Tetrahymena. Βιοχηµεία ΙΙ / Εργαστήριο Φροντιστήριο Ν. Γαλανοπούλου

Transcript

1 Tetrahymena Βιοχηµεία ΙΙ / Εργαστήριο Φροντιστήριο Ν. Γαλανοπούλου

2 Kατάταξη µονοκύτταρων οργανισµών Πρώτιστα Προκαρυωτικά: βακτήρια (ευ- και αρχαιο-) κυανοβακτήρια Ευκαρυωτικά: φύκη µύκητες πρωτόζωα: σαρκοµαστιγοφόρα σπορόζωα κνιδόσπορα βλεφαριδωτά

3 Εξελικτική πορεία των οργανισµών Tetrahymena

4 Tetrahymena σχηµατισµός φαγοσώµατος και σύντηξη µε λυσόσωµα (LY)

5 H Tetrahymena διαθέτει δυο είδη πυρήνων, τον µικρο- (MIC) και τον µακρο-πυρήνα (MAC) έχει χρησιµοποιηθεί DAPI για τη χρώση του πυρήνα και αντίσωµα για την τουµπουλίνη, συνδεδεµένο µε GFP, για τη χρώση των βλεφαρίδων

6 Η Tetrahymena πολλαπλασιάζεται µε µίτωση Αν στην καλλιέργεια υπάρχουν κύτταρα δυο συζευκτικών τύπων (mating types), γίνεται ανταλλαγή γενετικού υλικού (κυτοκίνηση)

7 Καλλιέργειες κυττάρων Σε σχέση µε τη σύσταση του θρεπτικού µέσου -καλλιέργειες σε χηµικώς καθορισµένο µέσο -καλλιέργειες σε µη χηµικώς καθορισµένο µέσο -καλλιέργειες σε βιολογικό µέσο Σε σχέση µε το µέσο που αναπτύσσονται -υγρές καλλιέργειες -στερεές ή ηµιστερεές Καλλιέργειες συνεχούς ροής Συγχρονισµένες καλλιέργειες

8 Σύσταση χηµικώς καθορισµένου µέσου για την Tetrahymena Αµινοξέα: Αργινίνη, ιστιδίνη, λευκίνη, ισολευκίνη, λυσίνη, µεθειονίνη, φαινυλαλανίνη, θρεονίνη, θρυπτοφάνη, βαλίνη Άλλες αζωτούχες ενώσεις: Γουανίνη, ουρακίλη ή κυτιδίνη ή κυτιδυλικό οξύ Βιταµίνες: Θειαµίνη, ριβοφλαβίνη,πυριδοξάλη,παντοθενικό οξύ, φολικό οξύ, λιποϊκό οξύ, νιασίνη Ανόργανα συστατικά: Φωσφορικά, Mg, K, Cu

9 Σύσταση µη χηµικώς καθορισµένου µέσου για την Tetrahymena 2% πρωτεόζη-πεπτόνη (πηγή άνθρακα και αζώτου) 0,5% γλυκόζη (πηγή άνθρακα) 0,2% εκχύλισµα ζύµης (πηγή βιταµινών και ανόργανων αλάτων) 1% (v/v) διάλυµα σιδήρου

10 Μέτρηση κυττάρων (I) Με αιµατοκυττόµετρο σε οπτικό µικροσκόπιο Με µετρητή Coulter Ζύγιση υγρού ή ξηρού βάρους των κυττάρων Με βιοχηµικό προσδιορισµό (π.χ. ολικής πρωτεΐνης) Μέτρηση οπτικής πυκνότητας (συνήθως στα 600 nm) Μέτρηση αποικιών

11 Μέτρηση κυττάρων (II) αιµατοκυτόµετρο καµπύλη ανάπτυξης (διάγραµµα φάσεων) καλλιέργειας βακτηρίων

12 Οµογενοποίηση κυττάρων oµογενοποιητής Potter-Elvehjem οµογενοποίηση ήπατος ποντικού

13 Φυγοκέντρηση F c =M ω 2 x F β =Μ ω 2 χ V ρ F f =f dx/dt (όταν αποκατασταθεί σταθερή ταχύτητα) F c =F β +F f M ω 2 x=μ ω 2 χ V ρ+f dx/dt dx/dt=m ω 2 x (1- V ρ)/f x=απόσταση από τον άξονα περιστροφής V=µερικός ειδικός όγκος ρ=πυκνότητα διαλύµατος f=συντελεστής τριβής

14 έλεγχος της ταυτότητας των κλασµάτων µπορεί να γίνει µικροσκοπικά, συνήθως όµως γίνεται µε οδηγά ένζυµα Κλασµάτωση µε διαφορική φυγοκέντρηση (Stryer I, σελ. 86)

15 η κλασµάτωση, στην περίπτωση αυτή, στηρίζεται στη διαφορά πυκνότητας των υποκυτταρικών σωµατιδίων Κλασµάτωση σε κλίσεις πυκνότητας (Stryer I, σελ. 95)

16 Σχήµα κλασµάτωσης κυττάρων Tetrahymena οµογενοποίηση µε υπέρηχους (σε παγωµένο διάλυµα NaCl 0,9%) οµογενοποίηµα 1000g, 10min η ταχύτητα περιστροφής εκφράζεται σε πολλαπλάσια του g ή σε rpm ίζηµα Ι πυρήνες, ακέραια κύτταρα, τµήµατα κυττάρων (debris), κυστίδια προερχόµενα από την πλασµατική µεµβράνη υπερκείµενο Ι 15000g, 20min ίζηµα ΙΙ µιτοχόνδρια λυσοσώµατα* (χλωροπλάστες**) υπερκείµενο ΙΙ g, 1h *µιτοχόνδρια και λυσοσώµατα διαχωρίζονται σε κλίσεις σακχαρόζης **όταν κλασµατώνονται φυτικά κύτταρα ίζηµα ΙΙΙ κλάσµα µικροσωµάτων= κυστίδια προερχόµενα από το ενδοπλασµατικό δίκτυο υπερκείµενο ΙΙΙ διαλυτό κυτόπλασµα ριβοσώµατα

17 Οδηγά ένζυµα Oδηγά ένζυµα (γενικότερα, markers) που χρησιµοποιούνται για τον έλεγχο της κλασµάτωσης Πυρήνες: DNA Μιτοχόνδρια: Ηλεκτρική αφυδρογονάση, κυτοχρωµική οξειδάση Λυσοσώµατα: Όξινη φωσφατάση, όξινη DNAάση Πλασµατική µεµβράνη: Νa + /K + ΑΤΡάση Συσκευή Golgi: πυροφωσφατάση της θειαµίνης Υπεροξυσώµατα: καταλάση Χλωροπλάστες: χλωροφύλλη Ενδοπλασµατικό δίκτυο (κλάσµα µικροσωµάτων): φωσφατάση της 6-φωσφογλυκόζης Κυτόπλασµα: γαλακτική αφυδρογονάση (LDH), αφυδρογονάση του 6-φωσφογλυκονικού οξέος

18 Προσδιορισµός δραστικότητας γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH, οδηγό ένζυµο κυτοπλάσµατος) από το ρυθµό αύξησης του NADH* (φωτοµέτρηση στα 340 nm) Stryer I, σελ. 85 *ή µείωσης, όταν ως υπόστρωµα χρησιµοποιείται πυροσταφυλικό

19 Βιβλιογραφία Φυλλάδιο εργαστηρίου J.M. Clark, R.L. Switzer (1992) Πειραµατική Βιοχηµεία (ενότητα I, πείραµα 5), Πανεπιστηµιακές Εκδόσεις Κρήτης J.M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer (2001) Βιοχηµεία (τόµος Ι), Πανεπιστηµιακές Εκδόσεις Κρήτης D.L. Hill (1972) The biochemistry and physiology of Tetrahymena, Academic Press D.J. Asai and J.D. Forney, eds. (1999) Tetrahymena thermophila, Methods Cell Biol. 62,