ΑΣΚΗΣΗ 9 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ C

Transcript

1 ΑΣΚΗΣΗ 9 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ C Εισαγωγή Οι φωσφολιπάσες C των φωσφοϊνοσιτιδίων είναι σημαντικές σηματοδοτικές πρωτεΐνες. Συναντώνται σε ποικιλία ισομορφών (β, γ, δ, ε, ζ και η) που διαφέρουν ως προς τις υποπεριοχές που διαθέτουν, την ενεργοποίησή τους από υπομονάδες των πρωτεϊνών G (PLCβ), την ενεργοποίησή τους μέσω τυροσινικής φωσφορυλίωσης (PLCγ), από άλλες μικρές GTPάσες (PLCε) ή την ευαισθησία τους στη συγκέντρωση του Ca 2+ (PLCδ, ζ). Το κοινό χαρακτηριστικό όλων των ισομορφών είναι ότι εμφανίζουν εκλεκτικότητα για την, έναντι της φωσφατιδυλο-ινοσιτόλης και βέλτιστη ενεργότητα σε χαμηλές συγκεντρώσεις ελεύθερου Ca 2+ (nμ-μm). Η κλασσική μέθοδος προσδιορισμού της ενεργότητας PLC απαιτεί τη χρήση ραδιοσημασμένης ως υποστρώματος. Παρότι έχουν αναπτυχθεί και μη-ραδιομετρικές μέθοδοι (π.χ. φθορισμομετρικές), συνήθως δεν προτιμώνται όταν χρειάζεται να αναλυθούν πολύπλοκα βιολογικά δείγματα όπως εκχυλίσματα ιστών και κυττάρων. Πρέπει να σημειωθεί ότι μόνο ορισμένα εργαστήρια και χώροι είναι αδειοδοτημένοι για τη χρήση ραδιομετρικών μεθόδων προσδιορισμού. Σε κάθε περίπτωση πρέπει να ακολουθούνται οι βασικοί κανόνες ασφάλειας για τη διάθεση, χρήση και απόρριψη ραδιοσημασμένων ενώσεων, όπως προσδιορίζονται από τους αρμόδιους οργανισμούς. Στην Ελλάδα, αρμόδια είναι η Διεύθυνση Αδειών και Ελέγχων της Ελληνικής Επιτροπής Ατομικής Ενέργειας (ΕΕΑΕ). Θα πρέπει πάντως να σημειωθεί ότι το ραδιοσημασμένο ισότοπο που χρησιμοποιείται στην παρούσα μέθοδο (τρίτιο, 3 Η), καθώς και οι ποσότητες που χρειάζονται, απαιτούν απλά μέτρα προστασίας όπως τη χρήση πλαστικών γαντιών. 279

2 Αρχή μεθόδου Η μέθοδος στηρίζεται στη χρήση επισημασμένης με 3 Η στο δακτύλιο της ινοσιτόλης ([ 3 ΗΙns] ). Η υδρόλυση της 3 Η[Ins] από τη PLC θα οδηγήσει στην παραγωγή μη-επισημασμένης DAG και [ 3 ΗΙns]IP 3 η οποία είναι υδατοδιαλυτή. Μετά από εκχύλιση των προϊόντων της αντίδρασης και μέτρηση της ραδιενέργειας που ανακτήθηκε στην υδατική φάση, προσδιορίζεται η ποσότητα της IP 3 που παράχθηκε και εξ αυτής η ειδική ενεργότητα της PLC. Σε ορισμένες περιπτώσεις απαιτείται η ταυτοποίηση του προϊόντος, η οποία μπορεί να γίνει με μια απλή χρωματογραφική μέθοδο που παρουσιάζεται στο τέλος της άσκησης ως παράρτημα. Ένα σημείο που αξίζει να σημειωθεί είναι ότι η PLC θα δράσει εξειδικευμένα και αποτελεσματικά έναντι της μόνο όταν αυτή χρησιμοποιηθεί σε λιποσωμικές ή μικυλλιακές μορφές. Στην συγκεκριμένη μέθοδο παρουσιάζεται η παρασκευή μικυλλιακών μορφών της με τη χρήση δεοξυχολικού νατρίου. Ωστόσο, λιποσώματα που παρασκευάζονται μετά από ανάμιξη της με άλλα φωσφολιπίδια και κυρίως φωσφατιδυλοχολίνη είναι εξίσου αποτελεσματικά. Τέλος, χρειάζεται προσοχή στη ρύθμιση της συγκέντρωσης του ελεύθερου Ca 2+ στο διάλυμα της αντίδρασης. Επειδή η βέλτιστη συγκέντρωση Ca 2+ για τις PLC είναι πολύ χαμηλή (1-10 μm) απαιτείται η χρήση ρυθμιστικών διαλυμάτων CaCl 2 /EGTA. Απουσία Ca 2+, δηλαδή χρήση μόνο του EGTA σε συγκέντρωση 3mM, η ενεργότητα της PLC πρέπει να είναι πολύ χαμηλή ή σχεδόν μηδενική. Υλικά - CaCl 2 και MgCl 2, δεοξυχολικό νάτριο, EGTA, ρυθμιστικό διάλυμα Tris 50mM, ph 6.5, 10x ρυθμιστικό διάλυμα Ca 2+ /EGTA (CaCl 2 20mM, EGTA 30mM, διόρθωση του ph στο 7.0 με NaOH 2N για τελική συγκέντρωση ελεύθερου Ca 2+ 1 μμ), παγωμένο μίγμα CHCl 3 OH (2:1, v/v), διάλυμα HCl 1N. - σε CHCl 3 OH (2:1, v/v) (απομονωμένη από μίγμα φωσφοϊνοσιτιδίων). - [ 3 ΗΙns] σε CH 2 Cl 2 /C 2 H 5 OH/H 2 O (20:10:1) (1Cimmol -1, 10μCimL -1 ). Βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL, bronchoalveolar lavage) To βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) είναι υδατικό εναιώρημα που παραλαμβάνεται με βρογχοσκόπηση και δίνει με μεγάλη ακρίβεια την στιγμιαία απεικόνιση της ανοσολογικής κατάστασης τοπικά στον πνεύμονα. Αντιπροσωπεύει το κυψελιδικό υγρό σε αραίωση, περιέχει δε και κυτταρικούς πληθυσμούς που βρίσκονται στον κυψελιδικό χώρο. Τέλος, περιέχει τον επιφανειοδραστικού παράγοντα των πνευμόνων. Το υλικό αυτό είναι λιποπρωτεϊνικής σύστασης με επιφανειοδραστικές ιδιότητες, που απλώνεται ως μονοστιβάδα στη διεπιφάνεια αέρα-υμενίου υγρής φάσης που επικα- 280

3 λύπτει τις κυψελίδες. Βασική λειτουργία του υλικού αυτού είναι η μείωση της επιφανειακής τάσης στη διεπιφάνεια, η προστασία των κυψελίδων από κατάρρευση στο τέλος της εκπνοής και από την δημιουργία πνευμονικού οιδήματος, συμβάλλει όμως και στην κυτταρική άμυνα μέσω των ειδικών πρωτεϊνών που περιέχει και οι οποίες διαθέτουν ιδιότητες λεκτινών. Με μια διαφορική φυγοκέντρηση παραλαμβάνονται τα κύτταρα (ίζημα) του BAL και το υγρό (υπερκείμενο) BAL. Η υπερκείμενη υγρή φάση του BAL περιέχει συσσωματώματα του επιφανειοδραστικού παράγοντα, τα οποία ανακτήθηκαν κατά την έκπλυση, διαλυτούς παράγοντες, καθώς και εξωκυττάρια κυστίδια που έχουν εκκριθεί από τα κύτταρα και παίζουν ρόλο στην διακυτταρική επικοινωνία, όπως είναι τα εξωσώματα. Τα κύτταρα BAL αποτελούνται κυρίως από κυψελιδικά μακροφάγα και, σε περίπτωση φλεγμονής και από άλλα κύτταρα, όπως πολυμορφοπύρηνα ή και ηωσινόφιλα, ανάλογα με το είδος της βλάβης. Τα κύτταρα αυτά συρρέουν στον κυψελιδικό χώρο λόγω της αυξημένης διαπερατότητας της τριχοειδοκυψελιδικής μεμβράνης. Μελέτες έχουν δείξει τη παρουσία φωσφολιπασών στο BAL ασθενών με οξεία πνευμονική βλάβη, όπως η PLA 2 και η εκλεκτική για φωσφοϊνοσιτίδια PLC. Ειδικά για την PLC, η ενεργότητα εντοπίζεται και στο υγρό BAL και στα κύτταρα BAL. Αξίζει να σημειωθεί ότι ο προσδιορισμός των ενζύμων αυτών μπορεί να έχει διαγνωστική αξία. Προετοιμασία υποστρώματος Η παρασκευή του υποστρώματος γίνεται ως εξής: παραλαμβάνονται από διαλύματα stock και εξατμίζονται σε ρεύμα αζώτου διαδοχικά, στον ίδιο σωλήνα, ποσότητες ψυχρής και ραδιοσημασμένης έτσι, ώστε η ειδική ραδιενέργεια να είναι 6,700 10,000 cpm/nmol. Μετά την εξάτμιση των οργανικών διαλυτών, το μίγμα επαναδιαλύεται σε μικρή ποσότητα CHCl 3 και εξατμίζεται καλά ο διαλύτης με ρεύμα αζώτου. Το υμένιο που σχηματίζεται αναδιασπείρεται σε διάλυμα δεοξυχολικού νατρίου 0.05% σε Tris 50mM, ph 6.5 (10μL διαλύματος ανά 3nmol ) και ο σωλήνας πωματίζεται αφού διοχετευθεί σε αυτόν άζωτο. Το υδατικό μίγμα των φωσφολιπιδίων αναδεύεται έντονα σε vortex και υποβάλλεται σε υπερήχηση (σε λουτρό υπερήχων) για 10min και σε θερμοκρασία 25 ο C. Από αυτό το διάλυμα χρησιμοποιούνται 10μL για κάθε προσδιορισμό. Πορεία εργασίας Η μέθοδος που χρησιμοποιείται αποτελεί τροποποίηση της μεθόδου των Melin et al. Σημειώνεται ότι εκτός από το υγρό BAL ακριβώς η ίδια μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τον προσδιορισμό της ενδοκυττάριας ενεργότητας PLC από μεμβρανικά ή κυτοπλασμικά κλάσματα μετά 281

4 από κλασμάτωση ομογενοποιημάτων κυττάρων (π.χ. κυτταρική σειρά A549 ή κύτταρα Tetrahymena thermophila). Το μίγμα επώασης για τον προσδιορισμό της PLC αποτελείται από: Tris 50mM, ph 6.5, δεοξυχολικό νάτριο 0.01%, 3 H[Ιns] 30 60μΜ και 4-8μg, συνήθως, πρωτεΐνης σε τελικό όγκο 50μL. Για την προσθήκη Ca 2+ ή EGTA προστίθενται 5μL από τα αντίστοιχα 10x διαλύματα. Όλοι οι προσδιορισμοί γίνονται εις διπλούν. Μετά την ανάμιξη των διαλυμάτων Tris 50mM και CaCl 2 ή EGTA με τα ενζυμικά παρασκευάσματα (5-12μg πρωτεΐνης δείγματος υπερκειμένου BAL) και τη συμπλήρωση του όγκου στα 40μL, τα δείγματα μεταφέρονται σε υδρόλουτρο θερμοκρασίας 37 o C, επωάζονται για 5min και η αντίδραση ξεκινά με την προσθήκη 10μL του υποστρώματος. Μετά από επώαση για διάφορα χρονικά διαστήματα (1 30min), η αντίδραση τερματίζεται με προσθήκη 1mL παγωμένου μίγματος CHCl 3 OH (2:1, v/v) και, μετά από έντονη ανάδευση, προστίθενται 250μL HCl 1N. Τα δείγματα αναδεύονται και πάλι και φυγοκεντρούνται σε θερμοκρασία δωματίου στα 2,000g για 3min, οπότε και διαχωρίζονται οι φάσεις. Λαμβάνονται κλάσματα 300μL από την επάνω υδατική φάση και μετράται η ραδιενέργεια σε μετρητή σπινθηρισμού υγρών. Παράλληλα, χρησιμοποιούνται και δείγματα αναφοράς, χωρίς προσθήκη πρωτεΐνης ή με προσθήκη πρωτεΐνης μετά από βρασμό για 10min. Από τις τιμές της ραδιενέργειας των υδατικών φάσεων υπολογίζεται η ενζυμική ενεργότητα απελευθέρωσης υδατικών προϊόντων σε nmol/min/mg πρωτεΐνης ως εξής: (cpm δείγματος x A) - (cpm control x A) / ΕΡΔ / t / μgπρωτεΐνης x 10 3, όπου cpm: counts per minute, Α: διόρθωση ως προς την συνολική υδατική φάση (330μL), ΕΡΔ: ειδική ραδιενέργεια υποστρώματος σε cpm/nmol και t: χρόνος αντίδρασης σε min. Στις περιπτώσεις που μελετώνται περαιτέρω τα υδατοδιαλυτά προϊόντα (με χρωματογραφία σε στήλες Dowex), συλλέγεται και φυλάσσεται στους -20 ο C μέρος της υδατικής φάσης των δειγμάτων (συνήθως μL τα οποία αραιώνονται και εξουδετερώνονται με H 2 O και αραιωμένο 1:5 διάλυμα NH 4 OH αντίστοιχα). 282

5 Ανάλυση προϊόντων Υλικά - μυρμηκικό αμμώνιο 0.2, 0.4 και 1Μ σε μυρμηκικό οξύ 0.1Μ - προκατασκευασμένες στήλες Dowex AG 1- x8 στη μορφή του μυρμηκικού ανιόντος ( mesh, όγκου 2mL) Πορεία εργασίας Για το διαχωρισμό των υδατικών προϊόντων του προσδιορισμού της PLC χρησιμοποιείται χρωματογραφία ανιοντανταλλαγής σε μικροστήλες Dowex. Οι ενεργές ομάδες του χρωματογραφικού υλικού είναι τεταρτοταγείς θετικά φορτισμένες αμινομάδες, ενώ το αντισταθμιστικό ιόν είναι το μυρμηκικό ανιόν (formate form). Τα δείγματα από τις υδατικές φάσεις των προσδιορισμών αραιώνονται με Η 2 Ο σε αναλογία τουλάχιστον 1:10, εξουδετερώνονται με αραιωμένο (1:5) διάλυμα π.nh 4 ΟΗ και προστίθενται με προσοχή σε προεξισορροπημένες έτοιμες στήλες Dowex. Η προεξισορρόπηση γίνεται με πέρασμα από τη στήλη 20-40mL νερού πριν αρχίσει η χρωματογράφηση. Μετά το δείγμα, προστίθενται 10mL νερό για έκπλυση της στήλης και ακολούθως εκλούονται κατά σειρά οι μονοφωσφορικές ινοσιτόλες (IP), η διφωσφορική ινοσιτόλη (IP 2 ) και τελικά η IP 3 με την προσθήκη των παρακάτω διαλυμάτων στην εξής σειρά: 10mL 0.2Μ μυρμηκικού αμμωνίου σε μυρμηκικό οξύ 0.1 Μ, 12mL 0.4Μ μυρμηκικού αμμωνίου σε 0.1Μ μυρμηκικό οξύ, 10mL 1Μ μυρμηκικού αμμωνίου σε 0.1Μ μυρμηκικό οξύ. Παραλαμβάνονται κλάσματα των 2mL από τη στήλη και μετράται η ραδιενέργεια μικρής ποσότητας από τα κλάσματα. Για την βαθμονόμηση των στηλών μπορεί να χρησιμοποιηθεί πρότυπη [ 3 ΗΙns]ΙP 3 και να αναλυθεί με την ίδια διαδικασία. Η [ 3 ΗΙns]ΙP 3 εκλούεται σε ποσοστό 98% με το κατάλληλο διάλυμα (μυρμηκικό αμμώνιο 1 Μ σε μυρμηκικό οξύ 0.1Μ). Βιβλιογραφία Spyridakis S, Leondaritis G, Nakos G, Lekka ME, Galanopoulou D (2010) A specific phospholipase C activity regulates phosphatidylinositol levels in lung surfactant of patients with acute respiratory distress syndrome. Am J Respir Cell Mol Biol, 42: Kitsiouli E, Nakos G, Lekka ME (2009) Phospholipase A 2 subclasses in acute respiratory distress syndrome. Biochim Biophys Acta, 1792: