( cross talk ) PPAR KAI AP-1

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΣΤΙΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΙ ΙΚΟΤΗΤΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΝΟΜΙΛΙΑΣ ( cross talk ) ΤΩΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ PPARγ KAI AP-1 ΣΤΗΝ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ ΓΕΡΑΣΙΜΟΣ Π. ΒΑΝ ΩΡΟΣ ΙΑΤΡΟΣ ΠΑΘΟΛΟΓΟΑΝΑΤΟΜΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΟΝΥΣΗΣ ΣΠ. ΜΠΟΝΙΚΟΣ ΙΟΥΝΙΟΣ 2011

2 2 Στη µνήµη της µικρής µου Μαρίας Ελπίδας,

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ιονύσης Μπονίκος Οµότιµος Καθηγητής 2. Ιωάννης Βαράκης Οµότιµος Καθηγητής 3. Γεωργία Σωτηροπούλου Μπονίκου Αναπληρώτρια Καθηγήτρια 3

4 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ιονύσης Μπονίκος, Οµότιµος Καθηγητής 2. Ιωάννης Βαράκης, Οµότιµος Καθηγητής 3. Χαράλαµπος Καλόφωνος, Καθηγητής 4. Γεωργία Σωτηροπούλου Μπονίκου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια 5. Μιχάλης Σταυρόπουλος, Αναπληρωτής Καθηγητής 6. Μαρία Μελαχροινού, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια 7. Βασιλική Ζολώτα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΚΟΠΟΣ σελ.7 σελ.10 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ σελ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ 2. ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗΣ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ σελ ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΣ σελ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ σελ ΣΥΖΗΤΗΣΗ σελ ΠΕΡΙΛΗΨΗ σελ ABSTRACT σελ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ σελ ΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ σελ.125 5

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Είναι ευρύτατα γνωστό ότι ο καρκίνος του παχέος εντέρου προσφέρεται ως κλινική και ιστοπαθολογική οντότητα για έρευνα εδώ και µερικές δεκαετίες. Η αιτία δεν είναι άλλη από την σχετικά αναγνωρίσιµη φυσιοπαθολογία της νόσου, η οποία σε αντίθεση µε άλλες νεοπλασµατικές επεξεργασίες, αρκετά συχνά εµφανίζει πρώϊµα διαγνωστικά στοιχεία. Γνωρίζουµε ότι η καρκινογένεση είναι πολυσταδιακή και πολυπαραγοντική διαδικασία, γνωρίζουµε αρκετούς προδιαθεσικούς και περιβαλλοντολογικούς παράγοντες που συµβάλλουν στην εκτροπή της φυσιολογικής λειτουργίας των επιθηλιακών κυττάρων του παχέος εντέρου, όµως θα θεωρούσα υψηλή προτεραιότητα την γρήγορη εφαρµογή των «έτοιµων δεδοµένων» σε µαζική καθηµερινή πρακτική µε ταυτόχρονη εκµετάλλευση των στοιχείων που προκύπτουν σχετικά µε την αιτιοπαθογένεια και τα επί µέρους χαρακτηριστικά της νόσου µελετώντας την κάθε περίπτωση σαν ξεχωριστή οντότητα. Κερδίζει συνεχώς έδαφος η άποψη ότι ο καρκίνος του Χ ασθενούς µοιάζει αλλά δεν είναι ποτέ ίδιος µε τον καρκίνο του Ψ ασθενούς, ασχέτως εάν εντάσσονται στην ίδια ιστοπαθολογική κατηγορία και στο ίδιο κλινικό στάδιο. Η µοναδικότητα του ανθρώπου ως έµβιου όντος µέσα στον µακρόκοσµο και η εν συνεχεία µοναδικότητα του κάθε ανθρώπου µέσα στον ανθρώπινο µικρόκοσµο δεν µπορεί και δεν πρέπει να εκλαµβάνεται ως τυχαίο γεγονός. Από αυτό και µόνο απορρέει η λογική αλληλουχία βάσει της οποίας η νόσος πέρα από τα γενικά της χαρακτηριστικά θα ακολουθεί µία ξεχωριστή πορεία, µία πορεία που θα χαρακτηρίζει έναν συγκεκριµένο ασθενή και που θα χαρακτηρίζεται από τον συγκεκριµένο ασθενή σαν ένα είδος ταυτότητας νόσου. Είναι χρέος µας να προσπαθούµε σε κάθε περίπτωση να ξεχωρίζουµε και να ταυτοποιούµε όσο µπορούµε λεπτοµερέστερα την νόσο του κάθε ασθενούς µας, ούτως ώστε να µπορούµε να πετύχουµε το µέγιστο δυνατό θεραπευτικό όφελος. Σε αυτή τη λογική κινείται η παρούσα µελέτη εστιάζοντας σε ένα τµήµα της διαδικασίας καρκινογένεσης στο παχύ έντερο, µε την προσδοκία της πρόσθεσης χρήσιµων πληροφοριών στην εξαιρετικά πολύπλοκη προσπάθεια αποτελεσµατικής αντιµετώπισης της νόσου που µόνο στις ΗΠΑ ευθύνεται για περίπου θανάτους ετησίως. Από πλευράς του γράφοντος δεν υπάρχει στην παρούσα µελέτη πρόθεση εντυπωσιασµού ή παράθεσης «βαρετών» και λίγο πολύ γνωστών στοιχείων που απλά διογκώνουν ένα σύγγραµµα. Πιστεύω ότι το τελικό αποτέλεσµα παρουσιάζει αρκετό ενδιαφέρον όµως θεωρώ υποχρέωσή µου να αναφέρω ορισµένα στοιχεία που αφορούν την πορεία της µελέτης. 6

7 Η µελέτη ξεκίνησε πριν από µερικά χρόνια προκειµένου να διερευνηθεί η έκφραση των µεταγραφικών παραγόντων PPARγ και ΑΡ1 στον καρκίνο του παχέος εντέρου και να συσχετισθεί η έκφρασή τους µε την έκφραση της Κυκλοοξυγενάσης -2 ( COX-2) µε στόχο την ανάδειξη ενός µοριακού µοντέλου το οποίο να εξηγεί την υπερέκφραση της COX-2 στα αδενοκαρκινώµατα του παχέος εντέρου µε την όποια κλινική σηµασία αυτό συνεπάγεται. Όπως όµως σε κάθε µελέτη έτσι και εδώ προχωρώντας άρχισαν να δηµιουργούνται νέες απορίες και ερωτήµατα. Σίγουρα αυτό είναι αναπόφευκτο στα πλαίσια της µελέτης γενικότερα. Κάποια απαντήθηκαν, κάποια όχι, κάποια θα απαντηθούν πολύ σύντοµα. Θα ήθελα οπωσδήποτε να εκφράσω όσο µπορώ καλύτερα αυτό που έµεινε. Πιστεύεται ότι το όφελος µιας διδακτορικής διατριβής είναι κτήµα όλων όσων συµβάλλουν σε αυτήν αλλά και όλων όσων κάτι περιµένουν να µάθουν από αυτήν. Στην προκειµένη περίπτωση αυτό που θα µπορούσα να θεωρήσω όφελος πέρα από την αποτύπωση του βιολογικού µονοπατιού της COX-2 είναι η επαφή µε την καθηµερινή εξέλιξη της νόσου σε ορισµένους ασθενείς. Η επαφή που ξεκίνησε µε την απλή ενηµερωτική ανάγνωση εργαστηριακών εξετάσεων στη διάρκεια της θεραπείας και εξελίχθηκε σε ανάλυση στοιχείων ιστορικού της νόσου, στοιχείων του οικογενειακού περιβάλλοντος, στοιχείων ψυχισµού των ασθενών, στοιχείων που αφορούσαν την υποστήριξή τους από το συγγενικό περιβάλλον ακόµα και στοιχείων της νέας στάσης ζωής των ασθενών µε δεδοµένη τη νόσο τους. Οι φίλοι µας στην άλλη πλευρά του Ατλαντικού σίγουρα κάτι ήξεραν όταν απέδωσαν την ερµηνεία Doctor in Philosophy στους ιδακτορικούς τίτλους. Από την πρώτη στιγµή της ενασχόλησης µε την παρούσα µελέτη, εντελώς απλά και φυσιολογικά, άρχισαν να προκύπτουν ερωτήµατα φιλοσοφικού τύπου. Ο λόγος εξίσου απλός. Ζωή και θάνατος. Φυσιολογικές λειτουργίες και εκτροπές προς την καρκινογένεση. Θεραπευτικές παρεµβάσεις, υποτροπές, υφέσεις και εξάρσεις της νόσου. Ένας κύκλος γεγονότων ο οποίος περιβάλλει πολλούς ανθρώπους και εµφανίζει συχνά ένα απρόσµενο χαρακτηριστικό. Στο κέντρο του δεν βρίσκεται πάντοτε υποχρεωτικά ο ασθενής. Στο σηµείο αυτό θα ήθελα ειλικρινά να ευχαριστήσω όλους όσους µου συµπαραστάθηκαν και µε βοήθησαν να ολοκληρώσω την παρούσα µελέτη. Ευχαριστώ θερµά πρώτα από όλα τους εκλεκτούς Καθηγητές της Τριµελούς Επιτροπής, οι οποίοι καθοµολογούµενα έχουν σφραγίσει µε τη δουλειά τους την εξέλιξη της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστηµίου Πάτρας. Τόσο ο κος ιονύσης Μπονίκος όσο και ο κος Ιωάννης Βαράκης µου δηµιουργούν συναίσθηµα ιδιαίτερης τιµής µε την παρουσία τους στην επιτροπή. 7

8 Ιδιαίτερη αναφορά θα ήθελα να κάνω για το τρίτο µέλος της Επιτροπής, την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα Γεωργία Σωτηροπούλου Μπονίκου. Θα µιλήσω όχι µόνο εκ µέρους µου αλλά και εκ µέρους συναδέλφων που είχαν την ευκαιρία να συνεργαστούν µαζί της. Πρόκειται πραγµατικά για άνθρωπο που εκτός από γνώση του αντικειµένου, έχει την ικανότητα να στέκεται κυριολεκτικά δίπλα στους ανθρώπους που συνεργάζεται και να τους βοηθά να αναδείξουν µε τον καλύτερο δυνατό τρόπο τη δουλειά τους. Η παρουσία της κας Σωτηροπούλου Μπονίκου συµβάλλει τα µέγιστα, τόσο στην κατάρτιση όσο και στην ανάδειξη συναδέλφων που προάγουν την έρευνα και τιµούν το χώρο µας. Θέλω να ευχαριστήσω επίσης τρείς φίλους και πολύτιµους συνεργάτες, οι οποίοι συνέβαλαν αποφασιστικά σε πολλά δύσκολα στάδια της µελέτης,τον Καθηγητή κο Αθανάσιο Παπαβασιλείου, τον πρόσφατα εκλεγέντα Επίκουρο καθηγητή κο Παναγιώτη Κωνσταντινόπουλο και τον ιδάκτορα κο Κωνσταντίνο Κουρέλη. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τους τεχνολόγους του Παθολογοανατοµικού Εργαστηρίου του Γενικού Νοσοκοµείου Αιγίου, κες Ελένη και Ευφροσύνη Νικολοπούλου, Πολυνίκη Μπέκα και τον αγαπητό µας Φώτη Χρυσανθόπουλο, που έφυγε πρόωρα από την ζωή. Επειδή ασχολήθηκα αρκετά εντατικά µε όλο το φάσµα του καρκίνου του παχέος εντέρου ελπίζω στη συνέχεια όλων των µελετών και στην αξιοποίησή τους από τη δική µας πλευρά προς όφελος των ασθενών µας. Η πλειοψηφία των ασθενών µας αναγνωρίζει τη συνεισφορά µας και χρέος µας είναι να συνεχίσουµε. 8

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ - ΣΚΟΠΟΣ Ο καρκίνος του παχέος εντέρου ήταν και παραµένει µία από τις κυριότερες αιτίες θανάτου παγκοσµίως. Ενδεικτικά θα πρέπει να τονιστεί ότι στις ΗΠΑ ο αναµενόµενος αριθµός θανάτων σύµφωνα µε τα επίσηµα στατιστικά στοιχεία αναµένεται το 2011 να φτάσει στις , ενώ εννέα χρόνια νωρίτερα, το 2002, ο αντίστοιχος αριθµός θανάτων ήταν Η αναφορά στα στατιστικά στοιχεία των ΗΠΑ γίνεται για πολλούς και ποικίλους λόγους. Κύριος λόγος είναι η γενικά αποδεκτή αξιοπιστία των συγκεκριµένων στατιστικών στοιχείων και η εύκολη πρόσβαση σε αυτά µέσω του διαδικτύου, από πηγές ελεύθερης χρήσης για το κοινό. Ένας άλλος λόγος είναι το γεγονός ότι σε σχέση µε τους δικούς µας ασθενείς, οι στατιστικές των ΗΠΑ εµφανίζουν αρκετά σηµεία προσέγγισης, σε ότι αφορά τον γενικό τρόπο ζωής, τις διατροφικές συνήθειες και τους αρκετά οµοιάζοντες περιβαλλοντικούς παράγοντες. Η απλή ανάγνωση των αριθµών αναδεικνύει εύκολα ένα πρώτο δυσµενές συµπέρασµα. Παρά την πάροδο σχεδόν µιας δεκαετίας, ο αριθµός των ετήσια καταγραφόµενων θανάτων παραµένει ουσιαστικά ο ίδιος. Αν µάλιστα συνυπολογίσουµε το γεγονός ότι το έτος 2002 διαγνώστηκαν νέοι ασθενείς και το 2011 ο αντίστοιχος αριθµός θα φτάσει στους νέους ασθενείς, χωρίς ανάλογη µείωση των θανάτων, σύµφωνα µε τα στοιχεία του Παγκόσµιου Οργανισµού Υγείας (WHO) για τις ΗΠΑ, καταλαβαίνουµε ότι ακόµα η µάχη είναι σε πλήρη εξέλιξη. Είναι γνωστό σε όλους εµάς που συµµετέχουµε σε αυτή τη µάχη, ότι προκειµένου τα αποτελέσµατα της εφαρµογής των διαρκώς εµπλουτιζόµενων γνώσεων να φτάσουν στα βέλτιστα επίπεδα, θα υπάρχουν πάντοτε δύο σταθερές και µη υποκαθιστούµενες παράµετροι. Η χειρουργική εξαίρεση και η ιστοπαθολογική εκτίµηση. Μετά απο µία σωστή χειρουργική εξαίρεση και µία επίσης σωστή και επαρκή ιστοπαθολογική εκτίµηση µπορούµε να περάσουµε στις επόµενες µεθόδους και τεχνικές αντιµετώπισης. Σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν η µορφολογική εκτίµηση της συνοµιλίας crosstalk των µεταγραφικών παραγόντων PPARγ και ΑΡ1 στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου, η δηµιουργία ενός µοντέλου που να εξηγεί την υπερέκφραση της COX-2 στα αδενοκαρκινώµατα του παχέος εντέρου µε εµπλεκόµενους τους ανωτέρω µεταγραφικούς παράγοντες και οι τυχόν κλινικές εφαρµογές που θα µπορούσαν να προκύψουν από τα αποτελέσµατα της εκτίµησης των παραπάνω. 9

10 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 10

11 1. ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΚΑΙ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΠΑΧΕΟΣ ΕΝΤΕΡΟΥ 1.1 Στοιχεία Ανατοµίας Το παχύ έντερο και το ορθό αποτελούν το τελικό τµήµα του γαστρεντερικού σωλήνα. Το µήκος του παχέος εντέρου φθάνει τα 130cm ενώ το µήκος του ορθού φθάνει τα 15 έως 20cm. Τα επιµέρους τµήµατα του παχέος εντέρου είναι τα ακόλουθα: Τυφλό Ανιόν Εγκάρσιο Κατιόν Σιγµοειδές. Το παχύ έντερο αρχίζει από την θέση της ειλεοτυφλικής βαλβίδας συνεχίζοντας µε το τυφλό. Σε σχετικά µικρή απόσταση από την ειλεοτυφλική βαλβίδα βρίσκεται συνήθως η σκωληκοειδής απόφυση. Στην συνέχεια υπάρχει το ανιόν κόλον το οποίο πορεύεται δεξιά προς τα άνω µέχρι το ήπαρ όπου σχηµατίζει τη δεξιά κολική (ηπατική καµπή). Ακολουθεί το εγκάρσιο κόλον το οποίο πορεύεται τοξοειδώς προς τα αριστερά µέχρι το αριστερό άνω τµήµα της κοιλίας όπου κατά τον πόλο του σπλήνα σχηµατίζει την αριστερή κολική καµπή (σπληνική καµπή) όπου και µεταπίπτει στο κατιόν κόλον. Το κατιόν κόλον πορεύεται προς τα κάτω και πίσω κατά µήκος του αριστερού πλαγίου της κοιλιακής χώρας. Η πρόσφυση του αριστερού κολικού συνδέσµου (φρενοκολικός σύνδεσµος) αποτελεί το έδαφος του χώρου που κατασκηνώνει ο σπλήνας. Το κατιόν κόλον µεταπίπτει στο σιγµοειδές κόλον το οποίο αρχικά πορεύεται στον αριστερό λαγόνιο βόθρο και µετά εισέρχεται στην ελάσσονα πύελο σχηµατίζοντας αγκύλη σχήµατος S. Στο ύψος του 2 ου -3 ου ιερού σπονδύλου µεταπίπτει στο ορθό ή απευθυσµένο το οποίο καταλήγει στον πρωκτό. Το ορθό αρχικά ακολουθεί το κοίλο σχήµα του ιερού οστού (ιερή καµπή) και µετά, στο ύψος του κόκκυγα στρέφεται προς τα πίσω και περνάει διαµέσου του πυελικού εδάφους (περινεϊκή καµπή). Η ιερή καµπή καλύπτεται εν µέρει από µπροστά µε περιτόναιο (ευθυκυστικό ή ευθυµητρικό κόλπωµα) ενώ η περινεϊκή καµπή βρίσκεται εξωπεριτοναϊκά. Το άνω τριτηµόριο του ορθού είναι πιο διευρυσµένο και αποτελεί την λήκυθο. Κάτω από την λήκυθο στο εσωτερικό του ορθού υπάρχουν τρεις σταθερές εγκάρσιες πτυχές, η άνω, η µέση και η κάτω από τις οποίες η άνω και η κάτω είναι µικρότερες και βρίσκονται αριστερά, ενώ η µέση είναι µεγαλύτερη, βρίσκεται δεξιά και λέγεται πτυχή ή βαλβίδα του Kohlrausch. Η απόστασή της από τον πρωκτό είναι 5-8 cm 11

12 Με τη σύσπαση της κυκλοτερούς µυϊκής στιβάδας οι πτυχές συµπλησιάζουν, ενώ µε την σύσπαση της επιµήκους µυϊκής στιβάδας αποµακρύνονται. Εικόνα 1: Ανατοµία Παχέος Εντέρου.Μετά το ορθό βρίσκεται ο πρωκτικός σωλήνας. Ο βλεννογόνος του παχέος εντέρου φτάνει µέχρι το άνω τριτηµόριο του πρωκτικού σωλήνα ενώ τα δύο κατώτερα τριτηµόρια του πρωκτικού σωλήνα καλύπτονται από λεπτό κερατινοποιηµένο δέρµα, µε πλούσια αισθητική νεύρωση που συνεχίζεται µε το υπόλοιπο δέρµα της γύρω περιοχής, το οποίο έχει κερατινοποιηµένη επιδερµίδα, µε τρίχες, ιδρωτοποιούς και σµηγµατογόνους αδένες. Ο πρωκτικός σωλήνας κλείνει µε λείες µυϊκές ίνες, τον έσω σφιγκτήρα του πρωκτού και µε γραµµωτές µυϊκές ίνες, τον έξω σφιγκτήρα του πρωκτού. Πάνω και έξω από τον έξω και έσω σφιγκτήρα φέρεται ο ηβοορθικός µυς που αποτελεί µοίρα του ανελκτήρα του πρωκτού µυ. Αποτελεί το σηµαντικότερο µυ του σφιγκτηριακού µηχανισµού σύγκλεισης του πρωκτού, γιατί σχηµατίζει αγκύλη πίσω και γύρω από την ορθοπρωκτική συµβολή και έλκει την περινεϊκή καµπή προς τα εµπρός. 12

13 Χαρακτηριστικό του παχέος εντέρου είναι ότι οι µυϊκές ίνες της έξω επιµήκους στιβάδας έχουν περιορισθεί σε τρεις επιµήκεις ταινίες, πλάτους 1 εκατοστού, τις κολικές ταινίες. Η ελεύθερη ταινία πορεύεται στην πρόσθια επιφάνεια, η επιπλοϊκή ταινία πορεύεται πίσω και έξω και στο εγκάρσιο κόλον αντιστοιχεί στην πρόσφυση του µείζονος επιπλόου (γαστροκολικός σύνδεσµος). Η µεσοκολική ταινία πορεύεται πίσω και έσω και στο εγκάρσιο κόλον αντιστοιχεί στην πρόσφυση του εγκάρσιου µεσόκολου. Το παχύ έντερο παρουσιάζει επίσης τα εκκολπώµατα, που χωρίζονται µεταξύ τους µε κυκλοτερείς περισφίξεις, οι οποίες προβάλλουν στο εσωτερικό και σχηµατίζουν τις µηνοειδείς πτυχές. Το ανιόν και κατιόν κόλον βρίσκονται οπισθοπεριτοναϊκά γιατί καλύπτονται από περιτόναιο µόνο από µπροστά και από τα πλάγια. Το τυφλό τις πιο πολλές φορές περιβάλλεται εξολοκλήρου από περιτόναιο και εφάπτεται στο οπίσθιο κοιλιακό τοίχωµα. Η σκωληκοειδής απόφυση, το εγκάρσιο κόλον και το σιγµοειδές κόλον βρίσκονται µέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα, περιβαλλόµενα από περιτόναιο που ονοµάζεται αντίστοιχα µεσεντερίδιο της σκωληκοειδούς, εγκάρσιο µεσόκολο και µεσοσιγµοειδές. Αιµάτωση Νεύρωση Λεµφική παροχέτευση Η νήστιδα, ο ειλεός και το παχύ έντερο µέχρι την άνω µοίρα του ορθού αιµατώνονται αποκλειστικά από τους κλάδους της άνω και κάτω µεσεντέριας αρτηρίας. Το όριο αιµάτωσης µεταξύ άνω και κάτω µεσεντέριας αρτηρίας αντιστοιχεί στην περιοχή του αριστερού τµήµατος του εγκαρσίου κόλου και της κολικής καµπής. Κλάδοι της άνω µεσεντέριας αρτηρίας: 1. Ειλεοκολική αρτηρία που χορηγεί κλάδους στο τυφλό και στην αρχή του ανιόντος. 2. Αρτηρία της σκωληκοειδούς. 3. εξιά κολική που χορηγεί κλάδους στο ανιόν κόλον. 4. Μέση κολική που χορηγεί κλάδους ως τα 2/3 του εγκαρσίου κόλου. Αναστοµώνεται µε την αριστερή κολική (κλάδος της κάτω µεσεντέριας αρτηρίας). 13

14 Κλάδοι της κάτω µεσεντέριας αρτηρίας: 1. Αριστερή κολική (ανιών και κατιών κλάδος) 2. Σιγµοειδικές αρτηρίες 3. Άνω αιµορροιδική ή ορθική αρτηρία. Αυτή η αρτηρία αναστοµώνεται µε τις µέσες και κάτω αιµορροιδικές αρτηρίες που είναι κλάδοι των έσω λαγόνιων αρτηριών. Οι αρτηρίες αυτές αιµατώνουν το ορθό. Οι φλέβες από τις περιοχές που διανέµονται οι άνω και οι κάτω µεσεντέριες αρτηρίες εκβάλλουν σε αντίστοιχες φλέβες του πυλαίου φλεβικού συστήµατος. Οι φλέβες του µέσου και κάτω τµήµατος του ορθού (µέσες και κάτω αιµορροιδικές) εκβάλλουν στην έσω λαγόνια φλέβα και από εκεί στην κάτω κοίλη φλέβα. Η λεµφική παροχέτευση ακολουθεί γενικά την πορεία των αντίστοιχων αγγείων. Το παχύ έντερο λαµβάνει παρασυµπαθητική νεύρωση (χαλάρωση σφιγκτήρων, αύξηση κινητικότητας και εκκρίσεων) από το πνευµονογαστρικό νεύρο έως την αριστερή κολική καµπή και από τα ιερά παρασυµπαθητικά νεύρα από εκεί και κάτω. Η συµπαθητική νεύρωση (ελάττωση κινητικότητας, σύσπαση σφιγκτήρων) προέρχεται από το κοιλιακό και τα άνω και κάτω µεσεντέρια πλέγµατα.(εικόνα 2) Εικόνα2: Γαγγλιακά κύτταρα χρώση ΗΕ Χ

15 1.2 Στοιχεία Ιστολογίας Εικόνα3: Ιστολογία φυσιολογικού παχέος εντέρου - Αρχιτεκτονική κρυπτών (αιµατοξυλίνη ηωσίνη) Το τοίχωµα του παχέος εντέρου όπως και του υπολοίπου γαστρεντερικού σωλήνα αποτελείται από τέσσερις χιτώνες: Εικόνα 4: Οι στιβάδες του τοιχώµατος του εντέρου 15

16 Επιθήλιο 1. Βλεννογόνος Ινοσυνδετικό Στρώµα ( Lamina propria ) Βλεννογόνια µυϊκή στιβάδα 2. Υποβλεννογόνιος χαλαρός συνδετικός ιστός 3. Μυϊκός χιτώνας Έσω στιβάδα κυκλοτερώς διατασσοµένων λείων µυϊκών ινών Έξω στιβάδα επιµήκως διατασσοµένων λείων µυϊκών ινών 4. Ορογόνος χιτώνας όπου το όργανο περιβάλλεται µε περιτόναιο ή ινώδης χιτώνας από χαλαρό συνδετικό ιστό όταν το όργανο ή µέρος του βρίσκεται οπισθοπεριτοναϊκά Βλεννογόνος Επιφανειακό επιθήλιο Το επιθήλιο του παχέος εντέρου είναι ένα απλό κυλινδρικό ή κυβικό επιθήλιο το οποίο λειτουργεί ως προστατευτική ασπίδα µεταξύ του εσωτερικού και του αυλού. Αποτελείται από απορροφητικά και καλυκοειδή κύτταρα. Και οι δύο κυτταρικοί τύποι είναι πολικοί και επικάθονται πάνω στην βασική µεµβράνη. Τα απορροφητικά κύτταρα είναι υπεύθυνα για την µεταφορά ύδατος και ηλεκτρολυτών. Στο ενδοαυλικό τµήµα τους παρουσιάζουν ψυκτροειδή παρυφή λόγω της παρουσίας των µικρολαχνών. Το κυτταρόπλασµα των ώριµων επιφανειακών απορροφητικών κυττάρων είναι ηωσινόφιλο και δεν περιέχει βλέννη. Οι πυρήνες είναι ωοειδείς, στην βάση του κυττάρου και µε τους µεγάλους άξονες τους παράλληλα µε τους µεγάλους άξονες των κυττάρων. Συχνά περιέχουν πυρήνια. Τα καλυκοειδή κύτταρα συνθέτουν, αποθηκεύουν και εκκρίνουν κοκκία βλέννης. Το κυτταρόπλασµα τους είναι γεµάτο κοκκία βλέννης. Οι πυρήνες τους βρίσκονται στην βασική επιφάνεια και συνήθως βάφονται πιο πυκνά µε αιµατοξυλίνη σε σχέση µε τους πυρήνες των απορροφητικών κυττάρων και γι αυτό δεν διακρίνονται πυρήνια. 16

17 Εικόνα 5: Στην εικόνα αυτή φαίνονται καλυκοειδή κύτταρα στις κρύπτες που παράγουν βλέννη (χρώση βλέννης Alcian Blue ) Λεµφοκύτταρα και περιστασιακά ηωσινόφιλα µπορεί φυσιολογικά να βρίσκονται µεταξύ των επιφανειακών επιθηλιακών κυττάρων, όπως και αποπτωτικά σωµάτια τα οποία περιέχουν κυτταρικά και πυρηνικά υπολείµµατα. Χρειάζεται προσοχή να µην παρερµηνευθούν τα αποπτωτικά κύτταρα ως ουδετερόφιλα τα οποία δεν βρίσκονται φυσιολογικά στο επιθήλιο του κόλου. Μια λεπτή βασική µεµβράνη η οποία αποτελείται από κολλαγόνο και άλλες πρωτείνες υποστηρίζει το επιθήλιο. Η δοµή αυτή είναι διαπερατή σε απορροφηθέντα ή εκκριθέντα ιόντα, πρωτείνες και νερό και επιπλέον επιτρέπει την µετανάστευση λεµφοκυττάρων του χορίου προς την επιθηλιακή επιφάνεια. 17

18 Επιθήλιο των κρυπτών (αδένων Lieberkuhn) Το απλό κυλινδρικό επιθήλιο το οποίο καλύπτει τις κρύπτες του παχέος εντέρου αποτελείται από ένα πολύ ετερογενή πληθυσµό κυττάρων. Σε αντίθεση µε τα ώριµα απορροφητικά και καλυκοειδή κύτταρα, ανώριµα και αδιαφοροποίητα πρώιµα κύτταρα καθώς και εξειδικευµένα νευροενδοκρινικά κύτταρα βρίσκονται στις κρύπτες. Τα απορροφητικά κύτταρα και καλυκοειδή κύτταρα έχουν δοµές παρόµοιες µε αυτές του επιφανειακού επιθηλίου, αλλά τα λιγότερο ώριµα, λιγότερο διαφοροποιηµένα που βρίσκονται βαθύτερα στις κρύπτες είναι πιο κυβοειδή από τα επιφανειακά κυλινδρικά. Τα λιγότερο διαφοροποιηµένα κύτταρα περιέχουν ελάχιστη ή καθόλου βλέννη. Τα νευροενδοκρινικά κύτταρα παρουσιάζουν συνήθως πολικότητα αντίθετη µε αυτή των πολυάριθµων απορροφητικών και καλυκοειδών κυττάρων. Το κυτταρόπλασµα το οποίο είναι γεµάτο κοκκία βρίσκεται κάτω από τον πυρήνα προς τη βάση. Τα ηωσινόφιλα κοκκία τα οποία χαρακτηρίζουν τα νευροενδοκρινικά κύτταρα είναι µικρότερα σε µέγεθος από τα κοκκία των κυττάρων Paneth, µικρός αριθµός των οποίων µπορεί να βρεθεί στο τυφλό και στο ανιόν κόλον και βρίσκονται µεταξύ πυρήνα και βάσης του κυττάρου ενώ στα κύτταρα Paneth τα κοκκία βρίσκονται στην κορυφαία (προς τον αυλό) επιφάνεια του κυττάρου. Τα κοκκία των κυττάρων αυτών περιέχουν διάφορες ορµόνες (5 hydroxytryptamine, substance P, leuenkephalin, and somatostatin). Υπάρχουν δύο κατηγορίες νευροενδοκρινικών κυττάρων. Αυτά των οποίων η κορυφή έρχεται σε επαφή µε τον αυλό του οργάνου (ανοικτή κατηγορία) και αυτά των οποίων η κορυφή καλύπτεται από άλλα επιθηλιακά κύτταρα (κλειστή κατηγορία). Τα περισσότερα από τα νευροενδοκρινικά κύτταρα είναι αργυρόφιλα ενώ λίγα είναι αργενταφινικά. Πάντως ο αριθµός των νευροενδοκρινικών κυττάρων του παχέος εντέρου είναι σηµαντικά µειωµένος σε σχέση µε το λεπτό έντερο (εικόνα 6). 18

19 Εικόνα 6: Nευροενδοκρινικά Κύτταρα Κρυπτών Ανοσοϊστοχηµική χρώση, Chromogranin A Στην Εικόνα 6 διακρίνονται µε ανοσοϊστοχηµική χρώση τα νευροενδοκρινικά κύτταρα των κρυπτών. Έχει χρησιµοποιηθεί αντίσωµα έναντι Chromogranin A ενός πεπτιδίου που βρίσκεται στα κοκκία των νευροενδοκρινικών κυττάρων. Όπως βλέπουµε είναι πολύ λίγα αυτά τα κύτταρα στις κρύπτες. 19

20 Εικόνα 7: Κατηγορίες Νευροενδοκρινικών Κυττάρων Τα κύτταρα Paneth είναι εκκριτικά κύτταρα των οποίων η ακριβής λειτουργία δεν έχει διευκρινιστεί µε βεβαιότητα. Είναι πυραµιδικά κύτταρα και παρουσιάζουν την ίδια πολικότητα βάσης και κορυφής-αυλού όπως τα απορροφητικά και τα καλυκοειδή κύτταρα. Το χαρακτηριστικό τους είναι τα µεγάλα ηωσινόφιλα εκκριτικά τους κοκκία τα µεγαλύτερα σε όλο το επιθήλιο του γαστρεντερικού συστήµατος. Τα κοκκία τους περιέχουν λυσοζύµη, επιδερµιδικό αυξητικό παράγοντα και βασικές πρωτεϊνες πλούσιες σε αργινίνη καθώς και γλυκοπρωτεΐνες. Η λυσοζύµη διαθέτει αντιβακτηριακή δραστηριότητα και µπορεί να παίζει ρόλο στον έλεγχο της εντερικής χλωρίδας. Τα κύτταρα Paneth βρίσκονται φυσιολογικά µόνο στο τυφλό και στο εγγύς δεξιό κόλον. Η παρουσία τους σε άλλες περιοχές του παχέος εντέρου καταδεικνύει µεταπλασία, συνήθως ως συνέπεια χρόνιας φλεγµονώδους επεξεργασίας. Μία από τις σπουδαιότερες λειτουργίες των κρυπτών είναι η ανανέωση του επιφανειακού επιθηλίου, τα κύτταρα του οποίου έχουν πεπερασµένο χρόνο ζωής και διαρκώς εκπίπτουν 20

21 στον αυλό ή χάνονται διαµέσου της διεργασίας του προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου γνωστού ως απόπτωση. Η ζώνη πολλαπλασιασµού στη βάση των κρυπτών διακρίνεται από τις µιτώσεις των προγονικών επιθηλιακών κυττάρων τα οποία διατηρούν την ικανότητα τους για κυτταρική διαίρεση. Το βασικό 50% της κρύπτης αποτελεί την ζώνη πολλαπλασιασµού ενώ το 25% αποτελεί τη ζώνη ωρίµανσης. Τα περισσότερα από τα κύτταρα της ζώνης ωρίµανσης έχουν χάσει την ικανότητα πολλαπλασιασµού αλλά συνεχίζουν να διαφοροποιούνται και γίνονται όλο και περισσότερο λειτουργικά ώριµα µέχρι τελικά να εκπέσουν από την επιφάνεια. Τα επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου αντικαθίστανται κάθε 6 ηµέρες από άωρα κύτταρα τα οποία µετατρέπονται είτε σε απορροφητικά, είτε σε καλυκοειδή είτε σε ενδοκρινικά. Τα κύτταρα Paneth αντικαθίστανται πολύ πιο αργά και ζουν περίπου 30 ηµέρες µέχρι να αντικατασταθούν. Χόριο ( ινοσυνδετικό στρώµα lamina propria ) Το χόριο αποτελεί το στρώµα που υποστηρίζει το βλεννογόνο του παχέος εντέρου και εκτείνεται από την υποεπιθηλιακή βασική µεµβράνη µέχρι τη βλεννογόνια µυϊκή στιβάδα. Περιέχει ένα ποικίλο αριθµό κυττάρων ο οποίος βρίσκεται ανάµεσα σε σχετικά αραιές ίνες κολλαγόνου, λείες µυϊκές και νευρικές ίνες. Τα περισσότερα κύτταρα του χορίου είναι υπεύθυνα για τοπικούς ανοσολογικούς µηχανισµούς που εξασφαλίζουν την άµυνα ενάντια σε επιβλαβείς ξενιστές. Τα πλασµατοκύτταρα (Β cells) αποτελούν τον κυρίαρχο πληθυσµό. Αναγνωρίζονται εύκολα από την χαρακτηριστική µορφή της χρωµατίνης που είναι σαν τροχός άµαξας. Τα κύρια πρωτεϊνικά προϊόντα είναι ανοσοσφαιρίνες του τύπου ΙgA, αλλά παράγονται και ανοσοσφαιρίνες IgM, IgG και IgE. Η δράση των ΙgA και IgM γίνεται µε µεταφορά διαµέσου του εντερικού επιθηλίου µέσα στον αυλό του κόλου. Τα πλασµατοκύτταρα στον φυσιολογικό βλεννογόνο του ορθού τείνουν να συγκεντρώνονται στις πιο επιφανειακές περιοχές του χορίου. Τα λεµφοκύτταρα είναι συνήθως παρόντα όχι µόνο στο χόριο αλλά και στο επιθήλιο και στον υποβλεννογόνιο χιτώνα. Οι πυρήνες των λεµφοκυττάρων βάφονται πυκνά και οµοιόµορφα µε αιµατοξυλίνη και συνήθως µόνο µία λεπτή άλως κυτταροπλάσµατος είναι ορατή. Η πλειοψηφία των λεµφοκυττάρων είναι helper/suppressor τα οποία συµµετέχουν σε περίπλοκες ανοσολογικές διεργασίες, ενώ µικρό µόνο ποσοστό είναι killer ή ανήκουν στην κατηγορία των natural killers. Ενδοεπιθηλιακά λεµφοκύτταρα µπορεί να έχουν αµυντική λειτουργία και εύκολα διακρίνονται από τους πυρήνες των απορροφητικών και καλυκοειδών κυττάρων. 21

22 Τα λεµφοκύτταρα µέσα στο χόριο µπορεί να είναι είτε διάχυτα είτε να είναι οργανωµένα σε λεµφοζίδια. Τα λεµφοζίδια µπορεί να περιορίζονται πλήρως είτε στο χόριο είτε µέσα στον υποβλεννογόνιο χαλαρό συνδετικό ιστό, αλλά µπορεί και να εκτείνονται διαµέσου την βλεννογόνιας µυϊκής στιβάδας και να καταλαµβάνουν και τους δύο χώρους. Όταν συµβαίνει αυτό, υπάρχει µία διακοπή της βλεννογόνιας µυϊκής στιβάδας όπου οι κρύπτες µπορεί να επεκτείνονται δηµιουργώντας λεµφαδενικά συµπλέγµατα που µπορεί να µπερδευτούν µε παθολογικές µορφολογίες. Το επιθήλιο που καλύπτει τα λεµφοζίδια διαφέρει από το γειτονικό, στο ότι τα επιθηλιακά κύτταρα είναι πιο κυβοειδή και περιέχουν ανάµεσά τους πάρα πολλά λεµφοκύτταρα. Τα Μ κύτταρα είναι βλεννογόνια εξειδικευµένα επιθηλιακά κύτταρα τα οποία επικαλύπτουν τα λεµφοζίδια. Αυτά τα κύτταρα είναι χαρακτηριστικά για την παρουσία πολυάριθµων καταδύσεων στην κορυφαία τους επιφάνεια και τις εγκολπώσεις του κυτταρικού σώµατος και των πλαγίων επιφανειών τους εξαιτίας ενδοεπιθηλιακών λεµφοκυττάρων. Τα Μ κύτταρα ενδοκυτταρώνουν αντιγόνα και τα µεταφέρουν στα υποκείµενα λεµφικά κύτταρα, απ όπου µπορεί να ξεκινήσει η ανοσολογική απόκριση στα ξένα αντιγόνα. Τα Μ κύτταρα δεν διακρίνονται µε το κοινό µικροσκόπιο. Κύτταρα της µυελοειδούς σειράς τα οποία βρίσκονται φυσιολογικά στο χόριο περιλαµβάνουν ηωσινόφιλα και µαστοκύτταρα. Στο φυσιολογικό κόλον ο αριθµός των ηωσινοφίλων είναι εξαιρετικά ποικίλος αλλά είναι σχετικά σπάνια σε σχέση µε τα πλασµατοκύτταρα και τα Τ λεµφοκύτταρα και βρίσκονται τυχαία διασκορπισµένα µέσα στο χόριο. Τα µαστοκύτταρα ή αλλιώς ιστικά βασεόφιλα, είναι λιγότερα από τα ηωσινόφιλα. Περιστασιακά ανευρίσκονται µαστοκύτταρα και ηωσινόφιλα µέσα στο επιφανειακό επιθήλιο στο φυσιολογικό βλεννογόνο. Παρόλα αυτά ουδετερόφιλα δεν πρέπει να είναι παρόντα στο επιφανειακό επιθήλιο, ούτε στο επιθήλιο των κρυπτών. Ουδετερόφιλα βρίσκονται φυσιολογικά µέσα στον αυλό τριχοειδών του χορίου και σε περιοχές αιµορραγίας λόγω τραύµατος ή βιοψίας. Ινοβλάστες ανευρίσκονται σε δύο διαφορετικές περιοχές. Είτε βρίσκονται τυχαία διασκορπισµένοι µέσα στο χόριο, είτε περιβάλλουν τις κρύπτες στην πιο επιφανειακή περιοχή του χορίου και είναι πολύ στενά προσκολληµένοι στη βασική µεµβράνη δηµιουργώντας έτσι ένα περικρυπτικό ινοβλαστικό περίβληµα. Οι ινοβλάστες παράγουν κολλαγόνο και συµβάλλουν έτσι στην δηµιουργία της βασικής µεµβράνης. Περιέχουν δε 22

23 αρκετό αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο για βιοσύνθεση κολλαγόνου. Με ανοσοϊστοχηµεία (µε τη χρήση του µονοκλωνικού αντισώµατος HHF-35) διαπιστώθηκε η παρουσία µυϊκής ακτίνης στους περικρυπτικούς ινοβλάστες και συνεπώς είναι πιο σωστό να ονοµάζονται περικρυπτικοί µυοϊνοβλάστες. Τα µακροφάγα είναι συχνοί κάτοικοι του χορίου και αποτελούν ιστικά µονοκύτταρα. Τα µακροφάγα είναι σηµαντικά για την επεξεργασία και παρουσίαση του αντιγονικού υλικού σε άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος. Αυτό επιτυγχάνεται εν µέρει µε την ικανότητα του κυττάρου να φαγοκυτταρώνει το αντιγονικό υλικό κάτι που διακρίνεται από τα πολυάριθµα κυτταροπλασµατικά κενοτόπια και λυσοσώµατα. Σε βιοψίες υγιών οργανισµών µπορούν να διακριθούν µακροφάγα περιέχοντα βλέννη προερχόµενη από τα καλυκοειδή κύτταρα που πέρασε διαµέσου της βασικής µεµβράνης στο χόριο. Μεγάλη συγκέντρωση µακροφάγων µέσα στο χόριο είναι παθολογική και µπορεί να αντιπροσωπεύει λοίµωξη από Mycobacterium avium-intracellulare ή διάφορα µεταβολικά νοσήµατα (θησαυρισµώσεις). Σε βιοψίες υγιών ατόµων µπορεί κανείς περιστασιακά να δει πυρηνικά και κυτταρικά υπολείµµατα µέσα στο χόριο ακριβώς κάτω από την βασική µεµβράνη των επιφανειακών επιθηλιακών κυττάρων ή µέσα στο κυτταρόπλασµα µακροφάγων στο άνω τµήµα του χορίου. Αυτά προέρχονται πιθανότατα από αποπτωτικά κύτταρα του επιφανειακού επιθηλίου. Τα υπολείµµατα αυτά διέρχονται διαµέσου της βασικής µεµβράνης µέσα στο χόριο. Νευροενδοκρινικά κύτταρα είναι παρόντα έξω από τη βασική µεµβράνη των κρυπτών στο φυσιολογικό κόλον όπως και στο λεπτό έντερο και στην σκωληκοειδή απόφυση. Αυτά τα κύτταρα αναγνωρίζονται µε ειδικά αντισώµατα ( NSE, Chromogranin A ) και πιθανότατα αποτελούν τα κύτταρα προέλευσης των νευροενδοκρινικών όγκων όπως τα καρκινοειδή. Αγγειακοί σχηµατισµοί µέσα στο χόριο περιορίζονται στα τριχοειδή, τα οποία αναγνωρίζονται εύκολα από τα λεπτά τους τοιχώµατα και τα περιεχόµενα στον αυλό τους ερυθροκύτταρα και ουδετερόφιλα. Τα λεµφαγγεία του βλεννογόνου του κόλου περιορίζονται στην περιοχή ακριβώς επάνω από την βλεννογόνια µυϊκή στιβάδα και δεν βρίσκονται πάνω από αυτή την περιοχή στο άνω τµήµα του χορίου. Παρόλο που τα λεµφαγγεία γενικά φαίνεται να έχουν λεπτότερα τοιχώµατα από τα αιµοφόρα αγγεία και δεν περιέχουν 23

24 ερυθροκύτταρα, η διαφοροποίηση µεταξύ των δύο αυτών δοµών µπορεί να απαιτεί ηλεκτρονική µικροσκοπία ή ανοσοϊστοχηµικές τεχνικές. Βλεννογόνια µυϊκή στιβάδα Μια λεπτή στιβάδα από λείες µυϊκές ίνες, η βλεννογόνια µυϊκή στιβάδα, διαχωρίζει τον βλεννογόνο (επιθήλιο και χόριο) από τον υποβλεννογόνιο χαλαρό συνδετικό ιστό. Μερικά λεία µυϊκά κύτταρα από αυτή τη στιβάδα µπορεί να εκτείνονται προς τα επάνω στο χόριο και µπορεί να είναι πολυάριθµα σε περιοχές που βρίσκονται βλεννογονικές προβολές οι µηνοειδείς πτυχές. Το πάχος της βλεννογόνιας µυϊκής στιβάδας ποικίλλει. Συσπάσεις της µυϊκής στιβάδας προκαλούν αλλαγές της µορφής του βλεννογόνου και αλλάζουν τις φυσιολογικές διεργασίες του επιθηλίου (απορροφητικές, εκκριτικές). Η βλεννογόνια µυϊκή στιβάδα φυσιολογικά διασχίζεται από λεµφαδενικά συµπλέγµατα, αγγειακούς σχηµατισµούς και νευροϊνίδια Υποβλεννογόνιος συνδετικός ιστός Πολλά από τα κυτταρικά στοιχεία του χορίου βρίσκονται και µέσα στον υποβλεννογόνιο χιτώνα (λεµφοκύτταρα, πλασµατοκύτταρα, ινοβλάστες, µακροφάγα). Μερικές όµως δοµές του υποβλεννογόνιου όπως τα λιποκύτταρα δεν ανευρίσκονται στο χόριο. ύο νευρικά πλέγµατα καταλαµβάνουν τον υποβλεννογόνιο. Το πρώτο πλέγµα βρίσκεται ακριβώς κάτω από την βλεννογόνια µυϊκή στιβάδα και είναι γνωστό ως υποβλεννογόνιο πλέγµα του Meissner. Το δεύτερο πλέγµα βρίσκεται στο βάθος του υποβλεννογόνιου χιτώνα ακριβώς πάνω από τον εξωτερικό µυϊκό χιτώνα και είναι γνωστό ως εν τω βάθει υποβλεννογόνιο πλέγµα ή πλέγµα του Henle. Τα κυτταρικά σώµατα των νευρώνων και των γαγγλιονικών κυττάρων έχουν µία χαρακτηριστική εµφάνιση µε στρογγυλούς ή οβάλ πυρήνες που περιέχουν εµφανές πυρήνιο και περιβάλλονται από αρκετό βασεόφιλο κυτταρόπλασµα. Οι νευρώνες δεν υποστηρίζονται µε κολλαγόνο και κύτταρα Schwann όπως στο υπόλοιπο περιφερικό νευρικό σύστηµα αλλά από γλοία που προσοµοιάζει τα αστροκύτταρα του ΚΝΣ. Εκτός από τους νευρώνες και τη γλοία τα πλέγµατα περιέχουν και τα ενδιάµεσα κύτταρα του Cajal που είναι ξεχωριστός κυτταρικός τύπος. Τα κύτταρα αυτά θεωρούνται ως βηµατοδότες που ρυθµίζουν τις συσπάσεις του εντέρου.(εντερικό νευρικό σύστηµα) 24

25 Οι αγγειακοί σχηµατισµοί του υποβλεννογόνιου χιτώνα περιλαµβάνουν αρτηριόλια, φλεβίδια και λεµφαγγεία. Αυτά τα υποβλεννογόνια αγγεία πολύ συχνά φαίνονται µεγάλα και µε πολλές διακλαδώσεις σε φυσιολογικά κατά τα άλλα έντερα, ιδίως όταν το κόλον συσπάται. Φλεβίδια ή τριχοειδή τα οποία δεν περιέχουν ερυθροκύτταρα µπορούν να διακριθούν από τα λεµφαγγεία µε ανοσοιστοχηµεία ή µε ηλεκτρονική µικροσκοπία των ενδοθηλιακών κυττάρων. Τα αιµοφόρα αγγεία και τα λεµφαγγεία δεν περιβάλλονται φυσιολογικά από φλεγµονώδη κύτταρα αλλά µπορεί να περιέχουν ουδετερόφιλα Εξωτερικός µυϊκός χιτώνας - Oρογόνος Ο εξωτερικός µυϊκός χιτώνας του παχέος εντέρου αποτελείται απο µια έσω κυκλοτερή στιβάδα και µία έξω επιµήκη στιβάδα. Ο νευρικός ιστός του µυεντερικού πλέγµατος του Auerbach βρίσκεται µεταξύ των δύο µυϊκών στιβάδων και έχει παρόµοια ιστολογικά χαρακτηριστικά µε το πλέγµα του Meissner. Το πλέγµα του Auerbach περιέχει τους νευρώνες που είναι υπεύθυνοι για την κινητικότητα του εντέρου και για την έκκριση ενζύµων από τα γειτονικά όργανα. Το µικρότερο πλέγµα του Μeissner περιέχει αισθητικά κύτταρα που αλληλεπιδρούν µε τους νευρώνες του µυεντερικού πλέγµατος, και κινητικές ίνες που διεγείρουν την έκκριση ουσιών από τα επιθηλιακά κύτταρα των κρυπτών. Ο εξωτερικός µυϊκός χιτώνας διαπερνάται από αιµοφόρα αγγεία και λεµφαγγεία και υποστηρίζεται από την υπορογόνια ζώνη που το πάχος της ποικίλει. Κάτω από την υπορογόνια ζώνη βρίσκεται ο ορογόνος από µεσοθηλιακά κύτταρα. 25

26 2. Μοριακή Ανατοµική καρκινογένεσης παχέος εντέρου Κατά την παρούσα εργασία µελετήθηκαν 6 µοριακοί παράγοντες-κλειδιά της καρκινογένεσης του παχέος εντέρου, των οποίων ο ρόλος τόσο στα φυσιολογικά όσο και τα παθολογικά κυτταρικά συστήµατα αναλύεται παρακάτω. Πρόκειται για παράγοντες µε θέσεις σε ολόκληρο το δίκτυο σηµατοδότησης που είναι εγκατεστηµένο στο κύτταρο : Πυρηνικός υποδοχέας (PPARγ) Γενικός επαγόµενος µεταγραφικός παράγοντας (c-fos, pc-jun) Συν-ενεργοποιητής µεταγραφικών παραγόντων (CBP) Αναστολέας µεταγραφικού παράγοντα (ΙκΒ-α) Ένζυµο µεταβολισµού (COX-2) Μεµβρανικός υποδοχέας (EGFR) Αν και στη συνέχεια κάθε µόριο περιγράφεται ξεχωριστά ως προς το ρόλο του, είναι αναγκαίο να τονιστεί πως in vivo το σύνολο των παραγόντων δρα µε απόλυτη αλληλοεξάρτηση των επιµέρους παραγόντων καθώς και φυσικά µε εκατοντάδες άλλους πρωταγωνιστές που ενισχύουν ή αναστέλλουν τη λειτουργία του. Μια θεώρηση της γενικότερης συµπεριφοράς του δικτύου θα επιχειρηθεί κατά την Συζήτηση του Ειδικού Μέρους, και στη βάση πλέον των πειραµατικών αποτελεσµάτων της εργασίας. 26

27 2.1 Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ (PPARγ) Δομή και λειτουργία Το ανθρώπινο γονίδιο του PPARγ, εντοπίζεται στο χρωµόσωµα 3p25, εγγύς των γενετικών τόπων για τα γονίδια των πυρηνικών υποδοχέων RARβ(3p24) και TRβ(3p21) (1-5). Περιέχει 9 εξόνια και επεκτείνεται σε τµήµα γονιδιώµατος µεγέθους 100Kb. Στον άνθρωπο έχουν περιγραφεί 3 ισοµορφές mrna, οι γ 1, γ 2, γ 3, οι οποίες προκύπτουν από εναλλακτικό splicing και θέση έναρξης της µεταγραφής.(εικόνα 8) Εικόνα 8: Γονίδιο και ισοµορφές mrna και πρωτείνης του PPARγ Ο PPARγ ακολουθεί τη χαρακτηριστική δοµή των πυρηνικών υποδοχέων και αποτελείται από τις γνωστές λειτουργικές περιοχές (2, 4, 5). H LBD των PPARs περιλαµβάνει εκτός από τις καθιερωµένες 12 α-έλικες και τη β-πτυχωτή επιφάνεια, και µια επιπλέον α-έλικα, την H2`. Η προσθήκη της τελευταίας, σε συνδυασµό µε τριτοταγή µετατόπιση της H2, δηµιουργεί µια κοιλότητα για το πρόσδεµα, πολύ µεγαλύτερης χωρητικότητας σε σύγκριση µε άλλους υποδοχείς. Η δοµική αυτή ιδιαιτερότητα, πιθανόν να εξηγεί την ιδιότητα του PPARγ να ενεργοποιείται από ευρύ φάσµα προσδεµάτων, όπως αυτό των Peroxisome Proliferators. Η έλικα H12, που αποτελεί τον κορµό της AF-2 λειτουργικής περιοχής, υπεύθυνης για τη µεταγραφική ενεργοποίηση, µετά τη σύνδεση κάποιου αγωνιστή στον υποδοχέα αλλάζει θέση, ώστε να σχηµατιστεί η ειδική επιφάνεια που θα αλληλεπιδράσει µε το Nuclear Receptor-box κάποιου συν-ενεργοποιητή. Όσο αφορά την AF-1 περιοχή, που επάγει τη 27

28 µεταγραφή ανεξάρτητα από τη σύνδεση προσδέµατος, η αποτελεσµατικότητα της είναι 5-10 φορές µεγαλύτερη στην ισοµορφή PPARγ 2, η οποία περιέχει 28 επιπλέον αµινοξέα στο N- τελικό άκρο της, σε σχέση µε την PPARγ 1.(εικόνα 9) Έχει παρατηρηθεί πως φωσφορυλίωση του υποδοχέα στη Σερίνη 114 της A/B περιοχής, από την ενεργοποίηση των MAP κινασών εξαιτίας κάποιου εξωκυττάριου ερεθίσµατος, καταστέλλει τη δράση του. Φαίνεται πως η παραπάνω περιοχή επιδρά στη διαµόρφωση της LBD του µη κατειληµµένου υποδοχέα, τροποποιώντας την ικανότητά της να δεσµεύει το πρόσδεµα. Εποµένως φωσφορυλίωση σε µια τέτοια θέση, πιθανόν να εκδηλώνει την ανασταλτική της δράση µέσω µείωσης της συγγένειας του PPARγ προς το πρόσδεµα. Εικόνα 9: Κρυσταλλογραφική δοµή του τεταρτοταγούς συµπλόκου hpparγ LBD οµοδιµερές/ ροζιγκλιταζόνη/ συν-ενεργοποιητής. Ένα LBD µονοµερές είναι πράσινο και το άλλο κίτρινο. Οι έλικες απεικονίζονται ως κύλινδροι και οι β-πτυχώσεις ως βέλη. Η ροζιγκλιταζόνη (πρόσδεµα) έχει µπλε χρώµα και ο συν-ενεργοποιητής φαίνεται ως κόκκινη κορδέλα. Μόνο τα Nuclear Receptor-boxes (συντηρηµένα LXXLL µοτίβα) φαίνονται εδώ. Κάθε Nuclear Receptor-box σχηµατίζει µια έλικα που προσαρµόζεται στην υδρόφοβη σχισµή της LBD επιφάνειας η οποία αποτελείται από τo C-τελικό άκρο της H3, την αγκύλη Η3-Η4, τις H4 και H12. 28

29 Αν και έχουν αναγνωριστεί κάποιοι παράγοντες φυσικής προέλευσης µε ικανότητα ενεργοποίησης του PPARγ, η ταυτότητα του πραγµατικού φυσικού προσδέµατος αποτελεί ακόµα µυστήριο. Έχει βρεθεί πως πολυακόρεστα λιπαρά οξέα µακράς αλυσίδας ενεργοποιούν τον PPARγ σε συγκεντρώσεις παρόµοιες µε εκείνες που παρατηρούνται στο ανθρώπινο πλάσµα. Η συγκέντρωσή τους όµως στον πυρήνα του κυττάρου είναι άγνωστη. Το ίδιο συµβαίνει και µε κάποιους µεταβολίτες της προσταγλανδίνης PGD 2. Από τους τελευταίους υψηλότερη συγγένεια προς τον υποδοχέα παρουσιάζει η 15-δεόξυ- PGJ 2 (15-d-PGJ 2 ), η οποία µάλιστα έχει εκδηλώσει αντινεοπλασµατική και αντιφλεγµονώδη δράση. ιαπιστώθηκε ακόµα, πως διέγερση µονοκυττάρων µε το C- τελικό τµήµα της α 1 -αντιθρυψίνης, ενεργοποιεί τον PPARγ. ιάφορα συνθετικά προσδέµατα για τον PPARγ έχουν αναπτυχθεί τα τελευταία 7 χρόνια (2-4, 6-8). Γνωστότερα είναι οι θειαζολιδινεδιόνες (TZDs) (9, 10), που χορηγούνται ευρέως ως αντιδιαβητικά φάρµακα εξαιτίας της ικανότητάς τους να αυξάνουν την ευαισθησία στην ινσουλίνη, αλλά και των οποίων ο µοριακός στόχος ήταν αρχικά άγνωστος. Από αυτές, η ροζιγκλιταζόνη (11) είναι ο ισχυρότερος και ο πιο εκλεκτικός αγωνιστής (12-14).(εικόνα 10) Εικόνα 10: Συνθετικά προσδέµατα του PPARγ

30 Ο PPARγ σχηµατίζει ετεροδιµερή σύµπλοκα µε τον υποδοχέα RXR (1, 2, 4, 15). Ο µη κατειληµµένος υποδοχέας συνδέεται µε ένα συν-καταστολέα που δεν επιτρέπει την ενεργοποίηση της µεταγραφής. έσµευση προσδέµατος είτε στον PPARγ είτε στον RXR ή και στους δύο επάγει τη µεταγραφή, µε µεγαλύτερη ένταση στην τελευταία περίπτωση, δηλαδή εκδηλώνεται συνεργιστική δράση. Η σύνδεση του προσδέµατος αφενός σταθεροποιεί τη διαµόρφωση του ετεροδιµερούς, αφετέρου ευνοεί την απελευθέρωση του συν-καταστολέα και επιστράτευση συν-ενεργοποιητών. Το σύµπλοκο PPARγ/RXR αναγνωρίζει ειδικές αλληλουχίες στην 5` πλευρική περιοχή των γονιδίων στόχων, τα PPAR Response Elements (PPREs). Το τυπικό PPRE σχηµατίζεται από την εξαµερή αλληλουχία 5`-AGGNCA-3` δύο φορές, µε ένα νουκλεοτίδιο να µεσολαβεί ανάµεσά τους (DR-1). Το πρότυπο DR-1 είναι απόλυτα ειδικό για το ετεροδιµερές PPAR/RXR και δεν αναγνωρίζεται από σύµπλοκα του RXR µε άλλους πυρηνικούς υποδοχείς. To PPRE αποκτά πολικότητα χάρη σε µια βραχεία αλληλουχία ακριβώς upstream από αυτό, µε συνέπεια το ετεροδιµερές να προσδένεται πάντα µε τον PPARγ προς το 5` άκρο (16).(εικόνα 11) Ο PPARγ, όπως και οι άλλοι πυρηνικοί υποδοχείς, δηµιουργεί αλληλεπιδράσεις πρωτείνης-πρωτείνης µε διάφορους συν-παράγοντες. εν έχουν βρεθεί ειδικοί συνενεργοποιητές ή συν-καταστολείς οι οποίοι να συνδέονται αποκλειστικά µε τον PPARγ. Πέρα από τη µεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων που φέρουν PPREs, ο PPARγ φαίνεται να επεµβαίνει στη δράση άλλων µεταγραφικών παραγόντων, όπως AP-1, STAT και NF-κB. Έχει βρεθεί πως αγωνιστές του PPARγ περιορίζουν την έκφραση της πρωτείνης c-jun, που αποτελεί συστατικό του AP-1 (17). Επιπλέον, η επιστράτευση του συν-ενεργοποιητή CBP/p300 από τον ενεργοποιηµένο PPARγ, ίσως λειτουργεί ανταγωνιστικά στη µεταγραφική διέγερση µέσω AP-1, ο οποίος χρειάζεται τον ίδιο συνπαράγοντα για να εκδηλώσει τη δράση του(30,31). Παρόµοιος ανταγωνισµός για τη δέσµευση του CBP/p300 φαίνεται να επικρατεί και στην περίπτωση των STAT µεταγραφικών παραγόντων. Επίσης, έχει αναφερθεί συµµετοχή του PPARγ στη ρύθµιση της έκφρασης των STAT. Η επιρροή των αγωνιστών του PPARγ στη δράση των παραπάνω µεταγραφικών παραγόντων είναι πιθανό να οφείλεται και σε µηχανισµούς που δεν σχετίζονται µε την ενεργοποίηση του υποδοχέα. Ο NF-κB διατηρείται σε ανενεργή κατάσταση στο κυτταρόπλασµα, συνδεόµενος µε µέλη της οικογένειας ανασταλτικών πρωτεινών IκB. Απαραίτητη προυπόθεση για τη µετατόπισή του στον πυρήνα, όπου θα 30

31 επάγει µεταγραφή γονιδίων, είναι η αποδόµηση των ανασταλτικών πρωτεινών. Έχει διαπιστωθεί πως η τελευταία αναστέλλεται από την ενεργοποίηση του PPARγ (18). Ο PPARγ υπάγεται σε ρύθµιση από άλλα µεταγωγικά µονοπάτια του κυττάρου. Η µείωση στη µεταγραφική ενεργοποίηση ως αποτέλεσµα της φωσφορυλίωσης του υποδοχέα από τις MAP κινάσες αναφέρθηκε παραπάνω (19, 20). Συνεπώς αυξητικοί παράγοντες, όπως EGF, PDGF και TGFβ ελέγχουν τη δράση του PPARγ µέσω ενεργοποίησης της οδού των MAP κινασών (21-24). Έχει παρατηρηθεί φωσφορυλίωση του υποδοχέα από τις κινάσες ERK και JNK, εξηγώντας ίσως την επίδραση των EGF και TNFα αντίστοιχα, στη γονιδιακή έκφραση (25). Εκτός από αυξητικούς παράγοντες, η φωσφορυλίωση ρυθµίζεται και από ινσουλίνη, προαγωγείς των όγκων, καθώς και προσταγλανδίνες (26-28). Εικόνα 11: Εξαρτώµενη από πρόσδεµα κινητοποίηση συν-ενεργοποιητών, από το ετεροδιµερές PPAR/RXR 31

32 Σημασία του PPARγ στην καρκινογένεση Αυτή εξετάστηκε αρχικά στο λιποσάρκωµα, όγκος λιποκυττάρων (29-31). Η έκφραση του PPARγ εδώ είναι πολύ υψηλή, ενώ τα κύτταρα από λιποσάρκωµα δείχνουν µια δραµατική απόκριση διαφοροποίησης στους αγωνιστές του, που περιλαµβάνει ανάκτηση δοµικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών ώριµου λιποκυττάρου, αλλά και διακοπή της αύξησης (29-31). Αν και οι µεταλλάξεις του γονιδίου του δεν έχουν συσχετιστεί επαρκώς µε τους πιο κοινούς συµπαγείς όγκους στον άνθρωπο, υπάρχουν δύο εξαιρέσεις : Σε σποραδικούς καρκίνους του παχέος εντέρου έχουν διαπιστωθεί σηµειακές µεταλλάξεις non-sense, αντικατάστασης αµινοξέος ή αλλαγής πλαισίου (32, 33). Ορισµένα θυλακιώδη καρκινώµατα του θυρεοειδούς χαρακτηρίζονται από χρωµοσωµική µετάθεση, που οδηγεί στη δηµιουργία προϊόντος το οποίο προέρχεται από συγχώνευση του µεταγραφικού παράγοντα PAX-8 και του PPARγ. Η νέα πρωτείνη επικρατεί του φυσιολογικού PPARγ και αποτρέπει την ενεργοποίησή του από πρόσδεµα (34). Υψηλή έκφραση του PPARγ έχει διαπιστωθεί σε αρκετούς όγκους όπως µαστού, πνεύµονα, παχέος εντέρου, προστάτη, ουροδόχου κύστης, στοµάχου, νεφρού και ήπατος (5-8, 29-31, 34-36). Συνήθως, στα καρκινικά κύτταρα τα επίπεδα του υποδοχέα είναι υψηλότερα από τα φυσιολογικά, όπως έχει αναφερθεί για τις περιπτώσεις µαστού, προστάτη, εγκεφάλου, θυρεοειδή αδένα, παγκρέατος, όρχι, ενώ το αντίθετο παρατηρείται στον οισοφάγο και τον πνεύµονα. Μάλιστα για τον τελευταίο, ο βαθµός έκφρασης είναι µεγαλύτερος στα καλά διαφοροποιηµένα καρκινώµατα ενώ η χαµηλή έκφραση συνδέεται µε δυσµενή πρόγνωση. Παρόµοια επίδραση στην πρόγνωση έχει η παρουσία του PPARγ στον καρκίνο οισοφάγου. Η αντινεοπλασµατική δράση των αγωνιστών του υποδοχέα έχει καταγραφεί in vitro σε σειρές κυττάρων από καρκίνο µαστού, πνεύµονα, παχέος εντέρου και όρχεος, όπου οδηγεί σε διαφοροποίηση και εµφάνιση χαρακτηριστικών ωρίµανσης (37-42). Επιπλέον, στους όγκους µαστού, προστάτη, παχέος εντέρου, πνεύµονα, παγκρέατος, ουροδόχου κύστης, στοµάχου, οισοφάγου, νεφρού, σιελογόνων αδένων, καθώς και στο κακόηθες µελάνωµα δέρµατος, αναστέλλεται ο κυτταρικός πολλαπλασιασµός. Σε κακοήθη κύτταρα µαστού, προστάτη, πνεύµονα, παχέος εντέρου (16, 43-48), θυρεοειδή αδένα, ήπατος, στοµάχου, οισοφάγου και χόνδρου επάγεται απόπτωση.(74) 32

33 Η διαφοροποίηση που επάγεται από την ενεργοποίηση του PPARγ αντανακλάται εκτός από τον ωριµότερο και λιγότερο κακοήθη φαινότυπο, και στη µεταγραφική ρύθµιση γονιδίων που εκφράζουν πρωτείνες όψιµων σταδίων κυτταρικής εξέλιξης (49-52). Στον καρκίνο του πνεύµονα, δείκτες που συναντώνται σε πρόδροµες σειρές κυττάρων, ελαττώνονται σηµαντικά ενώ η έκφραση δεικτών τελικής διαφοροποίησης, όπως HT156, ακολουθεί ανοδική πορεία. Οµοίως στο παχύ έντερο, ρυθµίζονται θετικά γονίδια επιθηλιακής ωρίµανσης, όπως GOB-4 και κερατίνη. Η µειωµένη αύξηση των καρκινικών κυττάρων, ως αποτέλεσµα της επίδρασης προσδεµάτων για τον PPARγ, πραγµατοποιείται µέσω ανακοπής του κυτταρικού κύκλου, κυρίως στη φάση G1 (15). Η καταστολή της αύξησης καρκινικών κυττάρων που παρατηρείται µετά από σύνδεση προσδέµατος στον PPARγ, εκτός από την επέµβαση στον κυτταρικό κύκλο, είναι δυνατό να οφείλεται και σε αύξηση της απόπτωσης (53-55). Στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωµα, η τρογλιταζόνη, που ανήκει στις TZDs, επάγει την απόπτωση ενεργοποιώντας την κασπάση-3, ενώ ανάλογο αποτέλεσµα στο θηλώδες καρκίνωµα θυρεοειδούς, συνδέεται πιθανόν µε αυξηµένη έκφραση του ρυθµιστικού παράγοντα c-myc. Επαγωγή της απόπτωσης από τρογλιταζόνη ή 15-d-PGJ 2 σε κύτταρα γαστρικού καρκίνου, ενισχύεται από την επίδραση 9-cis-ρετινοικού οξέος, το οποίο ενεργοποιεί τον RXR (5-8, 30, 34, 35). 2.2 Activator Protein 1 (AP 1) οµή και λειτουργία Το µεγαλύτερο µέρος της τρέχουσας γνώσης γύρω από τους µεταγραφικούς παράγοντες προέρχεται από την ανακάλυψη της πρωτεΐνης AP-1 (56-59). Η δραστηριότητα της τελευταίας ενέχεται τόσο στη βασική όσο και την επαγόµενη έκφραση αρκετών γονιδίων που εµπεριέχουν AP-1 περιοχές (αλληλουχία 5 - TCAG/CTCA-3 ), επίσης γνωστή ως TPA-αποκρινόµενο στοιχείο (TRE). Ο όρος AP-1 συγκεντρωτικά περιγράφει µια οµάδα µορίων δοµικά και λειτουργικά 33

34 σχετιζόµενων µε την οικογένεια πρωτεϊνών Jun (Jun ή c-jun, JunB και JunD) και την οικογένεια πρωτεϊνών Fos (Fos ή c-fos, FosB, Fra-1 και Fra-2).(εικόνα 12) Επιπλέον, κάποια µέλη των υπο-οικογενειών ATF (ATFa, ATF-2, ATF-3) και JDP (JDP-1 και JDP-2), που παρουσιάζουν δοµικές οµοιότητες και σχηµατίζουν ετεροδιµερή σύµπλοκα µε τις AP-1 πρωτεΐνες (κυρίως τις Jun) µπορούν να δεσµευτούν σε TRE οµόλογες περιοχές. Κάθε µία από τις πρωτεΐνες εκφράζεται και ρυθµίζεται διαφορετικά, ώστε σε κάθε κυτταρικό τύπο να δραστηριοποιείται χαρακτηριστικός αριθµός AP-1 διµερών µε διαφορετικές λειτουργικές επιπτώσεις (17, 60, 61). Εικόνα 12: Συνοπτικό λειτουργικό µοτίβο του ΑΡ-1 34

35 Κοινό δοµικό µοτίβο όλων των επιµέρους πρωτεϊνών είναι η συντηρηµένη αλληλουχία bzip, όπου µια βασική DNA-δεσµευτική περιοχή συνδυάζεται µε την αλληλουχία «φερµουάρ» λευκίνης. Η τελευταία είναι υπεύθυνη για το διµερισµό, που προηγείται της σύνδεσης στο DNA, καθώς και για την ειδικότητα και σταθερότητα των διµερών Jun-Fos. Ενώ οι Jun πρωτεΐνες απαντώνται ως όµο- και έτερο- διµερή, οι πρωτεΐνες Fos δεν οµοδιµερίζονται, παρά µόνο σχηµατίζουν ετεροδιµερή µε τις Jun και ενισχύουν τη DNA-δεσµευτική δραστικότητα. Σε αντίθεση µε τη DNAδεσµευτική περιοχή, οι δοµικές ιδιότητες των περιοχών που επάγουν µεταγραφική ενεργοποίηση είναι πολύ λιγότερο µελετηµένες. Οι επιµέρους Jun και Fos πρωτεΐνες έχουν σηµαντικά διαφορετικές δυνατότητες επαγωγής µεταγραφής. Ενώ οι Jun, Fos και FosB έχουν θεωρηθεί ισχυροί ενεργοποιητές, οι JunB, JunD, Fra-1 και Fra-2 εµφανίζουν χαµηλό δυναµικό επαγωγής, ενώ υπό ορισµένες συνθήκες είναι δυνατό να λειτουργούν και ως συν-καταστολείς της µεταγραφής (56, 60, 62). Η δραστηριότητα του AP-1 ρυθµίζεται σε ένα κύτταρο από ένα ευρύ φάσµα φυσιολογικών και παθολογικών ερεθισµάτων, όπως κυτοκίνες, αυξητικοί παράγοντες, λοιµώξεις, και ογκογόνα ή stress σήµατα. Ρύθµιση της «καθαρής» AP-1 δραστικότητας µπορεί να επιτευχθεί µε αλλαγές στη µεταγραφή των γονιδίων που κωδικοποιούν τις AP-1 υποµονάδες, το ρυθµό παραγωγής/κάθαρσης υποµονάδων και αλληλεπιδράσεις µεταξύ του AP-1 και υπολοίπων µεταγραφικών παραγόντων και συν-παραγόντων (63-66). Ο µετα-µεταγραφικός έλεγχος έχει διαλευκανθεί εκτενώς στην περίπτωση µιτογόνων και stress ερεθισµάτων, τα οποία καταλήγουν στην ενεργοποίηση του Jun µέσω της Jun N-terminal Kinase (JNK) (60). Οι JNKs, µέλη των Mitogen Activated Protein kinases (MAPKS), απαντούν σε 3 ισοµορφές (JNK1, JNK2, JNK3) και ύστερα από ενεργοποίησή τους από τον καταράκτη των MAPKs µεταναστεύουν εντός του πυρήνα, όπου φωσφορυλιώνουν την Jun εντός του Ν-τελικού άκρου της περιοχής µεταγραφικής ενεργοποίησης (υπολείµατα Ser63 και Ser73), µε αποτέλεσµα την ισχυρή επαγωγή της και τη διέγερση µεταγραφής. Αντίθετα µε τη Jun, ο µηχανισµός φωσφορυλίωσης-ενεργοποίησης της Fos δεν είναι ξεκάθαρος. Έχουν προταθεί οι Fosrelated Kinase (FRK) και ribosomal S6 kinase (RSK).(206) 35

36 Σηµασία στην καρκινογένεση Η συµµετοχή του AP-1 στην καρκινογένεση θεωρήθηκε πιθανή ύστερα από την ταυτοποίηση των βασικών συστατικών του Jun και Fos ως τα ευκαρυωτικά οµόλογα των ογκοπρωτεϊνών ρετροϊών (v-jun και v-fos), αλλά και τη διαπίστωση πως αυξητικοί παράγοντες και προαγωγείς όγκων (TPA, οκαδαϊκό οξύ, UV ακτινοβολία) διεγείρουν τη δράση του AP-1 (58, 59). Αναστολή της δραστηριότητας του AP-1 σε ποντίκια αναστέλλει την προαγωγή των όγκων. Σε κυτταρικές σειρές, το γεγονός του µετασχηµατισµού σχετίζεται µε υπερ-έκφραση και ενεργοποίηση του AP-1 (61-64, 66). O AP-1 ασκεί έλεγχο στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό τροποποιώντας την έκφραση και λειτουργία κυτταρικών ρυθµιστών όπως κυκλίνη D1, κυκλίνη Α, κυκλίνη Ε, p53, p21 Cip1, p16 Ink4a, p19 ARF. Η παραπάνω δράση του AP-1 φαίνεται να παρουσιάζει ειδικότητα ως προς τον κυτταρικό τύπο.(εικόνα 13) Εικόνα 13: Κινητήρια και κατασταλτική επίδραση των υποµονάδων του AP-1 στον κυτταρικό κύκλο, σε δύο διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους. ιφορούµενη είναι η επίδραση του AP-1 στην κυτταρική επιβίωση, όπου σε ορισµένες περιπτώσεις ο ΑΡ-1 προάγει την απόπτωση και σε άλλες την αποτρέπει. Στην πρώτη κατηγορία ανήκει το παράδειγµα της απόπτωσης επαγόµενης από stress, όπου ο αγωνιστής FasL διεγείρει τον υποδοχέα του Fas µε συνέπεια την διέγερση των MAPKs και την JNK-εξαρτώµενη φωσφορυλίωση της Jun. Προ-αποπτωτικά γονίδια- 36

37 στόχοι της p-jun (φωσφορυλιωµένη µορφή) είναι εκείνα που κωδικοποιούν τους παράγοντες FasL, TNF-α, τα οποία περιέχουν AP-1 ρυθµιζόµενες αλληλουχίες. Σε αντίθεση µε τη Jun, η πρωτείνη Fos καταστέλλει την έκφραση του FasL, οδηγώντας ίσως σε ισορροπία στη συνολική δράση του AP-1. Μια πληθώρα ευρηµάτων προβάλλει τον AP-1 ως ισχυρό παράγοντα επιβίωσης. Τόσο η έκφραση της Fos σε νευρικά κύτταρα, όσο και της Jun σε ηπατοκύτταρα είναι αναγκαία για την αναστολή της απόπτωσης(207). Μάλιστα η δράση της τελευταίας εκδηλώνεται σε συγκεκριµένο στάδιο διαφοροποίησης των κυττάρων. Φαίνεται πως η Jun δρα ανταγωνιστικά προς την p53 πρωτεΐνη, οδηγώντας πιθανόν στην πρώιµη φάση της καρκινογένεσης. Τα επίπεδα ανταγωνισµού είναι πολλαπλά και περιλαµβάνουν µεταγραφική απενεργοποίηση του γονιδίου της p53 εξαρτώµενης από Jun, αλλά και αναστολή της δέσµευσης της p53 σε υποκινητές γονιδίων στόχων, όπως το p21 Cip1. Αξίζει να σηµειωθεί πως η φωσφορυλιωµένη Jun (p-jun), συνεργάζεται µε τον αντι-αποπτωτικό παράγοντα NF-κΒ, για την ενίσχυση της έκφρασης γονιδίων επιβίωσης, όπως το γονίδιο του Αναστολέα Απόπτωσης IAP-2 (58, 59, 62, 64). 2.3 CREB Binding Protein (CBP) οµή και λειτουργία Η CBP και η οµόλογη πρωτεΐνη p300 αρχικά ταυτοποιήθηκαν ως πρωτεΐνες που συνδέονται στους παράγοντες camp-response-element-binding protein (CREB) και E1A αντίστοιχα (67-70). Τα γονίδιά τους έχουν συντηρηθεί σε πληθώρα πολυκύτταρων οργανισµών, από τους έλµινθες ως τον άνθρωπο. Η ανθρώπινη CBP κωδικοποιείται στην χρωµοσωµική περιοχή 16p13.3, που επίσης ενέχεται στο σύνδροµο Rubinstein-Taybi και σε αρκετούς υπότυπους οξείας µυελοειδούς λευχαιµίας (71-73). Η δοµή της CBP είναι οργανωµένη σε περιοχές που αναλαµβάνουν ορισµένη δράση.(εικόνα 14) 1. περιοχή οµόλογη προς τις ακετυλτρανφεράσες των ιστονών (ΗΑΤs) 2. 3 περιοχές πλούσιες σε κυστεΐνη-ιστιδίνη (CH1, CH2, CH3) 37