Investigation of Apoptosis Induction in Differentiated PC-12 Cells after Exposure to Hydrostatic Pressure

Transcript

1 Originl Article Investigtion of Apoptosis Induction in Differentited PC-12 Cells fter Exposure to Hydrosttic Pressure S. Sdri, M.Sc. 1, M. Dvry Znjni, M.Sc. 1, M. Azdkht, Ph.D. 1, A. Amini, Ph.D. 1, M. Hil, Ph.D Biology Deprtment, Fculty of Sciences, Rzi University 2. Cell Biology Lortory, School of Antomy, University of New South Wles, NSW Corresponding Address: P.O.Box: , Biology Deprtment, Fculty of Sciences, Rzi University, Kermnshh, Irn Emil: zdkhtm@rzi.c.ir Astrct Received: 4/Fe/2008, Accepted: 19/Apr/2008 Ojective: Hydrosttic pressure is crucil component of cell environment nd fundmentl physicl quntity, lso it is the min fctor of oth cell integrity nd function. Pressure vrition disorder, eyond physiologicl limits, my led to pthologicl sttes. In this study, we exmined the effect of hydrosttic pressure on poptosis induction, viility, morphology, dhesion potency to sustrte nd migrtion of differentited PC-12 cells. Mterils nd Methods: PC-12 s neuronl cell line mintined in RPMI 1640 culture medium supplemented with 10% fetl ovine serum. Sturosporine ws used for differentiting of mitotic PC-12 cells to post mitotic nd differentited neuronl cells. Exclusion Dye ws used for viility ssy, totl neurite length of ech cell s well s morphometry. TUNEL stining ws lso performed for poptosis detection, dhesion potency of cells to sustrte nd evlution of cell migrtion. Results: Hydrosttic pressure, over physiologicl limits, induced poptosis in differentited PC-12 cells. It chnged cell viility grdully nd reduction hppened significntly fter 24 hours (p<0.05). In compre to the control group, hydrosttic pressure reduced totl neurite length, dhesion potency to sustrte nd migrtion of cells in the exmined group (p<0.05). Conclusion: Hydrosttic pressure induced poptosis in differentited PC-12 cells s result of inpproprite interction etween cells nd sustrte. We propose tht poptosis in differentited PC-12 cells my e n noikis cusing to lose the ttchment to the sustrte. Keywords: Hydrosttic Pressure, Apoptosis, Anoikis, Neuronl Differentition, PC-12 Cells Ykhteh Medicl Journl, Vol 10, No 2, Summer 2008, Pges: Ykhteh Medicl Journl, Vol 10, No 2, Summer

2 مقاله اصیل بررسي بروز آپوپتوز در سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 پس از اعمال فشار هيدروستاتيك سهیل صدری M.Sc. 1 مریم داوری زنجانی 1 M.Sc. مهری آزادبخت Ph.D. 1 علی امینی 1 Ph.D. 2 مارک هیل Ph.D. 1. دانشگاه رازی کرمانشاه دانشکده علوم گروه زیست شناسی 2. دانشگاه نیوساوت ولز گروه آناتومی آدرس نويسنده مسئول: کرمانشاه صندوق پستی: دانشگاه رازی کرمانشاه دانشکده علوم گروه زیست شناسی پست الكترونيك: Emil: zdkhtm@rzi.c.ir چکیده دريافت مقاله: 86/11/15 پذيرش مقاله: 87/1/31 * هدف: بررسي بروز آپوپتوز در سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 در اثر اعمال فشار هيدروستاتيك * مواد و روشها: در اين مطالعه سلول هاي رده PC-12 در محيط كشت 1640 RPMI همراه با 10 درصد سرم كشت داده شدند. سلول ها پس از تيمار با غلظت تمايزي مناسب استئورسپورين به سلول هاي عصبي )نورون( تمايز يافتند. سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 به دو گروه كنترل و آزمايش تقسيم شدند. سلول هاي گروه آزمايش به محفظه اعمال فشار منتقل شدند و به مدت 2 ساعت در معرض 100 ميلي متر جيوه فشار هيدروستاتيك قرار گرفتند. سپس با استفاده از رنگ آميزي حياتي و رنگ آميزي TUNEL به ترتيب ميزان بقاي سلول ها و شاخص آپوپتوز آنها سنجيده شد. با اندازه گيري طول نوريت ها مورفولوژي سلول ها بررسي و توانايي چسبندگي به بستر و مهاجرت سلول ها نيز ارزيابي شد. * يافتهها: نتايج نشان داد ميزان بقاي سلول ها در دو گروه مشابه بود اما پس از 24 ساعت بقاي سلول ها در گروه آزمايش كاهش يافت )0/05<p(. شاخص آپوپتوز در گروه آزمايش در مقايسه با گروه كنترل بيشتر بود )0/05<p(. همچنين طول نوريت ها توانايي چسبندگي سلول ها به بستر و توانايي مهاجرت سلول ها درگروه آزمايش در مقايسه با گروه كنترل به طور معنی داري كاهش يافته بود )0/05<p(. * نتيجهگيري: به نظر مي رسد اعمال فشار هيدروستاتيك وارده به سلول ها با كاهش طول نوريت ها كاهش توانايي چسبندگي سلول به بستر و كاهش توانايي مهاجرت سلول ها كه از رفتارهاي حياتي سلولي تلقي مي شود سبب وقوع آپوپتوز در سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 شده است. با توجه به اختاللي که فشارهيدروستاتيك در چسبندگي سلول ها به بستر پدید آورده به نظر مي رسد آپوپتوز ايجاد شده در سلول ها از نوع آنويکيز باشد. كليدواژگان: فشار هيدروستاتيك آپوپتوز آنويكيز تمايز عصبي رده سلولي PC-12 مقدمه سلول ها چه در حالت منفرد وچه زمانی که در بافت قرار دارند تحت تاثير نيروهايي مكانيكي هستند و بايد خود را با اين نيروها سازگار کنند. اگر چنين نيروهايي بيش از اندازه معمول شوند به طوري که در حد پاسخ طبيعي سلول نباشند عامل استرس زا محسوب می شوند و به سلول ها آسيب مي رسانند. در اغلب موارد آسيب وارده به صورت ايجاد بيماري يا حتي از بين رفتن موجود زنده بروز مي كند )1(. فشار هيدرواستاتيک يکي از اجزاي مکانيکي حياتي محيط سلولي به شمار مي آيد و ميزان آن در قسمت هاي مختلف بدن متفاوت است. سلول هاي عصبي مغز در معرض فشاري حدودا 15 ميلي متر جيوه هستند که از طرف مايع مغزي-نخاعي به آنها وارد مي شود )2(. دستگاه عصبي و سلول هاي آن به علت تماس مداوم با فشار هيدرواستاتيک و بيماري هايي كه در اثرافزايش بيش از حد فشار هيدرواستاتيک در اين دستگاه به وجود مي آيد مورد توجه محققان بسیاری قرار گرفته است. آگار و همكارانش با طراحي يك محفظه فشار به بررسي مرگ سلولي در رده هاي مختلف سلول هاي عصبي پرداخته اند و مرگ سلولي ايجاد شده در آنها را از نوع آپوپتوز و ناشي از افزايش ميزان فشار هيدرواستاتيک دانسته اند )3(. سپس مطالعات ديگري در زمينه افزايش ميزان فشار هيدرواستاتيک در سلول هاي عصبي با بررسي فصلنامه پزشکی یاخته سال دهم شماره 2 تابستان 87 صفحات: روند ايجاد آسيب سلولي در جريان بيماري گلوکوما كه نوعي بيماري مرتبط با افزايش فشار داخل اتاقک چشم است انجام شد 4(.)5 نيروهاي مکانيکي از جمله فشار هيدرواستاتيک با اثر بر كانال هاي يوني دريچه مكانيكي سطح سلول ها و همچنين ماتريكس خارج سلولي سبب تغيير در رفتارهاي ساختاري و عملكردي سلول ها مي شوند )1(. ماتريكس خارج سلولي عالوه بر آن كه به عنوان داربست فيزيكي در محيط اطراف سلول ها عمل مي كند )6( واسطه انتقال بسياري از پيام هاي حياتي مانند القاي تكثير تمايز و مرگ سلولي در سلول ها به شمار مي آيد )7 8 (.اهميت ماتريكس خارج سلولي تا آن اندازه است که فقدان بر هم کنش مناسب سلول و ماتريكس خارج سلولي که توسط اتصاالت نقطه اي رخ مي دهد منجر به بروز آپوپتوز مي شود. به اين نوع آپوپتوز که در پاسخ به بر هم كنش نامناسب سلول و ماتريكس خارج سلولي رخ مي دهد آنويکيز گفته مي شود )9(. با وجود مطالعات ذكر شده در زمينه اثرات ا فزايش ميزان فشار هيدرواستاتيک بر سيستم هاي بيولوژیک هنوز پرسش هاي زيادي در مورد چگونگي ايجاد مرگ و آسيب هاي سلولي ناشي از آن وجود دارد که تحقيقات و مطالعات بيشتري را طلب مي کند. تحقيق حاضر با بررسی تاثير ميزان آسيب رسان فشار هيدرو استاتيك بر سلول هاي فصلنامه پزشکی یاخته سال دهم شماره 2 تابستان 87

3 آپوپتوز در سلول هاي تمايز يافته PC-12 عصبي تمايز يافته در محيط كشت و بررسي تغييرات درتوانايي هاي حياتي سلول ها مانند مورفولوژي چسبندگي سلول به بستر و مهاجرت سلول ها سعي در يافتن پاسخ مناسب به نكات مبهمي كه در نتيجه اعمال فشار هيدرواستاتيك در سلول هاي عصبي روي مي دهد دارد. مواد و روش ها کشت و تمايز سلول هاي رده PC-12 در اين مطالعه از رده سلوليPC-12 مشتق شده از مدوالي غده فوق كليه كه ماهيت عصبي دارد استفاده شد. اين رده سلولي توسط گرين و تيچلر استخراج شده و از آن پس به طور متداول در تحقيقات نوروشيميايي و نوروفيزيولوژي مورد استفاده قرار گرفته است )10(. سلول های تهيه شده از بانک سلولي انستيتو پاستور ايران در محيط کشت (Gico,UK) RPMI 1640 همراه با افزودني هايي شامل 10 درصد Serum(Gico,UK) Fetl Bovine 2 ميلي موالر (Sigm,USA) L-Glutmine و 1 درصد اسيدهاي آمينه غيرضروري USA) (Sigm, کشت داده و در فالسک هاي كشت 40 ميلي ليتري در انکوباتور 37 درجه CO 2 به ميزان 5 درصد نگهداري شدند. سانتي گراد با تمايز سلول هاي رده PC-12 براساس مطالعات رسولي و همكارانش با اندكي تغييرات انجام شد. بدين منظور سلول هاي رده PC-12 به مدت 5 ساعت تحت تيمار با غلظت 214 نانوموالر )100 نانوگرم در ميلي ليتر( استئورسپورين (Alexis,USA) قرار گرفته و پس از ايجاد زوايد نوريتي بلند به عنوان نورون هاي بالغ و سلول هاي عصبي تمايز يافته در نظر گرفته شدند )11(. سپس سلول هاي تمايز يافته PC-12 در دو گروه كنترل )بدون اعمال فشار هيدرواستاتيك( و آزمايش )در معرض فشار هيدرواستاتيك( مورد مطالعه قرار گرفتند. سيستم اعمال فشار هيدرواستاتيك سيستم اعمال فشار هيدرواستاتيك مورد استفاده در اين تحقيق يك مدل تاييد شده در بين سيستم هاي متعدد اعمال فشار هيدرواستاتيك بر سلول هاست كه پيش از اين توسط آگار و همكارانش مورد استفاده قرار گرفته است )3(. اين سيستم شامل محفظه ای است که از طريق يک دريچه ورودي هوا به يک پمپ دمنده فشار متصل مي شود. ظروف كشت حاوي سلول هاي گروه آزمايش در داخل محفظه قرارداده شدند و فشار هيدرواستاتيك به ميزان 100 ميلي متر جيوه و به مدت 2 ساعت داخل محفظه پمپ شد. در گروه كنترل ظروف کشت حاوي سلول ها در محفظه ديگري بدون آنكه به آنها فشار اعمال شود در انکوباتور قرارداده شدند. سپس سلول ها از نظر ميزان بقا وقوع آپوپتوز مورفولوژي چسبيدن به بستر و مهاجرت مورد ارزيابي قرار گرفتند. در هر ارزيابي آزمايش ها چهار بار در گروه هاي غيروابسته تكرار شد. ارزيابي ميزان بقاي سلول ها به منظور تعيين اثر افزايش فشار هيدرواستاتيک بر درصد بقاي سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 سلول ها با تراكم سلول در هر خانه ظروف كشت 24 خانه كشت شده و به محفظه اعمال فشار منتقل شدند و تنها در گروه آزمايش فشار هيدرواستاتيك اعمال شد. سپس سلول هاي هر دو گروه در چهار زمان و 24 ساعت از نظر ميزان بقاي سلول ها مورد ارزيابي قرار گرفتند. بدين منظور ابتدا جداسازي سلول ها از كف ظرف با آنزيم تريپسين- EDTA 0/25 درصد USA) (Sigm, انجام شد سپس 100 ميكرو ليتر از سوسپانسيون سلولي با 100 ميكرو ليتر محلول 0/4 درصد تريپان بلو مخلوط شد و پس از 2 دقيقه سلول ها روي الم نئوبار شمارش شدند و درصد بقاي سلول ها از تقسيم تعداد سلول هاي رنگ نگرفته بر تعداد کل سلول ها ضربدر عدد 100 محاسبه شد )12(. نتايج به دست آمده از تعيين ميزان بقاي سلول ها پس از رنگ آميزي حياتي با پروپيديوم يديدكه پيش از اين توسط تاس و همكارانش پيشنهاد شده است مورد تاييد قرار گرفت )13(. بدين منظور سلول ها پس از تثبيت با محلول پارافرمالدئيد 4 درصد به مدت 20 دقيقه در محلول پروپيديوم يديد )20 ميکروگرم در ميلي ليتر(رنگ آميزي شده و پس از سه بار شست وشو با (Phosphte Bffer Slin) PBS با ميکروسکوپ فلورسنت Jpn) (Olympus AX-70; مطالعه شدند. با توجه به سم ی بودن اين رنگ در كليه مراحل رنگ آميزي اصول حفاظتي به خوبي رعايت شد. بررسي وقوع آپوپتوز در اثر اعمال فشار هيدرواستاتيك براي بررسي ميزان وقوع آپوپتوز در اثر اعمال فشار هيدرواستاتيك از رنگ آميزي تونل (Terminl Uridine Deoxynucleotidyl Trnsferse dutp Nick End Leling) TUNEL استفاده شد. اين نوع رنگ آميزي روشي براي مشخص کردن قطعه قطعه شدن منظم DNA در جريان مرگ سلولي از نوع آپوپتوز محسوب مي شود )14(. سلول هاي عصبي تمايز يافته با تراکم 10 3 سلول در هر خانه ظرف کشت 96 خانه كشت داده شدند. پس از انجام آزمايش سلول ها در محلول پارافرمالدئيد 4 درصد به مدت يك ساعت تثبيت شدند. نفوذپذيري غشای سلول ها با استفاده از محلول 0/2 درصد USA) Triton 100-X (Sigm, به مدت دو دقيقه برروي يخ انجام شد. سپس سلول ها به مدت 1 ساعت دردماي 37 درجه سانتي گراد و شرايط تاريکي با محلول ترکيبي (Roche,Denmrk) TUNEL انکوبه شدند. سرانجام رنگ آميزي سلول ها در محلول 20 ميکروگرم در ميلي ليتر پروپيديوم يديد انجام شد و سلول ها پس از سه بار شست وشو با (Olympus AX-70; Jpn) با ميکروسکوپ فلورسنت PBS مطالعه شدند. سلول هاي با هسته رنگ زرد درخشان به عنوان سلول هاي آپوپتوتيك شمارش شده و در نهايت شاخص آپوپتوز از تقسيم تعداد سلول هاي آپوپتوتيك بر تعداد كل سلول ها ضربدر عدد 100 محاسبه شد. در اين آزمايش از هر خانه ظرف کشت 40 زمينه ميکروسکوپي )بزرگ نمايي x100( به طور تصادفي بررسي شد. سلول هاي PC-12 كه در محيط كشت همراه با اتانول 5 درصد به عنوان القاگر قوي آپوپتوز به مدت 2 ساعت قرار گرفته بودند به عنوان گروه كنترل مثبت در نظر گرفته شدند. ارزيابي مورفولوژي سلول ها ارزيابي مورفولوژي سلول ها به منظور تعيين اثر افزايش فشار هيدرواستاتيک بر طول نوريت هاي سلول هاي تمايز يافته PC-12 در چهار زمان و 24 ساعت پس از اعمال فشار هيدرواستاتيك انجام شد. بدين منظور سلول هاي هر دو گروه کنترل و آزمايش كه با تراكم 10 4 سلول در هر خانه ظرف کشت 24 خانه کشت شده بودند پس از تثبيت در پارافرمالدئيد 4 درصد به مدت يك ساعت و رنگ آميزي با محلول کريستال ويولت 2 درصد به مدت 5 دقيقه و سه بار شست وشو با PBS مورد ارزيابي مورفولوژيک قرار گرفتند. يکي از بهترين روش ها براي ارزيابي مورفولوژي سلول هاي عصبي تمايز يافته اندازه گيري طول كل 131 Ykhteh Medicl Journl, Vol 10, No 2, Summer

4 صدری و همکاران نوريت هاي هر سلول است )15(. در اين روش كه توسط رون معرفي شد از سلول ها به صورت نقاط تصادفي در ظرف کشت با ميکروسکوپ نوري معکوس Jpn( )Olympus IX-71; عکس برداري شد )بزرگ نمايي x100( عكس ها در يک پس زمينه تعريف شده با خطوط افقي با فاصله هاي مشخص (d) قرار گرفتند تعداد نقاطي که نوريت ها خطوط افقي را قطع مي كنند تحت عنوان Intersection شمارش و پس از قرار دادن در فرمول زير مقدار حاصل به عنوان طول كل نوريت هاي يک نورون (TNL) محاسبه شد )13(. در هر گروه تعداد 100 سلول ارزيابي شدند. π. d TNL = I 2 TNL) Totl )=طول Neurite Length: تمام نوريت هاي يك نورون d= فاصله بين دو خط افقي intersection تعداد =I π=3.14 ارزيابي توانايي چسبندگي سلول ها به بستر اين آزمون به منظور تعيين اثر افزايش فشار هيدرواستاتيک بر توانايي چسبندگي سلول ها به بستر انجام شد. بدين منظور سلول ها به دنبال بازگرداندن ازمحفظه اعمال فشار با آنزيم تريپسين EDTA- 0/25 درصد از كف ظروف كشت جدا شدند. سپس سوسپانسيون سلولي به دست آمده از هر دو گروه با تراكم 10 4 سلول در هر خانه ظرف كشت 24 خانه پوشيده شده با كالژن مجددا پليت شدند و در انکوباتور قرار گرفتند. در زمان هاي و 240 دقيقه پس از پليت مجدد و فرصت دادن به سلول ها براي چسبيدن به بستر محلول رويي حاوي سلول هاي نچسبيده برداشته و سلول هاي چسبيده توسط پارافرمالدئيد 4 درصد به مدت يك ساعت تثبيت شدند )16(. سپس سلول ها با رنگ کريستال ويولت 2 درصد به مدت 5 دقيقه رنگ آميزي و پس از سه بار شست وشو با PBS شمارش شدند. شمارش سلول هاي چسبيده به كف ظرف كشت توسط عکس برداري از تمام نقاط ظرف كشت )بزرگ نمايي x40( در هريك از فواصل زماني مورد مطالعه در هر دو گروه انجام شد. در هر گروه 100 زمينه ميكروسكوپي بررسي شد. ارزيابي توانايي مهاجرت سلول ها در اين آزمون به سلول هاي رده PC-12 اجازه داده شد آن قدر تقسيم شوند تا كامال كف ظرف كشت را پر كرده و به صورت تك اليه سلولي درآيند. پس از تمايز انتقال به محفظه اعمال فشار و خارج كردن ظروف كشت از محفظه بخش مشخصي از تك اليه سلولي از کف ظرف كشت توسط یک تيغ تميز و استريل تراشيده شد تا يک سطح عاري از سلول و عالمت گذاري شده در کف ظرف ايجادشود. تک اليه تراشيده شده به آرامي از ظرف كشت شسته شد و در ادامه محيط کشت تازه جايگزين شد. سپس ظروف كشت به مدت 24 ساعت داخل انكوباتور قرار گرفته و پس از گذشت اين زمان سلول ها با پارافرمالدئيد 4 درصد تثبيت شدند. سپس سلول ها با رنگ کريستال ويولت 2 درصد به مدت 5 دقيقه رنگ آميزي و پس از سه بار شست وشو با PBS مورد بررسي قرار گرفتند. در اين بررسي ها كه با عكس برداري )بزگ نمايي x200( از مناطق عالمت گذاري شده صورت گرفت تعداد سلول هاي مهاجرت كرده از خط نشانه شمارش شدند )17(. در هر گروه 30 زمينه ميكروسكوپي واجد خط نشانه بررسي شد. بررسي هاي آماري داده هاي مربوط به درصد بقاي سلول ها شاخص آپوپتوز طول نوريت ها تعداد سلول هاي چسبيده به بستر و تعداد سلول هاي مهاجرت كرده در دو گروه كنترل و آزمايش به صورت ميانگين و انحراف از خطاي ميانگين محاسبه و از آزمون )12.Ver,softwre SPSS( t-test براي بررسي معني دار بودن اختالف بين گروه ها استفاده شد و تفاوت هاي با 0/05<p معني دار در نظر گرفته شد. يافته ها اثر فشار هيدرواستاتيک بر درصد بقاي سلول ها نتايج به دست آمده از ارزيابي ميزان بقاي سلول ها نشان داد اعمال فشار هيدرواستاتيک در زمان هاي 6 0 و 12 ساعت پس از اعمال فشار اختالف معنی داري را در دو گروه كنترل و آزمايش ايجاد نکرده بود. درحالي كه پس از گذشت 24 ساعت درصد بقاي سلول ها از 91±1/4 درصد در گروه کنترل به 87±1/6 درصد در گروه آزمايش کاهش يافته بود كه اين کاهش از نظر آماري اختالف معنی داري را بين دو گروه نشان داد 0/05( p< (t test, )نمودار.)1 گروه کنترل گروه آزمایش نمودار 1: اثر فشار هيدرواستاتيك بر در صد بقاي سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 در زمان هاي مختلف :/ ستون هاي با حروف مختلف داراي اختالف معني دار هستند. (t test, p< 0/05( گروه كنترل: سلول ها بدون اعمال فشار هيدرواستاتيك گروه آزمايش: سلول ها در معرض فشار هيدرواستاتيك 100 درصد 95 درصد 90 درصد 85 درصد 80 درصد 75 درصد زمان )ساعت( گروه کنترل گروه آزمایش زمان )ساعت( طول نوریت ها )میکرومتر( درصد بقای سلول ها نمودار 2: اثر فشار هيدرواستاتيك بر مورفولوژي سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 در زمان هاي مختلف :/ ستون هاي با حروف مختلف داراي اختالف معنی دار هستند. (t test, p< 0/05( گروه كنترل: سلول ها بدون اعمال فشار هيدرواستاتيك گروه آزمايش: سلول ها در معرض فشار هيدرواستاتيك 132 فصلنامه پزشکی یاخته سال دهم شماره 2 تابستان

5 آپوپتوز در سلول هاي تمايز يافته PC-12 اثر فشار هيدرواستاتيک بر شاخص آپوپتوز در سلول ها بررسي نتايج به دست آمده از مقايسه شاخص آپوپتوز كه بالفاصله پس از خارج كردن سلول ها از محفظه فشار انجام شد حاكي از آن بود كه شاخص آپوپتوز از 3±0/5 در گروه کنترل به /15±0 8 در گروه آزمايش افزايش معنی داري يافته بود )0/05 >p t) test, )شكل 1(. اين امر نشان داد كه اعمال فشار هيدرواستاتيک سبب ايجاد مرگ سلولي از نوع آپوپتوز در سلول هاي گروه آزمايش شده است. اثر فشار هيدرواستاتيک بر مورفولوژي سلول ها اندازه گيري طول نوريت هاي سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 در چهار فاصله زماني و 24 ساعت پس از اعمال فشار هيدرواستاتيک انجام شد. ميانگين طول نوريت هاي سلول ها در چهار فاصله زماني اندازه گيري شده در گروه كنترل به ترتيب 176±13/2 185±7/8 196±7/5 196±7/8 ميکرومتر و در گروه آزمايش 134±7/7 138±5/7 124±6/7 123±9/0 ميکرومتر بود )شكل 2 نمودار 2(. اين نتايج كاهش معنی داري بين طول نوريت هاي گروه آزمايش در مقايسه با گروه كنترل نشان داد.(t test, p< 0/05( شكل 1: اثر فشار هيدرواستاتيك بر ميزان وقوع آپوپتوز در سلول هاي عصبي تمايز يافته.PC-12 سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 در گروه هاي كنترل )بدون اعمال فشار هيدرواستاتيك( )A,B( و آزمايش )در معرض فشار هيدرواستاتيك( ),(. ظاهر آسيب ديده سلول هايي كه با پيكان مشخص شده در تصاوير ميكروسكوپ معكوس ),A( و سلول هاي به رنگ زرد درخشان در تصاوير رنگ آميزي ( TUNEL,B) نشان دهنده ايجاد آپوپتوز در آنهاست..)Scle Br=40µm( ) بزرگ نمايي x 320 و x 200) ( بزرگ نمايي B و A( شكل 2 : اثر فشار هيدرواستاتيك بر مورفولوژي سلول هاي عصبي تمايز يافته.PC-12 جمع شدن زوايد نوروني و كاهش طول آنها در سلول ها پس از تاثير فشار هيدرواستاتيك مشهود است. گروه كنترل )بدون اعمال فشار هيدرواستاتيك( )A( گروه آزمايش )در معرض فشار هيدرواستاتيك( )(. نمايي )x 100 )بزرگ )Scle Br=20µm( 133 Ykhteh Medicl Journl, Vol 10, No 2, Summer

6 صدری و همکاران A 5 دقیقه B 15 دقیقه C 30 دقیقه D d 60 دقیقه E e 120 دقیقه F f 240 دقیقه شكل 3: اثر فشار هيدرواستاتيك بر چسبندگي به بستردر سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 در زمان هاي مختلف. كاهش تعداد سلول هاي چسبيده شده به بستر در گروه كنترل )F,A(,B,C,D,E در مقايسه با گروه آزمايش ( f,(,,c,d,e پس از گذشت 15 دقيقه كامال مشهود است. گروه كنترل )بدون اعمال فشار هيدرواستاتيك( گروه آزمايش )در معرض فشار هيدرواستاتيك(. نمايي )x40 )بزرگ.)Scle Br=150µm( اثر فشار هيدرواستاتيک بر توانايي چسبندگي سلول ها به بستر شمارش تعداد سلول هاي چسبيده به بستر در 6 فاصله زماني مختلف پس از پليت مجدد سلول ها انجام شد. براساس اين مشاهدات ميانگين تعداد سلول هاي چسبيده به بستر در شش زمان مورد بررسي در گروه كنترل به ترتيب 7/1±1/0 112±12/3 103/3±11/4 39/3±6/0 15/8±2/2 112±6/4 و در گروه آزمايش 5/2±0/7 6/8±0/4 14±2/0 47/7±3/8 36/9±2/1 و 57±5/0 بود )شكل 3(. اين نتايج نشان مي دهد تا 5 دقيقه پس از پليت مجدد سلول ها که تعداد سلول هاي چسبيده به بستر در دوگروه اختالف معنی داري نداشت در ساير زمان ها کاهش قابل مالحظه و معنی داري در تعداد سلول هاي چسبيده به بستر در گروه آزمايش در مقايسه با گروه کنترل مشاهده شد 0/05( p<.(t test, 134 فصلنامه پزشکی یاخته سال دهم شماره 2 تابستان

7 آپوپتوز در سلول هاي تمايز يافته PC-12 اثر فشار هيدرواستاتيک بر توانايي مهاجرت سلول ها شمارش تعداد سلول هاي مهاجرت کرده از خط نشانه 24 ساعت پس از نشانه گذاري ظروف كشت انجام شد. ميانگين تعداد سلول هاي مهاجرت کرده ازخط نشانه در گروه کنترل 14/3±1/2 و در گروه آزمايش 6/4±0/6 بود )0/05 >p t). test, اين نتايج نشان داد كه اعمال فشار هيدرواستاتيک سبب کاهش معنی دار تعداد سلول هاي مهاجرت کرده در گروه آزمايش درمقايسه با گروه کنترل شده است. بحث فشار هيدرواستاتيک يكي از عوامل مكانيكي اصلي محيط اطراف سلول ها است که نقش بسيار مهمي در عملکرد و حيات آنها دارد. تحقيقات اندكي در زمينه بررسي اثر فشار هيدرواستاتيک و نحوه مرگ سلولي و ايجاد بيماري در نورون ها به صورت آزمايشگاهي انجام شده است. همين مسئله سبب شده تا پاتوفيزيولوژي آسيب هاي به وجود آمده و چگونگي بروز مرگ سلولي در اثر افزايش ميزان فشار هيدرو استاتيک تا سال ها ناشناخته بماند. در تحقيق حاضر براي دست يابي به مدلي مناسب از نورون هاي دستگاه عصبي و تاثير فشار هيدرواستاتيك بر آن از سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 كه توسط استئورسپورين تمايز يافته بودند استفاده شد )11 18(. سپس مطالعه اثرات فشار هيدرواستاتيک روي اين سلول ها با يک ديد مورفولوژيکي- عملکردي انجام شد. به طوري که پس از بررسي درصد بقا و مورفولوژي سلول ها و مقايسه آنها در دو گروه کنترل و در معرض فشار توانايي اتصال سلول ها به بستر و مهاجرت آنها در جهت بررسي بروزآپوپتوز در سلول هاي عصبي در اثر افزايش ميزان فشار هيدرواستاتيک مورد مطالعه قرار گرفت. تا سال 2000 مطالعه اي مبني بر تاثير مستقيم فشار هيدرواستاتيک بر سلول هاي عصبي انجام نشده بود تا اينکه آگار و همکارانش سلول هاي عصبي را در معرض فشارهيدرواستاتيک به ميزان 100 ميلي متر جيوه قرار دادند و تغييرات به وجود آمده را بررسي کردند. بررسي هاي مورفولوژيکي و کم ي اين محققان مشخص كرد که فشار هيدرواستاتيک به تنهايي عامل بروز آپوپتوز در اين سلول هاست. اما چگونگي ايجاد آپوپتوز و داليل افزايش وقوع آن در اثر فشار هيدرواستاتيک همچنان ناشناخته است )3(. در تحقيق ديگري تزل و واكس اثر فشار هيدرواستاتيک به ميزان 50 ميلي متر جيوه را به طور مداوم بر سلول هاي عصبي گانگليوني شبكيه چشم در كشت هم زمان با سلول هاي گليال بررسي كردند. آنها TNF-α مترشحه از سلول هاي گليال را مسئول ايجاد آپوپتوز در سلول هاي عصبي گانگليوني معرفي كردند )4(. در تحقيق حاضر نيز ايجاد آپوپتوز پس از اعمال 100 ميلي متر جيوه فشار هيدرواستاتيک به مدت 2 ساعت توسط رنگ آميزي TUNEL و مقايسه شاخص آپوپتوز بين دو گروه کنترل و در معرض فشار تایيد شد. در آزمايش ارزيابي ميزان بقاي سلول ها درصد بقای سلول هاي هر دو گروه پس از گذشت 12 ساعت از اعمال فشار هيدرواستاتيک بيش از 95 درصد بود كه اين مسئله نشان دهنده درصد بقاي طبيعي در هر دو گروه کنترل و در معرض فشار است. اما پس از گذشت 24 ساعت درصد بقاي سلول هايي كه در معرض فشار هيدرواستاتيک قرار گرفته بودند كاهش يافت. يكي از داليل اين کاهش درصد بقا مي تواند تشديد اثر فشار هيدرواستاتيک با گذشت زمان و ناتواني برخي از سلول ها در بازيابي توان زيستي خود پس از اعمال فشار هيدرواستاتيک باشد که حتي باعث اختالل در سازماندهي غشا و در نهايت مرگ سلول پارگي غشا و نفوذپذيري آن به تريپان بلو و پروپيديوم يديد شده است. از آنجايي كه اعمال فشار هيدرواستاتيک بر سلول ها همواره به عنوان يکي از ابزارهاي مفيد براي تحليل ساختار معماري و در نهايت عملکرد سلول ها است )19-21( برآن شديم تا جهت بررسي آپوپتوز در سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 تغييرات مورفولوژيکي ايجاد شده در اين سلول ها را پس از اعمال فشار هيدرو استاتيک مورد بررسي قرار دهيم. براي بررسي مورفولوژيکي سلول هاي عصبي تمايز يافته بهترين راه ممکن اندازه گيري طول کل نوريت ها و زوايد سلولي است )15(. بررسي ها نشان داد که فشار هيدرواستاتيک سبب کاهش معني دار طول نوريت ها در تمام فواصل زماني می شود بود لذا مي توان نتيجه گرفت سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 در اثر اعمال فشار هيدرواستاتيک شروع به جمع كردن نوريت ها مي كنند كه اين امر يكي ازنشانه هاي مورفولوژيکي شروع پديده آپوپتوز در سلول ها تحت عنوان Pseudo Retrction است )22(. سلول هاي تمايز يافته عصبي براي نوريت زايي و افزايش طول نوريت ها به برهم کنش مناسب با ماتريکس خارج سلولي و بستر احتياج دارند ) 23 (.کاهش طول نوريت ها درا ثر فشار هيدرواستاتيک كه در بررسي هاي مورفولوژيکي مشاهده شد مي تواند ناشي از اثر مستقيم فشار هيدرو استاتيک بر سلول و کم کردن برهم کنش مناسب سلول-بستر در سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 به عنوان يک سلول وابسته به اتصال باشد. ارتباطات سلول با ماتريكس خارج سلولي و بستر نقش بسيار مهمي در فرايندهاي اساسي بيولوژيکي از جمله حرکات سلولي رشد تمايز مهاجرت تنظيم تظاهرات ژني و در نهايت حيات سلول بازي مي کند )7 8(. سيگنال هايي که از ماتريكس خارج سلولي به سلول القا مي شود حتي سبب سرکوب مرگ سلولي در آنها مي گردد )24(. اهميت سيگنال هاي مخابره شده از ماتريكس خارج سلولي که توسط اينتگرين ها و نقاط اتصالي صورت مي گيرد به حدي است که دسته اي ازاين سيگنال ها در پاسخ به کاهش يا فقدان برهم کنش سلول با ماتريكس خارج سلولي سبب القاي آنويکيز مي شوند. آنويکيز واكنش هايي است که سلول در پاسخ به برهم کنش نامناسب با ماتريكس خارج سلولي و بستر در قالب مرگ سلول بروز مي دهد )25 26 (.نتايج مطالعات گي يو و همكارانش كه به بررسي بافت شبكيه چشم موش هاي صحرايي مبتال به بيماري گلوكوما پرداخته بودند نشان داد افزايش ميزان فشار هيدرواستاتيک سبب تخريب المينين يكي از پروتئين هاي اصلي ماتريكس خارج سلولي اطراف سلول هاي گانگليوني شبکيه چشم شده بود كه همين تغييرات سبب بروز آپوپتوز در بافت عصبي شبکيه و در نهايت ايجاد بيماري گلوكوما شده است )27(. در تحقيق حاضر نيز همانند مطالعات گي يو و همكارانش اثر افزايش ميزان فشار هيدرواستاتيک بر برهم كنش سلول هاي عصبي با بستر اطراف بررسي شد.با اين تفاوت كه مطالعه حاضر روي يك سيستم سلولي انجام شده و فشار هيدرواستاتيک مستقيما و بدون واسطه بر سلول ها اعمال شده است. بررسي تعداد سلول هاي چسبيده به كف ظرف كه پس از پليت مجدد سلول ها انجام گرفت نشان داد که توانايي چسبندگي سلول ها به بستر خارج سلولي کاهش بسيار محسوس و معنی داري يافته است. به طوري که مثال در فاصله هاي زماني 1 تا 2 ساعت پس از پليت مجدد سلول ها توانايي چسبندگي سلول هاي در معرض فشار در مقايسه با گروه کنترل از نصف هم کمتر شده بود. از سوي ديگر توانايي مهاجرت سلول ها که خود نمودي از برهم کنش مناسب سلول با بستر است )28( پس از گذشت 24 ساعت از اعمال فشار هيدرواستاتيك در سلول هاي گروه فشار 135 Ykhteh Medicl Journl, Vol 10, No 2, Summer

8 صدری و همکاران نسبت به گروه کنترل افت محسوس و معنی داري را نشان داد.با توجه به اين كه سلول هاي عصبي به تنهايي و بدون هم كشتي با سلول هاي پشتيبان به سيستم اعمال فشار هيدرواستاتيک منتقل شده بودند مي توان استنباط كرد كه فشار هيدرواستاتيک مستقيما روي خود سلول و واسطه هاي غشايي سلول و ماتريكس خارج سلولي اثر گذاشته و سبب اختالل در برهم كنش مناسب سلول ها به بستر و در نهايت ايجاد آپوپتوز در سلول هاي تحت فشار هيدرواستاتيک شده است. نتيجه گيري در اين مطالعه آپوپتوز ناشي از اثر فشار هيدرواستاتيک در سلول هاي عصبي تمايز يافته PC-12 تایيد شدند. نتايج بررسي هاي مورفولوژيكي و عملكردي سلول ها نشان داد فشار هيدرواستاتيك عالوه بر تاثيري كه بر مورفولوژي اين سلول ها دارد و سبب جمع كردن نوريت ها مي شود با ايجاد اختالل در برهمكنش مناسب سلول با بستر اطرافش ممكن است زمينه ايجاد مرگ سلولي در آنها را فراهم كند. اهميت اين مسئله تا آن اندازه است كه در آينده مي توانيم با استفاده از بررسي ايمونوسيتوشيمي پروتئين هايي كه در اتصاالت سلول - بستر نقش دارند و بررسي ژن هاي موثر در بروز مرگ سلولي ناشي از اختالل در برهم كنش سلول - بستر مرگ سلولي ايجاد شده در اثر فشار هيدرو استاتيك در سلول هاي عصبي تمايز يافته را مورد بررسي دقيق تري قرار دهيم. References 1. Tn J, Klpesi F, Coroneo M. Mechnosensitivity nd the eye: cells coping with the pressure. J Ophthlmol, 2006; 90: Guyton A, Hll J. Textook of Medicl Physiology. Snders, 10 nd ed.new York: Oryx Press 2000; Agr A, Yip S, Hill M, Coroneo M. Pressure relted poptosis in neuronl cell lines. J Neurosci Res, 2000; 60: Tezel G, Wx M. Incresed production of tumor necrosis fctor-α y glil cells exposed to simulted ischemi or elevted hydrosttic pressure induced poptosis in cocultured retinl gnglion cells. J Neurosci, 2000; 23: Agr A, Li Sh, Agrwl N, Coroneo M, Hill M. Retinl gnglion cell line poptosis induced y hydrosttic pressure. Brin Res, 2006; 1086: Geiger B, Bershdsky A. Exploring the neighorhood: dhesion-coupled cell mechnosensors. Cell, 2002; 110: Gincotti F. Integrin signling: specificity nd control of cell survivl nd cell cycle progression. Curr Opin Cell Biol, 1997; 9: Drlene G, Ross A, Desi. A chrcteriztion of PC-12 cell prolifertion nd differentition-stimulted y ECM dhesion proteins nd neurotrophic fctors. J Mterils Sci, 2003; 14: Gilmore A. Anoikis. Cell Deth Differ, 2005; 12: Greene L, Tischler A. Estlishment of nordrenergic clonl line of rt drenl pheochromocytom cells which respond to nerve growth fctor. Nt Acid Sci, 1976; 73: Rsouly D, Rhmim E, Lester D, Mtsud Y, Lzrovici P. Sturosporine-induced neurite outgrowth in PC-12 cells is independent of protein kinse C inhiition. Mol Phrmco, 1992; 42: Freshney R. Animl cell culture: prcticl pproch. 3rd ed.london: Oxford University Press P: Ts J, Westerneng G. Regent for the fluorescent stining of nucleic cids.histochem Cytochem, 981; 29: Gold R. Differentition etween cellulr poptosis nd necrosis y the comined use of in situ tiling nd nick trnsltion techniques. L Invest, 1994; 71: Ronn L, Rlets I, Hrtz B, Bech M, Berezin A, Berezin V, et l. A simple procedure for quntifiction of neurite outgrowth sed on stereologicl principles. J Neurosci Method, 2000; 100: Kir-Slmni M, Shiokw S, Akimoto Y, Ski K, Iwshit, M. Chrcteriztion of morphologicl nd cytoskeletl chnges in tropholst cells induced y insulin-like growth fctor-i. J Clinicl Endocrin & Metolism, 2002; 12: Kir-Slmni M, Shiokw S, Akimoto Y, Hsnnejed H, Ski K, Hosseini A, et l. The role of lph (5) et (1)-integrin in the IGF-I-induced migrtion of extr villous tropholst cells during the process of implnttion. Mol Hum Reprod, 2004; Hshimoto S, Hgino A. Sturosporine induced neurite outgrowth in PC-12 cells. Exp Cell Res, 1983; 184: Rosin M, Zimermnn A. High pressure studies in cell iology. J Cell Sci, 1997; 26: Msson P. Action of hydrosttic pressure on proteins: emergence of high-pressure iotechnology, potentil phrmceuticl nd medicl pplictions. Annu Phrmceutiques, 1999; 57: Ronld G, Wilson J, Judy E, Zimmermn S, Zimmermn A. Hydrosttic pressure induced chnges in the cytorchitechture of PC-12 cells, Cell Biol Int, 2001;25: 7, Kerr J, Wyllie A, Currie A. Apoptosis: sic iologicl phenomenon with wide rnging implictions in tissue kinetics, Br J Cncer, 1972; 26: Seidenfden R, Kruter A, Hilderndt H. The neurl cell dhesion molecule regultes neuritogenesis y multiple mechnisms of interction.nourochem int, 2006; 49: Frisch S, Frncis H. Disruption of epithelil cellmtrix interctions induces poptosis. J Cell Biol, 124: Frisch S, Screton R. Anoikis mechnisms. Curr Opin Cell Biol, 2001; 13: Kroemer G, El-Deiry W, Golstein P, Peter M, Vux D, Vndeneele P, et l. Clssifiction of cell deth: recommendtions of the nomenclture committee on cell deth. Cell Deth Differ, 2005; 12: Guo l, Moss S, Alexnder R, Ali R, Fitzke F, Cordeiro M. Retinl gnglion cell poptosis in glucom is relted to introculr pressure nd IOP-induced effects on extrcellulr mtrix.invest Ophthlmol Vis Sci, 2005; 46: Luffenurger D, Horwitz A. Cell migrtion: A physiclly integrted moleculr process. Cell, 1996; 84: فصلنامه پزشکی یاخته سال دهم شماره 2 تابستان