Τμήμα βιοϊατρικών επιστημών

Transcript

1 Τμήμα βιοϊατρικών επιστημών Μοριακή Διαγνωστική Προσέγγιση Παρασιτώσεων Δρ. ΒΟΓΙΑΤΖΑΚΗ Χρύσα Αθήνα 2018

2 Παράσιτο ορίζεται ο ευκαρυωτικός ( μονοκύτταρος ή πολυκύτταρος) οργανισμός που ζεί επί ή εντός ενός οργανισμού και σε βάρος αυτού του οργανισμού. Στους μονοκύτταρους οργανισμούς κατατάσσονται τα πρωτόζωα και στους πολυκύτταρους οργανισμούς κατατάσσονται τα μετάζωα και αρθρόποδα ΠΑΡΑΣΙΤΑ

3 Ως ευκαρυωτικά, ή ευκαρυώτες, τα μονοκύτταρα ή τα πολυκύτταρα παράσιτα έχουν πλήρως σχηματισμένο πυρήνα, όπου το γενετικό υλικό περιβάλλεται από την πυρηνική μεμβράνη, εξωτερικά περιβάλλονται από κυττατοπλασματική μεμβράνη ενώ στο κυτταρόπλασμα υπάρχουν οργανίδια, τα οποία είναι υπεύθυνα για τις διάφορες λειτουργίες του κυττάρου, όπως μιτοχόνδρια που φέρουν μικρή ποσότητα γενετικού υλικού,λυσόσωμα,ριβόσωμα κ.ά., ενώ απαντώνται ( στα πρωτόζωα) και οργανίδια που δεν ανευρίσκονται στα τυπικά ευκαρυωτικά κύτταρα όπως ο κινητοπλάστης, το κυτταρόστομα, τα συσταλτά κενοτόπια κ.ά.

4 Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας ( έχει εντοπίσει δέκα σημαντικά, αλλά παραμελημένα, μολυσματικά νοσήματα (αφρικανική τρυπανοσωμίαση, νόσος Chagas, πυρετός δάγκειος πυρετός, λεισμανίαση, λέπρα, ελονοσία, onchocerciasis, σχιστοσωμίαση και φυματίωση) που αποτελούν το επίκεντρο έντονων προσπαθειών για τον έλεγχο ή ακόμη και την εξάλειψη των μικροοργανισμών που προκαλούν αυτά τα νοσήματα. Τέσσερα από αυτά τα νοσήματα προκαλούνται από από πρωτόζωα παράσιτα (αφρικανική τρυπανοσωμίαση, νόσος Chagas, η λεϊσμανίαση και η ελονοσία) προκαλώντας περισσότερους από 1,3 εκατομμύρια θανάτους ετησίως, πιθανώς μέχρι 4 εκατομμύριο.

5 ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ ΠΑΡΑΣΙΤΟΥ Προκειμένου να ολοκληρώσουν τον βιολογικό τους κύκλο τα παράσιτα απαιτούν την ύπαρξη ενός ή περισσότερων ενδιάμεσων ξενιστών στους οποίους εντοπίζονται τα διάφορα στάδια εξέλιξης του παρασίτου και στους οποίους πραγματοποιείται ο πολλαπλασιασμός (μονογονικός ή αμφιγονικός).η γνώση του βιολογικού κύκλου των παρασίτων θεωρείται απαραίτητη προκειμένου να εντοπίζονται κάθε φορά οι αποθήκες του παρασίτου και για να πραγματοποιείται κάθε φορά η κατάλληλη υγειονομική παρέμβαση για τον περιορισμό ή την εξάλειψή τους.

6 ΠΑΡΑΣΙΤΩΣΕΙΣ Η διάγνωση των παρασιτώσεων πραγματοποιείται στο εργαστήριο. Απαραίτητη η συλλογή του κατάλληλου δείγματος (αίμα, κόπρανα, ΕΝΥ, πύον, ούρα, μυελός των οστών κ.ά.).

7 ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΠΑΡΑΣΙΤΩΣΕΩΝ Άμεσες παρασιτολογικές εξετάσεις ανίχνευση παρασίτων με γυμνό οφθαλμό με μικροσκοπική εξέταση βιολογικών υγρών ή ιστών στους οποίους εντοπίζονται τα παράσιτα). ή Περιορισμένος αριθμός ειδών εντοπίζονται με γυμνό οφθαλμό (παρατήρηση κατά την φάση του βιολογικού κύκλου που αποβάλλονται ώριμες αναπαραγωγικές μορφές) Μέθοδος αναφοράς. Μέθοδος διάγνωσης παρασιτώσεων για έναν αιώνα και πλέον. Χαμηλή επαναληψιμότητα, χαμηλή ευαισθησία, χρονοβόρα και επίπονη διαδικασία, εξειδικευμένο προσωπικό για την μικροσκόπηση

8 ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΠΑΡΑΣΙΤΩΣΕΩΝ Έμμεσες διαγνωστικές εξετάσεις (ανίχνευση συμπλόκου αντιγόνου αντισώματος) Ορολογικές εξετάσεις ανίχνευσης κυκλοφορούντος αντιγόνου ή αντισωμάτων Ενεργός λοίμωξη Διασταυρούμενες αντιδράσεις Ανοσοκατασταλμένοι ασθενείς Επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων με επιπλέον ανοσολογική δοκιμασία

9 ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΠΑΡΑΣΙΤΩΣΕΩΝ Απεικονιστικές εξετάσεις ενδέχεται να απαιτούνται για την διερεύνηση εντόπισης κάποιων παρασίτων σε εσωτερικά όργανα (Taenia solium, Toxoplasma gondii, Echinococcus spp)

10

11 Έχουν περάσει περισσότερα από 20 χρόνια από τότε που οι προσεγγίσεις γονιδιωματικής άρχισαν να εφαρμόζονται στο πρόβλημα των τροπικών παραμελημένων παρασιτικών νοσημάτων (tropical neglected parasitic diseases) με τη μορφή πιλοτικών προγραμμάτων μελέτης του γονιδιώματος. Η αλληλουχία γονιδιώματος Plasmodium falciparum δημοσιεύθηκε το 2002 ως αποτέλεσμα μιας διεθνούς συνεργατικής προσπάθειας και οι πρώτες γενετικές αλληλουχίες αναφοράς Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei και Leishmania major δημοσιεύθηκαν το 2005.

12 Aυτό έχει ως αποτέλεσμα, η γνώση της βιολογίας των παρασίτων να αυξάνεται συνεχώς και υπάρχουν πολλές ελπιδοφόρες προσεγγίσεις για τον εντοπισμό νέων υποψηφίων μορίων για χημειοθεραπεία και εμβόλια. Η εισαγωγή τεχνολογιών αλληλουχίας επόμενης γενεάς έχει πλέον προσφέρει πολλούς νέους τρόπους χρήσης της γονιδιωματικής για τη μελέτη παρασιτικών ασθενειών και την ενσωμάτωση με άλλους τύπους βιολογικών δεδομένων μεγάλης κλίμακας όπως η συγκριτική αλληλούχιση του γονιδιώματος, η μεταγραφική, η πρωτεωμική, η μεταβολική και την επιγενετική του παρασίτου, καθώς και πολλαπλές πτυχές της βιολογίας του ξενιστή.

13 Η Μοριακή Παρασιτολογία μελετά όλα τα βιολογικά μόρια (πρωτεΐνες,πολυσακχαρίτρες λιπίδια ) των παρασίτων εφαρμόζοντας παράλληλα τεχνικές της Μοριακής Βιολογίας που αναλύουν το DNA ΚΑΙ RNA των παρασιτικών οργανισμών Η πλέον συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος μελέτης του παρασιτικού DNA είναι η Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης (PCR) και οι διάφορες παραλλαγές αυτής που εφαρμόζονται όλο και συχνότερα σε αντίθεση με άλλες μοριακές μεθόδους όπως η ανάγνωση της αλληλουχίας του γονιδιώματος ( genome sequencing), μικροσυστοιχίες (microarrays) που δεν εφαρμόζονται σε διαγνωστικό επίπεδο αλλά κυρίως σε ερευνητικό.

14 Aλυσιδωτή Aντίδραση της Πολυμεράσης (PCR, Polymerase Chain Reaction) Ο ειδικός πολλαπλασιασμός ενός μικρού τμήματος της αλληλουχίας του γενετικού υλικού, ώστε να είναι δυνατή η ανίχνευση του και η περαιτέρω απομόνωση και μελέτη του, έγινε πραγματικότητα με την εφαρμογή της Aλυσιδωτής Aντίδρασης της Πολυμεράσης (PCR, Polymerase Chain Reaction) Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt 1: Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155:

15 Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (polymerase chain reaction, PCR) είναι µία τεχνική in vitro, ελεύθερη κυττάρων, η οποία επιτρέπει την ενίσχυση συγκεκριµένης αλληλουχίας DNA, που βρίσκεται ανάµεσα σε δύο περιοχές γνωστής αλληλουχίας του µορίου. Μέσα σε λίγες ώρες παράγεται τεράστιος αριθµός αντιγράφων της επιθυµητής αλληλουχίας. Το DNA στόχος ενισχύεται µε γεωµετρική πρόοδο σε κάθε κύκλο. O ολικός αριθµός των αντιγράφων DNA µπορεί να φθάσει θεωρητικά τον αριθµό

16 Η μέθοδος μιμείται το φυσικό μηχανισμό πολλαπλασιασμού του DNA, αλλά πραγματοποιείται in vitro Έχει εφαρμογή σε όλα τα πεδία των βιολογικών επιστημών, ενώ τα αποτελέσματα της αξιολογούνται από πλήθος άλλων επιστημών.

17 H ανάπτυξη της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (PCR- Polymerase Chain Reaction) επινοήθηκε από τον Kary Mullis το 1984 και αποτέλεσε επανάσταση στο χώρο της µοριακής γενετικής, δίνοντας τη δυνατότητα νέων προσεγγίσεων στην ανάλυση των γονιδίων (τα γονίδια στόχοι βρίσκονται σε λίγα αντίγραφα στο γονιδίωµα, το οποίο χαρακτηρίζεται από εξαιρετική πολυπλοκότητα). To 1993 Kary Mullis κέρδισε το Νόμπελ χημείας. Η πατέντα αγοράστηκε από τη φαρμακευτική εταιρεία Hoffman- La Roche έναντι $300 εκατ.

18 Η PCR αντίδραση έχει ένα πλήθος εφαρµογών. Ενδεικτικά αναφέρονται οι εξής: Ενίσχυση τµηµάτων γονιδίων και συµπληρωµατικού DNA (cdna). Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης µε RT- PCR. Εφαρµογή στην ανίχνευση και στην ανάλυση µεταλλάξεων. Χρησιµοποίηση περιοριστικών ενδονουκλεασών που κόβουν στην περιοχή όπου εντοπίζεται η µετάλλαξη που ψάχνουµε. Παρακολούθηση της πορείας της αντικαρκινικής θεραπείας, ώστε αυτή να τροποποιείται ανάλογα µε την πορεία της νόσου. Συγκεκριµένα, τα καρκινικά κύτταρα εντοπίζονται λόγω µεταλλάξεων ή υπερέκφρασης κάποιων γονιδίων τους.

19 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ PCR ΣΤΗΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΠΑΡΑΣΙΤΩΣΕΩΝ Με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης είναι δυνατόν να πολλαπλασιαστεί ένα µικρό κοµµάτι DNA ή RNA εκατοµµύρια φορές σε λίγες µόνο ώρες, κάνοντας δυνατή τη µοριακή διάγνωση των παρασιτώσεων. Η τεχνική αυτή επιτρέπει την ανίχνευση των παρασίτων στο δείγµα ενός ασθενούς, χωρίς να είναι απαραίτητη η κλωνοποίηση και η µεταφορά τύπου Southern ή Northern. Επίσης η τεχνική αυτή δίνει τη δυνατότητα να γίνουν αναλύσεις ακόµα και από ένα κύτταρο, το οποίο µπορει να προέρχεται π.χ. από µια σταγόνα αποξηραµένου αίµατος ή από διάφορους ιστούς και υγρά του σώµατος που περιέχουν παράσιτα, χωρίς να υπάρχει ανάγκη να παρασκευάσει κανείς µεγάλες ποσότητες DNA ή RNA.

20 Η δειγματοληψία είναι μια πολύ σημαντική και συχνά δύσκολη πτυχή για τη μελέτη πολλών παρασιτικών νοσημάτων. Σε πολλές περιπτώσεις, τα παράσιτα πρέπει συλλέγονται με τυποποιημένο τρόπο, διαθέτουν περιορισμένα μεταδεδομένα και πολύ συχνά η στρατηγική δειγματοληψίας δεν έχει στο μυαλό συγκεκριμένο βιολογικό ερώτημα Απαιτείται DNA παρασίτων, το οποίο αποµονώνεται από τα υγρά ή τους ιστούς όπου αυτά εντοπίζονται, όπως π.χ.: Αµνιακό υγρό (Toxoplasma gondii). είγµατα περιφερικού αίµατος (Plasmodium spp, Trypanosoma spp, Leishmania donovani, Piroplasma spp κ.α.). Κόπρανα (Entamoeba spp, Giardia spp κ.α.). Οπός λεµφογαγγλίων (Leishmania donovani κ.α.). Μυελός των οστών (Leishmania donovani). Εγκεφαλονωτιαίο υγρό (Naegleria spp) κ.α.

21 ΙΑΓΝΩΣΗ ΠΑΡΑΣΙΤΩΣΕΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο ΤΗΣ ΑΛΥΣΙ ΩΤΗΣ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) Αρχή της µεθόδου Η τεχνική της PCR βασίζεται στην ενζυµική αντίδραση του πολλαπλασιασµού ενός κοµµατιού µονόκλωνου DNA που οριοθετείται από δύο εκκινητές. Αυτοί αρχίζουν τη σύνθεση της συµπληρωµατικής αλυσίδας DNA µε το ένζυµο DNA πολυµεράση. Απαραίτητη είναι η µετατροπή του δίκλωνου DNA σε µονόκλωνο, αφού η DNA πολυµεράση η οποία επιµηκύνει τους εκκινητές µπορεί να χρησιµοποιήσει σαν µήτρα µόνο µονόκλωνο DNA.

22 Όπως φαίνεται στο επόµενο σχήµα, οι εκκινητές υβριδοποιούνται µε τέτοιο τρόπο, ώστε οι δύο νέες αλυσίδες DNA να είναι συµπληρωµατικές. Ο ένας εκκινητής είναι συµπληρωµατικός του τµήµατος της 5-3 και ο άλλος συµπληρωµατικός του τµήµατος της 3-5 αλυσίδας του DNA. Υβριδοποίηση εκκινητών στους 60 o C.

23 ηµιουργία αντιγράφου της αρχικής αλληλουχίας DNA

24 Oι τρεις φάσεις της PCR 1) εκθετική, κατά την οποία πραγµατοποιείται ο συνεχής και ακριβής διπλασιασµός του επιθυµητού τµήµατος και η ταυτόχρονη συσσώρευσή του (Φάση 1). 2) γραµµική, κατά την οποία τα αντιδραστήρια του µίγµατος αρχίζουν να καταναλώνονται και η αντίδραση επιβραδύνεται µέχρι να σταµατήσει (πιθανώς από κατανάλωση ή αποδιάταξη πλέον της πολυµεράσης) (Φάση 2). 3) φάση πλατό, κατά την οποία η αντίδραση έχει σταµατήσει και δεν υπάρχει πλέον παραγωγή άλλων αντιγράφων. Στο σηµείο αυτό το σύστηµα πρέπει να σταµατήσει, ώστε να µη ξεκινήσει µία διαδικασία εκφυλισµού των προϊόντων που έχουν προκύψει (Φάση 3).

25

26 Εκτίµηση αποτελέσµατος της µεθόδου Για τον ποιοτικό προσδιορισµό των προϊόντων της αντίδρασης PCR χρησιµοποιείται η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης (βλέπε αντίστοιχη εργαστηριακή άσκηση). Η ανίχνευση των προϊόντων της PCR αφορά στην τελευταία φάση της αντίδρασης (φάση πλατό). Φωτογραφία πηκτώµατος αγαρόζης.

27 ΑΛΥΣΙ ΩΤΗ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ (REAL TIME PCR)

28 Η PCR έχει χρησιµοποιηθεί ευρύτατα για τη διάγνωση παρασιτώσεων. Οι απλές ποσοτικές PCR αναφέρονται σαν ηµιποσοτικές τεχνικές, στις οποίες γίνεται ανάλυση των τελικών ενισχυµένων προϊόντων. Σε αυτό το σηµείο η καθαρή σύνθεση έχει ελαττωθεί σηµαντικά. Για να πραγµατοποιηθεί η ποσοτικοποίηση των προϊόντων των τελικών σταδίων απαιτούνται µεταπολλαπλασιαστικοί χειρισµοί, όπως για παράδειγµα η µέτρηση της σχέσης του κοµµατιού που πολλαπλασιάζεται σε σχέση µε γνωστά πρότυπα. Αυτές οι µέθοδοι στερούνται ευαισθησίας. Φωτογραφίες ενισχυµένων προϊόντων PCR.

29 Η Real Time PCR αποτελεί µία υψηλά ευαίσθητη τεχνική, η οποία επιτρέπει ταυτόχρονα 1) την ενίσχυση (πολλαπλασιασµό), 2) την ποσοτικοποίηση µιας συγκεκριµένης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας και 3) την ανίχνευση του προϊόντος της (PCR) σε πραγµατικό χρόνο και σε µικρό χρονικό διάστηµα.

30 Βασικές αρχές της Real Time PCR 1. Η PCR πραγµατικού χρόνου επιτρέπει την ακριβή ανίχνευση και ποσοτικοποίηση αρχικών ποσοτήτων DNA, cdna και RNA στόχων µε µεγάλη ευαισθησία και σε µικρό χρόνο (20 λεπτά για 30 κύκλους). 2. ίνει τη δυνατότητα καταγραφής και ταυτόχρονης παρακολούθησης της κινητικής της αντίδρασης σε πραγµατικό χρόνο, χάρη στο ενσωµατωµένο φθοριόµετρο και τη χρήση ειδικών φθορισµοχρωµάτων. Ο φθορισµός µετράται σε κάθε κύκλο. 3. Η ποσότητα του φθορισµού είναι ανάλογη µε την ποσότητα του προϊόντος της PCR. 4. Τα προϊόντα της PCR µπορούν να ανιχνευτούν χρησιµοποιώντας χρωστικές φθορισµού, που συνδέονται µε την διπλή έλικα του DNA ή µε ειδικούς, για την εξεταζόµενη αλληλουχία, ανιχνευτές υβριδισµού, οι οποίοι είναι σηµασµένοι µε φθορίζουσες ουσίες. 5. Πραγµατοποιείται εύκολη αναγνώριση και χαρακτηρισµός των PCR προϊόντων µε τη βοήθεια της ανάλυσης της καµπύλης τήξης (melting curve analysis). 6. Είναι δυνατή η ταυτόχρονη διεξαγωγή της PCR και η ανίχνευση του προϊόντος µέσα στο ίδιο µίγµα της αντίδρασης.

31 Εφαρµογές της Real Time PCR.

32 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕΤΑΞΥ ΤΗΣ PCR ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΚΑΙ ΤΗΣ ΑΠΛΗΣ PCR Με την απλή PCR η ανίχνευση της ενίσχυσης πραγματοποιείται µόνο κατά τα τελικά στάδια της αντίδρασης. Τα προβλήµατα της ανίχνευσης των ενισχυµένων προϊόντων κατά τα τελικά στάδιατης αντίδρασης είναι τα εξής: Χαµηλή ακρίβεια και διακριτικότητα. Χαµηλή ευαισθησία. Χαµηλή διαχωριστική ικανότητα. Έλλειψη ικανότητας ποσοτικοποίησης (διάκριση µόνο µε βάση το µοριακό βάρος του προϊόντος η χρήση του βρωµιούχου αιθίδιου δε δίνει τη δυνατότητα ποσοτικοποίησης). Κίνδυνος επιµολύνσεων. Μικρή δυνατότητα αυτοµατοποίησης. Mε την PCR πραγµατικού χρόνου η ανίχνευση της ενίσχυσης πραγµατοποιείται κατά τα αρχικά στάδια της αντίδρασης, δηλαδή κατά την εκθετική φάση της αντίδρασης, όπου τα δείγµατα προς εξέταση ενισχύονται εκθετικά οπότε δεν υπάρχει αποδόµηση των αντιδραστηρίων µε αποτέλεσµα ο διπλασιασµός του DNA είναι ακριβής. Η PCR πραγµατικού χρόνου συνδυάζει την ενίσχυση του DNA στόχου µε την ανίχνευση των ενισχυµένων προϊόντων στην ίδια αντίδραση. Έτσι αποφεύγονται οι επιµολύνσεις

33 Φθοριογενείς ανιχνευτικές µέθοδοι που χρησιµοποιούνται στη Real Time PCR Οι ανιχνευτικές µέθοδοι χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: Χρωστικές φθορισµού. Ανιχνευτές υβριδισµού σηµασµένοι µε φθορίζουσες ουσίες.

34 Χρωστικές φθορισµού. Το SYBR Green I αποτελεί µία χρωστική. Η χρωστική αυτή συνδέεται σε όλα τα µόρια µε διπλή έλικα DNA, µε αποτέλεσµα να εκπέµπεται σήµα φθορισµού σε ένα ορισµένο µήκος κύµατος κατά τη διάρκεια της σύνδεσης Σχόλιο: Τα µη ειδικά προϊόντα της PCR καθώς και η αντίδραση primer dimer (εκκινητή διµερούς) συµµετέχουν στην εκποµπή του σήµατος. Γι αυτό το λόγο απαιτείται υψηλή ειδικότητα στην PCR όταν χρησιµοποιείται το SYBR Green I.

35 Ανιχνευτές υβριδισµού σηµασµένοι µε φθορίζουσες ουσίες Aποτελούν την πιο ειδική και ευαίσθητη µέθοδο ανίχνευσης, διότι ανιχνεύουν µόνο το προϊόν που µας ενδιαφέρει. Οι σηµαντικότεροι είναι: Ανιχνευτές υβριδισµού TaqMan (TaqMan Probes). Ανιχνευτές υβριδισµού FRET (FRET Probes). Μοριακοί πυρσοί (Molecular Beacons).

36 Ανιχνευτές υβριδισµού TaqMan (TaqMan Probes) Οι ανιχνευτές υβριδισµού TaqMan είναι ειδικοί ανιχνευτές υβριδισµού για αλληλουχίες στόχους. Περιέχουν ένα φθορισµόχρωµα ανταποκριτή (R) και µια χρωστική καταστολέα (Q). Το φθορισµόχρωµα του ανταποκριτή προσκολλάται στο 5 άκρο του ανιχνευτή υβριδισµού και η χρωστική του καταστολέα βρίσκεται στο 3 άκρο.

37

38

39 Ανιχνευτές υβριδισµού FRET (FRET Probes) Η PCR πραγµατικού χρόνου, που πραγµατοποιείται µε τη µεταφορά συντονισµένης ενέργειας φθορισµού (FRET), χρησιµοποιεί δύο σηµασµένα νουκλεοτίδια, ανιχνευτές υβριδισµού. Αυτοί ενώνονται στο προϊόν της PCR µε σχηµατισµό κεφαλιού ουράς Προσκόλληση του ανιχνευτή FRET στην αλληλουχία στόχο.

40 ράση του ανιχνευτή FRET κατά το στάδιο της επέκτασης.

41 1) Η ποσότητα του σήµατος φθορισµού του δέκτη για ένα δεδοµένο δείγµα είναι ανάλογη µε την ποσότητα του προϊόντος που πολλαπλασιάστηκε. 2) Ανιχνευτής δότης (D): Σηµασµένος µε φλουορεσκεΐνη στο 3 άκρο. Φάσµα εκποµπής 530 nm. Ανιχνευτής δέκτης (A): Σηµασµένος µε LC Red. Φάσµα εκποµπής 640 nm.

42 Αρχή λειτουργίας κυκλοποιητή πραγµατικού χρόνου (Light Cycler). O κυκλοποιητής πραγµατικού χρόνου περιλαµβάνει 1) έναν ταχύ θερµαινόµενο κυκλοποιητή 2)µαζί µε ένα µετρητή φθορισµού µικρού όγκου (φθοριόµετρο). Το µηχάνηµα χρησιµοποιεί αέρα για τη θέρµανση και τη ψύξη. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται κυκλοποίηση υψηλής ταχύτητας

43 Τριχοειδή σωληνάρια Με τη χρήση των τριχοειδών επιτυγχάνεται υψηλή αναλογία επιφάνειας εµβαδού/όγκου, οπότε υπάρχει υψηλή αποδοτικότητα στη µεταφορά θερµότητας. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την πραγµατοποίηση γρήγορης κυκλοποίησης. Κάθε τριχοειδές παίζει ρόλο κυβέττας φθορισµού.η ένταση του σήµατος από τη φθορίζουσα ουσία που ενσωµατώνεται στο PCR προϊόν είναι ανάλογη µε την ποσότητα του προϊόντος που παράγει. Το σήµα από κάθε τριχοειδές µεταφέρεται στα ειδικά φωτοστοιχεία συλλογής δεδοµένων, τα οποία αµέσως καταγράφονται σε υπολογιστή. Το σήµα από κάθε τριχοειδές καταγράφεται µια φορά σε κάθε κύκλο, κι έτσι µετράται το προϊόν που σχηµατίζεται και τελικά πραγµατοποιείται η παρακολούθηση της PCR σε πραγµατικό χρόνο

44 Βήµατα µεθόδου 1) Παρασκευή master mix. Προσθήκη αποσταγµένου νερού (distilled water DNA RNA free). Προσθήκη διαλύµατος MgCl 2. Προσθήκη εναρκτήριων µορίων (primers forward). Προσθήκη εναρκτήριων µορίων (primers reverse). Προσθήκη ανιχνευτών υβριδισµού στο 3 άκρο (donor probe forward) σηµασµένων µε φλουορεσκεΐνη. Προσθήκη ανιχνευτών υβριδισµού στο 5 άκρο (receiver probe reverse) σηµασµένων µε LC Red. Προσθήκη Taq πολυµεράσης. Σχόλιο: Ανάδευση µε πιπέττα (η ανάδευση µε δίνη καταστρέφει τους ανιχνευτές υβριδισµού). 2) Κατανοµή master mix στα τριχοειδή σωληνάρια. 3)Προσθήκη δειγµάτων (π.χ. αµνιακών υγρών) για εξέταση στα τριχοειδή σωληνάρια. 4) Προσθήκη θετικού µάρτυρα (π.χ. αποµονωµένα παράσιτα Toxoplasma gondii) στα τριχοειδή σωληνάρια. 5) Προσθήκη αρνητικού µάρτυρα. 6) Τοποθέτηση των πωµάτων στα τριχοειδή σωληνάρια. 7)Φυγοκέντρηση των τριχοειδών σωληναρίων για την καθίζηση του µίγµατος DNA master mix. 8)Τοποθέτηση των τριχοειδών σωληναρίων στην κεφαλή του κυκλοποιητή. 9) Εγκατάσταση του προγράµµατος κυκλοποίησης και καταγραφή των δειγµάτων στο πρόγραµµα. 10) Έναρξη της κυκλοποίησης. ιάρκεια περίπου 30 min

45 Εκτίµηση αποτελεσµάτων Τα δεδοµένα της Real Time PCR επιδεικνύονται ως σιγµοειδείς καµπύλες πολλαπλασιασµού (όταν χρησιµοποιείται γραµµική κλίµακα), όπου ο φθορισµός σχεδιάζεται σε γράφηµα έναντι του αριθµού των κύκλων. Η εκθετική φάση (γραµµική λογαριθµική φάση) αρχίζει όταν αρκετό προϊόν έχει συσσωρευτεί και σταµατά όταν η αποδοτικότητα της αντίδρασης αρχίζει και εξασθενεί (φάση πλατό). Στο επόµενο σχήµα φαίνονται οκτώ καµπύλες πολλαπλασιασµού, που δείχνουν την αύξηση του φθορισµού από ισάριθµα δείγµατα. Όσο το προϊόν συσσωρεύεται κατά τη διάρκεια της PCR, o φθορισµός του ανιχνευτή LC Red 640 αυξάνεται διότι µεταφέρεται η ενέργεια από τον ανιχνευτή, ο οποίος είναι σηµασµένος µε φλουορεσκεΐνη. Το F2 είναι η µέτρηση εκποµπής του φθορισµού για το LC Red 640 και το F1 είναι η µέτρηση εκποµπής του φθορισµού για τη φλουορεσκεΐνη.

46

47 τιµή Cp : Είναι ο κύκλος, κατά τον οποίο η καµπύλη πολλαπλασιασµού ξεπερνά το όριο (π.χ. υπάρχει αύξηση στο φθορισµό). Το Cp χρησιµοποιείται για τον υπολογισµό της αρχικής συγκέντρωσης της µήτρας κάθε δείγµατος Ο συγκεκριµένος κύκλος στον οποίο ένα καθορισµένο δείγµα διαφαίνεται θετικό (τιµή Cp) εξαρτάται από την αρχική ποσότητα του στόχου στο δείγµα που µελετάται. Έτσι, όσο µεγαλύτερη ποσότητα µήτρας υπάρχει σε ένα δείγµα τόσο λιγότεροι κύκλοι θα χρειαστούν ώστε αυτό το δείγµα να δώσει θετικό σήµα. Το δείγµα 1 περιέχειµεγαλύτερο αριθµό αντιγράφων του DNA στόχου σε σύγκριση µε το δείγµα 8.

48 Εξωτερικά πρότυπα Η χρήση των εξωτερικών προτύπων δίνει τη δυνατότητα να πραγµατοποιηθεί η µέτρηση της έκφρασης ενός γονιδίου σαν απόλυτος αριθµός αντιγράφων. Για την ανάλυση της έκφρασης ενός γονιδίου, τα πιο ακριβή εξωτερικά πρότυπα αποτελούν τα DNA µόρια, των οποίων ο αριθµός των αντιγράφων ή η συγκέντρωση τους είναι γνωστή

49 Καµπύλη αναφοράς Μία καµπύλη αναφοράς δηµιουργείται µε Cp τιµές (αριθµός κύκλων) έναντι του λογαρίθµου της συγκέντρωσης του προτύπου (τουλάχιστον 5 διαδοχικές αραιώσεις). Για να υπολογιστεί η ακριβής τιµή των δειγµάτων προς εξέταση, πραγµατοποιείται η σύγκριση των Cp τιµών των προς εξέταση δειγµάτων µε αυτών της πρότυπης καµπύλης. Κάθε καµπύλη αναφοράς πρέπει να ελέγχεται για την αξιοπιστία της. Αυτό επιτυγχάνεται µέσω της µέτρησης της κλίσης της καµπύλης (slope), η οποία πρέπει να βρίσκεται µεταξύ των τιµών -3,2 έως -3,8

50

51 Παράδειγµα: Αναγωγή για ποσοτικοποίηση σε 1 ml αίµατος Όπως φαίνεται στην καµπύλη αναφοράς το θετικό δείγµα έχει: Cp = 24 και η συγκέντρωση του [α] σε αντίγραφα (copies) είναι: 1,25 x 10 6 Λόγω του ότι χρησιµοποιήθηκαν 5 µl από τη µήτρα του DNA, ισχύει: [α] = 5 µl Λόγω του ότι o τελικός όγκος της εκχύλισης ήταν 200 µl ισχύει: 200/5 = 40 Όµως η αρχική ποσότητα του αίµατος ήταν 200 µl οπότε ισχύει: 40 x [α] = 200 µl αίµατος Για να υπολογισθεί τη τελική συγκέντρωση για 1 ml αίµατος ισχύει: X= 40 x [α] x 1000 µl / 200 µl αίµατος => => X= 200 x [α] => X = 200 x 1,25 x 10 6 => Χ= 2,5 x 10 8 copies/ml αίµατος

52

53 Τα αποτελέσµατα είναι ενθαρρυντικά καθώς είµαστε σε θέση να: Ανιχνεύσουµε την ύπαρξη γενετικού υλικού του παρασίτου Toxoplasma gondii στο αµνιακό υγρό µέσα σε 24 ώρες από τη λήψη του δείγµατος. Παρακολουθήσουµε την εξέλιξη της λοίµωξης κατά τη διάρκεια της θεραπευτικής αγωγής. Επισηµάνουµε ενδεχόµενη υποτροπή

54 Εφαρµογή της Real Time PCR στην παρασιτολογία Η πραγµατικού χρόνου ποσοτική PCR είναι ιδιαίτερα χρήσιµη για παρασιτικές µολύνσεις, όπου συνηθισµένες µέθοδοι (συνήθως µικροσκοπικές µέθοδοι) για ποσοτικοποίηση είναι δύσκολο να εφαρµοστούν ή λιγότερο ευαίσθητες για την κλινική ανίχνευση παρασίτων. Η ικανότητα για ποσοτικοποίηση χαµηλού επιπέδου παρασιτικών φορτίων επιτρέπει τον έλεγχο της αποτελεσµατικότητας του εµβολίου στα προ-συµπτωµατικά στάδια, την πρόοδο των µολύνσεων κάτω από θεραπείες και τη διάγνωση των χαµηλών επιπέδου µολύνσεων ή ακόµα και την κατάσταση των φορέων.

55 Η φωλεακή PCR είναι μία τροποποίηση της τυποποιημένης PCR, που αποσκοπεί στη μείωση της επιμόλυνσης του προϊόντος λόγω μη ειδικής υβριδοποίησης των εκκινητών (mispriming). Εάν το επιδιωκόμενο θραύσμα δεν μπορεί να ενισχυθεί χωρίς παρεμβολή από ανταγωνιστικές θέσεις δέσμευσης, ενισχύεται ένα μεγαλύτερο εξωτερικό θραύσμα το οποίο περιέχει το μικρότερο προοριζόμενο θραύσμα. Έχοντας ενισχύσει το εξωτερικό θραύσμα σε μεγάλους αριθμούς, η PCR ενίσχυση του εσωτερικού θραύσματος μπορεί να προχωρήσει και θα δώσει ενίσχυση αυτού με ελάχιστη μόλυνση.. Φωλεακή Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης (Nested PCR) PCR Methods Appl Jun;3(6): Improved quantitative PCR using nested primers. Haff LA

56 ΦΩΛΕΑΚΗ (Nested) PCR Περιλαμβάνει τη χρήση δύο ζευγών εκκινητών για δύο διαδοχικές αντιδράσεις. Το πρώτο σετ εξωτερικών εκκινητών (outer primers), έχει σχεδιαστεί για να υβριδοποιείται με μια επιθυμητή αλληλουχία του DNA και να την πολλαπλασιάζει. Τα προϊόντα που προκύπτουν από την πρώτη αυτή αντίδραση PCR, χρησιμοποιούνται ως μήτρα όπου δεσμεύεται το δεύτερο σετ εσωτερικών εκκινητών (inner primers) και πραγματοποιούν μια διαδοχική αντίδραση.

57 ΦΩΛΕΑΚΗ (Nested) PCR /

58 ΦΩΛΕΑΚΗ (Nested) PCR Πλεονεκτήματα Αυξημένη ειδικότητα, καθώς μειώνει λάθη που οφείλονται στην υβριδοποίηση των εκκινητών σε μη ειδικές περιοχές και την δημιουργία μη ειδικών προϊόντων. Αυξημένη ευαισθησία. Εγγυάται την ορθή ενίσχυση μικρών ποσοτήτων γενετικού υλικού χωρίς λάθη, επιτρέποντας τον πολλαπλασιασμό έστω και ενός αντιγράφου χρήσιμο στη διάγνωση λοιμώξεων με ελάχιστο μικροβιακό φορτίο.

59 H πολυπλεκτική (multiplex PCR) επιτρέπει την ταυτόχρονη ενίσχυση διαφορετικών στόχων σε έναν απλό σωλήνα PCR. Η πολυπλεξία όχι μόνο εξοικονομεί χρόνο, αντιδραστήρια και δείγματα αλλά ταυτόχρονα κάνει ταυτόχρονη σύγκριση πολλαπλών amplicons Multiplex PCR

60 Multiplex PCR H ύπαρξη μέσα σε ένα σωλήνα πλέον του ενός ζεύγους εκκινητών όπως συμβαίνει στην πολυπλεκτική PCR, δημιουργεί το μειονέκτημα της μη εξειδικευμένης ενίσχυσης και της μειωμένης αποτελεσματικότητας αφού η είναι γνωστή η δυσκολία βελτιστοποίησης της αντίδραση για ένα μόνο ζεύγος εκκινητή και στόχο πολλώ δε μάλλον για όλους τους εκκινητές και τους στόχους. Επομένως, ο σχεδιασμός των εκκινητών είναι κρίσιμος για να ελαχιστοποιηθεί η εσφαλμένη ενίσχυση που θα οδηγούσε σε μη ειδική απάντηση. Οι αλληλουχίες των εκκινητών θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πιο μοναδικές στον στόχο τους και οι Tms όλων των εναρκτήριων θα πρέπει να βρίσκονται εντός των 5 C μεταξύ τους. Μονοπλεκτική PCR vs πολυπλεκτικής PCR. Στην απλή PCR, κάθε αντίδραση περιέχει ένα ζεύγος εκκινητών για να ενισχύσει έναν στόχο. Στην πολλαπλή PCR, πολλαπλά ζεύγη εκκινητών χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση πολλαπλών στόχων σε μία αντίδραση.

61 κάθε ζεύγος εκκινητών θα πρέπει να ελέγχεται σε απλή PCR για την βέλτιστη ειδικότητα (δηλαδή να λαμβάνουμε ένα μοναδικό προϊόν, Specificity ) και την μέγιστη απόδοση (την παραγωγή πολλών μορίων των PCR προϊόντων, Efficiency). Περαιτέρω, τα amplicons θα πρέπει να έχουν διακριτά μεγέθη που μπορούν να διαχωριστούν με ηλεκτροφόρηση πηκτής για αναγνώριση. Εκτός από το σχεδιασμό των εναρκτηρίων μορίων απαιτείται DΝΑ πολυμεράση θερμής έναρξης και ένα ρυθμιστικό διάλυμα PCR ειδικά για πολυπλεξία μπορούν να βοηθήσουν την επιτυχία και την εξειδίκευση της PCR

62 Agarose gel electrophoresis of multiplex PCR products using DNA samples of Eimeria acervulina (lane 1), E. brunetti (lane 2), E. tenella (lane 3), E. mitis (lane 4), E. praecox (lane 5), E. maxima (lane 6), E. necatrix (lane 7), a mixture of the 7 Eimeria species (lane 8) and a control with no starting DNA (lane 9). Molecular size markers (lane M) in base pairs are indicated on the left.

63 Multiplex PCR Λιγότερος χρόνος προετοιμασίας Εξοικονόμηση χρημάτων Ταχύτητα αποτελέσματος Ολοκληρώνεται σε μια αντίδραση ένα πείραμα που θα απαιτούσε περισσότερες monoplex PCR!!

64 Multiplex PCR Μειονεκτήματα Δυσκολία στο σχεδιασμό των primers (μέγεθος, Tm, αναλογία G-C). Λάθη λόγω διασταυρούμενης υβριδοποίησης των primers (primer dimers). Εφαρμογές Διάγνωση παθογόνων Εγκληματολογικές μελέτες Ανάλυση μετάλλαξης Ανάλυση διαγραφής γονιδίων Ανίχνευση RNA Γονοτύπηση σημειακών μεταλλάξεων

65 ΜΕΛΕΤΗ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗΣ

66 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΕΙΔΩΝ PLASMODIUM VIVAX ΚΑΙ PLASMODIUM FALCIPARUM ΜΕ ΤΗΝ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΝESTED PCR ΚΑΙ MULTIPLEX PCR

67 Βιβλιογραφία 1. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA (1988). "DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (24): doi : /pnas Korbie DJ, Mattick JS (2008) Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification. Nat Protoc 3 : Paul, N., Shum, J., Le, T. Hot Start PCR in Methods in Molecular Biology in RT-PCR Protocols, Springer Science&Business Media, LLC 2010, 630: Pavlov AR, Pavlova NV, Kozyavkin SA, Slesarev AI (2006). "Thermostable DNA Polymerases for a Wide Spectrum of Applications: Comparison of a Robust Hybrid TopoTaq to other enzymes". In Kieleczawa J. DNA Sequencing II: Optimizing Preparation and Cleanup. Jones and Bartlett. pp ISBN Sanchez JA, Pierce KE, Rice JE, Wangh LJ Linear-after-the-exponential (LATE)-PCR: an advanced method of asymmetric PCR and its uses in quantitative real-time analysis. Proc Nat AcadSci USA; 101: Singh OP, GoswamiGeeta, Nanda N, Raghavendra K, Chandra D, and Subbarao SK An allele-specific polymerase chain reaction assay for the differentiation of members of the Anopheles culicifacies complex. 7. Frickmann H, Hinz R, Rojak S, Bonow I, Ruben S, Wegner C, Zielke I, Hagen RM, Tannich E Evaluation of automated loopmediated amplification (LAMP) for routine malaria detection in blood samples of German travelers - A cross-sectional study. Travel Med Infect Dis. May 12. pii: S (18) Ebrahimzadeh A, Shahraki MK, Mohammadi A Serological and molecular diagnosis of Toxoplasma gondii in patients with schizophrenia.j Parasit Dis Jun;42(2): Nazeer JT, El Sayed Khalifa K, von Thien H, El-Sibaei MM, Abdel-Hamid MY, Tawfik RA, Tannich E Use of multiplex realtime PCR for detection of common diarrhea causing protozoan parasites in Egypt. Parasitol ResFeb; 112(2): Epub 2012 Nov Rochat L, Croxatto A, De Vallière S, D'Acremont V, Genton B. Rev Med Suisse Multiplex PCR gastro-intestinal panels for the management of traveller's diarrhea : are they accurate and useful? May 3; 13(561):

68 Ευχαριστώ για την προσοχή σας!!