفاده شد. تحلیل داده تالی یابی شده کره جنبی نشان داد که د سیه K1 Y11 جدا شده از ماست سنتی الکتباسیلس رامنسس است )تصیر رامنسس سبزار دارای %22 Y11 با شماره اختصاصی مرکز ملی داده های بیلژیکی شباهت با 2(. سیه الکتباسیلس GenBank: JX )NCBI( به ثبت رسید )تصیر 4(. در نتایج ارزیابی کشت دالیه اصالح شده نشان داد که از میان چهار باکتری پربیتیک الکتباسیلس کازهئی دارای بیشترین میانگین اثرمهار رشد میکربی بر ری باکتری های بیماری زا بیژه برری سدمناس آئرژینزا با قطر هاله عدم رشد 35/4 میلی متر بد. میانگین قطر هاله عدم رشد کلبسیال پنمنیه استافیلککس ارئس انترککس فکالیس در حضر این باکتری پربیتیک 33 میلی متر بدست آمد الکتباسیلس پالنتارم بیشترین اثر ضدمیکربی را بر ری استافیلککس ارئس با میانگین قطر هاله عدم رشد 35/33 میلی متر داشت از بین سیه های جداشده الکتباسیلس رامنسس Y11 دارای بیشترین اثر مهاری رشد بر ری کلبسیال پنمنیه با میانگین قطر هاله عدم رشد 31/33 میلی متر بد )نمدار 4(. در کشت همزمان الکتباسیلس کازه ای به ترتیب بیشترین اثر مهاری رشد را بر باکتری های بیماری زای سدمناس آئرژینزا اشریشیاکلی به ترتیب با میانگین 03/33 54/35 در صد مهار رشد نشان داد. همچنین الکتباسیلس پالنتارم بیشترین اثر مهاری رشد را برری باکتری های استافیلککس ارئس انترککس فکالیس به ترتیب با میانگین 55/34 53/31 درصد مهار رشد نشان داد کلبسیال پنمنیه کمترین میانگین درصدهای مهار رشد در حضر باکتری های پربیتیک ها را داشت. در میان جدایهها با رش کشت مشابه بیشترین میانگین درصد مهار رشد باکتری های بیماریزا در حضر الکتباسیلس رامنسس K1 مربط به سیه سدمناس آئرژینزا کمترین میانگین درصد مهار رشد مربط به سیه استافیلککس ارئس با %15/15 بد. میانگین درصد مهار رشد انترککس فکالیس %12/55 بد. در حضر چهار باکتری پربیتیک 45

6 ارشادیان همکاران اثر ضدمیکربی تجمع سللی الکتباسیلس ه یا پربیتیکی از بین جدایه ها الکتباسیلس رامنسس بر ری K1 استافیلککس ارئس با میانگین مهار رشد %55/41 بیشترین اثر برری کلبسیال پنمنه کمترین اثر را نشان داد )نمدار 2(. بررسی اثر تجمع پذیری الکتباسیلس های پربیتیک با باکتری های بیماریزا از این جهت که از اثر ضد اتصالی بر ری آن ها داشته از شرع بیماری جلگیری می کند اهمیت دارد نتایج نشان داد که میزان تجمع پذیری الکتباسیلس کازه ای با سدمناس آئرژنرا اشیرشیا کلی بیش از سایر باکتری ها است به ترتیب با میانگین تجمع یافتن 55/33 10/45 درصد بدست آمد همچنین میانگین تجمع یافتن الکتباسیلس پالنتارم با استافیلککس ارئس بیش از سایرباکتری های پربیتیک 15/43.)3 درصد بد. تجمع سللی الکتباسیلس کازهئی الکتباسیلس پالنتارم به طر مجزا با استافیلککس ارئس با میکرسکپ نری نیز بررسی شد )تصیر شکل 4: محصل PCR باند bp4533 مربط به ژن 16s rrna باکتری جداسازی شده الکتباسیلس رامنسس Y11 از ماست سنتی سبزار. شکل 2: رسم درخت فیلژنی سیه های الکتیاسیل جدا سازی شده الکتباسیلس رامنسس K11 Y11 از ماست سنتی سبزار با استفاده از نرم افزار )Phylodrow Version 0.80) در بین جدایه ها نیز الکتباسیلس رامنسس K1 بیشترین میانگین تجمع پذیری را با سدمناس آئرژینزا 53 درصد کمترین میانگین تجمع پذیری آن با کلبسیال پنمنیه 12/11 درصد بد. همچنین بررسی نتایج آزمن تی مستقل نشان داد در سطح خطای 4 درصد تفات معنیداری )نمدار 3(. مشاهده الکتباسیلسس کازهئی بین الکتباسیلس ها جد دارد. تجمع سللی باکتری پربیتیکی با باکتری بیماری زای استافیلککس ائرس در حد میکرمتر با استفاده از میکرسکپ نیری اتمی )AFM( صرت گرفت پس از عکس برداری افزارهای این میکرسکپ نیری اتمی )AFM( باکتری با استفاده از نرم های کری شکل استافیلککس ارئس با اندازه حدد 3/5 میکرمتری که تسط باکتری های میله ای شکل الکتباسیلس کازه ئی با اندازه حدد 4 میکرمتری احاطه شده بد مشاهده شد )تصیر 1(. 40

7 مجله میکرب شناسی پزشکی ایران سال 2 شماره 3 پاییز P.aeroginosa E.coli E.feacalis K.penomonia S.aureus L.casei L.plantarum L.rhamnososK1 L.rhamnososY11 نمدار 4: میانگین قطر هاله عدم رشد در کشت کامل باکتری های پربیتیک بر علیه باکتری های بیماریزا بر حسب میلی متر نمدار 2: میانگین درصد مهار رشد تأثیر کشت همزمان باکتری های پربیتیک بر ری باکتری های بیماری زا شکل 3: تصیر تجمع سللی باکتری های پربیتیکی الکتباسیلس کازه ئی الکتباسیلس پالنتارم با باکتری بیماری زای استافیلککس ارئس با استفاده از میکرسکپ نری. 42

8 ارشادیان همکاران اثر ضدمیکربی تجمع سللی الکتباسیلس ه یا پربیتیکی نمدار 3: میانگین درصد تجمع یافتن باکتری های پربیتیک باکتری های بیماری زا شکل 1: تصیر میکرسکپی از تجمع سللی الکتباسیلس کازهئی استافیلککس ارئس در حد میکرمتر که درابتدا تجمع پذیری باکتری ها بر طبق رش Collado انجام شد )68(. سپس از نمنه تسط سمپلر بر ری المل استریل به ابعاد 4 4 میلی متر یک قطره قرار داده شد پس از خشک شدن کامل در دمای اتاق تسط میکرسکپ نیری اتمی AFM) ) ازآن عکس برداری شد. بحث امرزه با افزایش بیماری ها پیدایش سیهه یا باکتریه یا مقام به آنتی بیتیکها محققین را بر آن داشته تا با رشه یا جدید بکارگیری میکرارگانیسمه یا مفید درمان کنترل بیماریها را میسر سازند. این مطالعه به منظر بررسی خاص ضد میکربی باکتری های پربیتیک بر ری برخی از باکتری های بیماریزا مهار آن ها بر اساس مکانیسم ضد اتصالی تجمع پذیری باکتری های پربیتیک باکتری های بیماریزا انجام شد. در این تحقیق برای بررسی اثر کشت کامل باکتری های پربیتیک از رشی که در سال 2334 دانشمندی به نام Maia آن را Double layer method نامید در سال 2343 تسط Arbab Solemani همکاران کمی اصالح شد Modified Double Layer استفاده شد نام گرفت.)61 8( کشت کامل باکتری های پربیتیک در این آزمایش اثر مهاری بر رشد باکتری های بیماریزا داشتند. میانگین مجمع قطر هاله عدم رشد در رش کشت د الکتباسیلس کازهئی الیه بیشترین 31/5 اثر متر میلی مهارکنندگی بدست آمد را بر رشد سدمناس آئرژینزا با اندازه قطر هاله عدم رشد 35/55 میلی متر داشت که این نتایج مطابق با یافته های Christian Forestier همکارانش در سال 2330 بد که تانایی باکتری های پربیتیک در جلگیری از عفنت سدمناس آئرژینزا را در بین بیماران گزارش کردند Mami anas.)26( کشت کامل الکتباسیلس پالنتارم همکارانش در سال 2341 اعالم کردند اثرات ضد میکربی علیه استافیلککس ارئس اشریشیاکلی باسیلس سبتلیس دارد نشان دادند الکتباسیلس پالنتارم بر ری استافیلککس ارئس بیشترین اثر ضد میکربی را دارد الکتباسیلس پالنتارم که دراین تحقیق نیز بیشترین اثر ضد میکربی علیه 23

9 ( مجله میکرب شناسی پزشکی ایران سال 2 شماره 3 پاییز 4321 استافیلککس باکتریه یا ارئس نشان داد )22(. یکی پربیتیک آن است که قادرند باکتری ه یا ه یا از تانایی بیماریزا را به دام انداخته با آن ها تجمع یابند بدین ترتیب فعالیت باکتری ه یا بیماریزا متقف عملکردشان مهار می شد. گزارش هایی از در سال Reid Schachtsiek 4200 در سال 2331 Collado در سال 2335 جد دارد که بیان داشتند باکتری های پربیتیک عاله بر تلید عامل ممانعت کننده رشد باکتری های بیماریزا نظیر اسیدهای آلی پراکسید هیدرژن یا تلید باکتریسین با مکانیسم تجمع سللی با باکتری های بیماریزا مکانیسم دفاعی قابل اهمیتی را برای میزبان بر علیه اتصال استقرار عامل باکتریایی بیماری زا ایجاد می کنند ) اما هنز مطالعات در خصص مکانیسم های تجمع سللی باکتری های بیماریزا ها جد ندارد رش های کمی در حال حاضر برای اندازه گیری قابلیت تجمع سللی باکتری های پربیتیک جد دارد که تسط در سال است Cesena 2333 Jankovi 2334 در تحقیق حاضر الکتباسیلسس کازه ای سللی تجمع collado همکارانش 2330 آزمایش شده را )%55/33( برای الین بار نشان داده شد که با سدمناس آئرژنرا بیشترین درصد در میان دیگر باکتری های بیماریزا داشت ) (. نتایج حاصل از این آزمایش مؤید آن است که باکتری ه یا بیماری زای مهارباکتری های الکتباسیلس پربیتیک با درصدهای باالیی قادرند با باکتری ه یا مرد آزمایش تجمع بیماریزا شند با کازهئی نیز باکتری های یابند بدین ترتیب سبب میزان تجمع یافتن میان بیماریزا بیشتر از الکتباسیلس پالنتارم بد برای الین بار تسط میکرسکپ نیری اتمی تجمع سللی باکتری پربیتیکی با باکتری بیماری زا بررسی شد در سال اثر الکتباسیلس پالنتارم بر ری سدمناس آئرژینزا تسط Lim همکارانش گزارش شد )27(. در این تحقیق نیز اثر کشت همزمان الکتباسیلس های پربیتیکی باکتری های بیماریزا بررسی شد پالنتارم بر که در این میان الکتباسیلس ری استافیلککس ارئس بیشترین اثر مهار رشد را نشان داد مشابه نتایج بدست آمده تسط Lim 2332 سال بیشترین اثر بد )27(. در همکارانش در کشت همزمان الکتباسیلس کازهئی مهار کنندگی رشد را بر سدمناس آئرژینزا )%03/33( سپس اشریشیا کلی )%54/35( نشان داد که تقریبا با نتایج بدست آمده تسط.)28( تقدیر تشکر Khalfa Klale در سال 2330 یکسان بد بدین سیله از اساتید محترم دانشگاه حکیم سبزاری جهت به ثمر رسیدن این پژهش تشکر قدر دانی می گردد. تعارض منافع: بین نیسندگان مجله میکربشناسی پزشکی ایران هیچ گنه تعارض منافعی جد ندارد. References 1. Sanders ME. Considerations for use of probiotic bacteria to modulate human health. J Nutr. 2000;130(2S Suppl):384S-90S. 2. Reid G, Burton J. Use of Lactobacillus to prevent infection by pathogenic bacteria. Microbes Infect. 2002;4(3): FAO/WHO: Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria. Report of a joint FAO/WHO Expert Consultation. 2001; October 1-Cordoba, Argentina. nt/en/probiotics.pdf 4. Rafter J. Lactic acid bacteria and cancer: mechanistic perspective. Br J Nutr. 2002;88 Suppl 1:S Burns AJ, Rowland IR. Anti-carcinogenicity of probiotics and prebiotics. Curr Issues Intest Microbiol. 2000;1(1): Lye HS, Kuan CY, Ewe JA, Fung WY, Liong MT. The improvement of hypertension by probiotics: effects on cholesterol, diabetes, renin, and phytoestrogens. Int J Mol Sci. 2009;10(9): Collado MC, Surono I, Meriluoto J, Salminen S. Indigenous dadih lactic acid bacteria: cell-surface properties and interactions with pathogens. J Food Sci. 2007;72(3):M Soleimani NA, Kermanshahi RK, Yakhchali B, Sattari TN. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli against Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis. 24

10 ارشادیان همکاران اثر ضدمیکربی تجمع سللی الکتباسیلس ه یا پربیتیکی African Journal of Microbiology Research ;4(20): Chou LS, Weimer B. Isolation and characterization of acid-and bile-tolerant isolates from strains of Lactobacillus acidophilus. Journal of Dairy Science ;82(1): Servin AL. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens. FEMS microbiology reviews ;28(4): Chen H, Hoover DG. Bacteriocins and their food applications. Comprehensive reviews in food science and food safety Jul 1;2(3): Reniero R, Cocconcelli P, Bottazzi V, Morelli L. High frequency of conjugation in Lactobacillus mediated by an aggregation-promoting factor. Journal of General Microbiology Apr 1;138(4): Garrity GM, Bell JA, Lilburn TG. Taxonomic outline of the prokaryotes. Bergey's manual of systematic bacteriology. Springer, New York, Berlin, Heidelberg Bosch M, Nart J, Audivert S, Bonachera MA, Alemany AS, Fuentes MC, Cuné J. Isolation and characterization of probiotic strains for improving oral health. Archives of oral biology ;57(5): Collins JK, Thornton G, Sullivan GO. Selection of probiotic strains for human applications. Int dair j ;8(5): Maia OB, Duarte R, Silva AM, Cara DC, Nicoli JR. Evaluation of the components of a commercial probiotic in gnotobiotic mice experimentally challenged with Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium. Vet microb ;79(2): Lim S, Dong-Soon IM. Screening and Characterization of Probiotic Lactic Acid Bacteria Isolated from Korean fermented Foods. J. Microbiol. Biotechnol., (2): Collado, M. C., Meriluoto, J., and Salminen, S. Adhesion and aggregation properties of probiotic and pathogen strains. Eur. Food Res. Technol., (6): Collado, M.C., Meriluoto, J., Salminen, S. Interactions between pathogens and lactic acid bacteria: aggregation and coaggregation abilities.eur. J. Food Res. Technol (7): Dufrene YF. Atomic force microscopy, a powerful tool in microbiology. J Bacteriol. 2002;184(19): Forestier C, De Champs C, Vatoux C, Joly B. Probiotic activities of Lactobacillus caseirhamnosus: in vitro adherence to intestinal cells and antimicrobial properties. Res Microbiol ;152(2): Anas M, Eddine HJ, Mebrouk K. Antimicrobial activity of Lactobacillus species isolated from Algerian raw goat s milk against Staphylococcus aureus. World J Dairy Food Sci. 2008;3(2): Collado MC, Meriluoto J, Salminen S. Adhesion and aggregation properties of probiotic and pathogen strains. Eur food res technol ;226(5): Schachtsiek, M., Hammes, W.P., Hertel, C. Characterization of Lactobacillus coryniformis DSM 20001T surface protein Cpf mediating coaggregation with and aggregation among pathogens. Appl. Environ. Microbiol (12): Cesena C, Morelli L, Alander M, Siljander T, Tuomola E, Salminen S, Mattila-Sandholm T, Vilpponen-Salmela T, Von Wright A. Lactobacillus crispatus and its nonaggregating mutant in human colonization trials. J dairy sci ;84(5): Jankovic I, Ventura M, Meylan V, Rouvet, M., Elli, M., Zink, R..Contribution of aggregation-promoting factor to maintenance of cell shapein Lactobacillus gasseri 4B2. J Bacteriol (5): Lim IS, Lee HS, Kim WY. The effect of lactic acid bacteria isolates on the urinary tract pathogens to infants in vitro. J Kor med sci Jan 1;24(Suppl 1):S Al-Delaimy KS, Kanakri KA. Bacterial Antagonism between Lactobacillus casei and Staphylococcus aureus with other Bacteria on Refrigerated Broiler Carcasses.