µυκόριζες ϖου είναι µια µορφή συµβίωσης µεταξύ µυκήτων και φυτών όϖου οι µύκητες ϖροµηθεύουν τα φυτά µε ανόργανα στοιχεία, ενώ τα φυτά ϖροµηθεύουν του

Transcript

1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Βιολογική καταϖολέµηση των ασθενειών Ο όρος βιολογική καταϖολέµηση χρησιµοϖοιείται σε διάφορους τοµείς της εφαρµοσµένης βιολογίας όϖως στην εντοµολογία και την φυτοϖαθολογία. Όσον αφορά στη φυτοϖαθολογία, βιολογική καταϖολέµηση είναι η χρήση µικροβιακών ανταγωνιστών (µυκήτων, βακτηρίων, ιών), καθώς και ϖροϊόντων ϖου ϖαράγονται αϖό αυτούς για την ϖαρεµϖόδιση της εξέλιξης µιας ασθένειας. Οι µικροοργανισµοί αυτοί ονοµάζονται βιολογικοί ϖαράγοντες (Pal & Mc Spadden 2006). 1.1 Μορφές αλληλεϖίδρασης µεταξύ των οργανισµών στην ϖεριοχή της ριζόσφαιρας Σύµφωνα µε τον Hiltner (1904), ως ριζόσφαιρα ορίζεται η ϖεριοχή η οϖοία εϖηρεάζεται αϖό το ριζικό σύστηµα των φυτών. Οι ρίζες εκκρίνουν ουσίες ϖου είναι ϖλούσιες σε ενώσεις άνθρακα, όϖως διάφορα οργανικά οξέα, σάκχαρα, αµινοξέα κ.α. και δηµιουργούν ένα θρεϖτικά ϖλούσιο ϖεριβάλλον, το οϖοίο διεγείρει διάφορες µικροβιακές δραστηριότητες (Vancura & Hovadik 1965). Στη ριζόσφαιρα αναϖτύσσονται αλληλεϖιδράσεις µεταξύ των φυτών και ϖοικίλων άλλων οργανισµών. Υϖάρχουν διάφορες µορφές αλληλεϖίδρασης και ϖροκειµένου δύο οργανισµοί να αλληλεϖιδράσουν ϖρέϖει να έρθουν σε εϖαφή είτε άµεσα είτε έµµεσα. O Odum (1953) ϖρότεινε τις εξής µορφές αλληλεϖιδράσεων µεταξύ των οργανισµών: αµοιβαιότητα (mutualism), ϖαρασιτισµό (parasitism), ανταγωνισµό (competition), οµοσιτισµό (commensalism) και ουδετερότητα (neutralism). Όσον αφορά στη βιολογική καταϖολέµηση, σ αυτή συµβάλουν κατά κύριο λόγο οι τρεις ϖρώτες µορφές. Αµοιβαιότητα είναι η µορφή συµβίωσης µεταξύ δύο ή ϖερισσοτέρων οργανισµών όϖου όλοι οι οργανισµοί ωφελούνται αϖό αυτή τη συµβίωση. Αυτός ο τύϖος αλληλεϖίδρασης συµβάλλει στη βιολογική καταϖολέµηση ενισχύοντας τα φυτά είτε µε την ϖαροχή θρεϖτικών στοιχείων είτε διεγείροντας µηχανισµούς άµυνας των φυτών, όϖως για ϖαράδειγµα οι 1

2 µυκόριζες ϖου είναι µια µορφή συµβίωσης µεταξύ µυκήτων και φυτών όϖου οι µύκητες ϖροµηθεύουν τα φυτά µε ανόργανα στοιχεία, ενώ τα φυτά ϖροµηθεύουν τους µύκητες µε οργανικές ενώσεις ( Smith & Read 1997). Ο ανταγωνισµός έχει αρνητική εϖίϖτωση είτε στον έναν είτε και στους δύο οργανισµούς και έχει ως αϖοτέλεσµα τη µείωση της ανάϖτυξης ή της δραστηριότητας των εµϖλεκοµένων οργανισµών. Όσον αφορά στη βιολογική καταϖολέµηση, ανταγωνισµός υϖάρχει όταν µη ϖαθογόνοι οργανισµοί ανταγωνίζονται τους ϖαθογόνους για θρεϖτικά στοιχεία στην ϖεριοχή της ριζόσφαιρας. Παράδειγµα αϖοτελεί ο ανταγωνισµός µεταξύ βακτηρίων του γένους Pseudomonas και φυτοϖαθογόνων µυκήτων στη ριζόσφαιρα για ενώσεις του σιδήρου (σιδηροφόροι) (Buyer & Leong 1986, Loper & Buyer 1991), καθώς και µεταξύ ϖαθογόνων και µη φυλών του Fusarium oxysporum για ενώσεις άνθρακα (Alabouvete et al 1998). Παρασιτισµός είναι η µορφή συµβίωσης όϖου ένας οργανισµός (ϖαράσιτο) ευνοείται, ενώ ο άλλος ζηµιώνεται (ξενιστής). Η δράση ϖολλών υϖερϖαράσιτων µυκήτων (µυκήτων ϖου ϖαρασιτούν ϖαθογόνους µικροοργανισµούς) έχει χρησιµοϖοιηθεί στη βιολογική καταϖολέµηση ϖ.χ. µύκητες του γένους Trichoderma και Clonostachys (Papavizas 1985). Η αναγνώριση των φυτών αϖό τους µικροοργανισµούς θεωρείται ότι είναι ο ϖρωταρχικός ϖαράγοντας - κλειδί στην ανταϖόκριση των φυτών στους µικροοργανισµούς. Η αναγνώριση µϖορεί να εϖέλθει είτε µέσω φυσικής αλληλεϖίδρασης (όϖως µέσω µαστιγίων, τριχιδίων κ.α.) είτε µέσω µηνυµάτων µέσω µικρών µορίων (Lugtenberg et al 2002). Ένας αϖό τους ϖιο ενδιαφέροντες µηχανισµούς ϖου χρησιµοϖοιείται αϖό τα ϖαθογόνα βακτήρια ϖροκειµένου να εϖιτεθούν στα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι ένα εξειδικευµένο ϖρωτεϊνικό σύστηµα έκκρισης, το TTSS (Type Three Secretion System), το οϖοίο µεταφέρει τις ϖρωτεΐνες ϖαθογένειας του βακτηρίου αϖευθείας στο κύτταρο ξενιστή (He 1998, Galan & Collmel 1999). Είναι ένας ευρύτατα διαδεδοµένος µηχανισµός στις αλληλεϖιδράσεις µεταξύ φυτικών κυττάρων και βακτηρίων (ϖρόκληση αντίδρασης υϖεραισθησίας σε ανθεκτικά φυτά), άλλα και µεταξύ ζωικών κυττάρων και 2

3 βακτηρίων. Πρόσφατα στοιχεία αϖοδεικνύουν το ρόλο του TTSS στη συµβίωση και στη βιολογική καταϖολέµηση (Lugtenberg et al 2002). Είναι γενικά αϖοδεκτό ότι ο αϖοικισµός των φυτικών ιστών αϖό τους µικροοργανισµούς είναι ένα καίριο βήµα τόσο στην ϖαθογένεση όσο και στη βιολογική καταϖολέµηση. Πολλά γονίδια φαίνεται να εµϖλέκονται στον αϖοικισµό των ριζών αϖό τους µικροοργανισµούς (Lugtenberg et al 2001). Ο εϖιτυχής αϖοικισµός έχει ως αϖοτέλεσµα: α) καλύτερη άµυνα του κυττάρου, β) αϖοτελεσµατική ϖρόσληψη θρεϖτικών στοιχείων αϖό τα φυτά, γ) εξασθένιση ή καταστροφή των οργανισµών ανταγωνιστών. Εδώ ϖρέϖει να σηµειωθεί ότι λίγες µελέτες έχουν διεξαχθεί όσον αφορά στις αλληλεϖιδράσεις µεταξύ µικροοργανισµών στη ριζόσφαιρα. Η ϖρόσφατη ανακοίνωση ότι βακτήρια του γένους Pseudomonas αϖοικίζουν όχι µόνο τις ρίζες των φυτών αλλά και τις υφές του F. oxysporum f.sp. radicis lycopersici δείχνει ότι τέτοιες αλληλεϖιδράσεις ίσως ϖαίζουν έναν σηµαντικό ρόλο στη βιολογική καταϖολέµηση (Bolwerk et al 2003). 1.2 Μηχανισµοί βιολογικής καταϖολέµησης φυτοϖαθογόνων µικροοργανισµών. α) Υϖερϖαρασιτισµός και αρϖακτικότητα Στον υϖερϖαρασιτισµό ο βιολογικός ϖαράγοντας εϖιτίθεται άµεσα στον φυτοϖαθογόνο οργανισµό και θανατώνει είτε τον ίδιο είτε τις µολυσµατικές του µονάδες (σϖόρια, σκληρώτια κ.α.). Υϖάρχουν ϖολλοί µύκητες οι οϖοίοι ϖαρασιτούν φυτοϖαθογόνους µύκητες, όϖως για ϖαράδειγµα µύκητες των γενών Trichoderma και Clonostachys (συν. Gliocladium) (Pal & Mc Spadden 2006). β) Παραγωγή αντιβιοτικών ουσιών Τα αντιβιοτικά είναι ουσίες ϖου ϖαράγονται αϖό µικροοργανισµούς και µϖορούν σε µικρές συγκεντρώσεις να θανατώσουν ή να δηλητηριάσουν άλλους µικροοργανισµούς. Για το λόγο αυτό, τα αντιβιοτικά ϖου ϖαράγονται αϖό ορισµένους µικροοργανισµούς χρησιµοϖοιούνται ως βιολογικοί ϖαράγοντες (Pal & Mc Spadden 2006). Για ϖαράδειγµα, το βακτήριο Pseudomonas chlororaphis PCL 1391 ϖαράγει την καρβοξαµύδη 1- φεναζίνη 3

4 (phenazine 1- carboxamide) ϖου χρησιµοϖοιείται ως βιολογικός ϖαράγοντας (Chin A Woeng et al 1998). γ) Παραγωγή υδρολυτικών ενζύµων και άλλων ϖαραϖροϊόντων Πολλοί µικροοργανισµοί εκκρίνουν µεταβολίτες οι οϖοίοι µϖορούν να εϖηρεάσουν την ανάϖτυξη και τη δράση ενός ϖαθογόνου. Η ϖαραγωγή και έκκριση των υδρολυτικών ενζύµων, ϖου υδρολύσουν µακροµόρια όϖως χιτίνη, ϖρωτεΐνες, κυτταρίνη, ηµικυτταρίνη και DNA, αϖό διάφορους µικροοργανισµούς µϖορούν να αναστείλουν τη δράση ενός φυτοϖαθογόνου οργανισµού ( Pal & Mc Spadden 2006). δ) Ανταγωνισµός Για τους µικροοργανισµούς το έδαφος και η ζωντανή φυτική εϖιφάνεια είναι συχνά ϖεριβάλλοντα µε ϖεριορισµένη διαθεσιµότητα θρεϖτικών στοιχείων. Ο ανταγωνισµός ϖαθογόνων και µη ϖαθογόνων οργανισµών για θρεϖτικά στοιχεία ϖαίζει σηµαντικό ρόλο στην µείωση της έντασης της ασθένειας (Pal & Mc Spadden 2006). Οι ϖερισσότεροι µη ϖαθογόνοι µικροοργανισµοί, ϖροστατεύουν τα φυτά εξαιτίας της ικανότητας τους να αϖοικίζουν γρηγορότερα τους φυτικούς ιστούς, σε σύγκριση µε τα φυτοϖαθογόνα, και να εκµεταλλεύονται τα θρεϖτικά στοιχεία της ριζόσφαιρας. Χαρακτηριστικό ϖαράδειγµα είναι η καταϖολέµηση του F. oxysporum µε τη χρήση µη ϖαθογόνων φυλών του ίδιου µύκητα, όϖου οι µη ϖαθογόνες φυλές ανταγωνίζονται τις ϖαθογόνες για τις ίδιες θέσεις ϖάνω στη ρίζα του φυτού, άλλα και για τα ίδια θρεϖτικά στοιχεία στη ριζόσφαιρα (άνθρακας) (Alabouvete et al 1998), καθώς και ο ανταγωνισµός µεταξύ εδαφογενών φυτοϖαθογόνων µυκήτων µε βακτήρια του γένους Pseudomonas για σίδηρο (Buyer & Leong 1986, Loper & Buyer 1991). ε) Πρόκληση αντοχής Τα φυτά αντιδρούν σε χηµικά σήµατα ϖου ϖαράγονται αϖό µικροοργανισµούς και είναι ικανά να διεγείρουν µηχανισµούς άµυνας µέσω βιοχηµικών αλλαγών αυξάνοντας την αντοχή τους έναντι ϖολλών ϖαθογόνων. ιακρίνουµε δυο µορφές διασυστηµατικής αντοχής: την διασυστηµατική εϖίκτητη αντοχή (Systemic Acquired Resistance, SAR) η οϖοία διεγείρεται αϖό ϖαθογόνους οργανισµούς και την εϖαγώγιµη 4

5 διασυστηµατική αντοχή (Induced Systemic Resistance, ISR) ϖου µϖορεί να ϖροκληθεί αϖό µη ϖαθογόνους οργανισµούς όϖως ριζοβακτήρια του γένους Pseudomonas (van Peer et al 1991, Leeman et al 1995). 1.3 Τα βακτήρια του γένους Pseudomonas ως βιολογικοί ϖαράγοντες Πολλά ριζοβακτήρια κυρίως των γενών Pseudomonas (Weller et al 1983), Bacillus (Pusey 1999) και Streptomyces (Emmert & Handelsman 1999) έχουν αϖοδειχτεί ότι εϖηρεάζουν την ένταση µιας ασθένειας χρησιµοϖοιώντας διάφορους µηχανισµούς (Lugtenberg et al 1991). Ειδικότερα τα βακτήρια του γένους Pseudomonas έχουν τη µεγαλύτερη σηµασία στη βιολογική καταϖολέµηση καθώς: α) είναι ικανά να χρησιµοϖοιούν εκκρίµατα των ριζών ως ϖηγή θρεϖτικών ουσιών (Lugtenberg et al 1999), β) βρίσκονται σε µεγάλους ϖληθυσµούς ϖάνω στο ριζικό σύστηµα των φυτών (Sands & Rovira 1971), γ) έχουν ϖολύ υψηλότερο ρυθµό ανάϖτυξης συγκρινόµενα µε άλλα ριζοβακτήρια, δ) χρησιµοϖοιούν µια ϖληθώρα µηχανισµών για την καταστολή ενός φυτοϖαθογόνου οργανισµού (Gutterson 1990), ε) είναι εύκολο να αναϖτυχθούν σε εργαστηριακές συνθήκες και µϖορούν εύκολα να εφαρµοστούν στους σϖόρους των φυτών (Lugtenberg et al 1994), στ) µϖορούν εύκολα να τροϖοϖοιηθούν γενετικά και ζ) το γενετικό τους υλικό είναι ϖροσϖελάσιµο (Chin A- Woeng et al 2001). Εϖίσης, έχει ϖαρατηρηθεί συνεργιστική δράση µεταξύ βακτηρίων του γένους Pseudomonas. Παράδειγµα αϖοτελεί ο συνδυασµός των βακτηρίων P. chlororaphis PCL1391 και P. fluorescens WCS 365 στην αντιµετώϖιση του µύκητα F. oxysporum f.sp. radicis lycopersici στην τοµάτα (Dekkers et al. 2000). Οι µηχανισµοί ϖου χρησιµοϖοιούν τα βακτήρια Pseudomonas ϖροκειµένου να ϖροστατεύσουν τα φυτά αϖό φυτοϖαθογόνα είναι οι εξής: α) Ανταγωνισµός µε το φυτοϖαθογόνο για θέσεις ϖάνω στο φυτό ή για θρεϖτικά στοιχεία. Τα βακτήρια αυτά αϖοικίζουν το ριζικό σύστηµα σχηµατίζοντας µικροαϖοικίες στα µεσοκυττάρια διαστήµατα των εϖιδερµικών κυττάρων (Bowen & Rovira 1976, Chin A- Woeng et al 1997, Bolwek et al 2003) ϖου βρίσκονται οι υψηλότερες συγκεντρώσεις των θρεϖτικών στοιχείων ϖου 5

6 εκκρίνουν οι ρίζες (Bloemberg et al 1997, Bloemberg et al 2000, Chin A- Woeng et al 1997). Οµοίως, ο µύκητας F. οxysporum f.sp. radicis lycopersici εγκαθίσταται στις ίδιες ακριβώς θέσεις της ρίζας µε το βακτήριο (Lagopodi et al 2002). Έτσι, η κατάληψη των θέσεων αυτών τόσο αϖό το βιολογικό ϖαράγοντα όσο και αϖό το φυτοϖαθογόνο έχει ως αϖοτέλεσµα οι οργανισµοί αυτοί να ανταγωνίζονται µεταξύ τους για αυτές τις ϖεριορισµένες θέσεις (Lugtenberg et al 1999). Ο ανταγωνισµός µεταξύ των µικροοργανισµών για συγκεκριµένες θέσεις ϖάνω στο φυτό συνεϖάγεται και τον ανταγωνισµό για θρεϖτικά στοιχεία όϖως ο άνθρακας, το άζωτο και ο σίδηρος (Alabouvete et al 1986, Buyer & Leong 1986, Fernando et al 1996). Έχει αϖοδειχτεί ότι τα χηµικά αυτά στοιχεία εµϖλέκονται στους µηχανισµούς µε τους οϖοίους οι βιολογικοί ϖαράγοντες µειώνουν την ανάϖτυξη των φυτοϖαθογόνων µυκήτων στο έδαφος (Hubbard et al 1983, Handelsman & Stabb 1996,). β) Παρασιτισµός και Αρϖακτικότητα Έχει βρεθεί ότι τα συγκεκριµένα βακτήρια ϖαράγουν λυτικά ένζυµα όϖως χιτινάσες, ϖρωτεάσες και άλλες ουσίες όϖως το υδροκυάνιο κ.α. (Shapira et al 1989, Chin A- Woeng et al 1998, Ross et al 2000) ϖου αϖοικοδοµούν µακροµόρια όϖως η χιτίνη, η κυτταρίνη κ.α. τα οϖοία είναι ζωτικής σηµασίας για τους µύκητες. Τα ένζυµα µϖορούν να δρουν συνεργιστικά και µε άλλους µυκητοστατικούς µεταβολίτες (Antifungal Metabolites, AFMs) (Duffy et al 1996, Lorito et al 1994). Για ϖαράδειγµα, ο συνδυασµός υδρολυτικών ενζύµων, ϖου ϖαράγονται αϖό φυλές των µυκήτων T. virens και T. harzianum, και αντιβιοτικών, ϖου ϖαράγονται αϖό φυλές βακτηρίων του γένους Pseudomonas, βελτίωσε την in vitro βιολογική καταϖολέµηση ϖολλών φυτοϖαθογόνων (Woo et al 2002). γ) Παραγωγή µυκητοστατικών µεταβολιτών (AFM s) Τα βακτήρια του γένους Pseudomonas ϖαράγουν ένα ευρύ φάσµα AFM s (Leisinger & Margraff 1979, O Sullivan & O Gara 1992). Είναι οργανικές ουσίες µικρού µοριακού βάρους οι οϖοίες αναστέλλουν την ανάϖτυξη ορισµένων µικροοργανισµών. Στους AFM s ανήκουν και τα αντιβιοτικά. Συγκεκριµένα το βακτήριο P. chlororaphis PCL1391 ϖαράγει το 6

7 µεταβολίτη φεναζίνη -1- καρβοξαµύδη (PCN) (Chin A- Woeng et al 1998). Άλλα αντιβιοτικά ϖου ϖαράγονται αϖό αυτά τα βακτήρια είναι η ϖυρολνιτρίνη (pyrrolnitrin) (Arima et al 1964), η ϖυοκυανίνη (pyocyanin) (Baron et al 1997) και η ωοµυκίνη (oomycin) (Howie & Suslow 1991). Τα βακτήρια έχουν υιοθετήσει ϖολλούς µηχανισµούς µε τους οϖοίους καθορίζουν την ϖαραγωγή µυκητοστατικών µεταβολιτών. Ένας αϖό αυτούς ϖου ϖαίζει σηµαντικό ρόλο στην βιοσύνθεση της φεναζίνη -1- καρβοξαµύδης σχετίζεται µε την ϖυκνότητα του ϖληθυσµού και ονοµάζεται quorum sensing (Bassler 1999, Miller & Bassler 2001). Είναι ένας µηχανισµός διακυτταρικής εϖικοινωνίας µε τον οϖοίο ένα βακτήριο µϖορεί να ελέγξει την ϖυκνότητα του ϖληθυσµού του. Εϖιτρέϖει στα βακτήρια να καθορίσουν την έκφραση των γονιδίων τους ανάλογα µε τον ϖληθυσµό τους και να ϖροσαρµόσουν τις φυσιολογικές διεργασίες σύµφωνα µε τις ϖεριβαλλοντικές συνθήκες. Η ϖαραγωγή PCN αϖό το P. chlororaphis PCL1391 φαίνεται να σχετίζεται µε το quorum sensing (Chin A- Woeng et al 2001). Έτσι τα βακτήρια δρώντας συλλογικά είναι ϖερισσότερο αϖοτελεσµατικά αϖέναντι σ έναν οργανισµό. Η σύνθεση του PCN φαίνεται να σχετίζεται άµεσα µε τη φυσιολογική κατάσταση στην οϖοία βρίσκεται το βακτήριο, η οϖοία µε τη σειρά της εξαρτάται αϖό τις ϖεριβαλλοντικές συνθήκες. Για τα κύτταρα του P. chlororaphis PCL1391 η διαθεσιµότητα σε άνθρακα, εϖηρεάζει θετικά την ϖαραγωγή φεναζίνης (Chin A- Woeng 2000). δ) Πρόκληση διασυστηµατικής αντοχής Τα βακτήρια του γένους Pseudomonas διεγείρουν την ϖαραγωγή γιασµονικού οξέος και αιθυλενίου αϖό τα φυτά (van Peer et al 1991,, Leeman et al 1995, Dong 1998), ϖου αϖοτελούν µηχανισµό άµυνας των φυτών (ISR). 1.4 Ο µύκητας Clonostachys rosea ως βιολογικός ϖαράγοντας Οι µύκητες του γένους Clonostachys (συν. Gliocladium) ανήκουν στην τάξη Moniliales των Αδηλοµυκήτων. Σχηµατίζουν τα µονοκύτταρα κονίδιά τους σε ελεύθερους κονιδιοφόρους ϖου µοιάζουν µε τους κονιδιοφόρους των µυκήτων του γένους Penicillium και Verticillium (Εικ. 1). Οι αϖοικίες του µύκητα C. rosea έχουν χρώµα λευκό έως ανοικτό ϖορτοκαλί. Τέλεια µορφή 7

8 είναι ο Ασκοµύκητας της τάξης των Hypocreales Nectria ochroleuca Schwein (Sutton et al 1997). Εϖίσης, εϖιβιώνει και ως σαϖρόφυτο σε νεκρή οργανική ύλη (Johansen et al 2005). Οι µύκητες αυτοί έχουν εϖιλεγεί ως αϖοτελεσµατικοί βιολογικοί ϖαράγοντες εναντίον ϖαθογόνων όϖως ο Botrytis cinerea (Sutton et al 1997), αλλά και εναντίον του ωοµύκητα Pythium spp. σε καρότο, λάχανο και τεύτλο (Moller et al 2003). Το στέλεχος του C. rosea IK726 αϖοµονώθηκε αϖό ρίζες σιτηρών σε αγρούς της ανίας και ήταν αϖοτελεσµατικό εναντίον φυτοϖαθογόνων µυκήτων, όϖως οι Fusarium culmorum και Bipolaris sorokiniana στα σιτηρά (Knudsen et al 1995). Εϖίσης, είναι αϖοτελεσµατικό και εναντίον άλλων φυτοϖαθογόνων µυκήτων όϖως του Alternaria radicina και A. dauci σε καρότα (Jensen et al 2004). Ο τρόϖος µε τον οϖοίο δρα ο C. rosea δεν είναι ϖλήρως κατανοητός. Όµως η δράση εξωκυτταρικών ενζύµων, ο ϖαρασιτισµός και ο ανταγωνισµός για θρεϖτικά στοιχεία ϖιστεύεται ότι ϖαίζουν ένα σηµαντικό ρόλο. Σχετικά ϖρόσφατες µελέτες έχουν δείξει ότι ο C. rosea ΙΚ726 ϖαράγει ένζυµα αϖοικοδόµησης των κυτταρικών τοιχωµάτων (Cell Wall Degradation Enzymes, CWDEs) συµϖεριλαµβάνοντας χιτινάσες, γλουκανάσες και κυτταρινάσες (Inglis & Kawchuk 2002, Roberti et al 2002). Ο δραστικός ρόλος αυτών των ενζύµων στον ϖαρασιτισµό δεν έχει ακόµα εκτιµηθεί. Τελευταία, χρησιµοϖοιώντας τεχνικές PCR έχουν ταυτοϖοιηθεί και χαρακτηριστεί 4 γονίδια τα οϖοία κωδικοϖοιούν 3 ενδο-χιτινάσες και 1 εξω-χιτινάση (Gan et al 2007, Mamarabadi et al 2008). Η εφαρµογή νέων τεχνικών, όϖως η TAST (transposon assisted signal trapping), είναι ϖιθανό να οδηγήσει στην εύρεση νέων γονιδίων ϖου ϖαίζουν σηµαντικό ρόλο στις αλληλεϖιδράσεις του C. rosea µε τα φυτοϖαθογόνα (Becker et al 2004). Εϖιϖρόσθετα, βρέθηκε ότι ο συγκεκριµένος µύκητας ϖαράγει ένα ένζυµο, την λακτονουδρολάση, η οϖοία αϖοδοµεί την µυκοτοξίνη ζερεαλινόνη (zerealenone), και ϖαράγεται αϖό µύκητες του γένους Fusarium (Takahashi Ando et al 2002). Εϖίσης, έχει ταυτοϖοιηθεί και µια εξωκυτταρική ϖρωτεάση της σερίνης η οϖοία είναι ικανή να αϖοδοµήσει ουσίες ϖου βρίσκονται στην εϖιδερµίδα νηµατωδών ( Li et al 2005). 8

9 Εικ.1. Καρϖοφορίες του µύκητα Clonostachys rosea (Πηγή: Εικ. 2. Υφές του µύκητα Clonostachys rosea ΙΚ726 γύρω αϖό κονίδια του Alternaria dauci (Αϖό Birgit Jensen Plant Pathology Dept. University of Copenhagen) Εκτός αϖό την ϖαραγωγή εξωκυτταρικών ενζύµων, ο µύκητας αυτός βρέθηκε να ϖαρασιτεί κονίδια, µυκηλιακές υφές, καθώς και σκληρώτια ϖολλών µυκήτων (Barnett & Lilly 1962, Sutton & Peng 1993). Εϖίσης, µύκητες του γένους Clonostachys βρέθηκαν να ϖαρασιτούν και νηµατώδεις (Carris et al 1989). 9

10 Οι Sutton & Peng (1993) αναφέρουν ότι εκτός αϖό τον ϖαρασιτισµό, ο ανταγωνισµός για θρεϖτικά στοιχεία ϖαίζει σηµαντικό ρόλο στην µείωση της έντασης της ϖροσβολής φύλλων φράουλας αϖό τον µύκητα B. cinerea. Συγκεκριµένα ο C. rosea αϖοικίζει τους ιστούς των φύλλων και εκµεταλλεύεται τα θρεϖτικά στοιχεία ταχύτερα αϖό τον B. cinerea εµϖοδίζοντας τον να ϖροκαλέσει µόλυνση. Εϖίσης, ο C. rosea ΙΚ726 µερικές φορές ϖροάγει την ανάϖτυξή των φυτών, ενώ ϖοτέ δεν την εϖηρεάζει αρνητικά (Johansen et al. 2005, Ravnskov et al. 2006). Συγκεκριµένα, ο C. rosea ΙΚ726 έχει άµεση θετική εϖίδραση στην ανάϖτυξη φυτών κριθαριού (Johansen et al. 2005). Εϖίσης, έχει µελετηθεί η εϖίδραση του υϖερϖαράσιτου αυτού µύκητα στην ιθαγενή µικροϖανίδα του ριζικού συστήµατος των τεύτλων και των σιτηρών. Παρατηρήθηκε ότι ο C. rosea ΙΚ726 διεγείρει την ενζυµατική δράση των µικροοργανισµών στο έδαφος ιδιαιτέρως βακτηρίων του γένους Pseudomonas καθώς και θετικών κατά Gram βακτηρίων (Johansen et al. 2005). 2. Σήψη του λαιµού και της ρίζας της τοµάτας αϖό το µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis - lycopersici Η ασθένεια διαφέρει αϖό την τυϖική αδροφουζαρίωση ϖου οφείλεται στον F. oxysporum f.sp. lycopersici (Fol). Η σήψη του λαιµού και της ρίζας της τοµάτας αναφέρθηκε για ϖρώτη φορά σε φυτά τοµάτας ϖου καλλιεργούνταν σε θερµοκήϖια του Οχάιο των ΗΠΑ και του Οντάριο του Καναδά το 1974 (Farley et al 1975, Jarvis et al 1975). Αϖό τότε η ασθένεια αυτή αϖοτελεί ϖεριοριστικό ϖαράγοντα στην ϖαραγωγή θερµοκηϖιακής τοµάτας στις ανατολικές ΗΠΑ και έχει αναφερθεί και σε άλλες έξι ϖολιτείες (Nutter et al 1978, Rowe et al 1977, Sonoda 1976). Παρόµοια ασθένεια αναφέρθηκε το 1974 και στην Ιαϖωνία ϖροκαλώντας και εκεί σοβαρά ϖροβλήµατα (Sato & Araki 1974, Yamamoto 1974). Στην Ελλάδα η ασθένεια αυτή αναφέρθηκε για ϖρώτη φορά το 1985 σε φυτά τοµάτας ϖου καλλιεργούνταν σε θερµοκήϖιο στο Ρέθυµνο της Κρήτης (Malathrakis 1985). Όσον αφορά στη συµϖτωµατολογία, το ϖρώτο σύµϖτωµα ϖου ϖαρουσιάζεται είναι ένα ϖεριθωριακό κιτρίνισµα των ϖαλιότερων φύλλων 10

11 όταν οι ϖρώτοι καρϖοί ϖλησιάζουν στην ωρίµανση (Εικ.3). Αυτό το κιτρίνισµα σύντοµα ακολουθείται αϖό νέκρωση και τα φύλλα τελικά ξεραίνονται ολοκληρωτικά και ϖέφτουν. Στη συνέχεια, τα συµϖτώµατα αυτά εµφανίζονται και στα νεαρότερα φύλλα, αλλά η εξέλιξη των συµϖτωµάτων είναι βραδύτερη σε σύγκριση µε τα ϖαλιότερα φύλλα. Μερικά φυτά µϖορεί να εµφανίσουν νανισµό και να µαραθούν ϖολύ γρήγορα, ενώ σε άλλα ο µαρασµός µϖορεί να είναι αργός και τα φυτά να ϖαραµείνουν ζωντανά µέχρι το τέλος της καλλιεργητικής ϖεριόδου (Sonoda 1976). Αναφορικά µε τα συµϖτώµατα στη ρίζα, ϖροσβάλλεται όλο το ριζικό σύστηµα στο οϖοίο εµφανίζεται ξηρή καστανή σήψη του ξυλώµατος και του φλοιώµατος (Εικ.4). Ένα άλλο σύµϖτωµα της ασθένειας αυτής είναι το έλκος στο λαιµό των ασθενών φυτών το οϖοίο µϖορεί ν αναϖτυχθεί τόσο ϖάνω όσο και κάτω αϖό τη γραµµή φύτευσης. Στις ϖερισσότερες ϖεριϖτώσεις µία εϖιµήκης νεκρωτική κηλίδα εµφανίζεται στην εϖιφάνεια του λαιµού είτε cm ϖάνω αϖό αυτή. Με βροχερό ή υγρό καιρό ϖάνω στην κηλίδα εµφανίζεται το µυκήλιο του µύκητα έχοντας ένα ροζ χρώµα (Sonoda 1976). Εικ.3. Φυτά τοµάτας ϖροσβεβληµένα αϖό τον µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (Πηγή: 11

12 Εικ. 4. Συµϖτώµατα ϖροσβολής του λαιµού της τοµάτας αϖό τον µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (Πηγή: Όταν ο Yamamoto το 1974 ϖεριέγραψε την ασθένεια, θεώρησε το ϖαθογόνο αίτιο σαν µία νέα φυλή του F. oxysporum f.sp. lycopersici βασιζόµενος στην ϖαρατήρηση συµϖτωµάτων σε φυτά µιας ϖοικιλίας ϖου ήταν ανθεκτική και στις δύο τότε γνωστές φυλές του Fol. Το 1978 οι Jarvis & Shoemaker ονόµασαν το ϖαθογόνο αυτό ως µια νέα ειδική µορφή του F. oxysporum µε το όνοµα radicis lycopersici εξαιτίας του γεγονότος ότι δεν ϖαρατηρούνταν συµϖτώµατα στα αγγεία των ϖροσβεβληµένων φυτών βασισµένοι στον διαχωρισµό ϖου έκανε ο Weimer το 1944 στα λούϖινα. Έτσι, ως ϖαθογόνο αίτιο της ασθένειας αυτής εϖικράτησε το F. oxysporum f.sp. radicis lycopersici. Ο µύκητας αυτός κατά τη διάρκεια του βιολογικού του κύκλου (Εικ.5) ϖαράγει µικροκονίδια, µακροκονίδια και χλαµυδοσϖόρια (Εικ.6). Σϖόρια του µύκητα έχουν βρεθεί στο άχυρο, ϖου τοϖοθετείται στα θερµοκήϖια µεταξύ των σειρών, αλλά και σε αϖοσυντεθηµένα φυτά τοµάτας. Τα µικροκονίδια συνήθως βρίσκονται στον αέρα των µολυσµένων θερµοκηϖίων και η υψηλή συγκέντρωση χλαµυδοσϖορίων στο έδαφος χρησιµεύει ως µόλυσµα. Η ασθένεια ευνοείται σε µάλλον δροσερά εδάφη (20 0 C 22 0 C ). Ο µύκητας εισέρχεται αρχικά στην κύρια ρίζα του φυτού και µετακινείται αργά ϖρος τις δευτερεύουσες, κυρίως µέσω του φλοιώµατος και 12

13 δευτερευόντως µέσω του ξυλώµατος. Το ξύλωµα συχνά µεταχρωµατίζεται σε αϖόσταση αρκετών εκατοστών αϖό το µυκήλιο του µύκητα. Το παθογόνο διαχειµάζει µε τα χλαµυδοσπόριά του πάνω σε προσβεβληµένες ρίζες ή οργανική ουσία Τέλος αναπτύσσεται χλώρωση και καστανός µεταχρωµατισµός των φύλλων Αργότερα όταν τα φυτάρια είναι µεγαλύτερα και περισσότερο στρεσαρισµένα, ο µύκητας διακλαδίζεται και καταστρέφει Νωρίς το καλοκαίρι τα χλαµυδοσπόρια βλαστάνουν και µολύνουν τα ριζίδια κοντινών φυταρίων τοµάτας Εικ. 5: Βιολογικός κύκλος του µύκητα Fusarium οxysporum f.sp. radicis lycopersici (Πηγή: Internet) Μερικές αϖοµονώσεις του µύκητα αυτού είναι ελαφρώς ϖαθογόνες σε ϖιϖεριά και µελιτζάνα, ενώ µερικά ψυχανθή είναι αρκετά ευαίσθητα (Rowe 1980). Εικ. 6: Χλαµυδοσϖόρια του µύκητα Fusarium οxysporum f.sp. radicis lycopersici (Πηγή: 13

14 Η καταϖολέµηση της ασθένειας αυτής έχει εϖιτευχθεί στα θερµοκήϖια µε αϖολύµανση του εδάφους µε ατµό και στη συνέχεια εφαρµογή ενός κατάλληλου µυκητοκτόνου. Ενώ το έδαφος είναι ακόµη θερµό, το µυκητοκτόνο εφαρµόζεται στις γραµµές άρδευσης και δεν ϖραγµατοϖοιείται καµιά κατεργασία για ϖερίϖου δύο εβδοµάδες µετά την εφαρµογή (Rowe et al 1978). Σήµερα η αντιµετώϖιση της ασθένειας βασίζεται στη χρήση ανθεκτικών ϖοικιλιών( Rowe & Farley 1981). 3. Βιολογική καταϖολέµηση στο ϖαθοσύστηµα τοµάτα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici Εξαιτίας της αϖαγόρευσης χρήσης του βρωµιούχου µεθυλίου και ϖολλών άλλων µυκητοκτόνων εδάφους, του αυξηµένου κόστους αϖολύµανσης του εδάφους µε ατµό και του µικρού αριθµού ανθεκτικών ϖοικιλιών, ϖραγµατοϖοιήθηκαν αρκετές ϖροσϖάθειες βιολογικής καταϖολέµησης της συγκεκριµένης ασθένειας. Αρκετές ϖροσϖάθειες έγιναν µε τη χρήση του υϖερϖαράσιτου µύκητα Trichoderma harzianum ϖου είναι αϖοτελεσµατικός βιολογικός ϖαράγοντας τόσο σε θερµοκήϖια όσο και στον αγρό (Sivan 1987). Σηµαντική µείωση της έντασης της ασθένειας ϖαρατηρήθηκε εϖίσης αϖό το συνδυασµό του T. harzianum µε τον Glomus intraracides (Datnoff et al 1995). Εϖιϖρόσθετα, βιολογική καταϖολέµηση εϖετεύχθη και µε τη χρήση άλλων µυκήτων, όϖως ο Penicillium funiculosum και Aspergillus ochraceus (Marrois et al 1981), καθώς και µε µη ϖαθογόνες φυλές του F. oxysporum όϖως η φυλή Fo47 (Alabouvete & Couteaudier 1992). Προσϖάθειες βιολογικής καταϖολέµησης της σήψης του λαιµού και της ρίζας της τοµάτας έγιναν και µε τη χρήση µη ϖαθογόνων βακτηρίων του γένους Pseudomonas. Συγκεκριµένα, βιολογική καταϖολέµηση εϖετεύχθη µε το βακτήριο P. chlororaphis PCL1391. Ο µηχανισµός δράσης το συγκεκριµένου βακτηρίου είναι η ϖαραγωγή του αντιβιοτικού µεταβολίτη φεναζίνη 1 καρβοξαµύδη, καθώς και ο ανταγωνισµός για θρεϖτικά στοιχεία στην ϖεριοχή της ριζόσφαιρας. Αυτό το βακτήριο µείωσε τον αριθµό των 14

15 ϖροσβεβληµένων φυτών τοµάτας αϖό τον µύκητα F. οxysporum f.sp. radicis lycopersici αϖό 78% σε 33% και αϖοδείχθηκε ότι το αντιβιοτικό ήταν ένας αϖό τους υϖεύθυνους ϖαράγοντες για τη βιολογική καταϖολέµηση σ αυτό το ϖαθοσύστηµα (Chin A Woeng et al 1998). Εϖίσης και το βακτήριο P. fluorescence WCS 365 αϖοδείχθηκε αϖοτελεσµατικός βιολογικός ϖαράγοντας µειώνοντας σηµαντικά την ένταση ϖροσβολής των φυτών τοµάτας αϖό τον F. oxysporum f.sp radicis lycopersici. Ο µηχανισµός δράσης δεν είναι η ϖαραγωγή κάϖοιου µυκητοστατικού µεταβολίτη, αλλά η ϖρόκληση διασυστηµατικής αντοχής στα φυτά (Dekkers et al 2000). 15

16 Σκοϖός της εργασίας Σκοϖός της συγκεκριµένης εργασίας ήταν: 1) να ελεγχθεί η δυνατότητα βιολογικής καταϖολέµησης της σήψης του λαιµού και των ριζών της τοµάτας ϖου ϖροκαλείται αϖό τον φυτοϖαθογόνο µύκητα F. οxysporum f.sp. radicis lycopersici µε τη χρήση του υϖερϖαράσιτου µύκητα C. rosea ΙΚ726, γνωστού για την αϖοτελεσµατικότητά του εναντίον άλλων φυτοϖαθογόνων µυκήτων. 2) Ταυτόχρονα, να µελετηθεί η αλληλεϖίδραση του υϖερϖαράσιτου αυτού µύκητα µε το βακτήριο P. chlororaphis PCL1391 στη ριζόσφαιρα της τοµάτας κατά τη βιολογική καταϖολέµηση του συγκεκριµένου φυτοϖαθογόνου. 3) Τέλος, να διερευνηθεί η εϖίδραση ευρέως χρησιµοϖοιούµενων µυκητοκτόνων στην ανάϖτυξη του C. rosea ΙΚ726 και να υϖολογισθεί η EC50. 16

17 Πειραµατικό Μέρος 17

18 Μέρος Α: Μελέτη αλληλεϖιδράσεων in vitro 1. Αλληλεϖιδράσεις µεταξύ των βιολογικών ϖαραγόντων Pseudomonas chlororaphis PCL1391 και Clonostachys rosea IK726 και του φυτοϖαθογόνου µύκητα Fusarium oxysporum f.sp radicis - lycopersici (σε διϖλές και τριϖλές καλλιέργειες) Τα in vitro ϖειράµατα ϖεριλαµβάνουν διϖλές καλλιέργειες, όϖου ο εν δυνάµει βιολογικός ϖαράγοντας τοϖοθετείται µαζί µε έναν φυτοϖαθογόνο µύκητα σε τρυβλίο Petri ϖροκειµένου να µελετηθεί η δράση ϖου ασκεί στο φυτοϖαθογόνο. Ο εν δυνάµει βιολογικός ϖαράγοντας εκτιµάται ανάλογα µε την ικανότητά του να αναστέλλει την µυκηλιακή ανάϖτυξη του φυτοϖαθογόνου µύκητα, σχηµατίζοντας µία ζώνη αναστολής ή ζώνη συνάντησης. Τα in vitro ϖειράµατα είναι ικανά να ανιχνεύσουν βιολογικούς ϖαράγοντες ϖου ϖαράγουν αντιβιοτικά, καθώς και βιολογικούς ϖαράγοντες ϖου είναι ικανοί να ϖαρασιτήσουν το φυτοϖαθογόνο οργανισµό, αλλά δεν είναι ικανά να αναδείξουν βιολογικούς ϖαράγοντες ϖου διεγείρουν µηχανισµούς άµυνας του φυτού ή ανταγωνίζονται το φυτοϖαθογόνο για θρεϖτικά στοιχεία ή για θέσεις ϖάνω στο φυτό (Knudsen et al 1997). Στο κεφάλαιο αυτό ϖεριγράφονται ϖειράµατα µε διϖλές καλλιέργειες του F. oxysporum f.sp. radicis-lycopersici µε κάθε έναν αϖό τους βιολογικούς ϖαράγοντες, καθώς και διϖλές καλλιέργειες οι οϖοίες ϖεριείχαν τους δύο µόνο βιολογικούς ϖαράγοντες, ενώ έγιναν και τριϖλές καλλιέργειες του φυτοϖαθογόνου µύκητα µε τον µύκητα C. rosea IK726 και το βακτήριο ταυτόχρονα, ϖροκειµένου να διαϖιστωθεί η ύϖαρξη αλληλεϖίδρασης µεταξύ του ϖαθογόνου και των βιολογικών ϖαραγόντων, αλλά και η τυχόν αλληλεϖίδραση µεταξύ των δύο βιολογικών ϖαραγόντων. 1.1 Υλικά και µέθοδοι Προέλευση, καλλιέργεια και διατήρηση των µικροοργανισµών Fusarium oxysporum f.sp. radicis - lycopersici 18

19 Ο φυτοϖαθογόνος µύκητας ϖαραχωρήθηκε αϖό τον Dr. Ben Lugtenburg, Institute of Biology, Leiden University, Ολλανδία. Καλλιεργήθηκε σε υϖόστρωµα PDA σε ϖλαστικά τρυβλία Petri στους 25 ο C. Η διατήρηση του ϖαθογόνου για µικρά χρονικά διαστήµατα γινόταν σε σωλήνες µε PDA σε ψυγείο, στους 0 o C - 4 ο C. Για µακρύ χρονικό διάστηµα, ο µύκητας διατηρήθηκε στους -80 ο C µέσα σε σωληνάρια eppendorf σε διάλυµα ϖεϖτόνης γλυκερόλης (15% κ.ο. γλυκερόλη και 0,5% κ.β. ϖρωτεόζη- ϖεϖτόνη) αϖό όϖου εϖανακαλλιεργούταν κάθε χρόνο. Το όνοµα του µύκητα αναφέρεται στο κείµενο µε τη συντοµογραφία Forl. Pseudomonas chlororaphis PCL 1391 Το βακτηριακό στέλεχος P. chlororaphis PCL 1391 ήταν εϖίσης µια ευγενική ϖροσφορά του Dr Ben Lugtenberg. Καλλιεργήθηκε σε τρυβλία Petri µε υϖόστρωµα King s medium B (King et al., 1954) ύστερα αϖό ϖροσθήκη 1,8% άγαρ σε συνθήκες σκότους και σε θερµοκρασία 23 ο C για 2 µέρες. Η διατήρηση του για µικρό χρονικό διάστηµα ϖραγµατοϖοιούταν µε την τοϖοθέτηση καλλιέργειας σε τρυβλία σε ψυγείο, ενώ η διατήρηση του για µεγάλο χρονικό διάστηµα γινόταν µε την τοϖοθέτηση αιωρήµατος βακτηριακών κυττάρων σε διάλυµα ϖεϖτόνης γλυκερόλης. Το βακτήριο αναφέρεται στο κείµενο µε τη συντοµογραφία PCL. Clonostachys rosea ΙΚ726 Η συγκεκριµένη αϖοµόνωση του µύκητα αυτού, ϖροέρχεται αϖό ρίζες σιτηρών ϖου καλλιεργούνταν σε αγρούς της ανίας και ϖαραχωρήθηκε αϖό τον Dr. Dan Funk Jensen, Department of Plant Biology, Copenhagen University. Καλλιεργήθηκε σε θρεϖτικό υϖόστρωµα PDA σε τρυβλία Petri σε θερµοκρασία ϖερίϖου 25 ο C. Ο µύκητας για βραχυχρόνια αϖοθήκευση τοϖοθετήθηκε σε ψυγείο σε σωλήνες µε PDA, ενώ για µακροχρόνια στους - 80 ο C σε διάλυµα ϖεϖτόνης γλυκερόλης Μεταχειρίσεις Πειραµατικός σχεδιασµός 19

20 Τόσο οι διϖλές, όσο και οι τριϖλές καλλιέργειες ϖραγµατοϖοιήθηκαν σε τρυβλία, τα οϖοία ϖεριείχαν θρεϖτικό υϖόστρωµα PDA. Η τοϖοθέτηση των εµβολίων του ϖαθογόνου, καθώς και των βιολογικών ϖαραγόντων, γινόταν σε αντιδιαµετρικά σηµεία ϖου αϖείχαν ϖερίϖου 1cm αϖό την ϖεριφέρεια του τρυβλίου. Το εµβόλιο κάθε µύκητα λαµβανόταν αϖό την ϖεριφέρεια νεαρής αϖοικίας ϖου είχε αναϖτυχθεί σε PDA και αϖοτελούταν αϖό ένα δίσκο 4mm. Όσον αφορά στο βακτηριακό στέλεχος, ϖροερχόταν αϖό νεαρές αϖοικίες σε ΚΒ + άγαρ (1,8%) λαµβάνοντας µία ϖοσότητα βακτηριακών κυττάρων µε τη βοήθεια βελόνας εµβολιασµού βακτηρίων. Εϖειδή η ανάϖτυξη του C. rosea IK726 ήταν ϖολύ ϖιο αργή σε σύγκριση µε το φυτοϖαθογόνο µύκητα και το βακτήριο, αυτός εµβολιαζόταν 10 µέρες νωρίτερα. Πραγµατοϖοιήθηκαν οι εξής µεταχειρίσεις: 1) Τρυβλία ϖου αναϖτυσσόταν µόνο ο φυτοϖαθογόνος µύκητας F. oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (µάρτυρας Forl). 2) Τρυβλία ϖου αναϖτυσσόταν µόνο το βακτηριακό στέλεχος P. chlororaphis PCL 1391 (µάρτυρας PCL). 3) Τρυβλία ϖου αναϖτυσσόταν µόνο ο µύκητας C. rosea ΙΚ726 (µάρυρας C. rosea). 4) Τρυβλία ϖου αναϖτυσσόταν ο F. oxysporum f.sp. radicis-lycopersici ταυτόχρονα µε το βακτηριακό στέλεχος P. chlororaphis PCL 1391 εµβολιασµένα σε αντιδιαµετρικά σηµεία. 5) Τρυβλία ϖου αναϖτυσσόταν ο F. oxysporum f.sp. radicis-lycopersici ταυτόχρονα µε τον µύκητα C. rosea ΙΚ726 εµβολιασµένα σε αντιδιαµετρικά σηµεία. 6) Τρυβλία ϖου αναϖτυσσόταν ο µύκητας C. rosea ΙΚ726 ταυτόχρονα µε το βακτηριακό στέλεχος P. chlororaphis PCL 1391 εµβολιασµένα σε αντιδιαµετρικά σηµεία. 7) Τρυβλία ϖου αναϖτυσσόταν ο F. oxysporum f.sp. radicis-lycopersici ταυτόχρονα µε το P. chlororaphis PCL 1391 και τον C. rosea ΙΚ726 εµβολιασµένα σε σηµεία ϖου αντιστοιχούσαν σε κορυφές ισόϖλευρου τριγώνου. 20

21 Η κάθε µεταχείριση αϖοτελούταν αϖό 5 τρυβλία και η δοκιµή εϖαναλήφθηκε 2 φορές. Η εϖώαση των τρυβλίων γινόταν σε συνθήκες σκότους στους 25 0 C. Μακροσκοϖικές ϖαρατηρήσεις ϖραγµατοϖοιούνταν ανά δύο ηµέρες για διάστηµα δύο εβδοµάδων ϖροκειµένου να διαϖιστωθεί η αλληλεϖίδραση ανάµεσα στους µικροοργανισµούς. 1.2 Αϖοτελέσµατα Μακροσκοϖικές ϖαρατηρήσεις Στις in vitro δοκιµές ϖαρατηρήθηκαν τα ακόλουθα: 1) Όταν ο φυτοϖαθογόνος µύκητας αναϖτυσσόταν µόνος στο τρυβλίο είχε καταλάβει ολόκληρη την εϖιφάνεια του τρυβλίου στο τέλος της ϖειραµατικής δοκιµής (15 ηµέρες µετά τον εµβολιασµό). 2) Όταν ο µύκητας αναϖτυσσόταν ταυτόχρονα µε το βακτηριακό στέλεχος P. chlororaphis PCL 1391, ϖαρατηρήθηκε ανάσχεση της ανάϖτυξης του µύκητα µε τη δηµιουργία µιας ζώνης αναστολής ϖρος την ϖλευρά της αϖοικίας του βακτηρίου (Εικ. 7). 3) Στις διϖλές καλλιέργειες, όϖου αναϖτυσσόταν ο φυτοϖαθογόνος µύκητας ταυτόχρονα µε τον C. rosea ΙΚ726, η ανάϖτυξη του F. oxysporum f.sp. radicis-lycopersici αναστάλθηκε, όταν αυτός συνάντησε τον C. rosea ΙΚ726 (Εικ. 8). 4) Στην ϖερίϖτωση των διϖλών καλλιεργειών, όϖου αναϖτύσσονταν ταυτόχρονα οι δύο βιολογικοί ϖαράγοντες, φαίνεται να εϖηρεάζεται η ανάϖτυξη του υϖερϖαράσιτου µύκητα και να σχηµατίζεται ζώνη αναστολής ϖρος την ϖλευρά της αϖοικίας του βακτηρίου (Εικ. 9). 5) Όσον αφορά στις τριϖλές καλλιέργειες, οι ϖαρατηρήσεις ήταν αντίστοιχες µε εκείνες ϖου έγιναν στις διϖλές. ηλαδή το P. chlororaphis PCL 1391 ανέστειλε την ανάϖτυξη τόσο του F. oxysporum f.sp. radicis-lycopersici όσο και του C. rosea ΙΚ726, καθώς και στο σηµείο συνάντησης των δύο µυκήτων (Εικ. 10). 21

22 Εικ. 7. ι λή καλλιέργεια του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici ( άνω) µε βακτήριο Pseudomonas chlororaphis PCL 1391 (κάτω) ό ου αρατηρείται ανάσχεση της ανά τυξης του µύκητα και σχηµατισµός ζώνης αναστολής ρος την λευρά ανά τυξης του βακτηρίου 15 ηµέρες µετά τον εµβολιασµό Εικ. 8. ι λή καλλιέργεια του Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (κάτω) και του Clonostachys rosea ΙΚ726 ( άνω) ό ου αρατηρείται ανάσχεση της ανά τυξης του φυτο αθογόνου ρος την λευρά ανά τυξης του βιολογικού αράγοντα 15 ηµέρες µετά τον εµβολιασµό του βιολογικού αράγοντα 22

23 Εικ. 9. ιϖλή καλλιέργεια του Clonostachys rosea IK 726 (ϖάνω) και του βακτηρίου Pseudomonas chlororaphis PCL 1391 (κάτω) όϖου ϖαρατηρείται ανάσχεση της ανάϖτυξης του µύκητα και σχηµατισµός ζώνης αναστολής ϖρος την ϖλευρά ανάϖτυξης του βακτηρίου 15 ηµέρες µετά τον εµβολιασµό του Clonostachys rosea IK 726 Εικ. 10. Τριϖλή καλλιέργεια του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici (κάτω) του µύκητα Clonostachys rosea IK 726 (ϖάνω) και του βακτηρίου Pseudomonas chlororaphis PCL 1391 (αριστερά) όϖου ϖαρατηρείται ανάσχεση της ανάϖτυξης των δύο µυκήτων ϖρος την ϖλευρά του βακτηρίου, καθώς και ανάσχεση της ανάϖτυξης των µυκήτων στο σηµείο συνάντησης αυτών 15 ηµέρες µετά τον εµβολιασµό του Clonostachys rosea IK

24 2. Αϖοµόνωση του αντιβιοτικού PCN αϖό το βακτήριο Pseudomonas chlororaphis PCL 1391 µε χρωµατογραφία λεϖτής στοιβάδας και εϖίδραση στην ανάϖτυξη του φυτοϖαθογόνου και του υϖερϖαράσιτου µύκητα in vitro Αφού διαϖιστώθηκε ο σχηµατισµός ζώνης αναστολής και στους δύο µύκητες, αϖοφασίστηκε να ελεγχθεί η εϖίδραση του αντιβιοτικού φεναζίνη -1- καρβαµύδη (PCN), ϖου εκκρίνει το βακτηριακό στέλεχος P. chlororaphis PCL 1391, στη βλάστηση των κονιδίων και στην ανάϖτυξη αϖοικίας του µύκητα C. rosea ΙΚ726 ϖροκειµένου να διερευνηθεί αν το αντιβιοτικό PCN ϖου ϖαράγει το βακτήριο ευθύνεται για την αναστολή της ανάϖτυξή τους και να γίνει σύγκριση µε την εϖίδραση του καθαρού µεταβολίτη PCN εϖί του φυτοϖαθογόνου µύκητα F. oxysporum f.sp. radicis-lycopersici. 2.1 Υλικά και µέθοδοι Παραγωγή και µέτρηση µολύσµατος Fusarium oxysporum f.sp. radicis - lycopersici Για ϖαραγωγή µεγάλου αριθµού κονιδίων χρησιµοϖοιήθηκε ως θρεϖτικό υλικό το Czapek Dox Broth (Duchefa, Haarlem The Netherlands). Το θρεϖτικό υλικό ϖεριέχει ανά λίτρο τα ϖαρακάτω συστατικά: FeSO4 x 7H2O 0.01g MgSO4 x 7H2O 0.5g KCl 0.5g NaNO3 3.0g K2HPO4 1.0g Sucrose 30.0g (νερό αϖεσταγµένο 1 lt ) Το υλικό µοιράστηκε σε τέσσερις κωνικές φιάλες των 500ml και αϖοστειρώθηκε σε ϖίεση 1,5 bar στους C για 20 λεϖτά. Κάθε φιάλη ϖεριείχε 250 ml υλικού και εµβολιάστηκε µε ϖερίϖου 4 κοµµάτια τα οϖοία είχαν ληφθεί αϖό την ϖεριφέρεια αναϖτυσσόµενης καλλιέργειας του µύκητα. Στη συνέχεια, οι φιάλες εϖωάστηκαν σε αναδευτήρα (incubator shaker) στις 24

25 150 στροφές / λεϖτό και σε θερµοκρασία 28 0 C για τρεις ηµέρες. Η µέτρηση της συγκέντρωσης των σϖορίων του µύκητα ανά ml υγρής καλλιέργειας έγινε σε µικροσκόϖιο µε τη βοήθεια αιµατοκυτταροµέτρου ύστερα αϖό διήθηση του υλικού µε ειδικό αϖοστειρωµένο τουλουϖάνι (miracloth, Calbiochem, USA). Clonostachys rosea IK726 Ο µύκητας καλλιεργήθηκε σε τρυβλία ϖου ϖεριείχαν υϖόστρωµα PDA. Για τη λήψη µιας ικανοϖοιητικής ϖοσότητας κονιδίων σε νεαρές καλλιέργειες (ϖερίϖου 15 ηµερών) ϖροστέθηκε αϖοστειρωµένο και αϖεσταγµένο νερό και στη συνέχεια η εϖιφάνεια της καλλιέργειας αφαιρέθηκε µε αϖοστειρωµένο νυστέρι σε ασηϖτικές συνθήκες. Ακολούθησε διήθηση αυτού του αιωρήµατος µέσα αϖό αϖοστειρωµένο miracloth και το αιώρηµα κονιδίων τελικά συλλέχθηκε σε µια µικρή αϖοστειρωµένη κωνική φιάλη των 100ml Αϖοµόνωση PCN Για την ϖαραγωγή του συγκεκριµένου µεταβολίτη το βακτήριο καλλιεργήθηκε σε θρεϖτικό υλικό King s medium B (King et al., 1954), για την ϖαρασκευή του οϖοίου χρειάζονται: ϖρωτεόζη ϖεϖτόνη 20gr γλυκερόλη 10ml νερό αϖεσταγµένο 1 lt καθώς και 250µl αϖό το αϖοστειρωµένο διάλυµα (x1000) K2HPO4 (1,5 gr K2HPO4 σε 1 lt αϖεσταγµένο νερό), 250µl αϖό το αϖοστειρωµένο διάλυµα (x1000) MgSO4 (1,5 gr MgSO4 x 7H2O σε 1 lt αϖεσταγµένο νερό) και FeCl3 100 µμ τα οϖοία ϖροστέθηκαν µετά την αϖοστείρωση. Το υλικό µοιράστηκε σε τέσσερις κωνικές φιάλες των 500ml και αϖοστειρώθηκε στους C για 20 λεϖτά. Το υγρό θρεϖτικό υλικό εµβολιάστηκε µε βακτήρια µε τη βοήθεια βελόνας εµβολιασµού αϖό νεαρή καλλιέργεια σε στερεό υϖόστρωµα ΚΒ (+ άγαρ 1,8%). Οι καλλιέργειες εϖωάστηκαν σε αναδευτήρα (incubator shaker) στις 150 στροφές / λεϖτό και θερµοκρασία 28 0 C για 72 ώρες. 25

26 Η αϖοµόνωση του PCN έγινε σύµφωνα µε την ϖεριγραφή των Chin A Woeng et al (1998). Μετά το ϖέρας των 72 ωρών, ϖροκειµένου να αϖοµακρυνθούν τα βακτηριακά κύτταρα και να εκχειλιστεί ο µεταβολίτης η καλλιέργεια (500ml) φυγοκεντρήθηκε στις στροφές / λεϖτό για 15 λεϖτά. Στη συνέχεια, το υϖερκείµενο αφαιρέθηκε και αναµείχθηκε µε ίσο όγκο τολουολίου σε διαχωριστικό χωνί. Αφού το χωνί ανακινήθηκε αρκετά, αφέθηκε σε ηρεµία για λίγη ώρα ϖροκειµένου να διαχωριστούν οι φάσεις. Η φάση του διαλύτη συλλέχθηκε και, µετά την αϖοµάκρυνση του ϖλεονάζοντος νερού µε φυγοκέντρηση, η οργανική φάση συµϖυκνώθηκε µέχρι ξηρού. Το υλικό ϖου αϖέµεινε ύστερα αϖό τη συµϖύκνωση διαλύθηκε σε 500 µl ακετονιτρίλιο. Εϖίσης, 500 µl τολουολίου συµϖυκνώθηκαν µέχρι ξηρού, το υϖόλειµµα διαλύθηκε σε 500 µl ακετονιτρίλιο και χρησιµοϖοιήθηκε ως µάρτυρας. Με τη βοήθεια µηχανικής ϖιϖέτας 10 µl του υϖολείµµατος τοϖοθετήθηκαν σε ϖλάκα TLC µε υλικό C18 (Merck, Darmstadt, Germany). Εϖίσης, στην ϖλάκα τοϖοθετήθηκαν και 10 µl του µάρτυρα. Η ϖλάκα στη συνέχεια τοϖοθετήθηκε σε γυάλινο θάλαµο ανάϖτυξης TLC ο οϖοίος ϖεριείχε ένα µείγµα διαλυτών βουτανόλης : ακετόνης αναλογίας 90 : 10 (ν:ν) Μεταχειρίσεις Πειραµατικός σχεδιασµός Μετά την έκλουση οι ϖλάκες αφέθηκαν να στεγνώσουν για ϖερίϖου µία ώρα σε ρεύµα αέρα υϖό ασηϖτικές συνθήκες (Laminar Flow). Στη συνέχεια, τοϖοθετήθηκαν σε τετράγωνα τρυβλία και καλύφθηκαν µε θρεϖτικό υϖόστρωµα PDA θερµοκρασίας 40 0 C ϖου ϖεριείχε κονίδια του εκάστοτε µύκητα, σε συγκέντρωση 5 x 10 5 κονίδια / ml θρεϖτικού υλικού. Τα τρυβλία τοϖοθετήθηκαν σε θάλαµο ανάϖτυξης µε θερµοκρασία 25 0 C και ϖλήρες σκότος για 5 ηµέρες. Πραγµατοϖοιήθηκαν 2 εϖαναλήψεις µε σύνολο 4 τρυβλία (2 για κάθε µύκητα) η καθεµία. Οι µεταχειρίσεις ήταν οι εξής: 1) τρυβλία όϖου αναϖτυσσόταν ο φυτοϖαθογόνος µύκητας ϖαρουσία του µεταβολίτη ϖάνω στην ϖλάκα TLC. 2) τρυβλία όϖου αναϖτυσσόταν ο µύκητας C. rosea IK726 ϖαρουσία του µεταβολίτη ϖάνω στην ϖλάκα TLC. 26

27 2.2 Αϖοτελέσµατα Μακροσκοϖικές ϖαρατηρήσεις Μετά το ϖέρας 5 ηµερών τόσο στα τρυβλία, όϖου αναϖτύχθηκε ο φυτοϖαθογόνος µύκητας F. oxysporum f.sp. radicis lycopersici, όσο και στα τρυβλία, όϖου αναϖτύχθηκε ο µύκητας C. rosea IK726, ϖαρατηρήθηκε αϖουσία ανάϖτυξης µυκηλίου στο σηµείο µε Rf = 0,49, όϖου αντιστοιχεί στο µεταβολίτη φεναζίνη-1- καρβοξαµύδη ϖου ϖαράγεται αϖό το βακτήριο P. chlororaphis PCL 1391 (Chin A- Woeng et al 1998) (Εικ.11, 12). Αυτό αϖέδειξε ότι ο µεταβολίτης αναστέλλει όχι µόνο την ανάϖτυξη του φυτοϖαθογόνου, αλλά και του µύκητα C. rosea IK726. Εντούτοις, η αναστολή φάνηκε εντονότερη στην ϖερίϖτωση του F. oxysporum f.sp. radicis lycopersici αφού οι κηλίδες αναστολής στο µύκητα αυτόν είχαν µεγαλύτερη διάµετρο σε σχέση µε τον C. rosea IK726 (σύγκριση Εικ. 11 και 12). ϖαρατηρήθηκε στη θέση του µάρτυρα. Καµία αναστολή δεν Μάρτυρας Εικ. 11. Καλλιέργεια Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε PDA ϖάνω σε ϖλάκα C 18 όϖου ϖαρατηρείται αϖουσία ανάϖτυξης µυκηλίου στις ϖεριοχές όϖου αναϖτύχθηκε ο µεταβολίτης PCN ϖου ϖαράγεται αϖό το βακτήριο Pseudomonas chlororaphis PCL

28 µάρτυρας Εικ. 12. Καλλιέργεια του µύκητα Clonostachys rosea IK726 σε PDA ϖάνω σε ϖλάκα C 18 όϖου ϖαρατηρείται αϖουσία ανάϖτυξης µυκηλίου στις ϖεριοχές όϖου αναϖτύχθηκε ο µεταβολίτης PCN ϖου ϖαράγεται αϖό το βακτήριο Pseudomonas chlororaphis PCL Συζήτηση Ως γνωστόν το αντιβιοτικό PCN, ϖου εκκρίνει το βακτήριο P. chlororaphis PCL 1391, αναστέλλει τη µυκηλιακή ανάϖτυξη του φυτοϖαθογόνου µύκητα F. oxysporum f.sp. radicis lycopersici (Chin A- Woeng et al 1998). Τα αϖοτελέσµατα των in vitro δοκιµών σε TLC έδειξαν ότι ο µεταβολίτης αυτός αναστέλλει και την ανάϖτυξη του C. rosea IK726, αλλά σε µικρότερο βαθµό. Τα αϖοτελέσµατα των in vitro δοκιµών δείχνουν ότι ο µεταβολίτης PCN δρα ανασταλτικά στην ανάϖτυξη και των δύο µυκήτων, αλλά µε διαφορετική ένταση. Εϖοµένως, µε βάση τα ϖαραϖάνω ευρήµατα µϖορεί να θεωρηθεί ότι η δράση του βακτηρίου P. chlororaphis PCL 1391 ϖάνω στον C. rosea IK726, ϖου φάνηκε ότι οφείλεται στο αντιβιοτικό PCN, είναι ϖιθανό να εϖηρεάζει δυσµενώς την ενδεχόµενη δράση του υϖερϖαράσιτου µύκητα ϖάνω στο φυτοϖαθογόνο µύκητα. Όµως, η ϖαραγωγή αντιβιοτικών ουσιών in vitro δεν σχετίζεται ϖάντα και την ϖαραγωγή αυτών in vivo (Fravell 1988, Renwick et al 1991). Ένας 28

29 λόγος µϖορεί να είναι το γεγονός ότι η ϖαραγωγή αντιβιοτικών ουσιών διεγείρεται αϖό την ϖαρουσία διαφορετικών θρεϖτικών στοιχείων στη ριζόσφαιρα και in vitro. Για ϖαράδειγµα, οι Whipps & Magan (1987) µελέτησαν τις αλληλεϖιδράσεις βιολογικών ϖαραγόντων και φυτοϖαθογόνων και βρήκαν ότι το ϖοσοστό αναστολής σε διϖλές καλλιέργειες εξαρτάται αϖό το θρεϖτικό υϖόστρωµα. Οι Brown et al (1987) ανέφεραν ότι ορισµένα θρεϖτικά στοιχεία ϖαίζουν σηµαντικό ρόλο στην ϖοσότητα των αντιβιοτικών ουσιών ϖου ϖαράγονται αϖό το βακτήριο Epicoccum purpurrascens, γεγονός ϖου συνιστά ϖροσοχή στην ϖροσϖάθεια συσχέτισης της ϖαραγωγής αντιβιοτικών in vitro και in vivo. Τέλος, οι Stack et al (1987) ανέφεραν ότι η αναλογία C:N του υϖοστρώµατος εϖηρεάζει σηµαντικά την ϖαραγωγή αντιβιοτικών σε διάφορους βιολογικούς ϖαράγοντες. Εϖίσης, η θερµοκρασία, το ph και το νερό είναι ϖιθανό να εϖηρεάζουν την ϖαραγωγή αντιβιοτικών Ένας άλλος λόγος για τη µη συσχέτιση της ϖαραγωγής αντιβιοτικών in vitro και in vivo είναι η γρήγορη αδρανοϖοίηση τους στο έδαφος καθώς ϖροσκολλώνται στα κολλοειδή του εδάφους (Williams, 1982). Για ϖαράδειγµα, η συγκέντρωση χλωροµφαινικόλης (chloramphenicol) σε αϖοστειρωµένο έδαφος ϖαραµένει σταθερή για ϖερίϖου 14 µέρες, ενώ σε µη αϖοστειρωµένο έδαφος αϖοικοδοµείται µέσα σε 3 ηµέρες και µόνο ίχνη αυτής ϖαραµένουν µετά αϖό 14 ηµέρες (Gottlieb and Simonoff 1952). Συνεϖώς, τα in planta ϖειράµατα είναι αϖαραίτητα για ϖεραιτέρω αϖοσαφήνιση αυτών των φαινοµένων στη ριζόσφαιρα των φυτών τοµάτας. 29

30 Μέρος Β: Μελέτη αλληλεϖιδράσεων in planta Εϖεκτείνοντας ένα σύστηµα αξιολόγησης βιοϖαραγόντων, ϖροκειµένου να ϖεριλαµβάνονται και φυτά (ϖειράµατα in planta), άλλοι µηχανισµοί, όϖως η ϖρόκληση διασυστηµατικής αντοχής και η ϖροώθηση ανάϖτυξης των φυτών, αλλά και εδαφικοί ϖαράγοντες, όϖως οι εκκρίσεις θρεϖτικών ουσιών αϖό τις ρίζες των φυτών, θα συµϖεριληφθούν στο ϖαθοσύστηµα. Πρόσφατες έρευνες έχουν αϖοδείξει ότι όχι µόνο ένας, αλλά ϖερισσότεροι µηχανισµοί µϖορεί να είναι υϖεύθυνοι για τη βιολογική καταϖολέµηση (Knudsen et al 1997). Έτσι, ϖαρά το γεγονός ότι ο τρόϖος δράσης ενός βιολογικού ϖαράγοντα µϖορεί να είναι η ϖαραγωγή αντιβιοτικών ή ο ϖαρασιτισµός, εντούτοις ο ανταγωνισµός στη ριζόσφαιρα για θρεϖτικά στοιχεία µϖορεί να αϖοτελεί σηµαντική ϖτυχή της εϖιτυχούς βιολογικής καταϖολέµησης (Deacon 1991). Εϖοµένως, είναι φανερό ότι η αϖουσία φυτών αϖό ένα σύστηµα αξιολόγησης δεν δίνει ϖληροφορίες για την ικανότητα ενός µικροοργανισµού να αϖοικίζει και να ϖροστατεύει τις ρίζες ενός φυτού. Εϖιϖρόσθετα, τα εδαφογενή φυτοϖαθογόνα εξαρτώνται αϖό τις εκκρίσεις των ριζών κατά τα ϖρώτα στάδια της µόλυνσης (Nelson 1991), οϖότε η ικανότητα ενός υϖοψηφίου βιολογικού ϖαράγοντα να µεταβολίζει αυτές τις ουσίες, αϖοτελεί ϖολύ σηµαντικό γεγονός στη βιολογική καταϖολέµηση (Nelson 1991, Green & Jensen 1995). Σκοϖός των in planta ϖειραµάτων ϖου ϖαρουσιάζονται στη συνέχεια ήταν να διαϖιστωθεί αν συµβαίνει α) µείωση της έντασης της ασθένειας της σήψης λαιµού και ριζών της τοµάτας αϖό τον C. rosea IK726, ο οϖοίος έχει αναφερθεί για την εϖιτυχή αντιµετώϖιση άλλων φυτοϖαθογόνων όϖως ο F. culmorum στα σιτηρά (Knudsen et al 1995) και β) αν υϖάρχει αλληλεϖίδραση µεταξύ του C. rosea IK726 και του ήδη γνωστού βιολογικού ϖαράγοντα P. chlororaphis PCL 1391 εναντίον αυτής της ασθένειας (Chin A- Woeng et al 1988). 30

31 4. Μελέτη της αλληλεϖίδρασης του µύκητα Clonostachys rosea IK726 µε το βακτήριο Pseudomonas chlororaphis PCL 1391 κατά την αντιµετώϖιση της σήψης της ρίζας και του λαιµού της τοµάτας αϖό το µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici σε σύστηµα ελεγχόµενων συνθηκών (gnotobiotic) Σύστηµα gnotobiotic είναι ένα αϖοµονωµένο σύστηµα µελέτης οργανισµών, κάτω αϖό ϖλήρως ελεγχόµενες συνθήκες, όϖου αναϖτύσσονται µόνο οι υϖό εξέταση οργανισµοί χωρίς την ϖαρουσία κανενός άλλου ζώντος οργανισµού. Έτσι, ο σκοϖός αυτών των ϖειραµάτων ήταν 1) ο έλεγχος της δράσης του C. rosea IK726 εναντίον του F. oxysporum f.sp. radicis lycopersici in planta και 2) ο έλεγχος της αλληλεϖίδρασης του µύκητα C. rosea IK726 και του βακτηρίου P. chlororaphis PCL 1391 στην αντιµετώϖιση του µύκητα F. oxysporum f.sp. radicis lycopersici χωρίς την εϖίδραση άλλων βιοτικών ή αβιοτικών ϖαραγόντων, ώστε να υϖάρχει µία ξεκάθαρη εικόνα της δυνατότητας βιολογικού ελέγχου. 4.1 Υλικά και Μέθοδοι Σύστηµα gnotobiotic µε άµµο σε δοκιµαστικούς σωλήνες Το σύστηµα gnotobiotic ϖου χρησιµοϖοιήθηκε, ήταν µια ϖαραλλαγή αυτού ϖου ϖεριγράφηκε αϖό τους Simons et al (1996). Αϖοτελείται αϖό ένα γυάλινο κυλινδρικό σωλήνα ύψους 95mm και εσωτερικής διαµέτρου 40mm, στο εσωτερικό του οϖοίου αναϖτύσσονται τα φυτά. Οι σωλήνες γεµίστηκαν σε ύψος 5 cm µε ϖερλίτη. Το άνοιγµα του σωλήνα σφραγίστηκε µε ανυδρόφιλο βαµβάκι και καλύφτηκε µε αλουµινόχαρτο. Στη συνέχεια, οι σωλήνες αϖοστειρώθηκαν για 25 λεϖτά στους C. Μετά το ϖέρας της αϖοστείρωσης οι σωλήνες ϖληρώθηκαν µε αϖοστειρωµένη άµµο (quartz sand), ϖερίϖου 30 gr ο καθένας και διάµετρο κόκκων αϖό 0,1mm 0,3mm, η οϖοία ϖροηγουµένως αναµείχθηκε µε 10% (v : w) θρεϖτικό διάλυµα PNS (Plant Nutrition Solution) (Εικ. 13). Για την ϖαρασκευή 1 λίτρου PNS (x4) αϖαιτούνται τα εξής (Hoffland 1992): 31

32 1. 5,0 mm Ca(NO3)2 1,8 gr 2. 5,0 mm KNO3 0,5 gr 3. 2,0 mm MgSO4 x 7H2O 0,48 gr mM KHPO4 1% 5. διάλυµα ιχνοστοιχείων 1,0 ml 1 lt αϖεσταγµένο νερό Το ph ϖροσαρµόστηκε στο 5,8 Για την ϖαρασκευή του διαλύµατος ιχνοστοιχείων χρησιµοϖοιήθηκαν τα εξής: 1. 4,5 µμ ΚΙ 0,75 mg/ lt 2. 5,0 µμ H3BO4 3,0 mg/ lt µμ MnSO4 Η2Ο 10,0 mg/ lt 4. 7,0 µμ ZnSO4 5 Η2Ο 2,0 mg/ lt 5. 1,0 µμ NaMoO4 2 Η2Ο 0,25 mg/ lt 6. 0,1 µμ CuSO45 Η2Ο 0,025 mg/ lt 7. 0,1 µμ CoCl2 6 Η2Ο 0,025 mg/ lt Εικ. 13. Ανάϖτυξη φυτών σε σύστηµα gnotobiotic 32

33 4.1.2 Μικροοργανισµοί Οι µικροοργανισµοί διατηρήθηκαν και καλλιεργήθηκαν όϖως αναφέρθηκε στο κεφάλαιο Παραγωγή και µέτρηση του µολύσµατος Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici Η ϖαραγωγή µολύσµατος έγινε όϖως αναφέρθηκε στην ϖαράγραφο Clonostachys rosea ΙΚ726 Κονίδια του µύκητα ϖαραλήφθηκαν µε τον ίδιο τρόϖο ϖου ϖεριγράφηκε στην ϖαράγραφο Pseudomonas chlororaphis PCL 1391 Για την ϖαραγωγή ϖυκνού αιωρήµατος βακτηρίων χρησιµοϖοιήθηκε ως θρεϖτικό υλικό το King s medium B (King et al 1954), όϖως ϖεριγράφεται στην ϖαράγραφο µε τη διαφορά ότι στο υλικό δεν ϖροστέθηκε Fe. Το υγρό θρεϖτικό υλικό εµβολιάστηκε µε βακτήρια, µε τη βοήθεια βελόνας εµβολιασµού, αϖό νεαρή καλλιέργεια σε στερεό υϖόστρωµα ΚΒ (+ άγαρ 1,8%). Οι καλλιέργειες εϖωάστηκαν σε αναδευτήρα (incubator shaker) στις 150 στροφές / λεϖτό και θερµοκρασία 28 0 C για µία ηµέρα. Για τη µέτρηση της συγκέντρωσης των βακτηριακών κυττάρων χρησιµοϖοιήθηκε φασµατοφωτόµετρο (JENWAY 6405). Η εϖιθυµητή συγκέντρωση των 2 x 10 9 cfu / ml αντιστοιχούσε σε οϖτική ϖυκνότητα OD620 = 0,7. Προκειµένου να εϖιτευχθεί η ϖαραϖάνω συγκέντρωση, αφού αϖοµακρύνθηκε το ΚΒ µε φυγοκέντρηση για δεκαϖέντε λεϖτά σε θερµοκρασία 24 0 C και στις 6000 rpm, έγιναν διαδοχικές αραιώσεις µε ρυθµιστικό διάλυµα PBS (Phosphate Buffered Saline) Για την ϖαρασκευή του PBS χρησιµοϖοιήθηκαν: NaCl KCl 8,0 gr / lt 0,2 gr / lt 33

34 Na2HPO4 x 2 H2O 1,44 gr / lt K2HPO4 0,24 gr / lt (νερό αϖεσταγµένο 1 lt) Πριν την αϖοστείρωση του διαλύµατος το ph του ρυθµίστηκε στην τιµή 7,4 µε την ϖροσθήκη ΝaOH Εφαρµογή βιολογικών ϖαραγόντων Η εφαρµογή του βακτηρίου έγινε µε εµβάϖτιση ϖροβλαστηµένων σϖόρων της τοµάτας (βλ ) σε αιώρηµα βακτηριακών κυττάρων συγκέντρωσης 2 x 10 9 cfu / ml για 15 λεϖτά. Παροµοίως, η εφαρµογή του C. rosea IK726 ϖραγµατοϖοιήθηκε µε εµβάϖτιση των σϖόρων σε αιώρηµα κονιδίων συγκέντρωσης 10 6 κονίδια/ ml για 15 λεϖτά Μόλυνση µε το φυτοϖαθογόνου Υγρή καλλιέργεια ηλικίας 3 ηµερών του φυτοϖαθογόνου µύκητα F. oxysporum f.sp. radicis - lycopersici σε Czapek Dox Broth διηθήθηκε µέσω αϖοστειρωµένου miracloth. Στο σύστηµα gnotobiotic ϖρέϖει να αλληλεϖιδρούν µόνο οι µικροοργανισµοί µε το φυτό. Κάθε ίχνος θρεϖτικών στοιχείων, όϖως ενώσεις του άνθρακα, ϖρέϖει να αϖοµακρυνθεί, ώστε οι µικροοργανισµοί να ελκύονται ϖρος τη ρίζα για να βρουν ϖηγή άνθρακα αϖό τις εκκρίσεις της. Έτσι, ϖροκειµένου να αφαιρεθεί το θρεϖτικό διάλυµα αϖό τα σϖόρια, η καλλιέργεια φυγοκεντρήθηκε για 15 λεϖτά στις στροφές / λεϖτό. Στη συνέχεια, το υϖερκείµενο αφαιρέθηκε και το ίζηµα κονιδίων εϖαναδιαλύθηκε σε αϖοστειρωµένο νερό και φυγοκεντρήθηκε ξανά. Η διαδικασία αυτή εϖαναλήφθηκε 3 φορές. Τέλος, το ίζηµα διαλύθηκε σε 10ml αϖοστειρωµένου νερού και χρησιµοϖοιήθηκε για τη µόλυνση των φυτών. Η µόλυνση ϖραγµατοϖοιήθηκε µε ϖροσθήκη κονιδίων στο θρεϖτικό διάλυµα PNS, µε το οϖοίο στη συνέχεια έγινε διαβροχή της άµµου. Η συγκέντρωση κονιδίων µέσα στο PNS ϖροσαρµόστηκε στα 5 x 10 2 κονίδια / ml, το οϖοίο στη συνέχεια αναµείχθηκε µε αϖοστειρωµένη άµµο (quartz sand) σε αναλογία 1:10 v:w, έτσι ώστε υϖάρχουν 50 κονίδια / gr άµµου. 34

35 4.1.6 Φυτικό υλικό, υϖόστρωµα, συνθήκες ανάϖτυξης των φυτών και ϖειραµατικός σχεδιασµός Σε όλες τις ϖειραµατικές δοκιµές χρησιµοϖοιήθηκαν φυτά τοµάτας ϖοικιλίας ACE 55 η οϖοία είναι ευϖαθής στην ϖροσβολή αϖό το συγκεκριµένο φυτοϖαθογόνο µύκητα. Οι σϖόροι αυτοί αϖολυµάνθηκαν µε εµβάϖτισή τους σε οικιακή χλωρίνη. Μετά το ϖέρας 3 λεϖτών οι σϖόροι ξεϖλένονταν ανά 30 λεϖτά µε αϖοστειρωµένο νερό για τις εϖόµενες δύο ώρες. Στη συνέχεια, οι αϖολυµασµένοι σϖόροι τοϖοθετήθηκαν σε τρυβλία Petri τα οϖοία ϖεριείχαν θρεϖτικό διάλυµα PNS + άγαρ 1,8%. Προκειµένου να βλαστήσουν οι σϖόροι, τα τρυβλία τοϖοθετήθηκαν ανεστραµµένα για 2 µέρες στους 4 ο C και για 2 µέρες στους 25 ο C. Οι ϖροβλαστηµένοι σϖόροι τοϖοθετήθηκαν ένας σε κάθε σωλήνα υϖό ασηϖτικές συνθήκες σε βάθος ϖερίϖου 1cm µέσα στη στήλη της άµµου. Τα φυτά αναϖτύχθηκαν σ αυτό το αϖοµονωµένο σύστηµα για 15 µέρες µέσα σε θάλαµο ανάϖτυξης µε σταθερή θερµοκρασία 22 0 C και φωτοϖερίοδο 16 ώρες. Πραγµατοϖοιήθηκαν τέσσερις χρονικές εϖαναλήψεις του ϖειράµατος χρησιµοϖοιώντας 100 φυτά σε κάθε µια αϖό αυτές ακολουθώντας σε κάθε µία τους ϖαρακάτω χειρισµούς: 1) 20 ϖροβλαστηµένοι σϖόροι αναϖτύχθηκαν σε άµµο ϖου ϖεριείχε µόνο το θρεϖτικό διάλυµα PNS (αρνητικός µάρτυρας). 2) 20 ϖροβλαστηµένοι σϖόροι αναϖτύχθηκαν σε άµµο µολυσµένη µε κονίδια του φυτοϖαθογόνου µύκητα (θετικός µάρτυρας). 3) 20 ϖροβλαστηµένοι σϖόροι εµβαϖτίστηκαν σε αιώρηµα κονιδίων του µύκητα C. rosea IK726 και στη συνέχεια φυτεύτηκαν σε άµµο µολυσµένη µε κονίδια του φυτοϖαθογόνο µύκητα (Forl + C. rosea). 4) 20 ϖροβλαστηµένοι σϖόροι εµβαϖτίστηκαν σε αιώρηµα βακτηρίων και στη συνέχεια φυτεύτηκαν σε µολυσµένη µε κονίδια άµµο (Forl + PCL). 5) 20 ϖροβλαστηµένοι σϖόροι εµβαϖτίστηκαν σε ένα αιώρηµα ϖου ϖεριείχε και τους δύο βιολογικούς ϖαράγοντες σε αναλογία 1:1 και φυτεύτηκαν σε µολυσµένη άµµο (Forl + PCL + C. rosea). 35