Iranian Journal of Medical Microbiology

Transcript

1 Original Article Iranian Journal of Medical Microbiology Iran J Med Microbiol: Volume 10, Number 5 (November - December) Journal homepage: Detection of stx1 gene in Shigella dysenteriae from Mazandaran province clinical samples by -ELISA method Askary Ahmadpour 1, Esmail Fatahi 1, Jafar Amani 2, Abbas Ali Imani Fooladi 2, Aghil Tabar Molahassan 3 1. Department of Biology, Islamic Azad University Amol branch, Amol, Iran 2. Applied Microbiology Research Center, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran 3. Department of Immunology, Islamic Azad University Babol branch, Babol, Iran Article Information Article history: Received: 2015/09/02 Accepted: 2016/10/19 Available online: 2016/10/17 Article Subject: Medical Bacteriology IJMM 2016; 10(5): Corresponding author at: Dr. Jafar Amani Aplied Microbiology Research Center, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran Tel: Jafar.amani@gmail.com Abstract Background and Aim: Among Enterobacteriaceae, Shigella dysenteriae produce a shiga toxin, and have cytotoxicity, enterotoxin and neurotoxin activity. The toxin causes diseases such as diarrhea, gastroenteritis, intravascular coagulation disorder. Today diarrhea is the most important challenge for the human health. The classic and conventional microbiological detection methods are sensitive and specificity, but there are limitations. This study was designed between Bahman 93 and Farvardin 94 to identify S. dysenteriae in shortest time and the amount of toxin with high sensitivity and specificity using -ELISA method. Materials and Methods: The stx1 sequence (490bp) as a target gene was amplified by Dig-dUTP labeled, then product was coating on microplate and detection was done using an antibody against digoxigenin conjugated. Also the specificity and sensitivity of the method were examined by clinical specimens. Results: Sensitivity detection of bacteria in the samples was 1.56 pg using genomic for S. dysenteriae and specificity of technique didn t show acceptable OD in other species of Enterobacteriaceae family. ELISA had significant absorption for genomic Up to dilution pg. As well as among 70 clinical samples which were analyzed, 3 samples contained the stx1 gene. Conclusions: Efficiency -ELISA techniques showed that it was simple, faster, high specific and sensitive methods. This technique is more suitable than culture and method also it was easy can apply in each medical laboratory. KeyWords: Shigella dysenteriae, Shiga toxin, Digoxigenin, -ELISA Copyright 2016 Iranian Journal of Medical Microbiology. All rights reserved. How to cite this article: Ahmadpour A, Fatahi E, Amani J, Imani Fooladi AA, Tabar Molahassan A. Detection of stx1 gene in Shigella dysenteriae from Mazandaran province clinical samples by -ELISA method. Iran J Med Microbiol. 2016; 10 (5):11-19 Īrān. Majallah-i mīkrub/shināsī-i pizishkī-i مجله میکرب شناسی پزشکی ایران 11

2 مجله میکربشناسی پزشکی ایران سال 16 شماره 1 آذر دی 1311 مقاله پژهشی Journal homepage: تشخیص ژن stx1 ازشیگال دیسانتریه جدا شده از نمنهه یا بالینی استان مازنان با استفاده ازرش -ELISA مقدمه عسکری احمدپر 1 اسماعیل فتاحی 1 جعفر گره زیست شناسی دانشگاه آزاد اسالمی احد آیت ا... آملی آمل ایر نا مرکز تحقیقات میکربیلژی کاربردی دانشگاه علم پزشکی بقیه ا... )عج( تهران ایران گره ایمنلژی دانشکده پزشکی دانشگاه آزاد اسالمی احد بابل بابل ایران اطالعات مقاله تاریخچه مقاله یافت: 1314/60/11 پذیرش: 1311/60/22 انتشار مضع: باکتریشناسی پزشکی آنالین: 1311/60/20 IJMM 1395; 10(5): نیسنده مسئل: دکتر جعفر امانی مرکز تحقیقات میکربیلژی کاربردی دانشگاه علم پزشکی بقیه ا... )عج( تهران ایران تلفن: شد. چکیده زمینه اهداف: امانی 2 عباسعلی ایمانی فالدی 2 عقیل تبار مالحسن 3 میان باکتریهای خاناده انترباکتریاسه شیگال دیسانتریه به دلیل تلید تکسین پرتئینی تحت عنان شیگاتکسین با داشتن فعالیت سیتتکسینی نرتکسینی مجب بیماریهایی اسهال گاسترانتریت اختالل انعقاد داخل عرقی میشد که امرزه بهعنان مهمترین چالش برای سالمتی انسانها مطرح میباشند. هرچند رشهای کالسیک متدال میکربیلژی برای تشخیص حساس اختصاصی میباشند اما محددیتهای خاص خد رادارند لذا این مطالعه بهمنظر رفع محددیتها شناسایی تکسین کمترین زمان میزان شیگال دیسا نتریه با حساسیت اختصاصیت باال بهسیله تکنیک -ELISA بازه زمانی بهمن 39 تا فردین 39 انجام ماد رش کار: تالی )094bp( stx1 بهعنان ژن هدف با استفاده از DIG-dUTP نشاندار تکثیر سپس محصل نشاندار شده کف میکرپلیت الیزا کت شده نهایت با استفاده از آنتیبادی ضد دیگکسیژنین کانژگه شناسایی انجام شد. همچنین حساسیت اختصاصیت این تکنیک با نمنهه یا یافتهها: بالینی مردبررسی قرار گرفت. حساسیت تشخیص باکتری نمنه بررسیشده با استفاده از ژنمی 1/65 pg برای شیگال دیسانتریه تعیین بررسی اختصاصیت این تکنیک جذب قابل قبلی نداشتند. الیزا مربط به ژنمی تا ر تق بالینی مردبررسی 9 نمنه حای ژن stx1 با این تکنیک شناسایی شد. نتیجهگیری: کارایی بهغیراز شیگال دیسانتریه دیگرگنههای خاناده انترباکتریاسه 0/165 پیکگرم از جذب معنیداری داشت. از 00 نمنه تکنیک -ELISA نشان داد عاله بر سادگی سریع بدن برخرداری از حساسیت پست الکترنیک: Jafar.amani@gmail.com اختصاصیت باال جایگزینی مناسب برای رش کشت میباشد بهراحتی قابلیت کاربردی شدن هر آزمایشگاه طبی را دارد. کلمات از میان باکتریهای خاناده انترباکتریاسه شیگالدیسانتریه مهمترین باکتری است که تلید تکسین پرتئینی تحت عنان شیگاتکسین )Stx( تکسین این مینماید. کلیدی شیگال دیسانتریه شیگاتکسین دیگکسیژنین -ELISA کپیرایت : حق چاپ نشر استفاده علمی از این مقاله برای مجله میکربشناسی پزشکی ایران محفظ است. ژنهای تسط کرمزمی کد شده )1-1( با دارا بدن فعالیت سیتتکسینی انترتکسینی سالمتی برای نرتکسینی مطرح ها انسان بهعنان امرزه میباشد پرتئینی ازلحاظ ساختمانی متعلق به گره.)2( AB5 مهمترین این چالش تکسین تکسین بده قسمت B تکسین بهصرت پنتامریک غیر تکسیک میباشد که بهطر اختصاصی از طریق یک گیرنده گلیکلیپیدی به نام Gb3 به سطح سلل هدف متصل سپس از طریق فرایند اندسیتز بهصرت یک زیکل به داخل سلل منتقل میشد )3(. پس از برش پیند پپتیدی تسط آنزیم فرین بخش A قطعه A1 که بهعنان بخش کاتالتیک این تکسین محسب میشد آزاد فعالیت با شده سیتزل ارد شدن فعال از پس 11

3 مجله میکرب شناسی پزشکی ایران سال 11 شماره 5 آذر دی N گلیکزیدازی با حذف یک باز آدنین از 28SrRNA زیر احد 61s ریبزمی با جلگیری از طیل شدن زنجیره پپتیدی فرآیند پرتئینسازی را سلل مهار کرده بدینسیله مجب میشد میزبان سللی مرگ شدن فراهم این )4(. انتقال بیماری مرحله ال از طریق دستان آلده از طریق دهان مدفع میباشد. منابع آب ماد غذایی سبزیجات میه ها نقش مهمی تکسین حالتسعه انتقال بهصرت دارند آسیای جهانی )0(. عفنته یا مرکزی انتشار بنگالدش ایجادشده این تسط عمما کشرهای شیع آن از میزان باالیی برخردار می باشد ایران بهصرت اندمیک شیع دارد.)0( نهتنها شیگال دیسانتریه بلکه برخی انترباکتریاسه مانند E.coli O157:H7 از باکتریهای خاناده انترباکترکلآکه Citrobacter ( سیترباکتر فرندی )Enterobacter cloacae( )freundii آئرمناس آئرمناس کائی اشریشیاکلی هیفیال )Aeromonas hydrophila( )Aeromonas caviae( مانند O89:H19 دیگر استرینهای O146:H21 O128:H2 ONT:H19 O146:H21 O126:H8 شیگاتکسین آلدگی صد به کدکان حساسترین گرههای تمام )2(. میباشند تکسین شیگال دیسانتریه قرار گره زیر قا سنی داشته به عمما تلید معرض 55 5 سنی سال به معرض دلیل این ضعف تکیسن سیستم میباشند ایمنی.)1( دیسانتری اسهال گاسترانتریت تشنج انسفالپاتی فلج عصبی اختالل ایمنی سنم انعقاد داخل عرقی Hus Ekiri کمخنی سیستم تعدیل شدید از مهمترین بیماریهایی میباشند که تسط تکسین شیگال دیسانتریه ایجاد که مجب مرگمیر میشند این تشخیص برای )16(. رشهای کشت سرلژی ملکلی از مهمترین رشهای تشخیصی محسب میشند اما حساسیت رشهای باالیی کالسیک برخردارند ملکلی دلیل به هرچند از اختصاصیت محددیتهایی خاص ازجمله صرف زمان هزینه زیاد محددیت استفاده از تعداد زیاد نمنهها بهطر همزمان زمان اپیدمی بکارگیری ماد کمتر سرطانزا محددیتهای که طراحی محددیتهای پرایمر اختصاصی مردتجه تشخیصی عاله برداشتن اقعشدهاند تکنیکی مجد رفع میگردد. ژن.)11( بر اساس حساسیت این این رفع برای -ELISA تکثیر Stx محصل نشاندار شده کف پلیت ه یا شناسایی پرب از محصل اختصاصی محصل اختصاصیت تکنیک با باال با طراحی DIG-dUTP میکرتیتر کت جهت بابیتین که طراحیشده نشاندار بهطر اختصاصی با قطعه نشاندار شده هیبرید با DIG میشد استفاده که با اضافه نمدن آنتیبادی ضد دیگکسیژنین کانژکه با آنزیم پراکسیداز ژن Stx زمان ممکن با حساسیت باالرا دارد. ماد رشها سیههای باکتری سیههای RITCC1875 قابلیت شناسایی کمترین استاندارد شیگالدیسانتریه با شناسه از دانشگاه یبریکلرا سدمناس آئرژینزا بینالمللی شاهد شیگال فلکسنری شیگال سنئی E.coli O157:H7 از مرکز تحقیقات میکربیلژی دانشگاه علم پزشکی بقیه ا... )عج( تهیه با استفاده از رشهای کشت تسته یا ایمنلژیکی مرد تائید مجدد قرار گرفتند. آنزیم فرمنتاز ماد مرداستفاده DIG-DUTP کانژکه مرداستفاده بیشیمیایی از شرکت Roche Ladder 100bp Taq polymerase شرکت از Proteinase K RnaseA Lysozyme dntp MgCl2 آگارز از شرکت سینا کلن خریداری شد. همچنین پرایمرها پرب مرداستفاده تسط شرکت تکاپ زیست سنتز شدند. پس از تهیه ژنمی باکتری رش از ژنمی تهیه جهت Boiling شد. استفاده کشت شیگالدیسانتریه محیط XLD منطقه ال کشت با لب برداشته به محیط کشت LB مایع تلقیح شد پس از رسیدن باکتریها به فاز رشد لگاریتمی گرمادهی متقف 1/5 میلیلیتر از سسپانسین سللهای باکتریایی به مدت 5 دقیقه با 0111rpm سانتریفیژ شد. سپس محلل ریی خارج به رسب سللی حاصل مقدار 311 میکر لیتر از بافر اضافه TE با رتکس مخلط گردید ادامه به مدت 15 دقیقه حمام آب جش قرار داده شد. )Vortex) مایع رتکس از پس (Supernatant) شد. ریی برداشته بهعنان الگ برای استفاده انتخاب قطعة ژنی طراحی پرایمر پرب مناسب با تجه به اینکه عامل اصلی ایجاد بیماری تکسین شیگالدیسانتریه میباشد به همین جهت زیر احد بهعنان A بخش کاتالتیک سکانس آن از بانک ژنی استخراج از ری آن اقدام به طراحی یک جفت پرایمر جهت تکثیر قطعه ژن

4 احمدپر همکاران تشخیص ژن شیگال دیسانتریه نمده ادامه بهمنظر تائید نهایی ژنه یا تکثیر یافته برای شناسایی محصل باز مجد انتهای 5' اقدام به طراحی پرب نمدیم که پرب با بیتین نشاندار چنان تعریف شد که تشکیل ساختارهای ثانیه )ساختمان سنجاق سری( نیز دایمر شدن پرب به حداقل برسد. همچنین یژگی کیفیت پرایمرها مانند صد GC دمای Tm احتمال تشکیل لپ دلتا )ΔG( G جفتشدگی پرایمرها هر یک از جفت پرایمرهای پیشر معکس با استفاده از نرمافزارهای ملکلی Primer3 IDT BLAST بهطر مجزا مردبررسی قرار گرفتند. جدل 1: اطالعات مربط به پرایمرها پرب طراحیشده پرایمرپرب سکانس پرایمرپرب جایگاه بر ری ژن کد کننده سم تعداد نکلئتید Ah stx1f TTGTTTGCAGTTGATGTCAGAGG Ah stx1r CAGGCAGGACACTACTCAACCTTC Ah stx1p 5'Biotin-TGTTGCAGGGATCAGTCGTACG-3' جداسازی تکثیر ژن نشاندار نمدن محصل اجزای اکنش اکنش با ژن جهت تکثیر حجم 15 میکرلیتر شامل 1 میکرلیتر الگ 1/5 میکرلیتر از آنزیم 1 )5U/µL( Taq polymerase 1/5 )11pmol/ µl) میکرلیتر بافر میکرلیتر میکرلیتر X از هر پرایمر 1/5,11 51( MgCl 2 میلی مالر( 1 میکرلیتر dntp 16/5 میکرلیتر آب مقطر انجام شد برای نشاندار نمدن محصالت از dntp بجای اسرشتگی الیه DIG-dUTP )Denaturation( استفاده شد. هر چرخه شامل 30 جه به مدت 3 دقیقه جدل 2: نحه اجرای اکنش جهت تکثیر ژن stx1 اسرشتگی 35 جه 05 ثانیه اتصال جه تکثیر )Annealing) نهایی ثانیه تکثیر )Extension( جه به مدت تکثیری صرت گرفت. اکنش دقیقه 5 جهیک 35 با 55 دقیقه سیکل 31 چرخه دمایی مطابق با جدل )1( انجام گرفت. جهت بررسی محصل محصل اکنش تسط ژل آگارز یک صد به مدت 05 دقیقه تحت لتاژ الکترفرز شده محصل UV مشاهده Gel document تصیری تهیه گردید. تعداد سیکل مرحله جه حرارت زمان 1 دناتره شدن الیه دناتره شدن ثانیه اتصال تکثیر 1 سیکل 3 دقیقه 30 جه بعد از الکترفرز زیر نر از ژل با استفاده از دستگاه 31 سیکل 05 ثانیه 05 ثانیه 30 جه 53 جه 51 جه 1 3 تکثیر نهایی 1 د قیقه س 1 یکل 5 دقیقه 51 جه 35 جه سلسیس انکبه کرده سپس چاهکها را 3 بار بافر PBST شناسایی محصل نشاندار شده با تکنیک -ELISA ابتدا 5 میکرلیتر استرپتایدین با 35 میکرلیتر بافر پششی به چاهک A 11 میکرلیتر محصل با دیگکسیژنین با 31 میکرلیتر بافر پششی نشاندار شده (Coating Buffer) چاهک B 11 میکرلیتر محصل عادی )غیر نشاندار( با 31 میکرلیتر بافر پششی چاهک C بافر پششی ( )-Ag چاهک 111 میکرلیتر D 5 میکرلیتر محصل E عادی با 35 میکرلیتر بافر پششی ریخته به مدت 1 ساعت )فسفات سالین حای %1/15 تیین( شستش داده مرحله بعد به هرکدام از چاهکها 111 میکرلیتر بهعنان BSA%3 Blacking Buffer اضافه کرده یک ساعت 35 جه انکبه کرده نمدیم. سپس چاهکها را 3 بار با بافر PBST شستش داده همزمان با این مرحله 11 میکرلیتر محصل نشاندار شده با DIG )SSC) ریخته را 31 میکرلیتر بافر گهسازی 11 دقیقه میجشانیم سپس 5 دقیقه داخل یخ قرار داده به آن 11 ماکرلیتر پرب نشاندار که انتهای 5 آن 10

5 مجله میکرب شناسی پزشکی ایران سال 11 شماره 5 آذر دی 1335 بیتینیله شده اضافه به مدت 1 ساعت 55 جه قرار داده سپس این مخلط را ری ریخته A چاهک جه قرار داده بعد از 3 بار شستش با بافر 35 ساعت 1 PBST 35 مقدار 111 میکرلیتر آنتیبادی ضد دیگکسیژنین نشاندار با پراکسیداز با رقت 1/1111 به هرکدام از چاهکها اضافه کرده 1 ساعت جه قرار گرفت پس از شستشی مجدد با 111PBST میکرلیتر از محلل سبسترا )1 میلیگرم 111+OPD میکرلیتر +5 میکرلیتر آباکسیژنه %31( به هر چاهک Detection buffer اضافه چند دقیقه اتاقک تاریک نگهداری گردید. برای تقف اکنش از 111 میکرلیتر اسیدسلفریک 1/5 مالراستفاده شد سپس جذب نری با استفاده از دستگاه (Bio-Rad) ELISA Reader 031 نانمتر خانده شد )12(. تعیین حساسیت تکنیک -ELISA محصل حداقل غلظت تعیین برای با استفاده از ژنمی شیگالدیسانتریه که میتاند تسط این رش شناسایی گردد پس از اندازهگیری رقت سریال نری جذب حساسیت ابتدا با رش از تهیه ژنمی جهت تعیین سپس استفاده با تکنیک - ELISA ژن ارزیابی بهکاربرده شد. صرت گرفت همچنین باکتری شیگال دیسانتریه تعیین اختصاصیت تکنیک از سیههای باکتریایی برای آغازگرهای بررسی طراحیشده اختصاصی بدن برای رش -ELISA تکنیک این تأیید با به همراه شیگال دیسانتریه محصل گهسازی با استفاده استفاده دیگر از از سرگره های شیگال باکتریهای خاناده انترباکتریاسه مانند سالمنالتیفی یبریکلرا سدمناس E.coli آئرژینزا O157:H7 نری هریک استفاده سپس با تکنیک -ELISA از سش ها مرد ارزیابی قرار گرفت. میزان جذب استخراج مردبررسی قرار گرفتند. یافتهها انجام بررسی اکنش اکنش شیگالدیسانتریه تکنیک با سپس -ELISA با باپرایمرهای نشاندارشدن محصل ژنمی اختصاصی استخراجشده طراحیشده سیه مطابق )شکل 1( انجام گرفت تکثیر قطعه 031 جفت بازی مربط به ژن میباشد که این دلیل بر صحت قطعات تکثیرشده ازلحاظ اندازه میباشد. همانطر که )شکل 1( نشان دادهشده است پس از نشاندار شدن محصل باندهای محصالت نشاندار شده با باالتر محصل DIG-dUTP قرارگرفته است نشاندار نسبت به محصل نشاندار نشده کمی علت که شده قطعه مردنظر گردیده است.. امر این میباشد جد باعث که دیگکسیژنین سنگین شکل 1: اکنش با ژنم استخراجشده از شیگال دیسانتری ستن :1 نشانگر اندازه )100bp Ladder( ستن :2 شدن محصل از ژنم Shigella dysenteriae )قطعه 416bp مربط به ژن stx1 است( تشخیص نمنههای استفاده با بالینی از تکنیک -ELISA از 51 نمنه بالینی مثبت حاصل از کشت مدفع با هیت شیگالدیسانتریه سنئی فلکسنری مربط به مراجعهکنندگان آزمایشگاههای تشخیص طبی بیمارستانها مراکز خصصی استان مازنان که طی 3 ماه از اسفند 33 ا یل اردیبهشت 30 جمعآریشده بد پس از کشت مجدد تعیین هیت سیهها شکل 2: تصیر ژل آگارز مربط به نشاندار کردن محصل ژنمیک شیگال دیسانتریه بهسیله.DIG-dUTP 1: سایز مارکر 2: محصل نشاندار نشده (stx1) :3(stx1) محصل نشاندار شده 15

6 احمدپر همکاران تشخیص ژن شیگال دیسانتریه تعیین حساسیت تکنیک -ELISA غلظت ژنمی پس از تهیه رقتهای مختلف از ژنمی که باعث آلدگی میشد بارش با استفاده از ژنمی حداقل برابر با 1/56 بده )شکل 3 الف( حالیکه 1/156 پیکگرم pg کمترین غلظت ژنمی میباشد )شکل 3 ب( که از جذب نری قابل قبلی با تکنیک الیزا برخردار میباشد. شکل 3: بررسی میزان حساسیت تکنیک -ELISA الف( تصیر ژل آگارز مربط به بررسی میزان حساسیت تکنیک -ELISA با نمنه ژنمی شیگال دیسانتریه 1- نشانگر اندازه 2-110ng محصل نشاندار نشده 3 تا 1 رقت 110ng تا 6/110 pg محصل نشاندار شده. ب( تعیین حساسیت -ELISA با استفاده از محصل ژن طراحیشده تعیین اختصاصیت تکنیک -ELISA این رش برای بررسی اختصاصی بدن آغازگرهای عاله بر شیگالدیسانتریه شیگالسنئی فلکسنری از دیگر سیههای خاناده انترباکتریاسه استفاده شد که بهغیراز شیگالدیسانتریه هیچ باندی بر ری ژل آگارز مشاهده نشد )شکل 0 الف( بررسی با رش -ELISA نمنه شیگالدیسانتریه میزان جذب نری از میزان جذب باالتری برخردار حالیکه جذب نری دیگر سیهها پایینتر از مقادیر کنترل بد )شکل 0 ب(. شکل 4: تعیین اختصاصیت الف( ژل آگارز مربط به تعیین اختصاصیت ژن : 1- نشانگر اندازه 2- محصل نشاندار نشده ژن شیگال دیسانتریه 3- محصل نشاندار شده ژن شیگال دیسانتریه 4- شیگال فلکسنری 1- شیگال سنئی 0- سدمناس آئرژینزا 0- یبریکلرا 2- O157:H7 E.coli ب( بررسی تعیین اختصاصیت رش -ELISA 16

7 مجله میکرب شناسی پزشکی ایران سال 11 شماره 5 آذر دی 1335 بررسی نمنههای بالینی با استفاده از تکنیک -ELISA برای کاربردی نمدن این تکنیک تعداد 51 نمنه بالینی که با هیت شیگالدیسانتریه فلکسنری سنئی که طی سه تا اردیبهشت 33 اسفند ماه از از 30 آزمایشگاههای تشخیص طبی بیمارستانها مراکز خصصی از استان مازنان جمعآری با این تکنیک مردبررسی قرار گرفتند 3 نمنه حای ژن بده است که نتایج بهدستآمده از )شکل 5 الف( نشان داد نمنههای مثبت از میزان جذب نری قابل قبلی برخردار میباشند همچنین این نتایج با نتایج بهدستآمده از طریق کشت کامأل مطابقت داشت. شکل 1: بررسی نمنههای بالینی حای ژن. 1- نشانگر اندازه 2 تا 4- ژن از نمنههای بالینی مثبت بحث بهعنان از خاناده مهمترین انترباکتریاسه شیگالدیسانتریه عامل بیماریزای که 1 تیپ ردهای انسان محسب میشد )13( به دلیل تلیدتکسینی بنام شیگاتکسین که دارای خاصیت نرتکسیک سیتتکسیک انترتکسیک میباشد )14( علت مهم مرگمیر کدکان زیر 5 سال افراد مسن به دلیل ابتال به بیماریهایی مانند تشنج انسفالپاتی فلج عصبی اختالل انعقاد داخل عرقی تعدیل سیستم ایمنی دیسانتری کمخنی گاسترانتریت سنم شدید ترمبسیتپنی Hus Ekiri میباشد )16(. ازآنجاییکه این باکتری انتشار آن بهصرت جهانی ایران بهصرت اندمیک میباشد بهعنان تهدیدی جدی برای سالمت بخصص کدکان محسب شده )11( لذا رشهای شناسایی تکسین شیگا شیگال دیسانتریه نحه پیشگیری مان آنها از اهمیت قابلتجهی میباشد. رشهای کالسیک مانند کشت سللی الیزا اگرچه از حساسیت باالیی شناسایی این برخردار RPLA تکسین برخردار میباشند اما به دلیل داشتن معایبی از قبیل آهسته بدن صرف قت هزینه زیاد مشکل استاندارد نمدن نیاز به افراد باتجربه محددیت اختیار داشتن امکاناتی نظیر کشت سللی آنتیتکسین مخصص جهت خنثیسازی نیاز به آنتیبادیهای من پلی کلنال ضد تکسین استفاده چندانی از آن نمیشد )10-10(. رشهای تشخیص ملکلی مانند Real time گهسازی با تجه به پیشرفتهای رزافزن زمینه تشخیص تکسین شیگا هنز دارای معایب میباشند. تکنیک ملکلی که از سال 1353 )تسط حال )Karch تا که بهطر مفقیتآمیزی برای شناسایی شیگاتکسین ها کاربرد دارد با تجه به اینکه از سرعت اختصاصیت حساسیت بیشتری نسبت به رشهای گفتهشده برخردار میباشد به دلیل استفاده رزمره از ماده سرطانزای اتیدیم برماید جهت رنگآمیزی ژل خطر آلدگی کارکنان آزمایشگاهی محیط را باالمی برد. همچنین محددیت تعداد نمنهها بهطر همزمان از دیگر ماردی است که تکنیک را زمانی که گسترش بیماری بهصرت پاندمی آندمی ظاهر میشد با مشکل ربر ساخته است )12(. از سپتامبر 1111 تسط تا حال مطالعات Fortin متعددی مرد جداسازی شیگاتکسین ها با استفاده از رش Real time صرت گرفته است اما با تجه به داشتن اختصاصیت 111 صدی حساسیت باالی اکنش به دلیل ناتانی این تکنیک برآرد اندازه محصل تکثیرشده استفاده از پربهای فلرسنس دار مخصص هزینه باال کمبد افراد ماهر باتجربه این رش را با محددیت ماجه نمده است )11(. رش گهسازی برای شناسایی شیگاتکسین ها که سال 1331 تسط Thomas همکارانش ارائه شد با تجه به اینکه یک تکنیک ملکلی مؤثر بسیار حساس اختصاصی با استفاده از ماد غیر رادیاکتی مانند دیگکسیژنین بیتین میباشد اما به دلیل عدم کارایی آن مرد تعداد زیاد نمنههای بالینی آزمایشگاههای تشخیص طبی مردتجه اقع نشده است )26(. اگرچه محققین یکی پس از دیگری سعی برطرف نمدن معابی رشهای پیشین نمدهاند لی تالش برای رشهای جدیدی که آن برخی از معایب رشهای قبلی برطرف شده باشد یا نسبت به رشهای قبل از حساسیت سرعت عمل بیشتری برخردار باشد پیسته مدنظر محققین بده است. با تجه به نکات فق این تحقیق رش ملکلی بر پایه هیبریداسین محصل طراحیشده تحت عنان تکنیک به همراه پرب اختصاصی -ELISA باهدف رفع معایب گفته به دلیل ساده بدن مراحل کار که شامل انتقال 15

8 احمدپر همکاران تشخیص ژن شیگال دیسانتریه افزایش انکباسین میباشد به دلیل استفاده از پرب اختصاصی برای باال بردن حساسیت اکنش بهکارگیری عدم ماد رادیاکتی جهت شناسایی سریع اختصاصی تکسین شیگا شیگال دیسانتریه بهعنان یک رش شناسایی کمخطر مناسب قابلاعتماد برای الین بار بکار گرفته شد. سال 1111 برای الین بار با Beilei همکارانش همین سال Fach تکنیک -ELISA با حساسیت از 11 6 راشناسایی نمایند )21(. همکارانش مدت 5 ساعت با 31 سیکل تکثیری ژنمی تانستند E.coli O157:H7 E.coli O157:H7 Daly سال 1111 تسط همکارانش با تکنیک -ELISA مدت 5 ساعت با سیکل تکثیری شناسایی شد )22(. با حساسیت از 11 5 Morata دادند که باکتری برسال با حساسیت 11 5 از ژنمی همکارانش سال 1113 نشان ژنمی با 31 سیکل تکثیری مدت 5 ساعت قابلیت شناسایی دارد )23(. سال با تکنیک Mousavi ELISA تکثیری با حساسیت 11 5 از همکارانش تانستند باکتری یبریکلرا را مدت 0 ساعت با حداقل 5 سیکل دهند )24(. سالمنال تیفی سال همکارانش با تکنیک ژنمی مرد شناسایی قرار تسط 1115 Mousavi -ELISA سیکل تکثیری با حساسیت 11 5 از مدت 0 ساعت با 5-31 ژنمی شناسایی شد )21(. Elmi همکارانش سال 1111 نشان دادند که باکتری هلیکباکتر پیلری با حساسیت 11 3 از ژنمی با 31 سیکل تکثیری مدت 5 Esfandiyari ساعت قابلیت شناسایی دارد )20(. همکارانش سال 1110 تانستند مدت 0 ساعت با 11 سیکل تکثیری ژن با این تکنیک شناسایی نمایند LT تکسین را با حساسیت 11 6 )20( تحقیق اما نتایج ما حاضر نشان داد شیگالدیسانتریه مدت 0 ساعت با 31 سیکل حساسیت با تکثیری 11 6 از با تکنیک ژنمی - ELISA قابلیت شناسایی دارد. از این مطالعه میتان اینطر نتیجهگیری نمد که رش -ELISA نسبت به بقیه رشهای تشخیصی دارای چندین مزیت میباشد: به دلیل ترکیب شدن محصل با یک مرحله گهسازی صحت کار باال میرد استفاده از پلیت های میکرتیتر امکان بررسی 36 نمنه بهطر همزمان جد دارد حساسیت اختصاصیت آن بیشتر زمان تشخیص کاهش بهطریکه حساسیت این رش برای تشخیص سم شیگالدیسانتریه 111 برابر بیشتر از رش الکترفرز ژل آگارز بده مدت 0 ساعت شناسایی میشد. عدم نیاز به دستگاه ژل داکت اتاق تاریک امکان آلدگی کم نسبت به رشهای لکهگذاری ساترن عدم استفاده از ماد گرانقیمت که رش Real-time بکار میرد از دیگر محاسن این تکنیک محسب میشد. ازآنجاکه این تکنیک بهراحتی قابلیت استاندارد شدن آزمایشگاههای تشخیص طبی داشته رشی سریع مدتزمان کتاه قابلاجرا میباشد ضمن ریسک آلدگی برای کارکنان آزمایشگاه کاهش مییابد به نظر میرسد یک رش آزمایشگاهی مناسب قابلاعتماد برای تشخیص شیگاتکسین ها باشد. تقدیر تشکر تحقیق حاضر بخشی از پایاننامه کارشناسی ارشد میکربیلژی مصب دانشگاه آزاد اسالمی احد آیت ا... آملی است. تعارض منافع: بین نیسندگان مجله میکربشناسی پزشکی ایران هیچگنه تعارض منافعی جد ندارد. References 1. Kim SH, Lee SR, Kim KS, Ko A, Kim E, Kim YH, Chang KT. Shiga toxin A subunit mutant of Escherichia coli O157:H7 releases outer membrane vesicles containing the B-pentameric complex. FEMS Immunol Med Microbiol 2010;58(3): Cherla RP1, Lee SY, Tesh VL. Shiga toxins and apoptosis. FEMS Microbiol Lett 2003; 228(2): Lingwood CA1. Shiga toxin receptor glycolipid binding. Pathology and utility. Methods Mol Med 2003;73: Odumosu O, Nicholas D, Yano H, Langridge W. AB toxins: a paradigm switch from deadly to desirable. Toxins 2010; 2(7): Huang A, Friesen J, Brunton JL. Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of 15

9 مجله میکرب شناسی پزشکی ایران سال 11 شماره 5 آذر دی 1335 Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli. J Bacteriol 1987;169(9): Waren BR, Parsh ME, Schneider KR. Shigella as foodborne pathogen and current methods for detection in food. Crit Rev Food Sci Nutr 2006; 46(7): Green MS, Block C, Cohen D, Slater PE. Our decades of shigellosis in Israel: epidemiology of a growing public health problem. Rev Infect Dis 1991;13(2): Sandvig K. Shiga toxins. Toxicon 2001;39(11): Siegler RL. Postdiarrheal Shiga toxin-mediated hemolytic uremic syndrome. JAMA 2003; 290(10): O'Loughlin EV, Robins-Browne RM. Effect of Shiga toxin and Shiga-like toxins on eukaryotic cells. Microbes Infect 2001;3(6): Teel LD, Steinberg BR, Aronson NE, O'Brien AD. Shiga toxin-producing Escherichia coli-associated kidney failure in a 40-year-old patient and late diagnosis by novel bacteriologic and toxin detection methods. J Clin Microbiol 2003;41(7): Crowther JR. ELISA. Theory and practice. Methods Mol Biol. 1995;42: Hesaraki M, Saadati S, Honari H, Olad G, Ranjbar R, Heiat M, Tat M. Induction of immune response against IpaD N-terminal region of Shigella dysenteriae in Guinea pigs. G3M 2011, 9(1): [in persion] 14. Pina DG, Johannes L. Cholera and Shiga toxin B- subunits: thermodynamic and structural considerations for function and biomedical applications.toxicon 2005;45(4): MoezArdalan K, Zali MR, Dallal MM, Hemami MR, Salmanzadeh-Ahrabi S. Prevalence and pattern of antimicrobial resistance of Shigella species among patients with acute diarrhoea in Karaj, Tehran, Iran. Tehran, Iran. J Health Popul Nutr 2003;21(2): [in persion] 16. Feng P, Sandlin RC, Park CH, Wilson RA, Nishibuchi M. Identification of a rough strain of Escherichia coli O157:H7 that produces no detectable O157 antigen. J Clin Microbiol 1998; 36(8): Beutin L, Zimmermann S, Gleier K. Rapid detection and isolation of shiga-like toxin (verocytotoxin)- producing Escherichia coli by direct testing of individual enterohemolytic colonies from washed sheep blood agar plates in the VTEC-RPLA assay. J Clin Microbiol 1996; 34(11): Son I, Binet R, Maounounen-Laasri A, Lin A, Hammack TS, Kase JA. Detection of five Shiga toxinproducing Escherichia coli genes with multiplex. Food Microbiol 2014;40: Margot H, Cernela N, Iversen C, Zweifel C, Stephan R. Evaluation of seven different commercially available real-time assays for detection of shiga toxin 1 and 2 gene subtypes and 2 gene subtypes. J Food Prot 2013;76(5): Beutin L, Zimmermann S, Gleier K. Rapid detection and isolation of shiga-like toxin (verocytotoxin)- producing Escherichia coli by direct testing of individual enterohemolytic colonies from washed sheep blood agar plates in the VTEC-RPLA assay. J Clin Microbiol 1996;34(11): Fach P, Perelle S, Dilasser F, Grout J. Comparison between a -ELISA test and the vero cell assay for detecting Shiga toxin-producing Escherichia coli in dairy products and characterization of virulence traits of the isolated strains.j Appl Microbiol 2001;90(5): Daly P, Collier T, Doyle S.-ELISA detection of Escherichia coli in milk. Lett Appl Microbiol 2002;34(3): Morata P, Queipo-Ortuño MI, Reguera JM, García- Ordoñez MA, Cárdenas A, Colmenero JD. Development and evaluation of a -enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of human brucellosis. J Clin Microbiol 2003;41(1): Mousavi SL, Nazarian S, Amani J, Rahgerdi AK. Rapid screening of toxigenic vibrio cholerae O1 strains from south Iran by -ELISA. Iran Biomed J 2008;12(1): [in persion] 25. Mousavi SL, Salimiyan J, Karimi Rahgerdi A, Amani J, Nazarian S, Ardestani H. A rapid and specific ELISA for detecting Salmonella typhi. Iranian J Clin Infect Dis 2006;1(3): [in persion] 26. Elmi A, Forouzandeh M, Bojary MR. Diagnosis of Helicobacter pylori infection in stool specimen by -ELISA of urec gene. MJMS 2011;13(4): [in persion] 27. Esfandiari P, Amani J, Imani Fooladi AA, Forghanifard MM, Mirhossaini SA. Detection of heatlabile toxin in enterotoxigenic Escherichia coli using -ELISA technique. J Gorgan Uni Med Sci 2015; 17(3): [in persion] 13