Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών. Ενόργανη Χημική Ανάλυση

Transcript

1 Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εργαστήριο Χημείας Ενόργανη Χημική Ανάλυση Πανεπιστημιακές Σημειώσεις H 3 C CH 3 O CH 3 Πέτρος Α. Ταραντίλης Χρήστος Σ. Παππάς Αθήνα 2015

2

3 Περιεχόμενα 1. Ενόργανη Ανάλυση Φυτών 1 2. Τεχνικές εκχύλισης και απόσταξης 5 3. Χρωματογραφικές τεχνικές ανάλυσης Αέρια Χρωματογραφία Υγρή Xρωματογραφία Φασματοσκοπικές τεχνικές ανάλυσης Φασματοφωτομετρία Yπεριώδους Oρατού Φασματοσκοπία Yπερύθρου Φασματοσκοπία Raman Φασματοσκοπία Πυρηνικoύ Μαγνητικού Συντονισμού Φασματομετρία μαζών Ασκήσεις Βιβλιογραφία 133

4

5 Ενόργανη Ανάλυση Φυτών O σκοπός αυτής της σειράς μαθημάτων είναι να γίνει μια εισαγωγή και να παρουσιαστούν οι μέχρι τώρα διαθέσιμες μέθοδοι για την ανάλυση των φυτικών συστατικών και να δοθούν λέξεις κλειδιά που χρησιμοποιούνται στη βιβλιογραφία για αυτό το θέμα. Στο πλαίσιο αυτό, δεν κρίνεται σκόπιμο να γίνει εξαντλητική περιγραφή συγκεκριμένων τεχνικών, παρά μόνο να δοθούν οι αρχές και τα βασικότερα σημεία των συνηθέστερα χρησιμοποιούμενων μεθόδων ενόργανης ανάλυσης. Πράγματι, ο σκοπός είναι να περιγραφούν εκείνες οι μέθοδοι που έχουν ευρύτατα χρησιμοποιηθεί και χρησιμοποιούνται, ώστε στη συνέχεια ο φοιτητής-ερευνητής να μπορεί πάρα πολύ γρήγορα να αναπτύξει τις συγκεκριμένες τεχνικές που απαιτούνται για να λύσει τα προβλήματά του. Κάποιες γνώσεις στις απλές εργαστηριακές τεχνικές χημείας θεωρούνται ως υπόβαθρο. Εντούτοις, είναι δυνατό για ένα βοτανικό και κάθε άλλο επιστήμονα που ασχολείται με φυτά και γνωρίζει στοιχειωδώς χημεία, να ασχοληθεί με τη φυτοχημεία, δεδομένου ότι πολλές από τις τεχνικές είναι απλές. Όπως και σε άλλα πρακτικά θέματα, έτσι και εδώ ο φοιτητής πρέπει να εφαρμόσει την πείρα του και να αναπτύξει τις δεξιότητες του. Καμία συγκεκριμένη, γραπτή συνταγή δε δίνεται που να μπορεί να εφαρμοστεί ως έχει στο εργαστήριο. Τα πρακτικά παραδείγματα που θα αναφερθούν μπορούν να επαναληφθούν κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών ασκήσεων. 1

6 Εισαγωγή 1. Ενόργανη Ανάλυση Φυτών 1.1. Εισαγωγή Το αντικείμενο της φυτοχημείας ή χημείας των φυτών, αναπτύσσεται τα τελευταία χρόνια μεταξύ οργανικής χημείας φυσικών προϊόντων και βιοχημείας φυτών. Το αντικείμενο αυτό εμπλέκεται με μεγάλη ποικιλία και αριθμό οργανικών ενώσεων που παράγονται από τα φυτά και ασχολείται με τη χημική δομή τους, τη βιοσύνθεσή τους, την αναλογία τους, το μεταβολισμό τους, τη φυσική κατανομή τους στα φυτά και τη βιολογική τους δράση. Για να μελετηθούν όλα τα παραπάνω, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθούν κατάλληλες μέθοδοι εκχύλισης, απόσταξης, διαχωρισμού, απομόνωσης, καθαρισμού και ταυτοποίησης των διαφορετικών συστατικών που υπάρχουν στα φυτά. Έτσι, για να καταλάβουμε τη χημεία των φυτών, πρέπει να γνωρίζουμε αυτές τις τεχνικές και να τις χρησιμοποιούμε για να λύνουμε τα προβλήματα που προκύπτουν. Μια από τις προκλήσεις φυτοχημείας είναι να πραγματοποιηθεί το σύνολο της παραπάνω διαδικασίας με μικρές ποσότητες φυτικού υλικού. Συχνά, η λύση ενός βιολογικού προβλήματος που αφορά, για παράδειγμα, στη ρύθμιση της αύξησης των φυτών, στη βιοχημεία των αλληλεπιδράσεων φυτών-ζωών ή στην κατανόηση της προέλευσης απολιθωμένων φυτών εξαρτάται από τον προσδιορισμό μιας σειράς ουσιών με πολύπλοκες χημικές δομές, οι οποίες μπορεί να είναι διαθέσιμες για μελέτη σε μικρές ποσότητες στα επίπεδα των μικρογραμμαρίων (μg). Ο αριθμός των ουσιών που παράγονται από τα φυτά είναι μεγάλος. Έχει υπολογιστεί, παραδείγματος χάριν, ότι υπάρχουν τώρα πάνω από 5500 γνωστά αλκαλοειδή και είναι τέτοιο το φαρμακολογικό ενδιαφέρον για τα αλκαλοειδή που συνεχώς ανακαλύπτονται και περιγράφονται νέα. Η πρόοδος στη φυτοχημεία έχει βοηθηθεί πάρα πολύ από την ανάπτυξη των γρήγορων και αξιόπιστων μεθόδων ανάλυσης, όπως οι χρωματογραφικές και φασματοσκοπικές τεχνικές. Αν και ο όρος "φυτό" χρησιμοποιείται εδώ για να αναφερθεί στο βασίλειο των φυτών συνολικά, δίνεται κάποια έμφαση στα ανώτερα φυτά. Μερικές μέθοδοι ανάλυσης μπορούν να εφαρμοστούν και για τους μικροοργανισμούς, αν και η ανάλυση των μικροοργανισμών δεν εξετάζεται λεπτομερώς. Ως γενικός κανόνας, οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στα ανώτερα φυτά για τον προσδιορισμό των αλκαλοειδών, των αμινοξέων των τερπενοειδών κ.α. μπορούν να εφαρμοστούν άμεσα στους μικροοργανισμούς. Σε πολλές περιπτώσεις, η απομόνωση είναι πολύ ευκολότερη. Σε μερικές περιπτώσεις, μπορεί να είναι δυσκολότερη, λόγω της ανθεκτικότητας των κυτταρικών τοιχωμάτων των μικροβίων και της ανάγκης να εφαρμοστεί η μηχανική διάσπασή τους για να απελευθερωθούν τα συστατικά που είναι παρόντα. Τα χημικά συστατικά των φυτών μπορούν να ταξινομηθούν με πολλούς διαφορετικούς τρόπους. Ορισμένοι βασίζονται στη βιοσυνθετική προέλευση, τη διαλυτότητα και την παρουσία ορισμένων βασικών χαρακτηριστικών ομάδων. Οι φαινολικές ενώσεις είναι ουσίες που αναγνωρίζονται εύκολα από την υδρόφιλη φύση τους και από την κοινή προέλευσή τους από το σικιμικό οξύ. Τα τερπενοιδή έχουν κοινό χαρακτηριστικό τη διαλυτότητα τους σε μη πολικούς (λιπόφιλους) διαλύτες και οι πρόδρομες ενώσεις από τις οποίες προέρχονται είναι το μεβαλονικό οξύ και το πυροσφωσφορικό ισοπεντύλιο. Τα οργανικά οξέα, τα λιπίδια και άλλα κατηγορίες ενώσεων προέρχονται βιοσυνθετικά από το οξικό ιόν. Αζωτούχες ενώσεις των φυτών αποτελούν ουσίες με αλκαλική αντίδραση που αναγνωρίζονται από τη θετική αντίδραση είτε με νινυδρίνη είτε με το αντιδραστήριο Dragendorff. 2

7 Ενόργανη Ανάλυση Φυτών Υδατοδιαλυτοί υδατάνθρακες και τα παράγωγά τους και τέλος τα μακρομόρια των φυτών, δηλαδή τα νουκλεϊνικά οξέα, οι πρωτεΐνες και οι πολυσακχαρίτες διαχωρίζονται εύκολα από άλλα συστατικά με κριτήριο τα μεγάλα μοριακά βάρη τους Εφαρμογές Ενώ σήμερα οι φυτοχημικές μέθοδοι ανάλυσης έχουν έναν καθιερωμένο ρόλο σε σχεδόν όλους τους κλάδους της επιστήμης των φυτών, αυτό δεν ήταν πάντα έτσι. Αν και αυτές οι μέθοδοι είναι προφανώς ουσιαστικές σε όλες τις χημικές και βιοχημικές μελέτες, η εφαρμογή τους σε εξειδικευμένους βιολογικούς τομείς έχει αναπτυχθεί περισσότερο τα τελευταία χρόνια. Ακόμη και σε επιστημονικές περιοχές, «μακρινές» από αυτές που σχετίζονται με τη χημεία και το χημικό εργαστήριο, όπως η συστηματική βοτανική, η φυτογεωγραφία, η οικολογία και η παλαιοβοτανική, οι φυτοχημικές μέθοδοι ανάλυσης έχουν καταστεί σημαντικό εργαλείο για την επίλυση ορισμένων τύπων προβλημάτων και θα χρησιμοποιηθούν αναμφισβήτητα με αυξανόμενη συχνότητα στο μέλλον. Η σημασία της εφαρμογής των φυτοχημικών μεθόδων ανάλυσης στη γεωργία, στη διατροφή και τη βιομηχανία τροφίμων και στη φαρμακευτική έρευνα είναι προφανής και μπορεί να θεωρηθεί ως δεδομένη. Οι ακόλουθες εφαρμογές δίνονται απλά για να επεξηγήσουν την αξία των φυτοχημικών τεχνικών σε μερικούς από τους σημαντικότερους κλάδους της επιστήμης φυτών. Φυσιολογία φυτών. Η σημαντικότερη συνεισφορά των φυτοχημικών μελετών στη φυσιολογία φυτών είναι αναμφισβήτητα στην αποσαφήνιση των χημικών δομών, της βιοσυνθετικής προέλευσης και του τρόπου δράσης των φυσικών ρυθμιστών αύξησης (ορμονών). Ως αποτέλεσμα της συνεργασίας κατά τη διάρκεια των ετών μεταξύ των φυσιολόγων φυτών και των φυτοχημικών, αναγνωρίζονται τώρα πέντε κατηγορίες ρυθμιστών αύξησης: αυξίνες, κυτοκινίνες (φυτοκινίνες), αμπσισικό οξύ, γιβερελίνες και το αιθυλένιο. Στην ομάδα των γιβερελινών είναι γνωστός ένας μεγάλος αριθμός δομών (σχεδόν σαράντα), όλες προφανώς με παρόμοιες αυξητικές ιδιότητες. Η ανάγκη για πολύ ακριβείς μεθόδους ανίχνευσης και διάκρισης μεταξύ των γιβερελινών οδήγησε στην ανάπτυξη μεθόδων αέριας χρωματογραφίας συνδυασμένης με φασματομετρία μαζών (GC-MS) για την ανάλυσή τους. Φυτοπαθολογία. Οι φυτοχημικές τεχνικές είναι πρώτιστα σημαντικές στον φυτοπαθολόγο για το χημικό χαρακτηρισμό των φυτοτοξινών (προϊόντων της μικροβιακής σύνθεσης που παράγονται στα ανώτερα φυτά όταν προσβάλλονται από βακτήρια ή μύκητες) και των φυτοαλεξινών (προϊόντων μεταβολισμού των ανωτέρων φυτών που παράγονται σε απάντηση στη μικροβιακή προσβολή). Μια σειρά διαφορετικών χημικών δομών περιλαμβάνεται και στις δύο περιπτώσεις. Οι πιο γνωστές φυτοτοξίνες είναι το lycomarasmin και το φουζαρικό οξύ, παράγωγα αμινοξέων τα οποία απαντώνται στην τομάτα. Άλλες τοξίνες που έχουν απομονωθεί είναι γλυκοπεπτίδια, ναφθακινόνες ή σεσκιτερπένια. Μερικές φυτοτοξίνες είναι χημικά ασταθείς και επομένως πρέπει να ληφθούν ειδικές προφυλάξεις κατά τη διάρκεια της απομόνωσης και της ταυτοποίησής τους. Οι φυτοαλεξίνες έχουν επίσης διαφορετικές δομές, ανάλογα με το φυτό στο οποίο παράγονται. Μπορούν να είναι σεσκιτερπένια, ισοφλαβανοειδή, οξικό οξύ και παράγωγά του ή φαινολικά συστατικά. Οι προ-μολυσματικές ουσίες (δευτερογενή φυσικά συστατικά) θεωρούνται από τους φυτοπαθολόγους σημαντικές στη μετάδοση της ανθεκτικότητας στις ασθένειες των φυτών. Οι φαινολικές ενώσεις, όπως τανίνες, εμπλέκονται κυρίως στο φαινόμενο αυτό. Οικολογία. Δύο ερευνητικοί τομείς όπου τα δευτερογενή συστατικά των φυτών είναι σημαντικά είναι αυτοί που αφορούν στις αλληλεπιδράσεις φυτών-ζώων και φυτών- 3

8 Εισαγωγή φυτών. Τα αναλυτικά προβλήματα και στις δύο περιπτώσεις είναι δύσκολα, λόγω των πολύ περιορισμένων ποσών βιολογικού υλικού που υπάρχουν στη διάθεση του φυτοχημικού. Παραδείγματος χάριν, για τον προσδιορισμό της μεταφοράς των δευτερογενών μεταβολιτών στα έντομα που τρέφονται με φυτά, είναι απαραίτητο να αναλυθούν τα διαφορετικά όργανα του εντόμου για να προσδιοριστεί πού αποθηκεύονται οι ενώσεις, όμως οι αναλύσεις είναι συχνά περίπλοκες και απαιτούν χρόνο. Οι ενώσεις που είναι γνωστές μέχρι τώρα και εμπλέκονται στις αλληλεπιδράσεις φυτών-ζώων είναι πρώτιστα αλκαλοειδή, γλυκοσίδια, στεροειδή ή πτητικά τερπένια. Οι ενώσεις αυτές μπορούν ποικιλοτρόπως να ενεργήσουν ως ελκυστικές ή απωθητικές ουσίες, να έχουν ορμονικά αποτελέσματα στα έντομα ή να παρέχουν στα έντομα ένα χρήσιμο αμυντικό μηχανισμό. Οι αλληλεπιδράσεις φυτών-φυτών σχετίζονται με τις αποκαλούμενες αλληλοπαθητικές ουσίες που ένα φυτό εκκρίνει από τις ρίζες του, προκειμένου να αποτραπεί η αύξηση άλλων φυτών στην εγγύτητά τους. Οι ενώσεις μπορεί να είναι είτε πτητικά τερπένια είτε απλά φαινολικά οξέα, ανάλογα π.χ. με το εάν το φυτό ευδοκιμεί σε ένα ημιτροπικό ή εύκρατο κλίμα. Η φυτοχημική μελέτη της αλληλόπαθειας μπορεί να είναι δύσκολη, δεδομένου ότι απαιτεί αναλύσεις σε φύλλα, ιστούς αλλά και σε εδαφικά δείγματα. Παλαιοβοτανική. Η φυτοχημεία έχει εφαρμοστεί και στη μελέτη των απολιθωμένων φυτών, αλλά φαίνεται λίγο αμφίβολο ότι θα διαδραματίσει έναν αυξανόμενης βαρύτητας ρόλο, παραδείγματος χάριν, στη δοκιμή των διάφορων υποθέσεων για την καταγωγή των φυτών. Μερικά από τα επιτεύγματα των φυτοχημικών τεχνικών περιλαμβάνουν τον προσδιορισμό μερικώς αποικοδομημένων χλωροφυλλών σε κοιτάσματα λιγνίτη 50 εκατομμυρίων ετών και υδατανθράκων και υδρογονανθράκων σε φυτά ηλικίας εκατομμυρίων ετών. Τα συστατικά της γύρης από απολιθωμένα φυτά έχουν αναλυθεί επιτυχώς και έχουν αναγνωριστεί λιπαρά οξέα και τα φαινολικά οξέα στη διαδικασία της αποικοδόμησης τους. Ο προσδιορισμός των τερπενίων σε απολιθωμένες ρητίνες αποτελεί στοιχείο ιδιαίτερου φυτογενετικού ενδιαφέροντος. Γενετική. Στο παρελθόν, η φυτοχημεία έχει συμβάλει στη γενετική των ανωτέρων φυτών στην προσπάθεια ταυτοποίησης χρωστικών ουσιών όπως ανθοκυανών, φλαβονών και καροτενοειδών που εμφανίζονται στους διαφορετικούς γονότυπους των ανθοκομικών φυτών. Οι αναλύσεις έχουν δείξει ότι τα βιοχημικά αποτελέσματα αυτών των γονιδίων έχουν μια απλή βάση και έχουν υποδείξει τα πιθανά βιοχημικά μονοπάτια της σύνθεσης των χρωστικών. Η προέλευση άλλων χημικών ουσιών (αλκαλοειδή, τερπένια, κ.λ.π.) σε φυτά έχει προσδιοριστεί επιτυχώς μέσω της φυτοχημικής ανάλυσης. Συστηματική Βοτανική. Ένας από τους πλέον γρήγορα αναπτυσσόμενους τομείς της φυτοχημείας είναι η χημειοταξινόμηση των φυτών, τομέας που αναπτύσσεται μεταξύ της χημείας και της συστηματικής ταξινόμησης των φυτών. Βασικά, το ενδιαφέρον της χημικής έρευνας εστιάζεται σε συστατικά που απαντούν σε χαμηλά επίπεδα, κυρίως δευτερογενείς μεταβολίτες, αλλά και μακρομόρια και στη χρησιμοποίηση των στοιχείων αυτών στην ταξινόμηση των φυτών. Ίσως η πλέον χρήσιμη κατηγορία ενώσεων για τέτοια μελέτη είναι τα φλαβονοειδή. Οι έρευνες για πολλές άλλες κατηγορίες ενώσεων (αλκαλοειδή, μη πρωτεϊνικά αμινοξέα, τερπένια και ενώσεις θείου) παρέχουν, επίσης, χρήσιμες πληροφορίες για τη συστηματική ταξινόμηση των φυτών. Οι φυτοχημικές μέθοδοι είναι σημαντικές και στον προκαταρκτικό χαρακτηρισμό των φυτών, αλλά και στην περισσότερο λεπτομερή ανάλυση των μεμονωμένων συστατικών τους. Οι χημικές αναλύσεις των ακολουθιών των αμινοξέων στις πρωτεΐνες των φυτών έχουν επίσης εφαρμοστεί στην επίλυση προβλημάτων συστηματικής ταξινόμησης. 4

9 Τεχνικές παραλαβής-αποµόνωσης 2. Τεχνικές παραλαβής- αποµόνωσης 2.1. Φυτικό υλικό - Συντήρηση Οι φυτικοί ιστοί που θα χρησιμοποιηθούν για τη χημική ανάλυση φυτών, για καλλίτερα αποτελέσματα, θα πρέπει να είναι νωποί (φρέσκοι). Τις περισσότερες όμως φορές το φυτό που θέλουμε να μελετήσουμε δεν το έχουμε στα χέρια μας και το φυτικό υλικό θα μας το προμηθεύσει κάποιος που βρίσκεται μακριά μας, όποτε αυτό πρέπει να συντηρηθεί κατάλληλα, ώστε οι δραστικές ενώσεις του να παραμείνουν αναλλοίωτες κατά τη διάρκεια της μεταφοράς και της αποθήκευσής τους. Τα κύτταρα των φυτικών ιστών περιέχουν ένζυμα τα οποία κυρίως μετά τη συλλογή (και θάνατο) του φυτικού υλικού προάγουν διάφορες χημικές αντιδράσεις μεταξύ των κυτταρικών συστατικών, όπως οξειδώσεις ή υδρολύσεις. Σε αυτή την περίπτωση οι φρέσκοι φυτικοί ιστοί πρέπει να συντηρηθούν. Σκοπός της κατεργασίας συντήρησης είναι ο περιορισμός των διεργασιών αυτών στο μικρότερο δυνατό βαθμό. Η συνηθέστερη μέθοδος συντήρησης φυτικών υλικών είναι η ξήρανση ή αφυδάτωση. Οι ενζυμικές διεργασίες γίνονται σε υδατικό περιβάλλον, οπότε η γρήγορη απομάκρυνση του νερού από τα κύτταρα προλαμβάνει σε μεγάλο ποσοστό την αποικοδόμηση των κυτταρικών συστατικών, ενώ επιπλέον ελαττώνονται οι κίνδυνοι ανάπτυξης μικροοργανισμών (π.χ. μύκητες). Το ζωντανό φυτικό υλικό έχει μεγάλη περιεκτικότητα σε νερό: Τα φύλλα περιέχουν νερό σε ποσοστό 60-90%, οι ρίζες και τα ριζώματα 70-80% και ο ξυλώδης ιστός 40-50%. Τα σπέρματα έχουν τη χαμηλότερη περιεκτικότητα σε νερό συνήθως 5-10%, γι αυτό και διατρέχουν μικρότερο κίνδυνο αποικοδόμησης συγκριτικά με τα άλλα όργανα των φυτών. Για την αναστολή των ενζυμικών διεργασιών, το νερό πρέπει να ελαττωθεί στο 10%. Η διαδικασία αυτή πρέπει να γίνει γρήγορα και απαιτεί αφ ενός υψηλές θερμοκρασίες, αφ ετέρου αποτελεσματική απομάκρυνση των υδρατμών. Οι κυριότερες μέθοδοι ξήρανσης γι αυτή την περίπτωση είναι: Α. ξήρανση με έκθεση στον αέρα, Β. ξήρανση με θέρμανση, Γ. λυοφιλίωση (κρυοαφυδάτωση). Η ξήρανση του φυτικού υλικού είναι απαραίτητο να γίνει κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες για την αποφυγή χημικών αλλαγών των συστατικών κατά τη διάρκεια της. Γι αυτό η ξήρανση θα πρέπει να γίνει όσο το δυνατό πιο γρήγορα, χωρίς να χρησιμοποιούνται υψηλές θερμοκρασίες. Η αύξηση της θερμοκρασίας επιταχύνει τη διαδικασία της ξήρανσης, πολλές φορές όμως τα συστατικά των φυτικών ιστών που μελετάμε είναι ευαίσθητα στη θέρμανση. Για το λόγο αυτό, η επιλογή της κατάλληλης θερμοκρασίας πρέπει να γίνεται λαμβάνοντας υπόψη τόσο την αναγκαιότητα της γρήγορης ξήρανσης όσο και την ευαισθησία των συστατικών. Α. Η ξήρανση με έκθεση στον αέρα είναι ο πιο απλός τρόπος. Το υλικό απλώνεται σε λεπτές στρώσεις με καλό αερισμό, ώστε να διευκολύνεται η διαδικασία της ξήρανσης. Η έκθεση απ ευθείας στον ήλιο ή η παραμονή στη σκιά επιλέγεται με κριτήριο την ευαισθησία των συστατικών στο φως. Όταν η ξήρανση γίνεται στη σκιά, σε δωμάτια, πολλές φορές υποβοηθείται με αύξηση της θερμοκρασίας και τη δημιουργία ρεύματος αέρα για την απομάκρυνση των υδρατμών. Β. Η ξήρανση σε ξηραντήρες είναι ο καλλίτερος τρόπος. Υπάρχουν διάφοροι τύποι ξηραντήρων όπως οι απλοί φούρνοι, όπως λέγονται, και οι ξηραντήρες τύπου σήραγγας (τούνελ). Και στις δυο περιπτώσεις το φυτικό υλικό απλώνεται σε λεπτές στρώσεις πάνω σε δίσκους και τοποθετείται στον ξηραντήρα. Στην περίπτωση του 5

10 Τεχνικές παραλαβής-απομόνωσης ξηραντήρα τύπου σήραγγας, οι δίσκοι διέρχονται μέσα από αυτή. Μέσα στη σήραγγα, με αντίθετη κατεύθυνση προς την κίνηση των δίσκων, κινείται ρεύμα θερμού αέρα. Εφόσον η κίνηση γίνεται αντίθετα προς το ρεύμα του θερμού αέρα, το φυτικό υλικό έρχεται σε επαφή με ξηρό αέρα, ενώ ο υγρός αέρας ωθείται με εξαεριστήρες προς την αντίθετη κατεύθυνση. Η θερμοκρασία ξήρανσης διατηρείται στους ο C όταν ξηραίνονται λεπτά φυτικά υλικά, όπως φύλλα, και στους ο C για μέρη του φυτού που ξηραίνονται δύσκολα, όπως ρίζες και φλοιοί. Επιπλέον, για ευκολότερη ξήρανση, οι ρίζες μεγάλου όγκου συνήθως διαχωρίζονται ή κόβονται σε λεπτότερα τμήματα. Γ. Η λυοφιλίωση (κρυοαφυδάτωση) είναι η πιο ήπια μέθοδος. Το φυτικό υλικό καταψύχεται, έτσι το νερό περνά από υγρή σε στερεή κατάσταση (πάγος), και τοποθετείται σε κατάλληλη συσκευή που λειτουργεί κάτω από κενό, η επιφάνεια της οποίας διατηρείται σε θερμοκρασία 60 έως -70 ο C. Στη συνέχεια ο πάγος εξαχνώνεται (περνά στην αέρια κατάσταση, υδρατμοί) χωρίς να περάσει από την υγρή. Έτσι οι υδρατμοί από το κατεψυγμένο φυτικό υλικό μεταφέρονται γρήγορα στην ψυχρή επιφάνεια. Η μέθοδος αυτή απαιτεί σχετικά πολύπλοκο εξοπλισμό και κοστίζει πολύ περισσότερο από τη μέθοδο ξήρανσης με ρεύμα θερμού αέρα. Γι αυτό δεν χρησιμοποιείται ως μέθοδος ρουτίνας αλλά σε περιπτώσεις ξήρανσης πολύτιμων και θερμοευαίσθητων φυτικών υλικών όταν μελετώνται πεπτίδια, πρωτεΐνες κ.λπ. Τέλος οι αποξηραμένοι ιστοί πρέπει να διατηρηθούν σε πλαστικές σακούλες και σε καλές συνθήκες μέχρι να αναλυθούν Τεχνικές Εκχύλισης Η παραλαβή των συστατικών από το αποξηραμένο φυτικό υλικό γίνεται με εκχύλιση. Η εκχύλιση είναι μια από τις πιο συνηθισμένες τεχνικές διαχωρισμού και βασίζεται στην ισορροπία κατανομής μιας ουσίας μεταξύ δύο φάσεων που πρακτικά δεν αναμειγνύονται ή αναμειγνύονται ελάχιστα μεταξύ τους. Οι πιο συνηθισμένες τεχνικές εκχύλισης είναι οι εξής: 1. Εκχύλιση στερεών με υγρό (extraction). Βασίζεται στην διαλυτοποίηση ενός ή περισσότερων συστατικών μείγματος στερεών σε κατάλληλο διαλύτη. 2. Εκχύλιση υγρού ή στερεού σώματος διαλυμένου σε υγρό από άλλο υγρό (liquidliquid extraction), δηλαδή η εκχύλιση ενός διαλύματος ουσιών με ένα υγρό. 3. Εκχύλιση στερεής φάσης (solid phase extraction). Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό ουσιών από υγρά δείγματα, με διέλευση της υγρής φάσης μέσα από στερεό προσροφητικό υλικό, οπότε οι προς διαχωρισμό ουσίες προσροφούνται στη στερεή φάση. Ανεξάρτητα πιο τεχνική εκχύλισης θα χρησιμοποιήσουμε, πρώτα από όλα προσοχή πρέπει να δοθεί ώστε όλοι οι διαλύτες να είναι καθαροί και ιδιαίτερα οι αιθέρες να περιέχουν αντιοξειδωτικά, όπως βουτυλο-υδροξυ-τολουένιο (ΒΗΤ). O ακριβής τρόπος εκχύλισης εξαρτάται από τη δομή τη φυτικού υλικού, το νερό που περιέχει και το είδος των συστατικών που πρόκειται να απομονωθούν. Η αλκοόλη σε κάθε περίπτωση είναι ένας καλός διαλύτης για μια προκαταρκτική εκχύλιση Εκχύλιση στερεών με υγρό (Extraction). Η εκχύλιση στερεών με υγρό αποτελεί την πιο συνηθισμένο και απλή μέθοδο παραλαβής των συστατικών από φυτικά υλικά. Α. Απλή εκχύλιση σε «θερμοκρασία δωματίου» ή «εν θερμώ». Το φυτικό υλικό εκχυλίζεται με εμβάπτιση και ανάδευση σε «θερμοκρασία δωματίου» ή με θέρμανση με τη βοήθεια θερμαινόμενου μαγνητικού αναδευτήρα. Αυτό είναι αναγκαίο μόνο όταν 6

11 Τεχνικές παραλαβής-αποµόνωσης επιχειρείται εξαντλητική εκχύλιση, και ακολουθεί διήθηση η φυγοκέντρηση για την παραλαβή του εκχυλίσματος το οποίο στη συνέχεια, συνήθως, συμπυκνώνεται σε περιστροφικό συμπυκνωτή (rotary evaporator) σε θερμοκρασία ο C. Όταν απομονώνονται συστατικά από πράσινους φυτικούς ιστούς (π.χ. χλωροφύλλη) με αλκοόλη, η εκχύλιση έχει φτάσει στο τέλος της όταν μετά από διαδοχικές εκχυλίσεις η αλκοόλη της εκχύλισης είναι άχρωμη. Σχήμα2.1. Σύστημα απλής εκχύλιση. Β) Εκχύλιση σε συσκευή Soxhlet. Εκτός από την απλή τεχνική εκχύλισης για την παραλαβή οργανικών ουσιών από αποξηραμένους φυτικούς ιστούς χρησιμοποιείται ευρύτατα η τεχνική τη συνεχούς εκχύλισης σε ειδικούς εκχυλιστήρες, συνηθέστερος των οποίων είναι η συσκευή Soxhlet. Στη συσκευή Soxhlet το δείγμα που θέλουμε να εκχυλίσουμε μπαίνει στην κάψα α, ενώ ο διαλύτης στη σφαιρική φιάλη Α. Η φιάλη Α θερμαίνεται και οι ατμοί του διαλύτη μέσα από τον σωλήνα Β, φτάνουν στον ψυκτήρα Γ. Εκεί υγροποιούνται και πέφτοντας μέσα στην κάψα α διαλύουν μέρος των συστατικών του δείγματος. Όταν ο διαλύτης που υγροποιείται γεμίσει τον εκχυλιστήρα Β με σιφωνισμό ρέει πίσω στη φιάλη Α παρασύροντας μαζί του τις εκχυλιζόμενες ουσίες. Ο διαλύτης στη φιάλη Α, ξαναεξατμίζεται ενώ οι εκχυλισθείσες ουσίες Σχήμα 2.2. Συσκευή Soxhlet. παραμένουν. Έτσι η διαδικασία συνεχίζεται μέχρι πλήρους εκχυλίσεως των συστατικών. Οι διαλύτες που συνήθως χρησιμοποιούνται είναι: α) αιθέρας, πετρελαϊκός αιθέρας, και χλωροφόρμιο για να παραληφθούν λιπίδια και τερπενοειδή και β) αλκοόλη και οξικός αιθυλεστέρας για να παραληφθούν περισσότερο πολικές ουσίες. Στη συνέχεια όλα τα παραπάνω εκχυλίσματα συμπυκνώνονται μέχρι ξηρού χρησιμοποιώντας περιστροφικό συμπυκνωτή (rotary evaporator) σε θερμοκρασία ο C Εκχύλιση υγρού ή στερεού σώματος διαλυμένου σε υγρό από άλλο υγρό (Liquid-Liquid Extraction). Στην τεχνική αυτή, ορισμένος όγκος του προς εκχύλιση διαλύματος φέρεται σε επαφή με ορισμένο όγκο εκχυλιστικού μέσου μέσα σε διαχωριστική χοάνη και αναταράσσεται για να αναμειχθούν οι δύο φάσεις. Μετά την ανάμειξη περιμένουμε μέχρις ότου αποκατασταθεί η ισορροπία και διαχωριστούν οι δύο φάσεις. Στην συνέχεια οι δύο φάσεις παραλαμβάνονται χωριστά, συνήθως με εκροή της κάτω στοιβάδας από το κάτω το κάτω μέρος της διαχωριστικής χοάνης. Στην εκχύλιση υγρού ή στερεού σώματος διαλυμένου σε υγρό από άλλο υγρό επιδιώκεται ο διαχωρισμός δύο ουσιών με βάση τη διαφορετική Σχήμα 2.3. Εκχυλιστική χοάνη κατανομή τους σε σύστημα δύο διαλυτών, η οποία εκφράζεται από τον συντελεστή κατανομής Κ D (Distribution Coefficient ) της ουσίας. 7

12 Τεχνικές παραλαβής-απομόνωσης όπου K D C C C 2 συγκέντρωση της ουσίας στον εκχυλιστή διαλύτη και C 1 συγκέντρωση της ουσίας στον εκχυλιζόμενο διαλύτη Εκχύλιση στερεής φάσης (solid phase extraction). Στην τεχνική αυτή, που αποτελεί σήμερα μια από τις καλύτερες τεχνικές προκατεργασίας δειγμάτων, χρησιμοποιείται στερεό προσροφητικό υλικό, που είναι συνήθως διοξείδιο του πυριτίου με χημικά συνδεδεμένες ομάδες, ώστε να αποκτά διάφορες προσροφητικές ιδιότητες. Ανάλογα με τις δραστικές ομάδες, που φέρει το προσροφητικό υλικό, μπορούν να γίνουν διάφορα είδη εκχυλίσεων, όπως πολικές, μη πολικές, ομοιοπολικές, κατιονανταλλακτικές και ανιοανταλλακτικές εκχυλίσεις. Τα προσροφητικά υλικά είναι μέσα σε κλειστά προσυσκευασμένα μικροφυσίγγια μιας χρήσεως (sep-pak) ή είναι στερεωμένα σε πλαστικές θήκες συρίγγων (bon elut). Το C18 είναι το περισσότερο υδροφοβικό υλικό πλήρωσης διαθέσιμο για SPE με βάση το πυρίτιο. Επίσης, αποτελεί το πιο δημοφιλές υλικό πλήρωσης στηλών SPE, λόγω της Εικόνα 2.1. Στήλη SPE εξαιρετικής συγκρατητικής του φύσης για μη πολικές ενώσεις. Θεωρείται γενικά ότι έχει μικρή διαχωριστική δυνατότητα, εφόσον συγκρατεί τους περισσότερους οργανικούς μεταβολίτες από υδατικά διαλύματα και αυτό συχνά αποτελεί πλεονέκτημα όταν οι ενώσεις που μας ενδιαφέρουν διαφέρουν σημαντικά στη δομή Εκχύλιση υποβοηθούμενη από υπερήχους (Ultra Sound Assisted Extraction, USE). Στη μέθοδο αυτή το φυτικό υλικό μαζί με ανάλογη ποσότητα διαλύτη τοποθετείται σε υδατόλουτρο υπερήχων, που λειτουργεί σε συγκεκριμένη συχνότητα. Η εκχύλιση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία μικρότερη των 30 ο C και ελέγχεται ώστε να διατηρείται σταθερή. Μερικά λεπτά λειτουργία των υπερήχων αρκούν για να ολοκληρωθεί η ποσοτική παραλαβή των συστατικών Υπέρηχοι Υπέρηχοι είναι τα ακουστικά κύματα τα οποία διαδίδονται με συχνότητα πάνω από 16 khz και τα οποία δεν προκαλούν το αίσθημα της ακοής στο ανθρώπινο αυτί. Το ανώτατο όριο δεν καθορίζεται αυστηρά. Είναι της τάξης των 5 ΜHz όταν η διάδοση γίνεται μέσα σε αέρια και 500 ΜHz όταν η διάδοση γίνεται στα υγρά και τα στερεά. Η διάδοση των κυμάτων γίνεται με διαδοχικά πυκνώματα και αραιώματα. Παράγονται είτε από ειδικές ακίδες είτε από λουτρά υπερήχων. Οι υπέρηχοι εκτός των άλλων εφαρμογών (π.χ. στη μέτρηση αποστάσεων, ιατρική) χρησιμοποιούνται και στη Χημεία δημιουργώντας τον κλάδο της υπερηχοχημείας. Οι εφαρμογές των υπερήχων στη Χημεία έχουν ξεκινήσει από το Οι πρώτες εφαρμογές των υπερήχων στα χημικά εργαστήρια έγιναν στον κλάδο της μεταλλουργίας όπως και στον καθαρισμό χημικών συσκευών. Στη συνέχεια εφαρμόστηκαν στη χημική σύνθεση (οργανική, οργανομεταλλική και ανόργανη) και στη χημεία των πολυμερών (σύνθεση και αποικοδόμησή τους). 8

13 Τεχνικές παραλαβής-αποµόνωσης Τρόπος δράσης κατά την εκχύλιση Με τη βοήθεια του εναλλασσομένου ηλεκτρικού ρεύματος η ηχητική πηγή διεγείρεται, δηλαδή ταλαντώνεται με κάποια συχνότητα. Η κινητική ενέργεια της ταλάντωσης μεταφέρεται στα γειτονικά μόρια του υλικού με τα οποία έρχεται σε επαφή η πηγή. Στην περίπτωση που το υλικό αυτό είναι υγρό τα μόρια του αρχίζουν να ταλαντώνονται. Με τον τρόπο αυτό διαδίδεται το ηχητικό κύμα του οποίου η διεύθυνση διάδοσης είναι ίδια με τη διεύθυνση ταλάντωσης των μορίων του υλικού μέσου. Η ταλάντωση των μορίων οδηγεί στο σχηματισμό διαδοχικών πυκνωμάτων (μείωση των αποστάσεων μεταξύ των μορίων) και αραιωμάτων (αύξηση των αποστάσεων). Κατά την ταλάντωση ενός μορίου, όσο η απομάκρυνσή του από τη θέση ισορροπίας αυξάνει, αυξάνει και η δύναμη επαναφοράς και επομένως η δύναμη που το απομακρύνει από τη θέση ισορροπίας μειώνεται και μηδενίζεται όταν το μόριο του υγρού αποκτήσει απομάκρυνση όσο είναι το πλάτος της ταλάντωσης. Η δύναμη που ασκείται σε μια στοιχειώδη επιφάνεια του υγρού και τείνει να απομακρύνει μια στοιχειώδη μάζα υγρού από τη θέση ισορροπίας προς το εμβαδόν της επιφάνειας αυτής λέγεται ακουστική πίεση (Ρ α ) και προκαλεί μεταβολή στην πίεση του υγρού. Η εξίσωση της ακουστικής πίεσης είναι: Ρ α =Ρ Α.sin2πft, όπου f η συχνότητα του ηχητικού κύματος. Αποκτά μέγιστη τιμή όταν η απομάκρυνση των μορίων από τη θέση ισορροπίας γίνει ελάχιστη και αντιστρόφως. Εξαιτίας του φαινομένου έχουμε μεταβολή της πίεσης του υγρού. Επομένως σε ένα αραίωμα η πίεση είναι ίση με P h Ρ α, όπου P h η υδροστατική πίεση. Εάν σε ένα αραίωμα η Ρ α είναι αρκετά μεγάλη τότε οι διαμοριακές έλξεις μπορούν να υπερνικηθούν και οι αποστάσεις μεταξύ των μορίων του υγρού να υπερβούν μια κρίσιμη τιμή (R). Τότε δημιουργούνται στο υγρό φυσαλίδες. Όσο μάλιστα αυξάνει η Ρ α το μέγεθος των φυσαλίδων αυξάνει. Όταν όμως το αραίωμα αρχίζει να μετατρέπεται σε πύκνωμα η ολική πίεση που ασκείται στη φυσαλίδα γίνεται P h + Ρ α. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την πολύ μεγάλη αύξηση της πίεσης με αποτέλεσμα τη κατάρρευση των φυσαλίδων αυτών (Εικόνες 2.1 και 2.2). Εικόνα 2.2. Φυσαλίδα κατά τη διάρκεια της κατάρρευσης. Εικόνα 2.3. Η διαδικασία δημιουργίας και κατάρρευσης των φυσαλίδων. Η αναταραχή που ακολουθεί την κατάρρευση επηρεάζει πάρα πολύ όλη τη περιοχή έτσι ώστε να παρατηρείται πολύ μεγάλη διάβρωση ακόμη και σε σκληρά μέταλλα όπως το τιτάνιο. Όταν το στερεό είναι φυτικός ιστός τότε η διάβρωση στην οποία υπόκειται αφ ενός μεν βοηθά τη διείσδυση του διαλύτη και επομένως την καλλίτερη εκχύλιση αφ ετέρου αποικοδομεί σε αρκετό βαθμό τα πολυμερή που περιέχει με αποτέλεσμα την πιο εύκολη εκχύλισή τους. Όταν σαν διαλύτης χρησιμοποιείται νερό σχηματίζονται ελεύθερες ρίζες.η,.ο,.οη,.ο 2 Η οι οποίες βοηθούν τις οξειδώσεις. Έχει εκτιμηθεί ότι για να σχηματιστούν φυσαλίδες στο νερό απαιτείται, θεωρητικά, ακουστική πίεση περίπου 1500 atm. Πειραματικά βρέθηκε ότι μπορεί να είναι και μικρότερη των 20 atm. 9

14 Τεχνικές παραλαβής-απομόνωσης Αυτό ερμηνεύθηκε με την θεωρία των «ασθενών σημείων» που υπάρχουν μέσα στο νερό (ή γενικότερα σε ένα υγρό). Τα ασθενή αυτά σημεία οφείλονται σε μόρια αερίων τα οποία είναι διαλυμένα στο υγρό. Φαίνεται ότι τα μόρια αυτά των αερίων επειδή παρεμβάλλονται μεταξύ των μορίων του υγρού μειώνουν τις διαμοριακές έλξεις των μορίων του, διευκολύνοντας έτσι το σχηματισμό φυσαλίδων. Η άποψη αυτή επιβεβαιώθηκε όταν με απαέρωση του υγρού η απαιτούμενη, για τη δημιουργία φυσαλίδων, ακουστική πίεση, αυξήθηκε. Πρέπει να σημειωθεί ότι τα μόρια των αερίων που είναι διαλυμένα στο υγρό δεν οφείλονται μόνο στο διαλυμένο ατμοσφαιρικό αέρα αλλά και σε ατμούς του ίδιου του υγρού. Όμως τα μόρια των διαλυμένων αερίων δρουν και με έναν επιπλέον τρόπο, όταν μέσα στο υγρό βρεθεί ένα στερεό. Ορισμένα από τα μόρια των αερίων παγιδεύονται σε κοιλότητες ή σε χαραμάδες του στερεού (Σχήμα 2.2). Όταν η ακουστική πίεση ασκηθεί επάνω τους με κατεύθυνση προς το στερεό, τότε δημιουργείται μία φυσαλίδα παγιδεύοντας μέσα μόρια αερίου η οποία όταν η ακουστική πίεση αλλάξει κατεύθυνση η φυσαλίδα αυτή αρχίζει και γίνεται τμήμα σφαιρικής επιφάνειας της οποίας η επιφάνεια επαφής με το στερεό μειώνεται όσο αυξάνει η ακουστική πίεση. Όταν η ακουστική πίεση αποκτήσει μια κρίσιμη τιμή η φυσαλίδα αποκόπτεται από την επιφάνεια του στερεού. Η κρίσιμη αυτή τιμή όταν πρόκειται για νερό είναι ίση με 1,78 atm. Επομένως οι φυσαλίδες που δημιουργούνται μέσα σε ένα υγρό μπορεί να είναι κενές ή γεμάτες από αέρια συστατικά. Σχήμα 2.4. ημιουργία φυσαλίδων στην επιφάνεια στερεού υπό την επίδραση υπερήχων σε σύστημα στερεού-υγρού Παράγοντες που επηρεάζουν τη δράση των υπερήχων κατά την εκχύλιση Οι παράγοντες που επηρεάζουν τη δράση των υπερήχων κατά την διάρκεια της εκχύλισης είναι η συχνότητά τους, οι ιδιότητες του μέσου μετάδοσης των υπερήχων (δηλ. του υγρού), η θερμοκρασία του υγρού, η περιεκτικότητα του υγρού σε αέρια, κ.α. Όταν η συχνότητα αυξάνει πάρα πολύ, η ένταση παραγωγής των κοιλοτήτων μειώνεται. Αυτό συμβαίνει διότι η εναλλαγή των πυκνωμάτων και αραιωμάτων γίνεται πάρα πολύ γρήγορα με αποτέλεσμα να μην ολοκληρώνεται ο σχηματισμός των φυσαλίδων. Επίσης έχει παρατηρηθεί ότι όταν αυξάνεται η συχνότητα, η ακουστική πίεση μειώνεται με αποτέλεσμα τη μείωση του ρυθμού παραγωγής των φυσαλίδων. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες του υγρού μέσα στο οποίο διαδίδεται το ηχητικό κύμα επιδρά στο σχηματισμό των φυσαλίδων. Σε υγρά τα οποία παρουσιάζουν μεγάλο ιξώδες, είναι παχύρρευστα και παρουσιάζουν μεγάλη επιφανειακή τάση, ο σχηματισμός 10

15 Τεχνικές παραλαβής-αποµόνωσης φυσαλίδων είναι προβληματικός. Επίσης η τάση των ατμών του στη θερμοκρασία στην οποία διαδίδεται το ηχητικό κύμα παίζει σημαντικό ρόλο με την παρατήρηση ότι η μεγάλη τάση ατμών ευνοεί το σχηματισμό φυσαλίδων. Ένας άλλος παράγοντας που επηρεάζει το σχηματισμό φυσαλίδων είναι η θερμοκρασία του μέσου διάδοσης. Γενικά η αύξηση της θερμοκρασίας ευνοεί το σχηματισμό φυσαλίδων σε χαμηλότερη ακουστική πίεση. Αυτό επιτυγχάνεται κύρια επειδή αυξάνει η τάση των ατμών του υγρού. Όμως έχει παρατηρηθεί ότι τα αποτελέσματα είναι φτωχότερα. Συμπερασματικά φαίνεται ότι η δράση των υπερήχων είναι περισσότερο αποτελεσματική σε χαμηλές θερμοκρασίες σε σχετικά πτητικά μέσα ή αν χρησιμοποιηθούν μέσα με χαμηλή τάση ατμών. Στην αύξηση του αριθμού των φυσαλίδων μπορεί να συνεισφέρει η περιεκτικότητα του υγρού μέσου σε αέρια, των οποίων η επίδραση έχει μελετηθεί παραπάνω, ενώ η επίδραση υψηλής εξωτερικής πίεσης αυξάνει γενικά την αναγκαία ακουστική πίεση για τη δημιουργία φυσαλίδων όμως από την άλλη μεριά ευνοεί τη μεγαλύτερη διαλυτότητα αερίων τα οποία με τη σειρά τους ευνοούν την αύξηση φυσαλίδων. Επίσης τα αποτελέσματα του ηχητικού κύματος ευνοεί και η αυξημένη ένταση του ηχητικού κύματος. Εικόνα 2.4. Λουτρά Υπερήχων Σχήμα 2.6. ιεγέρτης Υπερήχων 2.4. Εκχύλιση υποβοηθούμενη από μικροκύματα (Micro-Wave Assisted Extraction, MWAE) Η εκχύλιση και η ανάκτηση οργανικών συστατικών από ένα φυτικό υλικό είναι συχνά το πιο αργό και πιο επιρρεπές σε λάθη βήμα μιας αναλυτικής μεθόδου. Οι συμβατικές τεχνικές εκχύλισης έχουν δύο κύρια μειονεκτήματα. Πρώτον, ο μεγάλος όγκος του οργανικού διαλύτη που απαιτείται, ο οποίος μπορεί να οδηγήσει σε μόλυνση και σε "απώλειες" συστατικών του δείγματος λόγω εξάτμισης κατά τη διάρκεια της συμπύκνωσής τους. εύτερον, για να επιτευχθεί μια εξαντλητική εξαγωγή μπορεί να απαιτηθούν αρκετές ώρες στην ημέρα. Με την ανάπτυξη αναλυτικών οργάνων με χαμηλά όρια ανίχνευσης ουσιών έγινε αναγκαία η ανάπτυξη και η εφαρμογή ταχύτατων και ασφαλών διαδικασιών παραλαβής οργανικών συστατικών από τα φυτικά υλικά. Η υποβοηθούμενη από μικροκύματα εκχύλιση (Microwave Assisted Extraction, MAE) αποτελεί μια χρήσιμη τεχνική για την παραλαβή οργανικών συστατικών από φυτικά υλικά. Η εφαρμογή των μικροκυμάτων επιταχύνει την κινητική της εκχύλισης συνεπεία των γρήγορων διαδικασιών θέρμανσης του δείγματος και της δυνατότητας εφαρμογής της σε ένα ευρύ φάσμα διαφορετικών δειγμάτων και με τη χρήση διαφόρων πολικοτήτων διαλυτών. 11

16 Τεχνικές παραλαβής-απομόνωσης Η υποβοηθούμενη από μικροκύματα εκχύλιση (MAE) υιοθετήθηκε πρώτη φορά για να προάγει τη διάλυση των μετάλλων από χώμα και βιολογικά δείγματα. Οι διαδικασίες θέρμανσης που συνδέθηκαν με την MAE θεωρήθηκαν "πάρα πολύ έντονες" για τα οργανικά μόρια. Η MAE δεν χρησιμοποιήθηκε για την εξαγωγή των οργανικών ουσιών μέχρι Το 1986 δημοσιεύτηκαν εφαρμογές που χρησιμοποιούν έναν συμβατικό φούρνο μικροκυμάτων στην εξαγωγή των οργανικών ενώσεων από φυτικά υλικά, σπόρους, τρόφιμα κ.α. και αναφέρθηκε ότι ήταν αποδοτικότερη από τις κλασσικές μεθόδους (θέρμανσης σε συσκευή Soxhlet) για πολικές ενώσεις. Το 1990, χρησιμοποιήθηκε η ενέργεια μικροκυμάτων για να εξαγάγουν οργανοχλωριομένα φυτοφάρμακα από τα δείγματα φυτικών υπολειμμάτων. Η ανάκτηση ήταν σχεδόν 100% για την κυρία ένωση και χωρίς καμία υποβάθμιση ως αποτέλεσμα της έκθεσης στην ενέργεια μικροκυμάτων. Επίσης αναφέρθηκαν τα μικροκύματα ως τεχνική παραλαβής φυσικών προϊόντων φυτικά υλικά. Η ενέργεια των μικροκυμάτων είναι μια μη ιονίζουσα μορφή ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας η οποία προκαλεί τη μοριακή κίνηση λόγω της μετανάστευση των ιόντων και της περιστροφής των διπόλων, αλλά δεν προκαλεί αλλαγές στη μοριακή δομή. Η ενέργεια μικροκυμάτων έχει ένα φάσμα συχνότητας από 300 έως MHz. Η πιο συνηθέστερα χρησιμοποιημένη συχνότητα για τα εμπορικά όργανα μικροκυμάτων είναι 2450 MHz, η οποία αντιστοιχεί σε μια ενεργειακή παραγωγή Watts. Τα ίδια μήκη κύματος χρησιμοποιούνται για τα ραντάρ και τις τηλεπικοινωνίες. Για να μην παρεμποδίζουν αυτές τις χρήσεις, οι βιομηχανικές και οικιακές χρήσεις μικροκυμάτων απαιτείται να λειτουργούν είτε σε 2450 MHz είτε 900 MHz. ύο παράμετροι καθορίζουν τις διηλεκτρικές ιδιότητες των υλικών. Ο πρώτος, είναι ε, η διηλεκτρική σταθερά, που περιγράφει την πολωσιμότητα του μορίου σε ένα ηλεκτρικό πεδίο. Ο διηλεκτρικός παράγοντας απώλειας ε, μετρά την αποδοτικότητα με την οποία η απορροφημένη ενέργεια μικροκυμάτων μπορεί να μετατραπεί στη θερμότητα. Η αναλογία των δύο όρων είναι ο παράγοντας διάχυσης της θερμότητας δ. Οι φυσικές παράμετροι που πρέπει να ληφθούν υπόψη κατά την επιλογή των μικροκυμάτων για να χρησιμοποιηθούν σε μια εκχύλιση είναι: η διαλυτότητα, η διηλεκτρική σταθερά, και ο παράγοντας διάχυσης της θερμότητας. Ο πρώτος παράγοντας είναι να επιλεχτεί ένας διαλύτης στον οποίο τα συστατικά που θέλουμε να παραλάβουμε είναι διαλυτά. Ανάλογα με τη φύση του δείγματος (φυτικό υλικό) και τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ του δείγματος και των συστατικών πρέπει να επιλεγεί ένας διαλύτης που να διαλύει περισσότερο την επιθυμητή ουσία από τις άλλες που υπάρχουν μαζί της. Συνήθως, όσο υψηλότερη είναι η διηλεκτρική σταθερά του διαλύτη τόσο υψηλότερος ο βαθμός απορρόφησης μικροκυμάτων (πίνακας 1). Πίνακας Φυσικές σταθερές για τους συνήθως χρησιμοποιημένους διαλύτες ιαλύτης ιηλεκτρική ιηλεκτρικός δ Χ 10 4 Σταθερά (ε ) Παράγοντας Απώλειας (ε ) Ύδωρ 80,00 12, Ακετόνη 20,70 11, Μεθανόλη 23,90 15, Αιθανόλη 7,00 1, Εξάνιο 1,88 0, ,10 Οξικός αιθυλεστέρας 6,02 3,

17 Τεχνικές παραλαβής-αποµόνωσης Κατά τη διάρκεια της υποβοηθούμενης από μικροκύματα εκχύλισης (MAE), ένας πολικός διαλύτης με μια υψηλή διηλεκτρική σταθερά περιβάλλει το φυτικό υλικό. Τα μόρια του διαλύτη απορροφούν την ενέργεια των μικροκυμάτων και πολώνονται. Όταν η επίδραση των μικροκυμάτων σταματήσει αποκαθίσταται η θερμικά προκληθείσα αναταραχή. Αυτή η διαδικασία θερμαίνει όλο τον όγκο του διαλύτη και μπορεί να προκαλέσει εντοπισμένα αποτελέσματα υπερθέρμανσης μόνο στις περιοχές του φυτικού υλικού που περιέχουν νερό. Τελικά αποκαθίσταται θερμική ισορροπία σε όλο το σύστημα επειδή η θερμότητα μεταφέρεται από το διαλύτη και τις περιοχές του φυτικού υλικού που υπερθερμαίνεται μέσω των συγκρούσεων έτσι ώστε η ενέργεια να διανέμεται ομοιόμορφα σε όλο το σύστημα. ιαταγμένη ευθυγράμμιση των διπόλων Σχήμα 2.7. Η επίδραση των μικροκυμάτων στο νερό. Θερμικά προκληθείσα αναταραχή Η τελική θερμοκρασία που αναπτύσσεται κατά τη διάρκεια της υποβοηθούμενη από μικροκύματα εκχύλισης είναι ανάλογη προς την ισχύ (Watt), το χρόνο, και την αρχική θερμοκρασία είναι αντιστρόφως ανάλογη προς την ικανότητα απορρόφησης θερμότητας από το διαλύτη, και τη μάζα του δείγματος σε γραμμάρια. Όπου, το Κ είναι ο παράγοντας μετατροπής των θερμίδων (calories) σε Joules, Cp είναι η θερμοχωρητικότητα του διαλύτη, το m αντιπροσωπεύει τη μάζα του φυτικού υλικού, Pabs είναι η ισχύς (ενέργεια) που απορροφάται, το t είναι ο χρόνος εφαρμογής των μικροκυμάτων, και το Ti είναι η αρχική θερμοκρασία. Ο ρυθμός με τον οποίο ο διαλύτης θερμαίνεται εξαρτάται από τρεις παράγοντες: την ιοντική αγωγιμότητα, το ιξώδες, και το διηλεκτρικό παράγοντα απώλειας. Όταν χρησιμοποιούνται οργανικοί διαλύτες η συμβολή της ιοντικής αγωγιμότητας είναι αμελητέα. Εντούτοις, τα περισσότερα γεωργικής προέλευσης υλικά περιέχουν σε μικρά ποσοστά ιόντα (άλατα). Γενικά ο ρυθμός θέρμανσης αυξάνεται με την αύξηση της συγκέντρωση των ιόντων στο δείγμα. Το ιξώδες έχει επιπτώσεις στη δυνατότητα απορρόφησης της ενέργεια των μικροκυμάτων επειδή έχει επιπτώσεις στη μοριακή περιστροφή. Όταν τα μόρια "κλειδώνονται στη θέση τους" λόγω του ιξώδους τους, η μοριακή κινητικότητα μειώνεται καθιστώντας έτσι δύσκολο να ευθυγραμμιστούν μέσα στο πεδίο επίδρασης των μικροκυμάτων. Αυτό επηρεάζει αρνητικά τη θερμότητα που παράγεται μέσω της περιστροφής των διπόλων. Και εξετάζοντας φυσικά τον παράγοντα διάχυσης της 13

18 Τεχνικές παραλαβής-απομόνωσης θερμότητας (δ), όσο υψηλότερος είναι αυτός ο παράγοντας, τόσο μεγαλύτερος είναι ο ρυθμός θέρμανσης (γρηγορότερα θα αυξηθεί η θερμοκρασία) του διαλύτη. Πίνακας Ρυθμός θέρμανσης και ιξώδες ιαλύτης Σημείο βρασμού ( o C) Ιξώδες (cp, 25 o C) Ρυθμός θέρμανσης (K/sec) Ακετόνη Οξικός αιθυλεστέρας Αιθανόλη Μεθανόλη 65 l Ύδωρ Εξάνιο Οι παράγοντες που επηρεάζουν την εκχύλιση ενός συστατικού από το φυτικό υλικό με ΜΑΕ είναι η διαλυτότητα του συστατικού στο διαλύτη, η κινητική της εκχύλισης και η δύναμη με την οποία συγκρατείται στο φυτικό υπόστρωμα. Ο πρώτος παράγοντας είναι προφανής. Για τα δείγματα, με μια ομοιογενή σύνθεση και το περιορισμένο πορώδες, το ποσοστό εξαγωγής καθορίζεται από τη διάχυση του συστατικού μέσω της επιφάνειας του φυτικού υλικού. Υψηλότερες θερμοκρασίες και διόγκωση του φυτικού υλικού αύξηση του ποσοστού διάχυσης και της κινητικής της εκχύλισης. Για δείγματα ξύλου το ποσοστό εξαγωγής του συστατικού εξαρτάται από τη διάχυση του μέσα από τους πόρους, μετανάστευση από μια περιοχή προσρόφησης σε άλλη, και μετατόπιση των μορίων του συστατικού στις περιοχές προσρόφησης από το διαλυτή. Αυτήν την περίοδο, υπάρχουν δύο τύποι συστημάτων μικροκυμάτων που είναι εμπορικά διαθέσιμοι: ένα κλειστό σύστημα και ένα ανοικτό σύστημα Οι κύριες παράμετροι που εξετάζονται όταν χρησιμοποιείται κλειστό σύστημα μικροκυμάτων είναι: ο διαλύτης, θερμοκρασία, πίεση, ισχύς και το μήκος των μικροκυμάτων και η διάρκεια (χρόνο) της εκχύλισης. Υπάρχουν μερικές ανησυχίες ασφάλειας όταν υιοθετείται ένα κλειστό σύστημα μικροκυμάτων, παραδείγματος χάριν, η δυνατότητα έκρηξης. Τα ανοικτά συστήματα μικροκυμάτων είναι απλά και συνήθως πιο ασφαλή. Οι παράμετροι βελτιστοποίησης περιορίζονται: στο διαλύτη, στην ισχύ που εφαρμόζονται και στο χρόνο. Και στις δύο περιπτώσεις, η ισχύς και ο χρόνος εξαρτώνται από τον τύπο του φυτικού υλικού και των συστατικών που θέλουμε να εκχυλίσουμε. Υπάρχουν πλεονεκτήματα και στους δύο τύπους οργάνων. Σχήμα 2.8. Κλειστό και ανοικτό σύστημα ΜΑΕ Τα κλειστά συστήματα ΜΑΕ λειτουργούν κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας. Η θερμοκρασία του διαλύτη επιτρέπεται να φτάσει επάνω από το σημείο βρασμού του. Συνήθως, η μέγιστη επιτρεπόμενη θερμοκρασία είναι 200 o C και η μέγιστη πίεση είναι 120 psi. Στα κλειστά συστήματα MAE οι απώλειες λόγω εξάτμισης 14

19 Τεχνικές παραλαβής-αποµόνωσης ελαχιστοποιούνται επειδή τα δείγματα ψύχονται πριν βγουν από αυτά. Επίσης, στα περισσότερα κλειστά συστήματα MAE μπορούμε να εκχυλίζουμε συγχρόνως μέχρι 12 ή 24 δείγματα. Τα ανοικτά συστήματα ΜΑΕ λειτουργούν σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης και σε θερμοκρασίες ± 5 ο C του σημείου βρασμού των διαλυτών. Η διαδικασία θέρμανσης είναι αποδοτικότερη επειδή όλη η ενέργεια στρέφεται σε ένα δείγμα αντί του διαχωρισμού μεταξύ διάφορων δειγμάτων. Όταν η θερμοκρασία του διαλύτη πλησιάζει το σημείο βρασμού, ο διαλύτης ατμοποιείται, ανέρχεται σε έναν ψυκτήρα-συμπυκνωτή όπου συμπυκνώνεται και επιστρέφει στον εκχυλιστήρα. Τα κύρια χαρακτηριστικά γνωρίσματα του ανοικτού συστήματος ΜΑΕ είναι τα ακόλουθα: η ευκολία της προσθήκης αντιδραστηρίων, η αποδοτική θέρμανση διαλυτών-φυτικού υλικού και η ταχύτητα Mικροεκχύλιση στερεάς φάσης (Solid-Phase Microextraction, SPME) Εισαγωγή Η μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (Solid-Phase Microextraction, SPME) αποτελεί μια σχετικά νέα τεχνική και παρουσιάστηκε από τον Pawliszyn το Αναπτύχθηκε προκειμένου να αντιμετωπιστεί η ανάγκη για πιο γρήγορη προετοιμασία των δειγμάτων και εφαρμόζεται για την ανάλυση πτητικών και ημιπτητικών, πολικών και μη πολικών ουσιών σε διάφορα δείγματα. Η τεχνική SΡΜΕ αφορά στην απορρόφηση των ουσιών που πρόκειται να αναλυθούν από ίνα επικαλυμμένη με κατάλληλο προσροφητικό υλικό, η οποία βυθίζεται μέσα στο εξεταζόμενο δείγμα (συνήθως στην αέρια φάση πάνω από αυτό). Μετά την αποκατάσταση της ισορροπίας, η ίνα απομακρύνεται από το δείγμα και το περιεχόμενο της εισάγεται με σύριγγα συνήθως σε έναν αέριο χρωματογράφο. Επειδή η SΡΜΕ είναι εύκολη και απλή στην χρήση της, σχετικά φτηνή και δεν προϋποθέτει τη χρήση οργανικών διαλυτών, αποκτά όλο και μεγαλύτερο ενδιαφέρον. Συγκεκριμένα, διαχωρίζει τις ουσίες που πρόκειται να αναλυθούν από το δείγμα ή τον υπερκείμενο αυτού χώρο με τη βοήθεια του πολυμερούς φιλμ της ίνας βελτιστοποιώντας την εκχύλιση τους και συνδυάζεται με αέριο χρωματογράφο για την θερμική απελευθέρωση, τον διαχωρισμό και τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό των ουσιών. Σχήμα 2.9. Σχήμα

20 Τεχνικές παραλαβής-απομόνωσης Η διαδικασία της SΡΜΕ Η αναλυτική διαδικασία αποτελείται από τη δειγματοληψία, την προετοιμασία του δείγματος, την παραλαβή των ουσιών, το διαχωρισμό τους, τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό τους, την στατιστική επεξεργασία και την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων. Κάθε βήμα είναι καθοριστικό για την απόκτηση σωστών αποτελεσμάτων. Η δειγματοληψία θα πρέπει να περιλαμβάνει δείγματα τα οποία να προσδιορίζουν το αντικείμενο της έρευνας και στα οποία να υπάρχουν οι απαιτούμενες ποσότητες των ουσιών που μας ενδιαφέρουν. Στη συνέχεια, το δείγμα είναι απαραίτητο να προετοιμαστεί ώστε να απομονωθούν από την επιφάνεια του τα συστατικά που μας ενδιαφέρουν. Μετά την απομόνωση του μίγματος των συστατικών που θέλουμε, αυτά διαχωρίζονται με την αέρια χρωματογραφία. Αν η αέρια χρωματογραφία συνδυάζεται με φασματομετρία μαζών γίνεται ποιοτικός προσδιορισμός των συστατικών του δείγματος. Κατά τον ποσοτικό προσδιορισμό, καθορίζεται η ακριβής ποσότητα των συστατικών. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων αποσκοπεί στον υπολογισμό της συγκεντρώσεως των συστατικών του μίγματος στο αρχικό δείγμα που αναλύεται. Η SΡΜΕ είναι μια πολυφασική διαδικασία ισορροπίας. Συχνά, το σύστημα εκχύλισης είναι περίπλοκο καθώς το δείγμα αποτελείται από μία υγρή φάση, όπου βρίσκονται υπό αιώρηση στερεά σωματίδια με ποικίλες αντιδράσεις απορρόφησης με τις αναλυόμενες ουσίες, και μία αέρια φάση στο χώρο πάνω από το δείγμα. Κατά την ανάλυση, υπάρχουν διάφορα προβλήματα τα οποία πρέπει να αντιμετωπιστούν όπως είναι οι διεργασίες βιοαποδόμησης καθώς και το σημαντικό ποσό των αναλυόμενων ουσιών που προσροφώνται από τα τοιχώματα του φιαλιδίου που περιέχει το δείγμα. Για την απλοποίηση του συστήματος, θα πρέπει κατ' αρχήν να ληφθούν υπόψη μόνο τρεις φάσεις: (α) η στερεή φάση, η επένδυση της ίνας, (β) η υγρή φάση, το νερό που περιέχει το αρχικό δείγμα και (γ) η αέρια φάση, ο υπερκείμενος χώρος της υγρής φάσης. Κατά την εκχύλιση, οι ουσίες κινούνται μεταξύ των τριών φάσεων μέχρι να αποκατασταθεί η ισορροπία. Η διαδικασία της εκχύλισης έχει ως εξής: με την ίνα μη εκτεθειμένη, τρυπάμε με τη βελόνα το σεπτό του φιαλιδίου που περιέχει το δείγμα. Πιέζοντας το έμβολο της σύριγγας, η ίνα εκτίθεται στο υγρό δείγμα ή στον υπερκείμενο αυτού χώρο. Σε 2 με 30 min, η ίνα απορροφά τις ουσίες. Η ίνα παύει να εκτίθεται και αποσύρουμε τη βελόνα από το φιαλίδιο. Στη συνέχεια, η σύριγγα τοποθετείται στην σημείο εισαγωγής του δείγματος στο αέριο χρωματογράφο. H ποσότητα των ουσιών που απομονώνονται, είναι ανεξάρτητη από τη θέση της ίνας στο σύστημα (η ίνα μπορεί να τοποθετηθεί τόσο στο χώρο πάνω από το δείγμα, όσο και μέσα στο διάλυμα), και εξαρτάται από το πάχος της επένδυσης Παράγοντες που επηρεάζουν τη SPME Οι παράγοντες που επηρεάζουν την απομόνωση των ουσιών από το δείγμα είναι η θερμοκρασία, η προσθήκη κάποιου άλατος, το ph, η παρουσία οργανικού διαλύτη και η ανάδευση. Η επίδραση της θερμοκρασίας θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη, όταν συμβαίνουν διακυμάνσεις σε περιπτώσεις που το δείγμα επεξεργάζεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος ή όταν χρησιμοποιείται θέρμανση για να αυξήσει το ρυθμό εκχύλισης. Ο ρυθμό της εκχύλισης συστατικών από υγρά διαλύματα μπορεί να αυξηθεί ή να μειωθεί με την προσθήκη άλατος και την κατάλληλη προσαρμογή του ph, ανάλογα με τη συγκέντρωση του άλατος, η οποία καθορίζεται πειραματικά. Η πολικότητα των συστατικών του δείγματος, η πολικότητα του υλικού επικάλυψης της ίνας και η θερμική διαστολή της, αποτελούν παράγοντες που επηρεάζουν το είδος 16

21 Τεχνικές παραλαβής-αποµόνωσης και την ποσότητα των συστατικών που εκχυλίζονται, χωρίς όμως να έχει καθοριστεί επακριβώς ο τρόπος επίδρασης τους. Τέλος η ανάδευση του δείγματος αυξάνει το ρυθμό εκχύλισης των συστατικών Επιλογή του κατάλληλου τύπου ίνας Ο τύπος της ίνας που θα χρησιμοποιηθεί, δηλαδή το υλικό κατασκευής και η διάμετρος της, καθορίζεται ανάλογα με το μοριακό βάρος (ΜΒ) και την πολικότητα των ουσιών του δείγματος. Οι ίνες που χρησιμοποιούνται ανά περίπτωση φαίνονται στον παρακάτω πίνακα: ουσία αέριες ουσίες με μικρό ΜΒ (30<ΜΒ<225) τύπος ίνας Carboxen/polydimethylsiloxane για πτητικές ουσίες (60<ΜΒ<275) polydimethylsiloxane για πτητικές ουσίες, αμίνες και νιτροαρωματικές ουσίες (50<ΜΒ<300) για πολικές ημιπτητικές ουσίες (80<ΜΒ<300) για μη πολικές ουσίες μεγάλου ΜΒ (125<ΜΒ<600) για μη πολικές ουσίες ημιπτητικές (80<ΜΒ<500) για αλκοόλες και πολικές ουσίες (40<ΜΒ<275) για αρώματα (πτητικά και ημιπτητικά, C3- C20) (40<ΜΒ<275) για αρώματα (40<ΜΒ<275) polydimethylsiloxane/divinylbenzene polyacrylate polydimethylsiloxane polydimethylsiloxane carboxen/divinylbenzene divinylbenzene/carboxen/ polydimethylsiloxane divinylbenzene/carboxen/ polydimethylsiloxane Εφαρμογές της SΡΜΕ Μερικές τυπικές εφαρμογές της SΡΜΕ είναι: 1. οι αναλύσεις αρωμάτων σε τρόφιμα, 2. οι αναλύσεις σε δείγματα από εμπρησμούς και εκρήξεις, 3. οι τοξικολογικές αναλύσεις για αλκοόλ στο αίμα ή για ναρκωτικά στα ούρα και τον ορό του αίματος, 4. οι αναλύσεις αρωμάτων. 5. η ανάλυση απορρυπαντικών και άλλες βιομηχανικές εφαρμογές, 6. η ανάλυση για ίχνη προσμίξεων σε πολυμερή και στερεά δείγματα, 7. οι περιβαλλοντικές αναλύσεις σε δείγματα νερού, 17

22 Τεχνικές παραλαβής-απομόνωσης Παρόλο που οι συσκευές της SΡΜΕ έχουν χρησιμοποιηθεί κυρίως σε εφαρμογές στο εργαστήριο, οι ερευνητές σήμερα προσανατολίζονται στην χρήση της για εξ αποστάσεως παρακολούθηση, ειδικά για εφαρμογές στην ιατρική, σε περιβαλλοντικά προβλήματα καθώς και σε αναλύσεις σχετικές με την υγιεινή στις βιομηχανίες. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των συσκευών που χρησιμοποιούνται στο ύπαιθρο είναι η ικανότητα τους να διατηρούν τις ουσίες που εκχύλισαν μέσα στο κάλυμμα της ίνας. Ο απλούστερος και πιο πρακτικός τρόπος να επιτευχθεί αυτός ο στόχος, είναι να στεγανοποιηθεί το τέλος της βελόνας με ένα πολυμερές. Επιπλέον, ο χρόνος διατήρησης των συστατικών μπορεί να παραταθεί με διατήρηση σε χαμηλή θερμοκρασία. Ωστόσο, το πολυμερισμένο υλικό με το οποίο καλύπτεται η ίνα μπορεί να προκαλέσει την απώλεια ουσιών. Γι αυτό, μία καλύτερη προσέγγιση είναι η χρήση μεταλλικών καλυμμάτων. Τα συστήματα SPME που θα σχεδιάζονται στο μέλλον για εφαρμογές στο ύπαιθρο θα είναι πιο προσεκτικά κατασκευασμένες σε σχέση με αυτά που χρησιμοποιούνται σήμερα στα εργαστήρια και θα μοιάζουν περισσότερο με "ράβδους" και "στυλό" παρά με σύριγγες. Τρόφιμα και φάρμακα Η SΡΜΕ μπορεί να χρησιμοποιηθεί προκειμένου να προσδιορίσει αρώματα σε λάδια, αναψυκτικά, καρυκεύματα και γλυκά. Τα δείγματα διαλύονται σε νερό και οι ουσίες μπορούν να εκχυλιστούν απευθείας από τον χώρο πάνω από το προϊόν. Η βοτανική προέλευση του μελιού αποτελεί ένα σημαντικό χαρακτηριστικό για την ποιότητα αυτού. Μέλια που προέρχονται από ένα είδος φυτού έχουν χαρακτηριστικό άρωμα το οποίο κυρίως προέρχεται από την πηγή του νέκταρος και υποδηλώνεται την παρουσία των πτητικών συστατικών. Ωστόσο, η βοτανική προέλευση του μελιού καθορίζεται από την γυρεοσκοπική ανάλυση, τις φυσικοχημικές παραμέτρους και τις οργανοληπτικές ιδιότητες. Τα κύρια πτητικά συστατικά του μελιού ανήκουν σε κατηγορίες όπως είναι τα ισοπρενοειδή τα τερπένια, τα αρωματικά παράγωγα κ.λ.π. Ορισμένες από τις ουσίες αυτές έχουν περιγραφεί ως χαρακτηριστικά της βοτανικής πηγής ενώ άλλα συστατικά, όπως κάποιες αλκοόλες, διακλαδισμένες αλδεϋδες και παράγωγα της φουράλης, μπορεί να σχετίζονται με το μικροβιακό περιεχόμενο και τις διαδικασίες συσκευασίας και αποθήκευσης. Η ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση των πτητικών συστατικών ενός πολύπλοκου μίγματος όπως είναι το μέλι είναι δύσκολη. Η εφαρμογή της SΡΜΕ στην περίπτωση του μελιού στοχεύει στον καθορισμό των κύριων πτητικών συστατικών του και στην εκτίμηση της πιθανότητας να χρησιμοποιηθεί αυτή η τεχνική για τον χαρακτηρισμό της βοτανικής του προέλευσης. Η SΡΜΕ έχει εφαρμοστεί στην ανάλυση των πτητικών συστατικών που συνθέτουν το άρωμα του κρασιού. Συγκεκριμένα, έχουν γίνει αναλύσεις με τη χρησιμοποίηση διαφόρων τύπων ίνας και έχουν ελεγχθεί διάφορες παράμετροι όπως είναι ο χρόνος προετοιμασίας του δείγματος, η ανάδευση, ο όγκος του χώρου πάνω από το δείγμα, η συγκέντρωση της αλκοόλης, ο χρόνος και η θερμοκρασία της εκχύλισης. Με τον τρόπο αυτό, επιδιώχθηκε η βελτιστοποίηση των συνθηκών ώστε η εκχύλιση να μπορεί να γίνει όσο το δυνατόν πιο αποτελεσματική. Ως παράδειγμα, μπορεί να αναφερθεί το γεγονός πως η τάση που έχουν οι εκχυλιζόμενες ουσίες να περάσουν στο χώρο πάνω από το δείγμα και επομένως και στην ίνα μπορεί να επιταχυνθεί με ανάδευση του υγρού δείγματος. Ένα πρωτοποριακό χαρακτηριστικό της SΡΜΕ για εφαρμογή της στην ανάλυση τροφίμων και των φαρμάκων είναι το γεγονός πως σε ορισμένες περιπτώσεις έχει την ικανότητα να απομονώνει ουσίες από προϊόντα χωρίς να χρειάζεται να ανοιχθεί η συσκευασία τους. Για παράδειγμα, αρωματικές ουσίες που υπάρχουν στο κρασί, μπορούν να ελεγχθούν με εισαγωγή της ίνας, μέσω του φελλού του μπουκαλιού, στο κενό που υπάρχει πάνω από το κρασί. Επειδή λαμβάνεται ένα μικρό ποσό του αρώματος, η σύνθεση του προϊόντος δεν αλλοιώνεται. Άλλη μία ενδιαφέρουσα εφαρμογή της στην ανάλυση τροφίμων είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός της καφεΐνης σε αναψυκτικά και αφεψήματα όπως είναι το τσάι. Τέλος, η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση ζιζανιοκτόνων σε δείγματα κρασιού. 18