ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΙΔΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ PSEUDO-NITZSCHIA PERAGALLO (ΒACILLARIOPHYCEAE) ΑΠΟ ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΠΑΡΑΚΤΙΑ ΥΔΑΤΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗ ΕΠΕΤΗΡΙΔΑ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΜΟΣΧΑΝΔΡΕΟΥ Κ. ΚΙΜΩΝ MSc Βιολόγος ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΙΔΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ PSEUDO-NITZSCHIA PERAGALLO (ΒACILLARIOPHYCEAE) ΑΠΟ ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΠΑΡΑΚΤΙΑ ΥΔΑΤΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΟΥ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

2 «Η έγκριση της παρούσας διατριβής υπό του Τμήματος Βιολογίας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2)»

3 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI SCIENTIFIC ANNALS OF THE SCHOOL OF BIOLOGY OF THE FACULTY OF SCIENCES MOSCHANDREOU Κ. KIMON MSc Biologist IDENTIFICATION OF SPECIES PSEUDO-NITZSCHIA PERAGALLO (ΒACILLARIOPHYCEAE) FROM GREEK COASTAL WATERS DOCTORAL DISSERTATION SUBMITTED TO THE SCHOOL OF BIOLOGY FACULTY OF SCIENCES ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI THESSALONIKI 2011

4 Επιβλέπων: Αμπατζόπουλος Θεόδωρος, Καθηγητής Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή: Αμπατζόπουλος Θεόδωρος, Καθηγητής Δανιηλίδης Δανιήλ, Επίκουρος Καθηγητής Ελευθέριος Π. Ελευθερίου, Καθηγητής Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή: Αμπατζόπουλος Θεόδωρος, Καθηγητής (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Αρσενάκης Μηνάς, Καθηγητής (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Δανιηλίδης Δανιήλ, Επίκουρος Καθηγητής (Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών) Δεληβόπουλος Στυλιανός, Καθηγητής (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Ελευθερίου Π. Ελευθέριος, Καθηγητής (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Καππάς Ηλίας, Λέκτορας (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης) Οικονόμου-Αμίλλη Αθηνά, Καθηγήτρια (Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών)

5 Στον αείμνηστο δάσκαλο Γεώργιο Νικολαΐδη και σε όλους αυτούς που στάθηκαν πλάι μου μετά την απώλειά του

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή ξεκίνησε προς τα τέλη του Εκπονήθηκε στον Τομέα Βοτανικής, του Τμήματος Βιολογίας, της Σχολής Θετικών Επιστημών, του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης υπό την επίβλεψη του αείμνηστου Αναπληρωτή Καθηγητή Γ. Νικολαΐδη. Έπειτα από τον αδόκητο χαμό του επιβλέποντα, καθήκοντα επιβλέποντα ανέλαβε ο καθηγητής Θ. Ι. Αμπατζόπουλος (Τομέας Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης). Τμήμα της διατριβής εκπονήθηκε και στο Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς Θαλασσίων Βιοτοξινών (Ινστιτούτο Υγιεινής Τροφίμων, Κέντρο Κτηνιατρικών Ιδρυμάτων Θεσσαλονίκης) του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Με την ολοκλήρωση της παρούσας διδακτορικής διατριβής οφείλω να ευχαριστήσω όλους αυτούς που συνέβαλαν με οποιοδήποτε τρόπο στην εκπόνηση και ολοκλήρωσή της. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον είμνηστο Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ. Γεώργιο Νικολαΐδη, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε με την ανάθεση της διδακτορικής διατριβής, τη μετέπειτα επιστημονική καθοδήγηση και τις πολύτιμες συμβουλές του. Επιπλέον, ευαριστώ θερμά τον Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ. Θεόδωρο Ι. Αμπατζόπουλο, ο οποίος ανέλαβε καθήκοντα επιβλέποντα έπειτα από τον αδόκητο θάνατο του Γ. Νικολαΐδη. Χωρίς τη δική του παρουσία αλλά και την πολύτιμη επιστημονική του καθοδήγηση η ολοκλήρωση της παρούσας διδακτορικής διατριβής θα ήταν αδύνατη. Εκφράζω επίσης τις βαθιές μου ευχαριστίες σε όλα τα μέλη της εξταστικής επιτροπής, και συγκεκριμένα στους: Δανιήλ Δανιηλίδη, Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας Ε.Κ.Π.Α. και μέλος της συμβουλευτικής επιτροπής, για την μακροχρόνια βοήθεια και συμπαράστασή του. Ελευθέριο Π. Ελευθερίου, Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ., για τη συμμετοχή του στην συμβουλευτική επιτροπή έπειτα από τα τελευταία τραγικά γεγονότα. Τον ευχαριστώ επίσης για την προθυμία και την καθοδήγηση του στη χρήση της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας αλλά και την καλοπροαίρετη κριτική του στο τελικό κείμενο. Μηνά Αρσενάκη, Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ., για τις πολύτιμες υποδείξεις του αλλά και τη στήριξή του για την περάτωση της παρούσας διατριβής, ως πρόεδρος του Τμήματος i

7 Βιολογίας και επιστημονικός υπεύθυνος του Προγράμματος Παρακολούθησης Θαλάσσιων Τοξικών Μικροφυκών. Αθηνά Οικονόμου-Αμίλλη, Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας Ε.Κ.Π.Α., για τις χρήσιμες παρατηρήσεις της και την επιστημονική της βοήθεια. Στυλιανό Δεληβόπουλο, Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ., για τη συμμετοχή του στην επταμελή εξεταστική επιτροπή και τις εύστοχες και χρήσιμες υποδείξεις του. Ηλία Καππά, Λέκτορα του Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ., για την καλοπροαίρετη συνεργασία και τις εποικοδομητικές επιστημονικές συζητήσεις. Σε αυτό το σημείο θα πρέπει να ευχαριστήσω και τον Ηλία Παπαπαναγιώτου, Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Κτηνιατρικής Α.Π.Θ. ο οποίος ξεκίνησε ως μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, αλλά λόγοι ανωτέρας βίας δεν του επέτρεψαν να είναι μέλος της επιτροπής έως το τέλος. Ειλικρινά ευχαριστώ τη Δρ. Παναγιώτα Κατίκου, η οποία μου παρείχε τη δυνατότητα διεξαγωγής αλλά και πολύτιμη καθοδήγηση στις αναλύσεις παραγωγής τοξινών (Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς Θαλασσίων Βιοτοξινών). Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω το προσωπικό του Εργαστηρίου για τη θερμή φιλοξενία τους και τη βοήθειά τους, με προεξέχουσα την κ. Αλέκα Πάνου. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στο Δρ. Αθανάσιο Μπαξεβάνη, ο οποίος με την καθημερινή απόκτηση εμπειριών και γνώσεων βοήθησε τα μέγιστα στην ολοκλήρωση της διδακτορικής διατριβής. Θερμά ευχαριστώ τη Δρ. Δήμητρα Παπευθυμίου, η οποία με μύησε σε τεχνικές που μου ήταν παντελώς άγνωστες και η συνεργασία μας συνεχίσθηκε μέχρι το πέρας της διατριβής. Ιδιαίτερα θερμά ευχαριστώ τη Δρ. Αικατερίνη Αλιγιζάκη για τη μακροχόνια βοήθεια, συμπαράσταση και κατανόηση. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω και στους Καθηγητές του Τμήματος Βιολογίας Ε.Κ.Π.Α. Χρήστο Κατσαρό και Παναγιώτη Αποστολάκο, για τη θερμή φιλοξενία στο εργαστήριό τους και την ανιδιοτελή βοήθειά τους στη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στον υποψήφιο διδάκτορα του Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ. Ιωάννη Αδαμάκη για τη βοήθειά του στη χρήση της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. Επίσης ευχαριστώ από καρδιάς όλους τους συναδέλφους και συνεργάτες που πέρασαν από το εργαστήριο κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής και έκαναν πολύ πιο ευχάριστες τις ώρες στο εργαστήριο (ιδιαίτερα τους Άρη Βλάμη και Αθανασία Κατσικάρη). ii

8 Θερμές ευχαριστίες οφείλω και στην Ελένη Καλοπέσα για τη συμπαράστασή της και την εποικοδομητική συνεργασία μαζί της. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την κ. Μύριαμ Λεβή, για τη βοήθειά της στη μορφοποίηση της εργασίας αλλά και την πολυετή συμπαράστασή της. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω την οικογένειά μου αλλά και όλους τους φίλους που με προθυμία με στηρίζουν και με αγαπούν όλα αυτά τα χρόνια. iii

9 ΣΥΜΒΟΛΑ-ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΣΥΜΒΟΛΑ - ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ASP: Amnesic Shellfish Poisoning, αμνησιακού τύπου δηλητηρίαση από οστρακοειδή BI: Bayesian Inference, Ανάλυση κατά Bayes CBC: Compensatory Base Change, αντισταθμιστική αλλαγή βάσης cf.: confer (compare with ), εν συγκρίσει cox1: cyclooxygenase-1, κυκλοξυγενάση-1 CTAB: N-cetyl-N,N,N-trimethylammonium bromide, N-ακέτυλο-N,N,N-τριμεθυλο-βρωμιούχο αμμώνιο DA: domoic acid, δομοϊκό οξύ DAP: Domoic Acid Poisoning, δηλητηρίαση από δομοϊκό οξύ datp: 2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate, 5 τριφωσφορική αδενοσίνη dctp: 2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate, 5 τριφωσφορική κυτοσίνη dgtp: 2'-deoxycytidine -5'-triphosphate, 5 τριφωσφορική γουανίνη dttp: 2'-deoxyτhymidine-5'-triphosphate, 5 τριφωσφορική ουρακίλη EM/ΗΜ: electron microscope, ηλεκτρονικό μικροσκόπιο emend.: emended, τροποποιημένη epi-da: epi-domoic acid, επι-δομοϊκό οξύ f.: forma (form), μορφή HAB: Harmful Algal Blooms, επιβλαβής άνθηση φυκών HCBC: Hemi Compensatory Base Change, ημι-αντισταθμιστική αλλαγή βάσης iso-da: iso-domoic acid, ισο-δομοϊκό οξύ ITS: Internal Transcribed Spacer, μεταγραφόμενος εσωτερικός διαχωριστής rbcl: Ribulose-1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase, καρβοξυλάση-οξυγενάση της 1,5- διφωσφορικής ριβουλόζης L.O.Q.: Limit Of Quantification, όριο ποσοτικοποίησης LSU: Large SubUnit, μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα ML: Maximum Likelihood, Μέγιστη Πιθανοφάνεια MP: Maximum Parsimony, Μέγιστη Φειδωλότητα NMDA: N-methyl-D-aspartate, Ν-µεθυλο- -ασπαρτικό οξύ OM/ΟΜ: light microscope, οπτικό μικροσκόπιο PCR: Polymerase Chain Reaction, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης iv

10 ΣΥΜΒΟΛΑ-ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ PET: polyethylene terephthalate, τετραφθαλικό πολυαιθυλένιο PVC: polyvinyl chloride, χλωριούχο πολυβινύλιο ή πολυνινυλοχλωρίδιο SEM/ΗΜΣ: scanning electron microscope, ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης SNP: Single Nucleotide Polymorphism, πολυμορφισμός ενός νουκλεοτιδίου sp.: species (singular), είδος (ενικός) spp.: species (plural), είδη (πληθυντικός) SSU: Small SubUnit, μικρή ριβοσωμική υπομονάδα TE: Tris-HCl/EDTA buffer, Ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl/EDTA TEM/ΗΜΔ: transmission electron microscope, ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης var.: variety, ποικιλία v

11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το Γένος Pseudo-nitzschia Γενικές Πληροφορίες/Ιστορία Συστηματική Κατάταξη Εξάπλωση και Οικολογία Αναπαραγωγή Μορφολογία Παραγωγή Τοξινών Δομοϊκό Οξύ Δηλητηρίαση από Δομοϊκό Οξύ Δυνητικοί Παραγωγοί Δομοϊκού Οξέος Ποικιλότητα του Γένους Pseudo-nitzschia Ελληνικά Παράκτια Ύδατα Σκοπός ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Περιοχές Έρευνας - Γεωγραφική Προέλευση Υλικού Περίοδος, Συχνότητα και Πρωτόκολλο Συλλογής Υλικού Εργαστηριακές Αναλύσεις Επιλογή Δειγμάτων Απομόνωση Κυττάρων & Εγκατάσταση Καλλιεργειών Μορφολογική Ταυτοποίηση Ειδών Επεξεργασία Δειγμάτων Ορολογία Μορφολογικοί Χαρακτήρες με Ταξινομική Αξία Γενετική Ανάλυση Απομόνωση Γενετικού Υλικού Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Έλεγχος και Απομόνωση Προϊόντων της PCR Εύρεση της Πρωτοδιάταξης του DNA Επεξεργασία Ακολουθιών 35 vi

12 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ευθυγράμμιση Ακολουθιών Επιλογή Εξελικτικού Μοντέλου Νουκλεοτιδικών Αντικαταστάσεων Υπολογισμός Γενετικών Αποστάσεων Κατασκευή Φυλογενετικών Δένδρων Αρχή της Μέγιστης Φειδωλότητας Αρχή της Μέγιστης Πιθανοφάνειας Ανάλυση κατά Bayes Ανάλυση Αξιοπιστίας Διερεύνηση Τοξικότητας Προετοιμασία Καλλιεργειών-Δειγματοληψία Πειραματική Διαδικασία Διερεύνησης Παραγωγής Τοξινών από Στελέχη Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima Επεξεργασία-Εκχύλιση Δειγμάτων Ανάλυση σε Υγρή Χρωματογραφία ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μορφολογική Ταυτοποίηση Ειδών Pseudo-nitzschia Pseudo-nitzschia brasiliana Lundholm, Hasle et Fryxell Pseudo-nitzschia calliantha Lundholm, Moestrup et Hasle Pseudo-nitzschia delicatissima (Cleve) Heiden Μορφότυπος Pseudo-nitzschia cf. delicatissima Pseudo-nitzschia fraudulenta (Cleve) Hasle Pseudo-nitzschia galaxiae Lundholm et Moestrup Pseudo-nitzschia mannii Amato et Montresor Pseudo-nitzschia multiseries (Hasle) Hasle Pseudo-nitzschia multistriata (Takano) Takano Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima (Hasle) Hasle emend. Lundholm, Hasle et Moestrup Pseudo-nitzschia cf. pseudodelicatissima μορφότυπος Pseudo-nitzschia pungens var. pungens (Grunow ex Cleve) Hasle Pseudo-nitzschia subfraudulenta (Hasle) Hasle Pseudo-nitzschia subpacifica (Hasle) Hasle Pseudo-nitzschia cf. dolorosa 75 vii

13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σύνθεση Ειδών Pseudo-nitzschia ανά Περιοχή Μελέτης Ανάλυση Πρωτοδιάταξης ITS2 - Φυλογενετική Ανάλυση Γενετική Διαφοροποίηση Φυλογενετικές σχέσεις & Γενετική Ποικιλομορφία Παραγωγή Τοξινών από Είδη του Γένους Pseudo-nitzschia Δυνητικά Τοξινοπαραγωγά Στελέχη Παραγωγή Δομοϊκού Οξέος από Στελέχη του Είδους Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima κατά τη Διάρκεια της Ανάπτυξης ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ταυτοποίηση Ειδών Pseudo-nitzschia brasiliana Pseudo-nitzschia fraudulenta και Pseudo-nitzschia subfraudulenta Pseudo-nitzschia galaxiae Pseudo-nitzschia multiseries Pseudo-nitzschia multistriata Pseudo-nitzschia pungens var. pungens Pseudo-nitzschia subpacifica Σύμπλεγμα Ειδών Pseudo-nitzschia delicatissima Pseudo-nitzschia delicatissima Pseudo-nitzschia cf. delicatissima Pseudo-nitzschia cf. dolorosa Σύμπλεγμα Ειδών Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima & P. cuspidata Pseudo-nitzschia caciantha, P. calliantha & P. mannii Φυλογενετικές Σχέσεις Μεταξύ Ειδών του Γένους Pseudo-nitzschia Αξιολόγηση του Μοριακού Δείκτη Ταξινομική Αξία Μορφολογικών Χαρακτήρων Παραγωγή Τοξινών Δυνητικά Τοξινοπαραγωγά Είδη Παραγωγή DA από Στελέχη του Είδους Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima κατά τη Διάρκεια της Ανάπτυξης 148 viii

14 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Διεθνής Βιβλιογραφία Ελληνική Βιβλιογραφία ΠΕΡΙΛΗΨΗ - ABSTRACT 171 ix

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Το Γένος Pseudo-nitzschia Γενικές Πληροφορίες/Ιστορία Η ονομασία Pseudo-nitzschia αναφέρθηκε για πρώτη φορά στις αρχές του περασμένου αιώνα. Χρησιμοποιήθηκε από τους H. και M. Peragallo (Peragallo & Peragallo ) για την ταξινόμηση κάποιων πελαγικών διατόμων αβέβαιης ταξινομικής κατάταξης, τα οποία έως τότε κατατάσσονταν στο γένος Nitzschia Hassall (Hasle 1965, 1993). Αφορούσε στα είδη Nitzschia migrans, N. sicula, N. sicula var. bicuneata, N. seriata και N. seriata var. fraudulenta (Peragallo & Peragallo , Pl. LXXII) (Εικόνα 1.1). Πρόκειται για πτεροειδή διάτομα, τα οποία χαρακτηρίζονται από οξύληκτες, ατρακτοειδούς σχήματος θυρίδες. Επίσης, οι περισφίγξεις της ραφής ( keel puncta ή fibulae όπως είναι γνωστά σήμερα) είναι δυσδιάκριτες ή δεν παρατηρήθηκαν καθόλου, χαρακτηριστικό το οποίο κατά τη Hasle (1965) αποτέλεσε τον κύριο λόγο διάκρισής τους ως ξεχωριστό γένος. Ωστόσο, δεν είχε ορισθεί από τους ερευνητές υλικό τυπολογικής περιγραφής. Η μεταφορά και άλλων ειδών από το γένος Nitzschia στο Pseudo-nitzschia, υιοθετήθηκε και από άλλους ερευνητές στη συνέχεια, π.χ. Heiden & Kolbe, Frenguelli, Manguin και Hustedt (Hasle 1994). Το 1958 όμως, ο Hustedt, βασισμένος στη δομή της ραφής, πρότεινε την υπαγωγή των ειδών Pseudo-nitzschia ως ομάδα του γένους Nitzschia (Hasle 1994). Οι Fryxell et al. (1991) όρισαν το Nitzschia seriata ως λεκτότυπο του Pseudo-nitzschia [χρησιμοποιώντας ως τυπικό δείγμα το S405, του Cleve (1883), από το Tindingen της Γροιλανδίας] (Εικόνα 1.2), διατηρώντας το ωστόσο ως υποομάδα του γένους Nitzschia. Μόλις το 1993, και έπειτα από σύγκριση μορφολογικών χαρακτήρων μεταξύ των Pseudo-nitzschia και Nitzschia υπογένος Nitzschia (Mann 1986), η Hasle (1993, 1994) επανέφερε το Pseudo-nitzschia ως ένα διακριτό γένος: Pseudo-nitzschia Peragallo, 1900 emend. Hasle, 1993 Λεκτότυπος: P. seriata (Cleve) Peragallo (Peragallo & Peragallo, , Pl. LXXII [72], Fig. 28) 1

16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 1.1. Μικρογραφία της πρώτης αναφοράς ειδών Pseudo-nitzschia (εντός πλαισίων) (από Peragallo & Peragallo, , Pl. LXXII). Figure 1.1. Micrograph of the first reference of Pseudo-nitzschia species (within the frames) (from Peragallo & Peragallo, , Pl. LXXII). 2

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 1.2. Μικρογραφία του Pseudo-nitzschia seriata (S405, Tindingen, Greenland) που ορίσθηκε (ως N. seriata) ως λεκτότυπος του Pseudo-nitzschia από τους Fryxell et al. (1991). Κλίμακα=10μm (από Hasle, 1994). Figure 1.2. Micrograph of Pseudo-nitzschia seriata (S405, Tindingen, Greenland) that was chosen by Fryxell et al. (1991) (as N. seriata) to lectotypify the section Pseudo-nitzschia. Scale bar=10μm. (from Hasle, 1994) Το γένος Pseudo-nitzschia αποτελεί ένα σχετικά μικρό γένος διατόμων, ως προς τον αριθμό ειδών. Αριθμεί 35 είδη: 1 P. americana (Hasle) Fryxell P. antarctica Manguin P. arenysensis Quijano-Scheggia, Garcés, Lundholm P. australis Frenguelli P. brasiliana Lundholm, Hasle & Fryxell P. caciantha Lundholm, Moestrup & Hasle P. calliantha Lundholm, Moestrup & Hasle P. cuspidata (Hasle) Hasle P. decipiens Lundholm & Moestrup P. delicatissima (Cleve) Heiden P. dolorosa Lundhlom & Moestrup P. fraudulenta (Cleve) Hasle P. galaxiae Lundholm & Moestrup P. granii (Hasle) Hasle 1974 P. granii var. curvata Hasle P. heimii Manguin P. inflatula (Hasle) Hasle

18 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 17 P. linea Lundholm, Hasle & Fryxell P. lineola (Cleve) Hasle P. mannii Amato & Montresor P. micropora Priisholm, Moestrup & Lundholm P. multiseries (Hasle) Hasle P. multistriata (Takano) Takano P. obtusa (Hasle) Hasle & Lundholm P. prolongatoides (Hasle) Hasle P. pseudodelicatissima (Hasle) Hasle emend. Lundholm, Hasle & Moestrup P. pungens (Grunow ex Cleve) Hasle 1993 P. pungens var. cingulata Villac 1998 P. pungens var. aveirensis Lundholm, Churro, Carreira & Calado P. pungiformis (Hasle) Hasle P. roundii Hernández-Becerril P. seriata (Cleve) Peragallo P. sinica Qi & Wang P. subcurvata (Hasle) Fryxell P. subfraudulenta (Hasle) Hasle P. subpacifica (Hasle) Hasle P. turgidula (Hustedt) Hasle P. turgiduloides (Hasle) Hasle 1993 (Qi et al. 1994, Hernández-Becerril & Díaz-Almeyda 2006, Guiry 2011) Αξίζει να σημειωθεί, ότι το είδος P. pungens διακρίνεται σε τρεις διαφορετικές ποικιλίες (την τυπική ποικιλία και δύο επιπλέον) και το P. granii σε δύο (την τυπική και μία ακόμη). Επιπλέον, τα είδη P. multiseries και P. obtusa είχαν αρχικά προσδιοριστεί ως διαφορετικές μορφές των ειδών P. pungens [P. pungens f. multiseries (Hasle) Hasle] και P. seriata [P. seriata f. obtusa (Hasle) Hasle], αντίστοιχα. 4

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Συστηματική Κατάταξη Το Pseudo-nitzschia είναι ένα γένος ραφιδικών πτεροειδών διατόμων. Κατά συνέπεια, κατατάσσεται στην Κλάση των Bacillariophyceae (Round et al. 1990). Συνδυάζοντας μοριακές (γονίδια 16S και 18S rrna) και μορφολογικές (κυτταροπλασματικοί χαρακτήρες) αναλύσεις, οι Medlin & Kaczmarska (2004) πρότειναν ένα νέο, τροποποιημένο σύστημα ταξινομικής κατάταξης για τα διάτομα. Συγκεκριμένα, πέραν των ανακατατάξεων σε ανώτερα τάξα (όπως ο ορισμός των Υποαθροισμάτων Coscinodiscophytina και Bacillariophytina, και η περιγραφή μίας νέας Κλάσης των Mediophyceae στο Υποάθροισμα Bacillariophytina), πρότειναν τη συγχώνευση των πτεροειδών διατόμων, ραφιδικών και μη ραφιδικών, στην κλάση Bacillariophyceae (Medlin & Kaczmarska 2004). Ωστόσο, για το γένος Pseudo-nitzschia η κατάταξη δεν διαφοροποιείται. Επίσης, άλλες ανακατατάξεις στο σύστημα ταξινομικής κατάταξης των διατόμων (Adl et al. 2005), αφορούν ανώτερες ταξινομικές ομάδες και δεν επηρεάζουν την κατάταξη του γένους. Η συστηματική κατάταξη του γένους Pseudo-nitzschia είναι η παρακάτω: Άθροισμα: Bacillariophyta Υποάθροισμα: Bacillariophytina Κλάση: Bacillariophyceae Υπόκλαση: Bacillariophycidae Τάξη: Bacillariales Υποτάξη: Bacillariineae Οικογένεια: Bacillariaceae Γένος: Pseudo-nitzschia Εξάπλωση και Οικολογία Το γένος Pseudo-nitzschia περιλαμβάνει αποκλειστικά θαλάσσια, πλαγκτικά είδη (Hasle 1965, 1972, 1993, 1994, Hasle & Syvertsen 1995, Fryxell & Hasle 2003). Το γένος εμφανίζει ευρεία γεωγραφική εξάπλωση (Hasle 1965, 1972, 2002, Hasle & Medlin 1990, Hasle & Syvertsen 1995, Fryxell & Hasle 2003, Almandoz et al. 2007, 2008 και οι επιμέρους αναφορές). Αρκετά είδη του γένους θεωρούνται κοσμοπολιτικά (πχ. τα P. pungens, P. fraudulenta, P. multiseries, P. australis, P. delicatissima και P. calliantha) (Hasle 2002, Lundholm et al. 2003). Αντίθετα, κάποια άλλα εμφανίζουν σχετικά περιορισμένη εξάπλωση. Τέτοια παραδείγματα είναι το Pseudo-nitzschia seriata, το οποίο έχει αναφερθεί αποκλειστικά 5

20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ στο Βόρειο Ατλαντικό (Hasle 2002, Hasle & Lundholm 2005) [πρόσφατα βρέθηκε και στο Νότιο Ημισφαίριο (Almandoz et al. 2009)], τα P. antarctica, P. subcurvata και P. prolongatoides, που έχουν βρεθεί μόνο στην Ανταρκτική (Scott & Thomas 2005, Lundholm et al. 2006, Almandoz et al. 2008), και το P. micropora μόνο σε τροπικές περιοχές (Priisholm et al. 2006, Lundholm et al. 2006). Αρκετά είδη Pseudo-nitzschia έχουν καταγράψει στο παρελθόν υψηλές πληθυσμιακές εξάρσεις (ανθήσεις, blooms). Η δυνατότητα υπέρμετρης αύξησης, σε συνδυασμό με την ικανότητα συγκεκριμένων ειδών να παράγουν νευροτοξίνες, έχουν προκαλέσει αρκετές φορές στο παρελθόν Επιβλαβείς Ανθήσεις Φυκών (Harmful Algal Blooms, HABs) (Bates et al. 1998, Fryxell & Hasle 2003, Bates & Trainer 2006, και οι εκεί αναφορές) Αναπαραγωγή Στα είδη του γένους Pseudo-nitzschia, όπως και όλων των διατόμων, απαντάται ο διπλοβιοτικός αναπαραγωγικός κύκλος. Περιλαμβάνει δύο κύριες φάσεις: μία παρατεταμένης διάρκειας βλαστητική φάση (διαρκεί από μήνες έως χρόνια) κατά την οποία τα κύτταρα διαιρούνται μιτωτικά, και μία σχετικά βραχυπρόθεσμη φάση η οποία περικλείει την εγγενή αναπαραγωγή (γαμετογένεση και γονιμοποίηση) (διαρκεί μερικές ώρες) και μία μετέπειτα πολύπλοκη αναπτυξιακή διαδικασία που οδηγεί στο σχηματισμό νέων βλαστητικών κυττάρων (διαρκεί αρκετές ώρες έως μία εβδομάδα, ή και περισσότερο) (Chepurnov et al. 2004). Τα βλαστητικά κύτταρα είναι διπλοειδή, ενώ τα μοναδικά απλοειδή κύτταρα είναι οι γαμέτες. Κατά την αγενή αναπαραγωγή (μιτωτικές κυτταροδιαιρέσεις) ο σκληρός και άκαμπτος πυριτικός εξωσκελετός των διατόμων δεν επιτρέπει περαιτέρω αύξηση των κυτταρικών διαστάσεων. Αυτό οδηγεί σε προοδευτική μείωση του μεγέθους της θήκης κατά τη βλαστητική φάση (κανόνας MacDonald-Pfitzer). Το αρχικό μέγεθος ανακτάται μέσω εγγενούς αναπαραγωγής, κατά την οποία σχηματίζεται ένας μοναδικός τύπος κυττάρου, το αυξοσπόριο (δεν περιβάλλεται από πυρίτιο και είναι ικανό να αυξάνει σε μέγεθος) (Round et al. 1990, Mann 1993, 2002). Η μετάβαση από βλαστητικά κύτταρα σε δυνητικά αναπαραγωγικά ενεργά κύτταρα (γαμετογένεση) ελέγχεται από το μέγεθος των κυττάρων (Round et al. 1990, Davidovich & Bates 1998, Chepurnov et al. 2005). Κατά την εγγενή αναπαραγωγή δύο κύτταρα αντίθετου αναπαραγωγικού τύπου στοιχίζονται παράλληλα και σε επαφή (θυρίδα με θυρίδα ή θυρίδα με περιζώνιο) (Εικόνες 1.3.A- B). Το κάθε κύτταρο υφίσταται μείωση και στο κάθε γαμετάγγειο σχηματίζονται δύο γαμέτες 6

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Εικόνα 1.3.C). Οι γαμέτες είναι μορφολογικά όμοιοι (μορφολογικώς ισογαμέτες), ωστόσο εμφανίζουν διαφορετική συμπεριφορά (ηθολογική ή φυσιολογική ανισογαμία). Οι δύο γαμέτες που παράγονται από το ένα γαμετάγγειο είναι ενεργοί, ενώ οι γαμέτες που παράγονται από το δεύτερο γαμετάγγειο στερούνται δυνατότητας κίνησης (λειτουργικοί ανισογαμέτες). Οι ενεργοί λοιπόν γαμέτες κινούνται, με αμοιβαδοειδή κίνηση (όχι μαστιγoφόροι γαμέτες, κάτι που απαντάται σε κεντρικά διάτομα), στο εσωτερικό του παθητικού γαμετάγγειου (Εικόνα 1.3.D). Εκεί, επέρχεται συνένωση των γαμετών (αλλογαμική) και σχηματισμός ενός ζυγωτού, του αυξοσπορίου (Εικόνα 1.3.E). Είναι πιθανό να ενώνονται και οι δύο γαμέτες από το κάθε γαμετάγγειο προς σχηματισμό δύο ζυγωτών (στο P. delicatissima, Amato et al. 2005) ή μόνο ο ένας γαμέτης από το κάθε γαμετάγγειο σχηματίζοντας ένα ζυγωτό (στο P. multiseries, Davidovich & Bates 1998). Το αυξοσπόριο αυξάνει σε μέγεθος, σε διεύθυνση κάθετη του μητρικού κυττάρου (Εικόνες 1.3.F-G). Στο εσωτερικό του σχηματίζεται ένα βλαστητικό κύτταρο με το μέγιστο μέγεθος, συνήθως δύο με τρεις φορές το μέγεθος των γονικών κυττάρων, το οποίο καλείται αρχικό κύτταρο (Εικόνα 1.3.H). Το αρχικό κύτταρο εξέρχεται από το αυξοσπόριο και αρχίζει να διαιρείται μιτωτικά σχηματίζοντας αλυσίδες κυττάρων με μεγάλο μέγεθος (Εικόνα 1.3.I). Αυτό το πρότυπο εγγενούς αναπαραγωγής καλείται cis-τύπου ηθολογική ανισογαμία (Chepurnov et al. 2004) και ανταποκρίνεται στον IA2-τύπο σχηματισμού αυξοσπορίου σύμφωνα με το σύστημα κατάταξης του Geitler (1973). Ο χρόνος στον οποίο ολοκληρώνεται η διαδικασία εγγενούς αναπαραγωγής ποικίλλει ανάμεσα σε διαφορετικά είδη και σε διαφορετικές μελέτες σε 4 ημέρες για τα P. delicatissima (Amato et al. 2005) και P. multiseries (Davidovich & Bates 1998), σε 6 11 ημέρες για το P. multiseries (Hiltz et al. 2000), σε 2 4 ημέρες για τα P. pseudodelicatissima και P. calliantha (Davidovich & Bates 1998). Ωστόσο, αυτή η ποικιλότητα έχει αποδοθεί στις διαφορετικές πειραματικές συνθήκες (πχ. φωτοπερίοδος, ακτινοβολία) ή στις διαφορετικές συγκεντρώσεις γονικών στελεχών (Amato et al. 2005). 7

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 1.3. Στάδια εγγενούς αναπαραγωγής στα είδη Pseudo-nitzschia multiseries and P. pseudodelicatissima. Βλ. κείμενο για περισσότερες λεπτομέρειες. Κλίμακα: 100 μm (από Davidovich & Bates 1998, 2002). Figure 1.3. Sexual stages of Pseudo-nitzschia multiseries and P. pseudodelicatissima. See text for details. Scale bar: 100 μm (from Davidovich & Bates 1998, 2002). 8

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εγγενής αναπαραγωγή, σε συνθήκες εργαστηριακής καλλιέργειας, έχει έως τώρα αναφερθεί σε 12 είδη Pseudo-nitzschia. Αυτά είναι τα: P. subcurvata (αναφερόμενο ως Nitzschia subcurvata, Fryxell et al. 1991), P. multiseries (Davidovich & Bates 1998), P. calliantha (αναφερόμενο ως P. pseudodelicatissima, Davidovich & Bates 1998), P. pseudodelicatissima ή P. cuspidata (αναφερόμενο ως P. pseudodelicatissima, Davidovich & Bates 1998), P. fraudulenta (Chepurnov et al. 2004), P. pungens (Chepurnov et al. 2005, Casteleyn et al. 2008), P. delicatissima (Amato et al. 2005), P. dolorosa (Amato et al. 2007), P. multistriata (D Alelio et al. 2009a), P. brasiliana (Quijano-Scheggia et al. 2009a), P. mannii (Amato & Montresor 2008) και P. australis (K. E. Holtermann και E. V. Armbrust, αδημοσίευτα δεδομένα, Holtermann et al. 2010). Επίσης, έχει αναφερθεί εγγενής αναπαραγωγή σε δείγματα πεδίου για τα είδη P. australis και P. pungens (Holtermann et al. 2010). Στα περισσότερα από αυτά απαντάται ετεροθαλλική εγγενής αναπαραγωγή (εγγενής αναπαραγωγή μπορεί να επιτευχθεί μόνο μεταξύ κυττάρων διαφορετικών και συμβατών στελεχών αντίθετου αναπαραγωγικού τύπου). Εξαίρεση αποτελεί το P. brasiliana, στο οποίο απαντάται ομοθαλλική εγγενής αναπαραγωγή (Quijano-Scheggia et al. 2009a). Επίσης, στο P. subcurvata παρατηρήθηκε σχηματισμός αυξοσπορίων σε μία μονοκλωνική καλλιέργειά του και πιθανότατα και αυτό αποτελεί ομοθαλλικό είδος (Fryxell et al. 1991). Επιπρόσθετα, έχει παρατηρηθεί σχηματισμός αυξοσπορίων έπειτα από τη διασταύρωση στελεχών P. calliantha του ίδιου αναπαραγωγικού τύπου, θέτοντας υπό αμφισβήτηση το διοικισμό (Davidovich & Bates 1998). Ωστόσο, στη διεθνή βιβλιογραφία απαντώνται και περιπτώσεις αύξησης των κυτταρικών διαστάσεων κατά τη βλαστητική φάση, χωρίς την παρεμβολή εγγενούς αναπαραγωγής. Συγκεκριμένα, οι Pan et al. (2001) παρατήρησαν ότι κάποια στελέχη σε συνθήκες καλλιέργειας, τα οποία αναγνώρισαν ως P. sp. cf. pseudodelicatissima, ενώ είχαν φτάσει σε πολύ μικρό μέγεθος (15 25 μm) ανέκτησαν τις αρχικές τους διαστάσεις χωρίς να διασταυρωθούν με άλλες κλωνικές καλλιέργειες, και χωρίς να παρατηρηθούν γαμέτες ή αυξοσπόρια. 9

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.2. Μορφολογία Σύμφωνα με την πρώτη περιγραφή του γένους (Hasle 1993, 1994), τα κύτταρα Pseudonitzschia χαρακτηρίζονται από έντονα επίμηκες σχήμα, συνήθως γραμμικό έως λογχοειδές, σπάνια ελαφρά ρομβοειδές ή με πεπλατυσμένα άκρα. Σχηματίζουν αλυσίδες με αλληλοεπικάλυψη των άκρων τους (stepped chains). Φέρουν δύο ελασματοειδείς χλωροπλάστες τοποθετημένους συμμετρικά ως προς τον εγκάρσιο άξονα του κυττάρου. Τα λοιπά ταξινομικά γνωρίσματα διακρίνονται με χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (ΗΜ), και ιδιαίτερα με ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (ΗΜΔ). Τα κύτταρα των ραφιδικών (raphid) πτεροειδών (pennates) διατόμων, μεταξύ των οποίων και τα είδη Pseudo-nitzschia, εμφανίζουν αμφίπλευρη συμμετρία και φέρουν κατά μήκος του κορυφαίου (διαμήκους) άξονα μια δομή όμοια με σχισμή, τη ραφή (raphe) (Εικόνα 1.4). (A) κορυφαίος άξονας (B) κορυφαίος άξονας εγκάρσιος άξονας διαθυριδικός άξονας ραφή Εικόνα 1.4. Σχηματική απεικόνιση των ραφιδικών πτεροειδών διατόμων σε (Α) θυριδική όψη (valve view) και (Β) περιζωνική όψη (girdle view) (από Hasle & Syvertsen 1995). Figure 1.4. Schematic diagrams of the raphid pennate diatoms in (A) valve view and (B) girdle view (from Hasle & Syvertsen 1995). Τα κύτταρα των διατόμων περικλείονται από ένα δύσκαμπτο κέλυφος, τη θήκη (frustule ή theca), η οποία αποτελείται από ένυδρο οξείδιο του πυριτίου με οργανικές επιστρώσεις. Σε σχέση με άλλα γένη διατόμων, τα κύτταρα Pseudo-nitzschia χαρακτηρίζονται ως ασθενώς πυριτιωμένα. Η θήκη τους είναι διμερής και απαρτίζεται από την επιθήκη (epitheca) στην ανώτερη επιφάνεια και την υποθήκη (hypotheca) στην κατώτερη (Εικόνα 1.5). Η επιθήκη είναι ελαφρώς μεγαλύτερη από την υποθήκη, την οποία και επικαλύπτει μερικώς. Σε κάθε τμήμα της θήκης διακρίνεται μία επίπεδη επιφάνεια (ή ελαφρώς κυρτή, όχι όμως κυματοειδής), η θυρίδα (valve). Η θυρίδα της επιθήκης ονομάζεται επιθυρίδα (epivalve) και της υποθήκης υποθυρίδα (hypovalve), αντίστοιχα (Εικόνα 1.5). Η θυρίδα πλαισιώνεται πλευρικά από ζώνες πυριτίου που συνθέτουν το περιζώνιο (cingulum) ή ζώνη (girdle). Το περιζώνιο της επιθήκης ονομάζεται επιπεριζώνιο (epicingulum) και της υποθήκης υποπεριζώνιο (hypocingulum), αντίστοιχα 10

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Εικόνα 1.5). Στην κάθε θυρίδα διακρίνονται ένα επίπεδο ή ελαφρώς κυρτό τμήμα, η επιφάνεια της θυρίδας (valve face), και στα κράσπεδα της θυρίδας δύο κυρτά τμήματα που αποτελούν το τμήμα σύνδεσής της με το περιζώνιο, τους μανδύες (mantles) (Εικόνα 1.5). Ο πλησιέστερος της ραφής μανδύας είναι ο εγγύς μανδύας (proximal mantle) ενώ ο πιο απομακρυσμένος άπω μανδύας (distal mantle) (Εικόνα 1.8). επιφάνεια θυρίδας μανδύας επιθυρίδα επιθήκη επιπεριζώνιο υποθήκη υποπεριζώνιο υποθυρίδα Εικόνα 1.5. Σχηματική απεικόνιση της δομής της θήκης των διατόμων (από Hasle & Syvertsen 1995). Figure 1.5. Schematic diagrams of diatoms frustule structure (from Hasle & Syvertsen 1995). Το σύστημα της ραφής απαντάται σε αμφότερες τις θυρίδες. Η ραφή έχει επίμηκες σχήμα και εκτείνεται κατά τον κορυφαίο άξονα της θυρίδας σε έκκεντρη θέση (πλησίον των περιθωρίων της θυρίδας). Αντίθετα με άλλα γένη, όπως το Nitzschia, η ραφή στο γένος Pseudonitzschia δεν ανασηκώνεται από το επίπεδο της θυρίδας και δεν διαμορφώνεται κάποιο είδος τρόπιδας (keel). Στα κύτταρα Pseudo-nitzschia απαντάται διαυλική ραφή (canal raphe) (Εικόνα 1.6Β). Αντίθετα με την απλή ραφή (simple raphe) (Εικόνα 1.6Α), η οποία συνίσταται σε μία απλή σχισμή, η διαυλική ραφή είναι μία περισσότερο πολύπλοκη δομή. Εσωτερικά της σχισμής της ραφής υπάρχουν πυριτικές γέφυρες, οι αποκαλούμενες περισφίγξεις της ραφής (raphe fibulae). Αυτές ενώνουν τις δύο πλευρές της θυρίδας εκατέρωθεν της σχισμής, σχηματίζοντας με αυτό τον τρόπο ένα εσωτερικό δίαυλο (Εικόνα 1.6Γ). 11

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Α) Απλή ραφή (B) Διαυλική ραφή Περιζώνιο Σχισμή της ραφής (Γ) Ενδιάμεσος χώρος περισφίγξεων ραφής Περισφίγξεις ραφής Σχισμή της ραφής Περίσφιγξη ραφής Σχισμή ραφής Εικόνα 1.6. Σχηματική απεικόνιση (Α) της απλής και (Β) της διαυλικής ραφής (από Hasle & Syvertsen 1995). (Γ) Εγκάρσια όψη της διαυλικής ραφής. Figure 1.6. Schematic diagrams of the (Α) simple and (Β) canal raphe (from Hasle & Syvertsen 1995). (Γ) Transversal view of the canal raphe. Η ραφή καθώς και η σχισμή της ραφής εκτείνονται κατά μήκος της θυρίδας και τερματίζουν στους πόλους σχηματίζοντας τις ακραίες απολήξεις της ραφής (raphe apical endings) και τους τερματικούς κόμβους (terminal nodules), αντίστοιχα (Εικόνα 1.7Α). Σε συγκεκριμένα είδη η ραφή και η σχισμή της διακόπτονται και στο μέσο της θυρίδας σχηματίζουν τις κεντρικές απολήξεις της ραφής (central raphe endings) και τον κεντρικό κόμβο (central nodule), αντίστοιχα (Εικόνα 1.7Β). 12

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Α) Τερματικός κόμβος (Β) Κεντρικές απολήξεις ραφής Κεντρικός ενδιάμεσος χώρος Ακραία απόληξη ραφής Κεντρικός κόμβος Εικόνα 1.7. Ηλεκτρονιογραφίες (ΗΜΔ) της επιφάνειας της θυρίδας (Α) ενός κυττάρου Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima στην περιοχή του ενός άκρου και (Β) ενός κυττάρου P. calliantha στην κεντρική περιοχή (από Lundholm et al. 2003). Figure 1.7. Micrographs (TEM) of the valve face of (Α) a Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima cell at the apical area and (Β) a P. calliantha cell at the central area (from Lundholm et al. 2003). Η πρόσοψη της θυρίδας των κυττάρων του γένους Pseudo-nitzschia εμφανίζει ραβδώσεις, οι οποίες προκύπτουν από την παράλληλη διάταξη συμπαγών και λιγότερο συμπαγών δομών του πυριτικού σκελετού, που είναι οι διαραβδωσιακές ζώνες (interstriae) και οι ραβδώσεις (striae), αντίστοιχα (Εικόνα 1.8). Στην επιφάνεια των ραβδώσεων εντοπίζονται σειρές ποροειδών (poroids) (Εικόνα 1.8). Ο αριθμός των σειρών ποροειδών, η πυκνότητα, το γεωμετρικό τους σχήμα και η δομή τους ποικίλλουν μεταξύ των ειδών, συνιστούν δεν σημαντικό ταξινομικό γνώρισμα σε επίπεδο είδους. Σειρές ποροειδών απαντώνται και στους μανδύες (Εικόνα 1.8). Η μεμβράνη που καλύπτει τα ποροειδή φέρει μικρούς πόρους. Οι πόροι αυτοί μπορεί να καλύπτουν το σύνολο της επιφάνειας του ποροειδούς (όπως στην Pseudo-nitzschia pungens) δίνοντας μια συνεχή, ομοιόμορφη υμενώδη δομή (Εικόνα 1.9Α). Σε κάποια είδη, μεταξύ των πόρων παρεμβάλλονται συμπαγείς (άνευ πόρων) πυριτικές λωρίδες (silica strips), δημιουργώντας νησίδες πόρων, τις διάτρητες περιοχές (perforated sectors). Οι διάτρητες περιοχές εμφανίζουν μεγάλη ποικιλία ως προς τη δομή και τα πρότυπα διάταξης μεταξύ των ειδών (πχ. στο P. pseudodelicatissima απαντώνται δύο, μεγάλου μεγέθους διάτρητες περιοχές, ενώ στο P. calliantha 3 11 μικρότερου μεγέθους διάτρητες περιοχές) (Εικόνες 1.9Β & Γ). 13

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Περισφίγξεις ραφής Ενδιάμεσος χώρος περισφίγξεων ραφής Εγγύς μανδύας Διαραβδωσιακές ζώνες Ραβδώσεις Επιφάνεια θυρίδας Άπω μανδύας Σειρές Σχισμή ραφής Εικόνα 1.8. Ηλεκτρονιογραφία (ΗΜΔ) της επιφάνειας της θυρίδας ενός κυττάρου Pseudo-nitzschia delicatissima (από Lundholm et al. 2006). Figure 1.8. Micrograph (TEM) of the valve face of a P. delicatissima cell (from Lundholm et al. 2006). 14

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Α) (Β) (Γ) Εικόνα 1.9. Ηλεκτρονιογραφίες (ΗΜΔ). Δομή των ποροειδών της επιφάνειας της θυρίδας σε κύτταρα διαφορετικών ειδών: (Α) Pseudo-nitzschia pungens, με συνεχή ομοιόμορφα διάτρητη επιφάνεια (από Kaczmarska et al. 2005a), (Β) P. pseudodelicatissima, με δύο διάτρητες περιοχές (από Lundholm et al. 2003) και (Γ) P. calliantha, με πολυάριθμες (4-9) διάτρητες περιοχές (παρούσα μελέτη). Figure 1.9. Micrographs (TEM). Structure of the valve face poroids of different species cells: (Α) Pseudo-nitzschia pungens, with hymenate, continuous and regularly perforated velum (from Kaczmarska et al. 2005a), (Β) P. pseudodelicatissima, with two perforated sectors (from Lundholm et al. 2003) and (Γ) P. calliantha, with many (4-9) perforated sectors (present study). Οι ταινίες του περιζωνίου εμφανίζουν επίσης ραβδώσεις, οι οποίες προκύπτουν από την παράλληλη διάταξη συμπαγών (διαραβδωσιακών ζωνών) και λιγότερο συμπαγών δομών (ραβδώσεων). Η δομή των ραβδώσεων ποικίλλει μεταξύ των ειδών. Έτσι είναι δυνατό να σχηματίζονται σειρές ποροειδών κατά το διαθυριδικό άξονα (Εικόνα 1.10Α & Β) ή να περιέχουν ένα ποροειδές. Σε αυτά που περιέχουν ένα ποροειδές, αυτό είναι δυνατό να έχει συνεχή υμενώδη δομή σε κάποια είδη, ενώ σε κάποια άλλα διαιρείται σε μικρότερες διάτρητες περιοχές (perforated sectors) (Εικόνα 1.10Γ). (B) (A) (Γ) Εικόνα Ηλεκτρονιογραφία (ΗΜΔ) (Α) των τριών ταινιών και (Β) της πρώτης ταινίας του περιζωνίου, ενός κυττάρου Pseudo-nitzschia calliantha. Οι ραβδώσεις αποτελούνται από σειρές ποροειδών. (Γ) Των δύο πρώτων ταινιών του περιζωνίου ενός κυττάρου P. pseudodelicatissima. Οι ραβδώσεις αποτελούνται από μία σειρά ποροειδών (από Lundholm et al. 2003). Figure Micrographs (TEM) of (Α) the three girdle bands and (Β) the valvocopula, of a Pseudonitzschia calliantha cell. Striae consist of rows of poroids. (Γ) The first and second girdle bands of a P. pseudodelicatissima cell. Striae consist of one row of poroids (from Lundholm et al. 2003). 15

30 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.3. Παραγωγή Τοξινών Το γένος Pseudo-nitzschia έγινε αποδέκτης ιδιαίτερου ερευνητικού ενδιαφέροντος κατά τα τέλη της δεκαετίας του 1980, όταν και συσχετίσθηκε με την παραγωγή της νευροτοξίνης δομοϊκό οξύ (Domoic Acid, DA) Δομοϊκό Οξύ Το DA απομονώθηκε για πρώτη φορά από το ροδοφύκος Chondria armata (Takemoto & Daigo 1958). Εκχυλίσματα από το ροδοφύκος αυτό, γνωστά στην Ιαπωνία ως domoi, παρουσιάζουν ανθελμινθική και εντομοκτόνο δράση (Takemoto & Daigo 1958). Επιπλέον, το DA αποτελούσε, σε χαμηλή δοσολογία, ένα παραδοσιακό φάρμακο στην Ιαπωνία αποτελεσματικό στην καταπολέμηση εντερικών παρασίτων (Mos 2001). Το DA είναι ένα πολικό, μη πρωτεϊνικό διεγερτικό αμινοξύ. Είναι υδατοδιαλυτό και γενικά θερμοανθεκτικό. Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωρισθεί δέκα θαλάσσια, βιολογικά παραγόμενα ισομερή του DA (Maeda et al. 1986, Wright et al. 1990, Zaman et al. 1997). Από αυτά, σε δείγματα Pseudo-nitzschia και οστρακοειδών έχουν ανιχνευθεί εκτός από το DA, τα γεωμετρικά του ισομερή ισο-δομοϊκό οξύ C, D, E και F (iso-da C, D, E, και F), καθώς και το C5 διαστερεομερές του 5 επι-δομοϊκό οξύ (5 epi-da) (Wright et al. 1990, Holland et al. 2005). Τα γεωμετρικά ισομερή του DA θεωρούνται παράγωγα του DA έπειτα από έκθεσή του σε υπεριώδη ακτινοβολία ή υψηλή θερμοκρασία και όχι de novo παράγωγα πλαγκτικών κυττάρων (Wright et al. 1990, Wright & Quilliam 1995, Bates et al. 2004). Επίσης, η νευροτοξική δραστικότητά τους είναι σημαντικά χαμηλότερη από αυτή του DA (Wright et al. 1990, Hampson et al. 1992, Holland et al. 2005, Munday et al. 2008) Δηλητηρίαση από Δομοϊκό Οξύ Το DA μπορεί να εισέλθει στη θαλάσσια τροφική αλυσίδα μέσω της διηθηματοφάγου θρέψης οστρακοειδών ή και καρκινοειδών με τοξινοπαραγωγά κύτταρα φυτοπλαγκτού. Παραδείγματα τέτοιων οργανισμών είναι τα κυδώνια (Cerastoderma edule), τα καβούρια (Cancer magister), οι αχιβάδες (Scrobicularia plana), τα μύδια (Mytilus edulis), οι πετροσωλήνες (Siliqua patula) και τα χτένια (Pecten maximus) (Wekell et al. 1994, Rhodes et al. 1998, Vale & Sampayo 2001). Η τοξίνη συσσωρεύεται στο ηπατοπάγκρεας και σε ιστούς των οστρακοειδών, χωρίς αυτά να εκδηλώνουν εμφανή παθολογικά συμπτώματα. Έκθεση των 16

31 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ανθρώπων στο DA συμβαίνει έπειτα από κατανάλωση τοξικών οστρακοειδών (Mos 2001, Lefebvre & Robertson 2010). Εκτός από τα οστρακοειδή, φορείς του DA μπορεί να αποτελούν και πλαγκτοφάγα ψάρια, όπως ο γαύρος, η σαρδέλα και το σκουμπρί. Η τοξίνη συσσωρεύεται στα εντόσθιά τους, επηρεάζοντας όμως τη συμπεριφορά και τη βιωσιμότητά τους (Lefebvre et al. 2001). Ωστόσο, τα επίπεδα DA που συσσωρεύονται σε πλαγκτοφάγα ψάρια είναι πολύ χαμηλότερα σε σχέση με αυτά που ανιχνεύονται σε οστρακοειδή (Vale & Sampayo 2001). Το DA είναι δομικά όμοιο με το διεγερτικό νευροδιαβιβαστή γλουταμινικό οξύ και τα ανάλογά του. Δρα ως ανταγωνιστής του, και είναι, μάλιστα, πολύ ισχυρότερο του γλουταμινικού οξέος (συγγένεια δέσμευσης με τον υποδοχέα έως και 100 φορές πιο ισχυρή) (Todd 1993, Mos 2001). Έπειτα από την έκθεση, το DA δεσμεύεται σχεδόν αποκλειστικά με τους NMDA (Nmethyl-D-aspartate) υποδοχείς στο κεντρικό νευρικό σύστημα (Berman & Murray 1997), προκαλώντας αποπόλωση των νευρώνων. Ως επακόλουθο, αυξάνεται η συγκέντρωση ενδοκυτταρικών ιόντων Ca 2+, προκαλείται παρατεταμένη ενεργοποίηση των ευαίσθητων σε ασβέστιο ενζύμων, οδηγώντας σε εξάντληση ενέργειας, διόγκωση των νευρώνων και κυτταρικό θάνατο. Οι νευρώνες που επηρεάζονται εντοπίζονται κυρίως στον ιππόκαμπο, και σχετίζονται με τη διατήρηση της μνήμης. Προκαλείται έτσι απώλεια μνήμης, το πλέον χαρακτηριστικό σύμπτωμα της ASP (Amnesic Shellfish Poisoning, ASP) δηλητηρίασης (Bates et al. 1998). Άλλα συμπτώματα που εμφανίζονται εντός 24 ωρών από την κατανάλωση τοξικών οστρακοειδών είναι σύγχυση, ναυτία, τάση για έμετο, γαστρεντερίτιδα, κράμπες και διάρροια. Νευρολογικές παθήσεις, όπως αταξία, πονοκέφαλοι, αποπροσανατολισμός, δυσκολία στην αναπνοή και κώμα, εκδηλώνονται 48 ώρες μετά την κατανάλωση. Πιθανό να προκληθεί και μόνιμη βλάβη στον εγκέφαλο από δηλητηρίαση με DA (Mos 2001). Επιπρόσθετα, η έκθεση σε DA έχει φανεί να επηρεάζει την έκφραση γονιδίων σε ποντίκια (Ryan et al. 2005). Ιδιάζουσας σημασίας είναι και οι δυνητικές επιπτώσεις της μακροπρόθεσμης έκθεσης σε χαμηλά επίπεδα DA (συγκεντρώσεις χαμηλότερες του κανονιστικού ορίου των 20 μg DA g -1 ιστού), οι οποίες προς το παρόν παραμένουν άγνωστες (Villac et al. 1993, Lefebvre & Robertson 2010). Το πρώτο καταγεγραμμένο περιστατικό DA δηλητηρίασης ανθρώπων από κατανάλωση τοξικών μυδιών, καταγράφηκε το 1987 στο Prince Edward Island (ακτές Ανατολικού Καναδά) (Subba Rao et al. 1988, Bates et al. 1989). Περισσότεροι από 100 άνθρωποι παρουσίασαν έντονα κλινικά συμπτώματα ναυτίας, εμέτου, διάρροιας, γαστρικών σπασμών, πονοκέφαλου και πρόσκαιρης απώλειας μνήμης, και μάλιστα τρεις ή τέσσερις από αυτούς κατέληξαν (Bates et al. 1989, Jeffery et al. 2004). Το σύνδρομο ονομάστηκε αμνησιακή δηλητηρίαση από κατανάλωση 17

32 ΕΙΣΑΓΩΓΗ οστρακοειδών. Το DA ταυτοποιήθηκε ως η υπεύθυνη τοξίνη (Wright et al. 1989) και η παραγωγή του αποδόθηκε στην άνθηση του είδους P. multiseries (αναφερόμενο ως Nitzschia pungens forma multiseries) (Subba Rao et al. 1988, Bates et al. 1989). Πριν από το περιστατικό αυτό τα μικροφύκη δεν είχαν συσχετιστεί με παραγωγή DA (Bates & Trainer 2006). Μετά το περιστατικό του 1987, δεν έχουν εντοπιστεί άλλες περιπτώσεις ASP δηλητηρίασης ανθρώπων, τουλάχιστο επίσημα καταγεγραμμένες. Οι Lefebvre & Robertson (2010) απέδωσαν το γεγονός αυτό στην αποτελεσματική λειτουργία των προγραμμάτων παρακολούθησης θαλασσίων βιοτοξινών. Ωστόσο, έχουν καταγραφεί περιστατικά δηλητηρίασης από DA (Domoic Acid Poisoning, DAP) με σημαντικές επιπτώσεις στη θαλάσσια πανίδα. Τέτοια είναι μαζικοί θάνατοι πτηνών και θαλάσσιων θηλαστικών το 1991 και 1998, αντίστοιχα, στον Κόλπο Monterey (ακτές Δυτικών ΗΠΑ) (Garrison et al. 1992, Scholin et al. 2000). Σε αυτή την περίπτωση ο φορέας του DA δεν ήταν οστρακοειδή αλλά πλαγκτοφάγα ψάρια, και το υπεύθυνο τοξινοπαραγωγό είδος το P. australis. Επίσης, διάφορα περιστατικά συσσώρευσης DA στα οστρακοειδή (χωρίς επιπτώσεις σε ζώντες οργανισμούς) έχουν προκαλέσει σοβαρές οικονομικές απώλειες του παραγωγικού κλάδου, κυρίως σε ακτές της Βορείου Αμερικής (Ανατολικού Καναδά και Δυτικών ΗΠΑ), σε αρκετές περιοχές παγκοσμίως (π.χ. Ευρώπη, Κορέα, Ιαπωνία, Νέα Ζηλανδία και Αυστραλία) (Hallegraeff 2003) Δυνητικοί Παραγωγοί Δομοϊκού Οξέος Όπως προαναφέρθηκε, το DA απομονώθηκε για πρώτη φορά από το ροδοφύκος Chondria armata (Takemoto & Daigo 1958). Σήμερα είναι γνωστό ότι και άλλα έξι είδη ροδοφυκών (από πέντε γένη της οικογένειας Rhodomelaceae) είναι ικανά να παράγουν DA (τα Alsidium corallinum, Amansia glomerata, Chondria armata, Chondria baileyana, Digenea simplex και Vidalia obtusiloba). Εκπρόσωποι μικροφυκών που δυνητικά παράγουν DA απαντώνται αποκλειστικά στα διάτομα, συγκεκριμένα σε 14 είδη διατόμων: 1 είδος Amphora (Catenulaceae) (Amphora coffeaeformis), 1 είδος Nitzschia (Bacillariaceae) (Nitzschia navis-varingica) και 12 είδη Pseudo-nitzschia (Bacillariaceae) 1. P. australis, 2. P. calliantha, 3. P. cuspidata, 18

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 4. P. delicatissima, 5. P. fraudulenta, 6. P. galaxiae, 7. P. multiseries, 8. P. multistriata, 9. P. pseudodelicatissima, 10. P. pungens, 11. P. seriata και 12. P. turgidula. (Lefebvre & Robertson 2010, Lundholm 2011, και οι εκεί αναφορές) Σε αυτό το σημείο αξίζει να σημειωθεί ότι η παραγωγή DA από το είδος P. pseudodelicatissima έχει αποτελέσει σημείο έντονων διαφωνιών. Αυτές εστιάζουν στην ορθότητα της ταυτοποίησης των τοξινοπαραγωγών στελεχών σε κάποιες μελέτες πιστεύεται ότι αφορούν στα είδη P. calliantha ή P. cuspidata, τα οποία αποτελούν αδιαμφισβήτητους δυνητικούς παραγωγούς DA (Lundholm et al. 2003, Kaczmarska et al. 2005a, Bates & Trainer 2006). Όπως φαίνεται από τα παραπάνω, τα είδη Pseudo-nitzschia αποτελούν τους κυριότερους δυνητικούς παραγωγούς DA. Εάν σε αυτό συνυπολογίσουμε και το γεγονός ότι όλα τα δυνητικά τοξινοπαραγωγά είδη απαντώνται κυρίως σε παράκτια ύδατα (Bates & Trainer 2006), αλλά και τη σχεδόν κοσμοπολίτικη εξάπλωση των περισσότερων από αυτά (Hasle 2002), τότε εύκολα γίνεται αντιληπτή η σημασία του γένους για τις παράκτιες δραστηριότητες παγκοσμίως Ποικιλότητα του Γένους Pseudo-nitzschia Έπειτα από τη διαπίστωση ότι συγκεκριμένα είδη Pseudo-nitzschia είναι ικανά να παράγουν DA προέκυψε η αναγκαιότητα για ένα αξιόπιστο και ακριβές σύστημα ταξινόμησης. Το γένος έγινε αποδέκτης αυξημένου επιστημονικού ενδιαφέροντος, κάτι που μεταφράστηκε σε πολυάριθμες επιστημονικές δημοσιεύσεις τα τελευταία χρόνια, και σε ευρύ φάσμα ερευνητικών πεδίων. Έφτασε μάλιστα σε σημείο να αποτελεί ένα εξαιρετικό μοντέλο για τη μελέτη της μικρο-εξελικτικής διαδικασίας στα διάτομα λόγω της αφθονίας δεδομένων σχετικών με τη μοριακή φυλογένεση, τη λεπτή δομή, το αναπαραγωγικό σύστημα, την εξάπλωση και την οικολογία τους (Mann & Evans 2007). 19

34 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Παρατηρώντας τις χρονολογίες περιγραφής των ειδών Pseudo-nitzschia (βλ. Υποκεφάλαιο ), διαπιστώνεται ότι πολλά από αυτά (14) έχουν περιγραφεί την τελευταία δεκαετία. Στην πλειονότητα τους μάλιστα τα νέα είδη προέκυψαν από επανεξέταση παλαιότερων ειδών ή συμπλεγμάτων ειδών. Τέτοια παραδείγματα αποτελούν οι περιγραφές των P. brasiliana και P. linea από το P. americana (Lundholm et al. 2002b), των P. caciantha, P. calliantha και P. pseudodelicatissima (τροποποίηση της αρχικής περιγραφής) από τα P. cuspidata και P. pseudodelicatissima (Lundholm et al. 2003, Amato & Montresor 2008) και των P. arenysensis, P. decipiens και P. dolorosa από το P. delicatissima (Lundholm et al. 2006, Quijano-Scheggia et al. 2009b). Η ταυτοποίηση των ειδών Pseudo-nitzschia έχει στηριχθεί, μέχρι και πρόσφατα, σε δεδομένα μορφολογικής διαφοροποίησης (δομικοί και μετρικοί χαρακτήρες) του πυριτικού τους εξωσκελετού, της θήκης (Hasle 1965, 1993, 1995, Takano 1993, Hernández-Becerril & Díaz- Almeyda 2006). Ωστόσο, η μορφολογική και γενετική διαφοροποίηση που παρατηρήθηκε μεταξύ στελεχών ή πληθυσμών του ίδιου είδους (πχ. P. pseudodelicatissima, P. delicatissima και P. pungens) (Rivera 1985, Hallegraeff 1994, Rhodes et al. 1998, Villac & Fryxell 1998, Parsons et al. 1999, Priisholm et al. 2002, Stehr et al. 2002, Orsini et al. 2004, Casteleyn et al. 2008, Churro et al. 2009), αλλά και αντιφατικά ευρήματα πειραμάτων διασταυρώσεων (P. pseudodelicatissima) (Davidovich & Bates 1998), φανέρωσαν ότι η αποκλειστική χρήση μορφολογικών χαρακτήρων για τη διάκριση ειδών έχει καταφανώς υποεκτιμήσει την ποικιλότητα των ειδών του γένους. Αυτά τα ευρήματα ημικρυπτικής διαφοροποίησης οδήγησαν στη χρήση μοριακών δεικτών, και συγκεκριμένα της διαφοροποίησης της πρωτοδιάταξής τους για τη διάκριση σε επίπεδο είδους. Στην καθολική πλειονότητα των μελετών έχει χρησιμοποιηθεί η μη-κωδικοποιούσα περιοχή του μεταγραφόμενου εσωτερικού διαχωριστή (internal transcribed spacer, ITS) (Lundholm et al. 2002b, 2003, 2006, Hasle & Lundholm 2005). Με σκοπό την ακόμη πιο αποτελεσματική διάκριση των ειδών Pseudo-nitzschia, εφαρμόστηκαν πειράματα αναπαραγωγικής συμβατότητας (Amato et al. 2007, Amato & Montresor 2008, Casteleyn et al. 2008, Churro et al. 2009, Quijano-Scheggia et al. 2009b). Η πολυπαραγοντική αυτή προσέγγιση ανέδειξε υψηλά επίπεδα ενδοειδικής διαφοροποίησης και την ύπαρξη γενετικά διακριτών ομάδων με όμοια ή ίδια μορφολογία. Επιπρόσθετα, έγινε δυνατή η ανάδειξη περιπτώσεων κρυπτικής διαφοροποίησης (τα P. delicatissima και P. arenysensis, Quijano- Scheggia et al. 2009b) και πρόσφατης ειδογένεσης (πχ. τα P. calliantha και P. mannii, και οι τρεις ποικιλίες P. pungens, Amato et al. 2007, Amato & Montresor 2008, Casteleyn et al. 2008). 20

35 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Όλες αυτές οι περιπτώσεις κατέστησαν αναγκαία την επανεξέταση των ορίων μεταξύ ενδοειδικής ποικιλομορφίας και διαειδικής διαφοροποίησης, και κατ επέκταση τον επαναπροσδιορισμό των ταξινομικών ορίων μεταξύ των ειδών. Ως αποτέλεσμα, επανεξετάστηκαν αρκετά από τα υπάρχοντα είδη και περιγράφηκαν νέα είδη ή και νέες ποικιλίες (Lundholm et al. 2003, 2006, Hasle & Lundholm, 2005, Amato & Montresor 2008, Casteleyn et al. 2008, Churro et al. 2009, Quijano-Scheggia et al. 2009b). Επιπλέον, η χρήση πρόσθετων προσεγγίσεων έδωσε τη δυνατότητα βελτίωσης της διακριτικής ικανότητας των μορφολογικών χαρακτήρων. Συγκεκριμένα, αναδείχθηκαν μορφολογικές διαφορές οι οποίες στο παρελθόν είτε είχαν αγνοηθεί και παραβλεφθεί ή είχαν θεωρηθεί ως προϊόν ενδοειδικής ποικιλότητας (πχ. μεταξύ των τριών ποικιλιών P. pungens, Casteleyn et al. 2008, Churro et al. 2009). Επιπρόσθετα, ορίσθηκαν και νέοι μορφολογικοί διαγνωστικοί χαρακτήρες (πχ. η δομή και η μορφομετρία των ποροειδών μεταξύ ειδών του συμπλέγματος P. pseudodelicatissima/cuspidata, Lundholm et al. 2003, Amato & Montresor 2008) Ελληνικά Παράκτια Ύδατα Οι πληροφορίες που αφορούν στην παρουσία ειδών του γένους Pseudo-nitzschia στις ελληνικές θάλασσες είναι περιορισμένες. Η πρώτη πιθανή αναφορά σε κάποιο είδος Pseudonitzschia έγινε στη δεκαετία του 1960 (Αναγνωστίδης ) και αφορά στο N. seriata (συνώνυμο του είδους P. seriata). Επίσης, υπάρχουν καταγραφές για τα είδη P. delicatissima και P. seriata (στην πλειονότητα τους αναφέρονται ως N. delicatissima και N. seriata, αντίστοιχα) έως τα τέλη του προηγούμενου αιώνα (Ignatiades 1969, 1976, Gotsis-Skretas & Satsmadjis 1984, Gotsis-Skretas & Friligos 1990, Nikolaides & Moustaka-Gouni 1990, Nikolaidis & Evagelopoulos 1997, Gotsis-Skretas et al. 1999). Ωστόσο, σε καμία δεν παρουσιάζεται κάποια αντίστοιχη μορφολογική περιγραφή (εμπεριέχονται σε γενικούς ταξινομικούς καταλόγους φυτοπλαγκτού). Αναφορές σε είδη Pseudo-nitzschia οι οποίες συνοδεύονται και από λεπτομερή μορφολογική περιγραφή, με ανάλυση σε ΗΜ, απαντώνται κυρίως την τελευταία πενταετία (με εξαίρεση αυτή της Hasle 1995). Συγκεκριμένα έχουν αναφερθεί τα είδη: P. multiseries, P. pungens, P. pseudodelicatissima και P. calliantha (Hasle 1995, Nikolaidis et al. 2005, Moschandreou & Nikolaidis 2006, Spatharis et al. 2007, Μοσχανδρέου Κ. 2007). Ωστόσο, και 21

36 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αυτές οι μελέτες δεν πραγματεύονται την ποικιλότητα των ειδών Pseudo-nitzschia στα ελληνικά ύδατα. Εκπρόσωποι του γένους Pseudo-nitzschia καταγράφονται συχνά τα τελευταία χρόνια σε διάφορες περιοχές της Ελλάδος. Έχουν, μάλιστα, αναφερθεί και περιπτώσεις πληθυσμιακών ανθήσεων ειδών Pseudo-nitzschia (έως και 12,28 * 10 6 κύτταρα. L -1 ) [Nikolaidis et al. 2005, Spatharis et al. 2007, δεδομένα του Εθνικού Προγράμματος Παρακολούθησης Επιβλαβών Μικροφυκών, Ερευνητική Μονάδα Θαλάσσιων Τοξικών Μικροφυκών (Ε.Μ.Θ.Τ.Μ.), Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ.]. Επεισόδια αμνησιακής δηλητηρίασης δεν έχουν καταγραφεί ποτέ στον ελλαδικό χώρο. Ωστόσο, DA έχει βρεθεί σε ιστούς οστρακοειδών και μάλιστα έχει συσχετισθεί με την παρουσία υψηλής αφθονίας κυττάρων Pseudo-nitzschia (2,5 * 10 5 κύτταρα L -1 ) (Kaniou- Grigoriadou et al. 2005). Σε καμία περίπτωση, όμως, οι μετρούμενες συγκεντρώσεις δεν ξεπέρασαν το κανονιστικό όριο (European Union Regulation 853/2004/EC) των 20 μg DA g -1 ιστού (Kaniou-Grigoriadou et al. 2005, Κατίκου, Π., προσωπική επικοινωνία) Σκοπός Σύμφωνα με τα παραπάνω, φαίνεται ότι η ποικιλότητα του γένους Pseudo-nitzschia έχει έως τώρα υποεκτιμηθεί. Σε συνδυασμό και με αντικρουόμενες πληροφορίες για την παραγωγή τοξινών από κάποια είδη, καθίσταται απαραίτητη η περαιτέρω μελέτη του γένους. Πόσο μάλλον, σε μία περιοχή της Ανατολικής Μεσογείου όπου οι σχετικές με το γένος πληροφορίες (συστηματική και παραγωγή τοξινών) απουσιάζουν. Πέρα από το ερευνητικό ενδιαφέρον, είναι αναγκαία και η προστασία της δημόσιας υγείας αλλά και της βιωσιμότητας του αντίστοιχου παραγωγικού κλάδου (αλιεία και καλλιέργεια δίθυρων μαλακίων) της Ελλάδας. Η συχνή και περιστασιακά άφθονη παρουσία εκπροσώπων του γένους Pseudo-nitzschia σε ελληνικές ακτές, αλλά και η ικανότητα παραγωγής τοξινών από κάποιους εξ αυτών, καθιστά επιτακτική τη μελέτη του γένους στην περιοχή. Η παρούσα μελέτη αποσκοπεί: στην ανίχνευση και ταυτοποίηση των ειδών Pseudo-nitzschia που απαντώνται στα ελληνικά παράκτια ύδατα, με χρήση τόσο μορφολογικών (του πυριτικού εξωσκελετού) όσο και μοριακών χαρακτήρων (του πυρηνικού μοριακού δείκτη ITS2 rdna). 22

37 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Διερεύνηση της ικανότητας παραγωγής τοξινών (DA) από στελέχη ειδών Pseudonitzschia σε συνθήκες καλλιέργειας. Μελέτη του βαθμού διαφοροποίησης, μορφολογικής και γενετικής, και εύρεση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των ειδών του γένους (με χρήση του πυρηνικού μοριακού δείκτη ITS2 rdna) και σύγκριση των αποτελεσμάτων με προγενέστερες εργασίες. 23

38 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 2. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Περιοχές Έρευνας - Γεωγραφική Προέλευση Υλικού Για τη μελέτη των ειδών του γένους Pseudo-nitzschia σε ελληνικά παράκτια ύδατα, συλλέχθηκαν δείγματα νερού από τις κυριότερες περιοχές καλλιέργειας και αλιείας διθύρων μαλακίων της Ελλάδας (Εικ. 2.1). Οι περισσότερες περιοχές αφορούν κλειστούς ή ημίκλειστους κόλπους (Θερμαϊκός, Αμβρακικός, Μαλιακός), καθώς και ακτές (Θράκης, Καβάλας και Μεγάρων) με ποικίλες οικονομικές-παραγωγικές δραστηριότητες, όπως αλιεία, υδατοκαλλιέργεια και τουρισμός Εικόνα 2.1. Χάρτης της Ελλάδας με τις περιοχές δειγματοληψίας: 1. Θερμαϊκός Κόλπος, 2. ακτές Καβάλας, 3. ακτές Θράκης, 4. Αμβρακικός Κόλπος, 5. Μαλιακός Κόλπος και 6. ακτές Μεγάρων (Δυτικός Σαρωνικός Κόλπος). Figure 2.1. Map of Greece showing the sampling sites: 1. Thermaikos gulf, 2. Kavala coasts, 3. Thrace coasts, 4. Amvrakikos gulf, 5. Maliakos gulf and 6. Megara coasts (West Saronicos gulf). 24

39 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Πίνακας 2.1. Σταθμοί λήψης των δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη Table 2.1. Sampling stations from where samples used in the present study were obtained Περιοχή Τοποθεσία Γεωγραφικό Γεωγραφικό Κύρια Δραστηριότητα Σταθμού Μήκος (Ε) Πλάτος (Ν) Θερμαϊκός Περαία 22 56'22.44" 40 31'04.92" Αλιεία οστρακοειδών Κόλπος Αγγελοχώρι 22 48'06.43" 40 28'48.41" Αλιεία/καλλιέργειες οστρακοειδών Καβούρα 22 45'32.49" 40 31'22.74" Καλλιέργειες οστρακοειδών Ναζίκι 22 47'16.74" 40 32'48.09" Καλλιέργειες οστρακοειδών Φανάρι Παλιομάνας 22 52'33.87" 40 35'23.23" Αλιεία οστρακοειδών Διαχυτήρας αγωγού 22 50'16.18" 40 33'47.25" Αλιεία οστρακοειδών Ε.Υ.Α.Θ. Λευκούδι 22 45'41.65" 40 32'56.41" Καλλιέργειες οστρακοειδών Επανωμή 22 52'33.58" 40 24'32.33" Αλιεία/καλλιέργειες οστρακοειδών Νέοι Επιβάτες 22 53'25.20" 40 30'46.38" Αλιεία οστρακοειδών Καραμπουρνάκι 22 55'43.95" 40 35'25.47" Αλιεία οστρακοειδών Κύμινα 22 41'23.51" 40 29'23.60" Καλλιέργειες οστρακοειδών Κύμινα 22 39'55.90" 40 27'30.23" Καλλιέργειες οστρακοειδών Κύμινα 22 40'18.48" 40 30'41.77" Καλλιέργειες οστρακοειδών Αθερίδα 22 37'40.43" 40 23'09.34" Καλλιέργειες οστρακοειδών Μακρύγιαλος 22 37'06.53" 40 24'32.86" Καλλιέργειες οστρακοειδών Μακρύγιαλος 22 37'03.72" 40 24'37.67" Καλλιέργειες οστρακοειδών Μεθώνη 22 36'41.96" 40 27'02.00" Καλλιέργειες οστρακοειδών Μεθώνη 22 36'36.45" 40 27'08.96" Καλλιέργειες οστρακοειδών Βαρικό 22 33'40.89" 40 09'11.04" Καλλιέργειες οστρακοειδών Ακτές Κεραμωτή 24 41'34.10" 40 51'36.59" Καλλιέργειες οστρακοειδών Καβάλας Βάσοβα 24 33'30.48" 40 55'27.76" Καλλιέργειες οστρακοειδών Ηρακλείτσα 24 19'48.02" 40 51'45.06" Καλλιέργειες οστρακοειδών Ακτές Αγία Παρασκευή 25 45'34.39" 40 50'51.31" Αλιεία οστρακοειδών Θράκης Κόκκινα Βράχια 25 50'17.60" 40 50'49.70" Αλιεία οστρακοειδών Αργώ 25 52'13.53" 40 50'27.04" Αλιεία οστρακοειδών Φανάρι 25 07'29.17" 40 57'10.42" Αλιεία/καλλιέργειες οστρακοειδών Αμβρακικός Μάζωμα 20 47'28.79" 39 00'13.00" Καλλιέργειες οστρακοειδών Κόλπος Κορωνησία 20 54'44.57" 39 00'53.30" Καλλιέργειες οστρακοειδών Αμφιλοχία 21 09'47.78" 38 52'26.58" Αλιεία οστρακοειδών Μαλιακός Μώλος 22 38'02.88" 38 50'15.22" Καλλιέργειες οστρακοειδών Κόλπος Αγία Τριάδα 22 36'15.67" 38 49'50.38" Καλλιέργειες οστρακοειδών Άγιος Ιωάννης 22 37'15.67" 38 54'11.01" Καλλιέργειες οστρακοειδών Ακτές Νεράκι 23 26'47.11" 38 00'49.37" Αλιεία/καλλιέργειες οστρακοειδών Μεγάρων Δρέπανο 23 25'14.92" 37 59'49.28" Αλιεία/καλλιέργειες οστρακοειδών 25

40 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Οι σταθμοί δειγματοληψίας ήταν αυτοί που εντάσσονται στο πλαίσιο του Προγράμματος Παρακολούθησης Επιβλαβών Μικροφυκών (Ε.Μ.Θ.Τ.Μ., Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ.). Ο αριθμός των σταθμών ανά περιοχή, οι ονομασίες και οι ακριβείς συντεταγμένες των σταθμών παρατίθενται στον Πίνακα 2.1. Το βάθος των σταθμών δειγματοληψίας κυμαίνεται από τρία έως 25 m Περίοδος, Συχνότητα και Πρωτόκολλο Συλλογής Υλικού Το υλικό που εξετάστηκε συλλέχθηκε, στο πλαίσιο του Εθνικού Προγράμματος Παρακολούθησης Επιβλαβών Μικροφυκών, κατά την περίοδο Μάρτιος 2007 έως και Απρίλιος Προκαταρκτικές, επιλεκτικές και σποραδικές συλλογές υλικού είχαν ξεκινήσει από τον Ιούνιο του 2006 (Πίνακας 2.2, βλ. σελ ). Οι συλλογές του υλικού έγιναν σε εβδομαδιαία (από το Θερμαϊκό, Μαλιακό και Αμβρακικό Κόλπο και από τις ακτές Καβάλας και Μεγάρων) ή δεκαπενθήμερη συχνότητα (από τις ακτές της Θράκης) σύμφωνα με το Πρόγραμμα Παρακολούθησης Επιβλαβών Μικροφυκών. Δείγματα νερού συλλέχθηκαν με χρήση ενός πλαστικού σωλήνα (από PVC, διατομής 1,5 inch και μήκους 30 m) ο οποίος σε κατακόρυφη τοποθέτηση προς τον πυθμένα εσωκλείει ολόκληρη τη στήλη του νερού. Μέσω μιας βαλβίδας αντεπιστροφής κλείνει το κάτω στόμιο και παγιδεύει μ αυτό τον τρόπο το νερό που εσωκλείει. Επίσης λήφθηκαν δείγματα με κατακόρυφη σύρση πλαγκτοσυλλέκτη (διαμέτρου πόρων 20 μm, Hydro-Bios Apparatebau GmbH, Germany) κατά μήκος της στήλης νερού. Τα δείγματα νερού που λήφθηκαν με χρήση του πλαστικού σωλήνα, τοποθετήθηκαν σε φιάλες πολυαιθυλενίου (PET), χωρητικότητας 500 ml, και μονιμοποιήθηκαν επί τόπου με διάλυμα Lugol (Andersen & Throndsen 2003) (συντηρημένα δείγματα). Η μεταφορά τους στο εργαστήριο έγινε εντός 2 48 ωρών. Τα δείγματα νερού που λήφθηκαν με σύρση του πλαγκτοσυλλέκτη, τοποθετήθηκαν σε φιάλες πολυαιθυλενίου, χωρητικότητας 500 ml, και μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο (ζωντανά δείγματα). Η μεταφορά τους στο εργαστήριο έγινε σε συνθήκες συντήρησης (με φορητά ψυγεία) και σκότους, εντός χρονικού διαστήματος 2 48 ωρών. Από τα ζωντανά δείγματα απομονώθηκαν κύτταρα για τη δημιουργία καλλιεργειών, οι οποίες αποτέλεσαν το κυρίως υλικό για τις περαιτέρω αναλύσεις. 26

41 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 2.3. Εργαστηριακές Αναλύσεις Επιλογή Δειγμάτων Ζωντανά δείγματα νερού (συνολικά 1.095) από όλες τις περιοχές μελέτης που συλλέχθηκαν κατά την περίοδο (καθώς και επιλεγμένα δείγματα που λήφθηκαν κατά την περίοδο , Μοσχανδρέου 2007) παρατηρήθηκαν σε ανάστροφο οπτικό μικροσκόπιο Olympus CK30 (Olympus America Inc., USA). Τα κύτταρα Pseudo-nitzschia ταξινομήθηκαν σε διακριτούς μορφοτύπους με βάση το σχήμα και τις διαστάσεις τους (και με χρήση πρόσθετων δεδομένων από Μοσχανδρέου 2007). Η απομόνωση κυττάρων προς καλλιέργεια έγινε με γνώμονα την όσο το δυνατό πιο αντιπροσωπευτική εκπροσώπηση από κάθε μορφότυπο αλλά και κάθε περιοχή προέλευσης. Πρόσθετο κριτήριο αποτέλεσε και η εμφάνιση συγκεκριμένων ειδών/μορφοτύπων σε υψηλές αφθονίες. Έτσι απομονώθηκαν κύτταρα Pseudo-nitzschia τα οποία παρατηρήθηκαν σε αφθονίες > κύτταρα L -1 (Ε.Μ.Θ.Τ.Μ., Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ.). Επιπλέον, τα συντηρημένα δείγματα στα οποία μετρήθηκαν υψηλές αφθονίες κυττάρων Pseudo-nitzschia (συνολικά 90) υπεβλήθησαν σε περαιτέρω επεξεργασία και παρατήρηση με ΗΜΔ (βλ ) με σκοπό την ταυτοποίηση των ειδών Pseudo-nitzschia Απομόνωση Κυττάρων & Εγκατάσταση Καλλιεργειών Συνολικά δημιουργήθηκαν 98 μονοκλωνικές μη-αξενικές καλλιέργειες ειδών Pseudonitzschia από δείγματα ζωντανού υλικού. Για την απομόνωση κυττάρων Pseudo-nitzschia από τα δείγματα νερού ακολουθήθηκε η μέθοδος της μικροπιπέττας (Hoshaw & Rosowski 1973). Συγκεκριμένα, με χρήση αποστειρωμένης γυάλινης μικροπιπέττας αναρροφήθηκαν κύτταρα (ένα κύτταρο ή μία αλυσίδα κυττάρων) από το φυσικό δείγμα. Ακολούθησε διαδοχική μεταφορά των κυττάρων (πέντε φορές) σε σταγόνες αποστειρωμένου θρεπτικού μέσου, έτσι ώστε να επιτευχθεί όσο το δυνατόν καλύτερη απομόνωση από άλλους μικροοργανισμούς. Τελικά μεταφέρθηκαν σε αποστειρωμένα πλαστικά τριβλία Petri (διαμέτρου 5,5 cm) τα οποία περιείχαν θρεπτικό μέσο. Τα τριβλία τοποθετήθηκαν σε θάλαμο καλλιέργειας και παρακολουθήθηκαν σε ημερήσια βάση (σε ανάστροφο οπτικό μικροσκόπιο Olympus CK30) για διάστημα μίας έως τεσσάρων εβδομάδων. Εφόσον εντός του συγκεκριμένου χρονικού διαστήματος διαπιστώθηκε μικροσκοπικά η επιτυχής ανάπτυξη των κυττάρων, ποσότητα μέσου και κυττάρων 27

42 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ μεταφέρθηκαν σε αποστειρωμένες κωνικές φιάλες (τύπου Erlenmeyer και όγκου 250 ml) που περιείχαν 200 ml θρεπτικό μέσο και διατηρήθηκαν στο θάλαμο καλλιέργειας. Το θρεπτικό μέσο καλλιέργειας που χρησιμοποιήθηκε προετοιμάστηκε από διηθημένο (σε ηθμούς GF/C, με διάμετρο πόρων 1,2 μm και διάμετρο ηθμού 45 mm, Whatman International Ltd, England) φυσικό θαλασσινό νερό, από την ευρύτερη περιοχή του Θερμαϊκού Κόλπου (αλατότητας ~36 psu). Το θαλασσινό νερό εμπλουτίστηκε με θρεπτικό μέσο L1 (Guillard & Morton 2003). Για τη ρύθμιση του ph του θρεπτικού μέσου στην τιμή 8,0 8,2 χρησιμοποιήθηκαν κατάλληλοι όγκοι διαλυμάτων 1 N HCl (Merck KGaA, Germany) και 1 N NaOH (Merck KGaA, Germany). Στη συνέχεια ακολούθησε μετάγγιση του μέσου σε κωνικές φιάλες και αποστείρωση σε κλίβανο αποστείρωσης υγρής θερμότητας (αυτόκαυστο, HV-25L, HMC Europe GmbH, Germany). Η θερμοκρασία στο θάλαμο καλλιέργειας ρυθμίστηκε στους 19 ± 2 C, η ένταση της φωτεινής ακτινοβολίας στα 70 μmol m -2 s -1 και η φωτοπερίοδος στην εναλλαγή 12 h φως / 12 h σκοτάδι. Εκ νέου εμβολιασμός των καλλιεργούμενων κυττάρων σε φιάλες με νέο θρεπτικό μέσο γινόταν κάθε ημέρες Μορφολογική Ταυτοποίηση Ειδών Επεξεργασία Δειγμάτων Η μορφολογική ταυτοποίηση έγινε με χρήση ΗΜΔ. Για την εξέταση της δομής του πυριτικού κελύφους των κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν παρασκευάσματα υλικού απαλλαγμένου από οργανικά συστατικά. Η επεξεργασία των δειγμάτων βασίστηκε στη μέθοδο των Hasle & Fryxell (1970), και περιλαμβάνει τα εξής βήματα: 1. Λήψη ποσότητας (10 ml) δείγματος (υλικό από τις καλλιέργειες ή υλικό από το πεδίο). 2. Ανάδευση του υποδείγματος (σε αναδευτήρα vortex για 1 min στην υψηλότερη ταχύτητα, IKA MS 3 basic, IKA Werke GmbH & Co. KG, Germany). 3. Προσθήκη ίσου όγκου με το υποδείγμα (10 ml) διαλύματος πυκνού H 2 SO 4 (95 97%, Merck KGaA, Germany) με ταυτόχρονη ανάδευση. 4. Σταδιακή προσθήκη κορεσμένου διαλύματος KMnO 4 (Merck KGaA, Germany και Riedel-de Haën, Germany) με ταυτόχρονη ανάδευση, μέχρι το διάλυμα αποκτήσει σκούρο ιώδες χρώμα. 5. Το δείγμα αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 24 h. 28

43 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 6. Προσθήκη κορεσμένου διαλύματος οξαλικού οξέος (Riedel-de Haën, Germany) με ταυτόχρονη ανάδευση, μέχρι τον πλήρη αποχρωματισμό του διαλύματος (με έντονη έκλυση φυσαλίδων). 7. Συμπύκνωση του διαλύματος έως τα 3 ml, με φυγοκέντρηση για 15 min στις rpm (Κ240, Centurion Scientific Ltd, England) και απόρριψη ποσότητας του υπερκείμενου (με χρήση πιπέττας και αποφυγή αναταράξεων). 8. Διαδοχικές πλύσεις (επτά φορές). Επαναδιάλυση με προσθήκη δις-απεσταγμένου νερού, ανάδευση σε vortex για 1 min στην υψηλότερη ταχύτητα και συμπύκνωση (στάδιο 7). Διατήρηση 3 ml τελικού διαλύματος. 9. Προσθήκη σταγόνων τελικού διαλύματος σε πλέγματα χαλκού (50-mesh grids και διαμέτρου 3,05 mm, Agar Scientific Ltd., UK) επικαλυμμένα με υμένιο στήριξης (formvar, Agar Scientific Ltd., UK). 10. Ξήρανση στον αέρα. 11. Παρατήρηση σε ΗΜΔ (Zeiss EM 9S-2, Carl Zeiss Inc., Germany και Philips 300, Koninklijke Philips Electronics N.V., Netherlands). Στην περίπτωση που διαπιστωνόταν μικροσκοπικά ατελής οξείδωση του οργανικού υλικού, η διαδικασία επαναλαμβανόταν από το στάδιο προσθήκης KMnO 4 (στάδιο 4) και έπειτα Ορολογία Για την περιγραφή των μορφολογικών χαρακτηριστικών των κυττάρων, η ξενόγλωσση ορολογία που χρησιμοποιήθηκε είναι αυτή των Anonymous (1975), Ross et al. (1979) και Round et al. (1990), όπως τροποποιήθηκε από τους Hasle et al. (1996). Στην περίπτωση του είδους Pseudo-nitzschia galaxiae και μόνο για τις ταινίες του περιζωνίου χρησιμοποιήθηκε η ορολογία που είχε προταθεί από τον von Stosch (1975), εξαιτίας της παρουσίας τριών διαφορετικών τύπων ταινιών (Lundholm & Moestrup 2002, Cerino et al. 2005, Moschandreou & Nikolaidis 2010). Η ελληνική ορολογία στηρίχθηκε στην αντίστοιχη των Δανιηλίδη (1998), Μοσχανδρέου (2007) και Οικονόμου-Αμίλλη (2011), με κάποιες τροποποιήσεις Μορφολογικοί Χαρακτήρες με Ταξινομική Αξία Η ταξινομική κατάταξη των ειδών του γένους Pseudo-nitzschia απαιτεί την εξέταση της λεπτής δομής του πυριτικού τους κελύφους με παρατηρήσεις σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, και κυρίως ΗΜΔ. Τα χαρακτηριστικά που εξετάστηκαν είναι: 29

44 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 1. το μήκος της θυρίδας, 2. το πλάτος της θυρίδας (αφορά το πλάτος της επιφάνειας της θυρίδας, η επιφάνεια των μανδυών δεν προσμετράται), 3. το σχήμα της θυρίδας (σε θυριδική και περιζωνική όψη), 4. η παρουσία/απουσία κεντρικού κόμβου, 5. η πυκνότητα των περισφίγξεων της ραφής (ο αριθμός των περισφίγξεων που αντιστοιχούν σε μήκος 10 μm κατά τον κορυφαίο άξονα η μέτρηση γίνεται σε ένα κεντρικό τμήμα της θυρίδας και όχι πλησίον των άκρων), 6. η πυκνότητα των ραβδώσεων της θυρίδας (ο αριθμός των ραβδώσεων της θυρίδας που αντιστοιχούν σε 10 μm κατά τον κορυφαίο άξονα η μέτρηση γίνεται σε ένα κεντρικό τμήμα της θυρίδας και όχι πλησίον των άκρων), 7. ο αριθμός των σειρών ποροειδών ανά ράβδωση, 8. η πυκνότητα των ποροειδών της θυρίδας (ο αριθμός των ποροειδών που αντιστοιχούν σε 1 μm κατά τον εγκάρσιο άξονα η μέτρηση γίνεται σε ένα κεντρικό τμήμα της επιφάνειας της θυρίδας και όχι πλησίον των άκρων), 9. το σχήμα και η δομή των ποροειδών καθώς και της μεμβράνης των ποροειδών, 10. η δομή του περιζωνίου (αριθμός και δομή ταινιών του περιζωνίου) και η πυκνότητα των ραβδώσεων της 1 ης ταινίας (αριθμός ραβδώσεων που αντιστοιχούν σε 10 μm κατά τον κορυφαίο άξονα η μέτρηση γίνεται σε ένα κεντρικό τμήμα της επιφάνειας της ταινίας και όχι πλησίον των άκρων), και 11. η δομή των μανδυών της θυρίδας. (Hasle 1965, 1995, Hasle et al. 1996, Villac & Fryxell 1998, Lundholm et al. 2002b, Lundholm & Moestrup 2002, Orsini et al. 2002, Priisholm et al. 2002, Lundholm et al. 2003, Hasle & Lundholm 2005, Lundholm et al. 2006). Σε ορισμένες περιπτώσεις εξετάζεται και ο σχηματισμός ή μη αλυσίδων με επικάλυψη κυττάρων στα άκρα τους (stepped colonies) (Lundholm et al. 2002b). Πρόσφατα, οι Amato & Montresor (2008) εισήγαγαν και δύο νέα μορφολογικά γνωρίσματα για τη διάκριση μεταξύ συγκεκριμένων ειδών (του συμπλέγματος ειδών P. pseudodelicatissima/cuspidata). Πρόκειται για τον αριθμό των διάτρητων περιοχών που απαντώνται στη μεμβράνη των ποροειδών της θυρίδας και για το ποσοστό των ποροειδών της θυρίδας που φέρουν μία κεντρικά τοποθετημένη διάτρητη περιοχή (η μέτρηση γίνεται σε ένα κεντρικό τμήμα της επιφάνειας της θυρίδας). 30

45 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Τουλάχιστο 30 κύτταρα μετρήθηκαν από κάθε είδος (εκτός από το είδος Pseudonitzschia multiseries, το οποίο εντοπίστηκε σε πολύ μικρές τιμές αφθονίας και σε δύο μόνο δείγματα πεδίου) Γενετική Ανάλυση Απομόνωση Γενετικού Υλικού Γενετικό υλικό, DNA, απομονώθηκε από κύτταρα μονοκλωνικών καλλιεργειών με όσο το δυνατό πιο αντιπροσωπευτική εκπροσώπηση από κάθε είδος και κάθε περιοχή προέλευσης. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε σε συμπλέγματα ειδών (πχ. P. delicatissima και P. pseudodelicatissima). Συνολικά απομονώθηκε DNA από κύτταρα 76 διαφορετικών καλλιεργειών σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Doyle & Doyle (1987), και περιλαμβάνει τα εξής βήματα: 1. Λαμβάνεται ποσότητα δείγματος από καλλιέργεια (10 ml), ζωντανό ή συντηρημένο σε συνθήκες βαθιάς κατάψυξης (-70 C), και τοποθετείται σε βαθμονομημένους σωλήνες φυγοκέντρησης (των 15 ml με βιδωτό καπάκι). 2. Φυγοκέντρηση για 10 min στις rpm, σε θερμοκρασία δωματίου (23-24 C) (Κ240, Centurion Scientific Ltd, England). 3. Απόρριψη υπερκείμενου υγρού (θρεπτικό μέσο), με χρήση πιπέττας και αποφυγή αναταράξεων. 4. Μεταφορά του ιζήματος (απομονωμένα κύτταρα) σε αποστειρωμένο σωληνάκι Eppendorf (όγκου 1,5 ml) περιέχον προθερμασμένο (65 C) διάλυμα CTAB (Nκέτυλο-N,N,N-τριμεθυλο-βρωμιούχο αμμώνιο, Merck KGaA, Germany). Για την παρασκευή του διαλύματος CTAB προστίθεται 1 μl β-μερκαπτοαιθανόλη (4 C) (Fluka Chemie GmbH, Switzerland) και 9 μl πρωτεϊνάση K (-20 C) (New England Biolabs Inc, UK) ανά 500 μl CTAB, και ακολουθεί πολύ καλή ανάδευση (vortex). 5. Επώαση του διαλύματος (CTAB με τα περιέχοντα στο ίζημα κύτταρα) στους 65 C για 1 h (συσκευή θερμοστάτησης, thermoblock METAL BLOCK HEATER BH 100, BIOLine Scientific, Greece) με ενδιάμεσες αναδεύσεις (vortex) ανά 15 min. 31

46 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 6. Εκχύλιση με ίσο όγκο (500 μl) διαλύματος χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης (24 : 1 v/v) (Merck KGaA, Germany) 7. Φυγοκέντρηση για 10 min στις rpm, σε θερμοκρασία δωματίου (23-24 C). 8. Αναρρόφηση της υπερκείμενης (υδατικής) φάσης σε ένα νέο, κενό, αποστειρωμένο σωληνάκι Eppendorf (όγκου 1,5 ml) και επανάληψη της διαδικασίας καθαρισμού (βήματα 6 8) για μία ακόμη φορά. 9. Κατακρήμνιση των νουκλεϊκών οξέων, με προσθήκη ίσου όγκου ισοπροπανόλης (-20 C) (Merck KGaA, Germany), ανάδευση και ολονύκτια επώαση σε συνθήκες κατάψυξης (-20 C). 10. Φυγοκέντρηση για 15 min στις rpm, σε θερμοκρασία 4 C (ψυχόμενη φυγόκεντρος τύπου Digicen 20-R, Orto Alresa, Spain) και απόρριψη του υπερκείμενου υγρού (απλό άδειασμα). 11. Προσθήκη 100 μl διαλύματος οξικού νατρίου (συγκέντρωση 3M, ph 5,2 και θερμοκρασία 4 C) (Fluka Chemie GmbH, Switzerland) και 400 μl διαλύματος αιθανόλης (περιεκτικότητα 96% v/v και θερμοκρασία -20 C) (Panreac Quimica S.A.U., Spain), ανάδευση και επώαση σε πάγο για 20 min. 12. Φυγοκέντρηση για 30 min στις rpm, σε θερμοκρασία 4 C. 13. Αφαίρεση υπερκείμενου υγρού και επανάληψη της διαδικασίας έκπλυσης, αυτή τη φορά με ανάδευση του ιζήματος με διάλυμα αιθανόλης (περιεκτικότητα 70% v/v και θερμοκρασία συντήρησης 20 C), ανάδευση και επώαση σε πάγο για 20 min. 14. Φυγοκέντρηση για 15 min στις rpm, σε θερμοκρασία 4 C και προσεκτική αφαίρεση του υπερκείμενου υγρού (αποφυγή ανατάραξης του ιζήματος). 15. Ξήρανση του ιζήματος σε απαγωγό νηματικής ροής (Faster TWO 30, Faster S.r.l., Italy) 16. Επαναιώρηση του ιζήματος με 50 μl ρυθμιστικού διαλύματος TE και 2 μl ριβονουκλεάσης Α (RNase A, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Germany), επώαση για 10 min στους 70 C (σε συσκευή θερμοστάτησης) και αποθήκευση έως τα επόμενα στάδια ανάλυσης σε συνθήκες βαθιάς κατάψυξης (-70 C). 32

47 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Ποιοτική αξιολόγηση του DNA που απομονώθηκε έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (1 % w/v) (Agarose low EEO-standard, AppliChem GmbH, Germany) (βλ. Υποκεφάλαιο ) Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Για τη μελέτη της γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ ειδών ή/και στελεχών του γένους Pseudo-nitzschia εξετάστηκε ο πυρηνικός μοριακός δείκτης μεταγραφόμενος εσωτερικός διαχωριστής 2 (Internal Transcribed Spacer 2, ΙΤS2) (για την ακρίβεια τμήμα της περιοχής 5.8S, ολόκληρη η περιοχή ITS2 και τμήμα της περιοχής 28S rdna), ο οποίος αναλύθηκε με την τεχνική εύρεσης της πρωτοδιάταξης του DNA. Για την απομόνωση και την ενζυμική ενίσχυση του δείκτη χρησιμοποιήθηκε η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR). Οι αντιδράσεις PCR έγιναν σε δύο στάδια (ημι-ένθετη αντίδραση, semi-nested), σε θερμικό κυκλοποιητή Mastercycler ep Gradient (Eppendorf AG, Germany). Κατά την αρχική αντίδραση PCR ενισχύθηκε ολόκληρο το τμήμα LSU και ITS του rdna. Αυτό επιτεύχθηκε με χρήση δύο εξωτερικών εκκινητών, του ITS-1 (5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ) (White et al. 1990) και του D3Ca (5 -ACGAACGATTTGCACGTCAG-3 ) (Scholin et al. 1994). Το μίγμα αντιδραστηρίων για την αντίδραση της PCR (τελικού όγκου 50 μl) περιείχε: - 38 μl ενέσιμου ύδατος (molecular biology grade, AppliChem GmbH, Germany) - 5 μl ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης για την πολυμεράση DyNAzyme II (10x Optimized DyNAzyme TM buffer F-511, Finnzymes, Finland) (1.5 mm MgCl 2 ) - 1 μl μίγματος τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων (200 μm, ισομοριακό μίγμα datp, dctp, dgtp, dttp, HT Biotechnology, England) - 1 μl διαλύματος εκκινητή ITS-1 (0.5 μm, Invitrogen, USA) - 1 μl διαλύματος εκκινητή D3Ca (0.5 μm, Invitrogen, USA) - 1 μl πολυμεράσης DyNAzyme II (0.04 U, Finnzymes, Finland) - 3 μl απομονωμένου DNA (εκμαγείο DNA) διαλυμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα TE. Το θερμοκρασιακό προφίλ μιας τυπικής αντίδρασης PCR περιελάμβανε: - αρχική αποδιάταξη στους 94 C για 4 min, - 10 κύκλους με θερμοκρασία αποδιάταξης στους 94 C για 45 sec, - υβριδισμός στους 50 C για 45 sec (με σταδιακή ελάττωση της θερμοκρασίας κατά 0,4 C σε κάθε κύκλο), 33

48 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ - επιμήκυνση στους 72 C για 50 sec, - 30 κύκλους με θερμοκρασία αποδιάταξης στους 94 C για 40 sec, - υβριδισμός στους 46 C για 40 sec, - επιμήκυνση στους 72 C για 45 sec, και - τελική επιμήκυνση στους 72 C για 10 min. Τα παραγόμενα προϊόντα χρησιμοποιήθηκαν ως εκμαγείο DNA στη δεύτερη αντίδραση PCR. Συγκεκριμένα, με χρήση του εξωτερικού εκκινητή ITS-1 και ενός νέου εσωτερικού εκκινητή, του ITS4 (5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ) (White et al. 1990), ενισχύθηκε η περιοχή ITS [τελικό τμήμα της SSU (18S), ολόκληρη η ITS και αρχικό τμήμα της LSU (28S)]. Οι ποσότητες για τα αντιδραστήρια του μίγματος της δεύτερης PCR αντίδρασης (τελικού όγκου 50 μl) ήταν ίδιες με αυτές της πρώτης αντίδρασης. Το θερμοκρασιακό προφίλ μιας τυπικής αντίδρασης PCR περιελάμβανε: - αρχική αποδιάταξη στους 94 C για 4 min, - 10 κύκλους με θερμοκρασία αποδιάταξης στους 94 C για 40 sec, - υβριδισμός στους 48 C για 30 sec (με σταδιακή ελάττωση της θερμοκρασίας κατά 0,6 C σε κάθε κύκλο), - επιμήκυνση στους 72 C για 30 sec, - 25 κύκλους με θερμοκρασία αποδιάταξης στους 94 C για 20 sec, - υβριδισμός στους 44 C για 15 sec, - επιμήκυνση στους 68 C για 20 sec, και - τελική επιμήκυνση στους 68 C για 10 min. Η ποιοτική αξιολόγηση των τμημάτων που ενισχύθηκαν έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (1% w/v) (βλ. Υποκεφάλαιο ) Έλεγχος και Απομόνωση Προϊόντων της PCR Η απομόνωση και ο ποιοτικός έλεγχος των προϊόντων της αντίδρασης PCR έγινε με ηλεκτροφόρησή τους σε πηκτή αγαρόζης. Για την κατασκευή της πηκτής διαλύθηκε αγαρόζη (1% w/v) σε 1Χ ρυθμιστικό διάλυμα TAE και θερμάνθηκε έως το σημείο βρασμού (σε συσκευή θερμοστάτησης Thermolyne Cimarec 2, Lab Extreme Inc., USA). Στο παραπάνω διάλυμα προστέθηκαν 2,5 μl για κάθε 100 ml διαλύματος αγαρόζης, διαλύματος βρωμιδίου του αιθιδίου (1%) (Barloworld Scientific Ltd., UK). Ακολούθησε μεταφορά σε κατάλληλου μεγέθους πλαίσιο ηλετροφόρησης (Cleaver Scientific Ltd., UK). Εκεί διατηρήθηκε σε συνθήκες θερμοκρασίας 34

49 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ δωματίου μέχρι να στερεοποιηθεί. Ποσότητα από τα τελικά προϊόντα (περιοχή ITS) της PCR (50 μl) αναμίχθηκε με 2,5 μl διαλύματος φόρτωσης [Gel Loading Dye, Blue (6x), Νew England Βiolabs Ltd., UK] και φορτώθηκε στους θύλακες της πηκτής. Σε κάθε πηκτή, σε ένα βοθρίο φορτώθηκαν 5 μl κλίμακας μοριακών βαρών (100 bp DNA Ladder, Invitrogen, USA), που χρησίμευσε ως σταθερά για τον υπολογισμό των μηκών των ηλεκτροφορούμενων τμημάτων DNA. Σε ένα δεύτερο βοθρίο φορτώθηκαν 5 μl αρνητικού μάρτυρα (απεσταγμένο νερό αντί απομονωμένου DNA). Η ηλεκτροφόρηση του πηκτώματος πραγματοποιήθηκε στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα (1Χ TAE) σε οριζόντια ηλετροφορητική συσκευή (Cleaver Scientific Ltd., UK). Εφαρμόστηκε τάση 150 Volt (τροφοδοτική συσκευή Consort EV243, BioPoint Ltd., UK) στα άκρα της συσκευής για min. Έπειτα από την ηλεκτροφόρηση ακολούθησε παρατήρηση των πηκτωμάτων αγαρόζης σε τράπεζα UV ακτινοβολίας (365 nm), τεμαχισμός του τμήματος πηκτής με το ενισχυμένο τμήμα DNA και μεταφορά του σε προζυγισμένο, αποστειρωμένο σωληνάκι Eppendorf (όγκου 1.5 ml). Ακολούθησε καθαρισμός του τμήματος πηκτής με ειδικά σκευάσματα καθαρισμού (Nucleospin Extract II, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Germany) και σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το ενισχυμένο τμήμα του DNA, διαλυμένο στο ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (σε αποστειρωμένο σωληνάκι Eppendorf όγκου 1,5 ml), εστάλη ταχυδρομικά στην εταιρεία Macrogen Inc. (Korea) με σκοπό την εύρεση της πρωτοταγούς χημικής δομής των ενισχυμένων τμημάτων DNA. Συνολικά εστάλησαν για αλληλούχιση 61 δείγματα Εύρεση της Πρωτοδιάταξης του DNA Η εύρεση της πρωτοδιάταξης των ενισχυμένων τμημάτων DNA έγινε σε αυτόματο αναλυτή (Automatic DNA Sequencer 3730XL, Applied Biosystems Inc., USA) από την εταιρεία Macrogen Inc. (Korea). Η αλληλούχιση έγινε μόνο από την αντίθετη κατεύθυνση (3' 5') του τμήματος στόχου με χρήση του εκκινητή ITS4. Τα αποτελέσματα της αλληλούχισης λήφθηκαν μέσω ηλεκτρονικού ταχυδρομείου Επεξεργασία Ακολουθιών Ο ποιοτικός έλεγχος των ακολουθιών έγινε με έλεγχο των χρωματογραφημάτων στο λογισμικό BioEdit (Hall 1999). Συγκεκριμένα, ελέγχθηκε εάν οι κορυφές του χρωματογραφήματος (σήμα καταγραφής σημασμένου με φθορίζουσα χρωστική νουκλεοτιδίου) ήταν μοναδικές και ευδιάκριτες, όπως επίσης και εάν η μεταξύ τους απόσταση ήταν σταθερή. 35

50 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Όπου παρατηρήθηκαν σημειακά λάθη αυτά διορθώθηκαν με το χέρι. Μόνο όσες ακολουθίες πληρούσαν τις ανωτέρω προϋποθέσεις χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Τελικά χρησιμοποιήθηκαν 34 ακολουθίες της περιοχής ITS2. Ακολούθησε έλεγχος της ομολογίας της ακολουθίας με άλλες ήδη κατατεθειμένες στη διαδικτυακή βάση δεδομένων GenBank. Αυτό έγινε με χρήση του διαδικτυακού προγράμματος αναζήτησης και εξόρυξης δεδομένων BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. 1990, Με αυτό τον τρόπο πιστοποιήθηκε ότι όλες οι ακολουθίες προέρχονται από είδη του γένους Pseudo-nitzschia και ότι απομονώθηκε και ενισχύθηκε το ζητούμενο τμήμα DNA (ITS2). Επίσης βρέθηκε μεγάλη ομολογία της τελικής περιοχής 5.8S και της αρχικής περιοχής 28S με αυτές άλλων κατατεθειμένων ακολουθιών. Πέρα από τον έλεγχο της ακολουθίας, το BLAST χρησιμοποιήθηκε και για την επιλογή κατατεθειμένων στη GenBank ακολουθιών από είδη Pseudo-nitzschia, οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν στις φυλογενετικές αναλύσεις. Η επιλογή τους έγινε με διάφορα κριτήρια. Αρχικά με βάση το είδος. Χρησιμοποιήθηκαν κατατεθειμένες ακολουθίες από είδη του γένους που έχουν καταγραφεί στη λεκάνη της Μεσογείου (P. arenysensis, P. australis, P. brasiliana, P. calliantha, P. cuspidata, P. delicatissima, P.dolorosa, P. fraudulenta, P. galaxiae, P. mannii, P. multistriata, P. pseudodelicatissima, P. pungens var. pungens, P. subfraudulenta, P. subpacifica) (Hasle 2002, Lundholm et al. 2003, 2006, Orsini et al. 2004, Mamán et al. 2006, Amato et al. 2007, Quijano-Scheggia et al. 2009b, 2010, Moschandreou & Nikolaidis 2010) και από μορφολογικά όμοια με όλα τα ανωτέρω είδη (P. decipiens, P. pungens var. cingulata, P. pungens var. aveirensis και τα στελέχη Hobart5 και Ner-D6) (Lundholm et al. 2003, Casteleyn et al. 2008, Churro et al. 2009, Orive et al. 2010). Επίσης, σε περιπτώσεις όπου υπήρχαν πάρα πολλές διαθέσιμες ακολουθίες που πληρούσαν τα ανωτέρω κριτήρια (π.χ. το είδος Pseudonitzschia delicatissima, οι ποικιλίες του είδους P. pungens κ.ο.κ.) επιλέχθηκαν αντιπροσωπευτικές ακολουθίες με βάση βιβλιογραφικά δεδομένα (αντιπροσωπευτική εξάπλωση και βαθμό μορφολογικής ή γενετικής διαφοροποίησης). Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 160 ακολουθίες, οι 34 προήλθαν από την παρούσα μελέτη και οι υπόλοιπες (126) από τη GenBank. Ως εξωομάδα επιλέχθηκε μία ακολουθία (AY574377) προερχόμενη από στέλεχος που αναγνωρίστηκε ως Nitzschia compressa (Bailey) Boyer [συνώνυμο του είδους Tryblionella compressa (Bailey) Poulin]. 36

51 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Ευθυγράμμιση Ακολουθιών Για την περαιτέρω ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των εξεταζόμενων στελεχών ακολούθησε η ευθυγράμμιση των ακολουθιών τους. Η ευθυγράμμιση αποσκοπεί στον προσδιορισμό των ομόλογων θέσεων, βήμα το οποίο είναι απαραίτητο για τις φυλογενετικές αναλύσεις. Για την ευθυγράμμιση των ακολουθιών χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα ClustalX2.0.3 (Thompson et al. 1997). Τόσο για τη δυαδική όσο και για την πολλαπλή στοίχιση εφαρμόστηκαν οι προεπιλεγμένες (default) τιμές παραμέτρων. Δοκιμάζοντας συνδυασμό τιμών για τις διάφορες παραμέτρους του προγράμματος διαπιστώθηκε ότι οι προκαθορισμένες τιμές έδιναν την καλύτερη ευθυγράμμιση (μικρότερο αριθμό κενών και το μεγαλύτερο αριθμό συντηρημένων θέσεων) (Hall 2001). Οι αμφισβητούμενες και λανθασμένα στοιχισμένες αλληλουχίες αφαιρέθηκαν. Το τελικό σύνολο δεδομένων περιελάμβανε 161 ακολουθίες ITS2 (Πίνακας 2.2) με συνολικό μήκος 451 bp (έως και 388 bp από ολόκληρη την ITS2 ακολουθία, 37 bp από το τελικό άκρο του 5.8S και 26 bp από το αρχικό άκρο του 28S). Τα αρχεία με τις ευθυγραμμισμένες ακολουθίες αναλύθηκαν με χρήση των προγραμμάτων MEGA v4 (Tamura et al. 2007) και DAMBE (Xia & Xie 2001) για την περαιτέρω ανάλυσή τους. Στην ανάλυση των ακολουθιών ITS2 εξαιτίας του μεγάλου αριθμού ακριβώς ίδιων σε πρωτοδιάταξη ακολουθιών, βρέθηκαν 94 απλότυποι (Πίνακας 2.2), οι οποίοι και χρησιμοποιήθηκαν στις περαιτέρω φυλογενετικές αναλύσεις. Η αναγνώρισή τους έγινε με εφαρμογή του λογισμικού Collapse 1.2 ( collapse.html). Οι ακολουθίες των ελληνικών στελεχών Pseudo-nitzschia κατατέθηκαν στη βάση δεδομένων GenBank, και οι αριθμοί πρόσβασης δίδονται στον Πίνακα

52 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Πίνακας 2.2. Στελέχη Pseudo-nitzschia που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Τα στελέχη από ελληνικά παράκτια ύδατα τονίζονται με έντονη γραμματοσειρά. Για τα στελέχη που έχουν χρησιμοποιηθεί στη φυλογενετική ανάλυση δίδονται οι αριθμοί πρόσβασής τους στη GenBank, όπως και τα ονόματα των σχηματιζόμενων απλοτύπων. Τα στελέχη που εξετάστηκαν για παραγωγή DA υποδεικνύονται με έναν αστερίσκο (*). Τα ονόματα των ειδών για κάθε στέλεχος είναι αυτά με τα οποία αναφέρονται στη GenBank. Οι τροποποιημένες ταυτοποιήσεις, όπως αυτές έχουν αναφερθεί για κάποια στελέχη στη βιβλιογραφία (Lundholm et al. 2003; Amato et al. 2007; McDonald et al. 2007; Amato & Montresor 2008) δίνονται εντός παρενθέσεων Table 2.2. Pseudo-nitzschia strains used in the present study. The Greek strains are denoted with bold lettering. GenBank accession numbers are given for strains used for phylogenetic analyses and the names of the formed haplotypes as well. Strains tested for DA production are indicated with a superscript asterisk (*). Species names are those reported in GenBank, while the emended species names, as suggested in literature studies (Lundholm et al. 2003; Amato et al. 2007; McDonald et al. 2007; Amato & Montresor 2008) are given in parenthesis Είδος Pseudo-nitzschia Στέλεχος Αρ. Πρόσβασης GenBank Απλότυπος Προέλευση (Ημερομηνία απομόνωσης), Αναφορά P. australis Delta 2 EU ast_h76 Λιμνοθάλασσα Aveiro, Πορτογαλία, Churro et al OEM1 ή ØM1 AY ast_h78 Aveiro, ακτές Πορτογαλίας, Lundholm et al au43 DQ ast_h77 Κόλπος Monterey, ακτές Δ. ΗΠΑ, Hasle & Lundholm 2005 PLY1St.27E AM ast_h77 Ακτές Δ. Σκωτίας, Fehling et al P. brasiliana (09)12A2* JF bras_h80 Θερμαϊκός Κόλπος (Δεκ. 2009) (09)12A3* JF bras_h80 Θερμαϊκός Κόλπος (Δεκ. 2009) (09)12A4* Θερμαϊκός Κόλπος (Δεκ. 2009) ICMB-172 EU bras_h81 Olimpic, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al. 2009a ICMB-175 EU bras_h81 Olimpic, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al. 2009a Xt3C DQ bras_h82 Κόλπος Van Phong, Βιετνάμ, Hasle & Lundholm 2005 P. caciantha Mex 20 AY cac_h18 Tuxpam, Κόλπος του Μεξικού, Μεξικό, Lundholm et al AL-56 DQ cac_h17 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Amato et al P. calliantha (08)2A1* Αμβρακικός Κόλπος (Φεβ. 2008) (09)2A2* Αμβρακικός Κόλπος (Φεβ. 2009) (09)2A8* Αμβρακικός Κόλπος (Φεβ. 2009) (09)2A10* Αμβρακικός Κόλπος (Φεβ. 2009) (09)2A11* Αμβρακικός Κόλπος (Φεβ. 2009) (09)2A12* JF cal_h5 Αμβρακικός Κόλπος (Φεβ. 2009) (09)2A13 Αμβρακικός Κόλπος (Φεβ. 2009) (09)7A1* Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2009) (09)7A2* Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2009) 38

53 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Πίνακας 2.2. Συνέχεια από προηγούμενη σελίδα Table 2.2. Continued from previous page (09)7A3* Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2009) (09)9A4* JF cal_h5 Θερμαϊκός Κόλπος (Σεπ. 2009) (09)9A6* Θερμαϊκός Κόλπος (Σεπ. 2009) DS2 AY cal_h5 Do Son, ακτές Β. Βιετνάμ, Lundholm et al HA-D4 AY cal_h5 Κόλπος Ha Long, Β. Βιετνάμ, Lundholm et al TA-1 AY cal_h5 Thuan An, ακτές Κ. Βιετνάμ, Lundholm et al AL-112 DQ cal_h4 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Amato et al ICMB-144 EU cal_h5 Blanes, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, ICMB-138 DQ cal_h5 Blanes, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, (45) ICMB-119 DQ cal_h5 Ràpita, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, (24) ICMB-158 EU cal_h5 Blanes, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al ICMB-147 EU cal_h7 Blanes, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al ICMB-159 EU cal_h10 Villanova, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al ICMB-111 EU cal_h9 Ràpita, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al ICMB-120 EU cal_h8 Ràpita, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al ICMB-157 EU cal_h3 Ràpita, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al B4 DQ cal_h5 Ràpita, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, B3 DQ cal_h6 Ràpita, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Fernandez Pn-3 DQ cal_h1 Ποταμός Choptank, ακτές Α. ΗΠΑ, Thessen et al Pn-7 DQ cal_h1 Ποταμός Patuxent, ακτές Α. ΗΠΑ, Thessen et al Pn-8 DQ cal_h1 Ποταμός Choptank, ακτές Α. ΗΠΑ, Thessen et al Pn-13 DQ cal_h1 Ποταμός Choptank, ακτές Α. ΗΠΑ, Thessen et al Pn-16 EF cal_h1 Στενό Tangier, ακτές Α. ΗΠΑ, Thessen et al Pn-17 EF cal_h1 Στενό Tangier, ακτές Α. ΗΠΑ, Thessen et al Pn-18 EF cal_h2 Στενό Tangier, ακτές Α. ΗΠΑ, Thessen et al P. cuspidata Mex 12 AY cus_h61 Tuxpam, Κόλπος του Μεξικού, Μεξικό; Lundholm et al Sydney 1 AY cus_h59 Σίδνεϋ, ακτές Αυστραλίας, Lundholm et al

54 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Πίνακας 2.2. Συνέχεια από προηγούμενη σελίδα Table 2.2. Continued from previous page AL-17 DQ cus_h60 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Amato et al P. delicatissima Pdlc Θερμαϊκός Κόλπος (Οκτ. 2007) Pdld Θερμαϊκός Κόλπος (Οκτ. 2007) (09)4A1* JF del_h22 Θερμαϊκός Κόλπος (Απρ. 2009) (09)4A2* Θερμαϊκός Κόλπος (Απρ. 2009) (09)4A3* Θερμαϊκός Κόλπος (Απρ. 2009) (09)4A4* JF del_h22 Θερμαϊκός Κόλπος (Απρ. 2009) (09)4A5* Θερμαϊκός Κόλπος (Απρ. 2009) (09)10A2* Ακτές Θράκης (Οκτ. 2009) (10)4A4* JF del_h22 Θερμαϊκός Κόλπος (Απρ. 2010) (10)4A5* JF del_h22 Ακτές Θράκης (Απρ. 2010) ICMB-101 (Ra2) DQ del_h23 Ràpita, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al. 2009b ICMB-135 (42) EU del_h21 Blanes, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al. 2009b ICMB-170 EU del_h22 Βαρκελώνη, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al. 2009b A4 DQ del_h22 Δέλτα ποταμού Ebre, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al. 2009b AY del_h22 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Orsini et al CT B3 EU del_h24 Ακρωτήρι Tormentine, ακτές Α. Καναδά, Kaczmarska et al WC4B1 28F EU del_h24 Νήσος Wolves, ακτές Α. Καναδά, Kaczmarska et al BBA4 EU del_h25 Λεκάνη Bedford, ακτές Α. Καναδά, Kaczmarska et al PLY1St.46A AM del_h26 Ακτές Δ. Σκωτίας, Fehling et al PLY1St.45E AM del_h24 Ακτές Δ. Σκωτίας, Fehling et al OFPd972 DQ del_h27 Κόλπος Ofunato, Ιαπωνία, Lundholm et al Tasm 10 AY del_h28 Hobart, ακτές Τασμανίας, Αυστραλία, Lundholm et al ØM2 DQ del_h24 Aveiro, ακτές Πορτογαλίας, Lundholm et al Læsø5 AY del_h24 Θάλασσα Kattegat, Δανία, Lundholm et al P. cf. delicatissima (07)10A2* JF cfdel_h30 Θερμαϊκός Κόλπος (Οκτ. 2007) (07)10A3* JF cfdel_h31 Θερμαϊκός Κόλπος (Οκτ. 2007) P. arenysensis ICMB-129 (36) EU arns_h32 Arenys, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al. 2009b ICMB-130 (37) EU arns_h33 Arenys, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al. 2009b Ner-D1 GQ arns_h34 Εκβολές ποταμού Nervion, Βισκαϊκός Κόλπος, Ισπανία, Orive et al P. delicatissima (P. arenysensis) Castell1 DQ arns_h36 Castellamare, ακτές Ιταλίας, Lundholm et al

55 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Πίνακας 2.2. Συνέχεια από προηγούμενη σελίδα Table 2.2. Continued from previous page P. delicatissima (P. arenysensis) AY arns_h37 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Orsini et al P. delicatissima (P. arenysensis) AL-110 DQ arns_h35 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Amato et al P. delicatissima (P. arenysensis) MexA DQ arns_h38 Tuxpam, Κόλπος του Μεξικού, Μεξικό, Lundholm et al P. decipiens GranCan4-1 DQ dep_h39 Gran Canaria, Κανάριες νήσοι, Lundholm et al Mex13 DQ dep_h40 Tuxpam, Κόλπος του Μεξικού, Μεξικό, Lundholm et al P. dolorosa AL-59 DQ dol_h45 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Amato et al BP2 DQ dol_h48 Boca Piccola,ακτές Ιταλίας, Lundholm et al DQ dol_h47 Ria de Aveiro, ακτές Πορτογαλίας, Lundholm et al Calif1 DQ dol_h46 Κόλπος Monterey, ακτές Δ. ΗΠΑ, Lundholm et al P. delicatissima (P. dolorosa) 4-01 AY dol_h47 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Orsini et al P. cf. dolorosa (07)7Α9 Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2007) P. fraudulenta (07)12A5* JF fra_h92 Θερμαϊκός Κόλπος (Δεκ. 2007) (07)12B1* Θερμαϊκός Κόλπος (Δεκ. 2007) (09)2A3* JF fra_h92 Ακτές Καβάλας (Φεβ. 2009) (09)2A6* Ακτές Καβάλας (Φεβ. 2009) (09)2A8 Αμβρακικός Κόλπος (Φεβ. 2009) ICMB-104 (AR2) DQ fra_h93 Arenys, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al ICMB-105 (AR3) DQ fra_h94 Arenys, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al PO2 DQ fra_h93 Ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Elandaloussi Limens1 AY fra_h94 Limens, ακτές Ισπανίας, Lundholm et al Pn-9 DQ fra_h90 Νήσος Assateague, ακτές Α. ΗΠΑ, Thessen et al Pn-10 DQ fra_h90 Νήσος Assateague, ακτές Α. ΗΠΑ, Thessen et al Pn-11 DQ fra_h90 Νήσος Assateague, ακτές Α. ΗΠΑ, Thessen et al Pn-12 DQ fra_h90 Νήσος Assateague, ακτές Α. ΗΠΑ, Thessen et al Pn-15 DQ fra_h90 Asilomar, Καλιφόρνια, ακτές Δ. ΗΠΑ, Thessen et al PLY1St.11C AM fra_h91 Ακτές Δ. Σκωτίας, Fehling et al PLY1St.15A AM fra_h91 Ακτές Δ. Σκωτίας, Fehling et al PLY1St.11D AM fra_h91 Ακτές Δ. Σκωτίας, Fehling et al

56 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Πίνακας 2.2. Συνέχεια από προηγούμενη σελίδα Table 2.2. Continued from previous page PLY1St.12A AM fra_h91 Ακτές Δ. Σκωτίας, Fehling et al P. galaxiae (07)7A2* Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2007) (07)7A3* Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2007) (07)7A4* Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2007) (07)7A5* Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2007) (07)7A6* Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2007) (07)7A7* Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2007) (07)7A8* Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2007) (07)7A10* Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2007) (07)7A12* Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2007) (08)5A3* JF gal_h41 Θερμαϊκός Κόλπος (Μαΐ. 2008) (08)5A4* JF gal_h41 Θερμαϊκός Κόλπος (Μαΐ. 2008) (08)5A5 Θερμαϊκός Κόλπος (Μαΐ. 2008) (10)4A3* JF gal_h41 Ακτές Θράκης (Απρ. 2010) ICMB-173 EU gal_h41 Olimpic, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al ICMB-174 EU gal_h42 Olimpic, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al Mex23 AY gal_h43 Tuxpam, Κόλπος του Μεξικού, Μεξικό, Lundholm et al Sydney4 DQ gal_h44 Σίδνεϋ, ακτές Αυστραλίας, Lundholm et al P. mannii (07)Ε* Ακτές Μεγάρων (Μαρ. 2007) (07)E-2* JF man_h13 Ακτές Μεγάρων (Μαρ. 2007) (08)8Α4* Θερμαϊκός Κόλπος (Αυγ. 2008) (08)8Α5* Θερμαϊκός Κόλπος (Αυγ. 2008) (08)8Α6* Θερμαϊκός Κόλπος (Αυγ. 2008) (08)8Α7* Θερμαϊκός Κόλπος (Αυγ. 2008) (08)8Α8* Θερμαϊκός Κόλπος (Αυγ. 2008) (08)8Α11* Θερμαϊκός Κόλπος (Αυγ. 2008) (08)9A4* Θερμαϊκός Κόλπος (Σεπ. 2008) (08)9A6* Θερμαϊκός Κόλπος (Σεπ. 2008) (08)9Β1* Θερμαϊκός Κόλπος (Σεπ. 2008) (08)10A1* Θερμαϊκός Κόλπος (Οκτ. 2008) (08)10A2* JF man_h16 Θερμαϊκός Κόλπος (Οκτ. 2008) (08)10A4* Θερμαϊκός Κόλπος (Οκτ. 2008) (08)10B2* Μαλιακός Κόλπος (Οκτ. 2008) (08)10B4* Μαλιακός Κόλπος (Οκτ. 2008) (08)10B5* Μαλιακός Κόλπος (Οκτ. 2008) (08)10B8* JF man_h14 Μαλιακός Κόλπος (Οκτ. 2008) AL-101 DQ man_h11 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Amato et al C-AL-1 DQ man_h12 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Amato et al P. delicatissima (P. mannii) AY man_h15 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Orsini et al P. multiseries Pn-1 DQ mlse_h72 Ποταμός Choptank, ακτές Α. ΗΠΑ, Thessen et al

57 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Πίνακας 2.2. Συνέχεια από προηγούμενη σελίδα Table 2.2. Continued from previous page mu3 AY mlse_h74 Κόλπος Monterey, ακτές Δ. ΗΠΑ, Lundholm et al OFPm984 DQ mlse_h73 Κόλπος Ofunato, Ιαπωνία, Hasle & Lundholm 2005 P. multistriata (07)12A1* Θερμαϊκός Κόλπος (Δεκ. 2007) (07)12A2* JF mst_h87 Θερμαϊκός Κόλπος (Δεκ. 2007) (07)12A3* Θερμαϊκός Κόλπος (Δεκ. 2007) (07)12A4* Θερμαϊκός Κόλπος (Δεκ. 2007) ICMB-150 EU mst_h86 Blanes, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al ICMB-113 (CM1) DQ mst_h89 Tarragona, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia t al ICMB-115 (CM3) DQ mst_h85 Tarragona, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia et al KoreaA AY mst_h88 Κόλπος Chinhae, Κορέα, Lundholm et al A EF mst_h84 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, D'Alelio et al. 2009b B5 EF mst_h83 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, D'Alelio et al. 2009b A/B2 EF mst_h83 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, D'Alelio et al. 2009b A/B3 EF mst_h84 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, D'Alelio et al. 2009b P. pseudodelicatissima (06)31 Θερμαϊκός Κόλπος (Νοε. 2006) (08)8A9* FJ psd_h56 Θερμαϊκός Κόλπος (Αυγ. 2008) (08)8A10* Θερμαϊκός Κόλπος (Αυγ. 2008) (08)8A13* Θερμαϊκός Κόλπος (Αυγ. 2008) (08)8A14* FJ psd_h58 Θερμαϊκός Κόλπος (Αυγ. 2008) (08)9A1* FJ psd_h53 Θερμαϊκός Κόλπος (Αυγ. 2008) (08)10A3* Θερμαϊκός Κόλπος (Οκτ. 2008) (08)10B1* JF psd_h57 Μαλιακός Κόλπος(Οκτ. 2008) (08)10B7* Μαλιακός Κόλπος(Οκτ. 2008) (09)7A4* JF psd_h57 Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουλ. 2009) (09)9A1* JF psd_h57 Θερμαϊκός Κόλπος (Σεπ. 2009) (09)9A2* JF psd_h57 Θερμαϊκός Κόλπος (Σεπ. 2009) (09)10A3* JF psd_h57 Ακτές Θράκης (Οκτ. 2009) (09)10A4* JF psd_h57 Ακτές Θράκης (Οκτ. 2009) P-11 AY psd_h57 Gafahna, ακτές Πορτογαλίας, Lundholm et al AL-41 DQ psd_h49 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Amato et al AL-29 DQ psd_h52 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Amato et al AL-60 DQ psd_h51 Κόλπος της Νάπολη, Ιταλία, Amato et al Ner-D5 GQ psd_h50 Εκβολές ποταμού Nervion, Βισκαϊκός Κόλπος, Ισπανία, Orive et al P. cuspidata (P. pseudodelicatissima) Tenerife 8 AY psd_h57 Tenerife, Κανάριες νήσοι, Lundholm et al

58 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Πίνακας 2.2. Συνέχεια από προηγούμενη σελίδα Table 2.2. Continued from previous page P. cf. pseudodelicatissima (08)9Β2* JF cf.psd_h99 Θερμαϊκός Κόλπος (Σεπ. 2008) (08)9A7* JF cf.psd_h99 Θερμαϊκός Κόλπος (Σεπ. 2008) Pseudo-nitzschia sp. Ner-D8 GQ sp_h99 Εκβολές ποταμού Nervion, Βισκαϊκός Κόλπος, Ισπανία, Orive et al P. calliantha IEO-PS50V AM sp_h100 Pontevedra, ακτές Ισπανίας, Penna et al Pseudo-nitzschia sp (P. sp. Hobart5) Hobart 5 AY Hob_h55 Ακτές Τασμανίας, Αυστραλία, Lundholm et al Pseudo-nitzschia sp. Ner-D6 GQ Hob_h54 Εκβολές ποταμού Nervion, Βισκαϊκός Κόλπος, Ισπανία, Orive et al P. pungens var. aveirensis partial sequence AY avr_h68 ακτές Κίνας, ΒΔ Ειρηνικός, Zhang,B. & Wang,G. partial sequence DQ avr_h70 Hai Phong, ΒΔ Ειρηνικός, Βιετνάμ, Hoang,A.L., Dang,H.D. & Chu,T.V. KBH2b DQ avr_h69 Κόλπος Khan Hoa, ΒΔ Ειρηνικός, Βιετνάμ, Hasle & Lundholm 2005 Mex 18 AY avr_h71 Tuxpam, Κόλπος του Μεξικού, Μεξικό, Lundholm et al Alfa 3 EU avr_h71 Λιμνοθάλασσα Aveiro, Πορτογαλία, Churro et al P-24 AY avr_h71 Costa Nova, ακτές Πορτογαλίας, Lundholm et al P. pungens var. cingulata US-123/c AM cing_h64 Washington, ακτές Δ. ΗΠΑ, Casteleyn et al US-132 AM cing_h64 Washington, ακτές Δ. ΗΠΑ, Casteleyn et al P. pungens var. pungens (06)22 Θερμαϊκός Κόλπος (Ιουν. 2006) (07)11A1* Θερμαϊκός Κόλπος (Νοε. 2007) (07)11A2* Θερμαϊκός Κόλπος (Νοε. 2007) (07)11A5 Θερμαϊκός Κόλπος (Νοε. 2007) (07)11B1* Θερμαϊκός Κόλπος (Νοε. 2007) (07)11B3* Θερμαϊκός Κόλπος (Νοε. 2007) (07)11B4* Θερμαϊκός Κόλπος (Νοε. 2007) (07)12B2* Θερμαϊκός Κόλπος (Δεκ. 2007) (09)9A5* JF png_h66 Θερμαϊκός Κόλπος (Σεπ. 2009) (09)12A1* Θερμαϊκός Κόλπος (Δεκ. 2009) (10)4A2* JF png_h65 Θερμαϊκός Κόλπος (Απρ. 2010) ICMB-108 (PO3) DQ png_h67 Olimpic, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia e al ICMB-143 EU png_h65 Blanes, ακτές Καταλωνίας, Ισπανία, Quijano-Scheggia t al AM png_h62 Ambleteuse, Βόρεια Θάλασσα, Γαλλία, Casteleyn et al CTB1 EU png_h65 Ακρωτήριο Tormentine, ακτές Α. Καναδά, Kaczmarska et al NZ-74 AM png_h62 Νότια Νήσος, Νέα Ζηλανδία, Ν Ειρηνικός, Casteleyn et al Jp-14 AM png_h62 Κόλπος Ofunato, Ιαπωνία, ΒΔ Ειρηνικός, Casteleyn et al

59 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Πίνακας 2.2. Συνέχεια από προηγούμενη σελίδα Table 2.2. Continued from previous page US-94/f AM png_h62 Πάρκο Κόλπου Sequim, ακτές Δ. ΗΠΑ, Casteleyn et al Cn-218 AM png_h62 Νήσος Prince Edward, ακτές Α. Καναδά, Casteleyn et al Vigo-3/a AM png_h62 Κόλπος του Βίγκο, Ισπανία, Casteleyn et al W4(7)2 AM png_h62 Westerscheldt, ακτές Ολλανδίας, Casteleyn et al S(7)1 AM png_h62 Λιμνοθάλασσα Oostend, Βέλγιο, Casteleyn et al V215(7)3 AM png_h63 Βόρεια Θάλασσα, Βέλγιο, Casteleyn et al P. subfraudulenta (07)11B5* Θερμαϊκός Κόλπος (Νοε. 2007) (08)8A3* JF sbfra_h95 Θερμαϊκός Κόλπος (Αυγ. 2008) P. subpacifica (09)2A5 JF sbpc_h19 Ακτές Καβάλας (Φεβ. 2009) - EU sbpc_h19 Ακτές Δ. Γαλλίας, Nezan et al P. cf. subpacifica P-28 AY sbpc_h19 Costa Nova, ακτές Πορτογαλίας, Lundholm et al P. cf. subpacifica RdA8 AY sbpc_h19 Ria de Arousa, ακτές Ισπανίας, Lundholm et al Nitzschia compressa τμήμα ακολουθίας ITS2 AY out_h101 Joubert, Y., Rousse, G., Robert, J.-M. & Fleurence, J., δελτίο δείγματος καταλόγου: WDCM NCC Επιλογή Εξελικτικού Μοντέλου Νουκλεοτιδικών Αντικαταστάσεων Κάποιες μέθοδοι φυλογενετικής ανάλυσης (πχ. η αρχή της μέγιστης πιθανοφάνειας και η ανάλυση κατά Bayes), απαιτούν επιλογή του καταλληλότερου εξελικτικού μοντέλου νουκλεοτιδικών αντικαταστάσεων για το υπό ανάλυση σύνολο ακολουθιών. Ουσιαστικά πρόκειται για υποθέσεις σχετικές με τη διαδικασία αντικαταστάσεων νουκλεοτιδίων, οι οποίες εκφράζονται με τη μορφή μοντέλου (Hall 2001). Το πιο απλό μοντέλο είναι το JC69 (Jukes & Cantor 1969). Αυτό δέχεται τις παραδοχές ότι η πιθανότητα των μεταπτώσεων (transitions) σε κάθε θέση είναι ίδια με αυτή των μεταστροφών (transversions), και ότι και οι συχνότητες των τεσσάρων νουκλεοτιδίων είναι ίσες (π T = π C = π A = π G = π). Αυτό το μοντέλο ωστόσο, δεν είναι το πλέον ρεαλιστικό μιας και είναι πλέον γνωστό πως οι διάφορες αλλαγές δε συμβαίνουν με την ίδια συχνότητα (Hall 2001). Έτσι έχει αναπτυχθεί μια πληθώρα μοντέλων αντικαταστάσεων βασισμένα σε παραδοχές για τη συχνότητα των μεταπτώσεων και των μεταστροφών (έως και 12 διαφορετικές συχνότητες) και για τις συχνότητες των τεσσάρων νουκλεοτιδίων. Επίσης, είναι πιθανό οι συχνότητες αντικαταστάσεων να μην είναι ίδιες για όλες τις θέσεις μίας ακολουθίας, αλλά μεταβλητές (Hall 2001). 45

60 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Ο έλεγχος της καταλληλότητας του μοντέλου (από ένα σύνολο 56 προεπιλεγμένων μοντέλων) με βάση το σύνολο των εξεταζόμενων ακολουθιών έγινε με το λογισμικό ModelTest 3.7 (Posada & Crandal 1998). Χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία λόγων ιεραρχημένης πιθανοφάνειας (hierarchical Likelihood Ratio Tests, hlrts). Ως καταλληλότερο μοντέλο χαρακτηρίστηκε το HKY + G (Hasegawa-Kishino-Yano plus Gamma) (Hasegawa et al. 1985). Πρόκειται για μία τροποποίηση του μοντέλου HKY85 (Hasegawa et al. 1985), μιας και η ετερογένεια του ρυθμού αλλαγών μεταξύ των θέσεων ακολουθεί γ κατανομή (G). Το HKY85 αποτελεί ένα συνδυασμό των μοντέλων K2P (Kimura 1980) και F81 (Felsenstein 1981). Συγκεκριμένα, δέχεται τις παραδοχές ότι το ποσοστό των μεταπτώσεων σε κάθε θέση είναι διαφορετικό από αυτό των μεταστροφών (χρησιμοποιώντας την παράμετρο κ ) (μοντέλο K2P), και ότι οι συχνότητες των τεσσάρων νουκλεοτιδίων είναι διαφορετικές (π T π C π A π G ) (μοντέλο F81). Οι βασικές παράμετροι του εξελικτικού μοντέλου προσδιορίστηκαν ως εξής: διαφορετικές συχνότητες βάσεων (A = 0,221, C = 0,188, G = 0,233, T = 0,358), διαφορετικό ποσοστό μεταπτώσεων-μεταστροφών (αριθμός αντικαταστάσεων, Nst = 2), παράμετρος α της γ-κατανομής, gamma Shape = 0,626, ποσοστό αμετάβλητων θέσεων, Pinvar = 0 και λόγος μεταπτώσεων/μεταστροφών, TRatio = 1, Υπολογισμός Γενετικών Αποστάσεων Οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των απλοτύπων υπολογίστηκαν με το πρόγραμμα PAUP* 4.0b10 (Swofford 1998) εισάγοντας το εξελικτικό μοντέλο και τις απαιτούμενες παραμέτρους του (όπως αυτές προέκυψαν με την ανάλυση στο ModelTest 3.7, βλ. Υποκεφάλαιο ). Ο υπολογισμός μέσων τιμών γενετικών αποστάσεων μεταξύ ομάδων ακολουθιών (μεταξύ ακολουθιών του ίδιου είδους, μεταξύ ακολουθιών διαφορετικών ποικιλιών, ειδών και μορφοτύπων) έγινε με το λογισμικό MEGA software (Tamura et al. 2007). 46

61 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Κατασκευή Φυλογενετικών Δένδρων Αρχή της Μέγιστης Φειδωλότητας Η μέθοδος της μέγιστης φειδωλότητας (Maximum Parsimony, MP) στηρίζεται στην παραδοχή ότι το βέλτιστο φυλογενετικό δένδρο είναι αυτό που προκύπτει με το μικρότερο αριθμό εξελικτικών αλλαγών. Βασική προϋπόθεση είναι ότι τα τάξα φέρουν κοινούς χαρακτήρες επειδή τους κληρονόμησαν από έναν κοινό πρόγονο οι αποκλίσεις από αυτή την παραδοχή εξηγούνται από φαινόμενα ομοπλασιών (Hall 2001). Εξετάζονται όλες οι πιθανές τοπολογίες και ως μέγιστης φειδωλότητας επιλέγονται αυτές που προκύπτουν με το μικρότερο αριθμό αλλαγών. Οι σταθεροί χαρακτήρες καθώς επίσης και οι χαρακτήρες που εμφανίζουν διαφοροποίηση κατά ένα μόνο νουκλεοτίδιο στο σύνολο των ακολουθιών, αγνοούνται στην ανάλυση. Η μέθοδος δεν καταλήγει συνήθως σε ένα μόνο δένδρο αλλά σε πολλά ισοπίθανα. Στην παρούσα μελέτη οι αναλύσεις με την αρχή της μέγιστης φειδωλότητας έγιναν με το πρόγραμμα PAUP* 4.0b10 (Swofford 1998), θεωρώντας τα κενά που εισήχθησαν κατά την ευθυγράμμιση των ακολουθιών ως έναν επιπλέον (πέμπτο) χαρακτήρα. Η αναζήτηση των δένδρων έγινε με τις ακόλουθες παραμέτρους: αλγόριθμους ευρετικής αναζήτησης με τυχαία προσθήκη ακολουθιών-αντιγράφων (random sequence addition replicates) και αντιμετάθεση κλάδων TBR (Διχοτόμηση-Επανασύνδεση Κλάδων, Τree Bisection-Reconnection). Για την ανεύρεση του συναινετικού (consensus) δενδρογράμματος εφαρμόστηκαν το κριτήριο πλειοψηφίας 50% (MajRule 50%) αλλά και το ημι-απόλυτο (semistrict) κριτήριο. Η αξιοπιστία των κόμβων προσδιορίστηκε με χρήση της μη-παραμετρικής μεθόδου bootstrap, με δημιουργία ψευδοεπαναλήψεων (βλ. Υποκεφάλαιο ) Αρχή της Μέγιστης Πιθανοφάνειας Με τη μέθοδο της μέγιστης πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood, ML) κατασκευάζονται διαφορετικά υποθετικά φυλογενετικά δένδρα και από αυτά αναζητάται το δένδρο εκείνο το οποίο ερμηνεύει με τη μεγαλύτερη πιθανότητα τις παρατηρήσεις (ευθυγραμμισμένες ακολουθίες) (Hall 2001). Η αναζήτηση γίνεται με δεδομένο ότι οι ακολουθίες εξελίσσονται σύμφωνα με το προκαθορισμένο εξελικτικό μοντέλο νουκλεοτιδικών αντικαταστάσεων. Με αυτή τη μέθοδο παράγεται συνήθως ένα δένδρο, το οποίο θεωρείται ως το πιο πιθανό να ανταποκρίνεται στο πραγματικό φυλογενετικό δένδρο. 47

62 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Οι αναλύσεις με την αρχή της μέγιστης πιθανοφάνειας έγιναν μέσω διαδικτύου με τον αλγόριθμο PhyML 3.0 (Phylogenetic Maximum Likelihood, Guindon & Gascuel 2003) στη ψηφιακή πλατφόρμα λογισμικού βιοπληροφορικής ATGC Bioinformatics Platform ( Επιλέχθηκε το εξελικτικό μοντέλο HKY + G εισάγοντας τις απαιτούμενες παραμέτρους (όπως αυτές προέκυψαν με την ανάλυση στο ModelTest 3.7, βλ. Υποκεφάλαιο ). Η αναζήτηση των δένδρων έγινε με χρήση αλγορίθμων ευρετικής αναζήτησης, με εναρκτήριο φυλογενετικό δένδρο BIONJ (BIONJ starting tree) και τον αλγόριθμο επαναδιευθέτησης κλάδων NNI (εναλλαγή εγγύτατου γείτονα, nearest-neighbor interchange branch-swapping). Η αξιοπιστία των κόμβων προσδιορίστηκε με τη μέθοδο bootstrap, με δημιουργία ψευδοεπαναλήψεων (βλ. Υποκεφάλαιο ) Ανάλυση κατά Bayes Η ανάλυση κατά Bayes (Bayesian inference, BI) είναι όμοια με την ML. Και στις δύο αναλύσεις αναζητώνται τα φυλογενετικά δένδρα τα οποία εξηγούν καλύτερα τις παρατηρήσεις (ευθυγραμμισμένες ακολουθίες). Η διαφορά τους είναι ότι η ανάλυση ML αναζητά εκείνο το δένδρο που μεγιστοποιεί την πιθανότητα ερμηνείας των δεδομένων με βάση το συγκεκριμένο δένδρο, ενώ η ανάλυση κατά Bayes αναζητά εκείνο το δένδρο που μεγιστοποιεί την πιθανότητα τα δεδομένα και το εξελικτικό μοντέλο να ερμηνεύουν το δένδρο (Hall 2001). Τα αρχεία με τις ευθυγραμμισμένες ακολουθίες επεξεργάστηκαν με το πρόγραμμα BEAUti v1.5.4 (Drummond & Rambaut 2007). Αυτό έγινε ώστε να εξαχθεί ο αναγκαίος τύπος αρχείου για την ανάλυση Bayes, η οποία εκτελέστηκε με το πρόγραμμα BEAST v1.5.4 (Drummond & Rambaut 2007). Το πρόγραμμα αυτό χρησιμοποιεί τον αλγόριθμο MCMC (Markov Chain Monte Carlo). Εξετάζεται μία αλυσίδα Markov που ενεργεί για τον υπολογισμό της ύστερης πιθανότητας του κάθε παραγόμενου δένδρου. Για την ανάλυση των ακολουθιών εξετάστηκαν δύο διαφορετικές αλυσίδες Markov για γενεές, με δειγματοληψία των δένδρων κάθε δένδρα. Χρησιμοποιήθηκε ένα μοντέλο μοριακού ρολογιού πολλαπλών μοριακών ρυθμών (relaxed uncorrelated molecular clock), με εκθετική κατανομή των ρυθμών εξέλιξης (exponential) και υποθέτοντας ότι η διαδικασία ειδογένεσης περιγράφεται κατά Yule (Yule speciation process) (η τοπολογία του δένδρου περιγράφεται από μία στοχαστική διαδικασία ειδογένεσης). Επιπρόσθετα, επιλέχθηκε το εξελικτικό μοντέλο (HKY + G) εισάγοντας τις απαιτούμενες παραμέτρους (όπως αυτές προέκυψαν με την ανάλυση στο ModelTest 3.7, βλ. Υποκεφάλαιο ). Αγνοώντας τις πρώτες γενεές, τα 48

63 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ αποτελέσματα της κάθε ανάλυσης ελέγχθηκαν στο πρόγραμμα Tracer v1.5.0 (MCMC Trace Analysis Tool, Drummond & Rambaut 2007). Η επάρκεια συγκερασμού (adequacy of mixing) εκτιμήθηκε με έλεγχο των τιμών (μεγαλύτερες του 200) των παραμέτρων του επαρκούς μεγέθους δείγματος (effective sample size, ESS) (Drummond et al. 2006). Οι δύο ξεχωριστές αναλύσεις συνδυάστηκαν με χρήση του προγράμματος LogCombiner v1.5.4 και το δένδρο με τη μεγαλύτερη υποστήριξη βρέθηκε με το πρόγραμμα TreeAnnotator v Το τελικά παραγόμενο δένδρο απεικονίστηκε και επεξεργάστηκε ανάλογα στο πρόγραμμα Figtree v Ανάλυση Αξιοπιστίας Ο έλεγχος της αξιοπιστίας των δένδρων εκφράζεται ως η πιθανότητα τα μέλη ενός συγκεκριμένου κλάδου να αποτελούν πάντοτε μέλη αυτού του κλάδου (Hall 2001). Αυτό επιτυγχάνεται με τη δημιουργία ψευδοεπαναλήψεων, οι οποίες είναι τυχαία υποσύνολα του αρχικού δείγματος (ευθυγραμμισμένες ακολουθίες), και την κατασκευή του αντίστοιχου δένδρου. Τα δένδρο αυτό συγκρίνεται με το αρχικό. Η συχνότητα εμφάνισης ενός κλάδου στις ψευδοεπαναλήψεις αποτελεί την πιθανότητα ενός κλάδου να περιέχεται στο πραγματικό δένδρο (Felsenstein & Kishino 1993) και συνήθως εκφράζεται σε ποσοστό επί τις εκατό (%). Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της ανάλυσης bootstrap για τον έλεγχο της αξιοπιστίας των MP και ML αναλύσεων ψευδοεπαναλήψεις και στις δύο αναλύσεις. Ως αξιόπιστες θεωρήθηκαν οι τιμές bootstrap μεγαλύτερες ή ίσες με 80%. Κατά την ανάλυση κατά Bayes είναι δυνατή η απευθείας εκτίμηση της συχνότητας εμφάνισης ενός κλάδου στα δένδρα που λαμβάνονται ως δείγματα. Αυτό επιτυγχάνεται με υπολογισμό των ύστερων πιθανοτήτων για κάθε κλάδο (posterior probability), δηλαδή των συχνοτήτων με την οποία απαντώνται επιμέρους κλάδοι στο σύνολο των δένδρων. Ως αξιόπιστες τιμές θεωρήθηκαν αυτές που ήταν ίσες ή μεγαλύτερες από το 0, Διερεύνηση Τοξικότητας Η πλειονότητα των στελεχών του γένους Pseudo-nitzschia (88 από τα συνολικά 101) που απομονώθηκαν, εξετάστηκαν ως προς τη δυνατότητα παραγωγής DA υπό συνθήκες καλλιέργειας (Πίνακας 2.2, βλ. σελ ). Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε η παρουσία ολικού DA ( whole-culture DA, από Bates 1998) σε δείγματα καλλιεργειών, και προσδιορίστηκε η συγκέντρωσή του σε όσα από αυτά ανιχνεύθηκε. Το ολικό DA συνιστά την ποσότητα DA που μετράται όταν ως αναλυτικό δείγμα χρησιμοποιείται τόσο το θρεπτικό μέσο όσο και τα 49

64 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ περιεχόμενα σε αυτό κύτταρα (χωρίς προηγούμενο διαχωρισμό τους). Για τον προσδιορισμό του ολικού DA παρασκευάστηκαν εκχυλίσματα του μέσου και των κυττάρων τα οποία στη συνέχεια αναλύθηκαν με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης με υπεριώδη ανίχνευση με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (HPLC-UV-DAD) Προετοιμασία Καλλιεργειών-Δειγματοληψία Λήφθηκαν υποδείγματα από τις αρχικές καλλιέργειες στελεχών Pseudo-nitzschia, οι οποίες βρίσκονται στην αρχή ή στη μέση της εκθετικής φάσης ανάπτυξής τους. Η επιλογή δειγματοληψίας στη συγκεκριμένη φάση ανάπτυξης έγινε ώστε να αποφευχθεί το ενδεχόμενο μεταφοράς τοξινών κατά τον εμβολιασμό (Douglas & Bates 1992, Douglas et al. 1993, Bates 1998, Fehling et al. 2004b). Για τον προσδιορισμό της φάσης ανάπτυξης της κάθε καλλιέργειας λήφθηκαν υποδείγματα (όγκου 5 ml), με ημερήσια συχνότητα, από την ημέρα του εμβολιασμού (μέρα 0) έως την ημέρα λήψης του προς ανίχνευση DA δείγματος (τέλος εκθετικής-αρχή στάσιμης φάσης ανάπτυξης). Τα υποδείγματα μονιμοποιήθηκαν με όξινο διάλυμα Lugol (Andersen & Throndsen 2003) και προσδιορίστηκε η αφθονία των κυττάρων Pseudo-nitzschia (δύο επαναλήψεις). Ακολουθήθηκε η μέθοδος καθίζησης των κυττάρων κατά Utermöhl (1958), σε θαλάμους καθίζησης όγκου 25 ml (Hydro-Bios Apparatebau GmbH, Germany) με ανάστροφο οπτικό μικροσκόπιο Olympus CK30. Η μέτρηση της αφθονίας (σε μεγέθυνση 100x) έγινε είτε με σάρωση του πυθμένα του θαλάμου ή με τη μέθοδο των πεδίων (σε δείγματα με μεγάλες τιμές αφθονίας, > κύτταρα L -1 ). Κατά την εφαρμογή της μεθόδου των πεδίων καταμετρήθηκαν τουλάχιστο 60 πεδία ή 400 κύτταρα ανά μέτρηση. Οι κενές θήκες κυττάρων Pseudo-nitzschia (χωρίς χρώση-κυτόπλασμα) δεν προσμετρήθηκαν στην αφθονία (Fehling et al. 2004b). Τα υποδείγματα εμβολιάστηκαν σε αποστειρωμένες κωνικές φιάλες τύπου Erlenmeyer και όγκου 500 ml, μερικώς πληρωμένες έως τα 450 ml με θρεπτικό μέσο. Διατηρήθηκαν στο θάλαμο καλλιέργειας εφαρμόζοντας τις ίδιες συνθήκες (βλ ), εκτός από την ένταση φωτεινής ακτινοβολίας η οποία ρυθμίστηκε στα 98 μmol m -2 s -1. Αυτή είναι η συνιστώμενη ένταση (~100 μmol m -2 s -1 ) για αποφυγή του ενδεχόμενου περιορισμού της αύξησης ή της παραγωγής τοξινών, λόγω φωτός (Bates 1998). Από τις καλλιέργειες αυτές λήφθηκαν δείγματα θρεπτικού μέσου (μέσο και κύτταρα) (300 ml). Τοποθετήθηκαν σε πλαστικούς βαθμονομημένους σωλήνες φυγοκέντρησης (50 ml) με 50

65 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ βιδωτό καπάκι (περίπου 35 ml ανά σωλήνα) και συντηρήθηκαν σε συνθήκες κατάψυξης (-20 o C) και σκότους έως τη στιγμή της ανάλυσης. Σε αυτή την περίπτωση, η δειγματοληψία έγινε κατά το τέλος της εκθετικής-αρχή στάσιμης φάσης ανάπτυξης της καλλιέργειας. Σε αυτή τη φάση έχουν παρατηρηθεί οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις DA, τόσο ολικού όσο και διαλυμένου στο μέσο ή ενδοκυτταρικού (Bates et al. 1991, Garrison et al. 1992, Lundholm et al. 1994, Pan et al. 1996, Bates 1998, Adams et al. 2000, Cusack et al. 2002, Fehling et al. 2004b, Moschandreou et al. 2010). Επιπρόσθετα, η λήψη των δειγμάτων έγινε σε σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα από τη δημιουργία της καλλιέργειας (εντός τριών μηνών) ώστε να αποφευχθεί ενδεχόμενη πτώση των επιπέδων παραγωγής DA με την πάροδο του χρόνου (Pan et al. 1998, Bates & Davidovich 2002). Η όλη διαδικασία δειγματοληψίας έγινε σε δύο επαναλήψεις για το κάθε στέλεχος. Ταυτόχρονα με τη λήψη του δείγματος για ανίχνευση DA, λήφθηκαν και υποδείγματα (όγκου 10 ml) με σκοπό τον υπολογισμό της τελικής αφθονίας κυττάρων Pseudo-nitzschia στο προς ανάλυση δείγμα. Τα υποδείγματα αυτά μονιμοποιήθηκαν με όξινο διάλυμα Lugol. Ο προσδιορισμός της αφθονίας των κυττάρων έγινε αυθημερόν και σε δύο επαναλήψεις για τον προσδιορισμό της φάσης ανάπτυξης και τρεις για τη μέτρηση της τελικής αφθονίας. Εφαρμόστηκε η μέθοδος καθίζησης κατά Utermöhl (1958), όπως περιγράφηκε παραπάνω Πειραματική Διαδικασία Διερεύνησης Παραγωγής Τοξινών από Στελέχη Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima Τρία στελέχη του είδους P. pseudodelicatissima, τα (08)8A9, (08)9A1 και (09)9A1 (Πίνακας 2.2), εξετάστηκαν σε συνθήκες μονοκαλλιέργειας στατικού τύπου με σκοπό τη διερεύνηση της παραγωγής DA αλλά και της φάσης ανάπτυξης στην οποία αυτό συμβαίνει. Λήφθηκαν υποδείγματα από τις αρχικές καλλιέργειες των τριών αυτών στελεχών, οι οποίες βρίσκονται στην αρχή ή στη μέση της εκθετικής φάσης ανάπτυξής τους ώστε να αποφευχθεί το ενδεχόμενο μεταφοράς τοξινών. Αυτά εμβολιάστηκαν σε αποστειρωμένες κωνικές φιάλες τύπου Erlenmeyer και όγκου 5 L. Οι φιάλες ήταν μερικώς πληρωμένες έως τα 4 L με θρεπτικό μέσο L1. Ο όγκος του υποδείγματος που εμβολιάστηκε υπολογίστηκε έτσι ώστε σε κάθε φιάλη η αρχική αφθονία κυττάρων (ημέρα 0) να είναι περίπου κύτταρα ml -1 (μέτρηση αφθονίας στην αρχική καλλιέργεια και αντίστοιχη ρύθμιση όγκου). Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν σε συνθήκες ελεγχόμενης θερμοκρασίας (19±2 C) και έντασης του φωτισμού (98 μmol m -2 s -1 ) και η φωτοπερίοδος ρυθμίστηκε σε εναλλαγή φως/σκοτάδι ανά 12 h. Η πειραματική διαδικασία έγινε σε δύο επαναλήψεις για το κάθε στέλεχος. 51

66 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Η ανάπτυξη των καλλιεργειών μελετήθηκε με περιοδικές δειγματοληψίες θρεπτικού μέσου (10 ml) ανά δύο ημέρες, μονιμοποίησή του με όξινο διάλυμα Lugol, και ακόλουθες μετρήσεις αφθονίας (τρεις επαναλήψεις, σε οπτικό μικροσκόπιο με τη μέθοδο καθίζησης, βλ. Υποκεφάλαιο ). Τα δεδομένα αφθονίας κατά την εκθετική φάση ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό του ρυθμού ανάπτυξης (σε κυτταροδιαιρέσεις ανά ημέρα). Η παραγωγή ολικού DA (κυτταρικό και διαλυμένο στο θρεπτικό μέσο) διερευνήθηκε με λήψη δειγμάτων μέσου (300 ml) ανά 3 4 ημέρες. Αυτά τοποθετήθηκαν σε πλαστικούς διαβαθμισμένους σωλήνες φυγοκέντρησης (50 ml, με βιδωτό καπάκι) και συντηρήθηκαν σε συνθήκες κατάψυξης (-20 C) και σκότους έως τη στιγμή της ανάλυσης με HPLC-UV-DAD. Για τον έλεγχο της σύγκρισης μεταξύ των μετρούμενων συγκεντρώσεων DA για κάθε στέλεχος εφαρμόστηκε η ανάλυση της διασποράς (ANOVA) και η δοκιμασία t-test (στατιστικό πακέτο SPSS version 15.0) Επεξεργασία-Εκχύλιση Δειγμάτων Η επεξεργασία-εκχύλιση των δειγμάτων (θρεπτικό μέσο και κύτταρα), τα οποία τοποθετήθηκαν σε ένα αριθμό πλαστικών σωλήνων φυγοκέντρησης, έγινε με την εξής διαδικασία: 1. Τα προς ανάλυση δείγματα (αποθηκευμένα σε συνθήκες κατάψυξης), αφέθηκαν για λίγες ώρες να αποψυχθούν σε θερμοκρασία δωματίου (23-24 C). 2. Ανάδευση (σε vortex) για 5 min στην υψηλότερη ταχύτητα. 3. Εκχύλιση με υπέρηχους για 5 10 min (σε συσκευή Vibra Cell, VCX 500, Sonics & Materials, Inc., USA) σε πάγο. 4. Φυγοκέντρηση για 10 min στις rpm στους 4 ο C (σε ψυχόμενη φυγόκεντρο τύπου 4K15C, Sigma-Aldrich Inc., USA). 5. Μεταφορά του υπερκείμενου σε γυάλινες σφαιρικές φιάλες (των 250 ml) και εξάτμισή του μέχρι ξηρού υπό κενό σε περιστροφικό εξατμιστήρα (Vacuum Controller V800, BÜCHI Labortechnik GmbH, Germany). 6. Επαναδιάλυση των ξηρών υπολειμμάτων με προσθήκη 6 ml υδατικού διαλύματος μεθανόλης 50% (Merck KGaA, Germany) (διαλύτης εκχύλισης). 52

67 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 7. Διήθηση του διαλύτη εκχύλισης διαμέσου συμβατού με μεθανόλη φίλτρου σύριγγας (διαμέτρου πόρων 0,45 μm, Titan 2 nylon with pre-filter, Sun Sri, Rockwood TN, USA). 8. Τοποθέτηση του διηθήματος σε φιαλίδιο HPLC κατάλληλο για αυτόματο δειγματολήπτη. 9. Αποθήκευση σε συνθήκες κατάψυξης και σκότους έως τη στιγμή της ανάλυσης (εντός 3 4 ημερών) Ανάλυση σε Υγρή Χρωματογραφία Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός και η ανίχνευση του DA έγιναν σε ένα ισοκρατικό σύστημα Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (Waters HPLC-UV-DAD, Alliance 2695 Separations module, Waters Corporation, USA), εξοπλισμένο με απαερωτή, αντλία, αυτόματο δειγματολήπτη, θάλαμο θερμοστάτησης στηλών και ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (UV/DAD, model 996). Η συλλογή των δεδομένων έγινε με το λογισμικό Waters Empower Chromatography Data. Χρησιμοποιήθηκε αναλυτική στήλη αντίστροφης φάσης C18 (με διαστάσεις 150 mm x 4,6 mm και μέγεθος σωματιδίων 4 μm) (Phenomenex Synergi 4u Fusion- RP 80A, Phenomenex, Inc., USA) με προστήλη C18 (Phenomenex SecurityGuard Cartridges Fusion RP, Phenomenex, Inc., USA), και οι δύο στους 40 o C. Ο ρυθμός ροής ήταν 1,3 ml min -1, ενώ η κινητή φάση αποτελείτω από όξινο, με 0,1 % τριφθοροξικό οξύ (Merck KGaA, Germany), και διηθημένο, διαμέσου συμβατού με μεθανόλη ηθμού (διαμέτρου πόρων 0,45 μm, διαμέτρου ηθμού 47 mm, Nylon Membrane Filters, Whatman International Ltd, England), υδατικό ακετονιτρίλιο (Merck KGaA, Germany και Sigma-Aldrich Inc., USA) (ακετονιτρίλιο/νερό 10.2 : 89.8 v/v). Το μέγιστο μήκος κύματος ανίχνευσης ήταν στα 242 nm. Τα δείγματα αναλύθηκαν εις διπλούν με όγκο έγχυσης 40 μl. Ο ποσοτικός προσδιορισμός του DA έγινε με τη χρήση καμπύλης βαθμονόμησης, για τη δημιουργία της οποίας χρησιμοποιήθηκε πιστοποιημένο πρότυπο διάλυμα DA, με πιστοποιημένη συγκέντρωση 99.4 ± 0.8 μg ισοδυνάμων DA [DA + epi-da (C5 -διαστερεομερές του DA)] ml -1 (NRC-CRM-DA-e, Nova Scotia-Canada). Με αραίωση του πιστοποιημένου πρότυπου διαλύματος με υδατικό διάλυμα ακετονιτριλίου (ακετονιτρίλιο/νερό 1 : 9 v/v), δημιουργήθηκε μία σειρά διαλυμάτων βαθμονόμησης με αυξανόμενες συγκεντρώσεις DA, με εύρος από 0,2 έως 24,85 µg ml -1. Για κάθε διαφορετική ημέρα ανάλυσης με HPLC σχεδιάστηκε αντίστοιχη καμπύλη βαθμονόμησης, από επτά διαφορετικές τιμές συγκεντρώσεων. Από αυτή 53

68 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ υπολογίστηκε, με γραμμική παλινδρόμηση, η εξίσωση συσχέτισης των συγκεντρώσεων των εγχεόμενων διαλυμάτων βαθμονόμησης με τα μετρούμενα εμβαδά κορυφών. Η συγκέντρωση του ολικού DA σε δείγματα καλλιεργειών υπολογίστηκε με διαίρεση της μετρούμενης ποσότητας DA με τον αρχικό όγκο του δείγματος (πριν από τη εξάτμιση). Η μετρούμενη ποσότητα DA αφορά στην ποσότητα που μετράται στο συμπυκνωμένο υδατικό διάλυμα μεθανόλης με το οποίο ανακτήθηκε το ξηρό υπόλειμμα από τον εξατμιστήρα (διαλύτης εκχύλισης). Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης της μεθόδου για το συμπυκνωμένο υδατικό διάλυμα μεθανόλης υπολογίστηκαν στα 11 και 37 ng DA ml -1, αντίστοιχα. Τα αντίστοιχα όρια για τα αρχικά δείγματα θρεπτικού μέσου και κυττάρων (αναγωγικά) κυμάνθηκαν από 0,20 έως 0,24 ng ml -1 το όριο ανίχνευσης, και από 0,67 έως 0,82 ng ml -1 το όριο ποσοτικοποίησης. 54

69 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Μορφολογική Ταυτοποίηση Ειδών Pseudo-nitzschia Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας αναγνωρίστηκαν και περιγράφηκαν δώδεκα (12) είδη του γένους Pseudo-nitzschia. Αυτά, κατ αλφαβητική σειρά, είναι τα εξής: P. brasiliana, P. calliantha, P. delicatissima, P. fraudulenta, P. galaxiae, P. mannii, P. multiseries, P. multistriata, P. pseudodelicatissima, P. pungens var. pungens, P. subfraudulenta και P. subpacifica. Επίσης, ανιχνεύτηκαν: ένα στέλεχος το οποίο φέρει σημαντικές ομοιότητες με το είδος P. dolorosa (και στην παρούσα μελέτη χαρακτηρίζεται ως P. cf. dolorosa), δύο στελέχη [τα (07)10A2 ή Pdl2 και (07)10A3] τα οποία κατατάχθηκαν σε έναν μορφότυπο όμοιο με το είδος P. delicatissima και δύο στελέχη [τα (08)9Β2 και (08)9A7] τα οποία κατατάχθηκαν σε έναν μορφότυπο όμοιο με το είδος P. pseudodelicatissima. Οι μορφομετρικοί χαρακτήρες των ειδών και των μορφοτύπων Pseudo-nitzschia που προσδιορίστηκαν στην παρούσα μελέτη δίνονται στον Πίνακα Pseudo-nitzschia brasiliana Lundholm, Hasle et Fryxell Τα κύτταρα αυτού του είδους σχηματίζουν σχετικά μικρές αλυσίδες οι μεγαλύτερες αλυσίδες που παρατηρήθηκαν τόσο σε δείγματα καλλιέργειας όσο και σε δείγματα πεδίου δεν ξεπέρασαν τα πέντε κύτταρα. Πρόκειται για κύτταρα με θήκη γραμμικού έως λογχοειδούς σχήματος, με πλατιά αποστρογγυλεμένα άκρα σε θυριδική όψη (σχεδόν ορθογώνιο σχήμα) (Εικόνα 3.1Α). Σε περιζωνική όψη έχουν σχεδόν γραμμικό σχήμα με ακρότμητα άκρα. Το μήκος της θυρίδας (κορυφαίος άξονας) κυμαίνεται από 25 έως 35 μm και το πλάτος της (εγκάρσιος άξονας) από 2,2 έως 3,2 μm (Πίνακας 3.1, βλ. σελ ). Η σχισμή της ραφής δεν διακόπτεται στη μέση του κορυφαίου άξονα από την παρουσία κεντρικού κόμβου (Εικόνα 3.1Α). Και στα δύο άκρα οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής και οι πολικοί κόμβοι εντοπίζονται κοντά στο περιθώριο της θυρίδας. Οι πυκνότητες των ραβδώσεων της θυρίδας και των περισφίγξεων της ραφής εμφανίζουν όμοιες τιμές (25 29 και σε 10 μm, αντίστοιχα) (Πίνακας 3.1). Οι ραβδώσεις της θυρίδας είναι κάθετα διατεταγμένες κατά μήκος του κορυφαίου άξονα της θυρίδας, εκτός από τους πόλους, όπου διατάσσονται κεκλιμένα (όμοια και στους δύο πόλους) (Εικόνα 3.1Α). Στην επιφάνεια των ραβδώσεων διακρίνονται δύο σειρές πυκνά διατεταγμένων ποροειδών (7 9 σε 1 μm) (Πίνακας 3.1). Οι σειρές αυτές εντοπίζονται πλησίον των διαραβδωσιακών ζωνών, αν και 55

70 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ περιστασιακά είναι δυνατό να παρατηρηθούν ποροειδή και μεταξύ των δύο αυτών σειρών (Εικόνα 3.1Β). Η ράβδωση του εγγύς μανδύα είναι περιστασιακά ευθυγραμμισμένη με τη ράβδωση της επιφάνειας της θυρίδας (συνήθως στο κεντρικό τμήμα της θυρίδας) (Εικόνα 3.1Β). Αντίθετα, η ράβδωση του άπω μανδύα είναι απόλυτα ευθυγραμμισμένη. Και στους δύο πάντως παρατηρούνται δύο σειρές με ένα (σπάνια δεύτερο) ποροειδές κατά τον εγκάρσιο άξονα. Η μεμβράνη των ποροειδών έχει υμενώδη δομή (Εικόνα 3.1Γ). Εικόνα 3.1. Pseudo-nitzschia brasiliana, κύτταρα από καλλιέργεια σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδα ενός κυττάρου. (Β) Κεντρικό τμήμα μιας θυρίδας, όπου φαίνεται η δομή της. (Γ) Τμήμα μιας θυρίδας σε μεγέθυνση, όπου διακρίνεται η δομή των ποροειδών. (Δ) Τμήμα της 1 ης ταινίας του περιζωνίου (VC). (Ε) Τμήμα της 2 ης (II) και 3 ης (III) ταινίας του περιζωνίου. Κλίμακα: 5 μm (Α), 1 μm (Β), και 0,2 μm (Γ-Ε). Figure 3.1. Pseudo-nitzschia brasiliana, culture specimens in TEM. (Α) Whole valve. (Β) Detail of the central area of the valve, showing the valve structure. (Γ) Detail of the valve, showing poroids structure. (Δ) Detail of the valvocopula (VC). (Ε) Detail of the 2 nd (II) and 3 rd (III) cingular band. Scale bar: 5 μm (Α), 1 μm (Β) and 0.2 μm (Γ-Ε). Το περιζώνιο αποτελείται από τρείς ταινίες οι οποίες πλαισιώνονται από συνεχή (μηδιάτρητα) περιθώρια (Εικόνα 3.1Δ, Ε). Το πλάτος των ταινιών ελαττώνεται κατά το διαθυριδικό άξονα, ενώ των περιθωρίων αυξάνεται. Η 1 η ταινία αποτελείται από μία σειρά ποροειδών (46 50 ραβδώσεις σε 10 μm) (Πίνακας 3.1). Το σχήμα τους είναι ακανόνιστο και η δομή τους υμενώδης (Εικόνα 3.1Δ). Η 2 η ταινία έχει παρόμοια δομή με την 1 η, ωστόσο τα ποροειδή της είναι μικρότερα σε μέγεθος (το μισό ή και λιγότερο). Η 3 η ταινία είναι συνεχής (Εικόνα 3.1Ε). 56

71 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Pseudo-nitzschia calliantha Lundholm, Moestrup et Hasle Κύτταρα με θήκη γραμμικού σχήματος τόσο σε θυριδική (Εικόνα 3.2Α) όσο και σε περιζωνική όψη. Το μήκος της θυρίδας κυμαίνεται από 56 έως 95 μm και το πλάτος της από 1,4 έως 1,9 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής διακόπτεται από τον κεντρικό κόμβο, στη μέση του κορυφαίου άξονα,. Ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος που σχηματίζεται αντιστοιχεί σε 4 6 ραβδώσεις της θυρίδας. Και στα δύο άκρα, οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής και οι πολικοί κόμβοι εντοπίζονται στο μέσο περίπου της επιφάνειας της θυρίδας. Α Β Γ Δ Εικόνα 3.2. Pseudo-nitzschia calliantha, κύτταρα από καλλιέργεια (Α, Β, Δ) και από δείγματα πεδίου (Γ) σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδα ενός κυττάρου. (Β) Τμήμα της θυρίδας, όπου φαίνεται η δομή της θυρίδας και των ποροειδών. (Γ) Τμήμα της θυρίδας και της 1ης ταινίας του περιζωνίου (VC), όπου διακρίνεται η ιδιαίτερη δομή της 1ης ταινίας του περιζωνίου, με 2 3 σειρές 6 8 ποροειδών κατά το διαθυριδικό άξονα. (Δ) Τμήμα της 1ης ταινίας του περιζωνίου (VC), με 2 3 σειρές 4 5 ποροειδών κατά το διαθυριδικό άξονα, και της 2ης ταινίας του περιζωνίου (II). Κλίμακα: 5 μm (Α) και 1 μm (Β-Δ). Figure 3.2. Pseudo-nitzschia calliantha, culture (Α, Β, Δ) and field sample (Γ) specimens in TEM. (Α) Whole valve. (Β) Portion of the valve, showing the valve and the poroids structure. (Γ) Detail of the valve and the valvocopula (VC), showing an aberrant valvocopula structure, with 2 3 rows of 6 8 poroids in the pervalvar direction. (Δ) Detail of the valvocopula (VC), with 2 3 rows of 4 5 poroids in the pervalvar direction, and the 2nd cingular band (II). Scale bar: 5 μm (Α) and 1 μm (Β-Δ). Ο αριθμός των ραβδώσεων της θυρίδας (34 42 σε 10 μm) αντιστοιχεί σε σχεδόν διπλάσιο αριθμό περισφίγξεων της ραφής (18 23 σε 10 μm) (Πίνακας 3.1). Στις επιφάνειες των ραβδώσεων υπάρχει μόνο μία σειρά ποροειδών, κυκλικού έως τετραγωνικού σχήματος (4 7 ποροειδή σε 1 μm) (Εικόνα 3.2Β) (Πίνακας 3.1). Η διαγράμμιση της θυρίδας τερματίζεται πριν από τις κορυφαίες απολήξεις της ραφής και στους δύο πόλους. Η ράβδωση του εγγύς μανδύα είναι περιστασιακά ευθυγραμμισμένη με τη ράβδωση της επιφάνειας της θυρίδας (συνήθως στο κεντρικό τμήμα της θυρίδας) (Εικόνα 3.2Β), ενώ η ράβδωση του άπω μανδύα είναι απόλυτα 57

72 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ευθυγραμμισμένη. Και στους δύο παρατηρείται μία σειρά ποροειδών, τα οποία συνήθως είναι επιμηκυσμένα ως προς τον εγκάρσιο άξονα (περισσότερο αυτά του εγγύς μανδύα). Η μεμβράνη των ποροειδών αποτελείται από 3 11 διάτρητες περιοχές (6,2 ± 0,6), οι οποίοι εντοπίζονται στην περιφέρεια των ποροειδών. Στο κεντρικό τμήμα των ποροειδών είναι πιθανόν να υπάρχει μία διάτρητη περιοχή, σε ποσοστά που κυμαίνονται από 14,5 έως 64,7% (36,8 ± 13,6%). Το περιζώνιο αποτελείται από τρεις ταινίες που φέρουν ραβδώσεις και πλαισιώνονται από συνεχή περιθώρια. Το πλάτος των ταινιών ελαττώνεται κατά το διαθυριδικό άξονα, ενώ των περιθωρίων αυξάνεται. Οι ταινίες της ζώνης αριθμούν όλες δύο σειρές ποροειδών κατά τον κορυφαίο άξονα (συχνά παρατηρούνται και ποροειδή ενδιάμεσα των δύο σειρών). Κατά το διαθυριδικό άξονα παρατηρούνται 4 5 (1 η ταινία), 3 4 (2 η ταινία) και 2 3 (3 η ταινία) ποροειδή. Η πρώτη ταινία αριθμεί ραβδώσεις σε 10 μm (Εικόνα 3.2Δ) (Πίνακας 3.1). Ωστόσο, σε κάποια δείγματα πεδίου παρατηρήθηκαν θήκες κυττάρων με ελαφρά διαφορετική δομή της 1 ης ταινίας. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκαν ταινίες με δύο έως τρεις σειρές ποροειδών (κορυφαίο άξονα) που αριθμούσαν 6 8 ποροειδή κατά το διαθυριδικό άξονα (Εικόνα 3.2Γ) Pseudo-nitzschia delicatissima (Cleve) Heiden Κύτταρα με θήκη γραμμικού έως λογχοειδούς σχήματος σε θυριδική όψη (Εικόνα 3.3Α) και λογχοειδούς σχήματος σε περιζωνική όψη. Το μήκος της θυρίδας κυμαίνεται μεταξύ μm και το πλάτος της μεταξύ 1,3 1,8 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής διακόπτεται, στη μέση περίπου του κορυφαίου άξονα, από τον κεντρικό κόμβο. Ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος που σχηματίζεται αντιστοιχεί σε 4 6 ραβδώσεις της θυρίδας. Και στα δύο άκρα, η σχισμή της ραφής καταλήγει στην περιοχή μεταξύ του μέσου της επιφάνειας και του περιθωρίου της θυρίδας. Ο αριθμός των περισφίγξεων της ραφής και των ραβδώσεων της θυρίδας κυμαίνονται στα και σε 10 μm, αντίστοιχα (Πίνακας 3.1). Στις επιφάνειες των ραβδώσεων παρατηρούνται δύο σειρές πυκνά διατεταγμένων ποροειδών (6 11 ποροειδή σε 1 μm, κατά τον εγκάρσιο άξονα) (Πίνακας 3.1), οι οποίες εντοπίζονται πλησίον των διαραβδωσιακών ζωνών (Εικόνα 3.3Β). Οι ραβδώσεις της θυρίδας εμφανίζουν κεκλιμένη διάταξη προς τους πόλους και τερματίζονται πριν από τις κορυφαίες απολήξεις της ραφής. Και στους δύο πόλους παρατηρείται όμοια, ή σχεδόν όμοια, δομή. Η ράβδωση του άπω μανδύα είναι ευθυγραμμισμένη με τη ράβδωση της επιφάνειας της θυρίδας κάτι το οποίο δεν απαντάται στον εγγύς μανδύα. Και οι 58

73 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ δύο, ωστόσο, διακρίνονται από μία σειρά ποροειδών κατά τον εγκάρσιο άξονα. Η μεμβράνη των ποροειδών είναι υμενώδης. Α Β Γ Εικόνα 3.3. Pseudo-nitzschia delicatissima, κύτταρα από καλλιέργεια σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδες κυττάρων. (Β) Τμήμα της θυρίδας, όπου φαίνεται η δομή της θυρίδας και των ποροειδών. (Γ) Τμήμα του περιζωνίου, όπου διακρίνονται η 1η (VC), η 2η (II) και η 3η (III) ταινία. Κλίμακα: 10 μm (Α) και 1 μm (Β και Γ). Figure 3.3. Pseudo-nitzschia delicatissima, culture specimens in TEM. (Α) Whole valves. (Β) Portion of the valve, showing the valve and the poroids structure. (Γ) Portion of the cingulum, with valvocopula (VC), 2nd (II) and 3rd (III) cingular bands. Scale bar: 10 μm (Α) and 1 μm (Β and Γ). Το περιζώνιο αποτελείται από τρεις ταινίες (Εικόνα 3.3Γ). Η 1η ταινία αποτελείται από μία σειρά ποροειδών (43 51 ραβδώσεις σε 10 μm) (Πίνακας 3.1), και πλαισιώνεται από συνεχές περιθώριο. Τα ποροειδή έχουν υμενώδη δομή και διαιρούνται σε 2 3 μικρότερες περιοχές. Στη 2η και η 3η ταινία απαντάται μια περισσότερο πυκνά πυριτιωμένη, διαμήκη γραμμή, η οποία τις διαχωρίζει σε δύο ήμισυ. Η 2η ταινία εμφανίζει δομή όμοια με της 1ης ταινίας στο εγγύς της θυρίδας ήμισυ. Το απώτερο της θυρίδας ήμισυ έχει συνεχή δομή, αν και στην επιφάνειά του συχνά απαντώνται μικροσκοπικές αμυδρά ορατές οπές/ faintly ornamented small perforations. Η 3η ταινία έχει συνεχή δομή και στα δύο ήμισυ Μορφότυπος Pseudo-nitzschia cf. delicatissima Κύτταρα με θήκη λογχοειδούς σχήματος σε θυριδική (περισσότερο έντονο λογχοειδές σχήμα σε σχέση με το P. delicatissima, ελαφρά ασύμμετρες ως προς τον κορυφαίο άξονα) (Εικόνα 3.4Α) και περιζωνική όψη. Το μήκος της θυρίδας κυμαίνεται μεταξύ μm και το πλάτος της μεταξύ 1,7 2,1 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής διακόπτεται από τον κεντρικό κόμβο, στη μέση περίπου του κορυφαίου άξονα. Ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος που 59

74 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ σχηματίζεται αντιστοιχεί σε 4 7 ραβδώσεις. Και στα δύο άκρα, η σχισμή της ραφής καταλήγει στην περιοχή ανάμεσα από το μέσο της επιφάνειας και το περιθώριο της θυρίδας. Α Β Γ Εικόνα 3.4. Pseudo-nitzschia cf. delicatissima μορφότυπος, κύτταρα από καλλιέργεια σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδες κυττάρων. (Β) Τμήμα της θυρίδας, όπου φαίνεται η δομή της θυρίδας και των ποροειδών ποροειδή διατεταγμένα σε δύο αντικριστές σειρές (σε κύκλο) και με τάση ομαδοποίησης ανά δύο ή τρία (βέλη). (Γ) Τμήμα του περιζωνίου, όπου διακρίνονται η 1 η (VC), η 2 η (II) και η 3 η (III) ταινία, και πιθανόν και μία 4 η (?). Κλίμακα: 10 μm (Α) και 1 μm (Β και Γ). Figure 3.4. Pseudo-nitzschia cf. delicatissima morphotype, culture specimens in TEM. (Α) Whole valves. (Β) Portion of the valve, showing valve and poroids structure; poroids arranged into two opposite rows (circled) and poroids with a tendency to cluster (2 3 poroids) (arrows). (Γ) Portion of the cingulum, with valvocopula (VC), 2 nd (II) and 3 rd (III) cingular bands, with possibly a 4 th one (?) one. Scale bar: 10 μm (Α) and 1 μm (Β and Γ). Ο αριθμός των περισφίγξεων της ραφής και των ραβδώσεων της θυρίδας κυμαίνεται στα και σε 10 μm, αντίστοιχα (Πίνακας 3.1). Στις επιφάνειες των ραβδώσεων παρατηρούνται δύο αντικριστές σειρές ποροειδών, οι οποίες εντοπίζονται πλησίον των διαραβδωσιακών ζωνών (Εικόνα 3.4Β). Τα ποροειδή είναι πυκνά διατεταγμένα και συνήθως τοποθετημένα το ένα απέναντι από το άλλο (Εικόνα 3.4Β, σε κύκλο) η πυκνότητά τους φτάνει τα 6 11 ποροειδή σε 1 μm (Πίνακας 3.1). Ωστόσο, σε ορισμένα τμήματα της επιφάνειας της θυρίδας (συνήθως πλησίον της ραφής και του απώτερου μανδύα) τα ποροειδή εμφανίζουν μια τάση ομαδοποίησης ανά δύο ή τρία (Εικόνα 3.4Β, βέλη). Δίνεται έτσι η εικόνα ενός ποροειδούς με μεγάλο μέγεθος, το οποίο διαιρείται σε 2 3 διάτρητες περιοχές. Οι ραβδώσεις της θυρίδας εμφανίζουν κεκλιμένη διάταξη προς τους πόλους και τερματίζονται πριν από τις κορυφαίες απολήξεις της ραφής. Σχεδόν όμοια δομή παρατηρείται και στους δύο πόλους. Η ράβδωση του άπω μανδύα είναι ευθυγραμμισμένη με τη αυτή της επιφάνειας της θυρίδας. Κάτι αντίστοιχο 60

75 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ απαντάται μόνο περιστασιακά στον εγγύς μανδύα. Και οι δύο, ωστόσο, αποτελούνται από μία σειρά ποροειδών κατά τον εγκάρσιο άξονα. Η μεμβράνη των ποροειδών είναι υμενώδης. Το περιζώνιο αποτελείται από τρεις ταινίες (Εικόνα 3.4Γ). Η 1 η ταινία αποτελείται από μία σειρά ποροειδών (43 45 ραβδώσεις σε 10 μm) (Πίνακας 3.1) και πλαισιώνεται από συνεχές περιθώριο. Τα ποροειδή διαιρούνται σε 3 5 διάτρητες περιοχές. Η 2 η και η 3 η ταινία διαιρούνται από μια περισσότερο πυκνά πυριτιωμένη διαμήκη γραμμή, η οποία τις διαχωρίζει σε δύο ήμισυ. Στη 2 η ταινία, το εγγύς της θυρίδας ήμισυ αποτελείται από μία σειρά ποροειδών που συνήθως διαιρούνται σε δύο διάτρητες περιοχές. Στο απώτερο ήμισυ απαντώνται διάτρητες περιοχές, επιμήκεις κατά το διαθυριδικό άξονα, μεταξύ των οποίων παρεμβάλλονται πυριτικές λωρίδες. Η 3 η ταινία, εμφανίζει στο εγγύς της θυρίδας ήμισυ, δομή όμοια με αυτή του αντίστοιχου ημίσεος της 2 ης ταινίας, ενώ το απώτερο ήμισυ είναι συνεχές, αν και περιστασιακά παρατηρούνται σε αυτό μικρές αμυδρά ορατές οπές. Παρατηρήθηκε επίσης μία επιπλέον πολύ λεπτή ταινία, με συνεχή δομή, η οποία όμως δεν κατέστη ξεκάθαρο αν αποτελεί μία τέταρτη ταινία ή τμήμα του περιθωρίου της 3 ης ταινίας Pseudo-nitzschia fraudulenta (Cleve) Hasle Κύτταρα με θήκη λογχοειδούς σχήματος σε θυριδική όψη (Εικόνα 3.5Α) και γραμμικού έως λογχοειδούς σε περιζωνική όψη. Τα πλευρικά περιγράμματα της θυρίδας είναι παράλληλα μόνο στο κεντρικό τμήμα και σταδιακά συγκλίνουν καταλήγοντας σε αποστρογγυλεμένα άκρα. Το μήκος της θυρίδας κυμαίνεται από 48 έως 80 μm και το πλάτος της από 4,2 έως 5,8 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής διακόπτεται στη μέση περίπου του κορυφαίου άξονα από τον κεντρικό κόμβο. O κεντρικός ενδιάμεσος χώρος αντιστοιχεί σε 4 5 ραβδώσεις. Στον ένα πόλο της θυρίδας οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής και οι πολικοί κόμβοι απαντώνται κοντά στο περιθώριο της θυρίδας. Αντίθετα, στον άλλο πόλο εντοπίζονται σχεδόν στο μέσο της επιφάνειας της θυρίδας. Η πυκνότητα των περισφίγξεων της ραφής εμφανίζει ίδιο εύρος τιμών με αυτή των ραβδώσεων της θυρίδας (21 24 σε 10 μm) (Πίνακας 3.1). Στην επιφάνεια των ραβδώσεων διακρίνονται δύο σειρές ποροειδών (Εικόνα 3.5Β), τα οποία αριθμούν 5 6 ποροειδή σε μήκος 1 μm κατά τον εγκάρσιο άξονα (Πίνακας 3.1). Τα ποροειδή καλύπτουν το μεγαλύτερο τμήμα της επιφάνειας των ραβδώσεων και έχουν σχήμα ωοειδές έως δακρύμορφο. Περιστασιακά, παρατηρούνται ποροειδή ανάμεσα από τις δύο σειρές σχηματίζοντας μία τρίτη ημιτελή σειρά ποροειδών. Στον ένα πόλο της θυρίδας (όπου η σχισμή της ραφής καταλήγει κοντά στο 61

76 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ περιθώριο της θυρίδας) παρατηρούνται μια ή δύο λοξές σειρές ποροειδών. Στον άλλο πόλο (όπου οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής εντοπίζονται σχεδόν στο μέσο της επιφάνειας της θυρίδας) οι λοξές σειρές ποροειδών απουσιάζουν. Ο εγγύς μανδύας της θυρίδας αντιστοιχεί σε δύο σειρές με ένα ή δύο ποροειδή κατά τον εγκάρσιο άξονα (Εικόνα 3.5Β). Η ράβδωσή του είναι περιστασιακά ευθυγραμμισμένη με τη ράβδωση της επιφάνειας της θυρίδας (συνήθως σε τμήματα της κεντρικής περιοχής). Η ράβδωση του άπω μανδύα είναι απόλυτα ευθυγραμμισμένη με αυτή της επιφάνειας της θυρίδας και αποτελείται από δύο σειρές με ένα (σπάνια δύο) ποροειδές κατά τον εγκάρσιο άξονα. Η μεμβράνη των ποροειδών αποτελείται από ένα κεντρικό μη-διάτρητο τμήμα με 3 6 διακλαδώσεις προς την περιφέρεια (αστερόμορφο). Ανάμεσά τους υπάρχουν υμενώδεις περιοχές. Α Β Γ Εικόνα 3.5. Pseudo-nitzschia fraudulenta, κύτταρα από καλλιέργεια σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδες κύτταρων. (Β) Τμήμα της θυρίδας, όπου διακρίνεται ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος και η δομή της θυρίδας και των ποροειδών. (Γ) Τμήμα του περιζωνίου, όπου φαίνονται η 1 η (VC), η 2 η (II) και μία ασαφής 3 η (III) (με συνεχή δομή) ταινία. Κλίμακα: 5 μm (Α) και 0,5 μm (Β και Γ). Figure 3.5. Pseudo-nitzschia fraudulenta, culture specimens in TEM. (Α) Whole valve. (Β) Portion of the valve, showing the central interspace and the valve and poroids structure. (Γ) Portion of the cingulum, with valvocopula (VC), 2 nd (II) cingular band and a vague unperforated 3 rd (III) band. Scale bar: 5 μm (Α) and 0.5 μm (Β and Γ). 62

77 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το περιζώνιο αποτελείται από δύο διακοσμημένες ταινίες (1 η και 2 η ) και πιθανότατα δύο ακόμη στενά συνδεδεμένες ταινίες με συνεχή δομή (Εικόνα 3.5Γ). Η 1 η ταινία αποτελείται από 2 3 σειρές που αριθμούν 6 8 ποροειδή κατά τον διαθυριδικό άξονα. Η πυκνότητα των ραβδώσεων της 1 ης ταινίας κυμαίνεται στις σε 10 μm (Πίνακας 3.1). Η 2 η ταινία αποτελείται από μία σειρά μεγάλου μεγέθους ποροειδών. Το σχήμα τους είναι ακανόνιστο και η δομή τους υμενώδης. Στις θήκες κάποιων κυττάρων παρατηρήθηκαν μόνο η 1 η ταινία και ένας ασαφής αριθμός (1 3) από στενά συνδεδεμένες συνεχείς ταινίες Pseudo-nitzschia galaxiae Lundholm et Moestrup Τα κύτταρα αυτού του είδους συνήθως απαντώνται ως μονήρη. Ωστόσο, σχηματίζουν και σχετικά μικρές αλυσίδες οι μεγαλύτερες αλυσίδες αυτού του είδους που παρατηρήθηκαν τόσο σε δείγματα καλλιέργειας όσο και σε δείγματα πεδίου δεν ξεπέρασαν τα οκτώ κύτταρα. Η θήκη των κυττάρων του είδους είναι ασθενώς πυριτιωμένη σε σχέση με τα λοιπά είδη Pseudonitzschia. Σε θυριδική και περιζωνική όψη εμφανίζουν ένα χαρακτηριστικό λογχοειδές σχήμα στο κεντρικό τμήμα φέρουν μία διόγκωση και στενεύουν απότομα διαμορφώνοντας ραμφοειδούς σχήματος άκρα (Εικόνα 3.6Α). Το μήκος της θυρίδας κυμαίνεται από 18 έως 50 μm και το πλάτος της από 1,1 έως 1,8 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής διακόπτεται από τον κεντρικό κόμβο, στη μέση περίπου του κορυφαίου άξονα (Εικόνα 3.6Β). Ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος αντιστοιχεί σε 7 13 ραβδώσεις. Οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής και οι πολικοί κόμβοι εντοπίζονται σχεδόν στο μέσο της επιφάνειας της θυρίδας. Ο αριθμός των ραβδώσεων της θυρίδας (55 70 σε 10 μm) είναι σχεδόν τριπλάσιος του αντίστοιχου αριθμού των περισφίγξεων της ραφής (17 28 σε 10 μm) (Πίνακας 3.1). Στην επιφάνεια των ραβδώσεων δεν διακρίνονται ποροειδή, αλλά μικροσκοπικοί πόροι ποικίλου μεγέθους και αριθμού (Εικόνα 3.6Β, Γ). Συνήθως εμφανίζουν μεγαλύτερη πυκνότητα πλησίον των διαραβδωσιακών ζωνών, ενώ εντοπίζονται ακόμη και στο κανάλι της ραφής (Εικόνα 3.6Γ). Η διαγράμμιση της θυρίδας τερματίζεται πριν από τις κορυφαίες απολήξεις της ραφής, αν και δύσκολα γίνεται αντιληπτή εξαιτίας του πολύ μικρού πλάτους της επιφάνειας της θυρίδας και της ασθενούς πυριτίωσης. Για τους ίδιους λόγους, οι μανδύες δίνουν την εντύπωση ότι δεν εμφανίζουν ράβδωση προς τα πόλους της θυρίδας. Η ράβδωση και των δύο μανδυών είναι στοιχισμένη με αυτή της επιφάνειας της θυρίδας. 63

78 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α Β Γ Δ Εικόνα 3.6. Pseudo-nitzschia galaxiae, κύτταρα από καλλιέργεια σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδα ενός κυττάρου. (Β) Κεντρικό τμήμα μίας θυρίδας, όπου διακρίνεται ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος και η δομή της θυρίδας. (Γ) Τμήμα της θυρίδας, όπου φαίνεται η δομή των μικροσκοπικών πόρων. (Δ) Τμήμα του περιζωνίου, όπου διακρίνονται ο σύνδεσμος της θυρίδας (1 η ταινία του περιζωνίου) (VC), οι δύο σύνδεσμοι (C) και η πλευρά (P). Κλίμακα: 5 μm (Α), 1 μm (Β) και 0,5 μm (Γ και Δ). Figure 3.6. Pseudo-nitzschia galaxiae, culture specimens in TEM. (Α) Whole valve. (Β) Central part of the valve, showing the central interspace and valve structure. (Γ) Portion of the valve, showing the minute pores structure. (Δ) Portion of the cingulum, with valvocopula (VC), two copulae (C) and one pleura (P). Scale bar: 5 μm (Α), 1 μm (Β) and 0.5 μm (Γ and Δ). Το περιζώνιο αποτελείται από τέσσερεις ταινίες (Εικόνα 3.6Δ). Όλες διαιρούνται από μια περισσότερο πυκνά πυριτιωμένη διαμήκη γραμμή σε δύο ήμισυ. Στην 1 η ταινία (σύνδεσμος θυρίδας), το εγγύς της θυρίδας ήμισυ εμφανίζει ραβδώσεις με δομή όμοια της θυρίδας (αριθμώντας ραβδώσεις σε 10 μm) (Πίνακας 3.1). Το απώτερο ήμισυ έχει συνεχή δομή με μικρές διάσπαρτες οπές. Η 2 η και η 3 η ταινία (σύνδεσμοι) εμφανίζουν, και στα δύο ήμισυ, συνεχή δομή με μικρές διάσπαρτες οπές. Η 4 η ταινία (πλευρά) διαιρείται σε δύο άνισα τμήματα. Το μεγαλύτερο και εγγύς της θυρίδας τμήμα αποτελείται από κάθετες λεπτοφυείς πυριτικές λωρίδες ακανόνιστου προτύπου. Το μικρότερο και απώτερο τμήμα της θυρίδας, εμφανίζει παρόμοια δομή. Σε αρκετές περιπτώσεις, παρατηρήθηκε σε κάποιες θήκες περιζώνιο το οποίο αποτελείτω από τρεις ταινίες μόνο, χωρίς 4 η ταινία (πλευρά) Pseudo-nitzschia mannii Amato et Montresor Κύτταρα με θήκη γραμμικού σχήματος σε θυριδική (Εικόνα 3.7Α) και περιζωνική όψη. Το μήκος της θυρίδας κυμαίνεται από 53 έως 93 μm και το πλάτος της από 1,5 έως 2,1 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής διακόπτεται, στη μέση περίπου του κορυφαίου άξονα, από 64

79 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ τον κεντρικό κόμβο (Εικόνα 3.7Β) και ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος που σχηματίζεται αντιστοιχεί σε 4 5 ραβδώσεις. Οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής και οι πολικοί κόμβοι εντοπίζονται στο μέσο περίπου της επιφάνειας της θυρίδας. Στη ραφή εντοπίζονται περισφίξεις σε 10 μm και στην επιφάνεια της θυρίδας ραβδώσεις σε 10 μm (Πίνακας 3.1). Στις επιφάνειες των ραβδώσεων υπάρχει μόνο μία σειρά ποροειδών, κυκλικού έως τετραγωνικού σχήματος (4 7 ποροειδή σε 1 μm) (Εικόνα 3.7Β, Γ) (Πίνακας 3.1). Και στους δύο πόλους, η διαγράμμιση της θυρίδας τερματίζεται πριν από τις κορυφαίες απολήξεις της ραφής. Η ράβδωση του εγγύς μανδύα είναι περιστασιακά ευθυγραμμισμένη με τη ράβδωση της επιφάνειας της θυρίδας (ιδίως πλησίον της κεντρικής περιοχής) (Εικόνα 3.7Β), ενώ η ράβδωση του άπω μανδύα είναι απόλυτα ευθυγραμμισμένη. Και στους δύο μανδύες παρατηρείται μία σειρά ποροειδών, τα οποία είναι συνήθως επιμηκυσμένα ως προς τον εγκάρσιο άξονα, ιδιαίτερα στον εγγύς μανδύα. Η μεμβράνη των ποροειδών αποτελείται από ένα κεντρικό διάτρητο ή μη τμήμα, το οποίο περιφερειακά περιβάλλεται από 2 7 (3,2 ± 0,6) διάτρητες περιοχές (Εικόνα 3.7Β, Γ). Το ποσοστό των ποροειδών που φέρουν μία κεντρικά τοποθετημένη διάτρητη περιοχή (βέλη, Εικόνα 3.7Β) κυμάνθηκε από 2,8 έως 7,1% (5,1 ± 1,3%). Α Β Γ Δ Figure 3.7. Pseudo-nitzschia mannii, κύτταρα από καλλιέργεια σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδα ενός κυττάρου. (Β) Κεντρικό τμήμα της θυρίδας, όπου διακρίνονται ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος και η δομή της θυρίδας ποροειδή που φέρουν μία κεντρικά τοποθετημένη διάτρητη περιοχή υποδεικνύονται με βέλος. (Γ) Τμήμα της θυρίδας σε μεγέθυνση, όπου φαίνεται η δομή των ποροειδών. (Δ) Τμήμα του περιζωνίου, όπου φαίνονται η 1 η (VC), η 2 η (II) και η 3 η (III) ταινία. Κλίμακα: 10 μm (Α), 1 μm (Β) και 0,5 μm (Γ και Δ). Figure 3.7. Pseudo-nitzschia mannii, culture specimens in TEM. (Α) Whole valve. (Β) Portion of the valve, showing central interspace and valve structure; poroids possessing a centrally located perforated sector are indicated by arrows. (Γ) Detail of the valve, showing poroids structure. (Δ) Portion of the cingulum, with valvocopula (VC), 2 nd (II) and 3 rd (III) cingular bands. Scale bar: 10 μm (Α), 1 μm (Β) and 0.5 μm (Γ and Δ). 65

80 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το περιζώνιο αποτελείται από τρεις ταινίες που φέρουν ραβδώσεις και πλαισιώνονται από συνεχή περιθώρια (Εικόνα 3.7Δ). Το πλάτος των ταινιών ελαττώνεται κατά το διαθυριδικό άξονα, ενώ των περιθωρίων αυξάνεται. Οι ταινίες της ζώνης αποτελούνται όλες από δύο σειρές ποροειδών με 3 4 (1 η ταινία) και 2 3 (2 η και 3 η ταινία) ποροειδή κατά το διαθυριδικό άξονα. Η 1 η ταινία αριθμεί ραβδώσεις σε 10 μm (Πίνακας 3.1) Pseudo-nitzschia multiseries (Hasle) Hasle Κύτταρα με θήκη γραμμικού έως λογχοειδούς σχήματος σε θυριδική όψη και λογχοειδούς σχήματος σε περιζωνική όψη. Το μήκος της θυρίδας κυμαίνεται από 71 έως 85 μm και το πλάτος της από 3,3 έως 3,5 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής δεν διακόπτεται στο κεντρικό της τμήμα με την παρεμβολή ενός κεντρικού κόμβου. Α Β Εικόνα 3.8. Pseudo-nitzschia multiseries, κύτταρα από δείγματα πεδίου σε ΗΜΔ. (Α) Κεντρικό τμήμα μίας θυρίδας, όπου φαίνεται η δομή της. (Β) Τμήμα της θυρίδας σε μεγέθυνση, όπου διακρίνονται η δομή της ραφής, των ραβδώσεων της θυρίδας και των ποροειδών. Κλίμακα: 1 μm (Α) και 0,5 μm (Β). Figure 3.8. Pseudo-nitzschia multiseries, field sample specimens in TEM. (Α) Portion of the valve at center, showing valve structure. (Β) Detail of valve, showing raphe, striae and poroids structure. Scale bar: 1 μm (Α) and 0.5 μm (Β). Οι περισφίγξεις της ραφής είναι σχεδόν στοιχισμένες με τις ραβδώσεις της θυρίδας (12 14 σε 10 μm) (Πίνακας 3.1). Στις επιφάνειες των ραβδώσεων παρατηρούνται 3 5 σειρές ποροειδών οι δύο εντοπίζονται πλησίον των διαραβδωσιακών ζωνών και στον ενδιάμεσό τους χώρο 1 3 σειρές (ελαφρά μικρότερων σε μέγεθος ποροειδών) (Εικόνα 3.8Α, Β). Κατά τον εγκάρσιο άξονα εντοπίζονται 4 7 ποροειδή σε μήκος 1 μm (Πίνακας 3.1). Η διάταξη των ραβδώσεων του εγγύς μανδύα είναι περιστασιακά ευθυγραμμισμένη με αυτή της επιφάνειας της 66

81 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ θυρίδας, ενώ η αντίστοιχη διάταξη του άπω μανδύα έχει ίδια δομή με αυτή της επιφάνειας της θυρίδας (Εικόνα 3.8Α). Στους μανδύες της θυρίδας υπάρχουν 2 3 σειρές ποροειδών, οι οποίες αριθμούν έως και τρία ποροειδή κατά τον εγκάρσιο άξονα (Εικόνα 3.8Β). Η μεμβράνη των ποροειδών είναι υμενώδης (Εικόνα 3.8Β). Η δομή του περιζωνίου δεν κατέστη δυνατό να μελετηθεί εξαιτίας του μικρού αριθμού κυττάρων του είδους που εντοπίστηκαν σε δείγματα πεδίου Pseudo-nitzschia multistriata (Takano) Takano Οι θήκες των κυττάρων του είδους είναι ασθενώς πυριτιωμένες. Σε θυριδική όψη, εμφανίζουν γραμμικό έως λογχοειδές σχήμα. Τα πλευρικά περιγράμματα της θυρίδας είναι παράλληλα στην κεντρική περιοχή και για σχεδόν τα ¾ του συνολικού μήκους της θυρίδας, και συγκλίνουν απότομα καταλήγοντας σε αποστρογγυλεμένα άκρα (Εικόνα 3.9Α). Σε περιζωνική όψη, οι πόλοι της θυρίδας εμφανίζουν χαρακτηριστικό σιγμοειδές σχήμα το οποίο προσδίδει στις αλυσίδες κυττάρων ένα κυματοειδές σχήμα, εύκολα διακριτό με ΟΜ. To μήκος της θυρίδας κυμαίνεται από 41 έως 49 μm και το πλάτος της από 2,8 έως 3,6 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής δεν διακόπτεται στο κεντρικό της τμήμα με την παρεμβολή κεντρικού κόμβου. Η ραφή, και στους δύο πόλους, καταλήγει κοντά στο περιθώριο της θυρίδας όπου εντοπίζονται και οι πολικοί κόμβοι. Ο αριθμός των περισφίγξεων της ραφής κυμαίνεται από 24 έως 28 σε 10 μm και των ραβδώσεων της θυρίδας από 38 έως 45 σε 10 μm (Πίνακας 3.1). Στις επιφάνειες των ραβδώσεων διακρίνονται δύο σειρές πυκνά διατεταγμένων ποροειδών (10 12 ποροειδή σε 1 μm) (Εικόνα 3.9Β) (Πίνακας 3.1). Οι δύο σειρές ποροειδών εντοπίζονται πλησίον των διαραβδωσιακών ζωνών. Περιστασιακά απαντώνται ποροειδή και στην ενδιάμεση των δύο σειρών επιφάνεια. Επίσης, συχνά παρατηρείται δύο γειτονικές διαραβδωσιακές ζώνες να συγκλίνουν στην ίδια περίσφιγξη της ραφής (Εικόνα 3.9Β). Οι δομή των ραβδώσεων διαφέρει στους δύο πόλους. Στον ένα διακρίνονται μία ή δύο λοξές σειρές ποροειδών, ενώ στον άλλο δεν παρατηρείται κάτι ανάλογο. Η ράβδωση του άπω μανδύα είναι ευθυγραμμισμένη με αυτή της επιφάνειας της θυρίδας κάτι αντίστοιχο δεν παρατηρείται στον εγγύς μανδύα. Και οι δύο αποτελούνται από δύο σειρές ποροειδών που αριθμούν ένα ή δύο ποροειδή κατά τον εγκάρσιο άξονα. Η μεμβράνη των ποροειδών είναι υμενώδης. 67

82 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α Β Γ Δ Εικόνα 3.9. Pseudo-nitzschia multistriata, κύτταρα από καλλιέργεια σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδα ενός κυττάρου. (Β) Κεντρικό τμήμα μίας θυρίδας, όπου φαίνεται η δομή της. (Γ) Τμήμα του περιζωνίου, όπου διακρίνονται η 1 η (VC), η 2 η (II) και η 3 η (III) ταινία η 2 η ταινία αποτελείται από μία σειρά ποροειδών. (Δ) Τμήμα του περιζωνίου, όπου διακρίνονται η 1 η (VC) και η 2 η ταινία η 2 η ταινία αποτελείται από δύο σειρές ποροειδών. Κλίμακα: 5 μm (Α) και 1 μm (Β Δ). Figure 3.9. Pseudo-nitzschia multistriata, culture specimens in TEM. (Α) Whole valve. (Β) Portion of the valve at center, showing valve structure. (Γ) Portion of the cingulum, with valvocopula (VC), 2 nd (II) cingular band with one row of poroids and 3 rd (III) cingular band. (Δ) Portion of the cingulum, with valvocopula (VC) and 2 nd (II) cingular band with two rows of poroids. Scale bar: 5 μm (Α) and 1 μm (Β Δ). Στο περιζώνιο απαντώνται τρεις ταινίες (Εικόνα 3.9Γ, Δ). Οι δύο πρώτες φέρουν διαγράμμιση και πλαισιώνονται από συνεχή περιθώρια. Το ραβδωτό τμήμα της 1 ης ταινίας απαρτίζεται από δύο σειρές, με 2 3 ποροειδή κατά τον διαθυριδικό άξονα (48 51 ραβδώσεις σε 10 μm) (Πίνακας 3.1). Το ραβδωτό τμήμα της 2 ης ταινίας αποτελείται είτε από μία απλή σειρά ποροειδών (Εικόνα 3.9Γ) ή από δύο σειρές με δύο ποροειδή κατά τον εγκάρσιο άξονα (Εικόνα 3.9Δ). Η τρίτη ταινία είναι συνεχής Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima (Hasle) Hasle emend. Lundholm, Hasle et Moestrup Κύτταρα με θήκη γραμμικού σχήματος σε θυριδική (Εικόνα 3.10Α) και περιζωνική όψη, με μήκος θυρίδας το οποίο εκτείνεται από 49 έως 106 μm και πλάτος από 1,1 έως 2,1 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής διακόπτεται στο κεντρικό της τμήμα με την παρεμβολή ενός κεντρικού κόμβου. Ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος που σχηματίζεται αντιστοιχεί σε

83 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ραβδώσεις. Οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής και οι πολικοί κόμβοι εντοπίζονται στο μέσο περίπου της επιφάνειας της θυρίδας. Ο αριθμός των ραβδώσεων της θυρίδας σε 10 μm κυμαίνεται στα και αυτός των περισφίγξεων της ραφής στα (Πίνακας 3.1). Στις επιφάνειες των ραβδώσεων υπάρχει μόνο μία σειρά ποροειδών, κυκλικού έως τετραγωνικού σχήματος (Εικόνα 3.10Β). Οι ραβδώσεις αριθμούν 5 8 ποροειδή σε 1 μm κατά τον εγκάρσιο άξονα (Πίνακας 3.1). Και στους δύο πόλους, η διαγράμμιση της θυρίδας τερματίζεται πριν από τις κορυφαίες απολήξεις της ραφής. Ο εγγύς μανδύας της θυρίδας φέρει ράβδωση περιστασιακά ευθυγραμμισμένη με τη διαγράμμιση της επιφάνειας της θυρίδας και αποτελείται από μία σειρά ποροειδών, αν και συνήθως στην κεντρική περιοχή παρατηρείται και δεύτερη σειρά ποροειδών κατά τον εγκάρσιο άξονα. Ο άπω μανδύας φέρει μία σειρά ποροειδών (συνήθως επιμηκυσμένη κατά τον εγκάρσιο άξονα στην κεντρική περιοχή) και η ράβδωσή του είναι απόλυτα ευθυγραμμισμένη με αυτή της επιφάνειας της θυρίδας (Εικόνα 3.10Β). Η μεμβράνη των ποροειδών συνήθως διαιρείται σε δύο μεγάλα διάτρητα τμήματα τα οποία διαχωρίζονται από συνεχείς λωρίδες (Εικόνα 3.10Β, Γ). Διακρίνονται επίσης, αν και εξαιρετικά σπάνια, ποροειδή τα οποία διαθέτουν τρία διάτρητα τμήματα, συνήθως πλησίον της ραφής (βέλη, Εικόνα 3.10Β, Γ). Α Β Γ Δ Ε Εικόνα Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima, κύτταρα από καλλιέργεια σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδα ενός κυττάρου. (Β) Τμήμα της θυρίδας, όπου φαίνεται η δομή της. (Γ) Τμήμα της θυρίδας, όπου φαίνεται η δομή των ποροειδών διακρίνονται με βέλη τα ποροειδή που διαχωρίζονται σε τρεις διάτρητες περιοχές. (Δ) Τμήμα του περιζωνίου, όπου διακρίνονται η 1 η (VC), η 2 η (II) και η 3 η (III) ταινία. (Ε) Τμήμα της 1 ης (VC) και η 2 ης ταινίας του περιζωνίου, σε μεγέθυνση. Κλίμακα: 5 μm (Α), 1 μm (Β και Δ) και 0,5 μm (Γ και Ε). Figure Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima, culture specimens in TEM.(Α) Whole valve. (Β) Portion of the valve, showing the valve structure. (Γ) Portion of the valve, showing poroids structure; poroids split into three perforated sector are indicated by arrows. (Δ) Portion of the cingulum, with valvocopula (VC), 2 nd (II) and 3 rd (III) cingular bands. (Ε) Detail of the valvocopula (VC) and 2 nd (II) cingular band. Scale bar: 5 μm (Α), 1 μm (Β and Δ) and 0.5 μm (Γ and Ε). 69

84 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το περιζώνιο αποτελείται από τρεις ταινίες οι οποίες φέρουν ραβδώσεις και πλαισιώνονται από μη-διάτρητα περιθώρια (Εικόνα 3.10Δ). Και οι τρεις ραβδωτές ζώνες φέρουν μία σειρά με ποροειδή, ακανόνιστου σχήματος. Το μέγεθος τους ελαττώνεται κατά το διαθυριδικό άξονα. Στην 1 η ταινία τα ποροειδή συνήθως διαιρούνται σε 2 3 διάτρητευς περιοχές (Εικόνα 3.10Γ, Δ) και ο αριθμός των ραβδώσεων σε 10 μm κυμαίνεται από 49 έως 55 (Πίνακας 3.1). Στις άλλες δύο ταινίες τα ποροειδή σπάνια διαιρούνται (συνήθως έχουν ενιαία υμενώδη δομή) (Εικόνα 3.10Γ, Δ) Pseudo-nitzschia cf. pseudodelicatissima μορφότυπος Κύτταρα με θήκη γραμμικού έως λογχοειδούς σχήματος τόσο σε θυριδική (Εικόνα 3.11Α) όσο και σε περιζωνική όψη. Το μήκος της θυρίδας κυμαίνεται από 57 έως 64 μm και το πλάτος της από 1,6 έως 2,2 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής διακόπτεται, στη μέση περίπου του κορυφαίου άξονα, από τον κεντρικό κόμβο. Ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος αντιστοιχεί σε 4 6 ραβδώσεις. Οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής και οι πολικοί κόμβοι εντοπίζονται στο μέσο περίπου της επιφάνειας της θυρίδας. Α Β Γ Δ Εικόνα Pseudo-nitzschia cf. pseudodelicatissima μορφότυπος, κύτταρα από καλλιέργεια σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδες κυττάρων. (Β) Κεντρικό τμήμα μίας θυρίδας, όπου φαίνεται η δομή της θυρίδας και των ποροειδών ποροειδή που αποτελούνται από δύο αντικριστά τοποθετημένες διάτρητες περιοχές (σε κύκλο) και ποροειδή που αποτελούνται από 2 5 διάτρητες περιοχές (βέλη). (Γ) Τμήμα του περιζωνίου, όπου διακρίνονται η 1 η (VC) και η 2 η (II) ταινία. (Δ) Τμήμα της 3 ης (III) ταινίας του περιζωνίου, σε μεγέθυνση. Κλίμακα: 10 μm (Α) και 0,5 μm (Β-Δ). Figure Pseudo-nitzschia cf. pseudodelicatissima morphotype, culture specimens in TEM. (Α) Cell valves. (Β) Detail of the central area of the valve, showing the valve and poroids structure; poroids with two opposite hymenate sectors (circled) and poroids with 2 5 hymenate sectors (arrows). (Γ) Detail of the cingulum, comprising valvocopula (VC) and 2 nd (II) cingular band. (Δ) Detail of the 3 rd (III) cingular band. Scale bar: 10 μm (Α) and 0.5 μm (Β-Δ). Ο αριθμός των ραβδώσεων της θυρίδας (34 38 σε 10 μm) αντιστοιχεί σε σχεδόν διπλάσιο αριθμό περισφίγξεων της ραφής (17 21 σε 10 μm) (Πίνακας 3.1). Στις επιφάνειες των 70

85 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ραβδώσεων υπάρχει μόνο μία σειρά ποροειδών, κυκλικού έως τετραγωνικού σχήματος (5 7 ποροειδή σε 1 μm) (Εικόνα 3.11Β) (Πίνακας 3.1). Η διαγράμμιση της θυρίδας τερματίζεται πριν από τις κορυφαίες απολήξεις της ραφής και στους δύο πόλους. Η ράβδωση του εγγύς μανδύα είναι περιστασιακά ευθυγραμμισμένη με τη ράβδωση της επιφάνειας της θυρίδας (ιδίως στην κεντρική περιοχή), ενώ η ράβδωση του άπω μανδύα είναι απόλυτα ευθυγραμμισμένη. Και στους δύο μανδύες παρατηρείται μία σειρά, με 1 2 ποροειδή κατά τον εγκάρσιο άξονα. Συνήθως είναι επιμηκυσμένα ως προς τον εγκάρσιο άξονα, ιδιαίτερα στον εγγύς μανδύα. Η μεμβράνη των ποροειδών συνήθως διαιρείται σε δύο μεγάλα διάτρητα τμήματα διατεταγμένα αντικριστά (Εικόνα 3.11Β, σε κύκλο). Διαχωρίζονται μεταξύ τους από συνεχείς λωρίδες. Ωστόσο, ένα σημαντικό ποσοστό ποροειδών (περίπου 31%) αποτελούνται από 2 5 διάτρητες περιοχές (2.5 ± 0.7), χωρίς ωστόσο να φέρουν μία κεντρικά τοποθετημένη διάτρητη περιοχή (Εικόνα 3.11Β, βέλη). Ποροειδή με αυτή τη δομή παρατηρούνται συνήθως κοντά στους μανδύες. Το περιζώνιο αποτελείται από τρεις ταινίες (Εικόνα 3.11Γ, Δ). Όλες φέρουν ραβδώσεις και πλαισιώνονται από μη-διάτρητα περιθώρια. Επίσης, όλες αποτελούνται από δύο σειρές ποροειδών με 4 6 (1 η ταινία), 3 4 (2 η ταινία) και 2 3 (3 η ταινία) ποροειδή κατά το διαθυριδικό άξονα. Στις δύο πρώτες ταινίες συχνά παρατηρούνται και ποροειδή ενδιάμεσα των δύο σειρών (Εικόνα 3.11Γ). Η πρώτη ταινία αριθμεί ραβδώσεις σε 10 μm (Πίνακας 3.1) Pseudo-nitzschia pungens var. pungens (Grunow ex Cleve) Hasle Κύτταρα με θήκη γραμμικού έως λογχοειδούς σχήματος σε θυριδική όψη (Εικόνα 3.12Α) και λογχοειδούς σχήματος σε περιζωνική όψη. Το μήκος της θυρίδας κυμαίνεται από 77 έως 101 μm και το πλάτος της από 2,5 έως 3,6 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής δεν διακόπτεται στο κεντρικό της τμήμα με την παρεμβολή ενός κεντρικού κόμβου. Οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής και οι πολικοί κόμβοι εντοπίζονται κοντά στο περιθώριο της θυρίδας. Οι περισφίγξεις της ραφής είναι σχεδόν στοιχισμένες με τις ραβδώσεις της θυρίδας (11 14 σε 10 μm) (Πίνακας 3.1). Στις επιφάνειες των ραβδώσεων παρατηρούνται δύο σειρές ποροειδών (2 4 ποροειδή σε 1 μm) (Πίνακας 3.1), οι οποίες εντοπίζονται πλησίον των διαραβδωσιακών ζωνών (Εικόνα 3.12Β). Περιστασιακά παρατηρούνται ποροειδή και ενδιάμεσα των δύο σειρών. Η διαγράμμιση της θυρίδας τερματίζεται πριν από τις κορυφαίες απολήξεις της ραφής, αν και ποροειδή παρατηρούνται σποραδικά και πέραν αυτών. Μεταξύ των δύο πόλων δεν παρατηρούνται εμφανείς διαφορές στη διαγράμμιση. Η ράβδωση του άπω μανδύα είναι ευθυγραμμισμένη με αυτή της επιφάνειας της θυρίδας (Εικόνα 3.12Β), ενώ αυτή του εγγύς 71

86 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ μανδύα σπάνια συμπίπτει. Και οι δύο μανδύες αποτελούνται από δύο σειρές ποροειδών. Η μεμβράνη των ποροειδών είναι υμενώδης (Εικόνα 3.12Γ). Α Β Γ Δ Εικόνα Pseudo-nitzschia pungens var. pungens, κύτταρα από καλλιέργεια σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδα ενός κυττάρου. (Β) Τμήμα της θυρίδας, όπου φαίνεται η δομή της. (Γ) Δομή ποροειδών. (Δ) Τμήμα του περιζωνίου, όπου διακρίνονται η 1 η (VC), η 2 η (II) και η 3 η (III) ταινία. Κλίμακα: 10 μm (Α), 1 μm (Β και Δ) και 0,2 μm (Γ). Figure Pseudo-nitzschia pungens var. pungens, culture specimens in TEM. (Α) Whole valve. (Β) Portion of the valve, showing valve structure. (Γ) Poroids structure. (Δ) Portion of the cingulum, with valvocopula (VC), 2 nd (II) and 3 rd (III) cingular band. Scale bar: 10 μm (Α), 1 μm (Β and Δ) and 0.2 μm (Γ). Το περιζώνιο περιλαμβάνει τρεις ταινίες (Εικόνα 3.12Δ). Όλες αποτελούνται από μία σειρά με ποροειδή, το μέγεθος των οποίων ελαττώνεται σταδιακά κατά τον διαθυριδικό άξονα. Η μεμβράνη των ποροειδών έχει υμενώδη δομή και ακανόνιστο σχήμα. Η 1 η ταινία αριθμεί ραβδώσεις σε 10 μm (Πίνακας 3.1) Pseudo-nitzschia subfraudulenta (Hasle) Hasle Κύτταρα με θήκη λογχοειδούς σχήματος σε θυριδική όψη (Εικόνα 3.13Α) και γραμμικού έως λογχοειδούς σε περιζωνική όψη. Τα πλευρικά περιγράμματα της θυρίδας είναι παράλληλα στο μεγαλύτερο τμήμα της θυρίδας (για σχεδόν τα ¾ του συνολικού της μήκους), και σταδιακά συγκλίνουν καταλήγοντας σε αποστρογγυλεμένα άκρα. Το μήκος της θυρίδας κυμαίνεται από 70 έως 78 μm και το πλάτος της από 4,3 έως 5,0 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής διακόπτεται, στη μέση περίπου του κορυφαίου άξονα, από τον κεντρικό κόμβο (Εικόνα 3.13Β). Ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος αντιστοιχεί σε 4 5 ραβδώσεις. Στον ένα πόλο της θυρίδας οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής και οι πολικοί κόμβοι εντοπίζονται κοντά στο περιθώριο της θυρίδας, ενώ στον άλλο πόλο σχεδόν στο μέσο της επιφάνειας της θυρίδας. 72

87 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η πυκνότητα των περισφίγξεων της ραφής (15 19 σε 10 μm) είναι μικρότερη της αντίστοιχης των ραβδώσεων της θυρίδας (24 27 σε 10 μm) (Πίνακας 3.1). Στις επιφάνειες των ραβδώσεων διακρίνονται δύο σειρές ποροειδών, ωοειδούς έως δακρύμορφου σχήματος (Εικόνα 3.13Β). Τα ποροειδή καλύπτουν σχεδόν το σύνολο της επιφάνειας των ραβδώσεων (4 6 σε μήκος 1 μm) (Πίνακας 3.1). Στον ένα πόλο της θυρίδας οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής απαντώνται στο περιθώριο της θυρίδας και παρατηρούνται μια ή δύο λοξές σειρές ποροειδών. Στον άλλο πόλο, οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής εντοπίζονται στο μέσο της επιφάνειας της θυρίδας και απουσιάζουν κεκλιμένες σειρές ποροειδών. Ο εγγύς μανδύας της θυρίδας αντιστοιχεί σε δύο σειρές, με ένα ή δύο ποροειδή κατά τον εγκάρσιο άξονα. Η ράβδωσή του είναι περιστασιακά ευθυγραμμισμένη με αυτή της επιφάνειας της θυρίδας (κυρίως στην κεντρική περιοχή) (Εικόνα 3.13Β). Η ράβδωση του άπω μανδύα είναι απόλυτα ευθυγραμμισμένη με αυτή της επιφάνειας της θυρίδας και αντιστοιχεί σε δύο σειρές ποροειδών (Εικόνα 3.13Α). Η μεμβράνη των ποροειδών αποτελείται από ένα κεντρικό συνεχές τμήμα με 3 6 διακλαδώσεις προς την περιφέρεια (αστερόμορφο) και υμενώδεις περιοχές ανάμεσά τους (ίδια δομή με το είδος P. fraudulenta). Α Β Γ Δ Εικόνα 3.13 Pseudo-nitzschia subfraudulenta, κύτταρα από καλλιέργεια σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδα ενός κυττάρου. (Β) Τμήμα της θυρίδας, όπου φαίνεται η δομή της. (Γ) Τμήμα του περιζωνίου, όπου διακρίνονται οι 1ες (VC) και η 2ες (II) ταινίες (υποπεριζώνιο και επιπεριζώνιο). (Δ) Τμήμα της 1ης (VC) ταινίας του περιζωνίου, σε μεγέθυνση. Κλίμακα: 10 μm (Α), 1 μm (Β και Γ) και 0,5 μm (Δ). Figure 3.13 Pseudo-nitzschia subfraudulenta, culture specimens in TEM. (Α) Whole valve. (Β) Portion of the valve, showing valve structure. (Γ) Portion of the cingulum, with valvocopulae (VC) and 2nd (II) unperforated cingular bands (hypocingulum and epicingulum). (Δ) Detail of the valvocopula. Scale bar: 10 μm (Α), 1 μm (Β and Γ) and 0.5 μm (Δ). 73

88 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το περιζώνιο αποτελείται από μία διακοσμημένη ταινία (1 η ) και έναν ασαφή αριθμό στενά συνδεδεμένων συνεχών ταινιών (Εικόνα 3.13Γ). Η 1 η ταινία αποτελείται από 2 3 σειρές οι οποίες αριθμούν 6 8 ποροειδή κατά τον διαθυριδικό άξονα (Εικόνα 3.13Δ). Η πυκνότητα των ραβδώσεών της κυμαίνεται στις σε 10 μm (Πίνακας 3.1) Pseudo-nitzschia subpacifica (Hasle) Hasle Κύτταρα με θήκη λογχοειδούς σχήματος σε θυριδική (Εικόνα 3.14Α) και περιζωνική όψη. Η θυρίδα εμφανίζει ασυμμετρία ως προς τον κορυφαίο άξονα η μία πλευρά της εμφανίζει κυρτό περίγραμμα, ενώ το περίγραμμα της άλλης πλευράς της είναι λιγότερο καμπυλωτό έως και ευθυτενές (στην κεντρική περιοχή). Το μήκος της θυρίδας κυμαίνεται από 44 έως 55 μm και το πλάτος της από 3,9 έως 4,3 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής διακόπτεται, στη μέση περίπου του κορυφαίου άξονα, από τον κεντρικό κόμβο (Εικόνα 3.14Β). Ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος αντιστοιχεί σε 4 6 ραβδώσεις. Στον ένα πόλο της θυρίδας οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής και οι πολικοί κόμβοι εντοπίζονται πλησίον του περιθωρίου της θυρίδας, ενώ στον άλλο πόλο σχεδόν στο μέσο της επιφάνειας της θυρίδας. Ο αριθμός των περισφίγξεων της ραφής κυμαίνεται από 17 έως 21 σε 10 μm και των ραβδώσεων της θυρίδας από 29 έως 32 σε 10 μm (Πίνακας 3.1). Στις επιφάνειες των ραβδώσεων διακρίνονται δύο σειρές ποροειδών (5 6 σε 1 μm) (Πίνακας 3.1), οι οποίες εντοπίζονται πλησίον των διαραβδωσιακών ζωνών (Εικόνα 3.14Β). Στον ένα πόλο της θυρίδας (όπου οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής απαντώνται κοντά στο περιθώριο της θυρίδας) παρατηρούνται μια ή δύο κεκλιμένες σειρές ποροειδών. Στον άλλο πόλο (όπου οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής εντοπίζονται στο μέσο της επιφάνειας της θυρίδας) οι κεκλιμένες σειρές ποροειδών απουσιάζουν. Ο εγγύς μανδύας της θυρίδας αντιστοιχεί σε δύο σειρές, με ένα ή δύο ποροειδή κατά τον εγκάρσιο άξονα. Η ράβδωσή του είναι περιστασιακά ευθυγραμμισμένη με τη ράβδωση της επιφάνειας της θυρίδας (Εικόνα 3.14Β). Η ράβδωση του άπω μανδύα είναι απόλυτα ευθυγραμμισμένη με αυτή της επιφάνειας της θυρίδας και αποτελείται από δύο σειρές με ένα ποροειδές (σπάνια δύο) κατά τον εγκάρσιο άξονα (Εικόνα 3.14Β). Η μεμβράνη των ποροειδών είναι υμενώδης. Το περιζώνιο περιλαμβάνει τρεις ταινίες οι δύο πρώτες φέρουν ραβδώσεις και πλαισιώνονται από συνεχή περιθώρια (Εικόνα 3.14Γ). Η 1 η ταινία αποτελείται από δύο σειρές, με 3 4 ποροειδή κατά τον διαθυριδικό άξονα, και αριθμεί ραβδώσεις σε 10 μm (Πίνακας 74

89 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1). Η 2 η ταινία αποτελείται από δύο σειρές, με 2 3 ποροειδή κατά τον διαθυριδικό άξονα. Η 3 η ταινία είναι συνεχής. Α Β Γ Εικόνα Pseudo-nitzschia subpacifica, κύτταρα από καλλιέργεια σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδα ενός κυττάρου. (Β) Κεντρικό τμήμα μίας θυρίδας, όπου φαίνεται ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος και η δομή της θυρίδας. (Γ) Τμήμα του περιζωνίου, όπου διακρίνονται η 1 η (VC), η 2 η (II) και η 3 η (III) ταινία (υποπεριζώνιο και επιπεριζώνιο). Κλίμακα: 5 μm (Α) και 1 μm (Β και Γ). Figure Pseudo-nitzschia subpacifica, culture specimens in TEM. (Α) Whole valve. (Β) Detail of the central area of the valve, showing the central interspace and valve structure. (Γ) Portion of the cingulum with the valvocopula (VC), 2nd (II) and 3rd (III) cingular bands (hypocingulum and epicingulum). Scale bar: 5 μm (Α) and 1 μm (Β and Γ) Pseudo-nitzschia cf. dolorosa Κύτταρα με θήκη λογχοειδούς σχήματος σε θυριδική (Εικόνα 3.15Α) και περιζωνική όψη. Η θυρίδα εμφανίζει ασυμμετρία ως προς τον κορυφαίο άξονα η μία πλευρά της εμφανίζει κυρτό περίγραμμα, ενώ το περίγραμμα της άλλης πλευράς της είναι λιγότερο καμπυλωτό έως και ευθυτενές. Το μήκος της θυρίδας κυμαίνεται από 41 έως 56 μm και το πλάτος της από 2,3 έως 2,8 μm (Πίνακας 3.1). Η σχισμή της ραφής διακόπτεται, στη μέση περίπου του κορυφαίου άξονα με την παρεμβολή του κεντρικού κόμβου. Ο κεντρικός ενδιάμεσος χώρος αντιστοιχεί σε 4 7 ραβδώσεις. Οι κορυφαίες απολήξεις της ραφής και οι πολικοί κόμβοι εντοπίζονται στο μέσο περίπου της επιφάνειας της θυρίδας. Ο αριθμός των ραβδώσεων της θυρίδας σε 10 μm είναι και των περισφίγξεων της ραφής (Πίνακας 3.1). Στις επιφάνειες των ραβδώσεων παρατηρούνται δύο πρότυπα 75

90 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ διάταξης ποροειδών. Είτε απαντώνται δύο σειρές αντικριστά τοποθετημένων ποροειδών ή μία σειρά μεγάλων (καλύπτουν ολόκληρη την επιφάνεια μεταξύ των διαραβδωσιακών ζωνών) ποροειδών τα οποία αποτελούνται από 3 5 διάτρητες περιοχές (Εικόνα 3.15Β). Το δεύτερο πρότυπο απαντάται συνήθως, αν και όχι αποκλειστικά, σε τμήματα της θυρίδας πλησίον της ραφής ή του άπω μανδύα. Σε μήκος 1 μm εκτείνονται 4 8 ποροειδή, κατά τον εγκάρσιο άξονα (Πίνακας 3.1). Η διαγράμμιση της θυρίδας τερματίζεται πριν από τις κορυφαίες απολήξεις της ραφής. Ο εγγύς μανδύας φέρει ράβδωση περιστασιακά ευθυγραμμισμένη με τη διάταξη των ραβδώσεων της επιφάνειας της θυρίδας. Αποτελείται από δύο σειρές, με ένα ή δύο ποροειδή (συνήθως επιμηκυσμένα) κατά τον εγκάρσιο άξονα. Ο άπω μανδύας φέρει ράβδωση απόλυτα ευθυγραμμισμένη με αυτή της επιφάνειας της θυρίδας και δομή όμοια με του εγγύς μανδύα (Εικόνα 3.15Β). Α Β Γ Εικόνα Pseudo-nitzschia cf. dolorosa, κύτταρα από καλλιέργεια σε ΗΜΔ. (Α) Θυρίδα ενός κυττάρου. (Β) Κεντρικό τμήμα μίας θυρίδας, όπου φαίνεται η δομή της θυρίδας και των ποροειδών. (Γ) Τμήμα του περιζωνίου, όπου διακρίνονται η 1 η (VC), η 2 η (II) και η 3 η (III) ταινία. Κλίμακα: 10 μm (Α) και 0.5 μm (Β και Γ). Figure Pseudo-nitzschia cf. dolorosa, culture specimens in TEM. (Α) Whole valve. (Β) Detail of the central area of the valve, showing the valve and poroids structure. (Γ) Portion of the cingulum with the valvocopula (VC), 2nd (II) and 3rd (III) cingular bands. Scale bar: 10 μm (Α) and 0.5 μm (Β and Γ). Το περιζώνιο περιλαμβάνει τρεις ταινίες που φέρουν ραβδώσεις και πλαισιώνονται από συνεχή περιθώρια (Εικόνα 3.15Γ). Οι ταινίες της ζώνης αριθμούν όλες δύο σειρές ποροειδών με 3 4 (1 η ταινία), 3 4 (2 η ταινία) και 1 2 (3 η ταινία) ποροειδή κατά το διαθυριδικό άξονα. Η 1 η 76

91 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ταινία έχει ραβδώσεις σε 10 μm (Πίνακας 3.1). Στα συνεχή περιθώρια της 2 ης και 3 ης ταινίας συνήθως απαντώνται μικροσκοπικές αμυδρά ορατές οπές Σύνθεση Ειδών Pseudo-nitzschia ανά Περιοχή Μελέτης Στον Πίνακα 3.2 δίνονται οι περιοχές λήψης δειγμάτων στις οποία βρέθηκαν τα διάφορα είδη Pseudo-nitzschia. Όπως γίνεται εμφανές από τον πίνακα, σχεδόν όλα τα είδη (με εξαίρεση το P. subpacifica) βρέθηκαν στο Θερμαϊκό Κόλπο. Σε αφθονία ειδών ακολουθούν οι ακτές Καβάλας και Θράκης με οκτώ και επτά είδη, αντίστοιχα. Ο μικρότερος αριθμός ειδών παρατηρήθηκε στον Αμβρακικό Κόλπο (τρία είδη). 77

92 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πίνακας 3.1. Μορφομετρικοί χαρακτήρες των ειδών Pseudo-nitzschia, όπως αυτοί μετρήθηκαν στην παρούσα εργασία. Στην πρώτη γραμμή αναγράφεται το εύρος των τιμών και στη δεύτερη γραμμή με πλάγιο φόντο γραμματοσειράς δίνονται η μέση τιμή ± την τυπική απόκλιση, καθώς και ο αριθμός των μετρήσεων (εντός παρένθεσης). α.δ.: απουσία δεδομένων Table 3.1. Morphometric characters of Pseudo-nitzschia species found in Greek coastal waters. The range of values is given on the first line, while the average ± standard deviation and the number of measurements (in parenthesis) on the following lines are italicized. α.δ.: no data Είδος Πλάτος (μm) P. brasiliana 2,2-3,2 2,6 ± 0,2 (30) P. calliantha 1,4 1,9 1,7 ± 0,2 (42) P. delicatissima 1,3-1,8 1,5 ± 0,1 (58) P. cf. delicatissima 1,7 2,1 1,9 ± 0,2 (26) P. fraudulenta 4,2 5,8 4,8 ± 0,5 (32) P. galaxiae 1,1 1,8 1,4 ± 0,2 (49) P. mannii 1,5 2,1 1,8 ± 0,1 (59) Περισφίγξεις / 10 μm ,5 ± 1,4 (32) ,3 ± 1,3 (51) ,5 ± 1,3 (90) ,0 ± 1,5 (31) ,7 ± 0,7 (35) ,4 ± 3,3 (53) ,9 ± 1,5 (55) Ραβδώσεις / 10 μm ,3 ± 1,2 (28) ,0 ± 2,1 (52) ,9 ±1,3 (95) ,0 ± 1,4 (31) ,0 ± 1,0 (35) ,2 ± 4,2(53) ,7 ± 1,5 (62) Σειρές ποροειδών (3) Ποροειδή / 1 μm 7-9 8,0 ± 1,4 (50) 4 7 5,1 ± 0,8 (85) ,2 ± 1,2 (84) ,4 ± 1,2 (50) 5 6 5,7 ± 0,5 (79) ,2 ± 0,8 (65) Ραβδώσεις 1ης ταινίας / 10 μm ,1 ± 1,4 (17) ,2 ± 1,5 (10) ,0 ± 1,9 (21) ,5 ± 1,3 (7) ,0 ± 1,2 (13) ,8 ± 1,8 (16) ,4± 1,6 (18) 78

93 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ P. multiseries 3,3 3,5 3,4 ± 0,1 (6) ,7 ± 0,8 (6) ,8 ± 0,8 (6) ,5 ± 0,8 (50) α,δ, P. multistriata 2,8 3,6 3,2 ± 0,3 (19) ,4 ± 1,3 (14) ,6 ± 2,2 (14) 2 (3) ,5 ± 0,7 (50) ,8 ± 1,5 (4) P. pseudodelicatissima 1,2 2,0 1,7 ± 0,2 (81) ,6 ± 1,3 (78) ,2 ± 1,6 (84) ,1 ± 0,8 (77) ,8 ± 1,8 (26) P. cf. pseudodelicatissima 1,6 2,2 1,9 ± 0,1 (28) ,4 ± 1,2 (35) ,8 ± 1,1 (33) ,0 ± 0,6 (50) ,0 ± 1,7 (12) P. pungens var. pungens 2,5 3,6 2,9 ± 0,3 (75) ,2 ± 0,9 (71) ,0 ± 0,8 (71) ,5 ± 0,6 (105) ,5 ± 1,6(45) P. subfraudulenta 4,3 5,0 4,7 ± 0,2 (14) ,7 ± 1,3 (14) ,7 ± 0,9 (16) 2 (3) 4 6 5,2 ± 0,6 (50) ,0 ± 1,6 (8) P. subpacifica 3,9-4,3 4,0 ± 0,1 (8) ,4 ± 1,1 (18) ,4 ± 1,1 (16) ,5 ± 1,3 (50) ,0 ± 1,3 (8) P. cf. dolorosa 2,3 2,8 2,4 ± 0,1 (28) ,1 ± 1,0 (30) ,4 ± 1,5(42) ,1 ± 0,8 (90) ,2 ± 1,6 (21) 79

94 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πίνακας 3.2. Είδη του γένους Pseudo-nitzschia και οι περιοχές που βρέθηκαν (υποδεικνύονται με +). Κάτω από την κάθε περιοχή και εντός παρένθεσης αναγράφεται ο αριθμός των δειγμάτων που παρατηρήθηκαν σε ΟΜ καθώς και σε ΗΜΔ (ΟΜ/ΗΜΔ). (τροποποιημένο από Moschandreou & Nikolaidis, 2010) Table 3.2. Species of the genus Pseudo-nitzschia and the areas that were found (indicated by +). Below each area are given the numbers of samples examined in LM and TEM (LM/TEM). (modified from Moschandreou & Nikolaidis, 2010) Είδος Θερμαϊκός Κόλπος (370/39) P. brasiliana + Μαλιακός Κόλπος (168/11) Αμβρακικός Κόλπος (97/9) ακτές Καβάλας (147/11) P. calliantha P. delicatissima + + P. cf. delicatissima + P. cf. dolorosa + ακτές Θράκης (138/12) ακτές Μεγάρων (175/8) P. fraudulenta P. galaxiae P. mannii P. multiseries + + P. multistriata P. pseudodelicatissima P. cf. pseudodelicatissima + P. pungens

95 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ P. subfraudulenta + P. subpacifica + 81

96 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.2. Ανάλυση Πρωτοδιάταξης ITS2 - Φυλογενετική Ανάλυση Το τελικό σύνολο δεδομένων περιελάμβανε 161 ακολουθίες της περιοχής ITS2 (οι 34 προήλθαν από την παρούσα μελέτη), οι οποίες ομαδοποιήθηκαν σε 94 απλοτύπους. Το τελικό μήκος των ευθυγραμμισμένων ακολουθιών ήταν 451 bp, συμπεριλαμβανόμενων των κενών (από τα οποία τα 37 αντιστοιχούν στο τελικό άκρο του 5.8S και τα 17 στο αρχικό άκρο του 28S). Συνολικά αναγνωρίστηκαν 75 συντηρημένοι χαρακτήρες, οι 23 στο τελικό άκρο του 5.8S και οι υπόλοιποι 52 στην περιοχή ITS2. Κανένας συντηρημένος χαρακτήρας δεν εντοπίστηκε στο αρχικό άκρο του 28S. Ως καταλληλότερο μοντέλο χαρακτηρίστηκε το HKY85 (Hasegawa- Kishino-Yano) (Hasegawa et al. 1985) με την ετερογένεια του ρυθμού αντικαταστάσεων/ μεταπτώσεων να ακολουθεί γ-κατανομή (HKY + G) Γενετική Διαφοροποίηση Οι ακολουθίες ομαδοποιήθηκαν και ταξινομήθηκαν σύμφωνα με τη μορφολογική ανάλυση των στελεχών από τα οποία προήλθαν (παρούσα και βιβλιογραφική μελέτη, Hasle 1965, Lundholm et al. 2003, Quijano-Scheggia et al. 2009b, Orive et al. 2010). Προκύπτουν με αυτό τον τρόπο 23 ομάδες απλοτύπων οι οποίες αντιστοιχούν σε 23 τάξα (σε επίπεδο ποικιλίας, μορφοτύπου ή/και είδους), χωρίς την εξωομάδα (Πίνακας 3.3). 82

97 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πίνακας 3.3. Συντμήσεις ομάδων απλοτύπων του γένους Pseudo-nitzschia που χρησιμοποιήθηκαν στη φυλογενετική ανάλυση, και η αντίστοιχη μορφολογική τους αναγνώριση (σε επίπεδο ποικιλίας, του ίδιου είδους ή μορφοτύπου) Table 3.3. Abbreviations of the haplotype groups of the genus Pseudo-nitzschia, used in the phylogenetic analysis, and respective morphological identification (at variety, species or morphotype level) Σύντμηση cfdel del cal man cfpsd cac sbpc fra sbfra png cing avr mlse ast bras mst psd Hob cus dep gal dol arns Ποικιλία Είδος ή Μορφότυπος P. cf. delicatissima μορφότυπος P. delicatissima P. calliantha P. mannii P. cf. pseudodelicatissima μορφότυπος P. caciantha P. subpacifica P. fraudulenta P. subfraudulenta P. pungens var. pungens P. pungens var. cingulata P. pungens var. aveirensis P. multiseries P. australis P. brasiliana P. multistriata P. pseudodelicatissima P. sp. Hobart5 μορφότυπος P. cuspidata P. decipiens P. galaxiae P. dolorosa P. arenysensis Επιπρόσθετα, προσδιορίστηκαν οι μορφολογκές ομοιότητες των τάξα και οι ομάδες απλοτύπων κατατάχθηκαν σε πέντε κατηγορίες (Εικόνα 3.16). Αυτές είναι: 1. απλότυποι του ίδιου τάξου/της ίδια ομάδας (ίδιας ποικιλίας, ίδιου μορφοτύπου ή ίδιου είδους) (Πίνακας 3.3) (στην Εικόνα 3.16 σημαίνονται με μαύρο χρώμα), 2. απλότυποι διαφορετικών ποικιλιών του ίδιου είδους (στην Εικόνα 3.16 σημαίνονται με κόκκινο χρώμα), 3. απλότυποι ειδών ή μορφοτύπων και όμοιων τους μορφοτύπων (Πίνακας 3.4) (στην Εικόνα 3.16 σημαίνονται με πράσινο χρώμα), 4. απλότυποι όμοιων ειδών (Πίνακας 3.4) (στην Εικόνα 3.16 σημαίνονται με μπλε χρώμα) και 5. απλότυποι διακριτών ειδών (στην Εικόνα 3.16 σημαίνονται με κίτρινο χρώμα). 83

98 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πίνακας 3.4. Μορφολογικά όμοιες ομάδες απλοτύπων Pseudo-nitzschia (είδη ή/και μορφότυποι) που χρησιμοποιήθηκαν στη φυλογενετική ανάλυση Table 3.4. Morphologicaly similar groups of Pseudo-nitzschia haplotypes (species or/and morphotypes) used in the phylogenetic analysis 3 η Κατηγορία 4 η Κατηγορία Είδη Μορφότυποι Είδη Είδη del cfdel del arns arns cfdel cus psd cac Hob cal man man Hob fra sbfr cal Hob cac cal psd Hob cac man cus Hob psd cal man cfpsd psd man cac cfpsd cus cal cal cfpsd cus man cus cfpsd psd cfpsd Μορφότυπος Μορφότυπος cfpsd Hob Οι τιμές των γενετικών αποστάσεων τόσο εντός όσο και μεταξύ των ομάδων, αυτών δίδονται στον Πίνακα 3.5. Επίσης, στην Εικόνα 3.16, παρουσιάζεται ένα ιστόγραμμα συχνοτήτων των τιμών γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ των ομάδων απλοτύπων. Το ιστόγραμμα είναι σύνθετο καθώς οι τιμές γενετικής διαφοροποίησης έχουν καταταχθεί στις πέντε κατηγορίες απλοτύπων που αναφέρθηκαν παραπάνω. Όπως φαίνεται στο ιστόγραμμα (Εικόνα 3.16), οι μικρότερες τιμές μέσων γενετικών αποστάσεων υπολογίζονται μεταξύ απλοτύπων της ίδιας ποικιλίας ή του ίδιου είδους/μορφοτύπου (1 η Κατηγορία, μαύρο χρώμα) (0,011 ± 0,019). Κυμαίνονται από <10-3 (μεταξύ απλοτύπων αρκετών ειδών, del, arns, dol, psd, mst, ast, mlse, png, fra, cfpsd, man και cal) έως 0,106 (μεταξύ απλοτύπων του είδους P. caciantha). Πέραν της αρκετά υψηλής τιμής που παρατηρείται στο είδος P. caciantha, οι αντίστοιχες τιμές στα υπόλοιπα είδη/μορφοτύπους/ποικιλίες δεν ξεπερνούν τα 0,080 (arns, gal, del, κτλ.). 84

99 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εικόνα A. Ιστόγραμμα κατανομής των τιμών γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ απλοτύπων της ίδιας ποικιλίας και του ίδιου είδους/μορφοτύπου (μαύρο), διαφορετικών ποικιλιών του ίδιου είδους (κόκκινο), ειδών και όμοιων τους μορφοτύπων (πράσινο), όμοιων ειδών (μπλε) και διακριτών ειδών (κίτρινο). B. Μεγέθυνση της Εικόνας 3.16Α στην πέριοχή που υποδεικνύεται από το πλάισιο. Figure A. Histogram of the distribution of genetic distance values between haplotypes of the same variety and species/morphotype (black), different varieties of the same species (red), species and their similar morphotypes (green), similar species (blue) and distinct species (yellow). B. Detail of the Figure 3.16A, of the part indicated by the frame. 85