Μελέτη γενετικών αλλαγών στο γονίδιο CYP2D6 σε υπερταχείς μεταβολιστές που λαμβάνουν αντιψυχωτική και αντικαταθλιπτική αγωγή

Transcript

1 ΛΙΟΠΕΤΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ Μελέτη γενετικών αλλαγών στο γονίδιο CYP2D6 σε υπερταχείς μεταβολιστές που λαμβάνουν αντιψυχωτική και αντικαταθλιπτική αγωγή ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΠΑΤΡΑ 2020

2 ΛΙΟΠΕΤΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ Μελέτη γενετικών αλλαγών στο γονίδιο CYP2D6 σε υπερταχείς μεταβολιστές που λαμβάνουν αντιψυχωτική και αντικαταθλιπτική αγωγή ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΓΕΩΡΓΙΟΣ Π. ΠΑΤΡΙΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΠΟΥΛΑΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΠΑΙΡΑΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ

3 Πρόλογος Ευχαριστίες Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακογονιδιωματικής και Εξατομικευμένης Θεραπείας (ΕΦΕΘ), του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος Ανακάλυψη και ανάπτυξη φαρμάκων, υπό την επίβλεψη του καθηγητή κ. Γεώργιου Π. Πατρινού. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Γεώργιο Πατρινό για τη δυνατότητα που μου έδωσε να συμμετάσχω στην ερευνητική του ομάδα. Ακόμη τον ευχαριστώ για την αμέριστη βοήθεια, την ουσιαστική καθοδήγηση, την συμπαράσταση και την εμπιστοσύνη προς το πρόσωπό μου καθ όλη τη διάρκεια της συνεργασίας μας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Γεώργιο Πάϊρα και τον κ. Κωνσταντίνο Πουλά για την τιμή που μου έκαναν να είναι μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής, αλλά και την ουσιαστική καθοδήγηση και την εμπιστοσύνη προς το πρόσωπό μου κατά την εκπόνηση της διατριβής μου. Ιδιαιτέρως ευχαριστώ τη μεταδιδάκτορα Δρ. Ευαγγελία-Ειρήνη Τσερμπίνι για την διαρκή στήριξή της, τις πολύτιμες γνώσεις της, την επίβλεψη και καθοδήγησή της κατά την διάρκεια του μεταπτυχιακού μου και ειδικά κατά την συγγραφή του. Ευχαριστώ επίσης την υποψήφια διδάκτορα Ζωή Κορδού για τη στήριξη της και την άριστη συνεργασία μας. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στην Αθηνά Τσικρικά για την άριστη συνεργασία μας κατά την διάρκεια του μεταπτυχιακού προγράμματος. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα μέλη του εργαστηρίου. Ήταν χαρά μου να συνεργαστώ μαζί τους.

4

5 Περιεχόμενα Περίληψη...1 Abstract...2 Συντμήσεις- Ξενόγλωσσοι όροι...3 Εισαγωγή Ψυχιατρικές διαταραχές Κατάθλιψη Διπολική διαταραχή Σχιζοφρένεια Αγχώδεις διαταραχές Φαρμακευτική αγωγή Αντιψυχωτικά φάρμακα Αντικαταθλιπτικά φάρμακα Εξατομικευμένη Θεραπεία Φαρμακογονιδιωματική και ψυχιατρικά νοσήματα CYP2D Σκοπός Πειραματικό μέρος Πληθυσμιακό δείγμα Πειραματική διαδικασία Απομόνωση DNA από ολικό αίμα Προσδιορισμός συγκέντρωσης και καθαρότητας του DNA Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Μεγάλης εμβέλειας PCR (long-range PCR / LR-PCR) Ηλεκτροφόρηση Μεθοδολογία γενετικής ανάλυσης μικροδεξαμενής (Minipool) Αποτελέσματα Δημογραφικά στοιχεία ασθενών Πειραματικά αποτελέσματα Συζήτηση Βιβλιογραφία...74

6 Περίληψη Οι ψυχιατρικές διαταραχές περιλαμβάνουν ένα ευρύ φάσμα ψυχικών νόσων που επηρεάζουν τη διάθεση, τη σκέψη και τη συμπεριφορά. Έχουν σημαντικές επιπτώσεις στους ασθενείς, όπως μειωμένη ποιότητα ζωής και αυξημένα ποσοστά θνητότητας, ενώ συνδέονται επίσης με υψηλό κοινωνικό και οικονομικό κόστος. Η φαρμακευτική αγωγή που χορηγείται στους ασθενείς περιλαμβάνει κυρίως αντικαταθλιπτικά και αντιψυχωτικά φάρμακα. Ωστόσο, η ανταπόκριση των ασθενών στην φαρμακευτική αγωγή εξαρτάται από ένα σύνολο παραγόντων και διαφέρει από άτομο σε άτομο. Η εξατομίκευση της θεραπείας κρίνεται απαραίτητη έτσι ώστε να περιοριστεί η εμφάνιση των ανεπιθύμητων ενεργειών και ταυτόχρονα να επιτευχθεί η μέγιστη αποτελεσματικότητα των φαρμάκων, με στόχο την βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών και την μείωση του κόστους της ιατροφαρμακευτικής περίθαλψης. Η εφαρμογή της φαρμακογονιδιωματικής στην ψυχιατρική κλινική πράξη μπορεί να παίξει καθοριστικό ρόλο και μπορεί να δώσει σημαντικές πληροφορίες για την εξατομίκευση της δόσης σε ασθενείς με ψυχιατρικά νοσήματα. Πολλές φαρμακογονιδιωματικές μελέτες επικεντρώνονται στα ένζυμα που μεταβολίζουν αντικαταθλιπτικά και αντιψυχωτικά φάρμακα. Η πλειοψηφία των φαρμάκων αυτών μεταβολίζονται από το ένζυμο CYP2D6. Συγκεκριμένα στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ύπαρξη διπλασιασμού του γονιδίου CYP2D6, που είναι απαραίτητη για την εμφάνιση του φαινοτύπου του υπερταχέος μεταβολιστή. Για το σκοπό αυτό έγινε γονοτύπηση 540 ασθενών, με την βοήθεια της LR-PCR και βρέθηκε ότι το 5.18% από αυτούς φέρει επιπλέον αντίγραφα του CYP2D6. Η συσχέτιση της κλινικής εικόνας των ασθενών με τον συγκεκριμένο γονότυπο υποδηλώνει την συνεισφορά του στην διαφορική ανταπόκρισή τους στη θεραπεία. Επιπλέον, ο θεράπων ιατρός, λαμβάνοντας υπόψη τις κατευθυντήριες οδηγίες του DPWG πραγματοποίησε προσαρμογή της δόσης ή αλλαγή του φαρμάκου σε όσους ασθενείς κρίθηκε απαραίτητο και στις περισσότερες περιπτώσεις παρατηρήθηκε βελτίωση της κλινικής τους εικόνας. 1

7 Abstract Mental illnesses include a wide range of disorders that affect mood, behavior and personal functioning, with schizophrenia, bipolar disorder, depression and anxiety disorders to be the most common. They have significant impact on patients quality of life, while they are also associated with increased healthcare costs. Antidepressant and antipsychotic drugs are administered to patients in order to improve their symptoms and reduce their psychological distress. However, patients' response to psychiatric drugs varies and not all patients have the desired effect. Individualized therapy reduces the emergence of adverse drug reactions, while, it simultaneously, aims to achieve maximum efficacy. This leads to improvement of patients quality of life and reduction of the medical care costs. The implementation of pharmacogenomics in the clinical psychiatric routine can be proved essential, given the fact that most of the pharmacogenomics studies focused on cytochrome P450 enzymes (CYPs), which play important role in the metabolism of antidepressants ant antipsychotics. The majority of these drugs are metabolized by CYP2D6, while there are pharmacogenomic guidelines for many psychiatric drugs. The present thesis focuses on the identification of CYP2D6 duplication, which is necessary for the appearance of the Ultrarapid Metabolizer phenotype. Five hundred forty patients were genotyped using long range PCR and according to our results, 5.18% of them carry additional copies of CYP2D6. Moreover, we tried to evaluate the contribution of CYP2D6 duplication in patients differential response to treatment. In addition, the medical specialist, taking into account the DPWG guidelines, adjusted the dose or changed the drug in some patients that thought it was useful and in most of the cases patients symptoms were improved. 2

8 Συντμήσεις- Ξενόγλωσσοι όροι CNV Copy Number Variation Αριθμός αντιγράφων γονιδίου CPIC Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium Κοινοπραξία εφαρμογής κλινικής φαρμακογενετικής DALYs disability-adjusted life year Προσαρμοσμένα έτη ζωής στην αναπηρία ddh2o Double distilled water Διπλά απεσταγμένο νερό DNA Deoxyribonucleic acid Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ dntps Deoxynucleotide triphosphates Δεοξυριβονουκλεοτίδια DPWG Dutch Pharmacogenetics Working Group Ολλανδική Ομάδα Εργασίας στη Φαρμακογενετική DSM-5 Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 5th Edition Στατιστικό Εγχειρίδιο για τις Ψυχιατρικές Διαταραχές της Αμερικανικής Ψυχικής εταιρείας, πέμπτη αναθεώρηση EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ EM Extensive Metabolizers Εκτενείς Μεταβολιστές EMA European Medicines Agency Ευρωπαϊκός Οργανισμός Φαρμάκων FDA Food and Drug Administration Αμερικανικός οργανισμός τροφίμων και φαρμάκων GABA gamma-aminobutyric acid γ-αμινοβουτυρικό οξύ ICD-10 10th revision of the International Statistical Classification of Diseases 10 η ταξινόμηση των Ψυχικών Διαταραχών και Διαταραχών της Συμπεριφοράς του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας IM Intermediate Metabolizers Ενδιάμεσοι Μεταβολιστές MAOI Monoamine Oxidase Inhibitors Αναστολείς Μονοάμινο οξειδάσης PCR Polymerase Chain Reaction Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PM Poor Metabolizers Πτωχοί Μεταβολιστές 3

9 RNA Ribonucleic acid Ριβονουκλεϊκό οξύ SNP Single Nucleotide Polymorphism Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφοσμός SNRIs Serotonin norepinephrine reuptake inhibitors Αναστολείς επαναπρόσληψης σεροτονίνηςνορεπινεφρίνης SSRIs Selective Serotonine reuptake inhibitors Εκλεκτικοί Αναστολείς επαναπρόσληψης σεροτονίνης TAE Tris-acetate-EDTA Τρις-οξικό EDTA TCAs Tricyclic Antidepressants Τρικυκλικά Αντικαταθλιπτικά UM Ultrarapid Metabolizers Υπερταχείς μεταβολιστές YLDs Years lived with disability Έτη ζωής με ανικανότητα ή αναπηρία 4

10 Εισαγωγή 5

11 1.1Ψυχιατρικές διαταραχές Οι ψυχικές διαταραχές περιλαμβάνουν ένα ευρύ φάσμα ψυχικών καταστάσεων που επηρεάζουν τη διάθεση, τη σκέψη και τη συμπεριφορά. Είναι μία από τις κυριότερες αιτίες νοσηρότητας παγκοσμίως (1). Αποτελούν μείζον πρόβλημα λόγω του υψηλού επιπολασμού, της πρώιμης ηλικίας έναρξης, των πολλαπλών υποτροπών, της χρονιότητάς τους καθώς και της αναπηρίας που συχνά συνοδεύονται (1 3). Σύμφωνα με τον οργανισμό GBD (Global Burden of Disease) τα ψυχιατρικά νοσήματα συγκαταλέγονται στις κορυφαίες αιτίες αναπηρίας. Αξίζει να αναφερθεί η ύπαρξη δυο σημαντικών όρων που βοηθούν στην αξιολόγηση της βαρύτητας μιας ασθένειας, οι όροι YLDs (Years lived with disability) και DALYs (disability-adjusted life years). Ο όρος YLD αναφέρεται στα χρόνια που πάσχει κάποιος από μία ασθένεια, ενώ ο DALY, στα λειτουργικά χρόνια του ασθενούς, που έχουν «χαθεί» εξαιτίας της αναπηρίας που έχει προκύψει. Οι ψυχικές διαταραχές αντιπροσωπεύουν περίπου το 20% των YLDs. Επίσης ανέρχονται στην 5 η σημαντικότερη αιτία αναπηρίας, σύμφωνα με τα DALYs, αντιπροσωπεύοντας το 7% του συνόλου. Ωστόσο αυτά τα ποσοστά είναι πιθανό να μην ανταποκρίνονται στην πραγματικότητα και οι πραγματικές τιμές να είναι ακόμα μεγαλύτερες, ξεπερνώντας το 30% και 13% για τα YLDs και DALYs αντίστοιχα (4). Για την ευκολότερη και καθολική διάγνωση μιας ψυχιατρικής ασθένειας χρησιμοποιούνται συστήματα ταξινόμησης όπως η 10η ταξινόμηση των Ψυχικών Διαταραχών και Διαταραχών της Συμπεριφοράς του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ICD-10) (5) ή το Διαγνωστικό και Στατιστικό Εγχειρίδιο για τις Ψυχιατρικές Διαταραχές της Αμερικανικής Ψυχικής Εταιρείας, πέμπτη αναθεωρημένη έκδοση (DSM-5) (6). Σύμφωνα με το DSM-5, ψυχικές διαταραχές θεωρούνται οι παρακάτω (7,8): Νευροαναπτυξιακές διαταραχές Φάσμα της σχιζοφρένειας και άλλες ψυχωτικές διαταραχές Διπολικές και συναφείς διαταραχές Καταθλιπτικές διαταραχές Αγχώδεις διαταραχές Ιδεοψυχαναγκαστικές διαταραχές 6

12 Διαταραχές συνδεόμενες με τραυματικές και στρεσσογόνες καταστάσεις Αποσυνδετικές διασχιστικές διαταραχές Σωματόμορφες διαταραχές Διατροφικές διαταραχές Διαταραχές απέκκρισης Διαταραχές ύπνου Σεξουαλικές διαταραχές Διαταραχές ταυτότητας φύλου Διαταραχές συμπεριφοράς και παρορμήσεων Διαταραχές χρήσης ουσιών Νευρογνωσιακές διαταραχές Διαταραχές προσωπικότητας Παραφιλικές διαταραχές Άλλες ψυχιατρικές διαταραχές Φαρμακο-επαγόμενες κινητικές διαταραχές και άλλες διαταραχές που οφείλονται σε παρενέργειες φαρμάκων Άλλες καταστάσεις που μπορεί να χρήζουν κλινικής προσοχής Κατάθλιψη Η κατάθλιψη είναι μια συχνά εμφανιζόμενη ψυχική διαταραχή και μία από τις κύριες αιτίες αναπηρίας παγκοσμίως. Σε παγκόσμιο επίπεδο, υπολογίζεται ότι 264 εκατομμύρια άνθρωπο πάσχουν από κατάθλιψη. Γενικά, η κατάθλιψη δεν φαίνεται να σχετίζεται με την ηλικία ή την φυλή, ωστόσο, το ποσοστό εμφάνισης της κατάθλιψης στις γυναίκες είναι διπλάσιο από αυτό των αντρών (9). Η κατάθλιψη χαρακτηρίζεται από συμπτώματα, όπως θλίψη, απώλεια ενδιαφέροντος ή ευχαρίστησης, συναισθήματα ενοχής, χαμηλή αυτοεκτίμηση, διαταραγμένο ύπνο ή όρεξη, δυσκολία στη σκέψη και στη συγκέντρωση. Τα άτομα με κατάθλιψη μπορεί επίσης να παρουσιάσουν σωματικά συμπτώματα όπως κόπωση ή έλλειψη ενεργητικότητας που δεν οφείλονται σε κάποια άλλη σωματική πάθηση και χωρίς εμφανή φυσική αιτία. Τα συμπτώματα 7

13 μπορεί να είναι βραχυπρόθεσμα ή μακροπρόθεσμα και επιδρούν στην καθημερινότητα των ανθρώπων που υποφέρουν από κατάθλιψη. Μπορεί να εξελιχθεί σε μία σοβαρή κατάσταση, επηρεάζοντας την ικανότητα των ανθρώπων να λειτουργούν στο εργασιακό τους περιβάλλον, στο σχολείο και στις διαπροσωπικές τους σχέσεις (10). Σε αρκετές περιπτώσεις, η κατάθλιψη μπορεί να οδηγήσει σε αυτοκτονία. Περίπου άνθρωποι αυτοκτονούν κάθε χρόνο, ενώ οι απόπειρες αυτοκτονίας είναι έως και 20 φορές περισσότερες από αυτές που έχουν ολοκληρωθεί. Η αυτοκτονία είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου σε άτομα ηλικίας ετών (11). Παράγοντες που είναι πιθανό να παίξουν ρόλο στην εμφάνιση της κατάθλιψης περιλαμβάνουν (12): Γενετικό υπόβαθρο αλλαγές στα επίπεδα νευροδιαβιβαστών του εγκεφάλου περιβαλλοντικούς παράγοντες ψυχολογικούς και κοινωνικούς παράγοντες οικογενειακό ιστορικό, όπως η ύπαρξη διπολικής διαταραχή σε κάποιο μέλος της οικογένειας Όσο νωρίτερα ξεκινήσει η θεραπεία, τόσο πιο αποτελεσματική είναι. Η κατάθλιψη αντιμετωπίζεται συνήθως με φαρμακευτική αγωγή, ψυχοθεραπεία ή συνδυασμό των δύο. Αν και η φαρμακευτική αγωγή μπορεί να είναι μια αποτελεσματική μορφή θεραπείας για μέτριασοβαρή κατάθλιψη, δεν αποτελεί την πρώτη γραμμή θεραπείας για περιπτώσεις ήπιας κατάθλιψης και δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της κατάθλιψης σε παιδιά εφόσον λαμβάνεται υπόψη η σχέση κινδύνου/οφέλους (12). Ωστόσο, σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος, οι υπηρεσίες θεραπείας και υποστήριξης για τη κατάθλιψη συχνά απουσιάζουν ή δεν έχουν αναπτυχθεί. Υπολογίζεται ότι το 76-85% των ατόμων που πάσχουν από ψυχικές διαταραχές σε αυτές τις χώρες δεν έχουν πρόσβαση στη θεραπεία που χρειάζονται (13). 8

14 1.1.2 Διπολική διαταραχή Η διπολική διαταραχή είναι μια ψυχική ασθένεια επηρεάζει περισσότερο από το 1% του παγκόσμιου πληθυσμού. Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, 45 εκατομμύρια άνθρωποι (9) ανεξαρτήτως εθνικότητας, καταγωγής ή κοινωνικοοικονομικής κατάστασης πάσχουν από διπολική διαταραχή. Είναι μία από τις κορυφαίες αιτίες αναπηρίας στους νέους και η πορεία της είναι μεταβλητή και μπορεί συχνά να οδηγήσει σε λειτουργική και γνωστική εξασθένηση αλλά και μείωση της ποιότητας ζωής (14). Χαρακτηρίζεται από διακύμανση της διάθεσης εντός μη φυσιολογικού εύρους, η οποία εναλλάσσεται από περιόδους φυσιολογικής διάθεσης (νορμοθυμίας), σε περιόδους με επεισόδια μανίας, υπομανίας ή κατάθλιψης. Ο αριθμός των επεισοδίων σε κάθε φάση διάθεσης και η διάρκειά τους ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των ατόμων, αλλά για τους περισσότερους ασθενείς τα επεισόδια κατάθλιψης είναι πιο παρατεταμένα και είναι υπεύθυνα για μεγάλο μέρος της νοσηρότητας της διαταραχής. Ανάλογα με τον τύπο (πιο πολλά καταθλιπτικά, μανιακά επεισόδια ή μικτά επεισόδια) η διπολική διαταραχή μπορεί να διαχωριστεί σε υποκατηγορίες, όπως η διπολική διαταραχή τύπου Ι, η διπολική διαταραχή τύπου ΙΙ, η κυκλοθυμία και η διπολική διαταραχή μη προσδιοριζόμενη αλλιώς (14). Τα καταθλιπτικά επεισόδια είναι σε γενικές γραμμές παρόμοια στη φύση και τη σοβαρότητα με αυτά της «συνηθισμένης» κατάθλιψης. Ωστόσο, υπάρχουν ορισμένα κλινικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την διπολική διαταραχή όπως η παρουσία ψύχωσης, η μεταβολή της συναισθηματικής διάθεσης κατά τη διάρκεια της ημέρας (μικτά επεισόδια), η υπερυπνία κατά τη διάρκεια καταθλιπτικών επεισοδίων καθώς και ο μεγαλύτερος αριθμός συντομότερων καταθλιπτικών επεισοδίων. Τέτοια χαρακτηριστικά θα πρέπει να λαμβάνονται σοβαρά υπόψη επειδή η βέλτιστη διαχείριση της διπολικής κατάθλιψης διαφέρει από αυτή της μονοπολικής (15). Ένα μανιακό επεισόδιο περιλαμβάνει όχι μόνο αλλαγή της διάθεσης, αλλά και αλλαγές στη συμπεριφορά και στις συνήθειες, όπως μειωμένη ανάγκη για ύπνο, αυξημένη ενέργεια, γρήγορος λόγος και λογόρροια, αυξημένη λίμπιντο καθώς και παράτολμη ή απερίσκεπτη συμπεριφορά (π.χ. υπερβολική δαπάνη). Σε σοβαρά επεισόδια, μπορεί επίσης να συνυπάρχουν και ψυχωτικά συμπτώματα, όπως ψευδαισθήσεις και παραισθήσεις (14). 9

15 Η ακριβής διάγνωση της διπολικής διαταραχής είναι σχετικά δύσκολη στην κλινική πρακτική επειδή η έναρξη είναι συνήθως ένα καταθλιπτικό επεισόδιο και μοιάζει με τη μονοπολική κατάθλιψη. Επιπλέον, δεν υπάρχουν έγκυροι βιοδείκτες για τη διαταραχή αυτή. Τα παραπάνω εξηγούν τον χρόνο που μεσολαβεί μεταξύ της έναρξης της ασθένειας και της διάγνωσης, που συνήθως είναι 5 με 10 χρόνια. Επομένως, ο ρόλος της κλινικής αξιολόγησης παραμένει βασικός. Η ανίχνευση υπομανιακής περιόδου και η διαμήκης αξιολόγηση είναι ζωτικής σημασίας για τη διαφοροποίηση της διπολικής διαταραχής από άλλες καταστάσεις (16) Σχιζοφρένεια Η σχιζοφρένεια είναι μια χρόνια και σοβαρή ψυχική διαταραχή που επηρεάζει τον τρόπο σκέψης, τα συναισθήματα και την συμπεριφορά ενός ατόμου. Αν και η σχιζοφρένεια δεν είναι τόσο συχνή όσο άλλες ψυχικές διαταραχές, τα συμπτώματα μπορεί να είναι πολύ σοβαρά, με σημαντικές επιπτώσεις στην λειτουργικότητα και στην ποιότητα ζωής του ασθενούς. Τα συμπτώματα μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε θετικά, αρνητικά και γνωσιακά. Τα θετικά ή αλλιώς ψυχωτικά συμπτώματα, αφορούν την επαφή με την πραγματικότητα και περιλαμβάνουν παραισθήσεις, ακουστικές και οπτικές ψευδαισθήσεις και παραλήρημα. Στα πλαίσια των αρνητικών συμπτωμάτων, παρατηρείται ιδιαίτερα μειωμένο κίνητρο, αλογία, μειωμένη συναισθηματική έκφραση και κοινωνική απόσυρση (17). Τέλος όσον αφορά τα γνωσιακά συμπτώματα, οι ασθενείς συνήθως έχουν προβλήματα στην συγκέντρωση, την προσοχή, την μάθηση και την μνήμη, αν και παρατηρείται μεγάλη ατομική μεταβλητότητα (18). Τα συμπτώματα εμφανίζονται συνήθως σταδιακά κατά την πρώιμη ενήλικη ζωή ενώ έχει παρατηρηθεί ότι η νόσος εμφανίζεται πιο νωρίς και με μεγαλύτερη συχνότητα στους άντρες σε σχέση με τις γυναίκες (19). Η εμφάνιση της νόσου σε παιδιά είναι πολύ σπανιότερη (20). Υπολογίζεται ότι επηρεάζει περισσότερους από 20 εκατομμύρια ανθρώπους σε όλο τον κόσμο (9). Γενικά, οι ασθενείς με σχιζοφρένεια αντιμετωπίζουν δυσκολίες σε πολλούς τομείς της καθημερινής ζωής, όπως για παράδειγμα στις κοινωνικές σχέσεις, στον εργασιακό χώρο (με το ποσοστό ανεργίας να φτάνει το 80-90% (21)), την ικανότητα να ζουν ανεξάρτητα (22), ενώ το προσδόκιμο ζωής τους είναι μειωμένο κατά χρόνια σε σχέση με τον γενικό πληθυσμό (23). Για την διάγνωση της σχιζοφρένειας, δεν υπάρχει αντικειμενική διαγνωστική δοκιμή και 10

16 βασίζεται σε παρατηρούμενη συμπεριφορά, στο ιστορικό που περιλαμβάνει τις αναφερόμενες εμπειρίες του ατόμου αλλά και τις αναφορές των οικείων του (6). Σε πολλούς ασθενείς με σχιζοφρένεια συνυπάρχουν και άλλες ψυχικές διαταραχές που μπορεί να περιλαμβάνουν μια διαταραχή άγχους όπως η κρίση πανικού, η ιδεοψυχαναγκαστική διαταραχή, η καταθλιπτική διαταραχή ή η διαταραχή χρήσης ουσιών (24). Η θεραπεία περιλαμβάνει κυρίως αντιψυχωτικά φάρμακα σε συνδυασμό με ψυχολογικές θεραπείες, κοινωνική υποστήριξη και αποκατάσταση. Ωστόσο, υπάρχει επιτακτική ανάγκη για πιο αποτελεσματικές θεραπείες και παροχή υπηρεσιών. Οι εξελίξεις στη γονιδιωματική, την επιδημιολογία και τις νευροεπιστήμες έχουν διαγράψει μεγάλη πρόοδο τα τελευταία χρόνια και συμβάλλουν στην καλύτερη κατανόηση της σχιζοφρένειας (17) Αγχώδεις διαταραχές Οι διαταραχές άγχους είναι μια ομάδα ψυχικών διαταραχών που χαρακτηρίζονται από έντονα συναισθήματα άγχους και φόβου. Το άγχος είναι μια ανησυχία για μελλοντικά γεγονότα, ενώ ο φόβος είναι μια αντίδραση στα τρέχοντα γεγονότα. Αυτά τα συναισθήματα παρεμβαίνουν στην ποιότητα ζωής και μπορεί να προκαλέσουν σωματικά συμπτώματα όπως για παράδειγμα ταχυπαλμία ή τρόμο. Υπάρχουν αρκετές διαταραχές άγχους, όπως η φοβία, η κρίση πανικού, η ιδεοψυχαναγκαστική διαταραχή και η γενικευμένη αγχώδης διαταραχή. Ένα άτομο μπορεί να έχει περισσότερες από μία διαταραχές άγχους. Αν και μπορούν να διαφοροποιηθούν ως προς τα συμπτώματά τους, μοιράζονται κάποια κοινά χαρακτηριστικά όπως (6): Έντονη αγωνία και άγχος Αδυναμία συγκέντρωσης Αίσθημα κόπωσης Διαταραχές ύπνου (Ενίοτε) μυϊκούς πόνους Ζάλη Ναυτία Ταχυπαλμία Κεφαλαλγία 11

17 Δυσκολία λήψης απόφασης Οι αγχώδεις διαταραχές αποτελούν τις πιο συχνές ψυχικές παθήσεις (25). Σε μία συστηματική ανασκόπηση μελετών σε 44 χώρες (26), εκτιμήθηκε ότι ένας στους 14 ανθρώπους (7.3%) ανά πάσα στιγμή πάσχει από μια διαταραχή άγχους. Επιπλέον, περίπου ένας στους εννέα (11,6%) είναι πιθανό να παρουσιάσει μια διαταραχή άγχους σε ένα δεδομένο χρόνο. Επίσης, οι γυναίκες έχουν διπλάσιες πιθανότητες από τους άνδρες για την εμφάνιση τέτοιου είδους διαταραχών καθώς επίσης και τα άτομα ηλικίας ετών είναι πιθανότερο κατά 20% να νοσήσουν σε σχέση με άτομα 55 ετών και άνω. Τόσο η ψυχοθεραπεία, όσο και η φαρμακευτική αγωγή αποτελούν αποτελεσματικές στρατηγικές διαχείρισης των διαταραχών του άγχους. Όσον αφορά τα φάρμακα, τα αντικαταθλιπτικά είναι η θεραπεία πρώτης γραμμής για τις περισσότερες διαταραχές (με εξαίρεση τις ειδικές φοβίες) και μειώνουν τα συμπτώματα άγχους, βελτιώνοντας την ποιότητα ζωής των ασθενών (27). Επιπλέον, το γεγονός ότι πολλοί ασθενείς με διαταραχές άγχους πάσχουν επίσης από κατάθλιψη (28), επιτρέπει τη χρήση αντικαταθλιπτικών ως συνδυαστική αγωγή. 1.2 Φαρμακευτική αγωγή Αντιψυχωτικά φάρμακα Τα αντιψυχωτικά φάρμακα ενδείκνυνται κυρίως για τη θεραπεία της σχιζοφρένειας και άλλων ψυχωτικών διαταραχών όπως για παράδειγμα η διπολική διαταραχή. Μπορούν να κατηγοριοποιηθούν ως «τυπικά» ή «κλασικά» και ως «άτυπα», με βάση τον μηχανισμό δράσης τους και τις ανεπιθύμητες ενέργειές τους. Ο κύριος στόχος των «τυπικών» αντιψυχωτικών φαρμάκων είναι οι ντοπαμινεργικοί υποδοχείς D2. Αν και η αναστολή των D2 υποδοχέων κατά 60-65% φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην αποτελεσματικότητα του φαρμάκου, όταν ξεπεράσει αυτό το ποσοστό έχει κατηγορηθεί πως ευθύνεται για την εμφάνιση εξωπυραμιδικών συμπτωμάτων, την κύρια παρενέργεια των κλασικών αντιψυχωτικών (29). Η δράση των άτυπων αντιψυχωτικών, εκτός από τον ανταγωνισμό των ντοπαμινεργικών υποδοχέων(σε μικρότερο βαθμό σε σχέση με τα τυπικά), οφείλεται και στη σημαντική διαμόρφωση της σεροτονινεργικής 12

18 νευροδιαβίβασης, που επιτυγχάνεται με την αναστολή των 5-HT2A υποδοχέων της σεροτονίνης (30). Πίνακας 1: Τυπικά και Άτυπα αντιψυχωτικά φάρμακα. ΤΥΠΙΚΑ ΑΤΥΠΑ Χλωροπρομαζίνη Αλοπεριδόλη Θειοριδαζίνη Ζουκλοπενθιξόλη Φλουφαιναζίνη Φλουπεντιξόλη Κλοπεντιξόλη Κλοζαπίνη Ρισπεριδόνη Ολανζαπίνη Αριπιπραζόλη Κουετιαπίνη Αμιλσουλπρίδη Ζοτεπίνη Ζιπρασιδόνη Οι ανεπιθύμητες ενέργειες των αντιψυχωτικών φαρμάκων κυμαίνονται από σχετικά δευτερεύοντα θέματα ανεκτικότητας (π.χ. ήπια καταστολή ή ξηροστομία) έως και απειλητικές για την ζωή καταστάσεις (ακοκκιοκυτταραιμία προκαλούμενη από την κλοζαπίνη) (31). Συχνές παρενέργειες περιλαμβάνουν: Εξωπυραμιδικά συμπτώματα (δυστονία, ακαθισία, ακινησία, παρκινσονισμός, όψιμη δυσκινησία, όψιμη δυστονία) Υπερ-προλακτιναιμία μεταβολικές παρενέργειες (αύξηση βάρους, υπερλιπιδαιμία, ο σακχαρώδης διαβήτης Αντιχολινεργικά συμπτώματα (ξηροστομία, δυσκοιλιότητα, ναυτία, ορθοστατική υπόταση, κοιλιακό άλγος, ταχυκαρδία, προβλήματα όρασης κ.α.) Αν και το κάθε φάρμακο έχει το δικό του προφίλ όσον αφορά τις ανεπιθύμητες ενέργεις, τα τυπικά αντιψυχωτικά είναι συνήθως συνδεδεμένα με την εμφάνιση εξωπυραμιδικών συμπτωμάτων (31). Από την άλλη, τα άτυπα αντιψυχωτικά τείνουν να έχουν μεταβολικές παρενέργειες, όπως αύξηση βάρους, υπερλιπιδαιμία και σακχαρώδης διαβήτης (32). Στον 13

19 παρακάτω πίνακα γίνεται σύγκριση του κινδύνου εμφάνισης των δύο κυριότερων παρενεργειών, των εξωπυραμιδικών συμπτωμάτων και της αύξησης βάρους, με φάρμακα των 2 κατηγοριών (33). Πίνακας 2: Κίνδυνος εμφάνισης εξωπυραμιδικών συμπτωμάτων και αύξησης βάρους με την χρήση "τυπικών" και "άτυπων" αντιψυχωσικών φαρμάκων. Φάρμακο Αύξηση Βάρους Εξωπυραμιδικά Συμπτώματα Τυπικά Αντιψυχωτικά Χλωροπρομαζίνη Φλουφαιναζίνη Αλοπεριδόλη Θειοριδαζίνη Άτυπα Αντιψυχωτικά Αριπιπραζόλη + + Κλοζαπίνη Ολανζαπίνη Κουετιαπίνη ++ + Ρισπεριδόνη Ζιπρασιδόνη + ++ ± = αμελητέος κίνδυνος, + χαμηλός κίνδυνος, ++ = μέτριος κίνδυνος, +++ = μέτριος προς υψηλός κίνδυνος ; ++++ = υψηλός κίνδυνος Αντικαταθλιπτικά φάρμακα Τα αντικαταθλιπτικά είναι φάρμακα που βοηθούν στην ανακούφιση των συμπτωμάτων της κατάθλιψης, του άγχους, της δυσθυμίας, καθώς άλλων καταστάσεων όπως της ιδεοψυχαναγκαστικής διαταραχής (34). Τα αντικαταθλιπτικά στοχεύουν στην διόρθωση της ανισορροπίας των νευροδιαβιβαστών στον εγκέφαλο. Αυτή η χημική ανισορροπία θεωρείται υπεύθυνη για τις αλλαγές της διάθεσης και της συμπεριφοράς. Νευροδιαβιβαστές είναι χημικές ενώσεις, οι οποίες χρησιμεύουν στη μεταβίβαση πληροφοριών από ένα νευρώνα στον επόμενο. Οι 14

20 νευροδιαβιβαστές όπως η σεροτονίνη, η ντοπαμίνη και η νοραδρεναλίνη ή η νορεπινεφρίνη βρίσκονται σε κυστίδια στα τερματικά του άξονα του νευρώνα που τους εκλύει. Μετά την δράση τους στους υποδοχείς του μετασυναπτικού νευρώνα, απομακρύνονται από την σύναψη μέσω της διαδικασίας επαναπρόσληψής του από υποδοχείς. Τα αντικαταθλιπτικά αναστέλλουν επαναπρόσληψη νευροδιαβιβαστών μέσω εκλεκτικών υποδοχέων αυξάνοντας τα επίπεδά τους στην σύναψη, κάτι που βελτιώνει τα συμπτώματα της κατάθλιψης (35). Στην παρακάτω εικόνα φαίνονται οι βασικοί στόχοι των κύριων κατηγοριών των αντικαταθλιπτικών φαρμάκων (36). Εικόνα 1. Γενική αναπαράσταση μιας μονοαμινεργικής νευροδιαβίβασης. Οι μωβ κουκκίδες αντιπροσωπεύουν τους νευροδιαβιβαστές. Τα πράσινα βέλη δείχνουν τους κύριους νευρωνικούς στόχους των νευροδιαβιβαστών, οι οποίοι μπορεί να είναι μετασυναπτικοί ιονοτροπικοί και μεταβοτροπικοί υποδοχείς, καθώς μπορούν επίσης να δρουν στους προσυναπτικούς μεταβοτροπικούς υποδοχείς. Τα κόκκινα βέλη δείχνουν τον μηχανισμό επαναπρόσληψής τους, που τους οδηγεί να αποικοδομηθούν από τη μονοαμινοξειδάση (ΜΑΟ). Τα μπλε βέλη δείχνουν τους κύριους στόχους των κλασικών αντικαταθλιπτικών. Τα μπλε κουτιά δείχνουν τα κύρια φάρμακα και κατηγορίες αντικαταθλιπτικών που σχετίζονται με κάθε στόχο (Η εικόνα δημιουργήθηκε με την βοήθεια του προγράμματος BioRender). 15

21 Η επιλογή του κατάλληλου αντικαταθλιπτικού όσον αφορά την αποτελεσματικότητα βασίζεται στις απαιτήσεις του κάθε ασθενούς, συμπεριλαμβανομένης της παρουσίας άλλων υπαρχόντων ασθενειών και φαρμακευτικής αγωγής, του κινδύνου αυτοκτονίας και της προηγούμενης ανταπόκρισης στην αντικαταθλιπτική θεραπεία (37). Τα αντικαταθλιπτικά φάρμακα μπορούν να κατηγοριοποιηθούν βάσει του μηχανισμού δράσης του σε: τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά, αναστολείς επαναπρόσληψης σεροτονίνης, αναστολείς επαναπρόσληψης σεροτονίνης και νορεπινεφρίνης, αναστολείς ΜΑΟ, καθώς και άτυπα αντικαταθλιπτικά φάρμακα. Τρικυκλικά ή TCAs Τα TCA αναστέλλουν μη επιλεκτικά την επαναπρόσληψη σεροτονίνης, νορεπινεφρίνης και ντοπαμίνης σε προσυναπτικά κυστίδια αποθήκευσης στον εγκέφαλο. Αν και είναι αποτελεσματικοί στη θεραπεία της κατάθλιψης, οι επιπτώσεις τους σε άλλα συστήματα υποδοχέων, συμπεριλαμβανομένων των ισταμινικών, χολινεργικών, αδρενεργικών υποδοχέων που δεν σχετίζονται με την κατάθλιψη, οδήγησαν στην ανάπτυξη σημαντικών ανεπιθύμητων ενεργειών που περιόρισαν τη χρήση τους στην κλινική πρακτική (38). Μερικές συχνές παρενέγειες των τρικυκλικών αντικαταθλιπτικών περιλαμβάνουν: ξηροστομία, δυσκοιλιότητα, επίσχεση ούρων, θόλωση όρασης, σεξουαλική δυσλειτουργία, ορθοστατική υπόταση, αρρυθμία ή ακανόνιστο καρδιακό ρυθμό, καταστολή (39). Φάρμακα αυτής της κατηγορίας είναι τα εξής: Ιμιπραμίνη Δεσιπραμίνη Αμιτριπτυλίνη Νορτριπτυλίνη Κλομιπραμίνη Δοξεπίνη Αμοξαπίνη Προτριπτυλίνη 16

22 Τριμιπραμίνη Επιλεκτικοί αναστολείς επαναπρόσληψης σεροτονίνης ή SSRIs Είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη κατηγορία αντικαταθλιπτικών. Λειτουργούν αυξάνοντας τα επίπεδα της σεροτονίνης στον εγκέφαλο. Σε αντίθεση άλλα αντικαταθλιπτικά φάρμακα, τα SSRIs δεν επηρεάζουν σημαντικά τα επίπεδα νορεπινεφρίνης. Τα SSRIs έχουν επίσης λιγότερες και πιο ήπιες παρενέργειες, λιγότερες αλληλεπιδράσεις με φάρμακα και είναι πολύ λιγότερο πιθανό να σχετίζονται με αυτοκτονία σε σύγκριση με τα τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά (40). Οι συνήθεις ανεπιθύμητες ενέργειες των SSRIs περιλαμβάνουν κεφαλαλγία, ναυτία, ανορεξία, ξηροστομία, σεξουαλική δυσλειτουργία καθώς και παρενέργειες που μειώνονται με την πάροδο του χρόνου όπως αϋπνία, ανησυχία και διέγερση. Η απώλεια βάρους ή η αύξηση βάρους έχει συσχετιστεί με SSRI (41). Τα φάρμακα αυτής της κατηγορίας είναι τα εξής: Φλουοξετίνη Φλουβοξαμίνη Παροξετίνη Σερτραλίνη Σιταλοπράμη Εσιταλοπράμη Αναστολείς επαναπρόσληψης σεροτονίνης και νορεπινεφρίνης ή SNRIs Είναι η νεότερη κατηγορία αντικαταθλιπτικών. Τα SNRIs εμποδίζουν την επαναπρόσληψη της σεροτονίνης και της νορεπινεφρίνης, αυξάνοντας έτσι τα επίπεδα σεροτονίνης και νορεπινεφρίνης που είναι ενεργά στον εγκέφαλο (42). Σε χαμηλές συγκεντρώσεις, οι ανεπιθύμητες ενέργειες που σχετίζονται με τα SNRIs είναι παρόμοιες με αυτές που παρατηρούνται στα SSRIs λόγω της δράσης τους στους υποδοχείς 5-HT 17

23 και περιλαμβάνουν κεφαλαλγία, ναυτία, ανορεξία, ξηροστομία, σεξουαλική δυσλειτουργία (43). Στο υψηλότερες δόσεις, μπορούν να προκαλέσουν τις ίδιες ανεπιθύμητες ενέργειες με οποιονδήποτε άλλο αναστολέα επαναπρόσληψης νορεπινεφρίνης όπως διάρροια, ταχυκαρδία, τρόμο, άγχος, υπέρταση (43). Τα φάρμακα αυτής της κατηγορίας είναι τα εξής: Βενλαφαξίνη Δενβενλαφαξίνη Ντουλοξετίνη Μιλνασιπράνη Λεβομιλνασιπράνη Aναστολείς της μονοαμινοξειδάσης ή ΜΑΟΙs Οι MAOI αυξάνουν τα επίπεδα νορεπινεφρίνης, σεροτονίνης και ντοπαμίνης αναστέλλοντας ένα ένζυμο που ονομάζεται μονοαμινοξειδάση. Η μονοαμινοξειδάση διασπά τη νορεπινεφρίνη, τη σεροτονίνη και τη ντοπαμίνη. Έτσι με την αναστολή του ενζύμου οι τρεις αυτοί νευροδιαβιβαστές δεν διασπώνται, και με αυτόν τον τρόπο αυξάνεται η συγκέντρωση και η δράση τους στον εγκέφαλο. Υπόταση, υπερβολική κεντρική διέγερση (τρόμος, αϋπνία, σπασμοί), αύξηση όρεξης, ξηροστομία, θόλωση όρασης, επίσχεση ούρων. Οι ΜΑΟΙ επίσης είναι υπεύθυνοι για επικίνδυνες και δυνητικά θανατηφόρες αλληλεπιδράσεις με τα τρόφιμα, ιδιαίτερα τρόφιμα πλούσια σε τυραμίνη (υπερτασική κρίση) και με άλλα φάρμακα όπως οι SSRIs (σύνδρομο σεροτονίνης) (44). Τα φάρμακα που ανήκουν σε αυτή την κατηγορία είναι τα εξής: Φαινελζίνη Τρανυλκυπρομίνη Ισοκαρβοξαζίδη 18

24 Άτυπα αντικαταθλιπτικά Κάθε φάρμακο αυτής της κατηγορίας έχει έναν μοναδικό μοριακό μηχανισμό δράσης ή μια χημική δομή που τα αποκλείει από την παραπάνω ταξινόμηση. Ωστόσο, όπως και άλλα αντικαταθλιπτικά, τα άτυπα αντικαταθλιπτικά επηρεάζουν τα επίπεδα ή τις επιδράσεις ενός ή περισσότερων από τους νευροδιαβιβαστές ντοπαμίνη, σεροτονίνη και νορεπινεφρίνης στον εγκέφαλο(38). Στα άτυπα αντικαταθλιπτικά συγκαταλέγονται τα εξής φάρμακα: Μιρταζαπίνη Βουπροπιόνη Τραζοδόνη Βορτιοξετίνη βιλαζοδόνη Τα προφίλ παρενεργειών είναι τόσο μοναδικά όσο οι μηχανισμοί δράσης τους. Μερικές συχνές ανεπιθύμητες ενέργειες περιλαμβάνουν ξηροστομία, δυσκοιλιότητα, ζάλη και ελαφριά κεφαλαλγία (44). Η μιρταζαπίνη και η τραζοδόνη προκαλούν υπνηλία και συνήθως λαμβάνονται κατά τον ύπνο. Σταθεροποιητές της διάθεσης Οι σταθεροποιητές διάθεσης χρησιμοποιούνται στη διαχείριση ασθενών με διπολική διαταραχή και σχιζοσυναισθηματική διαταραχή για την μείωση της συχνότητας των επεισοδίων μανίας, υπομανίας και κατάθλιψης (45). Μερικές φορές μπορούν να χρησιμοποιηθούν και σε σοβαρές περιπτώσεις κατάθλιψης (46). Οι βασικοί εκπρόσωποι αυτής της κατηγορίας είναι τα εξής: Λίθιο Βαλπροϊκό οξύ Καρβαμαζεπίνη Λαμοτριγίνη 19

25 Το λίθιο και το βαλπροϊκό μοιράζονται πολλούς κοινούς στόχους. Και τα δύο έχουν ευρεία επίδραση στις οδούς μεταγωγής σήματος εντός του κυττάρου. Συγκεκριμένα η σταθεροποίηση της διάθεσης σχετίζεται με την ιδιότητα των 2 παραπάνω φαρμάκων να αλληλεπιδρούν με την κινάση 3 συνθάσης γλυκογόνου (GSK3) και να μειώνουν την πρωτεϊνική κινάση C. Επιπλέον το βαλπροϊκό αυξάνει την συγκέντρωση του γ αμινοβουτυρικού οξέος (GABA) ενώ μπορεί να μειώσει και την ινοσιτόλη (45). Αμφότερα ρυθμίζουν την έκφραση ενός αριθμού σημαντικών γονιδίων στόχων όπως τα BCL-2 και GRP78, τα οποία είναι σημαντικά στην πρόληψη του κυτταρικού θανάτου και της τοξικότητας. Ακόμα, τόσο το λίθιο όσο και το βαλπροϊκό έχουν ισχυρά νευροπροστατευτικά αποτελέσματα (47). Η καρβαμαζεπίνη μπλοκάρει τα κανάλια νατρίου, μειώνει την απελευθέρωση του γλουταμινικού και μειώνει τον ρυθμό αποδέσμευσης της νοραδρεναλίνης και της ντοπαμίνης. Τέλος, η δράση της λαμοτριγίνης ως σταθεροποιητής διάθεσης σχετίζεται με την αναστολή των διαύλων νατρίου και ασβεστίου στους προσυναπτικούς νευρώνες (45). Πίνακας 3: Παρενέργειες σταθεροποιητών διάθεσης (45). Ρυθμιστής διάθεσης Παρενέργειες Λίθιο Βαλπροϊκό οξύ Καρβαμαζεπίνη Λαμοτριγίνη ναυτία, έμετος, τρόμος, νεφρική δυσλειτουργία, αύξηση σωματικού βάρους υπνηλία, ναυτία, διάρροια, αύξηση σωματικού βάρους, παροδική απώλεια μαλλιών ξηροστομία, ναυτία, κεφαλαλγία, υπνηλία, ζάλη, διπλωπία, αιματολογικές διαταραχές ναυτία, διάρροια, ξηροστομία, κεφαλαλγία, υπνηλία, εξάνθημα 20

26 1.3 Εξατομικευμένη Θεραπεία Είναι γνωστό ότι η ανταπόκριση σε ένα φάρμακο διαφέρει από ασθενή σε ασθενή. Μια αποτελεσματική δόση για κάποιον μπορεί να μην έχει επίδραση σε κάποιον άλλο ή ακόμα να είναι υπεύθυνη για την εκδήλωση ανεπιθύμητων ενεργειών (48). Οι ανεπιθύμητες ενέργειες από φάρμακα αποτελούν μία πολύ συχνή αιτία νοσηλείας καθώς επίσης ευθύνονται για μεγάλο ποσοστό θνησιμότητας ακόμα και όταν η φαρμακευτική περίθαλψη πραγματοποιείται μέσα στο νοσοκομείο. Έρευνες στις ΗΠΑ, κατατάσσουν τις ανεπιθύμητες ενέργειες μεταξύ 4ης και 6ης πιο συχνής αιτίας θανάτου (49,50), ενώ ευθύνονται για το 6.5% των εισαγωγών σε 2 μεγάλα νοσοκομεία του Ηνωμένου Βασιλείου (51). Επιπλέον φαίνεται ότι επιβαρύνουν σε μεγάλο βαθμό τα συστήματα υγείας αφού το συνολικό τους κόστος ανέρχεται σε 4 δισεκατομμύρια δολάρια (49) και 1 δισεκατομμύριο λίρες (51) ετησίως σε Αμερική και Ηνωμένο Βασίλειο αντίστοιχα. Ομοίως, η έλλειψη αποτελεσματικότητας των φαρμάκων θα μπορούσε να συσχετιστεί με πολλές αρνητικές συνέπειες, παρόλο που είναι πιο δύσκολο να εξαχθούν δεδομένα που να αποδεικνύουν το τελευταίο. Για παράδειγμα ένα αναποτελεσματικό αντικαταθλιπτικό φάρμακο μπορεί να θεωρηθεί ότι αυξάνει τον κίνδυνο αυτοκτονίας (52). Παρόλο που τα παραπάνω δεδομένα προκύπτουν από έρευνες που δεν αφορούν το σύνολο των χωρών παγκοσμίως, είναι πιθανό ότι αντιπροσωπεύουν το πρόβλημα σε μια πιο ευρεία κλίμακα. Παράγοντες όπως η αλληλεπίδραση φαρμάκων, η συμμόρφωση του ασθενούς, παθοφυσιολογικές καταστάσεις, ιδιαιτερότητες της νόσου, περιβαλλοντικοί παράγοντες συνεισφέρουν στην έκβαση του κλινικού αποτελέσματος. Μια συστηματική επανεξέταση των εισαγωγών νοσοκομείων που σχετίζονται με ανεπιθύμητες ενέργειες σε ενήλικες έχει δείξει ότι το 70% περίπου αυτών, μπορούν να αποφευχθούν μέσω βελτιωμένων πρακτικών συνταγογράφησης (53). Εκτός από τους παραπάνω, γενετικής αιτιολογίας παράγοντες φαίνονται να έχουν σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση παρενεργειών σύμφωνα με ορισμένους ερευνητές (54). Η συνεισφορά των γενετικών παραγόντων στην διαφορετική ανταπόκριση ασθενών σε ένα φάρμακο είναι δύσκολο να προσδιοριστεί. Ωστόσο, μελέτες διδύμων έχουν χρησιμοποιηθεί για να εκτιμηθεί η σχετική συμβολή γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων. Τέτοιες 21

27 μελέτες λοιπόν δείχνουν ότι για τις διαφορές στον μεταβολισμό κάποιων φαρμάκων κυρίαρχο ρόλο παίζουν γενετικοί παράγοντες (55 58). Η εξατομικευμένη θεραπεία στοχεύει σε διαγνωστικές, θεραπευτικές και προληπτικές στρατηγικές που λαμβάνουν υπόψη αυτά τα χαρακτηριστικά. Χάρη στην εξέλιξη της τεχνολογίας, της μοριακής βιολογίας και της γενετικής, είναι πλέον εφικτή η χρήση γονιδιωματικών δεδομένων για τη συσχέτισή τους με την ανταπόκριση ενός ατόμου σε ένα φάρμακο, εξασφαλίζοντας το βέλτιστο θεραπευτικό αποτέλεσμα. Αυτή ακριβώς η γενετική αιτιολογία της διαφορικής ανταπόκρισης ενός ασθενούς σε μια συγκεκριμένη θεραπευτική αγωγή, επιτυγχάνεται με την φαρμακογονιδιωματική που έχει ως απώτερο σκοπό την επίτευξη εξατομικευμένης θεραπείας. Έτσι εξασφαλίζεται η μεγιστοποίηση των θεραπευτικών οφελών καθώς και ο περιορισμός των ανεπιθύμητων ενεργειών (59). Η ιδέα ότι η απάντηση του οργανισμού στα φάρμακα σχετίζεται με γενετικούς παράγοντες συζητήθηκε το 1957 (60). Οι ερευνητές, στην προσπάθειά τους να συσχετίσουν τον φαινότυπο ενός κληρονομούμενου γενετικού στοιχείου με αυτή την απάντηση, εισήγαγαν τον όρο φαρμακογενετική το 1959 (61). Ο ευρύτερος όρος φαρμακογονιδιωματική χρησιμοποιήθηκε αργότερα και αναφέρεται σε όλα τα πιθανά γονίδια που καθορίζουν την ανταπόκριση του οργανισμού στα φάρμακα (62). Τόσο φαρμακοκινητικοί όσο και φαρμακοδυναμικοί μηχανισμοί που μπορούν να περιγράψουν την μεταβλητότητα στην ανταπόκριση του οργανισμού σε ένα φάρμακο. Η φαρμακοδυναμική ασχολείται με την μηχανισμό δράσης του φαρμάκου και τον τρόπο που αλληλεπιδρά με τον στόχο. Τέτοιοι στόχοι φαρμάκων είναι ιοντικοί δίαυλοι, υποδοχείς, ένζυμα, νουκλεϊκά οξέα. Πολυμορφισμοί μπορούν για παράδειγμα να οδηγήσουν σε μειωμένη ικανότητα σύνδεσης με τον στόχο μεταβάλλοντας την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου. Ο προσδιορισμός των φαρμακοδυναμικών παραγόντων που δημιουργούν την διαφορετική ανταπόκριση είναι αρκετά δύσκολος για αρκετούς λόγους: α) Ο τρόπος δράσης μιας ουσίας δεν είναι πάντα γνωστός, β) Πολλά φάρμακα έχουν περισσότερους από έναν στόχους, γ) Η αλληλεπίδραση φαρμάκου-στόχου ενεργοποιεί πολλαπλά γονίδια και σηματοδοτικά μονοπάτια, δ) Τα αποτελέσματα της αλληλεπίδρασης δεν είναι εύκολο να μελετηθούν (63). 22

28 Εικόνα 2. Φαρμακοκινητικοί και φαρμακοδυναμικοί παράγοντες. Αλλαγές στο DNA μπορούν να επηρεάσουν λειτουργείες όπως η απορρόφηση, η κατανομή, ο μεταβολισμός και η απέκκριση του φαρμάκου με αποτέλεσμα διαφορές στις συγκεντρώσεις του φαρμάκου ή των μεταβολιτών του στο πλάσμα και άρα μεταβλητότητα της φαρμακολογικής απάντησης. Η φαρμακογονιδιωματική λαμβάνει υπόψη αυτές της αλλαγές στην φαρμακοκινητική μιας ουσίας μελετώντας γονίδια του μεταβολισμού ή γονίδια που είναι υπεύθυνα για την μεταφορά της και προσαρμόζει την δόση ειδικά για κάθε ασθενή. Τα ένζυμα του κυτοχρώματος P450 έχουν μελετηθεί εκτενώς όσον αφορά την επίδρασή τους στην μεταβλητότητα της φαρμακοκινητικής τους, καθώς είναι υπεύθυνα για τον μεταβολισμό περίπου του 80% του συνόλου των φαρμάκων (64). Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται μερικά παραδείγματα φαρμάκων που ο μεταβολισμός τους εξαρτάται από τα ένζυμα αυτής της ομάδας (65). 23

29 Πίνακας 4. Υποστρώματα των ενζύμων του P450. Ένζυμο CYP1A2 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4 Υποστρώματα Καφεΐνη, κλομιπραμίνη, θεοφυλλίνη Δικλοφαινακη, ιβουπροφαίνη, πιροξικάμη, λοσαρτάνη, ιρβεσαρτάνη, σελεκοξίμπη, τολβουταμίδη, ταμοξιφαίνη, βαρφαρίνη Ομεπραζόλη, λανσοπραζόλη, παντοπραζόλη, νελφιναβίρη, διαζεπάμη Αμιτριπτυλίνη, δεσιπραμίνη, ιμιπραμίνη, παροξετίνη, αλοπεριδόλη, θειοριδαζίνη, μεξιλετίνη, προπαφαινόνη, προπρανολόλη, μετοπρολόλη, τιμολόλη, κωδεΐνη, δεξτρομεθορφάνη, υδροκωδόνη, ταμοξιφαίνη Διλτιαζέμη, φελοδιπίνη, νιμοδιπίνη, νιφεδιπίνη, νισολιδιπίνη, νιτρενδιπίνη, βεραπαμίλη, κυκλοσπορίνη Α, τακρόλιμος, βουδεσονίδη, κορτιζόλη, 17 β-οιστραδιόλη, προγεστερόνη, τεστοστερόνη, κλαριθρομυκίνη, ερυθρομυκίνη, κυκλοφωσφαμίδη, ταμοξιφαίνη, βινκριστίνη, βινβλαστίνη, ιφωσφαμίδη, αλπραζολάμη, μιδαζολάμη, τριαζολάμη, αλφαιντανύλη, φαιντανύλη, σουφεντανίλη, λοβαστατίνη, σιμβαστατίνη, ατορβαστατίνη, ινδιναβίρη, νελφιναβίρη, ριτοναβίρη, σακουιναβίρη, αμπρεναβίρη, αταζαναβίρη, κινιδίνη, σιλδεναφίλη Πλέον, υπάρχουν πολλές μελέτες και παραδείγματα που συσχετίζουν γενετικούς πολυμορφισμούς με την αποτελεσματικότητα και την τοξικότητα ορισμένων φαρμάκων. Αυτή η προσπάθεια έχει οδηγήσει στον χαρακτηρισμό γενετικών βιοδεικτών σε ένα σύνολο γονιδίων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατά την συνταγογράφηση (Πίνακας 5) (66,67). Ρυθμιστικές αρχές όπως ο Αμερικανικός οργανισμός τροφίμων και φαρμάκων (Food and Drug Administration - FDA) και ο Ευρωπαϊκός Οργανισμός Φαρμάκων (European Medicines Agency - EMA) παρέχουν φαρμακογονιδιωματικές πληροφορίες στα φύλλα οδηγιών ορισμένων φαρμάκων (Πίνακας 6) (68,69). Τα φύλλα οδηγιών τέτοιων φαρμάκων περιλαμβάνουν υποχρεωτικές οδηγίες, συστάσεις και πληροφορίες σχετικά με τον τρόπο με τον οποίο η γονιδιακή παραλλαγή πρέπει να λαμβάνεται υπόψη σχετικά με την ένδειξη ή τη δοσολογία - δεδομένα που αναμένεται να είναι ευεργετικά για την εξατομίκευση της φαρμακευτικής θεραπείας (70). 24

30 Πίνακας 5. Γονίδια που σχετίζονται με την ανταπόκριση των ασθενών σε συγκεκριμένα φάρμακα. Γονίδιο Φάρμακα TPMT CYP2D6 CYP2C19 VKORC1 CYP2C9 HLA-B CFTR DPYD G6PD UGT1A1 SLCO1B1 IFNL3 (IL28B) CYP3A5 Μερκαπτοπουρίνη, θειογουανίνη, αζαθειοπρίνη Κωδεΐνη, τραμαδόλη, τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά Τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά, κλοπιδογρέλη, βορικοναζόλη Βαρφαρίνη Βαρφαρίνη, φαινυτοΐνη Αλλοπουρινόλη, καρβαμαζεπίνη, αβακαβίρη, φαινυτοΐνη Ιβακαφτόρη φθοριοουρακίλη, καπεσιταβίνη, τεγκαφούρη Ρασμπουρικάση Ιρινοτεκάνη, αταζαναβίρη Σιμβαστατίνη Ιντερφερόνη Τακρόλιμους Πίνακας 6. Παραδείγματα φαρμακογονιδιωματικών πληροφοριών που περιλαμβάνονται στα φύλλα οδηγιών φαρμάκων από τον FDA και τον EMA. Φάρμακο Βιοδείκτες Αποτέλεσμα Οδηγία Αβακαβίρη HLA-Β*57:01 Αντιδράσεις υπερευαισθησίας Καρβαμαζεπίνη HLA-B*15:02, Σοβαρές HLA-A*31:01 δερματικές ανεπιθύμητες ενέργειες Συνιστάται δοκιμή ανίχνευσης του πολυμορφισμού HLA-B 57:01 πριν από την έναρξη της θεραπείας και την αποφυγή χρήσης σε φορείς HLA-B*57:01 Συνιστάται δοκιμή ανίχνευσης του πολυμορφισμού HLA-B*15:02 πριν από την έναρξη της θεραπείας σε ασθενείς με ασιατική καταγωγή και προειδοποιεί τους συνταγογράφους για αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης αντιδράσεων υπερευαισθησίας παρουσία HLA-A *31: 01 25

31 Σιταλοπράμη CYP2C19 παράταση του QT διαστήματος Κλοπιδογρέλη CYP2C19 μειωμένη απόκριση στην αντιαιμοπεταλιακή αγωγή Κωδεΐνη CYP2D6 υποαερισμός, θάνατος Πιμοζίδη CYP2D6 παράταση του QT διαστήματος, αιφνίδιος καρδιακός θάνατος Ροσουβαστατίνη SLCO1B1 Πληροφορίες φαρμακοκινητικής Βαλπροϊκό οξύ POLG Θανατηφόρα ηπατική ανεπάρκεια Συνιστάται η μέγιστη δόση που πρέπει να χρησιμοποιείται σε CYP2C19 πτωχούς μεταβολιστές με βάση το αποτέλεσμα παράτασης του QT διαστήματος Προειδοποήση για τον κίνδυνο μειωμένης απόκρισης σε CYP2C19 πτωχούς μεταβολιστές Αντενδείκνυται σε παιδιά ηλικίας <12 ετών και σε παιδιά <18 ετών μετά από αμυγδαλεκτομή ή/και αδενοειδεκτομή με βάση τον κίνδυνο υποαερισμός και θανάτου σε CYP2D6 υπερμεταβολιστές Συνιστάται δοκιμή σε συγκεκριμένο όριο δόσης που δεν πρέπει να ξεπεραστεί σε CYP2D6 πτωχούς μεταβολιστές και μεγαλύτερο διάστημα τιτλοδότησης δόσης σε CYP2D6 πτωχούς μεταβολιστές Παρέχει πληροφορίες φαρμακοκινητικής στην ενότητα «Κλινική Φαρμακολογία». Δεν συνιστώνται εναλλακτικές στρατηγικές θεραπείας βάσει του γονότυπου SLCO1B1 Αντενδείκνυται σε παιδιά με μιτοχονδριακές διαταραχές που προκύπτουν από μεταλλάξεις του γονιδίου POLG εξαιτίας του κινδύνου θανατηφόρας ηπατικής ανεπάρκειας CYP = cytochrome P450; G6PD = glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency; POLG = deoxyribonucleic acid polymerase Παρόλα αυτά, υπάρχουν και αρκετές αναφορές για την γενετική αιτιολόγηση της απόκρισης του οργανισμού στο φάρμακο, που δεν συνοδεύονται με οδηγίες έτσι ώστε να αξιοποιηθούν στην κλινική πράξη. Η έλλειψη ξεκάθαρων κατευθυντήριων οδηγιών καθιστά 26

32 δύσκολο στον κλινικό ιατρό να αξιολογήσει την φαρμακογονιδιωματική πληροφορία (71). Διάφοροι οργανισμοί υποστήριξης κλινικής εφαρμογής της φαρμακογονιδιωματικής όπως ο CPIC (Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium) (72) και ο DPWG (Dutch Pharmacogenetics Working Group) (73), εστιάζουν στον τρόπο με τον οποίο τα αποτελέσματα γενετικών δοκιμών μπορούν να μεταφραστούν σε οδηγίες για την εξατομίκευση της θεραπείας. Μετά από αρκετά χρόνια έρευνας, είναι λοιπόν εμφανές ότι γενετικές διαφορές μεταξύ ατόμων μπορούν να εξηγήσουν διαφορές στην αποτελεσματικότητα και στην τοξικότητα ορισμένων φαρμάκων και μπορούν να δώσουν κατευθυντήριες οδηγίες για την εξατομίκευση της θεραπείας για τους ασθενείς. Κατά την εφαρμογή φαρμακογονιδιωματικών δοκιμών στην κλινική, πρέπει να εξεταστεί η σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας των εξετάσεων. Οι ταχείς ρυθμοί εξέλιξης στη γενετική επιτρέπουν χαμηλότερο κόστος γονοτύπησης, δίνοντας την ευκαιρία σε τέτοιου είδους δοκιμές να αποτελέσουν μέρος της συνήθους υγειονομικής περίθαλψης. Το 2001 το κόστος για την αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος ενός ατόμου ήταν πάνω από 95 εκατομμύρια δολάρια(usd) (74). Το κόστος αυτό μέχρι σήμερα μειώθηκε δραματικά ενώ υπάρχουν εταιρίες (κατασκευής επιστημονικών οργάνων γονοτύπησης) που υποστηρίζουν ότι το κόστος μπορεί να πέσει μέχρι και τα 100 δολάρια τα επόμενα χρόνια (74,75). Πολλές μελέτες οικονομικής αξιολόγησης έχουν δείξει ότι φαρμακογονιδιωματικοί έλεγχοι μπορούν να έχουν θετικό αντίκτυπο τόσο στην ποιότητα της υγειονομικής περίθαλψης όσο και στο κόστος (76). Αυτό γιατί η εξατομίκευση της θεραπείας συνεπάγεται σε λιγότερες ανεπιθύμητες ενέργειες, περιορισμό της χρήσης υγειονομικής περίθαλψης όπως π.χ. επισκέψεις σε νοσοκομεία, με αποτέλεσμα την μείωση του κόστους φαρμακευτικής αγωγής και την εξοικονόμηση πόρων του συστήματος υγείας (77). Παρόλα αυτά ακόμα και με χαμηλού κόστους τεχνολογίες η εφαρμογή της φαρμακογονιδιωματικής στην κλινική έχει αρκετά εμπόδια να ξεπεράσει (78). 27

33 1.4 Φαρμακογονιδιωματική και ψυχιατρικά νοσήματα Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία ψυχιατρικών διαταραχών, ακόμη και όταν λαμβάνονται σύμφωνα με τις οδηγίες, δεν παρέχουν επαρκή ανακούφιση για ένα σημαντικό ποσοστό ασθενών. Η τρέχουσα επιλογή ενός κατάλληλου αντιψυχωτικού ή αντικαταθλιπτικού φαρμάκου εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την κλινική εμπειρία των ψυχιάτρων, καθώς και από τη μέθοδο δοκιμής και σφάλματος (trial-and-error approach), με πιθανές σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες όπως τον αυτοκτονικό ιδεασμό (79). Επιπλέον, ενώ τα αντικαταθλιπτικά και τα αντιψυχωτικά φαίνεται να έχουν επίδραση στον ασθενή σε σύγκριση με το εικονικό φάρμακο (80,81), η αποτελεσματικότητά τους δεν είναι εντυπωσιακή (82). Η αποτελεσματικότητα των φαρμάκων που δρουν στο ΚΝΣ έχει συσχετιστεί με γονίδια που κωδικοποιούν βιομόρια που εμπλέκονται στην φαρμακοκινητική. Συγκεκριμένα, πολυμορφισμοί σε γονίδια των μεταβολικών ενζύμων CYP2C19 και CYP2D6 συνδέονται συχνά με την ανταπόκριση σε τέτοιου είδους φάρμακα (83,84). Αντίθετα, τα δεδομένα που υπάρχουν όσον αφορά φαρμακοδυναμικούς παράγοντες δεν είναι επαρκή για μία αντίστοιχη συσχέτιση μεταξύ γονιδίων που κωδικοποιούν στόχους ψυχιατρικών φαρμάκων (π.χ. υποδοχείς φαρμάκων) και φαρμακολογικής απάντησης, αν και σε ορισμένες κλινικές καταστάσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην πρόβλεψη παρενεργειών (85). Στον παρακάτω πίνακα φαίνονται οι κατευθυντήριες οδηγίες από CPIC και DPWG για την εξατομίκευση της θεραπείας σε άτομα που λαμβάνουν αντικαταθλιπτικά ή αντιψυχωτικά φάρμακα (86). Πίνακας 7: Συστάσεις που παρέχονται από CPIC και DPWG. Φάρμακο Γονίδιο Οδηγίες, πληροφορίες Αμιτριπτυλίνη CYP2D6, Αποφυγή λήψης φαρμάκου από πτωχούς CYP2C19 μεταβολιστές και υπερμεταβολιστές ή ρύθμιση της δόσης Αριπιπραζόλη CYP2D6 Μείωση της μέγιστης δόσης σε 10mg/d σε πτωχούς μεταβολιστές Ατομοξετίνη CYP2D6 Ανεπαρκή δεδομένα για προσαρμογή της δόσης Οι πτωχοί μεταβολιστές δεν χρειάζονται αύξηση δόσης 28

34 Μειωμένη αποτελεσματικότητα σε υπερμεταβολιστές, επιλογή εναλλακτικής θεραπείας Καρβαμαζεπίνη HLA-A, HLA-B Εάν ο ασθενής φέρει ένα από τα αλληλόμορφα κινδύνου (HLA-A * 31: 01 ή HLA-B * 15: 02), μην συνταγογραφείτε καρβαμαζεπίνη Σιταλοπράμη CYP2C19 Επιλογή εναλλακτικής θεραπείας σε υπερμεταβολιστές ή αύξηση δόσης εως και 150%. 50% μείωση της αρχικής δόσης σε πτωχούς μεταβολιστές Κλομιπραμίνη CYP2D6, Αποφυγή λήψης φαρμάκου από πτωχούς CYP2C19 μεταβολιστές και υπερμεταβολιστές ή ρύθμιση της δόσης Δεσιπραμίνη CYP2D6 Αποφυγή λήψης φαρμάκου από πτωχούς μεταβολιστές και υπερμεταβολιστές ή ρύθμιση της δόσης Δοξεπίνη CYP2D6, Αποφυγή λήψης φαρμάκου από πτωχούς CYP2C19 μεταβολιστές και υπερμεταβολιστές ή ρύθμιση της δόσης Εσκιταλοπράμη CYP2C19 επιλογή εναλλακτικής θεραπείας σε υπερμεταβολιστές ή αύξηση δόσης εως και 150% 50% μείωση της αρχικής δόσης σε πτωχούς μεταβολιστές Φλουβοξαμίνη CYP2D6 25%-50% μείωση της αρχικής δόσης σε πτωχούς μεταβολιστές Ιμιπραμίνη CYP2D6, Αποφυγή λήψης φαρμάκου από πτωχούς CYP2C19 μεταβολιστές και υπερμεταβολιστές ή ρύθμιση της δόσης 29

35 Νορτριπτυλίνη CYP2D6 Αποφυγή λήψης φαρμάκου από πτωχούς μεταβολιστές και υπερμεταβολιστές ή ρύθμιση της δόσης Οξκαρβαζεπίνη HLA-B Εάν ο ασθενής φέρει το αλληλόμορφο κινδύνου HLA-B * 15: 02, μην συνταγογραφείτε καρβαμαζεπίνη Παροξετίνη CYP2D6 επιλογή εναλλακτικής θεραπείας σε υπερμεταβολιστές επιλογή εναλλακτικής θεραπείας ή 50% μείωση της δόσης σε πτωχούς μεταβολιστές Ρισπεριδόνη CYP2D6 Επιλογή εναλλακτικής θεραπείας σε ενδιάμεσους πτωχούς και υπερταχείς μεταβολιστές Κίνδυνος για παρενέργειες Προσαρμογή δόσης για την επίτευξη κλινικού αποτελέσματος Σερτραλίνη CYP2C19 50% μείωση της αρχικής δόσης σε πτωχούς μεταβολιστές ή επιλογή εναλλακτικής θεραπείας Τριμιπραμίνη CYP2D6, Αποφυγή λήψης φαρμάκου από πτωχούς CYP2C19 μεταβολιστές και υπερμεταβολιστές ή ρύθμιση της δόσης Βενλαφαξίνη CYP2D6 Επιλογή εναλλακτικής θεραπείας σε ενδιάμεσους και πτωχούς μεταβολιστές ή προσαρμογή δόσης Αύξηση δόσης εως και 150% της κανονικής δόσης σε υπερμεταβολιστές ζουκλοπενθιξόλη CYP2D6 Μείωση δόσης κατά 25%-50% ή επιλογή εναλλακτικής θεραπείας σε ενδιάμεσους και πτωχούς μεταβολιστές,αντίστοιχα Μειωμένη συγκέντρωση του φαρμάκου στο πλάσμα σε υπερμεταβολιστές, επιλογή εναλλακτικής θεραπείας 30

36 Η εφαρμογή λοιπόν της φαρμακογονιδιωματικής μπορεί να γίνει ιδιαίτερα χρήσιμη στην ψυχιατρική, μειώνοντας το χρόνο που απαιτείται για τον προσδιορισμό του ιδανικού φαρμάκου και δόσης, ο οποίος με τις συνήθεις πρακτικές μπορεί να διαρκέσει αρκετές εβδομάδες έως μήνες (87). Εκτός από τα οφέλη που προσφέρει στον ασθενή, μελέτες υποστηρίζουν ότι η χρήση της φαρμακογονιδιωματικής στην κατάθλιψη θα μπορούσε δυνητικά να εξοικονομήσει 3962 $ ετησίως ανά ασθενή (88), πράγμα που δείχνει την χρησιμότητα και την ανάγκη εφαρμογής της σε πιο ευρεία κλίμακα. 1.5 CYP2D6 Το ένζυμο CYP2D6 είναι μέλος της ενζυμικής υπεροικογένειας του κυτοχρώματος P450. Οι πρωτεΐνες του κυτοχρώματος Ρ450 είναι μονοοξυγενάσες οι οποίες καταλύουν πολλές αντιδράσεις κατά τη φάση I του μεταβολισμού των φαρμάκων (αντιδράσεις υδροξυλίωσης και απομεθυλίωσης) και είναι υπεύθυνες για τη σύνθεση της χοληστερόλης, στεροειδών και κάποιων λιπιδίων. Κωδικοποιείται από το γονίδιο CYP2D6. Εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ αλλά και σε περιοχές του κεντρικού νευρικού συστήματος και εντοπίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Αν και αντιπροσωπεύει μόνο ένα μικρό ποσοστό όλων των ηπατικών ενζύμων του P450 (1-4%), ο ρόλος του στον μεταβολισμό των φαρμάκων είναι σημαντικά υψηλότερος και υπολογίζεται ότι μεταβολίζει το 25% των συχνότερα συνταγογραφούμενων φαρμάκων. Αντικαταθλιπτικά, αντιψυχωτικά, αντικαρκινικά, αναλγητικά και αντιβηχικά, β-αναστολείς, αντιαρρυθμικά, αντιεμετικά είναι μεταξύ άλλων φάρμακα των οποίων είναι υπεύθυνα για τον μεταβολισμό και την βιομετατροπή τους (64,89). 31

37 Πίνακας 8. Φάρμακα που μεταβολίζονται από το CYP2D6 (90). Αντικαταθλιπτικά Αντιψυχωτικά Β-αποκλειστές Αντιαρρυθμικά Οπιοειδή Άλλες κατηγορίες Αμιτριπτυλίνη Αλοπεριδόλη Αλπρενολόλη Φλεκαϊνίδη Κωδεΐνη Χλωροφαινιραμίνη Κλομιπραμίνη Περφαιναζίνη Καρβεδιλόλη Προπαφαινόνη Οξυκωδόνη Ονδασετρόνη Δεσιπραμίνη Ρισπεριδόνη Προπρανολόλη Μεξιλετίνη Υδροκωδόνη Φαινακετίνη Ιμιπραμίνη Θειοριδαζίνη Τιμολόλη Σπαρτεΐνη Δεξφενφλουραμινη Φλουοξετίνη Ζουκλοπενθιξόλη Μετοπρολόλη Κλονιδίνη Παροξετίνη Ατομοξετίνη Νεμπιβολόλη Ταμοξιφαίνη Φλουβοξαμίνη Αλπρενολόλη Δεξτρομεθορφάνη Τριμιπραμίνη Αριπιπραζόλη Βενλαφαξίνη Χλωροπρομαζίνη Νορτριπτυλίνη Δοξεπίνη Η περιοχή CYP2D στο ανθρώπινο γονιδίωμα, βρίσκεται στο χρωμόσωμα 22(22q13.1) και περιλαμβάνει 3 υψηλής ομολογίας γονίδια τα CYP2D8, CYP2D7, CYP2D6 τα οποία βρίσκονται σε μια περιοχή περίπου 45kb. Όπως και άλλα μέλη της οικογένειας γονιδίων του CYP2, τα γονίδια του CYP2D αποτελούνται από 9 εξώνια και 8 εσώνια. Το CYP2D8P είναι ένα ψευδογονίδιο με πολλαπλές διαγραφές και εισαγωγές και κανένα ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης. Το γονίδιο CYP2D7 μοιάζει περισσότερο με το CYP2D6 παρά με το CYP2D8P. Μία εισαγωγή (Τ138) στο πρώτο εξώνιο της κωδικής αλληλουχίας, προκαλεί μετατόπιση του πλαισίου ανάγνωσης και πρόωρο τερματισμό μετάφρασης (91). Εικόνα 3. Το γονίδιο του CYP2D6. 32

38 Η θέση του γονιδίου CYP2D6 είναι ιδιαίτερα πολυμορφική και μέχρι σήμερα έχουν χαρακτηριστεί περισσότερα από 100 αλληλόμορφα (92). Παρ όλα αυτά δεν συναντώνται όλα με την ίδια συχνότητα. Μερικά από τα περισσότερο εμφανιζόμενα είναι τα CYP2D6*2, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*17 and CYP2D6*41. Η διαφορά των αλληλομόρφων ως προς το άγριου τύπου γονίδιο αφορά συνήθως μία ή περισσότερες σημειακές μεταλλάξεις. Οι μεταλλάξεις μπορεί να μην έχουν επίδραση στην λειτουργικότητα του ενζύμου ή μπορούν να οδηγούν σε μείωσή της ή και απώλεια λειτουργείας (93). Ένας άλλος τύπος γενετικής αλλαγής αφορά παραλλαγές του αριθμού αντιγράφων (Copy Number Variation CNV), όπως η έλλειψη και ο διπλασιασμός ή η ύπαρξη περισσότερων γονιδίων. Τα CNV είναι στην πραγματικότητα αρκετά συνηθισμένα αφού περίπου το 12% του ανθρώπινου γονιδιώματος εμφανίζει κάποια παραλλαγή αριθμού των αντιγράφων (94), συμπεριλαμβανομένου και του γονιδίου του CYP2D6 (95). Κατά την έλλειψη του γονιδίου παρατηρείται απώλεια της λειτουργείας του ενζύμου. Από την άλλη τα πολλαπλά αντίγραφα μπορούν να περιλαμβάνουν αλληλόμορφα που είναι λειτουργικά (π.χ. * 1xN και * 2xN), μη λειτουργικά (π.χ. * 4xN) ή αλληλόμορφα που προσδίδουν μειωμένη λειτουργικότητα στο ένζυμο (π.χ. * 41xN), ο συνδυασμός των οποίων μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικούς φαινοτύπους. Για το CYP2D6, αυξημένη λειτουργικότητα παρατηρείται μόνο όταν υπάρχει διπλασιασμός ή περισσότερα λειτουργικά αντίγραφα του γονιδίου (96). Πίνακας 9. Συχνά εμφανιζόμενα αλληλόμορφα του CYP2D6 και το αποτέλεσμα στο ένζυμο. Αλληλόμορφο Μετάλλαξη Αποτέλεσμα Αναφορές CYP2D6 * 2xn Διπλασιασμός γονιδίου/ Αυξημένη ενεργότητα ενζύμου (97,98) πολλαπλά αντίγραφα γονιδίου CYP2D6 * 4 Μη φυσιολογικό μάτισμα, Μη ενεργή μορφή γονιδίου (99 101) P34S, L91M, H94R, S486T CYP2D6 * 5 Έλλειψη γονιδίου Έλλειψη ενζύμου (102,103) CYP2D6 * 10 P34S, S486T Ασταθές ένζυμο (104,105) 33

39 CYP2D6 * 17 T107I, R296C, S486T Τροποποιημένη συγγένεια για (106,107) υποστρώματα CYP2D6 * 41 R296C, Μη φυσιολογικό μάτισμα, S486T Μειωμένη ενζυμική δραστηριότητα ( ) Επίσης έχει προταθεί ότι μερικοί πολυμορφισμοί μπορούν να εμπλέκονται και ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου. Για παράδειγμα ο πολυμορφισμός CYP2D6*41 είναι μια παραλλαγή του CYP2D6*2 όπου η γουανίνη στη θέση 1584, έχει αντικατασταθεί από κυτοσίνη και εκφράζεται λιγότερο από το τελευταίο. Αυτό πιθανώς εξηγείται από το γεγονός ότι η κυτοσίνη σε αυτή τη θέση δημιουργεί διαφορετικές συνθήκες κατά το μάτισμα του mrna (112). Σε αντίθεση με άλλα ηπατικά μεταβολικά ένζυμα του κυτοχρώματος P450, δεν έχει εντοπιστεί κάποιος περιβαλλοντικός παράγοντας ή κάποια γνωστή ορμόνη που να ρυθμίζει την έκφραση του CYP2D6. Ωστόσο δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως η μεταβλητότητα ανάμεσα σε άτομα που φέρουν τον ίδιο γονότυπο. Πρόσφατα δεδομένα δείχνουν ότι η μεταγραφική ρύθμιση του CYP2D6 μπορεί να αποτελεί μέρος αυτής της μεταβλητότητας. Παρ όλα αυτά, η κατανόηση των παραγόντων που διέπουν τη μεταγραφική ρύθμισή του είναι περιορισμένη (113). Επίσης το γεγονός ότι δεν υπάρχει διαφορά στον φαινότυπο ανάμεσα σε άτομα που έχουν έλλειψη του ενζύμου και σε άτομα που φέρουν ως και 13 αντίγραφα του γονιδίου, υποδεικνύει πως το ένζυμο ίσως δεν έχει σημαντική δράση ενδογενώς (93). Αν και υπάρχουν ορισμένες αναφορές ότι το ένζυμο μπορεί να εμπλέκεται στον μεταβολισμό κάποιων νευροδιαβιβαστών (114,115), είναι περισσότερο πιθανό πως ο κύριος ρόλος του είναι ο μεταβολισμός ξενοβιοτικών ουσιών (π.χ. τροφή, φαρμακα, κ.λπ.). Τέλος, μελέτες που συσχετίζουν τον αριθμό των ενεργών γονιδίων με την διατροφή, αποδεικνύουν ότι η φυσική επιλογή ευνόησε άτομα με μεγαλύτερο αριθμό αντιγράφων του γονιδίων όταν η επιβίωση στηριζόταν στην λήψη φυτών ως κύρια πηγή τροφής (116). Είναι γνωστό ότι το ένζυμο CYP2D6 έχει πολύ υψηλή συγγένεια με τις τοξίνες των φυτών όπως τα αλκαλοειδή (117). Έτσι θα μπορούσε να εξηγηθεί και η μεγάλη μεταβολή της συχνότητας εμφάνισης των πολυμορφισμών όταν συγκρίνονται διαφορετικοί πληθυσμοί (Πίνακας 10) (93) 34

40 και επίσης ενισχύεται ακόμα περισσότερο η υπόθεση για τον ρόλο του ενζύμου στην αποτοξίνωση κατά την πρόσληψη τροφής. Πίνακας 10. Συχνότητα εμφάνισης πολυμορφισμών του CYP2D6 σε διαφορετικούς πληθυσμούς. Αλληλόμορφα Συχνότητες αλληλομόρφων (%) Καυκάσιοι Ασιάτες Αφρικανοί Αιθίοπες και Σαουδάραβες CYP2D6 * 2xn CYP2D6 * CYP2D6 * CYP2D6 * CYP2D6 * Συγκρίνοντας το ρυθμό μεταβολισμού υποστρωμάτων του ενζύμου, προκύπτουν 4 φαινότυποι μεταβολιστών (118): οι Εκτενείς Μεταβολιστές (Extensive Metabolizers/EM), οι Ενδιάμεσοι Μεταβολιστές (Intermediate Metabolizers/IM), οι Πτωχοί Μεταβολιστές (Poor Metabolizers /PM) και οι Υπερταχείς μεταβολιστές (Ultrarapid Metabolizers /UM). Εικόνα 4: Κατανομή φαινοτύπων και γονοτύπων με βάση την οξείδωση της σπαρτεϊνης σε δείγμα Γερμανικού πληθυσμού (n=308) (64). MRS: urinary metabolic ratio for sparteine 35

41 Ως Εκτενείς Μεταβολιστές (75-85%), χαρακτηρίζονται άτομα ομόζυγα ή ετερόζυγα για το άγριου τύπου γονίδιο ή για κάποιο πολυμορφισμό που δεν επιδρά στην λειτουργεία του ενζύμου. Γενικά, στους Εκτενείς Μεταβολιστές μπορούν να χορηγηθούν φάρμακα που είναι υποστρώματα του ενζύμου σύμφωνα με τις συνήθεις πρακτικές χορήγησης της δόσης. Οι Ενδιάμεσοι Μεταβολιστές (10-15%), φέρουν τουλάχιστον 1 πολυμορφισμό που οδηγεί σε μειωμένη λειτουργικότητα και μπορούν να φέρουν επίσης και κάποιο nul αλληλόμορφο. Μπορούν να απαιτήσουν μικρότερη από τη μέση δόση του φαρμάκου για τη βέλτιστη θεραπευτική απόκριση του ασθενή. Επιπλέον, η πολλαπλή φαρμακευτική θεραπεία πρέπει να ελεγχθεί με προσοχή. Οι Πτωχοί Μεταβολιστές (5-10%), δεν διαθέτουν ενεργά γονίδια που παράγουν το ένζυμο και έχουν αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης παρενεργειών από τα φάρμακα λόγω της μειωμένης αποβολής τους. Επίσης, μπορούν να παρουσιάσουν έλλειψη θεραπευτικής επίδρασης όταν απαιτείται η μετατροπή του φαρμάκου στην ενεργό μορφή του. Οι Υπερταχείς μεταβολιστές (1-10%), είναι φορείς τουλάχιστον τριών λειτουργικών αντιγράφων του γονιδίου του ενζύμου, επιτυγχάνοντας υψηλότερο από τα κανονικά ποσοστά μεταβολισμό των φαρμάκων. Ο αυξημένος μεταβολισμός ενός φαρμάκου που χορηγείται στη δραστική του μορφή, μπορεί να απαιτεί αυξημένη δόση ή διαίρεση μιας υψηλότερης δόσης σε πολλαπλές δόσεις την ημέρα προκειμένου να επιτευχθούν σταθερά θεραπευτικά επίπεδα. Για προφάρμακα, συνιστάται εναλλακτική θεραπεία ή μειωμένη δόση επειδή αναμένεται μεγαλύτερη από το συνηθισμένο ποσότητα δραστικής ουσίας, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης παρενεργειών. Τα παραπάνω ποσοστά αφορούν τον γενικό πληθυσμό (119,120). Τα ποσοστά για τους Καυκάσιους αντιστοιχούν σε 1 5%, 70 80%, 10 17% and 5 10% για τους υπερμεταβολιστές, εκτενείς, ενδιάμεσους και τους πτωχούς μεταβολιστές, αντίστοιχα (121). Είναι λοιπόν εμφανές ότι η ίδια θεραπευτική προσέγγιση δεν θα έχει το ίδιο αποτέλεσμα σε κάθε ομάδα ασθενών, κάτι που φαίνεται και στην Εικόνα 5 (122). 36

42 Εικόνα 5. Σχηματική απεικόνιση του δυνητικού οφέλους της προσαρμογής της δόσης σύμφωνα με τον γονότυπο. Σύμφωνα με τις αρχές της βιοϊσοδυναμίας, διαφορές φαρμακοκινητικών παραμέτρων, όπως η κάθαρση και η AUC, σε διάφορους υποπληθυσμούς μπορούν να ξεπεραστούν με προσαρμογή της δόσης. Στην εικόνα φαίνεται η διαφορά σε αυτές τις παραμέτρους όταν χρησημοποιείται η θεωρητική δόση έναντι της προσαρμοσμένης στον γονότυπο δόσης. AUC, περιοχή κάτω από την καμπύλη. γ, συγκέντρωση φαρμάκων t, ώρα. Η μέτρηση του συνολικού αριθμού αντιγράφων του CYP2D6 είναι ιδιαίτερα σημαντική στην συνήθη κλινική πράξη. Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, ο μόνος γνωστός τρόπος αύξησης του μεταβολισμού του CYP2D6 είναι η ύπαρξη περισσότερων αλληλομόρφων με φυσιολογική ή και μειωμένη λειτουργία. Είναι από καιρό γνωστό ότι επιπλέον λειτουργικά αντίγραφα του CYP2D6 επηρεάζουν τη φαρμακοκινητική διαφόρων υποστρωμάτων, συμπεριλαμβανομένης της νορτριπτυλίνης. Αποδείχθηκε ότι τα ποσοστά αποβολής της νορτριπτυλίνης είναι πέντε φορές υψηλότερα για άτομα που φέρουν μόνο ένα επιπλέον αντίγραφο του CYP2D6, δηλαδή τρία συνολικά αντίγραφα σε σχέση με αυτά των πτωχών μεταβολιστών(κανένα λειτουργικό αντίγραφο). Όταν υπάρχουν 13 λειτουργικά αντίγραφα, ο ρυθμός είναι 17 φορές υψηλότερος σε σχέση με άτομα χωρίς ενεργό ένζυμο (123). 37

43 Επιπλέον, έχουν παρατηρηθεί εξαιρετικά υψηλά ποσοστά κάθαρσης του αντικαταθλιπτικού φαρμάκου τριμιπραμίνη, σε τρεις επαναλήψεις του γονιδίου CYP2D6 που ελήφθησαν από μια ομάδα υγιών ατόμων. Μία δόση έως και 200% του μέσου όρου μπορεί να απαιτείται για τέτοια άτομα ώστε να επιτύχουν παρόμοιες συγκεντρώσεις σε σχέση με τους φυσιολογικούς μεταβολιστές (124). Σε παρόμοιες μελέτες διερευνήθηκαν οι επιπτώσεις της επανάληψης του γονιδίου του CYP2D6 στο τρικυκλικό αντικαταθλιπτικό δοξεπίνη σε υγιή άτομα. Τόσο η δοξεπίνη, όσο και ο ενεργός μεταβολίτης της, Ν-δεμεθυλδοξεπίνη, παρουσίασαν 2 φορές υψηλότερα ποσοστά σε φυσιολογικούς μεταβολιστές σε σχέση με τους υπερταχείς μεταβολιστές. Τα ίδια αποτελέσματα ισχύουν και για τα τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά ιμιπραμίνη και δεσιπραμίνη (125,126). Ένα άλλο παράδειγμα που δείχνει την σημασία της φαρμακογονιδιωματικής πληροφορίας είναι αυτό της μιρταζαπίνης. Η κάθαρση της μορφής S (+) της μιρταζαπίνης έχει παρατηρηθεί ότι είναι 1,6 φορές υψηλότερη σε άτομα με τον φαινότυπο του υπερταχύ μεταφολιστή του CYP2D6 σε σχέση με τους εκτενείς (127). Δεδομένου ότι η μορφή R (-) δεν μεταβολίζεται από το CYP2D6 (128), αλλά φαίνεται να είναι υπεύθυνη για ανεπιθύμητες ενέργειες στο καρδιαγγειακό σύστημα, οι υπερταχείς μεταβολιστές μπορεί να διατρέχουν υψηλότερο κίνδυνο τόσο για θεραπευτική ανεπάρκεια όσο και για ανεπιθύμητες ενέργειες όταν συνταγογραφούνται υψηλές δόσεις μιρταζαπίνης (127). Επιπλέον, πολλές είναι οι έρευνες που υποστηρίζουν ότι η θεραπευτική αποτυχία λόγω των επιδράσεων του αυξημένου μεταβολισμού από το CYP2D6 μπορεί να αυξήσει την αυτοκτονική συμπεριφορά σε ασθενείς με κατάθλιψη ( ). Αν και δεν υπάρχουν πάντα γενικές κατευθυντήριες γραμμές για την αξιοποίηση της φαρμακογονιδιωματικής πληροφορίας στην πράξη, πολλές μελέτες υποστηρίζουν την χρησιμότητα της. Οι οργανισμοί FDA και EMA έχουν εγκρίνει την προσθήκη τέτοιων πληροφοριών που συσχετίζουν τον ρυθμό μεταβολισμού του φαρμάκου με την δοσολογία στα φύλλα οδηγιών. DPWG και CPIC επίσης παρέχουν κατευθυντήριες γραμμές, πολλές εκ των οποίων επισημαίνουν τον φαινότυπο του υπερταχέος μεταβολιστή CYP2D6 ως σημαντικό για την φροντίδα των ασθενών. Στη συνέχεια αναφέρονται αναλυτικά οι συστάσεις που παρέχονται 38

44 από το DPWG για τους υπερταχείς μεταβολιστές που λαμβάνουν αντικαταθλιπτική και αντιψυχωτική θεραπεία. Ζουκλοπενθιξόλη Ο γενετικός πολυμορφισμός οδηγεί σε αύξηση της μεταβολικής ικανότητας του CYP2D6, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της συγκέντρωσης της ζουκλοπενθιξόλης στο πλάσμα. Σύσταση: Δεν έχουν δημοσιευθεί δεδομένα από μελέτες σχετικά με τη φαρμακοκινητική και τις επιδράσεις της ζουκλοπενθιξόλης σε αυτόν τον φαινότυπο. Συμβουλεύεται, ως προφύλαξη, να υπάρχει εγρήγορση για μείωση της συγκέντρωσης του φαρμάκου ζουκλοπενθιξόλη στο πλάσμα και, εάν είναι απαραίτητο, αύξηση της δόση με βάση την κλινική επίδραση ή συνταγογράφηση ενός εναλλακτικού φαρμάκου, σύμφωνα με τις υπάρχουσες οδηγίες. Μερικά παραδείγματα αντιψυχωτικών που μεταβολίζονται μόνο εν μέρει, ή καθόλου κλοζαπίνη. από το CYP2D6, είναι η φλουπεντιξόλη, η κουετιαπίνη, η ολανζαπίνη και η Αλοπεριδόλη Ο γενετικός πολυμορφισμός οδηγεί σε αύξηση της μεταβολικής ικανότητας του CYP2D6, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της συγκέντρωσης της αλοπεριδόλης στο πλάσμα. Σύσταση: Βάσει της περιορισμένης διαθέσιμης βιβλιογραφίας, δεν είναι δυνατόν να υποβληθεί μια αρκετά καλά τεκμηριωμένη σύσταση σχετικά με την προσαρμογή της δόσης. Συμβουλεύεται, ως προφύλαξη, να υπάρχει εγρήγορση για μείωση της συγκέντρωσης του φαρμάκου αλοπεριδόλη στο πλάσμα και, εάν είναι απαραίτητο, αύξηση της δόση με βάση την κλινική επίδραση ή συνταγογράφηση ενός εναλλακτικού φαρμάκου, σύμφωνα με τις υπάρχουσες οδηγίες. Μερικά παραδείγματα αντιψυχωτικών που μεταβολίζονται μόνο εν μέρει, ή καθόλου από το CYP2D6, είναι η φλουπεντιξόλη, η κουετιαπίνη, η ολανζαπίνη και η κλοζαπίνη. 39

45 Νορτριπτυλίνη Ο γενετικός πολυμορφισμός οδηγεί σε αύξηση της μεταβολικής ικανότητας του CYP2D6, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της συγκέντρωσης της νορτριπτυλίνης στο πλάσμα και σε αύξηση του ενεργού μεταβολίτη E-10-OH-νορτριπτυλίνη. Σύσταση: Επιλέξτε μια εναλλακτική λύση. Μερικά παραδείγματα αντικαταθλιπτικών που μεταβολίζονται μόνο εν μέρει, ή καθόλου από το CYP2D6, είναι η σιταλοπράμη και η σερτραλίνη. Εάν δεν είναι δυνατή εναλλακτική λύση Αυξήστε τη δόση στο 160% της κανονικής δόσης, παρακολουθήστε τη συγκέντρωση της νορτριπτυλίνης στο πλάσμα και προσέξτε για μια αναμενόμενη αύξηση της συγκέντρωσης στο πλάσμα του δυνητικά καρδιοτοξικού, ενεργού μεταβολίτη E-10-OH-νορτριπτυλίνη. Παροξετίνη Η γενετική μεταβολή οδηγεί σε αυξημένη μετατροπή της παροξετίνης από το ένζυμο CYP2D6. Αυτό μπορεί να μειώσει την αποτελεσματικότητα. Σύσταση: Με βάση τη βιβλιογραφία, δεν είναι δυνατή η υποβολή σύστασης σχετικά με την προσαρμογή της δόσης. Εάν είναι δυνατόν, επιλέξτε μια εναλλακτική λύση. Μερικά παραδείγματα αντικαταθλιπτικών που μεταβολίζονται μόνο εν μέρει, ή καθόλου από το CYP2D6, είναι η σιταλοπράμη ή η σερτραλίνη. Ατομοξετίνη Ο γενετικός πολυμορφισμός οδηγεί σε αύξηση της μεταβολικής ικανότητας του CYP2D6, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της συγκέντρωσης της ατομοξετίνης στο πλάσμα και αύξηση του ενεργού της μεταβολίτη. Σύσταση: Δεν υπάρχουν γνωστά δεδομένα από μελέτες σχετικά με τη φαρμακοκινητική ή/και τις επιδράσεις της ατομοξετίνης σε αυτόν τον φαινότυπο. 40

46 Συμβουλεύεται, ως προφύλαξη, να υπάρχει εγρήγορση για μειωμένη θεραπευτική αποτελεσματικότητα και, εάν είναι απαραίτητο, επιλογή ενός εναλλακτικού φαρμάκου που μεταβολίζεται εν μέρη ή καθόλου από το CYP2D6, όπως η μεθυλφαινιδάτη και η κλονιδίνη. Αμιτριπτυλίνη Ο γενετικός πολυμορφισμός οδηγεί σε αύξηση της μεταβολικής ικανότητας του CYP2D6, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε μείωση των συγκεντρώσεων της αμιτριπτυλίνης και του ενεργού μεταβολίτη της, νορτριπτυλίνη, στο πλάσμα καθώς και σε αύξηση των συγκεντρώσεων των ενεργών μεταβολιτών στο πλάσμα E-10-OH-αμιτριπτυλίνη και Ε -10-ΟΗ-νορτριπτυλίνη. Σύσταση: Εάν είναι δυνατόν, επιλέξτε μια εναλλακτική λύση. Μερικά παραδείγματα αντικαταθλιπτικών που μεταβολίζονται μόνο εν μέρει, ή καθόλου από το CYP2D6, είναι η σιταλοπράμη και η σερτραλίνη. Εάν δεν είναι δυνατή η εναλλακτική λύση, αυξήστε τη δόση στο 125% της κανονικής δόσης, παρακολουθήστε τη συγκέντρωση στο πλάσμα και προσέξτε την πιθανότητα αποτυχίας της θεραπείας λόγω μείωσης των συγκεντρώσεων στο πλάσμα της αμιτριπτυλίνης και της νορτριπτυλίνης και της αύξησης της συγκέντρωσης των δυνητικά καρδιοτοξικών, ενεργών μεταβολιτών E-10-OH-αμιτριπτυλίνη και Ε -10-ΟΗ-νορτριπτυλίνη. Κλομιπραμίνη Ο γενετικός πολυμορφισμός οδηγεί σε αύξηση της μεταβολικής ικανότητας του CYP2D6. Αυτό μπορεί να προκαλέσει τη μείωση των συγκεντρώσεων στο πλάσμα της κλομιπραμίνης και του ενεργού μεταβολίτη της, αυξάνοντας ταυτόχρονα αυτές των δυνητικά καρδιοτοξικών υδροξυ μεταβολιτών. Σύσταση: Επιλέξτε μια εναλλακτική θεραπεία. Μερικά παραδείγματα αντικαταθλιπτικών που μεταβολίζονται μόνο εν μέρει, ή καθόλου από το CYP2D6, είναι η σιταλοπράμη και η σερτραλίνη. 41

47 Εάν δεν είναι δυνατή εναλλακτική λύση, αυξήστε τη δόση στο 150% της κανονικής δόσης και παρακολουθήστε τις συγκεντρώσεις στο πλάσμα της κλομιπραμίνης και της δεσμεθυλοκλομιπραμίνης. Βενλαφαξίνη Ο γενετικός πολυμορφισμός οδηγεί σε αύξηση της μεταβολικής ικανότητας του CYP2D6. Αυτό μπορεί να προκαλέσει τη μείωση της συγκέντρωσης της βενλαφαξίνης στο πλάσμα, ενώ παράλληλα αυξάνει τη συγκέντρωση του ενεργού μεταβολίτη Ο-δεσμεθυλβενλαφαξίνη. Σύσταση: Να είστε προσεκτικοί για πιθανή μείωση του αθροίσματος των συγκεντρώσεων της βενλαφαξίνης στο πλάσμα και του ενεργού μεταβολίτη της Ο-δεσμεθυλβενλαφαξίνη. Εάν είναι απαραίτητο, αυξήστε τη δόση στο 150% της κανονικής δόσης. Εάν δεν είναι δυνατή η προσαρμογή της δόσης με βάση την παρακολούθηση του θεραπευτικού φαρμάκου, θα πρέπει να επιλεγεί μια εναλλακτική λύση. Μερικά παραδείγματα αντικαταθλιπτικών που μεταβολίζονται μόνο εν μέρει, ή καθόλου από το CYP2D6, είναι η σιταλοπράμη και η σερτραλίνη. Ιμιπραμίνη Ο γενετικός πολυμορφισμός οδηγεί σε αύξηση της μεταβολικής ικανότητας του CYP2D6, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε μείωση των συγκεντρώσεων στο πλάσμα της ιμιπραμίνης και της δεσιπραμίνης, καθώς και σε αύξηση των υδροξυ- μεταβολιτών τους. Σύσταση: Επιλέξτε μια εναλλακτική θεραπεία. Μερικά παραδείγματα αντικαταθλιπτικών που μεταβολίζονται μόνο εν μέρει, ή καθόλου από το CYP2D6, είναι η σιταλοπράμη και η σερτραλίνη. Εάν δεν είναι δυνατή εναλλακτική λύση, αυξήστε τη δόση στο 170% της κανονικής δόσης και παρακολουθήστε τις συγκεντρώσεις στο πλάσμα της ιμιπραμίνης και της δεσιπραμίνης με σκοπό τον καθορισμό της δόσης συντήρησης. 42

48 Δοξεπίνη Ο γενετικός πολυμορφισμός οδηγεί σε αύξηση της μεταβολικής ικανότητας του CYP2D6, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε μείωση των συγκεντρώσεων της δοξεπίνης και της νορδοξεπίνης στο πλάσμα και σε αύξηση των συγκεντρώσεων στο πλάσμα των υδροξυ μεταβολιτών τους. Σύσταση: Επιλέξτε μια εναλλακτική θεραπεία. Μερικά παραδείγματα αντικαταθλιπτικών που μεταβολίζονται μόνο εν μέρει, ή καθόλου από το CYP2D6, είναι η σιταλοπράμη και η σερτραλίνη. Εάν δεν είναι δυνατή εναλλακτική λύση, αυξήστε τη δόση στο 200% της κανονικής δόσης και παρακολουθήστε τις συγκεντρώσεις της δοξεπίνης και της νορδοξεπίνης στο πλάσμα για τον καθορισμό της δόσης συντήρησης. 43

49 1.6 Σκοπός Η ανταπόκριση ενός ασθενή σε ένα συγκεκριμένο φάρμακο μπορεί να διαφέρει από άτομο σε άτομο. Διαφορές στην παθοφυσιολογία, στο περιβάλλον αλλά και στο γενετικό προφίλ των ασθενών είναι υπεύθυνες για αυτή την ετερογένεια. Η εξατομικευμένη θεραπεία στοχεύει σε διαγνωστικές, θεραπευτικές και προληπτικές στρατηγικές που λαμβάνουν υπόψη αυτές τις διαφορές. Χάρη στην εξέλιξη της τεχνολογίας, της μοριακής βιολογίας και της γενετικής, είναι πλέον εφικτή η χρήση φαμακογονιδιωματικών δεδομένων για τη συσχέτισή τους με την ανταπόκριση ενός ατόμου σε ένα φάρμακο, εξασφαλίζοντας το βέλτιστο θεραπευτικό αποτέλεσμα. Η ικανότητα μεταβολισμού μιας ουσίας, μπορεί να επηρεάσει το φαρμακολογικό αποτέλεσμα. Πέρα λοιπόν από τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ φαρμάκων, τους παθοφυσιολογικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες, η γενετική των μεταβολικών ενζύμων παίζει καθοριστικό ρόλο για την κατανόηση των διαφορών στην φαρμακολογική απόκριση καθώς και στην εκδήλωση ανεπιθύμητων ενεργειών. Η μεγαλύτερη επίδραση μεταξύ των ενζύμων που μεταβολίζουν τα φάρμακα ασκείται από αυτά του κυτοχρώματος P450s, τα κύρια ένζυμα της φάσης Ι. Μεταξύ αυτών, το CYP2D6 είναι το πιο εκτενώς μελετημένο μεταβολικό ένζυμο και είναι υπεύθυνο για τον μεταβολισμό και την βιομετατροπή του 25% περίπου των γνωστών φαρμάκων, συμπεριλαμβανομένου και μεγάλου μέρους των αντικαταθλιπτικών και αντιψυχωτικών φαρμάκων. Στην συγκεκριμένη εργασία μελετήθηκαν αλλαγές του γονιδίου του CYP2D6 και συγκεκριμένα η ύπαρξη πολλαπλών αντιγράφων του, η οποία οδηγεί στον φαινότυπο του υπερταχέος μεταβολιστή. Για το σκοπό αυτό, έγινε η συλλογή ολικού αίματος, 540 ασθενών που λάμβαναν αντικαταθλιπτική ή αντιψυχωτική θεραπεία, και συγκεκριμένα φάρμακα που μεταβολίζονται από το παραπάνω ένζυμο. Στην συνέχεια αναζητήθηκαν οι υπερταχείς μεταβολιστές και εξετάστηκε η σχέση του συγκεκριμένου φαινοτύπου με την ανταπόκριση στην φαρμακευτική αγωγή. Σκοπός της εργασίας είναι να αναδείξει την σημασία της φαρμακογονιδιωματικής στην βελτιστοποίηση της αποτελεσματικότητας καθώς και την αποφυγή ανεπιθύμητων ενεργειών φαρμάκων και στην εξατομίκευση της θεραπείας σε ασθενείς με ψυχιατρικά νοσήματα. 44

50 Πειραματικό μέρος 45

51 2.1 Πληθυσμιακό δείγμα Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκαν δείγματα DNA Ελλήνων ασθενών με ψυχιατρικά νοσήματα. Στην μελέτη εντάχθηκαν ασθενείς που έπασχαν από σχιζοφρένεια, διπολική διαταραχή, κατάθλιψη ή αγχώδεις διαταραχές, σύμφωνα με τα διαγνωστικά κριτήρια του DSM-V, ηλικίας >18 ετών. Τα κριτήρια αποκλεισμού ήταν η εγκυμοσύνη, ο θηλασμός και η μειωμένη νεφρική και ηπατική λειτουργία. Επίσης, απαραίτητη προϋπόθεση για τη συμμετοχή στη μελέτη ήταν η συμπλήρωση εντύπου συγκατάθεσης. Η ένταξη των ασθενών, πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με την Ψυχιατρική κλινική του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών (ΠΓΝΠ), αφού το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την επιτροπή ηθικής και δεοντολογίας του νοσοκομείου. Οι ασθενείς παρείχαν δείγμα ολικού αίματος, η συλλογή του οποίου έγινε σε ειδικά φιαλίδια που περιείχαν EDTA και από τα οποία πραγματοποιήθηκε στην συνέχεια η απομόνωση του DNA. 2.2 Πειραματική διαδικασία Απομόνωση DNA από ολικό αίμα Για την διαδικασία απομόνωσης του γενετικού υλικού από ολικό αίμα χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο Genomic DNA from blood της εταιρίας MACHEREY-NAGEL. Τα δείγματα αίματος που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αποθηκευμένα στους -80 o C, σε φιαλίδια που περιείχαν EDTA προς αποφυγή πήξεως τους. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα εξής: Πρωτεϊνάση K Διάλυμα λύσης B3: Υδροχλωρική γουανιδίνη 50 % Απόλυτη αιθανόλη: % Διάλυμα πλύσης BW: υδροχλωρική γουανιδίνη 50 % + 2-προπανόλη % Διάλυμα πλύσης B5 Διάλυμα έκλουσης BE: 5 mm Tris/HCl, ph

52 Η πειραματική πορεία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: Μεταφορά 200μL ολικού αίματος σε πλαστικά σωληνάρια τύπου eppendorf 1.5mL Προσθήκη 25μL Πρωτεϊνάσης Κ Προσθήκη 200μL διαλύματος λύσης Buffer B3 και έντονη ανάμιξη για δευτερόλεπτα (η έντονη ανάμιξη είναι σημαντική για να ληφθεί υψηλής απόδοσης και καθαρότητας DNA) Επώαση των δειγμάτων στους 70 ο C για 15 λεπτά, για να δράσει η πρωτεϊνάση Κ Προσθήκη 210μL απόλυτης αιθανόλης (96-100%) και καλή ανάμιξη για δευτερόλεπτα Μεταφορά του δείγματος σε στήλη (NucleoSpin Blood Column) που είναι τοποθετημένη σε πλαστικούς μικροσωλήνες φυγοκέντρησης όγκου 1.5 ml Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g Απομάκρυνση του υπερκείμενου από την στήλη και τοποθέτηση της στήλης σε νέο πλαστικό μικροσωλήνα φυγοκέντρησης όγκου 1.5 ml Προσθήκη 500μL διαλύματος πλύσης Buffer BW Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g Απομάκρυνση του υπερκείμενου από την στήλη και τοποθέτηση της στήλης σε νέο πλαστικό μικροσωλήνα φυγοκέντρησης όγκου 1.5 ml Προσθήκη 600μL διαλύματος πλύσης Buffer B5 Φυγοκέντρηση για 1 min σε x g Απόχυση του περιεχομένου του μικροσωλήνα φυγοκέντρησης και επανατοποθέτηση της στήλης σε αυτό Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g (η εναπομένουσα αιθανόλη απομακρύνεται κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου) Απομάκρυνση του μικροσωλήνα φυγοκέντρησης μαζί με το περιεχόμενό του και τοποθέτηση της στήλης σε πλαστικό σωληνάριο τύπου eppendorf 1.5mL Προσθήκη 100 μl διαλύματος έκλουσης BE, το οποίο έχει θερμανθεί στους 70 C Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 min 47

53 Φυγοκέντρηση για 1 min σε x g Συλλογή και αποθήκευση του διηθήματος, το οποίο περιέχει το απομονωμένο DNA Εικόνα 6. Συνοπτική παρουσίαση του πρωτοκόλλου απομόνωσης του DNA από ολικό αίμα 48

54 2.2.2 Προσδιορισμός συγκέντρωσης και καθαρότητας του DNA Η συγκέντρωση καθώς και η καθαρότητα του απομονωμένου DNA προσδιορίστηκε με φασματοφωτομετρία. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε η συσκευή Nanodrop 2000 με το λογισμικό NanoDrop 2000/2000c, η οποία πραγματοποιεί άμεσες μετρήσεις για δείγματα όγκου που κυμαίνονται μεταξύ 0,5-2 μl. Εικόνα 7. Φωτόμετρο Nanodrop Η μέτρηση της απορρόφησης του δείγματος γίνεται σε μήκη κύματος 230nm, 260nm και 280nm. Η συγκέντρωση του DNA προσδιορίζεται από την τιμή σε μήκος κύματος 260nm, όπου το DNA έχει την μέγιστη απορρόφηση, με βάση τον νόμο Lambert-Beer. Οι τιμές απορρόφησης στα 280nm και 230nm είναι ενδεικτικές της ύπαρξης αμινοξέων/πρωτεϊνών και οργανικών διαλυτών αντίστοιχα. Έτσι με βάση τον λόγο A260/A280 και Α260/Α230 αξιολογείται η καθαρότητα του απομονωμένου DNA. Τιμές μεταξύ για τον λόγο A260/A280 (132) και μεγαλύτερες του 2 για τον λόγο Α260/Α230, είναι ενδεικτικές για δείγματα απαλλαγμένα από πρωτεΐνες και οργανικούς διαλύτες, αντίστοιχα. Οι υπολογισμοί αυτοί γίνονται αυτόματα και με την βοήθεια του λογισμικού εμφανίζονται στην οθόνη του ηλεκτρονικού υπολογιστή που είναι συνδεδεμένη η συσκευή. 49

55 Εικόνα 8. Ενδεικτική εικόνα απορρόφησης με την χρήση του λογισμικού Nanodrop 2000/2000c (Sambrook & Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), είναι μια ενζυμική μέθοδος που χρησιμοποιείται ευρέως στη μοριακή βιολογία για τον πολλαπλασιασμό ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA, έτσι ώστε να είναι εφικτή η περαιτέρω μελέτη του. Ακόμα και πολύ μικρές ποσότητες γενετικού υλικού είναι αρκετές για την ενίσχυση του στόχου μέχρι και δισεκατομμύρια φορές, γεγονός που καθιστά την μέθοδο βασικό εργαλείο τόσο σε ερευνητικό όσο και σε διαγνωστικό επίπεδο. Η πλειοψηφία των αντιδράσεων PCR βασίζονται στην επανάληψη συγκεκριμένων θερμικών κύκλων. Η εναλλαγή θέρμανσης και ψύξης επιτρέπει την διεξαγωγή διαφορετικών αντιδράσεων που εξαρτώνται από την θερμοκρασία: συγκεκριμένα την αποδιάταξη και υβριδοποίηση του DNA καθώς και την αντιγραφή του. Στο πρώτο στάδιο της PCR, οι δύο κλώνοι της διπλής έλικας του DNA διαχωρίζονται σε υψηλή θερμοκρασία. Στο δεύτερο στάδιο, η θερμοκρασία μειώνεται και ολιγονουκλεοτίδια που οριοθετούν το τμήμα του γενετικού υλικού που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί, οι εκκινητές, δεσμεύονται στις συμπληρωματικές αλληλουχίες του DNA. Στη συνέχεια, οι δύο κλώνοι DNA χρησιμοποιούνται ως εκμαγείο για την πολυμεράση η οποία χρησιμοποιώντας ελεύθερα νουκλεοτίδια (dntps) συνθέτουν την επιθυμητή αλληλουχία. Τα καινούρια μόρια DNA που δημιουργούνται, χρησιμοποιούνται ως εκμαγείο σε επόμενο κύκλο, επιτρέποντας έτσι μια αλυσιδωτή αντίδραση κατά την οποία το 50

56 αρχικό DNA ενισχύεται εκθετικά (133,134). Τα στάδια της αντίδρασης της PCR παρουσιάζονται συνοπτικά στην παρακάτω εικόνα. Εικόνα 9. Απεικόνιση των σταδίων της αντίδρασης PCR Μεγάλης εμβέλειας PCR (long-range PCR / LR-PCR) Ωστόσο η συμβατική PCR επιτρέπει την ενίσχυση μόνο μικρών τμημάτων DNA. Το 1992 ο Barnes και οι συνεργάτες του (135) κατάφεραν να δημιουργήσουν συνθήκες που να επιτρέπουν ενίσχυση μεγαλύτερων τμημάτων, μεγέθους 3-5kb. Με περαιτέρω τροποποίηση των συνθηκών, η εφαρμογή της μεγάλης εμβέλειας PCR (long-range PCR - LR-PCR) αύξησε το μέγεθος των προϊόντων σε πάνω από 30kb. Τέτοιες τροποποιήσεις περιλαμβάνουν την πλήρη αποδιάταξη της διπλής έλικας DNA καθώς μεγάλα τμήματα είναι πιο δύσκολο να αποδιαταχθούν. Η επέκταση του χρόνου κάθε κύκλου έτσι ώστε να είναι επαρκής για την πλήρη σύνθεση του προϊόντος ήταν επίσης αναγκαία. Επιπλέον η προστασία του DNA εκμαγείου κατά την διάρκεια του θερμικού κύκλου (π.χ. διάσπαση των πουρινών) καθώς και η διατήρηση της εξειδίκευσης του ενζύμου περιλαμβάνονται σε αυτές τις τροποποιήσεις. Νουκλεοτίδια που ενσωματώνονται λανθασμένα μπορούν να μειώσουν την αποτελεσματικότητα όταν πρόκειται για ενίσχυση μεγάλου τμήματος. Ακόμα και μικρή συχνότητα λάθους της πολυμεράσης (<1 σε βάσεις) μπορεί να προκαλέσει πρόωρο τερματισμό της σύνθεσης του κλώνου και επηρεάζει αλληλουχίες μεγαλύτερες των 10kb. Ένζυμα με δραστικότητα 3 5 εξωνουκλεάσης μπορούν να απομακρύνουν λάθος ενσωματωμένα νουκλεοτίδια και να διορθώσουν αυτό το πρόβλημα (136). Στην συγκεκριμένη εργασία πραγματοποιήθηκε LR-PCR για την ανίχνευση της ύπαρξης διπλασιασμού του γονιδίου του CYP2D6. 51

57 Στον παρακάτω πίνακα φαίνονται οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την αντίδραση της LR-PCR. Πίνακας 11. Αλληλουχίες εμπρόσθιου και ανάστροφου εκκινητή. Εκκινητής Πρόσθιος Ανάστροφος Αλληλουχία TCCCCACTGACCCAACTCT CACGTGCAGGGCACCTAGAT Ο πρόσθιος εκκινητής μπορεί να προσδένεται στην περιοχή του γονιδίου του CYP2D6 αλλά και στην περιοχή του ψευδογονιδίου του CYP2D7. Ο ανάστροφος εκκινητής προσδένεται μόνο στο CYP2D6. Το προϊόν της PCR αντίδρασης που προκύπτει με αυτόν τον συνδυασμό εκκινητών έχει μέγεθος 5,2kb και αποτελεί προϊόν ενίσχυσης της περιοχής ανάμεσα στα γονίδια CYP2D7 και CYP2D6. Στα δείγματα που φέρουν περισσότερα αντίγραφα του γονιδίου λαμβάνεται και ένα δεύτερο προϊόν μικρότερου μεγέθους, 3,6kb, το οποίο αντιστοιχεί στην περιοχή ανάμεσα στα δύο γονίδια CYP2D6- CYP2D6. Εικόνα 10. Σημεία πρόσδεσης των εκκινητών με απουσία ή παρουσία επιπλέον γονιδίου. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν της εταιρίας biotechrabbit. Η στοιχειομετρία της αντίδρασης και οι συνθήκες του πειράματος περιγράφονται στους παρακάτω πίνακες (Πίνακας 12 και Πίνακας 13). 52

58 Πίνακας 12. Η στοιχειομετρία της αντίδρασης PCR. Αντιδραστήρια Όγκος (μl) Συγκέντρωση Long Range PCR Master Mix 7 2x Long Range PCR Enhancer 3 5x Reagent Mix Forward Primer 2 10μM Reverse Primer 2 10μM + DNA 6 20ng/μL = Σύνολο 20 Πίνακας 13. Πρόγραμμα θερμικού κυκλοποιητή. Βήμα Στάδιο Eπανάληψη Θερμοκρασία Χρόνος 1 Ενεργοποίηση του ενζύμου 1 95 ο C 2 min 2 Αποδιάταξη 95 ο C 30 s 3 Υβριδισμός ο C 30 s 4 Επιμήκυνση 68 ο C 6 min 5 Τελική επιμήκυνση 1 72 ο C 5 min 6 Συντήρηση των PCR προϊόντων 1 4 ο C Ηλεκτροφόρηση Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης βασίζεται στο διαχωρισμό φορτισμένων μορίων κατά μήκος ενός στερεού πορώδους υποστρώματος, στα άκρα του οποίου εφαρμόζεται ηλεκτρική τάση. Τα αρνητικά φορτισμένα μόρια DNA κινούνται με κατεύθυνση από την αρνητικό προς τον θετικό πόλο της συσκευής ηλεκτροφόρησης υπό την επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου και με 53

59 τον τρόπο αυτό μπορούν και διαχωρίζονται με βάση το μέγεθός τους. Η χρήση ειδικών χρωστικών μας επιτρέπει την οπτικοποίηση των θραυσμάτων διαφορετικού μεγέθους σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας (137). Στην παρούσα εργασία η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε σε πήκτωμα αγαρόζης και η χρωστική που χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση των PCR προϊόντων ήταν η Midori Green, η οποία εγκαθίσταται στις αύλακες του δίκλωνου DNA και φθορίζει όταν εκτεθεί σε υπεριώδη ακτινοβολία. Αναλυτικά για την παρασκευή του πηκτώματος αγαρόζης χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια: Ρυθμιστικό διάλυμα TAE (Tris base, acetic acid and EDTA) (1x) Σύσταση (50x): 242g Tris, 100mL 0.5 M EDTA (ph 8.0), 57.1 ml Glacial acetic acid, διπλά απεσταγμένο H2O (ddh2o) έως τελικού όγκου 1000mL. Αγαρόζη της εταιρείας Nippon Genetics Europe GmbH Midori Green της εταιρείας Nippon Genetics Europe GmbH Για την διαδικασία της ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιήθηκαν: Ρυθμιστικό διάλυμα TAE (1x) (running buffer) Διάλυμα φόρτωσης purple Loading Dye(6x) της εταιρίας New England Biolabs. Μάρτυρας μεγεθών σταθερού βήματος 1000bp DNA(ladder) της εταιρείας Thermo Scientific. 54

60 Εικόνα 11. GeneRuler 1 kb DNA Ladder της εταιρείας Thermo Scientific Μεθοδολογία γενετικής ανάλυσης μικροδεξαμενής (Minipool) Σύμφωνα με την παραπάνω πειραματική πορεία, η γονοτύπηση των ασθενών στηρίζεται στην εμφάνιση (ή μη) μίας επιπλέον μπάντας κατά την ηλεκτροφόρηση. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε μεγάλος αριθμός δειγμάτων και έτσι απαιτείται αντίστοιχος αριθμός επαναλήψεων της αντίδρασης PCR ώστε να γίνει η γονοτύπηση, γεγονός που αυξάνει το κόστος των αντιδραστηρίων και τον χρόνο διεξαγωγής των πειραμάτων. Από την βιβλιογραφία είναι γνωστό πως το ποσοστό εμφάνισης διπλασιασμού του γονιδίου του CYP2D6 για τους καυκάσιους είναι της τάξης του 1-5% (93). Άρα ο αριθμός των ασθενών που φέρουν διπλασιασμό είναι μικρός ανάμεσα σε έναν μεγάλο όγκο δειγμάτων. Στην προσπάθεια εξοικονόμησης αντιδραστηρίων και χρόνου, δοκιμάστηκε η στρατηγική της ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων μέσω της μεθοδολογίας minipool, που έχει δοκιμαστεί από άλλες ερευνητικές ομάδες (138), όπου τα δείγματα ομαδοποιούνται και ενισχύονται ταυτόχρονα ανά 5. Στην περίπτωση που υπάρχει θετικό σήμα για κάποια ομάδα, τα επιμέρους δείγματα ελέγχονται ξεχωριστά. 55

61 Για την αξιολόγηση της ευαισθησίας της μεθόδου, πραγματοποιήθηκε δοκιμή της αντίδρασης PCR σε δείγματα φθίνουσας συγκέντρωσης από 20μg/μL έως 4μg/μL και όπως φαίνεται στην Εικόνα 12. Ακόμα και για 5 φορές μικρότερη συγκέντρωση, κατά την ηλεκτροφόρηση υπάρχει εμφανές σήμα, τόσο για τον άγριου τύπου όσο και για το διπλασιασμένο γονότυπο. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε η αντίδραση για 2, 3, 4, 5 δείγματα ταυτόχρονα(εικόνα 13) και το αποτέλεσμα έδειξε πως ο γονότυπος ενός δείγματος που φέρει διπλασιασμό μπορεί να εμφανιστεί ακόμα και όταν ελέγχεται ταυτόχρονα με άλλα 4 δείγματα. Εικόνα 12..Διαδοχικές αραιώσεις δειγμάτων με γονότυπο wt και dup. Εικόνα 13. Αποτέλεσμα αντίδρασης LR-PCR για 1, 2, 3, 4, 5 δείγματα. 56

62 Η στοιχειομετρία της αντίδρασης παραμένει ίδια με την διαφορά ότι αντί για 6μL ενός δείγματος, προστίθεται 1.2μL από κάθε ένα από τα 5 δείγματα (Πίνακας 13). Πίνακας 13. Στοιχειομετρία της αντίδρασης PCR με την μεθοδολογία γενετικής ανάλυσης μικροδεξαμενής. Reagent Mix Αντιδραστήρια Long Range PCR Master Mix Long Range PCR Enhancer Forward Primer [10μM] Reverse Primer [10μM] x1 7 μl 3 μl 2 μl 2 μl + DNA (20ng/μL) 1,2 + 1,2 + 1,2 + 1,2 + 1,2 μl = Σύνολο 20 μl 57

63 Αποτελέσματα 58

64 3.1 Δημογραφικά στοιχεία ασθενών Στην παρούσα μελέτη, συμμετείχαν 540 ασθενείς με ψυχιατρικές διαταραχές, 254 άντρες και 286 γυναίκες, με μέσο όρο ηλικίας τα και τα έτη, αντίστοιχα. Ο μέσος όρος ηλικίας για το σύνολο των ασθενών ήταν τα έτη. Από τους 239 ασθενείς που έπασχαν από κατάθλιψη με μέσο όρο ηλικίας τα έτη, 97 ήταν άντρες και 142 γυναίκες, με μέσο όρο ηλικίας και έτη αντίστοιχα. 131 ήταν ασθενείς με σχιζοφρένεια με μέσο όρο ηλικίας 42.49±12.39 έτη, από τους οποίους 93 ήταν άντρες με μέσο όρο ηλικίας 41.99±12.63 έτη και 38 γυναίκες με μέσο όρο ηλικίας 43.71±11.85 έτη. Από τους 115 ασθενείς με διπολική διαταραχή (46.36±12.85 μέσος όρος ηλικίας), 39 ήταν άντρες και 38 γυναίκες με μέσους όρους ηλικίας τα 45.26±12.16 και 46.92±13.23 έτη, αντίστοιχα. Τέλος συμμετείχαν 55 ασθενείς που έπασχαν από αγχώδεις διαταραχές με μέσο όρο ηλικίας 39.58±14.13 έτη, εκ των οποίων οι 25 ήταν άντρες ενώ οι 30 ήταν γυναίκες. Ο μέσος όρος ηλικίας ήταν 40.64±14.35 και 38.7±14.13 έτη, αντίστοιχα. Ο αριθμός των ασθενών βάση της διάγνωσης και του φύλου, καθώς και ο μέσος όρος της ηλικίας τους συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 14). Πίνακας14. Δημογραφικά στοιχεία ασθενών. Άντρες Γυναίκες Σύνολο Διάγνωση Αριθμός Ηλικία SD Αριθμός Ηλικία SD Αριθμός Ηλικία SD (ΜΟ) (ΜΟ) (ΜΟ) Κατάθλιψη Σχιζοφρένεια Διπολική διαταραχή Αγχώδεις διαταραχές Σύνολο

65 Εικόνα 14. Ποσοστά ψυχιατρικών διαταραχών. Οι ασθενείς λάμβαναν ως θεραπεία ψυχιατρικά φάρμακα που στον μεταβολισμό τους εμπλέκεται το ένζυμο CYP2D6. Οι 370 ασθενείς λάμβαναν αντικαταθλιπτική θεραπεία και συγκεκριμένα 91 άτομα λάμβαναν σερτραλίνη, 85 εσιταλοπράμη, 69 σιταλοπράμη, 68 βενλαφαξίνη, 30 παροξετίνη, 18 αμιτριπτυλίνη, 8 κλομιπραμίνη και 1 ασθενής λάμβανε δοξεπίνη. Αντιψυχωτική θεραπεία λάμβαναν 170 άτομα εκ των οποίων 93 λάμβαναν αριπιπραζόλη,, 63 αλοπεριδόλη, 13 ζουκλοπενθιξόλη και 1 πιμοζίδη (Πίνακας 15). Πίνακας 15. Φαρμακευτική αγωγή ασθενών. Φάρμακο Αριθμός ασθενών Ποσοστό % Αντικαταθλιπτικά Σερτραλίνη Εσιταλοπραμη Σιταλοπράμη Βενλαφαξίνη Παροξετίνη Αμιτριπτυλίνη Κλομιπραμίνη Δοξεπίνη

66 Αντιψυχωτικά Αριπιπραζόλη Αλοπεριδόλη Ζουκλοπενθιξόλη Πιμοζίδη Σύνολο Εικόνα 15. Ποσοστά αντικαταθλιπτικών και αντιψυχωτικών φαρμάκων. 61

67 Εικόνα 16. Ποσοστά αντικαταθλιπτικών φαρμάκων. Εικόνα 16. Ποσοστά αντιψυχωτικών φαρμάκων. 62

68 3.2 Πειραματικά αποτελέσματα Αρχικά πραγματοποιήθηκε η διαδικασία απομόνωσης γενετικού υλικού από ολικό αίμα με το πρωτόκολλο Genomic DNA purification with NucleoSpin Blood της εταιρίας MACHEREY- NAGEL. Στην συνέχεια η συγκέντρωση και καθαρότητα υπολογίστηκε και αξιολογήθηκε με την βοήθεια της συσκευής NanoDrop. Ελέγχθηκαν οι λόγοι 260/280 και 260/230 καθώς και η συγκέντρωση έτσι ώστε να βρίσκονται στα αποδεκτά όρια τιμών που αναφέρονται στο Κεφάλαιο: Πειραματικό Μέρος και έγινε επανάληψη της διαδικασίας για όσα δείγματα δεν βρίσκονταν ανάμεσα σε αυτές τις τιμές. Επίσης για την αξιολόγηση της ποιότητας του DNA πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση των απομονωμένων δειγμάτων σε πήκτωμα αγαρόζης, η οποία δίνει πληροφορίες για το εάν το απομονωμένο γενετικό υλικό είναι ακέραιο (μακρομοριακό) ή κατακερματισμένο. Η πληροφορία αυτή είναι σημαντική όταν για παράδειγμα χρησιμοποιείται ενίσχυση με PCR μεγάλων τμημάτων DNA, όπως θα χρησιμοποιηθεί και στην παρούσα εργασία. Εικόνα 17. Ενδεικτική εικόνα ηλεκτροφόρησης γενωμικού DNA. 63

69 Στην συγκεκριμένη εργασία πραγματοποιήθηκε LR-PCR για την ανίχνευση της ύπαρξης διπλασιασμού του γονιδίου του CYP2D6. Η γονοτύπηση έγινε με την αξιολόγηση του PCR προϊόντος μετά από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης περιεκτικότητας 0.8% εφαρμόζοντας τάση 100 V για 1h. Το αποτέλεσμα της αντίδρασης PCR με αυτόν τον συνδυασμό εκκινητών είναι να λαμβάνεται από κάθε δείγμα ένα προϊόν βάρους 5,2kb ενώ στα δείγματα που φέρουν περισσότερα αντίγραφα του γονιδίου θα λαμβάνεται ένα δεύτερο προϊόν μικρότερου βάρους, 3,6kb, όπως αναφέρεται στο Κεφάλαιο: Πειραματικό Μέρος. Εικόνα 18. Ενδεικτική εικόνα ηλεκτροφόρησης 10 δειγμάτων DNA που έχουν ενισχυθεί με LR-PCR. Στην εικόνα φαίνονται τα προιόντα πολλαπλασιασμού διαφορετικού μοριακού βάρους βάση με τα οποία γίνεται η γονοτύπιση. Η ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων έγινε μέσω της μεθοδολογίας «minipool», που περιγράφεται στο Κεφάλαιο: Πειραματικό Μέρος. Όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα, τα ομαδοποιημένα ανά 5 δείγματα DNA αρχικά ενισχύονται ταυτόχρονα και στην συνέχεια γίνεται ενίσχυση των δειγμάτων ξεχωριστά για εκείνα που έδωσαν θετικό σήμα στην αρχική δοκιμασία. 64

70 Εικόνα 19. Ενδεικτική εικόνα ηλεκτροφόρησης δειγμάτων ενισχυμένων με την μεθοδολογία "minipool"(πάνω) και η ανάλυση των δειγμάτων τα οποία έδωσαν θετικό σήμα. Με την παραπάνω διαδικασία, από τους 540 ασθενείς που συμμετείχαν στην έρευνα, βρέθηκε ότι οι 28 έφεραν διπλασιασμό για το γονίδιο του CYP2D6. Αυτός ο αριθμός αντιστοιχεί στο 5,19% του συνόλου. Πίνακας 16. Αριθμός ασθενών με διπλασιασμό γονιδίου ανά πάθηση. Ασθένεια Αριθμός ασθενών Διπλασιασμός Κατάθλιψη Σχιζοφρένεια Διπολική διαταραχή Αγχώδεις διαταραχές 55 1 Σύνολο