Υγρή χρωματογραφία: Στατική φάση: στερεό πορώδες υλικό ή υγρό καθηλωμένο σε στερεό υπόστρωμα, Κινητή φάση: υγρό.

Transcript

1 q, HPLC) Πέτρος Ταραντίλης Αναπληρωτής καθηγητής Χρήστος Παππάς Επίκουρος καθηγητής

2 Υγρή χρωματογραφία: Στατική φάση: στερεό πορώδες υλικό ή υγρό καθηλωμένο σε στερεό υπόστρωμα, Κινητή φάση: υγρό. 2

3 Κατάταξη των τεχνικών υγρής χρωματογραφίας Κινητή Στατική Μηχανισμός Μορφή φάση φάση διαχωρισμού στατικής φάσης Τεχνική χρωματογραφίας Υγρό Στερεό Προσρόφηση Ιονανταλλαγή Μοριακός Αποκλεισμός Εκλεκτική Αντίδραση (συγγένεια) Στήλη Λεπτή Στοιβάδα σε Πλάκα Χρωματογραφία Προσρόφησης σε Στήλη Χρωματογραφία TLC Χάρτης ρης Χρωματογραφία σε Χάρτη ρη Στήλη Χάρτης Στήλη Στήλη Χρωματογραφία Ιονανταλλαγής σε Στήλη Χρωματογραφία Ιονανταλλαγής Χάρτη Υγρή Χρωματογραφία Μοριακού Αποκλεισμού Χρωματογραφία Συγγένειας Υγρό Στήλη Χρωματογραφία Κατανομής σε Στήλη (επάνω Κατανομή σε στερεό φορέα) Χάρτης Χρωματογραφία Κατανομής σε Χάρτη 3

4 Χρωματογραφία Χρωματογραφία Χρωματογραφία συγγένειας μοριακού αποκλεισμού ιονανταλλαγής affinity molecular exclusion ion-exchange chromatography chromatography chromatography

5 Χρωματογραφία προσρόφησης adsorption chromatography Χρωματογραφία κατανομής partition chromatography 5

6 Χρωματογραφία προσρόφησης (adsorption chromatography) 6

7 FLASH COLUMN CHROMATOGRAPHY Κινητή ηήφάση ιαλύτης Αντλία Εισαγωγέας γ δείγματος Σήλ Στήλη Ανιχνευτής H/Y 7

8 Η υγρή χρωματογραφία στήλης διακρίνεται σε: κλασική όταν η διαβίβαση της υγρής κινητής φάσης μέσα από τη στατική φάση πετυχαίνεται λόγω της βαρύτητας, όταν η στατική φάση αποτελείται από σχετικά μεγάλης διαμέτρου σωματίδια, υψηλής απόδοσης όταν η διαβίβαση της υγρής κινητής φάσης μέσα από τη στατική φάση πετυχαίνεται με τη χρησιμοποίηση αντλιών υψηλής πίεσης, όταν η στατική φάση αποτελείται από πολύ μικρής διαμέτρου, και επομένως μεγάλης αντιστάσεως, σωματίδια υψηλής διαχωριστικής απόδοσης (υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ή Highg q, g p HPLC). 8

9 Κινητή Φάση Εισαγωγέας ιαλύτης Αντλία δί δείγματος Στήλη Ανιχνευτής H/Y Εισαγωγέας Ανιχνευτής Καταγραφικό δείγματος Στήλη Αντλία H/Y Κινητή Φάση ιαλύτης Χρωματογράφημα 9

10 Οργανολογία 1. οχείο κινητής φάσης - ιαλύτης 2. Αντλία 3. Σύστημα εισαγωγής γής δείγματος 4. Στήλη 5. Ανιχνευτής 6. Καταγραφέας ή ηλεκτρονικός υπολογιστής - εκτυπωτής 1

11 Οργανολογία 1. οχείο κινητής φάσης - ιαλύτης 1. οχείο ή δοχεία από γυαλί 5 ml. 2. Σωληνάκι με ειδικό φίλτρο (2μm) 3. ιαλύτες υψηλής καθαρότητας (HPLC grade) και να έχουν απαερωθεί (degassed). 11

12 Οργανολογία 2. Αντλία Απαιτήσεις: (1) Ανάπτυξη υψηλών πιέσεων (14-6 psi) (2) Απαλλαγή από παλμούς ροής, (3) Ταχύτητες ροής από 1έως,1 1 ml/min (4) Έλεγχο ροής και επαναληψιμότητα,5% (5) Τμήματα ανθεκτικά στη διάβρωση (ανοξείδωτο χάλυβα,teflon) Τύποι Αντλιών: (1) Παλινδρομικές (2) Σύριγγας ή εκτόπισης (3) Πνευματικές ή σταθερής πίεσης

13 Οργανολογία 2. Αντλία υψηλή πίεση (14-6 psi) σταθερότητα στην ταχύτητα ροής (παροχή) Μια αντλία: ισοκρατική έκλουση (isocratic elution), η κινητή φάση έχει σταθερή σύσταση Σύστημα αντλιών: βαθμιδωτή έκλουση (gradient elution), η σύσταση της κινητής φάσης μεταβάλλεται βαθμιαία

14 Οργανολογία

15 Οργανολογία 3. Σύστημα εισαγωγής δείγματος Χειροκίνητο Αυτόματο Σύριγγα Βαλβίδα εισαγωγής Χωρητικότητα: 1-5 μl 15

16 Οργανολογία 4. Στήλη Υλικό κατασκευής: ανοξείδωτος χάλυβας. Πάχος τοιχωμάτων: 2-3 mm Μήκος: 1-1 cm ιάμετρος: 2-1 mm ιάμετρος κόκκων πληρωτικού υλικού: 3-1 μm, Μικρή διάμετρος κόκκων => Μικρό Υ.Ι.Θ.Π. Μεγάλος αριθμός Θ.Π. καλούς ταχύτατους διαχωρισμούς με στήλες μικρού μήκους 16

17 Οργανολογία 4. Στήλη Υλικό πλήρωσης: Υλικό στήριξης-αδρανές υλικό α) πορώδες, με βάση την πυριτική γη (silica), SiO 2 β) μη πορώδες (pellicular), γ) σκληρή πηκτή, με βάση το πολυστορόλιο. Υγρή στατική φάση Επικαλύπτει το αδρανές υλικό: α) φυσικά β) χημικά, δεσμευμένη στατική φάση (bonded stationary phase) Σωματίδιο - SiOH + (CH 3 CH 2 O) 3 SiR -CH 3 CH 2 OH Σωματίδιο -SiO - Si(OCH 2 CH 3 ) 2 - R R: (CH 2 ) 3 NH 2 ή (CH 2 ) 3 CN πολική φάση R: (CH 2 ) 17 CH 3 (C 18 ) ή (CH 2 ) 2 -C 6 H 5 (C 8 ) μη πολική φάση 17

18 Οργανολογία 4. Στήλη Η HPLC ανάλογα με την πολικότητα της στατικής - κινητής φάσης διακρίνεται σε: α) κανονικής φάσης (normal phase) υγρή στατική φάση: πολική κινητή φάση: μη πολική ιαχωρισμό: πολικών β) ανεστραμμένης φάσης (reversed phase) υγρή στατική φάση: μη πολική κινητή φάση: πολική ιαχωρισμό: μη πολικών ουσιών 18

19 q, g p y HPLC) α) ) κανονικής φάσης β) ανεστραμμένης φάσης (normal phase) (reversed phase) Λιποφιλικότητα όηα Λιποφιλικότητα 19

20 Οργανολογία 4. Στήλη Χαρακτηριστικά συστήματα στατικής - κινητής φάσης Στατική φάση Κινητή φάση α. LLC κανονικής φάσης διμέθυλο σουλφοξείδιο ισοοκτάνιο αιθυλενοδιαμίνη εξάνιο νιτρομεθάνιο CCl 4 / εξάνιο νερό/αιθυλενογλυκόλη εξάνιο/ccl 4 β. LLC ανεστραμμένης φάσης κυανο αιθυλ-σιλικόνη MeOH-H 2 O διμεθυλοπολυσιλοξάνιο MeCN-H 2O πολυμερείς H/C MeOH-H 2 O 2

21 Οργανολογία 5. Ανιχνευτής α) ) Φωτομέτρο UV-VisVi 1) σταθερού μήκους κύματος 2) πολλαπλών σταθερών μηκών κύματος 3) μεταβαλλόμενου μήκους κύματος Diode Array Detector, DAD β) ιαφορικό διαθλασίμετρο γ) Φθορισμόμετρο δ) Ηλεκτροχημικός (αμπερομετρικός) ανιχνευτής 21

22 Τεχνικές υγρής χρωματογραφίας Η στήλη: α) υλικό πλήρωσης και β) η υγρή στατική φάση Χαρακτηρίζουν τις διάφορες χρωματογραφικές τεχνικές 22

23 Οργανολογία 6. Καταγραφέας ή ηλεκτρονικός υπολογιστής - εκτυπωτής 23

24 Οργανολογία 6. Καταγραφέας ή ηλεκτρονικός υπολογιστής - εκτυπωτής 24

25 Επίτευξη επιθυμητού διαχωρισμού Χρωματογραφικοί παράμετροι Χρόνος συγκράτησης, t R Ύψος κορυφής, Υ Πλάτος κορυφής, W b ιαχωριστική ικανότητα Βελτίωση της διαχωριστικής ικανότητας: Αύξηση του t R =t 2 -t 1 Ελάττωση του W 1. Επιλογή στήλης: μήκος, διάμετρος υλικού πλήρωσης, πολικότητα 2. Επιλογή κινητής φάσης: πολικότητα, ισοκρατική ή βαθμιδωτή έκλουση 25

26 Επίτευξη επιθυμητού διαχωρισμού 1. Επιλογή στήλης: μήκος, διάμετρος υλικού πλήρωσης, πολικότητα Μεγάλο μήκος ή μικρή διάμετρος υλικού πλήρωσης Η πολικότητα του δείγματος να είναι ίδια με την πολικότητα της στατικής φάσης α) κανονικής φάσης (normal phase) υγρή στατική φάση: πολική κινητή φάση: μη πολική διαχωρισμό: πολικών β) ανεστραμμένης φάσης (reversed phase) υγρή στατική φάση: μη πολική κινητή φάση: πολική διαχωρισμό: μη πολικών ουσιών 2. Επιλογή κινητής φάσης: πολικότητα, ισοκρατική ή βαθμιδωτή έκλουση 26

27 2. Επιλογή κινητής φάσης Iσοκρατική έκλουση βαθμιδωτή έκλουση isocratic elution gradient elution βαθμιδωτή έκλουση Iσοκρατική έκλουση Bαθμιδωτή έκλουση: κατά τη διάρκεια του διαχωρισμού, κατόπιν προγραμματισμού μ του οργάνου, μεταβάλλεται η σύσταση και συνεπώς η πολικότητα του διαλύτη, με αποτέλεσμα να επιτυγχάνεται καλύτερος διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος 27

28 Καθαρότητα κορυφής (Peak purity) Φάσματα UV-Vis Χρωματογράφημα HPLC - DAD 28

29 Ποιοτική Ανάλυση Σύγκριση του t Rχ της άγνωστης ουσίας με το t Rs συγκεκριμένης πρότυπης ουσίας. Με τη μέθοδο του εμβολιασμού (spiking)

30 ma U DAD1 B, Sig=52,16 Ref=off (COLOURS\COLOR162.D) ma U DAD1 B, Sig=52,16 Ref=off (COLOURS\COLOR15.D) DAD1 B, Sig=52,16 Ref=off (COLOURS\COLOR149.D) ma U min min min

31 Ποιοτική Ανάλυση Σύγκριση του t Rχ της άγνωστης ουσίας με το t Rs συγκεκριμένης πρότυπης ουσίας. Με τη μέθοδο του εμβολιασμού (spiking) Ποσοτική Ανάλυση Το εμβαδόν της κάθε κορυφής του χρωματογραφήματος σχετίζεται με την ποσότητα του αντίστοιχου συστατικού μέσα στο δείγμα 1. Προσδιορισμός της % αναλογίας των συστατικών του δείγματος (percentage of total). 2. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης των συστατικών του δείγματος i) Μέθοδος εσωτερικού προτύπου ( internal standard). ii) Μέθοδος εξωτερικού προτύπου (external standard).

32 Ποιοτική Ανάλυση Όλοι οι προαναφερθέντες ανιχνευτές δεν κάνουν ταυτοποίηση των συστατικών ενός δείγματος. Ο χρόνος συγκράτησης (retention times) από μόνος του δεν μπορεί να ταυτοποίηση ένα συστατικό Για να γίνει ταυτοποίηση χρειάζεται Φασματόμετρο μ Μαζών (Mass spectrometer) Φασματόμετρο Υπερύθρου (Fourier Transform Infrared Spectrometer) Σύγκριση των φασμάτων με φάσματα γνωστών συστατικών (fingerprint)

33 Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης - φασματομετρία μαζών, Mass Spectrometry, HPLC-MS, Mass Spectrometry, LC-MS) Η HPLC, είναι βασικά μέθοδος διαχωρισμού και όχι μέθοδος ταυτοποίησης. Όταν συνδυαστεί με τη φασματομετρία μαζών γίνεται ισχυρότατο μέσο ταυτοποίησης πολύπλοκων βιολογικών δειγμάτων. 33 Μειονέκτημα: το κόστος αγοράς

34 Εφαρμογές Προετοιμασία δειγμάτων ΜΕΓΑΛΟΥ ΟΓΚΟΥ ΕΓΧΥΣΗ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΕΞΑΤΜΙΣΗ ΙΑΛΥΤΗ ΣΥΜΠΥΚΝΩΣΗ ΣΥΜΒΑΤΙΚΗ ΕΓΧΥΣΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ

35 HPLC HPLC-DAD Χρωματογραφικός διαχωρισμός συστατικών των στιγμάτων του φυτού Crocus sativus HPLC-DAD 35

36 H OH H 3 C CH 3 HO H H H O OH O CH 3 O HO H CH 3 CH 3 O R 1 O OR 2 O All-trans CH 3 CH 3 HPLC DAD R O R 1 O CH 3 CH 3 13-cis CH 3 CH 3 O OR 2 H 3 C CH 3 O CH 3 Χρωματογραφικός διαχωρισμός συστατικών των στιγμάτων του φυτού Crocus sativus 36

37 HPLC DAD MSD Χρωματογραφικός διαχωρισμός συστατικών των στιγμάτων του φυτού Crocus sativus 37

38 HPLC DAD MSD Χρωματογραφικός διαχωρισμός συστατικών των στιγμάτων του φυτού Crocus sativus 38

39 Χρωματογραφική Ανάλυση Συνδυασμένη με Φασματομετρία Μαζών - Mass Spectrometry g p y p y GC MS Ανάλυση Στοχευόμενη Ανάλυση Ανάλυση Δεδομένων Πτητικά Συστατικά Μη Στοχευόμενη Ανάλυση Προετοιμασία Δείγματος Διαχωρισμός Συστατικών Δείγματος Μη Πτητικά Συστατικά LC MS Ανάλυση Στοχευόμενη Ανάλυση Μη Στοχευόμενη Ανάλυση Ανάλυση Δεδομένων 39

40 Εφαρμογές Echinacea purpurea (L.) Monch. Προσδιορισμός των συστατικών των ριζών της E. purpurea που καλλιεργείται στην Ελλάδα και εκχυλίζονται σε σύστημα αλκοόλης:νερού

41 Εφαρμογές Ρίζες E. purpurea (,5 g) CH3OH:H2O Εκχύλιση: Ανάδευση σε θ o C περιβάλλοντος 15 min Εκχύλιση: Υπέρηχοι 15 min Φυγοκέντρηση Διήθηση Εκχύλισμα Φασματοσκοπικές τεχνικές HPLC, LC MS

42 mau Υγρή χρωματογραφία HPLC-Ποιοτικός υψηλής απόδοσης προσδιορισμός Πρότυπα Πρότυπα 7.98 Καφταρικό οξύ Sig=33nm ECHIN4) Κιχορικό οξύ 8 mau ECHIN25 Καφταρικό Οξύ (116 mau) 7.983min 1 mau 1 ECHIN4 Κιχορικό Οξύ 24.24min (16 mau) nm nm στήλη C-18 (25 x 4,6mm) που είχε εξισορροπηθεί με 25:75 MeOH:νερό-,1% σε TFA και εκλούστηκε με βαθμίδωση συγκέντρωσης MeOH 25-45% σε 4min min

43 Πρότυπα mau Sig=33 nm ECHIN5 11,56 (1) 12,47 15,19 (3) (2) 1Χλωρογενικό οξύ (1) καφεϊκό οξύ (2) και κυναρίνη (3) min mau Καφταρικό οξύ 7,91 7 Κυναρίνη 24,34 Κλασσική Μέθοδος Δείγμα Α Κιχορικό οξύ min στήλη C-18 (25 x 4,6mm) που είχε εξισορροπηθεί με 25:75 MeOH:νερό-,1% σε TFA και εκλούστηκε με βαθμίδωση συγκέντρωσης MeOH 25-45% σε 4min Συμπέρασμα Τα εργαστηριακά εκχυλίσματα περιέχουν: Καφταρικό οξύ Κιχορικό οξύ Κυναρίνη Χλωρογενικό??? Καφεϊκό???

44 LC-MS Υγρή χρωματογραφία Πρότυπα υψηλής απόδοσης MSD (x1,) Καφταρικό Οξύ m: 312 7, Inten.(x1,) min m/z (x1,) Κιχορικό Οξύ 19,82 m: min (x1,) 179. Καφεϊκό Οξύ m:18 13, Inten.(x1,) m/z Inten.(x1,) Negative mode σάρωση στην περιοχή 5-8 amu t/min m/z 367

45 MSD (x1,,) 2.25 TIC 2. LC-MS-Εκχυλίσματα Ε Κλασσική Μέθοδος είγμα Α min Στα εργαστηριακά εκχυλίσματα επιβεβαιώνεται 1. καφταρικό οξύ m: χλωρογενικό οξύ m: κυναρίνη m: εχινακοζίτης m: κιχορικό οξύ m:474 δεν ανιχνεύθηκε καφεϊκό οξύ 2.5.2

46 Εφαρμογές Echinacea purpurea (L.) Monch. Προσδιορισμός των συστατικών των ριζών της E. purpurea που καλλιεργείται στην Ελλάδα και εκχυλίζονται σε σύστημα αλκοόλης:νερού 1. καφταρικό οξύ m: χλωρογενικό οξύ m: κυναρίνη m: εχινακοζίτης m: κιχορικό οξύ m:474 Καφταρικό Οξύ Κιχορικό Οξύ OH OH HO O O OH HO HO O O O OH Εχινακοζίτης Κυναρίνη Χλωρογενικό Οξύ

47 Πλεονεκτήματα HPLC : HPLC κλασικές τεχνικές LC α) έχει πολύ καλύτερη επαναληψιμότητα και ακρίβεια β) έχει δυνατότητες πλήρους αυτοματοποίησης γ) ο διαχωρισμός επιτελείται σε σύντομο χρονικό διάστημα δ) παρέχει μεγαλύτερες δυνατότητες παρασκευαστικής εργασίας κ.α. Μειονέκτημα της HPLC είναι το αυξημένο κόστος συσκευών 47

48 Η HPLC υπερτερεί της GC διότι: HPLC GC α) ) αναλύει απ ευθείας και μη πτητικές ουσίες, β) παρέχει τη δυνατότητα συνδυασμού δύο φάσεων (κινούμενη, στατική) για καλύτερο διαχωρισμό έναντι της μιας (στατικής) φάσης που παρέχει η GC, γ) λειτουργεί σε θερμοκρασίες πολύ χαμηλότερες της GC, οπότε ελαχιστοποιείται η πιθανότητα αποικοδόμησης η απώλειας μέρους του δείγματος, δ) παρέχει δυνατότητα χρήσης ποικιλίας ανιχνευτών, φασματοφωτομετρικών (UV-Vis) ηλεκτροχημικών, μέτρησης δείκτη διάθλασης κ.ά. 48

49 Η HPLC, λόγω των πολλαπλών πλεονεκτημάτων της, χρησιμοποιείται για: 1. το διαχωρισμό των συστατικών πολύπλοκων βιολογικών δειγμάτων 2. τον ποσοτικό προσδιορισμό 3. τον ποιοτικό προσδιορισμό - ταυτοποίηση - αν συνδυαστεί με UV- Vis και MS 4. τον έλεγχο της νοθείας ή καθαρότητας κ.α. Μπορεί να εφαρμοσθεί και σε μη πτητικά συστατικά μεγάλου μοριακού βάρους 49