ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΧΗΜΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΧΗΜΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙΝΟΤΟΜΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΑΣΤΙΓΜΙΝΗΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΓΝΩΣΙΑΚΩΝ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΩΝ ΑΛΕΚΣΑΝΤΕΡ ΤΣΑΝΚΟ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ : ΓΕΡΑΣΙΜΟΣ ΡΑΣΣΙΑΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΑΤΡΑ 2017

2 INTERDEPARTMENTAL PROGRAM OF POSTGRADUATE STUDIES CHEMICAL BIOLOGY MASTER S THESIS SYNTHESIS OF NOVEL DERIVATIVES OF RIVASTIGMINE FOR THE TREATMENT OF COGNITIVE DISORDERS ALEKSANDER CANKO SUPERVISOR: GERASIMOS RASSIAS, ASSISTANT PROFESSOR PATRAS

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΡΑΣΣΙΑΣ ΓΕΡΑΣΙΜΟΣ (Επίκουρος Καθηγητής) ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ 2. ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ ΔΙΟΝΥΣΙΟΣ (Καθηγητής) ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ 3. ΚΥΠΡΑΙΟΣ ΚΥΡΙΑΚΟΣ (Καθηγητής) ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ THREE-MEMBERED COMITTEE 1. RASSIAS GERASIMOS (Assistant Professor) DEPARTMENT OF CHEMISTRY, UNIVERSITY OF PATRAS 2. PAPAIOANNOY DIONISIOS (Professor) DEPARTMENT OF CHEMISTRY, UNIVERSITY OF PATRAS 3. KYPREOS KYRIAKOS (Professor) DEPARTMENT OF MEDICINE, UNIVERSITY OF PATRAS 3

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα αρχικά να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Γ. Ρασσιά για την ευκαιρία που μου έδωσε να εργαστώ στην ερευνητική του ομάδα και σε θέμα οργανικής σύνθεσης. Αυτό τον καιρό έμαθα πολλά και οι γνώσεις που αποκόμισα είναι πολύτιμες και πιστεύω θα με βοηθήσουν στη μετέπειτα πορεία μου. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τους συνεργάτες μου, τους υποψήφιους διδάκτορες Ιωάννα Σαββοπούλου, Βασιλική Ζώγαλη και Χρήστο Τζουμανίκα καθώς και τους μεταδιδακτορικούς ερευνητές Δέσποινα Ταταράκη και Χαράλαμπο Αναστασόπουλο για την πολύτιμη βοήθειά τους καθ όλη τη διάρκεια της εργαστηριακής μου πορείας και για τις χρήσιμες συμβουλές τους, τους μεταπτυχιακούς φοιτητές Χατζηνάκη Μαρία Τερέζα, Γεωργοπούλου Μαρία-Παναγιώτα, Μοσχονά Φωτεινή, Ροκόπουλο Νίκο, Κουράκο Τάσο και Θεοδοσοπούλου Δήμητρα καθώς και τις προπτυχιακές φοιτήτριες Μαρία Τσιτοπούλου, Αθηνά Βαγενά και Άντζυ Καπλανάι για την άριστη συνεργασία που αναπτύξαμε και το ευχάριστο κλίμα που δημιούργησαν μέσα στο εργαστήριο.. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου Δημήτερ και Μπλέρτα και τον αδερφό μου Δημήτρη αλλά και τους φίλους μου Ανδρέα, Μαρία, Βαγγέλη, Ηλία, και Θάνο για την υποστήριξη τους καθ όλη τη διάρκεια των φοιτητικών μου χρόνων. 4

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα Μεταπτυχιακή Διπλωματική Εργασία εκπονήθηκε στον εργαστήριο οργανικής χημείας του Τομέα οργανικής χημείας βιοχημείας και οργανικών προϊόντων του τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών, στο πλαίσιο του Διατμηματικού Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών << Χημική Βιολογία>>. Η Εργασία αυτή πραγματοποιήθηκε υπό την επίβλεψη του επίκουρου καθηγητή οργανικής χημείας Γεράσιμου Ρασσιά καθώς και με την πολύτιμη βοήθεια όλης της εργαστηριακής ομάδας. 5

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η ριβαστιγμίνη έχει ένδειξη στη θεραπεία της νόσου Alzheimer και της άνοιας σε νόσο Parkinson. H ριβαστιγμίνη είναι αναστολέας του ενζύμου ακέτυλο-χολινεστεράση (AChE). Η AChE αποδομεί τη ακέτυλο-χολίνη (ACh) έναν νευροδιαβιβαστή σημαντικό για τις γνωσιακές λειτουργίες που βλάπτονται στη νόσο Alzheimer και την άνοια της νόσου Parkinson. H ριβαστιγμίνη αναστέλλοντας την AChE αυξάνει τη συγκέντρωση της ACh ενισχύοντας έτσι τις γνωστικές λειτουργίες. Πλην της AChΕ, για τη βελτίωση των γνωστικών λειτουργιών έχουν μελετηθεί και άλλοι βιολογικοί στόχοι όπως οι ισταμινικοί υποδοχείς Η3, οι υποδοχείς σεροτονίνης 5-ΗΤ6, οι μουσκαρινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης Μ1, η βήτα σεκρετάση (BACE1), οι νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης α7 καθώς και οι ντοπαμινικοί υποδοχείς D2 Συνδυασμοί αυτών των δράσεων έχουν διερευνηθεί μέσω της σύνθεσης πολυδύναμων υποκαταστατών (Multimodal Ligands) οι οποίοι στοχεύουν εκλεκτικά συγκεκριμένους και λίγους βιολογικούς στόχους παράγοντας συνεργική δράση για την καταπολέμηση μιας νόσου. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η σύνθεση πολυδύναμων παραγώγων της ριβαστιγμίνης που εκτός της δεδομένης ανασταλτικής τους δράσης ως προς την ακετυλοχολινεστεράση θα μπορούν να δρουν και ως ανταγωνιστές ή ως μερικοί αγωνιστές του D2 υποδοχέα της ντοπαμίνης, ώστε να διαλευκανθεί ο ρόλος των υποδοχέων D2 ως προς τη γνωστική λειτουργία. Στην παρούσα εργασία συντέθηκαν 24 πολυδύναμα παράγωγα της ριβαστιγμίνης για τους υποδοχείς D2 και το ένζυμο AChE τα οποία προσεχώς θα αποτιμηθούν βιολογικά σε συνεργαζόμενο εργαστήριο. Λέξεις κλειδιά : Ριβαστιγμίνη,Alzheimer, Parkinson, Ακέτυλο-χολινεστεράση, Υποδοχείς Ντοπαμίνης D2, Πολυδύναμοι προσδέτες (Multimodal Ligands), Γνωστικές διαταραχές, 6

7 ABSTRACT Rivastigmine has an indication in the treatment of Alzheimer's disease and dementia in Parkinson's disease. Rivastigmine is an inhibitor of the enzyme acetylcholinesterase (AChE). AChE degrades acetylcholine (ACh), a neurotransmitter important for cognitive functions that are harmed in Alzheimer's disease and dementia of Parkinson's disease. Rivastigmine by inhibiting AChE increases the concentration of ACh thus enhancing cognitive functions. In addition to AChE, other biological targets such as histamine H3 receptors, serotonin 5-HT6 receptors, muscarinic acetylcholine M1 receptors, beta secretase (BACE1), acetylcholine α7 nicotinic receptors and other dopamine D2 receptors. Combinations of these actions have been investigated through the synthesis of multimodal ligands which selectively target specific and few biological targets producing synergistic action to combat a disease. The aim of this diploma thesis is to synthesize polyvalent derivatives of rivastigmine which, in addition to their given acetylcholinesterase inhibitory activity, can act as both antagonists or partial dopamine D2 receptor agonists to elucidate the role of D2 receptors cognitive function. In the present study, 24 multimodal derivatives of rivastigmine for D2 receptors and AChE enzyme were synthesized, which will soon be biologically evaluated in a collaborating laboratory. Keywords: Rivastigmin, Alzheimer, Parkinson, Acetylcholinesterase (AChE), Dopamine Receptors D2, Multimodal Ligands, Cognitive Disorders 7

8 8

9 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΝΣ DSM-5 PD AD Κεντρικό Νευρικό Σύστημα Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition Parkinson's disease Alzheimer's disease Η3 r Histamine receptors 3 5-ΗΤ6r 5-Hydroxytryptamine receptor 6 Μ1r Muscarinic acetylcholine receptor 1 α7r AChE ADHD IC50 EC50 Κi Alpha-7 nicotinic receptor Acetylcholinesterase Attention deficit hyperactivity disorder Ιnhibitory Concentration Effective Concentration Συγγένεια δέσμευσης του αναστολέα BACE1 Beta-secretase 1 D2r Dopamine receptor 2 ΕΕ ΗΠΑ GPCRs Gs Ευρωπαϊκή Ένωση Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής G protein coupled receptors Stimulative regulative G-protein 5-ΗΤr 7TMr 5-Hydroxytryptamine receptor Seven-transmembrane domain receptors 9

10 MAChRs G q/11 ή G q G i/o ή G i / G o camp ΑΡΡ ACh ΠΝΣ IP3 BChE USD FDA F t 1/2 NMDAr GDP GTP ΡΚΑ AC Muscarinic acetylcholine receptors Heterotrimeric G protein G i alpha subunit Cyclic adenosine monophosphate Amyloid precursor protein Acetylcholine Περιφερικό νευρικό σύστημα Inositol trisphosphate Butyrylcholinesterase United States Dollar Food and Drug Administration Βιοδιαθεσιμότητα ενός φαρμάκου Χρόνος ημίσειας ζωής N-methyl-D-aspartate receptor Guanosine diphosphate Guanosine triphosphate Protein kinase A Adenylyl cyclase PLC Phospholipase C LTP Long-term potentiation 10

11 MTDLs MMT Multitarget-Directed Ligands Multiple-medication therapy MCM Multiple-compound medication ADMET ΜΑΟ-Β MCI STAB Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion Monoamine oxidase B Mild cognitive impairment Sodium triacetoxyborohydride HPLC High performance liquid chromatography NMR MS DMSO DCM THF TFA Eq MeCN MeOH DCE Et 3 SiH Nuclear Magnetic Resonance Mass spectrometry Dimethyl sulfoxide Dicloromethane Tetrahydrofuran Trifluoroacetic acid Equivalent Acetonitrile Methanol 1,2-Dichloroethene Triethylsilane 11

12 InCl 3 NaH DMF EtOAc Indium (III) chloride Sodium hydride Dimethylformamide Ethyl acetate PEMB 5-Ethyl-2-methylpyridine borane complex DMAP Et 3 N NMP PPTS TsCl DMAC Pd XPhos G3 MeB(OH) 2 CHCl 3 4-Dimethylaminopyridine Triethylamine N-Methyl-2-pyrrolidone Pyridinium p-toluenesulfonate Toluenesulfonyl chloride Dimethylacetamide (2-Dicyclohexylphosphino-2,4,6 - triisopropyl-1,1 -biphenyl)[2-(2 -amino- 1,1 -biphenyl)]palladium(ii) methanesulfonate Methaneboronic acid Chloroform 12

13 13

14 ΠΊΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΈΝΩΝ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...6 ABSTRACT...7 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ...9 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1 ΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ Α.2.1 ΝΟΣΟΣ ΑΛΤΣΧΑΙΜΕΡ A.3 ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΣΤΟΧΟΙ-ΥΠΟΘΕΣΕΙΣ ΓΙΑ ΓΝΩΣΙΑΚΕΣ ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ Α.3.1 ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΙΣΤΑΜΙΝΗΣ Η Α.3.2 ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΣΕΡΟΤΟΝΙΝΗΣ 5-ΗΤ Α.3.3 ΜΟΥΣΚΑΡΙΝΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ Μ Α.3.4 ΒΗΤΑ ΣΕΚΡΕΤΑΣΗ (BACE1) Α.3.5 ΑΛΦΑ-7 ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ (α7) Α.3.6 ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΕΣΤΕΡΑΣΗ Α.4 ΕΓΚΕΚΡΙΜΕΝΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΤΑΠΟΛΕΜΗΣΗΣ ΤΩΝ ΓΝΩΣΙΑΚΩΝ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΩΝ ΤΗΣ ΑD Α.5 ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΟΙ ΠΡΟΣΔΕΤΕΣ (MTDLs) ΓΙΑ ΓΝΩΣΤΙΚΈΣ ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ A.6 ΝΤΟΠΑΜΙΝΗ, ΑΝΤΙΨΥΧΩΣΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΓΝΩΣΤΙΚΗ ΕΚΠΤΩΣΗ Α.7 ΣΚΟΠΟΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Β. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Β.1 ΑΝΤΙΘΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Β.2 ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΙΠΕΡΑΖΙΝΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ Β.3 ΣΥΝΘΕΣΗ N-ΜΕΘΥΛΟ-Ν-ΑΙΘΥΛΟ-ΚΑΡΒΑΜΟΫΛΟ ΒΕΝΖΑΛΔΕΫΔΩΝ ΚΑΙ ΑΚΕΤΟΦΑΙΝΟΝΩΝ Β.4 ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΑΣΤΙΓΜΙΝΗΣ ΜΕΣΩ ΑΝΑΓΩΓΙΚΗΣ ΑΛΚΥΛΙΩΣΗΣ ΠΙΠΕΡΑΖΙΝΩΝ/ΠΙΠΕΡΙΔΙΝΩΝ ΜΕ ΥΠΟΚΑΤΕΣΤΗΜΕΝΕΣ ΒΕΝΖΑΛΔΕΫΔΕΣ Β.5 ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΑΣΤΙΓΜΙΝΗΣ ΠΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ ΑΠΟ ΚΕΤΟΝΕΣ

15 B.6 ΠΡΟΣΠΑΘΕΙΑ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΑΣΤΙΓΜΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗΝ D2 ΦΑΡΜΑΚΟΦΟΡΟ ΔΟΜΗ της 4-άμινο- π-φθόροβουτυροφαινόνης Β.7 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Γ.1 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΟΡΓΑΝΑ Γ.2 ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ ΜΟΡΙΩΝ-ΣΤΟΧΩΝ Γ.3 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΝΜR Γ.4 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ MS Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

16 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1 ΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ Οι γνωστικές λειτουργίες είναι η μάθηση, η μνήμη, η αντίληψη, η συγκέντρωση, η στόχοκατευθυνόμενη δραστηριότητα και η ικανότητα σχεδιασμού και επίλυσης προβλημάτων. Οι βλάβες αυτών των λειτουργιών δηλαδή οι γνωστικές διαταραχές, προκαλούν όπως είναι φυσικό σοβαρή έκπτωση της λειτουργικότητας του ατόμου, της αλληλεπίδρασης του με άλλους ανθρώπους και της ικανότητας για αυτοφροντίδα για αυτό το λόγο είναι απαραίτητη η θεραπευτική αγωγή. 27 Γνωστικές διαταραχές εμφανίζονται σε διάφορες παθήσεις της ιατρικής, μια απο τις συχνότερες παθήσεις είναι η άνοια και οδηγούν σε παθολογικές καταστάσεις όπως άνοια, αμνησία, διαταραχές κινητικών δεξιοτήτων και γενικότερες νοητικές δυσλειτουργίες. Ως γνωστικές διαταραχές ορίζονται οι διαταραχές οι οποίες παρεμποδίζουν σημαντικά την γνωστική λειτουργία ενός ατόμου σε βαθμό όπου η φυσιολογική του αλληλεπίδραση με την κοινωνία αλλά και η κανονική λειτουργία του ως μέλος αυτής να καθίστανται αδύνατες Σύμφωνα με την Πέμπτη έκδοση του Διαγνωστικού και Στατιστικού Εγχειριδίου των Ψυχικών Διαταραχών (DSM-V) οι γνωστικές διαταραχές κατατάσσονται ως μέρος της ευρύτερης κατηγορίας των νευρογνωστικών διαταραχών. 27 Ο αριθμός των ατόμων που πάσχουν από γνωστικές διαταραχές τείνει να έχει αυξητική πορεία με την πάροδο των χρόνων και αυτό οφείλεται στην αύξηση του προσδόκιμου χρόνου ζωής που συνεπάγεται αύξηση των ατόμων που πάσχουν από ηλικιακή εκφύλιση των νευροδιαβιβαστών. Τα άτομα αυτά παρουσιάζουν πληθώρα προβλημάτων στην καθημερινότητα τους μερικά από τα οποία είναι η δυσκολία στην επικοινωνία, η μη αποδοτικότητα στον χώρο εργασίας τους, η αίσθηση φόβου και η απώλεια της ανεξαρτησίας τους καθώς χρειάζονται την επίβλεψη άλλων ατόμων. Όλα αυτά οδηγούν σε απομόνωση, εσωστρέφεια, κοινωνικό αποκλεισμό, ακραίες συμπεριφορές και άσχημη ψυχολογική κατάσταση (γενικά μία χαμηλής ποιότητας ζωή). 27 Οι γνωστικές διαταραχές πολλές φορές όπως αναφερθήκαμε και πιο πάνω εμφανίζονται σε συννοσηρότητα με άλλες παθήσεις του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) όπως σχιζοφρένια, Parkinson disease και κατάθλιψη. 16

17 Γνωστικές διαταραχές και κατάθλιψη Η συναισθηματική επεξεργασία, η επεξεργασία κινήτρων και η γνωστική επεξεργασία απαιτούν αλληλεπιδράσεις εντός και μεταξύ συγκεκριμένων δικτύων του εγκεφάλου. Κοινές ψυχιατρικές ασθένειες περιλαμβάνουν διάφορους βαθμούς δυσλειτουργίας σε αυτούς τους τρεις τομείς. Αν και η μείζων καταθλιπτική διαταραχή μπορεί να θεωρηθεί κυρίως μια ασθένεια συναισθηματικής δυσλειτουργίας, περιλαμβάνει επίσης σημαντικές γνωστικές αλλαγές. Οι καταθλιπτικές διαταραχές σχετίζονται με προβλήματα σε πολλαπλούς γνωστικούς τομείς, όπως η προσοχή (συγκέντρωση), η μνήμη (μάθηση) και η λήψη αποφάσεων (κρίση). Οι γνωστικές αλλαγές που σχετίζονται με την κατάθλιψη πιθανόν να συμβάλλουν στις αναπηρίες που αντιμετωπίζουν τα άτομα με αυτή τη διαταραχή. 25 Γνωστικές διαταραχές και Πάρκινσον Η νόσος του Parkinson (PD) είναι μια προοδευτική νευροεκφυλιστική ασθένεια που χαρακτηρίζεται κυρίως από τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα των κινητικών συμπτωμάτων, όπως ο τρόμος, η βραδυκινησία, η ακαμψία και η αστάθεια της στάσης. Ωστόσο, μέσω κλινικών ερευνών σε ασθενείς και πειραματικών ευρημάτων σε ζωικά μοντέλα της νόσου του Πάρκινσον για χρόνια, είναι πλέον γνωστό ότι η ασθένεια του Parkinson είναι κάτι περισσότερο από μια διαταραχή κινητικού ελλείμματος. Η πλειοψηφία των ασθενών με νόσο του Πάρκινσον πάσχουν από μη κινητικές αναπηρίες, για παράδειγμα, γνωστική εξασθένηση, αισθητική δυσλειτουργία και διαταραχή ύπνου. Μέχρι στιγμής, οι θεραπευτικές αγωγές και οι χειρουργικές θεραπείες έχουν επικεντρωθεί κυρίως στις κινητικές δυσλειτουργίες. Στα συμπτώματα μη κινητικότητας, η γνωστική δυσλειτουργία αποτελεί την πιο κοινή και σημαντική πτυχή της νόσου. 22 Γνωστικές διαταραχές και ψύχωση Η γνωστική δυσλειτουργία είναι βασικό χαρακτηριστικό της σχιζοφρένειας. Τα ελλείμματα είναι μέτρια έως σοβαρά σε διάφορους τομείς, όπως η προσοχή, η μνήμη εργασίας, η λεκτική μάθηση και μνήμη και οι εκτελεστικές λειτουργίες. Αυτά τα ελλείμματα ξεπερνούν την έναρξη της ειλικρινούς ψύχωσης και είναι σταθερά καθ 'όλη τη διάρκεια της ασθένειας στους περισσότερους ασθενείς

18 Η κατηγορία των παθήσεων των γνωστικών δυσλειτουργιών είναι κατ 'εκτίμηση η τρίτη πιο δαπανηρή ασθένεια ως προς τον τρόπο θεραπείας στις Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής. Φάρμακα και θεραπείες είναι οι πιο κοινοί τρόποι καταπολέμησης, ωστόσο για ορισμένους τύπους διαταραχών, όπως ορισμένες μορφές αμνησίας, οι αγωγές μπορούν να καταστείλουν τα συμπτώματα, αλλά δεν υπάρχει προς το παρόν καμία θεραπεία. Όλα τα παραπάνω συντελούν στην αναγκαιότητα εξεύρεσης κάποιας μόνιμης θεραπείας αυτής της σύγχρονής και μελλοντικής ασθένειας που μαστίζει την ανθρωπότητα. 27 ΣΧΗΜΑ 1: Εικονική αναπαράσταση της σταδιακής επιδείνωσης της κατάστασης των ασθενών με γνωστικές διαταραχές και παρομοίωση της με ένα δέντρο που χάνει τα φύλλα του Α.2 ΑΝΟΙΑ Η άνοια αποτελεί μια ευρεία κατηγορία εγκεφαλικών ασθενειών που προκαλούν μια μακροπρόθεσμη και συχνά σταδιακή μείωση της ικανότητας σκέψης και μνήμης ενώ είναι αρκετά αισθητή ώστε να επηρεάσει την καθημερινή λειτουργία ενός ατόμου. Άλλα κοινά συμπτώματα περιλαμβάνουν συναισθηματικά προβλήματα, προβλήματα με τη γλώσσα και μείωση κινήτρων. Η συνείδηση ενός ατόμου συνήθως δεν επηρεάζεται. Η πρώτη διάγνωση της άνοιας βασίζεται στην αλλαγή της συνηθισμένης ψυχικής λειτουργίας ενός ατόμου και στην κατάπτωση του οργανισμού περισσότερο από ό, τι θα περίμενε κανείς λόγω της γήρανσης. Στο DSM-5, η άνοια αναταξινομήθηκε ως νευρογνωστική διαταραχή, με διάφορους βαθμούς σοβαρότητας.ο πιο συνηθισμένος τύπος άνοιας είναι η νόσος του Alzheimer, η οποία αποτελεί το 50% έως 70% των περιπτώσεων. Άλλοι συνηθισμένοι τύποι περιλαμβάνουν αγγειακή άνοια (25%), άνοια σώματος Lewy (15%) και μετωπιαία άνοια. Σε παγκόσμιο επίπεδο, η άνοια επηρέασε περίπου 46 εκατομμύρια ανθρώπους το Περίπου το 10% των ανθρώπων αναπτύσσουν τη διαταραχή σε κάποιο σημείο της ζωής τους. Η 18 28, 24

19 συχνότητα εμφάνισης της αυξάνεται εκθετικά με την ηλικία. Σχεδόν το 3% των ατόμων ηλικίας ετών έχουν άνοια, 19% μεταξύ 75 και 84 ετών και σχεδόν οι μισοί άνω των 85 ετών. Το 2013, η άνοια είχε ως αποτέλεσμα περίπου 1,7 εκατομμύρια θανάτους από τα 0,8 εκατομμύρια το Καθώς ο αριθμός των ανθρώπων που ζουν περισσότερο αυξάνεται, η άνοια γίνεται όλο και συχνότερη στο σύνολο του πληθυσμού. Ωστόσο, για άτομα συγκεκριμένης ηλικίας μπορεί να γίνεται λιγότερο συχνή, τουλάχιστον στον αναπτυγμένο κόσμο, λόγω της μείωσης των παραγόντων κινδύνου. Είναι μια από τις πιο κοινές αιτίες αναπηρίας μεταξύ των ηλικιωμένων. Πιστεύεται ότι οδηγεί σε οικονομικό κόστος 604 δισεκατομμυρίων δολαρίων το χρόνο. Τα άτομα με άνοια συχνά περιορίζονται φυσικά ή χημικά σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι είναι απαραίτητο, θέτοντας ζητήματα ανθρωπίνων δικαιωμάτων. Το κοινωνικό στίγμα εναντίον των 28, 24 πασχόντων είναι συχνό. ΣΧΗΜΑ 2: Σύγκριση ενός φυσιολογικού ηλικιωμένου εγκεφάλου (αριστερά) και του εγκεφάλου ενός ατόμου με Αλτσχάιμερ (δεξιά) Α.2.1 ΝΟΣΟΣ ΑΛΤΣΧΑΙΜΕΡ Η νόσος του Αλτσχάιμερ (AD) είναι μια χρόνια νευροεκφυλιστική ασθένεια που περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Γερμανό ψυχίατρο Alois Alzheimer το 1906 και συνήθως αρχίζει με ήπια συμπτώματα ενώ επιδεινώνεται με την πάροδο του χρόνου. Είναι η αιτία του 60% έως 70% των περιπτώσεων άνοιας. Το πιο συνηθισμένο πρόωρο σύμπτωμα είναι η απώλεια βραχυπρόθεσμης μνήμης. Καθώς η ασθένεια προχωράει, τα συμπτώματα μπορεί να περιλαμβάνουν προβλήματα με τη γλώσσα, τον αποπροσανατολισμό, τις μεταβολές της 19

20 διάθεσης, την απώλεια κινήτρων, τον μη αυτοέλεγχο και τα θέματα συμπεριφοράς. Καθώς η κατάσταση επιδεινώνεται η ασθένεια οδηγεί σε σοβαρή απώλεια μνήμης, πλήρη αποπροσανατολισμό, κοινωνική απόσυρση, απώλεια της ανεξαρτησίας του ατόμου. Σταδιακά, οι σωματικές λειτουργίες εξασθενούν, οδηγώντας τελικά σε θάνατο. Αν και η ταχύτητα της εξέλιξης μπορεί να ποικίλει, το μέσο προσδόκιμο ζωής μετά τη διάγνωση είναι τρία έως εννέα έτη. Καμία θεραπεία δεν σταματάει ή αναστρέφει την πρόοδό της ασθένειας, παρόλο που ενδέχεται να βελτιώσουν προσωρινά τα συμπτώματα. Η θεραπεία των συμπεριφορικών ή ψυχωσικών προβλημάτων της άνοιας με αντιψυχωσικά είναι συνηθισμένη, αλλά συνήθως δεν συνιστάται, καθώς υπάρχει μικρό όφελος και αυξημένος κίνδυνος πρόωρου θανάτου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3 οι χώρες που πλήττονται από την νόσο είναι κυρίως οι βιοτικά πιο ανεπτυγμένες κάτι το οποίο δικαιολογείται από το αυξημένο προσδόκιμο ζωής γεγονός που 1, 2, 29 καθιστά την AD μία από τις οικονομικά πιο δαπανηρές ασθένειες. ΣΧΗΜΑ 3: Συχνότητα θανάτου από την νόσο Αλτσχάιμερ σύμφωνα με στοιχεία του Με έντονο κόκκινο χρωματίζονται οι χώρες οι οποίες έχουν τα περισσότερα κρούσματα θανάτου ενώ με κίτρινο αυτές με τα λιγότερα ( όσο πιο έντονες είναι οι αποχρώσεις τόσο περισσότερα τα θύματα). 20

21 Το 2015 έπασχαν περίπου 29,8 εκατομμύρια άνθρωποι σε όλο τον κόσμο από AD. Συχνά αρχίζει σε άτομα ηλικίας άνω των 65 ετών, αν και το 4% έως 5% των περιπτώσεων εμφανίζει πρώιμη έναρξη της νόσου του Αλτσχάιμερ. Επηρεάζει περίπου το 6% των ανθρώπων ηλικίας 65 ετών και άνω. Το 2015, η άνοια είχε ως αποτέλεσμα περίπου 1,9 εκατομμύρια θανάτους. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας εκτιμά ότι το 2005 το 0,379% των ανθρώπων παγκοσμίως είχε άνοια και ότι ο επιπολασμός θα αυξηθεί σε σε 0,556% το Άλλες μελέτες έχουν καταλήξει σε παρόμοια συμπεράσματα. Μια άλλη μελέτη υπολόγισε ότι το 2006, το 0,40% του παγκόσμιου πληθυσμού (εύρος 0,17-0,89% απόλυτος αριθμός 26,6 εκατομμύρια, εύρος 11,4-59,4 εκατομμυρίων) επλήγη από την AD και ότι το ποσοστό επικράτησης θα τριπλασιαστεί και ο απόλυτος αριθμός θα τετραπλασιαστεί το , 29 A.3 ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΣΤΟΧΟΙ-ΥΠΟΘΕΣΕΙΣ ΓΙΑ ΓΝΩΣΙΑΚΕΣ ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ Αν και το βιολογικό υπόβαθρο των γνωστικών διαταραχών δεν έχει κατανοηθεί πλήρως έχουν προταθεί μερικοί βιολογικοί στόχοι οι οποίοι συνδέονται κυρίως με την αντιμετώπιση των συμπτωμάτων τους. Οι κυριότεροι στόχοι είναι οι ισταμινικοί υποδοχείς Η3, οι υποδοχείς σεροτονίνης 5-ΗΤ6, οι μουσκαρινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης Μ1, η βήτα σεκρετάση (BACE1), οι νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης α7 και η ακετυλοχολινεστεράση (AChE). Παρακάτω θα αναλύσουμε τους στόχους αυτούς καθώς και τους εν δυνάμει τρόπους αντιμετώπισης τους. Α.3.1 ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΙΣΤΑΜΙΝΗΣ Η3 10, 31, 62 Ο υποδοχέας ισταμίνης Η3 αναγνωρίστηκε το 1983 και περιγράφηκε αρχικά ως αυτοϋποδοχέας, που εκφράζεται κυρίως στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ), ρυθμίζοντας τη βιοσύνθεση και την απελευθέρωση της ισταμίνης από τους ισταμινεργικούς νευρώνες. Ακολούθως, αποδείχτηκε ότι οι υποδοχείς Η3 δρουν επίσης ως ετεροϋποδοχείς σε μη ισταμινεργικούς νευρώνες, όπου αναστέλλουν την απελευθέρωση άλλων νευροδιαβιβαστών όπως η ακετυλοχολίνη, η ντοπαμίνη, η νορεπινεφρίνη, η σεροτονίνη και διάφορα νευροπεπτίδια. Η υψηλή πυκνότητα των υποδοχέων Η3 σε διάφορες περιοχές του ΚΝΣ και η επίδρασή τους στην απελευθέρωση μιας μεγάλης ποικιλίας νευροδιαβιβαστών ενθάρρυναν την εκτεταμένη φαρμακολογική διερεύνηση του 21

22 φυσιολογικού ρόλου τους και την αναζήτηση για πιθανές θεραπευτικές εφαρμογές Η3- ανταγωνιστών στη θεραπεία διαφόρων ασθενειών του ΚΝΣ. Μεταξύ αυτών, οι πιο ελπιδοφόρες περιλαμβάνουν διαταραχή ελλειμματικής προσοχής και υπερκινητικότητας (ADHD), ασθένεια Alzheimer (ΑD), επιληψία, σχιζοφρένεια, παχυσαρκία και διατροφικές διαταραχές. ΣΧΗΜΑ 4: Χημική δομή του Pitolisant Το Pitolisant ή Tiprolisant (Σχήμα 4) είναι ένας ανάστροφος αγωνιστής /ανταγωνιστής υποδοχέα Η3 (Ki=0.16 nm). Έχει διεγερτικά και νοοτροπικά αποτελέσματα με βάση μελέτες πάνω σε ζώα και έχει αρκετές ιατρικές εφαρμογές, έχοντας ερευνηθεί για τη θεραπεία της ναρκοληψίας, για την οποία έχει εγκριθεί ως ορφανό φάρμακο στην ΕΕ και τις ΗΠΑ. Επί του παρόντος βρίσκεται σε κλινικές δοκιμές για τη σχιζοφρένεια και τη νόσο του Πάρκινσον. Το Pitolisant αναπτύχθηκε από τον Jean-Charles Schwartz, τον Walter Schunack και τους συναδέλφους του μετά την ανακάλυψη των υποδοχέων H3. Τα ενισχυτικά γνωστικά αποτελέσματα των Η3 ανταγωνιστών σε πολλαπλούς γνωστικούς τομείς βασιζόμενα σε ένα ευρύ αριθμό προ-κλινικών μοντέλων γνωστικής λειτουργίας, ενισχύουν την εμπιστοσύνη σε αυτή τη θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία της ADHD, της AD και της σχιζοφρένειας. Ωστόσο, παρόλο που επί του παρόντος βρίσκονται σε εξέλιξη διάφορες κλινικές μελέτες που εξετάζουν την αποτελεσματικότητα των ανταγωνιστών του υποδοχέα Η3 για μια ποικιλία γνωστικών διαταραχών, μέχρι σήμερα δεν έχει αναφερθεί κάποια κλινική απόδειξη και δεν έχει εγκριθεί κανένας H3 ανταγωνιστής για τέτοια δράση. Η ανακάλυψη αποτελεσματικών ανταγωνιστών της Η3 ως θεραπευτικοί παράγοντες για τη θεραπεία των γνωστικών διαταραχών θα επιτευχθεί μόνο μέσω συνεχιζόμενων ερευνητικών προσπαθειών που θα επιτρέψουν περαιτέρω την κατανόηση των λειτουργιών του υποδοχέα Η3. 1, 65 22

23 Α.3.2 ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΣΕΡΟΤΟΝΙΝΗΣ 5-ΗΤ6 8, 32 Ο υποδοχέας 5-ΗΤ6 είναι ένας υπότυπος υποδοχέα 5-ΗΤ που δεσμεύει τον ενδογενή νευροδιαβιβαστή σεροτονίνη. Είναι ένας υποδοχέας συζευγμένος με πρωτεΐνη G (GPCR) ο οποίος συζευγνύεται με Gs και μεσολαβεί στη διεγερτική νευροδιαβίβαση. Εκφράζεται σχεδόν αποκλειστικά στον εγκέφαλο. Ο υποδοχέας 5-ΗΤ6 είναι μεταξύ των τελευταίων ταυτοποιημένων μελών της οικογένειας υποδοχέων 5-ΗΤ και είναι ένας ιδιαίτερα ενδιαφέρον υπότυπος λόγω του σχετικά χαμηλού επιπέδου ομολογίας της αλληλουχίας του (<50%) σε σύγκριση με τους υπόλοιπους υποδοχείς σεροτονίνης, της μοναδικής κατανομής του, της ενδιαφέρουσας φαρμακολογίας του και τις πολλαπλές κυτταρικές οδούς σηματοδότησης που ενεργοποιεί στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ). Αν και οι μηχανισμοί που σχετίζονται με την ενεργοποίηση / αποκλεισμό του υποδοχέα 5-ΗΤ6 δεν είναι πλήρως κατανοητοί, οι προσδέτες του έχουν καταδείξει πιθανή χρησιμότητα ως αντικαταθλιπτικοί και αγχολυτικοί παράγοντες σε συναισθηματικές και ψυχωτικές διαταραχές. Τα τελευταία 10 χρόνια έχει σημειωθεί μια σταδιακά αυξανόμενη εστίαση στον 5-HT6 ως δυνητικό στόχο για γνωστικές διαταραχές, όπως ποσοτικοποιείται από τον αριθμό των επιστημονικών άρθρων σχετικά με τη συμμετοχή αυτού του υποδοχέα στις διαδικασίες μάθησης και μνήμης. Για παράδειγμα, μια έρευνα στο web of science το 2004 για τους όρους "5-HT6 και μνήμη ή μάθηση ή γνωστικό" παρήγαγε 145 άρθρα, ενώ η ίδια έρευνα το 2013 έδωσε 618 δημοσιεύσεις. Έτσι, κατά την τελευταία δεκαετία περίπου 473 έγγραφα έχουν εμφανιστεί που εμπλέκουν υποδοχείς 5-ΗΤ6 σε διαδικασίες μάθησης και μνήμης. Σήμερα η πιο ελπιδοφόρα θεραπευτική ένδειξη για τους ανταγωνιστές του υποδοχέα 5-HT6 είναι ως ενισχυτικά γνωστικής λειτουργίας σε ασθένειες που σχετίζονται με γνωστική εξασθένηση, όπως στην AD και άλλες νευροεκφυλιστικές ασθένειες. ΣΧΗΜΑ 5: Χημική δομή του Idalopirdine 23

24 Τo Idalopirdine (Σχήμα 5) είναι ένας ισχυρός και εκλεκτικός ανταγωνιστής υποδοχέα 5-ΗΤ6 (Ki=0.83nM) υπό ανάπτυξη από την Lundbeck για τη θεραπεία γνωστικών ελλειμμάτων που σχετίζονται με τη νόσο του Alzheimer και τη σχιζοφρένεια. Από τον Οκτώβριο του 2013 βρίσκεται σε κλινικές δοκιμές φάσης ΙΙΙ. Περαιτέρω δοκιμές φάσης ΙΙΙ πρόκειται να αναφερθούν στις αρχές του , 8 ΣΧΗΜΑ 6 : Χημική δομή του Intepirdine Το Intepirdine (Σχήμα 6) είναι ένας εκλεκτικός ανταγωνιστής υποδοχέα 5-ΗΤ6 με δυνητικά αποτελέσματα ενίσχυσης της μνήμης, της εκμάθησης και του γνωστικού. Αναπτύχθηκε από την GlaxoSmithKline για τη θεραπεία της νόσου του Αλτσχάιμερ και απέδειξε κάποια προκαταρκτική αποτελεσματικότητα στις κλινικές δοκιμές φάσης ΙΙ, ωστόσο η GSK επέλεξε να μην συνεχίσει την ανάπτυξη του και να πουλήσει τα δικαιώματα της στην Axovant Sciences τον Δεκέμβριο του Μια κλινική δοκιμή φάσης 3 για τη νόσο Alzheimer αναμένεται να καταγραφεί το 2017 ενώ επίσης βρίσκεται σε φάση 2 για άνοια με σώμα Lewy. 1, 8 Α.3.3 ΜΟΥΣΚΑΡΙΝΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ Μ1 11, 13, 33 Οι μουσκαρινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης (machrs) είναι μεταξύ των καλύτερα χαρακτηρισμένων επτά διαμεμβρανικών (7TM) υποδοχέων και εκφράζονται ευρέως σε ολόκληρο το ΚΝΣ. Υπάρχουν πέντε υπότυποι (Μ1, Μ2, Μ3, Μ4, Μ5) και χωρίζονται σε δύο ξεχωριστές κατηγορίες με βάση την μεταγωγή σήματος. Οι υπότυποι Μ1, Μ3 και Μ5 μετάγουν την ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης-c και κινητοποιούν το ενδοκυτταρικό ασβέστιο μέσω πρωτεϊνών Gq/11. Οι υπότυποι M2 και M4 σηματοδοτούν τις πρωτεΐνες Gi/o να αναστέλλουν την αδενυλική κυκλάση και να μειώνουν την ενδοκυτταρική συγκέντρωση camp. 24

25 Ο υποδοχέας Μ1 είναι ο κυρίαρχος υπότυπος μουσκαρινικού υποδοχέα στο ΚΝΣ και βρίσκεται σε περιοχές του εγκεφάλου όπως ο εγκεφαλικός φλοιός και ο ιππόκαμπος. Αυτές οι περιοχές του εγκεφάλου είναι σημαντικές για την μάθηση και την μνήμη και η ενεργοποίηση του M1 υποδοχέα έχει προταθεί ως μεσολαβητής της γνωστικής επεξεργασίας. Επιπλέον, αυτές οι περιοχές του εγκεφάλου επηρεάζονται σοβαρά από τη χολινεργική δυσλειτουργία στη νόσο του Alzheimer. Κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 1990, πολλές φαρμακευτικές εταιρείες επιδίωξαν την σύνθεση επιλεκτικών αγωνιστών του υποδοχέα Μ1 ως δυναμικές Θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη θεραπεία της AD και της σχιζοφρένειας. Ενώ πολλές από τις ενώσεις ήταν αποτελεσματικές σε προκλινικά ζωικά μοντέλα γνωστικής δυσλειτουργίας, εκείνες που προχώρησαν σε κλινικές μελέτες παρουσίασαν διάφορες παρενέργειες. Ωστόσο αρκετές ενώσεις σε κλινικές μελέτες φάσης 1 κατέδειξαν θετική επίδραση στα γνωστικά συμπτώματα και στα συμπτώματα συμπεριφοράς σε ασθενείς με AD αλλά και στην λεκτική μάθηση και στην βραχυπρόθεσμη μνήμη σε ασθενείς με σχιζοφρένεια. Πολλοί από τους πρώτης γενιάς αγωνιστές έδειξαν μέτρια επιλεκτικότητα ως προς τους υποδοχείς Μ1 έναντι των υπόλοιπων υπότυπων και ιδιαίτερα των υποδοχέων Μ2 και Μ3. Η χαμηλή αυτή εκλεκτικότητα έχει προταθεί ότι είναι η αιτία των παρατηρούμενων περιφερειακών χολινεργικών παρενεργειών. Πρόσφατα η φαρμακευτική εταιρία Lundbeck δημοσίευσε μια σειρά νέων μορίων με M1 αλλοστερική αγωνιστική δράση με την ένωση Α (EC50=61nM) που απεικονίζεται στο σχήμα 7 να αποτελεί την ένωση οδηγό αυτής της σειράς. Η ένωση Α εκτός από τη λειτουργική εκλεκτικότητα της για τον υποδοχέα M1, δεν είχε επίσης καμία συγγένεια πρόσδεσης με τους υποδοχείς Μ2-M5. 11 Μ1 ΣΧΗΜΑ 7: Χημική δομή του lead αγωνιστή Μ 1 που έχει αναπτύξει η Lundbeck Παρομοίως, παρατηρήθηκε πολύ περιορισμένη συγγένεια προς μία ομάδα 69 υποδοχέων που περιελάμβανε δίαυλους ιόντων, μεταφορείς και ένζυμα. Συνολικά, η ένωση Α είναι ένα μόριοοδηγός υψηλής ποιότητας για την ανακάλυψη του πρώτου φαρμάκου με Μ1 αγωνιστική δράση. 25

26 Α.3.4 ΒΗΤΑ ΣΕΚΡΕΤΑΣΗ (BACE1) 35 Το BACE1 (Σχήμα 8) είναι μία πρωτεάση ασπαρτικού οξέος, με σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό του περιβλήματος μυελίνης στα κύτταρα περιφερικού νεύρου. Η BACE1 αποτελεί μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη που περιέχει δύο υπολείμματα ασπαρτικού άλατος στην δραστική της θέση στην επικράτειά της εξωκυτταρικής πρωτεΐνης και μπορεί να λειτουργήσει ως διμερές. ΣΧΗΜΑ 8 : Τρισδιάστατη Δομή της πρωτεΐνης BACE1 Η δημιουργία των πεπτιδίων β-αμυλοειδούς βάρους 40 ή 42 αμινοξέων που συσσωματώνονται στον εγκέφαλο ασθενών με Alzheimer απαιτεί δύο διαδοχικά κοψίματα της πρόδρομης αμυλοειδούς πρωτεΐνης (ΑΡΡ). Η εξωκυτταρική διάσπαση της ΑΡΡ μέσω του BACE1 δημιουργεί ένα διαλυτό εξωκυτταρικό θραύσμα και ένα δεσμευμένο στη μεμβράνη θραύσμα που αναφέρεται ως C99. Η διάσπαση της C99 εντός της διαμεμβρανικής περιοχής αυτής από την γ- σεκρετάση απελευθερώνει τον ενδοκυτταρικό τομέα της ΑΡΡ παράγοντας το β-αμυλοειδές. Η αρχική διάσπαση της ΑΡΡ από την α-σεκρετάση και όχι από το BACE1 εμποδίζει την ενδεχόμενη δημιουργία αμυλοειδούς-β. Τα επίπεδα αυτού του BACE1 έχουν αποδειχθεί ότι είναι αυξημένα στο σποραδικό Alzheimer με καθυστερημένη έναρξη της νόσου. Ο σκοπός της διάσπασης της ΑΡΡ μέσω του BACE1 αλλά και άλλων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών που λαμβάνει χώρα υπό φυσιολογικές συνθήκες είναι άγνωστος. Εντούτοις, μία μόνη μετάλλαξη υπολείμματος στην ΑΡΡ μειώνει την ικανότητα του BACE1 να τη διασπάσει και να παράγει αμυλοειδές-βήτα μειώνοντας το ρίσκο για την εμφάνιση Alzheimer και άλλων γνωστικών διαταραχών. 26

27 Εν δυνάμει αναστολείς του ενζύμου BACE1 θα εμπόδιζαν τη συσσώρευση του β-αμυλοειδούς και θα βοηθούσαν στην επιβράδυνση ή ακόμη και την διακοπή της νόσου του Alzheimer. Αρκετές εταιρείες βρίσκονται σε πρώιμα στάδια ανάπτυξης και δοκιμής αυτής της πιθανής νέας κατηγορίας θεραπευτικής αγωγής. ΣΧΗΜΑ 9: Χημική δομή του Verubecestat Το Verubecestat της Merck (Σχήμα 9) είναι ένας αναστολέας του BACE1 και αποτελεί πειραματικό φάρμακο για τη θεραπεία της AD. Τον Απρίλιο του 2012 ανακοινώθηκαν τα κλινικά αποτελέσματα φάσης Ι ενώ έχουν αναφερθεί και αποτελέσματα φάσης 1b. Από τον Δεκέμβριο του 2016 πραγματοποιήθηκαν δύο κλινικές δοκιμές φάσης 2/3 που έχουν προχωρήσει στη φάση 3. Ωστόσο, τον Φεβρουάριο του 2017, η Merck σταμάτησε τη δοκιμή του Verubecestat για την ήπια έως μέτρια νόσο Αλτσχάιμερ, καθώς ανακοινώθηκε έλλειψη αποτελεσματικότητας και εκτιμήθηκε ότι δεν υπάρχει πιθανότητα να δείξει θετική κλινική επίδραση, σύμφωνα με ανεξάρτητη ομάδα εμπειρογνώμων. Τα αποτελέσματα της δοκιμής του Verubecestat σε ασθενείς σε πρώιμο στάδιο Αλτσχάιμερ αναμένονται το Φεβρουάριο του , 66 ΣΧΗΜΑ 10: Χημική δομή του Lanabecestat Το Σεπτέμβριο του 2014, οι εταιρείες AstraZeneca και Eli Lilly and Company ανακοίνωσαν την συμφωνία τους για την από κοινού ανάπτυξη του Lanabecestat (IC50 = 160 pm, Σχήμα 10) που είναι ένας αναστολέας ενζύμου BACE1. Μια βασική κλινική δοκιμή φάσης ΙΙ / ΙΙΙ του 27

28 Lanabecestat ξεκίνησε στα τέλη του 2014 και προγραμματίζεται να δοκιμαστεί σε 2200 ασθενείς και να λήξει τον Ιούνιο του Τον Απρίλιο του 2016 η εταιρεία ανακοίνωσε ότι θα προχωρήσει στη Φάση ΙΙΙ χωρίς περαιτέρω λεπτομέρειες. 1, 67 Α.3.5 ΑΛΦΑ-7 ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ (α7) Ο νικοτινικός υποδοχέας άλφα-7 (Σχήμα 11), γνωστός και ως ο υποδοχέας α7, είναι ένας τύπος υποδοχέα νικοτινικής ακετυλοχολίνης που εμπλέκεται με μακροχρόνια μνήμη και αποτελείται εξ ολοκλήρου από α7 υπομονάδες. Όπως και με άλλους υποδοχείς νικοτινικής ακετυλοχολίνης, οι λειτουργικοί α7 υποδοχείς είναι πενταμερείς. Βρίσκονται στον εγκέφαλο, τον σπλήνα και τα λεμφοκύτταρα των λεμφογαγγλίων όπου η ενεργοποίηση τους προκαλεί μετά- και προσυναπτική διέγερση, κυρίως αυξάνοντας την διαπερατότητα ιόντων ασβεστίου (Ca 2 + ). 9, 34 ΣΧΗΜΑ 11 : Μοριακό μοντέλο του α7 νικοτινικού υποδοχέα. Αρκετές σειρές πειραματικών δεδομένων υποστηρίζουν τη συμμετοχή των νευρωνικών νικοτινικών υποδοχέων τόσο στη σχιζοφρένεια όσο και στην AD. Αυτές περιλαμβάνουν μειωμένη έκφραση του α7 νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης στον εγκεφαλικό ιστό των ασθενών με σχιζοφρένεια και AD. Παραδείγματα πρωτότυπων αγωνιστών του υποδοχέα α7 έχουν δείξει βελτιωμένο cognition σε ζωικά μοντέλα και ομαλοποίηση των αισθητηριακών ελλειμμάτων, τα οποία πιστεύεται ότι συμβάλλουν στον γνωστικό κατακερματισμό. Με βάση αυτά τα δεδομένα, υπάρχει μεγάλη αισιοδοξία ότι οι επιλεκτικοί αγωνιστές των α7 υποδοχέων μπορούν να αποδειχθούν αποτελεσματικοί στη βελτίωση του cognition τόσο στη σχιζοφρένεια 28

29 όσο και στη AD. Ακολουθώντας αυτή την υπόθεση, αποδείχτηκε πρόσφατα ότι οι εκλεκτικοί αγωνιστές α7 βελτιώνουν τις γνωστικές επιδόσεις τόσο σε ζωικά μοντέλα όσο και σε ανθρώπινες κλινικές δοκιμές. ΣΧΗΜΑ 12 : Χημική δομή ένωσης Β Τα τελευταία χρόνια πολλές φαρμακευτικές εταιρίες έχουν διαθέσει μεγάλα ποσά για την ανάπτυξη μορίων-φαρμάκων με α7 επιλεκτική αγωνιστική δράση ωστόσο μέχρι σήμερα δεν υπάρχει κάποιο εγκεκριμένο φάρμακο με τέτοια δράση. Μια νέα σειρά ενώσεων που αναπτύχθηκε από την Pfizer που περιέχουν ένα τμήμα ουρίας και συγκεκριμένα η ένωση Β (Ki=0.07μΜ, Σχήμα 12) αυτής της σειράς παρουσίασε επιλεκτική αγωνιστική α7 δράση με εξαιρετικό in vitro και in vivo προφίλ, διείσδυση στον εγκέφαλο, βιοδιαθεσιμότητα p.o και iv, αποτελεσματικότητα σε πολλαπλά μοντέλα γνωστικής συμπεριφοράς. Δομικές τροποποιήσεις που οδηγούν σε βελτιωμένο προφίλ εκλεκτικότητας και περαιτέρω βιολογική αξιολόγηση της νέας αυτής σειράς αναμένεται να πραγματοποιηθούν. 9 Α.3.6 ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΕΣΤΕΡΑΣΗ 1, 36, 37, 38 Η ακετυλοχολίνη (ACh) είναι μια οργανική χημική ουσία που λειτουργεί στον εγκέφαλο και το σώμα πολλών τύπων ζώων, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων, ως νευροδιαβιβαστής. Το όνομα της προέρχεται από τη χημική της δομή: Είναι ένας εστέρας οξικού οξέος και χολίνης. Μέρη του σώματος που χρησιμοποιούν ή επηρεάζονται από την ακετυλοχολίνη αναφέρονται ως χολινεργικά ενώ ουσίες που παρεμποδίζουν τη δράση της ακετυλοχολίνης καλούνται αντιχολινεργικά. Η ακετυλοχολίνη είναι ο νευροδιαβιβαστής που χρησιμοποιείται στη νευρομυϊκή σύνδεση. Αυτή η ιδιότητα σημαίνει ότι τα φάρμακα που επηρεάζουν τα χολινεργικά συστήματα μπορούν να έχουν πολύ επικίνδυνες επιπτώσεις που κυμαίνονται από παράλυση έως σπασμούς. Η ακετυλοχολίνη χρησιμοποιείται επίσης ως νευροδιαβιβαστής στο αυτόνομο νευρικό σύστημα, τόσο ως εσωτερικός πομπός για το συμπαθητικό νευρικό σύστημα όσο και ως τελικό προϊόν που απελευθερώνεται από το παρασυμπαθητικό νευρικό σύστημα. 29

30 Στον εγκέφαλο, η ακετυλοχολίνη λειτουργεί ως νευροδιαβιβαστής και ως νευροδιαμορφωτής. Ο εγκέφαλος περιέχει μια σειρά χολινεργικών περιοχών, κάθε μία με ξεχωριστές λειτουργίες που παίζουν σημαντικό ρόλο στην διέγερση, την προσοχή, τη μνήμη και τα κίνητρα. Η ακετυλοχολίνη λειτουργεί τόσο στο περιφερικό νευρικό σύστημα (ΠΝΣ) όσο και στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ). Στο περιφερικό νευρικό σύστημα ενεργοποιεί τους μυς και είναι ένας κύριος νευροδιαβιβαστής στο αυτόνομο νευρικό σύστημα. Στο ΚΝΣ, οι χολινεργικές προεξοχές από τον βασικό πρόσθιο εγκέφαλο έως τον εγκεφαλικό φλοιό και τον ιππόκαμπο υποστηρίζουν τις γνωστικές λειτουργίες αυτών των περιοχών. Η ακετυλοχολίνη δρα κυρίως μέσω πρόσδεσης σε δύο κατηγορίες υποδοχέων: τους νικοτινικούς και τους μουσκαρινικούς. ΣΧΗΜΑ 13: Νικοτινικοί υποδοχείς- δίαυλοι ιόντων και μηχανισμός ενεργοποίησης τους από την ακετυλοχολίνη Οι νικοτινικοί υποδοχείς είναι ιοντικοί δίαυλοι ενσωματωμένοι σε κυτταρικές μεμβράνες, ικανοί να αλλάζουν από μία κλειστή σε μια ανοιχτή κατάσταση όταν η ακετυλοχολίνη συνδέεται με αυτούς. Σε ανοικτή κατάσταση επιτρέπουν τη διέλευση ιόντων νατρίου, καλίου και ασβεστίου (Σχήμα 13). Οι νικοτινικοί υποδοχείς χωρίζονται σε δύο βασικούς τύπους, γνωστούς ως μυϊκούς και νευρωνικούς. Η κύρια θέση των υποδοχέων μυϊκού τύπου είναι στα μυϊκά κύτταρα, Οι υποδοχείς νευρωνικού τύπου βρίσκονται σε αυτόνομα γάγγλια (συμπαθητικά και παρασυμπαθητικά) και στο κεντρικό νευρικό σύστημα. 30

31 Οι μουσκαρινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης έχουν έναν πιο πολύπλοκο μηχανισμό και επηρεάζουν τα κύτταρα στόχους σε ένα μεγαλύτερο χρονικό πλαίσιο. Στα θηλαστικά έχουν ταυτοποιηθεί πέντε υποτύποι μουσκαρινικών υποδοχέων, επισημασμένων Μ1 - Μ5. Όλοι αυτοί λειτουργούν ως υποδοχείς συζευγμένοι με πρωτεΐνες G, πράγμα που σημαίνει ότι ασκούν τα αποτελέσματά τους μέσω ενός δεύτερου συστήματος αγγελιοφόρων. Οι υποτύποι Μ1, Μ3 και Μ5 είναι συζευγμένοι με Gq και αυξάνουν τα ενδοκυτταρικά επίπεδα IP3, camp και ασβεστίου ενεργοποιώντας τη φωσφολιπάση C. Η επίδρασή τους στα κύτταρα-στόχους είναι συνήθως διεγερτική. Οι υποτύποι M2 και M4 συνδέονται με Gi / Go και μειώνουν τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του camp αναστέλλοντας την αδενυλική κυκλάση. Η επίδρασή τους στα κύτταραστόχους είναι συνήθως ανασταλτική. Οι μουσκαρινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης βρίσκονται τόσο στο κεντρικό νευρικό σύστημα όσο και στο περιφερικό νευρικό σύστημα της καρδιάς, στους πνεύμονες, στο άνω γαστρεντερικό σωλήνα και στους ιδρωτοποιούς αδένες. Έχει αποδειχτεί ότι η ακετυλοχολίνη εμπλέκεται με διάφορους τρόπους στην εκμάθηση και τη μνήμη. Στα ζώα, η διαταραχή της παροχής ακετυλοχολίνης στο νεοφλοιό εμποδίζει την εκμάθηση απλών καθηκόντων διάκρισης, συγκρίσιμη με την απόκτηση πραγματικών πληροφοριών και διακοπή της παροχής στον ιππόκαμπο και τις παρακείμενες φλοιώδεις περιοχές προκαλεί απώλεια μνήμης παρόμοια με την πρόωρη αμνησία στον άνθρωπο. Η ακετυλοχολινεστεράση, επίσης γνωστή ως AChE ή ακετυλυδρολάση, είναι η κύρια χολινεστεράση στο σώμα. Είναι ένα ένζυμο που καταλύει την αποικοδόμηση της ακετυλοχολίνης και ορισμένων άλλων εστέρων χολίνης που λειτουργούν ως νευροδιαβιβαστές. Η AChE βρίσκεται κυρίως σε νευρομυϊκές συνάψεις χολινεργικού τύπου, όπου η λειτουργία της χρησιμεύει για τον τερματισμό της συναπτικής μετάδοσης. Ανήκει στην οικογένεια ενζύμων καρβοξυλεστεράσης. Είναι ο πρωταρχικός στόχος αναστολής από οργανοφωσφορικές ενώσεις όπως νευρικοί παράγοντες και παρασιτοκτόνα. Κάθε μόριο AChE έχει πολύ υψηλή καταλυτική δραστικότητα και αποικοδομεί περίπου μόρια ακετυλοχολίνης (ACh) ανά δευτερόλεπτο, πλησιάζοντας το όριο που επιτρέπεται από τη διάχυση του υποστρώματος. Η δομή και ο μηχανισμός δράσης της AChE έχουν αποσαφηνιστεί από την κρυσταλλική δομή του ενζύμου (Σχήμα 14). Η ενεργός θέση της AChE περιλαμβάνει 2 υπομονάδες, την ανιονική θέση και την εστερική. Ο ανιονικός υπό-τόπος αλληλεπιδρά με το θετικά φορτισμένο τεταρτοταγές αμμωνιακό άλας της ακετυλοχολίνης καθώς και άλλα κατιονικά υποστρώματα. Τα κατιονικά 31

32 υποστρώματα δεν δεσμεύονται από ένα αρνητικά φορτισμένο αμινοξύ στην ανιονική θέση, αλλά αλληλεπιδρούν με 14 αρωματικά κατάλοιπα που οριοθετούν το φαράγγι που οδηγεί στην ενεργό θέση. Όλα τα 14 αμινοξέα στο αρωματικό φαράγγι διατηρούνται σε μεγάλο βαθμό σε διάφορα είδη. Μεταξύ των αρωματικών αμινοξέων, η τρυπτοφάνη 84 είναι κρίσιμη και η αντικατάστασή της με αλανίνη καταλήγει σε 3000 φορές μείωση της αντιδραστικότητας. Το φαράγγι διεισδύει στη μέση του ενζύμου και έχει μήκος περίπου 20 Αngstrom. Η ενεργός θέση βρίσκεται 4 Αngstroms από τον πυθμένα της ενεργής κοιλότητας. Ο εστερικός υπό-τόπος, όπου η ακετυλοχολίνη υδρολύεται προς οξικό και χολίνη, περιέχει την καταλυτική τριάδα των αμινοξέων: σερίνη 200, ιστιδίνη 440 και γλουταμικό 327. Αυτά τα τρία αμινοξέα είναι παρόμοια με την τριάδα σε άλλες πρωτεάσες σερίνης με την μόνη διαφορά ότι το γλουταμικό είναι το Τρίτο μέλος και όχι το ασπαρτικό. Επιπλέον, η τριάδα έχει αντίθετη στερεοχημική χωροταξία από τις άλλες πρωτεάσες. Η αντίδραση υδρόλυσης του καρβοξυλικού εστέρα οδηγεί στον σχηματισμό ενός ακυλιωμένου ενζύμου και ελεύθερης χολίνης. Στη συνέχεια, το ακυλιωμένο ένζυμο υφίσταται πυρηνόφιλη προσβολή από ένα μόριο νερού, βοηθούμενο από την ομάδα ιστιδίνης 440, απελευθερώνοντας οξικό οξύ και αναδημιουργώντας το ελεύθερο ένζυμο. ΣΧΗΜΑ 14: Δευτεροταγής δομή της ακετυλοχολινεστεράσης 32

33 ΣΧΗΜΑ 15: Σύνθεση, δράση και αποικοδόμηση της ακέτυλοχολίνης. Α.4 ΕΓΚΕΚΡΙΜΕΝΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΤΑΠΟΛΕΜΗΣΗΣ ΤΩΝ ΓΝΩΣΙΑΚΩΝ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΩΝ ΤΗΣ ΑD 1 Μελέτες που πραγματοποιήθηκαν τη δεκαετία του 1980 έδειξαν σημαντική εξασθένηση των χολινεργικών δεικτών στους ασθενείς της AD. Έτσι προτάθηκε ότι ο εκφυλισμός των χολινεργικών νευρώνων στον βασικό πρόσθιο εγκέφαλο και η σχετιζόμενη απώλεια της χολινεργικής νευροδιαβίβασης στον εγκεφαλικό φλοιό και σε άλλες περιοχές συνέβαλαν σημαντικά στην επιδείνωση της γνωστικής λειτουργίας που παρατηρήθηκε σε ασθενείς με AD. Περαιτέρω μελέτες σχετικά με το χολινεργικό σύστημα και το AD έδειξαν ότι η ακετυλοχολίνη παίζει σημαντικό ρόλο στη μάθηση και τη μνήμη. Η φυσιολογική γνωστική γήρανση μπορεί να επηρεάσει τη μακροχρόνια μνήμη και τη μνήμη εργασίας, αν και το χολινεργικό σύστημα και οι φλοιώδεις περιοχές διατηρούν την απόδοση μέσω λειτουργικής αντιστάθμισης. Οι ενήλικες με AD που εμφανίζουν δυσλειτουργία του χολινεργικού συστήματος δεν είναι σε θέση να αντισταθμίσουν τα ελλείμματα της μακροχρόνιας και εργασιακής μνήμης. Οι αναστολείς ακετυλοχολινεστεράσης χρησιμοποιούνται για τη μείωση της ταχύτητας με την οποία διασπάται η ακετυλοχολίνη (ACh), αυξάνοντας έτσι τη συγκέντρωση της στον εγκέφαλο και καταπολεμώντας την απώλεια ACh που προκαλείται από το θάνατο των χολινεργικών 33

34 νευρώνων. Υπάρχουν ενδείξεις για την αποτελεσματικότητα τέτοιων φαρμάκων στην ήπια έως μέτρια ασθένεια του Αλτσχάιμερ και κάποια στοιχεία για τη χρήση τους σε προχωρημένο στάδιο. Παρακάτω θα αναφερθούμε στα εγκεκριμένα φάρμακα για την αντιμετώπιση του Alzheimer τα οποία είτε πρωτίστως ή δευτερευόντως δρουν ως αναστολείς ακετυλοχολινεστεράσης 1, 39 DONEPEZIL ΣΧΗΜΑ 16: Χημική δομή, εταιρίες κυκλοφορίας και πωλήσεις του Donepezil Το Donepezil (εμπορικά γνωστό ως Aricept, Σχήμα 16) αναπτύχθηκε από την Eisai Tokyo και Pfizer, εγκρίθηκε από το FDA τον Νοέμβριο του 1996 και ξεκίνησε να κυκλοφορεί στις ΗΠΑ από τον Ιανουάριο του 1997 για τη θεραπεία της ήπιας έως μέτριας AD. Τον Οκτώβριο του 2006, εγκρίθηκε από την FDAη χρήσει του Donepezil για τη θεραπεία της βαρείας AD. Το Donepezilαναστέλλει ισχυρά την AChE (IC50 = 23 nμ), ενώ η αναστολή της βουτυρυλοχολινεστεράσης (BChE) ήταν 320 φορές Ασθενέστερη (IC50 = 7420 nm). Οι Ιάπωνες εφευρέτες υποστηρίζουν τιμές IC50 = 5,7 nμ για AChE και IC50 = 7140 nμ για BChE. Το Donepezil αλληλεπιδρά με την ενεργή θέση της AChE και την περιφερική ανιοντική θέση του ενζύμου. Ο μεγάλος χρόνος ημιζωής (t1/2= 70 ώρες) επιτρέπει την διάθεση του μία φορά την ημέρα ενώ διαθέτη κα πολύ υψηλή βιοδιαθεσιμότητα (F=100%). Οι πωλήσεις του Donepezil όπως ανέφερε η Eisai για το 2012 ανέρχονταν στα δισεκατομμύρια δολάρια Το Donepezil σε συνδυασμό με τη φυσική ιρουδίνη βελτίωσε τα κλινικά συμπτώματα των ασθενών με ήπια έως μέτρια AD. Μια συνδυασμένη θεραπεία με donepezil και μεμαντίνη έδειξε ευεργετικά αποτελέσματα σε ασθενείς με AD στη μείωση της γνωστικής επιδείνωσης. Εκτός από τις δράσεις του ως αναστολέα ακετυλοχολινεστεράσης, το Donepezil έχει βρεθεί ότι δρα ως 34

35 ισχυρός αγωνιστής του υποδοχέα σ1 (Κί = 14,6 nμ) και έχει δειχθεί ότι παράγει ειδικά αντιαμνησιακά αποτελέσματα σε ζώα κυρίως μέσω αυτής της δράσης. GALANTAMINE 1, 40 ΣΧΗΜΑ 17: Χημική δομή, εταιρίες κυκλοφορίας και πωλήσεις του Galantamine Το Galantamine (εμπορικά γνωστό ως Nivalin, Razadyne, Reminyl και Lycoremine, Σχήμα 17) αναπτύχθηκε από τις εταιρίες Johnson & Johnson, Shire and Takeda και κυκλοφόρησε το 2001 για τη θεραπεία της ήπιας έως μέτριας AD στην ΕΕ και τις ΗΠΑ και τον Μάρτιο του 2011 στην Ιαπωνία. Είναι ένα αλκαλοειδές που λαμβάνεται συνθετικά ή από τους βολβούς και τα λουλούδια του Galanthus caucasicus, του Galanthus woronowii και ορισμένων άλλων μελών της οικογένειας Amaryllidaceae όπως Narcissus, Leucojum και aestivum. Το Galantamine αναστείλει την AChE με IC50 της τάξης των 800nΜ και την BChE με IC50 των 7320nM. Οι πωλήσεις το 2011 για λογαριασμό της Johnson & Johnson ανέρχονταν στα 470 εκατομμύρια USD, ενώ για την Shire το 2012 στα 38 εκατ. USD και για την Takeda το 2012 στα 105 εκατομμύρια USD. Το Galantamine αναστέλλει πλήρως την ακετυλοχολινεστεράση. Ως αποτέλεσμα της αναστολής της ακετυλοχολινεστεράσης, η γαλανταμίνη αυξάνει τη διαθεσιμότητα ακετυλοχολίνης για συναπτική μετάδοση. Επιπλέον, η γαλανταμίνη δεσμεύεται σε αλλοστερικές θέσεις των νικοτινικών υποδοχέων, γεγονός που προκαλεί μεταβολές στη διαμόρφωση τους. Αυτή η 35

36 αλλοεστερική διαμόρφωση αυξάνει την απόκριση του νικοτινικού υποδοχέα στην ακετυλοχολίνη. Η ενεργοποίηση των προσυναπτικών νικοτινικών υποδοχέων αυξάνει την απελευθέρωση της ακετυλοχολίνης, αυξάνοντας περαιτέρω τη διαθεσιμότητά της. Η ανταγωνιστική αναστολή της ακετυλοχολινεστεράσης σε συνδυασμό με την αλλοστερική ενεργοποίηση των νικοτινικών υποδοχέων αποτελεί διπλό μηχανισμό δράσης. Η απόλυτη βιοδιαθεσιμότητα p.o της κυμαίνετε μεταξύ 80 και 100%. Έχει χρόνο ημισείας ζωής επτά ωρών. Στις 27 Απριλίου 2006, η FDA ενέκρινε αλλαγές στην επισήμανση σχετικά με όλες τις μορφές παρασκευασμάτων Galantamine (υγρών, τακτικών δισκίων και δισκίων παρατεταμένης αποδέσμευσης) προειδοποιώντας για τον κίνδυνο βραδυκαρδίας και μερικές φορές κολποκοιλιακού αποκλεισμού, ειδικά σε άτομα με προδιάθεση. Επιπροσθέτως, ο κίνδυνος συγκοπής (λιποθυμία) βρέθηκε αυξημένος σε σχέση με το πλασέμπο. HUPERZINE A 1, 44 ΣΧΗΜΑ 18: Χημική δομή, εταιρίες κυκλοφορίας και πωλήσεις του Huperzine A Το Huperzine A (εμπορικά γνωστό ως Cerebra, Σχήμα 18) είναι ένα φυσικό αλκαλοειδές σεσκιτερπένιο που βρέθηκε σε εκχυλίσματα από το φυτό Huperzia serrate. Ξεκίνησε να εμπορεύεται στην Κίνα για τη θεραπεία της AD το 1995.Το φάρμακο χορηγείται σε χαμηλές p.o δόσεις των 0,1mg τέσσερις φορές την ημέρα. Η Shasun Pharmaceuticals και η Debiopharm βρίσκονται σε συμφωνία αδειοδότησης για την κατασκευή και διάθεσή του. Το Huperzine Α είναι ένας αναστρέψιμος αναστολέας ακετυλοχολινεστεράσης που διασχίζει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. 36

37 TACRINE 1, 42 ΣΧΗΜΑ 19: Χημική δομή, εταιρίες κυκλοφορίας και πωλήσεις της Τακρίνης Η Τακρίνη (Σχήμα 19) ήταν ο πρώτος αναστολέας χολινεστεράσης που εγκρίθηκε για τη θεραπεία της νόσου του Alzheimer και κυκλοφόρησε στο εμπόριο με την εμπορική ονομασία Cognex. Λειτουργεί επίσης ως αναστολέας της ισταμινικής Ν-μεθυλοτρανσφεράσης. Η τακρίνη απορροφάται ταχέως. Η απόλυτη βιοδιαθεσιμότητα της τακρίνης είναι περίπου 17%. Ύστερα από μελέτες διαπιστώθηκε ότι έχει μικρό ευεργετικό αποτέλεσμα στη γνωστική λειτουργία, αν και τα δεδομένα της μελέτης ήταν περιορισμένα και η κλινική σημασία αυτών των ευρημάτων ήταν ασαφής. Η τακρίνη σταμάτησε να κυκλοφορεί στις ΗΠΑ το 2013, λόγω ανησυχιών για την ασφάλεια του φαρμάκου. MEMANTINE 1, 43 ΣΧΗΜΑ 20: Χημική δομή, εταιρίες κυκλοφορίας και πωλήσεις της Μεμαντίνης Η Μεμαντίνη (εμπορικά γνωστή ως Namenda, Axura, Ebixa και Memary, Σχήμα 20) είναι το πρώτο μιας νέας κατηγορίας φαρμάκων της νόσου του Αλτσχάιμερ που ονομάζονται 37

38 ανταγωνιστές μέτριας συγγένειας του υποδοχέα NMDA. Τα φάρμακα αυτά μειώνουν ορισμένους τύπους εγκεφαλικής δραστηριότητας με δέσμευση στους υποδοχείς NMDA σε κύτταρα εγκεφάλου και παρεμποδίζοντας την δραστηριότητα του γλουταμινικού νευροδιαβιβαστή. Σε φυσιολογικά επίπεδα, το γλουταμινικό βοήθα στη μνήμη και στη μάθηση, αλλά σε υψηλά επίπεδα, το γλουταμινικό φαίνεται να υπερδιεγείρει τα νευρικά κύτταρα και να τα σκοτώνει μέσω διέγερτο-τοξικότητας Η μεμαντίνη συντέθηκε για πρώτη φορά από τον Eli Lilly and Company το 1968 ως πιθανός παράγοντας για τη θεραπεία του διαβήτη αλλά ήταν αναποτελεσματική στην μείωση του σακχάρου στο αίμα. Αργότερα ανακαλύφθηκε ότι έχει δραστηριότητα στο ΚΝΣ και αναπτύχθηκε από την Merz για την αντιμετώπιση της άνοιας ενώ στις κλινικές δοκιμές ανακαλύφθηκε και η δράση της έναντι των υποδοχέων NMDA.Το 2000, η Merz συνεργάστηκε με την Forest,την Suntory και την Lundbeck για την εμπορευματοποίηση του φαρμάκου στις ΗΠΑ,την Ιαπωνία και την Ευρώπη αντίστοιχα. Οι πωλήσεις του φαρμάκου έφτασαν τα 1,8 δισεκατομμύρια δολάρια για το 2014 ενώ το κόστος είναι περίπου 269 έως 489 δολάρια το μήνα. RIVASTIGMINE 1-5, 41 ΣΧΗΜΑ 21: Χημική δομή της Ριβαστιγμίνης Η Ριβαστιγμίνη (το τρυγικό του άλας είναι εμπορικά γνωστό ως Exelon, Σχήμα 21) αναπτύχθηκε από το τμήμα Φαρμακολογίας του Εβραϊκού Πανεπιστημίου της Ιερουσαλήμ και πωλήθηκε στην Novartis από την Yissum. Κυκλοφόρησε ως φάρμακο για την θεραπεία της 38

39 ήπιας έως μέτριας μορφής άνοιας της AD το 2000 στην ΕΕ και στις ΗΠΑ και το 2010 στην Ιαπωνία. Επίσης έχει εγκριθεί η χρήση της Ριβαστιγμίνης για την θεραπεία της άνοιας με ήπια έως μέτρια οξύτητα που σχετίζεται με την νόσο Parkinson. Η Ριβαστιγμίνη λειτουργεί ως αναστολέας της AChE (IC50=4.1μM) ενώ παράλληλα αναστέλλει ισχυρά και την BChE (IC50=37nM) η οποία είναι επίσης υπεύθυνη για την υδρόλυση της ACh. Με αυτόν τον τρόπο αυξάνει τα επίπεδα και την διάρκεια της δράσης του νευροδιαβιβαστή ACh. Επιπλέον, πρόσφατες κλινικές δοκιμές έδειξαν ότι οι ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με rivastigmine παρουσίασαν μικρές φλοιώδεις ατροφικές μεταβολές και εξασθενημένη απώλεια εγκεφαλικού όγκου, κάτι το οποίο επιβεβαίωσε την υπόθεση ότι η αναστολή και των δύο ενζύμων μπορεί να έχει νευροπροστατευτικά και τροποποιητικά αποτελέσματα στη νόσο. Ο μηχανισμός δράσης της Ριβαστιγμίνης στηρίζεται στην δημιουργία ενός καρβαμοϋλιωμένου συμπλόκου με την Σερίνη του ενεργού κέντρου του ενζύμου, όπου δημιουργεί μια κατάσταση ψευδό-μη αναστρέψιμης αναστολής που διαρκεί περίπου δέκα ώρες. Το φάρμακο μπορεί να χορηγηθεί δια μέσου του στόματος ή μέσω διαδερμικού έμπλαστρου. Όταν χορηγείται δια του στόματος, η ριβαστιγμίνη παρουσιάζει βιοδιαθεσιμότητα περίπου 60-72% στη δόση των 3 mg. Οι φαρμακοκινητικές είναι γραμμικές για δόσεις μέχρι 3 mg δύο φορές ημερησίως, αλλά μη γραμμικές σε υψηλότερες δόσεις. Η αποβολή από τον οργανισμό γίνεται μέσω των ούρων. Οι μέγιστες συγκεντρώσεις στο πλάσμα εμφανίζονται σε περίπου μία ώρα, με μέγιστες συγκεντρώσεις στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό σε 1,4-3,8 ώρες. Όταν χορηγείται με διαδερμικό έμπλαστρο μία φορά την ημέρα, το φαρμακοκινητικό προφίλ της Rivastigmine είναι πολύ πιο ομαλό, σε σύγκριση με τις κάψουλες, με χαμηλότερες μέγιστες συγκεντρώσεις στο πλάσμα και μειωμένες διακυμάνσεις. Το έμπλαστρο Rivastigmine 9,5 mg / 24 h παρέχει συγκρίσιμα αποτελέσματα με την δοσολογία 12 mg / ημέρα υπό μορφή κάψουλων(υψηλότερη συνιστώμενηp.o. ). Ο χρόνος ημίσειας ζωής του φαρμάκου είναι 1.5 ώρα. Η μεταβολική οδός της Ριβαστιγμίνης δεν εξαρτάται από το σύστημα P450 του ύπατος, γεγονός που μειώνει τον κίνδυνο αλληλεπιδράσεων με άλλα φάρμακα. Το 2006, χρησιμοποιήθηκε σε περισσότερα από 6 εκατομμύρια ασθενείς παγκοσμίως. Οι πωλήσεις της Ριβαστιγμίνης για το 2013 ανέρχονταν στα δισεκατομμύρια USD για την 39

40 Novartis ενώ οι πωλήσεις από την Ono Pharmaceuticals (εμπορεύεται το διαδερμικό έμπλαστρο στην Ιαπωνία) για το 2012 απέφεραν κέρδη 48.8 εκατομμυρίων USD. Όλα τα παραπάνω δεδομένα και σε σύγκριση με τα υπόλοιπα φάρμακα οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η Ριβαστιγμίνη αποτελεί το κορυφαίο μέχρι στιγμής φάρμακο για την αντιμετώπιση των γνωστικών δυσλειτουργιών της νόσους Alzheimer Α.5 ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΟΙ ΠΡΟΣΔΕΤΕΣ (MTDLs) ΓΙΑ ΓΝΩΣΤΙΚΈΣ ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ Μέχρι σήμερα η έρευνα για την εύρεση νέων φαρμάκων στοχεύει στην ανακάλυψη μικρών μορίων ικανών να διαμορφώνουν και να ρυθμίζουν την βιολογική λειτουργία μίας και μόνο πρωτεΐνης-στόχου, η οποία θεωρείται υπεύθυνη για μία συγκεκριμένη ασθένεια. Μεγάλη προσπάθεια έχει καταβληθεί για την επίτευξη εκλεκτικότητας ως προς τον δεδομένο βιολογικό στόχο και μάλιστα σήμερα είναι διαθέσιμοι πολλοί προσδέτες (ligands) με εξαιρετική in vitro εκλεκτικότητα. Αυτή η μεθοδολογία του ενός μορίου-ενός στόχου έχει οδηγήσει στην ανακάλυψη πολλών επιτυχημένων φαρμάκων και πιθανότατα θα παραμείνει ορόσημο για τα επόμενα χρόνια. Τα φάρμακα που στοχεύουν σε έναν μόνο βιολογικό στόχο έχουν αποδειχτεί ανεπαρκή για την θεραπεία ασθενειών που περιλαμβάνουν πολλαπλούς παθογόνους παράγοντες όπως ο διαβήτης, οι καρδιαγγειακές παθήσεις και τα νευροεκφυλιστικά σύνδρομα. Όταν ένα μόνο φάρμακο δεν είναι επαρκές για την αποτελεσματική θεραπεία μίας νόσου τότε χρησιμοποιείται μια πολλαπλή φαρμακευτική αγωγή (Multi-Modal Therapy, MMT, «κοκτέιλ» φαρμάκων). Ένα «κοκτέιλ» αποτελείται από δύο ή τρία διαφορετικά φάρμακα που συνδυάζουν διαφορετικούς θεραπευτικούς μηχανισμούς. Η προσέγγιση αυτή ωστόσο μειονεκτεί ως προς τους ασθενείς που παρουσιάζουν προβλήματα συμμόρφωσης (ξεχνάνε ή αποφεύγουν να λάβουν την φαρμακευτική αγωγή). Μια δεύτερη προσέγγιση αποτελεί η χρήση σκευασμάτων που περιέχουν περισσότερες από μία δραστικές ουσίες (Fixed Dose Combination, FDC) που συνεπάγεται την ενσωμάτωση διαφορετικών φαρμάκων σε ένα προκειμένου να απλουστευθούν τα σχήματα δοσολογιών και να βελτιωθεί η συμμόρφωση του ασθενή. Μια νέα και πολύ ελπιδοφόρα στρατηγική για την θεραπεία διαταραχών με σύνθετους παθολογικούς μηχανισμούς βασίζεται στην υπόθεση ότι μια μεμονωμένη ένωση μπορεί να 56, 57 40

41 σχεδιαστεί έτσι ώστε να δρα εκλεκτικά σε πολλούς στόχους. Σαφώς, μία θεραπεία με ένα μόνο φάρμακο που έχει πολλαπλές βιολογικές ιδιότητες θα έχει εγγενή πλεονεκτήματα έναντι των MMT και FDC. Θα απέτρεπε την πρόκληση της χορήγησης πολλαπλών οντοτήτων ενός φαρμάκου, που θα μπορούσαν να έχουν διαφορετικές βιοδιαθεσιμότητες, φαρμακοκινητική και μεταβολισμό. Επιπλέον, όσον αφορά τη φαρμακοκινητική μέσω της βελτιστοποίησης των ADMET, η κλινική ανάπτυξη ενός φαρμάκου που μπορεί να επιδράσει σε πολλαπλούς στόχους δεν διαφέρει από την ανάπτυξη παραδοσιακών μορίων που δρουν σε έναν και μόνο στόχο. Επιπλέον, θα αποφευχθεί ο κίνδυνος πιθανών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των φαρμάκων ενώ η θεραπευτική αγωγή θα είναι πολύ πιο απλουστευμένη σε σχέση με την MMT. Όλες αυτές οι εκτιμήσεις έχουν ιδιαίτερη σημασία, καθώς μία από τις σημαντικότερες συμβολές στην ατρησία κατά την ανάπτυξη φαρμάκων εξακολουθεί να είναι το φαρμακοκινητικό προφίλ. Υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι η ανάπτυξη ενώσεων που μπορούν να επιτύχουν βιολογική δράση σε πολλαπλούς στόχους μπορεί να αποκαλύψει νέες οδούς σε θεραπείες, για παράδειγμα, σε αυτή των σημαντικότερων νευροεκφυλιστικών ασθενειών, για τις οποίες μια αποτελεσματική θεραπεία είναι επείγουσα ανάγκη. ΣΧΗΜΑ 22: Μονοπάτια που οδηγεί στην ανακάλυψη νέων φαρμάκων: (α) Ένα μόριο-ένας στόχος προσέγγιση. (b) MTDLs προσέγγιση Μια σύγχρονη τάση που έχει αναπτυχθεί τα τελευταία χρόνια για την αντιμετώπιση γνωστικών διαταραχών είναι η σύνθεση ενώσεων οι οποίες από σχεδιασμού τους στοχεύουν εκλεκτικά συγκεκριμένους και λίγους βιολογικούς στόχους παράγοντας συνεργική δράση για την 41

42 καταπολέμηση μίας νόσου ή περισσότερων ορίζονται ως πολυδυναμικοί προσδέτες (Multimodal ligands ή Μulti-target-directed-ligands{MTDLs}). Αυτή η σύγχρονη τάση έχει κεντρίσει το ενδιαφέρον σύσσωμης της επιστημονικής κοινότητας και έχουν ήδη αναπτυχθεί μερικά μόρια με MTDLs ικανότητες. Παρακάτω θα αναφέρουμε μερικά παραδείγματα MTDLs και τους διάφορους συνδυασμούς βιολογικών στόχων που έχουν μελετηθεί: ACHE ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ + H3 ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ 58, 59, 63 O συνδυασμός αναστολής της AChE και ανταγωνισμού στους Η3 σε ένα μόνο μόριο μπορεί να ενισχύσει τη χολινεργική νευροδιαβίβαση στον φλοιό σε μεγαλύτερο βαθμό σε σχέση με την αποκλειστική δράση στον έναν ή άλλον στόχο. Στο σχήμα 23 παρατίθενται μερικά μόρια που έχουν συντεθεί και εμφανίζουν σημαντική πρόσδεση στα Η3 / AChE με εκλεκτικότητα έναντι άλλων στόχων. ΣΧΗΜΑ 23: Πολυδύναμοι προσδέτες με AChE ανασταλτική και Η 3 ανταγωνιστική δράση AChE ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ + BACE1 ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ+ H3 ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ 60 O συνδυασμός αναστολής της AChE και ανταγωνισμού στους Η3 σε ένα μόνο μόριο μπορεί να παρουσιάσει συνεργικά αποτελέσματα για τη βελτίωση των γνωστικών δυσλειτουργιών μπορούν 42

43 να ενισχύσουν συνεργικά τη χολινεργική νευροδιαβίβαση. Αν ακόμη προσθέσουμε ανασταλτική BACE1 δράση ταυτόχρονα θα περιοριστούν η παραγωγή Αβ και η υδρόλυση της ACh ενώ επίσης θα εξασθένιση η αλληλεπίδραση μεταξύ ACh και Αβ. Μόρια που μπορούν να εμφανίσουν τέτοια συνεργική δράση ενδέχεται να παρουσιάσουν καλύτερα θεραπευτικά αποτελέσματα της νόσου Αλτσχάιμερ ΣΧΗΜΑ 24: Ένωση με G AChE, BACE1 ανασταλτική και Η 3 ανταγωνιστική δράση AChE ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ + MAO-Β ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ 56, 57, 61 Είναι ευρέως αποδεκτό ότι η γνωστική παρακμή σχετίζεται περισσότερο με την απώλεια χολινεργικών και γλουταμινεργικών νευρώνων. Ωστόσο, η αλλαγή της συμπεριφοράς δεν σχετίζεται μόνο με το μέγεθος της χολινεργικής απώλειας αλλά και με αλλοιώσεις στα σεροτονινεργικά και νοραδρενεργικά συστήματα. Για παράδειγμα, τα νοραδρενεργικά ελλείμματα της AD συνδέονται με κατάθλιψη. Αντιθέτως, τα σεροτονινεργικά ελλείμματα συνδέονται με κατάθλιψη και ψύχωση. Επομένως, προκύπτουν ευκαιρίες για θεραπευτική παρέμβαση με φάρμακα που αυξάνουν τη δραστηριότητα των βιογενών αμινών, είτε μόνα τους είτε ως MMT / FDC με ενώσεις που δρουν στο χολινεργικό σύστημα. Πρόσφατες μελέτες έχουν οδηγήσει στον σχεδιασμό μορίων με AChE και ΜΑΟ (μονοάμινο-οξειδάση) ανασταλτική δράση. Τα πρώιμα δεδομένα υποδεικνύουν πιθανά συνεργικά αποτελέσματα και δείχνουν την αναστολή της ΜΑΟ-Β ως ενδιαφέρουσα ιδιότητα που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά το σχεδιασμό MTDL για την AD. Πέραν της μείωσης της συγκέντρωσης των βιογενών μονοαμινών μέσω της αποδόμησής τους, η ΜΑΟ-Β, κατά τη διάρκεια της καταλυτικής αποαμίνωσης των συγκεκριμένων νευροδιαβιβαστών [νοραδρεναλίνη, ντοπαμίνη (DA) και σεροτονίνη (5-ΗΤ)], 43

44 παράγει υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2) το οποίο αποτελεί πιθανή πηγή οξειδωτικού στρες για ευάλωτους νευρώνες που σχετίζονται με την AD. Μια τέτοια ένωση το Ladostigil (αναπτύσσεται από την Avraham Pharmaceuticals, υπό την άδεια της Yissum Research Development, μια πλήρως ελεγχόμενης εταιρείας του Εβραϊκού Πανεπιστημίου της Ιερουσαλήμ) συνδυάζει το καρβαμικό τμήμα του αναστολέα BChE και AChE Rivastigmine με τη φαρμακοφόρο δομή προπαργυλαμίνης των αναστολέων ΜΑΟ-Β Selegiline και Rasagiline (σχήμα 25), συνδυάζοντας έτσι τους μηχανισμούς δράσης των παλαιότερων φαρμάκων σε ένα μόνο μόριο. ΣΧΗΜΑ 25: Στρατηγική σχεδίασης του αναστολέαache και ΜΑΟ-Β Ladostigil Το Ladostigil είναι ένας νέος νευροπροστατευτικός παράγοντας που διερευνάται για τη θεραπεία νευροεκφυλιστικών διαταραχών όπως η νόσος του Alzheimer, η νόσο του Lewy και η ασθένεια του Parkinson. Δρα ως αναστρέψιμος αναστολέας ακετυλοχολινεστεράσης και βουτυρυλοχολινεστεράσης και ως μη αναστρέψιμος αναστολέας. Εκτός από τις νευροπροστατευτικές του ιδιότητες, το Ladostigil ενισχύει την έκφραση νευροτροφικών 44

45 παραγόντων, γεγονός που μπορεί να αναστρέψει μερικές από τις βλάβες που παρατηρούνται στις νευροεκφυλιστικές ασθένειες μέσω της επαγωγής νευρογενέσεως. Το Ladostigil έχει επίσης αντικαταθλιπτική δράση. Το Ladostigil βρίσκεται σήμερα σε κλινικές δοκιμές Φάσης ΙΙb σε 190 ασθενείς στην Ευρώπη για τη δια του στόματος θεραπεία της AD και σε δοκιμές φάσης ΙΙ στο Ισραήλ και την Ευρώπη σε ασθενείς που πάσχουν από ήπια γνωστική εξασθένηση (MCI). A.6 ΝΤΟΠΑΜΙΝΗ, ΑΝΤΙΨΥΧΩΣΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΓΝΩΣΤΙΚΗ ΕΚΠΤΩΣΗ Η ντοπαμίνη είναι ένας νευροδιαβιβαστής που μεσολαβεί στις φυσιολογικές λειτουργίες τόσο στο κεντρικό όσο και στο περιφερικό νευρικό σύστημα μέσω αλληλεπίδρασης με υποδοχείς που βρίσκονται στην επιφάνεια των νευρικών κυττάρων. Οι υποδοχείς ντοπαμίνης είναι μια κατηγορία υποδοχέων συζευγμένων με G πρωτεΐνες που είναι εμφανή στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ). Οι υποδοχείς ντοπαμίνης εμπλέκονται σε πολλές νευρολογικές διεργασίες, όπως η δημιουργία κινήτρου, η διάθεση, το cognition, η μνήμη και η διαμόρφωση της νευροενδοκρινικής σηματοδότησης. Η μη φυσιολογική σηματοδότηση των υποδοχέων της ντοπαμίνης και η δυσλειτουργία των ντοπαμινεργικών οδών εμπλέκονται σε διάφορες νευροψυχιατρικές διαταραχές. Έτσι, οι υποδοχείς ντοπαμίνης είναι συνήθεις στόχοι φαρμάκων του ΚΝΣ. Τα αντιψυχωσικά είναι συχνά ανταγωνιστές υποδοχέων ντοπαμίνης και συγκεκριμένα του υποδοχέα D2, τα ψυχοδιεγερτικά είναι συνήθως έμμεσοι αγωνιστές υποδοχέων ντοπαμίνης και τα αντιπαρκινσονικά είναι αγωνιστές των υποδοχέων ντοπαμίνης ή L-DOPA (η πρόδρομη ουσία της ντοπαμίνης). Με βάση τα βιοχημικά και φαρμακολογικά αποτελέσματα, οι υποδοχείς της ντοπαμίνης ταξινομούνται σε υποδοχείς τύπου D1 και D2 Η υποοικογένεια υποδοχέων τύπου D2 περιλαμβάνει τους υποδοχείς D2, D3 και D4, οι οποίοι είναι ειδικά συζευγμένοι με πρωτεΐνες Gai και Ga0. Μετά τη δέσμευση ντοπαμίνης ή μορίων αγωνιστών, οι πρωτεΐνες Ga προάγουν την αντικατάσταση της GDP με GTP και η α-υπομονάδα διαχωρίζεται από το σύμπλοκο βγ. Σε αυτό το σημείο τόσο η α-υπομονάδα όσο και το σύμπλοκο βγ είναι ελεύθερα να μετάγουν σήμα και να ενεργοποιήσουν ένα αριθμό συστημάτων τελεστή. Οι υποοικογένειες Gαi και Gαoμειώνουν την παραγωγή κυκλικού ΑΜΡ μέσω της αναστολής της αδενυλικής κυκλάσης (AC), οδηγώντας σε μειωμένη ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α (ΡΚΑ). Το PKA διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη νευροπλαστικότητα. Επιπλέον, το σύμπλοκο υπομονάδος Gβγ ενεργοποιεί τη φωσφολιπάση C (PLC) που οδηγεί στην παραγωγή τριφωσφορικής ινοσιτόλης (IP3) που 45

46 φωσφορυλιώνει περαιτέρω άλλους βιολογικούς στόχους κατά μήκος του καταρράκτη σηματοδότησης. ΣΧΗΜΑ 26: Ενδοκυτταρική απόκριση των D 2 υποδοχέων Είναι πλέον επιστημονικά αποδεκτό ότι ο ντοπαμινικός υποδοχέας D2 είναι ο κύριος υποδοχέας δράσεις όλων των αντιψυχωσικών φαρμάκων που δρουν ανταγωνιστικά ως προς αυτόν (μπλοκάροντας την περεταίρω βιολογική του απόκριση). Στα άτομα με σχιζοφρένεια, οι γνωστικές ικανότητες - συμπεριλαμβανομένης της μνήμης - συνδέονται στενά με τη συναπτική ισχύ. Η μακροπρόθεσμη ενδυνάμωση (LTP) είναι μια μορφή νευροπλαστικότητας που πιστεύεται ότι είναι η φυσιολογική βάση της μνήμης. Έχει θεωρηθεί ότι τα αντιψυχωτικά φάρμακα μπορούν να βλάψουν την LTP και τη γνωστική λειτουργία μεταβάλλοντας τη ντοπαμινεργική μετάδοση. Έτσι, πραγματοποιήθηκε μια συστηματική ανασκόπηση για να εκτιμηθεί η σχέση μεταξύ των αντιψυχωσικών και των ανταγωνιστών του D2 υποδοχέα με την LTP. Η πλειονότητα των μελετών σχετικά με την LTP και τα αντιψυχωσικά έδειξε ότι η οξεία χορήγηση τους σχετίζεται με διαταραχές της LTP σε μοντέλα φυσιολογικών ζώων. Αντίθετα, για τη χρόνια χορήγηση αντιψυχωσικών σε ζωικά μοντέλα σχιζοφρένιας δε βρέθηκε συσχέτιση με την LTP. Τυπικά και άτυπα αντιψυχωσικά καθώς και άλλοι D2 ανταγωνιστές συμπεριφέρθηκαν παρομοίως, με εξαίρεση την κλοζαπίνη και την ολανζαπίνη. Η κλοζαπίνη προκάλεσε ενίσχυση της LTP ανεξάρτητα από την τετανίωση, ενώ η ολανζαπίνη διευκόλυνε την επαγόμενη από τετάνου ενίσχυση της LTP. Επίσης η χρόνια χρήση άλλον αντιψυχωσικών όπως το Haloperidol ή το Risperidone σε μερικές μελέτες δείχνουν να επηρεάζουν θετικά την LTP και σε άλλες να μην το επηρεάζουν καθόλου. Παράδειγμα 46

47 αντιψυχωσικού φαρμάκου με θετική επίδραση στις γνωστικές λειτουργίες είναι η καριπραζίνη που βελτίωσε την έκπτωση μάθησης σε ποντίκια που τους είχε προηγουμένως δοθεί σκοπολαμίνη. Αν και αρχικά αυτό αποδόθηκε στον ισχυρό μερικό αγωνισμό που επιδεικνύει η καριπραζίνη στους υποδοχείς D2 και D3, περαιτέρω μελέτες κρίνονται αναγκαίες για την κατανόηση αυτής της φαρμακολογικής συσχέτισης. 12 Γενικά η χρησιμότητα των υπαρχουσών μελετών περιορίζεται στη μοντελοποίηση και προβολή αποτελεσμάτων που έχουν προκύψει από δοκιμές αντιψυχωσικών φαρμάκων σε ζωικά μοντέλα φυσιολογικού τύπου σε ασθενείς με σχιζοφρένεια. Για την καλύτερη κατανόηση των επιδράσεων αυτών των φαρμάκων στις γνωστικές λειτουργίες ασθενών χρειάζονται περαιτέρω μελέτες πάνω σε ασθενείς με σχιζοφρένεια οι οποίοι λαμβάνουν χρόνια αντιψυχωτική θεραπεία. Όλα τα παραπάνω δεδομένα καθιστούν τον ντοπαμινικό υποδοχέα D2 ως έναν αμφιλεγόμενο στόχο για γνωστικές διαταραχές καθώς πολλά βιοχημικά αποτελέσματα του μερικού αγωνισμού και ανταγωνισμού του, δεν συμπίπτουν με τα κλινικά, όπου πολύ ασθενείς που πάσχουν από σχιζοφρένεια παρουσιάζουν γνωστική εξασθένηση η οποία όμως βελτιώνεται με την χρήση αντιψυχωσικών. 12 Τα αντιψυχωσικά διακρίνονται σε τρείς κατηγορίες, αντιπροσωπευτικά μέλη αυτών απεικονίζονται στο σχήμα 27. Τα αντιψυχωσικά πρώτης γενιάς, (τυπικά), τα οποία ανακαλύφθηκαν τη δεκαετία του 1950, τα αντιψυχωσικά δεύτερης γενιάς, (άτυπα), τα οποία αναπτύχθηκαν τα τελευταία 20 χρόνια. Και οι δύο αυτές γενιές φαρμάκων τείνουν να δρουν ανταγωνιστικά στους υποδοχείς της ντοπαμίνης (κυρίως τον D2) του εγκεφάλου, ενώ επιπλέον τα δεύτερης γενιάς φάρμακα τείνουν να δρουν και στους υποδοχείς σεροτονίνης 5ΗΤ2. Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί αντιψυχωσικά τρίτης γενιάς τα οποία είναι μερικοί 6, 30 αγωνιστές του υποδοχέα D2. 47

48 ΣΧΗΜΑ 27: Παραδείγματα πρώτης, δεύτερης και τρίτης γενιάς αντιψυχωσικών Αν και όλα τα αντιψυχωσικά δεσμεύονται στον υποδοχέα D2 και αυτό το φαινόμενο φαίνεται άμεσα από το θεραπευτικό αποτέλεσμα (για τα θετικά συμπτώματα), είναι σημαντικό να τονιστεί ότι σχεδόν όλα τα αντιψυχωσικά θεωρούνται "βρώμικα" φάρμακα διότι έχουν πολύπλευρη φαρμακολογία και συνεπώς πολύπλοκη και εκτεταμένη δράση πέραν της ντοπαμινεργικής, (Πίνακες 1 και 2)

49 Πίνακας 1: Τιμές K i(nm) διαφόρων αντιψυχωσικών για ανθρώπινους υποδοχείς ντοπαμίνης και σεροτονίνης 6 49

50 Πίνακας 2: Τιμές Κ ι(nm) διαφόρων αντιψυχωσικών για ανθρώπινους αδρενεργικούς, μουσκαρινικούς και ισταμινικούς υποδοχείς 6 50

51 Στην πραγματικότητα, με ελάχιστες εξαιρέσεις, τα αντιψυχωσικά παρουσιάζουν αξιοσημείωτη συγγένεια και προσδεσιμότητα με τους σεροτονικούς (5-ΗΤ), μουσκαρινικούς και ισταμινεργικούς υποδοχείς. Αυτή η πολυδιάστατη βιολογική δράση των αντιψυχωσικών είναι και αιτία πολλών παρενεργειών. Η μακροχρόνια χρήση αντιψυχωσικών συνδέεται με εξωπυραμιδικές παρενέργειες (κινητικές διαταραχές, δυστονία, Parkinson), γυναικομαστία και μεταβολικό σύνδρομο. Συνδέονται επίσης με αυξημένη θνησιμότητα σε ηλικιωμένους με άνοια. Συνεπώς είναι πιθανό, κάποια φαινόμενα επιδείνωσης των γνωστικών λειτουργιών να συνδέονται με την ενδεχομένως ανεπιθύμητη δράση τους σε πολλαπλούς στόχους. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει εγκεκριμένο αντιψυχωτικό που να δρα αμιγώς στους υποδοχείς D2 και D3, η επίπτωση του ντοπαμινεργικού ανταγωνισμού στη γνωστική λειτουργία δεν έχει αποσαφηνιστεί. Στα πλαίσια συνεργασίας γερμανικού ακαδημαϊκού εργαστηρίου με γαλλική εταιρία, δημοσιεύθηκε μια προσπάθεια διερεύνησης της πιθανής συνέργειας μεταξύ αντιντοπαμινεργικής και αντιισταμινικής δράσης με στόχο τη βελτίωση των γνωστικών λειτουργιών. Συγκεκριμένα, συντέθηκαν πολυδύναμα μόρια με διπλή ανταγωνιστική δράση στους υποδοχείς D2 και Η3 (σημαντικός παράγοντας για τη γνωστική λειτουργία) που συνδυάζουν αντίστοιχα δομικά χαρακτηριστικά του Η3 ανταγωνιστή Pitolisant και αντιψυχωτικών, κυρίως πρώτης γενιάς, όπως τα Amitriptyline, Fluphenazine, Clozapine, Chlorpromazine και Maprotiline. Το υβριδικό παράγωγο Pitolisant - Fluphenazine (Σχήμα 28) αποδείχθηκε το καλύτερο της σειράς και επιδεικνύει ταυτόχρονη σημαντική ανασταλτική δράση τόσο στους κυριότερους ντοπαμινεργικούς υποδοχείς όσο και στον Η3 και αναμένεται να έχει θετικότερη επιρροή στις γνωστικές λειτουργίες συγκριτικά με τα επιμέρους πατρικά μόρια. 64 ΣΧΗΜΑ 28: Πολυδύναμο μόριο H με Η 3, D 2 και D 3 ανταγωνιστική δράση. 51

52 Α.7 ΣΚΟΠΟΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η σύνθεση πολυδύναμων παραγώγων της ριβαστιγμίνης που εκτός της δεδομένης ανασταλτικής τους δράσης ως προς την ακετυλοχολινεστεράση θα μπορούν να δρουν και ως ανταγωνιστές ή ως μερικοί αγωνιστές του D2 υποδοχέα της ντοπαμίνης, ώστε να διαλευκανθεί ο ρόλος του D2 ως προς τις γνωστική λειτουργία. Αξίζει να σημειωθεί ότι πολυδύναμα μόρια που συνδυάζουν αυτές τις δύο δράσεις δεν έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία. Η βιβλιοθήκη πολυδύναμων μορίων αναστολέων ΑChE/D2 που στοχεύεται στη συγκεκριμένη εργασία, περιέχει ποικιλομορφία τόσο σε εκείνο το τμήμα της δομής που αφορά την πρόσδεση στον D2 όσο και σε εκείνο που αφορά την πρόσδεση στην ΑChE. Συγκεκριμένα, για την πρόσδεση στον D2 θα επιστρατευτεί το δομικό τμήμα των αρυλοπιπεραζινών από εγκεκριμένα αντιψυχωσικά φάρμακα πρώτης (αλοπεριδόλη), δεύτερης (ζιπρασιδονη, λουρασιδονη, ρισπεριδόνη) και τρίτης (αριπιπραζολη, μπρεξιπιπραζόλη) γενιάς. ΣΧΗΜΑ 29 : Χημικές δομές των εγκεκριμένων αντιψυχωσικών φαρμάκων αριπιπραζολη, ζιπρασιδονη, λουρασιδονη, ρισπεριδόνη και αλοπεριδόλη

53 Τα παραπάνω θα συνδυαστούν με το βενζυλικό τμήμα της ριβαστιγμίνης και υποκατεστημένων ισομερών του καθώς έχει αναφερθεί ότι παράγωγα αυτών με διάφορες αμίνες διατηρούν ισχυρή ανασταλτική δράση για την ΑChE. Αυτό αποτυπώνεται στον Πίνακα 3 όπου φαίνονται οι δομικές τροποποιήσεις που επιδέχεται η ριβαστιγμίνη στο βασικό άμινο- τμήμα της χωρίς να χάνεται ή ακόμη και να ενισχύεται η ανασταλτική του AChE και BChE δράση 2. Πιπεραζινικά παράγωγα όμως δεν φαίνεται να έχουν εξεταστεί και θα αποτελέσουν αντικείμενο αυτής της μελέτης (Σχήμα 30). Ένωση Θέση υποκατάστασης R3 NR1R2 IC50AChE (μμ) IC50 BChE Donepezil Rivastigmine Ortho H Piperidine a Meta H Piperidine b Morpholine c Pyrrolidine d Diethylamine e CH3 Piperidine f Morpholine g Pyrrolidine h Diethylamine a Para H Piperidine b Morpholine c Pyrrolidine d Diethylamine e CH3 Piperidine f Morpholine g Pyrrolidine h Diethylamine (μμ) Πίνακας 3: Αναστολή παραγώγων της Ριβαστιγμίνης έναντι των AChE και BChE. 2 53

54 ΣΧΗΜΑ 30: Φαρμακοφόρες δομές της ΑChe και του D 2 υποδοχέα που θα συνδυαστούν. 54

55 Β. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Β.1 ΑΝΤΙΘΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΧΗΜΑ 31: Αντιθετική ανάλυση των μορίων στόχων, όπου Χ= Ν ή CH, Y= H ή CH 3, Z= H ή OCH 3 και Ar= το υπόλοιπο αρωματικό κομμάτι που είναι συνδεδεμένο με την αντίστοιχη πιπεραζίνη ή πιπεριδίνη. Η ένωση Β1 μπορεί να προκύψει από την αντίδραση αναγωγικής αλκυλίωσης μεταξύ της καρβονυλομάδας της ένωσης Β2 και της δευτεροταγής αμινομάδας της ένωσης Β3. Η καρβαμόϋλο ομάδα της ένωσης Β2 μπορεί να προέλθει από αντίδραση της φαινόλης της ένωσης Β4 με το εμπορικά διαθέσιμο Ν-αίθυλο-Ν-μέθυλο-καρβαμόϋλο χλωρίδιο (Β5). Με την σειρά της η ένωση Β3, όταν αυτή αποτελεί μία Ν-άρυλοπιπεραζίνη (Χ=Ν), μπορεί να προκύψει από την αντίστοιχη ανιλίνη και τη δις-(2-χλωροαιθυλ)αμίνη. ΣΧΗΜΑ 32: Υποκατεστημένες βενζαλδεΰδες και ακετοφαινόνες που χρησιμοποιήθηκαν 55

56 Β.2 ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΙΠΕΡΑΖΙΝΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ Αρχικά αποφασίστηκε να διερευνηθούν οι συνθήκες με τις οποίες θα μπορούσε να επιτευχθεί το πρώτο στάδιο της προτεινόμενης συγκλίνουσας σύνθεσης δηλαδή η σύνθεση των Ν-άρυλοπιπεραζινών. Η προσπάθεια αυτή ξεκίνησε με την π-φθόροανιλίνη ως πρότυπη ανιλίνη στην αντίδραση με περίσσεια δις(2-χλωροαίθυλ)αμίνης σε διάλυμα NMP/H2O παρουσία 2,6- λουτιδίνης στους 130 ο C. Η αντίδραση αυτή οδήγησε στο σχηματισμό πολλών παραπροϊόντων και συνεπώς τροποποιήθηκαν οι συνθήκες. Αλλάζοντας την αναλογία των δύο αντιδρώντων σε 1/1 σε μίγμα διγλίμης/ισοαμυλικής αλκοόλης (1/1 ως προς τους όγκους) ως διαλύτη στους 150 ο C η επιθυμητή Ν-(4-φθοροφαίνυλ)πιπεραζίνη 8 λήφθηκε σε ικανοποιητική απόδοση (45%) και υψηλή καθαρότητα, ενώ η κατεργασία καθαρισμού ήταν απλή και δεν απαιτήθηκε στήλη χρωματογραφίας. Αξίζει να σημειωθεί ότι στις ουδέτερες συνθήκες αποθαρρύνεται πιθανή παράπλευρη αντίδραση μεταξύ της προκύπτουσας Ν-άρυλο-πιπεραζίνης και της Ν-bis(2- χλωροαιθυλ)αμίνης. Βάση των νέων συνθηκών πραγματοποιήθηκε και η σύνθεση των υπολοίπων Ν-αρυλο-πιπεραζινών που παρουσιάζονται στο σχήμα 33. Η πορεία των αντιδράσεων μελετήθηκε με χρωματογραφία HPLC (σχήμα 34). Τα προϊόντα ταυτοποιήθηκαν με φασματοσκοπία ΕSI-MS και με 1 Η, 13 C NMR. ΣΧΗΜΑ 33 : Σύνθεση των αρυλοπιπεραζινών 8, 10, 12 και 14 56

57 ΣΧΉΜΑ 34: Παρακολούθηση αντίδρασης σύνθεσης της ένωσης 12 μέσω HPLC. Το πάνω χρωματογράφημα αναφέρεται στην 2,3-διχλωροανιλίνη (κορυφή στα 3.3min). Το μεσαίο αναφέρεται στον μίγμα της αντίδρασης σχηματισμού της ένωσης 12 (κορυφή στα 2.27min).Το κάτω αναφέρεται στο απομονωμένο κρυσταλλικό προϊόν 12 (η κορυφή στο 4.7min είναι της στήλης). Με ομοίως παρακολουθήθηκε η σύνθεση και των υπόλοιπων μορίων 8, 10 και

58 Ο μηχανισμός για της αντίδρασης αυτής περιλαμβάνει δύο στάδια: Αρχικά σχηματίζεται το μονοαλκυλιωμένο παράγωγο μεταξύ της υποκατεστημένης ανιλίνης και της υδροχλωρικής δις(2- χλωροαίθυλ)αμίνης μέσω μίας διαμοριακής SN2 υποκατάστασης και στην συνέχεια ακολουθεί μια ενδομοριακή SN2 υποκατάσταση του ενδιάμεσου μορίου προς σχηματισμό της Ν-άρυλοπιπεραζίνης (σχήμα 35). ΣΧΗΜΑ 35: Μηχανισμός σύνθεσης πιπεραζινών (ένωση 10). Οι κατεργασίες απομόνωσης των προϊόντων 10, 12, και 14 ήταν εξίσου απλές και αυτά λήφθηκαν σε υψηλή καθαρότητα όπως και η ένωση 8. Η ένωση 8 δεν θα χρησιμοποιηθεί για την σύνθεση παραγώγων ριβαστιγμίνης καθώς δεν έχει αποδεδειγμένα κάποια εκλεκτική δραστικότητα ως προς τον D2 υποδοχέα. Η 4-αρυλοπιπεριδίνη 15 και οι αρυλοπιπεραζίνες 16 και 17 (σχήμα 36) δεν συντέθηκαν διότι είναι εμπορικά διαθέσιμες σε προσιτή τιμή. ΣΧΗΜΑ 36: Χημικές δομές των ενώσεων 15, 16 και 17 58

59 Β.3 ΣΥΝΘΕΣΗ N-ΜΕΘΥΛΟ-Ν-ΑΙΘΥΛΟ-ΚΑΡΒΑΜΟΫΛΟ ΒΕΝΖΑΛΔΕΫΔΩΝ ΚΑΙ ΑΚΕΤΟΦΑΙΝΟΝΩΝ ΣΧΗΜΑ 37: : Αντιθετική ανάλυση των μορίων στόχων Η προτεινόμενη σύνθεση των ενώσεων Β1 εκτός των αρυλοπιπεριδινών/πιπεραζινών Β3 των οποίων η παρασκευή περιγράφηκε παραπάνω, απαιτεί και τη σύνθεση των αντίστοιχων N- μεθυλο-ν-αιθυλο-καρβαμοϋλο-βενζαλδεϋδών και ακετοφαινονών Β2 (Σχήμα 37). Για την σύνθεση αυτή χρησιμοποιήθηκαν αρχικά οι αντίστοιχες φαινόλες και το Ν-μέθυλο-Ν-αίθυλοκαρβαμόϋλο χλωριδίο σε διαλύτη DMF και NaH ως βάση αλλά οι αποδόσεις δεν ήταν ικανοποιητικές (περίπου 50%). Με βάση τη βιβλιογραφία 2-5 δοκιμάστηκε ως βάση το K2CO3σε διαλύτη EtOAc αλλά και πάλι οι αποδόσεις ήταν χαμηλές (περίπου 25%) με σημαντικό σχηματισμό προσμίξεων. Τα πειραματικά αυτά δεδομένα μας ώθησαν στην αναζήτηση νέων συνθηκών για την σύνθεση των καρβαμόϋλων παραγώγων και έτσι αποφασίστηκε η δοκιμή Et3N ως βάση σε συνδυασμό με καταλυτική ποσότητα DMAP (0,1eq) ώστε να ενεργοποιηθεί η καρβονυλομάδα του καρβαμόϋλου χλωριδίου. Παράλληλα εξετάστηκε και ο παράγοντας διαλύτης, δοκιμάζοντας MeCN και DCM υπό αδρανή ατμόσφαιρα Ν2 σε RT. Η προσπάθεια αυτή ήταν επιτυχής τόσο σε απόδοση (ακόμη και >99%) όσο και σε καθαρότητα ενώ η αντίδραση ολοκληρώνεται μόλις σε 10 ώρες. Το MeCN έδωσε υψηλότερη απόδοση από το DCM για αυτό και επιλέχθηκε ως διαλύτης για την σύνθεση και τον υπόλοιπων παραγώγων 59

60 (Σχήμα 38). Η πορεία των αντιδράσεων παρακολουθήθηκε με HPLC (σχήμα 39) και τα προϊόντα ταυτοποιήθηκαν τόσο με φασματοσκοπία ESI-MS όσο και με 1 Η, 13 C NMR. ΣΧΗΜΑ 38: Η αντίδραση σύνθεσης των καρβαμόϋλο παραγώγων και οι ενώσεις που συντέθηκαν με αυτή την μέθοδο καθώς και οι αντίστοιχες αποδόσεις που ελήφθησαν από το καθένα 60

61 ΣΧΗΜΑ 39: Παρακολούθηση αντίδρασης σύνθεσης της ένωσης 18 μέσω HPLC. Το πάνω χρωματογράφημα αναφέρεται στην 4-υδρόξυ-3-μεθόξυ-βενζαλδεύδη. Το κάτω χρωματογράφημα αναφέρεται στο απομονωμένο κρυσταλλικό προϊόν 18. Με όμοιο τρόπο παρακολουθήθηκε η σύνθεση και των υπόλοιπων μορίων 19, 20, 21, 22 και

62 Β.4 ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΑΣΤΙΓΜΙΝΗΣ ΜΕΣΩ ΑΝΑΓΩΓΙΚΗΣ ΑΛΚΥΛΙΩΣΗΣ ΠΙΠΕΡΑΖΙΝΩΝ/ΠΙΠΕΡΙΔΙΝΩΝ ΜΕ ΥΠΟΚΑΤΕΣΤΗΜΕΝΕΣ ΒΕΝΖΑΛΔΕΫΔΕΣ Η αναγωγική αλκυλίωση αμινών περιλαμβάνει τη μετατροπή μιας αλδεΰδης ή μια κετόνης σε άλκυλο- υποκατάστατη μίας αμίνης. Η αντίδραση πραγματοποιείται με την αναγωγή της ενδιάμεσης ιμίνης/ιμινικού άλατος είτε με υδρίδιο μετάλλου ή με καταλυτική υδρογόνωση και μάλιστα οι δύο αντιδράσεις (η συμπύκνωση και η αναγωγή) γίνονται σε ένα βήμα (one pot). Θεωρείται ένας από τους χρησιμότερους και πιο ''πράσινους'' τρόπους σύνθεσης τριτοταγών αμινών και η πλειονότητα των Ν-αλκυλιώσεων διαφόρων αμινών στη φαρμακευτική βιομηχανία γίνεται με αυτόν τον τρόπο. Ως εκ τούτου, δοκιμάστηκε ως πρότυπο η αντίδραση των καρβαμόϋλο- βενζαλδεϋδών με τη μορφολίνη (της οποίας η πυρηνοφιλία είναι συγκρίσιμη των πιπεραζινικών παραγώγων) με τη χρήση STAB (sodium triacetoxy borohydride) ως αναγωγικού μέσου παρουσία ή μή οξικού οξέος σε διαλύτες DCM, DCE. Βέλτιστη απόδοση (80%) και υψηλή καθαρότητα χωρίς σχηματισμό παραπροϊόντων επιτεύχθηκε σε διαλύτη THF θερμοκρασία δωματίου ακόμα και απουσία οξικού οξέος. Επίσης εξετάστηκε ένα εναλλακτικό πρωτόκολλο από τη βιβλιογραφία με Et3SiH ως το αναγωγικό μέσο παρουσία καταλύτη InCl3 σε διάλυμα MeOH ωστόσο η αντίδραση αυτή δε λειτούργησε σύμφωνα με τα βιβλιογραφικά δεδομένα. Έτσι η μέθοδος αναγωγικής αλκυλίωσης με STAB εφαρμόστηκε με τα πραγματικά υποστρώματα πιπεριδινών/πιπεραζινών και καρβαμόϋλο βενζαλδεϋδών (Σχήμα 40) πορεία των αντιδράσεων ελέγχθηκε με χρωματογραφία HPLC (Σχήμα 41). σε και η ΣΧΗΜΑ 40: Αντίδραση αναγωγικής αλκυλίωσης των υποκατεστημένων καρβαμόϋλο Τα προϊόντα απομονώθηκαν υπό μορφή υδροχλωρικού άλατος ώστε να αποφευχθεί πιθανή οξείδωση τους και να παραταθεί με αυτόν τον τρόπο η διάρκεια αποθήκευσής τους. Αξίζει να σημειωθεί ότι μερικά από τα τελικά προϊόντα παρουσίασαν μέτρια διαλυτότητα σε όξινο 62

63 υδατικό διάλυμα κάτι το οποίο πολλές φορές κατά την κατεργασία καθαρισμού οδηγούσε στην κατανομή τους μεταξύ οργανικής και υδατικής φάσης γεγονός που σε κάποιες περιπτώσεις οδήγησε σε απώλειες στην απόδοση. Σε γενικές γραμμές οι αποδόσεις των τελικών προϊόντων ήταν ικανοποιητικές και η καθαρότητα τους πολύ υψηλή. Τα τελικά προϊόντα αφού ξηράνθηκαν, ταυτοποιήθηκαν τόσο με φασματοσκοπία ΕSI-MS όσο και με 1 Η, 13 C NMR. Στο σχήμα 42 παρουσιάζονται τα μόρια που συντέθηκαν καθώς και οι αποδόσεις τους. ΣΧΗΜΑ 41: Παρακολούθηση της αντίδρασης σχηματισμού της ένωσης 25. Στα 2.4 min εκλούεται η πιπεραζίνη 12, στα 2.96min η αλδεΰδη 18 (χρησιμοποιήθηκε σε περίσσεια), στα 3,29 min το παραγόμενο προϊόν (ένωση 25) και στα 4,77 min το κατάλοιπο της στήλης Πάνω χρωματογράφημα hplc: η αντίδραση μετά από μία ώρα. Κάτω χρωματογράφημα hplc: το απομονωμένο υδροχλωρικό άλας της ένωσης

64 ΣΧΗΜΑ 42: Τα τελικά ανάλογα ριβαστιγμίνης από καρβαμόϋλο-βενζαλδεΰδες και αρυλοπιπεραζίνες/πιπεριδίνες. 64

65 Β.5 ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΑΣΤΙΓΜΙΝΗΣ ΠΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ ΑΠΟ 2, ΚΕΤΟΝΕΣ Σχετικά με τη σύνθεση αντίστοιχων αναλόγων της ριβαστιγμίνης από ακετοφαινόνες δοκιμάστηκε η μεθοδολογία αναγωγικής αλκυλίωσης που εφαρμόστηκε με τις αλδεΰδες πάλι με τη μορφολίνη ως πρότυπη αμίνη και τη χρήση STAB. Με τις ακετοφαινόνες όμως δεν παρατηρήθηκε σχηματισμός των επιθυμητών προϊόντων σε κανέναν από τους διαλύτες που εξετάστηκαν (THF, DCM, DCE) παρουσία ή μη οξικού οξέος. Είναι γνωστό ότι ο μηχανισμός της αντίδρασης (σχήμα 43) ξεκινά αρχικά με την πυρηνόφιλη προσβολή της αμίνης στην αλδεΰδη ή τη κετόνη και τη συμπύκνωσή τους σε ιμίνη ή ιμινικό άλας αντίστοιχα τα οποία στη συνέχεια ανάγονται. Βάση τω αποτελεσμάτων από τα υποστρώματα αλδεϋδών και κετονών που δοκιμάστηκαν, συμπεραίνεται ότι η συμπύκνωση της μορφολίνης με τις κετόνες προς σχηματισμό ιμινικών αλάτων είναι πολύ πιο δύσκολο να συμβεί και πιθανόν είναι και το προβληματικό σημείο της αναγωγικής αλκυλίωσης κετονών διότι εκτιμάται ότι το αντίστοιχο ιμινικό άλας θα ήταν πολύ πιο δραστικό ως προς την αναγωγή του σε σχέση με τη λιγότερο ηλεκτρόφιλη ιμίνη. ΣΧΗΜΑ 43: Μηχανισμός αναγωγικής αλκυλίωσης δευτεροταγών αμινών με STAB. Μάλιστα, στη βιβλιογραφία ενώ υπάρχουν άφθονα παραδείγματα αναγωγικής αλκυλίωσης πρωτοταγών και δευτεροταγών αμινών με αρωματικές/αλειφατικές αλδεΰδες και αλειφατικές/αλεικυκλικές κετόνες, ο συνδυασμός δευτεροταγών αμινών με αρωματικές κετόνες 65

66 είναι σπάνιος. Είναι πιθανόν λόγω της μειωμένης ηλεκτροφιλίας αυτών των κετονών λόγω της συζυγίας με τον αρωματικό δακτύλιο, σε συνδυασμό με την αυξημένη στερεοχημική απαίτηση των δευτεροταγών αμινών, η ισορροπία του μίγματος να ευνοεί τα αντιδρώντα παρά το ιμινικό άλας το οποίο ίσως και να υδρολύεται γρηγορότερα από ότι ανάγεται. Προκειμένου να προωθηθεί το πρώτο στάδιο του μηχανισμού δηλαδή η συμπύκνωση της ακετοφαινόνης με τη μορφολίνη σε ιμινικό άλας, δοκιμάστηκαν ως καταλύτες τα Sc(OTf)3, PPTS, BF3*Et2O και το Ti( i PrΟ)4 σε διαλύτες DCM/THF παρουσία αναγωγικών μέσων ώστε η ισορροπία της αντίδρασης να μετατοπιστεί προς το προϊόν. Τα αναγωγικά που εξετάστηκαν ήταν τα STAB, NaBH3CN, NaBH4, 5-Ethyl-2-methylpyridine borane complex και H2 παρουσία καταλύτη Pd/C σε διαλύτες THF, MeOH και DCM. Παρά τις εντατικές και εκτεταμένες προσπάθειες, καμία από τις παραπάνω συνθήκες δεν οδήγησε στην παρασκευή του επιθυμητού προϊόντος ενώ σε κάποιες περιπτώσεις λήφθηκε ως προϊόν η δευτεροταγής αλκοόλη από την αναγωγή της αντίστοιχης κετόνης. Εφόσον η αναγωγική αλκυλίωση δε λειτούργησε έπρεπε να τροποποιήσουμε την αρχική μας αντιθετική ανάλυση και να εξετάσουμε εναλλακτικό τρόπο σύνθεσης αυτής της ομάδας αναλόγων της ριβαστιγμίνης. Κατά μία πιο κλασσική προσέγγιση, τα ζητούμενα πιπεράζινο- /πιπερίδινο- ανάλογα θα μπορούσαν να προέλθουν από την αλκυλίωση των αντίστοιχων αμινών με κατάλληλα παράγωγα των ακετοφαινονών που φέρουν αποχωρούσες ομάδες (LG, Σχήμα 44). ΣΧΗΜΑ 44 : Αντίδραση αναγωγικής αλκυλίωσης των υποκατεστημένων καρβαμόϋλο κετονών με τις αντίστοιχες Ν-άρυλο-πιπεραζίνες και Ν-άρυλο-πιπεριδίνες 66

67 Για την αναθεωρημένη σύνθεση επιλέχθηκε η αναγωγή των ακετοφαινονών και ο μετασχηματισμός τους στα αντίστοιχα χλωρίδια ή τοσυλιωμένα παράγωγα έτσι ώστε να εξεταστεί η αντίδραση SN2 με τις πιπεραζίνες/πιπεριδίνες. Πρώτο βήμα της νέας αυτής συνθετικής πορείας αποτελεί η εκλεκτική αναγωγή των ακετοφαινονών προς αλκοόλες παρουσία της καρβαμόϋλο ομάδας. Η αντίδραση αυτή πραγματοποιήθηκε χωρίς πρόβλημα εντός 45 λεπτών με NaBH4 σε MeOH δίνοντας τις αντίστοιχες καρβαμόϋλο δευτεροταγείς αλκοόλες (Σχήμα 45). Η πορεία της αντίδρασης μελετήθηκε με χρωματογραφία HPLC (σχήμα 46). Η απόδοση όσο και η καθαρότητα των απομονωμένων αλκοολών ήταν πολύ υψηλή και τα προϊόντα 36, 37, 38 και 39 ταυτοποιήθηκαν με φασματοσκοπία μάζας ESI-MS και με 1 Η, 13 C NMR. ΣΧΗΜΑ 45: Αντίδραση αναγωγής των καρβαμόϋλο ακετοφαινόνων προς της αντίστοιχες αλκοόλες καθώς και τα μόρια που συντέθηκαν με αυτόν τον τρόπο 67

68 ΣΧΗΜΑ 46: Πάνω: Χρωματογράφημα HPLC της καρβαμόϋλο κετόνης 20. Κάτω: Χρωματογράφημα HPLC του απομονωμένου προϊόντος αναγωγής (ένωση 36). Η κορυφή στα 4.7 οφείλεται σε κατάλοιπο της στήλης. Στην συνέχεια δοκιμάστηκε η ενεργοποίηση της αλκοόλης των ενώσεων 36, 37, 38 και 39 με την χρήση π-τολουολοσουλφονυλοχλωριδίου (TsCl) παρουσία τριαιθυλαμίνης και καταλυτικής ποσότητας (0.1 eq) DMAP σε RT. Ως διαλύτης για τις αντιδράσεις εξετάστηκε το MeCN. Η πορεία των αντιδράσεων μελετήθηκε με χρωματογραφία HPLC και έδειξε ότι καμία από τις τέσσερις αλκοόλες δεν είχε μετατραπεί στο αντίστοιχο τοσυλο- παράγωγο. Έτσι διερευνήθηκε η μετατροπή των αλκοολών στα αντίστοιχα χλωρίδια. Οι συνθήκες που δοκιμάστηκαν σύμφωνα με την βιβλιογραφία είναι το θειονυλοχλωρίδιο (SOCl2) σε DCM και θερμοκρασία δωματίου. Οι αντιδράσεις ελέγχθηκαν με χρωματογραφία HPLC και φασματοσκοπία EMS. Λόγω του ηλεκτρονιοδοτικού δακτυλίου τα χλωρίδια 41 και 42 68

69 αποδείχθηκαν ιδιαίτερα ευαίσθητα και υδρολύονταν προς τις μητρικές αλκοόλες κατά την ανάλυση με HPLC το οποίο λειτουργεί με διαλύτες H2O/ACN και 0.05% TFA. Τα προϊόντα των τεσσάρων αντιδράσεων απομονώθηκαν ύστερα από παρατεταμένη συμπύκνωση του διαλύματος μέχρι να απομακρυνθεί η περίσσεια του θειονυλοχλωριδίου και η δομή τους επιβεβαιώθηκε μέσω φασματοσκοπίας ESI-MS και 1 Η, 13 C NMR. Οι αποδόσεις και οι καθαρότητα των τεσσάρων χλωριδίων ήταν εξαιρετικά υψηλές αν και η ένωση 40 περιείχε μια μικρή πρόσμιξη η οποία ωστόσο όπως θα δούμε παρακάτω δεν επηρεάζει την επόμενη αντίδραση και απομακρύνεται στην κατεργασία αυτής. Οι ενώσεις 41 και 42 αποθηκεύτηκαν και διατηρήθηκαν στο ψυγείο λόγω της υψηλής τους δραστικότητας. ΣΧΗΜΑ 47: Αντίδραση σύνθεσης των χλωριδίων από τις αντίστοιχες αλκοόλες Τελικό βήμα στην εναλλακτική αυτή σύνθεση που προτάθηκε αποτελεί η SN2 υποκατάσταση των ενώσεων 40, 41, 42 και 43 από τα παράγωγα πιπεραζινών και πιπεριδινών. Οι αντιδράσεις αυτές πραγματοποιήθηκαν παρουσία βάσης K2CO3 σε διαλύτη MeCN στους 82 ο C υπό Ν2 ενώ σε μερικές περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκε και καταλυτική ποσότητα KI. Η πορεία των αντιδράσεων μελετήθηκε με χρωματογραφία HPLC (Σχήμα 48). 69

70 ΣΧΗΜΑ 49: Παρακολούθηση της αντίδρασης σύνθεσης της ένωσης 49. Πάνω: Χρωματογράφημα HPLC της πιπεραζίνης 17 (κορυφή στα 1.8min). Μέση: Το μίγμα της αντίδρασης μετά από 24 ώρες και σχηματισμός της ένωσης 49 (κορυφή στα 3.1 min). Η κορυφή στα 0.24 min αντιστοιχεί στο ΚΙ και η κορυφή στα 3.4 min είναι το παραπροϊόν της από το προηγούμενο βήμα. Κάτω: απομονωμένο προϊόν 49. Ομοίως παρακολουθήθηκε η σύνθεση και των υπόλοιπων αναλόγων της ριβαστιγμίνης. 70

71 Σε αυτές τις συνθήκες τα χλωρίδια 40, 41 και 43 αντέδρασαν όπως αναμενόταν δίνοντας τα επιθυμητά προϊόντα ενώ το χλωρίδιο 42 έδωσε ως προϊόν το αντίστοιχο αλκένιο (Σχήμα 48). ΣΧΗΜΑ 48 : Αντιδράσεις των χλωριδίων 40, 41, 42 και 43 με τα παράγωγα πιπεραζινών και πιπεριδινών Τα τελικά προϊόντα από τα χλωρίδια 40, 41 και 43 απομονώθηκαν υπό μορφή υδροχλωρικού άλατος ώστε να αποφευχθεί πιθανή οξείδωση τους και να παραταθεί με αυτόν τον τρόπο η διάρκεια αποθήκευσής τους. Επίσης μερικά από αυτά παρουσίασαν μέτρια διαλυτότητα σε όξινο υδατικό διάλυμα με συνέπεια την κατανομή τους στην υδατική φάση κατά την κατεργασία καθαρισμού που οδήγησε σε μείωση της απόδοσης για το απομονωμένο προϊόν. Παρά τη διακύμανση στις αποδόσεις των τελικών προϊόντων η καθαρότητα όλων των μορίων ήταν πολύ υψηλή καθιστώντας εφικτή τη βιολογική τους αποτίμηση. Τα τελικά προϊόντα αλλά και το αλκένιο παραπροϊόν ταυτοποιήθηκαν με φασματοσκοπία ESI-MS και 1 Η, 13 C NMR. 71

72 ΣΧΗΜΑ 50: Τα τελικά μόρια που έχουν προέλθει από S N2 υποκατάσταση των χλωριδίων 40, και 41από τις πιπεριδίνες/πιπεραζίνες 10, 12, 14, 15, 16 και

73 ΣΧΗΜΑ 51: Τα τελικά μόρια που προήλθαν από S N2 υποκατάσταση του χλωριδίου 43 από τις πιπεριδίνες/πιπεραζίνες 10, 12, 14, 15, 16 και 17. Ύστερα επιδιώχθηκε η σύνθεση των παραγώγων που προέρχονται από το χλωρίδιο 42 χρησιμοποιώντας πιο ήπιες συνθήκες (RT) ή απουσία βάσης προς αποφυγή/περιορισμό της αντίδρασης Ε2 που είναι υπεύθυνη για την αποδόμησή του στο αλκένιο 44. Επίσης διερευνήθηκε ο παράγοντας διαλύτης και δοκιμάστηκαν MeCN, DCM και DMF. Ωστόσο το αποτέλεσμα ήταν κάθε φορά η σύνθεση παραγωγή του αλκενίου 44 καθώς η αντίδραση απόσπασης επικρατούσε έναντι της αντίστοιχης υποκατάστασης. ΣΧΗΜΑ 52 : Μηχανισμοί απόσπασης ΗCl και υποκατάστασης για την ένωση 42 73

74 Ανατρέχοντας στην βιβλιογραφία για μια εναλλακτική σύνθεση αυτής της υποομάδας παραγώγων αποφασίστηκε να δοκιμαστεί μία multicomponent αντίδραση Petasis με χρήση μέθυλοβορονικού οξέος. Όπως αποδείχτηκε στα προηγούμενα πειράματα, η καρβονυλομάδα των βενζαλδευδών μπορεί να προσβληθεί από την αμινομάδα των πιπεραζινών και πιπεριδινών, προς σχηματισμού του ενδιαμέσου ιμινικού κατιόντος. Σε αντιστοιχία με την προσβολή αυτού από το πυρηνόφιλο υδρίδιο που παρέχετε από το αναγωγικό μέσο, κατά την αντίδραση Petasis ο ηλεκτρόφιλος ιμινικός άνθρακας μπορεί να προσβληθεί από την πυρηνόφιλη μεθυλομάδα που παρέχεται από το MeB(OH)2 (ο μηχανισμός της αντίδρασης Petasis παρουσιάζεται στο σχήμα 53). Η αντίδραση δοκιμάστηκε σε διάφορους διαλύτες όπως DCM, THF, MeCN, DCE, DMAC, παρουσία ή μη καταλύτη Pd/XPhos G3, υπό αδρανή ατμόσφαιρα Ν2 και σε θερμοκρασίες δωματίου ή και μέχρι 70 ο C. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε μέσω χρωματογραφίας HPLC ή ESI-ΜS ο σχηματισμός του επιθυμητού προϊόντος. ΣΧΗΜΑ 53: Μηχανισμός της αντίδρασης Τέλος, δοκιμάστηκε εκ νέου η αντίδραση SN2 του χλωριδίου 42 με περίσσεια πιπεραζίνης/πιπεριδίνης αντί εξωτερικής βάσης προκειμένου να αποσαφηνιστεί ποιο αντιδραστήριο είναι υπεύθυνο για την απόσπαση Ε2. 74

75 Με 2eq από τα παράγωγα πιπεραζίνης και πιπεριδίνης (το πρώτο eq ως πυρηνόφιλο το δεύτερο eq ως βάση για την εξουδετέρωση του HCl) σε διάλυμα ACN και θερμοκρασία δωματίου υπό αδρανείς συνθήκες. Οι αντιδράσεις αυτές αυτή την φορά έδωσαν τα επιθυμητά τελικά προϊόντα (Σχήμα 54) σε αρκετά υψηλή απόδοση και καθαρότητα, χωρίς τη χρήση στήλης χρωματογραφίας καθώς η περίσσεια πιπεραζίνης ή πιπεριδίνης καταβυθιζόταν από το μίγμα της αντίδρασης ως το υδροχλωρικό τους άλας και απομακρύνεται. Η πορεία των αντιδράσεων μελετήθηκε με χρωματογραφία HPLC και τα προϊόντα ταυτοποιήθηκαν με φασματοσκοπία ΕSI-MS και 1 Η, 13 C NMR. ΣΧΗΜΑ 54: Αντίδραση σύνθεσης των ασταθούς χλωρίδιου 42 από τις ενώσεις 12, 15, 16 και 17. τελικών μορίων που έχουν προέλθει από S N2 υποκατάσταση του 75

76 B.6 ΠΡΟΣΠΑΘΕΙΑ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΑΣΤΙΓΜΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗΝ D2 ΦΑΡΜΑΚΟΦΟΡΟ ΔΟΜΗ της 4-άμινο- π-φθόροβουτυροφαινόνης Μία επίσης σημαντική D2 φαρμακοφόρος δομή είναι αυτή της 4-άμινο-πφθόροβουτυροφαινόνης που περιέχεται στα αντιψυψωτικά φάρμακα αλοπεριδόλη, σπιπερόνη και λουματεπερόνη. Έτσι, πολυδύναμα ανάλογα της ριβαστιγμίνης που περιέχουν αυτό το δομικό στοιχείο (ενώσεις του τύπου C1 Σχήμα 56) ικανά για ντοπαμινεργικό ανταγωνισμό και αναστολή της χοληνεστεράσης, συμπεριλήφθηκαν στους στόχους της παρούσας εργασίας. ΣΧΗΜΑ 55: Τα αντιψυχωτικά Haloperidol, spiperone και lumateperone 76

77 ΣΧΗΜΑ 56: Αντιθετική ανάλυση μορίων στόχων με D 2 φαρμακοφόρο δομή της 4-άμινο- π- φθόροβουτυροφαινόνης Όπως παρουσιάζεται στην αντιθετική ανάλυση του Σχήματος 56, ενώσεις του τύπου C1 μπορούν να συντεθούν ακολουθώντας δύο διαφορετικά μονοπάτια. Το πρώτο αφορά στην αναγωγική αλκυλίωση της ένωσης C2 με την C3 όπου η τελευταία μπορεί να προκύψει με αντίδραση της 4-χλώρο-π-φθόροβουτυροφαινόνης με μεθυλαμίνη. Στο δεύτερο συνθετικό μονοπάτι ενώσεις του τύπου C1 μπορούν να προέλθουν από την αντίδραση της 4-χλώρο-πφθόροβουτυροφαινόνης με την αμίνη C4 και η τελευταία από την αντίδραση των καρβαμόϋλο χλωριδίων με μεθυλαμίνη. Αρχικά δοκιμάστηκε η σύνθεση της 4-μεθυλάμινο-π-φθόροβουτυροφαινόνης με στόχο την αναγωγική της αλκυλίωση όπως έγινε με τα παράγωγα πιπεραζινών και πιπεριδινών με τις βενζαλδεΰδες. Η αντίδραση 4-χλώρο-π-φθοροβουτυροφαινόνης με περίσσεια μεθυλαμίνης σε αιθανόλη δεν στέφθηκε με επιτυχία καθώς αντί της επιθυμητής αμινοκετόνης ΑΚ παράχθηκε η ένωση 67 (Σχήμα 57) που ταυτοποιήθηκε με NMR. Το ίδιο αποτέλεσμα προέκυψε και σε διαφορετικές συνθήκες (χρήση υδροχλωρικής μεθυλαμίνης με βάση σε διαφόρους διαλύτες) γεγονός που υποδηλώνει την ταχύτητα και προτίμηση σχηματισμού του 5-μελούς δακτυλίου της αρχικά παραγόμενης αμινοκετόνης ΑΚ προς την κυκλική εναμίνη 67 η οποία φαίνεται να είναι σταθερή στην υδρόλυση. ΣΧΗΜΑ 57: Αντίδραση της 4-chloro-1-(4-fluorophenyl)butan-1-one με το υδροχλωρικό άλας της μεθυλαμίνης Στην συνέχεια εξετάστηκε η δεύτερη προσέγγιση δηλαδή η αναγωγική αλκυλίωση διαφόρων αλδεϋδών με περίσσεια υδροχλωρικού άλατος μεθυλαμίνης παρουσία STAB σε H2O/THF (1/1) ωστόσο δεν παράχθηκαν οι επιθυμητές βενζυλαμίνες τύπου C4 (Σχήμα 56). Στο ίδιο πλαίσιο δοκιμάστηκε αντί του υδροχλωρικού άλατος, διάλυμα μεθυλαμίνης (4Μ) σε αιθανόλη σε EtOH, EtOH/THF (1/1), EtOH/THF (1/10), DCE, και DCM αλλά η προσπάθεια επίσης δεν απέδωσε τις βενζυλαμίνες τύπου C4. 77

78 Τελικά, αποφασίστηκε να δοκιμαστεί η αντίδραση της μεθυλαμίνης με τα χλωρίδια 40, 41 και 42 καθώς και με τα χλωρίδια 68 και 69 (Σχήμα 58) που δεν είχαν χρειαστεί ενωρίτερα αλλά συντέθηκαν από τις αντίστοιχες βενζαλδεΰδες με παρόμοιο τρόπο σε εξίσου υψηλές αποδόσεις. Αντίδραση αυτών σε περίσσεια διαλύματος μεθυλαμίνης παρουσία KI σε MeCN στους 70 ο C. έδωσε τα επιθυμητά προϊόντα 70, 71, 72, 73 και 74 της SN2 υποκατάστασης. Η πορεία των αντιδράσεων μελετήθηκε με χρωματογραφία HPLC. Τα προϊόντα απομονώθηκαν σε υψηλές αποδόσεις και καθαρότητα και ταυτοποιήθηκαν με φασματοσκοπία ESI-MS και 1 Η, 13 C NMR. ΣΧΗΜΑ 58: Τα χλωρίδια 68 και 69 ΣΧΗΜΑ 59: Αντίδραση σύνθεσης μεθυλαμίνης με τα αντίστοιχα χλωρίδια και τα μόρια που συντέθηκαν από αυτήν την μέθοδο Επόμενο βήμα του συνθετικού μονοπατιού αποτέλεσε η αλκυλίωση των ενώσεων 70, 71, 72, 73 και 74 με τη 4-χλώρο-π-φθοροβουτυροφαινόνης 66. Η αντίδραση αυτή επιτεύχθηκε παρουσία KI και Κ2CO3 σε διαλυτή MeCN στους 80 ο C (Σχήμα 60). 78

79 ΣΧΗΜΑ 60: Αντίδραση σύνθεσης των αναλόγων της ριβαστιγμίνης συνδεδεμένα με την D 2 φαρμακοφόρο δομή της 4-άμινο- π-φθόροβουτυροφαινόνης Η πορεία των αντιδράσεων μελετήθηκε με χρωματογραφία HPLC. Τα προϊόντα ταυτοποιήθηκαν με φασματοσκοπία ΕMS ωστόσο δεν κατέστη δυνατή η απομόνωση τους σε υψηλή καθαρότητα παρά την χρήση στήλης χρωματογραφίας ωστόσο ίσως είναι κατάλληλης ποιότητας για τη βιολογική τους αποτίμηση καθώς δείγματα με καθαρότητα 85% είναι συνήθως αποδεκτά. 79

80 Β.7 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η σύνθεση αναλόγων της ριβαστιγμίνης μέσω αναγωγικής αλκυλίωσης επιλεγμένων πιπεραζινών/πιπεριδινών με καρβαμόϋλο- βενζαλδεΰδες και λειτούργησε εξαιρετικά ομαλά (Σχήμα 61 κάτω τμήμα). Συμπεριλαμβανομένης της σύνθεσης των 4-αρυλοπιπεραζινών αναδεικνύεται μια συνολικά αποτελεσματική συγκλίνουσα σύνθεση των ζητούμενων παραγώγων που δεν απαιτεί χρωματογραφία σε κανένα από τα στάδια. ΣΧΗΜΑ 61: Συνθετική πορεία που ακολουθήθηκε για την σύνθεση παραγώγων της Ριβαστιγμίνης βασισμένα σε καρβαμόϋλο βενζαλδεΰδες/κετόνες και 4-αρυλοπιπεραζίνες. 80

81 Αναφορικά με τα ανάλογα της ριβαστιγμίνης που βασίστηκαν σε καρβαμόϋλο- ακετοφαινόνες και επιλεγμένες 4-άρυλο-πιπεραζίνες/πιπεριδίνες η αρχική προσέγγιση για τη σύνδεσή τους μέσω αναγωγικής αλκυλίωσης δεν ήταν επιτυχής. Η αναθεώρηση της σύνθεσης με τη σύνδεση των δύο τμημάτων να πραγματοποιείται με μια αντίδραση SN2 στέφθηκε με επιτυχία (Σχήμα 61 πάνω τμήμα) και κατέστησε τη σύνθεση και αυτών των παραγώγων συγκλίνουσα, με υψηλές αποδώσεις και χωρίς χρωματογραφική απαίτηση. ΣΧΗΜΑ 62: Συνθετική πορεία που ακολουθήθηκε για την σύνθεση παραγώγων της ριβαστιγμίνης βασισμένα σε καρβαμόϋλο βενζαλδεΰδες/ ακετοφαινόνες και 4-αρυλοπιπεραζίνες. Η τελευταία ομάδα αναλόγων της ριβαστιγμίνης αφορά στη σύνδεση καρβαμόϋλο βενζαλδεϋδών/ακετοφαινονών με τη 4-μεθυλάμινο-π-φθόροβουτυροφαινόνη. Αν και αυτή η σύνθεση της τελευταίας απεδείχθη προβληματική, εγκαθιστώντας το πυρηνόφιλο άζωτο στα καρβαμόϋλο παράγωγα ήταν εφικτή η αντίδραση SN2 αυτών των βενζυλικών αμινών με τη 4- χλώρο-π-φθόροβουτυροφαινόνη. 81

82 Τα υδροχλωρικά άλατα όλων των μορίων που συντέθηκαν παρουσιάζουν σημαντική διαλυτότητα σε οργανικούς διαλύτες γεγονός που υποδηλώνει την αυξημένη λιποφιλία τους, παράμετρος που είναι απαραίτητη για τη διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και δράση σε υποδοχείς του εγκεφάλου. Συνολικά, επετεύχθη ο στόχος της δημιουργίας μιας νέας βιβλιοθήκης τριάντα-τριών (33) μορίων αναλόγων της ριβαστιγμίνης τα οποία βρίσκονται στη φάση της βιολογικής τους αποτίμησης προκειμένου να εξεταστεί τόσο η ικανότητα αναστολής των ενζύμων AChE και BChE όσο και ο ανταγωνισμός στους ντοπαμινεργικούς υποδοχείς D2. Τα αποτελέσματα αυτά αναμένονται να διαλευκάνουν αν υπάρχει συνέργεια μεταξύ ντοπαμινεργικού ανταγωνισμού και αναστολή της ακετυλοχολινεστεράσης ως προς τη βελτίωση της γνωστικής λειτουργίας ή εάν οι νευροδιαβιβαστές ντοπαμίνη και ακετυλοχολίνη λειτουργούν συνολικά προς αντίθετες κατευθύνσεις. 82

83 83

84 84

85 ΣΧΗΜΑ 63: Τα τελικά μόρια που συντέθηκαν και απομονώθηκαν σε υψηλή καθαρότητα. 85

86 Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Γ.1 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΟΡΓΑΝΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΉΡΙΑ Τα αντιδραστήρια και οι διαλύτες (υψηλής καθαρότητας >95 και 99% αντίστοιχα), που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των ενώσεων που περιγράφονται στην παρούσα εργασία είναι εμπορικά διαθέσιμα προϊόντα των εταιρειών Sigma Aldrich, Alfa Aeasar, ABCR, Fluorochem, TCI, ACROS, Merck, Fluka. Η καθαρότητα των αντιδραστηρίων ήταν 98% και άνω και χρησιμοποιήθηκαν σχεδόν όλα χωρίς περαιτέρω καθαρισμό. ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΉ ΑΝΆΛΥΣΗ Οι αναλύσεις ΗPLC έγιναν με στήλη Luna C 18 50x2.00 mm, 3 μm και σε όργανο Agilent Συνθήκες HPLC: θερμοκρασία 40 ο C, ροή 1 ml/min, και εκλούτης ACN/H2O Σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης: ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ (NMR) Οι ενώσεις που συντέθηκαν χαρακτηρίστηκαν και ταυτοποιήθηκαν με 1 Η και 13 C φασματοσκοπία NMR στα 400MHz και 600MHz αντίστοιχα σε όργανο Bruker. Tα φάσματα 13 C είναι πλήρως αποσυζευγμένα. Οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των δειγμάτων ήταν CDCl3 και DMSO-d6. Η κλίμακα των χημικών μετατοπίσεων είναι 86

87 βαθμονομημένη σύμφωνα με τη χημική μετατόπιση του πρωτονιωμένου συστατικού που βρίσκεται ως πρόσμιξη στους δευτεριωμένους διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν. Οι τιμές αυτές ορίστηκαν βάσει βιβλιογραφικών δεδομένων και είναι: CDCl3 (7.26ppm, χημική μετατόπιση πρόσμιξης CHCl3), DMSO (2.54ppm, χημική μετατόπιση πρόσμιξης (CH3)2SO) και CD3CN (1.94ppm, χημική μετατόπιση πρόσμιξης MeCN). ESI-MS Τα φάσματα μάζας με ιονισμό δια ψεκασμού ηλεκτρονίων (ESI-MS) καταγράφηκαν σε φασματόμετρο Micromass-PlatformLC. Ως διαλύτης των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε MeOH HPLC. 87

88 Γ.2 ΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ ΜΟΡΙΩΝ-ΣΤΟΧΩΝ ΣΥΝΘΕΣΗ N-ΑΡΥΛΟ-ΠΙΠΕΡΑΖΙΝΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ Σε ένα καμένο multireactor tube των 25ml με μαγνητάκι ζυγίζονται 1g (8.12mmol, 1eq) 2- μεθόξυ-ανιλίνη και 1.45g (8.12mmol, 1eq) υδροχλωρική δις-(2-χλωροαίθυλ)αμίνη και διαλύονται σε 3ml (3vol) μίγματος διαλυτών(50/50) Isoamyl alcohol και διγλύμη. Η αντίδραση αφήνεται για ανάδευση στους 150 ο C υπό Ν2 στον multireactor για 1 μέρα και ελέγχεται με HPLC, ενώ παρατηρείται αλλαγή χρώματος προς σκούρο καφέ από απαλό πορτοκαλί και καθίζηση καφετή στερεού. Αφότου έχει ολοκληρωθεί η αντίδραση αφήνεται να ψυχθεί το tube ώστε να πιάσει θερμοκρασία δωματίου. Στην συνέχεια το στερεό διηθείται και ξεπλένεται πάνω στον ηθμό με 15ml από το μίγμα της αντίδρασης και 10ml διαιθυλαιθέρα. Το στερεό απομονώνεται και διαλύεται σε 10ml HCl 1Μ και ακολούθως εκχυλίζεται 2 φορές με 20ml EtOAc. Αργότερα η υδατική φάση αλκαλιώνεται σε ph= 12 12ml Na2CO3 και ξανα εκχυλίζεται 2 φορές με 25ml EtOAc. Η δεύτερη οργανική φάση στεγνώνεται με Na2SO3, διηθείται και συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού για να δώσει την καθαρή ένωση 12 υπό μορφή πορτοκαλί λαδιού. Η ένωση 10 αποθηκεύεται σε σφαιρική των 25ml υπό Ν2 και ζυγίζεται. Απόδοση: 44% (10) 1-(2-methoxyphenyl)piperazine Φάσμα 1 : 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) δ (m, 1H), (m, 2H), (m, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.07 (dt, J = 16.0, 7.3 Hz, 8H). Φάσμα 2 : 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ , , , , , , 55.87, 51.84, 50.68, 46.34,

89 Ομοίως συντέθηκαν οι ενώσεις 12 και 14 από τις αντίστοιχες 11 και 13 παρουσιάζοντας ωστόσο μερικές παραλλαγές κυρίως στον τρόπο κατεργασίας και απομόνωσης. Αφότου έχω ελέγξει ότι η αντίδραση σύνθεσης της ένωσης 12 έχει ολοκληρωθεί (2 με 3 μέρες) με HPLC την αφήνω να ψυχθεί σε θερμοκρασία δωματίου. Στην συνέχεια διηθώ σε χάρτινο ηθμό το σκούρο καφέ στερεό και το ξεπλένω με το15ml από το μίγμα της αντίδρασης. Ύστερα το διαλύω σε 8ml MeOH (χρησιμοποιώντας και θέρμανση και πάλι χωρίς να διαλύεται πλήρως) και προσθέτω 25ml διαιθυλαιθέρα. Έτσι καταβυθίζεται λευκό στερεό το οποίο διηθείται σε ηθμό Buchner και ξεπλένεται εκεί με 10ml διαιθυλαιθέρα. Το κρυσταλλικό στερεό (υδροχλωρικό άλας της ένωσης 12) απομονώνεται σε πλαστικό vial υπό Ν2 και ζυγίζεται. Απόδοση: 40-48% (12) 1-(2,3-dichlorophenyl)piperazine hydrochloride Φάσμα 3 : 1 H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.34 (dd, J = 6.5, 4.7 Hz, 2H), 7.17 (dd, J = 6.4, 2.4 Hz, 1H), (m, 8H). Φάσμα 4 : 13 C NMR (151 MHz, DMSO) δ , , , , , , 48.63(2C), 43.83(2C). 89

90 Για την ένωση 14 ακολουθώ ακριβώς το ίδια κατεργασία με την ένωση 13 μονάχα που στο τέλος το μαύρο λάδι που προκύπτει το μετατρέπω σε υδροχλωρικό άλας με την εξής διεργασία: Προσθέτω 1ml HCl in Dioxane, 1 ml MeOH και 15ml διαιθυλαιθέρα. Καταβυθίζεται καφέ στερεό το οποίο διηθώ σε Buchner και ξεπλένεται με διαιθυλαιθέρα. Το καφέ στερεό (ένωση 14) απομονώνεται και αποθηκεύεται σε σφαιρική των 25ml και ζυγίζεται. Απόδοση : 40% (14) 1-(benzo[d][1,3]dioxol-4-yl)piperazine hydrochloride Φάσμα 5 : 1 H NMR (400 MHz, DMSO ) δ 6.73 (dd, J = 8.3, 3.8 Hz, 1H), 6.56 (d, J = 2.1 Hz, 1H), (m, 1H), 5.92 (s, 2H), 3.16 (s, 8H). Φάσμα 6 : 13 C NMR (151 MHz, DMSO) δ (2C), , (2C), , , (2C), (2C). 90

91 ΣΥΝΘΕΣΗ N-ΜΕΘΥΛΟ-Ν-ΑΙΘΥΛΟ-ΚΑΡΒΑΜΙΚΩΝ ΒΕΝΖΑΛΔΕΥΔΩΝ ΚΑΙ ΑΚΕΤΟΦΑΙΝΟΝΩΝ Σε καμένη σφαιρική φιάλη των 50ml με μαγνητάκι ζυγίζονται υπό Ν2 1g (6.6mmol, 1eq) 2- μεθόξυ-3-υδρόξυ-βενζαλδεΰδη, 868mg (8.58mmol, 1.3eq) τριαιθυλαμίνη, 80mg (0.66mmol, 0.1eq) DMAP, τα οποία και διαλύονται σε 10ml (10vol) ACN ενώ στο τέλος προσθέτουμε 1.2g (9.9mmol, 1.5eq) N-μέθυλο-Ν-αίθυλο-καρβαμούιλο χλωρίδιο. Η αντίδραση αφήνεται υπό ανάδευση σε RT συνθήκες υπό N2 για ~10h και ελέγχεται με HPLC, ενώ παρατηρείται κατά την διάρκεια της αντίδρασης η καθίζηση λευκού στερεού (Et3NHCl). Αφού ολοκληρωθεί η αντίδραση προστίθενται 10ml H2O και τοποθετείται η σφαιρική για ανάδευση άλλα 10 λεπτά. Στην συνέχεια πραγματοποιείται εκχύλιση του μίγματος 2 φορές με διαιθυλαιθέρα από 15ml έκαστος. Οι οργανικές φάσεις ενώνονται σε μία και αυτή εκχυλίζεται 1φορά με brine (15ml) και ακολούθως ξηραίνεται με MgSO4. Τέλος η οργανική φάση διηθείται και συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού για να δώσει το κρυσταλλικό κιτρινωπό στερεό (ένωση 7) το οποίο και ζυγίζεται. Απόδοση: 88-90% (18) 4-formyl-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 7: 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.93 (s, 1H), (m, 2H), 7.28 (dd, J = 11.9, 5.6 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.50 (dd, J = 14.0, 6.9 Hz, 2H), 3.10 (s, 3H), 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 3H). Φάσμα 8: 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ , , , , , , , , 56.08, 44.35, 34.38,

92 Ομοίως παρασκευάστηκαν και τα υπόλοιπα καρβαμικά παράγωγα 11,12,13 και 14 από τις αντίστοιχες 2,3,4 και 5. (19) 5-formyl-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 9: 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.85 (s, 1H), 7.72 (dd, J = 8.4, 1.9 Hz, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.04 (dd, J = 8.2, 4.0 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.49 (dd, J = 13.5, 6.4 Hz, 2H), 3.09 (s, 3H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 3H). Φάσμα 10: 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ , , , , , , , , 56.23, 44.28, 34.39, (20) 3-acetylphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 11 : 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) δ (m, 1H), 7.69 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 7.44 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 3.48 (dd, J = 14.3, 7.2 Hz, 2H), 3.08 (s, 3H), 2.59 (s, 3H), 1.25 (t, J = 7.1 Hz, 3H). Φάσμα 12: 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ , , , , , , , , 44.18, 34.29, 26.68,

93 (21) 4-acetyl-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 13: 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.57 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 8.2, 1.9 Hz, 1H), (m, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.48 (dd, J = 13.7, 6.7 Hz, 2H), 3.08 (s, 3H), 2.58 (s, 3H), 1.25 (t, J = 6.8 Hz, 3H). Φάσμα 14: 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ , , , , , , , , 56.06, 44.33, 34.37, 26.51, (22) 5-acetyl-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 15: 1 H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.84 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.18 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.40 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 3.00 (s, 3H), 2.50 (s, 3H), 1.10 (dd, J = 43.6, 19.9 Hz, 3H). Φάσμα 16: 13 C NMR (151 MHz, DMSO) δ , , , , , , , , 56.99, 45.24, 34.75, 27.18,

94 (23) 4-acetylphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 17: 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) δ (m, 2H), (m, 2H), (m, 2H), (m, 3H), 2.42 (s, 3H), (m, 3H). Φάσμα 18: 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ , , , , (2C), (2C), 44.49, 34.57, 26.85,

95 ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΑΣΤΙΓΜΙΝΗΣ ΠΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ ΑΠΟ ΒΕΝΖΑΛΔΕΥΔΕΣ ΜΕΣΩ ΑΝΑΓΩΓΙΚΗΣ ΑΜΙΝΩΣΗΣ ΜΕ ΤΑ ΠΑΡΑΓΩΓΑ ΠΙΠΕΡΑΖΙΝΩΝ ΚΑΙ ΠΙΠΕΡΙΔΙΝΩΝ Σε ένα καμένο vial με μαγνητάκι ζυγίζονται 50mg (0.21mmol, 1.2eq) από την ένωση 18, 33.8mg (0.176mmol, 1eq) από την ένωση 10, 112mg (0.528mmol, 3eq) STAB και διαλύονται σε 0.5ml(15Vol) THF. Η αντίδραση αφήνεται για ανάδευση overnight σε RT συνθήκες, υπό Ν2 και ελέγχεται με HPLC. Όταν καταναλωθεί όλη η πιπεραζίνη 10, το μίγμα της αντίδρασης μεταφέρεται σε σφαιρική των 10ml και συμπυκνώνεται μέχρι να εξατμιστεί το THF. Στην συνέχεια προστίθεται 2ml HCl (1M) στην σφαιρική και εκχυλίζεται με (2x3ml) EtOAc. Η οργανική αυτή φάση πετιέται. Ύστερα η υδατική φάση μετατρέπεται σε αλκαλική (ph~12) με 1,5ml NaOH (1M) και εκχυλίζεται με EtOAc (2x3ml). Η δεύτερη αυτή οργανική φάση συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού και δίνει ένα πορτοκαλί λάδι. Τέλος προστίθενται στο πορτοκαλί λάδι 0.25ml HCl in Dioxane, 0.25ml MeOH και 5ml διαιθυλαιθέρα. Καταβυθίζεται λευκό στερεό το οποίο διηθείται και ξεπλένεται με διαιθυλαιθέρα (~2ml) σε ηθμό Buchner. Το λευκό στερεό αποθηκεύεται σε πλαστικό vial υπό Ν2 όπου και ζυγίζεται. Απόδοση : 86% (30) 2-methoxy-5-((4-(2-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 19: 1 H NMR (400MHz, DMSO at 75 o C) δ (s, 1H), 7.48 (dd, J = 8.6, 1.9 Hz, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.18 (d, J = 8.6 Hz, 1H), (m, 4H), 4.30 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 3.79 (d, J = 8.4 Hz, 6H), (m, 6H), (m, 7H), 1.19 (t, J = 6.9 Hz, 3H). Φάσμα 20: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , , , , , (2C), , , , , 58.32, 56.45, 55.84, 51.08, 47.24, 44.04, 34.42, 29.43, 13.27, (ESI-MS) calcd for C23H31N3O4 [M+H]: , found:

96 Με ακριβώς τον ίδιο τρόπο συντέθηκαν και απομονώθηκαν οι ενώσεις 24 (από τις ενώσεις 10 και 14) και 32 από τις ενώσεις (από τις ενώσεις 18και 19) (24) 2-methoxy-4-((4-(2-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 21 : 1 H NMR (600MHz, DMSO at 75 o C) δ 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), (m, 6H), 3.78 (s, 6H), 3.58 (s, 2H), 3.36 (s, 2H), 3.03 (s, 3H), 2.96 (dt, J = 30.7, 14.2 Hz, 4H), 2.61 (d, J = 1.8 Hz, 4H), (m, 3H). Φάσμα 22: 13 C NMR (600MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , , , , (2C), (3), (2C), 56.19, 55.75, 53.12, 50.44, 47.17, 44.61, 35.50, 34.37, 23.56, (ESI-ΜS) calcd for C23H31N3O4 [M+H]: , found:

97 (32)5-((4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)piperazin-1-yl)methyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 23: 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.10 (dd, J = 21.4, 9.3 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.34 (dd, J = 8.3, 2.1 Hz, 1H), 5.87 (s, 2H), 3.82 (s, 3H), (m, 4H), (m, 7H), (m, 4H), 1.22 (dt, J = 27.4, 6.5 Hz, 3H). Φάσμα 24: 13 C NMR (151 MHz, DMSO) δ , , (2C), , , , , (2C), (2C), , , 66.82, 58.12, 56.44, 50.58(2C), 47.19, 43.83, 31.02, (ESI-MS) calcd for C23H29N3O5 [M+H]: , found: Οι ενώσεις 25, 26, 27, 28, 29, 31, 33, 34 και 35 παρασκευάστηκαν με τις ίδιες ακριβώς συνθήκες ωστόσο απομονώθηκαν με διαφορετικό τρόπο από τις 24, 30 και 32 λόγο της ελάχιστης έως μηδενικής τους κατανομής στο όξινο υδατικό διάλυμα (λόγο της υψηλής τους λιποφιλίας). Η κατεργασία που ακολουθείτε είναι η εξής: Αφότου η αντίδραση έχει ελεγχθεί με HPLC ότι έχει ολοκληρωθεί, το μίγμα της αντίδρασης μεταφέρεται σε σφαιρική των 10ml και συμπυκνώνεται μέχρι να εξατμιστεί το THF. Στην συνέχεια προστίθεται 2ml HCl (1M) στην σφαιρική και εκχυλίζεται με (2x3ml) EtOAc. Η οργανική φάση συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού και δίνει ένα πορτοκαλί λάδι. Τέλος προστίθενται στο πορτοκαλί λάδι 0.25ml HCl in Dioxane, 0.25ml MeOH και 5ml διαιθυλαιθέρα. Καταβυθίζεται στερεό το οποίο διηθείται και ξεπλένεται με διαιθυλαιθέρα (~2ml) σε ηθμό Buchner. Το στερεό αποθηκεύεται σε πλαστικό vial υπό Ν2 όπου και ζυγίζεται. 97

98 (25) 4-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 25: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 75 o C) δ 7.57 (s, 1H), (m, 2H), (m, 3H), 4.36 (s, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.36 (d, J = 41.2 Hz, 6H), 2.93 (s, 4H), 1.16 (s, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 3Η Φάσμα 26: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , (2C), , , (2C), (2C), , 59.51, 56.92(2C), 51.80(2C), 48.53, 44.91, 34.85, (ESI-MS) calcd for C22H27Cl2N3O3 [M+H]: , found:

99 (26)4-((4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)piperazin-1-yl)methyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 27: 1 H NMR (400MHz, DMSO at 75 o C) δ 7.60 (s, 1H), 7.15 (dd, J = 16.4, 7.9 Hz, 2H), 6.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.41 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.92 (s, 2H), 4.33 (s, 2H), 3.85 (d, J = 12.4 Hz, 3H), 2.96 (s, 3H), 1.16 (s, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 10Η Φάσμα 28: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , , , , , , , , , , , , 58.80, 56.49, 50.78(2C), 47.15(2C), 44.09, 34.43, (ESI-MS) calcd for C23H29N3O5 [M+H]: , found:

100 (27)4-((4-(6-fluorobenzo[d]isoxazol-3-yl)piperidin-1-yl)methyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 29: 1 H NMR (400MHz, DMSO at 75 o C) δ 8.09 (dd, J = 8.0, 5.4 Hz, 1H), 7.63 (dd, J = 9.0, 1.6 Hz, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.28 (td, J = 9.2, 1.7 Hz, 1H), (m, 2H), 4.27 (s, 2H), 3.84 (s, 3H), 2.96 (s, 4H), 2.28 (s, 5H), 1.17 (s, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 5H Φάσμα 30: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , , (2C), , , , (2C), , 98.72(2C), 66.02, 60.46, 57.53(2C), 52.32, 44.88(2C), 41.74, 35.07, (ESI-MS) calcd for C24H28FN3O4 [M+H]: , found:

101 (28)4-((4-(benzo[d]isothiazol-3-yl)piperazin-1-yl)methyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 31: 1 H NMR (600 MHz, DMSO) δ 8.09 (dd, J = 17.3, 8.2 Hz, 2H), (m, 1H), (m, 2H), 7.13 (dd, J = 19.5, 7.9 Hz, 2H), 4.41 (d, J = 44.0 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.93 (d, J = 80.4 Hz, 3H), 1.12 (dt, J = 63.0, 6.8 Hz, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 10H Φάσμα 32: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , , , , (2C), , , , (2C), , 67.95, 59.53(2C), 56.96, 51.24(2C), 47.21, 44.60, 34.99, (ESI-MS) calcd for C24H28FN3O4 [M+H]: , found:

102 (29)4-((4-(benzo[b]thiophen-4-yl)piperazin-1-yl)methyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 33: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 75 o C) δ 7.70 (dd, J = 24.3, 6.8 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.31 (t, J = 7.8 Hz, 1H), (m, 2H), 6.96 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.40 (s, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.54 (t, J = 18.7 Hz, 2H), 3.38 (dd, J = 18.8, 11.8 Hz, 8H), 2.96 (d, J = 61.9 Hz, 3H), 1.12 (t, J = 7.0 Hz, 3H). Φάσμα 34: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ (2C), , , (2C), (2C), , , (2C), , (2C), 65.85, 59.35, 56.94, 51.90(2C), 49.18, 36.23, 16.09, (ESI-MS) calcd for C24H29N3O3S [M+H]: , found:

103 (31) 5-((4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)methyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 35: 1 H NMR(600MHz, DMSO at 75 o C) δ 7.41 (s, 1H), (m, 3H), (m, 2H), 4.30 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.97 (s, 3H), 1.17 (s, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 10Η Φάσμα 36: 13 C NMR(151MHz, DMSO at 75 o C) δ (2C), , (3C), , (3C), , , , 56.87(4C), 51.42, 48.60, 44.50, 34.87, (ESI-MS) calcd for C22H27Cl2N3O3 [M+H]: , found:

104 (33)5-((4-(6-fluorobenzo[d]isoxazol-3-yl)piperidin-1-yl)methyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 37: 1 H NMR (400MHz, DMSO at 75 o C) δ 8.16 (s, 1H), 7.63 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.42 (s, 1H), 7.28 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.27 (s, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.42 (d, J = 32.6 Hz, 5H), 2.97 (s, 3H), 2.37 (s, 2H), 2.24 (s, 2H), (m, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 2Η Φάσμα 38: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , , , , , , , , , , 97.84, 67.58, 60.18, 58.60, 56.41, 51.11, 44.12, 34.63, 31.58, 27.19, 25.90, (ESI-MS) calcd for C24H2FN3O4 [M+H]: , found:

105 (34)5-((4-(benzo[d]isothiazol-3-yl)piperazin-1-yl)methyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 39: 1 H NMR (400MHz, DMSO at 75 o C) δ 8.06 (dd, J = 15.7, 8.2 Hz, 2H), 7.57 (t, J = 7.5 Hz, 1H), (m, 2H), 7.38 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.30 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), (m, 6H), 2.95 (s, 3H), 1.16 (t, J = 6.3 Hz, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 4Η Φάσμα 40: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , (2C), (2C), (2C), (2C), , , 75.26, 54.51, 52.22, 46.45(2C), 42.62, 39.91, 30.17, (ESI-MS) calcd for C23H28N4O3S [M+H]: , found:

106 (37)5-((4-(benzo[b]thiophen-4-yl)piperazin-1-yl)methyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 41: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 75 o C) δ 7.72 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.1 Hz, 1H), (m, 2H), 7.41 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.31 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 4.36 (s, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.55 (d, J = 12.1 Hz, 2H), 3.43 (s, 3H), 3.30 (dd, J = 26.2, 8.9 Hz, 4H), 2.97 (d, J = 64.7 Hz, 4H), 1.18 (dt, J = 33.8, 28.3 Hz, 3H). Φάσμα 42: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , , , , , , , , , , , , , 58.93, 56.95(2C), 51.78(2C), 49.30, 44.52, 34.92, (ESI-MS) calcd for C24H29N3O3S [M+H]: , found:

107 ΣΥΝΘΕΣΗ ΑΛΚΟΟΛΩΝ ΑΠΟ ΤΙΣ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΕΣ Ν-ΜΕΘΥΛΟ-Ν-ΑΙΘΥΛΟ- ΚΑΡΒΑΜΙΚΕΣ ΑΚΕΤΟΦΑΙΝΟΝΕΣ Σε μία σφαιρική των 5ml με μαγνητάκι ζυγίζονται 200mg (0.9mmol, 1eq) από την ένωση 12 τα οποία διαλύονται σε 1ml MeOH (5vol) και προστίθενται 34mg(0.9mmol, 1eq) NaBH4. Η αντίδραση αφήνεται υπό ανάδευση σε RT συνθήκες για ~40 λεπτά και ελέγχεται με HPLC. Το μίγμα της αντίδρασης συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού. Στην συνέχεια προστίθενται 3ml H2O και εκχυλίζονται με EtOAc (2x5ml). Η οργανική φάση στεγνώνεται με NaSO4, διηθείται και συμπυκνώνεται για να δώσει την ένωση 36 υπό μορφή κίτρινου λαδιού το οποίο ζυγίζεται και αποθηκεύεται σε πλαστικό vial υπό Ν2. Απόδοση : 98% (36) 3-(1-hydroxyethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 43: 1 H NMR (600MHz, CDCl3) δ (m, 1H), (m, 2H), 7.02 (d, J = 27.0 Hz, 1H), 4.85 (q, J = 6.5 Hz, 1H), (m, 2H), 2.98 (dd, J = 44.4, 28.7 Hz, 3H), 1.46 (d, J = 6.5 Hz, 3H), (m, 3H). Φάσμα 44 : 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ , , , , , , 69.88, 44.01, 33.89, 24.96,

108 Ομοίως παρασκευάστηκαν και οι ενώσεις 39 και 40 από τις αντίστοιχες 21, 22 και 23. (37) 4-(1-hydroxyethyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 45: 1 H NMR (600MHz, CDCl3) δ (m, 2H), (m, 1H), 4.87 (q, J = 6.3 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.44 (d, J = 45.9 Hz, 2H), 3.03 (d, J = 58.6 Hz, 3H), 1.50 (dd, J = 23.9, 6.4 Hz, 3H), 1.22 (d, J = 38.6 Hz, 3H). Φάσμα 46 : 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ , , , (2C), , , 70.06, 55.84, 44.14, 34.23, 25.12, (38) 5-(1-hydroxyethyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 47 : 1 H NMR (600MHz, CDCl3) δ (m, 2H), (m, 1H), 4.81 (q, J = 6.2 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.44 (d, J = 44.9 Hz, 2H), 3.03 (d, J = 58.6 Hz, 3H), 1.51 (dd, J = 23.2, 6.1 Hz, 3H), 1.12 (d, J = 36.6 Hz, 3H). Φάσμα 48 : 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ , , , , , , , 69.47, 55.97, 44.15, 34.24, 24.78,

109 (39) 4-(1-hydroxyethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 49: 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) δ (m, 2H), 7.04 (d, J = 3.6 Hz, 2H), 4.80 (q, J = 6.5 Hz, 1H), 3.41 (dq, J = 42.9, 6.8 Hz, 2H), 3.00 (d, J = 52.8 Hz, 3H), 2.47 (s, 1H), 1.42 (d, J = 6.5 Hz, 3H), (m, 3H). Φάσμα 50: 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ , , , (2C), (2C), 69.78, 44.00, 34.16, 25.08,

110 ΣΥΝΘΕΣΗ ΧΛΩΡΙΔΙΩΝ ΑΠΟ ΤΙΣ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΕΣ ΑΛΚΟΟΛΕΣ Σε μία καμένη σφαιρική των 25ml με μαγνητάκι ζυγίζονται 1.25g(4.93mmol, 1eq) από την ένωση 39 τα οποία διαλύονται σε 10ml DCM και προστίθενται 0.54ml(7.4mmol, 1.5eq) SOCl2. Η αντίδραση αφήνεται για ανάδευση overnight υπό Ν2 (παρουσία bubler καθώς η αντίδραση παράγει SO2 υπό μορφή φυσαλίδων και πρέπει να απομακρυνθεί για να εκτονωθεί το σύστημα) σε RT συνθήκες και ελέγχεται με HPLC και NMR. Στην συνέχεια το μίγμα της αντίδρασης συμπυκνώνεται μέχρι να εξατμιστεί πλήρως το περισσευούμενο SOCl2 η οποία επιτυγχάνεται με την προσθήκη ACN(3x5ml) και επανασυμπύκνωση του προκύπτοντος διαλύματος. Η ένωση 42 απομονώνεται υπό μορφή καφετί λαδιού στην σφαιρική όπου και ζυγίζεται και αποθηκεύεται στο ψυγείο υπό Ν2. Απόδοση : 95% (41) 4-(1-chloroethyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 53: 1 H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.02 (dd, J = 15.9, 5.0 Hz, 2H), (m, 1H), 5.06 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), (m, 2H), 2.99 (dd, J = 47.7, 29.6 Hz, 3H), 1.83 (d, J = 6.8 Hz, 3H), (m, 3H). Φάσμα 54: 13 C NMR (151 MHz, CDCl 3) δ , , , , (2C), , 58.52, 55.88, 44.11, 34.23, 26.58,

111 Ομοίως συντέθηκαν και οι ενώσεις 41 και 43 από τις αντίστοιχες ενώσεις 38 και 40. (40) 3-(1-chloroethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 51: 1 H NMR(600MHz, CDCl3) δ 7.33 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 5.07 (q, J = 6.8 Hz, 1H), (m, 2H), 3.03 (d, J = 45.2 Hz, 3H), 1.84 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.21 (ddt, J = 23.0, 8.8, 7.1 Hz, 3H). Φάσμα 52: 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ , , , , (2C), , 58.01, 43.98, 34.16, 26.33, (42) 5-(1-chloroethyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 55: 13 C NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.20 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.16 (s, 1H), 6.90 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.06 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.44 (dd, J = 47.0, 6.7 Hz, 2H), 3.03 (d, J = 56.0 Hz, 3H), 1.83 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.22 (dt, J = 39.4, 6.5 Hz, 3H). Φάσμα 56: 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ , , , , , , , 58.19, 55.92, 44.11, 34.21, 26.21,

112 (43) 4-(1-chloroethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 57: 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) δ (m, 2H), 7.11 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 5.10 (q, J = 6.8 Hz, 1H), (m, 2H), 3.04 (d, J = 43.7 Hz, 3H), 1.85 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.21 (dq, J = 11.4, 7.1 Hz, 3H). Φάσμα 58: 13 C NMR (151 MHz, CDCl3) δ , , , , , , , 58.12, 43.97, 34.12, 26.50,

113 ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ ΡΙΒΑΣΤΙΓΜΙΝΗΣ ΠΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ ΑΠΟ ΑΚΕΤΟΦΑΙΝΟΝΕΣ Σε ένα καμένο multireactor tube με μαγνητάκι ζυγίζονται 95mg (0.35mmol, 1.5eq) από την ένωση 41, 45mg (0.234mmol, 1eq) από την ένωση 10, 97mg (0.7mmol, 3eq) Κ2CO3, 4mg (0.02mmol, 0.1eq) KI και διαλύονται σε 1ml CAN (10vol). Η αντίδραση αφήνεται για ανάδευση στον multireactor υπό Ν2 στους 85 o C overnight και ελέγχεται με HPLC. Όταν καταναλωθεί πλήρως η ένωση 18, προστίθενται 5ml H2O και εκχυλίζονται με EtOAc (2x5ml). Στην συνέχεια η οργανική φάση εκχυλίζεται με 5ml HCl (1M). Η όξινη υδατική φάση στην συνέχεια μετατρέπεται σε αλκαλική με την προσθήκη ΝαΟΗ (2Μ) και εκχυλίζεται με EtOAc (2x5ml). Η δεύτερη οργανική φάση στεγνώνεται με Na2SO4, διηθείται και συμπυκνώνεται για να δώσει ένα πορτοκαλί λάδι. Στο πορτοκαλί λάδι προστίθενται 0.25ml HCl in Dioxane, 0.25ml MeOH, 5ml διαιθυλαιθέρα. Καταβυθίζεται μπεζ στερεό το οποίο διηθείται σε Buchner και ξεπλένεται εκεί με 5ml διαιθυλαιθέρα. Τέλος απομονώνεται και ζυγίζεται σε πλαστικό vial και υπό Ν2. Απόδοση : 60% (45) 2-methoxy-4-(1-(4-(2-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)ethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 59: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 75 o C) δ 7.67 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 7.16 (dt, J = 21.6, 4.9 Hz, 2H), (m, 4H), (m, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.39 (dd, J = 8.6, 5.5 Hz, 2H), (m, 4H), 3.12 (tt, J = 17.0, 8.3 Hz, 4H), 3.01 (s, 3H), 1.76 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.18 (t, J = 6.7 Hz, 3H). Φάσμα 60: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , , , , (2C), , , , , , 66.02, 57.09, 56.33(2C), 51.08, 50.17, 47.75, 44.59, 35.03, 17.92, (ESI-MS) calcd for C24H33N3O4 [M+H]: , found:

114 Ομοίως συντέθηκαν και απομονώθηκαν οι ενώσεις 47 (από τις ενώσεις 42 και 22), 53 (από τις ενώσεις 41 και 22) και 51(από τις ενώσεις 41 και 18) (47)4-(1-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)piperazin-1-yl)ethyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 61: 1 H NMR(400MHz, DMSO at 75 o C) δ 7.62 (s, 1H), 7.16 (dt, J = 15.3, 4.8 Hz, 2H), 6.78 (dd, J = 8.4, 4.4 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 2.3 Hz, 1H), (m, 1H), 5.92 (d, J = 3.6 Hz, 2H), 4.47 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.52 (d, J = 12.1 Hz, 2H), 3.37 (s, 3H), (m, 1H), 3.19 (s, 1H), 3.06 (d, J = 9.8 Hz, 2H), 2.96 (s, 4H), 1.76 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.17 (s, 3H). Φάσμα 62: 13 C NMR(101MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , , , , (2C), , , , , , , 84.38, 70.15, 61.28(2C), 54.91, 51.99, 39.15, 32.65, 22.07, (ESI-MS) calcd for C24H31N3O5[M+H]: , found:

115 (53) 3-(1-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)piperazin-1-yl)ethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 63: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 75 o C) δ (m, 3H), 7.20 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.34 (dd, J = 8.5, 2.3 Hz, 1H), 5.90 (s, 2H), 4.52 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.73 (t, J = 16.6 Hz, 2H), (m, 2H), 3.17 (t, J = 11.7Hz, 2H), (m, 2H), 2.88 (s, 3H), 1.71 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.17 (t, J = 6.8 Hz, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 2Η Φάσμα 64: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , , ,130.82, , , , , , , , 65.36, 50.83, 47.74(2C0, 44.48(2C), 34.99, 17.61, (ESI-MS) calcd for C23H29N3O5[M+H]: , found:

116 (51) 3-(1-(4-(2-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)ethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 65: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 80 o C) δ 7.54 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.46 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 7.20 (dd, J = 8.1, 1.6 Hz, 1H), (m, 1H), 6.93 (dd, J = 10.9, 9.7 Hz, 1H), 6.88 (qd, J = 7.9, 1.7 Hz, 2H), 4.52 (q, J = 6.7 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.39 (s, 5H), 3.10 (s, 4H), 2.96 (s, 4H), 1.74 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.16 (s, 3H). Φάσμα 66: 13 C NMR (151 MHz, DMSO at 80 o C) δ , , , , , , , , , , , , 65.03, 55.80(2C), 50.77, 49.36, 47.28, 43.98(2C), 34.40, 17.10, (ESI-MS) calcd for C23H31N3O3[M+H]: , found:

117 Οι υπόλοιπες ενώσεις 46, 48, 49, 50, 52, 54, 55 και 56 παρασκεύαστηκαν με τις ίδιες ακριβώς συνθήκες ωστόσο απομονώθηκαν με διαφορετικό τρόπο λόγο της ελάχιστης τους κατανομής στο όξινο υδατικό διάλυμα. Η κατεργασία που ακολουθείτε είναι η εξής: Αφότου η αντίδραση έχει ελεγχθεί με HPLC ότι έχει ολοκληρωθεί, το μίγμα της αντίδρασης μεταφέρεται σε σφαιρική των 10ml και συμπυκνώνεται μέχρι να εξατμιστεί το THF. Στην συνέχεια προστίθεται 2ml HCl (1M) στην σφαιρική και εκχυλίζεται με (2x3ml) EtOAc. Η οργανική φάση συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού και δίνει ένα πορτοκαλί λάδι. Τέλος προστίθενται στο πορτοκαλί λάδι 0.25ml HCl in Dioxane, 0.25ml MeOH και 5ml διαιθυλαιθέρα. Καταβυθίζεται στερεό το οποίο διηθείται και ξεπλένεται με διαιθυλαιθέρα (~2ml) σε ηθμό Buchner. Το στερεό αποθηκεύεται σε πλαστικό vial υπό Ν2 όπου και ζυγίζεται. (46) 4-(1-(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)ethyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 67: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 75 o C) δ 7.53 (s, 1H), (m, 2H), (m, 3H), 4.54 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.47 (s, 2H), 3.37 (d, J = 9.8 Hz, 3H), 3.05 (s, 2H), 2.96 (s, 4H), 1.76 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 1.18 (d, J = 13.8 Hz, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 2Η Φάσμα 68: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , (2C), , , , (2C), , , , 65.90, 57.03(2C), 51.12, 50.42, 48.77, 44.68, 44.45, 34.91, 17.85, (ESI-MS) calcd for C23H29Cl2N3O3[M+H]: , found:

118 (48)4-(1-(4-(6-fluorobenzo[d]isoxazol-3-yl)piperidin-1-yl)ethyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 69: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 80 o C) δ 8.15 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 7.63 (dd, J = 9.0, 1.9 Hz, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.28 (td, J = 9.1, 2.0 Hz, 1H), (m, 2H), 4.53 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), (m, 2H), 3.38 (d, J = 11.9 Hz, 2H), 3.04 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 2.96 (s, 4H), (m, 4H), 1.77 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.17 (s, 3H). Φάσμα 70: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , , , , (2C), (2C), , , , 98.47, 65.75, 57.08(2C), 51.29, 49.23, 32.02, 28.00(2C), 17.56(2C), (ESI-MS) calcd for C25H30FN3O4[M+H]: , found:

119 (49)4-(1-(4-(benzo[d]isothiazol-3-yl)piperazin-1-yl)ethyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 71: 1 H NMR(600MHz, CD3CN at 60 o C δ 7.96 (dd, J = 13.4, 8.2 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.54 (ddd, J = 8.1, 7.0, 0.9 Hz, 1H), 7.42 (ddd, J = 8.0, 7.0, 0.9 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.26 (p, J = 6.7 Hz, 1H), (m, 1H), (m, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.81 (d, J = 12.4 Hz, 1H), (m, 1H), 3.34 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 3.18 (ddd, J = 20.4, 14.5, 8.6 Hz, 2H), 3.00 (dd, J = 12.3, 3.2 Hz, 1H), 2.91 (d, J = 14.5 Hz, 3H), 1.84 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 1.13 (dd, J = 12.6, 6.4 Hz, 3H). Φάσμα 72: 13 C NMR (151 MHz, CD3CN at 75 o C) δ , , , , , (2C), , (2C), , , , 78.61, 67.05, 50.63, 50.36, 49.88, 47.44, 46.99, 44.60, 33.99, 17.10, (ESI-MS) calcd for C24H30N4O3S [M+H]: , found:

120 (50)4-(1-(4-(benzo[b]thiophen-4-yl)piperazin-1-yl)ethyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 73: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 75 o C) δ 7.70 (dd, J = 15.3, 6.8 Hz, 2H), 7.57 (s, 1H), 7.47 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.31 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.18 (q, J = 8.2 Hz, 2H), 6.96 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.56 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), (m, 2H), 2.96 (d, J = 53.6 Hz, 3H), 1.78 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.18 (s, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 8Η Φάσμα 74: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , , , , (2C), , , , , , , , 92.74, 62.81, 61.28, 52.30, 46.44, 44.76, 44.57, 36.04, 30.54, (ESI-MS) calcd for C25H31N3O3S [M+H]: , found:

121 (52) 3-(1-(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)ethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 75: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 75 o C) δ (m, 2H), 7.42 (s, 1H), (m, 2H), 7.24 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 7.0, 2.5 Hz, 1H), 3.80 (s, 1H), (m, 5H), 3.03 (dd, J = 51.8, 32.3 Hz, 4H), 1.72 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.17 (d, J = 15.0 Hz, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 4Η Φάσμα 76: 13 C NMR (151 MHz, DMSO at 75 o C) δ , , (2C), , (2C), , (2C), , , , 51.08, 50.35, 49.14, (2C), 35.08, 17.52, 14.08, (ESI-MS) calcd for C22H27Cl2N3O2[M+H]: , found:

122 (54) 3-(1-(4-(6-fluorobenzo[d]isoxazol-3-yl)piperidin-1-yl)ethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 77: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 80 o C) δ 8.20 (dd, J = 8.8, 5.3 Hz, 1H), 7.69 (dt, J = 9.0, 4.4 Hz, 1H), (m, 2H), 7.44 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.29 (tt, J = 14.1, 7.0 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 6.3 Hz, 1H), (m, 1H), 3.80 (d, J = 11.5 Hz, 1H), (m, 6H), (m, 1H), 2.31 (qd, J = 13.3, 3.7 Hz, 1H), 2.18 (dd, J = 25.7, 13.8 Hz, 2H), 1.75 (d, J = 6.9 Hz, 3H), (m, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 3Η Φάσμα 78: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 80 o C) δ , , , , (2C), , , , , , , , 97.98, 64.80, 50.93, 48.52, 43.93(2C), 34.35, 31.53, 27.25, 16.84, (ESI-MS) calcd for C24H28FN3O4[M+H]: , found:

123 (55) 3-(1-(4-(benzo[d]isothiazol-3-yl)piperazin-1-yl)ethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 79: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 75 o C) δ (m, 2H), (m, 2H), 7.49 (dt, J = 8.2, 3.8 Hz, 2H), 7.43 (t, J = 7.4 Hz, 1H), (m, 1H), 4.58 (dd, J = 13.6, 6.7 Hz, 1H), (m, 2H), 3.41 (t, J = 22.6 Hz, 3H), (m, 2H), 2.98 (s, 4H), 1.78 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.17 (s, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 2Η Φάσμα 80: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 75 o C) δ , , , , , (2C), , (2C), , , , , 79.57, 50.05, 46.77, 46.59, 43.88, 33.45, 17.09, 13.46, (ESI-MS) calcd for C24H30N4O3S [M+H]: , found:

124 (56) 3-(1-(4-(benzo[b]thiophen-4-yl)piperazin-1-yl)ethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 81: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 80 o C) δ 7.69 (dd, J = 13.2, 6.8 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 9.5, 6.3 Hz, 2H), 7.45 (dd, J = 5.6, 0.7 Hz, 1H), 7.30 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 8.1, 1.5 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 7.7, 0.6 Hz, 1H), 4.60 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 3.83 (d, J = 12.0 Hz, 1H), (m, 1H), (m, 4H), 2.99 (d, J = 64.9 Hz, 3H), 1.78 (d, J = 6.9 Hz, 3H), (m, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 4Η Φάσμα 82: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 80 o C) δ , , (2C), , , (2C), , , , , , , , 60.96, 44.69, 39.72(4C), 30.24, 12.92, (ESI-MS) calcd for C24H29N3O2S [M+H]: found:

125 (57) 4-(1-(4-(2-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)ethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 83: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 80 o C) δ 7.73 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 8.4 Hz, 2H), (m, 4H), 4.54 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.49 (t, J = 15.1 Hz, 1H), (m, 4H), (m, 2H), (m, 2H), 2.95 (s, 4H), 1.77 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.11 (s, 3H). Φάσμα 84: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 80 o C) δ , , , , , , , , , , , , , 65.38, 56.26, 51.11, 49.63, 47.70, 44.45, 34.84, 34.51, 17.64, (ESI-MS) calcd for C23H31N3O3 [M+H]: , found:

126 (58) 4-(1-(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)ethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 85: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 80 o C) δ 7.72 (d, J = 8.4 Hz, 2H), (m, 2H), 7.22 (d, J = 8.5 Hz, 2H), (m, 1H), 4.56 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 3.80 (s, 1H), 3.39 (d, J = 38.2 Hz, 5H), 3.08 (d, J = 31.8 Hz, 3H), 2.97 (s, 4H), 1.76 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.16 (s, 3H). Φάσμα 86: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 80 o C) δ , , , , , , (2C), , , , , , 65.39, 51.12, 49.93, 48.55, 48.48, 44.45, 34.51, 17.70, (ESI-MS) calcd for C22H27Cl2N3O2 [M+H]: , found:

127 (59) 4-(1-(4-(6-fluorobenzo[d]isoxazol-3-yl)piperidin-1-yl)ethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 87: 1 H NMR(600MHz, DMSO at 80 o C) δ 8.24 (dd, J = 8.7, 5.3 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.63 (dd, J = 9.0, 1.9 Hz, 1H), (m, 3H), 4.55 (s, 1H), 3.80 (d, J = 11.4 Hz, 1H), (m, 4H), 2.95 (dd, J = 28.9, 18.2 Hz, 4H), (m, 1H), (m, 1H), (m, 1H), 2.15 (ddd, J = 18.0, 17.4, 8.0 Hz, 2H), 1.77 (t, J = 18.5 Hz, 3H), 1.16 (s, 3H). Φάσμα 88: 13 C NMR(151MHz, DMSO at 80 o C) δ , , , , , , , , , , , , , 98.43, 65.15, 51.34, 48.73, 44.43, 34.52, 32.15, 27.64(2C), 17.50, (ESI-MS) calcd for C24H28FN3O3 [M+H]: , found:

128 (60) 4-(1-(4-(benzo[d]isothiazol-3-yl)piperazin-1-yl)ethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 89: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 80 o C) δ 8.06 (dd, J = 15.2, 8.2 Hz, 2H), 7.72 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.56 (dd, J = 11.2, 3.9 Hz, 1H), 7.43 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.57 (d, J = 6.4 Hz, 1H), (m, 2H), (m, 2H), (m, 1H), 3.38 (s, 2H), (m, 4H), 1.78 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.20 (s, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 2Η Φάσμα 90: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 80 o C) δ , , , , , , , (2C), (2C), (2C), , 65.40, 50.53, 49.28, 47.32, 47.17, 44.46, 34.65, 17.66, (ESI-MS) calcd for C23H28N4O2S [M+H]: , found:

129 (61) 4-(1-(4-(benzo[b]thiophen-4-yl)piperazin-1-yl)ethyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 91: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 80 o C) δ (m, 2H), 7.68 (dd, J = 13.3, 6.8 Hz, 2H), 7.45 (dd, J = 5.6, 0.7 Hz, 1H), 7.30 (t, J = 7.9 Hz, 1H), (m, 2H), 6.94 (dd, J = 7.6, 0.6 Hz, 1H), 4.58 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 3.82 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 3.53 (d, J = 8.3 Hz, 2H), (m, 2H), 3.31 (dd, J = 24.6, 12.5 Hz, 2H), 3.24 (s, 1H), 3.15 (s, 2H), 2.98 (d, J = 39.5 Hz, 3H), 1.79 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.26 (s, 3H). Φάσμα 92: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 80 o C) δ , , , (2C), , , , (2C), , , , (2C), 65.47, 51.22, 50.03, 49.31, 49.09, 44.52, 34.43, 17.76, (ESI-MS) calcd for C24H29N3O2S [M+H]: , found:

130 ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΠΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ ΑΠΟ ΤΟ ΑΣΤΑΘΕΣ ΧΛΩΡΙΔΙΟ (43) Σε μία καμένη σφαιρική με μαγνητάκι ζυγίζονται 60mg (0.221mmol, 1eq) από την ένωση 43, 45mg (0.234mmol, 1eq) από την ένωση 12, 95mg (0.44mmol, 3eq) και διαλύονται σε 0.5ml ACN (6vol). Η αντίδραση αφήνεται για ανάδευση σε RT υπό Ν2 overnight και ελέγχεται με HPLC. Όταν καταναλωθεί πλήρως η ένωση 43 τότε η αντίδραση διακόπτεται και το μίγμα της αντίδρασης διηθείται. Στην συνέχεια το διήθημα συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού. Το πορτοκαλί λάδι που προκύπτει διαλύεται σε 5ml EtOAc και εκχυλίζεται με ρυθμιστικό διάλυμα (ph=5.6) φωσφωρικών (6x1ml). Ακολούθως η οργανική φάση στεγνώνεται με Na2SO4, διηθείται και συμπυκνώνεται για να δώσει ένα πορτοκαλί λάδι. Στο πορτοκαλί λάδι προστίθενται 0.25ml HCl in Dioxane, 0.25ml MeOH, 5ml διαιθυλαιθέρα. Καταβυθίζεται μπεζ στερεό το οποίο διηθείται σε Buchner και ξεπλένεται εκεί με 5ml διαιθυλαιθέρα. Τέλος απομονώνεται και ζυγίζεται σε πλαστικό vial και υπό Ν2. (62)5-(1-(4-(2,3-dichlorophenyl)piperazin-1-yl)ethyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 93: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 80 o C) δ 7.52 (dd, J = 8.4, 1.8 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 1.6 Hz, 1H), (m, 2H), (m, 2H), 4.51 (s, 1H), 3.82 (S, 3H), 3.43 (s, 2H), 3.38 (s, 4H), 2.96 (s, 4H), 1.75 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.19 (t, J = 5.8 Hz, 3H). Το νερό του DMSO καλύπτει τις κορυφές 3Η Φάσμα 94: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 80 o C) δ (2C), , (2C), , , , , (2C), , , 65.11, 56.84, 51.04, 49.44, 48.54, 48.49, 44.47, 35.01, 17.52, (ESI-MS) calcd for C23H29Cl2N3O3 [M+H]: , found:

131 (63)5-(1-(4-(6-fluorobenzo[d]isoxazol-3-yl)piperidin-1-yl)ethyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 95: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 80 o C) δ 8.22 (dd, J = 8.7, 5.3 Hz, 1H), 7.62 (dd, J = 9.0, 1.7 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 8.5, 1.6 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 1.3 Hz, 1H), (m, 1H), 7.19 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), (m, 1H), 3.41 (t, J = 12.3 Hz, 4H), 2.96 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 2.85 (dd, J = 22.1, 10.7 Hz, 1H), (m, 1H), 2.43 (ddd, J = 16.4, 13.4, 3.6 Hz, 1H), (m, 2H), 1.77 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.17 (s, 3H). Φάσμα 96: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 80 o C) δ , , , , , , , , , , , 98.00, 97.81, 90.29, 64.45, 56.44, 50.86, 47.85, 43.72, 34.10, 31.64, 27.23, 27.19, 16.83, (ESI-MS) calcd for C25H30FN3O4 [M+H]: , found:

132 (64)5-(1-(4-(benzo[d]isothiazol-3-yl)piperazin-1-yl)ethyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 97: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 80 o C) δ 8.06 (dd, J = 15.8, 8.2 Hz, 2H), 7.56 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.43 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.52 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.53 (s, 1H), 3.39 (d, J = 11.5 Hz, 3H), 3.31 (s, 2H), 3.04 (d, J = 33.0 Hz, 4H), 2.96 (s, 2H), 1.75 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.17 (s, 3H). Φάσμα 98: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 80 o C) δ , (2C), (2C), , (2C), (2C), (2C), (2C), 65.14, 56.91, 50.39, 47.34(2C), 44.57, 43.64, 34.67, 17.51, (ESI-MS) calcd for C24H30N4O3S [M+H]: , found:

133 (65)5-(1-(4-(benzo[b]thiophen-4-yl)piperazin-1-yl)ethyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate Φάσμα 99: 1 H NMR (600MHz, DMSO at 80 o C) δ (m, 2H), 7.56 (dd, J = 8.5, 2.0 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 7.30 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.53 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.50 (dt, J = 21.9, 10.7 Hz, 4H), 3.32 (t, J = 11.3 Hz, 2H), 3.21 (d, J = 11.3 Hz, 2H), 3.09 (dd, J = 24.7, 14.9 Hz, 1H), 2.94 (s, 4H), 1.78 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.16 (dd, J = 20.0, 6.7 Hz, 3H). Φάσμα 100: 13 C NMR (151MHz, DMSO at 80 o C) δ (2C), (2C), (2C), (2C), (2C), (2C), , (2C), 65.23, 56.85, 51.18, 49.61, 49.14(2C), 44.53, 34.48, 17.60, (ESI-MS) calcd for C25H31N3O3S [M+H]: , found:

134 Γ.3 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΝΜR ΦΑΣΜΑ 1: 1 H NMR (10) 1-(2-methoxyphenyl)piperazine ΦΑΣΜΑ 2 : 13 C NMR (10) 1-(2-methoxyphenyl)piperazine 134

135 ΦΑΣΜΑ 3: 1 H NMR (12) 1-(2,3-dichlorophenyl)piperazine hydrochloride ΦΑΣΜΑ 4 : 13 C NMR (12) 1-(2,3-dichlorophenyl)piperazine hydrochloride 135

136 ΦΑΣΜΑ 5: 1 H NMR (14) 1-(benzo[d][1,3]dioxol-4-yl)piperazine hydrochloride ΦΑΣΜΑ 6 : 13 C NMR(14) 1-(benzo[d][1,3]dioxol-4-yl)piperazine hydrochloride 136

137 ΦΑΣΜΑ 7: 1 H NMR (18) 4-formyl-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate ΦΑΣΜΑ 8: 13 C NMR (18) 4-formyl-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate 137

138 ΦΑΣΜΑ 9: 1 H NMR (19) 5-formyl-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate ΦΑΣΜΑ 10: 13 C NMR (19) 5-formyl-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate 138

139 ΦΑΣΜΑ 11: 1 H NMR (21) 4-acetyl-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate ΦΑΣΜΑ 12: 13 C NMR (21) 4-acetyl-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate 139

140 ΦΑΣΜΑ 13: 1 H NMR (20) 3-acetylphenyl ethyl(methyl)carbamate ΦΑΣΜΑ 14: 13 C NMR (20) 3-acetylphenyl ethyl(methyl)carbamate 140

141 ΦΑΣΜΑ 15: 1 H NMR (22) 5-acetyl-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate ΦΑΣΜΑ 16: 13 C NMR (22) 5-acetyl-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate 141

142 ΦΑΣΜΑ 17: 1 H NMR (23) 4-acetylphenyl ethyl(methyl)carbamate ΦΑΣΜΑ 18: 13 C NMR (23) 4-acetylphenyl ethyl(methyl)carbamate 142

143 ΦΑΣΜΑ 19: 1 H NMR (30) 2-methoxy-5-((4-(2-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate ΦΑΣΜΑ 20: 13 C NMR (30) 2-methoxy-5-((4-(2-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate 143

144 ΦΑΣΜΑ 21: 1 H NMR (24) 2-methoxy-4-((4-(2-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenyl ethyl(methyl)carbamate ΦΑΣΜΑ 22: ethyl(methyl)carbamate 13 C NMR (24) 2-methoxy-4-((4-(2-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)methyl)phenyl 144

145 ΦΑΣΜΑ 23: 1 H NMR(32) 5-((4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)piperazin-1-yl)methyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate ΦΑΣΜΑ 24: 13 C NMR(32) 5-((4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)piperazin-1-yl)methyl)-2-methoxyphenyl ethyl(methyl)carbamate 145