εργαστηριακό έλεγχο Κατσιαφλάκα Άννα Βιοπαθολόγος,Msc Επικ. Επιμελήτρια Β Εργαστήριο Υγιεινής κι Επιδημιολογίας

Transcript

1 Κλασσικές και νέες μέθοδοι στον εργαστηριακό έλεγχο Κατσιαφλάκα Άννα Βιοπαθολόγος,Msc Επικ. Επιμελήτρια Β Εργαστήριο Υγιεινής κι Επιδημιολογίας Π.Γ.Ν.Λάρισας

2 ΝΕΡΑ Περιορισμοί στον προσδιορισμό της μικροβιολογικής ποιότητας του νερού γενικά, και ειδικότερα του πόσιμου νερού: Πολύ μικρός αριθμός παρόντων παθογόνων Ολιγοτροφικό περιβάλλον περιβαλλοντικά στρεσαρισμένοι μικροοργανισμοί Συμπύκνωση / προ-εμπλουτισμός

3 Ομάδες μικροβίων Κοινές μέθοδοι Ιοί Βακτήρια Παρασιτικά πρωτόζωα Συμπύκνωση Προσρόφηση/ έκλουση Διήθηση μέσω μεμβράνης Cartridge filter/ims διαχωρισμός Ανίχνευση/ καταμέτρηση Κυτταροκαλλιέργεια Εκλεκτική ανάπτυξη σε άγαρ Ανοσολογική χρώση/ καταμέτρηση κύστεων

4 Συμπύκνωση: - Διήθηση μέσω μεμβράνης (47 mm, μm βακτήρια, mm, μm κύστεις πρωτοζώων) - Διήθηση μέσω ειδικών φίλτρων (cartridge filters π.χ. φίλτρο Envirocheck, compressed foam filters κύστεις πρωτοζώων) και ακολούθως απομάκρυνση μη ειδικών σωματιδίων (ανοσομαγνητικός διαχωρισμός, βαθμιδωτή φυγοκέντρηση, κυτταρομετρία ροής) Στάδιο προ-εμπλουτισμού: Προ-εμπλουτιστικά μέσα χωρίς αντιβιοτικά ή άλλους εκλεκτικούς παράγοντες αναζωογόνηση τραυματισμένων ή στρεσαρισμένων κυττάρων - Salmonella spp. (buffered peptone water) - Shigella spp. (alkaline nutrient broth ph 8.0)

5 Καλλιέργεια μικροβίων Υγρά θρεπτικά υλικά Μέθοδος πολλαπλών σωλήνων και υπολογισμός MPN (most( probable number) Στερεά θρεπτικά υλικά Ενσωμάτωση (pour plate technique). Διασπορά σε τρυβλίο (spread plate technique). Τεχνική διήθησης μεμβρανών (membrane filtration technique).

6 Ενσωμάτωση (pour plate technique) Εύκολη και οικονομική μέθοδος Vmax = 1ml Θερμικό σοκ αναστολή ευαίσθητων μικροοργανισμών Όχι πάντοτε εύκολη η καταμέτρηση των αποικιών

7 Τεχνική διήθησης μεμβρανών (membrane filtration technique) Ευελιξία στον όγκο του υπό ανάλυση δείγματος (μεγάλοι όγκοι δείγματος ευαισθησία) Ποσοτικό αποτέλεσμα με καλή ακρίβεια Λήψη καλά απομονωμένων αποικιών για περαιτέρω επιβεβαιωτικές δοκιμασίες Ποιότητα των μεμβρανών διήθησης ποικίλλει Στερεά σωματίδια και χημικές ουσίες παρεμβαίνουν στην ανάπτυξη του μικροβίου στόχου Όχι πάντοτε εύκολη η καταμέτρηση των αποικιών

8 International Organization for Standardization (ISO) ΕΛΟΤ ΕΝ ISO :200 1:2001 Ανίχνευση Ανίχνευση και καταμέτρηση κολοβακτηριοειδών και E.coli ΕΛΟΤ ΕΝ ISO : 2: Ανίχνευση καταμέτρηση εντεροκόκκων Ανίχνευση και ΕΛΟΤ ΕΝ ISO 6222: Καταμέτρηση καλλιεργήσιμων μικροοργανισμών 22 C και 37 C ΕΛΟΤ ΕΝ ISO :2009 Ανίχνευση Ανίχνευση και καταμέτρηση Pseudomonas aeruginosa

9 International Organization for Standardization (ISO) ISO :2004 Legionella 2:2004 Ανίχνευση και καταμέτρηση ISO 17995:2005 Ανίχνευση Ανίχνευση και καταμέτρηση των θερμοανθεκτικών Campylobacter species ISO 6340:1995 Ανίχνευση Salmonella ISO/PRF (under Ανίχνευση και καταμέτρηση under development) Ανίχνευση Salmonella spp. ISO 15553:2006 Ανίχνευση Ανίχνευση και ταυτοποίηση ωοκύστεων κρυπτοσποριδίου και κύστεων Giardia από το νερό

10 Καλλιέργεια μικροβίων Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα Σχετικά φθηνή μέθοδος Εύκολη Ποιοτικά και ποσοτικά αποτελέσματα Διαφοροποίηση και πρωταρχική ταυτοποίηση σε εκλεκτικά στερεά θ.υ. Δυνατή η ανίχνευση μικρού αριθμού βακτηρίων (σε συνδυασμό με τεχνικές συμπύκνωσης π.χ. διήθηση Χρονοβόρος (2-3 ημ.) Δυνατό να μην καλλιεργηθούν όλα τα μικρόβια-στόχοι Δεν ανιχνεύει viable but non- culturable μικροοργανισμούς Όχι επαρκής εκλεκτικότητα (ψευδώς θετικά) Όχι πληροφορίες σχετικά με τη μολυσματικότητα του παθογόνου

11 Καλλιέργεια ιών ανθρώπου/ζώων Αρκετοί εντερικοί ιοί μπορούν να προσαχθούν σε κυτταροκαλλιέργειες Ποσοτικό αποτέλεσμα Ανάπτυξη δείχνει μολυσματικότητα Απαιτεί ειδική εκπαίδευση και εξειδικευμένα εργαστήρια Ποικίλλες κυτταροκαλλιέργειες μπορεί να χρειαστεί να χρησιμοποιηθούν Θέματα βιοασφάλειας

12 Καλλιέργεια πρωτοζώων Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα Η in vitro εκκύστωση μπορεί να ληφθεί μερικώς ως ένδειξη βιωσιμότητας Όχι πληροφορίες σχετικά με τη μολυσματικότητα Χρονοβόρος Όχι καλλιέργεια όλων των πρωτοζώων

13 ΤΡΟΦΙΜΑ κλασσικές μέθοδοι Α. Ανίχνευση Προεμπλουτιστικά μέσα Εμπλουτιστικοί ζωμοί Εκλεκτικά θρεπτικά υλικά Β. Καταμέτρηση Αραιώσεις Επιφανειακή επίστρωση Ενσωμάτωση Μέθοδος πολλαπλών σωλήνων

14 Πρότυπες μέθοδοι τροφίμων ISO : Ανίχνευση Escherichia coli O157 : H7 ISO : Καταμέτρηση κοαγκουλάση θετικών σταφυλοκόκκων ISO 6579 : Ανίχνευση Salmonella spp. ISO : Ανίχνευση και απαρίθμηση Listeria monocytogenes

15 Μειονεκτήματα Χρονοβόρα Ετεροχρονισμένα αποτελέσματα Δυνατότητα ελέγχου μικρού αριθμού δειγμάτων Περιορισμένη επαναληψιμότητα Όρια προσδιορισμού ανεπαρκή ιδιαίτερα για τους παθογόνους (Detection limits e.g. insufficient for the reliable detection of low levels of organisms)

16 Ταχείες μικροβιολογικές μέθοδοι Οι ταχείες μικροβιολογικές μέθοδοι βασίζονται σε ενόργανες και βιοτεχνολογικές μεθόδους. Βοηθούν στους ελέγχους ρουτίνας, αλλά απαιτείται σημαντικά αυξημένη ευαισθησία της μεθοδολογίας, η οποία συχνά συγκρούεται με την απαιτούμενη ταχύτητα. Ζητούμενα: (1) ευκολία, (2) ταχύτητα, (3) αξιοπιστία, (4) πραγματικές εγγυήσεις για την αποφυγή λαθών και (5) μηχανοποίηση ή και αυτοματοποίηση.

17 Ταχείες μικροβιολογικές μέθοδοι 1.Μέθοδοι χαρακτηρισμού/aναγνώρισης ELISA Dna ανιχνευτές 2.Μέθοδοι καταμέτρησης Αγωγιμομετρία Τεχνική του άμεσα επιφθορίζοντος φίλτρου (Direct Epifluorescent Filter Technique -DEFT) ΑΤΡ-Bιοφωτεινότητα (ΑΤΡ-Bioluminescence)

18 Μοριακές τεχνικές ελέγχου παθογόνων στο υδάτινο περιβάλλον Η ανάγκη γρήγορης ανίχνευσης κοπρανώδους μόλυνσης του νερού ανάπτυξη μοριακών μεθόδων ανίχνευσης μικροβίων-δεικτών αλλά και παθογόνων μικροβίων στο υδάτινο περιβάλλον Βασικές μοριακές τεχνικές: Υβριδισμός Πέψη DNA με ένζυμα περιορισμού (περιοριστικές ενδονουκλεάσες) Πολλαπλασιασμός τμημάτων γενετικού υλικού (PCR) Αλληλούχιση (sequencing)

19 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction PCR) Αντιγραφή του φυσικού μοντέλου πολλαπλασιασμού του DNA Απλούστευση της αντίδρασης σε in vitro συνθήκες Ανάπτυξη τεχνικών για την ανίχνευση του τελικού προϊόντος

20 Συστατικά της αντίδρασης

21 Στάδια της μεθόδου Στάδιο Μετουσίωσης (Denaturation): Μετουσίωση DNA-στόχου (μετατροπή δικλώνου DNA σε μονόκλωνο) o C για ~30sec

22 Στάδια της μεθόδου Στάδιο Υβριδισμού (Annealing): Υβριδισμός των εκκινητικών μορίων στους αντίστοιχους κλώνους του DNA-στόχου o C, αναλόγως της περιεκτικότητας των primer σε G/C (όσο μεγαλύτερη, τόσο υψηλότερη η θερμοκρασία), για 30sec sec-2min

23 Στάδια της μεθόδου Στάδιο Επέκτασης Εκκινητικών Μορίων (Extension): Δημιουργία θυγατρικού κλώνου Ελεύθερα dntps 72 o C (θερμοκρασία βέλτιστης απόδοσης θερμοάντοχης DNA πολυμεράσης) για 30sec sec-2min

24 Στάδια μεθόδου Κάθε κύκλος αποτελείται από τα 3 στάδια μετουσίωσης, υβριδισμού και επέκτασης και επαναλαμβάνεται φορές Επιτυγχάνεται, συνεπώς, αύξηση των νέων κλώνων DNA με γεωμετρική πρόοδο Τελικός αριθμός αντιγράφων του DNA-στόχου στόχου: 2 n, όπου n αριθμός των κύκλων της PCR Παράδειγμα: PCR 40 κύκλων που ξεκινάει από 1 μόριο DNA- στόχου: 2 40 = αντίγραφα (υποθέτοντας απόδοση PCR 100%).

25 Ηλεκτροφόρηση DNA Το DNA διαχωρίζεται με βάση το μέγεθός του Χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο Ανάγνωση με χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας

26 Παραλλαγές PCR Πολυπλεκτική (Multiplex) PCR Χρήση πολλαπλών ζευγών εκκινητών σύγχρονη ανεύρεση πολλών μικροοργανισμών ή διαφορετικών υπο-ειδών Εμφωλιασμένη (Nested) PCR 2 ζεύγη εκκινητών, το 2 ο ζεύγος υβριδίζεται σε ήδη ειδικό προϊόν ευαισθησία και ειδικότητα Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) τυχαίοι εκκινητές υβριδίζονται τυχαία στο γονιδίωμα για ανίχνευση πολυμορφισμών Παράγει διαφορετικά αποτυπώματα DNA για διαφορετικά στελέχη

27 Πλεονεκτήματα PCR Γρήγορη (3-4 ώρες) Ευαίσθητη Ειδική Δυνατότητα ανίχνευσης «μη καλλιεργήσιμων» μικροβίων Αποτελεί τη βάση για περαιτέρω ανάλυση των νουκλεϊκών οξέων (αλληλούχιση,, RFLP) Ταυτοποίηση μικροοργανισμών μέσω ανίχνευσης γονιδίων: - Μη ειδικών (16S rrna) - Eιδικών για συγκεκριμένο μικροοργανισμό lacz (ολικά κολοβακτηριοειδή), uida (E.coli), gyrb (P.aeruginosa) Ανίχνευση γονιδίων που κωδικοποιούν για βακτηριακές τοξίνες (LT, SLT I, SLT II)

28 Μειονεκτήματα PCR Η έλλειψη ικανότητας διαχωρισμού ζωντανών και μη ζωντανών οργανισμών Η ανάγκη διήθησης μεγάλων ποσοτήτων νερού Η δυσκολία πολλές φορές στη λήψη επαρκούς ποσότητας εκχυλίσματος νουκλεϊκού οξέος Η πιθανή παρουσία ανασταλτικών ουσιών Η επαναληψιμότητα μεθόδου Η μη ποσοτικοποίηση του αποτελέσματος (βασική μέθοδος) Το κόστος, η ανάγκη χρήσης ειδικών χώρων και εξειδικευμένου προσωπικού Δεν έχουν ορισθεί όρια πάνω από τα οποία εμφανίζονται προβλήματα στη Δημόσια Υγεία

29 Reverse Transcription PCR (RT-PCR) Ανίχνευση ολικού RNA, mrna, trna, rrna, pre-rrna rrna (βακτήρια, ιοί, παράσιτα) mrna: ανευρίσκεται σε ζωντανά κύτταρα ένδειξη ύπαρξης ζωντανών κυττάρων ή πρόσφατα νεκρών κυττάρων Καθορισμός βιωσιμότητας Legionella pneumophila, Vibrio cholerae, κύστεων Giardia, ωοκύστεων Cryptosporidium Ασταθές μόριο (t ½ λίγα min) Όχι φυλογενετικές πληροφορίες Ανίχνευση rrna (ένδειξη της φυσιολογικής κατάστασης των κυττάρων στόχων, π.χ. Cryptosporidium parvum) Ανίχνευση pre-rrna rrna (ένδειξη της φυσιολογικής κατάστασης των κυττάρων στόχων λόγω αφθονίας τους σε αναπτυσσόμενα κύτταρα)

30 RT-PCR Πλεονεκτήματα Καλή ένδειξη για ζώντες μικροοργανισμούς Παρέχει πληροφορίες σχετικά με την παθογονικότητα ενός μικροβίου (ανίχνευση mrna ενός γονιδίου υπεύθυνου για έναν παράγοντα λοιμογονικότητας) Μειονεκτήματα Η εκχύλιση επαρκών ποσοτήτων και ανέπαφων μορίων RNA προβληματική Μεγάλη ευαισθησία της ανάστροφης μεταγραφάσης σε ανασταλτικούς παράγοντες Ποιοτικό αποτέλεσμα (παρουσία/απουσία) η βασική μέθοδος

31 Real-Time PCR Συνδυασμός PCR και υβριδισμού Παρακολούθηση του νεοσυντιθέμενου προϊόντος κατά τη διάρκεια της PCR με τη χρήση ανιχνευτών σημασμένων με φθορίζουσες χρωστικές Δεν απαιτείται επιπλέον στάδιο ανίχνευσης του προϊόντος της αντίδρασης Ταυτόχρονος πολλαπλασιασμός και ανίχνευση του προϊόντος Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός DNA και RNA Διάκριση μεταξύ μικροβίων ή/και στελεχών μικροβίων Ανίχνευση μεταλλαγών

32 Real-Time PCR Πλεονεκτήματα Ταχεία Μειωμένος κίνδυνος επιμολύνσεων Υψηλή ευαισθησία Υψηλή επαναληψιμότητα ISO/WD (standard under development): Detection and quantification of Legionella and/or Legionella pneumophila by concentration and genic amplification by polymerase chain reaction (RT-PCR)

33 Προσπάθεια καθορισμού βιωσιμότητας με μοριακές μεθόδους Συνδυασμός real-time Taqman PCR με PMA (propidium monpazide) PMA διεισδύει εκλεκτικά στα κύτταρα που έχουν διαταραγμένες κυτταρικές μεμβράνες θεωρούνται νεκρά- και παρεμβάλλεται στο DNA αναστολή PCR Real-time NASBA (Nucleic Acid Sequence Base Amplification) Ανίχνευση mrna που κωδικοποιεί για μία πρωτείνη θερμικού σοκ (clpb) επάγεται στα ζωντανά κύτταρα E.coli μετά από θερμικό σοκ. Γρήγορη (<4 ώρες), Υψηλή ειδικότητα, ευαισθησία 1 cfu/100ml

34 FISH (Fluorescence in situ hybridisation) Βακτήρια, πρωτόζωα Μικροσυστοιχίες (Microarrays) Σύγχρονη ανεύρεση εκατοντάδων ή/και χιλιάδων αντιδράσεων υβριδισμού επιτυγχάνοντας μαζικό έλεγχο με μεγάλη ειδικότητα και ευαισθησία. Ακόμη έλεγχος της λοιμογόνου δυνάμεως των υπό έλεγχο παθογόνων Biosensors Μελλοντική χρήση LAMP (Loop mediated isothermal amplification assay) Cryptosporidium, Giardia

35 Ευχαριστώ