ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ - ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ "ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ" ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Αλληλεπιδράσεις των συστημάτων νευροδιαβίβασης ντοπαμίνης/αδενοσίνης στον εγκέφαλο των weaver μυών, γενετικού μοντέλου ντοπαμινεργικής απονεύρωσης ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠOYΛΟΥ Βιολόγος Πάτρα, 2007

2 2

3 Η παρούσα διδακτορική διατριβή έγινε στο Εργαστήριο Φυσιολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες. Τριμελής συμβουλευτική επιτροπή Αγγελάτου Φεβρωνία Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Φλωρδέλλης Χριστόδουλος Ματσώκης Νικόλαος Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Αναπληρωτής καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Επταμελής εξεταστική επιτροπή Κωστόπουλος Γεώργιος Μοσχονάς Νικόλαος Φλωρδέλλης Χριστόδουλος, Αγγελάτου Φεβρωνία Ματσώκης Νικόλαος Μητσάκου Αδαμαντία Ταραβήρας Σταύρος Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Επίκουρος καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Η παρούσα διδακτορική διατριβή χρηματοδοτήθηκε από τη Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας και τον φορέα European Social Fund, Αριθμός 01ΕΔ611. Επιστημονικός Υπεύθυνος: Γ.Χαλεπάκης, Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Πανεπιστημίου Κρήτης 3

4 4

5 Αντί προλόγου Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την Επιβλέπουσα καθηγήτριά μου κ. Φεβρωνία Αγγελάτου, η οποία μου πρόσφερε την ευκαιρία να ασχοληθώ με την έρευνα στο πεδίο των Νευροεπιστημών, με καθοδήγησε επιστημονικά και με στήριξε τόσο σε επιστημονικό, όσο και σε ανθρώπινο επίπεδο. Η σχέση που αναπτύξαμε όλα αυτά τα χρόνια θεωρώ οτι είναι για μένα μια σχέση ζωής. Επίσης ευχαριστώ πολύ τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής για την παρουσία τους στην παρουσίαση αυτής της διατριβής και τα σχόλια τους πάνω στην εργασία μου: τον καθηγητή κ. Γ.Κωστόπουλο, τον καθηγητή κ. Χ.Φλωρδέλλη, τον καθηγητή κ. Ν.Μοσχονά, τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Ν.Ματσώκη και την αναπληρώτρια καθηγήτρια κ. Α.Μητσάκου. Ακόμη, τον επίκουρο καθηγητή κ. Σ.Ταραβήρα για την υποστήριξή που ελάμβανα από μέρους του. Θα ήθελα όμως να αναφερθώ ιδιαίτερα στα μέλη ΔΕΠ του Εργαστηρίου Φυσιολογίας του Τμήματος Ιατρικής για την προσφορά γνώσης όλα αυτά τα χρόνια τόσο μέσα από τα μαθήματα του μεταπτυχιακού προγράμματος των Βασικών Ιατρικών Επιστημών, όσο από σεμινάρια, αλλά και από την καθημερινή επαφή. Ευχαριστώ τους κ. Η.Κούβελα, κ. Γ.Κωστόπουλο, κ. Α.Μητσάκου, κ. Γ.Βουκελάτου και τον κ. Κ.Παπαθεοδωρόπουλο. Aκόμη, τα μέλη ΔΕΠ του Εργαστηρίου Φυσιολογίας του Τμήματος Βιολογίας κ. Ν.Ματσώκη, κ. Ν.Παναγόπουλο, κ. Π.Γιομπρέ και κ. Μ.Μαργαρίτη. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον Κώστα Μποτσάκη και τη Ράνια Παύλου που τον τελευταίο καιρό με βοήθησαν με τα πειράματα ηλεκτροφορήσεων. Επίσης για την άριστη συνεργασία που είχαμε. Η βοήθεια του Κ.Μποτσάκη ήταν ανεκτίμητη και τον ευχαριστώ πολύ. Τέλος ευχαριστώ πολύ τον Αντώνη Αυγουστίνο που ήταν δίπλα μου πολύ πριν απο το ξεκίνημα αυτό και συνεχίζει να με στηρίζει και να με εμψυχώνει και στα ερευνητικά μου ενδιαφέροντα αλλά και στη ζωή γενικότερα. 5

6 6

7 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ... 9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η νόσος του Πάρκινσον (ΝΠ) Πειραματικά μοντέλα μελέτης της NΠ Βασικά γάγγλια Ντοπαμίνη DARPP Αδενοσίνη...60 Αλληλεπιδράσεις μεταξύ υποδοχέων MAPKs: mitogen activated protein kinases Οπιοειδή πεπτίδια Πρώιμα γονίδια- Ρόλος- Έκφραση ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Θεωρητικό μέρος Πειραματικό μέρος Αυτοραδιογραφία για την ποσοτική και τοπογραφική μελέτη υποδοχέων In situ υβριδοποίηση για τον προσδιορισμό τoυ mrna του πρώιμου γονιδίου zif/268 και των γονιδίων των πεπτιδίων εγκεφαλίνης και δυνορφίνης Πειράματα φωσφορυλίωσης της DARPP-32 (στη θέση Thr-34) και των MAPK44/42 (ERK1/2) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αλληλεπίδραση των D1 υποδοχέων ντοπαμίνης και Α1 υποδοχέων αδενοσίνης στο επίπεδο της έκφρασης του πρώιμου γονιδίου zif/268 στο ραβδωτό σώμα και τον εγκεφαλικό φλοιό των μυών weaver Επίδραση του ειδικού αγωνιστή των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης CPA στην έκφραση του πρώιμου γονιδίου zif/

8 Διερεύνηση του μηχανισμού μέσω του οποίου η διέγερση του Α1 υποδοχέα αδενοσίνης (μέσω CPA) επάγει την έκφραση του zif/268 με χρήση ανταγωνιστών των Α1 και Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης και αγωνιστών των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης Διερεύνηση του μηχανισμού της επαγωγής του zif/268 μέσω των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης με χρήση αναστολέων της φωσφολιπάσης C (PLC) και της οδου των MAP κινασών In vivo επίδραση του αγωνιστή των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης CPA στην έκφραση του νευροπεπτιδίου εγκεφαλίνη στο ραβδωτό σώμα των weaver μυών Διερεύνηση του μηχανισμού μέσω του οποίου η διέγερση του Α1 υποδοχέα αδενοσίνης (μέσω CPA) επάγει την έκφραση της εγκεφαλίνης με χρήση αγωνιστών των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης και ανταγωνιστών των Α1 και Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης Διερεύνηση του μηχανισμού της επαγωγής της εγκεφαλινης μέσω των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης με χρήση αναστολέων της φωσφολιπάσης C (PLC) και της οδου των MAP κινασών In vivo επίδραση του αγωνιστή των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης CPA στην έκφραση του νευροπεπτιδίου δυνορφίνη στο ραβδωτό σώμα των weaver μυών Διερεύνηση του μηχανισμού της υπερευαίσθητης απόκρισης των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης στο ραβδωτό σώμα των μυών weaver Αυτοραδιογραφικη μελέτη των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης και των D1 υποδοχέων ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα των μυών weaver ΣΥΖΗΤΗΣΗ Αλληλεπίδραση Α1Rs/D1Rs στο επίπεδο έκφρασης του πρώιμου γονιδίου zif/268 mrna στο ραβδωτό σώμα των απονευρωμένων μυών weaver Επίδραση της ενεργοποίησης των A1Rs στην έκφραση του zif/268 mrna στους απονευρωμένους μύες weaver Διερεύνηση του μηχανισμού μέσω του οποίου η διέγερση του Α1 υποδοχέα αδενοσίνης (μέσω CPA) επάγει την έκφραση του zif/ Διερεύνηση του μηχανισμού της υπερευαίσθητης απόκρισης των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης που εμφανίζεται στη ντοπαμινεργική απονεύρωση των weaver μυών ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ABSTRACTS

9 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Τα βασικά γάγγλια αποτελούν πυρήνες του τελεγκεφάλου, του διεγκεφάλου και του μέσου εγκεφάλου, οι οποίοι εμπλέκονται στην ρύθμιση της εκούσιας κινητικής λειτουργίας. Αποτελούνται από το ραχιαίο ραβδωτό σώμα (κέλυφος-κερκοφόρο πυρήνα), την ωχρά σφαίρα, τον υποθαλάμιο πυρήνα και τη μέλαινα ουσία. Το ραβδωτό δέχεται γλουταμινεργική νεύρωση από τον εγκεφαλικό φλοιό και στέλνει ίνες στη δικτυωτή μοίρα της μέλαινας ουσίας και στη εσωτερική μοίρα της ωχράς σφαίρας, που αποτελούν τους πυρήνες εξόδου των βασικών γαγγλίων προς το θάλαμο και τελικά προς τον εγκεφαλικό φλοιό. Οι πυρήνες εξόδου των βασικών γαγγλίων τονικά αναστέλλουν τους πυρήνες στόχους τους στο θάλαμο/εγκεφαλικό στέλεχος. Αυτή η ανασταλτική έξοδος τροποποιείται από δυο παράλληλες οδούς που ξεκινούν από το ραχιαίο ραβδωτό: την άμεση και την έμμεση οδό, που είναι υπεύθυνες για την ομαλή και καλά συντονισμένη διεξαγωγή των κινήσεων. Η ενεργοποίηση της άμεσης οδού προκαλεί δυσαναστολή του θαλάμου, αυξάνοντας έτσι την θαλαμοφλοιική δραστηριότητα, με αποτέλεσμα να διευκολύνεται η κίνηση. Η ενεργοποίηση της έμμεσης οδού αυξάνει την αναστολή της θαλαμοφλοιικής δραστηριότητας, με αποτέλεσμα να μειώνεται η κινητική λειτουργία. Η ομαλή λειτουργία των δύο νευρικών οδών ρυθμίζεται από τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες, οι οποίοι ξεκινούν από τη συμπαγή μοίρα της μέλαινας ουσίας και νευρώνουν τα κύτταρα του ραβδωτού σώματος. Οι ντοπαμινεργικοί αυτοί νευρώνες ελέγχουν τη λειτουργία της άμεσης οδού μέσω των D1 υποδοχέων ντοπαμίνης (D1Rs), οι οποίοι συζευγνύονται με Gs (διεγερτικές) πρωτεΐνες και αντίστοιχα τη λειτουργία της έμμεσης οδού μέσω των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης (D2Rs), οι οποίοι συζευγνύονται με Gi (ανασταλτικές) πρωτεΐνες. Ωστόσο, αν και η δράση της ντοπαμίνης στις δύο οδούς είναι διαφορετική οδηγεί στο ίδιο αποτέλεσμα, δηλαδή στη μειωμένη αναστολή των θαλαμοφλοιικών νευρώνων, διευκολύνοντας έτσι τις κινήσεις που ξεκινούν από το φλοιό. Η νόσος του Πάρκινσον (ΝΠ) είναι μια νευροεκφυλιστική νόσος που εξαρτάται από την ηλικία και πλήττει το 1-2% του γηράσκοντα πληθυσμού. Η νόσος οφείλεται στην εκλεκτική εκφύλιση της ντοπαμινεργικής μελαινοραβδωτής οδού των βασικών γαγγλίων, με αποτέλεσμα να χάνεται ο έλεγχος της εύρυθμης λειτουργίας των δύο νευρικών οδών, της άμεσης και της έμμεσης. Συγκεκριμένα, στη ΝΠ παρατηρείται αυξημένη δραστηριότητας της έμμεσης οδού του ραβδωτού σώματος, με αποτέλεσμα αυξημένη αναστολή των 9

10 θαλαμοφλοιϊκών νευρώνων και του φλοιού που οδηγεί στην εμφάνιση των γνωστών κινητικών δυσλειτουργιών (βραδυκινησία, τρόμος σε ηρεμία, ακαμψία, αστάθεια θέσης). Στους νευρώνες του ραβδωτού σώματος της άμεσης οδού οι D1Rs συνεδράζονται και αλληλεπιδρούν ανταγωνιστικά με τους Α1 υποδοχείς αδενοσίνης (A1Rs), ενώ αντίστοιχα στους νευρώνες της έμμεσης οδού οι D2Rs συνεδράζονται και αλληλεπιδρούν ανταγωνιστικά με τους Α2Α υποδοχείς αδενοσίνης (A2ARs). Η σχέση των D1Rs/A1Rs και των D2Rs/A2ΑRs είναι ανταγωνιστική τόσο στο επίπεδο υποδοχέα-υποδοχέα στην κυτταρική μεμβράνη, όσο και στο επίπεδο δευτερογενών μηνυμάτων και κινητικής συμπεριφοράς. Τελευταία, ανακαλύφθηκαν λειτουργικά ετεροδιμερή σύμπλοκα A1/D1 και A2A/D2 υποδοχέων, που έδωσαν ένα μορφολογικό πλαίσιο για την ύπαρξη αυτών των αλληλεπιδράσεων σε βιοχημικό επίπεδο. Έχει ενδιαφέρον, ότι αυτά τα σύμπλοκα οδηγούν σε λειτουργικές και φαρμακολογικές ιδιότητες του διμερούς, που είναι διαφορετικές από αυτές του κάθε υποδοχέα ξεχωριστά. Από φαρμακολογική άποψη, αυτές οι αλληλεπιδράσεις ανοίγουν νέες θεραπευτικές προοπτικές με το ενδιαφέρον να είναι στραμμένο στη δημιουργία διμερών προσδεμάτων (bivalent ligands) που να μπορούν να αλληλεπιδρούν ταυτόχρονα και με τους δύο υποδοχείς. Δισθενή προσδέματα ντοπαμίνης/αδενοσίνης (που συμπεριφέρονται ταυτόχρονα ως αγωνιστές των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης και ως ανταγωνιστές των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης) αποτελούν καινούρια εργαλεία στη στόχευση για φαρμακευτική αγωγή της ΝΠ. Η πιο αποτελεσματική φαρμακευτική αγωγή για την ανακούφιση των κινητικών δυσλειτουργιών της ΝΠ θεωρείται σήμερα η χορήγηση της L-DOPA, που υποκαθιστά την έλλειψη της ενδογενούς ντοπαμίνης. Δυστυχώς όμως, χρόνια χορήγηση της L-DOPA προκαλεί στο μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών έντονες παρενέργειες με την εμφάνιση κινητικών δυσκινησιών. Για το λόγο αυτό η ανάγκη εξεύρεσης καινούριων φαρμάκων που θα υποκαταστήσουν ή θα μειώσουν τις δόσεις της L-DOPA είναι επιτακτική. Ένα πιθανό υποψήφιο αντιπαρκινσονικό φάρμακο, το οποίο δοκιμάζεται ήδη σε ασθενείς (κλινική φάση ΙΙΙ), είναι ανταγωνιστές των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης. Η αδενοσίνη αποτελεί ένα ομοιοστατικό μόριο που δρα και ως νευροτροποποιητής, ρυθμίζοντας την απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών και τη νευρωνική διεγερσιμότητα στον εγκέφαλο. Οι Α1 υποδοχείς αδενοσίνης (συζευγνύονται με Gi) εντοπίζονται σχεδόν σε όλα τις περιοχές του εγκεφάλου, ενώ οι Α2Α υποδοχείς (συζευγνύονται με Gs) εντοπίζονται σε μεγάλη συγκέντρωση κυρίως στο ραβδωτό σώμα, υποδεικνύοντας την ιδιαίτερη σημασία που έχουν στο κύκλωμα των βασικών γαγγλίων. 10

11 Με αυτά τα δεδομένα, ο πρώτος στόχος της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθεί σε ένα γενετικό μοντέλο μελαινοραβδωτής εκφύλισης, στον μυ weaver, εάν η ανταγωνιστική αλληλεπιδράση των Α1R/D1R υποδοχέων έχει διαταραχθεί κάτω από τη συνεχή έλλειψη ντοπαμίνης. Ο δεύτερος στόχος ήταν να μελετηθεί in vivo η μεταγωγή σήματος των Α1R και Α2ΑR υποδοχέων αδενοσίνης στο ραβδωτό σώμα των weaver μυών, κάτω από τη ντοπαμινεργική απονεύρωση. Ο μυς «weaver» είναι ένα γενετικό μοντέλο μελέτης παρκινσονισμού που προσομοιάζει πολύ την ανθρώπινη έκφραση της ΝΠ (phenocopy of Parkinson disease), καθώς χαρακτηρίζεται από προοδευτική εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας. Στον πρώτο στόχο η in vivo ανταγωνιστική αλληλεπίδραση των D1Rs/Α1Rs μελετήθηκε με την ενεργοποίηση της άμεσης οδού, με χορήγηση του ειδικού αγωνιστή των D1 υποδοχέων ντοπαμίνης SKF38393 και την καταστολή της ενεργοποίησης με τη συγχορήγηση του ειδικού αγωνιστή των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης CPA. Η επίδρασης της αδενοσίνης στους νευρώνες της άμεσης οδού μελετήθηκε επίσης με τη χορήγηση του ειδικού αγωνιστή των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης CPA. Και στις δύο περιπτώσεις η μελέτη έγινε στο επίπεδο της έκφρασης του πρώιμου γονιδίου zif/268 και των γονιδίων των πεπτιδίων εγκεφαλίνης και δυνορφίνης. Το πρώιμο γονίδιο zif/268 χρησιμοποιείται ευρέως για τη μελέτη της ενεργοποίησης των νευρικών κυττάρων, αλλά και για την ανίχνευση λειτουργικών νευρωνικών κυκλωμάτων, ενώ τα γονίδια της εγκεφαλίνης και δυνορφίνης αποτελούν δείκτες των νευρώνων της έμμεσης και της άμεσης οδού αντίστοιχα. Ο δεύτερος στόχος ήταν να διερευνηθεί ο μηχανισμός μέσω του οποίου η ενεργοποίηση των Α1 υποδοχέων επάγει την έκφραση του zif/268 στο ραβδωτό και στο φλοιό των weaver μυών. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι στην Α1 επαγόμενη ενεργοποίηση εμπλέκονται οι Α2Α υποδοχείς αδενοσίνης και η ενεργοποίηση της έμμεσης οδού. Η μελέτη της συμμετοχής των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης στην επαγωγή του zif/268 στο μυ weaver πραγματοποιήθηκε με τη διερεύνηση των οδών μεταβίβασης σήματος, που δραστηριοποιούνται μετά από την in vivo ενεργοποίηση με αγωνιστή των Α2Α υποδοχέων. Συγκεκριμένα η μελέτη έγινε με in vivo διέγερση των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης με τον ειδικό αγωνιστή CGS21680 και διερεύνηση της μεταγωγής σήματος α) μέσω του καθιερωμένου μονοπατιού Α2ΑR/Gs/AC/cAMP/PKA/pDARPP-32/ pcreb, το οποίο οδηγεί στη επαγωγή του zif/268 και β) μέσω του μονοπατιού των MAP κινασών (ΜΑΡΚ). Ως δείκτες ενεργοποίησης των δύο μονοπατιών μεταβίβασης σήματος χρησιμοποιήθηκαν α) η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης DARPP-32 (dopamine- and camp-regulated phosphoprotein, 11

12 MW 32kDa) στη θέση Thr-34 και β) η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών MAPK 42/44 (ERK1/2). Η DARPP-32 εκφράζεται στο ραβδωτό σώμα και γενικά στους νευρώνες που δέχονται ντοπαμινεργική είσοδο και αποτελεί κεντρικό μόριο της διαβίβασης σήματος των νευρώνων αυτών Η φωσφορυλίωση στη θέση Τhr-34 πολλαπλασιάζει τις δράσεις της πρωτεϊνικής κινάσης Α (ΡΚΑ). Οι MAPK 42/44 (ERK1/2) αποτελούν κινάσες που επάγονται στο νευρικό σύστημα σε καταστάσεις νευρωνικής πλαστικότητας. Η ερευνητική αξία αυτής της εργασίας έγκειται στο γεγονός ότι δίνει καινούρια πληροφορία για το ρόλο των Α1 και Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης στη λειτουργία των βασικών γαγγλίων, in vivo, κάτω από συνθήκες ντοπαμινεργικής απονεύρωσης. Η διέγερση των Α1 υποδοχέων στο μυ weaver οδηγεί απροσδόκητα στην ενεργοποίηση της έμμεσης οδού, η οποία όπως δείχτηκε διενεργείται μέσω της υπερευαίσθητης απόκρισης των Α2Α υποδοχέων. Η υπερευαίσθητη απόκριση των Α2Α υποδοχέων, σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, φαίνεται να οφείλεται στην ενισχυμένη μεταβίβαση σήματος μέσω του Α2ΑR/Gs/AC/cAMP/PKA /pdarpp-32/ pcreb μονοπατιού. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας έχουν ενδεχομένως κλινικό ενδιαφέρον, δεδομένου ότι η ενεργοποίηση της έμμεσης οδού μέσω των Α1 υποδοχέων από την ενδογενή αδενοσίνη θα επιδείνωνε περαιτέρω τις κινητικές δυσλειτουργίες της ΝΠ. Η πληροφορία αυτή, καθώς και η γνώση για την ενισχυμένη μεταγωγή σήματος μέσω των Α2Α υποδοχέων ενισχύουν την πρόταση για χρήση των Α2Α ανταγωνιστών ως αντιπαρκινσονικά φάρμακα. 12

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 13

14 14

15 Η ΝΟΣΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΚΙΝΣΟΝ (ΝΠ) Η ΝΠ είναι μια χρόνια και προοδευτική νόσος εξαρτώμενη από την ηλικία που οφείλεται στην εκφύλιση της μελαινοραβδωτής οδού των βασικών γαγγλίων, που υπερβαίνει το 1% σε ηλικίες άνω των 65 ετών. Η μέση ηλικία έναρξης της νόσου είναι έτη. Η νόσος όμως εμφανίζεται και σε πιο νεαρή ηλικία, κάτω των 40 ετών (νεανικός παρκινσονισμός). Περιγράφτηκε για πρώτη φορά από τον James Parkinson (1817). Η ΝΠ σε πλήρη ανάπτυξη αποτελεί ένα σύνδρομο που περιλαμβάνει ως κύριο σύμπτωμα την βραδυκινησία, δηλαδή τη δυσκολία ή αποτυχία εκτέλεσης εκούσιων κινήσεων σε συνδυασμό με ένα από τα επόμενα: τον τρόμο κατά την ηρεμία, την ακαμψία και διαταραχές της στάσης και της βάδισης (αστάθεια θέσης) (Richardson et al, 1997, Marsden and Fower, 2001). Συνήθως υπάρχουν δύο ή τρία συμπτώματα, αν και ενίοτε η διάγνωση μπορεί να τεθεί μόνο από την παρουσία του τρόμου. Η βραδυκινησία είναι το πιο εξουθενωτικό σύμπτωμα. Αναφέρεται συνήθως από τους ασθενείς ως αδυναμία ή δυσχέρεια εκτέλεσης των καθημερινών δραστηριοτήτων, όπως το πλύσιμο ή το ντύσιμο (Marsden and Fower, 2001). Ο τρόμος ηρεμίας με συχνότητα 3-5 κύκλους στο 1 υποχωρεί ή καταργείται με την κίνηση των άκρων και είναι το πιο αναγνωρίσιμο σύμπτωμα. Είναι κυρίως εμφανής σε υπτιασμό του αντιβραχίου και στις αρθρώσεις των δακτύλων των χεριών. Η γνάθος και η περιστοματική περιοχή μπορεί επίσης να συμμετέχουν. Ο ασθενής παρουσιάζει καμπτική στάση κορμού (κύφωση) και άκαμπτη κεφαλή. Έχουν την τάση να επιταχύνουν το βήμα τους (ακούσια επιτάχυνση του βαδίσματος) δίνοντας την εντύπωση ότι κυνηγούν το βήμα τους. Στα προχωρημένα στάδια της νόσου, παρατηρείται απώλεια της ισορροπίας (αστάθεια) και τάση για αιφνίδιες πτώσεις, που οδηγούν σε αναπηρία (Marsden and Fower, 2001). Τα κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου περιλαμβάνουν ακόμη τη μειωμένη εκφραστικότητα του προσώπου (καθηλωμένο, ανέκφραστο προσωπείο δίκην μάσκας ). Συχνά παρατηρείται βλεφαρόσπασμος, ενώ μπορεί να εμφανιστεί δυσαρθρία (ομιλία χαμηλής εντάσεως και μονότονη) και σιελόρροια. Ο ασθενής παρουσιάζει δυσγραφία (Marsden and Fower, 2001). Οι ασθενείς με NΠ έχουν διαταραχές στον ύπνο. Η δυσκολία στην έναρξη και τη διατήρηση (ελαφρύς και διακοπτόμενος ύπνος) είναι η πιο συνηθισμένη εκδήλωση του φαινομένου και μπορεί να οφείλεται στην αυξημένη σκελετική μυϊκή δραστηριότητα. Ακόμη να αναφερθεί ότι στα μη κινητικά συμπτώματα της ΝΠ περιλαμβάνονται επίσης η ανοσμία και δυσκοιλιότητα (Litvan et al, 2007b). Γενικά δεν παρουσιάζονται επικοινωνιακά 15

16 προβλήματα ή διανοητική υστέρηση, με εξαίρεση τα τελευταία στάδια, όπου παρατηρούνται άνοια, κατάθλιψη και ψυχώσεις (Litvan et al, 2007b). Το κύριο παθολογικοανατομικό χαρακτηριστικό της ΝΠ είναι η επιλεκτική απώλεια των ντοπαμινεργικών νευρώνων της συμπαγούς μοίρας της μέλαινας ουσίας, με αποτέλεσμα τα μειωμένα επίπεδα ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα. Κλινικά συμπτώματα παρκινσονισμού εμφανίζονται όταν ο κυτταρικός θάνατος υπερβεί μία κρίσιμη ουδό: 70-80% των ντοπαμινεργικών απολήξεων στο ραβδωτό σώμα και 50-60% των ντοπαμινεργικών κυττάρων στη μέλαινα ουσία, με αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα κατά 70% (Meissner et al, 2004). Επιπρόσθετα, τα αστροκύτταρα είναι διογκωμένα, ενώ τα κύτταρα μικρογλοίας αυξημένα σε αριθμό (Stewart and Weiner, 2002). Το άλλο σημαντικό ιστοπαθολογικό χαρακτηριστικό της ΝΠ είναι η παρουσία ινιδικών σφαιρικών εγκλείστων διαμέτρου 5-30 μm, που φαίνονται σαν ένας πυκνός πυρήνας με μια ωχρή περιοχή στο κυτταρόπλασμα των προσβεβλημένων νευρώνων, γνωστών ως σωμάτια Lewy (Lewy bodies). Σπάνια υπάρχουν πάνω από δύο ή περισσότερα σωμάτια Lewy μέσα στον ίδιο νευρώνα. Αυτά τα κυτταροσκελετικά έγκλειστα, παρόλο που υπάρχουν και στο φυσιολογικό γήρας (Stewart and Weiner, 2002), παρατηρούνται παντού στο εγκεφαλικό στέλεχος των ασθενών με ΝΠ. Εκτός από τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες της μέλαινας ουσίας τα σωμάτια Lewy εντοπίζονται επίσης και σε άλλες εγκεφαλικές περιοχές, όπως ο εγκεφαλικός φλοιός και οι μεγαλοκυτταρικοί βασικοί πυρήνες του πρόσθιου εγκεφάλου (Braak et al, 1995). Tα σωμάτια Lewy αποτελούνται από ένα ετερογενές μίγμα πρωτεϊνών και λιπιδίων. Τα λιπίδια σχηματίζουν τον πυρήνα των εγκλείστων, ενώ τα περιφερειακά ινιδιακά στοιχεία είναι πρωτεΐνες, όπως νευροινίδια, η ουμπικιτίνη, πολλά πρωτεασωμικά στοιχεία, και η πρωτεΐνη α-συνουκλεΐνη, που μπορεί να είναι οξειδωτικά τροποποιημένη (Spillantini et al, 1997, Giasson et al, 2000, Mc Naught et al, 2001). Η φυσιολογική α-συνουκλεΐνη είναι διαλυτή και μη αναδιπλούμενη. Εντοπίζεται στις τελικές απολήξεις των νευραξόνων και στα τελικά κομβία των νευρώνων (προσυναπτική πρωτεΐνη), όπου και δεσμεύεται με υψηλή συγγένεια στις μεμβράνες των συναπτικών κυστιδίων (Spillantini et al, 1997). Πιστεύεται ότι έχει την ικανότητα να τροποποιεί την ενεργότητα της φωσφολιπάσης D και έτσι να επηρεάζει τη διαθεσιμότητα των συναπτικών κυστιδίων προκειμένου να απελευθερώσουν το νευροδιαβιβαστή που περικλείουν (Volles et al, 2001, Payton et al, 2004). Μάλιστα, έχει αναφερθεί ότι τα προϊόντα οξείδωσης της ντοπαμίνης αντιδρούν με την α-συνουκλεΐνη (Conway et al, 2001). Αρχικά, η α-συνουκλεΐνη συσσωρεύεται σε πρωτοινίδια (μικρά ολιγομερή συσσωματώματα) και στη συνέχεια σε ινίδια. Μελέτες έχουν δείξει οτι τα μικρά ολιγομερή συσσωματώματα είναι πιθανότατα πιο 16

17 τοξικά από τα ίδια τα τελικά ινίδια α-συνουκλεΐνης (Gaeta and Hider, 2005). Αν και μεταλλάξεις στο γονίδιο της α-συνουκλεΐνης έχουν συσχετισθεί με τις σπάνεις περιπτώσεις οικογενούς ΝΠ (Polymeropoulos et al, 1997), η α-συνουκλεΐνη εντοπίζεται σε όλα τα σωμάτια Lewy, ακόμα και στις περιπτώσεις ΝΠ χωρίς μεταλλάξεις στο γονίδιο της α- συνουκλεΐνης. O ακριβής μηχανισμός με τον οποίο οι πρωτεΐνες αυτές συσσωρεύονται και σχηματίζουν τα σωμάτια Lewy δεν είναι ακόμη γνωστός. Ένα σημαντικό ερώτημα που μένει να απαντηθεί είναι εάν η εναπόθεση της α-συνουκλεΐνης στα σωμάτια Lewy είναι επιβλαβής ή προστατευτική για τους νευρώνες. Πολύ τελευταίες μελέτες αναδεικνύουν έναν μάλλον προστατευτικό, παρά επιβλαβή, ρόλο (Ciechanover and Brundin, 2003, Chandra et al, 2005) ωστόσο η υπερβολική συσσώρευση θα μπορούσε επίσης να είναι τοξική για τις κυτταρικές λειτουργίες, ξεκινώντας έτσι έναν κύκλο θετικής ανατροφοδότησης, που τελικά οδηγεί στον κυτταρικό θάνατο (Betarbet et al, 2005). Αιτιολογία της ΝΠ Η αιτία της εκφύλισης και του θανάτου των συγκεκριμένων ντοπαμινεργικών κυττάρων της μέλαινας ουσίας δεν είναι εξακριβωμένη. Πρόκειται για μια πολυπαραγοντική νόσο και τα αίτια μπορεί να είναι ιδιοπαθή ή να παίζουν ρόλο και περιβαλλοντικοί παράγοντες όσον αφορά τη σποραδική μορφή της νόσου. Ωστόσο τελευταία ανακαλύφθηκαν γενετικοί τόποι που ευθύνονται για την κληρονομική μορφή της νόσου. Η κληρονομική μορφή της νόσου αφορά περίπου το 10% του συνόλου των ατόμων που εμφανίζουν τη νόσο. Οι τρέχουσες θεωρίες παθογένειας που αφορούν τη ΝΠ προτείνουν ένα συνδυασμό γενετικής προδιάθεσης και έκθεσης σε περιβαλλοντικούς παράγοντες υψηλού κινδύνου (Litvan et al, 2007a,b). Παράγοντες που προδιαθέτουν για τη ΝΠ είναι η ηλικία, το φύλο, τα επίπεδα οιστρογόνων, η φυλή ή εθνικότητα, η έκθεση σε εντομοκτόνα, οι τραυματισμοί στην κεφαλή, η απουσία καπνίσματος, η μη κατανάλωση αλκοόλ και καφέ (Litvan et al, 2007a,b). Από όλους τους παράγοντες, η ηλικία συνδέεται στενά με τη ΝΠ: η πιθανότητα εκδήλωσης της νόσου αυξάνεται με την ηλικία τόσο στους άντρες όσο και στις γυναίκες (Bower et al, 2000, Van Den Eeden et al, 2003). Έχει παρατηρηθεί μια μεγαλύτερη εκδήλωση της νόσου στους άντρες, ενώ είναι άγνωστο εάν αυτό οφείλεται σε διαφορές στις ορμόνες, στη συμπεριφορά ή σε γενετικούς παράγοντες που σχετίζονται με το Χ ή Y χρωμόσωμα (Bower et al, 2000, Van Den Eeden et al, 2003). Επίσης, αρκετές έρευνες υποστηρίζουν ότι οι Καυκάσιοι προσβάλλονται πιο συχνά από τη ΝΠ σε σχέση με τους Αφροαμερικανούς, ωστόσο δεν θεωρείται τελείως αποδεδειγμένο (Van 17

18 Den Eeden et al, 2003, Schoenberg et al, 1985). Επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι η χρόνια έκθεσης σε νερό δεξαμενής και η ζωή ή η εργασία με βιομηχανικά χημικά ή εντομοκτόνα και ζιζανιοκτόνα προκαλούν αυξημένη πιθανότητα εμφάνισης της ΝΠ, κυρίως σε ασθενείς με πρώιμη έναρξη της νόσου (Tanner, 1989, Baldereschi et al, 2003, Di Monte, 2003). Πράγματι, το 1980 μη αντιστρεπτά συμπτώματα παρκινσονισμού εμφανίστηκαν σε νέους που είχαν λάβει ενδοφλέβια νοθευμένη ηρωίνη με τη χημική ουσία ΜΡΤΡ (Ν-μεθυλ-4- φαινυλ-1, 2, 3, 6-τετραυδροπυριδίνη). Η ουσία ΜΡΤΡ παρασκευάστηκε βιομηχανικά ως πιθανό ζιζανιοκτόνο, αλλά δεν παράχθηκε ποτέ εμπορικά. Το ζιζανιοκτόνο paraquat (ενεργός μεταβολίτης του ΜΡΤΡ), το οικιακής χρήσεως εντομοκτόνο rotenone (αναστολέας του μιτοχονδριακού συμπλόκου Ι), καθώς και το μυκητοκτόνο maneb και η ενεργή του ουσία manganese ethylene-bis-dithiocarbamate (προκαλεί αναστολή του πρωτεασώματος) οδηγούν επίσης σε παρκινσονισμό (Shastry, 2001, Greenamyre et al, 2001, Lapointe et al, 2004, Zhou et al, 2004). Άλλοι περιβαλλοντικοί παράγοντες, όπως ένα διεγερσιτοξικό αμινοξύ των σπόρων των γυμνοσπέρμων στη νήσο Guam σε συνδυασμό με διατροφή φτωχή σε μαγνήσιο και ασβέστιο και νερό πλούσιο σε αλουμίνιο θεωρείται ότι προκαλούν παρκινσονισμό στους ιθαγενείς (Oyanagi, 2005, Durlach et al, 1997). Σε όλες τις μελέτες έχει επιβεβαιωθεί μια χαμηλή πιθανότητα εκδήλωσης της ΝΠ μεταξύ ατόμων με ιστορικό καπνίσματος (Morens et al, 1995, Allam et al, 2004, Quik et al, 2007). Μεταξύ διδύμων, ο κίνδυνος ανάπτυξης της ΝΠ είχε αρνητική συσχέτιση με τη δόση των τσιγάρων, όπως μετρήθηκαν με το πακέτο και με τα χρόνια καπνίσματος. Ωστόσο, η προστατευτική επίδραση του καπνίσματος στους διδύμους ήταν μικρότερη όταν τα άτομα με ΝΠ συγκρίνονταν με φυσιολογικά άτομα (Τanner et al, 2002, Wirdefeldt et al, 2005). Από τη στιγμή που οι ασθενείς αναπτύξουν ΝΠ, δεν υπάρχουν ενδείξεις ότι οι καπνιστές έχουν ηπιότερα κινητικά προβλήματα ή αργότερη εξέλιξη της νόσου από ότι οι μη καπνιστές (Alves et al, 2004). Η κατανάλωση καφέ (περιέχει καφεΐνη: ανταγωνιστής της αδενοσίνης) έχει επίσης συνδεθεί με μειωμένο κίνδυνο εκδήλωσης ΝΠ (Hernan, 2003, Ascherio et al, 2003, 2004). Στις γυναίκες ειδικά, η κατανάλωση καφεϊνούχων αφεψημάτων έχει προστατευτική επίδραση μετά την εμμηνόπαυση σε γυναίκες χωρίς ορμονική υποκατάσταση, ενώ αυξάνει τον κίνδυνο σε γυναίκες που λαμβάνουν ορμονικά υποκατάστατα (Ascherio et al, 2003). Τέλος, η κατανάλωση ειδικά μπύρας και όχι γενικά αλκοολούχων ποτών βρέθηκε να μειώνει το κίνδυνο για εκδήλωση της ΝΠ (Hernan et al, 2003). Η έρευνα στη γενετική μελέτη της ΝΠ έχει γίνει μέσω δύο σημαντικών προσεγγίσεων: α) τη μελέτη σπάνιων οικογενειών με παρκινσονισμό που ακολουθούν το μεντελικό τρόπο κληρονόμησης, χρησιμοποιώντας τη κλασσική μεθοδολογία της ανάλυσης σύνδεσης και του 18

19 positional cloning και β) τη συνολική εκτίμηση του πληθυσμού με ΝΠ, στην προσπάθεια να καθοριστούν αλληλόμορφα υψηλού κινδύνου που συνεισφέρουν στην σποραδική μορφή της νόσου (Litvan et al, 2007a). Η πρώτη προσέγγιση έχει οδηγήσει στην ανακάλυψη γονιδίων υπεύθυνων για τη μονογονιδιακή ΝΠ (οικογενή), όπως: η α-συνουκλεΐνη, Park-1, LRRK2 (Park-8), που είναι υπερέχοντα αλληλόμορφα γονιδίων, καθώς και parkin (Park-2), PINK1 (Park-6) και DJ-1 (Park-7), που είναι υπολειπόμενα αλληλόμορφα γονιδίων (Πίνακας 1). Οι μεταλλάξεις αυτές προκαλούν τη νόσο σε ένα πολύ μικρό ποσοστό, με την εξαίρεση του LRRK2 γονιδίου, που είναι υπεύθυνο για ένα σημαντικό ποσοστό της οικογενούς ΝΠ (5.1%- 18.7%) και της σποραδικής ΝΠ (1.5%-6.1%). Οι ανακαλύψεις αυτών των γονιδίων είναι πολύ σημαντικές και οδήγησαν σε μερικά μοριακά μονοπάτια που ενέχονται στη ντοπαμινεργική απονεύρωση, τα οποία περιλαμβάνουν συσσωμάτωση πρωτεϊνών, ελαττωματική πρωτεασωμική αποικοδόμηση πρωτεϊνών, μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και οξειδωτικό στρες (Cookson, 2005, Abou-Sleiman et al, 2006). Η δεύτερη προσέγγιση έχει εστιάσει στη μελέτη πολυμορφισμών, όπως SNPs (single nucleotide polymorphisms) και αλληλουχιών με δινουκλεοτιδικό μοτίβο επανάληψης (dinucleotide repeat sequences). Το πλέον ξεκάθαρο αποτέλεσμα είναι ότι οι πολυμορφισμοί στον υποκινητή της α-συνουκλεΐνης σχετίζονται με τη ΝΠ, αλλά δεν επηρεάζουν την έναρξη της νόσου (Litvan et al, 2007a). Η τρέχουσα θεωρία για την εκδήλωση της νόσου υποστηρίζει ότι η διαταραχή των επίπεδων έκφρασης πρωτεϊνών κρίσιμων για την έναρξη της νόσου, ακόμα και με την φυσιολογική αμινοξική τους αλληλουχία και όχι απαραίτητα οι μεταλλάξεις αυτώναποτελεί παράγοντα κινδύνου για τους νευρώνες (Litvan et al, 2007a). Επίσης προτείνει ότι η εξάπλωση της νόσου, εφόσον έχει ήδη ξεκινήσει, μπορεί να είναι μια διαφορετική διαδικασία από την έναρξη της νόσου αυτή καθεαυτή. Η θεωρία αυτή στηρίζεται στις εντυπωσιακές ομοιότητες μεταξύ των νευροεκφυλιστικών νόσων που εμπλέκουν συσσώρευση διαφορετικών πρωτεϊνών, όπως πρωτεΐνη prion (PrP Sc, νόσος Creutzfeldt-Jacob), β- αμυλοειδές και πρωτεΐνη tau (νόσος Alzheimer), huntingtin (νόσος του Huntington) και α- συνουκλεΐνη (ΝΠ) (Litvan et al, 2007a, Gaeta and Hider, 2005). 19

20 Πίνακας 1: Οι γενετικοί τόποι που έχουν συσχετισθεί με την κληρονομικότητα της ΝΠ. γενετικός τόπος πρωτεΐνη χρωμοσωμική θέση μεντελική κληρονομικότητα λειτουργία φαινότυπος PARK1 α- synuclein 4q21 αυτοσωμική υπερέχουσα πρωτεΐνη συνοδός εκδήλωση σχετικά νωρίς PARK2 parkin 6q25.2- q27 αυτοσωμική υποτελής ubiquitin Ε3 ligase εφηβική εκδήλωση PARK3 άγνωστη 2p13 αυτοσωμική υπερέχουσα άγνωστη τυπική ΝΠ PARK4 άγνωστη 4p14 αυτοσωμική υπερέχουσα άγνωστη ΝΠ/βασικό τρέμουλο PARK5 UCH-L1 4p14 αυτοσωμική υπερέχουσα ubiquitin c-terminal hydrolase τυπική NΠ PARK6 PINK1 1p35-p36 αυτοσωμική υποτελής μιτοχονδριακή πρωτεΐνη πρώιμη εκδήλωση PARK7 DJ1 1p36 αυτοσωμική υποτελής πρώτο-ογκογονίδιο πρώιμη εκδήλωση PARK8 LRRK2 12p11.2 αυτοσωμική υπερέχουσα κινάση τυροσίνης PARK9 άγνωστη 1p36 αυτοσωμική υποτελής άγνωστη PARK10 άγνωστη 1p32 αυτοσωμική υπερέχουσα άγνωστη PARK11 άγνωστη 2q36-37 αυτοσωμική υπερέχουσα άγνωστη Μοριακή παθογένεια και βιοχημεία της ΝΠ Όπως προαναφέρθηκε, η μοριακή παθογένεια της νόσου εντοπίζεται στο οξειδωτικό στρες, τη δυσλειτουργία της μιτοχονδριακής συσκευής, και την ανώμαλη διαμόρφωση και συσσώρευση πρωτεϊνών σε συνδυασμό με τη βλάβη του συστήματος ουμπικιτίνηςπρωτεασώματος (UPS) (Lozano et al, 1998, Greenamyre et al, 2003, Betarbet et al, 2005, Abou-Sleiman et al, 2006). Οξειδωτικό στρες Το οξειδωτικό στρες προκαλείται από την αυξημένη παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου (H 2 O 2 ) και εξαιρετικά ενεργών ελεύθερων ριζών που προκαλούν οξειδωτική βλάβη στο DNA, τα λιπίδια και τις πρωτεΐνες. Σε φυσιολογικές συνθήκες οι ελεύθερες ρίζες 20

21 αποτελούν παραπροιόντα του μεταβολισμού του κυτταρικού οξυγόνου και είναι μόρια που περιέχουν ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια, όπως η ρίζα υπεροξειδίου ( O 2 ), η ρίζα υδροξυλίου ( OH) και η ρίζα νιτρικού οξειδίου (NO ) (Εικόνες 1 και 2). Ο κύριος ενδοκυτταρικός τόπος παραγωγής ελευθέρων ριζών είναι τα μιτοχόνδρια, όπου λαμβάνει χώρα η οξειδωτική φωσφορυλίωση κατά την παραγωγή του ATP. Οξειδωτική φωσφορυλίωση είναι η μεταφορά ηλεκτρονίων στο οξυγόνο μέσω της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων στην εσωτερική μεμβράνη του μιτοχονδρίου. Η αλυσίδα αυτή μεταφοράς αποτελείται από 5 σύμπλοκα (I V). Ελαττωματική λειτουργία στην αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή ελευθέρων ριζών και έτσι τη δημιουργία οξειδωτικού στρες. Φυσιολογικά, η παραγωγή τους ισορροπείται από ενδογενή αντιοξειδωτικά, τα οποία αποσβένουν αποτελεσματικά την τοξικότητα αυτών των προϊόντων. Τα πιο σημαντικά αντιοξειδωτικά είναι οι βιταμίνες A, E και C, τα ένζυμα δισμουτάση του υπεροξειδίου (superoxide dismutase, SOD), καταλάση και υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (glutathione peroxidase, GSH-Px) (Southorn and Powis,1988) (Εικόνα 2). Κύτταρα με υψηλές μεταβολικές απαιτήσεις, όπως τα ντοπαμινεργικά κύτταρα της συμπαγούς μέλαινας ουσίας (SN) είναι ιδιαίτερα ευπαθή στο οξειδωτικό στρες. Πολλά χαρακτηριστικά αυτών των νευρώνων, όπως η παρουσία της ίδιας της ντοπαμίνης (και ολόκληρης της ενζυμικής μηχανής παραγωγής της, επαναπρόσληψης και αποκοδόμησής της) (Fasano et al, 2006), η παρουσία νευρομελανίνης (Fahn and Cohen, 1992, Fasano et al, 2006) και σιδήρου (Olanow and Youdim, 1996, Fasano et al, 2006). Η νευρομελανίνη, ο σίδηρος και το ένζυμο MAO (μονο-άμινο οξειδάση Β), που όλα προάγουν την αύτοοξείδωση της ντοπαμίνης, δημιουργούν αυξημένο κίνδυνο για οξειδωτική βλάβη. Η MAO καταλύει την οξειδωτική απαμίνωση της ντοπαμίνης στην SN και σχηματίζει H 2 O 2 (Εικόνα 1) (Stewart and Weiner, 2002). Το H 2 O 2 από μόνο του είναι ένα οξειδωτικό μέσο, αλλά επίσης μπορεί να αντιδράσει με ιόντα σιδήρου (Fe +2 ), να σχηματίσει την ιδιαίτερα τοξική ρίζα υδροξυλίου (OH ), έναν κύριο διαμεσολαβητή της οξειδωτικής βλάβης (Εικόνα 1). Ο σίδηρος είναι σημαντικός στην κατάλυση οξειδωτικών αντιδράσεων χάρη στην ικανότητά του να υπάρχει σε δύο σθένη. Έτσι μπορεί να δώσει ένα ελεύθερο ηλεκτρόνιο, το οποίο προάγει το σχηματισμό ελεύθερων ριζών, συμπεριλαμβανομένου της OH (Εικόνα 1). Το H 2 O 2 και οι ελεύθερες ρίζες μπορούν επίσης να παραχθούν μη ενζυμικά με την αύτοοξείδωση της ντοπαμίνης σε κουινόνες (Q) και σεμικουινόνες (SQ) (Graham, 1978). Ο σχηματισμός της νευρομελανίνης από την αύτοοξείδωση της ντοπαμίνης (Graham, 1978, 21

22 1979) σχετίζεται με την παραγωγή ελεύθερων ριζών και H 2 O 2 (Youdim et al, 1989, Fasano et al, 2006). (a) DOPAMINE MAO HVA + H 2 O 2 Ενζυμική οξείδωση της ντοπαμίνης (b) DOPAMINE + Ο 2 H 2 O 2 + Ο ΟΗ - + SQ + Q Αυτοοξείδωση ντοπαμίνης (c) H 2 O 2 + Fe +2 OH - + OH + Fe +3 Παραγωγή ελεύθερω ριζών ΟΗ (d) 2GSH + H 2 O 2 GlutPerox GSSH + 2H 2 O Η απομάκρυνση του H 2 O 2 από την υπεροξειδάση Εικόνα 1: Υπόθεση οξειδωτικού στρες (oxidative tress hypothesis), όπου: MAO = μονο-άμινο οξειδάση, HVA= ομοβανιλλικό οξύ, H 2 O 2 = υπεροξείδιο του υδρογόνου, Fe 2+ = σίδηρος, OH = ανιόν υδροξυλίου, OH =ρίζα υδροξυλίου, GlutPerox = υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, O2 = ρίζα υπεροξειδίου, GSH: ανηγμένη γλουταθειόνη, GSSG: οξειδωμένη γλουταθειόνη, SQ: ημικουινόνη, Q: κουινόνη. DΑ MAO-b DOPAC + NH 3 + H 2 O 2 H 2O 2 Fe+2 OH - + OH H 2O 2 GSH-Px H 2 O + O 2 NO +O 2 - ONOO - + H + NO 2 + OH Εικόνα 2. Πολλαπλοί παράγοντες που συνεισφέρουν στο οξειδωτικό στρες στη ΝΠ, όπου: DA = ντοπαμίνη, MAO-b= μονο-άμινο οξειδάση Β, HVA= ομοβανιλλικό οξύ, DOPAC = 3, 4 διυδροξυφαινυλικο οξύ, NH 3 = αμμωνία, H 2 O 2 = υπεροξείδιο του υδρογόνου, Fe 2+ = σίδηρος, OH = ανιόν υδροξυλίου, OH =ρίζα υδροξυλίου, GSH-Px = υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, NO = ρίζα νιτρικού οξειδίου, O2 = ρίζα υπεροξειδίου, ONOO = υπεροξεινιτρικό, NO 2 = διοξείδιο του αζώτου. Σε φυσιολογικές συνθήκες, η αντιοξειδωτική ικανότητα (buffering capacity) του εγκεφάλου είναι ικανή να αποσβέσει την τοξικότητα του H 2 O 2 και των άλλων ελεύθερων ριζών. Για παράδειγμα, η γλουταθειόνη είναι το πιο ισχυρό ενδογενές αντιοξειδωτικό στο νευρικό σύστημα. Στους περισσότερους ιστούς η γλουταθειόνη βρίσκεται στην ανηγμένη της μορφή (GSH) (Stewart and Weiner, 2002). Η οξείδωσή της καταλύεται από την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης και είναι αυτό το μονοπάτι μέσω του οποίου το H 2 O 2 22

23 καθαρίζεται από τον εγκέφαλο. Ο μέσος λόγος της ανηγμένης προς την οξειδωμένη γλουταθειόνη (GSH:GSSG) στους περισσότερους φυσιολογικούς ιστούς είναι πάνω απο 50:1. Αν και η GSH είναι ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό, η GSSG μπορεί να είναι τοξική (Εικόνες 1 και 2) (Stewart and Weiner, 2002). Μελέτες σε μεταθανάτιο ιστό ασθενών με ΝΠ δείχνουν αυξημένη υπεροξείδωση λιπιδίων (peroxidation), πρωτεϊνών (carbonylation) (Yoritaka et al, 1996, Dexter et al, 1994, Alam et al, 1997a, Good et al, 1998, Bowling and Beal, 1995) και DNA (Alam et al, 1997b). Τα επίπεδα σιδήρου είναι ιδιαίτερα υψηλά στη μέλαινα ουσία και ακόμα πιο αυξημένα στα προχωρημένα στάδια της νόσου, παρόλο που παρατηρείται μια γενικευμένη μείωση της φεριττίνης στον εγκέφαλο (Jellinger at al, 1990, Przedborski and Jackson-Lewis, 1998) Η ελεύθερη σιδήρου φεριττίνη μπορεί να είναι τοξική και να προάγει επίσης το οξειδωτικό στρες. Επίσης, η έκθεση των νευρώνων σε αυξημένη κυτοσολική ντοπαμίνη μπορεί να αυξάνει το οξειδωτικό στρες και να προάγει και σταθεροποιεί πιθανόν τοξικά πρωτοϊνίδια α- συνουκλεΐνης (Conway et al, 2001, Fasano et al, 2006). Τα επίπεδα της GSH έχουν βρεθεί να είναι επιλεκτικά μειωμένα στην SN ασθενών με πρώιμη ΝΠ, συγκριτικά με υγιή άτομα ή ασθενείς με άλλες νευροεκφυλιστικές νόσους (Stewart and Weiner, 2002). Tα μειωμένα επίπεδα GSH θα μπορούσαν να είναι ένα πρωτογενές βιοχημικό γεγονός που να οδηγεί σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο των ντοπαμινεργικών νευρώνων. Σύμφωνα με την οξειδωτική θεωρία (oxidative stress hypothesis) αυτός ο συνδυασμός υψηλού ρυθμού οξειδωτικών ριζών (από ντοπαμίνη) και τα ανεπαρκή επίπεδα αντιοξειδωτικών (εξαιτίας μειωμένων επιπέδων GSH) είναι ο μεταβολικός μηχανισμός για την επιτάχυνση του κυτταρικού θανάτου στη ΝΠ. Μιτοχονδριακή δυσλειτουργία Η ενεργότητα του μιτοχονδριακού συμπλόκου I της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων μειώνεται με την ηλικία (Bowling et al, 1993). Η μειωμένη επίσης λειτουργικότητα του μιτοχονδριακού συμπλόκου Ι στη μέλαινα ουσία ασθενών με ΝΠ σε μεγαλύτερο βαθμό από ότι στο φυσιολογικό γήρας δείχνει ότι η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία μπορεί να αυξάνει το οξειδωτικό στρες στη ΝΠ (Bowling and Beal, 1995). Το ΜΡΤΡ, μια τοξίνη που αναστέλλει το μιτοχονδριακό σύμπλοκο Ι προκαλεί σύνδρομο παρκινσονισμού σε ανθρώπους και πρωτεύοντα, όπως προαναφέρθηκε. Επιπρόσθετα, δύο γονίδια της κληρονομικής ΝΠ, το DJ1 και το PINK1, βρέθηκαν ότι εντοπίζονται στα μιτοχόνδρια, συνδέοντας ανωμαλίες στη φυσιολογία των μιτοχονδρίων με την εκφύλιση των ντοπαμινεργικών κυττάρων. 23

24 Το οξειδωτικό στρες εξαιτίας μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας μπορεί να οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο με την επαγωγή απόπτωσης. Αποπτωτικοί νευρώνες σε αυξημένες συχνότητες στη μέλαινα ουσία ασθενών με ΝΠ έχουν επίσης αναφερθεί (Ziv and Melamed, 1998). Η αλλαγή στη διαπερατότητα του μιτοχονδρίου που οδηγεί σε απώλεια του μεμβρανικού δυναμικού του μιτοχονδρίου είναι ένα από τα πρώτα γεγονότα της απόπτωσης (Zamzami et al, 1995) και συνδέεται με την απελευθέρωση ενεργοποιητών της απόπτωση, όπως ο apoptosis-inducing factor (AIF) και το κυτόχρωμα c (Susin et al, 1996). Επιπλέον, όπως προαναφέρθηκε, το οξειδωτικό στρες στα ντοπαμινεργικά κύτταρα μπορεί επιλεκτικά να αυξάνει την ευπάθεια στις μιτοχονδριακές τοξίνες και στα μονοπάτια αποικοδόμησης μη λειτουργικών πρωτεϊνών, αφού οι πιο πολλές οξειδωμένες πρωτεΐνες αποικοδομούνται από το σύστημα ουμπικιτίνης- πρωτεασώματος (Betarbet et al, 2005, Lotharius and Brundin, 2002, McNaught and Jenner, 2001) Ανώμαλη διαμόρφωση και συσσώρευση πρωτεϊνών βλάβες στο σύστημα ουμπικιτίνης-πρωτεασώματος Το σύστημα ουμπικιτίνης-πρωτεασώματος (UPS) είναι υπεύθυνο για την αποικοδόμηση πολλών κυτταρικών πρωτεϊνών, εκτός από τις μεμβρανικές και εξωκυτταρικές πρωτεΐνες, οι οποίες μετά από ενδοκύττωση αποικοδομούνται μέσα στο λυσόσωμα (Sherman and Goldberg, 2001, Chichanover and Brundin, 2003)(Εικόνα 3). Επιπλέον, μη σωστά αναδιπλωμένες, μεταλλαγμένες ή οξειδωμένες πρωτεΐνες επίσης αποικοδομούνται από το UPS. Οι πρωτεΐνες αυτές μαζεύονται και συναθροίζονται, εάν έχει υπερκεραστεί η ικανότητα του κυττάρου να τις αποικοδομεί ή όταν η λειτουργία του πρωτεασώματος αναστέλλεται ή διαταράσσεται (Sherman and Goldberg, 2001). Επίσης, είναι πιθανό σύμφωνα με τελευταία δεδομένα, οι πρωτεΐνες που τείνουν να συναθροίζονται (aggregation-prone proteins), όπως η μεταλλαγμένη α-συνουκλεΐνη, να μπορούν να αναστείλουν το σύστημα UPS (Bence et al, 2001, Tanaka et al, 2001). Έτσι, η μερική ή ολική απώλεια της λειτουργίας του συστήματος UPS μπορεί να είναι υπεύθυνη για την παραγωγή συναθροίσεων ή αντίθετα τα συναθροίσματα των πρωτεϊνών αυτά καθαυτά μπορεί να είναι ικανά να βλάψουν τη μηχανή αποικοδόμησης των πρωτεϊνών (Betarbet et al, 2005). Επιπρόσθετα, ανάμεσα στις γενετικές μεταλλάξεις γονιδίων που οδηγούν σε οικογενή ΝΠ είναι και οι μεταλλάξεις στα γονίδια PARK2 (parkin) και PARK5 (UCH-L1), που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη λειτουργία του συστήματος UPS (Kitada et al, 1998, Polymeropoulos et al, 1997) (Πίνακας 1). Η parkin είναι πρωτεΐνη με ενεργότητα λιγάσης Ε3 της ουμπικιτίνης, η οποία λειτουργεί μαζί με τα ubiquitin-congugating ένζυμα 24

25 (Ε2s) UbcH7 και UbcH8 (Imai et al, 2000, Shimura et al, 2001) (Εικόνα 3). Η UCH-L1 είναι μια πανταχού παρούσα πρωτεΐνη που αποτελεί πάνω από το 2% των πρωτεϊνών του εγκεφάλου. Ανήκει στην οικογένεια των ενζύμων από-ουμπικιτινίωσης που είναι υπεύθυνα για την υδρόλυση των πολυουμπικιτινιωμένων αλυσίδων στα μονομερή ουμπικιτίνης (Pickart et al, 2000). Ακόμη, όπως έχει ήδη προαναφερθεί η παρουσία α-συνουκλεΐνης, ουμπικιτίνης και άλλων πρωτεασωμικών υπομονάδων στα σωμάτια Lewy υποδηλώνει την ανάμειξη της α- συνουκλεΐνης και της δυσλειτουργίας της πρωτεασωμικής αποικοδόμησης στην παθογένεση της ΝΠ. Εάν η α-συνουκλεΐνη είναι ή όχι υπόστρωμα για το πρωτεάσωμα παραμένει αμφισβητήσιμο, αφού έχουν αναφερθεί τόσο θετικά, όσο και αρνητικά δεδομένα (Paxinou et al, 2001). Παρόλα αυτά, η συσσώρευση α-συνουκλεΐνης μπορεί να σχηματίσει ποικίλα συμπλέγματα αλληλεπιδρώντας με πολλαπλές πρωτεΐνες και τροποποιώντας κυτταρικές λειτουργίες, όπως η αποικοδόμηση μέσω συστήματος UPS (Snyder et al, 2003). Εικόνα 3: Η ουμπικιτίνη (Ub) ετοιμάζεται για τη σύζευξη με άλλες πρωτεΐνες με το ATPdependent ubiquitin-activating ένζυμο (E1), το οποίο δημιουργεί μια ενεργοποιημένη ουμπικιτίνη που μεταφέρεται σε ένα ubiquitin-conjugating (E2) ένζυμο. To ένζυμο Ε2 δρα σε σύζευξη με βοηθητικές (Ε3) πρωτεΐνες. Στο σύμπλοκο Ε2-Ε3, που ονομάζεται λιγάση της ουμπικιτίνης, το Ε3 δεσμεύεται σε συγκεκριμένα σήματα αποικοδόμησης των πρωτεϊνώνυποστρωμάτων, βοηθώντας το Ε2 να σχηματίσει πολυουμπικιτιλιωμένες αλυσίδες συνδεμένες σε μια λυσίνη της πρωτεΐνης-υπόστρωμα. 25

26 Θεραπευτικές προσεγγίσεις Η τρέχουσα θεραπεία για τη ΝΠ περιορίζεται στην συμπτωματική ανακούφιση, αφού δεν έχουν βρεθεί ουσίες ικανές να αναστείλουν την εκφύλιση. Από την ανακάλυψη της έλλειψης ντοπαμίνης ως αιτία της ΝΠ μια ποικιλία θεραπειών έχουν χρησιμοποιηθεί. Η πιο αποτελεσματική και συχνή είναι η χορήγηση της L-DOPA, πρόδρομη ουσία της ντοπαμίνης, συνήθως σε συνδυασμό με περιφερικούς αναστολείς αποκαρβοξυλίωσης των αρωματικών αμινοξέων, όπως η καρβιντόπα και η benserazide. Δυστυχώς τα θεραπευτικά οφέλη από την L-DOPA μειώνονται με τις κινητικές (δυσκινησίες) και ψυχολογικές παρενέργειες που παρατηρούνται σε πολλούς ασθενείς μετά 4-6 χρόνια από την έναρξη της θεραπείας. Μοριακοί δείκτες φανερώνουν μια υπερευαίσθητη απόκριση των D1 υποδοχέων ντοπαμίνης και άρα των νευρώνών εξόδου της άμεσης οδού του ραβδωτού σώματος κάτω από τη ντοπαμινεργική απονεύρωση, με αποτέλεσμα την αυξημένη αναστολή των Gpi/SNr (εικόνες 5 και 6). Αυξανόμενος αριθμός ερευνών δείχνει επιπλέον ότι η ίδια η L-DOPA μπορεί έχει νευροτοξικές ιδιότητες (Lozano et al, 1998, Richardson et al, 1997). Η ίδια η Levodopa είναι μια πιθανή πηγή τοξικών ελεύθερων ριζών ως αποτέλεσμα της αποκαρβοξυλίωσής της σε ντοπαμίνη και της οξείδωσής της σε νευρομελανίνη και μπορεί να προκαλεί επιπρόσθετο οξειδωτικό στρες σε ένα ήδη υπερφορτωμένο και ανεπαρκές σε ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH) κύτταρο(stewart and Weiner, 2002). Η δράση των αγωνιστών των υποδοχέων ντοπαμίνης δεν είναι τόσο δραστική όσο η L- DOPA (Richardson et al, 1997). Οι πρόσφατες έρευνες προτείνουν τη χρήση των ανταγωνιστών υποδοχέων αδενοσίνης ως μια νέα θεραπευτική προσέγγιση στη ΝΠ (Richardson et al, 1997, Fredholm et al, 2003, Hauser at al, 2003, Ferre et al, 2004, Schwarzschild et al, 2006). Ήδη, ο ανταγωνιστής των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης KW-6002 (istradefylline) βρίσκεται σε φάση ΙΙΙ κλινική δοκιμές, από την εταιρεία Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd, Tokyo, Japan. Οι υποδοχείς ντοπαμίνης και αδενοσίνης, όπως θα φανεί στη συνέχεια αλληλεπιδρούν σε επίπεδο υποδοχέα-υποδοχέα στην κυτταρική μεμβράνη, σχηματίζοντας ετεροδιμερή σύμπλοκα (Franco et al, 2007, Fuxe et al, 2007). Μάλιστα, τα ετεροδιμερή αυτά έχουν λειτουργικές και φαρμακολογικές ιδιότητες διαφορετικές από αυτές του κάθε υποδοχέα ξεχωριστά. Από φαρμακολογική άποψη, αυτές οι αλληλεπιδράσεις ανοίγουν νέες θεραπευτικές προοπτικές, με τη σχεδίαση διμερών προσδεμάτων (bivalent ligands) που να μπορούν να αλληλεπιδρούν ταυτόχρονα και με τους δύο υποδοχείς (Agnati et al, 2003, Franco et al, 2007, Fuxe et al, 2007). Τα δισθενή προσδέματα 26

27 ντοπαμίνης/αδενοσίνης αποτελούν καινούρια εργαλεία στη στόχευση για τη φαρμακευτική αγωγή της ΝΠ, αφού θα δρουν ταυτόχρονα ως αγωνιστές των D2 υποδοχέων ντοπαμίνης και ως ανταγωνιστές των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης (Franco R, in Targeting adenosine A2A receptors in Parkinson s disease and other CNS disorders international research conference, Boston, 2006). Επίσης προτείνεται η χρήση ανταγωνιστών των κ υποδοχέων των οπιοειδών, ανταγωνιστές των υποδοχέων του γλουταμινικού, μεταμοσχεύσεις μεσεγκεφαλικών κυττάρων, υποστήριξη με τροφικούς παράγοντες, ενώ μεγάλη έρευνα γίνεται και στο πεδίο της γονιδιακής θεραπείας για τη ΝΠ (Lozano et al, 1998, Schapira et al, 2005). 27

28 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΤΗΣ NΠ Η ΝΠ οφείλεται στην εκφύλιση της μελανοραβδωτής οδού. Υπάρχουν πολλά πειραματικά μοντέλα για τη μελέτη της νόσου, που επάγονται είτε με χημικές ουσίες, είτε οφείλονται σε γενετικές μεταλλάξεις. Το μοντέλο της 6-υδροξυντοπαμίνης (6-ΟΗ-ντοπαμίνης) είναι το πλέον μελετημένο και χρησιμοποιημένο. Η 6-υδροξυντοπαμίνη είναι μια νευροτοξική ουσία που όταν ενίεται ενδοκρανιακά στη μέλαινα ουσία προκαλεί εκφύλιση των μεσεγκεφαλικών ντοπαμινεργικών κυττάρων (Ungerstedt U, 1968). Η έκχυση μπορεί να γίνει στο ένα ή και στα δύο ημισφαίρια του εγκεφάλου, με την περίπτωση της μονόπλευρης απονεύρωσης να έχει το πλεονέκτημα της ταυτόχρονης μελέτης στο ίδιο ζώο του ημισφαιρίου με βλάβη και του φυσιολογικού. Η χορήγηση άμεσων αγωνιστών των υποδοχέων ντοπαμίνης σε αυτό το μοντέλο προκαλεί περιστροφική συμπεριφορά προς την αντίθετη κατεύθυνση από αυτήν της βλάβης, ενώ η χορήγηση έμμεσων αγωνιστών προκαλεί περιστροφική κίνηση προς την ίδια κατεύθυνση με αυτήν της βλάβη (Svenningsson et al, 1999b). Οι έμμεσοι αγωνιστές ντοπαμίνης δεν δεσμεύονται οι ίδιοι πάνω στους υποδοχείς ντοπαμίνης, αλλά αυξάνουν τη διαθεσιμότητα της ντοπαμίνης στα κύτταρα, δεδομένου ότι αναστέλλουν το μεταφορέα της ντοπαμίνης και έτσι εμποδίζουν την επαναπρόσληψής της. Το μοντέλο αυτό βρίσκει καλή εφαρμογή κυρίως στα τρωκτικά, αλλά και στα πρωτεύοντα. Η συστεμική χορήγηση Ν-μεθυλ-4-φαινυλ-1,2,3,6-τετραυδροπυριδίνη (MPTP, συνθετική ηρωίνη) στον άνθρωπο και τα άλλα πρωτεύοντα οδηγεί σε παρκινσονισμό, προκαλώντας εκλεκτική απώλεια των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας. Το ΜΡΤΡ περνά τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και οξειδώνεται από την μονοάμινο οξειδάση Β (ΜΑΟ-Β), η οποία εντοπίζεται σε υψηλές συγκεντρώσεις στα μιτοχόνδρια των νευρογλοιακών κυττάρων, με αποτέλεσμα το σχηματισμό της τοξικής ρίζας Ν-μεθυλοπυριδίνη (MPP + ) και τη συσσώρευσής της εκλεκτικά στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες της μέλαινας ουσίας μέσω άμινομεταφορέων. Ένας πιθανός μηχανισμός καταστροφής των κυττάρων της μέλαινας ουσίας είναι ότι η MPP + απορροφάται από τα μιτοχόνδρια και αναστέλλει την αναπνευστική αλυσίδα οδηγώντας σε λιμοκτονία τα κύτταρα, λόγω έλλειψης ΑΤΡ. Μετά την συστεμική χορήγηση MPTP ένεσης σε πιθήκους, η τοξίνη MPP + ανιχνεύεται στις ντοπαμινεργικές απολήξεις στο ραβδωτό μέσα σε 24 ώρες. Η απώλεια των ντοπαμινεργικών απολήξεων και ο κλινικός παρκινσονισμός ανιχνεύονται μέσα σε 10 μέρες από την έναρξη της χορήγησης, ενώ τα ντοπαμινεργικά κύτταρα της μέλαινας ουσίας είναι ακόμη άθικτα (Smith et al, 1997). Το μοντέλο της MPTP βρίσκει εφαρμογή κυρίως σε πιθήκους. 28

29 Το γενετικό μοντέλο των μυών weaver είναι το πειραματικό μοντέλο με το οποίο έγινε η παρούσα εργασία και θα αναλυθεί με μεγαλύτερη λεπτομέρεια στη συνέχεια. TO ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΜΟΝΤΕΛΟ WEAVER Η μετάλλαξη weaver προέκυψε με αυθόρμητο τρόπο το 1961 σε μια αποικία μυών του στελέχους C57BL/6J (Lane, 1964). Πρόκειται για μια υπολειπόμενη αυτοσωμική σημειακή μετάλλαξη με λάθος νόημα, που εντοπίζεται στο 16 ο χρωμόσωμα (Won et al, 1997). Φαινότυπος των weaver μυών Οι μεταλλαγμένοι μύες weaver εμφανίζουν προοδευτική εκφύλιση των ντοπαμινεργικών κυττάρων της μέλανας ουσίας και των κοκκιωδών κυττάρων της παρεγκεφαλίδας. Αυτές οι νευρολογικές βλάβες έχουν ως αποτέλεσμα την αστάθεια της κίνησης, τρόμο, ανικανότητα συντονισμού των άκρων και τρόμο κατά την ακινησία ή όταν πρόκειται να κάνουν μια κίνηση, και σοβαρή αταξία, αντίστοιχα (Fox et al, 1998, Triarhou, 2002). Επίσης εκδηλώνουν μειωμένη ικανότητα ανταπόκρισης σε ορισμένες διαδικασίες συμπεριφοράς, καθώς και ένα χαρακτηριστικό αντανακλαστικό του οπίσθιου ποδιού, όταν κάποιος τους ανασηκώνει από την ουρά. Μια άλλη χαρακτηριστική μορφή συμπεριφοράς, που δεν παρουσιάζουν άλλοι μεταλλαγμένοι μύες με παρεγκεφαλιδικές βλάβες είναι ότι πηδούν προς τα πάνω μέχρι 25 εκατοστά στον αέρα μετά από ενοχλητικό ερέθισμα. Επιπλέον, παρουσιάζουν μη φυσιολογικό οπτικοκινητικό νυσταγμό, μια διαταραχή που αποδίδεται στην παρεγκεφαλιδική βλάβη που χαρακτηρίζει αυτούς τους μύες. Με λίγα λόγια, ο συμπεριφορικός φαινότυπος των μυών αυτών φαίνεται να είναι το αποτέλεσμα της συνδυασμένης επίδρασης των βλαβών στο ντοπαμινεργικό σύστημα του μεσεγκεφάλου και των βλαβών στην παρεγκεφαλίδα (Triarhou, 2002). Επιπλέον, οι μύες weaver εμφανίζουν αρσενική στειρότητα και ενίοτε επιληπτικές κρίσεις (Mark and Ηerlitze, 2000). Όπως και η αταξία και οι άλλες ανωμαλίες στην κινητική δραστηριότητα, η αρσενική στειρότητα οφείλεται σε κυτταρικό θάνατο. Συγκεκριμένα οι γαμέτες και τα κύτταρα Sertoli εκφυλίζονται αμέσως μετά την ήβη (Ηess, 1996). Ακόμη, ο φαινότυπος τους περιλαμβάνει καθυστέρηση στη σωματική ανάπτυξη και υποθυρεοειδισμό. Η σωματική ανάπτυξη των μυών αυτών είναι φυσιολογική μέχρι τη 14 η μέρα μετά τη γέννηση, ενώ κατά τη διάρκεια των επόμενων δύο εβδομάδων, το βάρος τους παραμένει σταθερό, σε αντίθεση με τη ραγδαία αύξηση που παρατηρείται στους φυσιολογικούς μύες. 29

30 Ο συμπεριφορικός φαινότυπος των wv/+ μυών όσον αφορά τη κινητική δραστηριότητα δε διαφέρει από αυτόν των φυσιολογικών μυών. Παρόλο όμως, που οι μύες αυτοί δεν παρουσιάζουν κινητικές διαταραχές ή τρόμο, εκδηλώνουν παροδικά τονοκλονικούς επιληπτικούς σπασμούς, οι οποίοι αποβαίνουν θανατηφόροι. Σύμφωνα με τους Triarhou and Ghetti (1989) η επιληπτική δραστηριότητα των ομόζυγων και ετερόζυγων weaver μυών μπορεί να σχετίζεται με την εκφύλιση των δενδριτών των ντοπαμινεργικών κυττάρων της μέλαινας ουσίας, καθώς η περιοχή αυτή έχει συσχετισθεί με επιληπτικές κρίσεις (Triarhou, 2002). Η σταδιακή εκφύλιση των ντοπαμινεργικών κυττάρων της μέλαινας ουσίας αυτών των μυών καθιστά τη μετάλλαξη weaver, ένα γενετικό μοντέλο παρκινσονισμού που προσομοιάζει πολύ την ανθρώπινη έκφραση της νόσου του Parkinson. Η μετάλλαξη weaver Πρόσφατες γενετικές μελέτες έδειξαν ότι στους weaver μύες το GIRK2 γονίδιο είναι μεταλλαγμένο. Το γονίδιο GIRK κωδικοποιεί μια οικογένεια εισερχόμενων ανορθωτικών διαύλων καλίου, οι οποίοι ρυθμίζονται από τις G πρωτεΐνες και τείνουν να σταθεροποιήσουν το δυναμικό της μεμβράνης κοντά στο δυναμικό ισορροπίας του καλίου, συνεισφέροντας έτσι στη διατήρηση του δυναμικού της μεμβράνης κοντά στο δυναμικό ηρεμίας (Won et al, 1997, Hess et al, 1996). Οι υπομονάδες GIRK σχηματίζουν ομοτετραμερείς ή ετεροτετραμερείς διαύλους που εξαρτώνται από τις G πρωτεΐνες και επιτρέπουν την εκλεκτική είσοδο του καλίου στο κύτταρο, σε υπερπολωμένα μεμβρανικά δυναμικά (Hou et al, 1999). Οι δίαυλοι GIRK είναι συζευγμένοι με αρκετούς μεταβοτροπικούς, ΡΤΧ-ευαίσθητους υποδοχείς, όπως οι οπιοειδείς, οι αδρενεργικοί, οι μουσκαρινικοί, οι ντοπαμινεργικοί και οι GABA B υποδοχείς και είναι σημαντικοί για την διατήρηση του δυναμικού ηρεμίας και την διεγερσιμότητα των νευρώνων (Hille, 1992). Όταν ενεργοποιούνται από υποδοχείς συζευγμένους με G-πρωτεΐνες, οι δίαυλοι GIRK επηρεάζουν την παραγωγή αργών συναπτικών δυναμικών (Hess et al, 1996). Έτσι, μια μετάλλαξη σε ένα από αυτούς τους διαύλους μπορεί να επηρεάσει την μεταβίβαση σήματος σε πολλά συστήματα νευροδιαβίβασης. Από τους δίαυλους GIRK που έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι σήμερα, οι υπότυποι GIRK1, GIRK2 και GIRK3 εκφράζονται στον εγκέφαλο. Και οι τρεις υπότυποι διαύλων εκφράζονται στα κοκκώδη κύτταρα της παρεγκεφαλίδας (Kobayashi et al, 1995). Ο δίαυλος GIRK2 εκφράζεται μόνο στον εγκέφαλο και τους όρχεις. Συγκεκριμένα, εκφράζεται στην μέλαινα ουσία, στον ιππόκαμπο, στην αμυγδαλή, στους γεφυρικούς πυρήνες, στον οσφρητικό βολβό και στα κύτταρα Purkinje της παρεγκεφαλίδας, αλλά δεν εντοπίζεται καθόλου στο ραβδωτό 30