Συσχέτιση των συγκεντρώσεων του υποδοχέα των τελικών προϊόντων προηγμένης γλυκοζυλίωσης σε στεφανιαίους ασθενείς με ή χωρίς σακχαρώδη διαβήτη.

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Συσχέτιση των συγκεντρώσεων του υποδοχέα των τελικών προϊόντων προηγμένης γλυκοζυλίωσης σε στεφανιαίους ασθενείς με ή χωρίς σακχαρώδη διαβήτη. ΔΙΣΛΙΑΝ ΒΑΛΑΝΤΗΝ ΙΑΤΡΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2006

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΟΥΒΕΛΑΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ) ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΓΙΑΝΝΟΓΛΟΥ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΑΡΙΑ ΧΑΤΖΗΣΤΥΛΙΑΝΟΥ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Ν. ΜΠΟΝΤΗΣ

4 Στην οικογένειά μου

5 Περιεχόμενα Πρόλογος 9 Γενικό μέρος Κεφάλαιο 1 Υπεργλυκαιμία και αθηροσκλήρωση Το μονοπάτι των πολυολών Σχηματισμός των τελικών προϊόντων προηγμένης γλυκοζυλίωσης Ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C Η οδός της Εξοζαμίνης 20 Κεφάλαιο 2: Βιοχημεία της μη ενζυμικής γλυκοζυλίωσης 22 Κεφάλαιο 3: Ταξινόμηση των τελικών προϊόντων προηγμένης γλυκοζυλίωσης 25 Κεφάλαιο 4: Υποδοχείς των τελικών προϊόντων προηγμένης γλυκοζυλίωσης Δομή του RAGE Ισομορφές του RAGE Πολυμορφισμοί του RAGE Ο πολυσυνδετικός υποδοχέας RAGE Μετάδοση του σήματος μέσω του RAGE 32 Κεφάλαιο 5: Τελικά προϊόντα προηγμένης γλυκοζυλίωσης και Αθηροσκλήρωση Μη εξαρτώμενοι από υποδοχείς μοριακοί μηχανισμοί Εξαρτώμενοι από υποδοχείς μοριακοί μηχανισμοί 37 Ειδικό μέρος 1. Σκοπός της μελέτης Υλικό και Μέθοδοι Υλικό 44

6 2.2 Εργαστηριακές μέθοδοι Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Συζήτηση Περιορισμοί της μελέτης Μελλοντικές προοπτικές Συμπεράσματα 78 Περίληψη 80 Summary 81 Βιβλιογραφία 83

7 Πρόλογος Η αθηροσκλήρωση απασχολεί ιδιαιτέρως την παγκόσμια επιστημονική κοινότητα, διότι θεωρείται ότι συμβάλει σημαντικά στην αύξηση της θνησιμότητας. Η αθηροσκλήρωση είναι μία συστηματική φλεγμονώδης διεργασία με χρόνια εξελικτική πορεία, που προσβάλλει τις μικρής, μεσαίας και μεγάλης διαμέτρου αρτηρίες του οργανισμού. Οι κύριες κλινικές εκδηλώσεις της αθηροσκλήρωσης περιλαμβάνουν συμπτώματα που προκύπτουν από την προσβολή των στεφανιαίων, εγκεφαλικών και περιφερικών αρτηριών. Τις τελευταίες δεκαετίες, μελέτες έδειξαν ότι οι αθηροσκληρωτικές βλάβες δεν αντιπροσωπεύουν απλώς τη συσσώρευση λιπιδίων στο αρτηριακό τοίχωμα, αλλά μια αλληλουχία κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών παρόμοιων με αυτούς που παρατηρούνται σε φλεγμονώδη νοσήματα. Σύμφωνα με την επικρατούσα θεωρία, για την ανάπτυξη και προαγωγή της αθηροσκλήρωσης, που διατυπώθηκε αρχικά από τους Ross και Glomset το 1973 και είναι γνωστή ως «θεωρία της απάντησης στη βλάβη», κεντρικό σημείο θεωρείται η βλάβη-τραυματισμός του ενδοθηλίου με συνέπεια τη δυσλειτουργία του 1. Όλοι οι παράγοντες που ευνοούν την ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης, και είναι γνωστοί ως παράγοντες καρδιαγγειακού κινδύνου, είναι δυνατό να προκαλέσουν βλάβη-δυσλειτουργία του ενδοθηλίου. Στους κλασικούς προδιαθεσικούς παράγοντες συγκαταλέγονται η δυσλιπιδαιμία, η υπέρταση, ο σακχαρώδης διαβήτης (ΣΔ), το κάπνισμα, η έλλειψη σωματικής άσκησης, το ανδρικό φύλο και η μεγάλη ηλικία. Τα τελευταία χρόνια η έρευνα στο πεδίο της αθηροσκλήρωσης εμβαθύνει σε μοριακό επίπεδο. Ο κατάλογος με νέους δείκτες καρδιαγγειακού κινδύνου συνεχώς αυξάνει και το ενδιαφέρον εστιάζεται στην μελέτη διαφόρων βιοχημικών παραμέτρων. Στους νεότερους δείκτες καρδιαγγειακού κινδύνου συγκαταλέγονται οι οξειδωμένες λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (oxidized Low Density Lipoproteins, ox-ldl), η C αντιδρώσα πρωτεΐνη (C-Reactive Protein, CRP), οι μεγάλες συγκεντρώσεις ομοκυστεΐνης, διάφορα μόρια προσκόλλησης, κυτταροκίνες, αυξητικοί παράγοντες, οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου καθώς επίσης και τα τελικά προϊόντα προηγμένης γλυκοζυλίωσης (Advanced Glycation End Products, AGEs) 2-7. Τα AGEs προέρχονται από τη μη ενζυμική γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών, λιπιδίων και νουκλεϊκών οξέων ως αποτέλεσμα της παρατεταμένης έκθεσης του οργανισμού στην υπεργλυκαιμία. Η υπεργλυκαιμία, που χαρακτηρίζει κυρίως το ΣΔ, 9

8 διαδραματίζει ρόλο-κλειδί στην παθογένεια των διαβητικών επιπλοκών, τόσο της μικροαγγειοπάθειας, όσο και της μακροαγγειακής νόσου. Η συσσώρευση των AGEs στον οργανισμό επάγει την αθηροσκληρωτική διεργασία με διάφορους μηχανισμούς, εξαρτώμενους και μη από υποδοχείς. Τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον των επιστημόνων εστιάζεται στην αλληλεπίδραση των AGEs με ειδικούς υποδοχείς, τους RAGE (Receptors of Advanced Glycation End Products) 8. Η ενεργοποίηση του άξονα AGEs-RAGE πυροδοτεί έναν καταρράκτη μοριακών αντιδράσεων, με συνεπακόλουθο την ενδοθηλιακή δυσλειτουργία και την προαγωγή της αθηροσκλήρωσης 9. Υπάρχει ωστόσο, μικρότερου βαθμού βιβλιογραφική τεκμηρίωση για τη συμμετοχή του RAGE και κατά συνέπεια των AGEs στην παθοφυσιολογία της ευγλυκαιμικής αθηροσκλήρωσης, αλλά και γενικότερα σε νοσήματα χρόνιας φλεγμονώδους αιτιολογίας Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της συσχέτισης των συγκεντρώσεων του διαλυτού RAGE (srage) με καθιερωμένους παράγοντες κινδύνου σε ασθενείς με στεφανιαία νόσο (ΣΝ), με και χωρίς ΣΔ, καθώς και η σχέση που υφίσταται μεταξύ των συγκεντρώσεων του srage και της βαρύτητας της ΣΝ, με βάση τον αριθμό των στενωμένων αγγείων. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 60 ασθενείς (44 άρρενες και 16 θήλεις), που προσήλθαν στο αιμοδυναμικό εργαστήριο, της Α Καρδιολογικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ, προκειμένου να υποβληθούν σε στεφανιογραφικό έλεγχο με στόχο τη διερεύνηση πιθανής ή την αξιολόγηση γνωστής ΣΝ. Η παρούσα εργασία αποτελείται από δύο μέρη, το γενικό και το ειδικό. Στο γενικό μέρος αναφέρονται οι παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί που συνδέουν την υπεργλυκαιμία με την αθηροσκλήρωση και δίνεται ιδιαίτερη έμφαση στους μοριακούς μηχανισμούς, μέσω των οποίων τα AGEs προάγουν την αθηροσκλήρωση. Στο ειδικό μέρος περιλαμβάνεται το υλικό (ομάδες εξετασθέντων ατόμων), οι μέθοδοι προσδιορισμού των εργαστηριακών εξετάσεων, τα αποτελέσματα αυτών καθώς και η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Στη συνέχεια παρουσιάζεται η συζήτηση των αποτελεσμάτων μας με τα αναφερόμενα στη διεθνή βιβλιογραφία και τέλος παρατίθεται η περίληψη και η βιβλιογραφία. Από τη θέση αυτή θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή για την ανάθεση της παρούσας μελέτης και τις υποδείξεις τους κατά την πορεία της. 10

9 Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή Φαρμακολογίας κ. Δημήτριο Κούβελα, επιβλέποντα της μελέτης, τόσο για την αμέριστη ηθική συμπαράσταση, που μου παρείχε, όσο και για την ουσιαστική συμβολή του στην πραγματοποίηση της μελέτης και για την προμήθεια των απαραίτητων αντιδραστηρίων. Παράλληλα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή Καθηγητή Καρδιολογίας κ. Γεώργιο Γιαννόγλου για την ουσιαστική συμβολή του στον καθορισμό του θέματος και των στόχων της μελέτης, καθώς και για τη συνεχή καθοδήγηση την οποία μου παρείχε από την αρχή ως το τέλος. Επίσης αισθάνομαι την ανάγκη να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παιδιατρικής-Ανοσολογίας κ. Μαρία Χατζηστυλιανού για την πολύτιμη βοήθειά της με έμφαση στην πραγματοποίηση του εργαστηριακού μέρους της μελέτης. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον τέως Διευθυντή της Α Πανεπιστημιακής Καρδιολογικής Κλινικής του Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ και Ομότιμο Καθηγητή Γεώργιο Λουρίδα, όλους τους καρδιολόγους του αιμοδυναμικού εργαστηρίου, και ιδιαίτερα τον Επίκουρο καθηγητή Καρδιολογίας κ. Σταύρο Χατζημιλτιάδη για την βοήθειά του στην αξιολόγηση των στεφανιογραφιών, με την ουσιαστική συνεργασία των οποίων πραγματοποιήθηκε η παρούσα μελέτη. Τέλος, θα ήταν παράλειψη εκ μέρους μου αν δεν ευχαριστούσα την κ. Μαρία Σαμαρά, παρασκευάστρια της Β Πανεπιστημιακής Παιδιατρικής Κλινικής του Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ, για την βοήθεια που μου παρείχε σε όλη τη διάρκεια του εργαστηριακού μέρους της μελέτης. 11

10 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

11 1. Υπεργλυκαιμία και αθηροσκλήρωση Ο σακχαρώδης διαβήτης (ΣΔ) είναι μεταβολική νόσος, που χαρακτηρίζεται από υπεργλυκαιμία, αυξημένη δηλαδή συγκέντρωση γλυκόζης στο πλάσμα. Αποτελεί έναν από τους σημαντικούς και ανεξάρτητους παράγοντες καρδιαγγειακού κινδύνου Οι αγγειακές επιπλοκές της νόσου ευθύνονται για την αυξημένη νοσηρότητα και θνητότητα. Η παρατεταμένη έκθεση του οργανισμού στην υπεργλυκαιμία θεωρείται ένας από τους πρωταρχικούς αιτιολογικούς παράγοντες πρόκλησης των διαβητικών αγγειακών επιπλοκών. Η στενή σχέση που υφίσταται μεταξύ γλυκαιμίας και διαβητικών επιπλοκών, τόσο της μικροαγγειοπάθειας, όσο και της μακροαγγειακής νόσου, έχει επιβεβαιωθεί από μεγάλες προοπτικού τύπου τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες Συνέπεια της παρατεταμένης έκθεσης σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης είναι η εμφάνιση μιας σειράς παθολογικών μεταβολών σε κυτταρικό επίπεδο, που έχει ως αποτέλεσμα την έναρξη, διατήρηση και επιτάχυνση της αθηροσκληρωτικής διαδικασίας. Αν και οι περισσότερες βιβλιογραφικές αναφορές που συνδέουν την υπεργλυκαιμία με την αθηροσκλήρωση, αφορούν τον ΣΔ, εντούτοις τα τελευταία χρόνια δίνεται ιδιαίτερη έμφαση στην βλαπτική επίδραση της γλυκόζης και επί απουσίας ΣΔ. Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες οι συγκεντρώσεις της γλυκόζης νηστείας σε μη διαβητικούς συσχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο καρδιαγγειακής νοσηρότητας Από την συστηματική ανασκόπηση της διεθνούς βιβλιογραφίας προκύπτει ότι υπάρχουν τέσσερις κύριοι μηχανισμοί, στα πλαίσια του μεταβολισμού της γλυκόζης, που ευθύνονται για την επιταχυνόμενη αθηροσκλήρωση του ΣΔ. Πρόκειται για : α) την αυξημένη δραστηριότητα της οδού της σορβιτόλης 25,26 β) την μη-ενζυματική γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών και των λιπιδίων, που καταλήγει στον σχηματισμό των τελικών προϊόντων προηγμένης γλυκοζυλίωσης (Advanced Glycation End Products- AGEs) 27,28 γ) την ενεργοποίηση των ισομορφών της πρωτεϊνικής κινάσης C (Protein Kinase C, PKC) 29,30 δ) την αυξημένη ροή στο μονοπάτι της εξοζαμίνης Σύμφωνα με την ενοποιημένη θεωρία, που έχει προταθεί από τον Michael Brownlee, το αποτέλεσμα της υπεργλυκαιμίας είναι η αύξηση του οξειδωτικού στρες (Oxidative stress, OS), καθώς όλοι οι προαναφερόμενοι μηχανισμοί καταλήγουν στην υπερπαραγωγή σουπεροξειδίου (Ο2 ) από την μιτοχονδριακή άλυσο μεταφοράς ηλεκτρονίων 34,35. Μπορεί το OS να είναι το κοινό σημείο κατάληξης, όλων των 15

12 προκαλούμενων από την υπεργλυκαιμία μηχανισμών, ταυτόχρονα όμως υφίσταται και ένα σύστημα θετικής ανατροφοδότησης. Για παράδειγμα το OS, που προκαλείται από την υπεργλυκαιμία, προάγει τον σχηματισμό των AGEs και την ενεργοποίηση της PKC καθώς επίσης ο σχηματισμός των AGEs επάγει το OS και την ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων 36. Δημιουργείται επομένως ένας φαύλος κύκλος που συντηρεί την αθηροσκλήρωση και ευθύνεται για την πρόκληση των διαβητικών αγγειακών επιπλοκών. Στην εικόνα που ακολουθεί απεικονίζονται οι μηχανισμοί μέσω των οποίων η υπεργλυκαιμία συνδέεται με τις επιπλοκές της αθηροσκλήρωσης 37. Εικόνα 1. Μηχανισμοί πρόκλησης διαβητικών αγγειακών επιπλοκών Το μονοπάτι των πολυολών Η ενεργοποίηση της οδού των πολυολών, που καταλήγει στον σχηματισμό της σορβιτόλης με την βοήθεια του ενζύμου ρεντουκτάσης της αλδόζης, συσχετίστηκε με την αιτιοπαθογένεια της διαβητικής νευροπάθειας, ήδη από το Η ρεντουκτάση της αλδόζης σε φυσιολογικές συνθήκες χρησιμεύει για την αδρανοποίηση των τοξικών αλδεϋδομάδων. Σε καταστάσεις όμως αυξημένης ενδοκυττάριας συγκέντρωσης της γλυκόζης, το ένζυμο αυτό χρησιμεύει για την μετατροπή της σε σορβιτόλη. Η συγκεκριμένη αντίδραση πραγματοποιείται με την βοήθεια του 16

13 συνενζύμου φωσφορο-νικοτιναμινο-αδενινο δινουκλεοτιδίου (NADPH). Το NADPH είναι επίσης απαραίτητο για την αντιοξειδωτική άμυνα του κυττάρου, καθώς χρησιμεύει για την μετατροπή της γλουταθειόνης στην αναγμένη της μορφή. Το αποτέλεσμα της ενεργοποίησης της οδού των πολυολών είναι να καθίσταται το κύτταρο ευάλωτο στις οξειδωτικές μετατροπές 25,26,38. Εικόνα 2. Ενεργοποίηση της οδού των πολυολών Σχηματισμός των τελικών προϊόντων προηγμένης γλυκοζυλίωσης Ο σχηματισμός των AGEs αναγνωρίστηκε ως ένας από τους σημαντικότερους μηχανισμούς πρόκλησης αγγειακής δυσλειτουργίας ήδη από τα τέλη της δεκαετίας του Τα AGEs είναι μία ετερογενής ομάδα ουσιών, που δημιουργούνται από την μη ενζυμική γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών, λιπιδίων, νουκλεϊκών οξέων και εντοπίζονται τόσο στον ενδοκυττάριο, όσο και στον εξωκυττάριο χώρο. Στη συνέχεια θα αναφερθούν οι μηχανισμοί δράσης των ενδοκυττάριων AGEs, ενώ η αναλυτική περιγραφή του σχηματισμού των εξωκυττάριων AGEs και των δράσεών τους θα περιγραφούν σε μεταγενέστερο σημείο. Όλα τα κύτταρα του οργανισμού δεν συμπεριφέρονται με τον ίδιο τρόπο σε καταστάσεις υπεργλυκαιμίας. Ορισμένα κύτταρα έχουν την ικανότητα να ελαττώνουν την μεταφορά της γλυκόζης στο εσωτερικό τους, με αποτέλεσμα να διατηρείται 17

14 σταθερή η ενδοκυττάρια συγκέντρωση της γλυκόζης. Ορισμένα όμως κύτταρα, όπως είναι τα ενδοθηλιακά και τα μεσσαγγειακά, αδυνατούν να μειώσουν αποτελεσματικά την μεταφορά της γλυκόζης, με αποτέλεσμα να αυξάνεται σημαντικά η ενδοκυττάρια συγκέντρωσή της 40,41. Η ενδοκυττάρια υπεργλυκαιμία ευθύνεται για την δημιουργία των ενδοκυττάριων AGEs, που με τη σειρά τους, μέσω τριών μηχανισμών, προκαλούν την κυτταρική δυσλειτουργία. Ο πρώτος μηχανισμός αφορά την τροποποίηση ενδοκυττάριων πρωτεϊνών και κυρίως προκαλεί γλυκοζυλίωση πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ρύθμιση μεταγραφικών γονιδίων 28,42. Σύμφωνα με τον δεύτερο μηχανισμό, τα ενδοκυττάρια AGEs διαχέονται στο εξωτερικό του κυττάρου, προκαλώντας τροποποιήσεις μακρομορίων της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Οι μετατροπές αυτές μεταβάλουν τη μετάδοση του σήματος μεταξύ των συστατικών της θεμέλιας ουσίας και του κυττάρου, με συνεπακόλουθο την κυτταρική δυσλειτουργία 43,44. Η διάχυση των ενδοκυττάριων AGEs στον εξωκυττάριο χώρο προκαλεί επίσης γλυκοζυλίωση πρωτεϊνών του αίματος, όπως είναι η αλβουμίνη. Η γλυκοζυλιωμένες πλέον πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με ειδικούς υποδοχείς της επιφανείας των κυττάρων, με τελικό αποτέλεσμα την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων Η σύνδεση των AGEs με τους υποδοχείς τους (AGE-R) είναι ένας μηχανισμός που αφορά τόσο τα ενδοκυττάρια, όσο και τα εξωκυττάρια AGEs και θα περιγραφεί αναλυτικά στην συνέχεια. Εικόνα 3. Μηχανισμός δράσης ενδοκυττάριων AGEs

15 1. 3 Ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C Στις αρχές της δεκαετίας του 1990 ένας τρίτος μηχανισμός, η ενεργοποίηση των ισομορφών της PKC, διαπιστώθηκε ότι συμβάλλει στην πρόκληση των αγγειακών επιπλοκών, ενισχύοντας ακόμη περισσότερο την στενή σχέση που υφίσταται μεταξύ υπεργλυκαιμίας και αθηροσκλήρωσης. Η PKC αντιπροσωπεύει μια οικογένεια κινασών, που περιέχει τουλάχιστον 12 ισομορφές. Η υπεργλυκαιμία επάγει τον σχηματισμό της διακυλογλυκερόλης (DAG), η οποία με την σειρά της ενεργοποιεί τις ισομορφές β, δ και α της PKC 29,30,49,50. Η ενεργοποίηση της PKC συμβάλει στη μεταγραφή αυξητικών παραγόντων, με κυριότερο εκπρόσωπο τον TGF-β (Transforming Growth Factor). Ο TGF-β ενεργοποιεί τη γονιδιακή έκφραση πρωτεογλυκανών και κολλαγόνου και ελαττώνει τη σύνθεση πρωτεολυτικών ενζύμων, που αποικοδομούν τις πρωτεΐνες της μεσοκυττάριας ουσίας, προκαλώντας μεσαγγειακή υπερπλασία και πάχυνση της βασικής μεμβράνης των τριχοειδών 51,52. Επίσης η PKC προκαλεί αγγειοσύσπαση, μέσω ελάττωσης του μονοξειδίου του αζώτου (NO) και αύξησης της ενδοθηλίνης 1 (ET-1), 53 καθώς και έκφραση προφλεγμονωδών γονιδίων, μέσω αύξησης του πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα κβ (Nuclear Factor κβ, NF- Κβ) 54. Επομένως η PKC διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην αλληλεπίδραση των αιμοδυναμικών και μεταβολικών μηχανισμών, δηλαδή στην αλληλεπίδραση της υπέρτασης και της υπεργλυκαιμίας στην παθογένεια της διαβητικής νεφροπάθειας (εικόνα 4). Η ιδιαίτερη σημασία του συγκεκριμένου μηχανισμού προκύπτει από μελέτες σε πειραματόζωα, όπου η χορήγηση αναστολέων της PKC είχε ως αποτέλεσμα την βελτίωση των πρώιμων διαβητικών μικροαγγειακών επιπλοκών 55,56. Εικόνα 4. Δράσεις ενεργοποιημένης PKC

16 1. 4 Η οδός της Εξοζαμίνης Ο πιο πρόσφατος μηχανισμός, που εμπλέκεται στους μοριακούς μηχανισμούς της αθηροσκλήρωσης, ως αποτέλεσμα της αυξημένης συγκέντρωσης γλυκόζης στο κύτταρο, είναι η αυξημένη ροή στο μονοπάτι της εξοζαμίνης. Σε καταστάσεις υπερλυκαιμίας ένα μέρος της 6 φωσφορικής φρουκτόζης, που προκύπτει από τον μεταβολισμό της γλυκόζης, εισέρχεται σε ένα άλλο σηματοδοτικό μονοπάτι διαμέσου του οποίου με την βοήθεια ειδικών ενζύμων, μετατρέπεται τελικά σε ουρίδινοδιφοσφωρική-ν-ακέτυλο-γλυκοζαμίνη (UDPGLcNAc). Στη συνέχεια η N- ακέτυλογλυκοζαμίνη τροποποιεί ορισμένους μεταγραφικούς παράγοντες, με συνεπακόλουθο την παθολογική γονιδιακή έκφραση Στην εικόνα 4 παρουσιάζονται αναλυτικά οι αντιδράσεις της οδού της εξοζαμίνης. Σύμφωνα με πρόσφατες βιβλιογραφικές αναφορές προκύπτει ότι η συγκεκριμένη οδός σχετίζεται με την παθολογική γονιδιακή έκφραση στα κύτταρα του σπειράματος καθώς επίσης και με την δυσλειτουργία των μυοκαρδιακών και ενδοθηλιακών κυττάρων 57,58. Εικόνα 5. Συνέπειες της αυξημένης ροής της οδού της εξοζαμίνης, ως αποτέλεσμα της υπεργλυκαιμίας 39. Τα κοινά σημεία των προηγούμενων μηχανισμών είναι δύο. Καταρχήν υπάρχει μια κοινή αφετηρία, που δεν είναι άλλη από την υπεργλυκαιμία, και κατά δεύτερο υπάρχει μια κοινή κατάληξη, που είναι η αύξηση του σουπεροξειδίου από την μιτοχονδριακή αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων. Η υπερπαραγωγή σουπεροξειδίου 20

17 προκαλεί με την σειρά της αναστολή του ενζύμου φωσφορική-δευδρογενάση της 3- γλυκεραλδεΰδης (GAPDH), με αποτέλεσμα να αυξάνεται η 3-φωσφορικήγλυκεραλδεΰδη καθώς αποτελεί το υπόστρωμα του ενζύμου GAPDH. Στη συνέχεια η 3-φωσφορική-γλυκεραλδεΰδη ενεργοποιεί τόσο την PKC, όσο και τον σχηματισμό των ενδοκυττάριων AGEs 59. Με αυτόν τον τρόπο συντηρείται ο φαύλος κύκλος. Στην εικόνα 6 που ακολουθεί απεικονίζονται οι τέσσερις μηχανισμοί μέσω των οποίων η υπεργλυκαιμία προάγει και επιταχύνει την αθηροσκλήρωση. Η δημιουργία των AGEs, όπως προκύπτει από την βιβλιογραφία, έχει ιδιαίτερη σημασία στην παθοφυσιολογία της αθηροσκλήρωσης και στη συνέχεια θα γίνει λεπτομερής αναφορά των αντιδράσεων σχηματισμού τους, καθώς και του τρόπου δράσης τους. Εικόνα 6. Μοριακοί μηχανισμοί πρόκλησης διαβητικών επιπλοκών

18 2. Βιοχημεία της μη ενζυμικής γλυκοζυλίωσης Το 1912 ο γάλλος χημικός Maillard περιέγραψε το πρώτο στάδιο των αντιδράσεων της μη ενζυμικής γλυκοζυλίωσης 60 που είναι γνωστό και ως αντίδραση Maillard. Ο Maillard παρατήρησε ότι όταν τα σάκχαρα υφίστανται θερμική επεξεργασία με αμινοξέα, πραγματοποιείται μία μη ενζυμική διαδικασία, που καταλήγει στην μεταβολή του χρώματος των τροφίμων. Αρχικά οι αντιδράσεις της μη ενζυμικής γλυκοζυλίωσης απασχόλησαν τους επιστήμονες που ασχολούνταν με την βιοχημεία των τροφίμων, καθώς διαπιστώθηκε ότι η συγκεκριμένη αντίδραση σχετίζεται με το χρώμα, την γεύση και την βιολογική σημασία των τροφίμων 61. Η κλινική σημασία της μη ενζυμικής γλυκοζυλίωσης αναγνωρίστηκε αργότερα, όταν διαπιστώθηκε ότι οι ασθενείς με ΣΔ έχουν αυξημένη συγκέντρωση γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης (HbA1c) 62. Τα AGEs είναι μία ετερογενής ομάδα ουσιών, που προέρχονται από την μη ενζυμική γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών, λιπιδίων και νουκλεϊκών οξέων. Η μη ενζυμική γλυκοζυλίωση θεωρείται μία από τις πιο συχνές μετα-μεταφραστικές μετατροπές. Σε φυσιολογικές καταστάσεις αυξημένη μη ενζυμική γλυκοζυλίωση παρατηρείται κατά την γήρανση, ενώ σε παθολογικές καταστάσεις το φαινόμενο σχετίζεται με αρκετά νοσήματα, με κυριότερο εκπρόσωπο τον σακχαρώδη διαβήτη 63,64. Το πρώτο στάδιο σχηματισμού των AGEs περιλαμβάνει την αντίδραση Maillard σύμφωνα με την οποία οι ελεύθερες αμινοομάδες των μακρομορίων, όπως πρωτεϊνών, λιπιδίων και νουκλεϊκών οξέων, αντιδρούν με τις αλδεϋδοομάδες ή κετονοομάδες σακχάρων, όπως η γλυκόζη. Συγκεκριμένα για τις πρωτεΐνες, το αμινοξύ λυσίνη είναι εκείνο που αντιδρά με τη γλυκόζη. Η αντίδραση αυτή ονομάζεται μη ενζυματική γλυκοζυλίωση, πραγματοποιείται μέσα σε χρονικό διάστημα λίγων μόνο ωρών και καταλήγει στο σχηματισμό ασταθών γλυκοζυλιωμένων ενώσεων που λέγονται βάσεις του Schiff. Τα ασταθή αυτά μόρια υπόκεινται σε διάφορες ενδομοριακές ανακατατάξεις, που διαρκούν μεγαλύτερο χρονικό διάστημα (εντός εβδομάδων) και καταλήγουν σε πιο σταθερά προϊόντα, τα προϊόντα Amadori, όπως η αιμοσφαιρίνη A1c. Τα προϊόντα Amadori, χαρακτηρίζονται ως πρώιμα προϊόντα μη ενζυμικής γλυκοζυλίωσης, υφίστανται μία σειρά αντιδράσεων, όπως σταδιακή μοριακή επαναδιευθέτηση, αφυδάτωση, 22

19 συμπύκνωση, διάσπαση, οξείδωση και τελικά καταλήγουν στη δημιουργία των τελικών προϊόντων προηγμένης γλυκοζυλίωσης (AGEs ) Το στάδιο μετατροπής των προϊόντων Amadori σε AGEs είναι μια μη αντιστρεπτή αντίδραση και έχει μεγάλη χρονική διάρκεια, από μήνες έως χρόνια. Γι αυτόν τον λόγο τα μακρομόρια στα οποία παρατηρούνται αυτού του είδους οι μετατροπές είναι εκείνα με μεγάλο χρόνο ημίσειας ζωής, όπως το κολλαγόνο του αγγειακού τοιχώματος 70. Στις εικόνες 7 και 8 φαίνονται τα διάφορα στάδια και η χρονική εξέλιξη των αντιδράσεων της μη ενζυματικής γλυκοζυλίωσης μέχρι τον τελικό σχηματισμό των AGEs 71,72 Η κλασική άποψη ότι τα AGEs σχηματίζονται μόνο σε εξωκυττάριες πρωτεΐνες με μεγάλο χρόνο ημίσειας ζωής, όπως το κολλαγόνο, έχει αρχίσει πλέον να αναθεωρείται. Σήμερα επικρατεί η άποψη ότι AGEs μετατροπές υφίστανται ακόμη και ενδοκυττάρια μόρια με μικρό χρόνο ζωής, όπως αυξητικοί παράγοντες 28. Εκτός από τα ενδογενή AGEs, τελευταία γίνεται λόγος και για τα εξωγενούς προέλευσης AGEs, αυτά που σχετίζονται με την πρόσληψη της τροφής ή και με το κάπνισμα. Η σημασία των εξωγενών AGEs στην παθογένεια των διαβητικών επιπλοκών δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί πλήρως 73. Οι αντιδράσεις μη ενζυμικής γλυκοζυλίωσης δεν αφορούν μόνο τις πρωτεΐνες. Η μετατροπή των λιπών σε AGEs δημιουργείται κατά την χημική αντίδραση των φωσφολιπιδίων που περιέχουν στο μόριό τους πρωτοταγείς αμίνες με τη γλυκόζη. Γλυκοζυλίωση υφίστανται τόσο οι λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (Low density lipoproteins, LDL), όσο και οι λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας (High density lipoproteins, HDL) με αποτέλεσμα να καθίστανται περισσότερο ευάλωτες σε οξειδωτική τροποποίηση Η γλυκοζυλίωση των λιπιδίων δημιουργείται σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση και με το χρόνο έκθεσης στη γλυκόζη 78. Μετατροπές σε AGEs μπορούν να υποστούν και τα μόρια του DNA κατά την αντίδραση της γλυκόζης με την αμονομάδα των νουκλεοτιδίων. Η γουανίνη είναι η βάση του DNA που κυρίως αντιδρά με τη γλυκόζη. Η προηγμένη γλυκοζυλίωση του DNA μπορεί να επηρεάσει τον μεταβολισμό του, είτε προκαλώντας μεταλλάξεις, είτε αδρανοποιώντας τους μηχανισμούς της επιδιόρθωσης 39,40. Ο βαθμός της μη ενζυμικής γλυκοζυλίωσης καθορίζεται κυρίως από την συγκέντρωση της γλυκόζης και από το οξειδοαναγωγικό δυναμικό που επικρατεί στο ιστικό μικροπεριβάλλον. Σε καταστάσεις αυξημένου OS ο σχηματισμός των AGEs αυξάνεται σημαντικά 69,

20 Εικόνα 7: Βιοχημικά στάδια σχηματισμού των AGEs 71. Εικόνα 8. Χρονική αλληλουχία των αντιδράσεων σχηματισμού των AGEs

21 3. Ταξινόμηση των τελικών προϊόντων προηγμένης γλυκοζυλίωσης Τα AGEs είναι μία ετερογενής ομάδα ουσιών και ανάλογα με τις πρωτεΐνες από τις οποίες προέρχονται, διαθέτουν διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες. Μία χαρακτηριστική ιδιότητα, που έχουν ορισμένα AGEs, είναι η ικανότητα του φθορισμού, ενώ κάποια άλλα έχουν την ιδιότητα να προκαλούν διασύνδεση των πρωτεϊνών. Η διασύνδεση έχει την έννοια της δημιουργίας σταθερών συνδέσεων μεταξύ των πρωτεϊνών, που είναι γνωστές ως cross-links 80,81. Με βάση λοιπόν την ιδιότητα του φθορισμού και την δημιουργία των cross-links, τα AGEs ταξινομούνται σε τρεις κατηγορίες. Τα φθορίζοντα διασυνδεδεμένα AGEs, όπως η πεντοζιδίνη και η crossline. Η πεντοζιδίνη σχηματίζεται μεταξύ των υπολειμμάτων αργινίνης και λυσίνης και τα επίπεδά της αυξάνονται στον ΣΔ 82. H crossline ανακαλύφθηκε αρχικά στους νεφρούς διαβητικών αρουραίων και μπορεί να σχηματιστεί τόσο in vitro, όσο και in vivo 83. Τα μη φθορίζοντα διασυνδεδεμένα AGEs, όπως η ιμιδαζόλη της αργινίνηςλυσίνης (ALI). Το ALI, που έχει πρόσφατα απομονωθεί, είναι ένα ενδοκυττάριο μόριο

22 Τα μη διασυνδεδεμένα AGEs, όπως η πυραλίνη και η Ν-καρβοξυ-μεθυλολυσίνη (CML). Η CML σχηματίζεται από την οξειδωτική διάσπαση των προϊόντων Amadori και κατά την διάρκεια της οξείδωσης των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων παρουσία πρωτεϊνών. Είναι ένα από τα κυριότερα AGEs in vivo και τα επίπεδά του αυξάνονται στο κολλαγόνο του δέρματος των διαβητικών 85,86. Ο ρόλος των διαφορετικών τύπων AGEs στην παθογένεια των διαβητικών επιπλοκών παραμένει ακόμη ασαφής. Για παράδειγμα τα επίπεδα της CML αυξάνονται στους διαβητικούς με αμφιβληστροειδοπάθεια και όχι σε αυτούς με νεφροπάθεια, ενώ τα επίπεδα της πεντοσιδίνης αυξάνονται και στις δύο περιπτώσεις 87. Σε μία πρόσφατη μελέτη διαπιστώθηκε ότι γενετικοί παράγοντες καθορίζουν τα επίπεδα των AGEs και είναι αυτοί που προδιαθέτουν στην εμφάνιση των υποκείμενων διαβητικών επιπλοκών Υποδοχείς των τελικών προϊόντων προηγμένης γλυκοζυλίωσης Η αλληλεπίδραση των AGEs με κατάλληλους υποδοχείς που υπάρχουν στην επιφάνεια των κυττάρων διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την αθηροσκλήρωση. Τα τελευταία χρόνια έχουν ταυτοποιηθεί αρκετά πρωτεϊνικά μόρια με ιδιότητες υποδοχέα των AGEs. Ανάμεσα στα μόρια αυτά συμπεριλαμβάνονται: η λακτοφερίνη, 89 η πρωτείνη 48 (AGE-R1), η πρωτεΐνη 80 Κ-Η (AGE-R2), 90 η λυσοζύμη, 91 η γαλεκτίνη-3, 92 οι υποδοχείς εκκαθαριστές των μακροφάγων τύπου Ι και ΙΙ, 93 η πρωτεΐνη CD-36 94, η πρωτεΐνη 26

23 LOX-1 95 καθώς και ο πλέον καλά μελετημένος υποδοχέας των AGEs, ο RAGE (Receptor of Advanced Glycation End Products) Δομή του RAGE Ο RAGE ανακαλύφθηκε και κλωνοποιήθηκε το 1992 και αρχικά θεωρήθηκε ότι λειτουργεί ως ένας υποδοχέας εκκαθαριστής (scavenger), συμβάλλοντας στην απομάκρυνση-κάθαρση των AGEs από τον οργανισμό. Σύντομα η αρχική αυτή αντίληψη εγκαταλείφθηκε και την θέση της πήρε η άποψη ότι ο RAGE είναι ένας υποδοχέας μετάδοσης σήματος, μέσω διαφόρων οδών 96,97. Ο RAGE είναι ένας κυτταρικός υποδοχέας επιφανείας και μέλος της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών. Το γονίδιο του RAGE βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6 μεταξύ των γονιδίων που κωδικοποιούν τα μόρια τάξης Ι και ΙΙΙ του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας 98. Διαθέτει εξωκυττάριο τμήμα, αποτελούμενο από μία μεταβλητή περιοχή (V-type) και από δύο σταθερές (C-type), διαμεμβρανική περιοχή και ενδοκυττάρια κυτταροπλασματική ουρά. Η μεταβλητή περιοχή χρησιμεύει για την σύνδεση του υποδοχέα με τα διάφορα μόρια, κυρίως όμως με τα AGEs, ενώ οι σταθερές περιοχές συμβάλλουν στην σταθεροποίηση της μεταβλητής περιοχής 46,99,100. Οι υποδοχείς RAGE εντοπίζονται σε διάφορα κύτταρα, όπως στα ενδοθηλιακά κύτταρα, στις λείες μυϊκές ίνες, στα λεμφοκύτταρα, στα μονοκύτταρα / μακροφάγα, στους ινοβλάστες, στα μεσαγγειακά κύτταρα του νεφρού και στους νευρώνες 101,102. Ο αριθμός των υποδοχέων RAGE δεν παραμένει σταθερός. Σε παθολογικές καταστάσεις, όπως στον ΣΔ, λόγω της επίμονης υπεργλυκαιμίας συσσωρεύονται σε μεγάλες ποσότητες τα AGEs, γεγονός που προκαλεί υπερέκφραση του RAGE. Εκτός από την αυξημένη έκφραση παρατηρείται και μια ρύθμιση του υποδοχέα προς τα πάνω (upregulation) Ισομορφές του RAGE Σύμφωνα με πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα υπάρχουν διάφορες ισομορφές του RAGE, που προκύπτουν από το διαφορετικό μάτισμα (splicing) του m RNA του RAGE. Τρεις είναι οι κύριες ισομορφές: η πλήρους μήκους (full-length) RAGE, η κυρίαρχη αρνητική (dominant negative, DN-RAGE) και η εκκριτική διαλυτή 27

24 (secretory-soluble RAGE, srage). Υπάρχουν ωστόσο και άλλες ισομορφές λιγότερο μελετημένες. Οι τρεις κύριες ισομορφές του RAGE διαθέτουν όλες μία μεταβλητή και δύο σταθερές περιοχές, ενώ διαφέρουν ως προς την διαμεμβρανική περιοχή και την ενδοκυττάρια κυτταροπλασματική ουρά Full-length RAGE Η πλέον καλά μελετημένη ισομορφή του RAGE είναι η full-length, διαδραματίζοντας σημαντικό ρόλο τόσο σε φυσιολογικές, όσο και σε παθολογικές καταστάσεις. Η full-length μορφή, εκτός από το εξωκυττάριο τμήμα, περιλαμβάνει μία διαμεμβρανική αλυσίδα καθώς και μία μικρή ενδοκυττάρια περιοχή. Η ενδοκυττάρια περιοχή είναι απαραίτητη για την μετάδοση του σήματος. Η συνένωση των AGEs με τους RAGE πυροδοτεί έναν καταρράκτη αντιδράσεων μέσω διαφόρων οδών με τελικό αποτέλεσμα την επαγωγή της γονιδιακής έκφρασης. Η μεταγωγή του σήματος πραγματοποιείται είτε μέσω ενεργοποίησης του πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα NF-kB, είτε με τη διαμεσολάβηση ορισμένων κινασών (MAPK, JAK- STAT) Soluble RAGE Ο srage αποτελείται από το εξωκυττάριο τμήμα του υποδοχέα και στερείται την διαμεμβρανική περιοχή, με αποτέλεσμα να απελευθερώνεται στον εξωκυττάριο χώρο και να αλληλεπιδρά με όλα τα μόρια που έχουν την ικανότητα σύνδεσης με τον RAGE, κυρίως όμως με τα AGEs. Η αλληλεπίδραση του srage με τα AGEs έχει ως αποτέλεσμα την αδρανοποίηση των AGEs. Με τον τρόπο αυτό παρεμποδίζεται η συνένωση των AGEs με το full-length RAGE, επομένως διακόπτεται ο καταρράκτης των αντιδράσεων, που ευθύνεται για την έναρξη και την συντήρηση της φλεγμονώδους διεργασίας. Ο srage επομένως είναι ένας από τους κύριους ρυθμιστές της έκφρασης του full-length RAGE, καταστέλλοντας την ενεργοποίησή του, μέσω ελάττωσης των συγκεντρώσεων των κυκλοφορούντων AGEs. Η ανασταλτική επίδραση του srage στην μετάδοση του σήματος μέσω του full-length RAGE έχει επιβεβαιωθεί από αρκετές μελέτες σε διαγονιδιακά ποντίκια. Η χορήγηση του srage σε ποντίκια, που είχαν καταστεί διαβητικά και ανενεργά για το γονίδιο της απολιποπρωτεΐνης Ε, είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή της αθηροσκλήρωσης κατά έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο

25 Dominant negative RAGE Η λιγότερο μελετημένη από τις τρεις ισομορφές του RAGE είναι ο DNRAGE. Ο DNRAGE μοιάζει αρκετά με τον full-length τύπο, με την διαφορά ότι στερείται την ενδοκυττάρια κυτταροπλασματική περιοχή, η οποία όπως έχει αναφερθεί είναι απαραίτητη για την μετάδοση του σήματος. Αν και ο ακριβής ρόλος του DNRAGE δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως, η επικρατούσα άποψη είναι ότι χρησιμεύει για την παρεμπόδιση της ενεργοποίησης του full-length τύπου. Ο DNRAGE συνδέεται με όλα τα μόρια που αλληλεπιδρούν με τον full-length RAGE, τα οποία με αυτόν τον τρόπο παγιδεύονται στην επιφάνεια του κυττάρου και δεν είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με τον full-length RAGE 115,116. Σύμφωνα με πρόσφατες βιβλιογραφικές αναφορές, εκτός από τις τρεις κύριες μορφές του RAGE, υπάρχουν και άλλες ισομορφές, ο ακριβής ρόλος των οποίων δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί πλήρως 103,108. Χαρακτηριστική είναι η εργασία των Ding και συνεργατών που αναφέρουν την παρουσία τριών νέων τύπων του RAGE στον ανθρώπινο εγκέφαλο 107. Στις εικόνες 9 και 10 απεικονίζονται οι ισομορφές του RAGE καθώς και η κατασταλτική επίδραση των δύο κύριων ισομορφών (srage, DNRAGE) στην μετάδοση του σήματος μέσω του full-length RAGE. Εικόνα 9. Ισομορφές του RAGE 117. Αριστερά απεικονίζονται οι τρεις κύριες ισομορφές του RAGE, ενώ στα δεξιά παρουσιάζονται τρεις από τις νεότερες μορφές του υποδοχέα. 29

26 Εικόνα 10. Αλληλεπίδραση μεταξύ των τριών κύριων ισομορφών του RAGE 117. Ο srage και DNRAGE παγιδεύοντας τις ουσίες που ενεργοποιούν τον RAGE (στην συγκεκριμένη περίπτωση το β αμυλοειδές) καταστέλλουν την μετάδοση του σήματος Πολυμορφισμοί του RAGE Τα τελευταία χρόνια ιδιαίτερη έμφαση έχει δοθεί στην μελέτη των πολυμορφισμών του γονιδίου του RAGE καθώς φαίνεται να επηρεάζουν την λειτουργικότητα του υποδοχέα. Υπάρχουν εργασίες που αναφέρουν ότι ένας συγκεκριμένος πολυμορφισμός στον προαγωγέα του γονιδίου του RAGE (-374Τ/Α) συνδέεται με μικρότερο κίνδυνο ανάπτυξης ΣΝ σε διαβητικούς. Επίσης ο συγκεκριμένος πολυμορφισμός διαπιστώθηκε ότι συσχετίζεται με την βαρύτητα της αγγειογραφικά αποδεδειγμένης ΣΝ σε μη διαβητικούς ασθενείς. Ταυτόχρονα όμως κάποιες άλλες εργασίες αμφισβητούν την συσχέτιση του συγκεκριμένου πολυμορφισμού με τον κίνδυνο εμφάνισης ΣΝ Η παρουσία του πολυμορφισμού G82S, που αφορά την μεταβλητή περιοχή του RAGE, όπως έχει προκύψει από μελέτες, συσχετίζεται με την ρευματοειδή αρθρίτιδα και τον ΣΔ 124,125. Ο κατάλογος με τους πολυμορφισμούς του RAGE διευρύνεται ολοένα και περισσότερο αποδεικνύοντας τον σημαντικό ρόλο που διαδραματίζει το γονιδιακό υπόστρωμα στην έκφραση και στην λειτουργικότητα του RAGE. 30

27 4. 4 Ο πολυσυνδετικός υποδοχέας RAGE Ο RAGE είναι ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας επιφανείας και μέλος της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών 46,99. Όταν πρωτοπεριγράφηκε το 1992 θεωρήθηκε ως ο κύριος υποδοχέας σύνδεσης των AGEs. Σύντομα όμως διαπιστώθηκε η ικανότητά του να αλληλεπιδρά με διάφορα μόρια (συνδέματαligands) πέραν των AGEs, γεγονός που ανέδειξε τον σημαντικό ρόλο του σε μία πληθώρα παθολογικών καταστάσεων. Τα AGEs είναι προϊόντα μη ενζυμικής γλυκοζυλίωσης πρωτεϊνών, λιπιδίων και νουκλεϊκών οξέων και σχηματίζονται στον ΣΔ ως αποτέλεσμα της υπεργλυκαιμίας 8,126. Η συνένωση των AGEs με τους RAGE πυροδοτεί έναν καταρράκτη αντιδράσεων, με τελικό αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα NF-kB και συνεπώς την αύξηση της γονιδιακής έκφρασης. Η ενεργοποίηση του άξονα AGEs-RAGE συμβάλλει στην αιτιοπαθογένεια των διαβητικών αγγειακών επιπλοκών, όπως έχει προκύψει από μελέτες, τόσο σε πειραματόζωα, 112,127,128 όσο και σε ανθρώπους 129,130. Τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον στρέφεται στην συμμετοχή του άξονα AGEs-RAGE στην παθοφυσιολογία της ευγλυκαιμικής αθηροσκλήρωσης και συγκεκριμένα της ΣΝ 10,131,132. Οι S100/calgranulins είναι μία οικογένεια αποτελούμενη από περίπου είκοσι ομόλογες πρωτεΐνες, που συνδέονται με το ασβέστιο, και απελευθερώνονται από ενεργοποιημένα φλεγμονώδη κύτταρα, όπως τα πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα και τα μονοπύρηνα μακροφάγα. Τα μέλη αυτής της οικογένειας συγκεντρώνονται στον εξωκυττάριο χώρο σε καταστάσεις χρόνιας φλεγμονής 133. Ο RAGE συνδέεται με διάφορα μέλη της οικογένειας, όπως με την S100A12, την S100B, την S100A1, την S100A4 και την S100P. Η αλληλεπίδραση του RAGE με τις S100/calgranulins καταλήγει στην κυτταρική ενεργοποίηση και δυσλειτουργία του αγγειακού τοιχώματος 134. Μία άλλη κατηγορία μορίων που αλληλεπιδρούν με τον RAGE είναι η οικογένεια των πρωτεϊνών υψηλής κινητικότητας (High mobility group protein-1, HMGP-1). Πρόκειται για μια ομάδα πρωτεϊνών του πυρήνα που διευκολύνουν την μεταγραφή των γονιδίων, σταθεροποιώντας τον σχηματισμό του νουκλεοσώματος 135. Εκτός από πυρηνική πρωτεΐνη, φαίνεται να συμμετέχει στην κυτταρική 31

28 μετανάστευση, την διήθηση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Η συγκεκριμένη δράση πραγματοποιείται μέσω της σύνδεσής της με τον RAGE και αναστέλλεται από την εξωκυττάρια διαλυτή μορφή του RAGE 136. Επίσης ο άξονας HMGP-RAGE συμμετέχει και κατά την ανάπτυξη των νευρικών κυττάρων 137. Τέλος, ο RAGE συμμετέχει στην παθοφυσιολογία νευροεκφυλιστικών νοσημάτων, όπως είναι η νόσος Alzheimer, καθώς προάγει την φλεγμονή μέσω αλληλεπίδρασης με το β αμυλοειδές 138,139. Επίσης συνδέεται και με το Α αμυλοειδές, που είναι χαρακτηριστικό της συστηματικής αμυλοείδοσης 140. Συμπερασματικά ο RAGE είναι ένας πολυσυνδετικός υποδοχέας που διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθοφυσιολογία πολλών νοσημάτων Μετάδοση του σήματος μέσω του RAGE Η αρχική αντίληψη ότι ο RAGE είναι ένας υποδοχέας εκκαθαριστής (scavenger), συμβάλλοντας στην απομάκρυνση-κάθαρση των AGEs από τον οργανισμό σύντομα αναθεωρήθηκε και την θέση της πήρε η άποψη ότι ο RAGE είναι ένας υποδοχέας μετάδοσης σήματος, μέσω διαφόρων οδών 96,97. Η σύνδεση του RAGE με τα AGEs, και όχι μόνο, σηματοδοτεί το αρχικό σημείο έναρξης ενός καταρράκτη αντιδράσεων μέσω διαφόρων οδών με τελικό αποτέλεσμα την αύξηση της γονιδιακής έκφρασης. Δύο είναι τα κομβικά σημεία στις αντιδράσεις μετάδοσης του σήματος μέσω του RAGE: η αύξηση του ενδοκυττάριου OS καθώς και η ενεργοποίηση του πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα NF-kB. Η αλληλεπίδραση του RAGE με τα AGEs καταστέλλει την αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού μέσω της οξειδάσης του NADPH, με αποτέλεσμα την αύξηση του ενδοκυττάριου OS 96,141. Σε φυσιολογικές συνθήκες ο NF-kB βρίσκεται στο κυτταρόπλσμα στην ανενεργή μορφή του συνδεδεμένος με το ανασταλτικό μόριο IkBa. Μετά την ενεργοποίηση του RAGE ο IkBa φωσφορυλιώνεται, αποδεσμεύεται από τον NF-kB και προκαλεί την μετάθεσή του στον πυρήνα. Στην συνέχεια ο NF-kB επάγει την μετάφραση προφλεγμονωδών γονιδίων, του RAGE καθώς και την de novo σύνθεση του ενεργοποιημένου NF-kB (NF-kBp65). Δημιουργείται επομένως ένας φαύλος κύκλος κατά τον οποίο ο RAGE ενεργοποιεί τον NF-kB, ο οποίος με τη σειρά του επάγει την έκφραση του RAGE και όλη η διαδικασία καταλήγει στην προς τα 32

29 πάνω ρύθμιση του υποδοχέα (up regulation) 142. Στις εικόνες που ακολουθούν απεικονίζονται οι οδοί μετάδοσης του σήματος μέσω του RAGE. Εικόνα 11. Εξαρτώμενη από τον RAGE ενεργοποίηση του πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα NF-kB 143. Εικόνα 12. Οδοί μετάδοσης του σήματος μέσω ενεργοποίησης του RAGE 8. 33

30 5. Τελικά προϊόντα προηγμένης γλυκοζυλίωσης και Αθηροσκλήρωση Ο σχηματισμός των AGEs είναι ένας από τους πιο σημαντικούς μοριακούς μηχανισμούς, που ευθύνεται για την έναρξη, προαγωγή και διατήρηση της αθηροσκλήρωσης. Τα AGEs αυξάνονται σε φυσιολογικές συνθήκες κατά την γήρανση και σε παθολογικές συνθήκες σε διάφορα νοσήματα, με κυριότερο εκπρόσωπο τον ΣΔ. Στον ΣΔ η δημιουργία των AGEs συμβάλλει στην πρόκληση τόσο των μικροαγγειακών επιπλοκών (αμφιβληστροειδοπάθεια, νευροπάθεια, νεφροπάθεια), όσο και της μακροαγγειακής νόσου (ΣΝ) 69. Τα τελευταία χρόνια η έρευνα εστιάζεται στο ρόλο που διαδραματίζουν τα AGEs στα πλαίσια της ευγλυκαιμικής αθηροσκλήρωσης. Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες οι συγκεντρώσεις των AGEs συσχετίζονται θετικά με τον βαθμό της στεφανιαίας αθηροσκλήρωσης σε μη διαβητικούς ασθενείς 10,144. Τα AGEs επιταχύνουν την αθηροσκλήρωση με διάφορους μηχανισμούς, που σε γενικές γραμμές μπορούν να ταξινομηθούν σε μη εξαρτώμενους από υποδοχείς (nonreceptor dependent) και σε εξαρτώμενους από υποδοχείς (receptor-mediated) 8, Μη εξαρτώμενοι από υποδοχείς μοριακοί μηχανισμοί Επιδράσεις των AGEs στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία Τα AGEs επηρεάζουν τις φυσικοχημικές, λειτουργικές και δομικές ιδιότητες διαφόρων συστατικών της θεμέλιας ουσίας. Το κολλαγόνο, που είναι μία πρωτεΐνη με μεγάλο χρόνο ημίσειας ζωής και αποτελεί βασικό συστατικό του αγγειακού τοιχώματος, συχνά υφίσταται μη ενζυμική γλυκοζυλίωση. Ο σχηματισμός των AGEs στο κολλαγόνο ευθύνεται για την δημιουργία των cross-links μεταξύ των ινιδίων του με συνεπακόλουθο την ελάττωση της ευενδοτότητας και την αύξηση της αρτηριακής δυσκαμψίας. Ο συγκεκριμένος μηχανισμός συνδέεται με την παθοφυσιολογία της αρτηριακής υπέρτασης και της διαστολικής καρδιακής ανεπάρκειας καθώς διαπιστώθηκε από μελέτες ότι η χορήγηση φαρμάκων που διασπούν τα cross-links (AGEs cross-links breakers) βελτιώνει την αρτηριακή ευενδοτότητα 81,146,147. Διάφορες πρωτεΐνες του πλάσματος, όπως η αλβουμίνη, η LDL και οι ανοσοσφαιρίνες IgG παγιδεύονται υπενδοθηλιακά, συνδέονται με τα ινίδια του 34

31 κολλαγόνου, που έχουν υποστεί γλυκοζυλίωση με αποτέλεσμα να δημιουργείται πάχυνση της βασικής μεμβράνης και ελάττωση της διαμέτρου του αυλού των αγγείων 148,149. Η γλυκοζυλίωση των συστατικών της μεσοκυττάριας ουσίας, όπως η λαμινίνη και η βιτρονεκτίνη, οδηγεί σε ελάττωση της θειϊκής ηπαράνης, τροποποίηση των περιοχών σύνδεσης των κυττάρων με το κολλαγόνο τύπου IV, με αποτέλεσμα να μεταβάλλεται η συνεκτικότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων και να διεγείρεται η παραγωγή εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Ο συγκεκριμένος μηχανισμός ευθύνεται για την πρόκληση της διαβητικής νεφροπάθειας 44,150,151. Τέλος τα AGEs προκαλούν κατά έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο μείωση του μονοξειδίου του αζώτου (NO) με αποτέλεσμα να μεταβάλλεται η ενδοθηλιο-εξαρτώμενη αγγειοδιαστολή. 152 Οι επιδράσεις των AGEs στα συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας απεικονίζονται στην εικόνα 13. Εικόνα 13. Επιδράσεις των AGEs σε συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας 37. Επιδράσεις των AGEs στα λιπίδια Η LDL είναι ένα από τα μόρια που συχνά υφίσταται μη ενζυμική γλυκοζυλίωση και μάλιστα η γλυκοζυλίωση συμβαίνει τόσο στο αποπρωτεϊνικό, όσο και στο λιπιδαιμικό τμήμα της 66,153. Κατά την σύγκριση ατόμων με διαβήτη με φυσιολογικά άτομα βρέθηκε ότι η μετατροπή του λιπιδαιμικού τμήματος σε AGEs είναι δύο φορές μεγαλύτερη, ενώ η μετατροπή του αποπρωτεϊνικού τέσσερις 35

32 φορές 153. Οι αντιδράσεις γλυκοζυλίωσης καθιστούν το μόριο της LDL επιρρεπές στην οξειδωτική τροποποίηση 154. Οι γλυκοξειδωμένες LDL αναγνωρίζονται από μία ειδική ομάδα υποδοχέων των μονοκυττάρων / μακροφάγων που ονομάζονται εκκαθαριστές (scavenger receptors). Παρατηρείται σημαντική αύξηση της πρόσληψης της οξειδωμένης LDL και παράλληλα ελαττωμένη απομάκρυνση αυτής από την υπενδοθηλιακή στιβάδα. Τα μακροφάγα, που βρίσκονται πλέον στο αγγειακό τοίχωμα, έχοντας προσλάβει μεγάλες ποσότητες οξειδωμένης LDL μετατρέπονται στα αφρώδη κύτταρα, τα οποία με τη σειρά τους δημιουργούν τις λιπώδεις ραβδώσεις, που αποτελούν τις αρχικές αλλοιώσεις της αθηρωματικής πλάκας 155. Επίσης μη ενζυματική γλυκοζυλίωση υφίσταται και το μόριο της HDL, με αποτέλεσμα να ελαττώνεται η δραστικότητα ενός ενζύμου, της παραοξονάσης, που παρεμποδίζει την οξείδωση της LDL και την προσκόλληση των μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα της αορτής 77,156. Το αποτέλεσμα της επίδρασης των AGEs στα λιπίδια είναι η αύξηση της αθηρογόνου δράσης της LDL καθώς και η ελάττωση της προστατευτικής ικανότητας της HDL. Όλα τα ανωτέρω φαίνονται στην εικόνα που ακολουθεί. Εικόνα 14. Μη ενζυμική γλυκοζυλίωση των λιποπρωτεϊνών

33 Λειτουργικές μεταβολές ρυθμιστικών πρωτεϊνών Φυσιολογικά τα κύτταρα διαθέτουν μία πρωτεΐνη ρυθμιστική της μεμβράνης τους, την CD59, που περιορίζει την ενεργοποίηση του συμπληρώματος και τον σχηματισμό συμπλέγματος του συμπληρώματος της μεμβρανικής προσβολής (membrane attack complex of complement, MAC). Η γλυκοζυλίωση του συμπληρώματος της ρυθμιστικής πρωτεΐνης CD59, προκαλεί την απενεργοποίησή της και αυξάνει την ετοιμότητα του διαβητικού ενδοθηλίου στην απελευθέρωση παραγόντων ανάπτυξης και κυτοκινών, που προκαλείται από το MAC Εξαρτώμενοι από υποδοχείς μοριακοί μηχανισμοί Τα AGEs αλληλεπιδρώντας με τους υποδοχείς τους και κυρίως με τον RAGE ενεργοποιούν σύνθετους μοριακούς μηχανισμούς μέσω των οποίων προάγουν την αθηροσκληρωτική διεργασία 158. Ο RAGE βρίσκεται στην επιφάνεια διαφόρων κυττάρων που σχετίζονται με την αθηροσκλήρωση, όπως στα μεγάλα μονοπύρηνα, στα ενδοθηλιακά κύτταρα και στα λεία μυϊκά κύτταρα 101. Σε φυσιολογικές συνθήκες οι συγκεντρώσεις του RAGE είναι χαμηλές, όταν όμως αυξάνεται η συγκέντρωση των AGEs, όπως στον ΣΔ, προκαλείται υπερέκφραση του υποδοχέα 159. Οι Park και συνεργάτες έχοντας ως σκοπό την διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών της διαβητικής αρτηριοσκλήρυνσης, ανέπτυξαν ένα μοντέλο σε ποντίκια που είχαν καταστεί διαβητικά και ανενεργά για το γονίδιο της απολιποπρωτεΐνης Ε, στα οποία διερεύνησαν την πιθανή εμπλοκή του υποδοχέα RAGE στη διαβητική αρτηριοσκλήρυνση. Χορήγησαν στα ποντίκια ένα διαλυτό κομμάτι του υποδοχέα RAGE, το οποίο αναφέρεται ως srage (soluble RAGE). Το μόριο αυτό αντιπροσωπεύει το εξωκυττάριο τμήμα του υποδοχέα RAGE, στο οποίο προσδένονται τα AGEs. Τα αποτελέσματα τους δείχνουν την πλήρη καταστολή της αρτηριοσκλήρυνσης κατά ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, αποδεικνύοντας έτσι τη συμβολή των RAGE και των AGEs στην ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης 112. Επιδράσεις των AGEs στα μονοπύρηνα / φαγοκύτταρα Η ένωση των AGEs με τους RAGE στα μονοπύρηνα / μακροφάγα προκαλεί την ενεργοποίησή τους με επακόλουθο την έκκριση ουσιών, που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της αθηροσκλήρωσης. Πρόκειται για αυξητικούς 37

34 παράγοντες, όπως ο αυξητικός παράγοντας προερχόμενος από τα αιμοπετάλια (platelet-derived growth factor, PDGF), ο ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγοντας (insulin-like growth factor-1, IGF-1) και προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, όπως η ιντερλευκίνη-1β ( IL-1β) και ο TNF-a ( tumor necrosis factor ) 48,160,161. H σύνδεση διαλυτών AGEs με τους RAGE προάγει την κυτταρική μετανάστευση (χημειοταξία), που ακολουθείται από διήθηση μονοκυττάρων μέσω του ακέραιου ενδοθηλίου. Σε αντιδιαστολή με τα διαλυτά AGEs, τα ακινητοποιημένα (immobilized) AGEs, όπως αυτά που βρίσκονται στις βασικές μεμβράνες, περιορίζουν την μετανάστευση των μονοκυττάρων, μια διαδικασία που είναι γνωστή ως απόπταξη (apoptaxis). Τόσο η χημειοταξία, όσο και η απόπταξη αναστέλλονται με τη χορήγηση αντισωμάτων έναντι των RAGE (anti-rage IgG) ή διαλυτών RAGE. Όταν τα μονοκύτταρα φτάνουν στους ιστούς όπου υπάρχουν τα ακινητοποιημένα AGEs περιορίζεται η μετανάστευσή τους. Στη συνέχεια δεσμεύονται στις επιφάνειες των ιστών που έχουν υποστεί AGE μετατροπή με επακόλουθο την ενεργοποίησή τους. Ο μοριακός αυτός μηχανισμός προσελκύει και διατηρεί τα μονοκύτταρα στις θέσεις εναπόθεσης των AGEs στους ιστούς 162,163. Επιδράσεις των AGEs στα λεία μυϊκά κύτταρα Η σύνδεση των AGEs με τους RAGE των λείων μυϊκών κυττάρων του αγγειακού τοιχώματος επάγει τον πολλαπλασιασμό και την μετανάστευσή τους καθώς και την παραγωγή φιμπρονεκτίνης. Ο ιστικός αυξητικός παράγοντας (TGF-β) φαίνεται να λειτουργεί ως μεσολαβητής στην παραγόμενη από τα λεία μυϊκά κύτταρα φιμπρονεκτίνη 164. Επιδράσεις των AGEs στα ενδοθηλιακά κύτταρα Το ενδοθήλιο διαδραματίζει ρόλο κλειδί στην διαδικασία της αθηροσκλήρωσης. Εκτίθεται στις βλαβερές επιδράσεις τόσο των κυκλοφορούντων, όσο και αυτών που βρίσκονται στην υποκείμενη υπενδοθηλιακή στιβάδα AGEs. Η σύνδεση των AGEs με τους RAGE των ενδοθηλιακών κυττάρων διαταράσσει την λειτουργία του ενδοθηλιακού φραγμού, με αποτέλεσμα την αύξηση της διαπερατότητας, την είσοδο λιπιδίων στην υπενδοθηλιακή στιβάδα καθώς και τη συγκόλληση μονοπυρήνων 165. Η αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας επάγεται από μηχανισμούς, στους οποίους εμπλέκονται η ενεργοποίηση της PKC και η παραγωγή του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) 166. Τα AGEs, όχι μόνο 38

35 αυξάνουν την βασική αγγειακή διαπερατότητα, αλλά και την επαγομένη από την ισταμίνη και τη βραδυκινίνη 167. Πρόσφατες μελέτες αποδεικνύουν, ότι η διάσπαση του συμπλέγματος των καντχερινών (VE-canherin complex) του ενδοθηλίου, που επάγεται από τα AGEs, διαταράσσει τις συνδέσεις μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων, με επακόλουθο την απορρύθμιση της διαπερατότητας του ενδοθηλίου 168. Η δέσμευση των AGEs με τους RAGE προκαλεί επίσης απώλεια των κυτταρικών αντιοξειδωτικών μηχανισμών (γλουταθειόνη, βιταμίνη C) με επακόλουθο την αύξηση του ενδοκυττάριου οξειδωτικού stress 169. Το οξειδωτικό stress στη συνέχεια επάγει την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα NF-Kβ, με αποτέλεσμα την έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν μόρια προσκόλλησης, όπως Ε-Selectin, VCAM-1, ICAM-1 καθώς και προπηκτικούς ιστικούς παράγοντες 170,171. Τα AGEs επηρεάζουν επίσης την ενδοθηλιο-εξαρτώμενη αγγειοδιαστολή, επηρεάζοντας την έκφραση ουσιών που ρυθμίζουν τον αγγειακό τόνο, όπως το μονοξείδιο του αζώτου (NO) και η ενδοθηλίνη. Η συσσώρευση των AGEs στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία προκαλεί εξάντληση των αποθεμάτων του ΝΟ, μείωση της γονιδιακής έκφρασης της συνθετάσης του ΝΟ, μέσω ελάττωσης της φωσφορυλίωσης της σερίνης του ενζύμου 172,173. Πρόσφατες έρευνες απέδειξαν, ότι τα αυξημένα επίπεδα των AGEs σε ασθενείς με ΣΔ τύπου 2 συσχετίζονται με την ενδοθηλιακή δυσλειτουργία, κατά έναν τρόπο ανεξάρτητο από τους υπόλοιπους καρδιαγγειακούς κινδύνους, γεγονός που φάνηκε με τη χρήση υπερήχων υψηλής ανάλυσης 174. Το ΝΟ, ως γνωστό, έχει και αντιπολλαπλασιαστική δράση. Με την αδρανοποίησή του από τα AGEs επάγεται η υπερπλασία των αγγείων και, κατά συνέπεια, δημιουργείται υπέρταση 175. Κατά την αλληλεπίδραση των AGEs με τους RAGE αναστέλλεται η παραγωγή ενός αγγειοδιασταλτικού και αντιθρομβωτικού παράγοντα, της προσταγλανδίνης PGI-2. Επιπλέον, προκαλείται υπερέκφραση του γονιδίου του αναστολέα -1 του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (PAI-1) στα ενδοθηλιακά κύτταρα των μικρών αγγείων, ο οποίος αναστέλλει την ινωδόλυση και εμπλέκεται στη θρόμβωση 176. Στο μονοπάτι μεταγωγής του μηνύματος φαίνεται να εμπλέκεται και το κυκλικό AMP (c- AMP), το οποίο δρα ως αγωνιστής του PAI-1. Τα AGEs δεν επηρεάζουν μόνο τα επίπεδα των αγγειοδιασταλτικών ουσιών, αλλά επάγουν ταυτόχρονα την παραγωγή της αγγειοσυσπαστικής ουσίας, ενδοθηλίνης-1, δια μέσω ενεργοποίησης του πυρηνικού παράγοντα κβ (NF-kB) 177. Στο σχήμα που ακολουθεί απεικονίζονται οι επιδράσεις των AGEs στα ενδοθηλιακά κύτταρα. 39

36 Εικόνα 15. Αλληλεπίδραση των AGEs με τους RAGE στα ενδοθηλιακά κύτταρα

37 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

38 1. Σκοπός της μελέτης Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της συσχέτισης των συγκεντρώσεων του srage με καθιερωμένους παράγοντες κινδύνου σε ασθενείς με στεφανιαία νόσο, με και χωρίς ΣΔ, καθώς και η σχέση που υφίσταται μεταξύ των συγκεντρώσεων του srage και της βαρύτητας της ΣΝ, με βάση τον αριθμό των στενωμένων αγγείων. 43

39 Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 60 ασθενείς (44 άρρενες και 16 θήλεις), που προσήλθαν στο Αιμοδυναμικό Εργαστήριο, της Α' Καρδιολογικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ, προκειμένου να υποβληθούν σε στεφανιογραφικό έλεγχο με στόχο τη διερεύνηση πιθανής ή την αξιολόγηση γνωστής στεφανιαίας νόσου (ΣΝ). Με βάση το πόρισμα της στεφανιογραφίας, τη λήψη του ιστορικού και τα αποτελέσματα των βιοχημικών εξετάσεων οι ασθενείς χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες. Στην πρώτη ομάδα συμπεριλήφθηκαν οι ασθενείς με ΣΝ χωρίς ΣΔ, 34 άτομα. Στη δεύτερη ομάδα οι ασθενείς με ΣΝ και ΣΔ, 14 άτομα. Στην τρίτη όσοι είχαν φυσιολογικές στεφανιαίες αρτηρίες χωρίς ΣΔ, και οι οποίοι αποτέλεσαν την ομάδα αναφοράς (control group), 12 άτομα. Κριτήρια αποκλεισμού από την μελέτη αποτέλεσαν οι εξής καταστάσεις: οξέα στεφανιαία σύνδρομα. συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια. καρδιομυοπάθειες. νευροεκφυλιστικά νοσήματα (όπως η νόσος Alzheimer). σακχαρώδης διαβήτης (ΣΔ) τύπου 1. ιστορικό αγγειακού εγκεφαλικού επεισοδίου ή περιφερικής αγγειοπάθειας. χρόνια φλεγμονώδη νοσήματα (όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα). παθήσεις του ήπατος. νεοπλάσματα. λήψη σκευασμάτων ορμονικής υποκατάστασης ή αντιοξειδωτικών. παθολογική νεφρική λειτουργία (κρεατινίνη > 1,3 mg/dl). Όλοι οι συμμετέχοντες στη μελέτη υποβλήθηκαν σε μία βασική κλινική εξέταση, προκειμένου να συμπληρωθεί ένα λεπτομερές ιατρικό ιστορικό. Αναλυτικότερα, το ιστορικό περιείχε προσωπικές πληροφορίες (ηλικία, φύλο, επάγγελμα, καταγωγή), πληροφορίες σχετικές με ανθρωπομετρικούς δείκτες (βάρος σε χιλιόγραμμα, ύψος σε μέτρα και περίμετρος μέσης σε εκατοστά) καθώς επίσης πληροφορίες για το κάπνισμα. Η τεκμηριωμένη αγγειογραφικώς ΣΝ ορίστηκε ως η παρουσία στένωσης σε βαθμό μεγαλύτερο από 70% σε μία τουλάχιστον από τις τρεις κύριες στεφανιαίες αρτηρίες (πρόσθιο κατιόντα κλάδο, δεξιά στεφανιαία και περισπωμένη αρτηρία). Η βαρύτητα της ΣΝ εκφράστηκε με τον αριθμό των στενωμένων αγγείων. Ο δείκτης μάζας σώματος υπολογίστηκε από 44