Μειέηε ηεο ζπκπεξηθνξάο βηνινγηθώλ θαη ζπλζεηηθώλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζην έδαθνο θαη ησλ επηπηώζεσλ ηνπο ζηε κηθξνβηαθή θνηλόηεηα

Transcript

1 ΑΡΗΣΟΣΔΛΔΗΟ ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΘΔΑΛΟΝΗΚΖ ΥΟΛΖ ΓΔΧΠΟΝΗΑ, ΓΑΟΛΟΓΗΑ & ΦΤΗΚΟΤ ΠΔΡΗΒΑΛΛΟΝΣΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΔΣΑΠΣΤΥΗΑΚΧΝ ΠΟΤΓΧΝ ΔΗΓΗΚΔΤΖ ΦΤΣΟΠΡΟΣΑΗΑ ΓΗΓΑΚΣΟΡΗΚΖ ΓΗΑΣΡΗΒΖ Μειέηε ηεο ζπκπεξηθνξάο βηνινγηθώλ θαη ζπλζεηηθώλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζην έδαθνο θαη ησλ επηπηώζεσλ ηνπο ζηε κηθξνβηαθή θνηλόηεηα ΠΑΠΑΓΟΠΟΤΛΟΤ ΔΤΑΓΓΔΛΗΑ ΜSc Γεσπόλνο Θεζζαινλίθε, Γεθέκβξηνο

2 2

3 Σξηκειήο ζπκβνπιεπηηθή επηηξνπή Ο. Μεκηίζμβθμο πονμφδδ (Δπζαθέπμοζα) Καεδβήηνζα Ανζζημηέθεζμ Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθμκίηδξ Γ. Κανπμφγαξ Δπίημονμξ Καεδβδηήξ Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθίαξ Γν.Γζαιακηίδδξ Ανζζημηέθεζμ Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθμκίηδξ Καεδβδηήξ Δπηακειήο εμεηαζηηθή επηηξνπή Ο. Μεκηίζμβθμο πονμφδδ Καεδβήηνζα Ανζζημηέθεζμ Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθμκίηδξ Γ. Κανπμφγαξ Δπίημονμξ Καεδβδηήξ Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθίαξ Γν.Γζαιακηίδδξ Ανζζημηέθεζμ Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθμκίηδξ Καεδβήηήξ Κ. Παπαδμπμφθμο Ακαπθδνχηνζα Καεδβήηνζα Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθίαξ Κ. Οζπαθζχηδξ Ακαπθδνςηήξ Καεδβδηήξ Γεπμκζηυ Πακεπζζηήιζμ Αεδκχκ Γ. Καναμβθακίδδξ Δπίημονμξ Καεδβδηήξ Ανζζημηέθεζμ Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθμκίηδξ Η. Τρδθάκηδξ Λέηημναξ Ανζζημηέθεζμ Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθμκίηδξ 3

4 4

5 τουσ γονείσ μου ωφρόνιο και Ζαχαροφλα, 5

6 6

7 «Δϊσ μοι πᾶ ςτῶ καὶ τὰν γᾶν κινάςω» «Δώςε μου κάπου να ςτηριχθώ, και μπορϊ και τθ γη να κινήςω». Αρχιμιδθσ (287 π.χ- 212 π.χ) 7

8 8

9 ΠΔΡΗΔΥΟΜΔΝΑ ΔΤΥΑΡΗΣΗΔ 16 ΑΚΡΧΝΤΜΗΑ ΚΑΗ ΤΝΣΟΜΟΓΡΑΦΗΔ 19 ΠΔΡΗΛΖΦΖ 24 ABSTRACT Γεκζηή Δζζαβςβή Σφπδ ηαζ οιπενζθμνά Γεςνβζηχκ Φανιάηςκ ζημ Πενζαάθθμκ Πανάβμκηεξ πμο επδνεάγμοκ ηδκ οπμθεζιιαηζηυηδηα ηςκ β.θ. ζημ έδαθμξ Πανάβμκηεξ πμο επδνεάγμοκ ηδκ ηζκδηζηυηδηα ηςκ β.θ. ζημ έδαθμξ Οζ ιζηνμμνβακζζιμί ημο εδάθμοξ ηαζ μ νυθμξ ημοξ οιιεημπή ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ζημοξ αζμβεςπδιζημφξ ηφηθμοξ ημο άκεναηα, ημο αγχημο ηαζ ημο θςζθυνμο Μφηδηεξ ημο εδάθμοξ Νζηνμπμίδζδ ηαζ ιζηνμμνβακζζιμί Νζηνςδμπμζδηζηά ααηηήνζα (ΑΟΒ, Ammonia-Oxidizing Bacteria) Νζηνςδμπμζδηζηά Ανπαία (ΑΟΑ, Ammonia-Oxidizing Archaea) Μέεμδμζ αλζμθυβδζδξ ηςκ επζδνάζεςκ ηςκ β.θ. ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ Μμνζαηέξ ηεπκζηέξ ακάθοζδξ Σεπκζηέξ Μμνζαηήξ Απμηφπςζδξ (Molecular Fingerprint Techniques) Λμζπέξ Μμνζαηέξ Μέεμδμζ Σεπκζηέξ μιζηήξ ακάθοζδξ Βζμπδιζηέξ ιέεμδμζ Μέεμδμξ ακάθοζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ (PLFAs) Πνμζδζμνζζιυξ δναζηζηυηδηαξ εκγφιςκ ιζηνμαζαηήξ πνμέθεοζδξ ζημ έδαθμξ Πνμζδζμνζζιυξ ιζηνμαζαηχκ δζενβαζζχκ ζημ έδαθμξ Δπζδνάζεζξ β.θ. ζηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ Δπζδνάζεζξ ζοκεεηζηχκ β.θ.. ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ Δπζδνάζεζξ αζμθμβζηχκ β.θ.. ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ Αλζμθυβδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ ζφιθςκα ιε ηδκ ημζκμηζηή κμιμεεζία Γεςνβζηά θάνιαηα πμο ιεθεηήεδηακ ζηδκ πανμφζα ενβαζία οκεεηζηά Νδιαηςδμηηυκα 93 9

10 Νδιαηςδμηηυκα Βζμθμβζηήξ Πνμέθεοζδξ Εζγακζμηηυκα Γεςνβζηά θάνιαηα πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδ ιεηαζοθθεηηζηή ιεηαπείνζζδ θνμφηςκ Μοηδημηηυκα οκεεηζηέξ εκχζεζξ ιε ακηζμλεζδςηζηή δνάζδ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδ ιεηαζοθθεηηζηή ιεηαπείνζζδ ηςκ θνμφηςκ ηυπμζ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ Βζαθζμβναθία Βεθηζζημπμίδζδ ηδξ ιεευδμο ακάθοζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ (PLFA, Phospholipid Fatty Acids Analysis) ηαζ εθανιμβή ηδξ ζηδ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ζοκεεηζηχκ ηαζ αζμθμβζηχκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ Πενίθδρδ Δζζαβςβή Βεθηζζημπμίδζδ ηδξ ιεευδμο ακάθοζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ (PLFAs) Δθανιμβή ηδξ αεθηζζημπμζδιέκδξ ιεευδμο ακάθοζδξ ηςκ PLFAs ζηδ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ζοκεεηζηχκ ηαζ αζμθμβζηχκ κδιαηςδμηηυκςκ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ Τθζηά ηαζ Μέεμδμζ Ακηζδναζηήνζα Δδάθδ Πνμζδζμνζζιυξ ηςκ εδαθμθμβζηχκ παναηηδνζζηζηχκ Πενζβναθή ηδξ ιεευδμο βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ PLFAs Δπίδναζδ ηςκ β.θ. ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ ηαηζζηζηή ακάθοζδ Απμηεθέζιαηα Βεθηζζημπμίδζδ ηδξ ιεευδμο ηςκ PLFAs Δπίδναζδ ηςκ παναιέηνςκ εηπφθζζδξ ζηδκ ζοκμθζηή ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs Δπίδναζδ ηςκ παναιέηνςκ εηπφθζζδξ ζηδκ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ ογήηδζδ Βεθηζζημπμίδζδ ηδξ ιεευδμο ηςκ PLFAs

11 Δπίδναζδ ηςκ παναιέηνςκ εηπφθζζδξ ζηδ ζοκμθζηή ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs Δπίδναζδ ηςκ παναιέηνςκ εηπφθζζδξ ζηδκ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ οιπενάζιαηα Βζαθζμβναθία Δπίδναζδ ημο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ Πενίθδρδ Δζζαβςβή Τθζηά ηαζ Μέεμδμζ Πεζναιαηζηυξ πεδζαζιυξ Αλζμθυβδζδ ηδξ επίδναζδξ ημο nicosulfuron ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ Αθοζζδςηή ακηίδναζδ ηδξ πμθοιενάζδξ (Polymerase Chain Reaction) Ζθεηηνμθυνδζδ ηςκ PCR πνμσυκηςκ ζε πδηηή αβανυγδξ Ζθεηηνμθυνδζδ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ ιε ααειίδςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ (DGGE) ηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ιμνζαηήξ απμηφπςζδξ ιε ηδκ ιέεμδμ DGGE Δπίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ Ανπή ηδξ ιεευδμο PCR πναβιαηζημφ πνυκμο Πμζμηζημπμίδζδ ηςκ amoa βμκζδίςκ ηςκ ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ ιε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηδξ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο Απμηεθέζιαηα Δπίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ PCR εκίζποζδ ηιήιαημξ ημο 16S rrna ηςκ ΑΟΒ Δκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ AOA 210 ΠΔΗΡΑΜΑ ΘΔΡΜΟΚΖΠΗΟΤ Ακάθοζδ DGGE ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ AOB

12 Ακάθοζδ DGGE ηδξ ημζκυηδηα ηςκ AOA 213 ΠΔΗΡΑΜΑ ΑΓΡΟΤ Ακάθοζδ DGGE ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ Ακάθοζδ DGGE ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΑ Αλζμθυβδζδ ηδξ επίδναζδξ ημο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ AOB ηαζ ΑΟΑ - Απμηεθέζιαηα PCR πναβιαηζημφ πνυκμο 225 ΠΔΗΡΑΜΑ ΘΔΡΜΟΚΖΠΗΟΤ Δπίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ Δπίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ 234 ΠΔΗΡΑΜΑ ΑΓΡΟΤ Δπίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ Δπίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ ογήηδζδ Δπίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ Δπίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ οιπενάζιαηα Βζαθζμβναθία Δπίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδκ ημζκυηδηα ηςκ Γεκδνυιμνθςκ Μοημννζγζηχκ Μοηήηςκ Πενίθδρδ Δζζαβςβή Τθζηά ηαζ Μέεμδμζ Πεζναιαηζηυξ πεδζαζιυξ Πείναια εενιμηδπίμο οθθμβή δεζβιάηςκ Πείναια αβνμφ οθθμβή δεζβιάηςκ Δπίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ Γεκδνυιμνθςκ Μοημννζγζηχκ Μοηήηςκ Δλαβςβή ημο DNA απυ ηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ PCR εκίζποζδ ηιήιαημξ ημο 18S rrna βμκζδίμο ηςκ Γεκδνυιμνθςκ Μοημννζγζηχκ Μοηήηςκ Ζθεηηνμθυνδζδ ηςκ PCR πνμσυκηςκ ζε πδηηή αβανυγδξ Ζθεηηνμθυνδζδ ηςκ PCR πνμσυκηςκ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ ιε ααειίδςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ (DGGE)

13 Γδιζμονβία Βζαθζμεδηχκ Κθχκςκ ηαηζζηζηή ακάθοζδ Απμηεθέζιαηα Δλαβςβή DNA ηαζ PCR εκίζποζδ ηιήιαημξ ημο 18S rrna βμκζδίμο ηςκ ΓΜΜ 265 ΠΔΗΡΑΜΑ ΘΔΡΜΟΚΖΠΗΟΤ Δπίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδκ ημζκυηδηα ηςκ ΓΜΜ DGGE ιμνζαηή απμηφπςζδ Σαοημπμίδζδ ιεθχκ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ ιε ηδκ πνήζδ αζαθζμεδηχκ ηθχκςκ 267 ΠΔΗΡΑΜΑ ΑΓΡΟΤ Δπίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδκ ημζκυηδηα ηςκ ΓΜΜ ογήηδζδ οιπενάζιαηα Βζαθζμβναθία Δπίδναζδ ιοηδημηηυκςκ ηαζ ακηζμλεζδςηζηχκ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζε ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ Πενίθδρδ Δζζαβςβή Τθζηά ηαζ Μέεμδμζ Πεζναιαηζηυξ ζπεδζαζιυξ Πνμζδζμνζζιυξ ηςκ θοζζημπδιζηχκ παναηηδνζζηζηχκ ημο εδάθμοξ Γεςνβζηά Φάνιαηα Μεθέηδ ηδξ πμνείαξ απμδυιδζδξ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζημ έδαθμξ Ακάπηολδ ακαθοηζηχκ ιεευδςκ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζημ έδαθμξ Έθεβπμξ αλζμπζζηίαξ ηςκ ιεευδςκ ακάθοζδξ Δπζθμβή ιαεδιαηζημφ ιμκηέθμο βζα ηδκ πενζβναθή ηδξ ηζκδηζηήξ ηδξ απμδυιδζδξ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζημ έδαθμξ Μεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ηςκ β.θ. ζημ ιέβεεμξ ηαζ ηδ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ ιε ηδ ιέεμδμ ηςκ PLFAs Μεηνήζεζξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ ηαζ ιζηνμαζαηήξ θεζημονβζάξ Πνμζδζμνζζιυξ ηδξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ υλζκςκ ηαζ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ ζημ έδαθμξ

14 Πνμζδζμνζζιυξ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ημο εκγφιμο α-βθοημζζδάζδ ζημ έδαθμξ Πνμζδζμνζζιυξ ημο νοειμφ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ Πνμζδζμνζζιυξ ηδξ βεκζηήξ οδνμθοηζηήξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ ζημ έδαθμξ ιε ηδκ ιέεμδμ οδνυθοζδξ ηδξ 3,6-δζαηεηοθμ-θθμομνμζηεΐκδξ (FDHA) Δηηίιδζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ δναζηδνζυηδηαξ ζημ έδαθμξ ιε ηδ ιέεμδμ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ακαπκμήξ ηαηζζηζηή ακάθοζδ Δπίδναζδ ημο ακηζμλεζδςηζημφ EQ ηαζ ηςκ πνμσυκηςκ ιεηααμθζζιμφ ημο ζηδ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ ζε ζοκάνηδζδ ιε ηδκ πμνεία απμδυιδζδξ ημοξ ζημ έδαθμξ Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ηαζ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ημο εδάθμοξ Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηδξ ιεευδμο DGGE Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ Δπίδναζδ ημο ethoxyquin ζηδκ θεζημονβία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ιε ηδκ πνήζδ reverse transcription PCR πναβιαηζημφ πνυκμο Απμηεθέζιαηα Έθεβπμξ αλζμπζζηίαξ ηςκ ιεευδςκ ακάθοζδξ ηαζ πνμζδζμνζζιμφ βεςνβζηχκ θανιάηςκ Ζ πμνεία απμδυιδζδξ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζημ έδαθμξ Ζ πμνεία απμδυιδζδξ ηςκ ΣΒΕ, ΗΜΕ, ΟΡΡ ηαζ DPA ζημ έδαθμξ Πμνεία απμδυιδζδξ ηαζ ιεηααμθζζιυξ ημο ethoxyquin ζημ έδαθμξ Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζημ ιέβεεμξ ηαζ ηδ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ δναζηζηυηδηα ηςκ υλζκςκ ηαζ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ Δπίδναζδ ηςκ β.θ.. ζηδ δναζηζηυηδηα ηςκ α-βθοημζζδαζχκ Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδκ οδνμθοηζηή δναζηζηυηδηα ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ υπςξ εηηζιήεδηε ιε ηδκ ιέεμδμ FDHA

15 Δπίδναζδ ηςκ β.θ.. ζηδ ιζηνμαζαηή ακαπκμή ημο εδάθμοξ Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ Δπίδναζδ ημο ethoxyquin ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ζηδ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ ζε ζοκάνηδζδ ιε ηδκ πμνεία απμδυιδζδξ ημοξ ζημ έδαθμξ Γοκδηζηή Νζηνμπμίδζδ Παναημθμφεδζδ ηδξ πμνείαξ απμδμιδζδξ ημο ethoxyquin ηαζ ηςκ πνμσυκηςκ ιεηααμθζζιμφ ημο Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ηαζ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ημο εδάθμοξ Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ Δπίδναζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ Δπίδναζδ ημο ethoxyquin ζηδκ θεζημονβία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ υπςξ πνμζδζμνίζηδηε ιε RT-PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ογήηδζδ οιπενάζιαηα Βζαθζμβναθία ΓΔΝΗΚΑ ΤΜΠΔΡΑΜΑΣΑ-ΔΠΗΛΟΓΟ ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ 440 ΜΔΡΟ Α 440 ΜΔΡΟ Β

16 ΔΤΥΑΡΗΣΗΔ Ζ πανμφζα δζαηνζαή ιε εέια «Μεθέηδ ηδξ ζοιπενζθμνάξ αζμθμβζηχκ ηαζ ζοκεεηζηχκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζημ έδαθμξ ηαζ ηςκ επζπηχζεςκ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα» εηπμκήεδηε ζημ Δνβαζηήνζμ Γεςνβζηχκ Φανιάηςκ ηδξ Γεςπμκζηήξ πμθήξ ημο Ανζζημηεθείμο Πακεπζζηδιίμο Θεζζαθμκίηδξ, ηαηά ηα έηδ , οπυ ηδκ επίαθερδ ηδξ ηαεδβήηνζαξ η. Οονακίαξ Μεκηίζμβθμο-πονμφδδ. Οζ ιεθέηεξ πμο αθμνμφζακ ζηδκ πνήζδ ιμνζαηχκ ηεπκζηχκ ακάθοζδξ (PCR, DGGE, qpcr, RT- PCR, clone libraries) πναβιαημπμζήεδηακ ζημ ενβαζηήνζμ Βζμηεπκμθμβίαξ Φοηχκ ηαζ Πενζαάθθμκημξ, ημο Σιήιαημξ Βζμπδιείαξ ηαζ Βζμηεπκμθμβίαξ, ηδξ πμθήξ Δπζζηδιχκ Τβείαξ, ημο Πακεπζζηδιίμο Θεζζαθίαξ, οπυ ηδκ επίαθερδ ημο επίημονμο ηαεδβδηή η. Γδιήηνζμο Κανπμφγα. ηα πθαίζζα αοηήξ ηδξ πνμζπάεεζαξ πμο μθμηθδνχκεηαζ ιε ηδ ζοββναθή ηδξ δζαηνζαήξ, εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς υθμοξ εηείκμοξ πμο ζοκέααθακ εκενβά ηαζ ιε ηάεε ηνυπμ ζηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ. Ανπζηά, εοπανζζηχ μθυροπα ηδκ ηαεδβήηνζα ιμο η. Οονακία Μεκηίζμβθμο- πονμφδδ, βζα ηδκ ειπζζημζφκδ πμο ιμο έδεζλε ιε ηδκ απμδμπή ιμο ςξ οπμρήθζα δζδάηημνα οπυ ηδκ επίαθερή ηδξ, ηδκ αιένζζηδ ζοιπανάζηαζδ, ημ εζθζηνζκέξ εκδζαθένμκ, ηδκ ελαίνεηδ ζοκενβαζία ηαζ ηδκ ζοκεπή επζζηδιμκζηή ηαεμδήβδζδ, παναημθμφεδζδ ηαζ οπμζηήνζλδ ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ εηπυκδζδξ ηαζ ζοββναθήξ ηδξ πανμφζα δζαηνζαήξ. Ηδζαίηενα εοπανζζηχ ημκ επίημονμ ηαεδβδηή ημο Σιήιαημξ Βζμπδιείαξ ηαζ Βζμηεπκμθμβίαξ, ημο Πακεπζζηδιίμο Θεζζαθίαξ, η. Γδιήηνζμ Κανπμφγα, ιέθμοξ ηδξ ηνζιεθμφξ ζοιαμοθεοηζηήξ επζηνμπήξ, βζα ηδκ απμδμπή ημο νυθμο ημο ηαζ ηδκ έηημηε εκενβή ζοιιεημπή ημο, ημ απνυζημπημ εκδζαθένμκ, ηδκ αιένζζηδ επζζηδιμκζηή ηαεμδήβδζδ, ηδκ άρμβδ ζοκενβαζία, ηδκ ελαζθάθζζδ ηςκ απαναίηδηςκ ενβαζηδνζαηχκ οπμδμιχκ, ημ ζπεδζαζιυ ηαζ ηδκ επμπηεία ηςκ πεζναιάηςκ ιμνζαηήξ ακάθοζδξ, ηδ αμήεεζα ημο ηαηά ηδκ ενιδκεία ηςκ δεδμιέκςκ ηαεχξ επίζδξ ηαζ βζα ηζξ πμθφηζιεξ μδδβίεξ ηαζ οπμδείλεζξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ζοββναθήξ αοηήξ ηδξ δζαηνζαήξ, μζ μπμίεξ ήηακ ηαεμνζζηζηέξ βζα ηδκ πθδνυηδηά ηδξ ςξ πνμξ ημ πενζεπυιεκμ, ηδ δμιή ηαζ ηδκ πανμοζίαζδ ηδξ. Δοπανζζηχ εενιά ημκ ηαεδβδηή ηδξ Γεςπμκζηήξ πμθήξ ημο Α.Π.Θ η. Γνδβυνζμ Γζαιακηίδδ, ιέθμξ ηδξ ηνζιεθμφξ ζοιαμοθεοηζηήξ επζηνμπήξ, ηυζμ βζα ηδκ απμδμπή ημο νυθμο ημο υζμ ηαζ βζα ηζξ πμθφηζιεξ ζοιαμοθέξ ηαζ ηδ αμήεεζά ημο ηαηά ηδ 16

17 δζάνηεζα ηςκ ενβαζηδνζαηχκ πεζναιάηςκ, αθθά ηαζ βζα ηδκ ηνζηζηή ακάβκςζδ ημο ηεζιέκμο ηαζ ηζξ πνήζζιεξ οπμδείλεζξ ημο. Ηδζαίηενεξ εοπανζζηίεξ μθείθς ζηδκ ακαπθδνχηνζα ηαεδβήηνζα ημο Πακεπζζηδιίμο Θεζζαθίαξ ηα. Καθθζυπδ Παπαδμπμφθμο, ζημκ ακαπθδνςηή ηαεδβδηή ημο Γ.Π.Α. η. Κςκζηακηίκμ Οζπαθζχηδ, ζημκ επίημονμ ηαεδβδηή ημο ηιήιαημξ ηδξ Γεςπμκζηήξ πμθήξ ημο Α.Π.Θ. η. Γεχνβζμ Καναμβθακίδδ, ζημκ Λέηημνα ηδξ Γεςπμκζηήξ πμθήξ ημο Α.Π.Θ. η. Ηςάκκδ Τρδθάκηδ, ιέθδ ηδξ ελεηαζηζηήξ επζηνμπήξ βζα ηδκ ηνζηζηή ακάβκςζδ ημο ηεζιέκμο ηαζ ηζξ πνήζζιεξ οπμδείλεζξ ημοξ πμο ζοκέααθακ ζηδ αεθηίςζδ ηδξ πανμφζαξ δαηνζαήξ. Θα ήεεθα ζδζαζηένςξ κα εοπανζζηήζς ηδκ επίημονμ ηαεδβήηνζα ηδξ Γεςπμκζηήξ πμθήξ ημο Α.Π.Θ. η. Θεμδχνα Μαηζή βζα ηδκ πανμπή εδαθζηχκ δεζβιάηςκ ηαζ ηδκ πναβιαημπμίδζδ/εηηέθεζδ ηςκ ακαθφζεςκ ηςκ εδαθμθμβζηχκ παναηηδνζζηζηχκ, ημκ επίημονμ ηαεδβδηή ημο Γ.Π.Α. η. Ηςάκκδ Γζακκαημφ, βζα ηδκ πανμπή εδαθζηχκ δεζβιάηςκ ηαζ ημο ζοκεεηζημφ κδιαηςδμηηυκμο fluensulfone, ημκ ηαεδβδηή ημο Σιήιαημξ Βζμπδιείαξ ηαζ Βζμηεπκμθμβίαξ η. Γδιήηνζμ Κμιζχηδ ηαζ ηδκ οπμρήθζα δζδάηημνα η. ηέθθα Μακηά βζα ηδκ ζφκεεζδ ηαζ ηαοημπμίδζδ ηςκ μοζζχκ 2,6- dihydro-2,2,4-trimethyl-6-quinone imine ηαζ 2,4-dimethyl-6-ethoxyquinoline, ημκ ακαπθδνςηή ηαεδβδηή ηδξ Γεςπμκζηήξ πμθήξ ημο Α.Π.Θ. η Δοεφιζμ ζκάπδ βζα ηδ δζάεεζδ ημο θαζιαημθςημιέηνμο ιάγαξ, ημκ ηαεδβδηή ηδξ Γεςπμκζηήξ ζπμθήξ ημο Α.Π.Θ. η. Ακδνέα Θναζοαμφθμο ηαζ ηδκ θέηημνα η. Υνφζα Σακακάηδ βζα ηδκ πανμπή ημο ενβαζηδνζαημφ ημοξ ελμπθζζιμφ βζα ηζξ πνςιαημβναθζηέξ ακαθφζεζξ ηαζ ηδκ επίημονμ ηαεδβήηνζα ηα. Καηενίκα Καναιακχθδ βζα ηζξ εφζημπεξ οπμδείλεζξ ηδξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ εηηέθεζδξ ηςκ πεζναιάηςκ. Έκα ιεβάθμ εοπανζζηχ μθείθς ζηδ ζοκάδεθθμ βεςπυκμ Ηςάκκα Μανία πφνμο, βζα ηδ αμήεεζα ηδξ ζηδκ ελμζηείςζδ ιμο ιε ηδ ιέεμδμ ακάθοζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ (PLFA). Δηθνάγς επίζδξ ηζξ εενιέξ ιμο εοπανζζηίεξ ζημοξ ζοκαδέθθμοξ βεςπυκμοξ Μακχθδ Καναγαθείνδ, Καηενίκα μοκά, Γεςνβία Σάκμο, Βαζίθδ Εζχβα, Νζηυθαμ Καθμφιεκμ, Λμοηά Παπαθμοηά, Αββεθζηή Ασκαθίδμο ηαζ Δθέκδ Νάζζμο, βζα ηδκ αιένζζηδ αμήεεζα, ηζξ πμθφηζιεξ ζοιαμοθέξ, ηδκ εζθζηνζκή ζοκαδεθθζηή αθθδθεββφδ, ηαζ ηδκ εοβεκζηή ζοκενβαζία ζε υθδ ηδ δζάνηεζα εηπυκδζδξ ηδξ δζδαηημνζηήξ ιμο δζαηνζαήξ. Ηδζαίηενεξ εοπανζζηίεξ εηθνάγς ζημοξ οπμρήθζμοξ δζδάηημνέξ ημο ηιήιαημξ Βζμπδιείαξ ηαζ Βζμηεπκμθμβίαξ ημο Πακεπζζηήιζμο Θεζζαθίαξ, Κςκζηακηίκα 17

18 Ρμοζίδμο, Chiara Perruchon ηαζ Πακαβζχηδ Καννά βζα ηδκ πμθφηζιδ ηαζ εοβεκζηή δζαεεζζιυηδηα ηδξ αμήεεζαξ ημοξ υπμηε ηδκ πνεζάζηδηα, ηδκ γεζηή θζθμλεκία ηαζ ημ εζθζηνζκέξ εκδζαθένμκ, ζε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ παναιμκήξ ιμο ζημ ενβαζηήνζμ Βζμηεπκμθμβίαξ Φοηχκ ηαζ Πενζαάθθμκημξ. Θα ήεεθα επίζδξ κα εοπανζζηήζς ηδ ιεηαπηοπζαηή θμζηήηνζα Κμνηζζκίδμο Μανζάκκα, ηαεχξ ηαζ ημοξ πνμπηοπζαημφξ θμζηδηέξ Μπέθθα Σζαπίδμο ηαζ Θειζζημηθή Αζηένδ, βζα ηδκ άρμβδ ζοκενβαζία ιαξ ηαηά ηδκ εηπυκδζδ ιένμοξ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ. Οθυροπα εοπανζζηχ ηδκ οπμρήθζα δζδάηημνα ημο ηιήιαημξ Βζμθμβίαξ ημο Α.Π.Θ. Δθεοεενία Γαθάημο βζα ηζξ ζοιαμοθέξ ηαζ ηδκ ακζδζμηεθή αμήεεζα πμο ιμο πνμζέθενε υπμηε ηδ πνεζάζηδηα. Έκα ιεβάθμ εοπανζζηχ απυ ηα αάεδ ηδξ ηανδζάξ ιμο μθείθς ζηζξ μζημβέκεζεξ Παπακαζηαζίμο ηαζ Καναηχθμο βζα ηδκ εοβεκζηή θζθμλεκία ηαζ ηδκ δεζηή ζοιπανάζηαζδ πμο ιμο πανείπακ ηαηά ημ δζάζηδια ηδξ εηπυκδζδξ ηςκ πεζναιάηςκ ζημ Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθίαξ. Σέθμξ, εα ήηακ πανάθεζρδ κα ιδκ εοπανζζηήζς ηδκ μζημβέκεζα ιμο ηαζ ημοξ θίθμοξ ιμο βζα ηδκ δεζηή οπμζηήνζλδ, ηδκ εκεάννοκζδ, ηδκ οπμιμκή ημοξ ηαζ ηδκ ζοκεπή ηαζ έιπναηηδ αθμζίςζδ ημοξ. 18

19 ΑΚΡΧΝΤΜΗΑ ΚΑΗ ΤΝΣΟΜΟΓΡΑΦΗΔ ΑΒΑ Abscisic acid Aρζζζηυ μλφ AHAS Acetohydroxy acid synthase οκεάζδ ημο οδνμλο-μλζημφ μλέμξ ALS Acetolactate synthase Oλζημβαθαηηζηή ζοκεάζδ AMO AmmoniaMonoOxygenase Mμκμ-μλοβμκάζδ ηδξ αιιςκίαξ Αnammox Anaerobic AMMonium Oxidation Ακαενυαζμξ μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ ANOVA Analysis of Variance Ακάθοζδ ηδξ δζαηφιακζδξ ΑΟΑ Αmmonia-Οxidizing Αrchaea Νζηνςδμπμζδηζηά Ανπαία (Ανπαία πμο μλεζδχκμοκ ηδκ αιιςκία) ΑΟΒ Αmmonia-Οxidizing Bacteria Νζηνςδμπμζδηζηά Βαηηήνζα (Βαηηήνζα πμο μλεζδχκμοκ ηδκ αιιςκία) ΑΟΜ Ammonia Oxidizing Microorganisms ΑRISA Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis Νζηνςδμπμζδηζημί Μζηνμμνβακζζιμί (Μζηνμμνβακζζιμί πμο μλεζδχκμοκ ηδκ αιιςκία) Αοημιαημπμζδιέκδ ακάθοζδ ημο νζαμζςιζημφ εζςβμκζδζαημφ δζαπςνζζηή ARDRA Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis Ακάθοζδ εκζζποιέκςκ εναοζιάηςκ εη πενζμνζζιμφ ημο νζαμζςιζημφdna ΑΣΡ Adenosine Triphosphate Σνζθςζθμνζηή αδεκμζίκδ ΒSA Bovine Serum Albumin Αθαμοιίκδ ημο μνμφ ημο Βμδζμφ cdna complementary DNA οιπθδνςιαηζηυ DNA CHL Chloroform Υθςνμθυνιζμ Cit Citrate Buffer Ροειζζηζηυ δζάθοια ηζηνζηχκ ζυκηςκ 19

20 CLCPs Community Level Catabolic Profiles Καηααμθζηυ πενίβναιια ζε επίπεδμ ημζκυηδηαξ CVA CanonicalVariateAnalysis Ακάθοζδ Κακμκζηχκ Μεηααθδηχκ DCM Dichloromethane Γζπθςνμιεεάκζμ DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Ζθεηηνμθυνδζδ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ ιε ααειίδςζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ DNA Deoxyribonucleic acid Γεζμλονζαμκμοηθεσηυ μλφ dntps Deoxynucleotide Solution Mix Γζάθοια ιίβιαημξ δεζμλονζαμκμοηθεμηζδίςκ DPA Diphenylamine Γζθαζκοθαιίκδ EC European Commission Δονςπασηή Δπζηνμπή EFSA European Food Safety Authority EPA Environmental Protection Agency Δονςπασηυξ Ονβακζζιυξ Αζθάθεζαξ Σνμθίιςκ Τπδνεζία πνμζηαζίαξ πενζαάθθμκημξ ΔQ EQNL 1,2-dihydro-6-ethoxy-2,2,4- trimethyl-quinoline 2,4-dimethyl-6- ethoxyquinoline ethoxyquin 2,4-δζιεεοθμ-6-αζεμλο-ηζκμθίκδ FAO Food and Agriculture Organization Ονβακζζιυξ Σνμθίιςκ ηαζ Γεςνβίαξ FDA 3,6- Fluorescein Diacetate 3,6-δζαηεηοθμ-θθμομνμζηεΐκδ GC Gas Chromatography Αένζμξ Υνςιαημβναθία 20

21 ΖΑΟ Hydroxyl Amine Oxidoreductase Ολεζδμακαβςβάζδ ηδξ οδνμλοθαιίκδξ HS Hockey Stick model Μμκηέθμ Hockey Stick ΗΜΕ ISO (1-[2-(2,4-dichlorophenyl)-2- (2-propenyloxy)ethyl]-1Himidazole) International Organization of Standardization Imazalil Γζεεκήξ Ονβακζζιυξ Σοπμπμίδζδξ Κd Adsorption coefficient οκηεθεζηήξ ηαηακμιήξ πνμζνυθδζδξ K H Henry s low constant ηαεενά Henry Κoc Sorption coefficient οκηεθεζηήξ νυθδζδξ Kow Octanol-Water coefficient partition οκηεθεζηήξ ηαηακμιήξ (ζε ζφζηδια)μηηακυθδξ-κενμφ LOD Limit of detection Όνζμ ακίπκεοζδξ LOQ Limit of quantification Όνζμ πμζμηζημφ πνμζδζμνζζιμφ LSD Least Significance Difference Δθάπζζηδ διακηζηή Γζαθμνά MeCN Acetonitrile Αηεημκζηνίθζμ mrna messenger RNA Αββεθζμθυνμ RNA % oc % organic carbon % μνβακζηυξ άκεναηαξ 21

22 ΟΡΡ Ortho-phenyl-phenol Ορθο-θαζκοθμ-θαζκυθδ PCA Principal Component Analysis Ακάθοζδ ηςκ Κφνζςκ οκζζηςζχκ PCR Polymerase Chain Reaction Αθοζζδςηή ακηίδναζδξ ηδξ πμθοιενάζδξ Phos Phosphate buffer Ροειζζηζηυ δζάθοια θςζθμνζηχκ ζυκηςκ PLFAs Phospholipid Fatty Acid Analysis Ακάθοζδ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ QI 2,6-dihydro-2,2,4-trimethyl-6- quinoneimine 2,6-δζοδνμ-2,2,4-ηνζιεεοθμ-6-ηζκμκ-ζιίκδ R 2 Regression coefficient οκηεθεζηήξ ζοιιεηααμθήξ RISA Ribosomal Intergenic Spacer Analysis Ακάθοζδ ημο νζαμζςιζημφ εζςβμκζδζαημφ δζαπςνζζηή RNA Ribonucleic acid Ρζαμκμοηθεσηυ μλφ rrna ribosomalrna Ρζαμζςιζηυ RNA RSD Relative Standard Deviation πεηζηή ηοπζηή απυηθζζδ Rt-PCR, qpcr Real Time PCR, quantitative PCR PCR πναβιαηζημφ πνυκμο, πμζμηζηή PCR RΣ-PCR Reverse Transcriptase PCR Αθοζζδςηή ακηίδναζδ ηδξ πμθοιενάζδξ (πανμοζία) ηδξ ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθάζδξ SFO Single First Order kinetics ηζκδηζηή πνχηδξ ηάλδξ t ½, DT 50 half life time Υνυκμξ διζγςήξ ΣΒΕ (2-(4-thiazolyl)-1H-benzimidazole thiabendazole 22

23 TGGE Thermal Gradient Gel Electrophoresis Ζθεηηνμθυνδζδ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ ιε ααειίδςζδ ηδξ εενιμηναζίαξ T-RFLP Terminal Restriction Fragment Polymorphisms Ακάθοζδ πμθοιμνθζζιμφ ημο ιήημοξ αηναίςκ εναοζιάηςκ (εκυξ βμκζδίμο) εη πενζμνζζιμφ WHC Water Holding Capacity Τδαημπςνδηζηυηδηα γ.θ. Γεςνβζηυ θάνιαημ ΓΜΜ Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) Γεκδνυιμνθμζ Μοημννζγζημί Μφηδηεξ 23

24 ΠΔΡΗΛΖΦΖ Ζ εκηαηζηή πνήζδ ηςκ ζοκεεηζηχκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ (β.θ..) έπεζ πνμηαθέζεζ ιαηνμπνυεεζια, πνμαθήιαηα υπςξ (1) δ απχθεζα ηδξ απμηεθεζιαηζηυηδηαξ ελαζηίαξ ηδξ ακάπηολδξ θαζκμιέκςκ ακεεηηζηυηδηαξ, (2) δ ημλζηή επίδναζδ ζε μνβακζζιμφξ ιδ-ζηυπμοξ ιε ζδζαίηενδ ζδιαζία βζα ηδκ θεζημονβία ημο μζημζοζηήιαημξ, υπςξ μζ ιζηνμμνβακζζιμί ημο εδάθμοξ, (3) δ επζαάνοκζδ ημο πενζαάθθμκημξ, (4) μ ηίκδοκμξ βζα ηδκ ακενχπζκδ οβεία. Απμηέθεζια ηδξ παναπάκς εκηαηζηήξ πνήζδξ, ήηακ δ απυζονζδ ή δ επακελέηαζδ ηδξ άδεζαξ ηοηθμθμνίαξ πμθθχκ απυ ηα εονέςξ πνδζζιμπμζμφιεκα ζοκεεηζηά β.θ.., βεβμκυξ πμο δδιζμονβεί επζηαηηζηή ακάβηδ βζα ηδκ ακάπηολδ ηαζ παναβςβή αζθαθέζηενςκ β.θ. ιε κέμ ηνυπμ δνάζδξ. Χξ πζεακή εκαθθαηηζηή θφζδ ηςκ ζοιααηζηχκ πδιζηχκ ιεευδςκ ηαηαπμθέιδζδξ, πνμηείκεηαζ δ πνήζδ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ.., αθθά ηαζ ζφβπνμκςκ ζοκεεηζηχκ β.θ. ιε αεθηζςιέκα παναηηδνζζηζηά θζθζηά πνμξ ημ πενζαάθθμκ ηαζ ελεζδζηεοιέκμ ηνυπμ δνάζδξ. Χζηυζμ, ακ ηαζ μζ παναπάκς ηαηδβμνίεξ β.θ.. εεςνμφκηαζ αζθαθείξ βζα ημ πενζαάθθμκ, μζ επζδνάζεζξ ημοξ ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ δεκ έπμοκ δζενεοκδεεί δζελμδζηά. Οζ ιζηνμμνβακζζιμί ημο εδάθμοξ παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ βζα ηδ βμκζιυηδηα ημο εδάθμοξ ηαζ ηδκ παναβςβζηυηδηα ηςκ θοηχκ ηαζ έκαξ ζδιακηζηυξ ανζειυξ ιεευδςκ είκαζ ζήιενα δζαεέζζιμξ βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ εδαθζηχκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ. Ζ πνήζδ ορδθήξ απυδμζδξ ιμνζαηχκ ηεπκζηχκ βζα ηδ δζενεφκδζδ ηδξ εδαθζηήξ ιζηνμαζαηήξ πμζηζθυηδηαξ δίκεζ κέεξ πνμμπηζηέξ υζμκ αθμνά ζηδκ ηαηακυδζδ ηδξ ηαηακμιήξ ηαζ ηδξ πμζηζθυηδηαξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζηα εδαθζηά εκδζαζηήιαηα. Χζηυζμ, πανά ηζξ παναπάκς δοκαηυηδηεξ, αθθά ηαζ ημ ιεβάθμ ανζειυ ακαθμνχκ ζπεηζηά ιε ηζξ επζδνάζεζξ ηςκ β.θ.. ζηδ θεζημονβία ηδξ εδαθζηήξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ, μζ ηεθεοηαίεξ δεκ θαιαάκμκηαζ ζμαανά οπυρδ ηαηά ηδκ εθανιμβή κέςκ κυιςκ ηαζ ηακμκζζιχκ. ηδκ πανμφζα δζαηνζαή, ιεθεηήεδηακ δέηα δζαθμνεηζηά β.θ.., ζοκεεηζηά ηαζ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ υζμκ αθμνά ζηδκ ηφπδ ημοξ ζημ πενζαάθθμκ ηαζ ηδκ επίδναζδ ημο ζηδκ εδαθζηή ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα. Ανπζηά, πναβιαημπμζήεδηε αεθηζζημπμίδζδ ηδξ ιεευδμο ακάθοζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ (PLFAs) πμο απμηεθεί ζδιακηζηυ ενβαθείμ βζα ημ παναηηδνζζιυ ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ ημο εδάθμοξ. οκμθζηά πνμζδζμνίζηδηε δ επίδναζδ α) ημο δζαθφηδ (πθςνμθυνιζμ ή δζπθςνμιεεάκζμ) α) ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (θςζθμνζηυ ph 7.0 ή ηζηνζηυ ph 4.0) ηαζ β) ημο ανζειμφ ηςκ ηφηθςκ εηπφθζζδξ (1 ηφηθμξ επί 2 χνεξ ή 2 ηφηθμζ επί 2 χνεξ ακά ηφηθμ), ζηδκ πμζυηδηα ηαζ 24

25 ηδκ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs πμο εηποθίζηδηακ απυ έκα υλζκμ άιιμ-πδθχδεξ (ph 5.5) ηαζ έκα αθηαθζηυ πδθχδεξ (ph 8.6) έδαθμξ. Ο ζοκδοαζιυξ πθςνμθυνιζμ ςξ δζαθφηδξ, νοειζζηζηυ δζάθοια ηζηνζηχκ ηαζ 2 x 2h ηφηθμζ εηπφθζζδξ ανέεδηε κα απμδίδεζ ηζξ ιέβζζηεξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ PLFAs ηαεχξ ηαζ ηδ ζαθέζηενδ εζηυκα υζμκ αθμνά ζηδ δμιή ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ηαζ ζηα δφμ εδάθδ πμο ιεθεηήεδηακ. Σμ αεθηζζημπμζδιέκμ πνςηυημθθμ πνδζζιμπμζήεδηε ζηδ ζοκέπεζα βζα ηδ δζενεφκδζδ ζε επίπεδμ ιζηνμηυζιςκ ηδξ επίδναζδξ ηςκ ζοκεεηζηχκ κδιαηςδμηηυκςκ μxamyl (Vydate) ηαζ fluensulfone (MCW-2) ηαζ ηςκ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ QL Agri (εηπφθζζια ημο θοημφ Quillaja saponaria) ηαζ BIOACT (ζπυνζα ημο παναζζηζημφ ιφηδηα Paecilomyces lilacinus, PL 251) ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Απυ ηδκ ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ πνμέηορε υηζ ηυζμ ηα ζοκεεηζηά κδιαηςδμηηυκα oxamyl, fluensulfone, υζμ ηαζ ημ θοηζηήξ πνμέθεοζδξ QL Agri δεκ επδνέαζακ ζδιακηζηά ηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Ακηίεεηα, ημ αίμ-κδιαηςδμηηυκμ BIOACT πνμηάθεζε αφλδζδ ηςκ ανκδηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ ηαζ ηςκ ιοηήηςκ. ηδ ζοκέπεζα, εηηζιήεδηε δ επίδναζδ ημο ζφβπνμκμο ζοκεεηζημφ γζγακζμηηυκμο nicosulfuron, πμο παναηηδνίγεηαζ απυ ορδθή δναζηζηυηδηα ζε παιδθέξ δυζεζξ εθανιμβήξ, ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ (ΑΟΜ) πμο ηαεμνίγμοκ ηδ ζδιακηζηή θεζημονβία ηδξ κζηνμπμίδζδξ ζημ έδαθμξ ηαζ έπεζ πνμηαεεί δ πνήζδ ημοξ ςξ αζμδείηηεξ ηδξ θοζζμθμβζηήξ ηαηάζηαζδξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ θεζημονβίαξ ζημ έδαθμξ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, αημθμοεήεδηακ δφμ δζαθμνεηζηέξ πεζναιαηζηέξ πνμζεββίζεζξ: i) ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ζε αηναίεξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ ζημ εενιμηήπζμ, ιε επακαθαιαακυιεκεξ εθανιμβέξ ζε δυζεζξ x0, x10, x100 ηαζ x1000 ηδξ ζοκζζηχιεκδξ βζα εθανιμβή ζημκ αβνυ (Tier I) ηαζ ii) ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ζε νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ ζημκ αβνυ ζε δυζεζξ 0x, 1x ηαζ 5x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ (Tier II). ε αηναίεξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ (πείναια εενιμηδπίμο) παναηδνήεδηακ αθθαβέξ ιυκμ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ, εκχ δ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΑ ηαζ δ αθεμκία ηαζ ηςκ δφμ ιζηνμαζαηχκ μιάδςκ (ΑΟΑ/ΑΟΒ) δεκ επδνεάζηδηε ζδιακηζηά. Ακηίεεηα, ζε νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ (πείναια αβνμφ), δεκ παναηδνήεδηε ζοβηεηνζιέκδ επίδναζδ υζμκ αθμνά ζηδ ζφζηαζδ ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΜ. ε ακάθμβδ ιε ηδκ παναπάκς πνμζέββζζδ, πνμζδζμνίζηδηε δ επίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ Γεκδνυιμνθςκ Μοημννζγζηχκ Μφηδηςκ (ΓΜΜ) εκηυξ ηςκ νζγχκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ ζε αηναίεξ ηαζ ζε νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ 25

26 έηεεζδξ, ζημ εενιμηήπζμ ηαζ ζημκ αβνυ, ακηίζημζπα. Οζ ΓΜΜ αλζμθμβήεδηακ θυβς ημο ζδζαίηενα ζδιακηζημφ νυθμο ημοξ ζημκ ηφηθμ ημο Ρ αθθά ηαζ ζε άθθεξ εδαθζηέξ θεζημονβίεξ πμο ημοξ ηαεζζημφκ ζδζαίηενα ηαθμφξ αζμδείηηεξ βζα ηδκ αλζμθυβδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ λεκμαζμηζηχκ μοζζχκ ζηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. ε ζοκεήηεξ αηναίαξ έηεεζδξ (πείναια εενιμηδπίμο) ζδιεζχεδηε δναζηζηή ιείςζδ ηδξ πμζηζθυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ ζηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ, ιυκμ ζηζξ δυζεζξ 100x ηαζ 1000x. Οζ εοαίζεδημζ ΓΜΜ ακήημοκ ζηδκ πθεζμρδθία ημοξ ζημ βέκμξ Glomus, εκχ έκα ιδ ηαθθζενβήζζιμ είδμξ ηδξ μζημβέκεζαξ Paraglomeraceae ηαζ έκαξ νζαυηοπμξ ημο είδμοξ Glomus etunicatum εκημπίζηδηακ ζηαεενά ζηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ, ζε υθμοξ ημοξ ηφηθμοξ επέιααζδξ ηαζ ηζξ δυζεζξ εθανιμβήξ, οπμδδθχκμκηαξ ακεεηηζηυηδηα ζηδκ επίδναζδ ημο nicosulfuron. Οζ ημλζηέξ ζοκέπεζεξ ημο nicosulfuron ζημοξ ΓΜΜ πμο παναηδνήεδηακ ζηδκ πενίπηςζδ εθανιμβήξ ηςκ ορδθυηενςκ δυζεςκ ιπμνεί κα μθείθμκηαζ ζε άιεζδ ημλζηυηδηα ζημοξ ιφηδηεξ ή ζε ημλζηυηδηα πμο εηδδθχκεηαζ ζηα θοηά ιε έιιεζδ επίπηςζδ ζηδ ζοιαζςηζηή ημοξ ιε ημοξ ΓΜΜ. Ακηίεεηα, ζε νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ (πείναια αβνμφ) δεκ παναηδνήεδηακ ιεηααμθέξ ςξ πνμξ ηδ ζφζηαζδ ηςκ ΓΜΜ. Σέθμξ, αλζμθμβήεδηε ζε επίπεδμ ιζηνμηυζιςκ δ επίδναζδ ηςκ ιοηδημηηυκςκ thiabendazole (TBZ), imazalil (IMZ), ortho-phenylphenol (OPP) ηαζ ηςκ ακηζμλεζδςηζηχκ diphenylamine (DPA) ηαζ ethoxyquin (EQ), πμο πενζέπμκηαζ ζηα οβνά απυαθδηα ηςκ ζοζηεοαζηδνίςκ θνμφηςκ, ζηδκ δμιή ηαζ ηδ θεζημονβία ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ ιε ηδκ πνήζδ δζαθμνεηζηήξ ακάθοζδξ ιμνζαηχκ ηαζ αζμπδιζηχκ ιεευδςκ. οβηεηνζιέκα, ιεθεηήεδηακ μζ επζδνάζεζξ ηςκ β.θ.., ζηδ ζφζηαζδ ηαζ ημ ιέβεεμξ ηδξ εδαθζηήξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ ιε ηδ ιέεμδμ PLFAs ηαζ ζηδκ θεζημονβία ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ιε εηηίιδζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ εκγφιςκ α-βθοημζζδάζδ (ηφηθμξ C), υλζκεξ ηαζ αθηαθζηέξ θςζθαηάζεξ (ηφηθμξ Ρ) ηαζ οδνμθάζεξ (ιέεμδμξ FDΖA) ηαζ ημο νοειμφ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ακαπκμήξ ηαζ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ. Δπίζδξ, ιεθεηήεδηε δ επίδναζδ ηςκ β.θ. ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ζημ έδαθμξ, αθθά ηαζ ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία, ηςκ ΑΟΜ ημο εδάθμοξ. Πανάθθδθα, πνμζδζμνίζηδηε δ πμνεία απμδυιδζδξ ηςκ β.θ. ζημ έδαθμξ ηαζ βζα ημ ζημπυ αοηυ, ακαπηφπεδηακ ακαθοηζηέξ ιέεμδμζ εηπφθζζδξ ηαζ παναθααήξ ημοξ απυ ημ έδαθμξ. Ζ απμδυιδζδ υθςκ ηςκ β.θ.. πμο ιεθεηήεδηακ πενζβνάθεηαζ ζηακμπμζδηζηά απυ ημ δζθαζζηυ ιμκηέθμ Hockey Stick (π 2 < 15, r 2 > 0.75). Σα ιοηδημηηυκα ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ πανμοζίαζακ ιέηνζα πνμξ ορδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα ζημ έδαθμξ (DT ηαζ διένεξ, ακηίζημζπα) ζε 26

27 ακηίεεζδ ιε ηα ΟΡΡ ηαζ DPA πμο απμδμιήεδηακ ηαπφηαηα (DT ηαζ 1.30 διένεξ, ακηίζημζπα). Σέθμξ ημ EQ (DT διένεξ) μλεζδχεδηε ηαπφηαηα αιέζςξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημο ζημ έδαθμξ, πνμξ 2,6-dihydro-2,2,4-trimethyl-6-quinone imine (QI) ηαζ 2,4-dimethyl-6-ethoxyquinoline (EQNL) εη ηςκ μπμίςκ ημ QI πμο απμηέθεζε ημκ ηφνζμ ιεηααμθίηδ απμδμιήεδηε ηαπφηαηα εκχ ημ EQNL πμο ζπδιαηίζηδηε ζε ιζηνέξ πμζυηδηεξ έδεζλε ορδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα. Ζ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ απμηέθεζε ημκ πζμ εοαίζεδημ δείηηδ ιεηααμθχκ ιε παναηηδνζζηζηυηενδ ηδκ ανκδηζηή επίδναζδ ημο ΔQ ζε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ. Πεναζηένς ιεθέηεξ ζημ ίδζμ έδαθμξ έδεζλακ υηζ δ ακαζημθή ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ πνμηαθείηαζ απυ ημκ ηφνζμ ιεηααμθίηδ ημο EQ ζημ έδαθμξ, ημ QI. διακηζηή ήηακ δ επίδναζδ ηςκ β.θ.. ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ηαζ ηςκ ΑΟΜ εκχ δ αθεμκία ηςκ ΑΟΜ ημο εδάθμοξ υπςξ εηηζιήεδηε ιε qpcr (ακηίβναθα amoa βμκζδίμο ng -1 DNA) δεκ θαίκεηαζ κα επδνεάζηδηε ζδιακηζηά απυ ηζξ επζιένμοξ ιεηαπεζνίζεζξ. Ακηίεεηα, ιείςζδ ηςκ θεζημονβζηά εκενβχκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ, ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ (ιεηάβναθα amoa βμκζδίμο ng -1 RNA), παναηδνήεδηε ζηζξ 3 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή, ζηα εδαθζηά δείβιαηα ημο EQ, ζοβηνζηζηά ιε ηα ακηίζημζπα δείβιαηα ημο ιάνηονα. Σα απμηεθέζιαηα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ, απμηεθμφκ έκδεζλδ ηςκ ακεπζεφιδηςκ επζδνάζεςκ ηςκ β.θ.. πμο πενζέπμκηαζ ζηα οβνά απυαθδηα ηςκ ζοζηεοαζηδνίςκ θνμφηςκ ζε ααζζηέξ θεζημονβίεξ ημο εδαθζημφ μζημζοζηήιαημξ ηαζ ηαηαδεζηκφμοκ ηδκ ακάβηδ βζα άιεζδ ηαζ απμηεθεζιαηζηή επελενβαζία ηςκ οβνχκ απμαθήηςκ απυ ηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ. Σα εονήιαηα ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ ιπμνμφκ κα απμηεθέζμοκ ηδκ αάζδ βζα ηδ δδιζμονβία ιζαξ πζμ απμηεθεζιαηζηήξ ηαζ αηνζαέζηενδξ αλζμθυβδζδξ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. Μζα ηέημζα αλζμθυβδζδ εα πνέπεζ κα πενζθαιαάκεζ α) ιζα πμθοθαζζηή αλζμθυβδζδ ηυζμ ζε επίπεδμ ενβαζηδνίμο ζε ζοκηδνδηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ (Tier I) υζμ ηαζ ζε επίπεδμ αβνμφ (Tier II) οπυ νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ, α) ηδ πνήζδ κέςκ ηοπμπμζδιέκςκ ιμνζαηχκ ηαζ αζμπδιζηχκ ενβαθείςκ πμο εα πανέπμοκ ιζα πθήνδ εζηυκα ηςκ επζδνάζεςκ ζε επίπεδμ πμζηζθυηδηαξ ηαζ θεζημονβίαξ ηαζ β) ηδκ αλζμθυβδζδ εηηυξ ηςκ ιδηνζηχκ ιμνίςκ ηςκ β.θ.. ηαζ ηςκ ηονζυηενςκ ιεηααμθζηχκ πνμσυκηςκ ημοξ ζημ έδαθμξ αθθά ηαζ ζοκμθζηά ηςκ ζηεοαζιάηςκ ηαεχξ μζ ιεθέηεξ ιαξ έδεζλακ υηζ ηυζμ μζ ιεηααμθίηεξ υζμ ηαζ ζοκέηδμπα ηςκ ζηεοαζιάηςκ ιπμνεί κα έπμοκ ακεπζεφιδηεξ επζδνάζεζξ ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. 27

28 ABSTRACT Synthetic pesticides play a major role in crop protection as a fast, easy and cheap method for pest control. However, their indiscriminate use has resulted in (1) efficacy loss due to the development of resistance by pests (2) toxicity to non-target organisms and (3) hazardous effects on the environment endangering the sustainability of ecosystems. Due to the environmental side effects and health concerns, many synthetic pesticides have been banned or are under re-evaluation. Alternative approaches to pest control are urgently needed. In recent years, pesticides of biological origin have been developed as alternatives for pest control, while modern synthetic pesticides have become safer and more target specific in their activity. Despite of general belief that their biological origin guarantee their environmentally safety the effects of such pesticides on non-target organisms in general and on soil microorganisms in particular have not been studied extensively. Soil microorganisms play a pivotal role in soil quality and plant productivity. Nowadays numerous new advanced methods have allowed the in depth study of soil microbial communities. The use of high-throughput molecular techniques for investigating microbial diversity in soil communities provides new understanding of the distribution and diversity of microorganisms in soil habitats. However, those methodological advances in soil microbial ecology have been hardly taken into account in the implementation of new legislation and regulations regarding pesticide authorization. In the present thesis a number of different pesticides both synthetic and of biological origin, were studied with regards to their fate in the environment and their impact on soil microbial communities. The first aim of the study was the optimization of Phospholipid Fatty Acid (PLFA) analysis in order to attain a precise picture of the size and the structure of the soil microbial community. Σhe effects of extraction solvent (chloroform vs dichloromethane) and buffer (phosphate vs citrate) on the yield and the profile of PLFAs extracted from an acidic (ph 5.5) and an alkaline (ph 8.6) soil following two2-h sequential extractions were determined. The yield and the profile of the PLFAs obtained separately by the first and the second 2-h extraction were compared to identify the impact of sequential extractions on the PLFA extraction efficiency. Chloroform citrate and a 2 2-h extraction maximized PLFA yields in both soils. Multivariate analysis of the data showed that the choice of the extraction mixture did 28

29 not significantly influence the profile of the PLFAs obtained by the first 2-h extraction, whereas it had a profound effect on the profile of the PLFAs obtained by the second 2-h extraction. Most PLFAs were extracted during the first extraction except from 18:2ς6,9 and 22:0 which were almost equally extracted by the two sequential extractions. The choice of organic solvent significantly influenced the profile of the PLFAs extracted; their yield increased with chloroform with the exception of 18:2ς6,9 and 22:0 which were favored by dichloromethane. Overall, a 2 2-h extraction with chloroform/methanol/citrate is expected to provide maximum PLFA yields. Subsequently, the optimized PLFA protocol was used for investigating the effects of Quillaja saponaria plant extract (QLAgri ) and Paecilomyces lilacinus strain 251 (PL251, BIOACT ) on the microbial community comparatively to the synthetic nematicides oxamyl and fluensulfone. No effects of QLAgri, oxamyl and fluensulfone were observed. In contrast BIOACT stimulated the growth of copiotrophic Gram negative bacteria and fungi which was attributed to individual components of the formulation like glucose and semi skimmed milk which upon their release in soil stimulated those microorganisms. Ammonia-oxidizing microorganisms (AOM) have been identified as a key group regulating N cycle through their involvement in the nitrification process in soil. Their pivotal role in N cycling, the availability of well-standardized tools to determine their activity and abundance in soil make them potential microbial indicators for use in the assessment of pesticide soil microbial toxicity. Despite all the above, little is known about the effects of pesticides on AOM. The impact of the low dose, high potency herbicide nicosulfuron on the community structure and abundance of AOM was investigated following a tiered pot-to-field experimental approach. This approach allowed the assessment of nicosulfuron toxicity i) at extreme exposure schemes (pot experiment, Tier I) invoked by the repeated application of a range of dose rates (x0, x10, x100 and x1000 the recommended dose) and ii) under realistic exposure scenarios (x0, x1, x2 and x5 the recommended dose) in the field (Tier II). Structural changes on AOM community were assessed via denaturating gradient gel electrophoresis (DGGE) at the DNA level, while changes in abundance of AOM were assessed via qpcr of the amoa gene. At extreme exposure schemes, nicosulfuron induced changes only in AOB community structure, while AOA community structure and AOM abundance were not significantly affected. On the other hand under realistic field exposure scenarios no specific effect on AOM was observed. 29

30 The key role of arbuscular mycorrhizal (AM) fungi in maintaining soil fertility and ecosystem functioning as well as their general responsiveness to pesticides make them good candidates as microbial indicators in pesticide soil microbial ecotoxicity assessment. In a similar to the above pot-to-field experimental approach, the impact of nicosulfuron on community structure of AM fungi was assessed i) at extreme exposure schemes (pot experiment, Tier I) and ii) under realistic exposure scenarios in the field (Tier II). In the pot experiment, the highest dose rates (x100 and x1000) significantly reduced AM fungal richness as determined by DGGE. This coincided with the progressive accumulation of herbicide concentrations in soil. In contrast, no effects on AM fungi were observed at the nicosulfuron dose rates tested in the field. Clone libraries developed for the pot experiment samples showed that the majority of AM fungi belonging to the previously known Glomus group and were sensitive to the high levels of nicosulfuron accumulated in soil at the latter culture cycles. In contrast, a Paraglomeraceae and a Glomus etunicatum ribotype were present in maize roots in all cycles and dose rates implying a tolerance to nicosulfuron induced stress. Overall, the deleterious effects of nicosulfuron on AM fungi induced by the highest dose rates in the pot experiment could be attributed either to fungal driven toxicity or to plant driven effects which have subsequent implications for mycorrhizal symbiosis. Thiabendazole (TBZ), imazalil (IMZ), ethoxyquin (EQ), diphenylamine (DPA), and ortho-phenyl phenol (OPP) are pesticides used in fruit packaging plants for the control of post-harvest fungal infestations and physiological disorders. Their application result in the production of large wastewater volumes with high pesticide loads ( mg L -1 ). These compounds were given authorization for use at the EU level under the clause that an efficient treatment of the produced wastewaters should be operative at a local scale. Despite that, no established depuration method is operative to date and their direct disposal into soil via land spreading is a common practice. Taking into account the key role of soil microbes in ecosystem functioning the effects of these pesticides on the diversity and activity of soil microbes were assessed in a microcosm study. In parallel, the dissipation of those pesticides was determined in order to identify possible links between persistence and soil microbial toxicity. The functional endpoints studied were microbial respiration, potential nitrification, acidic and alkaline phosphatases, α-glucosidase, and fluorescein diacetate (FDA), while the effect on the size and diversity of soil microbial biomass was studied via phospholipid fatty acid (PLFAs) analysis. Pesticides dose rates (50 30

31 mg Kg -1 ) were selected based on a direct disposal scenario for wastewaters. Reliable analytical methods were developed for the extraction and determination of pesticides and their metabolites in soil. The dissipation of all pesticides was biphasic and was adequately described by the hockey-stick model (π 2 < 15, r 2 > 0.75). IMZ and TBZ showed hight to moderate persistence (DT and 47.0 days, respectively) while OPP and DPA rapidly dissipated (DT and 1.30 days, respectively). EQ itself was not persistent (DT days) and was rapidly transformed in soil to its main oxidation derivatives quinone imine (QI) and 2,4-dimethyl-6-ethoxyquinoline (EQNL). Microbial respiration was not affected by pesticide application. DPA (44.6 nmol/g) and OPP (45.9 nmol/g) induced significant decreases on total PLFA yields compared to the control (51.9 nmol/g). However, no effects on the PLFAs profile in the different treatments were observed. Enzymatic activities were significantly affected by pesticides, however the effects did not show a clear temporal pattern. In contrast, EQ and OPP significantly inhibited potential nitrification with the effect of the former being more prominent and persistent. Complementary experiments were conducted in order to further investigate the effects of EQ and its oxidation derivatives on potential nitrification in soil in relation to their dissipation in soil. The major metabolite of EQ in soil was QI and appeared to be responsible for the drastic inhibition of potential nitrification observed in soil. In parallel the effects of these pesticides on the structure of basidiomycetes and AOM in soil (DGGE-DNA) and on the abundance of ammonia oxidizers both at DNA and RNA level were investigated, using DGGE-DNA, qpcr, and RTqPCR, respectively. Pesticides induced structural changes to basidiomycetes and AOM communities. The abundance of amoa gene copies was not significantly affected, while the abundance of amoa gene transcripts significantly decreased at the first three days after pesticide application suggesting a clear toxicity effect of EQ and its derivatives on AOM activity. Our results provide first evidence that soil spreading of pesticide-containing wastewaters from the fruit packaging plants could influence the size of soil microbial biomass and selected microbial activities depending on their pesticide content. The findings of this thesis could be the basis for the establishment of a new comprehensive assessment of the toxicity of pesticides on soil microbes. Such an assessment approach should include a) a tiered evaluation, including experimentation under laboratory conditions and highly conservative exposure schemes (Tier I) and under field conditions simulating a more realistic exposure step (Tier II), b) the use of 31

32 new standardized molecular and biochemical methods which could provide a more accurate and in-depth picture of potential effects of pesticides on soil microbes at both diversity and functional level and c) the evaluation of the toxicity of both parent compounds and main metabolites but also evaluation of the toxicity of the marketed formulations since our findings showed that pesticide metabolic products and components of the formulation could have deleterious effects on soil microorganisms. 32

33 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 1. Γεληθή Δηζαγσγή 1.1.Σύρε θαη πκπεξηθνξά Γεσξγηθώλ Φαξκάθσλ ζην Πεξηβάιινλ Ο υνμξ βεςνβζηυ θάνιαημ (β.θ.) 1 ηαθφπηεζ έκα εονφ θάζια πδιζηχκ μοζζχκ πμο ιπμνμφκ κα εακαηχζμοκ, κα πανειπμδίζμοκ ή κα επζαναδφκμοκ ηδκ ακάπηολδ ηςκ επενχκ ηςκ ηαθθζενβεζχκ. Ζ πνήζδ ηςκ β.θ. απμηεθεί πάβζα βεςνβζηή πναηηζηή ηδξ απμηαθμφιεκδξ ζοιααηζηήξ βεςνβίαξ ηαζ απμαθέπεζ ζηδκ αφλδζδ ηδξ παναβςβζηυηδηαξ ηαζ ηςκ απμδυζεςκ ηςκ ηαθθζενβμφιεκςκ θοηχκ, ζηδ αεθηίςζδ ηδξ πμζυηδηαξ ηςκ βεςνβζηχκ πνμσυκηςκ, ζηδκ πνμιήεεζα ημο ηαηακαθςηή ιε θεδκά βεςνβζηά πνμσυκηα, ζηδ ιείςζδ ηςκ απςθεζχκ ζηα βεςνβζηά πνμσυκηα ηαηά ηδκ απμεήηεοζδ, δζαηίκδζδ ηαζ ειπμνία ηαζ ζηδ δζαζθάθζζδ ηδξ επάνηεζαξ ηνμθχκ βζα ημκ άκενςπμ ηαζ ηα γχα (Εζχβαξ ηαζ Μάνημβθμο, 2010, Aktar et al., 2009, Taube et al., 2002). Δηηζιάηαζ υηζ 4 εηαημιιφνζα ηυκμζ β.θ. πνδζζιμπμζμφκηαζ εηδζίςξ ζηζξ δζάθμνεξ ηαθθζένβεζεξ ζε παβηυζιζα ηθίιαηα βζα ηδκ ηαηαπμθέιδζδ ηςκ επενχκ ηςκ ηαθθζενβεζχκ (Gavrilescu, 2005). Σα γζγακζμηηυκα απμηεθμφκ ηδκ πενζζζυηενμ πνδζζιμπμζμφιεκδ ηάλδ αβνμπδιζηχκ παβημζιίςξ (48% ηδξ ζοκμθζηήξ εθανιμβήξ β.θ.) αθθά ηαζ ζε Δονςπασηυ επίπεδμ (43%) ηαζ αημθμοεμφκ ηα ιοηδημηηυκα (35%) ηαζ ηα εκημιμηηυκα (14%) (Βlasioli et al., 2011). Οζ ηνυπμζ πνήζδξ ηςκ β.θ. ζημ βεςνβζηυ πενζαάθθμκ πμζηίθμοκ. Ακάιεζα ημοξ δζαηνίκμκηαζ μ ρεηαζιυξ ηςκ οπένβεζςκ μνβάκςκ ηςκ θοηχκ, δ επζηάθορδ ηαζ πνμζηαζία ηςκ ζπυνςκ ή άθθςκ πμθθαπθαζζαζηζηχκ μνβάκςκ ηαζ μζ απεοεείαξ επειαάζεζξ ζημ έδαθμξ (Εζχβαξ ηαζ Μάνημβθμο, 2010, van der Werf, 1996). Ακελάνηδηα υιςξ απυ ημκ ηνυπμ πνήζδξ ημοξ, ιζηνυ πμζμζηυ ηδξ ζοκμθζηήξ πνδζζιμπμζμφιεκδξ πμζυηδηαξ θηάκεζ ηεθζηά ζημ ζηυπμ ηδξ, εκχ ημ έδαθμξ θαίκεηαζ κα είκαζ μ ηεθζηυξ απμδέηηδξ υθςκ ηςκ β.θ.. (Gavrilescu, 2005, Galiulin et al., 2001). 1 Σύμφωνα με το Άρθρο 3 τησ Οδηγίασ 128/2009/ΕΚ (ςημείο 10) ιςχύει ο ακόλουθοσ οριςμόσ: «γεωργικό φάρμακο»: α) φυτοπροςτατευτικό προϊόν όπωσ ορίζεται ςτον κανονιςμό (ΕΚ) αριθ. 1107/2009. β) βιοκτόνο όπωσ ορίζεται ςτο ΠΔ 205/2001 (ΦΕΚ 160/Α / ), για τη διάθεςη ςτην αγορά βιοκτόνων. 33

34 φιθςκα ιε ζηαηζζηζηά ζημζπεία ημ πμζμζηυ ηςκ δναζηζηχκ μοζζχκ πμο ηαηαθήβμοκ ζημ έδαθμξ ακένπεηαζ ζημ 85% ηδξ ζοκμθζηήξ πνδζζιμπμζμφιεκδξ πμζυηδηαξ (5% ηαηαηναηείηαζ απυ ημ θφθθςια ηςκ θοηχκ ηαζ 15% εθεοεενχκεηαζ ζηδκ αηιυζθαζνα) (Margni et al, 2002). Ζ ηφπδ ηαζ δ ζοιπενζθμνά ηςκ β.θ. ζημ εδαθζηυ πενζαάθθμκ εθέβπεηαζ απυ πδιζηέξ, αζμθμβζηέξ ηαζ θοζζηέξ δζενβαζίεξ μζ μπμίεξ δζαηνίκμκηαζ πεναζηένς ζε αοηέξ πμο επδνεάγμοκ ηδκ οπμθεζιιαηζηή ημοξ δζάνηεζα (υπςξ είκαζ μζ δζενβαζίεξ δζάζπαζδξ: θςημπδιζηή, πδιζηή ηαζ ιζηνμαζαηή) ηαζ ζε αοηέξ πμο ηαεμνίγμοκ ηδκ ηζκδηζηυηδηα ημοξ (πνμζνυθδζδ, πνυζθδρδ απυ ηα θοηά, πηδηζημπμίδζδ, δζάανςζδ, επζθακεζαηή απμννμή, έηπθοζδ) (Andreu and Pico, 2004) Παξάγνληεο πνπ επεξεάδνπλ ηελ ππνιεηκκαηηθόηεηα ησλ γ.θ. ζην έδαθνο H οπμθεζιιαηζηή δζάνηεζα-ειιμκή ηςκ β.θ. μνίγεηαζ ζοκήεςξ απυ ημ πνυκμ διζγςήξ (t ½), δδθαδή ημ πνυκμ πμο απαζηείηαζ βζα κα μθμηθδνςεεί δ δζάζπαζδ ημο 50% ηδξ πμζυηδηαξ ημο β.θ.. πμο πνδζζιμπμζήεδηε ανπζηά ηαζ μζ ηζιέξ πμο παίνκεζ επδνεάγμκηαζ ζε ζδιακηζηυ ααειυ απυ δζενβαζίεξ υπςξ δ θςημπδιζηή, πδιζηή ηαζ ιζηνμαζαηή δζάζπαζδ (Tiryaki and Temur, 2010). Οζ ηζιέξ ημο πνυκμο διζγςήξ υηακ αοηυξ πνμζδζμνίγεηαζ ζε ζοκεήηεξ αβνμφ είκαζ βεκζηυηενα παιδθυηενεξ απυ ηζξ ακηίζημζπεξ πμο ηαηαβνάθμκηαζ ζε ζοκεήηεξ ενβαζηδνίμο ηονίςξ ελαζηίαξ ηδξ πανμοζίαξ ζε ζοκεήηεξ αβνμφ δζαθυνςκ παναβυκηςκ πμο εοκμμφκ ηδ ηαπφηενδ δζάζπαζδ (vanderwerf, 1996), υπςξ μζ ηθζιαημθμβζηέξ ζοκεήηεξ (ανμπμπηχζεζξ, εενιμηναζία), δ οπενζχδδξ αηηζκμαμθία ηαζ μζ ηαθθζενβδηζηέξ πναηηζηέξ (άνδεοζδ, υνβςια) (Chowdhury et al., 2008, Beulke et al., 2000). Φσηνρεκηθή δηάζπαζε ή Φσηόιπζε. Με ημκ υνμ θςημπδιζηή δζάζπαζδ ή θςηυθοζδ εκκμμφιε ηδκ απμδυιδζδ ηςκ β.θ. φζηενα απυ ηδκ έηεεζδ ζημ θχξ ηαζ ζοιααίκεζ υηακ οπενζχδδξ αηηζκμαμθία δζαζπά ημοξ πδιζημφξ δεζιμφξ ημο ιμνίμο ημο β.θ.. Ακάιεζα ζημοξ πανάβμκηεξ πμο επδνεάγμοκ ηδ θςηυθοζδ πενζθαιαάκμκηαζ δ έκηαζδ θςηυξ, μ πνυκμξ έηεεζδξ, δ ιέεμδμξ εθανιμβήξ ηαζ μζ ζδζυηδηεξ ημο β.θ.. Σα β.θ. πμο εθανιυγμκηαζ επζθακεζαηά ζημ έδαθμξ είκαζ πενζζζυηενμ εοάθςηα ζε θςηυθοζδ ζοβηνζηζηά ιε ηα β.θ. πμο εκζςιαηχκμκηαζ ζημ έδαθμξ. Ζ θςηυθοζδ ζημ έδαθμξ είκαζ δφζημθμ κα ηαεμνζζηεί ελαζηίαξ ηδξ εηενμβεκμφξ θφζδξ ημο εδάθμοξ ηαζ ηδξ πενζμνζζιέκδξ δζεζζδοηζηήξ ζηακυηδηαξ ημο θςηυξ (Gavrilescu, 2005, Tiryaki and Temur, 2010, Blasioli et al., 2011). 34

35 Υεκηθή Γηάζπαζε. Ζ πδιζηή ή ααζμηζηή δζάζπαζδ πναβιαημπμζείηαζ δζα ιέζμο δζαθυνςκ πδιζηχκ ακηζδνάζεςκ υπςξ δ οδνυθοζδ, δ μλείδςζδ-ακαβςβή ηαζ μ ζμκζζιυξ πμο ζοκήεςξ πναβιαημπμζμφκηαζ ζε υλζκεξ ή αθηαθζηέξ ζοκεήηεξ, ηαζ ζπεηίγμκηαζ άιεζα ιε ημ ph. Ο υνμξ οδνυθοζδ πενζβνάθεζ ηδ θφζδ ηςκ δεζιχκ ζε έκα ιυνζμ υηακ αοηυ ακηζδνά ιε ημ κενυ. Οζ ακηζδνάζεζξ οδνυθοζδξ ιεηααάθμοκ ηδ δμιή ηδξ έκςζδξ ηαζ ηνμπμπμζμφκ ηζξ ζδζυηδηεξ ηδξ. οκήεςξ ημ πνμσυκ ηδξ οδνυθοζδξ είκαζ έκςζδ θζβυηενμ ημλζηή απυ ηδκ ανπζηή. Οζ ακηζδνάζεζξ μλείδςζδξ ηαζ ακαβςβήξ ζπεηίγμκηαζ ιε ηδ ιεηαθμνά δθεηηνμκίςκ ιεηαλφ ηςκ ιεθχκ εκυξ μλεζδμακαβςβζημφ γεφβμοξ. Ο νοειυξ ιε ημκ μπμίμ πναβιαημπμζμφκηαζ μζ ακηζδνάζεζξ μλείδςζδξ ηαζ ακαβςβήξ ελανηάηαζ απυ ημ ph ηαζ ημ ιέβεεμξ ημο δοκαιζημφ μλεζδμακαβςβήξ. Ζ ηφπδ ηςκ β.θ. πμο ζοιπενζθένμκηαζ ςξ μλέα ή αάζεζξ επδνεάγεηαζ ζδιακηζηά απυ ηδκ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ζυκηςκ οδνμβυκμο, πμο ηαεμνίγεζ ημ ααειυ ζμκζζιμφ ημοξ δδθαδή ακ ηα μλέα ή μζ αάζεζξ εα ανίζημκηαζ ζημ εδαθζηυ δζάθοια ζε μοδέηενδ ή ζμκζηή ιμνθή. Έκα μνβακζηυ μλφ ή αάζδ πμο έπεζ ζμκζζηεί ιπμνεί κα δζαθένεζ ζδιακηζηά απυ ηδκ ακηίζημζπδ έκςζδ ζε μοδέηενδ ιμνθή ςξ πνμξ ηδ δζαθοηυηδηα, ηδκ πνμζνυθδζδ ηαζ ηα ημλζημθμβζηά ηδξ παναηηδνζζηζηά (Μuller et al., 2007, Gavrilescu, 2005). Μηθξνβηαθή δηάζπαζε. Πενζθαιαάκεζ ηδκ απμδυιδζδ ηςκ β.θ. απυ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ υπςξ ιφηδηεξ, ααηηήνζα ηαζ άθβδ. Σνεζξ δζαθμνεηζηέξ ιμνθέξ ιζηνμαζαηήξ δζάζπαζδξ ιζαξ πδιζηήξ μοζίαξ δζαηνίκμκηαζ: (i) Ο ηαηααμθζζιυξ, υπμο μζ ιζηνμμνβακζζιμί δζαζπμφκ ημ β.θ.. ιεηά ηδκ έηεεζδ ημοξ ζε αοηυ ηαζ ημ πνδζζιμπμζμφκ ςξ πδβή C, N, P, S ηαζ εκένβεζαξ. (ii) Ο ζοιιεηααμθζζιυξ (co-metabolism),υπμο δ δζάζπαζδ ημο β.θ. ζημ έδαθμξ πναβιαημπμζείηαζ εοηαζνζαηά απυ ιζηνμμνβακζζιμφξ πμο δεκ απμημιίγμοκ εκένβεζα βζα ηδκ αφλδζδ ηαζ ακάπηολδ ημοξ. Ο ζοιιεηααμθζζιυξ απμηεθεί ημκ ηονίανπμ ηνυπμ ιζηνμαζαηήξ δζάζπαζδξ ηαζ ζε αοηή ηδκ πενίπηςζδ ηα β.θ. δζαζπχκηαζ ιε ανβμφξ νοειμφξ (iii) Ζ αζμζοζζχνεοζδ, ηαηά ηδκ μπμία ημ β.θ. ζοζζςιαηχκεηαζ ηαζ ζοζζςνεφεηαζ ζημοξ μνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ ιέζα απυ εκενβδηζηέξ ηαζ παεδηζηέξ δζενβαζίεξ πνυζθδρδξ (Μuller et al., 2007, Racke, 1990). Ζ ζοκμθζηή δζάζπαζδ εκυξ β.θ. ζημ έδαθμξ πνμηφπηεζ ςξ απμηέθεζια ημο ζοκδοαζιμφ ηςκ παναπάκς ιδπακζζιχκ. Ο ααειυξ ζημκ μπμίμ ηάεε ιδπακζζιυξ ζοκεζζθένεζ ζηδ ζοκμθζηή δζάζπαζδ ελανηάηαζ: (α) απυ ηζξ θοζζημπδιζηέξ ζδζυηδηεξ 35

36 ημο β.θ. (πδιζηή δμιή, ζοβηέκηνςζδ, δζαθοηυηδηα), (α) ηα παναηηδνζζηζηά ημο εδάθμοξ (πενζεηηζηυηδηα ζε μνβακζηή μοζία, άνβζθμ, ph, οβναζία εδάθμοξ), (β) ηζξ πενζααθθμκηζηέξ ζοκεήηεξ (εενιμηναζία) ηαζ (δ) ηζξ ηαθθζενβδηζηέξ πναηηζηέξ (Chowdhury et al., 2008, Pal et al., 2006). Γεκζηά, ηα πνμσυκηα ιεηααμθζζιμφ ηςκ β.θ. ζηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ είκαζ θζβυηενμ ημλζηά απυ ηζξ ιδηνζηέξ εκχζεζξ. Χζηυζμ, ηάπμζεξ θμνέξ ηα πνμσυκηα ιεηααμθζζιμφ ηςκ β.θ. είκαζ ελίζμο ή αηυια ηαζ πενζζζυηενμ ημλζηά απυ ηζξ ιδηνζηέξ εκχζεζξ. Δπίζδξ, ζοπκά μζ ιεηααμθίηεξ είκαζ εκχζεζξ πμθζηυηενεξ ηαζ επζδεζηκφμοκ ιεβαθφηενδ ηζκδηζηυηδηα απυ ηζξ ιδηνζηέξ εκχζεζξ. Γζα ημ θυβμ αοηυ, πνζκ ηδκ έβηνζζδ ηοηθμθμνίαξ εκυξ κέμο β.θ., απαζημφκηαζ πνυζεεηα πενζααθθμκηζηά δεδμιέκα απυ ιεθέηεξ βζα υθμοξ ημοξ ιεηααμθίηεξ ηαζ ηα πνμσυκηα δζάζπαζδξ πμο απμηεθμφκ ιένμξ ιεβαθφηενμ απυ ημ 10% ηδξ ανπζηήξ ζοβηέκηνςζδξ ηδξ δναζηζηήξ μοζίαξ (Kookana and Simpson, 2008, Andreu and Pico, 2004) Παξάγνληεο πνπ επεξεάδνπλ ηελ θηλεηηθόηεηα ησλ γ.θ. ζην έδαθνο Πξνζξόθεζε. Με ημκ υνμ πνμζνυθδζδ εκκμμφιε ηδκ πνμζέθηοζδ ηαζ ζοβηνάηδζδ ηςκ β.θ. ζηα ακυνβακα ηαζ μνβακζηά ημθθμεζδή ημο εδάθμοξ, ιε πμθοάνζειμοξ πδιζημφξ δεζιμφξ (δεζιμί οδνμβυκμο, μιμζμπμθζημί δεζιμί, δοκάιεζξ van der Waals, αθθδθεπζδνάζεζξ δζπυθμο-δζπυθμο, δεζιμί ακηαθθαβήξ ζυκηςκ η.α). Ζ ηζκδηζηυηδηα ημο β.θ. ζημ έδαθμξ ηαζ επμιέκςξ δ δναζηζηυηδηα ηαζ δ οπμθεζιιαηζηή ημο δζάνηεζα ελανηχκηαζ απυ ηζξ δζαδζηαζίεξ πνμζνυθδζδξ, μζ μπμίεξ ηαεμνίγμοκ ηεθζηά ηδ ζοβηέκηνςζδ ημο β.θ. πμο παναιέκεζ δζαεέζζιδ ζημ εδαθζηυ δζάθοια βζα κα εηθνάζεζ ηδκ δναζηζηυηδηα ηδξ ή κα οπμζηεί δζενβαζίεξ δζάζπαζδξ ή ιεηαηίκδζδξ ζημ έδαθμξ. Σα β.θ. πνμζνμθχκηαζ ζζπονά ζε εδάθδ ιε ορδθή πενζεηηζηυηδηα ζε άνβζθμ ή μνβακζηή μοζία. Γζάθμνεξ εεςνίεξ ηαζ ιμκηέθα έπμοκ πνμηαεεί ιέπνζ ζήιενα βζα ηδκ ιαεδιαηζηή πενζβναθή ημο θαζκμιέκμο ηδξ πνμζνυθδζδξ. Ζ πζμ ζοπκά πνδζζιμπμζμφιεκδ ελίζςζδ βζα ηδκ πενζβναθή ηδξ πνμζνυθδζδξ μνβακζηχκ νφπςκ ζημ έδαθμξ είκαζ δ ζζυεενιδ ημο Freundlich. Ζ ζζυεενιδ ημο Freundlich δίκεηαζ απυ ηδκ ελίζςζδ: q=k f Ce 1/n, υπμο q είκαζ δ πμζυηδηα ηδξ μοζίαξ πμο πνμζνμθάηαζ ζημ έδαθμξ (mg g -1 ), Ce δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ πνμζνμθμφιεκδξ μοζίαξ ζημ εδαθζηυ δζάθοια ζε ηαηάζηαζδ ζζμννμπίαξ (mg L -1 ) ηαζ Kf ηαζ n, μζ ζηαεενέξ Freundlich πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ ιέβζζηδ πμζυηδηα πνμζνυθδζδξ ηαζ ηδκ έκηαζδ ηδξ πνμζνυθδζδξ, ακηίζημζπα. ηζξ πενζπηχζεζξ υπμο δ πμζυηδηα ηδξ μοζίαξ πμο πνμζνμθάηαζ ζημ έδαθμξ ζε ζπέζδ ιε ηδκ ακηίζημζπδ πμζυηδηα ζημ εδαθζηυ δζάθοια 36

37 αημθμοεεί βναιιζηή ζοιιεηααμθή πνδζζιμπμζείηαζ μ ζοκηεθεζηήξ ηαηακμιήξ πνμζνυθδζδξ ημο β.θ. ζημ έδαθμξ, Kd. Σέθμξ, υηακ δ μνβακζηή μοζία ημο εδάθμοξ απμηεθεί ηδκ ηφνζα επζθάκεζα πνμζνυθδζδξ πνδζζιμπμζμφκηαζ μζ ηακμκζημπμζδιέκμζ ςξ πνμξ ηδκ πενζεηηζηυηδηα ηςκ εδαθχκ ζε μνβακζηή μοζία ζοκηεθεζηέξ νυθδζδξ Κ oc ή K foc (Blasioli et al., 2011, Tiryaki and Temur, 2010, Kookana and Simpson, 2008, Muller et al., 2007, Wauchope et al., 2002, van derwerf, 1996). Πξόζιεςε από ηα θπηά. Ζ πνυζθδρδ ηςκ β.θ. ζημ έδαθμξ απυ ηα θοηά είκαζ πζεακυκ δ ηονζυηενδ αζηία ηδξ αζμζοζζχνεοζδξ ημοξ ζηδκ ηνμθζηή αθοζίδα ηαζ ζδιακηζηή μδυξ έηεεζδξ ηςκ ακενχπςκ ηαζ ηςκ γχςκ ζηα β.θ. (van derwerf, 1996). Πηεηηθνπνίεζε. Δίκαζ δ δζαδζηαζία ιεηαηνμπήξ ζηενεχκ ή οβνχκ πδιζηχκ μοζζχκ ζε αένζα ιμνθή ηαζ ζοιαάθεζ ζηδ ιεηαθμνά ημοξ ιαηνζά απυ ηδκ ανπζηή εέζδ εθανιμβήξ. Απμηεθεί ηδκ ηφνζα μδυ απμιάηνοκζδξ ηςκ β.θ. απυ ηδκ επζθάκεζα ημο εδάθμοξ, εκχ ιεζχκεηαζ ζδιακηζηά ζηζξ πενζπηχζεζξ υπμο ηα β.θ. εκζςιαηχκμκηαζ ζημ έδαθμξ. Ο νοειυξ πηδηζημπμίδζδξ ημο β.θ. πνμζδζμνίγεηαζ απυ ηδ ζηαεενά Henry K H, πμο ζζμφηαζ ιε ημ θυβμ ηδξ ηάζδξ ηςκ αηιχκ πνμξ ηδκ δζαθοηυηδηα ημο β.θ.. ζημ κενυ. Ζ ζηαεενά Henry K H πενζβνάθεζ ηδκ ηάζδ εκυξ β.θ. κα ηζκείηαζ ιεηαλφ ηδξ αηιυζθαζναξ ηαζ ημο εδαθζημφ δζαθφιαημξ ηαζ υζμ ιεβαθφηενδ δ ηζιή ηδξ ζηαεενάξ ηυζμ ιεβαθφηενδ δ πζεακυηδηα πηδηζημπμίδζδξ ημο απυ ημ εδαθζηυ δζάθοια. Γεκζηά, β.θ. ιε K H > 10-7 παναηηδνίγμκηαζ ςξ πηδηζηά. Απυ πενζααθθμκηζηήξ άπμρδξ ημ ηονζυηενμ παναηηδνζζηζηυ ηδξ πηδηζημπμίδζδξ είκαζ δ πζεακυηδηα ηαπείαξ απεθεοεένςζδξ ορδθήξ ζοβηέκηνςζδξ β.θ. ζηδκ αηιυζθαζνα. Οζ πανάβμκηεξ πμο επδνεάγμοκ ηδκ πηδηζημπμίδζδ ηςκ μνβακζηχκ μοζζχκ πενζθαιαάκμοκ πδιζηέξ ηαζ θοζζημπδιζηέξ ζδζυηδηεξ ηςκ μοζζχκ (ηάζδ αηιχκ, δζαθοηυηδηα, ζοβηέκηνςζδ), ζδζυηδηεξ ημο εδάθμοξ (οβναζία, πενζεηηζηυηδηα ζε μνβακζηή μοζία ηαζ άνβζθμ) ηαζ πενζααθθμκηζημφξ πανάβμκηεξ (εενιμηναζία, οβναζία, ηαπφηδηα ημο αένα) (Blasioli et al., 2011, Tiryaki and Temur, 2010, Kookana and Simpson, 2008, Muller et al, 2007, vanderwerf, 1996). Γηάβξσζε. Πενζβνάθεζ ηδ ιεηαθμνά ζε ιζηνέξ ή ιεβάθεξ απμζηάζεζξ δζα ιέζμο ημο αένα ή ανμπήξ ζςιαηζδίςκ εδάθμοξ ζηα μπμία έπμοκ πνμζνμθδεεί β.θ. (Βlasioli et al., 2011, Tiryaki and Temur, 2010). 37

38 Δπηθαλεηαθή απνξξνή. Πενζβνάθεζ ηδκ μνζγυκηζα ιεηαηίκδζδ ημο κενμφ ηδξ άνδεοζδξ ή ηδξ ανμπήξ ηαζ μπμζαζδήπμηε άθθδξ μοζίαξ πμο είκαζ δζαθοιέκδ ή αζςνείηαζ ζε αοηυ ηαζ μδδβεί ζηδκ επζθακεζαηή ζηνάββζζδ. οιααίκεζ υηακ δ έκηαζδ ηδξ ανμπήξ ή ημο κενμφ ηδξ άνδεοζδξ οπενααίκεζ ηδκ ζηακυηδηα ηαηαηνάηδζδξ κενμφ απυ ημ έδαθμξ. Μαγί ιε ηδκ δζάανςζδ είκαζ μζ ηονζυηενεξ δζαδζηαζίεξ πμο ηαεμνίγμοκ ηδκ απχθεζα ηςκ β.θ. απυ ηδκ επζθάκεζα ημο εδάθμοξ. Σα β.θ. πμο παναιέκμοκ βζα ιεβαθφηενμ πνμκζηυ δζάζηδια ζηδκ επζθάκεζα ημο εδάθμοξ, επεζδή είηε πνμζνμθχκηαζ ζζπονά ή επεζδή είκαζ ακεεηηζηά ζηδ δζάζπαζδ ηαζ ηδκ πηδηζημπμίδζδ, οπυηεζκηαζ εοημθυηενα ζε επζθακεζαηή απμννμή, εκχ ημ ακηίεεημ ζοιααίκεζ βζα ηα β.θ. πμο εκζςιαηχκμκηαζ ζημ έδαθμξ. Δπίζδξ ιεβάθεξ απχθεζεξ παναηδνμφκηαζ ζε πενζπηχζεζξ υπμο δ εθανιμβή ηςκ β.θ.. ζοκμδεφεηαζ απυ ιεβάθδξ έκηαζδξ ηαηαζβίδεξ (Kookana and Simpson, 2008, vanderwerf, 1996). Έθπιπζε. Πενζβνάθεζ ηδκ ηίκδζδ ηςκ β.θ. ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημοξ ιε ηδ νμή ημο κενμφ ζε ααεφηενα ζηνχιαηα ημο εδάθμοξ ιέζα απυ ιζηνμπυνμοξ, ιαηνμπυνμοξ ηαζ νςβιέξ. Σμ έδαθμξ ιε ηα ζοζηαηζηά ημο ζοκήεςξ δζδεεί ημ κενυ απμιαηνφκμκηαξ μοζίεξ υπςξ ηα β.θ. πμο παναιέκμοκ δζαθοημπμζδιέκα ζημ εδαθζηυ δζάθοια. Οζ ζδζυηδηεξ ημο εδάθμοξ (μνβακζηή μοζία, δμιή ηαζ ph), μ ηνυπμξ πνμζεήηδξ ημο β.θ. ηαζ μζ πενζααθθμκηζηέξ ζοκεήηεξ επδνεάγμοκ ηζξ δζαδζηαζίεξ έηπθοζδξ. Ζ έηπθοζδ μδδβεί ζε νφπακζδ ηςκ οπυβεζςκ οδνμθυνςκ ζοζηδιάηςκ. Σα β.θ. ιε παιδθυ ζοκηεθεζηή πνμζνυθδζδξ (K oc ) είκαζ πζεακυηενμ κα εηπθοεμφκ (Tiryaki and Temur 2010, Kookana and Simpson 2008, vanderwerf, 1996). Σέθμξ, 20-70% ηςκ β.θ. ή ηςκ πνμσυκηςκ δζάζπαζδξ (ακάθμβα ιε ηα θοζζημπδιζηά παναηηδνζζηζηά ημο ηάεε β.θ.. αθθά ηαζ ημ θοζζημπδιζηά παναηηδνζζηζηά ηςκ εδαθχκ) ημοξ παναιέκμοκ ζημ έδαθμξ ςξ έιιμκα οπμθείιιαηα δεζιεοιέκα ζηα ημθθμεζδή ημο εδάθμοξ (bound residues) ηαζ πςνίξ κα είκαζ ή κα εεςνείηαζ ζηακή δ απεθεοεένςζδ ημοξ ζημ εδαθζηυ δζάθοια (ιδ ακηζζηνεπηή) (van der Werf, 1996). 38

39 Εικόνα 1.1. Σφχθ των γεωργικϊν φαρμάκων ςτο περιβάλλον (In: Οη κηθξννξγαληζκνί ηνπ εδάθνπο θαη ν ξόινο ηνπο Σα β.θ. ηα μπμία πνμζηίεεκηαζ απεοεείαξ ζημ έδαθμξ ή ηαηαθήβμοκ ηεθζηά ζε αοηυ, αθθδθεπζδνμφκ ιε ημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ ηαζ ιπμνμφκ κα ιεηααάθμοκ ηδ ιεηααμθζηή ημοξ δναζηδνζυηδηα, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ηδ θοζζμθμβζηή ηαζ αζμπδιζηή ημοξ ζοιπενζθμνά. Σέημζμο ηφπμο αθθδθεπζδνάζεζξ είκαζ δοκαηυκ κα μδδβήζμοκ ζε ιεηααμθέξ ζηδκ μιαθή θεζημονβία ημο εδαθζημφ ιζηνυμζημζοζηήιαημξ ελαζηίαξ ημο ζδζαίηενμο νυθμο πμο δζαδναιαηίγμοκ μζ ιζηνμμνβακζζιμί ζημ έδαθμξ. Οζ ιζηνμμνβακζζιμί επδνεάγμοκ, ζοιιεηέπμοκ ηαζ ηαηαθφμοκ ιεβάθμ ανζειυ ζδιακηζηχκ δζενβαζζχκ ζημ έδαθμξ. Ο ηονζυηενμξ νυθμξ ημοξ έβηεζηαζ ζηδ ζοιιεημπή ημοξ ζηδκ ακαηφηθςζδ ηςκ ααζζηχκ ενεπηζηχκ ζημζπείςκ βζα ηα θοηά ηαζ ζδζαίηενα εκχζεςκ άκεναηα, αγχημο, θςζθυνμο ηαζ εείμο (Falkowski et al., 2008, Miransari, 2001). Ζ ιζηνμαζαηή δνάζδ ζημ έδαθμξ ιεηαηνέπεζ αοηά ηα ζημζπεία ζε ιμνθέξ πμο επζηνέπμοκ ηδκ εφημθδ πνυζθδρδ ημοξ απυ ηα θοηά, εκζζπφεζ ηδ 39

40 βμκζιυηδηα ηςκ εδαθχκ ηαζ ζοιαάθεζ ζηδκ αφλδζδ ηδξ παναβςβζηυηδηαξ ηςκ θοηχκ (van der Heijden et al., 2008, Miransari, 2001). Άθθμζ ιδπακζζιμί ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ πμο πνμςεμφκ ηδκ ακάπηολδ ηςκ θοηχκ είκαζ δ παναβςβή θοηζηχκ μνιμκχκ, βκςζηχκ ςξ νοειζζηέξ αφλδζδξ ηςκ θοηχκ, υπςξ αολίκεξ, βζαενζθθίκεξ, ηοημηζκίκεξ, αζεοθέκζμ ηαζ αρζγζηυ μλφ (ΑΒΑ). Έιιεζα, μζ ιζηνμμνβακζζιμί ζοιαάθθμοκ ζηδκ ακάπηολδ ηςκ θοηχκ είηε αεθηζχκμκηαξ ηδκ ζηακυηδηα πνυζθδρδξ ενεπηζηχκ ζημζπείςκ ή δδιζμονβχκηαξ ιζηνμπενζαάθθμκ πμο είκαζ επζζπεηζηυ βζα θοημπαεμβυκμοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ πνμζηαηεφμκηαξ έηζζ ηα θοηά απυ πνμζαμθέξ. Πανάδεζβια ακάθμβδξ δνάζδξ απμηεθεί δ παναβςβή ζζδδνμθυνςκ μοζζχκ απυ ααηηήνζα ημο βέκμοξ Ρseudomonas. Οζ ζζδδνμθυνεξ μοζίεξ απμηεθμφκ μνβακζηέξ εκχζεζξ πμο δδιζμονβμφκ ζφιπθμηα ιε ζυκηα ζζδήνμο. ημ έδαθμξ μ ζίδδνμξ απακηά ζηδκ μλεζδςιέκδ ηνζζεεκή ιμνθή πμο δεκ αθμιμζχκεηαζ απυ ημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ηαζ ηα θοηά. Ζ παναβςβή ηςκ ζζδδνμθυνςκ δίκεζ ζηα ααηηήνζα αθθά ηαζ ζηα θοηά ηδ δοκαηυηδηα πνυζθδρδξ ηαζ αθμιμίςζδξ ημο εδαθζημφ ζζδήνμο ζε δζζεεκή ιμνθή ηαζ ηα ηαεζζηά ακηαβςκζζηζηά ηαζ ακεεηηζηά έκακηζ ηςκ θοημπαεμβυκςκ ιζηνμμνβακζζιχκ (Hayat et al., 2010). Δπζπθέμκ, ζοιαάθθμοκ ζημκ άιεζμ πενζμνζζιυ θοημπαεμβυκςκ ιοηήηςκ ηαζ ααηηδνίςκ ημο εδάθμοξ, πανάβμκηαξ μοζίεξ ιε ακηζιζηνμαζαηή δνάζδ, ημλζηέξ μοζίεξ (π.π. οδνμηοάκζμ) ή έκγοια υπςξ δ πζηζκάζδ ηαζ δ α-1,3-βθμοηακάζδ πμο πνμηαθμφκ θφζδ ηςκ ηοηηανζηχκ ημζπςιάηςκ ηςκ ιοηήηςκ, αθθά ηαζ μοζίεξ πμο αεθηζχκμοκ ηδ θοζζμθμβζηή ηαηάζηαζδ ηςκ θοηχκ ηαζ εκζζπφμοκ ημοξ ιδπακζζιμφξ ακεεηηζηυηδηαξ ημοξ ζε ααζμηζηέξ ηαζ αζμηζηέξ ηαηαπμκήζεζξ (Hayat et al., 2010). Οζ ιζηνμμνβακζζιμί ημο εδάθμοξ ιπμνμφκ επίζδξ κα επδνεάζμοκ ηζξ θοζζηέξ ζδζυηδηεξ ημο εδάθμοξ. Δοεφκμκηαζ βζα ηδ αζμζφκεεζδ ηαζ εθεοεένςζδ μοζζχκ υπςξ πμθοζαηπανίηεξ ηαζ βθοημπνςηεΐκεξ, πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδ δζαδζηαζία ηδξ πνυζδεζδξ ηςκ ζςιαηζδίςκ ημο εδάθμοξ, ημο ζπδιαηζζιμφ ηαζ ηδξ ζηαεενμπμίδζδξ ηςκ ζοζζςιαηςιάηςκ (aggregates) αεθηζχκμκηαξ ηδ δμιή ημο εδάθμοξ ηαζ επδνεάγμκηαξ ηδκ οδαημπςνδηζηυηδηα, ηδ δζδεδηζηή ζηακυηδηα, ηδκ ακεεηηζηυηδηα ζηδ δζάανςζδ ηαζ ηδκ ακημπή ημο ζηδ ζοιπίεζδ (Das and Varma, 2011, Miransari, 2011). Οζ ιζηνμμνβακζζιμί είκαζ επίζδξ ζηακμί κα απμημλζημπμζμφκ ή κα δζαζπμφκ ακενςπμβεκείξ νφπμοξ υπςξ ημλζηά ιέηαθθα, ανςιαηζηέξ εκχζεζξ ηαζ β.θ., δζαιέζμο ιζαξ δζαδζηαζίαξ βκςζηήξ ςξ αζμαπμννφπακζδ ή αζμελοβίακζδ (bioremediation). Βαηηήνζα πμο ακήημοκ ζηα βέκδ Bacillus, Pseudomonas, Methanobacteria, 40

41 Ralstonia, Deinococcus η.α δζαπζζηχεδηε υηζ απμδμιμφκ ηαπφηαηα μνβακζημφξ νφπμοξ ιε ζδζαίηενα ορδθή απμηεθεζιαηζηυηδηα (Grenni et al., 2012, Hayat et al., 2010, Bollag et al., 1994). Οζ ιζηνμμνβακζζιμί ημο εδάθμοξ ηαζ εζδζηυηενα ηα ααηηήνζα απμηεθμφκ ίζςξ ηδκ ζδιακηζηυηενδ δελαιεκή βεκεηζημφ οθζημφ (Whitman et al., 1998). Δηηυξ ηςκ παναπάκς δ δζαηήνδζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ πμζηζθυηδηαξ είκαζ ζδζαζηένςξ ζδιακηζηή ηαεχξ δζαθμνεηζηά είδδ ιζηνμμνβακζζιχκ ζοιιεηέπμοκ ζε δζαθμνεηζηέξ θεζημονβίεξ ημο μζημζοζηήιαημξ, αθθδθεπζδνμφκ ιε δζαθμνεηζηά είδδ θοηχκ ηαζ πανέπμοκ δζαθμνεηζηά βζα ηδκ ακαπηολή ημοξ πενζμνζζηζηά ενεπηζηά ζημζπεία (van der Heijden et al., 2008). Απυ υθα υζα ακαθένεδηακ παναπάκς, βίκεηαζ ακηζθδπηυ υηζ ζοβηεηνζιέκεξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ ζπεηίγμκηαζ ιε ζημπεοιέκεξ θεζημονβίεξ ηαζ ελοπδνεημφκ ζδζαίηενμοξ νυθμοξ. Ακάιεζα ημοξ δζαηνίκμκηαζ μζ ιζηνμμνβακζζιμί πμο ζοιιεηέπμοκ ζημοξ αζμβεςπδιζημφξ ηφηθμοξ ημο άκεναηα, ημο αγχημο ηαζ ημο θςζθυνμο. Χξ ηέημζμζ ιζηνμμνβακζζιμί έπμοκ ακαβκςνζζηεί μζ ααζζδζμιφηδηεξ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδ δζάζπαζδ ηδξ μνβακζηήξ μοζίαξ ημο εδάθμοξ (ηφηθμξ άκεναηα) (Casieri et al., 2010, Hassett et al., 2009) ηαζ μζ ιζηνμμνβακζζιμί πμο ηαηαθφμοκ ηδκ μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ (κζηνςδμπμζδηζηά ανπαία ηαζ ααηηήνζα ηαζ κζηνζημπμζδηζηά ααηηήνζα) (ηφηθμξ αγχημο) (You et al., 2009, Francis et al., 2007). Σέθμξ, λεπςνζζηή ζδιαζία βζα ημ ηφηθμ ημο Ρ ηαζ άθθςκ ιζηνμζημζπείςκ θαίκεηαζ κα έπμοκ μζ δεκδνυιμνθμζ ιοημννζγζημί ιφηδηεξ πμο ζπδιαηίγμοκ ζοιαζςηζηέξ ζπέζεζξ ιε ημ 80% ηςκ θοηχκ (Wang and Qui, 2006) πκκεηνρή ησλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο ζηνπο βηνγεσρεκηθνύο θύθινπο ηνπ άλζξαθα, ηνπ αδώηνπ θαη ηνπ θσζθόξνπ Κύθινο ηνπ άλζξαθα. Ζ ηίκδζδ ημο άκεναηα ιεηαλφ ηδξ αηιυζθαζναξ ηαζ ηδξ αζυζθαζναξ μκμιάγεηαζ ηφηθμξ ημο άκεναηα. Ο άκεναηαξ δεζιεφεηαζ απυ ηδκ αηιυζθαζνα ιε ηδ ιμνθή ημο δζμλεζδίμο ημο άκεναηα (CO 2 ) ιέζς ηδξ θςημζφκεεζδξ ηαζ απμεδηεφεηαζ ζοζζςνεφεηαζ ζηδκ μνβακζηή μοζία ημο εδάθμοξ. ηδ ζοκέπεζα, μζ οπεφεοκμζ βζα ηδκ απμδυιδζδ ιζηνμμνβακζζιμί δζαζπμφκ ηδκ μνβακζηή φθδ ηαζ απεθεοεενχκμοκ ζηδκ αηιυζθαζνα ιέζς ηδξ ακαπκμήξ ημοξ ημ παναβυιεκμ CO 2 (Falkowski et al., 2000). O άκεναηαξ είκαζ ημ ζδιακηζηυηενμ ζημζπείμ βζα ηδκ ενέρδ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ υπςξ ηαζ ηςκ οπυθμζπςκ μνβακζζιχκ, αθμφ απμηεθεί 41

42 ημ ααζζηυηενμ δμιζηυ ζοζηαηζηυ υθςκ ηςκ μνβακζηχκ μοζζχκ (ηςκ πνςηεσκχκ, ηςκ ηςκ οδαηακενάηςκ, ηςκ θζπζδίςκ ηαζ ηάεε άθθμο αζμιμνίμο). Γζαθμνεηζηέξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ πνδζζιμπμζμφκ δζαθμνεηζηέξ πδβέξ άκεναηα, έηζζ βζα πανάδεζβια, ηα ιεεακυηνμθα ααηηήνζα πνδζζιμπμζμφκ ςξ πδβή C ημ ιεεάκζμ, ηα ιεεοθυηνμθα ααηηήνζα ηδκ ιεεακυθδ ή ηδκ ιεεοθαιίκδ, εκχ ηα αηηζκμααηηήνζα ιεηαλφ άθθςκ πνδζζιμπμζμφκ ημκ άκεναηα ημο αιφθμο ηαζ ηδξ βθοηυγδξ. Σέθμξ μζ ιφηδηεξ πνδζζιμπμζμφκ ςξ πδβή άκεναηα ημοξ πμθοζαηπανίηεξ ηαζ άθθα θοηζηήξ πνμέθεοζδξ πμθοιενή υπςξ ηοηηανίκδ, διζηοηηανίκδ, θζβκίκδ ηαζ πδηηίκδ (Hassett et al., 2009, Baldrian et al., 2008). Εικόνα 1.2. Κφκλοσ του άνκρακα (In: seaviewer-drop-camera). Κύθινο ηνπ αδώηνπ. Σμ άγςημ (Ν 2 ) είκαζ έκα απυ ηα ζδιακηζηυηενα πδιζηά ζημζπεία. Απμηεθεί ηφνζμ δμιζηυ ζοζηαηζηυ ζδζαίηενα ζδιακηζηχκ μνβακζηχκ εκχζεςκ υπςξ πνςηεΐκεξ, πθςνμθφθθδ, κμοηθεζηά μλέα (DNA, RNA) η.α. (Hayat et al., 2010). Καηαθαιαάκεζ ημ 78% ημο ζοκμθζημφ υβημο ηδξ αηιυζθαζναξ υπμο απακηάηαζ ιε ηδ ιμνθή ιμνζαημφ αγχημο (Ν 2 ) (Francis et al., 2007). Σα δφμ άημια 42

43 ζημ ιυνζμ ημο αγχημο ζοκδέμκηαζ ιεηαλφ ημοξ ιε ζζπονυ ηνζπθυ δεζιυ βεβμκυξ πμο ηαεζζηά ημ Ν 2 ελαζνεηζηά αδνακέξ (Falkowski et al., 2008). οκεπχξ, βζα κα ιπμνέζμοκ μζ μνβακζζιμί κα πνδζζιμπμζήζμοκ ημ αηιμζθαζνζηυ Ν 2 ςξ πδβή αγχημο ζηζξ αζμζοκεεηζηέξ ακηζδνάζεζξ αοηυ εα πνέπεζ πνχηα κα ιεηαηναπεί ζε ηάπμζα αζμθμβζηχξ αλζμπμίδζζιδ ιμνθή. Ζ δζαδζηαζία ηδξ ακαβςβήξ ημο αηιμζθαζνζημφ Ν 2 ζε αιιςκζαηά ζυκηα (ΝΖ + 4 ) μκμιάγεηαζ αγςημδέζιεοζδ ηαζ ηαηαθφεηαζ απυ ημ εκγοιζηυ ζφιπθμημ ηδξ κζηνμβεκάζδξ (Falkowski et al., 2008). Ζ κζηνμβεκάζδ απακηάηαζ απμηθεζζηζηά ζε ιζα μιάδα πνμηανοςηζηχκ μνβακζζιχκ βκςζηχκ ςξ αγςημδεζιεοηζηά ααηηήνζα. Δθεφεενα γχκηα αγςημδεζιεοηζηά ααηηήνζα ακήημοκ ζε δζάθμνα ααηηδνζαηά βέκδ υπςξ Clostridia, Azotobacter ηαζ Azospirillum sp. (Miransari, 2011, Hayat et al., 2010). Μζα μιάδα αγςημδεζιεοηζηχκ ααηηδνίςκ πμο ακήημοκ ζε δζάθμνα ααηηδνζαηά βέκδ υπςξ Rhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Allorhizobum, ηαζ Sinorhizobium (Hayat et al., 2010) ζπδιαηίγμοκ ζοιαζςηζηέξ ζπέζεζξ ιε θοηά λεκζζηέξ υπςξ είκαζ ηα ροπακεή. Αοηά απμζηίγμοκ ηζξ νίγεξ ροπακεχκ θοηχκ ζπδιαηίγμκηαξ θοιάηζα υπμο ηαζ πναβιαημπμζείηαζ δ αγςημδέζιεοζδ ημο ιμνζαημφ αγχημο ηαζ δ ιεηαηνμπή ημο ζε αιιςκζαηή ιμνθή πμο είκαζ αθμιμζχζζιδ απυ ηα θοηά. Απυ ηδκ άθθδ, ηα θοηά πανέπμοκ οδαηάκεναηεξ ακηαπμδίδμκηαξ ηδκ πνμζθμνά Ν απυ ηα αγςημδεζιεοηζηά ζοιαζςηζηά ααηηήνζα. Σμ άγςημ ιε ηδκ ιμνθή ημο αιιςκζαημφ ζυκημξ αθμιμζχκεηαζ ζηδκ μνβακζηή φθδ ημο εδάθμοξ ηαζ ηαηυπζκ δζαζπάηαζ ιζηνμαζαηά ζε αιιςκζάηα ζυκηα (ΝΖ + 4 ) δζαιέζμο ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ αιιςκζμπμίδζδξ ή ακμνβακμπμίδζδξ απυ δζάθμνμοξ ζαπνμθοηζημφξ μνβακζζιμφξ. ηδκ δζενβαζία αοηή ζοιιεηέπμοκ ιζηνμμνβακζζιμί πμο πανάβμοκ έκγοια υπςξ πεπηζδάζεξ (Emmerling e tal., 2002), μονεάζεξ ηαζ πζηζκάζεξ. ε αενυαζεξ ζοκεήηεξ, ηα ΝΖ + 4 ιεηαηνέπμκηαζ ζε κζηνζηά ζυκηα (ΝΟ - 3 ), ιε ηδ δζαδζηαζία ηδξ κζηνμπμίδζδξ πμο πναβιαημπμζείηαζ ζε δφμ ζηάδζα. Σμ πνχημ ζηάδζμ πενζθαιαάκεζ ηδκ μλείδςζδ ηδξ ΝΖ 3 ζε κζηνχδδ ζυκηα (ΝΟ - 2 ) ιε πανάθθδθδ απεθεοεένςζδ ζημ πενζαάθθμκ ζυκηςκ οδνμβυκμο, ιε εκδζάιεζμ πνμσυκ ηδκ - οδνμλοθαιίκδ (ΝΖ 2 ΟΖ). Καηά ημ δεφηενμ ζηάδζμ ηα ΝΟ 2 μλεζδχκμκηαζ πεναζηένς ζε ΝΟ - 3. ε αενυαζεξ ζοκεήηεξ, δ κζηνμπμίδζδ πναβιαημπμζείηαζ απυ ηνείξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ: ηα οπμπνεςηζηά αενυαζα κζηνςδμπμζδηζηά ααηηήνζα (ΑΟΒ, ammonia-oxidizing bacteria) ηαζ ηα κζηνςδμπμζδηζηά ανπαία (ΑΟΑ, ammoniaoxidizing archaea) ημο θφθμο Thaumarcheota πμο ηαηαθφμοκ ηδκ μλείδςζδ ηδξ 43

44 αιιςκίαξ ζε κζηνχδδ ζυκηα ηαζ ηα κζηνζημπμζδηζηά ααηηήνζα (NOB, nitrite-oxidizing bacteria) πμο ηαηαθφμοκ ηδκ μλείδςζδ ηςκ κζηνςδχκ ζε κζηνζηά ζυκηα (Youetal., 2009, Brochier-Armanete et al. 2008, Francis et al., 2007). ε υθεξ ηζξ παναπάκς πενζπηχζεζξ ηα ααηηήνζα πνδζζιμπμζμφκ ηα αιιςκζαηά ηαζ κζηνζηά ζυκηα ςξ πδβή εκένβεζαξ. Δηηυξ απυ ηδκ αενυαζα μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ, έπεζ πενζβναθεί ηαζ δ ακαενυαζα μλείδςζή ηδξ (Αnammox, Anaerobic AMMonium OXidation) (Jetten, 2001). Σα ααηηήνζα πμο πναβιαημπμζμφκ αοηή ηδ δζενβαζία ακήημοκ ζημ θφθμ Planctomycetes ηαζ ιεηαηνέπμοκ ηα κζηνχδδ ζυκηα ζε N 2 (You et al., 2009). Ζ κζηνμπμίδζδ ηαζ ζδζαίηενα ημ ζηάδζμ μλείδςζδξ ηδξ αιιςκίαξ, είκαζ εειεθζχδμοξ ζδιαζίαξ βζα ημ βεςπδιζηυ ηφηθμ ημο αγχημο, ιε ζδιακηζηέξ πενζααθθμκηζηέξ ηαζ μζημθμβζηέξ ζοκέπεζεξ. Λεπημιενήξ πενζβναθή ηςκ ιδπακζζιχκ πμο ηδ δζέπμοκ, ηαεχξ ηαζ πθδνμθμνίεξ ζπεηζηά ιε ηδκ θοθμβέκεζδ, ηδκ μζημθμβία, ηδ θοζζμθμβία ηαζ ηδ αζμπδιζηή δνάζδ ηςκ μνβακζζιχκ πμο ειπθέημκηαζ, δίκμκηαζ ακαθοηζηά παναηάης (Βθέπε 1.2.3). ε ζοκεήηεξ έθθεζρδξ μλοβυκμο (νοειυξ ηαηακάθςζδξ Ο 2 >>> νοειυξ πανμπήξ Ο 2 ) ηαζ πανμοζία ορδθχκ ζοβηεκηνχζεςκ κζηνζηχκ, ηα κζηνζηά ζυκηα (ΝΟ - 3 ) ιεηαηνέπμκηαζ, ιε ηδκ ζοιιεημπή ηονίςξ εηενυηνμθςκ αθθά ηαζ αοηυηνμθςκ ααηηδνίςκ ζε μλείδζα ημο αγχημο: δζμλείδζμ ημο αγχημο (ΝΟ 2 ), ιμκμλείδζμ ημο αγχημο (ΝΟ), οπμλείδζμ ημο αγχημο (N 2 O) ηαζ ηέθμξ ζε ιμνζαηυ άγςημ (N 2 ) ιε ηδ δζαδζηαζία ηδξ απμκζηνμπμίδζδξ. Οζ δζαδμπζηέξ ακαβςβέξ ηςκ ΝΟ - 3 ζε Ν 2 (ΝΟ ΝΟ 2 ΝΟ Ν 2 Ο Ν 2 ) ηαηαθφμκηαζ απυ ιζα μιάδα ηεζζάνςκ εκγφιςκ: ηδ κζηνζηή ακαβςβάζδ (NaR), ηδ κζηνχδδ ακαβςβάζδ (NiR), ηδκ ακαβςβάζδ ημο κζηνζημφ μλεζδίμο (NOR) ηαζ ηδκ ακαβςβάζδ ημο οπμλεζδίμο ημο αγχημο (Ν 2 ΟR), ακηίζημζπα (Francis et al., 2007, Emmerling et al., 2002). 44

45 Εικόνα 1.3. Κφκλοσ του αηϊτου. (1) Αηωτοδζςμευςθ, (2) αφομοίωςθ αμμωνίασ, (3) αμμωνιοποίθςθ, (4) αερόβια οξείδωςθ αμμωνίασ (νιτρωδοποίθςθ), (5) οξείδωςθ νιτρωδϊν ιόντων (νιτρικοποίθςθ), (6) αφομοίωςθ νιτρικϊν ιόντων (ΝΟ 3 - ), (7,8,9) απονιτροποίθςθ διαμζςου νιτρωδϊν ιόντων (ΝΟ 2 - ), μονοξειδίου του αηϊτου (ΝΟ) και υποξειδίου του αηϊτου (Ν 2 Ο), (10) αναερόβια οξείδωςθ αμμωνίασ. Ο θύθινο ηνπ θσζθόξνπ. Ο θχζθμνμξ εεςνείηαζ απαναίηδημ ζημζπείμ, ηαεχξ απμηεθεί δμιζηυ ζοζηαηζηυ ηδξ ΑΣΡ, ηςκ θςζθμπνςηεσκχκ, ηςκ θςζθμθζπζδίςκ ηαζ ηςκ κμοηθεσηχκ μλέςκ. Ο θχζθμνμξ ανίζηεηαζ ζηδ θφζδ ιε ηδ ιμνθή θςζθμνζηχκ ζυκηςκ ηαζ μνβακζηχκ θςζθμνζηχκ ή ακυνβακςκ δοζδζάθοηςκ αθάηςκ. Οζ ιζηνμμνβακζζιμί ιε ηδ δζαδζηαζία ηδξ απμδυιδζδξ, απεθεοεενχκμοκ ημ ιεβαθφηενμ ιένμξ ημο θςζθυνμο, απμδίδμκηαξ ημ ζημ έδαθμξ ιε ηδκ ιμνθή θςζθμνζηχκ ζυκηςκ (ΖΡΟ 4-2, Ζ 2 ΡΟ 4-1, ΡΟ 4 3- ), ηα μπμία ιπμνμφκ κα παναθδθεμφκ ιε εοημθία απυ ημοξ ακχηενμοξ μνβακζζιμφξ (θοηά ηαζ γχα). Βαηηήνζα ηςκ βεκχκ Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium, Micrococcus, Aerobacter, Flavobacterium ηαζ Erwinia είκαζ ζηακά κα δζαθοημπμζμφκ ηα αδζάθοηα θςζθμνζηά ακυνβακα άθαηα ηονίςξ πανάβμκηαξ μνβακζηά μλέα υπςξ ημ βθμοημκζηυ μλφ ηαζ ημ 2-ηεημβθμοημκζηυ μλφ ηαζ απεθεοεενχκμκηαξ ζημ πενζαάθθμκ ημκ Ρ. Ζ απμδυιδζδ ηςκ μνβακζηχκ ιμνθχκ θςζθυνμο βίκεηαζ ζοκήεςξ ιε ηδκ δνάζδ εκγφιςκ υπςξ μζ θςζθαηάζεξ, πμο πανάβμκηαζ απυ ααηηήνζα ηςκ βεκχκ Rhizobium, Enterobacter, Serattia, Citrobacter, Proteus ηαζ Klebsibiella, αθθά ηαζ απυ ημοξ 45

46 δεκδνυιμνθμοξ ιοημννζγζημφξ ιφηδηεξ (Miransari, 2011, Hayat et al., 2010, Gyaneshwar et al.,2002). Εικόνα 1.4. Κφκλοσ φωςφόρου (In: Μύθεηεο ηνπ εδάθνπο Βαζηδηνκύθεηεο.Οζ ζαπνμθοηζημί ααζζδζμιφηδηεξ ζοιιεηέπμοκ ζηδκ απμζφκεεζδ κεηνήξ θοηζηήξ φθδξ πμχδμοξ ηαζ λοθχδμοξ πνμέθεοζδξ, ζηδ πμοιμπμίδζδ ηαζ ηδκ ακμνβακμπμίδζδ ηδξ μνβακζηήξ φθδξ ημο εδάθμοξ ηαζ ζοιαάθθμοκ ζδιακηζηά ζηδκ μθμηθήνςζδ ημο ηφηθμο ημο άκεναηα, επδνεάγμκηαξ ηδκ ζφζηαζδ ηαζ δμιή ημο εδάθμοξ (Casieri et al., 2010, Hassett et al., 2009, Baldrian, 2008). Οζ ααζζδζμιφηδηεξ μθείθμοκ ηζξ παναπάκς ζδζυηδηεξ ημοξ, ζηδκ ζηακυηδηα ημοξ κα πανάβμοκ έκα ιεβάθμ θάζια ελςηοηηανζηχκ εκγφιςκ βζα ηδ δζάζπαζδ ζφκεεηςκ πμθοιενχκ θοηζηήξ πνμέθεοζδξ υπςξ δ θζβκίκδ, δ ηοηηανίκδ, μζ διζηοηηανίκεξ, δ πζηίκδ, ημ άιοθμ, δζαθμνέξ πνςηεΐκεξ ηαζ πμθοθαζκμθζηέξ εκχζεζξ (Casieri et al., 2010, Baldrian, 2008). Υαναηηδνζζηζηά, βζα ηδ δζάζπαζδ ηςκ πμθοζαηπανζηχκ ηςκ ηοηηανζηχκ ημζπςιάηςκ δζαθυνςκ μνβακζζιχκ μζ ααζζδζμιφηδηεξ πανάβμοκ οδνμθοηζηά έκγοια υπςξ μζ θοάζεξ ηαζ μζ μλεζδάζεξ. Γζα ηδ δζάζπαζδ ηδξ θζβκίκδξ πνδζζιμπμζμφκ ιζα μιάδα εκγφιςκ πμο απμηεθείηαζ ηονίςξ απυ μλεζδάζεξ ιε ηφνζμ 46

47 εηπνυζςπμ ηδ θαηηάζδ, δζάθμνεξ οπενμλεζδάζεξ (οπενμλεζδάζδ ημο ιαββακίμο ηαζ οπενμλεζδάζδ ηδξ θζβκίκδξ) ηαζ αμδεδηζηά έκγοια πμο πανέπμοκ νίγεξ οδνμλοθίμο (Casieri et al., 2010, Hassett et al., 2009, Baldrian, 2008). Εικόνα 1.5. Oι κφριεσ υποδιαιρζςεισ του Βαςιλείου των Μυκιτων (από Bruns, 2006). Γελδξόκνξθνη Μπθνξξηδηθνί Μύθεηεο (ΓΜΜ) (Arbuscular Mycorrhizal Fungi: AMF). Οζ δεκδνυιμνθμζ ιοημννζγζημί ιφηδηεξ (ΓΜΜ) ακήημοκ ζηδκ ηθάζδ Glomeromycetes (θφθμ Glomeromycota) ηαζ παναηηδνίγμκηαζ ςξ οπμπνεςηζηά ζοιαζςηζημί ιζηνμμνβακζζιμί. Αοημί ακαπηφζζμοκ ζοιαζςηζηέξ ζπέζεζξ ιε ημ 80% πενίπμο ηςκ βκςζηχκ ζήιενα εζδχκ θοηχκ (Wang and Qui, 2006). Ζ δζαδζηαζία ημο απμζηζζιμφ ηςκ νζγχκ ηςκ θοηχκ απυ ιοημννζγζημφξ ιφηδηεξ ααζίγεηαζ ζε ιμνζαημφξ ιδπακζζιμφξ ακαβκχνζζδξ ιεηαλφ ημο γεφβμοξ ιφηδηαξθοηυ. Σα θοηά λεκζζηέξ εηηνίκμοκ μοζίεξ υπςξ μζ ζηνζβημθαηηυκεξ πμο δνμοκ ςξ θοημνιυκεξ ηαζ δζεβείνμοκ ηδ ιεηααμθζηή δναζηδνζυηδηα ηςκ ιοηήηςκ ηαζ πνμηαθμφκ ηδ αθάζηδζδ οθχκ απυ ηα ζπυνζα ημοξ ζημ έδαθμξ χζηε κα παναπεεί ηεθζηά έκα θεπηυ ηαζ εονέςξ δζαηθαδζζιέκμ ιοηδθζαηυ δίηηομ οθχκ ελςηενζηά ηδξ νίγαξ. Οζ οθέξ ηςκ ιοηήηςκ ιε ηδ ζεζνά ημοξ εηηνίκμοκ μοζίεξ πμο δζαπέμκηαζ ηαζ ζδιαημδμημφκ ιδπακζζιμφξ ηςκ θοηχκ υπςξ δ έηθναζδ βμκζδίςκ πμο επάβμοκ ηδ ζοιαίςζδ. Αημθμοεεί μ ζπδιαηζζιυξ απνεζζμνίςκ ηαζ άθθςκ ιδπακζζιχκ δζείζδοζδξ, πνμηεζιέκμο μ ιφηδηαξ κα εζζέθεεζ ζηδ νίγα δζα ιέζμο ηδξ επζδενιίδαξ. Μέζα ζηζξ νίγεξ, μζ οθέξ ηςκ ιοηήηςκ αολάκμκηαζ δζαηοηηανζηά ιέπνζ κα θηάζμοκ 47

48 ζημκ εζςηενζηυ θθμζυ υπμο δζαηνοπμφκ ηα ηοηηανζηά ημζπχιαηα ηαζ ζπδιαηίγμοκ παναηηδνζζηζηέξ δμιέξ εκδμηοηηανζηχκ οθχκ (Feddermann et al., 2010). Γφμ δζαθμνεηζημί ηφπμζ ΓΜΜ δζαηνίκμκηαζ ιε αάζδ ηδ ιμνθμθμβία ηςκ εκδμηοηηανζηχκ ιοηδθζαηχκ οθχκ: (i) μ ηφπμξ Paris, υπμο δ ακάπηολδ ηςκ οθχκ βίκεηαζ απμηθεζζηζηά εκδμηοηηανζηά, ζπδιαηίγμκηαξ έθζημεζδείξ/ζπεζνμεζδείξ ζπδιαηζζιμφξ ζηα ηφηηανα ημο θθμζμφ ημο θοημφ λεκζζηή ηαζ (ii) μ ηφπμξ Arum υπμο δ εκδμηοηηανζηή ακάπηολδ ηςκ οθχκ βίκεηαζ ηονίςξ δζαηοηηανζηά δδιζμονβχκηαξ δεκδνυιμνθμοξ ζπδιαηζζιμφξ ζηα ηφηηανα ημο θθμζμφ ημο θοημφλεκζζηή (Willis et al., 2012, Dickson, 2004). Πνμηεζιέκμο κα μθμηθδνχζεζ ημκ ηφηθμ γςήξ ημο, μ ιφηδηαξ ελένπεηαζ απυ ηδ νίγα ηαζ αημθμοεεί εηηεηαιέκδ ακάπηολδ ιοηδθζαηχκ οθχκ ηαζ ηεθζηά ζπμνμπμίδζδ ζημ έδαθμξ (Feddermann et al., 2010). Εικόνα 1.6. Διαδικαςία του αποικιςμοφ των ριηϊν των φυτϊν από μυκορριηικοφσ μφκθτεσ (από Bonfante and Genre, 2010). 48

49 Εικόνα 1.7. χθματικι απεικόνιςθ των ενδοριηικϊν ςχθματιςμϊν των δενδρόμορφων μυκορριηικϊν μυκιτων: (a) απρεςςόρια, (ar) δενδρόμορφοι ςχθματιςμοι τφπου Arum, (ar-c) ελικοειδείσ δενδρόμορφοσ ςχθματιςμόσ, (c) ελικοειδισ ςχθματιςμόσ τφπου Paris, (s) ενδοριηικό ςπόριο, (v) κφςτθ (από Willis et al., 2012). Σμ εηηεηαιέκμ δίηηομ οθχκ ηςκ ΓΜΜ πμο πενζβνάθδηε ακαθοηζηά παναπάκς, αμδεάεζ ζδιακηζηά ηα θοηά ζηδκ πνυζθδρδ ακυνβακςκ ενεπηζηχκ ζημζπείςκ ηαζ κενμφ απυ ημ έδαθμξ. Όθα ηα είδδ ΓΜΜ ζοκεζζθένμοκ ακυνβακμ θςζθυνμ (Ρ) ζημοξ λεκζζηέξ ημοξ οδνμθφμκηαξ ημκ μνβακζηυ Ρ ημο εδάθμοξ ιε ηδ δνάζδ ηςκ θςζθαηαζχκ (Koide and Kabir, 2000, Joner et al., 2000, Bolan, 1991). Έιιεζα, μζ ΓΜΜ ιπμνμφκ κα εηιεηαθθεφμκηαζ ηζξ πμζυηδηεξ Ρ πμο εθεοεενχκμκηαζ ζηδ νζγυζθαζνα απυ ηδ δνάζδ άθθςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ηαζ κα ηζξ ιεηαθένμοκ ζημ θοηυ ιε ημ δίηηομ ηςκ οθχκ ημοξ (Karandashov and Bucher, 2005). Πνυζθαηα ανέεδηε υηζ εηηυξ απυ ημκ Ρ, μζ ΓΜΜ πνμζθαιαάκμοκ ηαζ άγςημ (Ν) απυ ηδκ μνβακζηή φθδ ηαζ ηα θοηζηά οπμθείιιαηα ημο εδάθμοξ (Nucio et al., 2013). Σμ δίηηομ ηςκ οθχκ ημο ιφηδηα ιεηαηνέπεζ ημ ακυνβακμ Ν ζε αιζκμλέα ηαζ ημ ιεηαθένεζ ηονίςξ ιε ηδ ιμνθή ανβζκίκδξ, απυ ηζξ ελςηενζηέξ νζγζηέξ οθέξ ζηζξ εζςηενζηέξ (Govindarajulu et al., 2005). Δηηυξ ηςκ Ρ ηαζ Ν, δ ιοημννζγζηή ζοιαίςζδ ζοκεζζθένεζ ζηα θοηά-λεκζζηέξ ηαζ ζεζνά απαναίηδηςκ ιζηνμζημζπείςκ. Οζ Suzuki et al., (2001), ηαηάθενακ κα ακζπκεφζμοκ ηδκ πνυζθδρδ ηαζ ιεηαθμνά ζε θοηά-λεκζζηέξ καηνίμο (Na), ρεοδανβφνμο (Zn), ζεθήκζμο (Se), νμοαίδζμο (Rb) ηαζ ζηνυκηζμο (Sr). Ζ ζοιαίςζδ ηςκ θοηχκ ιε ΓΜΜ έπεζ επίζδξ ανεεεί υηζ αεθηζχκεζ ηδκ οδαηζηή ημοξ ζζμννμπία ηαζ ζδζαίηενα ζε πενζυδμοξ οπενεπάνηεζαξ κενμφ ή λδναζίαξ (Auge, 2001). 49

50 ε ακηάθθαβια ημ θοηυ πνμιδεεφεζ ημκ ζοιαζςηζηυ ιφηδηα ιε ηα μνβακζηά πνμσυκηα ηδξ θςημζφκεεζδξ (μνβακζηυξ άκεναηαξ ιε ηδ ιμνθή ζαηπάνςκ) πμο πζζηεφεηαζ υηζ ιεηαθένμκηαζ ζημ νζγζηυ ζφζηδια ιε παεδηζηή δζάποζδ. Οζ εκδμηοηηανζηέξ οθέξ ηαζ/ή μζ δεκδνυιμνθμζ ζπδιαηζζιμί πνμζθαιαάκμοκ ελυγεξ, ζδιακηζηυ ιένμξ ηςκ μπμίςκ πνδζζιμπμζμφκ βζα ηδ ζφκεεζδ ηςκ θζπζδίςκ, ηδξ ηνεπαθυγδξ ηαζ ημο βθοημβυκμο. Όηζ πενζζζεφεζ ιεηαθένεηαζ δζα ιέζμο ηςκ οθχκ ημο ιφηδηα ζημ έδαθμξ ηαζ αθμιμζχκεηαζ ζηδκ μνβακζηή φθδ ημο εδάθμοξ (Bago et al., 2003, Jefries et al., 2003, Bago et al., 2000). Γεοηενεουκηςξ, μζ ΓΜΜ ζοιιεηέπμοκ ζηδ δδιζμονβία ζηαεενχκ ζοζζςιαηςιάηςκ ζημ έδαθμξ ιε ηδκ παναβςβή ιζαξ οδνυθμαδξ βθοημπνςηεΐκδξ, ηδξ βθμιαθίκδξ (glomalin) πμο έπεζ οθή αθεκκχδμοξ ηυθθαξ ηαζ δνα ςξ ζοκδεηζηυξ πανάβμκηαξ, εκχκμκηαξ ηα ζςιαηίδζα ημο εδάθμοξ ηαζ ζπδιαηίγμκηαξ ζηαεενά ιαηνυ-ζοζζςιαηχιαηα (macro-aggregates). Ζ βθμιαθίκδ, απμηίεεηαζ ζηα ελςηενζηά νζγζηά ιοηήθζα ηαζ ζηα βεζημκζηά ζςιαηίδζα ημο εδάθμοξ ηαζ ιπμνεί κα δζεβείνεζ ηδκ ακάπηολδ ααηηδνίςκ πμο ιε ηδ ζεζνά ημοξ ζοιαάθθμοκ ζηδ δζάζπαζδ ηδξ μνβακζηήξ μοζίαξ ημο εδάθμοξ. διακηζηυ πανάβμκηα πνυζδεζδξ ηςκ ζςιαηζδίςκ ημο εδάθμοξ απμηεθεί επίζδξ ημ εηηεηαιέκμ δίηηομ οθχκ ηςκ ΓΜΜ πμο ζπδιαηίγεηαζ ελςηενζηά ηδξ νίγαξ. Οζ παναπάκς δζαδζηαζίεξ αζημφκ ζδιακηζηή επζννμή ζηδ δμιή, ηδ βμκζιυηδηα ηαζ ηδκ οδαημπςνδηζηυηδηα ηςκ εδαθχκ (Willis et al., 2012, Borie et al., 2008, Singh, 2012, Purin and Rillig, 2007, Wright and Upadhyaya 1998). Ονζζιέκμζ ΓΜΜ, ανέεδηακ κα ζοιιεηέπμοκ ζε δζαδζηαζίεξ απμημλζημπμίδζδξ ηαζ αζμαπμηαηάζηαζδξ εδαθχκ επζαανοιέκςκ ιε αανέα ιέηαθθα είηε ειπμδίγμκηαξ ηδκ πνυζθδρδ ηςκ μοζζχκ αοηχκ απυ εοαίζεδηα θοηά ή εκζζπφμκηαξ ηδκ πνυζθδρδ ημοξ απυ ηα ακεεηηζηά θοηά (Willis et al., 2012, Turnau et al., 2006). πεηζηά πνυζθαηεξ ιεθέηεξ ηαηέδεζλακ ηαζ ηδκ ζοιιεημπή ηςκ ΓΜΜ ζηδκ αολδιέκδ απμιάηνοκζδ (Wang et al. 2010) ηαζ πνυζθδρδ απυ ηα θοηά (Huang et al. 2007) μνβακζηχκ νφπςκ υπςξ βεςνβζηά θάνιαηα απυ ημ νζγζηυ ζφζηδια θοηχκ. Ζ ζοιαίςζδ ιε ΓΜΜ ιπμνεί επίζδξ κα πανέπεζ ζηα θοηά πνμζηαζία έκακηζ πνμζαμθχκ απυ εδαθμβεκείξ θοημπαεμβυκμοξ ιφηδηεξ πμο ακήημοκ ζε δζάθμνα βέκδ υπςξ Aphanomyces, Cylindrocladium, Fusarium, Macrophomina, Phytopthora, Pythium, Rhizoctonia, Sclerotinium, Verticillium, Thielaviopsis, ηαεχξ ηαζ απυ πνμζαμθέξ απυ θοημπαεμβυκμοξ κδιαηχδεζξ ηςκ βεκχκ Heterodera, Meloidogyne, Pratylenchus, Radopholus. Χξ πζεακμί ιδπακζζιμί αοηήξ ηδξ πνμζηαζίαξ πνμηείκμκηαζ δ ηαθή ενεπηζηή ηαηάζηαζδ ηςκ θοηχκ πμο εκζζπφεζ ηδκ 50

51 πνμζανιμζηζηή ημοξ ζηακυηδηα (fitness), δ αθθαβή ηδξ ιμνθμθμβίαξ ημο νζγζημφ ζοζηήιαημξ δμιζηά, πςνζηά, πμζμηζηά ηαζ πνμκζηά, μ ακηαβςκζζιυξ βζα ηδκ ηαηάθδρδ πχνμο βζα απμζηζζιυ ηαζ δνάζδ, μ ακηαβςκζζιυξ βζα ηα πνμσυκηα ηδξ θςημζφκεεζδξ πμο πανάβεζ ημ θοηυ ηαζ δ εκενβμπμίδζδ ιδπακζζιχκ άιοκαξ ημο θοημφ υπςξ δ έηθναζδ βμκζδίςκ πμο ηςδζημπμζμφκ πνςηεΐκεξ ιε απμηέθεζια ηδκ ηεθζηή παναβςβή μοζζχκ ιε αιοκηζηυ νυθμ υπςξ μζ θοημαθελίκεξ (Bharadwaj and Sharma, 2006, Harrier and Watson, 2004). Σέθμξ, δεκ είκαζ θίβεξ μζ πενζπηχζεζξ υπμο παναηδνήεδηακ αθθδθεπζδνάζεζξ ηςκ ΓΜΜ ιε άθθμοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ, υπςξ νζγμααηηήνζα, αγςημδεζιεοηζηά ααηηήνζα, ααηηήνζα πμο δζαθοημπμζμφκ ημκ Ρ, ιφηδηεξ ημο εδάθμοξ αηυια ηαζ άθθμοξ ιοημννζγζημφξ ιφηδηεξ. Οζ αθθδθεπζδνάζεζξ αοηέξ ιπμνεί κα είκαζ ζοκενβζζηζηέξ, ακηαβςκζζηζηέξ ή μοδέηενεξ (Nucio et al., 2013, Jansa and Gryndler, 2010, Jefries et al., 2003). Δλαζηίαξ ηδξ εοκμσηήξ επίδναζδξ πμο αζημφκ μζ ΓΜΜ ζηδκ αφλδζδ ηαζ ακάπηολδ, ηδκ θοζζμθμβία ηαζ ηδκ πνμζανιμζηζηή ζηακυηδηα ηςκ θοηχκ εεςνείηαζ υηζ δ ζοιαίςζδ ηςκ θοηχκ ιε ΓΜΜ ιπμνεί κα μδδβήζεζ ζε ιείςζδ ηςκ πμζμηήηςκ ηςκ ζοκεεηζηχκ θζπαζιάηςκ ηαζ β.θ. πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδ βεςνβία ηαζ ζοκεπχξ κα μδδβήζμοκ ζε ακηίζημζπδ ιείςζδ ηςκ ανκδηζηχκ ζοκεπεζχκ πμο είκαζ πζεακυ κα πνμηθδεμφκ ζημ πενζαάθθμκ ηαζ ζηδκ οβεία ηςκ ηαηακαθςηχκ απυ ηδκ αολδιέκδ πνήζδ λεκμαζμηζηχκ μοζζχκ (Lekberg and Koide, 2005, Bedini et al., 2013, Zhang et al., 2003) Νηηξνπνίεζε θαη κηθξννξγαληζκνί Ζ κζηνμπμίδζδ απμηεθεί ηδκ ζδιακηζηυηενδ δζενβαζία βζα ηδκ μθμηθήνςζδ ημο βεςπδιζημφ ηφηθμο ημο Ν, επζηοβπάκεηαζ ιε ηδ ιεζμθάαδζδ ιζηνμμνβακζζιχκ ηαζ έπεζ ζδζαίηενδ μζημκμιζηή ζδιαζία βζα ηδ βεςνβία ηαζ ηδ ιεηαπείνζζδ ηςκ αβνμηζηχκ ηαζ αζμιδπακζηχκ απμαθήηςκ. Mε ηδ κζηνμπμίδζδ, δζαζθαθίγεηαζ δ ιεηαηνμπή ηδξ αιιςκίαξ, ζηδκ μλεζδςιέκδ ηαζ πενζζζυηενμ εοπνυζθδπηδ ιμνθή ηςκ κζηνζηχκ ζυκηςκ ηαζ ηαοηυπνμκα πανέπεηαζ ημ οπυζηνςια βζα ηδκ απμκζηνμπμίδζδ δζαιέζμο ηδξ μπμίαξ ημ άγςημ εα επζζηνέρεζ πίζς ζηδκ αηιυζθαζνα. Σα κζηνζηά ζυκηα είκαζ δ ακυνβακδ ιμνθή αγχημο πμο πνμηζιμφκ ηα θοηά ηαζ μζ αενυαζμζ ιζηνμμνβακζζιμί. Έηζζ, ζηα ηαθθζενβμφιεκα εδάθδ δ μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ πνμξ κζηνζηά ζυκηα αολάκεζ ηδ δζαεεζζιυηδηα ημο αγχημο βζα ηα θοηά (Schleper and Nicol, 2010, Tourna et al., 2008). Ζ μλείδςζδ ηδξ 51

52 αιιςκίαξ είκαζ επίζδξ ηαεμνζζηζηή βζα ηδκ απμιάηνοκζδ ημο αγχημο ηαηά ηδ δζαδζηαζία ηδξ επελενβαζίαξ οβνχκ απμαθήηςκ πμο πενζέπμοκ ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ αιιςκζαηχκ ζυκηςκ (Junier et al., 2010). Ακ ηαζ θοζζηή δζαδζηαζία, δ κζηνμπμίδζδ ιπμνεί κα έπεζ ηαζ ανκδηζηέξ ζοκέπεζεξ βζα ημ πενζαάθθμκ. Έκα απυ ηα ηονζυηενα πνμαθήιαηα πμο ακαθένμκηαζ είκαζ δ επζαάνοκζδ ηςκ οδαημζοθθμβχκ βθοημφ κενμφ (θίικεξ, πμηάιζα) ηαζ ηςκ οπυβεζςκ οδάηςκ ιε κζηνζηά ζυκηα δζαιέζμο ηδξ έηπθοζδξ ημοξ απυ αβνμηζηέξ πενζμπέξ. Ζ ηαηακάθςζδ κζηνζηχκ απυ ημκ άκενςπμ ηαζ ηα γχα ιπμνεί κα απμαεί επζηίκδοκδ βζα ηδκ οβεία ημοξ. Ζ ζοζζχνεοζδ ορδθχκ ζοβηεκηνχζεςκ κζηνζηχκ ζε οδαημζοθθμβέξ βθοημφ κενμφ, ιε ηδκ πνμτπυεεζδ υηζ ζηδκ οδαημζοθθμβή απακημφκ επανηείξ πμζυηδηεξ δζαεέζζιςκ θςζθμνζηχκ ζυκηςκ, ζοιαάθθεζ επίζδξ ζημ θαζκυιεκμ ημο εοηνμθζζιμφ. Ζ ιζηνμαζαηή δνάζδ έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ παναβςβή ηαζ εηπμιπή αενίςκ υπςξ ηα ΝΟ ηαζ Ν 2 Ο πμο εοεφκμκηαζ ζε ιεβάθμ ααειυ βζα ηδκ ηνφπα ημο υγμκημξ ηαζ ημ θαζκυιεκμ ημο εενιμηδπίμο, ακηίζημζπα. Αηυια, δ δζαδζηαζία ηδξ μλείδςζδξ ηδξ αιιςκίαξ μδδβεί ζε βεκζηυηενδ μλφκζζδ ημο πενζαάθθμκημξ. Όπμο μζ ζοβηεκηνχζεζξ αιιςκίαξ ηαζ ημ επίπεδμ κζηνμπμίδζδξ είκαζ ορδθά βζα ιεβάθα πνμκζηά δζαζηήιαηα, παναηδνείηαζ ιείςζδ ημο πενζααθθμκηζημφ ph (Hatzenpichler, 2012, Junier et al., 2010, Nicol and Schleper, 2006, Kowalchuk and Stephen, 2001). οκεπχξ, δ ηαηακυδζδ ηςκ επζιένμοξ ιδπακζζιχκ ηδξ κζηνμπμίδζδξ αθθά ηαζ δ βκχζδ ηδξ θοθμβέκεζδξ ηαζ ηδξ θοζζμθμβίαξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδ κζηνμπμίδζδ, υπςξ επίζδξ ηδξ μζημθμβίαξ ηαζ ηδξ βεκζηυηενδξ θεζημονβίαξ ηαζ δναζηδνζυηδηαξ ημοξ ζημ μζημζφζηδια είκαζ ζδιακηζηή βζα πενζααθθμκηζημφξ ηαζ μζημκμιζημφξ θυβμοξ. Μέπνζ πνυζθαηα ςξ ηφνζμζ ιζηνμμνβακζζιμί βζα ηδκ μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ εεςνμφκηακ ηα πδιεζμθζευηνμθα ααηηήνζα πμο ακήημοκ ζημ θφθμ Proteobacteria (Ammonia Oxidizing Bacteria: ΑΟΒ), πμο ζπδιαηίγμοκ δφμ δζαηνζηέξ ιμκμθοθεηζηέξ μιάδεξ ζηα α- ηαζ β- πνςηεμααηηήνζα. Σα ζηεθέπδ ηςκ ΑΟΒ πμο έπμοκ ηαθθζενβδεεί ιέπνζ ζήιενα ακήημοκ ζηα α-πνςηεμααηηήνζα πμο πζζηεφεηαζ υηζ είκαζ μζ ηονίανπμζ ιζηνμμνβακζζιμί βζα ηδκ μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ ζηα πενζζζυηενα πενζαάθθμκηα (Purkhold et al., 2000, Nicol and Schleper, 2006). Πνυζθαηεξ ιεθέηεξ πμο ααζίγμκηαζ ζε ιεηαβμκζδζςιαηζηέξ ηεπκζηέξ ηαζ ζε ηεπκζηέξ ηαθθζένβεζαξ έδεζλακ υηζ ηα ανπαία πμο ακήημοκ ζημ πνυζθαηα πνμηαεέκ θφθμ Thaumarcheota ζοιαάθθμοκ ζδιακηζηά ζηδ κζηνμπμίδζδ (κζηνςδμπμζδηζηά ανπαία : ΑΟΑ, ammonia-oxidizing archaea) ηυζμ ζημ έδαθμξ υζμ ηαζ ζε οδάηζκα μζημζοζηήιαηα (Brochier-Armanete et al. 2008, 52

53 Hansel et al., 2008, Tourna et al., 2008, Konneke et al., 2005). Λίβμ κςνίηενα, επζαεααζχεδηε δ ακαενυαζα μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ πμο πναβιαημπμζείηαζ απυ ααηηήνζα ημο θφθμο Plancomycetes (Strou et al., 1999, van de Graaf et al., 1995). Ζ κζηνςδμπμίδζδ, πμο απμηεθεί ημ πνχημ ζηάδζμ ηδξ κζηνμπμίδζδξ, είκαζ ιζα δζαδζηαζία δφμ δζαδμπζηχκ ζηαδίςκ πμο ηαηαθφμκηαζ απυ δζαθμνεηζηά εκγοιζηά ζφιπθμηα. ημ πνχημ ζηάδζμ δ αιιςκία μλεζδχκεηαζ ζε οδνμλοθαιίκδ (ΝΖ 3 +2e - +O 2 +2H + NH 2 OH+H 2 O) ιε ηδ δνάζδ ημο εκγφιμο ιμκμ-μλοβμκάζδ ηδξ αιιςκίαξ (ΑΜΟ, AmmoniaMonoOxygenase) (Hooper et al., 1997, Hollocher et al., 1981). Ζ ακηίδναζδ αοηή εεςνείηαζ νοειυ-ηαεμνζζηζηή (rate-limiting) βζα ηδ ζοκμθζηή δζαδζηαζία ηδξ κζηνμπμίδζδξ (Kowalchuk and Stephen, 2001). ημ δεφηενμ ζηάδζμ, δ οδνμλοθαιίκδ μλεζδχκεηαζ ζε κζηνζηά ζυκηα ηαζ δ ακηίδναζδ ηαηαθφεηαζ απυ ημ έκγοιμ μλεζδμακαβςβάζδ ηδξ οδνμλοθαιίκδξ (ΖΑΟ) (NH 2 OH+H 2 O NO 2 + 4e - + 5H + ) (Sayavedra-Soto et al., 1994). Καηά ημ δεφηενμ ζηάδζμ ηδξ μλείδςζδξ ηδξ αιιςκίαξ πνμηφπημοκ ηα δθεηηνυκζα πμο απαζημφκηαζ βζα ηδκ παναβςβή εκένβεζαξ ζηα ηφηηανα (Kumar and Nicholas, 1982,Hollocher et al., 1982). Ζ ιμκμ-μλοβμκάζδ ηδξ αιιςκίαξ (AMO) απμηεθεί έκγοιμ-ηθεζδί βζα ηδ αζμπδιεία ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ πμο ειπθέημκηαζ ζηδκ μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ. Απμηεθείηαζ απυ 3 οπμιμκάδεξ amoa,amob ηαζ amoc πμο ηςδζημπμζμφκηαζ απυ ηα ακηίζημζπα βμκίδζα. Σα βμκίδζα amoa (McTavish et al., 1993), amob (Bergmann and Hooper, 1994), amoc (Klotz et al., 1997) ανίζημκηαζ ζε έκα μπενυκζμ ιε βεκζηή δμιή amocab (Chain et al., 2003, Klotz et al., 2006, Norton et al., 2002, Stein et al., 2007). Πμθθαπθά ακηίβναθα, ζπεδυκ ηαοηυζδια, ημο μπενμκίμο amocab απακηχκηαζ ζημ βμκζδίςια ηςκ ΑΟΒ πμο ακήημοκ ζηα α-proteobacteria (Chain et al., 2003, Norton et al., 2008, Stein et al., 2007) ηαζ έκα ιυκμ ακηίβναθμ ζημ βμκζδίςια ΑΟΒ πμο ακήημοκ ζηα β-proteobacteria (Klotz et al., 2006). Ακηίεεηα, δεκ έπεζ ανεεεί ιέπνζ ζηζβιήξ ΑΟΑ πμο κα θένεζ πενζζζυηενα απυ έκα ακηίβναθα ηςκ amoa ηαζ amob ηαζ δφμ ακηίβναθα του amoc ζημ βμκζδίςια ημο (Hatzenpichler, 2012). Γεδμιέκδξ ηδξ θεζημονβζηήξ ημο ζδιακηζηυηδηαξ ηαζ ηδξ ζοκηδνδιέκδξ θοθμβέκεζδξ, ημ βμκίδζμ amoa πνδζζιμπμζείηαζ ςξ ιμνζαηυξ δείηηδξ βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ πμζηζθυηδηαξ ηαζ ηδξ αθεμκίαξ ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ ζε εδαθζηά ηαζ οδάηζκα πενζαάθθμκηα (Santoro et al., 2008). Γεκ είκαζ λεηάεανμ ακ δ ΑΜΟ ηαηαθφεζ ηδκ ίδζα ακηίδναζδ ηαζ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ΑΟΑ βζαηί δεκ έπεζ ανεεεί ςξ ηχνα ηάπμζμ έκγοιμ μιυθμβμ ηδξ μλεζδμακαβςβάζδξ ηδξ οδνμλοθαιίκδξ (ΖΑΟ) βζα ηδκ μλείδςζδ ηδξ οδνμλοθαιίκδξ, 53

54 ζε ηάπμζμ απυ ηα βμκζδζχιαηα ηςκ ΑΟΑ πμο έπμοκ αθθδθμοπδεεί ή ακαθοεεί απυ ιεηαβμκζδζςιαηζηέξ ιεθέηεξ (Hatzenpichler, 2012). Δπίζδξ, έπεζ παναηδνδεεί υηζ μζ δμιέξ ηςκ amo βμκζδίςκ δζαθένμοκ ζδιακηζηά ιεηαλφ ηςκ ααηηδνίςκ ηαζ ηςκ ανπαίςκ (Nicol and Schleper, 2006). Ο ζοκδοαζιυξ ηςκ παναπάκς παναηδνήζεςκ μδδβεί ζηδκ οπυεεζδ πςξ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ΑΟΑ έκα έκγοιμ πμο δεκ έπεζ αηυια ηαοημπμζδεεί δνα ςξ οπμηαηάζηαημ ηδξ ΖΑΟ ή πςξ ημ πνμσυκ ηδξ ακηίδναζδξ μλείδςζδξ ηδξ αιιςκίαξ δεκ είκαζ δ οδμλοθαιίκδ. ε αοηή ηδκ πενίπηςζδ ςξ πζεακυ πνμσυκ πνμηείκεηαζ ημ κίηνμλο-οδνίδζμ (nitroxy hydride: ΖΝΟ). Σμ ΖΝΟ ιπμνεί - αημθμφεςξ κα μλεζδςεεί ζε ΝΟ 2 ιε ηδ ζοιιεημπή ηάπμζαξ κζηνμλοθμμλεζδμακαβςβάζδξ (Ν Υ ΟR). Ζ εκενβμπμίδζδ ημο μλοβυκμο πμο πναβιαημπμζείηαζ ζηδκ ακηίδναζδ ιε ηδ ιμκμ-μλοβμκάζδ, ιπμνεί κα πναβιαημπμζδεεί απυ ημ μλείδζμ ημο αγχημο (ΝΟ), ημ πνμσυκ ηδξ ακηίδναζδξ ηδξ κζηνχδμοξ ακαβςβάζδξ (ΝΗR), πμο εα πνμηαθέζεζ ηεθζηά ηδκ παναβςβή αένζμο Ν 2 (Hatzenpichler, 2012) Νηηξσδνπνηεηηθά βαθηήξηα (ΑΟΒ, Ammonia-Oxidizing Bacteria) Σα κζηνςδμπμζδηζηά ααηηήνζα (ΑΟΒ) απακημφκ ζηα πενζζζυηενα αενυαζα πενζαάθθμκηα υπμο οπάνπεζ δζαεέζζιδ αιιςκία ελαζηίαξ ηδξ ακμνβακμπμίδζδξ ηδξ μνβακζηήξ φθδξ ή απυ ακενςπμβεκείξ πδβέξ αγχημο, υπςξ αιιςκζαηά θζπάζιαηα ηαζ απυαθδηα. Βνίζημκηαζ ζε αθεμκία ζημ έδαθμξ, ζε οδαημζοθθμβέξ βθοημφ κενμφ ηαζ αθιονμφ κενμφ. Ακ ηαζ εεςνμφκηαζ οπμπνεςηζηά αενυαζα έπμοκ απμιμκςεεί απυ πενζαάθθμκηα ιε έθθεζρδ μλοβυκμο υπςξ ακμλζηά εδάθδ ηαζ οθάθιονμ κενυ (Kowalchuk and Stephen, 2001). Σα ΑΟΒ είκαζ πδιεζμθζευηνμθμζ ιζηνμμνβακζζιμί πμο πνδζζιμπμζμφκ ακδβιέκεξ ιμνθέξ Ν (π.π αιιςκία) ςξ πδβή εκένβεζαξ, ημ δζμλείδζμ ημο άκεναηα ςξ πδβή άκεναηα ηαζ ημ ιμνζαηυ μλοβυκμ ςξ απμδέηηδ δθεηηνμκίςκ (You et al., 2009). Υςνίγμκηαζ ζε δφμ ιμκμθοθεηζηέξ θοθμβεκεηζηέξ βναιιέξ (Head et al., 1993, Purkhold et al., 2000, 2003). ηδκ πνχηδ βναιιή ακήημοκ ηα α-πνςηεμααηηήνζα ηςκ βεκχκ Νitrosomonas ηαζ Nitrosospira, εκχ ζηδ δεφηενδ βεκεαθμβζηή βναιιή, ακήημοκ ηα β-πνςηεμααηηήνζα ημο βέκμοξ Nitrosococcus (Ward and O Mullan, 2002). Σα ΑΟΒ πμο ακήημοκ ζηα α-πνςηεμααηηήνζα έπμοκ ηαηαηαπεεί ζε επηά ζοζηάδεξ (clusters) ιε αάζδ ηζξ θοθμβεκεηζηέξ ακαθφζεζξ ημο 16S rrna βμκζδίμο ηαζ μζημθοζζμθμβζηά παναηηδνζζηζηά ημοξ (Δζηυκα 1.8) (Kowalchuk and Stephen, 2001). Σα πζμ ζοπκά απακηχιεκα ΑΟΒ ζε εδαθζηά ηαζ οδάηζκα ζοζηήιαηα ακήημοκ ζηδ ζοζηάδα 2 (είδδ ημο βέκμοξ Nitrosospira πμο απακημφκ ηονίςξ ζε υλζκμ έδαθμξ), 54

55 ζοζηάδα 3 (είδδ ημο βέκμοξ Νitrosospira ζοββεκζηά ιε ηαθθζενβήζζια ζηεθέπδ ζοιπενζθαιαακμιέκμο ημο πνχδκ βέκμοξ Nitrosolobus), ζοζηάδα 4 (είδδ ημο βέκμοξ Νitrosospira ζοββεκζηά ιε ημ ζηέθεπμξ 40ΚΗ), ζοζηάδα 6 (είδδ ημο βέκμοξ Nitrosomonas πνμζανιμζιέκα ζε παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ αιιςκίαξ υπςξ ημ είδμξ Νitrosomonas oligotropha) ηαζ ζοζηάδα 7 (είδδ ημο βέκμοξ Nitrosomonas ζοββεκζηά ιε Ν.europaea ηαζ N.eutropha, πνμζανιμζιέκα ζε ορδθυηενεξ ζοβηεκηνχζεζξ αιιςκίαξ). Εικόνα 1.8. Φυλογενετικό δζντρο βαςιςμζνο ςε 16SrRNA αλλθλουχίεσ των βακτθρίων που ςυμμετζχουν ςτον κφκλο του αηϊτου. Σα αερόβια βακτιρια που οξειδϊνουν τθν αμμωνία φαίνονται με ςκοφρο γκρι, τα βακτιρια που οξειδϊνουν τα νιτρϊδθ με μαφρο και τα αναερόβια βακτιρια με γραμμζσ (απυ Kowalchuk and Stephen, 2001). Σα βέκδ Nitrosomonas ηαζ Nitrosospira θαίκεηαζ κα ηονζανπμφκ ανζειδηζηά ζε θοζζηά μζημζοζηήιαηα υπςξ πνμηφπηεζ απυ αθθδθμοπήζεζξ ηςκ 16SrRNΑ ηαζ amoa βμκζδίςκ. Έηζζ, ηα ΑΜΟ πμο ακήημοκ ζηα α-πνςηεμααηηήνζα έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί ςξ μνβακζζιμί δείηηεξ ζε ιζηνμαζαηέξ μζημθμβζηέξ ιεθέηεξ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ επίδναζδξ δζαθυνςκ νφπςκ υπςξ αθζεοηζηά απυαθδηα, αανέα ιέηαθθα ηαζ οδνμβμκάκεναηεξ (You et al., 2009, Kowalchuk and Stephen, 2001). 55

56 Ζ δζαπείνζζδ ηςκ απμαθήηςκ είκαζ ιέπνζ ζηζβιήξ δ πζμ ζδιακηζηή αζμηεπκμθμβζηή εθανιμβή ηςκ ΑΟΒ. Ζ απμιάηνοκζδ ημο αγχημο απυ ηα απυαθδηα είκαζ ελαζνεηζηήξ πενζααθθμκηζηήξ ζδιαζίαξ ελαζηίαξ ηδξ ζοιαμθήξ ημο ζε θαζκυιεκα εοηνμθζζιμφ. Χζηυζμ, ημ ζφιπθμημ εκγφιςκ ηδξ ιμκμ-μλοβμκάζδξ ηδξ αιιςκίαξ, ελαζηίαξ ηδξ εονείαξ ηαζ ιδ ελεζδζηεοιέκδξ δνάζδξ ημο, επζηνέπεζ ηαοηυπνμκα ιε ηδκ μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ, ηδκ μλείδςζδ ηαζ αθεζθαηζηχκ, ανςιαηζηχκ ηαζ αθμβμκμιέκςκ μνβακζηχκ μοζζχκ, δίκμκηαξ ηδ δοκαηυηδηα ζηα ΑΟΒ κα πνδζζιμπμζδεμφκ ηαζ ςξ πανάβμκηεξ αζμαπμηαηάζηαζδξ. Ζ ζοιιεημπή ηςκ ΑΟΒ ακαθένεηαζ ηέθμξ ζε ζοζηήιαηα αζμθμβζηχκ δειχκ υπμο πνδζζιμπμζμφκ ηα εζζενπυιεκα οπμζηνχιαηα χζηε κα ζοκηδνείηαζ δ αζμιάγα ζε ζηαεενά επίπεδα ηαζ κα απμιαηνφκoκηαζ ηοπυκ νφπμζ (Junier et al., 2010, Kowalchuk and Stephen, 2001) Νηηξσδνπνηεηηθά Αξραία (ΑΟΑ, Ammonia-Oxidizing Archaea) Σα Ανπαία θοθμβεκεηζηά πςνίγμκηαζ ζε ηέζζενα ηφνζα θφθα: (1) ηα Euryarchaeota υπμο πενζθαιαάκμκηαζ εηενυηθδηεξ απυ άπμρδ θοζζμθμβίαξ μιάδεξ υπςξ αθυθζθα, εενιυθζθα ηαζ ιεεακζμβυκα ανπαία, (2) ηα Crenarchaeota πμο απμηεθμφκηαζ απυ ηα οπενεενιυθζθα ηαζ ηα εείμ-ελανηχιεκα ανπαία, (3) ηα Κorarchaeota πμο απακημφκ ζε οδνμεενιζηά πενζαάθθμκηα ηαζ παναηηδνίγμκηαζ απυ παιδθή ζπεηζηή αθεμκία ζηo πενζαάθθμκ ηαζ (4) ημ θφθμ Thaumarcheota πμο πνμζηέεδηε πνυζθαηα ζημ θοθμβεκεηζηυ δέκηνμ ηςκ ανπαίςκ ηαζ πενζθαιαάκεζ είδδ εονέςξ δζαδεδμιέκα ηαζ άθεμκα ζημ πενζαάθθμκ πμο ειπθέημκηαζ ζηδκ ακηίδναζδ ηδξ μλείδςζδξ ηδξ αιιςκίαξ (Auchtung et al., 2011, Schleper and Nicol, 2010, You et al., 2009, Brochier-Armanet et al. 2008, Madigan et al., 2005). 56

57 Εικόνα 1.9. Φυλογενετικό δζντρο των Αρχαίων (In: Οζ πνχηεξ εκδείλεζξ ηδξ ζοιιεημπήξ ηςκ ανπαίςκ ζηδ κζηνμπμίδζδ πνμένπμκηαζ απυ δφμ δζαθμνεηζηέξ ιεηαβμκζδζςιαηζηέξ ιεθέηεξ ζε έδαθμξ (Treusch et al., 2005) ηαζ εαθαζζζκυ κενυ (Venter et al., 2004). Οζ ιεθέηεξ αοηέξ απμηάθορακ ηδκ φπανλδ βμκζδίςκ πμο ειπθέημκηαζ πζεακχξ ζηδκ μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ, ζε ηιήιαηα βμκζδζςιάηςκ πμο πνμένπμκηακ απυ ανπαία πμο δεκ έπμοκ ςζηυζμ ηαθθζενβδεεί. Ζ φπανλδ ανπαίςκ πμο μλεζδχκμοκ ηδκ αιιςκία επζαεααζχεδηε ιε ηδκ ηαθθζένβεζα ημο Candidatus Nitrosopumilus maritimus, ζηέθεπμξ SCM1, πμο απμιμκχεδηε απυ εκοδνείμ εαθαζζζκμφ κενμφ (Konneke et al., 2005). ηδ ζοκέπεζα, δφμ αηυιδ είδδ ανπαίςκ ηα Candidatus Nitrososphaera gargensis ηαζ Candidatus Nitrosocaldus yellowstonii, απμιμκχεδηακ απυ οδαηζηά πενζαάθθμκηα ηαζ ηαθθζενβήεδηακ (dela Torre et al., 2008, Hatzenpichler et al., 2008). Απυ ηδκ απμιυκςζδ ημο Candidatus N. maritimus ηαζ ιεηά, ανπαία πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδκ μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ (Ammonia Oxidizing Archaea: ΑΟΑ) έπμοκ ανεεεί ζε εενιέξ πδβέξ, εαθάζζζα μζημζοζηήιαηα, ζε οδαημζοθθμβέξ βθοηχκ κενχκ, ζημ έδαθμξ ηαζ ζε οβνά απυαθδηα ζοζηεοαζηδνίςκ μπςνμηδπεοηζηχκ (waste water treatment plants) (You et al., 2009). Αλζςιαηζηά έπεζ μνζζηεί υηζ ηα ΑΟΑ πμο απμιμκχκμκηαζ απυ οδαηζηά ζοζηήιαηα είκαζ αοηυηνμθα, εκχ ηα ακηίζημζπα ζηα πενζαία ζοζηήιαηα ιπμνεί κα είκαζ 57

58 ιζηηυηνμθα. Σμ Nitrososphaera viennensis, ζηέθεπμξ ΔΝ76, ημ πνχημ ζηέθεπμξ ανπαίςκ πμο απμιμκχεδηε απυ ημ έδαθμξ ηαζ ηαθθζενβήεδηε ακαπηφζζεηαζ πδιεζμθζευηνμθα πνδζζιμπμζχκηαξ αιιςκία ή μονία ςξ πδβέξ εκένβεζαξ (Hernandez et al., 2011). ηα εδαθζηά μζημζοζηήιαηα ηα AOA θαίκεηαζ κα οπενηενμφκ ανζειδηζηά έκακηζ ηςκ ΑΟΒ ζηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ (Erguder et al., 2009, Chen et al., 2008, Adair and Schwartz, 2008, Leininger et al., 2006, Nicol and Schleper, 2006). ε έκα βναιιάνζμ εδάθμοξ, βζα πανάδεζβια, πενζέπμκηαζ ζοκήεςξ ηφηηανα ΑΟΒ ηαζ 10 7 ή ηαζ πενζζζυηενα ηφηηανα ΑΟΑ (Nicol and Schleper, 2006). Γεκ έπεζ απμδεζπεεί ςζηυζμ εάκ υθα ηα ΑΟΑ πμο οπάνπμοκ ζημ έδαθμξ ζοιιεηέπμοκ εκενβά ζηδκ μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ (Prosser and Nicol, 2008, Leininger et al., 2006). Ζ βεκζηυηενδ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ ζημ εδαθζηυ μζημζφζηδια, υπςξ ηαζ δ αθεμκία ημοξ ζε ιεβαθφηενα αάεδ ζημ έδαθμξ, θακενχκμοκ υηζ μζ ιζηνμμνβακζζιμί αοημί ιπμνμφκ ηαζ πνμζανιυγμκηαζ ζε έκα εονφ θάζια ζοκεδηχκ ακάπηολδξ ηαζ βζα ημ θυβμ αοηυ εεςνείηαζ υηζ έπμοκ πενζζζυηενμ εοπνμζάνιμζημ ιεηααμθζζιυ απυ ηα ΑΟΒ (Leininger et al., 2006). Ζ φπανλδ ηάπμζαξ εκαθθαηηζηήξ ιεηααμθζηήξ μδμφ βζα ηα ανπαία πνέπεζ κα θδθεεί οπυρδ. Σα ανπαία πνδζζιμπμζμφκ ζοπκά ημ ιμκμπάηζ ημο 3-φδνμλο-πνμπζμκζημφ εζηένα (3-hydroxypropionate) ή ημκ ηφηθμ ημο Krebs (ηφηθμξ ηζηνζημφ μλέμξ) βζα ηδ δέζιεοζδ ημο άκεναηα, εκχ ηα ΑΟΒ πνδζζιμπμζμφκ ημκ ηφηθμ ημο Calvin (Τμu et al., 2009, Prosser and Nicol, 2008, Ward et al, 2007). Δπζπθέμκ, οπάνπμοκ εκδείλεζξ πςξ ηα ΑΟΑ ιπμνμφκ κα ακαπηφζζμκηαζ ιζηημηνμθζηά (Τμu et al., 2009, Prosser and Nicol, 2008, Leininger et al., 2006). Γμκζδζςιαηζηή ακάθοζδ ημο Canditus symbiosum έδεζλε πςξ ημ είδμξ ηαηείπε βεκεηζηυ οθζηυ βζα κα πνδζζιμπμζεί ςξ πδβή άκεναηα ηυζμ ημ δζμλείδζμ ημο άκεναηα υζμ ηαζ ηδκ μνβακζηή φθδ (Hallam et al., 2006a,b). οκεπχξ, δ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ είκαζ πζεακυ κα ιδκ μθείθεηαζ ζε αολδιέκδ ζηακυηδηα μλείδςζδξ ηδξ αιιςκίαξ αθθά πζεακυηαηα ζηδκ ζηακυηδηα ημοξ κα αθμιμζχκμοκ μνβακζηέξ εκχζεζξ ςξ πδβέξ άκεναηα ηαζ ακυνβακεξ εκχζεζξ ςξ δυηεξ δθεηηνμκίςκ βζα ημκ εκενβεζαηυ ιεηααμθζζιυ (Prosser and Nicol, 2008, Leininger et al., 2006, Nicol and Schleper, 2006). Δπίζδξ, δζάθμνεξ ιεθέηεξ έπμοκ δείλεζ υηζ ηα ΑΟΑ οπενηενμφκ ανζειδηζηά ζε πενζαάθθμκηα ιε παιδθή πενζεηηζηυηδηα ζε αιιςκζαηά ζυκηα έκακηζ ηςκ ΑΟΒ πμο ηονζανπμφκ ζοκήεςξ ζε εδάθδ ιε ορδθή ζοβηέκηνςζδ αιιςκζαηχκ. Έηζζ έπεζ πνμηαεεί πςξ ηα ΑΟΑ ζοκεζζθένμοκ ζδιακηζηά ζηδ κζηνμπμίδζδ ηδξ αιιςκίαξ πμο 58

59 πνμένπεηαζ απυ ηδκ ακμνβακμπμίδζδ, εκχ ηα ΑΟΒ πμο εοκμμφκηαζ απυ ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ αιιςκίαξ δνμοκ ηονίςξ ζε ηαθθζενβμφιεκα εδάθδ πμο δέπμκηαζ εζζνμέξ ακυνβακμο αγχημο ιε ηδ ιμνθή θζπαζιάηςκ (Verhamme et al., 2011, Dietal., 2010, Erguder et al., 2009). Έπεζ επίζδξ ανεεεί πςξ δ ιαηνυπνμκδ πδιζηή θίπακζδ, επδνεάγεζ ζδιακηζηά ηδκ αθεμκία ηαζ ηδ ζφκεεζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ ηαζ υπζ ηςκ ΑΟΑ (Shen et al., 2008). Χζηυζμ, μ ηονζυηενμξ πανάβμκηαξ πμο θαίκεηαζ κα ηαεμνίγεζ ημ είδμξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ πμο εα επζηναηήζμοκ ανζειδηζηά ηαεχξ ηαζ ηδ ζοκμθζηή δναζηδνζυηδηα ημοξ ζημ εδαθζηυ πενζαάθθμκ, είκαζ ημ ph ημο εδάθμοξ. οβηεηνζιέκμζ θοθυηοπμζ ηςκ ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ έπμοκ ανεεεί κα ζπεηίγμκηαζ ιε ημ ph ημο εδάθμοξ ζε έκα εφνμξ ηζιχκ απυ 4.9 έςξ 7.5, ιε ηα ΑΟΑ κα επζηναημφκ ανζειδηζηά ζε υλζκα ηαζ ηα ΑΟΒ ζε αθηαθζηά εδάθδ. Aκ ηαζ ηα ΑΟΑ θαίκεηαζ κα είκαζ μζ ιυκμζ θεζημονβζημί κζηνςδμπμζδηζημί ιζηνμμνβακζζιμί ζε εδάθδ ιε ph< 5.5, δ ακάπηολδ ηαζ δ δναζηδνζυηδηα ηάπμζςκ ΑΟΒ ζε υλζκεξ ζοκεήηεξ ιπμνεί κα επζηεοπεεί ιε ηδ δνάζδ ημο εκγφιμο μονεάζδ. οβηεηνζιέκα, ηα μονεμθοηζηά ααηηήνζα, οδνμθφμοκ ηδκ μονία ηαζ ηδ πνδζζιμπμζμφκ ζακ πδβή αιιςκίαξ ηαζ δζμλεζδίμο ημο άκεναηα, εκχ ζηδ ζοκέπεζα πνδζζιμπμζμφκ ηα πνμσυκηα ηδξ μονευθοζδξ βζα ηδκ ηνμπμπμίδζδ ημο ph ζηδκ πενζμπή ημο ηοηηάνμο (Prosser and Nicol, 2012, Yao et al., 2011, Nicol et al., 2008, Koper et al., 2004, DeBoer et al., 1991). Σα ααηηήνζα ηαζ ηα ανπαία απέπμοκ θοθμβεκεηζηά ιε δζαθμνέξ ςξ πνμξ ηδ θοζζμθμβία ηαζ ηδ δμιή ημο ηοηηάνμο. Σα ηφηηανα ηςκ ΑΟΑ (δζάιεηνμξ ιm) είκαζ ιζηνυηενα απυ αοηά ηςκ ΑΟΒ. οκεπχξ, δ δναζηζηυηδηα ακά ηφηηανμ ιπμνεί κα δζαθένεζ ζδιακηζηά. Δπίζδξ, μζ ηοηηανζηέξ ιειανάκεξ ηςκ ανπαίςκ δζαθένμοκ ζηδ ζφζηαζή ημοξ απυ εηείκεξ ηςκ εοηανοςηζηχκ μνβακζζιχκ ηαζ ηςκ ααηηδνίςκ, ςξ πνμξ ηδ δμιή ηςκ θζπζδίςκ. ηα ανπαία μζ αθηοθζηέξ αθοζίδεξ είκαζ δζαηθαδζζιέκεξ ζζμπνεκμεζδείξ αθοζίδεξ ηαζ υπζ θζπανά μλέα ηαζ ζοκδέμκηαζ ιε ημκ ημνιυ ηδξ βθοηενυθδξ ιέζς αζεενζημφ ακηί εζηενζημφ δεζιμφ (Δζηυκα 1.9). Ο αζεενζηυξ δεζιυξ είκαζ πζμ ακεεηηζηυξ ζηδκ οδνυθοζδ απυ ημκ εζηενζηυ, εκχ μζ ζζμπνεκμεζδείξ αθοζίδεξ είκαζ πζμ ακεεηηζηέξ ζε μλεζδςηζηά ιέζα (Schleper and Nicol 2010, Berg et al., 2004). Σα θζπίδζα ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ ηςκ Ανπαίςκ πνδζζιμπμζμφκηαζ ζοπκά ζακ αζμδείηηεξ ζε ιεθέηεξ ηδξ πανμοζίαξ ηαζ δζαζπμνάξ ημοξ (Leininger et al., 2006). 59

60 Εικόνα 1.9. Δομι των λιπιδίων των κυτταρικϊν μεμβρανϊν (α) των ευκαρυωτικϊν οργανιςμϊν και των βακτθρίων και (β) των αρχαίων. Σέθμξ, ημ έκγοιμ ΑΜΟ ηςκ ααηηδνίςκ είκαζ πμθφ-θεζημονβζηυ ηαζ ζοιιεηέπεζ ζηδκ μλείδςζδ ημο ιεεακίμο, ημο ιμκμλεζδίμο ημο άκεναηα ηαζ δζάθμνςκ άθθςκ μνβακζηχκ μοζζχκ. Μέπνζ ζηζβιήξ εθάπζζηα είκαζ βκςζηά βζα ηα εκαθθαηηζηά οπμζηνχιαηα ημο εκγφιμο ΑΜΟ ηςκ ΑΟΑ. Απυ ηδκ ακάθοζδ ημο βμκζδζχιαημξ ημο Cenarchaeum δζαπζζηχεδηε ςζηυζμ εηηυξ απυ ηα amoa, amob ηαζ amoc, δ φπανλδ ηαζ άθθςκ βμκζδίςκ πμο ηςδζημπμζμφκ μιυθμβα ηςκ ιεηαθμνέςκ ηδξ μονίαξ ηαζ ηδξ μονεάζδξ, βεβμκυξ πμο θακενχκεζ πςξ είκαζ πζεακυ ηα ΑΟΑ κα μλεζδχκμοκ δζάθμνεξ ακδβιέκεξ ιμνθέξ Ν (Τμu et al., 2009, Prosser and Nicol, 2008, Leininger et al., 2006) Μέζνδνη αμηνιόγεζεο ησλ επηδξάζεσλ ησλ γ.θ. ζηε κηθξνβηαθή θνηλόηεηα ηνπ εδάθνπο Ζ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα είκαζ απυ ηα πνχηα παναηηδνζζηζηά ημο εδάθμοξ πμο οθίζηακηαζ ηζξ άιεζεξ ηαζ έιιεζεξ επζδνάζεζξ ηςκ ηαθθζενβδηζηχκ πναηηζηχκ ηαζ ηςκ λεκμαζμηζηχκ μοζζχκ ηαζ ζοπκά πνδζζιμπμζείηαζ ζε μζημημλζημθμβζηέξ ιεθέηεξ ςξ έκαξ απυ ημοξ πθέμκ ηαηάθθδθμοξ αζμδείηηεξ βζα ηδκ επίδναζδ ηςκ β.θ. ζημ έδαθμξ. Ζ ηαηαθθδθυηδηα ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ςξ αζμδείηηεξ έβηεζηαζ ηονίςξ ζηδκ ζηακυηδηα ημοξ κα ακηαπμηνίκμκηαζ ηαπέςξ ζηζξ αθθαβέξ ημο εκδζαζηήιαημξ ημοξ, εηδδθχκμκηαξ ιεηααμθέξ ζημ ιέβεεμξ ηςκ πθδεοζιχκ ημοξ, ζηδ δμιή ηαζ ηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ημοξ, αθθά ηαζ ζηδ ιεηααμθζηή ημοξ δναζηδνζυηδηα. Ζ ζηακυηδηα ημοξ αοηή είκαζ ζοκοθαζιέκδ ιε ημ ιζηνμζημπζηυ ημοξ ιέβεεμξ ηαζ ηδκ αθεμκία ημοξ (ορδθή ακαθμβία επζθάκεζαξ πνμξ υβημ πμο ηαηαθαιαάκμοκ) αθθά ηαζ 60

61 ιε ηδ πενζμνζζιέκδ ζηακυηδηα μιμζυζηαζδξ ημοξ (Stefanowicz, 2006, Edwards et al., 1996). Ζ ακάπηολδ ηαηάθθδθςκ ιεευδςκ βζα ηδ ιέηνδζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ είκαζ πνμτπυεεζδ, χζηε κα εηηζιδεεί πθήνςξ δ επίδναζδ ηςκ ηαθθζενβδηζηχκ πναηηζηχκ ηαζ ηςκ λεκμαζμηζηχκ μοζζχκ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα (Saffina et al., 1989). Οζ πνχηεξ ιέεμδμζ πμο ακαπηφπεδηακ βζα ηδκ παναημθμφεδζδ ηδξ ζφζηαζδξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ζημ ενβαζηήνζμ ηαζ ηδκ αλζμθυβδζδ ηςκ επζδνάζεςκ δζαθυνςκ ελςηενζηχκ παναβυκηςκ ααζίζηδηακ ζηδκ ακάπηολδ ηαζ απμιυκςζδ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζε ενεπηζηά ιέζα ηαθθζένβεζαξ (culture-dependent methods) (Hill et al., 2000). Ακάιεζα ημοξ λεπςνίγεζ δ ηεπκζηή BIOLOG (Garl and Millis, 1991) πμο έπεζ ακαπηοπεεί ηαζ δζαηίεεηαζ ζημ ειπυνζμ ςξ ιζηνμπθάηεξ 96 πδβαδίςκ πμο πενζέπμοκ οπυζηνςια ηαζ ημκ δείηηδ μλεζδμακαβςβήξ ζχδεξ ημο ηεηναγμθίμο. Βαζίγεηαζ ζημκ θςημιεηνζηυ πνμζδζμνζζιυ ηδξ ακάπηολδξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ζε έκα εφνμξ οπμζηνςιάηςκ άκεναηα (ζοκμθζηά 95 οπμζηνχιαηα υπςξ οδνμβμκάκεναηεξ, αιζκμλέα, ηαναμλοθζηά μλέα, αιίκεξ, αιίδζα ηαζ άθθα πμθοιενή). Ζ μλείδςζδ ημο μνβακζημφ οπμζηνχιαημξ απυ ημοξ ακαπηοζζυιεκμοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ μδδβεί ζε ακαβςβή ηδξ πνςζηζηήξ ιε απμηέθεζια ηδκ αθθαβή ημο πνχιαημξ πμο ηαηαβνάθεηαζ θςημιεηνζηά ηαζ πνμζδζμνίγεηαζ ιε ηδ πνήζδ ηαηάθθδθμο θμβζζιζημφ. Ζ ηεπκζηή αοηή πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ δμιήξ ηαζ ηονίςξ ηδξ ιεηααμθζηήξ πμζηζθυηδηαξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ (Stefanowicz, 2006, Hill et al., 2000) ηαζ έπεζ εθανιμζηεί ιε επζηοπία ζε εδάθδ επζαανοιέκα ιε γζγακζμηηυκα (El Fantroussi et al., 1999). Δηθόλα Απεζηυκζζδ BIOLOG plate. 61

62 Σμ ηονζυηενμ ιεζμκέηηδια ηςκ ιεευδςκ πμο ζηδνίγμκηαζ ζηδκ ηαθθζένβεζα ζε ενεπηζηά ιέζα είκαζ υηζ δ ιεβάθδ πθεζμρδθία ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ δεκ ιπμνεί κα ηαθθζενβδεεί ζηα ιέπνζ ζήιενα βκςζηά ενεπηζηά ιέζα. Υαναηηδνζζηζηά, οπμθμβίγεηαζ πςξ ημ 95-99% ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ πμο οπάνπμοκ ζηδ θφζδ, δεκ ιπμνμφκ κα απμιμκςεμφκ ζημ ενβαζηήνζμ (Nocker et al., 2007, Kirk et al., 2004, Muyzer, 1999). ήιενα, έπμοκ ακαπηοπεεί αζμπδιζηέξ ηαζ ιμνζαηέξ ιέεμδμζ ηαηάθθδθεξ βζα ακάθοζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ πμζηζθυηδηαξ ηαζ ηδξ θεζημονβίαξ πμο δεκ ααζίγμκηαζ ζηδκ ηαθθζένβεζα ηαζ ηδκ απμιυκςζδ (culture-independent methods) ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ. Οζ ηεπκζηέξ αοηέξ ζοκήεςξ ααζίγμκηαζ: (i) ζηδκ ακάθοζδ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ (PLFAs) ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ, (ii) ζηoκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ελςηοηηανζηχκ εκγφιςκ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ πμο ζοιιεηέπμοκ ζε ζδιακηζηέξ θεζημονβίεξ, (iii) ζηδ πνήζδ ηδξ αθοζζδςηήξ ακηίδναζδξ ηδξ πμθοιενάζδξ (PCR) ζε δείβιαηα DNA πμο εηποθίγμκηαζ απυ ημ έδαθμξ ηαζ ζηδκ πεναζηένς ακάθοζδ ηςκ πνμσυκηςκ εκίζποζδξ ιε ηεπκζηέξ ιζηνμαζαηήξ απμηφπςζδξ (DGGE/TGGE, TRFLP, RISA/ARISA, ARDRA) ηαζ άθθεξ ιμνζαηέξ ηεπκζηέξ (αζαθζμεήηεξ ηθχκςκ, PCR πναβιαηζημφ πνυκμο, RT-PCR πναβιαηζημφ πνυκμο), (iv) ζηδ πνήζδ ηεπκζηχκ μιζηήξ ακάθοζδξ (ιεηαβμκζδζςιαηζηήξ, ιεηαηνακζηνζπηςιζηήξ, ιεηαπνςηεμιζηήξ) πμο δίκμοκ ηδκ δοκαηυηδηα ιεθέηδξ βμκζδζςιάηςκ, ηνακζηνζπηςιάηςκ ηαζ πνςηεσκχκ πμο πενζέπμκηαζ ζε έκα πενζααθθμκηζηυ δείβια ή μζημζφζηδια πςνίξ ηδκ απμιυκςζδ ημο ίδζμο ημο ιζηνμμνβακζζιμφ ηαζ ζηδνίγμκηαζ ζε αθθδθμφπζζδ ιεβάθδξ ηθίιαηαξ ηςκ κμοηθεζηχκ μλέςκ πμο παναθαιαάκμκηαζ απυ ημ πενζααθθμκηζηυ δείβια. Σέθμξ, πένακ ηςκ ιεευδςκ πμο ακαθένεδηακ παναπάκς, πνδζζιμπμζμφκηαζ επίζδξ ιέεμδμζ πμο ααζίγμκηαζ ζηδ ιέηνδζδ ηάπμζμο παναηηδνζζηζημφ ηδξ θοζζμθμβίαξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ, υπςξ δ ακαπκμή ηαζ μ νοειυξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ Μνξηαθέο ηερληθέο αλάιπζεο Οζ ιμνζαηέξ ηεπκζηέξ ακάθοζδξ πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδ ιεθέηδ ηυζμ ηδξ δμιήξ υζμ ηαζ ηδξ αθεμκίαξ ηςκ εδαθζηχκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ (Ranjard et al., 2000). Βαζίγμκηαζ ζηδκ ελαβςβή δεζμλονζαμκμοηθεσημφ μλέμξ (DNA) πμο απακηά ζε υθμοξ ημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ηαζ θένεζ θοθμβεκεηζηέξ πθδνμθμνίεξ. Σμ ζοκμθζηυ DNA πμο ελάβεηαζ απυ ηα εδαθζηά δείβιαηα οπμαάθθεηαζ ζηδ ζοκέπεζα ζε αθοζζδςηή 62

63 ακηίδναζδξ ηδξ πμθοιενάζδξ (PCR) βζα ηδκ εκίζποζδ βμκζδίςκ-ζηυπςκ ιε ηδ πνήζδ ηαηάθθδθςκ εηηζκδηχκ (primers). Οζ ιμνζαηέξ ιέεμδμζ ααζίγμκηαζ ζοκήεςξ ζηδκ εκίζποζδ ηςκ βμκζδίςκ ηδξ ιζηνήξ οπμιμκάδαξ ημο νζαμζςιζημφ RNA (SSUrRNA) 16S rrna βζα ημοξ πνμηανοςηζημφξ ηαζ 18S rrna βζα ημοξ εοηανοςηζημφξ ιζηνμμνβακζζιμφξ (Gremion et al., 2003, Duineveld et al., 2001, Torsvik et al., 1998, Ferris and Ward, 1997). Σα βμκίδζα ηδξ ιζηνήξ οπμιμκάδαξ ημο rrna απακηχκηαζ ζε ηάεε ιμνθή γςήξ ηαζ ζημοξ 3 «πχνμοξ» (Βαηηήνζα, Ανπαία ηαζ Δοηάνοα) ηαζ απμηεθμφκηαζ ηυζμ απυ ορδθά ζοκηδνδιέκεξ πενζμπέξ, υζμ ηαζ απυ πενζμπέξ ιε ζδιακηζηή εηενμβέκεζα. Οζ ζοκηδνδιέκεξ πενζμπέξ πνδζζιεφμοκ βζα ηδκ οανζδμπμίδζδ (annealing sites) ηαζ ημ ζπεδζαζιυ εηηζκδηζηχκ ιμνίςκ εκχ μζ πενζμπέξ ιε εηενμβέκεζα βζα ηδ θοθμβεκεηζηή δζαθμνμπμίδζδ (Nocker et al., 2007, Hill et al., 2007). Ακάθμβεξ πνμζεββίζεζξ πανέπμοκ πθδνμθμνίεξ ζπεηζηά ιε ημ πμζεξ θοθμβεκεηζηέξ μιάδεξ ανίζημκηαζ ζημ έδαθμξ (ιζηνμαζαηή πμζηζθυηδηα), εκχ δεκ πανέπμοκ πθδνμθμνίεξ βζα ηδ ιεηααμθζηή ημοξ δναζηδνζυηδηα ηαζ δεκ είκαζ ηαηάθθδθεξ βζα ηδκ ακάθοζδ ζοβηεηνζιέκςκ θεζημονβζηχκ μιάδςκ ιζηνμμνβακζζιχκ. Ζ ακάθοζδ θεζημονβζηχκ βμκζδίςκ-ζηυπςκ δδθαδή βμκζδίςκ πμο ηςδζημπμζμφκ έκγοια πμο ειπθέημκηαζ ζε ζοβηεηνζιέκεξ ιεηααμθζηέξ θεζημονβίεξ, απμηεθμφκ ηδ αάζδ βζα ηδ ιεθέηδ οπμ-πθδεοζιχκ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ιε ζοβηεηνζιέκεξ θοζζμθμβζηέξ ζηακυηδηεξ. Γζάθμνα θεζημονβζηά βμκίδζα έπμοκ πνμζδζμνζζηεί υπςξ αοηυ πμο ηςδζημπμζεί ημ έκγοιμ ιμκμ-μλοβμκάζδ ηδξ αιιςκίαξ (amoa) ηαζ έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί ιε επζηοπία βζα αοηυ ημ ζημπυ (Nocker et al., 2007, Kelly, 2003) Σερληθέο Μνξηαθήο Απνηύπσζεο (Molecular Fingerprint Techniques) Οζ ηεπκζηέξ ιμνζαηήξ απμηφπςζδξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ πενζθαιαάκμοκ PCR εκίζποζδ ζοβηεηνζιέκςκ βμκζδίςκ ηαζ αηυθμοεδ δθεηηνμθυνδζδ ηςκ πνμσυκηςκ ζε πδηηή αβανυγδξ ή πμθοαηνοθαιίδδξ, υπμο ηα πνμσυκηα βίκμκηαζ μναηά ιε ααθή ιε ανςιζμφπμ αζείδζμ (ΔtBr) ή κζηνζηυ άνβονμ (AgNO 3 ), ακηίζημζπα. Ο δζαπςνζζιυξ ααζίγεηαζ ζηδ δζαθμνεηζηή δθεηηνμθμνδηζηή ηζκδηζηυηδηα ηςκ ιμνίςκ ζηδκ πδηηή πμο ελανηάηαζ είηε απυ ηδκ αθθδθμοπία ηςκ κμοηθεμηζδίςκ ημοξ (DGGE, TGGE) είηε απυ ημ ιέβεεμξ ημοξ (T-RFLP, ARDRA, RISA, ARISA). Σμ ιμνζαηυ απμηφπςια πμο πνμηφπηεζ απανηίγεηαζ απυ έκα ζφκμθμ γςκχκ ηαζ πανέπεζ πθδνμθμνίεξ ζπεηζηά ιε ηδ βεκεηζηή δμιή ημο ζοκυθμο ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ή εκυξ ιένμοξ ηδξ, βεβμκυξ πμο ηαεμνίγεηαζ απυ ηα γεφβδ ηςκ εηηζκδηχκ πμο 63

64 επζθέβμκηαζ. Οζ ηεπκζηέξ αοηέξ δίκμοκ απμηεθέζιαηα πμο ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ ζε ζοβηνζηζηέξ ιεθέηεξ ηδξ δμιήξ ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ οπυ ιεηααθδηέξ ζοκεήηεξ (Lynch et al., 2004, Ranjard et al., 2000). DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis: Ζιεθηξνθόξεζε ζε πεθηή αθξπιακίδεο κε βαζκίδσζε ηεο ζπγθέληξσζεο ησλ απνδηαηαθηηθώλ νπζηώλ) /TGGE (Thermal Gradient Gel Electrophoresis: Ζιεθηξνθόξεζε ζε πεθηή αθξπιακίδεο κε βαζκίδσζε ηεο ζεξκνθξαζίαο). Καηά ηδκ DGGE/TGGE ακάθοζδ, ηιήιαηα DNA ιε ημ ίδζμ ιήημξ ( γεφβδ αάζεςκ) αθθά δζαθμνεηζηήξ κμοηθεμηζδζηήξ αθθδθμοπίαξ, δζαπςνίγμκηαζ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ. ηδκ πενίπηςζδ ημο DGGE πνδζζιμπμζείηαζ ααειίδςζδ ζηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ (μονία ηαζ θμνιαιίδδ), εκχ ζηδκ πενίπηςζδ ημο TGGE πνδζζιμπμζείηαζ εενιμηναζζαηή ααειίδςζδ. Ο δζαπςνζζιυξ ααζίγεηαζ ζηδ ιεζςιέκδ δθεηηνμθμνδηζηή ηζκδηζηυηδηα εκυξ ιενζηχξ απμδζαηαβιέκμο ιμνίμο DNA ζε ζφβηνζζδ ιε ηδ ηζκδηζηυηδηα ηδξ πθήνςξ δίηθςκδξ ιμνθήξ. Ζ ιενζηή απμδζάηαλδ ημο ιμνίμο επζαναδφκεζ ηδκ ηζκδηζηυηδηα ημο ζηδκ πδηηή αηνοθαιίδδξ ηαζ ημ ιυνζμ ζηαιαηάεζ κα ηζκείηαζ, ζπδιαηίγμκηαξ ζημ ζδιείμ μπμφ ζηαιαηά παναηηδνζζηζηή γχκδ. Ζ μθζηή απμδζάηαλδ ημο ιμνίμο απμηνέπεηαζ απυ ηδ πανμοζία ιζαξ αθθδθμοπίαξ αάζεςκ πθμφζζαξ ζε γεφβδ βμοακίκδξ- ηοημζίκδξ (GCclamp) ζημ 5 άηνμ ημο. Σμ ζφκμθμ ηςκ γςκχκ πμο πνμηφπημοκ απυ ηδκ δθεηηνμθυνδζδ εκυξ δείβιαημξ ακηακαηθά άιεζα ηδ βεκεηζηή ημο πμζηζθυηδηα ηαζ μ ανζειυξ ηςκ γςκχκ ακηζπνμζςπεφεζ ημκ ανζειυ ηςκ ηονίανπςκ εζδχκ. Οζ ιέεμδμζ DGGE/TGGEπνδζζιμπμζμφκηαζ εονέςξ ζηδ ιζηνμαζαηή μζημθμβία βζα ημ παναηηδνζζιυ ηδξ δμιήξ ηαζ ηδξ δοκαιζηήξ ηςκ ιζηνμαζαηχκ πθδεοζιχκ ημο εδάθμοξ. Έπμοκ ημ πθεμκέηηδια ηδξ ηαοηυπνμκδξ ακάθοζδξ πμθθχκ δεζβιάηςκ, βεβμκυξ πμο ηζξ ηαεζζηά ηαηάθθδθεξ βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ ιεηααμθχκ πμο ζοιααίκμοκ ζηδ δμιή ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ζε αάεμξ πνυκμο. Υαναηηδνζζηζηυ είκαζ επίζδξ, υηζ επζηνέπμοκ ημ δζαπςνζζιυ δφμ ιμνίςκ πμο δζαθένμοκ έζης ηαζ ηαηά ιζα ιυκμ αάζδ. Δπίζδξ, ιεηά ηδκ εθανιμβή ημοξ δίκεηαζ δ πεναζηένς δοκαηυηδηα ηαοημπμίδζδξ ζοβηεηνζιέκςκ ιεθχκ ηδξ ημζκυηδηαξ ιέζς ελαβςβήξ DNA απυ ηδκ γχκδ ζηδκ πδηηή ηαζ αηυθμοεδξ ηθςκμπμίδζδξ ηαζ αθθδθμφπζζδξ ή οανζδμπμίδζδξ ημο ιε ηαηάθθδθμοξ ζπκδθάηεξ (Nannipieri et al., 2003, Muyzer, 1999, Muyzer and Smalla, 1998). 64

65 Εικόνα χθματικι απεικόνιςθ τθσ μεκόδου θλεκτροφόρθςθσ ςε πθκτι ακρυλαμίδθσ με βακμίδωςθ τθσ ςυγκζντρωςθσ των αποδιατακτικϊν ουςιϊν (DGGE) (In: step procedure of using DGGE analysis in microbiology.pdf). T-RFLP: Αλάιπζε πνιπκνξθηζκνύ ηνπ κήθνπο αθξαίσλ ζξαπζκάησλ (ελόο γνληδίνπ) εθ πεξηνξηζκνύ (Terminal Restriction Fragment Polymorphisms). Ζ ιέεμδμξ αοηή πενζθαιαάκεζ ηδκ εκίζποζδ ιε ηδκ ηεπκζηή ηδξ PCR ημο βμκζδίμο ακαθμνάξ ιε ηδκ πνήζδ ημο εκυξ ή ηαζ ηςκ δφμ εηηζκδηχκ ζδιαζιέκςκ ιε θεμνίγμοζα πνςζηζηή (π.π. TET, 6-FAM). Βαζίγεηαζ ζηδκ πέρδ ηςκ πνμσυκηςκ ηδξ PCR ιε έκα ή πενζζζυηενα έκγοια πενζμνζζιμφ (εκδμκμοηθεάζεξ) ηαζ ηδκ αηυθμοεδ ακίπκεοζδ ηςκ αηναίςκ ηιδιάηςκ πενζμνζζιμφ πμο έπμοκ ζδιακεεί ιε ηδκ θεμνίγμοζα πνςζηζηή ζε αοηυιαημ ζφζηδια αθθδθμφπζζδξ DNA. Σμ πνυηοπμ ηςκ γςκχκ πμο πνμηφπηεζ πανέπεζ πθδνμθμνίεξ βζα ηδκ πμζηζθμιμνθία ημο πθδεοζιμφ ηαεχξ ηάεε γχκδ ακηζπνμζςπεφεζ ιζα ηαλζκμιζηή μιάδα. Ζ ιέεμδμξ T-RFLP απμηεθεί πνήζζιμ ενβαθείμ βζα ηδκ ιεθέηδ ζφκεεηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ ηαζ βζα ηδ ζφβηνζζδ δζαθμνεηζηχκ δεζβιάηςκ (Kirk et al., 2004, Clement et al., 1998, Liu et al., 1997). 65

66 Εικόνα χθματικι απεικόνιςθ τθσ μεκόδου ανάλυςθσ πμθοιμνθζζιμφ ημο ιήημοξ αηναίςκ εναοζιάηςκ (εκυξ βμκζδίμο) εη πενζμνζζιμφ πολυμορφιςμϊν μικουσ (TRFLP) (In: ARDRA: Αλάιπζε εληζρπκέλσλ ζξαπζκάησλ εθ πεξηνξηζκνύ ηνπ ξηβνζσκηθνύ DNA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis). Δίκαζ ιέεμδμξ ακάθμβδ ηδξ T-RFLP. Υνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ηςκ ααηηδνίςκ ηαζ ηδ ζοζηδιαηζηή ημοξ ηαηάηαλδ ζε επίπεδμ είδμοξ. Βαζίγεηαζ ζηδ ζήιακζδ ημο μθζβμκμοηθεμηίδζμο ηδξ εοιίκδξ (dutp) ιε θεμνίγμοζα πνςζηζηή ηαζ ιεηέπεζηα εκζςιάηςζδ ημο ζηδκ ακηίδναζδ ηδξ PCR, απυ ηδκ μπμία πνμηφπημοκ θεμνίγμκηα πνμσυκηα. Αημθμοεεί πέρδ ιε έκγοια πενζμνζζιμφ ηαζ δζαπςνζζιυξ ηςκ πνμσυκηςκ ζε πδηηή αβανυγδξ ή πμθοαηνοθαιίδδξ. Υνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδ ιεθέηδ ιεηααμθχκ ζηδ δμιή ηςκ ααηηδνζαηχκ ημζκμηήηςκ ελαζηίαξ ηδξ αθθαβήξ ηςκ πενζααθθμκηζηχκ ζοκεδηχκ ή ηδξ επίδναζδξ ημλζηχκ λεκμαζμηζηχκ μοζζχκ (Lynch et al., 2004, Ranjard et al., 2000, Muyzer, 1999). 66

67 RISA: Αλάιπζε ηνπ ξηβνζσκηθνύ εζσγνληδηαθνύ δηαρσξηζηή (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis). Πενζθαιαάκεζ ηδκ PCR εκίζποζδ ημο εζςβμκζδζαημφ δζαπςνζζηή (IGS, Intergenic Spacer) πμο ανίζηεηαζ ακάιεζα ζηδ ιζηνή (16S βζα ανπαία ηαζ ααηηήνζα ηαζ 18S βζα ημοξ ιφηδηεξ) ηαζ ζηδ ιεβάθδ οπμιμκάδα (23S βζα ανπαία ηαζ ααηηήνζα ηαζ 28S βζα ημοξ ιφηδηεξ) ηςκ rrna (νζαμζςιζηυ RNA) βμκζδίςκ. Ζ πενζμπή αοηή πμζηίθεζ ζε ιέβεεμξ ηαζ ζε αθθδθμοπία κμοηθεμηζδίςκ. Σμ ιήημξ ηδξ ελανηάηαζ απυ ημ ζηέθεπμξ ή ημ είδμξ ημο ιζηνμμνβακζζιμφ ηαζ ηοιαίκεηαζ απυ 50 ςξ 1500 γεφβδ αάζεςκ. Ζ ιέεμδμξ μοζζαζηζηά ζηδνίγεηαζ ζηδκ εηενμβέκεζα ημο ιήημοξ ηδξ πενζμπήξ αοηήξ. Σα πνμσυκηα ηδξ PCR δζαπςνίγμκηαζ ζε πδηηή πμθοαηνοθαιίδδξ απυ υπμο πνμηφπηεζ ηεθζηά έκα πνυηοπμ γςκχκ κμοηθεσηχκ μλέςκ πμο ηάεε ιία ακηζπνμζςπεφεζ ημοθάπζζημκ έκα μνβακζζιυ. Υνδζζιμπμζείηαζ βζα ημκ παναηηδνζζιυ ηαζ ηδκ ηαλζκυιδζδ ζηεθεπχκ ηαζ βζα ηδ ιμνζαηή απμηφπςζδ απθχκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ ηαζ ζφκεεηςκ πθδεοζιχκ (Lynch et al., 2004). ΑRISA: Απηνκαηνπνηεκέλε αλάιπζε ηνπ ξηβνζσκηθνύ εζσγνληδηαθνύ δηαρσξηζηή (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis). Απμηεθεί αοημιαημπμζδιέκδ εηδμπή ηδξ RISA. ηδκ πενίπηςζδ αοηή, βζα ηδκ PCR εκίζποζδ ηδξ IGS δζαβμκζδζαηήξ πενζμπήξ πνδζζιμπμζείηαζ εηηζκδηήξ ζδιαζιέκμξ ιε θεμνίγμοζα πνςζηζηή βζα κα ιπμνεί κα ακζπκεοηεί ημ πνμσυκ ζε έκα αοημιαημπμζδιέκμ ζφζηδια ηνζπμεζδμφξ αθθδθμφπζζδξ. Γζα ημ ίδζμ δείβια ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ δζάθμνμζ εηηζκδηέξ, ζημπεφμκηαξ ζε δζαθμνεηζηέξ θοθμβεκεηζηέξ μιάδεξ βζα ηδκ ηαοηυπνμκδ εηηίιδζδ ηδξ δοκαιζηήξ ημο πθδεοζιμφ δζαθμνεηζηχκ ιζηνμαζαηχκ θοθμηφπςκ ζε ιζα ημζκυηδηα (Lynch et al., 2004, Fisher and Triplett, 1999) Λνηπέο Μνξηαθέο Μέζνδνη PCR πξαγκαηηθνύ ρξόλνπ (Real Time PCR, qpcr). Ζ qpcr είκαζ ιέεμδμξ πμζμηζηή ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ζηδ ιζηνμαζαηή μζημθμβία βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ αθεμκίαξ μιάδςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζε πενζααθθμκηζηά δείβιαηα, ιέζς ηδξ ιέηνδζδξ ημο ανζειμφ ηςκ ακηζβνάθςκ εκυξ βμκζδίμο-δείηηδ. ηδκ qpcr, ζε ακηίεεζδ ιε ηδκ απθή PCR, δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ πνμσυκηςκ εκίζποζδξ εθέβπεηαζ ζε ηάεε ηφηθμ εκίζποζδξ ιε ηδκ πνήζδ θεμνζγμοζχκ πνςζηζηχκ. Oζ πνςζηζηέξ πνμζδέκμκηαζ ζηα πνμσυκηα εκίζποζδξ πςνίξ κα ηα αθθμζχκμοκ έηζζ χζηε δ εκίζποζδ ημοξ κα ιπμνεί κα 67

68 ζοκεπζζηεί ηαζ ζημοξ επυιεκμοξ ηφηθμοξ. Ζ έκηαζδ ημο θεμνζζιμφ πμο εηπέιπεηαζ ηαηά ηδκ δζάνηεζα αοηήξ ηδξ δζαδζηαζίαξ ζπεηίγεηαζ ιε ηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ πνμσυκηςκ εκίζποζδξ ζε δεδμιέκμ πνυκμ. Γζάθμνεξ ιέεμδμζ έπμοκ ακαπηοπεεί βζα ηδ ζήιακζδ ηαζ ηδκ ακίπκεοζδ ηςκ πνμσυκηςκ ηδξ qpcr. οκήεςξ ςζηυζμ πνδζζιμπμζμφκηαζ δ ιδ εζδζηή πανειααθθυιεκδ πνςζηζηή SYBRgreen ηαζ μζ εζδζημί ζδιαζιέκμζ ακζπκεοηέξ ΣaqMan. Ο πνμζδζμνζζιυξ ηδξ πμζυηδηαξ ηςκ παναβυιεκςκ πνμσυκηςκ ιπμνεί κα βίκεζ ιε απυθοημ ή ζπεηζηυ οπμθμβζζιυ. ηδκ απυθοηδ πμζμηζημπμίδζδ μ ανζειυξ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο ανπζημφ δείβιαημξ πνμζδζμνίγεηαζ ιε ηδ πνήζδ ηαιπφθδξ ακαθμνάξ εκχ ζηδ ζπεηζηή πμζμηζημπμίδζδ μζ αθθαβέξ ημο ανζειμφ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο-ζηυπμο εηθνάγμκηαζ ζε ζπέζδ ιε ημκ ανζειυ ηςκ ακηζβνάθςκ ηάπμζμο βμκζδίμο-ακαθμνάξ πμο θεζημφνβεζ ςξ ελςηενζηυ πνυηοπμ ακαθμνάξ (Smith and Osborn, 2009, Malik et al., 2008). 68

69 Εικόνα χθματικι απεικόνιςθ τθσ μεκόδου RtPCR με χριςθ των ειδικά ςθμαςμζνων ανιχνευτϊν ΣaqMan (αριςτερά) και τθσ μθ ειδικισ παρεμβαλλόμενθσ χρωςτικισ SYBRgreen (δεξιά) (In: Services/Applications/PCR/real-time-pcr/qpcr-education/taqman-assays-vs-sybr-green-dyefor-qpcr.html). Κισλνπνίεζε θαη Αιιεινύρηζε, Γεκηνπξγία Βηβιηνζεθώλ Κιώλσλ (Cloning and Sequencing, Clone Libraries). Ζ ηθςκμπμίδζδ πενζθαιαάκεζ ηδκ έκεεζδ ηιήιαημξ DNA ζε ηαηάθθδθμ θμνέα-πθαζιίδζμ ηαζ εζζαβςβή ημο ακαζοκδοαζιέκμο πθαζιζδίμο ζε ηφηηανα ηαηάθθδθμο μνβακζζιμφ-δέηηδ (δεηηζηά ζηεθέπδ E.coli) ιέζς ιεηαζπδιαηζζιμφ. Αημθμοεεί ακάπηολδ ηςκ ηοηηάνςκ ημο μνβακζζιμφ-δέηηδ ζε ενεπηζηυ οπυζηνςια πμο πενζέπεζ ακηζαζμηζηυ (π.π αιπζηζθθίκδ). Σα ιεηαζπδιαηζζιέκα ηφηηανα πμο πενζέπμοκ ημ πθαζιίδζμ-θμνέα μ μπμίμξ ηαηέπεζ βμκίδζμ ακεεηηζηυηδηαξ ζηδκ αιπζηζθθίκδ είκαζ αοηά πμο επζαζχκμοκ. Σα πθαζιίδζα ακηζβνάθμκηαζ ηαζ ηα ηφηηανα δζαζνμφκηαζ. Σα ααηηήνζα ακαπηφζζμοκ απμζηίεξ πμο πενζέπμοκ ημ ίδζμ ακηίβναθμ πθαζιζδίμο ηαζ ηάεε απμζηία ακηζζημζπεί ζε έκα ηθχκμ. 69

70 Σμ βεκεηζηυ οθζηυ ηςκ ηθχκςκ εκζζπφεηαζ ιε PCR ακηίδναζδ ηαζ ηα πνμσυκηα εκίζποζδξ δζαπςνίγμκηαζ πεναζηένς ιέζς δθεηηνμθυνδζδξ. Αημθμοεεί αθθδθμφπδζδ ηςκ ηθςκμπμζδιέκςκ βμκζδίςκ ηαζ ζφβηνζζδ ηςκ αθθδθμοπζχκ ιε αοηέξ πμο ανίζημκηαζ ηαηαπςνδιέκεξ ζε αάζεζξ δεδμιέκςκ (π.π GeneBank). Ζ δδιζμονβία αζαθζμεδηχκ ηθχκςκ πανέπεζ θεπημιενείξ θοθμβεκεηζηέξ πθδνμθμνίεξ βζα ηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα εκυξ πενζααθθμκηζημφ δείβιαημξ. Δίκαζ ιέεμδμξ επίπμκδ, πνμκμαυνμξ ηαζ ιε ορδθυ ηυζημξ, ζοκεπχξ είκαζ αηαηάθθδθδ βζα ιεθέηεξ υπμο απαζηείηαζ ακάθοζδ πμθθχκ πενζααθθμκηζηχκ δεζβιάηςκ (Nocker et al., 2007, Lynch et al., 2004, Ranjard et al., 2000). Αιπζηδσηή αληίδξαζε ηεο πνιπκεξάζεο (παξνπζία) ηεο αληίζηξνθεο κεηαγξαθάζεο θαη Αλίρλεπζε ηνπ αγγειηνθόξνπ RNA (Reverse Transcriptase PCR and mrna detection). Πμθθέξ θμνέξ βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ ιεηααμθζηά εκενβχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζε πενζααθθμκηζηά δείβιαηα πνδζζιμπμζείηαζ ημ RNA (rrna ηαζ mrna), ζηδ εέζδ ημο DNA. Σμ αββεθζμθυνμ RNA (mrna) απακηά ςξ εκδζάιεζμ ιυνζμ ζηδκ έηθναζδ ηςκ βμκζδίςκ ηαζ έπεζ ιζηνή δζάνηεζα γςήξ. οκεπχξ, δ ακίπκεοζδ ημο απμηεθεί έκδεζλδ ηδξ εκενβήξ έηθναζδξ εκυξ βμκζδίμο ηδ δεδμιέκδ πνμκζηή ζηζβιή. Δπζπθέμκ, μ ανζειυξ ηςκ ιεηαβνάθςκ mrna (mrna transcripts) ζπεηίγεηαζ ιε ημ επίπεδμ ηδξ δναζηζηυηδηαξ. Γζάθμνεξ ηεπκζηέξ έπμοκ ακαπηοπεεί βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ έηθναζδξ θεζημονβζηχκ βμκζδίςκ ιε ακίπκεοζδ ημο mrna. Ζ PCR ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθάζδξ (RT-PCR, Reverse Transcriptase PCR) είκαζ πνήζζιμ ενβαθείμ βζα ηδκ ακίπκεοζδ ημο mrna. ηδκ RTPCR ημ mrna πνδζζιμπμζείηαζ ςξ εηιαβείμ βζα ηδ ζφκεεζδ ιζαξ ζοιπθδνςιαηζηήξ αθοζίδαξ DNA (complementary DNA, cdna) ηαζ αοηή δ αθοζίδα εκζζπφεηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιέζς απθήξ PCR ή PCR πναβιαηζημφ πνυκμο, ακάθμβα ιε ηζξ ακάβηεξ ημο πεζνάιαημξ. H ακίπκεοζδ ημο mrna ιπμνεί επίζδξ κα βίκεζ ιε ζπκδθάηεξ DNA (DNAprobes), ιέζς ζοιααηζηχκ ηεπκζηχκ οανζδμπμίδζδξ (Nicol and Prosser, 2011, Kelly, 2003) Σερληθέο νκηθήο αλάιπζεο Όθεξ μζ ιμνζαηέξ ηεπκζηέξ πμο ακαπηφπεδηακ παναπάκς αθμνμφκ ζηδκ ακάθοζδ εκυξ ιυκo ηιήιαημξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ ηαζ δεκ ιπμνμφκ κα πενζβνάρμοκ πθήνςξ ηδ βεκεηζηή ιζηνμαζαηή πμζηζθυηδηα ζηα πενζααθθμκηζηά δείβιαηα. Σζξ ηεθεοηαίεξ δεηαεηίεξ έπμοκ ακαπηοπεεί ορδθήξ απυδμζδξ ιμνζαηά ενβαθεία βζα ηδ ιεθέηδ πενζααθθμκηζηχκ δεζβιάηςκ, υπςξ είκαζ μζ ηεπκζηέξ μιζηήξ 70

71 ακάθοζδξ (ιεηαβμκζδζςιαηζηή, ιεηαηνακζηνζπηςιζηή, ιεηαπνςηεμιζηή, ιεηααμθμιζηή) πμο επζδζχημοκ κα ακαθφζμοκ ημ ζφκμθμ ηςκ βεκεηζηχκ πθδνμθμνζχκ (βμκζδζςιάηςκ, ηνακζηνζπηςιάηςκ, πνςηεσκχκ ηαζ ιεηααμθζηχκ, ακηίζημζπα) πμο πενζέπμκηαζ ζηα πενζααθθμκηζηά δείβιαηα. Οζ παναπάκς ιμνζαηέξ πνμζεββίζεζξ ζε ζοκδοαζιυ ιε ηζξ πνυζθαηεξ ελεθίλεζξ ζηδ αζμπθδνμθμνζηή αζμζηαηζζηζηή, έπμοκ θένεζ επακάζηαζδ ζηδκ ηαηακυδζδ ηδξ μζημθμβίαξ ηαζ ηδξ θοζζμθμβίαξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ηαζ ηςκ ιμνζαηχκ ιδπακζζιχκ πμο δζέπμοκ ηζξ δζάθμνεξ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ηαζ είκαζ ελαζνεηζηήξ ζδιαζίαξ βζα ηδ ιεθέηδ ηαζ ημκ παναηηδνζζιυ ηδξ ηενάζηζαξ ιζηνμαζαηήξ πμζηζθυηδηαξ ηαζ ηδξ ηαηακυδζδξ ηςκ αθθδθεπζδνάζεςκ ιε αζμηζημφξ ηαζ ααζμηζημφξ πενζααθθμκηζημφξ πανάβμκηεξ (Rastogi and Sani, 2011). Ζ ιεηαβμκζδζςιαηζηή απμηεθεί ηδκ πενζζζυηενμ δζαδεδμιέκδ ηεπκζηή μιζηήξ ακάθοζδξ ηαζ ααζίγεηαζ ζηδκ ελαβςβή, αθθδθμφπδζδ ηαζ ακάθοζδ μθυηθδνμο ημο βεκεηζημφ οθζημφ εκυξ μζημζοζηήιαημξ. φιθςκα ιε ηδκ επίζδια πνχηδ πνήζδ ημο υνμο ημο ιεηα-βμκζδζχιαημξ (Handelsman et al., 1998), απμηεθεί ιζα ιμνζαηή πνμζέββζζδ πμο επζηνέπεζ ηδ δζενεφκδζδ ηδξ πμζηζθυηδηαξ ιειμκςιέκςκ βμκζδίςκ ηαζ ηςκ πνμσυκηςκ ημοξ, ηαεχξ ηαζ ηδκ ακάθοζδ μθυηθδνςκ μπενυκζςκ πμο ηςδζημπμζμφκ αζμζοκεεηζηέξ δ απμδμιδηζηέξ μδμφξ. Ζ ιεηαβμκζδζςιαηζηή πνδζζιμπμζείηαζ πνμηεζιέκμο κα απακηδεμφκ ηαίνζα μζημθμβζηά ενςηήιαηα δίκμκηαξ ηδ δοκαηυηδηα ζημοξ επζζηήιμκεξ κα ζοζπεηίζμοκ πζεακέξ θεζημονβίεξ ιε ζοβηεηνζιέκμοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ, ζε εδαθζηέξ ημζκυηδηεξ πμο απμηεθμφκηαζ απυ πθδεχνα δζαθμνεηζηχκ εζδχκ (Schmeisser et al., 2007). Ακηίζημζπα, δ ιεηαηνακζηνζπηςιζηή, πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδ ιεθέηδ ημο ζοκυθμο ηςκ mrna ιμνίςκ, ή «ηνακζηνζπηςιάηςκ», πμο πανάβμκηαζ ζε έκα ηφηηανμ ή ζε έκα πθδεοζιυ ηοηηάνςκ ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ βζα ημκ πμζμηζηυ πνμζδζμνζζιυ ηδξ δοκαιζηήξ έηθναζδξ ηςκ mrna ιμνίςκ ηαζ ηδξ πμηζθυηδηαξ πμο πανμοζζάγμοκ ζηα δζάθμνα ζηάδζα ηδξ βεκςιζηήξ ηθίιαηαξ, ακηζπνμζςπεφμκηαξ έηζζ ηα βμκίδζα πμο εηθνάγμκηαζ εκενβά ζε δεδμιέκμ πνυκμ, ιε ελαίνεζδ ηάπμζα θαζκυιεκα δζάζπαζδξ ημο mrna (Zhang et al., 2010). Σέθμξ, δ ακάπηολδ ηαζ δ εθανιμβή ηδξ ιεηαπνςηεμιζηήξ ηαζ ιεηααμθμιζηήξ ζπεηίγμκηαζ ιε ηδ θοζζμθμβία ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ηαζ ηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ ηαζ ημο πενζαάθθμκημξ. Οζ ηεπκζηέξ ιεηαπνςηεμιζηήξ ακάθοζδξ ζημπεφμοκ ζηδκ ηαοηυπνμκδ ακάθοζδ ηςκ πνςηεσκχκ πμο πανάβμκηαζ απυ έκα ζφκμθμ ηοηηάνςκ, ζζηχκ ή μνβακζζιχκ πμο ειπενζέπμκηαζ ζηα οπυ ιεθέηδ 71

72 πενζααθθμκηζηά δείβιαηα. Ζ ιεηααμθμιζηή απμηεθεί ιέεμδμ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ πμζηζθυηδηαξ ηςκ ιζηνχκ ιμνίςκ ζημ ηφηηανμ ηαζ βζα ημκ εκημπζζιυ ηςκ δζαθμνχκ ζηδκ αθεμκία ηςκ ιζηνχκ ιμνίςκ ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ζηζξ ακαθφζεζξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ημ ιεηααμθζζιυ, ηαεχξ μζ ιεηααμθίηεξ είκαζ θεζημονβζηέξ μκηυηδηεξ ιέζα ζηα ηφηηανα ηαζ ηα επίπεδα ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ημοξ ιεηααάθμκηαζ/πμζηίθμοκ ςξ ζοκέπεζα βεκεηζηχκ δ θοζζμθμβζηχκ αθθαβχκ (Zhang et al., 2010). Εικόνα υνοπτικι απεικόνιςθ των τεχνικϊν που χρθςιμοποιοφνται για τον χαρακτθριςμό τθσ δομικισ και λειτουργικισ μικροβιακισ ποκιλότθτασ ςτο περιβάλλoν και δεν βαςίηονται ςτθν καλλιζργεια και τθν απομόνωςθ των μικροοργανιςμϊν (από Rastogi and Sani,2011) Βηνρεκηθέο κέζνδνη Μέζνδνο αλάιπζεο ησλ ιηπαξώλ νμέσλ ησλ θσζθνιηπηδίσλ (PLFAs) Ζ ιέεμδμξ ακάθοζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ πνδζζιμπμζείηαζ εονέςξ βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ ιεηααμθχκ ζηδ ζφκεεζδ ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ ημο εδάθμοξ ελαζηίαξ ηδξ επίδναζδξ ελςβεκχκ παναβυκηςκ ηαηαπυκδζδξ, ηαθθζενβδηζηχκ πναηηζηχκ, βεςνβζηχκ θανιάηςκ ηαζ βεκζηυηενα αθθαβχκ ζηδκ πμζυηδηα ημο εδάθμοξ (Spyrou et al., 2009, Bossio et al., 1998, Frostegard et al., 1993). 72

73 Σα θςζθμθζπίδζα απμηεθμφκ ηφνζμ ζοζηαηζηυ υθςκ ηςκ αζμθμβζηχκ ιειανακχκ. Απμηεθμφκηαζ απυ έκα ημνιυ βθοηενυθδξ ζημκ μπμίμ πνμζδέκμκηαζ δφμ αθοζίδεξ θζπανχκ μλέςκ ηαζ ιζα θςζθμνοθζςιέκδ αθημυθδ (Δζηυκα 1.14). Σμ 60-90% ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ πενζέπμοκ θςζθμθζπίδζα ιε εζηενζημφξ δεζιμφξ (-C-O-C=O), εκχ ημ 10-40%, πμζμζηυ ζημ μπμίμ ζοιπενζθαιαάκμκηαζ ηαζ ηα Ανπαία, δεκ ζπδιαηίγμοκ εζηενζημφξ δεζιμφξ ιε ηδ βθοηενυθδ (Madigan et al., 2005, Berg et al., 2004, Kaur et al., 2005) (Δζηυκα 1.15). Εικόνα χθματικι απεικόνιςθ τθσ δομισ ενόσ φωςφολιπιδίου (In: Εικόνα χθματικι απεικόνιςθ τθσ δομισ των φωςφολιπιδίων που ςχθματίηουν αικερικοφσ (πάνω) και εςτερικοφσ (κάτω) δεςμοφσ με τθν γλυκερόλθ (In: 73

74 Σα θζπανά μλέα ηςκ θςζθμθζπζδίςκ (PLFAs) ζοβηεκηνχκμοκ έκα ζφκμθμ παναηηδνζζηζηχκ πμο ηα ηαεζζημφκ αλζυπζζημοξ δείηηεξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ. ημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ, ηα θζπανά μλέα απακηχκηαζ ςξ ζοζηαηζηυ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ ηςκ γςκηακχκ ηοηηάνςκ ηαζ δεκ έπμοκ ακζπκεοεεί ζηα απμεδηεοηζηά θζπίδζα ή ζε ακενςπμβεκείξ νφπμοξ. Μεηά ημ εάκαημ ηςκ ηοηηάνςκ, μζ ηοηηανζηέξ ιειανάκεξ απμδμιμφκηαζ ηαζ ηα θςζθμθζπίδζα δζαζπχκηαζ άιεζα ζε μοδέηενα θζπίδζα,βεβμκυξ πμο ηα ηαεζζηά δείηηεξ ηδξ εκενβήξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ (Drenovsky et al., 2004, Zelles, 1999). οκεπχξ, ηοπυκ ιεηααμθέξ ζηδ ζοβηέκηνςζδ ή ηδ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs, οπυ ηδκ επίδναζδ ελςβεκχκ παναβυκηςκ, οπμδεζηκφμοκ ιεηααμθέξ ζηδ δμιή ηαζ ηδ θοζζμθμβία ιυκμ ηςκ γςκηακχκ ιζηνμαζαηχκ πθδεοζιχκ ημο εδάθμοξ (Malik et al., 2008). Δπζπθέμκ, μζ δζάθμνεξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ παναηηδνίγμκηαζ απυ ηδκ πανμοζία ζοβηεηνζιέκςκ θζπανχκ μλέςκ-δεζηηχκ ζηα θςζθμθζπίδζα ηςκ ηοηηανζηχκ ημοξ ιειανακχκ (Piotrowska-Seget and Mrozik, 2003). οκεπχξ, δ πανμοζία ή δ απμοζία ζοβηεηνζιέκςκ θζπανχκ μλέςκ θακενχκεζ ηδκ πανμοζία ή απμοζία ηςκ ακηίζημζπςκ μιάδςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζηζξ μπμίεξ ηα θζπανά μλέα απακηχκηαζ. Σέθμξ, ηα PLFAs ιπμνμφκ κα εηποθζζημφκ εφημθα απυ ηα εδαθζηά δείβιαηα ηαζ ιε ζφβπνμκεξ ακαθοηζηέξ ιεευδμοξ κα ηαοημπμζδεμφκ ηαζ κα πμζμηζημπμζδεμφκ πανέπμκηαξ πθδνμθμνίεξ ηυζμ βζα ηδ δμιή υζμ ηαζ βζα ημ ιέβεεμξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ (Papadopoulou et al., 2011, Spyrou et al., 2009). Ζ ιέεμδμξ ηςκ PLFAs ααζίγεηαζ ζημ ηθαζζζηυ πνςηυημθθμ ηςκ Bligh and Dyer (1959), πμο ηνμπμπμζήεδηε ανβυηενα απυ ημοξ White et al (1979) ηαζ πενζθαιαάκεζ ηδκ εηπφθζζδ θζπζδίςκ απυ ημ έδαθμξ ιε μνβακζημφξ δζαθφηεξ ηαζ ημκ αηυθμοεμ δζαπςνζζιυ ηαζ απμιυκςζδ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ ιε εηπφθζζδ ζηενεήξ θάζδξ (Solid Phase Extraction, SPE). Σα θζπανά μλέα ηςκ θςζθμθζπζδίςκ ιεηαηνέπμκηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιε ηαηάθθδθδ πδιζηή επελενβαζία ζε ιεεοθεζηένεξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ. Tα πηδηζηά αοηά πανάβςβα ακαθφμκηαζ ιε αένζα πνςιαημβναθία έηζζ χζηε κα πνμζδζμνζζηεί μ ηφπμξ ηαζ δ ζπεηζηή αθεμκία ημοξ. Ακ ηαζ ζδζαίηενα πνήζζιδ, δ ιέεμδμξ ακάθοζδξ ηςκ PLFAs πανμοζζάγεζ ηάπμζμοξ ζδιακηζημφξ πενζμνζζιμφξ. Γεκζηά, δ ιέεμδμξ πανέπεζ πθδνμθμνίεξ βζα ηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ζε επίπεδμ μιάδαξ ιζηνμμνβακζζιχκ ηαζ δεκ ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί βζα ημ παναηηδνζζιυ ιζηνμμνβακζζιχκ ζε επίπεδμ βέκμοξ ή είδμοξ. Καηάθθδθα θζπανά μλέα-δείηηεξ, δεκ έπμοκ ηαεμνζζηεί βζα υθμοξ ημοξ μνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ ηαζ ζε πμθθέξ πενζπηχζεζξ έκα ζοβηεηνζιέκμ θζπανυ μλφ πμο ανίζηεηαζ 74

75 ζημ εδαθζηυ δείβια, δεκ ιπμνεί κα ζοκδεεεί ιε ηάπμζμ ιζηνμμνβακζζιυ ή μιάδα ιζηνμμνβακζζιχκ απαναίηδηα. Δπίζδξ, PLFAs πμο εεςνμφκηαζ δείηηεξ βζα ζοβηεηνζιέκεξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ, πενζέπμκηαζ έζης ηαζ ζε παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ηαζ ζε ιζηνμμνβακζζιμφξ άθθςκ μιάδςκ (Piotrowska-Seget and Mrozik, 2003, Zelles, 1997). Αηυια, ημ βεβμκυξ υηζ ηάεε θζπανυ μλφ ζοκδέεηαζ ζοκήεςξ ιε ζοβηεηνζιέκδ μιάδα ιζηνμμνβακζζιχκ, δεκ ζδιαίκεζ απαναίηδηα υηζ απακηάηαζ ιυκμ ζε αοημφξ ημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ οπυ υθεξ ηζξ ζοκεήηεξ (Hill et al., 2000). Γζα πανάδεζβια, είκαζ εονέςξ βκςζηυ υηζ ηα θζπανά μλέα ιε δζαηθαδζζιέκδ αθοζίδα αηυιςκ άκεναηα απμηεθμφκ παναηηδνζζηζηυ ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ ηςκ εεηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ. Χζηυζμ, έπμοκ ανεεεί ηαζ ζε ανκδηζηά ηαηά Gram ααηηήνζα ηςκ βεκχκ Cytophaga ηαζ Flavobacterium (Ζaack et al., 1994). H ζφζηαζδ ηςκ PLFAs ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ, πμζηίθεζ ςξ έκα ααειυ ακάθμβα ιε ηζξ πενζααθθμκηζηέξ ζοκεήηεξ ηαζ ηδκ δναζηδνζυηδηα ημο ηοηηάνμο (Vestal and White, 1989, Haack et al., 1994). Οζ ιζηνμμνβακζζιμί ακηζδνχκηαξ ζηζξ επζδνάζεζξ ελςβεκχκ ηαηαπμκήζεςκ, βεςνβζηχκ πναηηζηχκ ή ηθζιαημθμβζηχκ αθθαβχκ ιεηααάθθμοκ ηδ ζφκεεζδ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ ζηζξ ηοηηανζηέξ ημοξ ιειανάκεξ, χζηε κα πνμζανιυζμοκ ηδκ ακεεηηζηυηδηα ηαζ ηδ θεζημονβζηυηδηα ηςκ ιειανακχκ ημοξ ζηζξ κέεξ πενζααθθμκηζηέξ ζοκεήηεξ. ηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ μζ αθθαβέξ εηδδθχκμκηαζ ιε αφλδζδ ηδξ νεοζηυηδηαξ ηςκ ιειανακχκ. ημοξ ζοκήεεζξ ιδπακζζιμφξ πνμζανιμβήξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζε ζοκεήηεξ πενζααθθμκηζηήξ ηαηαπυκδζδξ πενζθαιαάκμκηαζ δ ιεηαηνμπή ηςκ cis αηυνεζηςκ θζπανχκ μλέςκ ζε trans αηυνεζηα θζπανά μλέα, ηαεχξ ηαζ δ ιεηαηνμπή ιμκμαηυνεζηςκ θζπανχκ μλέςκ ζηα πζμ ζηαεενά ηοηθμπνμπακζηά θζπανά μλέα, ιε απχηενμ ζημπυ ηδ δζαηήνδζδ ηδξ θεζημονβζηυηδηαξ ηςκ ιειανακχκ (Kaur et al., 2005, Piotrowska-Seget and Mrozik, 2003). 75

76 Πίλαθαο 1.1.Λζπανά μλέα - αζμδείηηεξ ζοβηεηνζιέκςκ μιάδςκ ιζηνμμνβακζζιχκ (Piotrowska-Seget and Mrozik 2003, Kaur et al.,2005, Zelles,1999) Οκάδεο κηθξννξγαληζκώλ PLFAs δείθηεο Θεηζηά ηαηά Gram Βαηηήνζα i14:0, i15:0, a15:0, i16:0, i16:1, i17:0, a17:0, i18:0 Ανκδηζηά ηαηά Gram Βαηηήνζα cy 17:0, cy19:0, 16:1ς9c, 16:1ς7c, 16:1ς7t, 16:1ς5c, a16:0, 18:1, 18:1ς5c, 18:1ς7c, 18:1ς9c, 18:1ς9t, 19:1, 3ΟΖ 16:1 Μφηδηεξ 18:2ς6, 18:3ς3, 18:3ς6, 24:0, 26:0, 16:1ς5c Αηηζκμιφηδηεξ 10Me 16:0, 10Me 17:0, 10Me 18:0 Ακαενυαζα ααηηήνζα -OH οπμηαηαζηδιέκα PLFAs Θεζμακαβςβζηά Βαηηήνζα (Desulfobacter sp.) cy 17:0, 10Me16:0 Μεεακζμβυκα Σφπμο I 16:1ς8 Μεεακζμβυκα Σφπμο II 18:1ς8 Ζ νλνκαηνινγία ησλ ιηπαξώλ νμέσλ. Ζ μκμιαημθμβία ηςκ θζπανχκ μλέςκ ααζίγεηαζ ζημκ αηυθμοεμ ηφπμ: ανζειυξ αηυιςκ άκεναηα: ανζειυξ δζπθχκ δεζιχκ : εέζδ ηςκ δζπθχκ δεζιχκ απυ ημ πθέμκ απμιαηνοζιέκμ άημιμ άκεναηα (άημιμ ς- άκεναηα) ηδξ ακεναηζηήξ αθοζίδαξ (Frostegard et al., 1993). Ζ εέζδ ημο δζπθμφ δεζιμφ ιπμνεί κα δδθχκεηαζ επίζδξ ιε ημ ζφιαμθμ Γ ιε έκακ εηεέηδ. Γζα πανάδεζβια cis-γ 9 ζδιαίκεζ υηζ οπάνπεζ έκαξ δζπθυξ δεζιυξ cis δζαιυνθςζδξ ιεηαλφ ηςκ αηυιςκ 9 ηαζ 10 (Berg et al., 2004). Σα πνμεέιαηα i ηαζ a, cy, 10Me, c ηαζ t, οπμδδθχκμοκ ίζμ- ηαζ ακηζίζμ- δζαηθάδςζδ, ηοηθμπνυποθμ-δζαηθάδςζδ, φπανλδ ιεεοθμιάδαξ ζημ δέηαημ άημιμ άκεναηα απυ ημ ηεθζηυ ηαναμλφθζμ (άκεναηαξ 1: απυ αοηυ λεηζκά δ ανίειδζδ) ημο ιμνίμο, δζαιυνθςζδ cis ηαζ trans, ακηίζημζπα (Kaur et al.,2005) Πξνζδηνξηζκόο δξαζηηθόηεηαο ελδύκσλ κηθξνβηαθήο πξνέιεπζεο ζην έδαθνο Όθεξ μζ αζμπδιζηέξ ακηζδνάζεζξ ηαηαθφμκηαζ απυ έκγοια πμο πανμοζζάγμοκ ορδθή ελεζδίηεοζδ ηυζμ ςξ πνμξ ημ είδμξ ηδξ ακηίδναζδξ πμο ηαηαθφμοκ, υζμ ηαζ ςξ πνμξ ηδκ επζθμβή ηςκ οπμζηνςιάηςκ (ακηζδνχκηα) ηδξ ακηίδναζδξ. Ζ εκγοιζηή 76

77 δναζηζηυηδηα ζημ έδαθμξ είκαζ ηονίςξ ιζηνμαζαηήξ πνμέθεοζδξ ηαζ πνμένπεηαζ απυ έκγοια πμο οπάνπμοκ εθεφεενα ζημ έδαθμξ, εκδμηοηηανζηά έκγοια πμο εθεοεενχκμκηαζ απυ ηφηηανα πμο απμζοκηίεεκηαζ ή έκγοια δεζιεοιέκα ζε ηοηηανζηά ζοζηαηζηά. Χζηυζμ, ηάπμζα έκγοια ιπμνεί κα πνμένπμκηαζ απυ θοηζηά ηαζ γςζηά οπμθείιιαηα (Tabatabai, 1994). Οζ εκγοιζηέξ θεζημονβίεξ πμο θαιαάκμοκ πχνα ζημ εδαθζηυ μζημζφζηδια α) ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ μνβακζηή μοζία ημο εδάθμοξ, ηζξ θοζζηέξ ζδζυηδηεξ ημο εδάθμοξ, ηδ ιζηνμαζαηή δναζηδνζυηδηα ηαζ ηδ αζμιάγα, α) ακηαπμηνίκμκηαζ ηαπέςξ ζε αθθαβέξ πμο μθείθμκηαζ ζε πενζααθθμκηζημφξ πανάβμκηεξ, αθθά ηαζ ζε ακενχπζκεξ πανειαάζεζξ ηαζ β) ιεηνχκηαζ ιε ζπεηζηή εοημθία (Das and Varma, 2011, Martinez- Salgado et al., 2010, Colombo et al., 2002, Drijber et al., 2000, Calderon et al., 2000, Gianfreda and Bollag, 1996). οκεπχξ, δ εκγοιζηή δναζηζηυηδηα ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί ςξ δείηηδξ ηδξ δναζηδνζυηδηαξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ, ηδξ ιζηνμαζαηήξ πμζηζθυηδηαξ, ηδξ παναβςβζηυηδηαξ ημο εδάθμοξ αθθά ηαζ ηςκ ανκδηζηχκ επζδνάζεςκ δζαθυνςκ παναβυκηςκ νφπακζδξ (Winding et al., 2005). ήιενα, οπάνπμοκ δζάθμνεξ δζαεέζζιεξ ηεπκζηέξ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ εκγφιςκ ζημ έδαθμξ. Ζ ιέηνδζδ ηςκ εκγφιςκ ααζίγεηαζ ζοκήεςξ ζηδκ πνμζεήηδ, εκυξ ηεπκδημφ, δζαθοημφ οπμζηνχιαημξ, ζε ηέημζα ζοβηέκηνςζδ χζηε μ νοειυξ ηδξ ακηίδναζδξ παναβςβήξ ηςκ πνμσυκηςκ κα είκαζ ακάθμβμξ ιε ηδ ζοβηέκηνςζδ ημο εκγφιμο (ηζκδηζηή ακηίδναζδξ πνχηδξ ηάλδξ). Αημθμοεεί επχαζδ βζα μνζζιέκμ πνμκζηυ δζάζηδια ηαζ ιέηνδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ πνμσυκηςκ ηδξ ακηίδναζδξ. Μεβάθεξ πενίμδμζ επχαζδξ πνέπεζ κα απμθεφβμκηαζ βζα κα ιδκ παναηδνείηαζ έθθεζρδ οπμζηνχιαημξ ηαζ κα πενζμνίγεηαζ δ ιζηνμαζαηή αφλδζδ (Winding et al., 2005). Ζ δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ δναζηδνζυηδηαξ, υπςξ αοηή εηηζιάηαζ ιε αάζδ ιεηααμθέξ ζηα επίπεδα εκγφιςκ πμο ειπθέημκηαζ ζε ζδιακηζηέξ θεζημονβίεξ, πνδζζιμπμζείηαζ ςξ ιέηνμ εηηίιδζδξ ηδξ δζαηαναπήξ ηδξ θεζημονβίαξ εκυξ μζημζοζηήιαημξ. Χζηυζμ, δ πνήζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ εκγφιςκ ςξ ιέηνμ εηηίιδζδξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ θεζημονβίαξ εα πνέπεζ κα βίκεηαζ ιε πνμζμπή ηαζ βκςνίγμκηαξ ημοξ πενζμνζζιμφξ πμο έπμοκ αοηέξ μζ ιεηνήζεζξ υπςξ υηζ μζ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ οπμζηνςιάηςκ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ είκαζ πμθφ ορδθυηενεξ απυ ηζξ in situ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ θοζζηχκ οπμζηνςιάηςκ (Winding et al., 2005). Δπίζδξ, δ δναζηζηυηδηα ηςκ έκγοιςκ ημο εδάθμοξ δεκ είκαζ πάκηα εκδεζηηζηή ηδξ ζοκμθζηήξ ιζηνμαζαηήξ δναζηδνζυηδηαξ αθμφ ζηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ ηα 77

78 έκγοια πανμοζζάγμοκ ορδθή ελεζδίηεοζδ ηυζμ οπμζηνχιαημξ, υζμ ηαζ ςξ πνμξ ηζξ ακηζδνάζεζξ πμο ηαηαθφμοκ (Chowdhury et al., 2008, Nannipieri et al., 1990, Tabatabai 1994). Όμηλεο θαη αιθαιηθέο θσζθαηάζεο Οζ θςζθαηάζεξ είκαζ ιζα μιάδα εκγφιςκ πμο ηαηαθφμοκ ηδκ οδνυθοζδ ηςκ εζηένςκ ηαζ ηςκ ακοδνζηχκ ημο θςζθμνζημφ μλέμξ (Ζ 3 ΡΟ 4 ) πνμξ ακυνβακα θςζθμνζηά ζυκηα (Martinez-Salgado et al., 2010, Rahmansyah et al., 2009, Tabatabai, 1994). Γζαηνίκμκηαζ ζε υλζκεξ ηαζ αθηαθζηέξ θςζθαηάζεξ ελαζηίαξ ηδξ αέθηζζηδξ δναζηζηυηδηαξ πμο πανμοζζάγμοκ ζε υλζκμ ηαζ αθηαθζηυ πενζαάθθμκ, ακηίζημζπα. Δπεζδή, ηα ακχηενα θοηά ζηενμφκηαζ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ, δ δναζηζηυηδηα ηςκ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ ιπμνεί κα απμδμεεί απμηθεζζηζηά ζημοξ ιζηνμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ (Tabatabai, 1994). Οζ υλζκεξ ηαζ αθηαθζηέξ θςζθαηάζεξ οδνμθφμοκ ηονίςξ ημοξ εζηενζημφξ δεζιμφξ ιεηαλφ Ρ ηαζ C (C-O-P) ζηδκ μνβακζηή φθδ ημο εδάθμοξ. Καηά ηδκ πναβιαημπμίδζδ ηδξ δζαδζηαζίαξ αοηήξ, εθεοεενχκεηαζ ακυνβακμξ Ρ απυ απμεειαηζηέξ πδβέξ δεζιεοιέκμο μνβακζημφ Ρ, υπςξ θοηζηά οπμθείιιαηα θφθθςκ ηαζ νζγχκ, ηαζ άθθα μνβακζηά οπμθείιιαηα πςνίξ αηυθμοεδ εθεοεένςζδ C. Οζ θςζθαηάζεξ ζοιιεηέπμοκ ζηδκ ιεηαηνμπή ημο μνβακζημφ θςζθυνμο ζε ακυνβακμ ηαζ ζηδκ πανμπή οδαημδζαθοηχκ θςζθμνζηχκ ζυκηςκ ζημοξ θοηζημφξ μνβακζζιμφξ ηαζ ςξ εη ημφημο, δζαδναιαηίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζημκ ηφηθμ ημο Ρ ζημ έδαθμξ (Rahmansyah et al., 2009, Tabatabai 1994). Ζ πζμ ζοπκά πνδζζιμπμζμφιεκδ ιέεμδμξ οπμθμβζζιμφ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ υλζκςκ ηαζ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ πενζθαιαάκεζ ηδκ εκζςιάηςζδ ζημ έδαθμξ ηαηάθθδθμο οπμζηνχιαημξ ακηίδναζδξ (θςζθμνζηή π-κζηνμθαζκυθδ) υπμο πανμοζία θςζθαηαζχκ αημθμοεεί οδνυθοζδ ημο θςζθμεζηενζημφ δεζιμφ ημο οπμζηνχιαημξ ηαζ ζοζζχνεοζδ π-κζηνμθαζκμθδξ δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ μπμίαξ πνμζδζμνίγεηαζ θςημιεηνζηά (Tabatabai, 1994). β-γιπθνζηδάζεο. Οζ βθοημζζδάζεξ είκαζ ιζα μιάδα εκγφιςκ πμο απακηχκηαζ ζε υθμοξ ημοξ μνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ (ιζηνμμνβακζζιμφξ, θοηά ηαζ γχα) ηαζ ηαηαθφμοκ ηδκ οδνυθοζδ δζαθυνςκ βθοημγζηχκ. Ακάιεζα ημοξ λεπςνίγμοκ μζ α- βθοημζζδάζεξ ηαζ α-βθοημζζδάζεξ πμο ηαηαθφμοκ ηδκ οδνυθοζδ ηςκ α-dβθοημπονακμγζηχκ (α-d-glucopyranosides) ηαζ α-d-βθοημπονακμγζηχκ (α-dglucopyranosides), ακηίζημζπα. Αθθά ηαζ μζ α-βαθαηημζζδάζδ ηαζ α-βαθαηημζζδάζδ 78

79 πμο ηαηαθφμοκ ηδκ οδνυθοζδ ηδξ ιεθζαζυγδξ ηαζ ηδξ θαηηυγδξ, ακηίζημζπα. Γεκζηά, είκαζ οπεφεοκεξ βζα ημκ απμπμθοιενζζιυ πμθοζαηπανζηζηχκ αθοζίδςκ πμο πενζέπμκηαζ ζε θοζζηά πμθοιενή ηαζ δ απμδυιδζή ημοξ έπεζ ζδζαίηενδ ζδιαζία βζα ηα εδαθζηά μζημζοζηήιαηα ηαεχξ ιέζς αοηήξ ηδξ δζαδζηαζίαξ πανέπεηαζ μ απαναίηδημξ άκεναηαξ βζα ημοξ μνβακζζιμφξ (Tabatabai,1994). Απυ αοηέξ, λεπςνίγμοκ μζ α-βθοημζζδάζεξ πμο ηονζανπμφκ ζηα εδαθζηά μζημζοζηήιαηα ηαζ πανάβμκηαζ απυ ιφηδηεξ, γφιεξ ηαζ θοηά. Σα πνμσυκηα ηδξ οδνυθοζδξ ηςκ α-βθοημζζδαζχκ απμηεθμφκ ζδιακηζηέξ πδβέξ εκένβεζαξ (άκεναηα) βζα ημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. οβηεηνζιέκα, ζοιιεηέπμοκ ςξ ηαηαθφηεξ ζηδκ ακηίδναζδ δζάζπαζδξ ηδξ ηοηηανίκδξ, εθεοεενχκμκηαξ βθοηυγδ ζακ πδβή εκένβεζαξ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ ιεηααμθζηά εκενβήξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ ημο εδάθμοξ (Tabatabai,1994, Martinez-Salgado et al., 2010). Οζ Eivazi ηαζ Tabatabai (1988) ακέπηολακ ιζα βνήβμνδ ηαζ απθή ιέεμδμ πνμζδζμνζζιμφ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηδξ α-βθοημζζδάζδξ. Ζ ανπή ηδξ ιεευδμο είκαζ ίδζα ιε αοηή βζα ηζξ υλζκεξ ηαζ αθηαθζηέξ θςζθαηάζεξ. Βαζίγεηαζ ζημκ θςημιεηνζηυ πνμζδζμνζζιυ ημο πνμσυκημξ (π-κζηνμθαζκμθδ) πμο απεθεοεενχκεηαζ απυ ηδ δνάζδ ηςκ α-βθοημζζδάζχκ, υηακ δείβια εδάθμοξ επςαζηεί ιε ημ ηαηάθθδθμ οπυζηνςια (π-κζηνμθαζκοθμ- α-d-βθμοημζίδζμ). Τδξνιπηηθή δξαζηηθόηεηα ηεο Γηαθεηπιν-θινπνξνζθεΐλεο (Fluorescein diacetate Hydrolyzing Activity, FDΖA). H οδνμθοηζηή δναζηζηυηδηα ηδξ 3,6- δζαηεηοθμ-θθμομνμζηεΐκδξ (3',6'-diacetylfluorescein hydrolyzing activity, FDHA) εεςνείηαζ πνήζζιμ ενβαθείμ βζα ηδκ άιεζδ εηηίιδζδ ηςκ ανκδηζηχκ επζδνάζεςκ ηςκ β.θ. ζηδκ θεζημονβία ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ. Δίκαζ ιζα ιέεμδμξ βνήβμνδ ηαζ εοαίζεδηδ, πμο πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ βεκζηυηενδξ οδνμθοηζηήξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ ζε δείβιαηα εδάθμοξ (Chowdhury et al., 2008, Schnurer and Rosswall, 1982). H 3,6-δζαηέηοθμ-θθμομνμζηεΐκδ οδνμθφεηαζ απυ έκακ ανζειυ δζαθμνεηζηχκ οδνμθοηζηχκ εκγφιςκ, υπςξ πνςηεάζεξ, θζπάζεξ ηαζ εζηενάζεξ (Guilbault and Kramer, 1964, Rotman and Papermaster, 1966), ηα μπμία ιπμνεί κα είκαζ είηε εθεφεενα (ελςέκγοια), είηε ζοκδεδειέκα ιε ηζξ ιειανάκεξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ (Stubberfield and Shaw, 1990). H 3,6-δζαηέηοθμ-θθμομνμζηεΐκδ ηαηυπζκ εκγοιζηήξ ιεηαηνμπήξ (οδνυθοζδ) ιεηαηνέπεηαζ ζε θθμομνμζηεΐκδ πμο είκαζ ημ θεμνίγςκ πνμσυκ ηδξ ακηίδναζδξ. Ζ ζοβηέκηνςζή ηδξ θθμομνμζηεΐκδξ ιπμνεί κα 79

80 πνμζδζμνζζηεί ιέζς θεμνζζιμιεηνίαξ, θαζιαημθςημιεηνίαξ (490nm) ηαζ άθθςκ ηεπκζηχκ (Chowdhury et al., 2008, Pal et al., 2006, Schnurer and Rosswall, 1982) Πξνζδηνξηζκόο κηθξνβηαθώλ δηεξγαζηώλ ζην έδαθνο Μηθξνβηαθή αλαπλνή. Χξ ιζηνμαζαηή ακαπκμή, παναηηδνίγεηαζ δ ηαηακάθςζδ μλοβυκμο ή δ παναβςβή CO 2 απυ ημοξ ιεηααμθζηά εκενβμφξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. Δίκαζ ιζα απυ ηζξ παθαζυηενεξ ηαζ πζμ ζοπκά πνδζζιμπμζμφιεκεξ ιεευδμοξ βζα ηδ πμζμηζημπμίδζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ δναζηδνζυηδηαξ ζημ έδαθμξ. Δηηζιάηαζ είηε ιε ηδ ιέηνδζδ ημο παναβυιεκμο CO 2, είηε ιε ηδ ιέηνδζδ ηδξ ηαηακάθςζδξ O 2, ή ηαζ ηςκ δφμ. Ζ ακαπκμή ιεθεηάηαζ ηυζμ ζε εδάθδ υπμο έπεζ βίκεζ πνμζεήηδ μνβακζηχκ εδαθμαεθηζςηζηχκ (amended soils) υζμ ηαζ ζε εδάθδ πμο δεκ δέπμκηαζ ακάθμβεξ πνμζεήηεξ (unamended soils). Ζ ακαπκμή ζηδκ πνχηδ πενίπηςζδ (amended soils) μνίγεηαζ ςξ ακαπκμή οπμζηνχιαημξ (substrate induced), εκχ ζηδ δεφηενδ πενίπηςζδ (unamended soils) ςξ ααζζηή ακαπκμή (basal respiration). Ζ ααζζηή ακαπκμή ακηακαηθά ηδ ζοκμθζηή πζεακή ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα, εκχ δ ακαπκμή οπμζηνχιαημξ είκαζ δείηηδξ ηδξ ιεηααμθζηά εκενβήξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ (Pal et al., 2006). Ζ εδαθζηή ακαπκμή, επδνεάγεηαζ ζδιακηζηά απυ ηδ εενιμηναζία, ηδκ εδαθζηή οβναζία, ηδ δζαεεζζιυηδηα ζε ενεπηζηά ζημζπεία ηαζ ηδ δμιή ημο εδάθμοξ. Γζα ημ θυβμ αοηυ, ζπάκζα εθανιυγμκηαζ ιεηνήζεζξ εδαθζηήξ ακαπκμήξ ζημκ αβνυ, ακ ηαζ ακάθμβεξ ιεηνήζεζξ ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα ζοβηνίζεζξ ιεηαλφ δζαθμνεηζηχκ ηαθθζενβδηζηχκ πναηηζηχκ. Ζ ζηαεενμπμίδζδ ηςκ ζοκεδηχκ ημο εδάθμοξ πνζκ ηδ ιέηνδζδ ηδξ εδαθζηήξ ακαπκμήξ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ εθαπζζημπμίδζδ ηδξ επίδναζδξ ηςκ ηθζιαηζηχκ ιεηααθδηχκ. Ζ ιζηνμαζαηή ακαπκμή απμηεθεί δείηηδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ δναζηδνζυηδηαξ ημο εδάθμοξ ηαζ ηδξ θεζημονβζηυηδηαξ ηςκ ιζηνμαζαηχκ εδαθζηχκ ημζκμηήηςκ ηαζ έπεζ πνδζζιμπμζδεεί βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ ημλζηυηδηαξ β.θ. ηαζ αανέςκ ιεηάθθςκ (Chowdhury et al.,2008, Pal et al., 2006, Winding et al., 2005). Ρπζκόο Γπλεηηθήο Νηηξνπνίεζεο. Χξ νοειυξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ (potential nitrification rate) ακαθένεηαζ μ ιέβζζημξ νοειυξ ιεηαηνμπήξ ηςκ ηαηζυκηςκ αιιςκίμο (ΝΖ + 4 ) ή ηδξ αιιςκίαξ (ΝΖ 3 ) ζε κζηνχδδ (ΝΟ - 2 ) ζυκηα πμο ζοιααίκεζ οπυ ζοκεήηεξ ημνεζιμφ υζμκ αθμνά ηδκ πανμπή οπμζηνχιαημξ (ΝΖ + 4 /ΝΖ 3 ) (Hart et al., 1994). Ο οπμθμβζζιυξ ημο νοειμφ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ααζίγεηαζ ζηδ νοειυ- 80

81 ηαεμνζζηζηή (rate-limiting) ακηίδναζδ ηδξ μλείδςζδξ ηδξ αιιςκίαξ. οβηεηνζιέκα, δείβια εδάθμοξ επςάγεηαζ ιε πενίζζεζα αιιςκζαημφ οπμζηνχιαημξ ηαζ οπμπθςνζμφπςκ αθάηςκ πμο πνδζζιεφμοκ βζα ηδκ πανειπυδζζδ ηδξ πεναζηένς μλείδςζδξ ηςκ κζηνςδχκ ζε κζηνζηά ζυκηα. Έπεζηα απυ επχαζδ ιενζηχκ ςνχκ, μ νοειυξ μλείδςζδξ ηδξ αιιςκίαξ ζε κζηνχδδ ζυκηα οπμθμβίγεηαζ θςημιεηνζηά ή ιε αένζα πνςιαημβναθία. Σα κζηνχδδ ζυκηα πνδζζιμπμζμφκηαζ ςξ ηεθζηυ ζδιείμ ακαθμνάξ ακ ηαζ απμηεθμφκ μοζζαζηζηά εκδζάιεζμ πνμσυκ ηδξ κζηνμπμίδζδξ ηαζ απακηχκηαζ ιυκμ ζε ηεπκζηέξ πμο ειπενζέπμοκ αζχνδζδ ηαζ ζε αζαεζημθζεζηά εδάθδ. Ζ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ ακηακαηθά ημ ιέβεεμξ ημο πθδεοζιμφ ηςκ αοηυηνμθςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ μνβακζζιχκ βζα ημοξ μπμίμοξ δ αιιςκία είκαζ απαναίηδημ οπυζηνςια ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ εονέςξ βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ ημλζηχκ επζδνάζεςκ αανέςκ ιεηάθθςκ, πμθοηοηθζηχκ ανςιαηζηχκ οδνμβμκακενάηςκ ηαζ β.θ. ζημοξ κζηνςδμπμζδηζημφξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ (Maliszewska-Kordybach et al., 2007, Winding et al., 2005, Smolders et al., 2001) Δπηδξάζεηο γ.θ. ζηελ κηθξνβηαθή θνηλόηεηα ηνπ εδάθνπο Δπηδξάζεηο ζπλζεηηθώλ γ.θ.. ζηε κηθξνβηαθή θνηλόηεηα ηνπ εδάθνπο Ζ εηηίιδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ. ζηα εδαθζηά μζημζοζηήιαηα είκαζ πμθφπθμηδ δζαδζηαζία ηαεχξ πενζθαιαάκεζ ζφκεεηεξ αθθδθεπζδνάζεζξ ακάιεζα ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ ηαζ ζημ ααζμηζηυ εδαθζηυ πενζαάθθμκ αθθά ηαζ ιδπακζζιμφξ ηαζ δζαδζηαζίεξ πμο δεκ είκαζ πθήνςξ ηαηακμδηέξ (Imfeld and Vuilleumier, 2012, Hussain et al., 2009, Nortcliff, 2002). Ονζζιέκεξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ πνδζζιμπμζμφκ ηα β.θ. ςξ πδβή εκένβεζαξ ηαζ ενεπηζηχκ ζοζηαηζηχκ βζα ηδκ αφλδζδ ηαζ ακάπηολδ ημοξ, εκχ μζ ίδζεξ μοζίεξ ιπμνεί κα είκαζ ημλζηέξ βζα άθθεξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ. Δπίζδξ δ εθανιμβή β. θ. είκαζ δοκαηυκ κα πνμηαθέζεζ πανμδζηέξ δζεβενηζηέξ ή ακαζηαθηζηέξ, επζδνάζεζξ ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ πμο ελμιαθφκμκηαζ ηεθζηά ζε αάεμξ πνυκμο. Κάπμζεξ θμνέξ, δ εθανιμβή β.θ. ιπμνεί κα μδδβήζεζ ζε ιείςζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ πμζηζθυηδηαξ, ακαζηέθθμκηαξ ηδ δνάζδ ή εακαηχκμκηαξ ζοβηεηνζιέκεξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ, αθθά ηαζ ζε ηαοηυπνμκδ αφλδζδ ηδξ θεζημονβζηήξ πμζηζθυηδηαξ ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ εκζζπφμκηαξ ανζειδηζηά άθθεξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ ιε ηδκ απεθεοεένςζή ημοξ απυ ημκ ακηαβςκζζιυ (Hussain et al., 2009). 81

82 διακηζηυξ ανζειυξ ιεθεηχκ έπεζ αζπμθδεεί ςξ ζήιενα ιε ηδκ αλζμθυβδζδ ηςκ επζδνάζεςκ ηςκ ζοκεεηζηχκ β.θ. ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Χζηυζμ, δ πθεζμρδθία ηςκ παναπάκς ιεθεηχκ έπεζ πναβιαημπμζδεεί ζε επίπεδμ ιζηνμηυζιςκ πμο υπςξ είκαζ βκςζηυ απέπεζ πμθφ απυ ηα νεαθζζηζηά επίπεδα έηεεζδξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζε επίπεδμ πεδίμο. Σα απμηεθέζιαηα ηςκ πενζζζμηένςκ απυ αοηέξ ηζξ ιεθέηεξ δείπκμοκ υηζ μζ επζδνάζεζξ ζηδ δμιή ηαζ ηδ θεζημονβία ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ πμο πνμηαθεί δ εθανιμβή ηδξ ζοκζζηχιεκδξ δυζδξ ζοκεεηζηχκ β.θ. είκαζ αζήιακηεξ ή πανμδζηέξ (Imfeld and Vuilleumier, 2012, Loet al., 2010). Παναηάης δίκεηαζ ιζα ζοκμπηζηή πανμοζίαζδ απμηεθεζιάηςκ απυ ιεθέηεξ αλζμθυβδζδξ ηςκ επζδνάζεςκ δζαθυνςκ μιάδςκ ζοκεεηζηχκ β.θ. ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Οζ Xinyu et al., (2008), ιεθέηδζακ ζε επίπεδμ ιζηνμηυζιςκ ηδκ επίδναζδ ημο γζγακζμηηυκμο acetochlor ζηδκ πμζηζθυηδηα ηαζ ηδ ζφκεεζδ ηςκ ημζκμηήηςκ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ααηηδνίςκ (ΑΟΒ) ημο εδάθμοξ, ζε 3 δζαθμνεηζηά επίπεδα επζαάνοκζδξ (50, 150, 250 mgkg -1 ). Ζ ζοκμθζηή δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ ήηακ 60 διένεξ. Ζ ακάθοζδ ηςκ δεζβιάηςκ έβζκε ιε PCR-DGGE ηαζ αηυθμοεδ θοθμβεκεηζηή ηαοημπμίδζδ επζθεβιέκςκ γςκχκ ιε ελαβςβή DNA απυ ηδκ πδηηή αηνοθαιίδδξ. Σα απμηεθέζιαηα έδεζλακ υηζ δ επίδναζδ ημο acetochlor ηζξ πνχηεξ διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ημο ήηακ εεηζηή, ηαζ μ ααειυξ ηδξ έκηαζδξ ηαζ ηδξ δζάνηεζαξ ηδξ επίδναζδξ ζπεηζγυηακ ιε ημ επίπεδμ ηδξ δυζδξ [ιεζαίμ (150mg/kg) > παιδθυ (50mg/kg) > ορδθυ (250mg/kg)]. Χζηυζμ, ζημ ηέθμξ ημο πεζνάιαημξ (60 διένεξ), ημ acetochlor είπε ανκδηζηή επίδναζδ ζηδκ πμζηζθυηδηα ηςκ ΑΟΒ. ε ηάεε πενίπηςζδ δ επίδναζδ ημο acetochlor ήηακ πζμ έκημκδ ηδκ 60 δ ζοβηνζηζηά ιε ηδκ 1 δ διένα. Απυ ηδκ θοθμβεκεηζηή ακάθοζδ πνμέηορε υηζ υθεξ μζ γχκεξ άκδηακ ζε είδδ ημο βέκμοξ Nitrosospira. φιθςκα ιε ηα παναπάκς απμηεθέζιαηα, μζ ζοββναθείξ ζοιπένακακ υηζ ημ acetochlor είπε ανκδηζηή επίδναζδ ζημοξ πθδεοζιμφξ ηςκ ΑΟΒ ζε ιαηνμπνυεεζιδ αάζδ ηαζ δ πνυκζα ημλζηυηδηα ημο πνέπεζ κα ιεθεηδεεί πεναζηένς. Οζ Omar ηαζ Abdel-Sater, (2001), ιεθέηδζακ ηδκ επίδναζδ ημο γζγακζμηηυκμο brominal ηαζ ημο ιοηδημηηυκμο selecron, ζε δυζεζξ 1x ηαζ 5x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ, ζηδ δναζηζηυηδηα ηςκ υλζκςκ ηαζ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ, ζε πείναια ενβαζηδνίμο ζοκμθζηήξ δζάνηεζαξ 10 εαδμιάδςκ. Απυ ηα απμηεθέζιαηα πνμέηορε υηζ ηαζ ηα δφμ β.θ. επδνέαζακ εεηζηά ηδ δναζηζηυηδηα ηςκ υλζκςκ θςζθαηαζχκ υηακ εθανιυζηδηακ ζηδ ζοκζζηχιεκδ δυζδ ηαζ ανκδηζηά υηακ εθανιυζηδηακ ζε δυζδ 5x 82

83 ηδξ ζοκζζηχιεκδξ. Ακηίεεηα, δ δναζηζηυηδηα ηςκ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ εοκμήεδηε απυ ηδκ εθανιμβή ηαζ ηςκ δφμ β.θ.. ηαζ ζηα δφμ επίπεδα δυζδξ. Οζ Javorekova et al., (2010), ελέηαζακ ηδκ επίδναζδ ημο ιοηδημηηυκμο benomyl ηαζ ημο γζγακζμηηυκμο prometryn ζηδκ ιζηνμαζαηή ακαπκμή ηαζ ηδ δμιή ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ ιε ηδ ιέεμδμ PLFAs. Καζ ηα δφμ β.θ. μδήβδζακ ζε αφλδζδ ηςκ επζπέδςκ ημο παναβυιεκμο CO 2 ηαηά ηζξ 21 πνχηεξ διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή, εκχ δ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs άθθαλε ζδιακηζηά ιεηά ηδκ εθανιμβή ηςκ β.θ.. οβηεηνζιέκα, ζηδκ πενίπηςζδ ημο prometryn επδνεάζηδηακ ζδιακηζηά μζ πθδεοζιμί ηςκ ααηηδνίςκ βεκζηά ηαζ εζδζηά ηςκ εεηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ ηαζ ηςκ αηηζκμααηηδνίςκ, εκχ ζηδκ πενίπηςζδ ημο benomyl επδνεάζηδηακ ζδιακηζηά μζ πθδεοζιμί ηςκ ααηηδνίςκ, ιοηήηςκ ηαζ αηηζκμααηηδνίςκ. Οζ Demanou et al., (2006), ενεφκδζακ θεπημιενχξ ηδκ επίδναζδ ηδξ ζοκδοαζιέκδξ εθανιμβήξ ημο ζοκεεηζημφ μνβακζημφ ιοηδημηηυκμο mefenoxam (4 mgkg -1 ) ηαζ παθημφ, ζηδ δμιή ηαζ ηδ θεζημονβία ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ, ζε πείναια ενβαζηδνίμο δζάνηεζαξ 60 διενχκ. Γζα ημκ ζημπυ αοηυ πνδζζιμπμζήεδηε δ ιέεμδμξ DGGE βζα ηδκ ακάθοζδ ηςκ PCR πνμσυκηςκ εκίζποζδξ ηςκ 16S ηαζ 18S rrna βμκζδίςκ ηαζ ιεηαβνάθςκ. Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ επίδναζδξ ζηδ θεζημονβία ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ιεθεηήεδηακ μζ δναζηζηυηδηεξ δζαθυνςκ εκγφιςκ υπςξ ηςκ θςζθαηαζχκ, ηδξ α-βθοημζζδάζδξ, ηδξ θαηάζδξ ηαζ ηδξ πζηζκάζδξ. Απυ ηα απμηεθέζιαηα πνμέηορε υηζ δ ζοκδοαζιέκδ εθανιμβή mefenoxam ηαζ παθημφ είπε ανκδηζηή επίδναζδ ζημοξ ιφηδηεξ ημο εδάθμοξ. ε ακηίεεζδ, μζ εκενβμί πθδεοζιμί ηςκ ααηηδνίςκ δεκ επδνεάζηδηακ ανκδηζηά. Οζ δναζηζηυηδηεξ ηςκ εκγφιςκ θαηάζδ ηαζ πζηζκάζδ αολήεδηακ ζδιακηζηά, επίδναζδ πμο πανέιεζκε ζηαεενή ςξ ημ ηέθμξ ημο πεζνάιαημξ, εκχ μζ θςζθαηάζεξ ηαζ μζ α- βθοημζζδάζεξ δεκ επδνεάζηδηακ. Οζ Bending et al., (2007), ιεθέηδζακ ηδκ επίδναζδ ηςκ ιοηδημηηυκςκ azoxystrobin, tebuconazole ηαζ chlorothalonil (ζε ζοβηεκηνχζεζξ ίζεξ ιε ηδ ιέβζζηδ ζοκζζηχιεκδ) ζηζξ ιζηνμαζαηέξ ημζκυηδηεξ εδαθχκ ιε πανυιμζα πδιζηά παναηηδνζζηζηά αθθά δζαθμνεηζηχκ ςξ πνμξ ημοξ ιζηνμαζαημφξ πθδεοζιμφξ ηαζ ηδκ πενζεπυιεκδ μνβακζηή μοζία, ελαζηίαξ δζαθμνεηζημφ ζζημνζημφ πναηηζηχκ δζαπείνζζδξ. PCR-DGGE ακάθοζδ ηςκ 16SrRNA ηαζ 18SrRNA βμκζδίςκ απυ ααηηήνζα ηαζ εοηανοςηζημφξ ιζηνμμνβακζζιμφξ έδεζλε υηζ ηακέκα απυ ηα ιοηδημηηυκα δεκ επδνέαζε ηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααηηδνίςκ, εκχ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ εοηανοςηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ έκαξ ιζηνυξ ανζειυξ γςκχκ 83

84 απμοζίαγε ζηζξ ιεηαπεζνίζεζξ ιε ζοβηεηνζιέκα ιοηδημηηυκα, ιε ηάεε γχκδ κα ζπεηίγεηαζ εζδζηά ιε ζοβηεηνζιέκμ ιοηδημηηυκμ ηαζ ζοβηεηνζιέκμ έδαθμξ. Αηυθμοεδ αθθδθμφπζζδ απμηάθορε υηζ μζ γχκεξ αοηέξ ακηζζημζπμφζακ ζε ιφηδηεξ ηαζ πνςηυγςα. Οζ Cernohlavkova et al., (2009), ελέηαζακ ηδκ επίδναζδ ηςκ ιοηδημηηυκςκ mancozeb ηαζ dinocap ζηδκ ακμνβακμπμίδζδ C (ααζζηή ακαπκμή ηαζ ακαπκμή οπμζηνχιαημξ) ηαζ Ν (δοκδηζηή αιιςκζμπμίδζδ ηαζ κζηνμπμίδζδ). Σα ιοηδημηηυκα εθανιυζηδηακ ζε δυζεζξ 1x ηαζ 10x ηδ ζοκζζηχιεκδξ, ζε δφμ δζαθμνεηζηά εδάθδ, έκα ηαθθζενβμφιεκμ (arable) ηαζ έκα ιδ ηαθθζενβμφιεκμ (grassland) ηαζ μζ επζδνάζεζξ ημοξ πνμζδζμνίζηδηακ 1 ηαζ 14 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή. Σδκ 14 δ διένα δ αιιςκζμπμίδζδ ζηδκ πενίπηςζδ ημο dinocap ιεζχεδηε ζημ 48% ηαζ 83% ζημ ηαθθζενβμφιεκμ ηαζ ζημ ιδ ηαθθζενβμφιεκμ έδαθμξ, ακηίζημζπα. To mancozeb πνμηάθεζε ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ κζηνμπμίδζδξ ζημ 11.2% ηαζ 5.6% ζημ ηαθθζενβμφιεκμ ηαζ ζημ ιδ ηαθθζενβμφιεκμ έδαθμξ, ακηίζημζπα. Ακηίεεηα, δ ακαπκμή (ααζζηή ακαπκμή ηαζ ακαπκμή οπμζηνχιαημξ) θαίκεηαζ κα εοκμήεδηε εζδζηά ζηδ παιδθή δυζδ εθανιμβήξ. Οζ Munoz-Leoz et al., (2011), ζε πείναια ενβαζηδνίμο δζάνηεζαξ 90 διενχκ, ζοιπένακακ υηζ ημ ιοηδημηηυκμ tebuconazole (3 δυζεζξ εθανιμβήξ: 5, 50, 500 mgkg -1 λδνμφ αάνμοξ εδάθμοξ) επδνέαζε ανκδηζηά ηδκ ααζζηή ακαπκμή, ηδκ ακαπκμή οπμζηνχιαημξ ηδ ιζηνμαζαηή αζμιάγα C ηαζ ηζξ δναζηζηυηδηεξ ηςκ εκγφιςκ μονεάζδ, ανοθζμοθθαηάζδ, θςζθαηάζεξ, α-βθοημζζδάζδ ηαζ αθοδνμβμκάζδ. Ο νοειυξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ επίζδξ επδνεάζηδηε ανκδηζηά αθθά ιυκμ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηςκ 30 πνχηςκ διενχκ. Οζ Puglisi et al., (2012), ιεθέηδζακ ζε επίπεδμ ιζηνμηυζιςκ, ηδκ επίδναζδ πμο αζημφκ ηα ιοηδημηηυκα penconazole ηαζ cyprodinil, πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζοπκά ζηδκ ηαθθζένβεζα αιπεθζμφ, ζηδ δμιή ηαζ ηδ θεζημονβία ηςκ ζοκμθζηά εκενβχκ κζηνςδςπμζδηζηχκ ααηηδνίςκ ηαζ ανπαίςκ (ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ) ζε ζηνχια μνβακζηχκ οπμθεζιιάηςκ πμο ηάθοπηε ημ επζθακεζαηυ έδαθμξ. Οζ ιεηααμθέξ ζηδ θεζημονβία ημοξ εηηζιήεδηακ ιε ημ νοειυ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ηαζ μζ δμιζηέξ αθθαβέξ ιε DGGE, ζε επίπεδμ DNA ηαζ RNA. Σα ιοηδημηηυκα πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ζηζξ ημζκυηδηεξ ηςκ AOB ηαζ AOA ιε πζμ έκημκεξ ιεηααμθέξ ζηδ ζφζηαζδ ηςκ ημζκμηήηςκ ηςκ ΑΟΑ. Ο νοειυξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ πανμοζίαζε ζδιακηζηή ιείςζδ ηαηά ηζξ πνχηεξ διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ηαζ υζμ μζ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ δφμ ιοηδημηηυκςκ ζημ έδαθμξ πανέιεζκακ ζε ορδθά επίπεδα ηαζ επακήθεε υηακ είπε 84

85 επέθεεζ ζδιακηζηή δζάζπαζδ ηςκ δφμ ιοηδημηηυκςκ ζημ οπυζηνςια. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, μζ ιεηααμθέξ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ δεκ ήηακ ακάθμβεξ ιε αοηέξ πμο παναηδνήεδηακ ζε δμιζηυ επίπεδμ ηαζ απμηαηαζηάεδηακ βνδβμνυηενα ζε ζπέζδ ιε ηζξ αθθαβέξ ζηδ δμιή πμο πανέιεζκακ μναηέξ βζα ιεβαθφηενμ πνμκζηυ δζάζηδια. Οζ Yao et al., (2006), ελέηαζακ ηζξ επζδνάζεζξ ημο κεμκζημηζκμεζδμφξ εκημιμηηυκμο acetamiprid, ζηδκ εδαθζηή ιζηνμαζαηή ακαπκμή ηαζ ζηδ δναζηζηυηδηα ηςκ θςζθαηαζχκ ηαζ άθθςκ εκγφιςκ (αθοδνμβμκάζδ, ηαηαθάζδ) ζε δυζεζξ ίζεξ ιε ηδ ζοκζζηχιεκδ (0.5 mgkg -1 λδνμφ αάνμοξ εδάθμοξ) αθθά ηαζ ορδθυηενεξ (10x ηαζ 100x ηδ ζοκζζηχιεκδ) ηαζ ζε πνμκζηά δζαζηήιαηα 7, 14, 21, 28, 35 ηαζ 50 διένεξ. Απυ ηα απμηεθέζιαηα πνμηφπηεζ υηζ υηακ ημ acetamiprid εθανιυζηδηε ζε ορδθέξ δυζεζξ πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ανκδηζηέξ επζδνάζεζξ ζηδκ εδαθζηή ακαπκμή ηαζ ηζξ δναζηζηυηδηεξ επζθεβιέκςκ εκγφιςκ ζε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ, εκχ υηακ εθανιυζηδηε ζηδ ζοκζζηχιεκδ δυζδ δεκ πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ακάθμβεξ ιεηααμθέξ. Οζ Das et al., (2007) ζοιπένακακ υηζ ημ novaluron, νοειζζηήξ ακάπηολδξ εκηυιςκ ηδξ μιάδαξ ηςκ αεκγμτθ-θαζκοθ-μονζχκ, υηακ εθανιυγεηαζ ζε δυζεζξ ιέπνζ ηαζ 10x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ (1x, 2x, 10x) πανμοζζάγεζ ιζα πανμδζηή ημλζηή επίδναζδ ζηδ ιζηνμαζαηή αζμιάγα ημο εδάθμοξ, ηδκ οδνμθοηζηή δναζηζηυηδηα ηδξ 3,6-δζαηεηοθμθθμομνμζηεΐκδξ (FDHA) ηαζ ζημ ιεηααμθζηυ θυβμ (metabolic quotient) ημο νοειμφ ακαπκμήξ ακά ιμκάδα ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ. Οζ Wang et al., (2008), ενεφκδζακ θεπημιενχξ ηζξ επζδνάζεζξ ημο μνβακμθςζθμνζημφ εκημιμηηυκμο methamidophos ζηδ δμιή ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ ηαζ ηδ βεκεηζηή πμζηζθυηδηα ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααηηδνίςκ, ιε πνήζδ ηςκ ιεευδςκ PLFAs ηαζ ARDRA, ακηίζημζπα. Πνμζδζυνζζακ επίζδξ ηδκ ιεηααμθζηή δναζηδνζυηδηα (CLCPs: ηαηααμθζηυ πενίβναιια ζε επίπεδμ ημζκυηδηαξ) ηαζ ηδ ιζηνμαζαηή αζμιάγα. Γφμ ζοκμθζηά επίπεδα δυζδξ πνδζζιμπμζήεδηακ (0.5 ηαζ 5 mg g -1 λδνμφ αάνμοξ εδάθμοξ). Απυ ηα απμηεθέζιαηα πνμέηορε υηζ δ εθανιμβή ηδξ ορδθήξ δυζδξ ημο methamidophos μδήβδζε ζε αφλδζδ ηςκ πθδεοζιχκ ηςκ ανκδηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ, πςνίξ κα επδνεαζημφκ ζδιακηζηά μζ πθδεοζιμί ηςκ εεηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ, εκχ ημ πνυηοπμ γςκχκ πμο πνμέηορε απυ ηδκ ARDRA ακάθοζδ έδεζλε υηζ δ βεκεηζηή πμζηζθυηδηα ιεζχκεηαζ απυ ηδκ επίδναζδ ημο β.θ.. Σέθμξ, δ ζοκμθζηή ιζηνμαζαηή αζμιάγα υπςξ ηαζ αοηή ηςκ ιοηήηςκ ιεζχεδηε ζδιακηζηά, εκχ αολδιέκδ πανμοζζάζηδηε δ ιεηααμθζηή δναζηδνζυηδηα ηςκ ανκδηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ. Οζ παναπάκς ιεηααμθέξ ήηακ θζβυηενμ 85

86 ζδιακηζηέξ ζηδκ πενίπηςζδ εθανιμβήξ ηδξ παιδθυηενδξ δυζδξ. Γεκζηά, παναηδνήεδηε υηζ ημ methamidophos, επδνεάγεζ δζαθμνεηζηά ηα δζάθμνα ιέθδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ, ηαεχξ ειπμδίγεζ ηδκ ακάπηολδ ηςκ ιοηήηςκ αθθά αολάκεζ ηδ αζμιάγα ηαζ ηδκ ιεηααμθζηή δναζηδνζυηδηα ηςκ ανκδηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ. Οζ Joseph et al., (2010), ανήηακ υηζ ημ εονέςξ θάζιαημξ εκημιμηηυκμ/ αηανεμηηυκμ endosulfan, δεκ επδνέαζε ανκδηζηά ηδκ εδαθζηή ακαπκμή ζε πεζνάιαηα πμο δζελάπεδηακ ζημκ αβνυ (ζε ηαθθζένβεζεξ Phaseolus vulgaris ηαζ ζε παναηείιεκμοξ αβνμφξ πςνίξ θοηζηή αθάζηδζδ) ηαηά ηδ δζάνηεζα 3 ηαθθζενβδηζηχκ πενζυδςκ. Οζ Dutta et al., (2010), ζοιπένακακ υηζ ημ μνβακμθςζθμνζηυ εκημιμηηυκμ chlorpyrifos, υηακ εθανιυγεηαζ ζηδ ζοκζζηχιεκδ δυζδ (0.5 mg kg -1 ) δεκ επδνεάγεζ ζδιακηζηά ηδ ααζζηή ακαπκμή ηαζ ηδκ οδνμθοηζηή δναζηζηυηδηα ηδξ 3,6-δζαηεηοθμ-- θθμομνμζηεΐκδξ. Ακηίεεηα, δ εθανιμβή ημο chlorpyrifos ζε επίπεδα 100x ηδξ ζοκζζηχιεκδ (50 mg kg -1 ) μδδβεί ζε ιείςζδ ηςκ παναπάκς παναιέηνςκ Δπηδξάζεηο βηνινγηθώλ γ.θ. ζηε κηθξνβηαθή θνηλόηεηα ηνπ εδάθνπο Σα ηεθεοηαία πνυκζα, ζημ επίηεκηνμ ημο εκδζαθένμκημξ ανίζηεηαζ δ πνήζδ ηςκ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ.., ςξ έκαξ εκαθθαηηζηυξ ηνυπμξ δζαπείνζζδξ ηςκ θοημπαναζίηςκ. Αοηυ μθείθεηαζ αθεκυξ ζηζξ πζεακέξ ανκδηζηέξ επζδνάζεζξ πμο ιπμνεί κα έπμοκ ηα ζοκεεηζηά β.θ.. ζημ πενζαάθθμκ ηαζ βεκζηυηενα ζηδκ οβεία ηαζ αθεηένμο ζηδ ιείςζδ ημο ανζειμφ ηςκ δζαεεζζιςκ β.θ.. θυβς ηδξ απυζονζδξ ζδιακηζημφ ανζειμφ βζα θυβμοξ πνμζηαζίαξ ημο πενζαάθθμκημξ ηαζ ηδξ οβείαξ. Δθάπζζηα είκαζ έςξ ζήιενα βκςζηά, βζα ηδκ επίδναζδ ηςκ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ. βεκζηυηενα ζε μνβακζζιμφξ ιδ-ζηυπμοξ ηαζ εζδζηυηενα ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ εκχ επζπθέμκ πενζμνζζιέκεξ είκαζ μζ πθδνμθμνίεξ βζα ηδκ ζοιπενζθμνά ημοξ ζημ έδαθμξ. Σα πνμσυκηα αοηά εεςνδηζηά ημοθάπζζημκ, υπςξ ηάεε λεκμαζμηζηή μοζία, δφκακηαζ κα επδνεάζμοκ ημοξ πθδεοζιμφξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζημ έδαθμξ. Παναηάης ακαθένμκηαζ εκδεζηηζηά μνζζιέκεξ απυ ηζξ ςξ ηχνα πνμζπάεεζεξ πνμζδζμνζζιμφ ηςκ επζδνάζεςκ ηςκ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ. ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. Οζ Gopal et al. (2007) ήηακ απυ ημοξ πνχημοξ ενεοκδηέξ πμο αζπμθήεδηακ ιε ηδ ιεθέηδ ηςκ επζδνάζεςκ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ. ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. οβηεηνζιέκα, ιεθέηδζακ ηδκ επίδναζδ ζηεοάζιαημξ ηυηηςκ 10% 86

87 azadirachtin (αθημμθζηυ εηπφθζζια ημο εζςηενζημφ ηιήιαημξ ηςκ ηανπχκ ημο δέκηνμο Azdirachta indica ακαιειεζβιέκμ ιε ηαμθζκίηδ) ζε πθδεοζιμφξ ααηηδνίςκ, αηηζκμααηηδνίςκ, ιοηήηςκ, αγςημδεζιεοηζηχκ ααηηδνίςκ ημο βέκμοξ Azotospira ηαζ κζηνςδμπμζδηζηχκ ααηηδνίςκ. Δπίζδξ, ιεθέηδζακ ηδκ επίδναζδ ημο παναπάκς ζηεοάζιαημξ ζηδ δναζηζηυηδηα ηςκ εκγφιςκ αθοδνμβμκάζδ ηαζ θςζθαηάζεξ, αθθά ηαζ ζηδκ εδαθζηή ακαπκμή. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, πναβιαημπμζήεδηακ εθανιμβέξ ημο ζηεοάζιαημξ ζε αιιμπδθχδεξ έδαθμξ ηαζ ζε δυζεζξ x1, x2, x5 ηδξ ζοκζζηχιεκδξ, εκχ ηα πνμξ ιεθέηδ πνμκζηά δζαζηήιαηα πμο επζθέπεδηακ ήηακ 0, 15, 30, 60 ηαζ 90 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ. Δηηυξ απυ ηα ααηηήνζα ημο βέκμοξ Azotospira sp., υθμζ μζ οπυθμζπμζ πθδεοζιμί ηαζ μζ εκγοιζηέξ δναζηζηυηδηεξ ιεζχεδηακ ζδιακηζηά ηαηά ηζξ πνχηεξ 15 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ, ζε υθα ηα επίπεδα δυζεςκ. Όιςξ, μζ πθδεοζιμί ηςκ ααηηδνίςκ ηαζ ηςκ αηηζκμααηηδνίςκ, υπςξ ηαζ δ ιζηνμαζαηή ακαπκμή ηαζ δ δναζηζηυηδηα ηςκ θςζθαηαζχκ επακήθεακ ηαζ αολήεδηακ ζδιακηζηά 60 διένεξ απυ ηδκ επέιααζδ ηαζ ιεηά. Σμ ζηεφαζια ημο azadirachtin ςζηυζμ πνμηάθεζε ζδιακηζηή ιείςζδ ηςκ πθδεοζιχκ ηςκ ιοηήηςκ ηαζ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ααηηδνίςκ ζε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ. Σμκ ίδζμ πνυκμ, απυ ηδκ ιεθέηδ ηςκ Qian et al. (2007), πνμέηορε υηζ ημ validamycin (ακηζαζμηζηυ ιε ιοηδημηηυκμ δνάζδ πμο πανάβεηαζ απυ ηαθθζένβεζεξ ημο ιφηδηα Rhizoctonia solani) υηακ εθανιυζηδηε ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ (240 ml mg -1 ) επδνέαζε ζδιακηζηά, ηυζμ ανκδηζηά (ηαηαθάζδ, μονεάζδ) υζμ ηαζ εεηζηά (θςζθαηάζεξ) ηζξ δναζηζηυηδηεξ δζαθυνςκ εκγφιςκ ζημ έδαθμξ, ςζηυζμ δ επίδναζδ ήηακ πνμζςνζκή. Ανβυηενα, ζε ιεθέηδ ηςκ Spyrou et al. (2009), ανέεδηε υηζ ηα αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ.. azadirachtin ηαζ εηπφθζζια ημο θοημφ Quillaja saponaria, ηαεχξ ηαζ αθεζιέκμζ ηανπμί ημο θοημφ Μelia azedarach, υηακ εθανιυζηδηακ ζηζξ ζοκζζηχιεκεξ δυζεζξ, δεκ πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ, υπςξ αοηή εηηζιήεδηε ιε ακάθοζδ ηςκ PLFAs ζε δείβιαηα εδάθμοξ πνμενπυιεκα απυ πεζνάιαηα ενβαζηδνίμο αθθά ηαζ αβνμφ. Ζ ακαθμνά αοηή είκαζ δ πνχηδ πμο απμδεζηκφεζ υηζ ηα αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ θοζζηά πνμσυκηα δεκ πνμηαθμφκ ιεηααμθέξ ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ ζε επίπεδμ ενβαζηδνίμο ηαζ αβνμφ υηακ εθανιμζημφκ ζηζξ ζοκζζηχιεκεξ δυζεζξ. ηδ ζοκέπεζα, μζ Okur et al. (2010), ιεθέηδζακ ηδκ επίδναζδ οδαηζηχκ εηποθζζιάηςκ απυ ηα θοηά Urginea maritime ηαζ Euphorbia myrsinites 87

88 (πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδκ ηαηαπμθέιδζδ ημο εκηυιμο Liriomyza trifolii ζε ηαθθζένβεζεξ ημιάηαξ) ζηδ ιζηνμαζαηή αζμιάγα ηαζ ζηζξ δναζηζηυηδηεξ δζαθυνςκ εκγφιςκ. Γζα ηζξ ακάβηεξ ημο πεζνάιαημξ, 2 g θοηζημφ οθζημφ εηποθίζηδηακ ιε 100 ml κενυ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα αναζχεδηακ ζε υβημοξ 1:100, 2:100 ηαζ 4:100. Ζ επίδναζδ ηδξ παιδθυηενδξ ζοβηέκηνςζδξ (1:100) ημο εηποθίζιαημξ Urginea maritime ήηακ αιεθδηέα. Όιςξ, μζ οπυθμζπεξ ζοβηεκηνχζεζξ (2:100, 4:100) εηποθζζιάηςκ ημο Urginea maritime ηαζ υθεξ ημο Euphorbia myrsinites πνμηάθεζακ ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ ηαζ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ εκγφιςκ α-βθοημζζδάζδ, θςζθαηάζεξ ηαζ μονεάζδ. Σέθμξ, μζ Ipsilantis et al., (2011), ιεθέηδζακ ηδκ επίδναζδ ηςκ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ. azadirachtin, spinosad, pyrethrum ηαζ μνζζιέκςκ ηενπεκίςκ, ηαεχξ ηαζ ημο ζοκεεηζημφ ιοηδημηηυκμο carbendazim ζε ελςβεκή ειαυθζα δεκδνυιμνθςκ ιοημννζγζηχκ ιοηήηςκ (ΓΜΜ) ζε πεζνάιαηα πμο πναβιαημπμζήεδηακ ζε βθάζηνεξ ηαζ ζε εκδμβεκείξ ΓΜΜ ζε πεζνάιαηα αβνμφ. Ζ επίδναζδ ηςκ β.θ. πνμζδζμνίζηδηε ιε PCR-DGGE, εκχ δ ηαοηυηδηα ΓΜΜ πμο πανμοζίαγακ εοαζζεδζία ή ακεεηηζηυηδηα ζηδκ εθανιμβή ηςκ β.θ.. πνμζδζμνίζηδηε ιε ηδκ δδιζμονβία αζαθζμεδηχκ ηθχκςκ. Σα spinosad, pyrethrum ηαζ ηα ηενπέκζα, δεκ επδνέαζακ ηδκ ζηακυηδηα απμζηζζιμφ ηαζ ηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ. Ακηίεεηα, δ εθανιμβή ημο azadirachtin ζηα πεζνάιαηα ζε βθάζηνεξ, πνμηάθεζε εηθεηηζηή ακαζημθή εκυξ εη ηςκ ηνζχκ ιοηήηςκ (Glomus etunicatum) πμο απμηεθμφζακ ημ ελςβεκέξ ιοημννζγζηυ ειαυθζμ. Ζ DGGE ακάθοζδ έδεζλε υηζ δ εθανιμβή azadirachtin ζημκ αβνυ πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ηαζ έιιμκεξ ιεηααμθέξ ζηδκ ημζκυηδηα ηςκ ΓΜΜ. Σμ ζοκεεηζηυ ιοηδημηηυκμ carbendazim ειπυδζζε μθμηθδνςηζηά ημκ απμζηζζιυ ζηζξ βθάζηνεξ ζοβηνζηζηά ιε ηδκ εθανιμβή ζημκ αβνυ ηαζ επέθενε πανμδζηέξ αθθαβέξ ζηδ δμιή ηςκ εκδμβεκχκ ΓΜΜ Αμηνιόγεζε ηεο ηνμηθόηεηαο ησλ γ.θ.. ζηνπο κηθξννξγαληζκνύο ηνπ εδάθνπο ζύκθσλα κε ηελ θνηλνηηθή λνκνζεζία Σζξ ηεθεοηαίεξ δεηαεηίεξ έκαξ εκηοπςζζαηυξ ανζειυξ ιεευδςκ ηαζ ηεπκζηχκ έπεζ ακαπηοπεεί βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ ζοκεζζθμνάξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ πμζηζθυηδηαξ ζηδ ζοκμθζηή θεζημονβία ημο εδαθζημφ μζημζοζηήιαημξ. Γζαθμνεηζηέξ ιεηαλφ ημοξ ιέεμδμζ ζημπεφμοκ ζηδκ εηηίιδζδ ηδξ αθεμκίαξ, ηδξ πμζηζθυηδηαξ ηαζ ηδξ δναζηδνζυηδηαξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ηαζ πνδζζιμπμζμφκηαζ ζοζηδιαηζηά ηαζ ζε ελεθζηηζηή αάζδ, ζδζαίηενα υζμκ αθμνά ηζξ ιμνζαηέξ ηεπκζηέξ 88

89 ιζηνμαζαηήξ απμηφπςζδξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ δμιήξ ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ. Απμηέθεζια αοηήξ ηδξ πνμζπάεεζαξ είκαζ κα πνδζζιμπμζείηαζ αοηή ηδ ζηζβιή παβημζιίςξ έκα πθήεμξ δζαθμνεηζηχκ πνςημηυθθςκ ιε ιζηνέξ ή ιεβάθεξ δζαθμνμπμζήζεζξ, βεβμκυξ πμο ειπμδίγεζ ηδκ ζφβηνζζδ ηαζ ηδκ εκζαία αλζμθυβδζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ πμο πνμένπμκηαζ απυ δζαθμνεηζηά ενβαζηήνζα. Γζα ηδκ επίθοζδ ακάθμβςκ πνμαθδιάηςκ οπάνπεζ δ ακάβηδ πνήζδξ ηαηάθθδθςκ, ηαεμνζζιέκςκ ηαζ ηοπμπμζδιέκςκ ιεευδςκ. Γζάθμνα επίπεδα ηοπμπμίδζδξ ηςκ ιεευδςκ ιεθέηδξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ δζαηνίκμκηαζ, υπςξ ηοπμπμίδζδ ζε επίπεδμ ενεοκδηζηήξ μιάδαξ, ζκζηζημφημο-μνβακζζιμφ ηαζ ζε εεκζηυ ή δζεεκέξ επίπεδμ, πμο απμηεθεί ημ ακχηενμ επίπεδμ ηοπμπμίδζδξ. Ζ ηοπμπμίδζδ ζε δζεεκέξ επίπεδμ βίκεηαζ ηονίςξ απυ ημκ ανιυδζμ ηαζ ακαβκςνζζιέκμ Γζεεκή Ονβακζζιυ Σοπμπμίδζδξ (International Organization of Standardization, ISO). Μέπνζ πνυζθαηα, ιυκμ έκαξ ιζηνυξ ανζειυξ ζπεηζηά ιε ημ πθήεμξ ηςκ ηαηαβεβναιιέκςκ ιεευδςκ/ηεπκζηχκ, είπε ηοπμπμζδεεί ζε δζεεκέξ επίπεδμ. Χζηυζμ ηα ηεθεοηαία πνυκζα, δ ηαηάζηαζδ αοηή ακαηνέπεηαζ ζηαδζαηά, ηαεχξ ηαηααάθθμκηαζ απυ ημοξ ενεοκδηέξ πνμζπάεεζεξ ζε παβηυζιζμ επίπεδμ βζα ηδκ ηοπμπμίδζδ ηαζ ακαβκχνζζδ εκζαίςκ πνςημηυθθςκ ακαθμνάξ, υζμκ αθμνά ηδ ιεθέηδ ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ ημο εδάθμοξ ηαζ ζδιακηζηυξ ανζειυξ ιεευδςκ έπμοκ πάνεζ ζήιενα ηοπμπμίδζδ ηφπμο ISO (Phillippot et al., 2012). Πανά ηδκ ακάπηολδ ορδθήξ απυδμζδξ ιεευδςκ υπςξ αοηέξ ηδξ ιμνζαηήξ αζμθμβίαξ (αθέπε 1.3), ηδκ πνυμδμ ζημκ ημιέα ηδξ ηοπμπμίδζδξ ηςκ ιεευδςκ ηαζ ηζξ πμθοάνζειεξ ακαθμνέξ ηδξ επίδναζδξ ακενχπζκςκ δναζηδνζμηήηςκ υπςξ δ πνήζδ β.θ. ζηδ ιζηνμαζαηή θεζημονβζηυηδηα ηςκ εδαθζηχκ μζημζοζηδιάηςκ ( ), ακάθμβδ πνυμδμξ δεκ εκημπίγεηαζ υζμκ αθμνά ηδ εέζπζζδ ηςκ ηακμκζζιχκ πμο δζέπμοκ ηδκ δζαδζηαζία έβηνζζδξ ηοηθμθμνίαξ ηςκ β.θ.. Αοηυ βίκεηαζ ηονίςξ ακηζθδπηυ ζηδκ πενίπηςζδ ημο κμιμεεηζημφ πθαζζίμο πμο αθμνά ηδκ έβηνζζδ ηοηθμθμνίαξ ηαζ πνήζδξ ηςκ β.θ. (Οδδβία 91/414 ημο Δονςπασημφ ζοιαμοθίμο πμο ακηζηαηαζηάεδηε πνυζθαηα απυ ημκ Κακμκζζιυ 1107/2009), ζφιθςκα ιε ημ μπμίμ δ εηηίιδζδ ηδξ επίδναζδξ ηςκ β.θ. ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ ααζίγεηαζ ζε δφμ ιυκμ δμηζιέξ, βκςζηέξ ςξ δμηζιέξ ακoνβακμπμίδζδξ ημο άκεναηα ηαζ ημο αγχημο (carbon-, nitrogen- mineralization tests) (OECD 217 ηαζ OECD 216, ακηίζημζπα). Ανηεί ηακείξ κα ακαθμβζζηεί ηδκ ορδθή πνμζανιμζηζηή ζηακυηδηα ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ηαζ ημ πθήεμξ ηςκ δζαθμνεηζηχκ θεζημονβζηχκ εκγφιςκ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηζξ παναπάκς 89

90 δζαδζηαζίεξ βζα κα ηαηαθάαεζ υηζ μζ δφμ αοηέξ δμηζιέξ δεκ ιπμνμφκ κα δχζμοκ ζε ηαιία πενίπηςζδ ηδκ πθήνδ εζηυκα ηδξ επίδναζδξ ηςκ β.θ. ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ ηαζ δεκ είκαζ ανηεηά εοαίζεδηεξ βζα ηδκ αλζμθυβδζδ ηδξ επίδναζδξ ηςκ β.θ. ζηδ δμιή ηαζ ηδ θεζημονβία ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ ηαζ ηαηά ζοκέπεζα ηςκ πνήζζιςκ οπδνεζζχκ πμο πανέπμοκ μζ ιζηνμμνβακζζιμί ζημ μζημζφζηδια (Martin- Laurent et al., 2013). Σα ηεθεοηαία πνυκζα, ηυζμ ζε εεκζηυ, υζμ ηαζ ζε παβηυζιζμ επίπεδμ, ημ κμιμεεηζηυ εκδζαθένμκ εζηζάγεηαζ ζηδκ πνμζηαζία ηαζ ηδ δζαηήνδζδ ηςκ θεζημονβζχκ ημο εδάθμοξ, υπμο ζοιπενζθαιαάκμκηαζ μζ βεςπδιζημί ηφηθμζ ηςκ ενεπηζηχκ ζημζπείςκ, δ δζάζπαζδ ηςκ λεκμαζμηζηχκ μοζζχκ ηαζ δ δζαηήνδζδ ηδξ μνβακζηήξ φθδξ ημο εδάθμοξ, δζαδζηαζίεξ πμο επζηεθμφκηαζ ιε ηδ ζοιιεημπή ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ. Ζ Οθθακδία έπεζ εεζπίζεζ ακάθμβμοξ κυιμοξ απυ ημκ Ηακμοάνζμ ημο 1987 (Dutch Soil Protection Act) ηαζ δ Γενιακία (Federal Soil Protection Act) απυ ημκ Μάνηζμ ημο Όιςξ, δ ζφκεεζδ εκυξ εκζαίμο Δονςπασημφ πθαζζίμο κυιςκ πμο εα αθμνμφκ ηδκ πμζυηδηα ηαζ ηδκ οβεία ημο εδάθμοξ, ανίζηεηαζ αοηή ηδ ζηζβιή οπυ ζογήηδζδ ακάιεζα ζηα ιέθδ ηδξ Δονςπασηήξ Κμζκυηδηαξ (Rombke et al., 2005, Emmerling et al., 2002, Nortcliff, 2002). Χξ εη ημφημο, μζ ιυκεξ δμηζιέξ αλζμθυβδζδξ ηςκ πζεακχκ επζδνάζεςκ ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ, ζηζξ μπμίεξ πνέπεζ κα οπμαάθθμκηαζ ηα β.θ. πνζκ ηδκ έβηνζζδ ηαζ ηδκ ειπμνία ημοξ ζηζξ πχνεξ ηδξ Δονςπασηήξ Έκςζδξ, είκαζ αοηέξ πμο μνίγμκηαζ απυ ηδκ Οδδβία 91/414 ηδξ Δονςπασηήξ Κμζκυηδηαξ ηαζ ημκ Κακμκζζιυ 1107/2009. ημ εββφξ ιέθθμκ μζ πνμζπάεεζεξ ηδξ επζζηδιμκζηήξ ημζκυηδηαξ πνέπεζ κα επζηεκηνςεμφκ ζηδ δδιζμονβία εκυξ ζφβπνμκμο, εκζαίμο ηαζ εονέςξ απμδεηημφ, ιε άθθα θυβζα αηθυκδημο ζοζηήιαημξ εηηίιδζδξ ηδξ μζημημλζηυηδηαξ, πμο εα έπεζ ςξ ακηίηηοπμ ηδκ αθθαβή ηδξ ζζπφμοζαξ κμιμεεζίαξ ηαζ ηδκ εέζπζζδ ηαηάθθδθςκ ηακμκζζιχκ ηαζ νοειίζεςκ υζμκ αθμνά ηδκ έηεεζδ ημο πενζαάθθμκημξ ζηα β.θ. ηαζ ηδ θεζημονβζηυηδηα ηςκ μζημζοζηδιάηςκ (Imfeld and Vuilleumier, 2012) Γεσξγηθά θάξκαθα πνπ κειεηήζεθαλ ζηελ παξνύζα εξγαζία Ζ πνήζδ ηςκ ζοκεεηζηχκ β.θ. εεςνείηαζ ςξ μ πζμ βνήβμνμξ, εφημθμξ ηαζ μζημκμιζηυξ ηνυπμξ ακηζιεηχπζζδξ ηςκ αζεεκεζχκ ηαζ ηςκ επενχκ ηςκ θοηχκ. Χζηυζμ, δ εκηαηζηή ηαζ ιαηνμπνυκζα πνήζδ ημοξ έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδ νφπακζδ ημο πενζαάθθμκημξ. Τπμθείιιαηα β.θ. απακημφκ ζημ έδαθμξ, ημκ αένα, ηα 90

91 επζθακεζαηά ηαζ οπυβεζα φδαηα. Ζ επίδναζδ ηςκ β.θ. εέηεζ ζε ηίκδοκμ μνβακζζιμφξ ιδ-ζηυπμοξ ιε ζδζαίηενδ ζδιαζία βζα ηδκ μιαθή θεζημονβία ημο μζημζοζηήιαημξ υπςξ μζ ιζηνμμνβακζζιμί ημο εδάθμοξ. Δπζπθέμκ, δ απχθεζα ηδξ απμηεθεζιαηζηυηδηαξ πμθφηζιςκ β.θ. ελαζηίαξ ηδξ ακάπηολδξ ακεεηηζηυηδηαξ ή επζηαποκυιεκδξ ιζηνμαζαηήξ απμδυιδζδξ, ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ απυζονζδ πμθθχκ παθαζχκ δναζηζηχκ ιμνίςκ βζα μζημθμβζημφξ, ημλζημθμβζημφξ ηαζ μζημκμιζημφξ θυβμοξ, ηαεζζηά οπανηηυ ημκ ηίκδοκμ ζμαανήξ ιείςζδξ ημο ανζειμφ ηαζ ηδξ δζαεεζζιυηδηαξ απμηεθεζιαηζηχκ β.θ.. Δπμιέκςξ, οπάνπεζ ιεβάθδ ακάβηδ βζα ηδκ ακάπηολδ ηαζ παναβςβή αζθαθέζηενςκ β.θ. ιε κέμ ηνυπμ δνάζδξ. Μζα απυ ηζξ πζεακέξ εκαθθαηηζηέξ πνμηάζεζξ-θφζεζξ είκαζ δ πνήζδ θοζζηήξ πνμέθεοζδξ, αζμθμβζηά εκενβχκ ηαζ ακακεχζζιςκ θοηζηχκ πνμσυκηςκ. Σα θοηά ελεθζηηζηά έπμοκ ακαπηφλεζ αιοκηζημφξ ιδπακζζιμφξ έκακηζ ηςκ θοζζηχκ επενχκ ημοξ, ιεηαλφ ηςκ μπμίςκ είκαζ ηαζ δ παναβςβή ηαζ έηηνζζδ/εκενβμπμίδζδ ηςκ πνμσυκηςκ ημο δεοηενμβεκή ιεηααμθζζιμφ υπςξ είκαζ ηα ηενπεκμεζδή, θζιμκμεζδή αθηαθμεζδή, θθααμκμεζδή, η.α. (Ntalli and Menkissoglu-Spiroudi, 2011). Οζ δεοηενμβεκείξ ιεηααμθίηεξ ηςκ θοηχκ οθίζηακηαζ ηαπεία δζάζπαζδ ζημ έδαθμξ, δεκ είκαζ ημλζημί βζα ηα εδθαζηζηά, ηαζ ηαηέπμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζε ιζα αεζθυνμ βεςνβία. Ακάιεζα ημοξ δζαηνίκμκηαζ μζ ζαπςκίκεξ, ζφκεεηεξ βθοημζζδζηέξ εκχζεζξ ηςκ ακχηενςκ θοηχκ βκςζηέξ βζα ηζξ ιοηδημζηαηζηέξ ημοξ ζδζυηδηεξ ηαζ ηδ κδιαηςδoηηυκμ δνάζδ ημοξ (SanMartin and Magunacelaya, 2005). Μέπνζ ζηζβιήξ δεκ έπεζ δδιμζζεοηεί ηάπμζα πενίπηςζδ επζηαποκυιεκδξ απμδυιδζδξ θοηζηχκ εηποθζζιάηςκ (Giannakou, 2011), εκχ ζηδκ επζζηδιμκζηή ημζκυηδηα επζηναηεί δ πεπμίεδζδ υηζ δ πνήζδ ακάθμβδξ θφζδξ πνμσυκηςκ είκαζ θζβυηενμ πζεακυ κα μδδβήζεζ ζε θαζκυιεκα ακεεηηζηυηδηαξ. Πανά ημ βεβμκυξ υηζ ακάθμβα πνμαθήιαηα ιπμνεί κα ειθακζζημφκ ζημ ιέθθμκ ηαζ βζα ηα αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ., μζ μοζίεξ αοηέξ απμηεθμφκ έκα ζφζηδια μζημθμβζηήξ ζζμννμπίαξ ζηδ θφζδ (Ribera et al., 2008, Chapagain et al., 2007). ηα αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ. (biopesticides) ακήημοκ επίζδξ ηα ζηεοάζιαηα ηςκ μπμίςκ δ αζμθμβζηή δνάζδ ζηδνίγεηαζ ζε ηάπμζμ αζμθμβζηυ πανάβμκηα υπςξ είκαζ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ εκημιμηηυκςκ δζάθμνμζ εκημιμπαεμβυκμζ ιφηδηεξ (π.π. Paecillomyces lillacinus), ααηηήνζα (π.π. Bacillus thurigiensis), ζμί, πνςηυγςα ή κδιαηχδεζξ (Steinernematidae, Heterorhabditidae) (Εζχβαξ ηαζ Μάνημβθμο, 2010). 91

92 Ακ ηαζ ηα πνμσυκηα αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ εεςνμφκηαζ αζθαθή ηαζ θζθζηά πνμξ ημ πενζαάθθμκ, απαζημφκηαζ ιεθέηεξ βζα ηδ δζενεφκδζδ ηαζ ηδκ επζαεααίςζδ αοηήξ ηδξ οπυεεζδξ (Lynch et al., 2004, Wan et al., 1998), ηαεχξ δεκ οπάνπμοκ ζηδ αζαθζμβναθία επανηή δεδμιέκα βζα ηζξ ζοκέπεζεξ θοζζηχκ μοζζχκ ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. Δπίζδξ, ηα ζφβπνμκα β.θ. εζκαζ απμηεθεζιαηζηά ηαζ εθανιυγμκηαζ ζε πμθφ ιζηνυηενεξ δυζεζξ ζοβηνζηζηά ιε ηζξ παθαζυηενεξ μιάδεξ β.θ.. ηδκ ηαηδβμνία αοηή ακήημοκ ηα γζγακζμηηυκα ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ. Σα γζγακζμηηυκα ηδξ μιάδαξ αοηήξ παναηηδνίγμκηαζ απυ ορδθή αζμπδιζηή δναζηζηυηδηα ηαζ εηθεηηζηυηδηα, ζε παιδθέξ δυζεζξ εθανιμβήξ (βναιιάνζα ακά εηηάνζμ). Ζ πνήζδ ημοξ αολάκεηαζ ζηαεενά απυ ηδκ είζμδμ ημοξ ζηδκ αβμνά ζηζξ ανπέξ ηδξ δεηαεηίαξ ημο 1980 ηαζ είκαζ οπεφεοκα βζα ηδ ιείςζδ ηδξ ζοκμθζηά εθανιμγυιεκδξ πμζυηδηαξ γζγακζμηηυκςκ δναζηζηχκ μοζζχκ ζηζξ αβνμηζηέξ ηαθθζένβεζεξ. Χζηυζμ, ζοκδέμκηαζ έκημκα ιε θαζκυιεκα ακεεηηζηυηδηαξ (Zhou et al., 2007). Δπίζδξ ημ βεβμκυξ υηζ εθανιυγμκηαζ ζε πμθφ παιδθέξ δυζεζξ δεκ ζδιαίκεζ απαναίηδηα υηζ είκαζ θζβυηενμ επζαθααή ζε μνβακζζιμφξ ιδ-ζηυπμοξ, ηαεχξ δ επζηζκδοκυηδηα ιζαξ μοζίαξ βζα ημ πενζαάθθμκ είκαζ ζοκδοαζιυξ ηδξ δυζδξ ηαζ ηδξ δναζηζηυηδηαξ (Radivojevic et al., 2012). Σέθμξ, οπάνπμοκ ηαηδβμνίεξ β.θ. πμο εεςνμφκηαζ αηίκδοκα βζα ημ πενζαάθθμκ ηαζ ημοξ μνβακζζιμφξ εηηυξ ζηυπμο δνάζδξ, ελαζηίαξ ημο ηνυπμο εθανιμβήξ ημοξ. Υαναηηδνζζηζηυ πανάδεζβια απμηεθμφκ ηα β.θ. πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ιεηαζοθθεηηζηά ζηζξ ιμκάδεξ επελενβαζίαξ μπμνςθυνςκ ηαζ ηδπεοηζηχκ βζα ηδκ ακηζιεηχπζζδ ιοηδημθμβζηχκ πνμζαμθχκ ηαζ ηδκ δζαζθάθζζδ ηδξ πμζυηδηαξ ηςκ ηανπχκ. Ζ εθανιμβή ηςκ β.θ. ζηζξ ιμκάδεξ αοηέξ μδδβεί ζηδκ παναβςβή ηενάζηζςκ πμζμηήηςκ οβνχκ απμαθήηςκ πμο πενζέπμοκ ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ β.θ. ηαζ πνήγμοκ επελενβαζίαξ ηαζ απμημλζημπμίδζδξ πνζκ ηδκ μνζζηζηή απυννζρδ ημοξ ζημ πενζαάθθμκ. Δλαζηίαξ ςζηυζμ ημο ορδθμφ ηυζημοξ πμο εκέπεζ δ δζαπείνζζδ ηςκ απμαθήηςκ ηαζ ηδξ απμοζίαξ ηαεζενςιέκμο ζοζηήιαημξ δζαπείνζζδξ, ηαηαθήβμοκ ηεθζηά ζημ πενζαάθθμκ ιέζς απυννζρδξ ζε βεζημκζημφξ οδάηζκμοξ ή εδαθζημφξ θμνείξ. Ζ άιεζδ απυννζρδ ηςκ οβνχκ απμαθήηςκ ιπμνεί κα μδδβήζεζ ζε ζδιακηζηή ζδιεζαηή νφπακζδ ηςκ θοζζηχκ πυνςκ (Flaim and Toller, 1989). Γεκ οπάνπμοκ ςζηυζμ ζηδ αζαθζμβναθία ιεθέηεξ βζα ηζξ ζοκέπεζεξ ακάθμβςκ ζηεοαζιάηςκ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. 92

93 Λαιαάκμκηαξ οπυρδ υθα ηα παναπάκς, ηέζζενεζξ δζαθμνεηζηέξ ηαηδβμνίεξ β.θ. (κδιαηςδμηηυκα, γζγακζμηηυκα, ιοηδημηηυκα, ακηζμλεζδςηζηά) ηαζ ζοκμθζηά δέηα (10) β.θ. ιεθεηήεδηακ ζηδκ πανμφζα ενβαζία. ημπυξ ήηακ δ ηάθορδ εκυξ εονέςξ θάζιαημξ μοζζχκ (παναδμζζαηέξ ζοκεεηζηέξ, ζοκεεηζηέξ ιε κέμ ηνυπμ δνάζδξ, ζοκεεηζηέξ πμο εθανιυγμκηαζ ζε παιδθέξ δυζεζξ εθανιμβήξ, μοζίεξ ιε θοημνοειζζηζηή δνάζδ, μοζίεξ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ) βζα ηδκ ηφπδ ηςκ μπμίςκ ζημ πενζαάθθμκ ηαζ ηδκ επίδναζδ ημοξ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ δεκ οπάνπμοκ επανηή ζημζπεία ζηδ αζαθζμβναθία. οβηεηνζιέκα, επζθέπεδηακ δφμ ζοκεεηζηά κδιαηςδμηηυκα: (i) Οxamyl, ζοκεεηζηυ ηαζ εονέςξ πνδζζιμπμζμφιεκμ ηαζ (ii) fluensulfone, ζοκεεηζηυ ιε κέμ ηνυπμ δνάζδξ, ηαζ δφμ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ.: (i) ημ θοηζηήξ πνμέθεοζδξ QLAgri (εηπφθζζια απυ ημ δέκδνμ Quillaja saponaria) ηαζ (ii) ημ BIOACT πμο πενζέπεζ θζμθοθμπμζδιέκα ζπυνζα ημο ζηεθέπμοξ 251 ημο κδιαηςδμπαναζζηζημφ ιφηδηα Paecilomyces lilacinus. Χξ εηπνυζςπμξ ηςκ γζγακζμηηυκςκ επζθέπεδηε ημ nicosulfuron, ιέθμξ ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ. Σέθμξ ιεθεηήεδηακ, ηνία ζοκεεηζηά ιοηδημηηυκα: thiabendazole, imazalil ηαζ ortho-phenyl phenol ηαζ δφμ μοζίεξ ιε ακηζμλεζδςηζηή δνάζδ: ηα diphenylamine ηαζ ethoxyquin πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδ ιεηαζοθθεηηζηή ιεηαπείνζζδ ιήθςκ ηαζ απθαδζχκ πλζεηηθά Νεκαησδνθηόλα Oxamyl (Vydate ) (N, N-dimethylcarbamoyloxyimino-2-(methylthio) acetamide). Γζαζοζηδιαηζηυ εκημιμηηυκμ, αηανεμηηυκμ ηαζ κδιαηςδμηηυκμ επαθήξ ηαζ ζημιάπμο πμο εζζήπεδηε ζηδ βεςνβζηή πνάλδ ημ 1974 απυ ηδκ εηαζνεία DuPont ιε ημ ειπμνζηυ υκμια Vydate (Wauchope et al., 1992). Ακήηεζ ζηα ηανααιζδζηά πανάβςβα ηςκ μλζιχκ (Εζχβαξ ηαζ Μανημβθμο, 2011) ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ εονέςξ βζα ημκ έθεβπμ ηςκ κδιαηςδχκ ζε ηαθθζένβεζεξ ηανυηςκ, παηάηαξ, γαπανυηεοηθμο, ααιααηζμφ ηαζ ημιάηαξ (Lawrence and McLean, 2000, Osborn et al., 2010b). Μεηά απυ ηδκ απαβυνεοζδ ηδξ ηοηθμθμνίαξ ηαζ απυζονζδ ανηεηχκ ιδ ηαπκζζηζηχκ κδιαηςδμηηυκςκ υπςξ ηα aldicarb, cadusafos ηαζ fenamiphos, ημ oxamyl απμηεθεί ημ ηονζυηενμ ζοκεεηζηυ ιδ ηαπκζζηζηυ κδιαηςδμηηυκμ παβημζιίςξ. Δθανιυγεηαζ ιε ρεηαζιμφξ θοθθχιαημξ, νζγμπυηζζια ή εκζςιάηςζδ ζημ έδαθμξ ακάθμβα ιε ημ είδμξ ημο ζηεοάζιαημξ πμο πνδζζιμπμζείηαζ ηαζ ηδκ ηαθθζένβεζα (FAO, 2008). Πανμοζζάγεζ πθήνδ δζαζοζηδιαηζηή ηίκδζδ (απμπθαζηζηή ηαζ ζοιπθαζηζηή). Έηζζ υηακ εθανιυγεηαζ ζημ θφθθςια, δζαπενκά ηδκ επζδενιίδα ηαζ ιεηαηζκείηαζ πνμξ ημ 93

94 νζγζηυ ζφζηδια ιέζς ημο θθμζχιαημξ (Lawrence and McLean, 2000), εκχ υηακ εθανιυγεηαζ ζημ έδαθμξ ιεηαηζκείηαζ πνμξ ημ θφθθςια δζαιέζμο ηδ δζαπκμήξ (Wauchope et al., 1992). Σμ oxamyl ειθακίγεζ παιδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα ζημ έδαθμξ ιε πνυκμ διζγςήξ πμο ηοιαίκεηαζ απυ διένεξ ζε ζοκεήηεξ ενβαζηδνίμο (Osborn et al. 2010a, Ou and Rao., 1986, Gerstl, 1984, Bromilow et al., 1980, Smelt et al., 1979) ηαζ απυ διένεξ ζε ζοκεήηεξ αβνμφ (Haydock et al, 2012). Μεηά ηδκ εθανιμβή ημο ζημ έδαθμξ, δζαζπάηαζ άιεζα πνμξ ημκ ιδ ημλζηυ ιεηααμθίηδ oxamyl oxime, πμο ιε ηδ ζεζνά ημο ιεηαηνέπεηαζ ηαπφηαηα ζε μλαιζηυ μλφ (oxamic acid) ηαζ ηεθζηά ζε CO 2 (Ou and Rao, 1986, Harvey and Han 1978). Σμ oxamyl ειθακίγεζ ορδθή δζαθοηυηδηα ζημ κενυ (280 g L -1 ) εκχ πνμζνμθάηαζ αζεεκχξ ζηα εδαθζηά ημθθμεζδή (K om 21.9 mlg -1 ), βεβμκυξ πμο ηαεζζηά πζεακή ηδκ έηπθοζδ ημο ζηα ααεφηενα εδαθζηά ζηνχιαηα (Gerstl, 1984). Τθίζηαηαζ ιζηνμαζαηή δζάζπαζδ απυ αενυαζα ηαζ ακαενυαζα ααηηήνζα ηαζ πνυζθαηα ακαθένεδηε δ απμιυκςζδ εδαθζηχκ ααηηδνίςκ ηςκ βεκχκ Aminobacter ηαζ Mesorhizobium πμο έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα ημ δζαζπμφκ ηαπφηαηα (Osborn et al., 2010b). Fluensulfone (5-chloro-2-(3,4,4-trifluoro-but-3-ene-1-sulfonyl)-thiazole). Νέμ β.θ. ηδξ μιάδαξ ηςκ θθμομνμαθηεκοθίςκ [fluoroalkenyle (-thioether)] ιε κδιαηςδμηηυκμ δνάζδ πμο ειθακίγεζ ζδζαίηενα ορδθά επίπεδα απμηεθεζιαηζηυηδηαξ εκακηίμκ ηςκ νζγυημιαςκ κδιαηςδχκ ημο βέκμοξ Meloidogyne spp. Ζ ζδζαζηενυηδηα ημο έβηεζηαζ ζημ κέμ ηνυπμ δνάζδξ ημο πμο ημο επζηνέπεζ κα ζημηχκεζ ημοξ κδιαηχδεζξ ιέζς επαθήξ ζε ακηίεεζδ ιε ηα ςξ ηχνα βκςζηά ιδ ηαπκζζηζηά κδιαηςδμηηυκα ηα μπμία δνμοκ κδιαηςδμζηαηζηά, αδνακμπμζχκηαξ απθά ημοξ κδιαηχδεζξ βζα ημ δζάζηδια πμο δ δναζηζηή μοζία είκαζ πανμφζα. Δπίζδξ, ζηα ζδζαίηενα παναηηδνζζηζηά ημο fluensulfone ζοβηαηαθέβεηαζ δ πενζμνζζιέκδ ημλζηυηδηα ημο ζε ζπέζδ ιε ηα ζοκήεδ μνβακμθςζθμνζηά ή ηανααιζδζηά κδιαηςδμηηυκα, ηυζμ βζα ημκ άκενςπμ ηαζ ηα γχα υζμ ηαζ βζα μνβακζζιμφξ ιδ-ζηυπμοξ υπςξ μζ ιέθζζζεξ ηαζ μζ βαζμζηχθδηεξ. Δλαζηίαξ ηδξ παιδθήξ δζαθοηυηδηάξ ημο ζημ κενυ ηαζ ημο ζπεηζηά ιζηνμφ πνυκμο διζγςήξ ημο ζημ έδαθμξ, δ πζεακυηδηα έηπθοζδξ ημο ζηα οπυβεζα κενά είκαζ πενζμνζζιέκδ (Oka et al., 2008). Σμ fluensulfone δεκ έπεζ πάνεζ αηυια έβηνζζδ ηοηθμθμνίαξ ηαζ ανίζηεηαζ πνμξ αλζμθυβδζδ βζα έκηαλδ ζηδκ θίζηα (ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ Η, 91/414ΔΔ) ηςκ πνμσυκηςκ ιε έβηνζζδ πνήζδξ ζηζξ πχνεξ ηδξ Δονςπασηήξ Έκςζδξ. 94

95 Νεκαησδνθηόλα Βηνινγηθήο Πξνέιεπζεο QLAgri (Δθρύιηζκα ηνπ θπηνύ Quillaja saponaria). Σμ είδμξ Quillaja saponaria είκαζ έκα αεζεαθέξ δέκηνμ πμο ακήηεζ ζηδκ μζημβέκεζα Rosaceae ηαζ απακηάηαζ ζηζξ άκοδνεξ πενζμπέξ ηδξ Υζθήξ, ημο Πενμφ ηαζ ηδξ Βμθζαίαξ. Σμ οδαηζηυ εηπφθζζια (ηονίςξ απυ ημ θθμζυ) ημο δέκηνμο αοημφ πενζέπεζ ηνζηενπεκμεζδείξ ζαπςκίκεξ (Ribera et al., 2008, Chapagain et al., 2007), πμθοθαζκυθεξ, άθαηα ηαζ ζάηπανα ηαζ ειπμδίγεζ ηδκ ακάπηολδ παεμβυκςκ ιοηήηςκ, εκηυιςκ ηαζ κδιαηςδχκ (Giannakou, 2011, Argentieri et al., 2008, Ribera et al., 2008, Chapagain et al., 2007, SanMartin and Magunacelaya, 2005). ε πεζνάιαηα εενιμηδπίμο ανέεδηε υηζ ημ εηποθίζια ημο Quillaja saponaria πμο απμηεθεί ημ ηφνζμ ζοζηαηζηυ ημο ζηεοάζιαημξ QLAgri 35 (QL), πενζυνζζε ημοξ πθδεοζιμφξ ηςκ νζγυημιαςκ κδιαηςδχκ ημο είδμοξ Meloidogyne incognita ηαζ δ απμηεθεζιαηζηυηδηα ημο ήηακ ακάθμβδ αοηήξ ηςκ ζοκεεηζηχκ κδιαηςδςηηυκςκ cadusafos ηαζ μxamyl (Giannakou, 2011). Ζ δναζηζηυηδηα ημο εηποθίζιαημξ ημο Quillaja saponaria ζημοξ κδιαηχδεζξ μθείθεηαζ ζε ζοκδοαζιέκδ δνάζδ ηςκ ζαπςκζκχκ ηαζ ηςκ πμθοθαζκμθχκ (SanMartin and Magunacelaya, 2005). Ο ιδπακζζιυξ δνάζδξ ηςκ ζαπςκζκχκ δεκ είκαζ πθήνςξ βκςζηυξ. Ζ αζμθμβζηή δνάζδ ημοξ απμδίδεηαζ ζε ελεζδζηεοιέκεξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιε ηζξ ηοηηανζηέξ ιειανάκεξ πμο ιεηααάθθμοκ ηδκ δζαπεναηυηδηα ημοξ (Argentieri et al., 2008). Οζ ζαπςκίκεξ αολάκμοκ ηδκ δζαπεναηυηδηα ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ ζηα ιαηνμιυνζα ηαζ ιε αοηυ ημκ ηνυπμ πζεακχξ δζεοημθφκμοκ ηδκ πνυζθδρδ ημλζηχκ ιμνίςκ υπςξ μζ πμθοθαζκυθεξ (SanMartin and Magunacelaya, 2005). Δπίζδξ, έπεζ ανεεεί υηζ μζ ζαπςκίκεξ αθθδθεπζδνμφκ ιε πνςηεΐκεξ (Argentieri et al., 2008). Δλαζηίαξ ηδξ ορδθήξ γήηδζδξ βζα ημκ θθμζυ (ιζα απυ ηζξ ζδιακηζηυηενεξ πδβέξ ηνζηενπεκζηχκ ζαπςκζκχκ παβημζιίςξ) ημο Quillaja saponaria ζε ζοκδοαζιυ ιε ημ παιδθυ νοειυ ακαπαναβςβήξ ημο ζηδ θφζδ ιε ζπυνμ ηαζ ηδκ πνμμδεοηζηή ακηζηαηάζηαζδ ηςκ δαζχκ ιε ηαθθζενβδηζηέξ εηηάζεζξ, μ ζοκμθζηυξ ανζειυξ ηςκ δέκηνςκ ζηδ Υζθή έπεζ ιεζςεεί ζδιακηζηά. Χξ θφζδ ζημ πνυαθδια αοηυ πνμηάεδηε πνυζθαηα δ in vitro ηαθθζένβεζα απυ αθαζημφξ ημο Quillaja saponaria ςξ εκαθθαηηζηή αζμηεπκμθμβζηή θφζδ ζημ πνυαθδια ηδξ δζαηήνδζδξ ημο είδμοξ. Δηποθίζιαηα απυ ηα θοηά πμο πανάπεδηακ ζημ ενβαζηήνζμ ανέεδηακ κα έπμοκ ζδιακηζηή δνάζδ εκάκηζα ζημκ θοημπαεμβυκμ ιφηδηα Botrytis cinerea (Ribera et al., 2008). 95

96 ΒΗΟΑCT Paecilomyces lilacinus strain 251. O ιφηδηαξ Paecilomyces lilacinus, ζηέθεπμξ 251, πνδζζιμπμζείηαζ παβημζιίςξ βζα ημκ έθεβπμ ηςκ θοημπαναζζηζηχκ κδιαηςδχκ (Kiewnick and Sikora, 2004). Σα ζηεοάζιαηα ημο ιφηδηα δζαηίεεκηαζ ζηδκ αβμνά ιε ηζξ μκμιαζίεξ ΜeloConWG, BioACTWG ηαζ Nemachek (U.S. Environmental Protection Agency, 2005). To ζηεφαζια BIOACT WG, απμηεθείηαζ απυ θζμθοθθμπμζδιέκα ζπυνζα ημο ζηεθέπμοξ 251 ημο ιφηδηα Paecilomyces lilacinus, ηαζ πενζέπεζ 6% απυ ημκ ιφηδηα P.lilacinus, ζηέθεπμξ 251, 6% ζηυκδ απμαμοηονςιέκμο βάθαηημξ, 78% βθοηυγδ ηαζ 10% κενυ. ε ηάεε βναιιάνζμ πνμσυκημξ πενζέπμκηαζ 1x10 10 ημκίδζα ημο ιφηδηα ζε θμνέα ηνοζηάθθμοξ βθοηυγδξ (Anastasiadis et al., 2008). Ο ιφηδηαξ, ανπζηά παναζζηεί ηαζ ηεθζηά ζημηχκεζ ηα αοβά, ηζξ πνμκφιθεξ ηαζ ηα εκήθζηα εδθοηά δζαθυνςκ κδιαηςδχκ. Ακηίεεηα ιε πμθθά άθθα ζηεθέπδ ημο ιφηδηα Paecilomyces lilacinus, ενβαζηδνζαηέξ ακαθφζεζξ έδεζλακ υηζ ημ ζηέθεπμξ 251 δεκ πανάβεζ ημλίκεξ (Mikami et al., 1989). To ζηεφαζια BIOACT WG, απμδείπεδηε απμηεθεζιαηζηυ βζα ηδκ ακηζιεηχπζζδ ηςκ εζδχκ Meloidogyne incognita ηαζ Meloidogyne javanica ζε θοηά ημιάηαξ, ημο Heterodera schachtii ζε ηαθθζένβεζεξ ζαηπανυηεοηθςκ, ηαζ ημο Radopholus similis ζε ηαθθζένβεζεξ ιπακάκαξ. ε υθεξ ηζξ παναπάκς πενζπηχζεζξ μζ ζοκεήηεξ πενζαάθθμκημξ ήηακ ηαηάθθδθεξ βζα ηδκ ακάπηολδ ημο ιφηδηα (Anastasiadis et al., 2008, Kiewnick and Sikora, 2006). Μπμνεί επίζδξ κα εθανιμζηεί ζε ζοζηήιαηα μθμηθδνςιέκδξ ηαηαπμθέιδζδξ βζα ηδκ ακηζιεηχπζζδ ημο Meloidogyne hapla (Kiewnick and Sikora, 2006). Ο ιφηδηαξ P.lilacinus, είκαζ είδμξ εκδδιζηυ ηςκ ηνμπζηχκ ηαζ οπμηνμπζηχκ εδαθχκ, ηαζ δ δναζηδνζυηδηα ημο εοκμείηαζ ζε εφνμξ εενιμηναζζχκ 24-28:C, εκχ δ αέθηζζηδ εενιμηναζία αθάζηδζδξ ηςκ ημκζδίςκ ηαζ ακάπηολδξ ημο ζηεθέπμοξ 251 ανίζηεηαζ ιεηαλφ 24-30:C. Δπεζδή δ δνάζδ ημο ΡL 251 δεκ ελανηάηαζ απυ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ημο ιε ημ θοηυ λεκζζηή, ιπμνεί κα εθανιμζηεί απμοζία ημο θοημφ ηαζ υηακ μζ εενιμηναζίεξ ζημ έδαθμξ είκαζ ηαηάθθδθεξ βζα ημκ ιφηδηα (Kiewnick and Sikora, 2006). Δθανιμβή ηδξ ζοκζζηχιεκδξ δυζδξ ημο BIOACT μδδβεί ζοκήεςξ ζε επίπεδα πθδεοζιμφ 10 6 ζπμνίςκ ιφηδηα.g -1 εδάθμοξ πμο είκαζ απαναίηδηα βζα ημκ επανηή έθεβπμ ηςκ θοημπαναζζηζηχκ κδιαηςδχκ. Μεθέηεξ πμο έπμοκ βίκεζ ιε ημ ζοβηεηνζιέκμ ζηεφαζια έδεζλακ υηζ μ πθδεοζιυξ ημο ιφηδηα ιεζχκεηαζ ζηαδζαηά 96

97 ηαζ 6-8 εαδμιάδεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή θεάκεζ ζε επίπεδα 10 3 ηφηηανα g -1 εδάθμοξ (Roumpos, 2005). Πμθθαπθέξ εθανιμβέξ ημο ΡL 251 δζαζθαθίγμοκ επανηή πθδεοζιυ ημο ιφηδηα ζημ έδαθμξ βζα ιζα ιαηνά πνμκζηή πενίμδμ ηαζ μδδβμφκ ζε ηαθφηενα απμηεθέζιαηα (Kiewnick and Sikora, 2006). Δλαζηίαξ ηδξ παιδθήξ οπμθεζιιαηζηυηδηαξ ημο ζημ έδαθμξ πνμηείκεηαζ ζημοξ πνήζηεξ δ εθανιμβή κα επακαθαιαάκεηαζ ηάεε έλζ εαδμιάδεξ (U.S. Environmental Protection Agency, 2005) Εηδαληνθηόλα Nicosulfuron (2-[[[[4,6-dimethoxy-2-pyrimidinyl]amino]carbonyl]sulfonyl]-N,Ndimethyl-3-pyridinecarboxamide) είκαζ εηθεηηζηυ γζγακζμηηυκμ ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ. Απυ ηδκ είζμδμ ημο ζηδκ αβμνά ηδ δεηαεηία ημο 1990 ιέπνζ ζήιενα, πνδζζιμπμζείηαζ ιεηαθοηνςηζηά βζα ημκ έθεβπμ εηήζζςκ ηαζ πμθοεηχκ αβνςζηςδχκ ηαζ πθαηφθοθθςκ γζγακίςκ ηονίςξ ζε ηαθθζένβεζεξ ανααυζζημο, αθθά ηαζ ζε ηαθθζένβεζεξ αιπεθζμφ, νογζμφ, εζπενζδμεζδχκ, παηάηαξ, ημιάηαξ ηαζ ζυβζαξ (Zhang et al., 2012, Wu et al., 2010, James et al., 2006). ηδκ Δθθάδα, έπεζ έβηνζζδ βζα ηδκ ηαηαπμθέιδζδ ηςκ αβνςζηςδχκ γζγακίςκ ηαζ ηδξ ιμοπνίηζαξ (Echinochloacrus-galli) ζε ηαθθζένβεζεξ ανααυζζημο. Πνυζθαηα, ανέεδηε υηζ είκαζ απμηεθεζιαηζηυ επίζδξ βζα ηδκ ακηζιεηχπζζδ δφμ αηυιδ εζδχκ ημο βέκμοξ Echinochloa, ηςκ Ε. oryzoides ηαζ E. phyllopogon (Damalas et al., 2012). Σμ nicosulfuron ςξ ιέθμξ ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ ακαζηέθθεζ ηδ δνάζδ ημο εκγφιμο μλζημβαθαηηζηή ζοκεάζδ (ALS) ή ζοκεάζδ ημο οδνμλο-μλζημφ μλέμξ (AHAS), πμο είκαζ απαναίηδημ βζα ηδ αζμζφκεεζδ ηςκ αιζκμλέςκ ιε δζαηθαδζζιέκδ αθοζίδα αηυιςκ άκεναηα: ααθίκδ, θεοηίκδ, ζζμθεοηίκδ. Απμηέθεζια αοημφ ημο ιδπακζζιμφ δνάζδξ είκαζ δ ακαζημθή ηδξ ηοηηανμδζαίνεζδξ ηαζ ηδξ ζφκεεζδξ ηςκ πνςηεσκχκ θίβεξ διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή, δ μπμία αημθμοεείηαζ απυ ακαζημθή ηδξ αφλδζδξ ηςκ ιενζζηςιαηζηχκ ζζηχκ ηαζ μδδβεί ηεθζηά ζηδ κέηνςζδ ημο θοημφ ιεηά απυ 3-4 εαδμιάδεξ (Damalas et al., 2012, Baghestani et al., 2007, Sikkema et al., 2007). ε ακηίεεζδ ιε ηα ζοκδεζζιέκα γζγακζμηηυκα πμο εθανιυγμκηαζ ζε δυζεζξ > 1 kg ha -1, ημ nicosulfuron εθανιυγεηαζ ζοκήεςξ ζε δυζεζξ < 100 g ha -1. Δλαζηίαξ ηδξ παιδθήξ δυζδξ εθανιμβήξ ημο εεςνείηαζ αζθαθέξ βζα ημ πενζαάθθμκ ζοβηνζηζηά ιε άθθα γζγακζμηηυκα πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ παναδμζζαηά ζε ηαθθζένβεζεξ ανααυζζημο, ηαεχξ ιζηνυηενδ πμζυηδηα γζγακζμηηυκμο είκαζ δζαεέζζιδ βζα ιεηαθμνά εηηυξ ζηυπμο εθανιμβήξ (Regitano and Koskinen, 2008, Baghestani et al., 2007). 97

98 Χζηυζμ, υπςξ υθα ηα γζγακζμηηυκα ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ, ημ nicosulfuron είκαζ αζεεκέξ μλφ, ιε απμηέθεζια δ πνμζνυθδζδ ημο κα ιεζχκεηαζ ζε εδάθδ ιε ph>pka (pka=4.3) δδθαδή ζε εδάθδ ιε μοδέηενμ πνμξ αθηαθζηυ ph μπυηε ηαζ πανμοζζάγεζ αολδιέκδ δζαθοηυηδηα ζημ κενυ (400 mg L -1 ) ηαζ παιδθυ ζοκηεθεζηή μηηακυθδξ κενμφ (Kow= -0.36, ph= 5.0; Kow= -1.77, ph= 7.0). οκεπχξ, δφκαηαζ κα εηπθοεεί πνμηαθχκηαξ νφπακζδ ηςκ οπυβεζςκ οδάηςκ. Γεκ οπάνπεζ ςζηυζμ ηαιία ακαθμνά ακίπκεοζδξ ημο nicosulfuron ζηα επζθακεζαηά ηαζ οπυβεζα φδαηα (Regitano and Koskinen, 2008). Σμ nicosulfuron έπεζ ιζηνυ πνυκμ διζγςήξ εκηυξ ηςκ θοηχκ ανααμζίημο ( διένεξ) εκχ ιέζα ζηζξ 7 πνχηεξ διένεξ δζαζπάηαζ ημ 90% ηδξ μοζίαξ. ημ έδαθμξ μ πνυκμξ διζγςήξ ημο είκαζ ιεβαθφηενμξ (15-17 διένεξ) (Wu et al., 2008). Ζ θςηυθοζδ ημο nicosulfuron ζημ έδαθμξ είκαζ πενζμνζζιέκδ ηαζ θαιαάκεζ πχνα ηονίςξ ζηα επζθακεζαηά εδαθζηά ζηνχιαηα. ε υλζκα ηαζ μοδέηενα εδάθδ δ δζάζπαζδ ημο nicosulfuron βίκεηαζ ιε ζοκδοαζιυ πδιζηήξ οδνυθοζδξ ηαζ ιζηνμαζαηήξ δζάζπαζδξ, εκχ ζηα αθηαθζηά εδάθδ ζοκηεθείηαζ ιυκμ ιζηνμαζαηή δζάζπαζδ. Σμ ααηηήνζμ Serratia marcescens ζηέθεπμξ N80 πμο απμιμκχεδηε απυ έδαθμξ είπε ηδκ ζηακυηδηα κα δζαζπά απμηεθεζιαηζηά ημ nicosulfuron (Zhang et al., 2012) Γεσξγηθά θάξκαθα πνπ ρξεζηκνπνηνύληαη ζηε κεηαζπιιεθηηθή κεηαρείξηζε θξνύησλ Σα ιοηδημηηυκα thiabendazole (TBZ), imazalil (IMZ) ηαζ ortho-phenylphenol (OPP) ηαζ μζ ακηζμλεζδςηζηέξ μοζίεξ diphenylamine (DPA) ηαζ ethoxyquin (EQ), πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ βζα ημκ έθεβπμ ιεηαζοθθεηηζηχκ ιοηδημθμβζηχκ πνμζαμθχκ ηαζ ηδξ θοζζμθμβζηήξ οπμαάειζζδξ ηςκ ηανπχκ ηςκ απμεδηεοιέκςκ θνμφηςκ, ακηίζημζπα. Ζ πνήζδ ημοξ μδδβεί ζηδκ παναβςβή ιεβάθςκ υβηςκ οβνχκ απμαθήηςκ πμο ζοκζζημφκ ζδιακηζηή πδβή νφπακζδξ ηςκ θοζζηχκ μζημζοζηδιάηςκ. Πνμξ ηδκ ηαηεφεοκζδ αοηή ζοιαάθμοκ μνζζιέκα ζδζαίηενα παναηηδνζζηζηά αοηχκ ηςκ β.θ.. οβηεηνζιέκα, ηα ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ παναηηδνίγμκηαζ απυ ορδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα ζημ έδαθμξ ηαζ βεκζηυηενα ζημ πενζαάθθμκ. Μεηνήζεζξ πμο πναβιαημπμζήεδηακ ζηα πθαίζζα αλζμθυβδζδξ ηςκ θαηέθςκ βζα ηδκ έβηνζζδ πνήζδξ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ β.θ.. έδεζλακ ηζιέξ DT 50 πμο ηοιαίκμκηακ απυ διένεξ βζα ημ ΗΜΕ (EFSA 2010a) ηαζ διένεξ βζα ημ ΣΒΕ (EPA 2000, Aharonson and Kafkafi, 1975). Δπίζδξ, ηα TBZ, OPP, DPA ηαζ ΔQ επζδεζηκφμοκ ορδθή ημλζηυηδηα βζα ημοξ οδνυαζμοξ μνβακζζιμφξ (EFSA, 2010, ΔΡΑ 98

99 2006, 2002a, Drzyzga, 2003), εκχ ημ ΗΜΕ παναηηδνίγεηαζ ςξ ιεηνίςξ ημλζηυ βζα ημοξ οδνυαζμοξ μνβακζζιμφξ, ιε ηζιέξ LC 50 πμο ηοιαίκμκηαζ απυ 1,48-3,99 ppm (EPA 2002b). Σέθμξ, βζα ημ DPA ανέεδηε υηζ δ πνήζδ ημο οπυ ζοβηεηνζιέκεξ ζοκεήηεξ, ιπμνεί κα μδδβήζεζ ζηδκ παναβςβή μοζζχκ φπμπηςκ βζα ηανηζκμβέκεζδ ηαζ ιεηαθθαλζβέκεζδ (EFSA 2011) Μπθεηνθηόλα Thiabendazole (TBZ) (2-(4-thiazolyl)-1H-benz-imidazole): δζαζοζηδιαηζηυ αεκγζιζδαγμθζηυ ιοηδημηηυκμ, πμο εζζήπεδηε ζηδ βεςνβζηή πνάλδ ανπζηά ςξ κδιαηςδμηηυκμ, ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ζήιενα πνμζοθθεηηζηά αθθά ηαζ ιεηαζοθθεηηζηά βζα ημκ έθεβπμ ιοηδημθμβζηχκ πνμζαμθχκ (Botrytis cinerea, Cercospora sp, Nectria galligena, Penicillium expansum, Penicillium italicum, Verticillium sp.,) ηςκ θνμφηςκ ηαζ ηςκ θαπακζηχκ ηαηά ηδκ απμεήηεοζή ημοξ (Prousalis et al., 2004, Davidse and Flach, 1978, Allen and Gottlieb, 1970). Σμ ΣΒΕ πανειπμδίγεζ ηδκ ακάπηολδ ηςκ ιοηήηςκ πανειααίκμκηαξ ζηδκ δζαδζηαζία ηδξ ιίηςζδξ ηαζ ηδξ ηοηηανμδζαίνεζδξ. Ο ιδπακζζιυξ ηδξ ιοηδημημλζηήξ δνάζδξ ημο ΣΒΕ ζπεηίγεηαζ ιε ηδκ πανειπυδζζδ ημο ζπδιαηζζιμφ ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ ηδξ ιζηςηζηήξ αηνάηημο. Οζ ιζηνμζςθδκίζημζ ζπδιαηίγμκηαζ ιε πμθοιενζζιυ ηδξ πνςηεΐκδξ α-ημιπμοθίκδ. Ζ πνμζηυθθδζδ ημο ΣΒΕ ζηδ α- ημιπμοθίκδ ειπμδίγεζ ημκ πμθοιενζζιυ ηδξ, δ άηναηημξ δεκ ζπδιαηίγεηαζ, δ ιζηςηζηή δζαίνεζδ ζηαιαηά ηαζ μ ιφηδηαξ δεκ ιπμνεί κα μθμηθδνχζεζ ηδκ ιίηςζδ. διακηζηυ υιςξ νυθμ βζα ηδ ιοηδημημλζηυηδηα ημο ΣΒΕ παίγεζ ηαζ δ πανειπυδζζδ ημο ζπδιαηζζιμφ ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ ημο ηοηηανμπθάζιαημξ απυ ημοξ μπμίμοξ ελανηάηαζ μ πνμζακαημθζζιυξ ηδξ αφλδζδξ ηςκ ιοηδθζαηχκ οθχκ (Zζχβαξ ηαζ Μάνημβθμο, 2010, Danaher et al., 2007, Lacey, 1990, Davidse and Flach, 1978, Allen and Gottlieb, 1970). Imazalil (IMZ) (1-[2-(2,4-dichlorophenyl)-2-(2-propenyloxy)ethyl]-1Himidazole): Γζαζοζηδιαηζηυ ιοηδημηηυκμ ιε πνμθδπηζηή ηαζ εεναπεοηζηή δνάζδ (Lopez and Riba, 1999). Δζζήπεδηε ζημ ειπυνζμ ημ 1977 ιε ηα ειπμνζηά μκυιαηα Fungaflor, Fungazil, ηαζ Fecundal (Εζχβαξ ηαζ Μανημβθμο, 2010). Δίκαζ απμηεθεζιαηζηυ ζε εονφ θάζια ιοηήηςκ πμο πνμζαάθμοκ μπςνμθυνα (ιήθα, απθάδζα, ιπακάκεξ, εζπενζδμεζδή), ηδπεοηζηά ηαζ ηαθθςπζζηζηά θοηά. οκζζηάηαζ επίζδξ βζα ηδκ πνμζηαζία ηςκ ζπυνςκ ηαζ είκαζ πμθφ απμηεθεζιαηζηυ εκάκηζα ζημοξ ιφηδηεξ ηςκ βεκχκ Fusarium, Helminthosporium, ηαζ Septoria spp. (Lopez and Riba, 99

100 1999). Υνδζζιμπμζείηαζ ιεηαζοθθεηηζηά βζα ηδκ πνμζηαζία ηςκ ηανπχκ απυ ημοξ ιφηδηεξ Penicillium digitatum ηαζ Penicillium italicum, Botrytis spp, Diplodia spp, Alternaria citri, Phomopsis sp ηαζ Diaporte citri, μζ μπμίμζ ακαπηφζζμκηαζ ζηα θνμφηα ηαζ ζδίςξ ζηα εζπενζδμεζδή ηαηά ηδκ απμεήηεοζή ημοξ (Kaplan and Dave 1979). Ακήηεζ ζηδκ μιάδα ηςκ ζιζδαγμθζηχκ ιοηδημηηυκςκ ηα μπμία ακαζηέθθμοκ ηδκ αζμζφκεεζδ ηδξ ενβμζηενυθδξ ζηζξ ηοηηανζηέξ ιειανάκεξ ηςκ ιοηήηςκ. οβηεηνζιέκα, ημ ΗΜΕ ακαζηέθθεζ ηδ ζφκεεζδ ηςκ C-4-απμιεεοθζμιέκςκ (desmethyl) ζηενμθχκ, υπςξ δ ενβμζηενυθδ, ηαζ πνμηαθεί ζοζζχνεοζδ ιέεοθ- ηαζ δζιέεοθ- παναβχβςκ, επδνεάγμκηαξ ηδκ ακάπηολδ ηςκ ιοηδθίςκ ηαζ βεκζηά ημκ ιεηααμθζζιυ ηςκ ιοηήηςκ (Lopez-Garcia et al., 2003, Schwinn, 1983, Siegel and Ragsdale, 1978). ηα ζηεοάζιαηα πμο ηοηθμθμνμφκ ζηδκ αβμνά πενζέπεηαζ ςξ ναηειζηυ ιίβια ηςκ δφμ εκακηζμιενχκ ημο. Έπεζ ζπεηζηά παιδθή δζαθοηυηδηα ζημ κενυ (182 mg L -1 ) ηαζ βζ αοηυ ακαιεζβκφεηαζ ιε οβνυ ηενί ηαζ ημ ιίβια ιπμνεί κα εθανιμζηεί ιέζς ρεηαζιμφ, δζαανμπήξ ηαζ άθθςκ ηεπκζηχκ ζε θνμφηα ηαηά ηδκ ιεηαζοθθεηηζηή ημοξ ιεηαπείνζζδ. H δνάζδ ημο θαίκεηαζ κα ελανηάηαζ απυ ημ ph ηαζ ειθακίγεηαζ αολδιέκδ βζα ηζιέξ ph>pka (pka= 6.53) (Siegel and Ragsdale, 1978). Ο ηφνζμξ ιεηααμθίηδξ ημο ΗΜΕ είκαζ ημ imazalil-ethanol [1-(2,4-dichlorophenyl)-2-(1Himidazole-1-yl)-1-ethanol] ηαζ απακηάηαζ ζοπκά ιαγί ιε ηδκ ιδηνζηή έκςζδ ζηα θνμφηα πμο έπμοκ δεπηεί εθανιμβή (Yoshioka et al., 2003). ημ έδαθμξ, ειθακίγεζ ιέηνζα ςξ ορδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα ιε πνυκμοξ διζγςήξ πμο ηοιαίκμκηαζ ζε ενβαζηδνζαηέξ ιεθέηεξ απυ διένεξ. Tμ ηφνζμ πνμσυκ ιεηααμθζζιμφ ημο imazalil ηαζ ζημ έδαθμξ είκαζ ημ imazalil-ethanol, ημ μπμίμ είκαζ θζβυηενμ οπμθεζιιαηζηυ αθθά ειθακίγεηαζ κα ακαζηέθθεζ ηδκ κζηνμπμίδζδ ζε πμζμζηυ >25% (ΔFSA, 2010). Σμ ΗΜΕ πανμοζζάγεζ ιέηνζα ημλζηυηδηα ζημοξ οδνυαζμοξ μνβακζζιμφξ υπςξ ράνζα, αζπυκδοθα ηαζ οδνμπανή θοηά (EFSA, 2010). Ortho-phenyl-phenol (OPP): Δονέςξ θάζιαημξ θαζκμθζηυ ιοηδημηηυκμ, πμο πνδζζιμπμζείηαζ ιεηαζοθθεηηζηά βζα ηδκ ακηζιεηχπζζδ ζήρεςκ ηανπχκ, ηονίςξ εζπενζδμεζδχκ, αθθά ηαζ ζηδκ απμθφιακζδ ηςκ οθζηχκ ζοζηεοαζίαξ (Appel, 2000, Saad et al., 2004). Δθανιυγεηαζ ζοκήεςξ ιε ηδκ ηεπκζηή ημο ηενχιαημξ. Άθθεξ ιέεμδμζ εθανιμβήξ ημο είκαζ δ ειαάπηζζδ ζε αθνυ ή ζε δζάθοια ηαζ μ ρεηαζιυξ ιε βαθάηηςια κενμφ- 100

101 ηενζμφ (Dezman et al., 1986, Papadopoulou-Mourkidou,1991). Με δνάζδ ηςκ αηιχκ ημο ιπμνεί κα πνμζηαηεφεζ ηα οθζηά ζοζηεοαζίαξ ηςκ ηανπχκ απυ πνμζαμθέξ απυ ημοξ ιφηδηεξ Penicillium italicum ηαζ P. digitatum, Diplodia natalensis, Botrytis cinerea ηαζ άθθα είδδ (Appel, 2000). Σμ ΟΡΡ εεςνείηαζ πανάβμκηαξ ηανηζκμβέκεζδξ (Appel, 2000). Σμ ΟΡΡ ηαζ μζ ιεηααμθίηεξ ημο πανμοζζάγμοκ επίζδξ ημλζηυηδηα ζε μνβακζζιμφξ ιδ-ζηυπμοξ. Δνβαζηδνζαηέξ ιεθέηεξ έδεζλακ υηζ ημ ΟΡΡ ηαζ μ ιεηααμθίηδξ ημο, phenylhydroquinone (PHQ), ιπμνμφκ κα πνμηαθέζμοκ ιεηαθθάλεζξ βμκζδίςκ ζε εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ, ηαεχξ επίζδξ ιείςζδ ηδξ βμκζιυηδηαξ ηαζ δζαηαναπέξ ηδξ ακάπηολδξ (Kolbe et al., 2006). Μία απυ ηζξ ζδιακηζηυηενεξ μδμφξ απμδυιδζδξ ημο ΟΡΡ ζηδκ αηιυζθαζνα, είκαζ δ θςηυθοζδ, ακ ηαζ πναβιαημπμζείηαζ ιε αναδφ νοειυ, ηαεχξ ημ ΟΡΡ ιπμνεί κα αλζμπμζήζεζ ιυκμ έκα ζηεκυ εφνμξ ιήημοξ ηφιαημξ ημο θςηυξ (Gore et al., 1971, Sarakha et al.,1993). Οζ ααζζηέξ μδμί απμδυιδζδξ ημο ζημ κενυ είκαζ δ θςηυθοζδ, δ οδνυθοζδ ηαζ δ ιζηνμαζαηή δζάζπαζδ. Ο πνυκμξ διζγςήξ ημο ΟΡΡ ζημ έδαθμξ ηοιαίκεηαζ ιεηαλφ 1-7 διενχκ (Howard et al., 1991) πλζεηηθέο ελώζεηο κε αληηνμεηδσηηθή δξάζε πνπ ρξεζηκνπνηνύληαη ζηε κεηαζπιιεθηηθή κεηαρείξηζε ησλ θξνύησλ Diphenylamine (DPA): Ακηζμλεζδςηζηυ ηδξ μιάδαξ ηςκ δζανοθ-αιζκχκ, ιε εονφ θάζια εθανιμβχκ. Υνδζζιμπμζείηαζ ηονίςξ ςξ ζηαεενμπμζδηήξ πνμςεδηζηχκ εηνδηηζηχκ οθζηχκ, αθθά ηαζ ζηδκ ζφκεεζδ ηαζ αζμιδπακζηή παναβςβή άθθςκ μοζζχκ υπςξ εθαζηζηά, ααθέξ ηαζ θανιαηεοηζηά πνμσυκηα (Drzyzga, 2003). ηδκ βεςνβία ανίζηεζ εθανιμβή ηαηά ηδκ ιεηαζοθθεηηζηή επελενβαζία ηςκ θνμφηςκ ηαζ ηονίςξ ηςκ ιδθμεζδχκ (ιήθςκ ηαζ απθαδζχκ), πνμζηαηεφμκηάξ ηα απμηεθεζιαηζηά απυ ηδκ ειθάκζζδ ηδξ ηαζηακυπνςζδξ ηδξ επζδενιίδαξ ηςκ ηανπχκ (scald) ηαζ ηδκ αηυθμοεδ επζθακεζαηή κέηνςζδ (Robatscher et al., 2012, Moggia et al,. 2010, Mattheis and Rudell, 2008, Rudell et al., 2006, Drzyzga, 2003). H εθανιμβή ημο βίκεηαζ ιε ειαάπηζζδ ηαζ ρεηαζιυ ή δζαανμπή ηςκ ηανπχκ (Robatscher et al., 2012). Ζ ηαζηακυπνςζδ ηδξ επζδενιίδαξ ηςκ ηανπχκ (scald) μθείθεηαζ ζηδκ μλείδςζδ ημο α-θανκεζεκίμο, εκυξ ηενπεκίμο θοζζημφ ζοζηαηζημφ ηδξ ηδνχδμοξ επζδενιίδαξ ηςκ ηανπχκ ηςκ ιδθμεζδχκ. Ζ μλείδςζδ ημο α-θανκεζεκίμο έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ παναβςβή δναζηζηχκ ζογεοβιέκςκ ηνζεκχκ (conjugated trienes), πμο ιε ηδ ζεζνά ημοξ ακηζδνμφκ ιε ηα θζπίδζα ηαζ ηζξ πνςηεΐκεξ ιεηααάθθμκηαξ ηδκ αηεναζυηδηα ηςκ 101

102 ηοηηανζηχκ ιειανακχκ ηαζ επζηνέπμκηαξ ηδκ επαθή ιε μλεζδςηζηά έκγοια ηαζ ηα ακηίζημζπα οπμζηνχιαηά ημοξ. Απμηέθεζια υθςκ ηςκ παναπάκς δζαδζηαζζχκ είκαζ δ πνυηθδζδ ημο παναηηδνζζηζημφ ηαθέ πνςιαηζζιμφ ηδξ επζδενιίδαξ ηςκ ιδθμεζδχκ ιε ηδ ιμνθή οδανχκ ηδθίδςκ, αηυια ηαζ δ κέηνςζδ ηςκ επζδενιζηχκ ηοηηάνςκ (Moggia et al., 2010, Mattheis and Rudell, 2008, Rudell et al., 2006). Σμ DPA ιε ηδκ ακηζμλεζδςηζηή ημο δνάζδ πανειααίκεζ ηαζ πανειπμδίγεζ ηδκ μλείδςζδ ημο α- θανκεζεκίμο, πνμζθένμκηαξ ςξ οπυζηνςια ακηίδναζδξ ζημοξ πανάβμκηεξ μλείδςζδξ ημ οδνμβυκμ ηδξ ζιίκδξ ημο. Σμ DPA ςξ ανςιαηζηή αιίκδ, είκαζ ελαζνεηζηά δναζηζηή έκςζδ ηαζ ζπδιαηίγεζ πθήεμξ ιεηααμθζηχκ. Αοηυ ημ παναηηδνζζηζηυ ηδξ μθείθεηαζ ζημ άημιμ οδνμβυκμο ηδξ ζιίκδξ πμο οπυηεζηαζ ζε δθεηηνμκζυθζθμ ακηζηαηάζηαζδ (Drzyzga, 2003). Μεηαλφ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημο DPA πμο έπμοκ ανεεεί ζε ηανπμφξ ιήθςκ είκαζ ηα 2-, 3- ηαζ 4-hydroxy-diphenylamine, (2-OH-DPA, 3-OH-DPA, 4-OH-DPA, ακηίζημζπα), 2,4-dihydroxy-diphenylamine ηαζ ζκδμθαζκυθδ (indophenol), N-nitrosodiphenylamine (NO-DPA), 2-nitrodiphenylamine (2NO 2 -DPA), ηαζ 4- nitrodiphenylamine (4NO 2 DPA), 4-methoxy-diphenylamine (4-MeO-DPA) ηαζ 3- methoxy-diphenylamine (3-MeO-DPA). Χζηυζμ, μ ηφνζμξ ιεηααμθίηδξ ημο DPA πμο ζπδιαηίγεηαζ ηαηά ηδκ απμεήηεοζδ ηςκ ιήθςκ είκαζ ημ 4-hydroxy-diphenylamine (4- OH-DPA) ημ μπμίμ είκαζ δναζηζηυ ηαζ ελίζμο απμηεθεζιαηζηυ ζηδκ ακηζιεηχπζζδ ηδξ ηαζηακυπνςζδξ ηδξ επζδενιίδαξ ηςκ ηανπχκ (Mattheis and Rudell, 2008, Rudell et al., 2006). ημοξ ιεηααμθίηεξ ημο DPA μζ μπμίμζ πανάβμκηαζ ηαηά ηδκ απμεήηεοζδ ηςκ θνμφηςκ ζοβηαηαθέβμκηαζ επίζδξ ηαζ μζ κζηνμγαιίκεξ (Drzyzga, 2003) πμο απμηεθμφκ φπμπηεξ βζα ηανηζκμβέκεζδ μοζίεξ. Ο ζπδιαηζζιυξ αοηχκ ηςκ εκχζεςκ απμηέθεζε έκα απυ ηα πνμαθήιαηα πμο μδήβδζακ ζηδκ απυζονζδ ημο DPA απυ ηδκ Δονςπασηή αβμνά ημ 2009 (EFSA 2011). Γεκζηά, ημ DPA ηαζ ηα πανάβςβά ημο εεςνμφκηαζ απυ ημοξ ζμαανυηενμοξ νφπμοξ ημο πενζαάθθμκημξ ηαζ έπμοκ εκημπζζηεί ζημ έδαθμξ, ζηα οπυβεζα ηαζ ζηα επζθακεζαηά κενά. Γμηζιέξ πμο έπμοκ βίκεζ έςξ ηχνα ζε πεζναιαηυγςα ηαηαδεζηκφμοκ ηδκ ηανηζκμβυκμ ηαζ ιεηαθθαλζβυκμ δνάζδ ημο DPA ζημοξ δζάθμνμοξ μνβακζζιμφξ (Greim et al.,1998, Lachance et al., 1999). Ethoxyquin (EQ) (1,2-dihydro-6-ethoxy-2,2,4-trimethyl-quinoline): ακηζμλεζδςηζηυ ηδξ μιάδαξ ηςκ ηζκμθζκχκ ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ ακηζιεηχπζζδ ηδξ ηαζηακυπνςζδξ ηδξ επζδενιίδαξ ηςκ ιδθμεζδχκ (superficial scald). Δθανιυγεηαζ 102

103 ιεηαζοθθεηηζηά ιε δζαανμπή, ρεηαζιυ ή ιέζς ηοθίβιαημξ ζε ειπμηζζιέκμ ιε ημ ΔQ πανηί. Όπςξ ηαζ ημ DPA, πανειπμδίγεζ ηδκ μλείδςζδ ημο ηενπεκίμο α-θανκεζέκζμ ηαζ ζοκεπχξ ηδκ παναβςβή ηςκ ημλζηχκ ιεηααμθζηχκ ημο πμο πνμηαθμφκ ηδ κέηνςζδ ηςκ επζδενιζηχκ ηοηηάνςκ (Εζχβαξ ηαζ Μάνημβθμο, 2010, Winell, 1976). Ζ ακηζμλεζδςηζηή ημο δνάζδ ημ ηαεζζηά επίζδξ απμηεθεζιαηζηυ ςξ ζοκηδνδηζηυ πνςζηζηχκ ηαζ θζπμδζαθοηχκ αζηαιζκχκ ζε ηνμθέξ υπςξ ράνζ, ηνέαξ, ιπαπανζηά, θίπδ, έθαζα ηαζ γςμηνμθέξ (He and Ackman, 2000, Schreier and Greene, 1997, Van Deren, 1966, Vinias et al., 1991, Perfetti et al., 1981, Witt et al., 1972). Γεκζηά δ ακηζμλεζδςηζηή δνάζδ ημο ΔQ έβηεζηαζ ζηδκ ζδζυηδηα ημο κα ακηζδνά άιεζα ιε ηζξ εθεφεενεξ νίγεξ μλοβυκμο πμο ζοκακηά ηαεχξ πανειαάθθεηαζ πνμζηαηεφμκηαξ άθθεξ εκχζεζξ. Σέζζενζξ ηφνζμζ ιεηααμθίηεξ πνμηφπημοκ απυ ηζξ ακηζδνάζεζξ μλείδςζδξ ημο ΔQ: 2,4,6-dimethylquinoline, quinμne-imine-n-oxide, quinμne-imine, ηαζ ethoxyquin1,8-dimer (Taimr et al., 1991, Brannegan, 2000). Σα πνμσυκηα μλείδςζδξ ημο ΔQ έπμοκ ελίζμο απμηεθεζιαηζηή ακηζμλεζδςηζηή δνάζδ, βεβμκυξ πμο δζαηνίκεζ ημ ΔQ απυ άθθεξ ακηζμλεζδςηζηέξ μοζίεξ (Shah et al., 2005). Σμ ΔQ πανμοζζάγεζ ιέηνζα δζαθοηυηδηα ζημ κενυ ( mg L -1 ), ιέηνζα πηδηζηυηδηα, δεκ είκαζ άιεζα αζμαπμδμιήζζιμ ηαζ μ πνυκμξ διζγςήξ ημο ζηδκ αηιυζθαζνα είκαζ 2 διένεξ (EPA, 2004). Ακ ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ιυκμ ζε εζςηενζημφξ πχνμοξ ηαζ ηα οβνά απυαθδηα πμο πανάβμκηαζ απυ ηδκ εθανιμβή ημο ζοκήεςξ ακαηοηθχκμκηαζ, δ πανμοζία ημο EQ ζηα επζθακεζαηά ηαζ ζηα οπυβεζα φδαηα, ηαεχξ ηαζ ζημ έδαθμξ δεκ ιπμνεί κα απμηθεζζηεί. ημ έδαθμξ ηαζ βεκζηυηενα ζημ πενζαάθθμκ ιεηααμθίγεηαζ ζηα 2,4,6- dimethylquinoline, quinμne-imine ηαζ ethoxyquin1,8- dimer (EFSA, 2010). Σμ ΔQ ακ ηαζ πανμοζζάγεζ ορδθή μλεία ημλζηυηδηα ζε οδνυαζμοξ μνβακζζιμφξ υπςξ ηα ράνζα, ηα άθβδ ηαζ ηα αζπυκδοθα, δεκ θαίκεηαζ κα επζδνά ανκδηζηά ζημοξ ιζηνμμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ (EFSA, 2010). Ζ δνάζδ ημο ζε δυζεζξ < 75 mg L -1 δεκ ήηακ ακαζηαθηζηή βζα ιζα ζφκεεηδ ημζκυηδηα ιεεακζμβυκςκ ααηηδνίςκ, εκχ ακηίεεηα ήηακ ηα απμηεθέζιαηα ζηδκ πενίπηςζδ πμο δ δυζδ λεπενκμφζε ηα 150 mg L -1 (Shah et al., 2005). To EQ δεκ ζοιπενζθήθεδηε ζημ Πανάνηδια Η ηδξ Κμζκμηζηήξ Οδδβίαξ 91/414/EEC, βζαηί δεκ οπήνλε ηάπμζα εηαζνεία πμο κα οπμζηδνίλεζ ηδκ πνήζδ ημο. Χζηυζμ, δ έκηαλδ ημο ζημ Πανάνηδια Η ανίζηεηαζ οπυ επακαλζμθυβδζδ (Calvo, 2010). 103

104 Δηθόλα Υδιζηή δμιή ηςκ ζοκεεηζηχκ κδιαηςδμηηυκςκ (α) oxamyl ηαζ (α) fluensulfone. Δηθόλα Υδιζηή δμιή ημο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron. Δηθόλα Υδιζηή δμιή ηςκ ιοηδημηηυκςκ (α) thiabendazole, (α) imazalil ηαζ(β) ortho-phenylphenol. Δηθόλα Υδιζηή δμιή ηςκ ακηζμλεζδςηζηχκ (α) diphenylamine ηαζ (α) ethoxyquin. 104

105 1.7. ηόρνη ηεο παξνύζαο δηαηξηβήο ηυπμξ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ ήηακ δ δζενεφκδζδ εκυξ εονέςξ θάζιαημξ μοζζχκ ιε δνάζδ βεςνβζηχκ θανιάηςκ, ηυζμ ζοκεεηζηχκ υζμ ηαζ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ βζα ηα μπμία δεκ οπάνπμοκ επανηή ζημζπεία ζηδ αζαθζμβναθία, υζμκ αθμνά (1) ζηδκ ζοιπενζθμνά ημοξ ζημ έδαθμξ ηαζ (2) ζηδκ επίδναζδ ημοξ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Γζα ηδκ επίηεολδ ημο παναπάκς ζηυπμο πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα αβνμφ ηαζ ενβαζηδνίμο ηαζ έβζκε πνήζδ αζμπδιζηχκ ηαζ ιμνζαηχκ ηεπκζηχκ ακάθοζδξ. ηα πθαίζζα ημο παναπάκς ηεκηνζημφ ζηυπμο ηέεδηακ μζ ελήξ επζιένμοξ ζηυπμζ: 1) Ζ αεθηζζημπμίδζδ ηδξ ιεευδμο ακάθοζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ (PLFAs) ηαζ δ πεναζηένς πνήζδ ηδξ βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ επίδναζήξ ζοκεεηζηχκ (oxamyl ηαζ fluensulfone) ηαζ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ (QLAgri ηαζ BIOACT ) βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. 2) Ζ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ημο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ. 3) Ζ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ημο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron ζηδκ ημζκυηδηα ηςκ δεκδνυιμνθςκ ιοημννζγζηχκ ιοηήηςκ (ΓΜΜ) 4) Ζ ιεθέηδ (α) ηδξ απμδυιδζδξ ηςκ ιοηδημηηυκςκ (thiabendazole, imazalil, ortho-phenylphenol) ηαζ ακηζμλεζδςηζηχκ (diphenylamine, ethoxyquin) πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ιεηαζοθθεηηζηά ζηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ ηαζ (α) ηδξ επίδναζδξ ημοξ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. 105

106 1.8. Βηβιηνγξαθία Adair, K.L., Schwartz, E. (2008) Evidence that ammonia-oxidizing archaea are more abundant than ammonia-oxidizing bacteria in semiarid soils of Northern Arizona, USA. Microbiol Ecol 56: Aktar, M.W., Sengupta, D., Chowdhury, A. (2009) Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisc Toxicol 2: Allen, P.M., Gottlieb, D. (1970) Mechanism of action of the fungicide thiabendazole, 2-(4 -thiazolyl) bendimidazole. Appl Microbiol20: Anastasiadis, I.A., Giannakou, I.O., Prophetou-Athanasiadou, D.A., Gowen, S.R. (2008) The combined effect of the application of a biocontrol agent Paecilomyces lilacinus, with various practices forthe control of root-knot nematodes. Crop Protection 27: Andreu, V., Pico, Y. (2004) Determination of pesticides and their degradation products in soil: a critical review and comparison of methods. Trends in Analytical Chemistry 23: Appel, K.E. (2000) The carcinogenicity of the biocide ortho-phenylphenol. Arch Toxicol 74: Argentieri, M.P., D Addabbo, T., Tava, A., Agostinelli, A., Jurzysta, M., Avato, P. (2008) Evaluation of nematicidal properties of saponins from Medicago spp. Eur J Plant Pathol 120: Auchtung, T.A., Shyndriayeva, G., Cavanaugh, C.M. (2011) 16S rrna phylogenetic analysis and quantification of Korarchaeota indigenous to the hot springs of Kamchatka, Russia.Extremophiles 15: Auge, R.M. (2001) Water relations, drought and vesicular-arbuscular mycorrhizal symbiosis. Mycorrhiza 11: Baghestani, M.A., Zand, E., Soufizahed, S., Eskandari, A., PourAzar, R., Veysi, M., Nassirzadeh, N. (2007) Efficacy evaluation of some dual purpose herbicides to control weeds in maize (Zea mays L.).Crop Protection 26: Bago, B., Pfefffer, P.E., Abubaker, J., Jun, J., Allen, J.W., Brouilette, J., Douds, D.D., Lammers, P.J., Shachar-Hill, Y. (2003) Carbon export from arbuscular mycorrhizal roots involves the translocation of carbohydrate as well as lipid. Plant Physiol 131:

107 Bago, B., Pfefffer, P.E., Shachar-Hill, Y. (2000) Carbon metabolism and transport in arbuscular mycorrhizas. Plant Physiol 124: Baldrian, P. (2008) Enzymes of saprotrophic basidiomycetes.british Mycological Society Symposia Series 28 (C): Bedini, S., Avio, L., Sbrana, C., Turrini, A., Migliorini, P., Vazzana, C., Giovannetti, M. (2013) Mycorrhizal activity and diversity in a long-term organic Mediterranean agroecosystem. Biol Fertil Soils (in press, doi: /s ). Bending, G.D., Rodriguez-Cruz, M.S., Lincoln, S.D. (2007) Fungicide impacts on microbial communities in soils with contrasting management histories. Chemosphere 69: Berg, J.M., Tymoczko, J.L., StryerL. (2004) Βζμπδιεία, Συιμξ 1, Πακεπζζηδιζαηέξ Δηδυζεζξ Κνήηδξ. Bergmann, D.J., Hooper, A.B. (1994) Sequence of the gene, amob, for the 43kDa polypeptide of ammonia monooxygenase of Nitrosomonas europaea. Biochem Biophys Res Commun 204: Beulke, S., Dubus, I. G., Brown, C. D., Gottesburen, B. (2000) Simulation of pesticide persistence in the field on the basis of laboratory datasa review. J Environ Qual 29: Bharadwaj, A., Sharma, S. (2006) Role of arbuscular mycorrhizae in pest management.international Journal of Ecology and Environmental Sciences 32: Blasioli, S., Braschi, I., Gessa, C.E. (2011) The fate of herbicides in soil. In: Herbicides and Environment. Edited by Dr Andreas Kortekamp. Chapter 8, pp Bolan, N.S. (1991) A critical review on the role of mycorrhizal fungi in the uptake of phosphorus by plants. Plant Soil 134: Bollag, J.-M., Mertz, T., Otjen, L. (1994) Role of microorganisms in soil bioremediation. In: Bioremediation through Rhizosphere Technology; Anderson et al.; ACS Symposium series; American Chemical Society: Washington DC. Bonfante, P., Genre, A. (2010) Mechanisms underlying beneficial plant fungus interactions in mycorrhizal symbiosis.nature Communications, Article number: 48. In: doi: /ncomms

108 Borie, F., Rubio, R., Morales, A. (2008) Arbuscular mycorrhizal fungi and soil aggregation. J Soil Sci Plant Nutr 8: Bossio, D.A., Scow, K.M., Gunapala, N., Graham, K.J. (1998) Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microb Ecol 36:1-12. Brannegan, D.R. (2000) Analysis of ethoxyquin and its oxidation products using supercritical fluid extraction and High Performance Liquid Chromatography with chemiluminescent nitrogen detection.master thesis. Βrochier-Armanet, C., Boussau, B., Gribaldo, S., Forterre, P. (2008) Mesophilic crenarheota: Proposal for a third archaeal phylum, the Thaumarheota. Nature Reviews Microbiology 6: Bromilow, R.H., Baker, R.J., Freeman, M.A.H., Gorog, K. (1980) The degradation of aldicarb and oxamyl in soil. Pestic Sci11: Bruns, T. (2006) Evolutionary biology: A kingdom revised. Nature 443: Cáceres, T.P., He, W., Megharaj, M., Naidu, R. (2009) Effect of insecticide fenamiphos on soil microbial activities in Australian and Ecuadorean soils. J Environ Sci Health B44: Calderon, J.F., Jackson, L.E., Scow, K.M., Rolston, D.E. (2000)Microbial responses to simulated tillage in cultivated and uncultivated soils. Soil Biol Biochem 32: Calvo, G. (2010) Antioxidant use in apple and pear storage. PartI-Regulatory Situation. (in: Casieri, L., Anastasi, A., Prigione, V., Varese, G.C. (2010) Survey of ectomycorrhizal, litter-degrading, and wood-degrading Basidiomycetes for dye decolorization and ligninolytic enzyme activity. Antoniee van Leeuwenhoek 98: Cernohlavkova, J., Jarkovsky, J., Hofman, J. (2009) Effects of fungicides mancozeb and dinocap on carbon and nitrogen mineralization in soils. Ecotoxicologyand Environmental Safety72: Chain, P., Lamerdin, J., Larimer, F. (2003) Complete genome sequence of the ammonia-oxidizing bacterium and obligate chemolithoautotroph Nitrosomonas europaea. J Bacteriol 185:

109 Chapagain, B.P., Wiesman, Z., Tsor (Lahkim), L. (2007) In vitro study of the antifungal activity of saponin-rich extracts against prevalent phytopathogenic fungi.industrial Crops and Products 26: Chen, X.-P., Zhu, Y.-G., Xia, Y., Shen, J.-P., He J.-Z. (2008) Ammonia-oxidizing archaea: important players in paddy rhizosphere soil? Environmental Microbiology 10: Chowdhury, A., Pradhan, S., Saha, M., Sanyal, N. (2008) Impact of pesticides on soil microbiological parameters and possible bioremediation strategies.indian J Microbiol 48: Clement, B.G., Kehl, L.E., DeBord, K.L., Kitts, C.L. (1998) Terminal restriction fragment patterns (TRFLPs), a rapid, PCR-based method for the comparison of complex bacterial communities.journal of Microbiological Methods 31: Colombo, C., Palumbo, G., Sannino, F., Gianfreda, L. (2002) Chemical and biochemical indicators of managed agricultural soils.17th World Congress of Soil Science, Bangkok, Thailand, vol. 1740, p.p 1 9. Damalas, C.A., Lithourgidis, A.S., Eleftherohorinos, I.G. (2012) Echinochloa species control in maize (Zea mays L.) with sulfonylurea herbicides applied alone and in mixtures with broadleaf herbicides. Crop Protection 34: Danaher Μ., De Ruyckb, Ζ., Crooks, S.R.H., Dowling, G., O Keeffe, M. (2007) Review of methodology for the determination of benzimidazole residues in biological matrices. Journal of Chromatography B 845: Das, P., Pal, R., Chowdhury, A. (2007) Effect of novaluron on microbial biomass, respiration, and fluorescent diacetate-hydrolyzing activity in tropical soils. Biol Fertil Soils 44: Das, S.K., Varma, A. (2011) Role of enzymes in maintaining soil health. In G. Shukla and A. Varma (eds.), Soil Enzymology, Soil biology 22, Chapter 2, pp Davidse, L.C., Flach, W. (1978) Interaction of thiabendazole with fungal tubulin. Biochimica et Biophysica Acta 543: De Boer, W., Klein Gunnewiek, P.J.A., Veenhuis, L.M., Bock, E., Laanbroek, E.J. (1991) Nitrification at low ph by aggregated chemolithotrophic bacteria. Applied and Environmental Microbiology 57:

110 de la Torre, J.R., Walker, C.B., Ingalls, A.E., Könneke, M., Stah, D.A. (2008) Cultivation of a thermophilic ammonia oxidizing archaeon synthesizing crenarchaeol. Environ Microbiol 10: Demanou, J., Sharma, S., Dorfler,U., Schroll, R., Pritsch, K., Njine, T., Bausenwein, U., Monkiedje, A., Munch, J.C., Schloter, M. (2006) Structural and functional diversity of soil microbial communities as a result of combined applications of copper and mefenoxam. Soil Biol Biochem 38: Dezman, D. J., Nagy, S., and Brown, G. B. (1986) Postharvest fungal decay control chemicals: treatments and residues in citrus fruits.residue Reviews 97: Di, H.J., Cameron, K.C., Shen, J.-P., Winefield, C.S., O Callaghan, M., Bowatte, S., He, J.-Z. (2010) Ammonia- oxidizing bacteria and archaea grow and under contrasting soil nitrogen conditions. FEMS Microbiol Ecol 72: Dickson, S. (2004) The Arum-Paris continuum of mycorrhizal symbioses. New Phytol 163: Drenovsky, R.E., Elliott, G.N., Graham, K.J., Scow, K.M. (2004) Comparison of phospholipid fatty acid (PLFA) and total soil fatty acid methyl esters (TSFAME) for characterizing soil microbial communities. Soil Biol Biochem 36: Drijber, R.A., Doran, J.W., Parkhurst, A.M., Lyon, D.J. (2000) Changes in soil microbial community structure with tillage under long-term wheat fallow management.soil Biol Biochem 32: Drzyzga, O. (2003) Diphenylamine and derivatives in the environment: a review. Chemosphere 53: Duineveld, B.M., Kowalchuk, G.A., Keijzer, A., van Elsans, J.D., van Veen, J.A. (2001) Analysis of the bacterial communities in the rhizosphere of chrysanthemum via denaturating gradient gel electrophoresis of PCR-amplified 16S rrna as well as DNA fragments coding for 16S rrna. Appl Environ Microbiol 67: Dutta, M., Sardar, D., Pal, R., Kole, R.K. (2010) Effect of chlorpyrifos on microbialbiomass and activities in tropical clay loam soil. Environ Monit Assess 160: Edwards, C.A., Subler, S., Chen, S.K., Bogomolov, D.M. (1996) Essential criteria for selecting bioindicator species, processes, or systems to assess the environmental impact of chemicals on soil ecosystems. In: New approaches to the development 110

111 of bioindicator systems for soil pollution, Eds: N.M. van Straalen, d.a. Krivolutskii). Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, Eivazi, F., Tabatabai, M.A. (1988). Glucosidases and galactosidases in soils.soil Biol Biochem 20: El Fantroussi, S., Verschuere, L., Verstraete, W., Top, E.M. (1999) Effect of phenylurea herbicides on soil microbial communities estimated by analysis of 16S rrna gene fingerprint and community-level physiological profiles. Appl Environ Microbiol 65: Emmerling, C., Schloter, M., Hartmann, A., Kandeler, E. (2002) Functional diversity of soil organisms - a review of recent research activities in Germany. J Plant Nutr Soil Sci 165: Environmental Protection Agency (2004) E.P.A R.E.D. Facts- Ethoxyquin.Protection Prevention, Pesticides and Toxic Substances (7508C), EPA-738-F Erguder, T.H., Boon, N., Wittebolle, L., Marzorati, M., Verstraete, W. (2009) Environmental factors shaping the ecological niches of ammonia-oxidizing archaea. FEMS Microbiol Rev 33: Errampalli, D. (2006) Postharvest control of blue mold of apples with reduced-risk fungicides together with anti-scald agent diphenylamine under cold and controlled atmosphere storage conditions.journal of Food, Agriculture and Environment 4: European Food Safety Authority (2010) Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance ethoxyquin.efsa Journal 8: 1710 (pp.38) (in: doi: /j.efsa ). European Food Safety Authority (2010) Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance imazalil.efsa Journal 8: 1526 (pp.69) (in:doi: /j.efsa ). European Food Safety Authority (2011) Review of the existing maximum residue levels (MPLs) for diphenylamine according to Article 12 of Regulation (EC). EFSA Journal 9: 2336 (pp.20) (in: doi: /j.efsa ). Falkowski, P.G., Fenchel, T., Delong, E.F. (2008) The microbial engines that drive earth s biogeochemical cycles. Science 320: Falkowski, P., Scholes, R.J., Boyle, E., Canadell, J., Canfield, D., Elser, J., Gruber, N., Hibbard, K., Hogberg, P., Linder, S., Mackenzie, F.T., Moore III, B., Pedersen, T., Rosenthal, Y., Seitzinger, S., Smetacek, V., Steffen, W. (2000) 111

112 The global carbon cycle: A test of our knowledge of earth as a system. Science 290: FAOSpecificationsandevaluationsfor agricultural pesticides. Oxamyl (N,N-dimethyl- 2-methylcarbamoyloxyimino-2- (methylthio)acetamide) (2008). In: Feddermann, N., Finlay, R., Boller, T., Elfstrand, M. (2010) Functional diversity in arbuscular mycorrhiza - the role of gene expression, phosphorous nutrition and symbiotic efficiency. Fungal Ecology 3: 1-8. Ferris, M.J., Ward, D.M. (1997) Seasonal distributions of dominant 16S rrna defined populations in a hot spring microbial mat examined by denaturating gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol 63: Fisher, M.M., Triplett, E.W. (1999) Automated approach for ribosomal intergenic spacer analysis of microbial diversity and its application to freshwater bacterial communities. Appl Environ Microb 65: Flaim, G.M., Toller, G. (1989) Treatment of postharvest pesticide residues. Agric Ecos Environ 27: Francis, C.A., Beman, J.M., Kuypers, M.M.M. (2007) New processes and players in the nitrogen cycle: the microbial ecology of anaerobic and archaeal ammonia oxidation. The ISME Journal 1: Frostegard, A., Tunlid, A., Baath, E. (1993) Phospholipid fatty-acid composition, biomass and activity of microbial communities from 2 soil types experimentally exposed to different heavy-metals. Appl Environ Microb 59: Galiulin, R.V., Bashkin, V.N., Galiulina, R.A., Birch, P. (2001) The theoretical basis of microbiological transformation and degradation of pesticides in soil. Land Contamination and Reclamation 9: Garland, J.L., Mills, A.L. (1991) Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of the patterns of community-level-solecarbon-source utilization.appl EnvironMicrobiol 57: Gavrilescu, M. (2005) Fate of pesticides in the environment and its bioremediation.eng Life Sci 5: Gerstl, Z. (1984) Adsorption, decomposition and movement of oxamyl in soil. Pestic Sci 15:

113 Gianfreda, L., Bollag, J.M. (1996). Influence of natural and anthropogenic factors on enzyme activity in soil. In: Stotzky G, Bollag JM, editors. Soil Biochemistry, vol. 9. New York 7 Marcel Dekker, pp Giannakou, I.O. (2011) Efficacy of a formulated product containing Quillaja saponaria plant extracts for the control of root-knot nematodes. Eur J Plant Pathol 130: Gopal, M., Gupta, A., Arunachalam, V., Magu, S.P. (2007) Impact of azadirachtin, an insecticidal allelochemical from neem on soil microflora, enzyme and respiratory activities.bioresource Technology 98: Gore, R. C., Hannah, R. W., Pattacini, S. C., and Porro, T. J. (1971) Infrared and ultraviolet spectra of seventy-six pesticides. Journal of the AOAC 54: Govindarajulu, M., Pfeffer, P.E., Jin, H., Abubaker, J., Douds, D.D., Allen, J.W., Bucking, H., Lammers, P.J., Shachar-Hill, Y. (2005) Nitrogen transfer in the mycorrhizal symbiosis.nature 435: Greim, H., Bury, D., Klimisch, H.-J., Oeben-Negele, M., Ziegler-Skylakakis, K., (1998) Toxicity of aliphatic amines: structure activity relationship.chemosphere 36: Gremion, F., Chatzinotas, A., Harms, H. (2003) Comparative 16S rdna and rrna sequence analysis indicates that Actinobacteria might be a dominant part of the metabolically active bacteria in heavy metal-contaminated bulk and rhizosphere soil. Environ Microbiol 5: Grenni, P., Falconi, F., Caracciolo, A.B. (2012) Microcosm experiments for evaluating natural bioremediation of contaminated ecosystems. Chemical Engineering Transactions 28: Guilbault, G. G., Kramer, D. N. (1964) Fluorometric determination of lipase, acylase, alpha - and gamma-chymotrypsin and inhibitors of these enzymes. Anal Chem 36: Gyaneshwar, P., Naresh Kumar, G., Parekh, L.J., Poole, P.S. (2002) Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants. Plant and Soil 245: Haack, S.H., Garchow, H., Odelson, D.A., Forney, L.J., Klug, M.J. (1994) Accuracy, reproducibility, and interpretation of fatty acid methyl ester profiles of model bacterial communities. Appl Environ Microbiol 52: 60:

114 Hallam, S.J., Konstantinidis, K.T., Putnam, N., Schleper, C., Watanabe, Y.-I., Sugahara, J., Preston, C., De La Torre, J., Richardson, P.M., DeLong, E.F. (2006a) Genomic analysis of the uncultivated marine crenarcheote Cenarcheum symbiosum. Proc Natl Acad Sci USA 103: Hallam, S.J., Mincer, T.J., Schleper, C., Preston, C., Roberts, K., Richardson, P.M., DeLong, E.F. (2006b) Pathways of carbon assimilation and ammonia oxidation suggested by environmental genomic analyses of marine Crenarcheota. PLoS Biol 4: Handelsmanl, J., Rondon, M.R., Brady, S.F., Clardy, J., Goodman,R.M. (1998) Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry and Biology 5: Harier, L.A., Watson, C.A. (2004) The potential role of arbuscular mycorrhizal (AM) fungi in the bioprotection of plants against soil-borne pathogens in organic and/or other sustainable farming systems. Pest Management Science 60: Hart, S.C., Stark, J.M., Davidson, E.A., Firestone, M.K. (1994) Nitrogen mineralization, immobilization, and nitrification. In: Weaver, R.W., Angle, J.S., Bottomley, P.S. (Eds.), Methods of Soil Analysis: Microbiological and Biochemical Properties. Part 2. SSSA Book Ser. 5. SSSA, Madison, WI, pp Harvey Jr., J., Han, J.C.-Y.(1978) Decomposition of oxamyl in soil and water.journal of Agricultural and Food Chemistry 26: Haydock, P.P.J. Ambrose, E.L, Wilcox, A., Deliopoulos T. (2012) Degradation of oxamyl under field and laboratory conditions. Nematology 14: Hassett, J., Zak, D.R., Blackwood, C.B., Pregitzer, K.S. (2009) Are basidiomycete laccase gene abundance and composition related to reduced lignolytic activity under elevated atmospheric NO _ 3 deposition in northern hardwood forest? Microbial Ecology 57: Hatzenpichler, R. (2012) Diversity, physiology, and niche differentiation of ammoniaoxidizing archaea.appl Environ Microbiol 78: Hatzenpichler, R., Lebedeva, E.V., Spieck, E., Stoecker, K., Richter, A., Daims, H., Wagner, M. (2008) A moderately thermophilic ammonia-oxidizing crenarchaeote from a hot spring.proc Natl Acad Sci USA 105:

115 Hayat, R., Ali, S., Amara, U., Khalid, R., Ahmed, I. (2010) Soil beneficial bacteria and their role in plant growth promotion: a review. Ann Microbiol (In :doi: /s ). He, P., Ackman, G. (2000) Residues of ethoxyquin and ethoxyquin dimer in oceanfarmed salmonids determined by High-Pressure Liquid Chromatography. Journal of Food Science 65: Head, I.M., Hiorns, W.D., Embley, T.M., McCarthy, A.J., Saunders, J.R. (1993) The phylogeny of autotrophic ammonia-oxidizing bacteria as determined by analysis of 16S ribosomal RNA gene sequences. J Gen Microbiol 139: Hernandez, M., Zhongjun, J., Conrad, R.,Seeger, M. (2011) Simazine application inhibits nitrification and changes the ammonia-oxidizing bacterial communities in a fertilized agricultural soil. FEMS Microbiol Ecol 78: Hill, G.T., Mitkowski, N.A., Aldrich-Wolfe, L., Emele, L.R., Jurkonie, D.D., Ficke, A., Maldonado-Ramirez, S., Lynch, S.T., Nelson, E.B. (2000) Methods for assessing the composition and diversity of soil microbial communities.appl Soil Ecol 15: Hollocher, T., Tate, M., Nicholas, D. (1981) Oxidation of ammonia by Nitrosomonas europaea. Definite 180-tracer evidence that hydroxylamine formation involves a monooxygenase. J Biol Chem 256: Hollocher, T.C., Kumar, S., Nicholas, D. J. (1982) Respiration-dependent proton translocation in Nitrosomonas europaia and its apparent absence in Nitrobacter agilis during inorganic oxidations.j Bacteriol 149: Hooper, A. B., Vannelli, T., Bergmann, D.J., Arciero, D.M. (1997) Enzymology of the oxidation of ammonia to nitrite by bacteria.antonie Van Leeuwenhoek 71: Howard, P. H., Boethling, R. S., Jarvis, W. F., Meylan, W. M., Michalenko, E. M. (1991) Handbook of environmental degradation rates. Lewis Publishers, Inc., Chelsea, Michigan. Huang, H., Zhang, S., Shan, X-Q., Chen, B-D., Zhu, Y-G., Bell, J.N.B. (2007) Effect of arbuscular mycorrhizal fungus (Glomus caledonium) on the accumulation and metabolism of atrazine in maize (Zea mays L.) and atrazine dissipation in soil. Environmental Pollution 146:

116 Hussain, S., Siddique, T., Saleem, M., Arshad, M., Khalid, A. (2009) Impact of pesticides on soil microbial diversity, enzymes, and biochemical reactions. Advances in Agronomy 102: Ibekwe, A.M., Papiernik, S.K., Gan, J., Yates, S.R., Yang, C., Crowley, D.E. (2001) Impact of fumigants on soil microbial communities. Appl Environ Microbiol 67: Imfeld, G., Vuilleumier, S. (2012) Measuring the effects of pesticides on bacterial communities in soil: a critical review. Eur J Soil Biol 49: Ipsilantis, I., Samourelis, C., Karpouzas, D.G. (2012) The impact of botanical pesticides on arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Biol Biochem 45: James, T.K., Rahman, A., Trolove, M. (2006) Optimal timing for post emergence applications of nicosulfuron for weed control in maize. New Zealand Protection 59: Jansa, J., Gryndler, M. (2010) Biotic environment of the arbuscular mycorrhizal fungi in soil. In: H. Koltai and Y. Kapulnik (eds.), Arbuscular Mycorrhizas: Physiology and Function, doi / _10, Springer Science + Business Media B.V Javorekova, S., Svrcekova, I., Makova, J. (2010) Influence of benomyl and prometryn on the soil microbial activities and community structures in pasture grasslands of Slovakia. Journal of Environmental Science and Health Part B 45: Jefries, P., Gianinazzi, S., Perotto, S., Turnau, K., Barea, J.-M. (2003) The contribution of arbuscular mycorrhizal fungi in sustainable maintenance of plant health and soil fertility. Biol Fertil Soils 37: Jetten, M. S. M. (2001) New pathways for ammonia conversion in soil and aquatic systems. Plant and Soil 230: Joner, E.J., Briones, R., Leyval, C. (2000) Metal-binding capacity of arbuscular mycorrhizal mycelium. Plant Soil 226: Joseph, R., Reed, S., Jayachandran, K., Clark-Cuadrado, C., Dunn, C. (2010) Endosulfan has no adverse effect on soil respiration. Agriculture, Ecosystems and Environment 138: Junier, P., Molina, V., Dorador, C., Hadas, O., Kim, O.-S., Junier, T., Witzel, K.-P., Imhoff, J.F. (2010) Phylogenetic and functional marker genes to study ammonia-oxidising microorganisms (AOM) in the environment. Appl. Microbiol Biotechnol 85:

117 Kaplan, H.J., Dave, B.A. (1979) The current status of imazalil: A post harvest fungicide for citrus. Proc Fla State Hort Soc 92: Karandashov, V., Bucher, M. (2005) Symbiotic phosphate transport in arbuscular mycorrhizas.trends Plant Sci 10: Kaur, A., Chaudhary, A., Kaur, A., Choudhary, R., Kaushik, R. (2005) Phospholipid fatty acid- A bioindicator of environment monitoring and assessment in soil ecosystem. Current Science 89: Kelly, J.J. (2003) Molecular techniques for the analysis of soil microbial processes: Functional gene analysis and the utility of DNA microarrays. Soil Science 168: Kiewnick, S., Sikora, R.A. (2004) Optimizing the efficacy of Paecilomyces lilacinus (strain 251) fort he control of root-knot nematodes. Communications in Agricultural and Applied Biological Sciences 69: Kiewnick, S., Sikora, R.A. (2005) Evaluation of Paecilomyces lilacinus strain 251 for the biological control of the northern root-knot nematode Meloidogyne hapla Chitwood. Nematology 8: Kirk, J.L., Beaudette, L.A, Hart, M., Moutoglis, P., Klironomos, J.N., Lee, H., Trevors, J.T. (2004) Methods of studying soil microbial diversity.journal of Microbiological Methods 58: Klotz, M.G,, Arp, D,J., Chain, P.S. (2006) Complete genome sequence of the marine, chemolithoautotrophic, ammonia-oxidizing bacterium Nitrosococcus oceani ATCC Appl Environ Microbiol 72: Klotz, M.G., Alzerreca, J., Norton, J.M. (1997) A gene encoding a membrane protein exists upstream of the amoa/amob genes in ammonia oxidizing bacteria: a third member of the amo operon? FEMS Microbiol Lett 150: Koide, R.T., Kabir, Z. (2000) Extraradical hyphae of the mychorrhizal fungus Glomus intraradices can hydrolyze organic phosphate. New Phytol 148: Kolbe, N., Andersson, J.T. (2006) Simple and sensitive determination of o- phenylphenol in citrus fruits using Gas Chromatography with atomic emission or mass spectrometric detection.journal of Agricultural Food and Chemistry 54: Könneke, M., Bernhard, A.E., de la Torre, J.R., Walker, C.B., Waterbury, J.B., Stahl, D.A. (2005) Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine archaeon. Nature 437:

118 Kookana, R.S., Simpson, B.W. (2008) Pesticide fate in farming systems: research and monitoring. Commun Soil Sci Plant Anal 31: Koper, T.E., El-Sheikh, A.F., Norton, J.M., Klotz, M.G. (2004) Urease-encoding genes in ammonia-oxidizing bacteria. Applied and Environmental Microbiology 70: Kowalchuk, G.A, Stephen, J.R. (2001) Ammonia-oxidizing bacteria: a model for molecular microbial ecology. Annu Rev Microbiol 55: Kumar, S., Nicholas, D.J.D.(1982) A protonmotive force-dependent adenosine-5 triphosphate synthesis in spheroplasts of Nitrosomonas europaea.fems Micriobiol Lett 14: Lacey, E. (1990) Mode of action of bendimidazoles. Parasitology Today6: Lachance, B., Robidoux, P.Y., Hawari, J., Ampleman, G., Thiboutot, S., Sunahara, G.I., 1999.Cytotoxic and genotoxic effects of energetic compounds on bacterial and mammalian cells in vitro.mutat Res 444: Lawrence, G.W., McLean, K.S. (2000) Effect of foliar applications of oxamyl with aldicarb for the management of Rotylenchulus reniformis on cotton. Supplement to the Journal of Nematology 32: Leininger, S., Urich, T., Schloter, M., Schwark, L., Qi, J., Nicol, G.W., Prosser, J.I., Schuster, S.C., Schleper, C., (2006) Archaea predominate among ammoniaoxidizingprokaryotes in soils. Nature 442: Lekberg, Y., Koide, R.T. (2005) Arbuscular mycorrhizal fungi, rhizobia, available P and nodulation of groundnut (Arachis hypogaea) in Zimbabwe.Agriculture, Ecosystems and Environment 110: Li, X., Zhang, H., Wu, M., Su, Z., Zhang, C. (2008) Impact of acetochlor on ammonia-oxidizing bacteria in microcosm soils.journalof Environmental Sciences 20: Liu, W.T., Marsh, T.L., Cheng, H., Forney, L.J. (1997) Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rrna. Appl EnvironMicrobiol 63: Lo, C. (2010) Effect of pesticides on soil microbial community. Journal of Environmental Science and Health Part B45: Lopez, M.L., Riba, M. (1999) Residue levels of ethoxyquin, imazalil, and iprodione in pears under cold-storage conditions. J AgricFood Chem 47:

119 Lopez-Garcia, B., Veyrat, A., Perez-Paya, E., Gonzalez-Candelas, L., Marcos, J.F. (2003) Comparison of the activity of antifungal hexapeptides and the fungicides thiabendazole and imazalil against postharvest fungal pathogens.international Journal of Food Microbiology 89: Lynch, J.M., Benedetti, A., Insam, H., Nuti, M.P., Smalla, K., Torsvik, V., Nannipieri, P. (2004) Microbial diversity in soil: ecological theories, the contribution of molecular techniques and the impact of transgenic plants and transgenic microorganisms. Biol Fertil Soils 40: Macalady, J.L., Fuller, M.E., Scow, K.M. (1998) Effects of metam sodium fumigation on soil microbial activity and community structure. Journal of Environmental Quality 27: Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. (2005) Βζμθμβία ηςκ Μζηνμμνβακζζιχκ, Συιμξ 1, Πακεπζζηδιζαηέξ Δηδυζεζξ Κνήηδξ. Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. (2008) The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environment International 34: Maliszewska-Kordybach, B., Klimkowicz-Pawlas, A., Smreczak, B. (2007) Ecotoxic eefect of phenanthrene on nitryfing bacteria in soils of different properties.j Environ Qual 36: Margni, M., Rossier, D., Crettaz, P., Jolliet, O. (2002) Life cycle impact assessment of pesticides on human health and ecosystems.agriculture, Ecosystems and Environment 93: Martinez-Salgado, M.M., Gutierrez-Romero, V., Jannsens, M., Ortega-Blu, R. (2010) Biological soil quality indicators: a review.current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology. In: A. Mendez-Vilas (Ed.), pp Martin-Laurent, F., Kandeler, E., Petric, I., Djuric, S., Karpouzas, D.G. (2013) ECOFUN-MICROBIODIV: an FP7 European project for developing and evaluating innovative tools for assessing the impact of pesticides on soil functional microbial diversity-towards new pesticide registration regulation? Environ Sci Pollut Res 20: Mattheis, J.M., Rudell, D.R. (2008) Diphenylamine metabolism in «Braeburn» apples stored under conditions conducive to the development of internal browning. J Agric Food Chem 56:

120 McTavish, H., Fuchs, J.A., Hooper, A.B. (1993) Sequence of the gene coding for ammonia monooxygenase in Nitrosomonas europaea. J Bacteriol 175: Megharaj, M., Singleton, I., Kookana, R., Naidu, R. (1999) Persistence and effects of fenamiphos on native algal populations and enzymatic activities in soil. Soil Biol Biochem 31: Mikami, Y., Yazawa, K., Fukushima, K, Arai, T., Udagawa, S., Samson, R.A. (1989) Paecilotoxin production in clinical or terrestrial isolates of Paecilomyces lilacinus strains. Mycopathologia 108: Miransari, M. (2011) Soil microbes and plant fertilization.appl Microbiol Biotechnol 92: Moggia, C., Moya-Leon, M.A., Pereira, M., Yuri, J.A., Lobos, G.A. (2010) Effect of DPA and 1-MCP on chemical compounds related to superficial scald of Granny Smith apples. Spanish Journal of Agricultural Research 8: Muller, K., Magesan, G.N., Bolan, N.S. (2007) A critical review of the influence of effluent irrigation on the fate of pesticides in soil.agriculture, Ecosystems and Environment 120: Munoz-Leoz, B., Ruiz-Romera, E., Antiguedad, I., Garbisu, C. (2011) Tebuconazole application decreases soil microbial biomass and activity. Soil Biol Biochem 43: Muyzer, G. (1999) Genetic fingerprinting of microbial communities-present status and future perspectives. Microbial Biosystems: New FrontiersProceedings of the 8th International Symposium on Microbial EcologyBell CR, Brylinsky M, Johnson-Green P (ed). Atlantic Canada Society for Microbial Ecology, Halifax, Canada. Muyzer, G., Smalla, K. (1988) Application of denaturating gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie van Leeuwenhoek 73: Nannipieri, P., Ascher, J., Ceccherini, M.T., Landi, L., Pietramellaia, G., Renella, G. (2003) Microbial diversity and soil functions. European Journal of Soil Science 54: Nannipieri, P., Grego, S., Ceccanti, B. (1990) Ecological significance of the biological activity in soil. In: J.M. Bollag and G. Stotzky, eds. Soil Biochemistry, Vol.6. Marcel Dekker, New York, pp

121 Nicol, G.W., Schleper, C. (2010) Ammonia oxidizing archaea: Genomes, physiology and ecology. Advances in Microbial Physiology 57: Nicol, G.W., Schleper, C. (2006) Ammonia-oxidising Crenarchaeota: important players in the nitrogen cycle? Trends Microbiol 14: Nocker, A., Burr, M., Camper, A.K. (2007) Genotypic microbial community profiling: A critical technical review.microbial Ecology 54: Nortcliff, S. (2002) Standardisation of soil quality attributes. Agriculture Ecosystems and Environment 88: Norton, J.M., Alzerreca, J.J., Suwa, Y., Klotz M.G. (2002) Diversity of ammonia monooxygenase operon in autotrophic ammoniaoxidizing bacteria. Arch Microbiol 177: Ntalli, N.G., Menkissoglu-Spiroudi, U. (2011) Pesticides of Botanical Origin: a Promising Tool in Plant Protection, Pesticides - Formulations, Effects, Fate, Prof. Margarita Stoytcheva (Ed.), ISBN: , InTech, Available from: Nuccio, E.E., Hodge, A., Pett-Ridge, J., Herman, D.J., Weber, P.K., Firestone, M.K. (2013) An arbuscular mycorrhizal fungus significantly modifies the soil bacterial community and nitrogen cycling during litter decomposition. Appl Microbiol (in press: doi: / ). Oka, Y., Shuker, S., Tkachi, N. (2009) Nematicidal efficacy of MCW-2, a new nematicide ofthe fluoroalkenyl group, against the root-knot nematode Meloidogyne javanica. Pest Manag Sci 65: Okur, N., Levent Tuna, A., Okur, B., Altunlu, H., Husnu Kayikcioglu, H., Civelek, H.S. (2010) Non-target effect of organic insecticides: effect of two plant extracts on soil microbial biomass and enzymatic activities in soil. Environ Monit Assess165: Omar, S.A., Abdel-Sater, M.A. (2001) Microbial populations and enzyme activities in soil treated with pesticides. Water Air Soil Pollut 127: Osborn R.K., Edwards S.G., Wilcox A., Haydock P.P.J. (2010a). Potential enhancement of degradation of the nematicides aldicarb, oxamyl and fosthiazate in UK agricultural soils through repeated applications.pest Management Science 66:

122 Osborn, R.K., Haydock, P.P.J., Edwards, S.G. (2010b) Isolation and indetification of oxamyl-degrading bacteria from UK agricultural soils.soil Biol Biochem 42: Ou, L.T and P.S.C. Rao (1986) Degradation and metabolism of oxamyl and fenamiphos in soils.journal of Environmental Science and Health Part B21: Pal, R., Chakrabati, K., Chakraborty, A., Chowdhury, A. (2006) Degradation and effects of pesticides on soil microbiological parameters- A review. International Journal of Agricultural Research 1: Papadopoulou, E.S., Karpouzas, D.G., Menkissoglu-Spiroudi, U. (2011) Extraction parameters significantly influence and the quantity and the profile of PLFAs extracted from soil. Microb Ecol 62: Papadopoulou-Mourkidou, E. (1991) Postharvest-applied agrochemicals and their residues in fresh fruits and vegetables.j Assoc Off Anal Chem74: Perfetti, G.A., Warner, C.R., Fazio, T. (1981) High pressure liquid chromatographic determination of ethoxyquin in paprika and chili powder. J Assoc Off Anal Chem 64: Philippot, L., Ritz, K., Pandard, P., Hallin, S., Martin-Laurent, F. (2012) Standardisation of methods in soil microbiology: progress and challenges.fems Microbiol Ecol 82: Piotrowska-Seget, Z., Mrozik, A. (2003) Signature lipid biomarker (SLB) analysis in determining changes in community structure of soil microorganisms.pol J Environ Stud 12: Prosser, J.I., Nicol, G.W. (2012) Archaeal and bacterial ammonia-oxidizers in soil: the quest for niche specialization and differentiation.trends in Microbiology 20: Prosser, J.I., Nicol, G.W. (2008) Relative contributions of archaea and bacteria to aerobic ammonia oxidation in the environment. Environ Microbiol 10: Prousalis, K.P., Polygenis, D.A., Syrokou A., Lamari F.N., Tsegenidis, T. (2004) Determination of carbendazim, thiabendazole, and o-phenyl phenol residues in lemons by HPLC following sample clean-up by ion-pairing. Anal Bioanl Chem 379:

123 Puglisi E., Vasiliadis S., Demiris, C., Bassi D., Karpouzas D.G., Capri E., Cocconcelli PS., Trevisan M., (2012) Fungicides impact on the diversity and function of non-target ammonia oxidizing microorganisms residing in a litter soil cover. Microb Ecol 64: Purin, S., Rillig, M.C. (2007) The arbuscular mycorrhizal fungal protein glomalin: Limitations, progress, and a new hypothesis for its function. Pedobiologia 51: Purkhold, U., Wagner, M., Timmermann, G., Pommerening-Röse, A., Koops, H.P. (2003) 16S rrna and amoa-based phylogeny of 12 novel beta proteobacterial ammonia-oxidizing isolates: extension of the dataset and proposal of a new lineage within the nitrosomonads. Int J Syst Evol Microbiol 53: Purkhold, U., Pommerening-Röser, A., Juretschko, S., Schmid, M. C., Koops, H.-P., Wagner, M. (2000).Phylogeny of all recognized species of ammonia oxidizers based on comparative 16S rrna and amoa sequence analysis: implications for molecular diversity surveys. Appl Environ Microbiol 66: Qian, H., Hu, B., Wang, Z., Xu, X. (2007) Effects of validamycin on some enzymatic activities in soil. Environ Monit Assess 125: 1-8. Racke, K.D. (1990) Pesticides in the soil microbial ecosystem. In: Enhanced biodegradation of pesticides in the environment; Racke, K., et al.; ACS Symposium Series; American Chemical Society: Washington, DC, Chapter 1, pp Radivojevic, L., Gasic, S., Santric, L., Umiljendic, J.G., Vljevic, D.M. (2012) Shorttime effects of the herbicide nicosulfuron on the biochemical activity of Chernozem soil.journal of the Serbian Chemical Society 77: Rahmansyah, M., Antonius, S., Sulistinah, N. (2009) Phosphatase and urease instability caused by pesticides present in soil improved by grounded rice straw. ARPN Journal of Agricultural and Biological Science 4: Ranjard, L., Poly, F., Nazaret, S. (2000) Monitoring complex bacterial communities using culture-independent molecular techniques: application to soil environment.res Microbiol 151: Rastogi, G., Sani, R. K. (2011) Molecular techniques to assess microbial community structure, function, and dynamics in the environment. In: I. Ahmad et al. (eds.), Microbes and Microbial Technology: Agricultural and Environmental Applications. DOI / _2. 123

124 Regitano, J.B., and Koskinen, W.C. (2008) Characterization of nicosulfuron availability in aged soils. Journal Agricultural Food and Chemistry 56: Ribera, A., Cotoras, M., Zuniga, G.E. (2008) Effect of extracts from in vitro-grown shoots of Quillaja saponaria Mol. on Botrytis cinerea Pers. World J Microbiol Biotechnol 24: Robatscher, P., Eisenstecken, D., Sacco, F., Pohl, H., Berger, J., Zanella, A., Oberhuber, M. (2012) Diphenylamine residues in apples caused by contamination in fruit storage facilities. Journal of Agricultural and Food Chemistry 60: Rombke, J., Breure, A.M., Mulder, C., Rutgers, M. (2005) Legislation and ecological quality assessment of soil: implementation of ecological indication systems in Europe. Ecotoxicology and Environmental Safety 62: Rotman, B., Papermaster, B.W. (1966) Membrane properties of living mammalian cells as studied by enzymatic hydrolysis of fluorogenic esters. Proc Natn Acad Sci U.S.A 55: Rudell, D.R., Matttheis, J.P., Fellman, J.K. (2006) Influence of ethylene action, storage duration on diphenylamine and diphenylamine derivative content of Granny Smith apple peel. J Agric Food Chem 54: Rumbos, C. (2005) Ecological studies on Paecilomyces lilacinus strain 251 and their importance for biocontrol of plant-parasitic nematodes and environmental risk assessment. PhD Thesis, Cuviller Verlag, Gottingen, The Netherlands. Saffina, P.G., Powlson, D.S., Brookes, P.C., Thomas, G.A. (1989) Influence of sorghum residues and tillage on soil organic matter and soil microbial biomass in an Australian vertisol. Soil Biol Biochem 21: San Martin, R., and Magunacelaya, J. C, (2005) Control of plant-parasitic nematodes with extracts of Quillaja saponaria.nematology 7: Santoro, A.E., Francis, C.A., De Sieyes, N.R., Boehm, A.B. (2008) Shifts in the relative abundance of ammonia-oxidizing bacteria and archaea across physicochemical gradients in a subterranean estuary. Environ Microbiol 10: Sarakha, M., Boule, P., and Lenoir, D. (1993). Phototransformation of 2-phenylphenol induced in aqueous solution by excitation of nitrate ions. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 75:

125 Sayavedra-Soto, L. A., Hommes, N. G., Arp, D.J. (1994) Characterization of the gene encoding hydroxylamine oxidoreductase in Nitrosomonas europaea.j Bacterio 176: Schleper, C., Nicol, G.W. (2010) Ammonia oxidizing archaea: Genomes, physiology and ecology. Adv Microb Physiol 57: Schmeisser, C., Steele, H., Streit, W.R. (2007)Metagenomics, biotechnology with non-culturable microbes.appl Microbiol Biotechnol 75: Schnürer, J., Rosswall, T. (1982) Fluorescein diacetate hydrolysis as a measure of total microbial activity in soil and litter.appl Environ Microbiol 43: Schnürer, J., Rosswall, T Fluorescein diacetate hydrolysis as a measure of total microbial activity in soil and litter.appl Environ Microbiol 43: Schreier, C.J., Greene, R.J. (1997) Determination of ethoxyquin in feeds by liquid chromatography: Collaborative study. Journal of AOAC International 80: Schwinn, F.J. (1983) Ergosterol biosynthesis inhibitors.an overview of their history and contribution to medicine and agriculture.pestic Sci 15: Shah, A.G., Pierson, J.A., Pavlostathis, S.G. (2005) Fate and effect of the antioxidant ethoxyquin on a mixed methanogenic culture.water Research 39: Shen, J.-P., Zhang, L.-M., Zhu, Y.-G., Zhang, J.-B., and He, J.-Z.(2008) Abundance and composition of ammoniaoxidizing bacteria and ammonia-oxidizing archaea communities of an alkaline sandy loam.environ Microbiol 10: Siegel, M.R., Ragsdale, N.N. (1978) Antifungal mode of action of imazalil. Pesticide Biochemistry and Physiology9: Sikkema, P.H., Kramer, C., Vyn, J.D., Kells, J.J.,Hillger, D.E., Soltani, N. (2007) Control of Muhlenbergia frondosa (wirestem muhly) with post-emergence sulfonylurea herbicides in maize (Zea mays). Crop Protection 26: Singh, P.K. (2012) Role of glomalin related soil protein produced by arbuscular mycorrhizal fungi: A review. Agricultural Science Research Journal 2: Smelt, J. H., A. Dekker, Leistra, M. (1979) Effect of soil moisture content on the conversion rate of oxamyl. Netherlands Journal of Agricultural Science 27: Smith, C.J., Osborn, A.M. (2009) Advantages and limitations of quantative PCR (Q- PCR)-based approaches in microbial ecology.fems Microbiol Ecol 67:

126 Smolders, E., Brans, K., Coppens, F., Merckx, R. (2001) Potential nitrification rate as a tool for screening toxicity in metal-contaminated soils.environmental Toxicology and Chemistry 20: Spyrou, I.M., Karpouzas, D.G., Menkissoglu-Spiroudi, U. (2009) Do botanical pesticides alter the structure of the soil microbial community. Microb Ecol 58: Stefanowicz, A. (2006) The Biolog plates technique as a tool in ecological studies of microbial communities. Polish J of Environ Stud 15: Stein, L.Y., Arp, D.J., Berube, P.M. (2007)Whole-genome analysis of the ammoniaoxidizing bacterium, Nitrosomonas eutropha C91: implications for niche adaptation. Environ Microbiol 9: Strous, M., Fuerst, J.A., Kramer, E.H. (1999) Missing lithotroph identified as new planctomycete. Nature 400: Stubberfield, L.C.F., Shaw, P.J.A. (1990) A comparison of tetrazolium reduction and FDA hydrolysis with other measurments of microbial activity.journal of Microbiological Methods 12: Suzuki, H., Kumagai, H., Oohashi, K., Sakamoto, K., Inubushi, K., Enomoyo, S. (2001) Transport of trace elements through the hyphae of an arbuscular mychorrhizal fungus into marigold determined by the multitracer technique. Soil Sci Plant Nutr 47: Tabatabai, M.A., Soil enzymes. In: Weaver, R.W., Angle, J.S., Bottomley, P.S. (Eds.), Methods of Soil Analysis: Microbiological and Biochemical Properties. Part 2. SSSA Book Ser. 5. SSSA, Madison, WI, pp Taimr, L. (1994) Study of the mechanism of the antioxidant action of ethoxyquin. Die Angewandte Makromolekulare Chemie 217: Taube, J., Vorkamp, K., Forster, M., Herrmann, R. (2002) Pesticide residues in biological waste.chemosphere 49: Tiryaki, O., Temur, C. (2010) The fate of pesticide in the environment. J Biol Environ Sci 4: Torsvik,V., Daae, F.L., Sandaa, R.A., Ovreas, L. (1988) Novel techniques for analyzing microbial diversity in natural and perturbed environments. Journal of Biotechnology 64:

127 Tourna, M., Freitag, T.E., Nicol, G.W., Prosser, J.I. (2008) Growth, activity and temperature responses of ammonia-oxidizing archaea and bacteria in soil microcosms.environ Microbiol 10: Treusch, A.H,, Leininger, S., Kletzin, A., Schuster, S.C., Klenk, H.P., Schleper, C. (2005) Novel genes for nitrite reductase and amo-related proteins indicate a role of uncultivated mesophilic crenarchaeota in nitrogen cycling. Environ Microbiol 7: Turnau, K., Orlowska, E., Ryszka, P., Zubek, S., Anielska, T., Gawronski, S., Jurkiewicz, A. (2006) Role of mycorrhizal fungi in phytoremediation and toxicity monitoring of heavy metal rich industrial wastes in southern Poland. In: I. Twardowska et al. (eds.), Soil and Water Pollution Monitoring, Protection and Remediation, Springer. U.S. Environmental Protection Agency (2005) Biopesticides registration action document, Paecilomyces lilacinus strain 251 (PC Code ). van de Graaf, A.A., Mulder, A., de Bruijn, P., Jetten, M.S., Robertson, L.A., Kuenen, J.G. (1995) Anaerobic oxidation of ammonium is a biologically mediated process. Appl Environ Microbiol 61: van der Heijden, M.G.A., Bardgett, R.D., van Straalen, N.M. (2008) The unseen majority: soil microbes as drivers of plant diversity and productivity in terrestrial ecosystems. Ecology Letters 11: van der Heijden, M.G.A., Horton, T.R. (2009) Socialism in soil? The importance of mycorrhizal fungal networks for facilitation in natural ecosystems.journal of Ecology 97: van der Werf, H.M.G (1996) Assessing the impact of pesticides on the environment. Agriculture, Ecosystems and Environment 60: Van Deren, J.M., Jaworski, E.G. (1966) Ethoxyquin (Santoquin ) in eggs, chicken muscle, and chicken liver. Journal of the A.O.A.C. 49: Venter, J.C., Remington, K., Heidelberg, J.F. (2004) Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science 304: Verhamme, D.T., Prosser, J.I., Nicol, G.W. (2011) Ammonia concentration determines differential growth of ammonia- oxidizing archaea and bacteria in soil microcosms. The ISME Journal 5: Vestal, J.R., White, D.C. (1989) Lipid analysis in microbial ecology: quantitative approaches to the study of microbial communities. BioScience 39:

128 Vinias, P., Hernandez Cordoba, M., Sanchez-Pedrenio, C. (1991) Determination of ethoxyquin in paprika by High-Performance Liquid Chromatography.Food Chemistry 42: Wagenet, L.P. A (1985) Review of Physical-Chemical Parameterss Related to the Soil and Grounwater Fate of Selected Pesticides in New York State, Report No.30. Cornell University Agricultural Experiment Station, Ithaka, NY. Wan, M.T., Rae, J.T. (1998) Impact of azadirachtin on Glomus intraradices and vesicular-arbuscular mycorrhiza n root inducing transferred DNA transformed roots of Daucus carota. Environmental Toxicology and Chemistry 17: Wang, B., Qui, Y.-L.(2006) Phylogenetic distribution and evolution of mychorrizae in land plants.mycorrhiza 16: Wang, M.-C., Liu,Y.-H., Wang, Q., Gong, M., Hua, X.-M., Pang, Y.-J., Hu, S., Yang, Y.-H. (2008) Impacts of methamidophos on the biochemical, catabolic, and genetic characteristics of soil microbial communities. Soil Biol Biochem 40: Wang, F.Y., Tong, R.J., Shi, Z.Y., Xu, X.F., He, X.H. (2010) Inoculationswithabuscularmycorrhizalfungiincreasevegetableyieldsanddecrease phoximconcentrationsincarrotandgreenonionandtheirsoils. PlosOne6(2):e Ward, B.B., O Mullan, G. D. (2002) Worldwide distribution of Nitrosococcus oceani, a marine ammonia-oxidizing gamma-proteobacterium, detected by PCR and sequencing of 16S rrna and amoa Genes. Appl Environ Micriobiol 68: 4153 Ward, B.B., Capone, D.G., Zehr, J.P. (2007) What s new in the nitrogen cycle? Oceanography 20: Wauchope, R.D., Buttler, T.M., Hornsby, A.G., Augustijn-Beckers, P.W.M., Burt, J.P. (1992) SCS/ARS/CES pesticides properties database for environmental decision making.rev Environ Contam Toxicol 123: Wauchope, R.D., Yeh, S., Linders, J.B.H.J., Kloskowski, R., Tanaka, K., Rubin, B., Katayama, A., Kördel, W., Gerstl, Z., Lane. M., Unsworth, J.B. (2002) Pesticide soil sorption parameters: theory, measurement, uses, limitations and reliability. Pest Manag Sci 58: White, D.C., Davis, W.M., Nickels, J.S., King, J.D., Bobbie, R.J. (1979) Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia 40:

129 Whitman, W.B., Coleman, D.C., Wiebe, W.J. (1998) Prokaryotes: The unseen majority. Proc Natl Acad Sci USA 95: Willis, A., Rodrigues, B.F., Harris, P.J.C. (2012) The ecology of arbuscular mycorrhizal fungi. Critical Reviews in Plant Sciences 32: Winding, A., Hund-Rinke, K., Rutgers, M. (2005) The use of microorganisms in ecological soil classification and assessment concepts. Ecotoxicology and Environmental Safety 62: Winell, B. (1976) Quantitative determination of ethoxyquin in apples by gas chromatography. Analyst 101: Witt, S.C., Bickoff, E.M., Kohler, G.O. (1973) Simplified method for the determination of ethoxyquin in Alfalfa products and mixed feeds. Journal of the A.O.A.C.56: Wright, S.F., Upadhyaya, A. (1998) A survey of soils for aggregate stability and glomalin, a glycoprotein produced by hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Soil 198: Wu, Q., Chen, X., Xu, Y., Han, L. (2010) Dissipation and residues of nicosulfuron in corn and soil under field conditions. Bull Environ Contam Toxicol 85: Yao,H.,Gao,Y.,Nicol,G.W., Campbell, C.D., Prosser, J.I., Zhang, L., Han, W.,Singh, B.K. (2011)Links between ammonia oxidizer community structure, abundance, and nitrification potential in acidic soils. Applied and Environmental Microbiology 77: Yao, X., Min, H., Lu, Z., Yuan, H. (2006) Influence of acetamiprid on soil enzymatic activities and respiration.european Journal of Soil Biology 42: Yoshioka, N., Akiyama, Y., Teranishi, K. (2004) Rapid simultaneous determination of o-phenyl phenol, diphenyl, thiabendazole, imazalil, and its major metabolite in citrus fruits by liquid chromatography-mass spectrometry using atmospheric pressure photoionization. Journal of Chromatography A 1022: Zelles, L. (1999) Fatty acid patterns of phospholipid and lopopolysaccharides in the characterization of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils29: Zelles, L.A., Palojavri, A., Kandeler, E., Von Lutzow, M., Winter, K., Bai, Q.Y. (1997) Changes in soil microbial properties and phospholipid fatty acid fractions after chloroform fumigation. Soil Biol Biochem 29:

130 Zhang, H., Mu, W., Hou, Z., Wu, X., Zhao, W., Zhang, X., Pan, H., Zhang, S. (2013) Biodegradation of nicosulfuron by the bacterium serratia marcescens N80. Journal of Environmental Science and Health, Part B 47: Zhang,Y., Zeng, M., Xiong, B., Yang, X. (2003) Ecological significance of arbuscular mycorrhiza biotechnology in modern agricultural system.chinese Journal of Applied Ecology 14: Zhang, W.,Li, F., Nie, L. (2010)Integrating multiple omics analysis for microbial biology: application and methodologies. Microbiology 156: Zhou, Q., Liu, W., Zhang, Y., Liu, K.K. (2007) Action mechanisms of acetolactate synthase - inhibiting herbicides. Pesticide Biochemistry and Physiology 89: Εζχβαξ, Β., Μανηυβθμο, Α. (2007) Γεςνβζηή θανιαημθμβία. Αεήκα. 130

131 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 2. Βειηηζηνπνίεζε ηεο κεζόδνπ αλάιπζεο ησλ ιηπαξώλ νμέσλ ησλ θσζθνιηπηδίσλ (PLFA, Phospholipid Fatty Acids Analysis) θαη εθαξκνγή ηεο ζηε κειέηε ηεο επίδξαζεο ζπλζεηηθώλ θαη βηνινγηθώλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηε κηθξνβηαθή θνηλόηεηα ηνπ εδάθνπο 2.1. Πεξίιεςε Ζ ιέεμδμξ ακάθοζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ (PLFAs) απμηεθεί ζδιακηζηυ ενβαθείμ βζα ημ παναηηδνζζιυ ηδξ ζφκεεζδξ αθθά ηαζ ηδξ θοζζμθμβζηήξ ηαηάζηαζδξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ. Κφνζμξ ζηυπμξ ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ ήηακ δ αεθηζζημπμίδζδ ηδξ ιεευδμοξ εηπφθζζδξ. Έηζζ, ιεθεηήεδηε δ επίδναζδ α) ημο δζαθφηδ (πθςνμθυνιζμ ή δζπθςνμιεεάκζμ) α) ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (θςζθμνζηυ ph 7.0 ή ηζηνζηυ ph 4.0) ηαζ β) ημο ανζειμφ ηςκ ηφηθςκ εηπφθζζδξ (έκαξ ηφηθμξ εηπφθζζδξ x 2 χνεξ ή 2 ηφηθμζ εηπφθζζδξ x 2 χνεξ ακά ηφηθμ), ζηδκ πμζυηδηα ηαζ ηδκ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs πμο εηποθίγμκηαζ απυ εδαθζηά δείβιαηα. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, πνδζζιμπμζήεδηακ δφμ δζαθμνεηζημί ηφπμζ εδαθχκ, έκα υλζκμ άιιμ-πδθχδεξ (ph 5.5) ηαζ έκα αθηαθζηυ πδθχδεξ (ph 8.6). Ζ ζοβηέκηνςζδ ηαζ δ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs πνμζδζμνίζηδηακ λεπςνζζηά ηαηά ημκ πνχημ ηαζ ημ δεφηενμ ηφηθμ εηπφθζζδξ ηαζ ηα δεδμιέκα αλζμθμβήεδηακ ζοβηνζηζηά χζηε κα εηηζιδεεί δ επίδναζδ ηςκ δφμ ζοκεπυιεκςκ εηποθίζεςκ ζηδκ απμηεθεζιαηζηυηδηα ηδξ εηπφθζζδξ ηςκ PLFAs απυ ηα εδαθζηά δείβιαηα. Οζ ιέβζζηεξ ζοβηεκηνχζεζξ PLFAs ηαζ ζηα δφμ εδάθδ παναηδνήεδηακ ζηδκ πενίπηςζδ εθανιμβήξ δφμ ζοκεπυιεκςκ ηφηθςκ εηπφθζζδξ, ιε ιίβια απμηεθμφιεκμ απυ πθςνμθυνιζμ, ιεεακυθδ ηαζ νοειζζηζηυ δζάθοια ηζηνζηχκ. Απυ ηδ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ, πνμέηορε υηζ δ επζθμβή ημο ιίβιαημξ εηπφθζζδξ δεκ επδνέαζε ζδιακηζηά ηδ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs πμο πανεθήθεδζακ ηαηά ημκ πνχημ ηφηθμ εηπφθζζδξ, εκχ ακηίεεηα, είπε ζδιακηζηή επίδναζδ ζημ είδμξ ηςκ PLFAs πμο πνμέηορακ ηαηά ημκ δεφηενμ ηφηθμ εηπφθζζδξ. Σα πενζζζυηενα PLFAs εηποθίζηδηακ ηαηά ημκ πνχημ ηφηθμ εηπφθζζδξ, εηηυξ ηςκ 18:2ς6,9 ηαζ 22:0 πμο εηποθίζηδηακ ζπεδυκ ζημκ ίδζμ ααειυ ζηζξ δφμ επζιένμοξ ζοκεπυιεκεξ εηποθίζεζξ. Ζ επζθμβή ημο μνβακζημφ δζαθφηδ επδνέαζε ηδ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs, εκχ μζ ορδθυηενεξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ PLFAs πνμέηορακ ζηδκ πενίπηςζδ πανμοζίαξ ημο πθςνμθμνιίμο ζημ ιίβια εηπφθζζδξ, ιε ελαίνεζδ ηα 18:2ς6,9 ηαζ 22:0 πμο 131

132 εοκμήεδηακ απυ ηδ πνήζδ δζπθςνμιεεακίμο ζημ ιίβια εηπφθζζδξ. Ακάθμβδ επίδναζδ δεκ παναηδνήεδηε ζηδκ πενίπηςζδ ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ. οιπεναζιαηζηά, απυ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ, δ αεθηζζημπμζδιέκδ ιέεμδμξ εηπφθζζδξ ηςκ PLFAs (πθςνμθυνιζμ ςξ δζαθφηδξ, νοειζζηζηυ δζάθοια ηζηνζηχκ ηαζ 2 x 2h ηφηθμζ εηπφθζζδξ) δφκαηαζ κα πανέπεζ ηζξ ιέβζζηεξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ PLFAs μδδβχκηαξ ζε ιζα πζμ μθμηθδνςιέκδ εζηυκα υζμκ αθμνά ζηδ δμιή ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ, ακελανηήηςξ εδαθζημφ ph. Σμ αεθηζζημπμζδιέκμ πνςηυημθθμ πνδζζιμπμζήεδηε ζηδ ζοκέπεζα βζα ηδ δζενεφκδζδ ζε επίπεδμ ιζηνμηυζιςκ ηδξ επίδναζδξ ηςκ ζοκεεηζηχκ κδιαηςδμηηυκςκ μxamyl (Vydate) ηαζ fluensulfone (MCW-2) ηαζ ηςκ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ QL Agri (εηπφθζζια ημο θοημφ Quillaja saponaria) ηαζ BIOACT (ζπυνζα ημο παναζζηζημφ ιφηδηα Paecilomyces lilacinus, PL 251) ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. ε ηάεε πενίπηςζδ, μζ επειαάζεζξ έβζκακ ζφιθςκα ιε ηδ ζοκζζηχιεκδ δυζδ βζα ηδκ ηαηαπμθέιδζδ ηςκ κδιαηςδχκ ζημ έδαθμξ. ε πνμκζηά δζαζηήιαηα 5, 20, 45 ηαζ 90 διενχκ, ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ κδιαηςδμηηυκςκ ζημ έδαθμξ, ζοθθέπεδηακ δείβιαηα ηαζ ιεθεηήεδηε δ πμζμηζηή ηαζ πμζμηζηή ζφζηαζδ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ. Απυ ηδκ ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ πνμέηορε υηζ ηυζμ ηα ζοκεεηζηά κδιαηςδμηηυκα oxamyl, fluensulfone, υζμ ηαζ ημ θοηζηήξ πνμέθεοζδξ QL Agri δεκ επδνέαζακ ζδιακηζηά ηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Ακηίεεηα, ηονίανπδ απμδείπεδηε κα είκαζ δ επίδναζδ ημο αίμκδιαηςδμηηυκμο BIOACT ζηδκ πμζυηδηα ηαζ ημ είδμξ ηςκ PLFAs πμο εηποθίζηδηακ, ζε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ. Σα PLFAs πμο επδνεάζηδηακ εεηζηά απυ ηδ πνήζδ ημο ήηακ ηονίςξ ηα 18:1ς9c, 18:1ς9t ηαζ 18:2ς6,9, πμο ζφιθςκα ιε ηδ αζαθζμβναθία απμηεθμφκ δείηηεξ ανκδηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ ηαζ ιοηήηςκ. Ζ εεηζηή επίδναζδ ημο BIOACT ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ απμδυεδηε ζηα επζιένμοξ ζοζηαηζηά ημο ζηεοάζιαημξ (78% βθοηυγδ ηαζ 6% απμαμοηονςιέκμξ μνυξ βάθαηημξ) πμο απμηεθμφκ πθμφζζα πδβή ενεπηζηχκ ζημζπείςκ βζα ημοξ ηαπέςξ ακαπηοζζυιεκμοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ ηαζ εθεοεενχεδηακ ζημ έδαθμξ ιε ηδκ εθανιμβή ημο BIOACT. 132

133 2.2. Δηζαγσγή Βειηηζηνπνίεζε ηεο κεζόδνπ αλάιπζεο ησλ ιηπαξώλ νμέσλ ησλ θσζθνιηπηδίσλ (PLFAs) Ζ ιέεμδμξ ηδξ ακάθοζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ (PLFA, Phospholipid Fatty Acids Analysis) ζοβηαηαθέβεηαζ ζηζξ ιεευδμοξ πμο δεκ ελανηχκηαζ απυ ηδκ ηαθθζένβεζα ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζε ενεπηζηά ιέζα (culture independent) ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ εονέςξ βζα ημκ παναηηδνζζιυ ηδξ δμιήξ ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ ζε θοζζηά μζημζοζηήιαηα (Gomez-Brandon et al., 2010, White et al., 1997, Vestal and White, 1989). Βαζίγεηαζ ζηδκ ακάθοζδ ηδξ ζφζηαζδξ ηςκ εζηενμπμζδιέκςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ. Σα θςζθμθζπίδζα, ζοκζζημφκ απαναίηδηα δμιζηά ζημζπεία ηςκ ηοηηανμπθαζιαηζηχκ ιειανακχκ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ. Οζ δζαθμνμπμζήζεζξ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ ακάιεζα ζε εοηανοςηζημφξ ηαζ πνμηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ ηαεχξ επίζδξ ηαζ ακάιεζα ζε δζαθμνεηζηέξ μιάδεξ πνμηανοςηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ, ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ ηαπφηαηδ απμζφκεεζή ημοξ ιεηά ηδκ θφζδ ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ ηαζ ημκ εάκαημ ημο ηοηηάνμο, ηαεζζηά ηα PLFAs πνήζζιμοξ δείηηεξ ηδξ εκενβήξ ηαζ θεζημονβζηήξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ (Findlay, 2004). Σα PLFAs πνδζζιμπμζμφκηαζ ςξ ιέηνμ πνμζδζμνζζιμφ ηδξ ζοκμθζηήξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ ημο εδάθμοξ (Baath and Anderson, 2003), αθθά ηαζ βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ επίδναζδξ ηαθθζενβδηζηχκ πναηηζηχκ (Bossio et al., 1998), βεςνβζηχκ θανιάηςκ (Spyrou et al., 2009) ηαζ αανέςκ ιεηάθθςκ (Hinojosa et al., 2005, Frostegard et al., 1993) ζηδ δμιή ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ. οβηνζηζηά ιε ηζξ ιμνζαηέξ αζμθμβζηέξ ιεευδμοξ ακάθοζδξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδ ιζηνμαζαηή μζημθμβία, δ ιέεμδμξ ακάθοζδξ ηςκ PLFAs δίκεζ ηδ δοκαηυηδηα ηδξ ηαοηυπνμκδξ εηηίιδζδξ ηνζχκ ζδιακηζηχκ παναηηδνζζηζηχκ ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ: ηδξ αζμιάγαξ ηςκ γςκηακχκ ηοηηάνςκ, ηδξ δμιήξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ηαζ ηδξ θοζζμθμβζηήξ ηαηάζηαζδξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ (Piotrowska- Seget and Mrozik, 2003). Απυ ηδκ άθθδ πθεονά, δ ιέεμδμξ οζηενεί ζε επίπεδμ αάεμοξ ακάθοζδξ ηαεχξ δεκ ιπμνεί κα δζαηνίκεζ δζαθμνέξ ζε επίπεδμ βέκμοξ ή αηυιδ ηαζ μζημβέκεζαξ αθθά ιυκμ ζε επίπεδμ εονφηενςκ μιάδςκ ιζηνμμνβακζζιχκ. Ακηίεεηα, ηέημζμο είδμοξ πθδνμθμνίεξ ιπμνμφκ κα ζοθθεπεμφκ ιέζς ηςκ ιμνζαηχκ ιεευδςκ ιζηνμαζαηήξ απμηφπςζδξ. 133

134 Ζ εηπφθζζδ ηςκ PLFAs απυ δείβιαηα εδάθμοξ ααζίγεηαζ ιέπνζ ηαζ ζήιενα ζημ ηθαζζζηυ πνςηυημθθμ ηςκ Bligh ηαζ Dyer (1959). Οζ ζοβηεηνζιέκμζ ενεοκδηέξ πνδζζιμπμίδζακ ιίβια απμηεθμφιεκμ απυ πθςνμθυνιζμ (CHL), ιεεακυθδ ηαζ κενυ, βζα ηδκ ελαβςβή ηςκ θζπζδίςκ απυ ιοξ ρανζμφ (ιπαηαθζάνμο). Απυ ηυηε, δζάθμνεξ ηνμπμπμζήζεζξ αοηήξ ηδξ ιεευδμο έπμοκ πνμηαεεί πμο αθμνμφκ ηονίςξ αθθαβέξ ηςκ επζιένμοξ ζοζηαηζηχκ ημο ιίβιαημξ. Ζ πζμ ημζκή δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ιεευδμο είκαζ αοηή υπμο ημ κενυ ζημ ιίβια έπεζ ακηζηαηαζηαεεί απυ ηάπμζμ νοειζζηζηυ δζάθοια (Bossio et al., 1998, Petersen and Klug, 1994). Οζ White et al., (1979), ήηακ μζ πνχημζ πμο πνδζζιμπμίδζακ νοειζζηζηυ δζάθοια θςζθμνζηχκ ζυκηςκ (Phos) ηαζ ανβυηενα μζ Frostegård et al., (1991) πνυηεζκακ ηδ πνήζδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ηζηνζηχκ (Cit). φιθςκα ιε ηδ αζαθζμβναθία, ημ Phos έπεζ πνδζζιμπμζδεεί ζηζξ πενζζζυηενεξ ςξ ηχνα ιεθέηεξ (Harner et al., 2007, Lee et al., 2007), εκχ ημ Cit αημθμοεεί ανζειδηζηά (Furhmann et al., 2009, Frostegård et al., 1993). Δηηυξ απυ ημ κενυ ή ημ νοειζζηζηυ δζάθοια, υπςξ ακαθένεδηε ζημ ανπζηυ ιίβια εηπφθζζδξ πενζθαιαάκμκηαζ έκαξ ιδ πμθζηυξ μνβακζηυξ δζαθφηδξ ηαζ ιεεακυθδ. ηζξ πενζζζυηενεξ ιεθέηεξ πμο έπμοκ δζελαπεεί ςξ ηχνα, ςξ δζαθφηδξ πνδζζιμπμζείηαζ ημ CHL ([Furhmann et al., 2009, Spyrou et al., 2009, Moore-Kucera and Dick, 2008), πανά ηζξ ανκδηζηέξ ημο επζδνάζεζξ ζηδκ ακενχπζκδ οβεία ηαζ ζημ πενζαάθθμκ. Σμ CHL ακήηεζ ζημοξ δζαθφηεξ ιε πζεακέξ ηανηζκμβυκεξ επζπηχζεζξ βζα ημκ άκενςπμ ηαζ ζε πμθθέξ πενζπηχζεζξ δ πνήζδ ημο έπεζ πενζμνζζηεί ή απαβμνεοηεί (Cequier-Sanchez et al., 2008). Δπμιέκςξ, δ ακηζηαηάζηαζδ ημο CHL ζηδ δζαδζηαζία εηπφθζζδξ θζπζδίςκ ιε έκακ πζμ αζθαθή δζαθφηδ, είκαζ ιείγμκμξ ζδιαζίαξ. ηδ δζαδζηαζία εηπφθζζδξ θζπζδίςκ απυ ζγήιαηα (sediments), έπεζ πνδζζιμπμζδεεί εηηεηαιέκα ημ δζπθςνμιεεάκζμ (DCM) ακηί ημο CHL (Findlay et al., 1989). Χζηυζμ, αοηή δ αθθαβή ζημ ανπζηυ πνςηυημθθμ έπεζ ςξ ηχνα πενζμνζζιέκδ πνήζδ ζηδκ πενίπηςζδ εηπφθζζδξ θζπζδίςκ απυ ημ έδαθμξ (Ibekwe and Kennedy, 1998, Petersen and Klug, 1994). Σμ DCM πθεμκεηηεί έκακηζ ημο CHL βζαηί είκαζ θζβυηενμ ημλζηυ [μνζαηή ηζιή (threshold limit) θμνέξ πζμ ορδθή απυ ηδκ ακηίζημζπδ βζα ημ CHL], είκαζ δοκδηζηυ (potential) ηαζ υπζ πζεακυ (probable) ηανηζκμβυκμ (Cequier-Sanchez et al., 2008, Chavew et al., 1995), ημζηίγεζ θζβυηενμ ηαζ έπεζ παιδθυηενμ ζδιείμ γέζεςξ (CHL: 61.1⁰C, DCM: 39⁰C) (O Neil et al., 2001). Χζηυζμ, δ απμηεθεζιαηζηυηδηα ημο DCM ζηδκ εηπφθζζδ ηςκ θζπζδίςκ απυ ημ έδαθμξ εα πνέπεζ κα πνμζδζμνζζεεί θεπημιενχξ πνζκ αοηυ ακηζηαηαζηήζεζ ημ CHL ζημ ιίβια εηπφθζζδξ. 134

135 Γφμ ιεθέηεξ έπμοκ ιέπνζ ζηζβιήξ δζενεοκήζεζ ηδ ζδιαζία επζθμβήξ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ηαζ/ή μνβακζημφ δζαθφηδ ζηδκ απμηεθεζιαηζηυηδηα εηπφθζζδξ ηςκ θζπζδίςκ. Ανπζηά, μζ Frostegård et al., (1991), ζφβηνζκακ ηδκ απμηεθεζιαηζηυηδηα ηεζζάνςκ δζαθμνεηζηχκ νοειζζηζηχκ δζαθοιάηςκ: Cit (ph 4.0), Phos (ph 7.4), μλζηχκ (ph 4.0) ηαζ Tris (ph 7.5) πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζε ζοκδοαζιυ ιε CHL ηαζ ιεεακυθδ, βζα ηδκ εηπφθζζδ θζπζδίςκ απυ δφμ δζαθμνεηζηά ηαθθζενβμφιεκα εδάθδ: έκα υλζκμ μνβακζηυ (ph 4.1) ηαζ έκα άιιμ-πδθχδεξ αθηαθζηυ (ph 7.8). Απυ ηα απμηεθέζιαηα αοηήξ ηδξ ιεθέηδξ θαίκεηαζ υηζ δ επζθμβή ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ επδνεάγεζ ηδκ απμηεθεζιαηζηυηδηα ηδξ εηπφθζζδξ ζημ υλζκμ αθθά υπζ ζημ αθηαθζηυ έδαθμξ. ηδ ζοκέπεζα, μζ Nielson and Petersen, (2000), ανήηακ επίζδξ υηζ δ επζθμβή ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (Phos ή Cit) επδνεάγεζ ηδκ απμηεθεζιαηζηυηδηα ηδξ εηπφθζζδξ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ, αθθά ηαζ υηζ μ ζοκδοαζιυξ μνβακζημφ δζαθφηδ (CHL ή DCM) ηαζ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ είκαζ επίζδξ ζδιακηζηυξ. Χζηυζμ, απυ ηδ ζφβηνζζδ ηδξ πμζηζθυηδηαξ ηςκ PLFAs πμο εηποθίζηδηακ ιε ημοξ 4 δζαθμνεηζημφξ ζοκδοαζιμφξ μνβακζηχκ δζαθοηχκ ηαζ νοειζζηζηχκ δζαθοιάηςκ ανέεδηε υηζ μζ δζαθμνέξ ζηδ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs ακάιεζα ζηα δζαθμνεηζηά εδάθδ ήηακ ζδιακηζηυηενεξ απυ ηζξ δζαθμνέξ πμο πνμέηορακ ελαζηίαξ ηδξ εθανιμβήξ ηςκ δζαθμνεηζηχκ πνςημηυθθςκ. Πεναζηένς ηνμπμπμζήζεζξ ημο πνςημηυθθμο ηςκ Bligh and Dyer (1959), αθμνμφκ αθθαβέξ ζημκ ανζειυ ηςκ ηφηθςκ εηπφθζζδξ. Οζ White et al., (1997) ηαζ μζ Findlay et al., (1989), πνυηεζκακ έκα ηφηθμ εηπφθζζδξ δζάνηεζαξ ςνχκ (overnight), εκχ μζ Frostegård et al., (1991), απέδεζλακ υηζ ιζα πνχηδ 2ςνδ εηπφθζζδ, υηακ αημθμοεείηαζ απυ έκα ζοιπθδνςιαηζηυ ζηάδζμ λεπθφιαημξ (wash step) είκαζ ανηεηή βζα ηδκ εηπφθζζδ ηςκ ιέβζζηςκ πμζμηήηςκ PLFAs απυ ημ έδαθμξ. Πνυζθαηα, μζ Wu et al., (2009), παναηήνδζακ υηζ δφμ ζοκεπυιεκεξ δίςνεξ εηποθίζεζξ επανημφκ χζηε κα εηποθζζηεί ημ 90 95% ηςκ PLFAs ημο εδάθμοξ ηαζ πανείπακ θεπημιενείξ πθδνμθμνίεξ βζα ηδκ ζηακυηδηα εηπφθζζδξ ηςκ δζαθμνεηζηχκ PLFAs-δεζηηχκ ζε δφμ υλζκα εδάθδ. Ο ανπζηυξ ζηυπμξ ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ ήηακ δ ακάπηολδ εκυξ αεθηζζημπμζδιέκμο πνςημηυθθμο ακάθοζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ. Γζα ημ θυβμ αοηυ ελεηάζεδηακ (1) δ επίδναζδ δζαθμνεηζηχκ μνβακζηχκ δζαθοηχκ (CHL ηαζ DCM) ηαζ δζαθμνεηζηχκ νοειζζηζηχκ δζαθοιάηςκ (Phos ηαζ Cit) ζηδκ πμζυηδηα ηαζ ημ είδμξ ηςκ PLFAs πμο εηποθίζηδηακ ιεηά απυ δφμ ζοκεπυιεκεξ εηποθίζεζξ, δζάνηεζαξ 2 ςνχκ ακά εηπφθζζδ ηαζ (2) δ επίδναζδ ηςκ δφμ επζιένμοξ 135

136 εηποθίζεςκ (πνχηδ έκακηζ δεφηενδξ εηπφθζζδξ) ζηδκ πμζυηδηα ηαζ ημ είδμξ ηςκ PLFAs πμο εηποθίζηδηακ ζηδκ ηάεε πενίπηςζδ. Ζ εηηίιδζδ ηδξ επίδναζδξ αοηχκ ηςκ παναιέηνςκ, πναβιαημπμζήεδηε ζε δφμ δζαθμνεηζηά εδάθδ πμο δζαθμνμπμζμφκηακ ηονίςξ ςξ πνμξ ημ ph (υλζκμ ηαζ αθηαθζηυ έδαθμξ), πνμηεζιέκμο κα ελεηαζεεί ημ εκδεπυιεκμ ηδξ ηαεμθζηήξ εθανιμβήξ ημο αέθηζζημο ζοκδοαζιμφ ζε δζάθμνμοξ ηφπμοξ εδαθχκ ακελανηήηςξ ημο εδαθζημφ ph. Πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ έπμοκ δείλεζ υηζ ημ ph θαίκεηαζ κα είκαζ μ πανάβμκηαξ πμο αζηεί ηδ ιεβαθφηενδ επίδναζδ υζμκ αθμνά ζηδ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ (Rousk et al., 2010) Δθαξκνγή ηεο βειηηζηνπνηεκέλεο κεζόδνπ αλάιπζεο ησλ PLFAs ζηε κειέηε ηεο επίδξαζεο ζπλζεηηθώλ θαη βηνινγηθώλ λεκαησδνθηόλσλ ζηε κηθξνβηαθή θνηλόηεηα ηνπ εδάθνπο Οζ θοημπαναζζηζημί κδιαηχδεζξ απμηεθμφκ ιζα απυ ηζξ ηφνζεξ αζηίεξ απχθεζαξ ηδξ βεςνβζηήξ παναβςβήξ παβημζιίςξ (Dong and Zhang, 2006, San Martin and Magunacelaya, 2005). Μέπνζ πνυζθαηα, δ ηαηαπμθέιδζδ ημοξ ααζίγμκηακ απμηθεζζηζηά ζηδ πνήζδ ζοκεεηζηχκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ, ηαπκζζηζηχκ ή ιδ, ιε επειαάζεζξ ζημ έδαθμξ (Oka et al., 2000). Χζηυζμ, απυ ηδκ πναηηζηή αοηή πνμέηορακ ζε αάεμξ πνυκμο ζμαανά πνμαθήιαηα υπςξ επζαάνοκζδ ημο πενζαάθθμκημξ, ηίκδοκμξ βζα ηδκ ακενχπζκδ οβεία, ηαηαζημθή ηςκ θοζζηχκ ακηαβςκζζηχκ ηςκ θοημπαναζζηζηχκ κδιαηςδχκ ηαζ ημλζηυηδηα ζε μνβακζζιμφξ ιδζηυπμοξ ιε ζδζαίηενδ ζδιαζία βζα ηδκ θεζημονβία ημο μζημζοζηήιαημξ, υπςξ μζ ιζηνμμνβακζζιμί ημο εδάθμοξ (Falkowski et al., 2008, San Martin and Magunacelaya, 2005, Akhtar and Mahmood, 1994). Απμηέθεζια ηδξ παναπάκς εκηαηζηήξ πνήζδξ, ήηακ δ απυζονζδ πμθθχκ απυ ηα εονέςξ πνδζζιμπμζμφιεκα ζοκεεηζηά κδιαηςδμηηυκα (π.π. ανςιζμφπμ ιεεφθζμ, fenamiphos) απυ ημ δζεεκέξ ειπυνζμ βζα μζημθμβζημφξ ηαζ ημλζημθμβζημφξ θυβμοξ (Anastasiadis et al., 2008). Αλίγεζ κα ακαθενεεί υηζ ζηδκ Δθθάδα έβηνζζδ ηοηθμθμνίαξ έπμοκ ιυκμ ηα ελήξ ζοκεεηζηά κδιαηςδμηηυκα: fenamiphos, oxamyl, dazomet, ethoprophos ηαζ fosthiazate ( cited 06/06/2013). Ο πενζμνζζιέκμξ ανζειυξ ηςκ δζαεέζζιςκ ζήιενα ζοκεεηζηχκ κδιαηςδμηηυκςκ ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ απχθεζα ηδξ απμηεθεζιαηζηυηδηαξ ημοξ θυβς ηδξ ακάπηολδξ θαζκμιέκςκ ακεεηηζηυηδηαξ ηαζ επζηαποκυιεκδξ ιζηνμαζαηήξ απμδυιδζδξ, δδιζμονβεί ιεβάθδ ακάβηδ βζα ηδκ ακάπηολδ ηαζ παναβςβή εκαθθαηηζηχκ 136

137 κδιαηςδςηηυκςκ ζηεοαζιάηςκ, αζθαθχκ βζα ημ πενζαάθθμκ ηαζ ιε κέμ ηνυπμ δνάζδξ (Giannakou, 2011, Dong and Zhang, 2006, Karpouzas et al., 2005, San Martin and Magunacelaya 2005, Oka et al., 2000, Suett et al. 1996, Akhtar and Mahmood, 1994). Χζηυζμ, δ πδιζηή αζμιδπακία ζπάκζα επεκδφεζ ζηδκ ακάπηολδ κέςκ ζοκεεηζηχκ κδιαηςδμηηυκςκ ζηεοαζιάηςκ ελαζηίαξ ημο πενζμνζζηζημφ ηυζημοξ παναβςβήξ ζοβηνζηζηά ιε ημ ακαιεκυιεκμ ηένδμξ (Νηάθθδ, 2010). Δλαίνεζδ απμηεθεί ημ ζηεφαζια fluensulfone, ζοκεεηζηυ κδιαηςδμηηυκμ επαθήξ ιε κέμ ηνυπμ δνάζδξ, ημ μπμίμ ακέπηολε δ εηαζνεία Makhteshim-Agan. Σμ fluensulfone ανίζηεηαζ αοηή ηδ ζηζβιή οπυ αλζμθυβδζδ βζα έκηαλδ ζηδκ θίζηα ηςκ β.θ. ιε έβηνζζδ πνήζδξ ζηζξ πχνεξ ηδξ Δονςπασηήξ Έκςζδξ. Χξ πζεακή εκαθθαηηζηή θφζδ ηςκ πδιζηχκ ιεευδςκ ηαηαπμθέιδζδξ, πνμηείκεηαζ δ πνήζδ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ. ιε κδιαηςδμηηυκμ δνάζδ. Tα αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ. ιπμνεί κα είκαζ (i) θοζζηά πνμσυκηα θοηζηήξ ή ιζηνμαζαηήξ πνμέθεοζδξ ή (ii) γςκηακμί ιζηνμμνβακζζιμί, πμο ιπμνμφκ κα πενζμνίζμοκ ηαζ κα ηαηαζηείθμοκ ηδ δνάζδ ηςκ θοημπαεμβυκςκ ηαζ ηςκ θοημπαναζίηςκ (Dong and Zhang, 2006, Akhtar and Mahmood, 1994). ηδκ πνχηδ μιάδα ακήηεζ ημ θοηζηήξ πνμέθεοζδξ αίμ-κδιαηςδμηηυκμ QL Agri. Σμ ζηεφαζια αοηυ απμηεθεί οδαηζηυ εηπφθζζια απυ ημκ θθμζυ ημο δέκδνμο Quillaja saponaria, πθμφζζμ ζε ζαπςκίκεξ ηαζ πμθοθαζκυθεξ, πμο ειπμδίγεζ απμηεθεζιαηζηά ηδκ ακάπηολδ ηςκ θοημπαναζζηζηχκ κδιαηςδχκ (Giannakou, 2011). φιθςκα ιε πνυζθαηδ ιεθέηδ ημ QL Agri δεκ πνμηάθεζε ιεηααμθέξ ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ ζε επίπεδμ ενβαζηδνίμο ηαζ αβνμφ, υηακ εθανιυζηδηε ζηδκ ζοκζζηχιεκδ δυζδ (Spyrou et al., 2009). Σμ BIOACT είκαζ αίμ-κδιαηςδμηηυκμ ηδξ δεφηενδξ μιάδαξ. Πενζέπεζ ζπυνζα ημο ιφηδηα εδάθμοξ Paecilomyces lilacinus, ζηέθεπμξ 251 (PL 251), πμο παναζζηεί ηα ααβά ηςκ κδιαηςδχκ (Khan et al., 2006). φιθςκα ιε πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ ημ PL 251 δεκ επδνέαζε ανκδηζηά ηδκ ακαπαναβςβή ακηαβςκζζηζηχκ ιοηήηςκ (Roumbos 2005) ηαζ ηδκ ζηακυηδηα απμζηζζιμφ δζαθμνεηζηχκ δεκδνυιμνθςκ ιοημννζγζηχκ ιοηήηςκ (Al-Raddad 1995, Roumbos et al., 2006), εκχ άθθεξ ιεθέηεξ έδεζλακ ακαζηαθηζηή επίδναζδ ημο PL 251 υζμκ αθμνά ζημ ιοημννζγζηυ απμζηζζιυ (Siddiqui and Akhtar, 2008). Χζηυζμ, ιέπνζ ζήιενα δεκ οπάνπμοκ ζηδ αζαθζμβναθία ιεθέηεξ ζπεηζηά ιε ηδκ επίδναζδ ημο PL 251 ζηδ ζφκεεζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ. 137

138 Γεκζηά, ζδιακηζηυξ ανζειυξ ιεθεηχκ έπεζ αζπμθδεεί ιέπνζ ζήιενα ιε ηζξ επζπηχζεζξ ηςκ ζοκεεηζηχκ κδιαηςδμηηυκςκ, ηαπκζζηζηχκ ή ιδ, ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Οζ Macalady et al. (1998), ήηακ απυ ημοξ πνχημοξ πμο δζαπίζηςζακ υηζ δ πνμζεήηδ ηδξ ζοκζζηχιεκδξ δυζδξ ημο ηαπκζζηζημφ κδιαηςδμηηυκμο metam sodium (MS) πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ηαζ ιυκζιεξ αθθαβέξ ζηδ δμιή ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ. ηδ ζοκέπεζα μζ Ibekwe et al., (2001), ηαηέθδλακ υηζ ηα ηαπκζζηζηά methyl bromide, methyl isothiocyanate, 1,3- dichloropropene ηαζ chloropicrin επδνέαζακ ηδ δμιή ηδξ εδαθζηήξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ υπςξ αοηή πνμζδζμνίζηδηε ιε ηεπκζηέξ πμο ααζίζηδηακ ζηδ ακάπηολδ ιζηνμμνβακζζιχκ ζε ενεπηζηά οπμζηνχιαηα (BIOLOG) αθθά ηαζ ιε αζμπδιζηέξ (PLFAs) ηαζ ιμνζαηέξ (DGGE) ηεπκζηέξ. Χζηυζμ, μζ Klose et al., (2006), ανήηακ υηζ μζ επειαάζεζξ ανςιζμφπμο ιεεοθίμο ζε ζοκδοαζιυ ιε πθςνμπζηνίκδ, propargylbromide ηαζ ζζμεεζμηοακζμφπμ ιεεφθζμ, δεκ επδνέαζακ ζδιακηζηά ηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ, υηακ πνδζζιμπμζήεδηακ ζηζξ ζοκζζηχιεκεξ δυζεζξ. Οιμίςξ μζ Megharaj et al (1999), παναηήνδζακ υηζ ημ μνβακμθςζθμνζηυ κδιαηςδμηηυκμ fenamiphos, υηακ εθανιυγεηαζ ζηδ ζοκζζηχιεκδ δυζδ δεκ επδνεάγεζ ανκδηζηά ηζξ δναζηζηυηδηεξ θςζθαηαζχκ ηαζ α-βθοημζζδάζδξ, εκχ μζ Caceres et al., (2009), ζε ακάθμβεξ ιεθέηεξ δζαπίζηςζακ ζδιακηζηή ιείςζδ ημο νοειμφ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ αηυια ηαζ ιε πνήζδ ηδξ ζοκζζηχιεκδξ δυζδξ ημο fenamiphos. Πανά ηζξ πμθοάνζειεξ ακαθμνέξ ζπεηζηά ιε ηδκ επίδναζδ ηςκ ζοκεεηζηχκ κδιαηςδμηηυκςκ, εθάπζζηα είκαζ έςξ ζήιενα βκςζηά βζα ηδκ επίδναζδ ηςκ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ κδιαηςδμηηυκςκ ζηδκ εδαθζηή ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα, ηονίςξ θυβς ηδξ βεκζηήξ πεπμίεδζδξ πμο επζηναηεί υηζ δ θοζζηή πνμέθεοζδ ακάθμβςκ ζηεοαζιάηςκ εββοάηαζ ηδκ απμοζία ανκδηζηχκ επζδνάζεςκ ζε μνβακζζιμφξ ιδ ζηυπμοξ. Ζ ακηίθδρδ αοηή ένπεηαζ ζε ακηίεεζδ ιε ηα απμηεθέζιαηα πνυζθαηςκ ιεθεηχκ πμο ηαηαδεζηκφμοκ υηζ ηα αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ. είκαζ δοκαηυκ κα έπμοκ ιδ ακαιεκυιεκδ ημλζηή επίδναζδ ζε ζοβηεηνζιέκεξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ, πμο ιπμνεί κα είκαζ πανμδζηή, υπςξ ζηδκ πενίπηςζδ ημο azadirachtin ζημοξ πθδεοζιμφξ ηςκ ααηηδνίςκ ηαζ αηηζκμααηηδνίςκ ημο εδάθμοξ (Gopal et al., 2007) ή αηυια ηαζ ιυκζιδ, υπςξ ζηδκ πενίπηςζδ ημο ίδζμο αίμκδιαηςδμηηυκμο ζηα κζηνςδμπμζδηζηά ααηηήνζα (Gopal et al., 2007) ηαζ ημοξ δεκδνυιμνθμοξ ιοημνζγζημφξ ιφηδηεξ (Ipsilantis et al., 2012). ηυπμξ αοηήξ ηδξ ιεθέηδξ ήηακ δ εηηίιδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ επζθεβιέκςκ ζοκεεηζηχκ (oxamyl ηαζ fluensulfone) ηαζ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ κδιαηςδμηηυκςκ 138

139 (QLAgri ηαζ BIOACT ) ζηδκ εδαθζηή ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα, ιε ηδ αεθηζζημπμζδιέκδ ιέεμδμ ακάθοζδξ ηςκ PLFAs ηαζ δ ακηζπανάεεζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ. 2.3 Τιηθά θαη Μέζνδνη Αληηδξαζηήξηα Γζα ηδκ ακάθοζδ ηςκ εδαθζηχκ δεζβιάηςκ ιε ηδ ιέεμδμ ηςκ PLFAs πνδζζιμπμζήεδηακ ζοκμθζηά μζ ελήξ ακαθοηζηχξ ηαεανμί (analytical grade, ProAnalysis ηαζ Pestanal grade) μνβακζημί δζαθφηεξ: πθςνμθυνιζμ, δζπθςνμιεεάκζμ, ιεεακυθδ, αηεηυκδ, ελάκζμ, ημθμουθζμ ηαζ μλζηυ μλφ. Γζα ηδκ παναζηεοή ηςκ νοειζζηζηχκ δζαθοιάηςκ πνδζζιμπμζήεδηακ K 2 HPO 4 (θςζθμνζηυ νοειζζηζηυ δζάθοια: Phos 50 mm, ph 7.0) ηαζ Na 3 C 6 H 5 O 7 2H 2 O (ηζηνζηυ νοειζζηζηυ δζάθοια: Cit 150 mm, ph 4.0). Ζ νφειζζδ ημο ph ζηδκ επζεοιδηή ηζιή πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδκ πνμζεήηδ ηαηάθθδθςκ υβηςκ δζαθοιάηςκ NaOH 1N ή HCl 1N, βζα ημ Phos ηαζ ημ Cit, ακηίζημζπα. Γζα ημ δζαπςνζζιυ ηςκ θζπζδίςκ πνδζζιμπμζήεδηακ ζηήθεξ εηπφθζζδξ ζηενεήξ θάζδξ (Solid Phase Extraction Columns: SPE DCS-Si, Silica Tube, 6 ml, 500 mg, Grace Davison Discovery Sciences). Γζα ηδ ιεεακυθοζδ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ παναζηεοάζηδηε ιεεακμθζηυ δζάθοια 0.2M ΚΟΖ (Merck, pa). Ο ιεεοθεζηέναξ ημο δεηαεκκασημφ μλέμξ (nonadecanoate methyl ester, 19:0 ΜΔ) πμο πνδζζιμπμζήεδηε ςξ εζςηενζηυ πνυηοπμ, παναζηεοάζηδηε ιε εζηενμπμίδζδ ημο δεηαεκκασημφ μλέμξ (nonadecanoic αcid) (Sigma-Aldrich) ηαζ δ ηαοημπμίδζδ ημο έβζκε ιε θαζιαημζημπία (spectroscopy) IR ηαζ NMR (πφνμο, 2008). Παναζηεοάζηδηε ποηκυ δζάθοια ημο ιεεοθεζηένα ζοβηέκηνςζδξ 1 mg ml -1 ζε δζαθφηδ ελάκζμ, απυ ημ μπμίμ ιε ηαηάθθδθδ αναίςζδ πνμέηορε ημ δζάθοια ζοβηέκηνςζδξ 100 ιg ml 1, πμο πνδζζιμπμζήεδηε ηεθζηά. Γζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ηςκ ιεεοθεζηένςκ ηςκ θζπανχκ μλέςκ, πνδζζιμπμζήεδηακ ειπμνζηά πνυηοπα ιίβιαηα ιεεοθεζηένςκ ααηηδνίςκ (BAME Mix, Supelco U), ηαζ εοηανοςηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ (37 Component FAME Mix, Supelco U). 139

140 2.3.2.Δδάθε Γζα ημ πείναια ηδξ αεθηζζημπμίδζδξ ηδξ ιεευδμο ηςκ PLFAs, πνδζζιμπμζήεδηακ δφμ δζαθμνεηζηά εδάθδ, έκα υλζκμ (ph 5.5 ζε H 2 O) άιιμ-πδθχδεξ ηαζ έκα αθηαθζηυ (ph 8.6 ζε H 2 O) πδθχδεξ. Σμ υλζκμ έδαθμξ ζοθθέπεδηε απυ ημπμεεζία ζηδκ πενζμπή Γανβαθζάκμζ, Μεζζδκία, Πεθμπυκκδζμξ. Σμ αθηαθζηυ έδαθμξ ζοθθέπεδηε απυ πεζναιαηζηυ ηειάπζμ ζηδκ πενζμπή ημο Αβνμηηήιαημξ ημο Α.Π.Θ, Θένιδ- Θεζζαθμκίηδ. Ζ δζάεεζδ ηςκ δφμ εδαθχκ, υλζκμο ηαζ αθηαθζημφ, έβζκε απυ ημκ Δπίημονμ Καεδβδηή η. Ηςάκκδ Γζακκαημφ, Γεςπμκζηυ Πακεπζζηήιζμ Αεδκχκ ηαζ ηδκ Δπίημονμ Καεδβήηνζα ηα. Θεμδχνα Μαηζή, Γεςπμκζηή πμθή Α.Π.Θ., ακηίζημζπα. Αιέζςξ ιεηά ηδκ ζοθθμβή ημοξ, ηα εδαθζηά δείβιαηα αενμλδνάκεδηακ ιενζηχξ βζα κα ηαηαζηεί εοημθυηενμξ μ πεζνζζιυξ ημοξ ηαζ ηαηυπζκ ημζηζκίζηδηακ ιε ηυζηζκμ μπχκ 4mm, χζηε κα απμιαηνοκεμφκ ηοπυκ θοηζηά οπμθείιιαηα ή πέηνεξ. Αημθμφεςξ, ημπμεεηήεδηακ ζε πθαζηζηέξ ζαημφθεξ ηαζ απμεδηεφηδηακ ζημοξ 4⁰C, ζε ζημηεζκυ ροπνυ εάθαιμ, ιέπνζ ηδκ επελενβαζία ημοξ. Σμ υλζκμ έδαθμξ πνδζζιμπμζήεδηε πεναζηένς βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ηςκ β.θ. ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ (Βθέπε ) Πξνζδηνξηζκόο ησλ εδαθνινγηθώλ ραξαθηεξηζηηθώλ Φοζζημπδιζηέξ Ηδζυηδηεξ Οζ θοζζημπδιζηέξ ζδζυηδηεξ ηςκ δφμ εδαθχκ, πνμζδζμνίζηδηακ ιε ακαθφζεζξ πμο πναβιαημπμζήεδηακ ζημ Δνβαζηήνζμ Δδαθμθμβίαξ ηδξ Γεςπμκζηήξ πμθήξ ημο Α.Π.Θ ηαζ ζοκμρίγμκηαζ ζημκ Πίκαηα 2.1. Ζ ιέηνδζδ ημο πενζεπυιεκμο μνβακζημφ άκεναηα έβζκε ζφιθςκα ιε ημοξ Walkley and Black, (1934) ηαζ δ ιδπακζηή ζφζηαζδ πνμζδζμνίζηδηε ζφιθςκα ιε ηδ ιέεμδμ Bouyoucos (Sheldrick and Wang, 1993). 140

141 Πίλαθαο 2.1. Φοζζημπδιζηέξ ζδζυηδηεξ ηςκ εδαθχκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ Ηδζυηδηεξ Όλζκμ έδαθμξ Αθηαθζηυ έδαθμξ ph Ονβακζηυξ άκεναηαξ (%) Άιιμξ (%) Ηθφξ (%) Άνβζθμξ (%) Μδπακζηή ζφζηαζδ Άιιμ-πδθχδεξ Πδθχδεξ Πνμζδζμνζζιυξ ημο ph ηςκ εδαθχκ Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο εδαθζημφ ph, 10 g εδάθμοξ (λδνυ αάνμξ) γοβίζηδηακ ηαζ ιεηαθένεδηακ ζε ηςκζηή θζάθδ ηςκ 50 ml. ηδ ζοκέπεζα πνμζηέεδηακ 25 ml απεζηαβιέκμο κενμφ (ακαθμβία 1:2.5 α/μ) ηαζ πναβιαημπμζήεδηε ακάδεοζδ ημο ιίβιαημξ ιε ηδ αμήεεζα ιαβκδηζημφ ακαδεοηήνα. Αημθμφεδζε ιέηνδζδ ζε πεπάιεηνμ ορδθήξ εοηνίκεζαξ (HANNA ph 211) ιε πνμζανηδιέκμ δθεηηνυδζμ (METTLER TOLEDO 412). Πνμζδζμνζζιυξ ηδξ ζπεηζηήξ οβναζίαξ ηςκ εδαθχκ Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ πενζεπυιεκδξ οβναζίαξ, 5 ± 0.01 g εδάθμοξ ιεηαθένεδηακ ζε πνμ-γοβζζιέκμ δμπείμ απυ αθμοιίκζμ ηαζ ημ ζοκμθζηυ αάνμξ ηαηαβνάθδηε. Γζα ηάεε δείβια εδάθμοξ πνδζζιμπμζήεδηακ 3 επακαθήρεζξ. Αιέζςξ ιεηά, ηα δείβιαηα ιεηαθένεδηακ ζε πνμεενιαζιέκμ θμφνκμ (LabLine) ζημοξ 105⁰C, υπμο ηαζ πανέιεζκακ βζα χνεξ. ηδ ζοκέπεζα ηα δείβιαηα επακαγοβίζηδηακ ηαζ πνμζδζμνίζηδηε δ πενζεπυιεκδ οβναζία ημο εδάθμοξ ζφιθςκα ιε ημκ ηφπμ: MC= [(W 1 -W 2 )*100%] / (W 1 -Wcont) MC: δ πενζεπυιεκδ οβναζία ημο εδάθμοξ W 1 : ημ αάνμξ ημο δμπείμο ιε ημ έδαθμξ πνζκ ηδκ λήνακζδ W 2 : ημ αάνμξ ημο δμπείμο ιε ημ έδαθμξ ιεηά ηδκ λήνακζδ Wcont: ημ αάνμξ ημο δμπείμο (πφνμο, 2008). 141

142 Πνμζδζμνζζιυξ ηδξ οδαημπςνδηζηυηδηαξ εδαθχκ Ο πνμζδζμνζζιυξ ηδξ οδαημπςνδηζηυηδηαξ έβζκε αανμιεηνζηά. οβηεηνζιέκα, 20g εδάθμοξ γοβίζηδηακ ηαζ ιεηαθένεδηακ ζε πςκί εκηυξ ημο μπμίμο είπε πνμδβμοιέκςξ ημπμεεηδεεί δζδεδηζηυ πανηί (Whatman No1). ηδ ζοκέπεζα ημ έδαθμξ δζαανέπηδηε επακεζθδιιέκα ιε απεζηαβιέκμ κενυ πνμηεζιέκμο κα δζαζθαθζζηεί μ ημνεζιυξ ημο. Ζ εθεφεενδ επζθάκεζα ημο πςκζμφ ηαθφθεδηε ιε αθμοιζκυπανημ βζα ηδκ απμθοβή απχθεζαξ κενμφ θυβς ελάηιζζδξ. Σμ έδαθμξ αθέεδηε ζε δνειία χνεξ χζηε κα ζηναββίζεζ δ πενίζζεζα ημο κενμφ. To αάνμξ ημο πςκζμφ, ιε ημ δζδεδηζηυ πανηί ηαζ ημ έδαθμξ ηαηαβνάθδηε πνζκ (W 1 ) ηαζ ιεηά (W 2 ) ηδκ ηαηάηθζζδ. Αημθμφεςξ, δ οδαημπςνδηζηυηδηα πνμζδζμνίζηδηε ζφιθςκα ιε ημκ ηφπμ: WHC= (B-X) + (W 2 -W 1 ) / X * 100% WHC: δ οδαημπςνδηζηυηδηα ημο εδάθμοξ Β: ημ αάνμξ ημο εδάθμοξ πμο πνμζηέεδηε ζημ πςκί Υ: ημ λδνυ αάνμξ εδάθμοξ πμο πνμζηέεδηε ζημ πςκί W 1 : ημ αάνμξ ημο πςκζμφ ιε ημ δζδεδηζηυ πανηί ηαζ ημ έδαθμξ, πνζκ ηδκ ηαηάηθζζδ W 2 : ημ αάνμξ ημο πςκζμφ ιε ημ δζδεδηζηυ πανηί ηαζ ημ έδαθμξ, ιεηά ηδκ ηαηάηθζζδ Πεξηγξαθή ηεο κεζόδνπ γηα ηνλ πξνζδηνξηζκό ησλ PLFAs Ο πνμζδζμνζζιυξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ έβζκε ζφιθςκα ιε ηδ ιέεμδμ πμο πνδζζιμπμζήεδηε απυ ημοξ Spyrou et al., (2009), ιε εθάπζζηεξ ηνμπμπμζήζεζξ. Ζ ιέεμδμξ πενζθαιαάκεζ 3 επζιένμοξ ζηάδζα: (1) εηπφθζζδ ηςκ θζπζδίςκ απυ ημ έδαθμξ, (2) δζαπςνζζιυ ηςκ θζπζδίςκ ιε πνςιαημβναθία ζηήθδξ ηαζ (3) ιεεοθίςζδ ηαζ ζπδιαηζζιυ ηςκ ιεεοθεζηένςκ ηςκ θζπανχκ μλέςκ. Δθρύιηζε ησλ ιηπηδίσλ από ην έδαθνο Γζα ηδκ εηπφθζζδ ηςκ θζπζδίςκ απυ ημ έδαθμξ πνδζζιμπμζήεδηακ δφμ δζαθμνεηζημί μνβακζημί δζαθφηεξ, ημ πθςνμθυνιζμ (CHL) ηαζ ημ δζπθςνμιεεάκζμ (DCM) ζε ζοκδοαζιυ ιε δφμ δζαθμνεηζηά νοειζζηζηά δζαθφιαηα, θςζθμνζηχκ (Phos) ηαζ ηζηνζηχκ (Cit). οκμθζηά πναβιαημπμζήεδηακ δφμ δζαδμπζηέξ εηποθίζεζξ δζάνηεζαξ δφμ ςνχκ δ ηαεειία. Ζ ζοβηέκηνςζδ ηαζ ημ είδμξ ηςκ PLFAs πμο πνμέηορακ ιεηά απυ ηδκ πνχηδ ηαζ ηδ δεφηενδ εηπφθζζδ ιεθεηήεδηακ λεπςνζζηά, πνμηεζιέκμο κα πνμζδζμνζζηεί δ επίδναζδ ημο ηάεε ηφηθμο εηπφθζζδξ. Ζ 142

143 ζοβηέκηνςζδ ηαζ ημ είδμξ ηςκ PLFAs πμο πνμέηορακ ζοκμθζηά (αενμζζηζηά) ηαζ απυ ηζξ δφμ εηποθίζεζξ πνδζζιμπμζήεδηακ χζηε κα πνμζδζμνζζηεί μ αέθηζζημξ ζοκδοαζιυξ μνβακζημφ δζαθφηδ ηαζ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ. Έηζζ, βζα ηάεε έδαθμξ ιεθεηήεδηακ 8 ζοκδοαζιμί νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ, μνβακζημφ δζαθφηδ ηαζ ανζειμφ ηφηθςκ εηπφθζζδξ: DCMPhos1, DCMPhos2, DCMCit1, DCMCit2, CHLPhos1, CHLPhos2, CHLCit1, and CHLCit2. Οζ ανζειμί πμο αημθμοεμφκ ιεηά ημ ζοκδοαζιυ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ηαζ μνβακζημφ δζαθφηδ ακαθένμκηαζ ζημκ ηφηθμ εηπφθζζδξ (πνχημξ ή δεφηενμξ). Γζα ηάεε ζοκδοαζιυ, ιεθεηήεδηακ 6 ζοκμθζηά επακαθήρεζξ. Πξώηε Δθρύιηζε Ληπηδίσλ 5 g εδάθμοξ (λδνυ αάνμξ) γοβίζηδηακ ηαζ ιεηαθένεδηακ ζε ηςκζηή θζάθδ ηςκ 50 ml. ηδ ζοκέπεζα, πνμζηέεδηακ ζηδκ ηςκζηή θζάθδ 10 ml ιεεακυθδξ, 5 ml μνβακζημφ δζαθφηδ (CHL ή DCM) ηαζ 4 ml νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (Phos ή Cit). οκμθζηά πνδζζιμπμζήεδηακ 19 ml ιίβιαημξ εηπφθζζδξ, ιε ακαθμβία ηςκ επζιένμοξ ζοζηαηζηχκ 1:2:0.8 (o/o/o), ακηίζημζπα. ε ηάεε πενίπηςζδ μ υβημξ ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ δζμνεχκμκηακ θαιαάκμκηαξ οπυρδ ηδκ πενζεπυιεκδ οβναζία ημο εδάθμοξ. Καηυπζκ, ημ ιίβια ακαδεφηδηε ζε μνζγυκηζμ ακαδεοηήνα βζα 2 h, ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Αημθμφεδζε θοβμηέκηνδζδ βζα 20 min ζε 2500 rpm, ηαζ ημ οπενηείιεκμ ιεηαθένεδηε ζε ζημονυπνςιμ θζαθίδζμ ηςκ 50 ml. Σμ ίγδια ημο εδάθμοξ λεπθφεδηε ζφκημια ιε 5 ml ιε ημ ίδζμ ιίβια εηπφθζζδξ ηαζ ημ δεφηενμ οπενηείιεκμ πνμζηέεδηε ζημ ανπζηυ. ηδ ζοκέπεζα, 10 ml ιίβιαημξ 1:1 (o/o) ημο ακηίζημζπμο ζοκδοαζιμφ δζαθφηδ ηαζ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ πνμζηέεδηε ζημ ζημονυπνςιμ θζαθίδζμ, αημθμφεδζε ακάδεοζδ ζε Vortex βζα 2 min ηαζ ημ δζάθοια αθέεδηε ζε δνειία βζα 18 h, ζε ζημηεζκυ ροπνυ εάθαιμ, ζημοξ 4 C πνμηεζιέκμο κα πναβιαημπμζδεεί μ δζαπςνζζιυξ ηςκ θάζεςκ. Ζ ηάης θάζδ ημο μνβακζημφ δζαθφηδ (CHL ή DCM) ζοθθέπεδηε ηαζ ζοιποηκχεδηε ιέπνζ λδνμφ ιε νεφια αγχημο ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Γεύηεξε Δθρύιηζε Ληπηδίσλ Σμ δείβια εδάθμοξ πμο πανέιεζκε ζηδκ ηςκζηή θζάθδ ιεηά ηδκ πνχηδ εηπφθζζδ, οπμαθήεδηε εη κέμο ζε δεφηενδ εηπφθζζδ δζάνηεζαξ 2 ςνχκ. Γζα ημ θυβμ αοηυ, ζε ηάεε ηςκζηή θζάθδ πνμζηέεδηακ 5 ml ιεεακυθδξ, 2,5 ml μνβακζημφ δζαθφηδ ηαζ 2ml νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ. οκμθζηά, πνδζζιμπμζήεδηακ 9,5 ml ιίβιαημξ εηπφθζζδξ ίδζαξ ζφζηαζδξ ιε αοηυ πμο πνδζζιμπμζήεδηε ζηδκ πνχηδ εηπφθζζδ ηαζ ακαθμβίαξ 143

144 1:2:0.8 (o/o/o). ηδ ζοκέπεζα, ηα δείβιαηα οπμαθήεδηακ ζηδκ ίδζα δζαδζηαζία πμο πενζβνάθδηε ηαηά ηδκ πνχηδ εηπφθζζδ. Σμ οπενηείιεκμ δζαπςνίζηδηε ζε δφμ θάζεζξ ιε πνμζεήηδ 5 ml ιίβιαημξ δζαθφηδ ηαζ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ζε ακαθμβία 1:1 (o/o), ηαζ ιεηά ημ δζαπςνζζιυ ηςκ θάζεςκ μ μνβακζηυξ δζαθφηδξ απμιαηνφκεδηε ιε νεφια αγχημο ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Γηαρσξηζκόο ησλ θσζθνιηπηδίσλ κε ρξσκαηνγξαθία ζηήιεο Σα θςζθμθζπίδζα πμο πνμήθεακ απυ ηζξ 2 εηποθίζεζξ, δζαπςνίζηδηακ απυ ηα μοδέηενα θζπίδζα ηαζ ηα βθοημθζπίδζα πμο ζοκεηποθίζηδηακ, ιε εηπφθζζδ ζηενεήξ θάζδξ πμο πναβιαημπμζήεδηε ζε ζηήθεξ Silica (SPE DSC-Si). Πνζκ ημ δζαπςνζζιυ μζ ζηήθεξ εκενβμπμζήεδηακ ιε πνμζεήηδ 3 ml μνβακζημφ δζαθφηδ (CHL ή DCM). Σμ ίγδια πμο πνμέηορε ιεηά ηδ ζοιπφηκςζδ ημο μνβακζημφ δζαθφηδ ζε νεφια αγχημο, επακαδζαθφεδηε ανπζηά ιε 250 ιl δζαθφηδ (CHL ή DCM) ηαζ ιεηαθένεδηε ζηδκ εκενβμπμζδιέκδ ζηήθδ. Ζ δζαδζηαζία αοηή επακαθήθεδηε ζοκμθζηά 4 θμνέξ (4 x 250 ιl). Σα μοδέηενα θζπίδζα ηαζ ηα βθοημθζπίδζα εηθμφζηδηακ ζηδ ζοκέπεζα απυ ηδ ζηήθδ ιε 5 ml δζαθφηδ (CHL ή DCM) ηαζ 5 ml αηεηυκδξ, ακηίζημζπα ηαζ απμιαηνφκεδηακ. Ζ έηθμοζδ ηαζ παναθααή ηςκ θςζθμθζπζδίςκ πναβιαημπμζήεδηε ιε 5 ml ιεεακυθδξ. Σμ ηθάζια ηςκ θςζθμθζπζδίςκ ζοιποηκχεδηε ζηδ ζοκέπεζα ιέπνζ λδνμφ ιε νεφια αγχημο. Μεζπιίσζε θαη ζρεκαηηζκόο ησλ κεζπιεζηέξσλ ησλ ιηπαξώλ νμέσλ ημ ίγδια ηςκ θςζθμθζπζδίςκ πνμζηέεδηακ 100 ιl ιεεοθεζηένα ημο δεηαεκκασημφ μλέμξ (19:0ME) ζοβηέκηνςζδξ 100 ιg ml 1, ςξ εζςηενζηυ πνυηοπμ. ηδ ζοκέπεζα πνμζηέεδηε 0.5 ml ιίβιαημξ ιεεακυθδξ : ημθμομθίμο 1:1 (o/o) ηαζ 0.5 ml ιεεακμθζημφ δζαθφιαημξ ΚΟΖ 0.2Μ, ηαζ ηα δείβιαηα ημπμεεηήεδηακ βζα 15 min ζε οδαηυθμοηνμ ζημοξ 37⁰C ηαζ ηα θζπανά μλέα ηςκ θςζθμθζπζδίςκ οπμαθήεδηακ ζε ήπζα ιεεακυθοζδ, πνμηεζιέκμο κα ζπδιαηζζημφκ μζ ακηίζημζπμζ ιεεοθεζηένεξ ημοξ. Μεηά ηδκ απμιάηνοκζδ απυ ημ οδαηυθμοηνμ πνμζηέεδηε ζημ ιεεακμθζηυ δζάθοια 0.5 ml μλζημφ μλέμξ (0,2 Ν) βζα ηδκ ελμοδεηένςζδ ηδξ πενίζζεζαξ ημο ΚΟΖ. Αημθμφεδζε εηπφθζζδ ηαζ παναθααή ηςκ ιεεοθεζηένςκ ζε δζαθφηδ ελάκζμ. Γζα ημ θυβμ αοηυ πνμζηέεδηακ ζημ δζάθοια ηςκ ιεεοθεζηένςκ 2 ml ιίβιαημξ ελάκζμο: μνβακζημφ δζαθφηδ (CHL ή DCM) 4:1 (μ/μ) ηαζ 2 ml απεζηαβιέκμο κενμφ (d. H 2 O), χζηε κα δζαπςνζζεμφκ μζ θάζεζξ. Αημθμφεδζε ζφκημιδ ακάδεοζδ ζε Vortex, θοβμηέκηνδζδ βζα 5 min ζε 2500 rpm ηαζ ζοθθμβή ηδξ οπενηείιεκδξ θάζδξ ημο 144

145 ελακίμο ζε ζημονυπνςιμ θζαθίδζμ ηςκ 10 ml. Ζ δζαδζηαζία επακαθήθεδηε ιε ηδκ πνμζεήηδ επζπθέμκ 2 ml ιίβιαημξ ελακίμο: μνβακζημφ δζαθφηδ 4:1 (μ/μ), θοβμηέκηνδζδ ηαζ ζοθθμβή ηδξ οπενηείιεκδξ θάζδξ ζημ θζαθίδζμ ηςκ 10 ml. Αημθμφεδζε απμιάηνοκζδ ημο ελακίμο ηαζ ζοιπφηκςζδ ιέπνζ λδνμφ ιε νεφια αγχημο. Σέθμξ, ημ ίγδια ηςκ ιεεοθεζηένςκ επακαδζαθφεδηε ζε 200 ιl ελάκζμ ηαζ ιεηαθένεδηε ζε θζαθίδζα αοηυιαημο δεζβιαημθήπηδ βζα ακάθοζδ ιε αένζα πνςιαημβναθία (GC). Σα ζγήιαηα ηςκ θζπζδίςκ, θςζθμθζπζδίςκ ηαζ ηςκ ιεεοθεζηένςκ ηςκ θζπανχκ μλέςκ πμο πνμηφπημοκ ιεηά απυ ηάεε επζιένμοξ ζηάδζμ ηδξ ιεευδμο, είκαζ δοκαηυκ κα απμεδηεοημφκ ζε αηιυζθαζνα αγχημο ζημοξ -20⁰C, πνζκ ηδκ πεναζηένς επελενβαζία ημοξ. Αέξηνο Υξσκαηνγξαθία (GC) Γζα ημκ πμζμηζηυ ηαζ πμζμηζηυ πνμζδζμνζζιυ ηςκ PLFAs πνδζζιμπμζήεδηε ζφζηδια αένζαξ πνςιαημβναθίαξ Hewlett Packard HP 5890 Series II GC ιε ακζπκεοηή ζμκζζιμφ θθυβαξ (Flame Ionization Detector) ηαζ αοηυιαημ δεζβιαημθήπηδ HP7673 Agilent. Όβημξ 2 ιl απυ ηάεε δείβια εβπφεδηε ζε εβποηή πμο θεζημονβμφζε ζε ηαηάζηαζδ splitless. Ο δζαπςνζζιυξ ηςκ πηδηζηχκ ιεεοθεζηένςκ ηςκ θζπανχκ μλέςκ πναβιαημπμζήεδηε ζε ηνζπμεζδή ζηήθδ HP-5ΜS (5% phenyl methylsiloxane fused silica) ιήημοξ 25 m ηαζ δζαιέηνμο 320 nm (HP-5 25 m length mm i.d., film thickness, 0.25 ιm) ηαζ αημθμοεήεδηε ζοβηεηνζιέκμ εενιμηναζζαηυ πνυβναιια. Ο θμφνκμξ νοειίζηδηε ανπζηά ζημοξ 120⁰C ηαζ πανέιεζκε ζηδ εενιμηναζία αοηή βζα ηα πνχηα 7 min. Αημθμφεδζε αφλδζδ ηδξ εενιμηναζίαξ βναιιζηά έςξ ημοξ 170 C ιε νοειυ 4 C min 1 υπμο δζαηδνήεδηε βζα 3 min ηαζ ζηδ ζοκέπεζα αολήεδηε έςξ ημοξ 250 C ιε νοειυ 3 C min 1 υπμο ηαζ πανέιεζκε βζα 2 min. Ο ζοκμθζηυξ πνυκμξ ακάθοζδξ ήηακ 51.2 min. Οζ εενιμηναζίεξ ημο εβποηή ηαζ ημο ακζπκεοηή νοειίζηδηακ ζημοξ 250 C ηαζ 310 C, ακηίζημζπα. Σμ ήθζμ (Ζe) ηαζ ημ άγςημ (N 2 ) πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ θένμκ ηαζ makeup αένζα ιε νμή of 1 ml min 1 ηαζ 20 ml min 1, ακηίζημζπα. Γζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ηςκ ιεεοθεζηένςκ ηςκ θζπανχκ μλέςκ, μζ πνυκμζ ηαηαηνάηδζδξ ηδξ ηάεε ημνοθήξ ζοβηνίκμκηακ ιε αοημφξ ηςκ ημνοθχκ πμο πνμέηορακ απυ ηα πνυηοπα ιίβιαηα FAME ηαζ BAME. Γζα ημκ ζημπυ αοηυ, 145

146 πνμεημζιάζηδηακ δζαθφιαηα ηςκ δφμ ιζβιάηςκ ζε δζαθφηδ ελάκζμ (αναίςζδ 1:100, μ/μ) ηαζ εβπφεδηακ ζημ ζφζηδια αένζαξ πνςιαημβναθίαξ. Δπζπθέμκ επζαεααίςζδ ηδξ ηαοηυηδηαξ ηςκ ιεεοθεζηένςκ ζηα πνυηοπα ιίβιαηα FAME ηαζ BAME, αθθά ηαζ ζε μνζζιέκα δείβιαηα επζθεηηζηά, έβζκε ιε ακάθοζδ ημοξ ζε ζφζηδια αένζαξ πνςιαημβναθίαξ, Agilent HP 6890 N GC MS System, ιε ακζπκεφηδ θαζιαημβνάθμ ιάγαξ Agilent 5975B ηαζ ιε αοηυιαημ δεζβιαημθήπηδ HP Agilent 7683B. Δβπφεδηακ 2 ιl δείβιαημξ ζε ηαηάζηαζδ splitless ηαζ μ δζαπςνζζιυξ ηςκ ιεεοθεζηένςκ έβζκε ζε ζηήθδ HP-5MS ιήημοξ 30 m ηαζ δζαιέηνμο 250 nm (30 m 0.25 mm i.d; film thickness, 0.25 ιm) (Agilent Scientific, USA). Σμ ζφζηδια θεζημφνβδζε ζημ ίδζμ εενιμηναζζαηυ πνυβναιια ιε ημκ GC FID υπςξ αοηυ πενζβνάθδηε παναπάκς. Σμ δοκαιζηυ πεδίμ (electron ionization energy) νοειίζηδηε ζηα 70 ev ηαζ μζ εενιμηναζίεξ ηδξ πδβήξ ζυκηςκ (ion source) ηαζ ημο ηεηνάπμθμο, νοειίζηδηακ ζημοξ 150 C ηαζ 230 C, ακηίζημζπα. Δπίζδξ, μζ εενιμηναζίεξ ημο εβποηή, ημο transfer line ηαζ ημο ακζπκεοηή μνίζηδηακ ζημοξ 270 C, 290 C ηαζ 120 C, ακηίζημζπα. ε αοηή ηδκ πενίπηςζδ βζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ηςκ επζιένμοξ ημνοθχκ ηςκ ιεεοθεζηένςκ πνδζζιμπμζήεδηε δ δθεηηνμκζηή αζαθζμεήηδ Nist 98. Ζ πμζμηζημπμίδζδ ημο ηάεε θζπανμφ μλέμξ (ζε nanomoles ακά βναιιάνζμ λδνμφ αάνμοξ εδάθμοξ) πναβιαημπμζήεδηε ιε ααειμκυιδζδ εκυξ ζδιείμο (one-point calibration) ζφιθςκα ιε ηδκ ακηαπυηνζζδ (ειααδυκ ηδξ ημνοθήξ) ημο εζςηενζημφ πνμηφπμο (19:0 ME), ζημ πνςιαημβναθζηυ ζφζηδια. ηζξ ζοκεήηεξ πμο πενζβνάθηδηακ, δ ακηαπυηνζζδ ημο εζςηενζημφ πνμηφπμο (ιεεοθεζηέναξ ημο 19:0) ήηακ βναιιζηή ζε εφνμξ ζοβηεκηνχζεςκ ιg ml 1, ιε απμδεηηέξ ακαηηήζεζξ πμο ηοιάκεδηακ απυ 91 έςξ 95.3 %, (ιέζδ ακάηηδζδ 93.6 %) ηαζ ζοκηεθεζηή παναθθαηηζηυηδηαξ < 2.9. Ζ ελίζςζδ ηδξ ιέζδξ ηαιπφθδξ πμο οπμθμβίζηδηε ήηακ y=1347.6x+2152, ιε ζοκηεθεζηή ζοιιεηααμθήξ R 2 = (πφνμο, 2008) Δπίδξαζε ησλ γ.θ. ζηε κηθξνβηαθή θνηλόηεηα ηνπ εδάθνπο Γζα ηδ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ηςκ ζοκεεηζηχκ ηαζ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ κδιαηςδμηηυκςκ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ, πνδζζιμπμζήεδηε ημ υλζκμ (ph 5.5 ζε H 2 O) άιιμ-πδθχδεξ έδαθμξ πμο πενζβνάθηδηε ζηδκ πανάβναθμ Οζ θοζζημπδιζηέξ ζδζυηδηεξ ημο εδάθμοξ πανμοζζάγμκηαζ ζημκ Πίκαηα 2.1. Σμ πνμξ ιεθέηδ έδαθμξ αθμφ ζοθθέπεδηε, αενμλδνάκεδηε ηαζ ημζηζκίζηδηε (Βθέπε 2.3.2), δζαπςνίζηδηε ζε 5 ζοκμθζηά οπμδείβιαηα ηςκ 2.3 Kg. Αημθμφεδζε επέιααζδ ιε ηα πνμξ ιεθέηδ β.θ. χζηε κα επζηεοπεεί επζαάνοκζδ ηςκ εδαθζηχκ 146

147 οπμδεζβιάηςκ ιε δυζδ ίζδ ιε ηδ ζοκζζηχιεκδ βζα ηδκ ηαηαπμθέιδζδ ηςκ κδιαηςδχκ ζημ έδαθμξ. οβηεηνζιέκα, βζα ηδκ επζαάνοκζδ ηςκ ηνζχκ πνχηςκ δεζβιάηςκ πνδζζιμπμζήεδηακ 40 ml απυ ηα οδαηζηά εκαζςνήιαηα ηςκ ζοκεεηζηχκ β.θ. oxamyl (VYDATE 10SC, DuPont) ηαζ fluensulfone (MCW-2 48Δ, Makhteshim- Agan Industries, Israel) ηαζ ημο αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ QL Agri, BASF UK, (θοηζηυ εηπφθζζια ημο Quillaja saponaria, 35SL). Γζα ηδκ επζαάνοκζδ ημο ηέηανημο δείβιαημξ πνδζζιμπμζήεδηε οδαηζηυ εκαζχνδια ημο αζμθμβζημφ κδιαηςδμηηυκμο BIOACT, Prophyta Biologischer Pflanzenschutz GmbH (Germany), (1x10 10 ζπυνζα ημο PL 251 ακά βναιιάνζμ ζηεοάζιαημξ) χζηε κα επζηεοπεεί δ ζοκζζηχιεκδ δυζδ (10 6 ζπυνζα g -1 εδάθμοξ). Σέθμξ, ημ πέιπημ δείβια δέπεδηε ακάθμβδ πμζυηδηα κενμφ, πςνίξ πανμοζία β.θ., χζηε κα πνδζζιμπμζδεεί ςξ ιάνηοναξ ακαθμνάξ. Μεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ β.θ. αημθμφεδζε ακάιζλδ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηα δείβιαηα αθέεδηακ βζα 1 χνα ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (25±1⁰C) χζηε κα επέθεεζ ζζμννμπία ηαζ κα επζηεοπεεί μιμζυιμνθδ ηαηακμιή ημοξ ζημ έδαθμξ. Καηάθθδθμξ υβημξ κενμφ πνμζηέεδηε χζηε ηεθζηά δ ζπεηζηή οβναζία ημο εδάθμοξ κα πνμζανιμζηεί ζημ 45% ηδξ οδαημπςνδηζηυηδηαξ. Σα εδαθζηά δείβιαηα δζαπςνίζηδηακ ζηδ ζοκέπεζα πεναζηένς ζε οπμδείβιαηα ηςκ 50g, ημπμεεηήεδηακ ζε αενμζηεβείξ πθαζηζηέξ ζαημφθεξ ηαζ επςάζηδηακ ζημ ζημηάδζ, ζημοξ 25±2⁰C. ε πνμκζηυ δζάζηδια 5, 20, 45, 90 διενχκ ιεηά ηδκ επέιααζδ, ηνία επζιένμοξ δείβιαηα απυ ηάεε ιεηαπείνζζδ ζοθθέπεδηακ ηαζ ημπμεεηήεδηακ ζημοξ 4⁰C χζηε κα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα ηδκ ακάθοζδ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ ζφιθςκα ιε ηδ αεθηζζημπμζδιέκδ ιέεμδμ πμο πενζβνάθηδηε θεπημιενχξ παναπάκς (CHL Cit- 2 ηφηθμζ εηπφθζζδξ). ε ηάεε πενίπηςζδ, δ ακάθοζδ ηςκ PLFAs πναβιαημπμζμφκηακ εκηυξ 7 διενχκ ηαηηζηηθή αλάιπζε Ανπζηά, οπμθμβίζηδηακ μζ ζοβηεκηνχζεζξ (ιg ml -1 ) ηςκ ιεεοθεζηένςκ ηςκ θζπανχκ μλέςκ πμο ακζπκεφηδηακ ζηα δζαθμνεηζηά δείβιαηα εδάθμοξ, ζε ζπέζδ ιε ηδ ζοβηέκηνςζδ (50 ιg ml -1 ) ημο εζςηενζημφ πνμηφπμο (19:0 ME) (one point calibration) ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιε αάζδ ημ ιμνζαηυ αάνμξ ημο ηάεε ιεεοθεζηένα οπμθμβίζηδηε δ ζοβηέκηνςζδ ημο ηάεε ιεεοθεζηένα ζημ έδαθμξ ζε nanomoles ακά βναιιάνζμ εδάθμοξ. Σμ άενμζζια ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ (nmol g -1 ) υθςκ ηςκ ιεεοθεζηένςκ εκυξ δείβιαημξ, απμηεθεί ηδ ζοκμθζηή ζοβηέκηνςζδ (nmol g -1 ) ημο 147

148 ηάεε δείβιαημξ ζε PLFAs. Οζ ηζιέξ αοηέξ πνδζζιμπμζήεδηακ ζε ηάεε πενίπηςζδ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ πμζμηζηχκ ιεηααμθχκ, ιεηαλφ ηςκ δζαθμνεηζηχκ ιεηαπεζνίζεςκ. Αημθμφεςξ, πνμζδζμνίζηδηε ημ % πμζμζηυ ημο ηάεε ιεεοθεζηένα (ζπεηζηή αθεμκία) (relative abundance data) ζηδ ζοκμθζηή πμζυηδηα ηςκ PLFAs βζα ηάεε δείβια. Οζ ηζιέξ αοηέξ πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ ιεηααμθχκ ζηδ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs, ιεηαλφ ηςκ δζαθμνεηζηχκ ιεηαπεζνίζεςκ. Βειηηζηνπνίεζε ηεο κεζόδνπ ησλ PLFAs Οζ επζδνάζεζξ ηςκ δζαθμνεηζηχκ παναιέηνςκ ηδξ εηπφθζζδξ (μνβακζηυξ δζαθφηδξνοειζζηζηυ δζάθοια-ανζειυξ ηφηθμο εηπφθζζδξ) ζηδ ζοκμθζηή ζοβηέκηνςζδ (nmol g - 1 ) ηςκ PLFAs ημο ηάεε δείβιαημξ, πνμζδζμνίζηδηακ ιε Πμθθαπθή Ακάθοζδ Γζαηφιακζδξ (multiple analysis of variance, MANOVA). Ζ επίδναζδ ημο δζαθφηδ ηαζ ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ζηδ ζοκμθζηή ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs (nmol g -1 ) πμο πνμέηορακ αενμζζηζηά ηαζ απυ ημοξ δφμ ηφηθμοξ εηπφθζζδξ, πνμζδζμνίζηδηε ιε Ακάθοζδ Γζαηφιακζδξ Γφμ παναβυκηςκ (Two-way ANOVA). Καζ ζηζξ δφμ παναπάκς πενζπηχζεζξ, υπμο παναηδνήεδηακ ζδιακηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ ηφνζςκ παναβυκηςκ (ακελάνηδηςκ ιεηααθδηχκ), πνδζζιμπμζήεδηε δ δμηζιή ηςκ Δθάπζζηςκ διακηζηχκ Γζαθμνχκ (Least Significance Difference, LSD Test) πνμηεζιέκμο κα ακζπκεοημφκ ηαζ κα δζαπςνζζημφκ μζ ηζιέξ ηςκ ιέζςκ υνςκ ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ πμο δζέθενακ ιεηαλφ ημοξ ζε επίπεδμ ζδιακηζηυηδηαξ 5% (p=0.05). Σέθμξ, βζα ηδκ εηηίιδζδ ηςκ επζδνάζεςκ ηςκ δζαθμνεηζηχκ ζοκδοαζιχκ δζαθφηδνοειζζηζημφ δζαθφιαημξ, ζηδκ ζηακυηδηα εηπφθζζδξ ηςκ επζιένμοξ PLFAs πνδζζιμπμζήεδηε Ακάθοζδ Γζαηφιακζδξ εκυξ πανάβμκηα (one-way ANOVA). Οζ επζδνάζεζξ ημο δζαθφηδ ηαζ ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ζηδκ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs πμο πνμέηορακ απυ ηδκ πνχηδ ή ηδ δεφηενδ εηπφθζζδ, δζενεοκήεδηακ ιε Ακάθοζδ Κονίςκ οκζζηςζχκ (Principal Component Analysis, PCA). Γζα ημ ζημπυ αοηυ πνδζζιμπμζήεδηακ ηα δεδμιέκα ζπεηζηήξ αθεμκίαξ (relative abundance) ηςκ επζιένμοξ PLFAs πμο ηαοημπμζήεδηακ ζε ηάεε δείβια. ηδ ζοκέπεζα, μζ έλζ πνχηεξ ζοκζζηχζεξ πμο πνμέηορακ απυ ηδκ ακάθοζδ ηςκ Κφνζςκ οκζζηςζχκ οπμαθήεδηακ ζε Ακάθοζδ Κακμκζηχκ Μεηααθδηχκ (Canonical Variate Analysis, CVA). Ζ ιέεμδμξ CVA πνδζζιμπμζείηαζ βζα ημκ εκημπζζιυ βναιιζηχκ ζοζπεηζζιχκ ιεηαλφ ηςκ ιεηααθδηχκ ηαζ έπεζ ζπεδζαζηεί χζηε κα ιεβζζημπμζεί ημ θυβμ ηδξ απυηθζζδξ ιεηαλφ ηςκ μιάδςκ (between-group) πνμξ ηζξ απμηθίζεζξ πμο πανμοζζάγμκηαζ εζςηενζηά ηδξ ηάεε μιάδαξ (within-group) ακζπκεφμκηαξ έηζζ μνζαηέξ δζαθμνέξ πμο άθθεξ 148

149 ζηαηζζηζηέξ πνμζεββίζεζξ δεκ είκαζ εθζηηυ κα δζαηνίκμοκ (McCaig et al., 2001). Όθεξ μζ παναπάκς ζηαηζζηζηέξ ακαθφζεζξ πναβιαημπμζήεδηακ ιε ημ ζηαηζζηζηυ παηέημ Genstat 11.0v. Δπίδξαζε ησλ γ.θ. ζηε κηθξνβηαθή θνηλόηεηα ηνπ εδάθνπο Σα δεδμιέκα ηδξ ζοκμθζηήξ ζοβηέκηνςζδξ (nmol g -1 ) ηςκ PLFAs βζα ηάεε δείβια, οπμαθήεδηακ ανπζηά ζε Ακάθοζδ Γζαηφιακζδξ Γφμ Παναβυκηςκ (Two-way ANOVA) ηαζ ηαηυπζκ πνδζζιμπμζήεδηε δ δμηζιή ηςκ Δθάπζζηςκ διακηζηχκ Γζαθμνχκ (Least Significance Difference, LSD test) πνμηεζιέκμο κα ακζπκεοημφκ ηοπυκ ζδιακηζηέξ επζδνάζεζξ (p=0.05) ημο πνυκμο δεζβιαημθδρίαξ, ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ηαζ ηδξ αθθδθεπίδναζδξ ηςκ δφμ αοηχκ παναβυκηςκ. Σα δεδμιέκα ηςκ ζπεηζηχκ ζοβηεκηνχζεςκ (relative abundance) ηςκ PLFAs ζε ηάεε εδαθζηυ δείβια οπμαθήεδηακ ζε Ακάθοζδ Κφνζςκ οκζζηςζχκ (Principal Component Analysis, PCA). Οζ ηζιέξ ηςκ δφμ ηφνζςκ ζοκζζηςζχκ (PC1ηαζ PC2) πμο πενζηθείμοκ ημ ιεβαθφηενμ ημιιάηζ ηδξ παναθθαηηζηυηδηαξ ( > 50%) ηςκ δεδμιέκςκ, πνδζζιμπμζήεδηακ ζηδ ζοκέπεζα βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβναιιάηςκ ζηα μπμία ιπμνεί κα δζαηνζεεί δ μιαδμπμίδζδ ηςκ δεζβιάηςκ ιε αάζδ ηζξ ακελάνηδηεξ ιεηααθδηέξ πμο ζηδκ πνμηεζιέκδ πενίπηςζδ ήηακ μζ πνυκμζ δεζβιαημθδρίαξ ηαζ ηα βεςνβζηά θάνιαηα. Όθεξ μζ παναπάκς ζηαηζζηζηέξ ακαθφζεζξ πναβιαημπμζήεδηακ ιε ημ ζηαηζζηζηυ παηέημ Genstat 11.0v Απνηειέζκαηα ηα δείβιαηα πμο ακαθφεδηακ, ακζπκεφηδηακ ζοκμθζηά 32 θζπανά μλέα ιζηνμαζαηήξ πνμέθεοζδξ, πμο πενζέπμοκ απυ 14 ςξ 24 άημια C. Χζηυζμ, ιυκμ 22 απυ αοηά, εηηυξ απυ ημ εζςηενζηυ πνυηοπμ (19:0), εκημπίζηδηακ ζηαεενά ζε υθα ηα εδαθζηά δείβιαηα ηαζ ζε ζπεηζηή αθεμκία > 0.5 % ηαζ αοηά πνδζζιμπμζήεδηακ ζηζξ ακαθφζεζξ. ημκ Πίκαηα 2.2. πανμοζζάγμκηαζ ηα θζπανά μλέα πμο ακζπκεοηήηακ ηαζ ηαοημπμζήεδηακ ηαεχξ ηαζ δ μιάδα ιζηνμμνβακζζιχκ ζηδκ μπμία απακηχκηαζ ζφιθςκα ιε ηδ αζαθζμβναθία (Federle, 1986, Findlay, 2004). 149

150 Πίλαθαο 2.2. Λζπανά μλέα ηςκ θςζθμθζπζδίςκ πμο ηαοημπμζήεδηακ ηαζ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ ζηζξ μπμίεξ απακηχκηαζ. Οκάδα κηθξννξγαληζκώλ Ληπαξά νμέα Θεηζηά ηαηά Gram ααηηήνζα 15:0, a15:0, i15:0, i16:0, 17:0, i17:0 Ανκδηζηά ηαηά Gram ααηηήνζα Αηηζκμααηηήνζα Μφηδηεξ Δοηανοςηζημί μνβακζζιμί (π.π. Πνςηυγςα) 16:0, 16:1ς7, cy17:0, cy19:0, 18:1ς9c, 18:1ς9t, 18:2ς6,9 10Me16:0, 10Me17:0, 10Me18:0 16:0, 18:2ς6,9, 18:1ς9c, 18:1ς9t 22:0, 23:0, 24:0 Σνία αηυια θζπανά μλέα ιζηνμαζαηήξ πνμέθεοζδξ πμο ηαοημπμζήεδηακ (14:0, 18:0 ηαζ 20:0) δεκ εεςνμφκηαζ δείηηεξ ηάπμζαξ ζοβηεηνζιέκδξ μιάδαξ ιζηνμμνβακζζιχκ. Πθδνμθμνίεξ ζπεηζηά ιε ηδκ μκμιαημθμβία ηςκ θζπανχκ μλέςκ δίκμκηαζ θεπημιενχξ ζηδκ πανάβναθμ , ημο ηεθαθαίμο Βειηηζηνπνίεζε ηεο κεζόδνπ ησλ PLFAs Δπίδξαζε ησλ παξακέηξσλ εθρύιηζεο ζηελ ζπλνιηθή ζπγθέληξσζε ησλ PLFAs Ακελάνηδηα απυ ημκ ζοκδοαζιυ μνβακζημφ δζαθφηδ-νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ, δ ζοκμθζηή ζοβηέκηνςζδ (nmol g -1 ) ηςκ PLFAs επδνεάζηδηε ζδιακηζηά (p<0.001) απυ ημκ ανζειυ ηςκ ηφηθςκ εηπφθζζδξ, ηαζ ζημοξ δφμ ηφπμοξ εδάθμοξ (Πίκαηαξ 2.3.). οβηεηνζιέκα, ζδιακηζηά ορδθυηενδ ήηακ δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs (p<0.001) ζημ υλζκμ (18.7 nmol g -1 εδάθμοξ: ιέζμξ υνμξ υθςκ ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ) ηαζ ζημ αθηαθζηυ έδαθμξ (12.9 nmol g -1 εδάθμοξ: ιέζμξ υνμξ υθςκ ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ), ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ δφμ δζαδμπζηχκ εηποθίζεςκ (αενμζζηζηά) ζοβηνζηζηά ιε ηζξ ακηίζημζπεξ πμο πνμέηορακ απυ ιζα ιυκμ εηπφθζζδ (14.3 ηαζ 8.9 nmol. g -1 εδάθμοξ, ακηίζημζπα). ηδκ πενίπηςζδ ηςκ δφμ δζαδμπζηχκ εηποθίζεςκ, δ επίδναζδ ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ανέεδηε κα είκαζ ζδιακηζηή (p<0.001) ιυκμ ζημ αθηαθζηυ έδαθμξ (Πίκαηαξ 2.3.). ημ έδαθμξ αοηυ, δ πνήζδ ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ηςκ ηζηνζηχκ 150

151 ζυκηςκ, μδήβδζε ζε ακάηηδζδ ζδιακηζηά ορδθυηενδξ (p<0.001) ζοβηέκηνςζδξ PLFAs (14.3 nmol g -1 εδάθμοξ: ιέζμξ υνμξ υθςκ ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ ιε νοειζζηζηυ δζάθοια ηζηνζηχκ ζυκηςκ) ζοβηνζηζηά ιε ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ πμο πνυεηορακ υηακ πνδζζιμπμζήεδηε νοειζζηζηυ δζάθοια θςζθμνζηχκ (11.6 nmol g- 1 εδάθμοξ: ιέζμξ υνμξ υθςκ ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ ιε νοειζζηζηυ δζάθοια θςζθμνζηχκ ζυκηςκ). Απυ ηδκ άθθδ πθεονά, δ επζθμβή ημο μνβακζημφ δζαθφηδ (CHL ή DCM) είπε ζδιακηζηή επίδναζδ (p<0.001) ζηδκ ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs πμο πνμέηορακ απυ ηζξ δφμ δζαδμπζηέξ εηποθίζεζξ ηαζ ζηα δφμ εδάθδ (Πίκαηαξ 2.3). οβηεηνζιέκα, δ πνήζδ ημο CHL μδήβδζε ζε ακάηηδζδ ζδιακηζηά ορδθυηενςκ (p<0.001) ζοβηεκηνχζεςκ PLFAs ζοβηνζηζηά ιε ημ DCM ηαζ ζημοξ δφμ ηφπμοξ εδάθμοξ. διακηζηέξ (p<0.001) αθθδθεπζδνάζεζξ ακάιεζα ζημ δζαθφηδ ηαζ ημ νοειζζηζηυ δζάθοια παναηδνήεδηακ ιυκμ ζημ υλζκμ έδαθμξ, ιε ηζξ ορδθυηενεξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ PLFAs ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ δφμ δζαδμπζηχκ εηποθίζεςκ κα πνμηφπημοκ απυ ημκ ζοκδοαζιυ CHL ιε νοειζζηζηυ δζάθοια ηζηνζηχκ (Cit) (πήια 2.1., Πζκάηαξ 2.4.). 151

152 Πίλαθαο 2.3. Δπίδναζδ ηςκ παναβυκηςκ εηπφθζζδξ : νοειζζηζηυ δζάθοια (Phos ή Cit) μνβακζηυξ δζαθφηδξ (CHLή DCM) ανζειυξ ηφηθςκ εηπφθζζδξ ( 1 ή 2 δζαδμπζηέξ εηποθίζεζξ) ζηδ ζοκμθζηή ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs πμο εηποθίζηδηακ απυ ημ υλζκμ ηαζ ημ αθηαθζηυ έδαθμξ, υπςξ πνμζδζμνίζηδηε ιε Πμθθαπθή Ακάθοζδ Γζαηφιακζδξ (multiple analysis of variance: MANOVA). Έδαθνο Ρπζκηζηηθό Γηαιύηεο Αξηζκόο θύθισλ Ρπζκ. δ/κα x Ρπζκ. δ/κα x Γηαιύηεο x Ρπζκ. δ/κα x Γηαιύηεο x Γηάιπκα εθρύιηζεο Γηαιύηεο Αξηζκ. θύθισλ εθρ. Αξηζκ. θύθισλ εθρ. Αξηζκ. θύθισλ εθρ Όλζκμ <0.001 <0.001 < Αθηαθζηυ <0.001 <0.001 <

153 ρήκα 2.1. οκμθζηή ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs (nanomoles g -1 εδάθμοξ) πμο εηποθίζηδηακ φζηενα απυ δφμ δζαδμπζημφξ ηφηθμοξ εηπφθζζδξ, απυ ημ υλζκμ ηαζ ημ αθηαθζηυ έδαθμξ, ιε ημοξ δζαθμνεηζημφξ ζοκδοαζιμφξ μνβακζημφ δζαθφηδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (CHLPhos, CHLCit, DCMPhos, DCMCit). H δζαηφιακζδ (error bars) αθμνά ηδκ ηοπζηή απυηθζζδ (standard deviation) ημο ιέζμο υνμο βζα ημκ πνχημ ηαζ ημ δεφηενμ ηφηθμ εηπφθζζδξ. Γζαθμνεηζηά βνάιιαηα οπμδδθχκμοκ ζηαηζζηζηά ζδιακηζηέξ δζαθμνέξ ιεηαλφ ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ, βζα ηάεε ηφπμ εδάθμοξ (ηεθαθαία βνάιιαηα βζα ημ υλζκμ έδαθμξ ηαζ ιζηνά βνάιιαηα βζα ημ αθηαθζηυ έδαθμξ). 153

154 Πηλάθαο 2.4. Ζ ζοβηέκηνςζδ ηςκ επζιένμοξ PLFAs (nanomoles g -1 ) πμο εηποθίζηδηακ φζηενα απυ δφμ δζαδμπζημφξ ηφηθμοξ εηπφθζζδξ, απυ υλζκμ ηαζ αθηαθζηυ έδαθμξ, ιε ημοξ δζαθμνεηζημφξ ζοκδοαζιμφξ μνβακζημφ δζαθφηδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ(chlphos, CHLCit, DCMPhos, DCMCit). Γζα ηάεε PLFAs ζε ηάεε έδαθμξ ηζιέξ πμο αημθμοεμφκηαζ απυ ημ ίδζμ βνάιια δεκ δζαθένμοκ ζδιακηζηά ζε επίπεδμ ζδιακηζηυηδηαξ 5%. Οζ ηζιέξ ζε πανέκεεζδ απμηεθμφκ ηδκ ηοπζηή απυηθζζδ ημο ιέζμο υνμο. Λζπανυ Ολφ Όλζκμ Έδαθμξ Αθηαθζηυ Έδαθμξ CHLPhos CHLCit DCMPhos DCMCit CHLPhos CHLCit DCMPhos DICCit 16: (0.70)a 5.89 (1.22)a 3.24 (0.47)b 3.06 (0.61)b 2.52 (0.43)ab 3.34 (0.49)a 1.60 (0.16)c 2.31 (0.27)bc 18: (0.08)b 1.13 (0.16)a 0.68 (0.11)b 0.61 (0.16)b 0.60 (0.19)a 0.66 (0.09)a 0.46 (0.04)a 0.55 (0.07)a 20: (0.02)b 0.26(0.05)a 0.13 (0.03)b 0.14 (0.06)b 0.07 (0.01)ab 0.10 (0.01)a 0.05 (0.02)b 0.05 (0.01)b 14: (0.13)ab 0.77(0.14)a 0.51 (0.16)ab 0.41 (0.08)b 0.35 (0.05)a 0.38 (0.04)a 0.30 (0.10)a 0.23 (0.09)a 15: (0.10)a 0.28 (0.08)a 0.16 (0.03)a 0.24 (0.10)a 0.14 (0.02)a 0.20 (0.09)a 0.14 (0.01)a 0.15 (0.03)a a15: (0.28)a 2.12 (0.47)a 1.58 (0.25)ab 1.08 (0.21)b 1.07 (0.11)ab 1.26 (0.28)a 0.80 (0.07)b 0.81 (0.18)b i15: (0.27)ab 1.71 (0.45)a 0.99 (0.21)bc 0.69 (0.22)c 1.19 (0.12)ab 1.39 (0.32)a 0.58 (0.10)c 0.77 (0.21)bc i16: (0.17)ab 1.23 (0.25)a 0.69 (0.10)bc 0.60 (0.11)c 0.51 (0.06)ab 0.72 (0.14)a 0.37 (0.06)b 0.53 (0.05)ab 17: (0.03)a 0.20 (0.05)a 0.20 (0.14)a 0.09 (0.02)a 0.08 (0.00)a 0.09 (0.02)a 0.05 (0.01)b 0.08 (0.01)a i17: (0.11)ab 0.95(0.34)ab 1.11 (0.10)a 0.59 (0.21)b 0.38 (0.12)b 0.41 (0.08)b 0.34 (0.19)b 0.79 (0.19)a 10Me16: (0.24)a 0.68 (0.16)a 0.75 (0.09)a 0.60 (0.15)a 0.63 (0.05)ab 0.79 (0.14)a 0.46 (0.005)b 0.50 (0.14)b 10Me17: (0.05)ab 0.39 (0.13)a 0.25 (0.05)ab 0.23 (0.06)b 0.37 (0.05)ab 0.53 (0.11)a 0.21 (0.04)b 0.33 (0.05)b 10Me18: (0.03)b 0.32 (0.06)a 0.17 (0.10)b 0.12 (0.03)b 0.19 (0.03)ab 0.23 (0.04)ab 0.14 (0.02)b 0.26 (0.08)a 16:1ς (0.34)ab 1.04 (0.29)a 0.67 (0.28)ab 0.43 (0.11)b 0.67 (0.08)ab 0.88 (0.18)a 0.55 (0.06)b 0.71 (0.10)ab cy17: (0.13)a 0.84 (0.19)a 0.61 (0.11)ab 0.47 (0.09)b 0.30 (0.04)ab 0.36 (0.06)a 0.20 (0.03)b 0.25 (0.04)b cy19: (0.18)ab 1.81 (0.40)a 1.44 (0.24)ab 1.16 (0.19)b 0.44 (0.08)bc 0.70 (0.14)a 0.29 (0.05)c 0.54 (0.10)ab 18:1ς9c 0.94 (0.24)a 0.95 (0.17)a 0.85 (0.10)a 0.67 (0.11)a 0.89 (0.21)a 0.91 (0.14)a 0.77 (0.16)a 0.92 (0.18)a 18:1ς9t 0.66 (0.31)a 0.65 (0.19)a 0.56 (0.12)a 0.31 (0.10)a 0.59 (0.14) a 0.69 (0.15)a 0.50 (0.17)a 0.56 (0.12)a 18:2ς6,9c 0.85 (0.44)a 0.75 (0.10)a 0.76 (0.14)a 0.57 (0.10)a 0.67 (0.17)ab 0.65 (0.11)b 0.85 (0.11)a 0.90 (0.08)a 22: (0.43)ab 0.70 (0.10)b 1.45 (0.23)a 1.43 (0.28)a 1.21 (0.13)b 1.15 (0.28)b 1.48 (0.31)a 1.59 (0.12)a 23: (0.05)a 0.17 (0.05)a 0.10 (0.03)a 0.11 (0.04)a 0.05 (0.02)ab 0.08 (0.03)a 0.02 (0.01)b 0.03 (0.01)b 24: (0.05)ab 0.28 (0.05)a 0.20 (0.10)ab 0.14 (0.07)b 0.06 (0.01)ab 0.11 (0.03)a 0.02 (0.01)b 0.02 (0.01)b φκμθμ (3.26) (3.90) 17.1 (1.99) (2.29) (1.50) (2.62) (0.95) (1.10) 154

155 Δπίδξαζε ησλ παξακέηξσλ εθρύιηζεο ζηελ ζύζηαζε ησλ PLFAs Απυ CVA ηςκ πεζναιαηζηχκ δεδμιέκςκ (ζπεηζηή αθεμκία επζιένμοξ PLFAs) πμο πνμέηορακ ιεηά ημκ πνχημ ηαζ ημ δεφηενμ ηφηθμ εηπφθζζδξ ζημ υλζκμ (π. 2.2α) ηαζ ζημ αθηαθζηυ έδαθμξ (π. 2.2α), δζαπζζηχεδηε λεηάεανμξ δζαπςνζζιυξ ηςκ δεζβιάηςκ ςξ πνμξ ημκ ηφηθμ εηπφθζζδξ (πνχημξ ή δεφηενμξ) ηαηά ημκ άλμκα CV1 (canonical variate 1). Σα δείβιαηα απυ ημκ 1 μ ηφηθμ εηπφθζζδξ δεκ δζαπςνίζηδηακ λεηάεανα ζφιθςκα ιε ημκ ζοκδοαζιυ μνβακζημφ δζαθφηδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ, ζημ υλζκμ έδαθμξ (π. 2.2α), εκχ έκαξ ζπεηζηά πενζμνζζιέκμξ, αθθά ςζηυζμ ζδιακηζηυξ δζαπςνζζιυξ ζφιθςκα ιε ημ δζαθφηδ πμο πνδζζιμπμζήεδηε, θαίκεηαζ κα οπάνπεζ ςξ πνμξ ηo CV1 ζημ αθηαθζηυ έδαθμξ (π. 2.2α). Ακηίεεηα, ηα δείβιαηα ημο 2 μο ηφηθμο εηπφθζζδξ, δζαπςνίζηδηακ ζφιθςκα ιε ημκ ζοκδοαζιυ μνβακζημφ δζαθφηδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ηαζ ςξ πνμξ ημοξ δφμ άλμκεξ (CV1 ηαζ CV2), ζημ υλζκμ έδαθμξ (π. 2.2α), ηαζ ιυκμ ςξ πνμξ ημκ άλμκα CV1 ζημ αθηαθζηυ έδαθμξ (π. 2.2α). Ζ απμηεθεζιαηζηυηδηα εηπφθζζδξ ηςκ επζιένμοξ PLFAs, ιε ηάεε έκακ απυ ημοξ ηέζζενζξ ζοκμθζηά ζοκδοαζιμφξ δζαθφηδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ, φζηενα απυ ημκ πνχημ ηφηθμ εηπφθζζδξ βζα ημ υλζκμ ηαζ ημ αθηαθζηυ έδαθμξ, πανμοζζάγεηαζ ακαθοηζηά ζημοξ Πίκαηεξ 2.5. ηαζ 2.6., ακηίζημζπα. Έηζζ, ακάθμβα ιε ηδκ ακηαπυηνζζή ημοξ ηα θζπανά μλέα ηαηαηάπεδηακ ζε ηέζζενεζξ δζαηνζηέξ μιάδεξ: (1) ζε αοηά πμο εηποθίζηδηακ ηονίςξ (> 70% ηδξ ζοκμθζηήξ ζοβηέκηνςζδξ) ηαηά ημκ πνχημ ηφηθμ εηπφθζζδξ (i-15:0, a15:0, i-16:0, 16:1ς7, 16:0, cy17:0, 10Me17:0, 18:1ς9t ηαζ cy19:0) (2) ζε αοηά πμο εηποθίζηδηακ ηονίςξ ηαηά ημκ πνχημ ηφηθμ εηπφθζζδξ ζε έκα απυ ηα δφμ εδάθδ (14:0, 15:0, 10Me16:0, i-17:0, 18:0, 10Me18:0, 20:0, 24:0), (3) ζε αοηά πμο εηποθίζηδηακ ζε ακαθμβία < 70% ηδξ ζοκμθζηήξ ημοξ ζοβηέκηνςζδξ ηαηά ημκ πνχημ ηφηθμ εηπφθζζδξ (17:0, 18:1ς9c, 23:0) ηαζ (4) ζηα 18:2ς6,9 ηαζ 22:0, βζα ηα μπμία πμζμζηυ > 40% ηδξ ζοκμθζηήξ ημοξ ζοβηέκηνςζδξ εηποθίζηδηε ηαηά ημ 2 μ ηφηθμ εηπφθζζδξ ηαζ ζηα δφμ εδάθδ. Ζ ηαηακμιή ηςκ δεζβιάηςκ εδάθμοξ ςξ πνμξ ηδκ ζφζηαζή ημοξ ζε PLFAs (ιε αάζδ ηδκ CVA) ιεηά απυ δφμ ηφηθμοξ εηπφθζζδξ (αενμζζηζηά), έδεζλε υηζ ηαζ ζηα δφμ εδάθδ μζ δζαθμνεηζημί ζοκδοαζιμί μνβακζημφ δζαθφηδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ, ζπδιάηζζακ ηέζζενζξ δζαηνζηέξ μιάδεξ. Έηζζ, ζημ υλζκμ έδαθμξ, ηα δείβιαηα πμο εηποθίζηδηακ ιε CHLCit ηαζ DCMPhos, δζαπςνίζηδηακ απυ αοηά πμο εηποθίζηδηακ ιε DCMCit ηαζ CHLPhos, ςξ πνμξ ημοξ CV1 ηαζ CV2, ακηίζημζπα (π. 155

156 2.3α). ημ αθηαθζηυ έδαθμξ, ηα δείβιαηα πμο εηποθίζηδηακ ιε DCM, δζαπςνίζηδηακ απυ αοηά πμο εηποθίζηδηακ ιε CHL ςξ πνμξ ημκ CV1 (π. 2.3α). Οζ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ επζιένμοξ PLFAs πμο πνμέηορακ (αενμζζηζηά) ιεηά απυ ηζξ δφμ δζαδμπζηέξ εηποθίζεζξ πνδζζιμπμζχκηαξ δζαθμνεηζημφξ ζοκδοαζιμφξ μνβακζημφ δζαθφηδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ, θαίκμκηαζ ζημκ Πζκάηα 2.4. Γζα ηα πενζζζυηενα PLFAs, μζ ορδθυηενεξ ζοβηεκηνχζεζξ παναηδνμφκηαζ ζηδκ πενίπηςζδ εηπφθζζδξ ιε CHL ηαζ ζηα δφμ εδάθδ. οβηεηνζιέκα, μ ζοκδοαζιυξ CHLCit πνμηάθεζε ηδκ εηπφθζζδ ζδιακηζηά ορδθυηενςκ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ θζπανχκ μλέςκ 16:0, 16:1ς7, i-16:0, a-15:0, i-15:0, cy17:0, cy19:0, ηαζ ζηα δφμ εδάθδ. Ακηίεεηα, ζδιακηζηά ορδθυηενεξ (p<0.05) ζοβηεκηνχζεζξ ημο 22:0 ηαζ ζηα δφμ εδάθδ ηαζ ημο 18:2ς6,9 ιυκμ ζημ αθηαθζηυ έδαθμξ, πνμέηορακ ιεηά απυ εηπφθζζδ ιε ιίβια πμο πενζείπε DCM (Πίκαηαξ 2.4). 156

157 (α) (β) ρήκα 2.2. Καηακμιή ηςκ δεζβιάηςκ εδάθμοξ ςξ πνμξ ηδκ ζφζηαζδ ημοξ ζε ιζηνμαζαηήξ πνμέθεοζδξ PLFAs (α) ζημ υλζκμ ηαζ (α) ζημ αθηαθζηυ έδαθμξ, υηακ ζακ πανάβμκηαξ απεζηυκζζδξ πνδζζιμπμζήεδηε μ ηφηθμξ εηπφθζζδξ (ιαφνα ζδιεία: 1 μξ ηφηθμξ εηπφθζζδξ, θεοηά ζδιεία: 2 μξ ηφηθμξ εηπφθζζδξ) βζα ημοξ δζάθμνμοξ ζοκδοαζιμφξ μνβακζημφ δζαθφηδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (CHLCit: ηεηνάβςκμ, CHLPhosh: ηνίβςκμ, DCMCit: νυιαμξ, DCMPhos: ηφηθμξ). Οζ ηφηθμζ βφνς απυ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ ακαθένμκηαζ ζε υνζα ειπζζημζφκδξ (confidence intervals) 95%. 157

158 Πηλάθαο 2.5. οβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs (nanomoles g -1 εδάθμοξ) πμο ηαοημπμζήεδηακ ζημ όμηλν έδαθνο, ιεηά ημκ πνχημ ηφηθμ εηπφθζζδξ δζάνηεζαξ 2 ςνχκ, ιε ημοξ δζαθμνεηζημφξ ζοκδοαζιμφξ μνβακζημφ δζαθφηδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (CHLPhos, CHLCit, DCMPhos, DCMCit). Γζα ηάεε PLFAs ηζιέξ πμο αημθμοεμφκηαζ απυ ημ ίδζμ βνάιια δεκ δζαθένμοκ ζδιακηζηά ζε επίπεδμ ζδιακηζηυηδηαξ 5%. ε πανέκεεζδ πανμοζζάγεηαζ δ ηοπζηή απυηθζζδ ημο ιέζμο υνμο. Λζπανυ Ολφ οβηέκηνςζδ PLFA (1 δ Δηπφθζζδ) % ηδξ οκμθζηήξ οβηέκηνςζδξ ηςκ PLFAs CHLPhos CHLCit DCMPhos DCMCit CHLPhos CHLCit DCMPhos DCMCit Μέζμξ Όνμξ 16: (0.67)a 4.91 (1.10)a 2.70 (0.44)b 2.17 (0.60)b (6.9) 18: (0.06)ab 0.86 (0.18)a 0.47 (0.09)bc 0.39 (0.15)c (6.9) 20: (0.02)ab 0.16 (0.02)a 0.10 (0.02)b 0.09 (0.04)b (8.7) 14: (0.11)a 0.54 (0.13)a 0.37(0.10)ab 0.27 (0.09)b (7.3) 15: (0.10)a 0.21 (0.06)a 0.12 (0.03)a 0.14 (0.04)a (9.7) a15: (0.26)a 1.68 (0.39)a 1.30 (0.21)ab 0.79 (0.21)b (5.9) i15: (0.26)ab 1.53 (0.42)a 0.84 (0.18)bc 0.54 (0.22)c (5.8) i16: (0.17)ab 1.01 (0.28)a 0.57 (0.10)bc 0.42 (0.12)c (7.8) 17: (0.03)a 0.15 (0.04)a 0.14 (0.13)a 0.05 (0.02)a (9.5) i17: (0.11)a 0.49 (0.30)a 0.62 (0.07)a 0.48 (0.21)a (19.4) 10Me16: (0.23)a 0.51 (0.14)a 0.62 (0.10)a 0.43 (0.12)a (5.2) 10Me17: (0.05)ab 0.32 (0.09)a 0.21 (0.04)ab 0.16 (0.06)b (6.7) 10Me18: (0.03)a 0.17 (0.05)a 0.13 (0.10)a 0.08 (0.03)a (11.7) 16:1ς (0.30)a 0.80 (0.21)a 0.58 (0.25)ab 0.27 (0.09)b (11.2) cy17: (0.12)a 0.72 (0.18)a 0.54 (0.09)ab 0.35 (0.10)b (6.9) cy19: (0.20)a 1.59 (0.36)a 1.28 (0.22)ab 0.89 (0.19)b (6.2) 18:1ς9c 0.77 (0.24)a 0.66 (0.16)ab 0.51 (0.08)ab 0.41 (0.10)b (10.1) 18:1ς9t 0.59 (0.26)a 0.46 (0.13)ab 0.37 (0.10)ab 0.22 (0.09)b (10.3) 18:2ς6,9c 0.47 (0.11)a 0.41 (0.09)ab 0.41(0.03)ab 0.28 (0.08)b (2.8) 22: (0.29)a 0.37 (0.12)b 0.63 (0.16)ab 0.84 (0.11)a (6.9) 23: (0.03)a 0.10 (0.02)a 0.07 (0.06)a 0.09 (0.03)a (10.2) 24: (0.03)ab 0.19 (0.06)a 0.09 (0.02)b 0.10 (0.06)ab (12.0) φκμθμ 17.19(2.88) (3.90) (1.81) 9.46 (2.22) 158

159 Πηλάθαο 2.6. οβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs (nanomoles g -1 εδάθμοξ) πμο ηαοημπμζήεδηακ ζημ αιθαιηθό έδαθνο, ιεηά ημκ πνχημ ηφηθμ εηπφθζζδξ δζάνηεζαξ 2 ςνχκ, ιε ημοξ δζαθμνεηζημφξ ζοκδοαζιμφξ μνβακζημφ δζαθφηδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (CHLPhos, CHLCit, DCMPhos, DCMCit). Γζα ηάεε PLFAs ηζιέξ πμο αημθμοεμφκηαζ απυ ημ ίδζμ βνάιια δεκ δζαθένμοκ ζδιακηζηά ζε επίπεδμ ζδιακηζηυηδηαξ 5%. ε πανέκεεζδ πανμοζζάγεηαζ δ ηοπζηή απυηθζζδ ημο ιέζμο υνμο. Λζπανυ Ολφ οβηέκηνςζδ PLFA (1 δ Δηπφθζζδ) % ηδξ οκμθζηήξ οβηέκηνςζδξ ηςκ PLFAs CHLPhos CHLCit DCMPhos DCMCit CHLPhos CHLCit DCMPhos DCMCit Μέζμξ Όνμξ 16: (0.42)a 2.28 (0.28)a 1.21 (0.16)b 1.69 (0.24)ab (3.8) 18: (0.18)a 0.41 (0.06)a 0.29 (0.06)a 0.35 (0.06)a (2.8) 20: (0.01)ab 0.07 (0.01)a 0.03 (0.01)b 0.03 (0.02)ab (5.6) 14: (0.05)a 0.23 (0.05)a 0.19 (0.08)a 0.17 (0.08)a (6.4) 15: (0.02)a 0.11 (0.04)a 0.08 (0.02)a 0.08 (0.00)a (4.8) a15: (0.11)a 0.88 (0.15)a 0.67 (0.04)a 0.60 (0.24)a (8.0) i15: (0.11)a 1.04 (0.2)a 0.50 (0.10)b 0.65 (0.21)ab (5.2) i16: (0.05)ab 0.50 (0.08)a 0.26 (0.04)b 0.39 (0.03)ab (2.5) 17: (0.01)ab 0.06 (0.01)a 0.03 (0.01)b 0.05 (0.01)ab (6.6) i17: (0.05)a 0.29 (0.06)a 0.24 (0.15)a 0.42 (0.03)a (8.8) 10Me16: (0.05)ab 0.51 (0.07)a 0.34 (0.04)ab 0.30 (0.12)b (6.1) 10Me17: (0.06)ab 0.38 (0.07)a 0.18 (0.05)b 0.26 (0.03)ab (5.9) 10Me18: (0.01)a 0.17 (0.03)a 0.11 (0.02)a 0.17 (0.03)a (6.3) 16:1ς (0.08)a 0.62 (0.12)a 0.46 (0.05)a 0.55 (0.09)a (5.5) cy17: (0.03)ab 0.26 (0.04)a 0.14 (0.02)c 0.19 (0.03)bc (3.2) cy19: (0.08)ab 0.45 (0.09)a 0.23 (0.02)b 0.37 (0.07)ab (6.4) 18:1ς9c 0.63 (0.18)a 0.61 (0.08)a 0.51 (0.18)a 0.60 (0.06)a (2.4) 18:1ς9t 0.45 (0.05)a 0.49 (0.12)a 0.39 (0.18)a 0.39 (0.05)a (4.0) 18:2ς6,9c 0.40 (0.17)a 0.41 (0.06)a 0.44 (0.12)a 0.46 (0.01)a (5.9) 22: (0.11)a 0.56 (0.19)a 0.78 (0.19)a 0.82 (0.20)a (2.6) 23: (0.02)ab 0.06 (0.03)a 0.01 (0.01)b 0.01 (0.01)b (21.4) 24: (0.01)ab 0.06 (0.03)a 0.02 (0.01)b 0.02 (0.01)ab (17.5) φκμθμ 9.43 (1.39) (1.52) 7.11 (0.87) 8.57 (0.76) 159

160 (α) (β). ρήκα 2.3. Καηακμιή ηςκ δεζβιάηςκ (α) υλζκμο ηαζ (α) αθηαθζημφ εδάθμοξ ςξ πνμξ ηδκ ζφζηαζδ ημοξ ζε ιζηνμαζαηήξ πνμέθεοζδξ PLFAs, ζφιθςκα ιε ακάθοζδ Κακμκζηχκ Μεηααθδηχκ (Canonical Variates) υηακ πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ δεδμιέκα μζ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ επζιένμοξ PLFAs πμο πνμέηορακ αενμζζηζηά απυ ηζξ δφμ δζαδμπζηέξ εηποθίζεζξ. Οζ δζάθμνμζ ζοκδοαζιμί μνβακζημφ δζαθφηδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ απεζημκίγμκηαζ ςξ ελήξ: CHLCit: ιαφνμ ηεηνάβςκμ, CHLPhosh: ιαφνμ ηνίβςκμ, DCMCit: άζπνμ ηεηναβςκμ, DCMPhos: άζπνμ ηνίβςκμ. Οζ ηφηθμζ βφνς απυ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ αθμνμφκ ζε υνζα ειπζζημζφκδξ (confidence intervals) 95%. 160

161 2.4.2 Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηε κηθξνβηαθή θνηλόηεηα ηνπ εδάθνπο Σμ ζηεφαζια BIOACT πνμηάθεζε ζδιακηζηή αφλδζδ (p < 0.001) ζηδκ ζοκμθζηή ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs ζε ζπέζδ ιε ηζξ άθθεξ ιεηαπεζνίζεζξ ηαζ ημκ ιάνηονα ακαθμνάξ. Ζ επίδναζδ αοηή ήηακ ζηαεενή ζε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ (πήια 2.4α). Ακηίεεηα, ηα οπυθμζπα βεςνβζηά θάνιαηα (oxamyl, fluensulfone, QL Agri ) δεκ επδνέαζακ ζδιακηζηά ηδκ ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs. Σα απμηεθέζιαηα απυ ηδκ ακάθοζδ Κφνζςκ οκζζηςζχκ (PCA) ζηα δεδμιέκα ηδξ ζπεηζηήξ αθεμκίαξ ηςκ επζιένμοξ PLFAs πμο ακζπκεφηδηακ, επζαεααίςζακ ηδκ ηονίανπδ επίδναζδ ημο BIOACT ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Ακελάνηδηα απυ ημ πνυκμ δεζβιαημθδρίαξ, ηα εδαθζηά δείβιαηα πμο επζαανφκεδηακ ιε ημ BIOACT μιαδμπμζήεδηακ ηαζ δζαπςνίζηδηακ λεηάεανα απυ ηα οπυθμζπα δείβιαηα πμο επζαανφκεδηακ ιε ηα άθθα β.θ., αθθά ηαζ απυ ημκ ιάνηονα ακαθμνάξ ςξ πνμξ ηδκ πνχηδ ηφνζα ζοκζζηχζα (PC1) (πήια 2.4α). φιθςκα ιε ηδκ απεζηυκζζδ (πήια 2.4β) ηδξ ζοιιεημπήξ ηςκ ιζηνμαζαηχκ PLFAs πμο ακζπκεφηδηακ ζηα εδαθζηά δείβιαηα, ηα θζπανά μλέα 18:1ς9c, 18:1ς9t ηαζ 18:2ς6,9 μιαδμπμζήεδηακ ιαγί ζηδκ ανκδηζηή πθεονά (ανζζηενά πάκς ηαζ ηάης ηεηανηδιυνζμ) ηδξ πνχηδξ ηφνζαξ ζοκζζηχζαξ (PC1), θακενχκμκηαξ ηδ ζδιακηζηή ηαζ ιυκζιδ αφλδζδ (p < 0.05) ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ημοξ ζε εδάθδ πμο δέπηδηακ επειαάζεζξ ιε BIOACT. 161

162 ρήκα 2.4α. οκμθζηή ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs (nanomoles g -1 εδάθμοξ) ζε δείβιαηα εδάθμοξ πμο δέπηδηακ επειαάζεζξ ιε ηα δζαθμνεηζηά βεςνβζηά θάνιαηα ηαζ ζε δείβιαηα ημο ιάνηονα ακαθμνάξ. Κάεε ηζιή ακηζπνμζςπεφεζ ημ ιέζμ υνμ ηςκ ηνζχκ επακαθήρεςκ βζα ηάεε ιεηαπείνζζδ. H δζαηφιακζδ (error bars) αθμνά ηδκ ηοπζηή απυηθζζδ ημο ιέζμο υνμο. Γζαθμνεηζηά βνάιιαηα οπμδδθχκμοκ ζηαηζζηζηά ζδιακηζηέξ δζαθμνέξ ιεηαλφ ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ ζημκ ίδζμ πνυκμ. 162

163 ρήκα 2.4β. Καηακμιή ηςκ δεζβιάηςκ εδάθμοξ ςξ πνμξ ηδ ζφζηαζδ ημοξ ζε ιζηνμαζαηά PLFAs υηακ ςξ πανάβμκηαξ απεζηυκζζδξ πνδζζιμπμζήεδηε ημ είδμξ ημο βεςνβζημφ θανιάημο πμο εθανιυζηδηε. Ζ ακάθοζδ έβζκε ιε ηδ ιέεμδμ ηςκ Κφνζςκ οκζζηςζχκ ηαζ μζ δφμ άλμκεξ πενζβνάθμοκ ημ 43.8 % (PC1) ηαζ ημ 13.2% (PC2) ηδξ παναθθαηηζηυηδηαξ. 163

164 ρήκα 2.4γ. Απεζηυκζζδ ηδξ ζοιιεημπήξ (loading scores) ηςκ επζιένμοξ ιζηνμαζαηχκ PLFAs ζηδκ ηαηακμιή ηςκ δεζβιάηςκ εδάθμοξ πμο δέπηδηακ εθανιμβή ιε ηα δζάθμνα β.θ

165 2.5. πδήηεζε Βειηηζηνπνίεζε ηεο κεζόδνπ ησλ PLFAs Δπίδξαζε ησλ παξακέηξσλ εθρύιηζεο ζηε ζπλνιηθή ζπγθέληξσζε ησλ PLFAs Κφνζμξ ζηυπμξ ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ ήηακ δ εηηίιδζδ ηδξ επίδναζδξ ζοβηεηνζιέκςκ παναιέηνςκ εηπφθζζδξ ζηδκ απμηεθεζιαηζηυηδηα ηδξ ακάθοζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ, ιε απχηενμ ζημπυ ηδκ ακάπηολδ εκυξ αεθηζζημπμζδιέκμο πνςημηυθθμο βζα ηδκ εηπφθζζδ ηαζ ακάθοζδ ηςκ PLFAs απυ ηα εδαθζηά δείβιαηα. Σμ πνχημ ζηάδζμ αεθηζζημπμίδζδξ αθμνμφζε ζημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ ιειμκςιέκςκ επζδνάζεςκ ημο δζαθφηδ ηαζ ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ πμο πενζέπμκηαζ ζημ ιίβια εηπφθζζδξ, αθθά ηαζ ημο ζοκδοαζιμφ ημοξ, ζηδκ ζοκμθζηή ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs πμο παναθαιαάκμκηαζ απυ ηα εδαθζηά δείβιαηα. φιθςκα ιε πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ, δ πνήζδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ηζηνζηχκ (Cit) ζημ ιίβια εηπφθζζδξ πνμηάθεζε αφλδζδ ζηζξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ PLFAs πμο ακζπκεφηδηακ ζε 8 υλζκα εδάθδ, ζοβηνζηζηά ιε ημ νοειζζηζηυ δζάθοια ηςκ θςζθμνζηχκ (Phos) (Nielsen and Petersen, 2000). Οιμίςξ, μζ Frostegard et al., (1991), παναηήνδζακ υηζ δ πνήζδ Phos, μδήβδζε ζε εηπφθζζδ ζηαεενά παιδθυηενςκ ζοβηεκηνχζεςκ PLFAs ζοβηνζηζηά ιε ημ Cit, ζηδκ πενίπηςζδ ιεθέηδξ εκυξ μνβακζημφ υλζκμο εδάθμοξ (ph 4.1, 79% μνβακζηή μοζία). Χζηυζμ, ηα δομ νοειζζηζηά δζαθφιαηα είπακ ακάθμβεξ απμδυζεζξ ζηδκ εηπφθζζδ ηςκ PLFAs ζηδκ πενίπηςζδ εκυξ άιιμ-πδθχδμοξ αθηαθζημφ εδάθμοξ (ph 7.8, 4.7 % μνβακζηή μοζία). φιθςκα ιε ηα απμηεθέζιαηα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ, δ πνήζδ Cit επίζδξ μδήβδζε ζε ζδιακηζηή αφλδζδ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ PLFAs ζημ υλζκμ έδαθμξ πμο ιεθεηήεδηε. Χζηυζμ, ζδιακηζηή οπενμπή ημο Cit έκακηζ ημο Phos παναηδνήεδηε ηαζ ζηδκ πενίπηςζδ ημο αθηαθζημφ εδάθμοξ. Σμ απμηέθεζια αοηυ ιπμνεί κα απμδμεεί ζηδκ πνμηεζιέκδ πενίπηςζδ ζηδκ αανφηενδ ζφζηαζδ ημο αθηαθζημφ εδάθμοξ [πδθχδεξ έκακηζ άιιμ-πδθχδμοξ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ Frostegard et al., (1991)]. Δπζπθέμκ, απυ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ πνμηφπηεζ μηζ δ ορδθυηενδ απμηεθεζιαηζηυηδηα ακάηηδζδξ PLFAs απυ ημ Cit δεκ ελανηάηαζ απυ ηδκ μλφηδηα ημο εδάθμοξ. Ζ παναηήνδζδ αοηή ανίζηεηαζ ζε άιεζδ ζοιθςκία ιε ημοξ Frostegard et al., (1991), πμο ηαηέθδλακ υηζ δ ορδθυηενδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs πμο παναθαιαάκμκηαζ φζηενα απυ εηπφθζζδ ιε ημ Cit δεκ ιπμνεί κα απμδμεεί απμηθεζζηζηά ζηζξ δζαθμνεηζηέξ ηζιέξ ph ιεηαλφ ηςκ 165

166 Cit ηαζ Phos, αθμφ ηαζ ημ νοειζζηζηυ δζάθοια ηςκ μλζηχκ (ph 4.0) πμο επίζδξ ιεθέηδζακ δεκ είπε ακάθμβδ απμηεθεζιαηζηυηδηα ιε ημ Cit. Πανάθθδθα ιεθεηήεδηε δ επίδναζδ ημο είδμοξ ημο μνβακζημφ δζαθφηδ (CHLή DCM) πμο πνδζζιμπμζείηαζ ζημ ιίβια εηπφθζζδξ ζηδκ ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs πμο παναθαιαάκμκηαζ. Απυ ηα απμηεθέζιαηα θαίκεηαζ υηζ δ πνήζδ CHL ακηί βζα DCM μδδβεί ζε ζδιακηζηή αφλδζδ ηςκ ζοκμθζηχκ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ PLFAs ηαζ ζηα δφμ εδάθδ. Σμ βεβμκυξ αοηυ ιπμνεί κα μθείθεηαζ ζε ιζηνέξ δζαθμνέξ πμο οπάνπμοκ ακάιεζα ζημοξ δφμ δζαθφηεξ ςξ πνμξ ηδκ πμθζηυηδηα. Ζ ορδθυηενδ πμθζηυηδηα ημο CHL (δείηηδξ πμθζηυηδηαξ 4.4) ζοβηνζηζηά ιε αοηή ημο DCM (δείηηδξ πμθζηυηδηαξ 3.4) (Snyder, 1974), ιάθθμκ εοκυδζε ηδκ εηπφθζζδ ηςκ PLFAs. Δπζπθέμκ, ζφιθςκα ιε ηδκ ηαλζκυιδζδ ηςκ δζαθοηχκ, ημ CHL ηαζ ημ DCM ηαηαηάζζμκηαζ ζε δζαθμνεηζηέξ μιάδεξ εηθεηηζηυηδηαξ (μιάδα VIII ηαζ VI, ακηίζημζπα) (Snyder, 1974). Ζ δζαθμνμπμίδζδ ημοξ αοηή, οπμβναιιίγεζ ηδ δζαθμνεηζηή πδιζηή θεζημονβζηυηδηα ημο ηάεε δζαθφηδ ζηδκ μπμία ιπμνεί κα μθείθμκηαζ μζ δζαθμνεηζηέξ δνάζεζξ πμο επζδεζηκφμοκ ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ. Λαιαάκμκηαξ οπυρδ ηδκ επίδναζδ ημο ζοκδοαζιμφ μνβακζημφ δζαθφηδ ηαζ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ, δ ζοκδοαζιέκδ πνήζδ CHLCit, ιεβζζημπμίδζε ηζξ πμζυηδηεξ ηςκ PLFAs πμο εηποθίζηδηακ ηαζ απυ ηα δφμ εδάθδ. Ζ παναηήνδζδ αοηή ανίζηεηαζ ζε ζοιθςκία ιε πνμδβμφιεκα εονήιαηα ηςκ Nielsen and Petersen, (2000) ζε μηηχ υλζκα εδάθδ. Χζηυζμ, ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ μ παναπάκς ζοκδοαζιυξ θαίκεηαζ κα είκαζ μ αέθηζζημξ ηαζ ζηδκ πενίπηςζδ αθηαθζηχκ εδαθχκ. Μζα αηυιδ πανάιεηνμξ πμο ελεηάζεδηε, ήηακ δ επίδναζδ δφμ ζοκεπυιεκςκ ηφηθςκ εηπφθζζδξ (1 μξ έκακηζ 2 μο ), δζάνηεζαξ δφμ ςνχκ ακά ηφηθμ, ζηδκ απμηεθεζιαηζηυηδηα εηπφθζζδξ ηςκ PLFAs. Απυ ηα απμηεθέζιαηα πνμηφπηεζ υηζ ηαζ βζα ηα δφμ εδάθδ, απαναίηδηεξ βζα ηδκ παναθααή ηςκ ιέβζζηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ PLFAs ήηακ μζ δφμ ζοκεπυιεκεξ εηποθίζεζξ, αθμφ πμζμζηυ πενίπμο 27% ηαζ 31% ηδξ ζοκμθζηήξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ PLFAs εηποθίζηδηε ηαηά ηδ δεφηενδ δίςνδ εηπφθζζδ ζημ υλζκμ ηαζ ημ αθηαθζηυ έδαθμξ, ακηίζημζπα (Πίκαηεξ 2.5 ηαζ 2.6). Σμ βεβμκυξ αοηυ ιπμνεί κα απμδμεεί ζηδ ζπεηζηά παιδθή ακαθμβία δζαθφηδ - εδάθμοξ (3.8) πμο πνδζζιμπμζήεδηε ηαηά ηδκ πνχηδ εηπφθζζδ. Οζ White et al., (1979), παναηήνδζακ πςξ δ αέθηζζηδ εηπφθζζδ ηςκ PLFAs απυ ζγήιαηα (sediments) επζηοβπάκεηαζ ιε ακαθμβία δζαθφηδ - εδάθμοξ 5.7. Ζ παναηήνδζδ αοηή ανίζηεηαζ ζε ζοιθςκία ιε ηα εονήιαηα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ ηαεχξ ηαηά ηδ δεφηενδ εηπφθζζδ ηςκ εδαθζηχκ δεζβιάηςκ, υπμο δ ακαθμβία δζαθφηδ εδάθμοξ αολήεδηε ζηδκ ηζιή 166

167 5.7, εηποθίζηδηακ ζδιακηζηέξ πμζυηδηεξ PLFAs απυ ημ έδαθμξ. Οζ Wu et al., (2009), έδεζλακ υηζ ημ ιέβζζημ (90-95%) ηςκ PLFAs απυ δφμ υλζκα εδάθδ παναθήθεδηε ιεηά απυ δφμ ζοκεπυιεκεξ δίςνεξ εηποθίζεζξ. ηδκ ίδζα ιεθέηδ, αφλδζδ ηδξ πμζυηδηαξ ημο εδάθμοξ (1-8 g) πςνίξ πανάθθδθδ αφλδζδ ημο υβημο ημο δζαθφηδ εηπφθζζδξ δεκ πνμηάθεζε ακάθμβδ αφλδζδ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ PLFAs. ε ακηίεεζδ, μζ Frostegard et al., (1991), παναηήνδζακ υηζ ιζα ιυκμ δίςνδ εηπφθζζδ είκαζ ανηεηή βζα ηδκ παναθααή ηδξ πθεζμρδθίαξ ηςκ PLFAs απυ ημ έδαθμξ, υηακ δ ακαθμβία δζαθφηδ - εδάθμοξ ήηακ ημοθάπζζημκ Δπίδξαζε ησλ παξακέηξσλ εθρύιηζεο ζηελ ζύζηαζε ησλ PLFAs Απυ ηδκ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ δεδμιέκςκ ηδξ ζπεηζηήξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ PLFAs ηαηά ημκ 1 μ ηαζ ημ 2 μ ηφηθμ εηπφθζζδξ, πνμέηορε υηζ δ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs δζέθενε ζδιακηζηά ιεηαλφ ηςκ δφμ ηφηθςκ εηπφθζζδξ ηαζ ζηα δφμ εδάθδ. Ζ επζθμβή ημο ιίβιαημξ εηπφθζζδξ (δζαθφηδξ ηαζ νοειζζηζηυ δζάθοια) δεκ επδνέαζε ζδζαίηενα ηδ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs πμο ακζπκεφηδηακ ιεηά ημκ πνχημ ηφηθμ εηπφθζζδξ ηαζ ζηα δφμ εδάθδ. Ακηίεεηα, είπε ζδιακηζηή επίδναζδ ζηδκ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs πμο πνμέηορακ απυ ημ 2 μ ηφηθμ εηπφθζζδξ. Ζ επίδναζδ αοηή ακηζηαημπηνίγεηαζ ζημ ζφκμθμ ηςκ PLFAs (άενμζζια ηςκ δφμ επζιένμοξ εηποθίζεςκ), υπμο ηαζ ζηα δφμ εδάθδ δ επζθμβή ημο ιίβιαημξ εηπφθζζδξ ήηακ ηαεμνζζηζηή βζα ηδκ ηεθζηή εζηυκα ηδξ ζφζηαζδξ ηςκ PLFAs (πήια 2.3). Όζμκ αθμνά ζηδκ εηπφθζζδ ηςκ ιειμκςιέκςκ PLFAs, ηα πενζζζυηενα απυ αοηά πνμέηορακ ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο 1 μο ηφηθμο εηπφθζζδξ, εκχ ζπεδυκ ημ 45% (ή ηαζ ιεβαθφηενμ αηυια πμζμζηυ) ηςκ 18:2ς6,9 (δείηηδξ ιοηήηςκ) ηαζ 22:0 (δείηηδξ εοηανοςηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ) παναθήθεδηε ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο 2 μο ηφηθμο εηπφθζζδξ. Ζ πθεζμρδθία ηςκ PLFAs πμο ηαοημπμζήεδηακ εοκμήεδηε απυ ηδκ πανμοζία CHL ζημ ιίβια εηπφθζζδξ εκχ ημ 22:0 ηαζ ζε ιζηνυηενμ ααειυ ημ 18:2ς6,9 θαίκεηαζ κα εοκμμφκηαζ απυ ημ DCM. Σέθμξ, δ επίδναζδ ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ζηδ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs δεκ ήηακ λεηάεανδ Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηε κηθξνβηαθή θνηλόηεηα ηνπ εδάθνπο Όπςξ πνμέηορε απυ ηδκ ακάθοζδ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ, δ πνμζεήηδ ηςκ ζοκεεηζηχκ κδιαηςδμηηυκςκ oxamyl ηαζ fluensulfone ηαεχξ ηαζ ημο αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ.. QLAgri δεκ πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ 167

168 δμιή ηαζ ζημ ιέβεεμξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ, υπςξ πνμζδζμνίζηδηακ ιε ηδκ αεθηζζημπμζδιέκδ ιέεμδμ εηπφθζζδξ PLFAs (πήια 2.4α). Μέπνζ ζήιενα, δεκ οπάνπμοκ ζηδ αζαθζμβναθία ιεθέηεξ πμο κα έπμοκ ενεοκήζεζ ηδκ ημλζηυηδηα ηςκ ζοκεεηζηχκ κδιαηςδμηηυκςκ oxamyl ηαζ fluensulfone ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. Χζηυζμ, ηα απμηεθέζιαηά ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ ανίζημκηαζ ζε άιεζδ ζοιθςκία ιε πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ ενεοκδηχκ πμο ηαηαθήβμοκ ζημ ζοιπέναζια υηζ υηακ ηα ζοκεεηζηά β.θ. εθανιυγμκηαζ ζηδ ζοκζζηχιεκδ δυζδ δεκ θαίκεηαζ κα επδνεάγμοκ ανκδηζηά ηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ (Seghers et al., 2003, Βending et al., 2007). Δπζπθέμκ, ηα απμηεθέζιαηα πμο αθμνμφκ ζηδκ επίδναζδ ημο αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ κδιαηςδμηηυκμο QLAgri, είκαζ ακάθμβα ιε αοηά πμο δδιμζζεφηδηακ πνυζθαηα απυ ημοξ Spyrou et al., (2009). ε ακηίεεζδ ιε ηα οπυθμζπα β.θ., ημ BIOACT πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ηαζ έιιμκεξ επζδνάζεζξ ζηδ ζοκμθζηή ζοβηέκηνςζδ ηςκ PLFAs πμο ακζπκεφηδηακ. οβηεηνζιέκα, παναηδνήεδηε ζδιακηζηή αφλδζδ ηδξ ζπεηζηήξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ 18:1ς9cis/trans ηαζ 18:2ς6,9, πμο ζφιθςκα ιε ηδ αζαθζμβναθία απμηεθμφκ δείηηεξ ανκδηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ ηαζ ιοηήηςκ. Οζ ζοβηεηνζιέκεξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ ακαπηφζζμκηαζ ηαπέςξ ηαζ ηονζανπμφκ ζημ εδαθζηυ πενζαάθθμκ ζηδκ πενίπηςζδ πανμοζίαξ εφημθα δζαεέζζιςκ πδβχκ άκεναηα ηαζ ενεπηζηχκ ζημζπείςκ υπςξ είκαζ δ βθοηυγδ ηαζ μ μνυξ απμαμοηονςιέκμο βάθαηημξ πμο πενζέπμκηαζ ζημ ειπμνζηυ ζηεφαζια ημο BIOACT ζε ακαθμβίεξ 78% ηαζ 6%, ακηίζημζπα (Anastasiadis et al., 2008). Σα απμηεθέζιαηα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ ανίζημκηαζ ζε ζοιθςκία ιε αοηά πνμδβμφιεκςκ ιεθεηχκ ζηζξ μπμίεξ επίζδξ παναηδνήεδηε ζδιακηζηή αφλδζδ ηςκ πθδεοζιχκ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ μιάδςκ ιζηνμμνβακζζιχκ φζηενα απυ ειπθμοηζζιυ ιε αζμιάγα θυβς εκζςιάηςζδξ ζημ έδαθμξ β.θ. αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ ιε ηαηαζηαθηζηή βζα ημοξ κδιαηχδεζξ δνάζδ, υπςξ δ ζηυκδ απυ ηανπμφξ ημο θοημφ Melia azedarach (Spyrou et al., 2009) ή ηειαπζζιέκμ θοηζηυ οθζηυ απυ θοηά Brassica (Omirou et al., 2011). Θα πνέπεζ κα ημκζζηεί υηζ ηα θζπανά μλέα 18:1ς9cis/trans ηαζ 18:2ς6,9 (πμο εκζζπφεδηακ ζηα εδάθδ πμο δέπηδηακ εθανιμβή BIOACT ) ιαγί ιε ημ 16:0 απμηεθμφκ ηα ηφνζα ζοζηαηζηά ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ ημο ιφηδηα P. lilacinus (Stahl and Klug, 1996). οκεπχξ, δεκ ιπμνεί κα απμηθεζζηεί ημ εκδεπυιεκμ δ αφλδζδ ζηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ θζπανχκ μλέςκ κα μθείθεηαζ ζηδκ πνμζεήηδ ημο PL 251 ιέζς ημο BIOACT. Όιςξ ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ, δ επέιααζδ ιε BIOACT δεκ πνμηάθεζε ακάθμβδ αφλδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο 16:0, πμο 168

169 απμηεθεί ημ 31% ημο ζοκυθμο ηςκ PLFAs ημο P. lilacinus. Πανάθθδθα ζε ακάθμβμ πείναια ζημ ίδζμ έδαθμξ μζ Rousidou et al., (2013) παναηήνδζακ ιε ηδκ πνήζδ qpcr ιζα πνμκμελανηχιεκδ ιείςζδ ηςκ πθδεοζιχκ ημο P. lilacinus ζημ έδαθμξ. Ζ παναηήνδζδ αοηή ανίζηεηαζ ζε ακηίεεζδ ιε ηδ ζηαεενά ορδθυηενδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ θζπανχκ μλέςκ 18:1ς9cis/trans ηαζ 18:2ς6,9, ζε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ ζηα δείβιαηα πμο είπακ δεπηεί ηδκ εθανιμβή ημο BIOACT. οκεπχξ, απυ ημ ζφκμθμ ηςκ παναπάκς δεδμιέκςκ πνμηφπηεζ υηζ δ ιεηααμθή ζηδκ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ πμο πνμέηορε απυ ηδκ εθανιμβή ημο BIOACT μθείθεηαζ πζεακυηαηα ζηδκ εκενβμπμίδζδ ζοβηεηνζιέκςκ μιάδςκ ιζηνμμνβακζζιχκ πμο ακαπηφπεδηακ ηαπφηαηα επί ηςκ θμζπχκ ζοζηαηζηχκ ημο ζηεοάζιαημξ (βθοηυγδ ηαζ μνυξ απμαμοηονςιέκμο βάθαηημξ) BIOACT. Δπζπθέμκ, απυ ηδ ιεθέηδ ηςκ Rousidou et al., (2013), ανέεδηε υηζ ημ ζηεφαζια BIOACT πνμηαθεί ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ δμιή ηςκ ημζκμηήηςκ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ (ΑΟΜ) (TRFLP) ηαζ πανμδζηή ςζηυζμ ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ αθεμκίαξ ημοξ (qpcr) (ζδιακηζηή ιείςζδ ηαηά ηζξ πνχηεξ 20 διένεξ ηαζ ζηαδζαηή αφλδζδ ιέπνζ ηζξ 90 διένεξ, ηεθζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ > ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ημο ιάνηονα). Οζ ζοββναθείξ ηαηέθδλακ ζηδκ οπυεεζδ υηζ ηα επζιένμοξ ζοζηαηζηά ημο ζηεοάζιαημξ BIOACT, βθοηυγδ (78%) ηαζ απμαμοηονςιέκμξ μνυξ βάθαηημξ (6%) εοκμμφκ πζεακχξ ηδκ ακάπηολδ ηςκ ηαπέςξ ακαπηοζζυιεκςκ πθδεοζιχκ ααηηδνίςκ ηαζ ιοηήηςκ ζε αάνμξ ηςκ αναδέςξ ακαπηοζζυιεκςκ ΑΟΜ. Ζ άπμρδ αοηή εκζζπφεηαζ απυ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ πανμφζαξ ακάθοζδξ ηςκ PLFAs, αθθά ηαζ απυ ζοιπθδνςιαηζηά πεζνάιαηα ηςκ εκ θυβς ενεοκδηχκ ζηα μπμία ανέεδηε υηζ δ πνμζεήηδ ημο ζηεοάζιαημξ BIOACT ζε εδαθζηά δείβιαηα, υπςξ ακηίζημζπα ηαζ δ πνμζεήηδ ζοκδοαζιμφ βθοηυγδξ ηαζ απμαμοηονςιέκμο μνμφ βάθαηημξ μδήβδζακ ζε πανμδζηή ιείςζδ ηδξ αθεμκίαξ ηςκ ΑΟΜ ιε ακάθμβδ πανμδζηή ιείςζδ ημο νοειμφ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ. Ακηίεεηα, ακηίζημζπδ επίδναζδ δεκ παναηδνήεδηε υηακ ζηα εδαθζηά δείβιαηα πνμζηέεδηακ ιυκμ ζπυνζα ημο ιφηδηα PL251 πμο πενζέπμκηαζ ζημ ζηεφαζια BIOACT πκπεξάζκαηα ηδκ πανμφζα ιεθέηδ εηηζιήεδηε δ επίδναζδ ημο μνβακζημφ δζαθφηδ ηαζ ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ, ηαεχξ ηαζ ηςκ επζιένμοξ ζοκδοαζιχκ ημοξ, ζηδκ πμζυηδηα ηαζ ηδ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs πμο παναθαιαάκμκηαζ ιεηά απυ δφμ ζοκεπυιεκμοξ ηφηθμοξ εηπφθζζδξ, ζε δφμ εδάθδ πμο δζέθενακ ςξ πνμξ ημ ph. Απυ ηδκ ακάθοζδ 169

170 ηςκ απμηεθεζιάηςκ ανέεδηε υηζ, δ εηηέθεζδ εκυξ δεφηενμο ηφηθμο εηπφθζζδξ δζάνηεζαξ δφμ ςνχκ ήηακ απαναίηδηδ βζα ηδκ παναθααή ιέβζζηςκ ζοβηεκηνχζεςκ PLFAs ηαζ ζηα δφμ εδάθδ, εκχ δ επζθμβή ηςκ ζοζηαηζηχκ ημο ιίβιαημξ εηπφθζζδξ πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs πμο πνμέηορακ ηαηά ηδ δεφηενδ εηπφθζζδ ηαζ αοηυ απμηοπχεδηε ζηδ ζφζηαζδ ηςκ ζοκμθζηχκ PLFAs πμο πνμέηορακ απυ ημ άενμζζια ηςκ δφμ επζιένμοξ εηποθίζεςκ. οκμθζηά, δ εηπφθζζδ ηςκ ιέβζζηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ PLFAs επζηεφπεδηε ιε ημκ ζοκδοαζιυ CHLιεεακυθδ-Cit ηαζ δομ δζαδμπζηέξ εηποθίζεζξ δζάνηεζαξ δφμ ςνχκ δ ηάεε ιία, ακελανηήηςξ εδαθζημφ ph. Σμ παναπάκς αεθηζζημπμζδιέκμ πνςηυημθθμ πνδζζιμπμζήεδηε ζηδ ζοκέπεζα ιε επζηοπία βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ επζθεβιέκςκ ζοκεεηζηχκ (oxamyl ηαζ fluensulfone) ηαζ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ κδιαηςδμηηυκςκ (QLAgri ηαζ BIOACT ) ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Οζ επειαάζεζξ ιε oxamyl, fluensulfone ηαζ QL Agri, ζηζξ ζοκζζηχιεκεξ δυζεζξ, δεκ πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ ζημ έδαθμξ, εκζζπφμκηαξ ηδκ άπμρδ υηζ δ πνήζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ δεκ ακαιέκεηαζ κα επζθένεζ ανκδηζηέξ ζοκέπεζεξ ζε μνβακζζιμφξ ιδ ζηυπμοξ. Ακηίεεηα, δ πνμζεήηδ ημο BIOACT πνμηάθεζε ζδιακηζηή αφλδζδ ηςκ πθδεοζιχκ ιοηήηςκ ηαζ ανκδηζηχκ ηαηά gram ααηηδνίςκ ζημ έδαθμξ, βεβμκυξ πμο απμδυεδηε ζηα επζιένμοξ ζοζηαηζηά ημο ζηεοάζιαημξ, βθοηυγδ (78%) ηαζ απμαμοηονςιέκμξ μνυξ βάθαηημξ (6%) πμο απμηεθμφκ εφημθα αθμιμζχζζιεξ πδβέξ εκένβεζαξ ηαζ εκζζπφμοκ ηδκ ακάπηολδ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ ημπζμηνμθζηχκ μιάδςκ ιζηνμμνβακζζιχκ. Χζηυζμ, δ αφλδζδ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ μιάδςκ ιζηνμμνβακζζιχκ δφκαηαζ ιέζς ακηαβςκζζιμφ κα ηαηαζηείθεζ ηδ δνάζδ άθθςκ μιάδςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ιε ελίζμο ζδιακηζηυ νυθμ βζα ημ εδαθζηυ μζημζφζηδια. οκεπχξ, δ αζμθμβζηή πνμέθεοζδ ηςκ μοζζχκ δεκ απμηεθεί επέββομ βζα ηδκ αζθαθή πνήζδ ημοξ ζημ πενζαάθθμκ, εκχ πεναζηένς ιεθέηεξ απαζημφκηαζ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ μζημημλζηυηδηαξ ηςκ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ β.θ. ιε ηδ πνήζδ ζφβπνμκςκ, ηοπμπμζδιέκςκ, αζμπδιζηχκ ηαζ ιμνζαηχκ ενβαθείςκ ακάθοζδξ. 170

171 2.7. Βηβιηνγξαθία Akhtar, M., Mahmood, I. (1994) Potentiality of phytochemicals in nematode control: a review. Bioresource Technology 48: Al-Raddad, A.M. (1995) Interaction of Glomus mosseae and Paecilomyces lilacinus on Meloidogyne javanica of tomato. Mycorrhiza 5: Anastasiadis, I.A., Giannakou, I.O., Prophetou-Athanasiadou, D.A., Gowen, S.R., (2008) The combined effect of the application of a biocontrol agent Paecilomyces lilacinus with various practices for the control of root-knot nematodes. Crop Prot 27: Bååth, E., Anderson, T.H. (2003) Comparison of soil fungal/ bacterial ratios in a ph gradient using physiological and PLFA- based techniques. Soil Biol Biochem 35: Bligh, E.G, Dyer, W.J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 37: Bossio, D.A., Scow, K.M., Gunapala, N., Graham, K.J. (1998) Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microb Ecol 36: Cáceres, T.P., He, W., Megharaj, M., Naidu, R. (2009) Effect of insecticide fenamiphos on soil microbial activities in Australian and Ecuadorean soils. J Environ Sci Health B 44: Campbell, C.D., Chapman, S.J., Cameron, C.M., Davidso, M.S., Potts, J.M. (2003) A rapid microtiter plate method to measure carbon dioxide evolved from carbon substrate amendments so as to determine the physiological profiles of soil microbial communities by using whole soil. Appl Environ Microb 69: Cequier-Sanchez, E., Rodríguez, C., Ravelo, A.G., Arate, R.Z. (2008) Dichloromethane as a solvent for lipid extraction and assessment of lipid classes and fatty acids from samples of different natures. J Agric Food Chem 56: Chaves, AL., Vergara, C.E., Mayer, J.E. (1995) Dichloromethane as an economic alternative to chloroform in the extraction of DNA from plant tissues. Plant Molec Biol Rep 13:

172 Dong, L., Zhang, K.Q. (2006) Microbial control of plant-parasitic nematodes: a fiveparty interaction. Plant Soil 288: Falkowski, P.G., Fenchel, T., Delong, E.F. (2008) The microbial engines that drive earth s biogeochemical cycles. Science 320: Federle, T.W. (1986) Microbial distribution in soil-new techniques. In: Megusar F, Gantar M. (Eds) Perspectives in Microbial Ecology. Slovene Society for Microbiology, International Symposium on Microbial Ecology IV, pp Findlay, R.H. (2004) Determination of microbial community structure using phospholipids fatty acid profiles. Molecular Microbial Ecology Manual, Second Edition 4.08, Kluwer Academic Publishers, Netherlands, pp Findlay, R.H., King, G.M., Watling, L. (1989) Efficacy of phospholipid analysis in determining microbial biomass in sediments. Appl Environ Microbiol 54: Frostegård, Ǻ., Bååth, E., Tunlid, A. (1993) Shifts in the structure of soil microbial communities in the limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol Biochem 25: Frostegård, Ǻ., Tunlid, A., Bååth, E. (1991) Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content. J Microbiol Meth 14: Fuhrmann, A., Gerzabek, M.H., Watzinger, A. (2009) Effects of different chloroform stabilizers on the extraction efficiencies of phospholipid fatty acids from soils. Soil Biol Biochem 41: Giannakou, I.O. (2011) Efficacy of a formulated product containing Quillaja saponaria plant extracts for the control of root-knot nematodes. Eur J Plant Pathol 130: Gómez-Brandón, M., Lores, M., Domínguez, J. (2010) A new combination of extraction and derativization methods that reduces the complexity and preparation time in determining phospholipids fatty acids in solid environmental samples. Biores Technol 101: Gopal, M., Gupta, A., Arunachalam, V., Magu, S.P. (2007) Impact of azadirachtin, an insecticidal allelochemical from neem on soil microflora, enzyme and respiratory activities. Biores Technol 98: Hamer, U., Unger, M., Makeschin, F. (2007) Impact of air-drying and rewetting on PLFA profiles of soil microbial communities. J Plant Nutr Soil Sci 170:

173 Hinojosa, M.B., Carreira, J.A., García-Ruíz, R., Dick, R.P. (2005) Microbial response to heavy metal-polluted soils: Community analysis from phospholipids-linked fatty acids and ester- linked fatty acids extracts. J Environ Qual 34: Ibekwe, A.M., Kennedy, A.C. (1998) Phospholipid fatty acid profiles and carbon utilization patterns for analysis of microbial community structure under field and greenhouse conditions. FEMS Microbiol Ecol 26: Ibekwe, A.M., Papiernik, S.K., Gan, J., Yates, S.R., Yang, C., Crowley, D.E. (2001) Impact of fumigants on soil microbial communities. Appl Environm Microbiol 67: Ipsilantis, I., Samourelis, C., Karpouzas, D.G., (2012) The impact of botanical pesticides on arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Biol Biochem 45: Karpouzas, D.G., Karanasios, E., Giannakou, I.O., Georgiadou, A., Menkissoglu- Spiroudi, U. (2005) The effect of soil fumigants methyl bromide and metham sodium on the microbial degradation of the nematicide cadusafos. Soil Biol Biochem 37: Khan, A., Williams, K.L., Nevalainen, H.K.M. (2006) Control of plant parasitic nematodes by Paecilomyces lilacinus and Monacrosporium lysipagum in pot trials. Biocontrol 51: Klose, S., Acosta-Martínez, V., Ajwa, H.A. (2006) Microbial community composition and enzyme activities in a sandy loam soil after fumigation with methyl bromide or alternative biocides. Soil Biol Biochem 38: Lee, Y.B., Lorenz, N., Dick, L.K., Dick, R.P. (2007) Cost storage and pretreatment incubation effects on soil microbial properties. Soil Sci Soc Am J 71: Macalady, J.L., Fuller, M.E., Scow, K.M. (1998) Effects of metam sodium fumigation on soil microbial activity and community structure. Journal of Environmental Quality 27: McCaig, A.E., Glover, L.A., Prosser, J.I. (2001) Numerical analysis of grassland bacterial community structure under different land management regimens by using 16S ribosomal DNA sequence data and denaturating gradient gel electrophoresis bandingpatterns. Appl Environ Microb 67: Megharaj, M., Singleton, I., Kookana, R., Naidu, R. (1999) Persistence and effects of fenamiphos on native algal populations and enzymatic activities in soil. Soil Biol Biochem 31:

174 Moore-Kucera, J., Dick, R.P. (2008) PLFA profiling of microbial community structure and seasonal shifts in soils of a Douglas- fir chronosequence. Microb Ecol 55: Nielsen, P., Petersen, S.O. (2000) Ester-linked polar lipid fatty acid profiles of soil microbial communities: a comparison of extraction methods and evaluation of interference from humic acids. Soil Biol Biochem 32: O Neil, M.J., Smith, A., Heekelman, P.L., Budavari, S. (2001) The Merck index an encyclopedia of chemicals, drugs, and biological, 13th edn. Merck Research Laboratories, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, pp Oka, Y., Koltai, H., Bar-Eyal, M., Mor, M., Sharon, E., Chet, I., Spiegel, Y. (2000) New strategies for the control of plant-parasitic nematodes. Pest Manag Sci 56: Omirou, M., Rousidou, C., Bekris, F., Papadopoulou, K.K., Ehaliotis, E.K., Menkissoglu-Spiroudi, U., Karpouzas, D.G., (2011) Σhe impact of biofumigation and chemical fumigation methods on the structure and function of the soil microbial community. Microb Ecol 61: Petersen, S.O., Klug, M.J. (1994) Effects of sieving, storage, and incubation temperature on the phospholipid fatty acid profile of a soil microbial community. Appl Environ Microbiol 60: Piotrowska-Seget, Z., Mrozik, A. (2003) Signature lipid biomarker (SLB) analysis in determining changes in community structure of soil microorganisms. Pol J Environ Stud 12: Rousidou, C., Papadopoulou, E., Kortsinidou M., Giannakou, I.O., Singh, B.K., Menkissoglu-Spiroudi, U., Karpouzas, D.G. (2013) Bio-pesticides: Harmful or harmless to ammonia oxidizing microorganisms? The case of a Paecilomyces lilacinus-based nematicide. Soil Biol Biochem 67: Rousk, J., Brookes, P.C., Bååth, E. (2010) The microbial PLFA composition as affected by ph in an arable soil. Soil Biol Biochem 42: Rumbos, C. (2005) Ecological studies on Paecilomyces lilacinus strain 251 and their importance for biocontrol of plant-parasitic nematodes and environmental risk assessment. PhD Thesis, Cuviller Verlag, Gottingen, The Netherlands. Rumbos, C., Kiewnick, S., (2006) Effect of plant species on persistence of Paecilomyces lilacinus strain 251 in soil and on root colonization by the fungus. Plant Soil 283:

175 San Martin, R., and Magunacelaya, J. C, (2005) Control of plant-parasitic nematodes with extracts of Quillaja saponaria. Nematology 7: Sheldrick, B.H., Wang, C. (1993) Particle size distribution. In: Carter MR, (Ed) Soil sampling and methods of analysis. Lewis, Boca, Raton, F.L, pp Siddiqui, Z.A., Akhtar, M.S., (2008) Synergistic effects of antagonistic fungi and a plant growth promoting rhizobacterium, an arbuscular mycorrhizal fungus, or composted cow manure on populations of Meloidogyne incognita and growth of tomato. Biocon Sci Technol 18: Snyder, L.R. (1974) Classification of the solvent properties of common liquids. J Chrom 92: Spyrou, I.M., Karpouzas, D.G., Menkissoglu-Spiroudi, U. (2009) Do botanical pesticides alter the structure of the soil microbial community? Microb Ecol 58: Suett, D.L., Fournier, J.-C., Papadopoulou-Mourkidou, E., Pussemier, L., Smelt, J. (1996) Accelerated degradation: the European dimension. Soil Biol. Biochem. 28: Vestal, J.R., White, D.C. (1989) Lipid analysis in microbial ecology. Bioscience 39: Walkey, A., Black, C.A. (1934) An examination of the Djetgarref method for determining organic matter and proposed modification of the chromic acid titration method. Soil Sci 5: White, D.C., Davis, W.M., Nickels, J.S., King, J.D., Bobbie, R.J. (1979) Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia 40: Wu, Y., Ding, N., Wang, G., Xu, J., Wu, J., Brookes, P.C. (2009) Effects of different soil weights, storage times and extraction methods on soil phospholipids fatty acid analyses. Geoderma 150: Νηάθθδ, Ν.Γ. (2010) Ακηζιεηχπζζδ ηςκ νζγυημιαςκ κδιαηςδχκ ζε εενιμηδπζαηέξ ηαθθζένβεζεξ ιε θοζζηά πνμσυκηα ηαζ ιεθέηδ ηδξ πδιζηήξ ζφζηαζδξ αοηχκ. Γζδαηημνζηή δζαηνζαή, Ανζζημηέθεζμ πακεπζζηήιζμ Θεζζαθμκίηδξ, Γεςπμκζηή πμθή. Πακηεθέθδξ, Η. (2006) Μεθέηδ ηδξ πνμζνυθδζδξ ηαζ απμδυιδζδξ ημο κδιαηςδμηηυκμο fosthiazate ζημ έδαθμξ ηαζ επίδναζδ ηςκ ζδζμηήηςκ ημο 175

176 εδάθμοξ. Μεηαπηοπζαηή δζαηνζαή, Ανζζημηέθεζμ πακεπζζηήιζμ Θεζζαθμκίηδξ, Γεςπμκζηή πμθή. πφνμο, Η.Μ. (2008) Αλζμθυβδζδ ηδξ επίδναζδξ ζοκεεηζηχκ ηαζ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ θοημπνμζηαηεοηζηχκ πνμσυκηςκ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Μεηαπηοπζαηή δζαηνζαή, Ανζζημηέθεζμ πακεπζζηήιζμ Θεζζαθμκίηδξ, Γεςπμκζηή πμθή. 176

177 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 3. Δπίδξαζε ηνπ δηδαληνθηόλνπ nicosulfuron ζηε δνκή θαη ηελ αθζνλία ηεο θνηλόηεηαο ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο Πεξίιεςε Ζ κζηνμπμίδζδ απμηεθεί ηδκ ζδιακηζηυηενδ δζενβαζία βζα ηδκ μθμηθήνςζδ ημο βεςπδιζημφ ηφηθμο ημο Ν ηαζ πναβιαημπμζείηαζ απυ κζηνςδμπμζδηζηά ανπαία (ΑΟΑ) ηαζ κζηνςδμπμζδηζηά ααηηήνζα (ΑΟΒ). Πανά ηδ ιεβάθδ ζδιαζία ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ αοηχκ βζα ηδ θεζημονβία ημο εδαθζημφ μζημζοζηήιαημξ, πενζμνζζιέκμξ ανζειυξ ιεθεηχκ έπεζ αζπμθδεεί ιε ηζξ επζδνάζεζξ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδκ θεζημονβζηή ημοξ πμζηζθυηδηα. ηδκ πανμφζα ιεθέηδ εηηζιήεδηε δ επίδναζδ ημο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron, πμο παναηηδνίγεηαζ απυ ορδθή αζμπδιζηή δναζηζηυηδηα ηαζ εηθεηηζηυηδηα, ζε παιδθέξ δυζεζξ εθανιμβήξ ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ (ΑΟΜ: Ammonia Oxidizing Microorganisms) ημο εδάθμοξ. ημ πθαίζζμ ηδξ ιεθέηδξ αοηήξ πναβιαημπμζδεδηακ πεζνάιαηα εενιμηδπίμο ηαζ αβνμφ πνμηεζιέκμο κα εηηζιδεεί δ επίδναζδ ημο nicosulfuron ζημοξ κζηνςδμπμζδηζημφξ ιζηνμμνβακζζιμφξ φζηενα απυ ιαηνμπνυκζα έηεεζδ ημο εδάθμοξ ζε ορδθέξ δυζεζξ (πείναια εενιμηδπίμο, Tier I) αθθά ηαζ οπυ νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ (πείναια αβνμφ, Tier II). ημ πείναια εενιμηδπίμο πναβιαημπμζήεδηακ ζοκμθζηά 5 δζαδμπζηέξ επειαάζεζξ ακά δζαζηήιαηα 40 διενχκ ηαζ ζε ηάεε ηφηθμ έβζκακ επειαάζεζξ ιε δυζεζξ 0x, 10x, 100x ηαζ 1000x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ. ημ πείναια αβνμφ πναβιαημπμζήεδηε ιία επέιααζδ ιε ημ nicosulfuron, ζε δυζεζξ 0x, 1x ηαζ 5x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ βζα εθανιμβή ζημκ αβνυ ηαζ ακαθφεδηακ εδαθζηά δείβιαηα πμο ζοθθέπεδηακ αιέζςξ πνζκ ηδκ επέιααζδ ηαζ ζε πνμκζηά δζαζηήιαηα 2, 28 ηαζ 116 διενχκ ιεηά ηδκ επέιααζδ. Ζ επίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ ιε PCR εκίζποζδ ημο 16S rrna ηαζ ημο amoa βμκζδίμο, βζα ηα ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ ακηίζημζπα ηαζ αημθμφεδζε ιμνζαηή απμηφπςζδ ιε ηδκ ιέεμδμ DGGE. Ακηίζημζπα, βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ επίδναζδξ ημο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ, πναβιαημπμζήεδηε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ιε ζηυπμ ημ βμκίδζμ amoa ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ. ημ πείναια εενιμηδπίμο παναηδνήεδηακ αθθαβέξ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ, ζδζαίηενα ιεηά ημκ πνχημ ηφηθμ επέιααζδξ, εκχ ζηαεενή πανέιεζκε δ ζφζηαζδ ηδξ 177

178 ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΑ. Ακηίεεηα, δ αθεμκία ηςκ ΑΟΜ δεκ επδνεάζηδηε ζδιακηζηά. ηδκ πενίπηςζδ ημο πεζνάιαημξ αβνμφ, δ ζφζηαζδ ηςκ ημζκμηήηςκ ηςκ ΑΟΜ δεκ επδνεάζηδηε απυ ηδκ επέιααζδ ιε ημ nicosulfuron ζε ηαιία απυ ηζξ ελεηαγυιεκεξ δυζεζξ, εκχ ζπεηζηά ιε ηδκ αθεμκία δεκ παναηδνήεδηε ζαθέξ πνυηοπμ επίδναζδξ ηςκ επζιένμοξ δυζεςκ ημο nicosulfuron, ζε ζοκάνηδζδ ιε ημ πνυκμ δεζβιαημθδρίαξ. οκμθζηά, δ εθανιμβή ημο nicosulfuron αηυιδ ηαζ ζε δυζεζξ πμθθαπθάζζεξ ηδξ ζοκζζηχιεκδξ δεκ πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ εκχ πενζμνζζιέκεξ ιεηααμθέξ ζηδκ πμζηζθυηδηα ηςκ ΑΟΒ παναηδνήεδηακ ιυκμ ζημ πείναια εενιμηδπίμο Δηζαγσγή Οζ ζμοθθμκοθμονίεξ (sulfonylureas) ειθακίζηδηακ ζηδ βεςνβζηή πνάλδ ζηζξ ανπέξ ηδξ δεηαεηίαξ ημο 1980, ςξ γζγακζμηηυκα εδάθμοξ ηαζ θοθθχιαημξ, απμηεθεζιαηζηά βζα ηδκ ηαηαπμθέιδζδ εηήζζςκ ηαζ πμθοεηχκ γζγακίςκ ζε δζάθμνεξ ηαθθζένβεζεξ. Ζ μζημβέκεζα ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ πενζθαιαάκεζ έκα ιεβάθμ ανζειυ δναζηζηχκ μοζζχκ ηαζ δ ακαηάθορή ημοξ απμηέθεζε ζδιείμ ακαθμνάξ βζα ηδκ βεςνβία θυβς ηςκ ζδζαίηενςκ παναηηδνζζηζηχκ πμο ζοκδοάγμοκ. οβηεηνζιέκα, ηα γζγακζμηηυκα ηδξ μιάδαξ αοηήξ (1) εθανιυγμκηαζ ζε ελαζνεηζηά παιδθέξ δυζεζξ (2-100 g δ.μ. ha -1 ), (2) είκαζ απμηεθεζιαηζηά βζα ηδκ ακηζιεηχπζζδ εονέςξ θάζιαημξ γζγακίςκ, (3) παναηηδνίγμκηαζ απυ ορδθή εηθεηηζηυηδηα, (4) επζδεζηκφμοκ παιδθή ζπεηζηά ημλζηυηδηα ζε μνβακζζιμφξ ιδ-ζηυπμοξ υπςξ εδθαζηζηά, ράνζα ηαζ άκενςπμξ ηαζ (5) δεκ εεςνμφκηαζ επζηίκδοκα βζα ημ πενζαάθθμκ, ηαεχξ είκαζ μοζίεξ παιδθήξ οπμθεζιιαηζηυηδηαξ πμο δζαζπχκηαζ εφημθα ζημ έδαθμξ ιε ζοκδοαζιυ αζμηζηχκ ηαζ ααζμηζηχκ δζενβαζζχκ (Radivojevic et al., 2012, Filimon et al., 2011, Saeki and Toyota, 2004). Ο ιδπακζζιυξ δνάζδξ ημοξ ααζίγεηαζ ζηδκ ζδζυηδηα ημοξ κα ακαζηέθθμοκ ηδ ζφκεεζδ ημο εκγφιμο μλζημβαθαηηζηή ζοκεάζδ (ALS) ή ζοκεάζδ ημο οδνμλο-μλζημφ μλέμξ (AHAS), πμο ζοιιεηέπεζ ζηδ αζμζφκεεζδ ηςκ αιζκμλέςκ ιε δζαηθαδζζιέκδ αθοζίδα αηυιςκ άκεναηα, ααθίκδ, θεοηίκδ ηαζ ζζμθεοηίκδ. Σμ έκγοιμ αοηυ απακηάηαζ ζηα θοηά ηαζ ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ, εκχ δεκ έπεζ ανεεεί ζε ακενχπμοξ ηαζ γχα. Οζ ιζηνμμνβακζζιμί ςζηυζμ, αθμιμζχκμοκ ζοκήεςξ ηα παναβυιεκα απυ ηα θοηά αιζκμλέα, ακηί κα ηα ζοκεέζμοκ μζ ίδζμζ (Allievi and Gigliotti, 2001). Χξ εη ημφημο, μζ ζμοθθμκοθμονίεξ ακ ηαζ εεςνμφκηαζ αηίκδοκεξ βζα ημκ άκενςπμ ηαζ ημ 178

179 πενζαάθθμκ, ιπμνεί κα αζηήζμοκ ημλζηή επίδναζδ ζηα εοαίζεδηα θοηά ηαζ ημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ (Djuric and Jarak, 2006). ηα πθαίζζα ηδξ αολακυιεκδξ ακδζοπίαξ πμο εηδδθχκεηαζ ζηζξ ιένεξ ιαξ ζπεηζηά ιε ηζξ ζοκέπεζεξ ηδξ εζζνμήξ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζημ εδαθζηυ μζημζφζηδια, δζάθμνεξ ιεθέηεξ έπμοκ δζελαπεεί υζμκ αθμνά ζηδκ επίδναζδ ηςκ γζγακζμηηυκςκ ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ ζηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Οζ Forlani et al., (1995) παναηήνδζακ υηζ ηα γζγακζμηηυκα chlorsulfuron ηαζ rimsulfuron, πανειπυδζζακ ηδκ ακάπηολδ μνζζιέκςκ ααηηδνίςκ πμο απμιμκχεδηακ απυ ηδκ πενζμπή ηδξ νζγυζθαζναξ. Ακάθμβα απμηεθέζιαηα πνμέηορακ απυ ηδ ιεθέηδ ηςκ Boldt et al., (1998), πμο ακέθενακ υηζ ηα γζγακζμηηυκα metsulfuron methyl, chlorsulfuron ηαζ trifensulfuron methyl πενζυνζζακ ζδιακηζηά ηδκ ακάπηολδ ζοβηεηνζιέκςκ ααηηδνζηχκ ζηεθεπχκ ημο είδμοξ Pseudomonas fluorescens. Οζ Ismail et al., (1996), ζε ιεηέπεζηα ιεθέηεξ ηαηέθδλακ υηζ ημ metsulfuron- methyl πανειπυδζζε πανμδζηά ηδκ ακαπκμή ηαζ ηδκ ακάπηολδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ ημο εδάθμοξ, υηακ εθανιυζηδηε ζε δυζδ δεηαπθάζζα (10x) ηδξ ζοκζζηχιεκδξ. Ανβυηενα, μζ Saeki ηαζ Toyota, (2004), παναηήνδζακ υηζ ημ bensulfuron-methyl, πνμηάθεζε πανμδζηή ακαζημθή ηδξ κζηνμπμίδζδξ, εκχ δ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααηηδνίςκ ζημ έδαθμξ (DGGE, 16S rdna) δεκ επδνεάζηδηε ζδιακηζηά. Οιμίςξ, μζ Allievi ηαζ Gigliotti (2001), παναηήνδζακ υηζ ημ cinosulfuron πνμηάθεζε πανμδζηή ακαζημθή ηδξ κζηνμπμίδζδξ, εκχ ιυκμ ζε δυζδ εηαημκηαπθάζζα ηδξ ζοκζζηχιεκδξ (100x) επδνέαζε ανκδηζηά ηδκ ακάπηολδ μνζζιέκςκ εζδχκ εηενυηνμθςκ ιζηνμμνβακζζιχκ. Σμ nicosulfuron (2-[[[[(4,6-dimethoxy-2-pyrimidinyl]amino]carbonyl]sulfonyl]- N,N-dimethyl-3-pyridinecarboxamide) 1-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl)-3-(3- dimethylcarbamoyl-2-pyridylsulfonyl)urea (IUPAC) είκαζ ιέθμξ ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ (Δζηυκα 3.1, 3.2) ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ εονέςξ ζηδκ Δονχπδ ιεηά ηδκ απυζονζδ ημο atrazine, βζα ημκ ιεηαθοηνςηζηυ έθεβπμ εηήζζςκ ηαζ πμθοεηχκ αβνςζηςδχκ ηαζ πθαηφθοθθςκ γζγακίςκ ζε ηαθθζένβεζεξ ανααυζζημο (Damalas et al., 2012, Regitano and Koskinen, 2008). Πενζμνζζιέκμξ ανζειυξ ιεθεηχκ έπεζ αζπμθδεεί ιέπνζ ζήιενα ιε ηζξ επζδνάζεζξ ημο nicosulfuron ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Κάπμζεξ απυ αοηέξ ζηδνίγμκηαζ ζε ιεευδμοξ πμο πενζθαιαάκμοκ ηδκ ηαθθζένβεζα ιζηνμμνβακζζιχκ ζε ενεπηζηά οπμζηνχιαηα ηαζ επζζδιαίκμοκ ανκδηζηή επίδναζδ ζε ζοβηεηνζιέκα είδδ ιοηήηςκ ηαζ ααηηδνίςκ (Filimon et al., 2012, 2011, Djuric and Jarak, 2006), εκχ άθθεξ, αθμνμφκ ζημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ αζμπδιζηήξ 179

180 δναζηζηυηδηαξ ημο εκγφιμο αθοδνμβμκάζδ, ηδξ ιζηνμαζαηήξ ακαπκμήξ ή ηδξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ ηαζ ηαηαδεζηκφμοκ πανμδζηή επίδναζδ, ακαζηαθηζηή ή δζεβενηζηή, ακάθμβα ιε ηδκ εθανιμγυιεκδ δυζδ ηαζ ηδ δζάνηεζα ηδξ έηεεζδξ (Radivojevic et al., 2012, Djuric and Jarak, 2006). Μυκμ ιία ιεθέηδ ςξ ηχνα έπεζ αλζμθμβήζεζ ηδκ επίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία ιζηνμμνβακζζιχκ ιε ζδζαίηενμ θεζημονβζηυ νυθμ, πνδζζιμπμζχκηαξ ιμνζαηέξ ηεπκζηέξ (DGGE-16S rrna, PCR πναβιαηζημφ πνυκμο). οβηεηνζιέκα, ζηδ ιεθέηδ αοηή δζαπζζηχεδηε ζδιακηζηή επίδναζδ ζηδ δμιή, αθθά υπζ ηαζ ζηδκ αθεμκία ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδκ μλείδςζδ ημο ιεεακίμο (Seghers et al., 2005). Eικόνα 3.1. Γενικόσ χθμικόσ τφποσ των ςουλφονυλουριϊν. Με κόκκινο επιςθμαίνεται θ λειτουργικι χθμικι ομάδα και με μπλε οι πλευρικζσ αλυςίδεσ ςφμφωνα με τισ οποίεσ διαφοροποιοφνται τα μζλθ των ςουλφονυλουριϊν μεταξφ τουσ. Eικόνα 3.2. Χθμικι δομι του ηιηανιοκτόνου nicosulfuron. Οζ παναπάκς παναηδνήζεζξ πανέπμοκ εκδείλεζξ υηζ ηα γζγακζμηηυκα ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ ακ ηαζ εεςνμφκηαζ αζθαθή βζα ημ πενζαάθθμκ ηονίςξ θυβς ηδξ παιδθήξ δυζδξ εθανιμβήξ ηαζ ημο εηθεηηζημφ ηνυπμο δνάζδξ, ιπμνμφκ κα επδνεάζμοκ ηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Πανά ςζηυζμ, ηδ δζαδεδμιέκδ πνήζδ ημοξ ηαζ ηζξ ενεοκδηζηέξ πνμζπάεεζεξ πμο έπμοκ βίκεζ ςξ ηχνα, δ επίδναζδ 180

181 ηςκ γζγακζμηηυκςκ ηδξ μιάδαξ αοηήξ ζηδ θεζημονβία ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ, δεκ έπεζ απμζαθδκζζηεί πθήνςξ. Οζ πενζζζυηενεξ ςξ ηχνα ιεθέηεξ έπμοκ επζηεκηνςεεί ζηδκ επίδναζδ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ ζε επίπεδμ ιζηνμηυζιςκ πμο ςξ βκςζηυκ απέπμοκ ζδιακηζηά απυ ηα νεαθζζηζηά επίπεδα έηεεζδξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ζε επίπεδμ αβνμφ. Δπζπθέμκ, μζ πενζζζυηενεξ απυ ηζξ παναπάκς ιεθέηεξ ζηδνίγμκηαζ ζε ιεευδμοξ ηαθθζένβεζαξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζε ενεπηζηά οπμζηνχιαηα ηαζ αζμπδιζηέξ δμηζιέξ πςνίξ κα ιπμνμφκ κα απμδχζμοκ ηδκ πθήνδ εζηυκα ηδξ επίδναζδξ ζε επίπεδμ ζφζηαζδξ υζμ ηαζ ζε επίπεδμ θεζημονβίαξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ. Ζ ακάπηολδ ζφβπνμκςκ ιμνζαηχκ ηεπκζηχκ έπεζ δζεονφκεζ ηζξ δοκαηυηδηεξ παναημθμφεδζδξ ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ ημο εδάθμοξ, ηαεχξ επζηνέπεζ ηδ ιεθέηδ ηδξ δμιήξ ηαζ ηδξ αθεμκίαξ μιάδςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ιε ζοβηεηνζιέκμ θεζημονβζηυ νυθμ. Ακάιεζα ζηζξ δζάθμνεξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ, μζ ιζηνμμνβακζζιμί πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδκ μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ έπμοκ ζδζαίηενδ θεζημονβζηή ζδιαζία ηαεχξ εθέβπμοκ ημ νοειμ-ηαεμνζζηζηυ ζηάδζμ ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ κζηνμπμίδζδξ, ηαηά ημ μπμίμ δ αιιςκία μλεζδχκεηαζ ζε οδνμλοθαιίκδ, ιε ηδκ δνάζδ ημο εκγφιμο ιμκμ-μλοβμκάζδ ηδξ αιιςκίαξ (Prosser and Nicol, 2008). Πνυζθαηεξ ένεοκεξ ζπεηζηέξ ιε ηδκ μζημθμβία ηςκ ΑΟΜ απμηάθορακ υηζ εηηυξ απυ ηα ΑΟΒ άθθδ ιζα μιάδα ιζηνμμνβακζζιχκ, ηα ΑΟΑ πμο ακήημοκ ζημ θφθμ Thaumarcheota, παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδ δζαδζηαζία ηδξ κζηνμπμίδζδξ ζημ έδαθμξ (Leininger et al., 2006, Zhang et al., 2010). Βαζζγυιεκμζ ζε αοηή ηδκ παναηήνδζδ μζ Wessen and Halin (2011), ηαηέθδλακ υηζ δ εηηίιδζδ ηδξ αθεμκίαξ ηςκ ΑΟΜ ιπμνεί κα ελοπδνεηήζεζ ςξ ηαηάθθδθμξ ηαζ απμδμηζηυξ μζημκμιζηά αζμδείηηδξ βζα ηδκ παναημθμφεδζδ ηδξ πμζυηδηαξ ηαζ ηδξ θεζημονβίαξ ημο εδάθμοξ. Οιμίςξ, μζ Pereira e Silva et al., (2013), επζζήιακακ υηζ δ μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ απμηεθεί δζαδζηαζία εφημθα ιεηνήζζιδ ηαζ εοαίζεδηδ ζηζξ αθθαβέξ, πμο επζηεθείηαζ ιε ηδ ζοιιεημπή ιζηνμμνβακζζιχκ ηαζ πνυηεζκακ υηζ μζ ακαθφζεζξ ηδξ δμιήξ ηαζ ηδξ αθεμκίαξ ηςκ ΑΟΜ ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ οβείαξ ημο εδάθμοξ. Γεδμιέκδξ ηδξ μζημθμβζηήξ ημοξ ζδιαζίαξ μζ κζηνςδμπμζδηζημί ιζηνμμνβακζζιμί ακήημοκ ζηζξ θεζημονβζηέξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ πμο έπμοκ ιεθεηδεεί εηηεκχξ ηαζ δζάθμνμζ ιμνζαημί δείηηεξ πνήζζιμζ βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ θοθμβεκεηζηήξ (16S rdna) ηαζ θεζημονβζηήξ (amoa) ημοξ πμζηζθυηδηαξ έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί ιε επζηοπία (Puglisi et al., 2012, Ruyters et al., 2010, Zhang et al., 2010, Kowalchuk et 181

182 al., 1997). Οζ ιεθέηεξ ηδξ επίδναζδξ ζημοξ ΑΟΜ έπμοκ ςξ επί ημ πθείζημκ επζηεκηνςεεί ζε ακυνβακεξ μοζίεξ, υπςξ μ ρεοδάνβονμξ ηαζ μ παθηυξ (Mertens et al., 2009, 2010), εκχ πενζμνζζιέκμξ ανζειυξ ιεθεηχκ έπεζ αζπμθδεεί ιε ηζξ επζδνάζεζξ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ. Οζ Hernandez et al., (2011) παναηήνδζακ υηζ ημ γζγακζμηηυκμ simazine πανειπυδζζε ζδιακηζηά ηδ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ ηαζ μδήβδζε ζε ιεηααμθέξ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ. Οζ Liu et al., (2012), παναηήνδζακ υηζ ημ μνβακμθςζθμνζηυ εκημιμηηυκμ profenofos δεκ επδνέαζε ηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΜ. Οζ Li et al., (2008), έδεζλακ υηζ ημ γζγακζμηηυκμ acetochlor ζε ζοβηεκηνχζεζξ > 50mg Kg -1, πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ηαζ ιυκζιεξ αθθαβέξ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ. Οιμίςξ, μζ Chang et al., (2001), απέδεζλακ υηζ δ εθανιμβή ιίβιαημξ γζγακζμηηυκςκ (atrazine, dicamba, fluometuron, metolachlor, and sulfentrazone), ζε ζοβηεκηνχζεζξ > 100mg Kg -1, ιεηέααθθε ζδιακηζηά ηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ ηαζ μδήβδζε ζε ζοζζχνεοζδ ΝΖ + 4 ζημ έδαθμξ. Πνυζθαηα, μζ Puglisi et al. (2012) παναηήνδζακ υηζ επειαάζεζξ ιε ηα ιοηδημηηυκα cyprodinil ηαζ penconazole ζε ζηνχια μνβακζηχκ οπμθεζιιάηςκ πμο ηάθοπηε ημ επζθακεζαηυ έδαθμξ πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ αθθά πανμδζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ δμιή (DNA/RNA-DGGE) ηαζ ηδ θεζημονβία (δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ) ηςκ ΑΟΜ. Γεκ οπάνπμοκ ςζηυζμ ζημζπεία ζηδ αζαθζμβναθία ζπεηζηά ιε ηδκ επίδναζδ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ ή ακάθμβςκ ζφβπνμκςκ β.θ. πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζε παιδθέξ δυζεζξ, ζηδ πμζηζθυηδηα ηαζ ηδκ αθεμκία ηδξ θεζημονβζηήξ μιάδαξ ηςκ ΑΟΜ. ηυπμξ ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ ήηακ δ εηηίιδζδ ηδξ επίδναζδξ ημο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron ζηδ πμζηζθυηδηα ηαζ ηδκ αθεμκία ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ ημο εδάθμοξ ιε ηδκ πνήζδ ηαηάθθδθςκ ιμνζαηχκ ηεπκζηχκ. Ζ ιεθέηδ ααζίζηδηε ζε πεζνάιαηα εενιμηδπίμο ζε θοημδμπεία ηαζ αβνμφ, χζηε κα πνμηφρεζ ζαθήξ ηαζ νεαθζζηζηή εζηυκα ηςκ επζδνάζεςκ ζημ επίπεδμ ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ θεζημονβζηήξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ. Ζ ζηναηδβζηή αοηή αημθμοεήεδηε χζηε κα εηηζιδεεί δ επίδναζδ ημο nicosulfuron ζε δφμ επίπεδα: 1) ανπζηά οπυ αοζηδνά ζοκηδνδηζηέξ ζοκεήηεξ, φζηενα απυ έηεεζδ ζε ορδθέξ δυζεζξ ηαζ ιε ιαηνμπνυκζα έηεεζδ ημο εδάθμοξ ζημ nicosulfuron πνμζμιμζάγμκηαξ ημ πνχημ επίπεδμ ακάθοζδξ επζηζκδοκυηδηαξ (Σier I, πείναια εενιμηδπίμο) ηαζ 2) οπυ πενζζζυηενμ νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ ζε δυζεζξ ηαζ πναηηζηέξ πμο αημθμοεμφκηαζ ζοκήεςξ ζηδκ πνάλδ ηαζ ακηζηαημπηνίγμοκ έκα δεφηενμ επίπεδμ ακάθοζδξ επζηiκδοκυηδηαξ (Tier II, πείναια αβνμφ). 182

183 3.3.Τιηθά θαη Μέζνδνη Πεηξακαηηθόο ρεδηαζκόο Ζ πανμφζα ιεθέηδ δζελάπεδηε ζηα πθαίζζα ημο πνμβνάιιαημξ ECOFUN- MICROBIODIV (SEE-ERA-NET-PLUS no 216, Σμ πνυβναιια αοηυ έπεζ ςξ ηφνζμ ζηυπμ ηδκ ακάπηολδ ηαζ αλζμθυβδζδ ηαζκμηυιςκ ιμνζαηχκ ηαζ αζμπδιζηχκ ιεευδςκ βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ μζημημλζημθμβζηήξ επίδναζδξ ζφβπνμκςκ β.θ. πμο εθανιυγμκηαζ ζε παιδθέξ δυζεζξ (low-dose pesticides) ζε μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ιε ζοβηεηνζιέκμ θεζημονβζηυ νυθμ. Ο πεζναιαηζηυξ ζπεδζαζιυξ ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ απμηεθεί ιένμξ ημο βεκζηυηενμο ζπεδζαζιμφ ημο παναπάκς πνμβνάιιαημξ. Ζ πνδιαημδυηδζδ ηδξ ιεθέηδξ έβζκε απυ ηδκ Δονςπασηή Δπζηνμπή (European Commission) ηαζ ημ Γενιακζηυ Αενμδζαζηδιζηυ Κέκηνμ (German Aerospace Centre, DLR). Πείξακα ζεξκνθεπίνπ Σμ πείναια εενιμηδπίμο πναβιαημπμζήεδηε ζηζξ εβηαηαζηάζεζξ ημο Ηκζηζημφημο INRA, πμο ανίζηεηαζ ζηδκ πυθδ Dijon ηδξ Γαθθίαξ απυ ηδκ μιάδα ημο Dr Fabrice Martin-Laurent. Υνδζζιμπμζήεδηε έδαθμξ (πενίπμο 100 Kg) πμο ζοθθέπεδηε απυ ημκ πεζναιαηζηυ αβνυ ηδξ εναίαξ, αιέζςξ πνζκ ηδκ έκανλδ ημο πεζνάιαημξ αβνμφ, ημ μπμίμ ημζηζκίζηδηε ιε ηυζηζκμ μπχκ 2mm ηαζ ηαηυπζκ απμζηάθεδηε ζηδ Γαθθία. Σμ έδαθμξ δζακειήεδηε ζε 20 πθαζηζηά θοημδμπεία (πενίπμο 4.5 Kg ακά θοημδμπείμ), δ οβναζία ημο πνμζανιυζηδηε ζημ 40% ηδξ οδαημπςνδηζηυηδηαξ ηαζ αημθμφεδζε επχαζδ ηςκ βθαζηνχκ βζα 1 εαδμιάδα εκηυξ ημο εενιμηδπίμο. ηδ ζοκέπεζα, ζε ηάεε θοημδμπείμ θοηεφηδηακ 10 ζπυνμζ ηαθαιπμηζμφ ηαζ ιία εαδμιάδα ιεηά, ιε ημ θφηνςια, πναβιαημπμζήεδηε αναίςζδ ηςκ θοηχκ χζηε κα δζαηδνδεμφκ ιυκμ 4 θοηάνζα ακά θοημδμπείμ. Αημθμφεςξ ηα θοημδμπεία δζαπςνίζηδηακ ζε 4 μιάδεξ ηςκ 5 θοημδμπείςκ ηαζ παναημθμοεήεδηε δ ακάπηολδ ημοξ ιέπνζ κα θηάζμοκ ζημ ζηάδζμ ηςκ 3-4 πναβιαηζηχκ θφθθςκ. ηδ ζοκέπεζα, ηα θοημδμπεία ηςκ 3 πνχηςκ μιάδςκ δέπηδηακ εθανιμβή ιε ημ γζγακζμηηυκμ nicosulfuron ζε δυζεζξ 10x, 100x ηαζ 1000x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ. Οζ δυζεζξ αοηέξ είκαζ πμθθαπθάζζεξ ηδξ ζοκζζηχιεκδξ βζα ηδκ ηαηαπμθέιδζδ ηςκ γζγακίςκ ζημκ αβνυ αθθά επζθέπεδηακ χζηε κα αλζμθμβήζμοιε ηδκ επίδναζδ ημο nicosulfuron ζε αηναίεξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ζημ εκ θυβς γζγακζμηηυκμ πνμζμιμζάγμκηαξ έκα ηεζη αλζμθυβδζδξ επζηζκδοκυηδηαξ επζπέδμο Η (Tier I). Ζ ηεθεοηαία μιάδα 183

184 θοημδμπείςκ δέπηδηε ηδκ ίδζα πμζυηδηα κενμφ υπςξ ηαζ μζ πνμδβμφιεκεξ ιεηαπεζνίζεζξ αθθά πςνίξ γζγακζμηηυκμ ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε ςξ ιάνηοναξ. Σα θοηά ακαπηφπεδηακ ηαζ δζαηδνήεδηακ ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ οπυ ζηαεενέξ ζοκεήηεξ: εενιμηναζία διέναξ 25:C, εενιμηναζία κφπηαξ 23:C, ζπεηζηή οβναζία 60% ηαζ δζάνηεζα διέναξ 11h. Ζ πενζεπυιεκδ εδαθζηή οβναζία δζαηδνήεδηε ζε ζηαεενά επίπεδα ιε ηαεδιενζκυ πυηζζια, εκχ ιζα θμνά ηδκ εαδμιάδα ηα θοηά πμηίγμκηακ ιε δζάθοια ενεπηζηχκ ζοζηαηζηχκ (ηνμπμπμζδιέκμ ενεπηζηυ δζάθοια Hoagland s). Με ηδκ μθμηθήνςζδ ιζαξ πενζυδμο 40 διενχκ απυ ηδκ εθανιμβή ημο nicosulfuron ηα θοηά απμιαηνφκεδηακ απυ ηα θοημδμπεία ηαζ αημθμφεδζε κέμξ ηφηθμξ ζπμνάξ θοηχκ ηαζ εθανιμβήξ ηςκ ίδζςκ δυζεςκ nicosulfuron ζηα ακηίζημζπα θοημδμπεία. οκμθζηά πναβιαημπμζήεδηακ 5 δζαδμπζηέξ επειαάζεζξ ακά δζαζηήιαηα 40 διένςκ, πμο μκμιάζηδηακ ακηίζημζπα: ηφηθμξ επέιααζδξ 1, 2, 3, 4, ηαζ 5. Αιέζςξ ιεηά απυ ηάεε επέιααζδ, ζοθθέπεδηακ δείβιαηα εδάθμοξ απυ ηάεε ιεηαπείνζζδ ηαζ απμεδηεφεδηακ ζημοξ -20:C ιέπνζ ηδκ πεναζηένς επελενβαζία ημοξ. Ο ζοβηεηνζιέκμξ πεζναιαηζηυξ ζπεδζαζιυξ ιε ηζξ δζαδμπζηέξ εθανιμβέξ ημο nicosulfuron ζε δυζεζξ πμθθαπθάζζεξ ηζξ ζοκζζηχιεκδξ αημθμοεήεδηε χζηε κα αλζμθμβδεεί δ επίδναζδ ημο γζγακζμηηυκμο ζε ζοκεήηεξ υπμο μζ ιζηνμμνβακζζιμί ημο εδάθμοξ εηηίεεκηαζ βζα ιεβάθμ πνμκζηυ δζάζηδια ζε ζηαεενά ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ημο nicosulfuron. Πανάθθδθα αλζμθμβήεδηε δ οπυεεζδ (υπζ ζηα πθαίζζα ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ) εάκ δ επακαθαιαακυιεκδ πνήζδ ημο nicosulfuron εα μδδβμφζε ζε ιζηνμαζαηή πνμζανιμβή (ηαζ άνα ζηαδζαηή επζηάποκζδ ηδξ απμδυιδζδξ ημο) ή ζε ειθάκζζδ ημλζηυηδηαξ ηαζ ζοζζχνεοζδ ημο ζημ έδαθμξ. Πείξακα αγξνύ Σμ πείναια αβνμφ πναβιαημπμζήεδηε ζε αβνμηειάπζμ ηδξ πενζμπήξ Rimski Sancevi (19 o 51,321 to 45 o 19,928), Novi Sad, εναίαξ. Ο ζοβηεηνζιέκμξ αβνυξ ανζζηυηακ ζε ηαθθζένβεζα ανααμζίημο ηαηά ηα ηεθεοηαία έηδ. ηζξ , πναβιαημπμζήεδηε ζπμνά ιε θοηά ανααυζζημο (Zea mays L., οανίδζμ NSSC 640), ζε ζφζηδια ιε ζεζνέξ ιε απμζηάζεζξ ζπμνάξ 25 cm ζηδκ βναιιή ηαζ 75 cm ιεηαλφ ηςκ βναιιχκ. Αημθμφεςξ, ημ πεζναιαηζηυ αβνμηειάπζμ πςνίζηδηε ιε πθήνςξ ηοπαζμπμζδιέκμ ζπέδζμ (random block design) ζε 16 πεζναιαηζηά ηειάπζα, δζαζηάζεςκ 6m πθάημξ x 5m ιήημξ. Γζα ηάεε ιεηαπείνζζδ οπήνπακ ηέζζενα πεζναιαηζηά ηειάπζα - επακαθήρεζξ. Ζ απυζηαζδ ιεηαλφ ηςκ επζιένμοξ πεζναιαηζηχκ ηειαπίςκ ήηακ 75m. Όηακ ηα θοηά ημο ανααυζζημο ανίζημκηακ ζημ 184

185 ζηάδζμ ακάπηολδξ ηςκ 6-8 θφθθςκ ( ), πναβιαημπμζήεδηε επέιααζδ, ιε ημ γζγακζμηηυκμ nicosulfuron (Accent 75DF) ζε δυζεζξ 0x, 1x, 2x ηαζ 5x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ (0 g ha -1, 60 g ha -1, 120 g ha -1, 300 g ha -1, ακηίζημζπα). H εθανιμβή ημο γζγακζμηηυκμο ζε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ πναβιαημπμζήεδηε ιε ρεηαζηήνα πθάηδξ. Εικόνα 3.3. Εφαρμογι του ηιηανιοκτόνου nicosulfuron ςτο πειραματικό αγροτεμάχιο (εικόνα που παραχωρικθκε από Dr. Simonida Djuric, Γεωπονικι χολι Πανεπιςτθμίου Novi Sad). Αιέζςξ πνζκ ηδκ επέιααζδ (πνυκμξ ιδδέκ: before) ηαζ ζε πνμκζηά δζαζηήιαηα 2 διενχκ (2 days), 28 διενχκ (28 days) ηαζ ζημ ηέθμξ ηδξ αθαζηζηήξ πενζυδμο (116 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ: end), ζοθθέπεδηακ δείβιαηα εδάθμοξ ιεηαλφ ηςκ ζεζνχκ ζπμνάξ ηςκ θοηχκ ηαζ ζε αάεμξ 0-10 cm. Απυ ηάεε πεζναιαηζηυ ηειάπζμ ζοθθέπεδηακ 5 οπμ-δείβιαηα εδάθμοξ, πμο μιμβεκμπμζήεδηακ χζηε κα έπμοιε έκα δείβια απυ ηάεε πεζναιαηζηυ ηειάπζμ ηαζ ιεηαθένεδηακ ζημ ενβαζηήνζμ υπμο ηαζ απμεδηεφηδηακ ζημοξ -20: C ιέπνζ ηδκ πεναζηένς επελενβαζία ημοξ πμο αθμνμφζε ζηδκ ελαβςβή ημο εδαθζημφ DNA. Θα πνέπεζ κα ημκζζηεί υηζ ζηδκ ζοβηεηνζιέκδ ιεθέηδ αλζμθμβήεδηακ δείβιαηα ιυκμ απυ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ x0, x1 x5 βζα θυβμοξ ηεπκζημφξ. Οζ θοζζημπδιζηέξ ζδζυηδηεξ ημο εδάθμοξ πνμζδζμνίζηδηακ απυ ηδκ μιάδα ημο πακεπζζηδιίμο ημο Novi Sad ηαζ ζοκμρίγμκηαζ ζημκ Πίκαηα 3.1. Τπεφεοκδ βζα ηδ δζελαβςβή ημο πεζνάιαημξ αβνμφ υπςξ αοηυ πενζβνάθηδηε παναπάκς ήηακ δ μιάδα ηδξ Dr. Simonida Djuric, ηδξ Γεςπμκζηήξ πμθήξ ημο Πακεπζζηδιίμο ημο Novi Sad ζηδ εναία. 185

186 Πίλαθαο 3.1. Φοζζημπδιζηέξ ζδζυηδηεξ ημο εδάθμοξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ. Ηδηόηεηεο Έδαθνο ph (ζε Ζ 2 Ο) 6,75 Ονβακζηυξ άκεναηαξ (%) 2,59 CaCO 3 (mg kg -1 ) 1.4 Οθζηυ Ν (g kg -1 ) 1.9 Ρ 2 Ο 5 (g kg -1 ) 0,084 K 2 O (g kg -1 ) 0,0273 Άιιμξ (%) 36.8 Ηθφξ (%) 35.8 Άνβζθμξ (%) 27.4 Μδπακζηή ζφζηαζδ Άνβζθμ-πδθχδεξ Δμαγσγή DNA από ηα εδαθηθά δείγκαηα Ζ ελαβςβή ημο DNA απυ ηα εδαθζηά δείβιαηα πμο πνμήθεακ απυ ηα πεζνάιαηα εενιμηδπίμο ηαζ αβνμφ πναβιαημπμζήεδηε ζφιθςκα ιε ηδκ πνυηοπδ ιέεμδμ ISO standard 11063, υπςξ πενζβνάθεηαζ θεπημιενχξ απυ ημοξ Petric et al., (2011) (απυ ηζξ μιάδεξ ηδξ Γαθθίαξ ηαζ ηδξ Κνμαηίαξ, ακηίζημζπα). Ζ ζοβηέκηνςζδ ηςκ επζιένμοξ δεζβιάηςκ DNA (ng ιl -1 DNA) οπμθμβίζηδηε ιε ηδ δμηζιή πμζμηζημπμίδζδξ δίηθςκμο DNA, PicoGreen (PicoGreen ds DNA quantitation assay) ζε θεμνζυιεηνμ Qubit 2v (Invitrogen, USA). Καηυπζκ ηα δείβιαηα ημο DNA ιεηαθένεδηακ ζε λδνυ πάβμ, ζημ ενβαζηήνζμ Βζμηεπκμθμβίαξ Φοηχκ ηαζ Πενζαάθθμκημξ, ημο ηιήιαημξ Βζμπδιείαξ ηαζ Βζμηεπκμθμβίαξ, ημο Πακεπζζηδιίμο Θεζζαθίαξ υπμο ιεθεηήεδηακ πεναζηένς ςξ πνμξ ηδκ επίδναζδ ημο nicosulfuron ζηα ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ ημο εδάθμοξ. 186

187 Αμηνιόγεζε ηεο επίδξαζεο ηνπ nicosulfuron ζηε ζύζηαζε ηεο θνηλόηεηαο ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο Αιπζηδσηή αληίδξαζε ηεο πνιπκεξάζεο (Polymerase Chain Reaction) Αξρή ηεο κεζόδνπ Ζ ιέεμδμξ ηδξ αθοζζδςηήξ ακηίδναζδξ ηδξ πμθοιενάζδξ (PCR) επζηνέπεζ ηδκ παναβςβή ηενάζηζμο ανζειμφ ακηζβνάθςκ επζθεβιέκςκ αθθδθμοπζχκ DNA ιε in vitro ζφκεεζδ, ζε ιζηνυ πνμκζηυ δζάζηδια (ζοκήεςξ 3-4 χνεξ). Ο παναπάκς πμθθαπθαζζαζιυξ επζηοβπάκεηαζ εκγοιζηά, ιε ηδ πνήζδ (1) εζδζηήξ DNA εενιμακεεηηζηήξ πμθοιενάζδξ ιε δναζηζηυηδηά πμο δεκ ιεηααάθθεηαζ ζε εενιμηναζίεξ έςξ ηαζ 95 μ C, (2) δφμ μθζβμκμοηθεμηζδζχκ, ζοιπθδνςιαηζηχκ ςξ πνμξ ηζξ αθθδθμοπίεξ ημο DNA-ζηυπμο, πμο μκμιάγμκηαζ εηηζκδηέξ (primers), (3) ηαηάθθδθμο δζαθφιαημξ εθεφεενςκ 5 ηνζθςζθμνζηχκ δεμλονζαμκμοηθεμηζδίςκ (dntps), απαναίηδημο βζα ηδ ζφκεεζδ ηςκ ζοιπθδνςιαηζηχκ ηθχκςκ, (4) ηαηάθθδθδξ ζοβηέκηνςζδξ δζαθφιαημξ MgCl 2 βζα ηδκ εκίζποζδ ηδξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ ηδξ πμθοιενάζδξ (5) εζδζημφ ςξ πνμξ ηδκ πμθοιενάζδ νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ βζα δζαηήνδζδ ημο ph ζε ηζιέξ ιεηαλφ ηαζ (6) ηαηάθθδθδξ πμζυηδηαξ DNA πμο παίγεζ ημ νυθμ ημο ιμνίμο-ιήηναξ. Ζ ηεπκζηή ηδξ PCR πενζθαιαάκεζ 3 ζηάδζα (Δζηυκα 3.4): (α) Σδκ απμδζάηαλδ (denaturation) ημο δίηθςκμο DNA-ζηυπμο ιε εένιακζδ ζημοξ μ C, (α) ηδκ οανζδμπμίδζδ, δδθαδή ηδκ πνυζδεζδ (annealing) ζε παιδθυηενδ εενιμηναζία (50-65 μ C) ηςκ δφμ εηηζκδηχκ ζηζξ απμδζαηαβιέκεξ ζοπθδνςιαηζηέξ αθοζίδεξ ημο DNA ηαζ (β) ηδκ επζιήηοκζδ (extension) ηςκ εηηζκδηχκ ζε εενιμηναζία μ C, ιε ηδ πνήζδ ηδξ πμθοιενάζδξ (Δζηυκα 3.4). ηδ ζοκέπεζα, ημ κεμζοκηζεέιεκμ DNA πνδζζιμπμζείηαζ ςξ εηιαβείμ βζα ηδκ πεναζηένς ζφκεεζδ DNA, ιε επακάθδρδ ηςκ ηνζχκ παναπάκς ζηαδίςκ ζε ηφηθμοξ (ζοκήεςξ ηφηθμοξ). Κάεε ηφηθμξ απμθένεζ εηεεηζηυ πμθθαπθαζζαζιυ ημο DNA ζηυπμο. Ο αέθηζζημξ ανζειυξ ηφηθςκ ελανηάηαζ απυ ηδκ ζοβηέκηνςζδ ημο DNA-ζηυπμο ηαζ ηδκ απυδμζδ ηδξ PCR ζε ηάεε ηφηθμ. Μεηά απυ μνζζιέκμοξ ηφηθμοξ ημ πνμσυκ πμο επζηναηεί είκαζ δίηθςκμ DNA, ηα 5 άηνα ημο μπμίμο ηαεμνίγμκηαζ απυ ημοξ εηηζκδηέξ (Ρμοζίδμο, 2010, Οιήνμο, 2009). 187

188 Εικόνα 3.4. χθματικι απεικόνιςθ των επιμζρουσ ςταδίων τθσ αλυςιδωτισ αντίδραςθσ τθσ πολυμεράςθσ. PCR εζσηεξηθήο έλζεζεο Γζα ηδ ιεθέηδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ ιε ηδ ιέεμδμ ιμνζαηήξ απμηφπςζδξ DGGE είκαζ απαναίηδηδ δ πνμζηυθθδζδ ζημ 5 άηνμ ιζαξ αθθδθμοπίαξ κμοηθεμηζδίςκ ειπθμοηζζιέκδξ ζε γεφβδ βμοακίκδξ ηοημζίκδξ (πενίπμο 50 γεφβδ αάζεςκ). Οζ αάζεζξ αοηέξ ζοκδέμκηαζ ιεηαλφ ημοξ ακά γεφβμξ ιε ηνείξ δεζιμφξ οδνμβυκμο (ζε ακηίεεζδ ιε ηζξ εοιίκδ-αδεκίκδ πμο ζοκδέμκηαζ ιε 2 δεζιμφξ οδνμβυκμο) ηαζ ελοπδνεημφκ ζηδκ απμθοβή ηδξ πθήνδξ απμδζάηαλδξ ημο εναφζιαημξ δίηθςκμο DNA πμο οπυηεζηαζ ζε δθεηηνμθυνδζδ ζε αολακυιεκδ ζοβηέκηνςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ. Δπζπθέμκ, ημ ιέβεεμξ ηςκ DNA αθθδθμοπζχκ πμο πνμμνίγμκηαζ βζα DGGE ακάθοζδ, δεκ εα πνέπεζ κα λεπενκά ηα γεφβδ αάζεςκ (ανζειυξ πμο οπενααίκεηαζ ιυκμ ζε ζοβηεηνζιέκεξ πενζπηχζεζξ). Γζα ημοξ παναπάκς θυβμοξ, πνζκ ηδκ δθεηηνμθυνδζδ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ ιε ααειίδςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ, ηα πνμσυκηα ηδξ πνχηδξ PCR ακηίδναζδξ, ζοκήεςξ οπμαάθθμκηαζ ζε κέα PCR εζςηενζηήξ έκεεζδξ (nested PCR). Ζ ηεπκζηή αοηή ααζίγεηαζ ζηδ πνήζδ γεφβμοξ εηηζκδηχκ πμο ακαπανάβεζ εζςηενζηυ ηιήια ηδξ ανπζηήξ αθθδθμοπίαξ DNA, πμο εκζζπφεδηε ηαηά ηδκ πνχηδ ακηίδναζδ (Δζηυκα 3.5) ηαζ παναηηδνίγεηαζ απυ ιεβαθφηενδ εοαζζεδζία ηαζ ιεβαθφηενδ ελεζδίηεοζδ απυ ηδκ ηεπκζηή ηδξ απθήξ PCR (Green, 2005). 188

189 Εικόνα 3.5. χθματικι απεικόνιςθ τθσ αντίδραςθσ PCR εςωτερικισ ζνκεςθσ. Αληηδξαζηήξηα πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ KAPATaq DNA Πμθοιενάζδ 10x KAPATaq νοειζζηζηυ δζάθοια, πμο πενζείπε 15mΜ MgCl 2 Μίβια 5 ηνζθςζθμνζηχκ δεμλονζαμκμοηθεμηζδίςκ, dntps (HT Biotechnology, UK) Αθαμοιίκδ ημο μνμφ ημο Βμδζμφ (Bovine Serum Albumin : ΒSA) (New England Biolabs, USA) Γζξ απεζηαβιέκμ ηαζ απμζηεζνςιέκμ Ζ 2 Ο (d.d H 2 O) Καηάθθδθμζ Δηηζκδηέξ ηδκ πανμφζα ιεθέηδ πνδζζιμπμζήεδηακ ηαηάθθδθμζ εηηζκδηέξ βζα ηδκ εκίζποζδ (1) ημο 16S rrna βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ ηαζ (2) ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ. Ζ δζαθμνεηζηή αοηή πνμζέββζζδ πνμέηορε θυβς ηςκ δοζημθζχκ πμο ακηζιεηςπίζαιε ζηδκ πνμζπάεεζα εκίζποζδξ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ααηηδνίςκ ιε ημοξ εηηζκδηέξ amo1f+gc ηαζ amo2r (πεναζηένς δζεοηνζκήζεζξ δίκμκηαζ ζηδκ ζογήηδζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ). ηδκ πενίπηςζδ εκίζποζδξ ηδξ 16S rrna αθθδθμοπίαξ ηςκ AOB πνδζζιμπμζήεδηε ακηίδναζδ PCR εζςηενζηήξ έκεεζδξ. Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζοκμθζηά βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ ΑΟΒ ήηακ: 1. ααμοf (5'-TGGGGRATAACGCAYCGAAAG-3') 2. ααμor (5'-AGACTCCGATCCGGACTACG-3') (McCaig et al., 1994). 3. CTO189fABC (5'-GGAGRAAAGYAGGGGATCG-3') 4. CTO654r (5'-CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC-3') (Kowalchuk et al., 1997) 189

190 5. 357f+GC (5'-CGCCCGCCGCGCGCCGCGGGCGGGGCGGGGGC- -ACGGGGGGCC TACGGGAGGGAGCAG-3') r (5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3') (Muyzer et al., 1993). Δκχ, μζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ ΑΟΑ ήηακ: 1. Α23f (5'-ATGGTCTGGCTWAGACG-3') 2. A616r (5'-GCCATCCATCTGTATGTCCA-3') (Tourna et al., 2008) Δλίζρπζε ηκήκαηνο ηνπ 16S rrna ησλ ΑΟΒ οκμθζηά, πναβιαημπμζήεδηακ ηνεζξ δζαδμπζηέξ PCR ακηζδνάζεζξ υπςξ πενζβνάθμκηαζ απυ ημοξ Karpouzas et al., (2010), ιε ιζηνέξ δζαθμνμπμζήζεζξ χζηε κα παναθδθεεί πνμσυκ ηαηάθθδθμ βζα δθεηηνμθυνδζδ ζε ζφζηδια DGGE. Καηά ηδκ πνχηδ ακηίδναζδ, ημ εδαθζηυ DNA (πείναια εενιμηδπίμο ηαζ αβνμφ) εκζζπφεδηε ιε πνήζδ ηςκ εηηζκδηχκ βαμοf ηαζ βαμοr (McCaig et al. 1994) ηαζ ημ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ είπε ιέβεεμξ 1100 γεφβδ αάζεςκ (base pairs: bp). Οζ εηηζκδηέξ αοημί πανμοζζάγμοκ ιενζηή ελεζδίηεοζδ ςξ πνμξ ηδκ εκίζποζδ ημο βμκζδίμο 16S rrna ηςκ ΑΟΒ ηαζ έπεζ ανεεεί υηζ εκζζπφμοκ ηαζ άθθα ζοββεκζηά βέκδ ααηηδνίςκ ζε ιζηνυ πμζμζηυ (McCaig et al. 1994). Ο ζοκμθζηυξ υβημξ ηδξ ακηίδναζδξ ήηακ 25ιl. Σα επζιένμοξ ζοζηαηζηά πμο πνδζζιμπμζήεδηακ, ηαεχξ ηαζ μζ εενιμηοηθμπμζδηζηέξ ζοκεήηεξ εηηέθεζδξ ηδξ ακηίδναζδξ θαίκμκηαζ ζημοξ Πίκαηεξ 3.2 ηαζ 3.3, ακηίζημζπα. 190

191 Πίλαθαο 3.2. Σα ακηζδναζηήνζα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζηδκ πνχηδ PCR βζα ηδκ εκίζποζδ ηιήιαημξ 1100 bp ημο 16S rrna βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ. Αληηδξαζηήξηα Όγθνο Σειηθή ζπγθέληξσζε 10x KAPATaq Buffer (+ 15mM MgCl 2 ) 2.5 ιl 1x buffer, 1.5mM MgCl 2 dntps (10mM) 0.5 ιl 200ιΜ απυ ημ ηαεέκα* βamof (20pmol/ιl) 0.5 ιl 0.4ιM βamor (20pmol/ιl) 0.5 ιl 0.4ιM **BSA (10ιg/ιl) 1 ιl 400ng/ιl KapaTaq Polymerase (5U/ιl) 0.2 ιl 1U/25ιl DNA 1 ιl Αναίςζδ 1:10 d.d.h 2 O οκμθζηυξ υβημξ 18.8 ιl 25 ιl * dntps: Ηζμιμνζαηυ δζάθοια πμο απμηεθείηαζ απυ ηα δεζμλοκμοηθεμηίδζα αδεκίκδξ (datp), ηοημζίκδξ (dctp), βμοακίκδξ (dgtp) ηαζ εοιίκδξ (dttp). ** Ζ αθαμοιίκδ ημο μνμφ ημο αμδζμφ (BSA) πνδζζιμπμζήεδηε ζηδκ πανμφζα ακηίδναζδ βζα κα ειπμδίζεζ ηδκ εκδεπυιεκδ ακαζημθή δνάζδξ ηδξ πμθοιενάζδξ απυ ζοζηαηζηά υπςξ ηα πμοιζηά μλέα πμο ζοκήεςξ πενζέπμκηαζ ζηα εδαθζηά ιίβιαηα. Πίλαθαο 3.3. Θενιμηοηθμπμζδηζηέξ ζοκεήηεξ PCR ακηίδναζδξ βζα ηδκ εκίζποζδ εκυξ ηιήιαημξ 1100 bp ημο 16S rrna βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ. Ανπζηή απμδζάηαλδ 94 o C 5 min Απμδζάηαλδ 94 o C 40 sec Τανζδμπμίδζδ 55 o C 30 sec 35 ηφηθμοξ Δπζιήηοκζδ 72 o C 2 min Σεθζηή επζιήηοκζδ 72 o C 5 min 191

192 ηδ ζοκέπεζα, ηo πνμσυκ ηδξ πνχηδξ PCR ακηίδναζδξ οπμαθήεδηε ζε κέα ακηίδναζδ PCR ιε πνήζδ ηςκ εηηζκδηχκ CTO189fABC ηαζ CTO654r βζα ηδκ εκίζποζδ ηιήιαημξ ηδξ αθθδθμοπίαξ ημο 16S rrna ηςκ ΑΟΒ. To ζοβηεηνζιέκμ γεφβμξ εηηζκδηχκ πανμοζζάγεζ ορδθή ηαζ απυθοηδ ελεζδίηεοζδ ςξ πνμξ ηδκ εκίζποζδ ημο 16S rrna βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ πμο ακήημοκ ζηα α-πνςηεμααηηήνζα ηαζ ηονζανπμφκ ζηα εδαθζηά μζημζοζηήιαηα (Kowalchuk et al., 1997). Ο ζοκμθζηυξ υβημξ ηδξ ακηίδναζδξ ήηακ 50ιl ηαζ ημ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ είπε ιέβεεμξ 465 bp. Σα επζιένμοξ ζοζηαηζηά πμο πνδζζιμπμζήεδηακ, ηαεχξ ηαζ μζ ζοκεήηεξ εηηέθεζδξ ηδξ ακηίδναζδξ πενζβνάθμκηαζ ζημοξ Πίκαηεξ 3.4 ηαζ 3.5, ακηίζημζπα. Πίλαθα 3.4. Ακηζδναζηήνζα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζηδκ δεφηενδ PCR (εζςηενζηήξ έκεεζδξ) βζα ηδκ εκίζποζδ ηιήιαημξ 465 bp ημο 16S rrna βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ. Αληηδξαζηήξηα Όγθνο Σειηθή ζπγθέληξσζε 10x KAPATaq Buffer (+ 15mM MgCl 2 ) 5 ιl 1x buffer, 1.5mM MgCl 2 dntps (10mM) 1 ιl 200ιΜ απυ ημ ηαεέκα CTO189fABC (10pmol/ιl) 1 ιl 0.2ιM CTO654r (10pmol/ιl) 1 ιl 0.2ιM KapaTaq Polymerase (5U/ιl) 0.2 ιl 1U/25ιl DNA d.d.h 2 O οκμθζηυξ υβημξ 1 ιl 40.8 ιl 50 ιl Πίλαθαο 3.5. Θενιμηοηθμπμζδηζηέξ ζοκεήηεξ PCR ακηίδναζδξ βζα ηδκ εκίζποζδ εκυξ ηιήιαημξ 465 bp ημο 16S rrna βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ. Ανπζηή απμδζάηαλδ 95 o C 3 min Απμδζάηαλδ 95 o C 1 min Τανζδμπμίδζδ 57 o C 1 min 30 ηφηθμοξ Δπζιήηοκζδ 72 o C 1 min Σεθζηή επζιήηοκζδ 72 o C 10 min 192

193 Σέθμξ, ημ πνμσυκ ηδξ δεφηενδξ PCR ακηίδναζδξ πνδζζιμπμζήεδηε ζε ηνίηδ PCR εζςηενζηήξ έκεεζδξ ιε ημοξ εηηζκδηέξ 357f+GC ηαζ 534r (Muyzer et al. 1993), πνμηεζιέκμο κα πνμηφρεζ πνμσυκ ηαηάθθδθμ βζα ακάθοζδ ιε ηδ ιέεμδμ DGGE. Ο ζοκμθζηυξ υβημξ ηδξ ακηίδναζδξ ήηακ 25ιl ηαζ ημ ηεθζηυ πνμσυκ είπε ιέβεεμξ 194bp. Σα επζιένμοξ ζοζηαηζηά πμο πνδζζιμπμζήεδηακ, ηαεχξ ηαζ μζ ζοκεήηεξ εηηέθεζδξ ηδξ ακηίδναζδξ θαίκμκηαζ ζημοξ Πίκαηεξ 3.6 ηαζ 3.7, ακηίζημζπα. Πίλαθα 3.6. Ακηζδναζηήνζα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζηδκ ηνίηδ PCR (εζςηενζηήξ έκεεζδξ) βζα ηδκ εκίζποζδ ηιήιαημξ 194 bp ημο 16S rrna βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ. Αληηδξαζηήξηα Όγθνο Σειηθή ζπγθέληξσζε 10x KAPATaq Buffer (+ 15mM MgCl 2 ) 2.5 ιl 1x buffer, 1.5mM MgCl 2 dntps (10mM) 0.5 ιl 200ιΜ απυ ημ ηαεέκα 357f+GC (20pmol/ιl) 0.25 ιl 0.2ιM 534r (20pmol/ιl) 0.25 ιl 0.2ιM KapaTaq Polymerase (5U/ιl) 0.2 ιl 1U/25ιl DNA 1 ιl Αναίςζδ 1:100 d.d.h 2 O οκμθζηυξ υβημξ 20.3 ιl 25 ιl Πίλαθαο 3.7. Θενιμηοηθμπμζδηζηέξ ζοκεήηεξ PCR ακηίδναζδξ βζα ηδκ εκίζποζδ εκυξ ηιήιαημξ 194 bp ημο 16S rrna βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ. Ανπζηή απμδζάηαλδ 95 o C 5 min Απμδζάηαλδ 95 o C 30 sec Τανζδμπμίδζδ 55 o C 30 sec 20 ηφηθμοξ Δπζιήηοκζδ 72 o C 30 sec Σεθζηή επζιήηοκζδ 72 o C 2 min 193

194 Δλίζρπζε ηνπ amoa γνληδίνπ ησλ ΑΟΑ Γζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ πνδζζιμπμζδεήηακ μζ εηηζκδηέξ Α23f ηαζ Α616r, υπςξ πενζβνάθεηαζ απυ ημοξ Tourna et al., (2008). Ο ζοκμθζηυξ υβημξ ηδξ ακηίδναζδξ ήηακ 50ιl ηαζ ημ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ είπε ιέβεεμξ 620 bp. Σμ πνμσυκ αοηυ ιπμνεί κα δθεηηνμθμνδεεί απεοεείαξ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ ιε ααειίδςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ, πςνίξ κα απαζηείηαζ δ ιεζμθάαδζδ πνυζεεηδξ ακηίδναζδξ PCR εζςηενζηήξ έκεεζδξ βζα ηδκ πνμζεήηδ γεοβχκ βμοακίκδξ-ηοημζίκδξ ζημ 5 άηνμ (GC-clamp). Σα επζιένμοξ ζοζηαηζηά πμο πνδζζιμπμζήεδηακ, ηαεχξ ηαζ μζ ζοκεήηεξ εηηέθεζδξ ηδξ ακηίδναζδξ θαίκμκηαζ ζημοξ Πίκαηεξ 3.8 ηαζ 3.9, ακηίζημζπα. Πίλαθα 3.8. Ακηζδναζηήνζα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζηδκ PCR βζα ηδκ εκίζποζδ ηιήιαημξ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟA. Αληηδξαζηήξηα Όγθνο Σειηθή ζπγθέληξσζε 10x KAPATaq Buffer (+ 15mM MgCl 2 ) 5 ιl 1x buffer, 1.5mM MgCl 2 dntps (10mM) 1 ιl 200ιΜ απυ ημ ηαεέκα Α23f (20pmol/ιl) 1.25 ιl 0.5ιM Α616r (20pmol/ιl) 1.25 ιl 0.5ιM BSA (10ιg/ιl) 2 ιl 400ng/ιl KapaTaq Polymerase (5U/ιl) 0.2 ιl 1U/25ιl DNA 1 ιl Αναίςζδ 1:10 d.d.h 2 O οκμθζηυξ υβημξ 38.3 ιl 50 ιl 194

195 Πίλαθαο 3.9. Θενιμηοηθμπμζδηζηέξ ζοκεήηεξ PCR ακηίδναζδξ βζα ηδκ εκίζποζδ ηιήιαημξ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟA. Ανπζηή απμδζάηαλδ 95 o C 5 min Απμδζάηαλδ 94 o C 30 sec Τανζδμπμίδζδ 55 o C 30 sec 10 ηφηθμοξ Δπζιήηοκζδ 72 o C 1 min Απμδζάηαλδ 92 o C 30 sec Τανζδμπμίδζδ 55 o C 30 sec 25 ηφηθμοξ Δπζιήηοκζδ 72 o C 1 min Σεθζηή επζιήηοκζδ 72 o C 10 min Ζιεθηξνθόξεζε ησλ PCR πξντόλησλ ζε πεθηή αγαξόδεο Αξρή ηεο κεζόδνπ Ζ δθεηηνμθυνδζδ ζε πδηηή αβανυγδξ πνδζζιμπμζείηαζ βζα ημ δζαπςνζζιυ, ηδκ ακαβκχνζζδ ηαζ ημκ ηαεανζζιυ ηιδιάηςκ DNA. Βαζίγεηαζ ζηδκ ηίκδζδ ημο ανκδηζηά θμνηζζιέκμο ιμνίμο ημο DNA ιέζα ζε πμνχδεξ πήηηςια αβανυγδξ οπυ ηδκ επίδναζδ δθεηηνζημφ πεδίμο. Σα ιυνζα ηςκ κμοηθεσηχκ μλέςκ πμο δζαθένμοκ ςξ πνμξ ημ δθεηηνζηυ θμνηίμ ημοξ, ημ ιέβεεμξ ή ηαζ ημ ζπήια ημοξ, ηζκμφκηαζ ιέζα ζημ δθεηηνζηυ πεδίμ ιε δζαθμνεηζηέξ ηαπφηδηεξ ηαζ έηζζ είκαζ δοκαηυκ κα δζαπςνζζημφκ οπυ ηαηάθθδθεξ ζοκεήηεξ, δζαηδνχκηαξ ηζξ αζμθμβζηέξ ημοξ ζδζυηδηεξ. Ζ πνχζδ ηςκ ηιδιάηςκ DNA επζηοβπάκεηαζ ιε πνςζηζηέξ υπςξ ημ ανςιζμφπμ αζείδζμ, πμο έπμοκ ηδκ ζδζυηδηα κα πνμζδέκμκηαζ ζημ DNA. Σμ ανςιζμφπμ αζείδζμ πανειαάθθεηαζ ακάιεζα ζηα κμοηθεμηίδζα ηαζ θεμνίγεζ υηακ δζεβείνεηαζ ιε οπενζχδδ αηηζκμαμθία (UV). Με έηεεζδ ηαζ παναηήνδζδ ηδξ πδηηήξ οπυ ζοκεήηεξ οπενζχδμοξ αηηζκμαμθίαξ, ηα ηιήιαηα ημο DNA ειθακίγμκηαζ ζακ ιζα 195

196 ζεζνά απυ θςηεζκέξ γχκεξ, ηαεειία απυ ηζξ μπμίεξ ακηζζημζπεί ζε ηιήια ζοβηεηνζιέκμο ιεβέεμοξ. Σμ ιέβεεμξ ημο ηάεε ηιήιαημξ DNA, ιπμνεί κα πνμζδζμνζζηεί ιεηά απυ ζφβηνζζδ ιε ιυνζα DNA βκςζημφ ιεβέεμοξ (Ρμοζίδμο, 2010). Αληηδξαζηήξηα Γζα ηδκ δθεηηνμθυνδζδ ηςκ PCR πνμσυκηςκ ζε πδηηή αβανυγδξ πνδζζιμπμζήεδηακ ηα παναηάης ακηζδναζηήνζα: Αβανυγδ Βνςιζμφπμ αζείδζμ (10 mg ml -1 ) Ροειζζηζηυ δζάθοια ΣΑΔ 1x: Πνμέηορε ιε αναίςζδ ποηκμφ δζαθφιαημξ ΣΑΔ 50x. Γζα ηδκ παναζηεοή ημο ΣΑΔ 50x, πνμζηέεδηακ ζε μβημιεηνζηή θζάθδ 1L απζμκζζιέκμ H 2 O, 242 g Tris Base, 57.1ml μλζηυ μλφ, 18.6 g EDTA ηαζ αημθμφεδζε ακάδεοζδ. Ο ηεθζηυξ υβημξ ημο δζαθφιαημξ πνμζανιυζηδηε ζημ 1L ιε απζμκζζιέκμ H 2 O ηαζ ημ ph νοειίζηδηε ζηδκ ηζιή 8.6±0.2. Ροειζζηζηυ δζάθοια θυνηςζδξ 6x (Loading buffer): Γζα ηδκ παναζηεοή ηεθζημφ υβημο δζαθφιαημξ θυνηςζδξ 10ml, πναβιαημπμζήεδηε ακάιζλδ 5 ml βθοηενυθδξ, 1 ml ηοακμφ ηδξ ανςιμθαζκυθδξ (Bromophenol blue), 0.5 ml 20x TAE ηαζ 3.5 ml d.d. H 2 O. Μίβια δεζηηχκ κμοηθεμηζδίςκ βκςζημφ ιεβέεμοξ (Quick-Load 2-Log DNA Ladder: Kb). Σα επζιένμοξ πνμσυκηα ηςκ PCR ακηζδνάζεςκ δθεηηνμθμνήεδηακ ζε πδηηέξ αβανυγδξ 1 ηαζ 1,2%, βζα ημκ έθεβπμ ηδξ πανμοζίαξ ηδξ αθθδθμοπίαξ κμοηθεμηζδίςκ ημο επζεοιδημφ ιεβέεμοξ. Γζα ηδκ παναζηεοή ηδξ πδηηήξ, ηαηάθθδθδ ηάεε θμνά πμζυηδηα αβανυγδξ δζαθφεηαζ ζε δζάθοια 1x ΣΑΔ, ιε αναζιυ. ημ δζάθοια πνμζηίεεηαζ ζηδ ζοκέπεζα δ πνςζηζηή ανςιζμφπμ αζείδζμ ιε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 0,5 ιg ml -1. Μεηά ηδ ζηενεμπμίδζδ ημο δζαθφιαημξ, δ πδηηή ειααπηίγεηαζ ζε δζάθοια 1x ΣΑΔ ηαζ αημθμοεεί θυνηςζδ 5 ή 10 ιl δείβιαημξ ακαιειεζβιέκμο ιε 1 ιl δζαθφιαημξ θυνηςζδξ. Σμ δζάθοια θυνηςζδξ επζηνέπεζ ηδκ εφημθδ ημπμεέηδζδ ηςκ δεζβιάηςκ ηαζ ηδκ παναημθμφεδζδ ηδξ ιεηαηίκδζδξ ημοξ ζηδ πδηηή. ηδκ πδηηή θμνηχκεηαζ επίζδξ 3ιl ιίβιαημξ κμοηθεμηζδίςκ βκςζημφ ιεβέεμοξ (DNA Ladder: Kb). Μεηά ηδκ ημπμεέηδζδ υθςκ ηςκ δεζβιάηςκ ζηδκ πδηηή, πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδ αμήεεζα ηνμθμδμηζημφ, δθεηηνμθυνδζδ ζηα V βζα 30 min πενίπμο. Ζ παναηήνδζδ ημο DNA ηςκ PCR πνμσυκηςκ πναβιαημπμζήεδηε ιε έηεεζδ ηδξ πδηηήξ 196

197 ζε οπενζχδδ αηηζκμαμθία ηαζ μ πνμζδζμνζζιυξ ημο ιεβέεμοξ ηςκ κμοηθεμηζδίςκ πνμέηορε ηαηά πνμζέββζζδ, ιεηά απυ ζφβηνζζδ ιε ημοξ δείηηεξ κμοηθεμηζδίςκ βκςζημφ ιεβέεμοξ Ζιεθηξνθόξεζε ζε πεθηή αθξπιακίδεο κε βαζκίδσζε απνδηαηαθηηθώλ νπζηώλ (DGGE) Ζ ανπή ηδξ ιεευδμο πενζβνάθεηαζ ζημ ηεθάθαζμ 1, πανάβναθμξ Υεκηθά αληηδξαζηήξηα πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ Αηνοθαιίδδ (Acrylamide-Bisacrylamide, 40% solution, 37.5:1, BioRad) Φμνιαιίδδ (Promega) Οονία (Promega) Ν,Ν,Ν,Ν -ηεηναιεεοθεκμ δζαιίκδ (N,N,N,Ν -tetramethylene diamine TEMED, BioRad) Γζάθοια οπενεεζσημφ αιιςκίμο (Ammonium Persulfate, APS) 10% (100mg ml -1 d.d. H 2 O) (Sigma, Germany) Ροειζζηζηυ δζάθοια ΣΑΔ 50x ηαζ 1x Δμνπιηζκόο Υνδζζιμπμζήεδηε πθήνεξ ζφζηδια δθεηηνμθυνδζδξ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ ιε ααειίδςζδ ηδξ ζοβηέκηςζδξ ηςκ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ (DGGE), INGENY phoru-2x2 (Ingeny International BV, the Netherlands). Εικόνα 3.6. φςτθμα INGENY phoru-2x2. 197

198 Πξνεηνηκαζία δηαιπκάησλ θαη παξαζθεπή ηεο πεθηήο αθξπιακίδεο Γζα ηδκ δθεηηνμθυνδζδ ηςκ PCR πνμσυκηςκ πμο πνυεηορακ απυ ηδκ εκίζποζδ ηςκ 16S rrna ηαζ amoa βμκζδίςκ ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ ακηίζημζπα πνδζζιμπμζήεδηε πδηηή αηνοθαιίδδξ ζοβηέκηνςζδξ 8% (α/μ). Ανπζηά παναζηεοάζηδηακ δζαθφιαηα ηςκ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ, μονίαξ ηαζ θμνιαιίδδξ, ζε ζοβηεκηνχζεζξ 0% ηαζ 100%, υπςξ πενζβνάθεηαζ ζημκ πίκαηα πμο αημθμοεεί (Πίκαηαξ 3.10). Πίλαθαο Παναζηεοή δζαθοιάηςκ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ Γηαιύκαηα απνδηαηαθηηθώλ νπζηώλ 0% 100% Αηνοθαιίδδ (40%) 20 ml 20 ml Φμνιαιίδδ - 40 ml Οονία - 42g 50x TAE 2 ml 2 ml Απζμκζζιέκμ H 2 O ιέπνζξ υβημο: 100 ml 100 ml ηδ ζοκέπεζα ηα δζαθφιαηα ηςκ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ (0% ηαζ 100%) ακαιίπεδηακ ζε ηαηάθθδθεξ ακαθμβίεξ βζα ηδκ πνμεημζιαζία δζαθοιάηςκ ιε ορδθή ηαζ παιδθή ζοβηέκηνςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ ζημ επζεοιδηυ εφνμξ. Γζα ηα ΑΟΒ παναζηεοάζηδηε πδηηή ιε ααειίδςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ 45-62%, εκχ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ΑΟΑ δ ααειίδςζδ ηοιάκεδηε ιεηαλφ 30-50%. Σα παναπάκς εφνδ ααειίδςζδξ απμδζαηαηηζηχκ μοζίςκ επζθέπεδηακ φζηενα απυ δμηζιέξ ηαζ ζφιθςκα ιε ηδκ αζαθζμβναθία. ημκ πίκαηα πμο αημθμοεεί, θαίκμκηαζ μζ υβημζ ηςκ δζαθοιάηςκ 0% ηαζ 100% ηςκ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ πμο ακαιίπεδηακ χζηε κα πνμηφρμοκ ηα επζιένμοξ δζαθφιαηα παιδθήξ ηαζ ορδθήξ ζοβηέκηνςζδξ, ηεθζημφ υβημο 25 ml. 198

199 Πίλαθαο Παναζηεοή δζαθοιάηςκ ιε ορδθή ηαζ παιδθή ζοβηέκηνςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ. Οκάδα κηθξννξγαληζκώλ % πγθέληξσζε απνδηαηαθηηθώλ νπζηώλ Όγθνο δηαιύκαηνο 0% (ml) Όγθνο δηαιύκαηνο 100% (ml) Νηηξσδνπνηεηηθά Βαθηήξηα Νηηξσδνπνηεηηθά Αξραία ηα δζαθφιαηα ηςκ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ παιδθήξ ηαζ ορδθήξ ζοβηέκηνςζδξ, θίβμ πνζκ λεηζκήζεζ δ ακάιζλδ ημοξ πνμζηέεδηακ 100ιl δζαθφιαημξ APS ηαζ 10 ιl δζαθφιαημξ TEMED, βζα ημκ πμθοιενζζιυ ηδξ αηνοθαιίδδξ. Παξαζθεπή ηεο πεθηήο αθξπιακίδεο Ζ πνμεημζιαζία ηδξ πδηηήξ αηνοθαιίδδξ έβζκε ιε ηδ πνήζδ ηαηάθθδθμο ζοζηήιαημξ ακάιζλδξ (Δζηυκα 3.7) ηςκ δζαθοιάηςκ ορδθήξ (Α) ηαζ παιδθήξ ζοβηέκηνςζδξ (Β) απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ ζοκδεδειέκμ ιε πενζζηαθηζηή ακηθία βζα ηδ ιεηαθμνά ημο δζαθφιαημξ αηνοθαιίδδξ ζημ ζφζηδια πθαηχκ INGENY. Γζα ηδ δδιζμονβία ηςκ ηεθζχκ θυνηςζδξ ημο δείβιαημξ ζηδκ πδηηή, πνδζζιμπμζμφκηακ ηάεε θμνά 5 ml δζαθφιαημξ αηνοθαιίδδξ 0% ζε απμδζαηαηηζηέξ μοζίεξ (stacker), ζημ μπμίμ πνμζεέημκηακ 50ιl δζαθφιαημξ APS ηαζ 5 ιl δζαθφιαημξ TEMED. Σμ δζάθοια αοηυ ιεηαθένμκηακ ιε ηδ αμήεεζα ζφνζββαξ, 15 min ιεηά ηδκ πθήνδ ιεηαθμνά ημο δζαθφιαημξ αηνοθαιίδδξ, ζημ ζφζηδια πθαηχκ INGENY. Εικόνα 3.7. Παραςκευι τθσ πθκτισ ακρυλαμίδθσ με βακμίδωςθ αποδιατακτικϊν ουςιϊν. 199

200 Ζιεθηξνθόξεζε ησλ δεηγκάησλ Μεηά ηδκ μθμηθήνςζδ ημο πμθοιενζζιμφ ηδξ αηνοθαιίδδξ (πενίπμο 1 χνα ηαζ 30 θεπηά), ημ ζφζηδια πθαηχκ INGENY ημπμεεημφκηακ ζε εζδζηή δελαιεκή πμο πενζείπε νοειζζηζηυ δζάθοια ΣΑΔ 1x. Αημθμφεςξ, ιεηαθένμκηακ ιε ηδ αμήεεζα πζπέηαξ ζηα ηεθζά ηδξ πδηηήξ ηαηάθθδθδ πμζυηδηα PCR πνμσυκημξ, ακαιειζβιέκμο ιε νοειζζηζηυ δζάθοια θυνηςζδξ (loading buffer). οβηεηνζιέκα, ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ΑΟΒ 1ιl PCR πνμσυκημξ ακαιζβκφμκηακ ιε 5 ιl δζαθφιαημξ θυνηςζδξ, εκχ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ΑΟΑ 3ιl PCR πνμσυκημξ ακαιζβκφμκηακ ιε 7 ιl δζαθφιαημξ θυνηςζδξ. Ζ δθεηηνμθυνδζδ πναβιαημπμζμφκηακ ιε ηδ αμήεεζα ηνμθμδμηζημφ, ζηα 75 V βζα 960 min εκχ δ εενιμηναζία ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ ζημ εζςηενζηυ ηδξ δελαιεκήξ δθεηηνμθυνδζδξ δζαηδνμφκηακ ζημοξ 60 C. Βαθή ηεο πεθηήο αθξπιακίδεο κε ηε κέζνδν ηνπ ληηξηθνύ αξγύξνπ (AgNO 3 ) Υεκηθά αληηδξαζηήξηα Αζεακυθδ Ολζηυ μλφ AgNO 3 (Νζηνζηυξ άνβονμξ) NaBH 4 (Νάηνζμ αυνζμ οδνίδζμ) NaOH 1,5 % (α/μ) Φμνιαθδεῢδδ Παξαζθεπή δηαιπκάησλ Γζάθοια Πνυζδεζδξ I : ε μβημιεηνζηή θζάθδ ημο 1L ιεηαθένεηαζ 100 ml ηαεανήξ αζεακυθδξ ηαζ 5 ml μλζημφ μλέμξ ηαζ μ υβημξ ζοιπθδνχκεηαζ ιέπνζ ηδ παναβή ιε απζμκζζιέκμ Ζ 2 Ο. Γζάθοια Bαθήξ: ε μβημιεηνζηή θζάθδ ημο 1L ιεηαθένεηαζ 1g AgNO 3 ηαζ μ υβημξ ζοιπθδνχκεηαζ ιέπνζ ηδ παναβή ιε απζμκζζιέκμ Ζ 2 Ο. Γζάθοια Eιθάκζζδξ: ε μβημιεηνζηή θζάθδ ημο 1L, πνμζηίεεηαζ ανπζηά 400 ml απζμκζζιέκμο Ζ 2 Ο ηαζ 15 g NaOH ηαζ αημθμοεεί ακάδεοζδ ιέπνζ κα επζηεοπεεί πθήνδξ δζάθοζδ. ηδ ζοκέπεζα πνμζηίεεηαζ ζημ δζάθοια 0.1 g NaBH 4 ηαζ 4ml θμνιαθδεΰδδξ ηαζ μ υβημξ ζοιπθδνχκεηαζ ιέπνζ ηδ παναβή ιε απζμκζζιέκμ Ζ 2 Ο. 200

201 Γηαδηθαζία βαθήο ησλ πεθηώλ αθξπιακίδεο Μεηά ηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ δθεηηνμθυνδζδξ, δ πδηηή αηνοθαιίδδξ απμιαηνφκεδηε απυ ηδ ζοζηεοή INGENY, ημπμεεηήεδηε ζε πθαζηζηυ θζθι βζα κα ηαηαζηεί εφημθμξ μ πεζνζζιυξ ηδξ, ιεηαθένεδηε ζε πθαζηζηυ δμπείμ ηαζ λεπθφεδηε εθαθνχξ ιε απζμκζζιέκμ κενυ. ηδ ζοκέπεζα, ζημ πθαζηζηυ δμπείμ πνμζηέεδηακ 500 ml απυ ημ δζάθοια πνυζδεζδξ I ηαζ αημθμφεδζε ακαηίκδζδ ζε μνζγυκηζμ ακαδεοηήνα (orbital shaker), βζα 2 χνεξ. Αιέζςξ ιεηά, ημ δζάθοια πνυζδεζδξ I απμιαηνφκεδηε, δ πδηηή λεπθφεδηε ιε απζμκζζιέκμ κενυ ηαζ ζημ πθαζηζηυ δμπείμ ημπμεεηήεδηακ 500 ml απυ ημ δζάθοια ααθήξ ημο AgNO 3 ηαζ αημθμφεδζε ακαηίκδζδ βζα 20 min. Καηυπζκ, ημ δζάθοια ααθήξ απμιαηνφκεδηε, δ πδηηή λεπθφεδηε ιε απζμκζζιέκμ κενυ ηαζ ζημ πθαζηζηυ δμπείμ πνμζηέεδηακ 500 ml απυ ημ δζάθοια ειθάκζζδξ. Αημθμφεδζε ιζα ηεθεοηαία ακαηίκδζδ δζάνηεζαξ πενίπμο 10 min ιέπνζ ηδκ ειθάκζζδ ηςκ γςκχκ ηαζ ιεηά ημ δζάθοια ειθάκζζδξ απμιαηνφκεδηε ηαζ δ πδηηή λεπθφεδηε βζα ηεθεοηαία θμνά ιε απζμκζζιέκμ κενυ. Ζ πδηηή ημπμεεηήεδηε ζε ηνάπεγα θςηυξ ηαζ θςημβναθήεδηε ιε ρδθζαηή θςημβναθζηή ιδπακή ορδθήξ ακάθοζδξ. Σέθμξ, μζ θςημβναθίεξ απυ ηζξ πδηηέξ ιεηαηνάπδηακ ζε ανπεία ηαηάθθδθδξ ιμνθήξ (.bmp) ηαζ ρδθζμπμζήεδηακ, πνμηεζιέκμο κα οπμαθδεμφκ ζε ηαηάθθδθδ ζηαηζζηζηή επελενβαζία ηαηηζηηθή αλάιπζε ησλ απνηειεζκάησλ κνξηαθήο απνηύπσζεο κε ηελ κέζνδν DGGE Οζ εζηυκεξ ηςκ πδηηςιάηςκ DGGE ιεηαηνάπδηακ ζε δεδμιέκα δοαδζηήξ ιμνθήξ (binary data), ακάθμβα ιε ηδκ πανμοζία ή απμοζία γςκχκ DNA ζημ ιμνζαηυ απμηφπςια, ιε πνήζδ ημο εθεφεενμο θμβζζιζημφ παηέημο CrossChecker (Wageningen, Netherlands). ηδ ζοκέπεζα, ηα δεδμιέκα δοαδζηήξ ιμνθήξ ακαθφεδηακ ιε ηδ ιέεμδμ πμθοιεηααθδηυηδηαξ ηςκ Κφνζςκ οκηεηαβιέκςκ (Principal Coordinates Analysis, PCoA) χζηε κα αλζμθμβδεεί δ επίδναζδ ηςκ δζαθμνεηζηχκ δυζεςκ ημο nicosulfuron ζε ηάεε ηφηθμ επέιααζδξ (πείναια εενιμηδπίμο) ή ηςκ δυζεςκ ηαζ ημο πνυκμο δεζβιαημθδρίαξ (πείναια αβνμφ), ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ. Οζ ηζιέξ ηςκ δφμ Κφνζςκ οκηεηαβιέκςκ (PCμ1 ηαζ PCμ2) πμο πενζεθάιαακακ ημ ιεβαθφηενμ ημιιάηζ ηδξ παναθθαηηζηυηδηαξ (>50%) ηςκ δεδμιέκςκ, πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ηαηαζηεοή δζαβναιιάηςκ ηαηακμιήξ (ordination) ηςκ δεζβιάηςκ ιε αάζδ ηζξ ακελάνηδηεξ ιεηααθδηέξ πμο ζηδκ πνμηεζιέκδ πενίπηςζδ 201

202 ήηακ ηα δζαθμνεηζηά επίπεδα δυζεςκ ημο nicosulfuron (πείναια εενιμηδπίμο ηαζ αβνμφ) ηαζ μζ πνυκμζ δεζβιαημθδρίαξ (πείναια αβνμφ). ηζξ πενζπηχζεζξ υπμο μζ δφμ ηφνζεξ οκηεηαβιέκεξ πενζέβναθακ πμζμζηυ < 50% ηδξ παναθθαηηζηυηδηαξ ηςκ δεδμιέκςκ, μζ έλζ πνχηεξ ζοκηεηαβιέκεξ πμο πνμέηορακ απυ ηδκ ακάθοζδ ηςκ Κφνζςκ οκηεηαβιέκςκ οπμαθήεδηακ ζε πεναζηένς Ακάθοζδ Κακμκζηχκ Μεηααθδηχκ (Canonical Variate Analysis, CVA) υπςξ έπεζ πενζβναθεί ήδδ ζημ ηεθάθαζμ 2 (πανάβναθμξ 2.3.6). Όθεξ μζ παναπάκς ζηαηζζηζηέξ ακαθφζεζξ πναβιαημπμζήεδηακ ιε ημ ζηαηζζηζηυ παηέημ Genstat 11.0v Δπίδξαζε ηνπ nicosulfuron ζηελ αθζνλία ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο Αξρή ηεο κεζόδνπ PCR πξαγκαηηθνύ ρξόλνπ Ζ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο απμηεθεί παναθθαβή ηδξ ζοιααηζηήξ PCR ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ βζα ημκ πμθθαπθαζζαζιυ, ηδκ ακίπκεοζδ ηαζ ηδκ πμζμηζημπμίδζδ εκυξ ζοβηεηνζιέκμο ηιήιαημξ DNA ζε πναβιαηζηυ πνυκμ. Ζ ζδζαζηενυηδηα ηδξ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο έβηεζηαζ ζηδ δοκαηυηδηα παναημθμφεδζδξ ηαζ ηαηαβναθήξ ηδξ εκίζποζδξ ημο DNA ζε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ ακηίδναζδξ ιε ηδ πνήζδ θεμνζγυκηςκ πνςζηζηχκ. ηδ ζοβηεηνζιέκδ ιεθέηδ ηα πνμσυκηα ηδξ PCR ακζπκεφηδηακ ιε ηδκ αμήεεζα ηδξ πνςζηζηήξ SYBR Green, δ μπμία πνμζδέκεηαζ ζημ DNA ηαζ εηπέιπεζ θεμνζζιυ ιυκμ υηακ πανειαάθθεηαζ ζηδκ δζπθή έθζηα (Δζηυκα 3.8). Ζ πνςζηζηή SYBR Green δεκ είκαζ εζδζηή βζα ηδ ζοβηεηνζιέκδ αθθδθμοπία πμο πμθθαπθαζζάγεηαζ. Ακηίεεηα, δεζιεφεηαζ ζε μπμζμδήπμηε δίηθςκμ ηιήια DNA οπάνπεζ ζημ δζάθοια. οκεπχξ, δ δζαθμνμπμίδζδ ιεηαλφ ημο θεμνζζιμφ πμο εηπέιπεηαζ απυ ημ ιυνζμ-ζηυπμ απυ ημκ θεμνζζιυ άθθςκ δίηθςκςκ ηιδιάηςκ DNA πμο είκαζ δοκαηυκ κα οπάνπμοκ ζημ δζάθοια, είκαζ ακαβηαία. Γζα ημ θυβμ αοηυ ιεηά ηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ εκίζποζδξ είκαζ απαναίηδηδ δ ακάθοζδ ηαιπφθδξ απμδζάηαλδξ (dissociation curve), δ μπμία δζεοημθφκεζ ηδκ δζαδζηαζία αεθηζζημπμίδζδξ ηςκ ζοκεδηχκ. Ζ ηαιπφθδ απμδζάηαλδξ δίκεζ ηδ δοκαηυηδηα δζαπςνζζιμφ ημο θεμνζζιμφ πμο πνμηφπηεζ απυ ηδκ εκίζποζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ-ζηυπμο απυ ημοξ θεμνζζιμφξ πμο μθείθμκηαζ ζηα δζιενή ηςκ εηηζκδηχκ ή ζε ιδ εζδζηά πνμσυκηα. 202

203 Εικόνα 3.8. Λειτουργία χρωςτικισ SYBR Green. Όταν θ χρωςτικι βρίςκεται ελεφκερθ ςτο διάλυμα δεν παράγεται φκοριςμόσ (αριςτερά). Η ενςωμάτωςισ τθσ ςτο DNA κατά τθ ςφνκεςι του ςε ςυνδυαςμό με τθ διζγερςι τθσ με ακτινοβολία κατάλλθλου μικουσ κφματοσ, ζχει ωσ αποτζλεςμα τθν παραγωγι φκοριςμοφ (δεξιά). Η ζνταςθ του φκοριςμοφ αυτοφ είναι ανάλογθ τθσ ςυγκζντρωςθσ του παραγόμενου προϊόντοσ. Οζ πθδνμθμνίεξ πμο θαιαάκμκηαζ απυ ηδκ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ηαηαβνάθμκηαζ ιε ηδ ιμνθή βναθδιάηςκ, ςξ ηαιπφθεξ εκίζποζδξ, ηαζ ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα ηδκ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ανπζηχκ πμζμηήηςκ DNA ιε αηνίαεζα βζα ιεβάθμ εφνμξ πμζμηήηςκ. Ζ ηαιπφθδ εκίζποζδξ ηδξ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ιπμνεί κα πςνζζηεί ζε 4 θάζεζξ. Σδκ θάζδ ζηδκ μπμία ηα επίπεδα ημο εκδμβεκή θεμνζζιμφ (background fluorescence) είκαζ ορδθυηενα απυ ηα επίπεδα ημο θεμνζζιμφ πμο πνμένπεηαζ απυ ηα πνμσυκηα ηςκ πνχηςκ ηφηθςκ ηδξ PCR, ηδκ εηεεηζηή θάζδ (exponential), ηδκ βναιιζηή θάζδ (linear) ηαζ ηδκ θάζδ ημνεζιμφ (plateau). Καηά ηδκ δζάνηεζα ηδξ εηεεηζηήξ θάζδξ εκίζποζδξ, δ πμζυηδηα ηςκ ζοκηζεέιεκςκ πνμσυκηςκ είκαζ ακάθμβδ ηδξ ανπζηήξ πμζυηδηαξ ηαζ ηαηά ηδκ δζάνηεζα αοηήξ ηδξ θάζδξ βίκεηαζ δ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ άβκςζηςκ δεζβιάηςκ. Καηά ηδ βναιιζηή θάζδ παναηδνείηαζ ιεζςιέκδ παναβςβή ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο ζηυπμο, θυβς ιείςζδξ ηςκ ακηζδναζηδνίςκ, εκχ ηαηά ηδ θάζδ ημνεζιμφ, δ ακηίδναζδ ηαζ παναβςβή κέςκ ακηζβνάθςκ έπεζ μθμηθδνςεεί θυβς ελάκηθδζδξ ηςκ ακηζδναζηδνίςκ. διακηζηή πανάιεηνμ βζα ηδκ πμζμηζημπμίδζδ απμηεθεί ή ηζιή Ct, πμο μνίγεηαζ ςξ μ ηφηθμξ ηαηά ημκ μπμίμ δ έκηαζδ ημο θεμνζζιμφ λεπενκά ιζα ηζιή-ηαηχθθζ (threshold) ηαζ δ εκίζποζδ ηςκ πνμσυκηςκ πενκά ζηδ εηεεηζηή θάζδ αφλδζδξ. Ζ ηζιή Ct είκαζ ακηζζηνυθςξ ακάθμβδ ηδξ θμβανζειζηήξ ηζιήξ ηδξ ανπζηήξ ζοβηέκηνςζδξ ημο βμκζδίμο-ζηυπμο. οκεπχξ, υζμ ορδθυηενδ είκαζ δ ανπζηή ζοβηέκηνςζδ ημο βμκζδίμο ζηυπμο ηυζμ ιζηνυηενδ είκαζ δ ηζιή Ct. 203

204 Ζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ανπζηχκ αθθδθμοπζχκ-ζηυπςκ εκυξ δείβιαημξ ιε άβκςζηδ ζοβηέκηνςζδ βίκεηαζ ιε απυθοημ ή ζπεηζηυ πνμζδζμνζζιυ ηςκ Ct ηζιχκ. ηδ ζοβηεηνζιέκδ ιεθέηδ έβζκε απυθοηδ πμζμηζημπμίδζδ ηαζ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ βμκζδίςκ ζηυπςκ ζηα οπυ ελέηαζδ «άβκςζηα» δείβιαηα ηαηαζηεοάζηδηε ηαιπφθδ ακαθμνάξ ιε εκίζποζδ ημο βμκζδίμο-ζηυπμο απυ δζαδμπζηέξ αναζχζεζξ ακαζοκδοαζιέκςκ πθαζιζδίςκ βκςζηήξ ζοβηέκηνςζδξ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηαεμνίζηδηακ μζ Ct ηζιέξ ηάεε ζοβηέκηνςζδξ. Ζ ηαιπφθδ ακαθμνάξ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ άβκςζηςκ δεζβιάηςκ ιε αάζδ ηζξ Ct ηζιέξ ημοξ. ηδκ πνάλδ, ιία αλζυπζζηδ ηαιπφθδ ακαθμνάξ πνέπεζ κα έπεζ ηα ελήξ παναηηδνζζηζηά: ηζιή R 2 > 0.95, ηθίζδ πμο κα ηοιαίκεηαζ απυ -3.0 έςξ -3.9 ηαζ απμηεθεζιαηζηυηδηα ηδξ ακηίδναζδξ PCR, ιεηαλφ % (Ρμοζίδμο, 2010, Zhang and Fang, 2006) Πνζνηηθνπνίεζε ησλ amoa γνληδίσλ ησλ ΑΟΑ θαη ΑΟΒ κε PCR πξαγκαηηθνύ ρξόλνπ Πνμηεζιέκμο κα εηηζιδεεί δ επίδναζδ ημο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ (ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ), πναβιαημπμζήεδηε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ζηα δείβιαηα DNA απυ ηα πεζνάιαηα εενιμηδπίμο ηαζ αβνμφ πμο πενζβνάθδηακ παναπάκς. ηδκ πενίπηςζδ αοηή πνδζζιμπμζδεήηακ ηα γεοβάνζα εηηζκδηχκ amoa1f/amoa2r ηαζ Arch-amoAF/ArchamoAR βζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ ακηίζημζπα (Πίκαηεξ 3.12, 3.13). Σμ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ πμο πνμέηορε απυ ηδκ ακηίδναζδ βζα ηα ΑΟΒ είπε ιέβεεμξ 491bp ηαζ ημ ακηίζημζπμ βζα ηα ΑΟΑ είπε ιέβεεμξ 635 bp. Σα οθζηά ηαζ μζ ζοκεήηεξ πναβιαημπμίδζδξ ηςκ ακηζδνάζεςκ ηδξ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο θαίκμκηαζ ζημοξ πίκαηεξ 3.14 ηαζ Ζ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο πναβιαημπμζήεδηε ζε ζφζηδια Μx3000P qpcr (Stratagen, UK). Πίλαθαο Δηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ ιε ηδκ ιέεμδμ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο. Δθθηλεηήο Αιιεινπρία Αλαθνξά amoa-1f amoa-2r 5'- GGGGTTTCTACTGGTGGT-3' 5'-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3' K = G or T, S = G or C Rotthauwe et al.,

205 Πίλαθαο Δηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ ιε ηδκ ιέεμδμ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο Δθθηλεηήο Αιιεινπρία Αλαθνξά Arch-amoAF Arch-amoAR 5'- STAATGGTCTGGCTTAGACG-3 5'-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3' Francis et al., 2005 Πίλαθαο Σα ακηζδναζηήνζα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο βζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ. Αληηδξαζηήξηα Όγθνο Σειηθή ζπγθέληξσζε KAPA SYBR FAST qpcr Master Mix (2x) Universal Forward primer (20pmol/ιl) AOB: AmoA1F AOA: Arch-amoAF Reverse primer (20pmol/ιl) AOB: AmoA2R AOA: Arch-amoAR 10 ιl 1X 0,2 ιl 0.2ιM 0,2 ιl 0.2ιM Rox Low (50X)* 0,4 ιl 1X BSA (10ιg ιl -1 ) 0,8 ιl 400ng ιl -1 DNA ddh 2 O οκμθζηυξ υβημξ 1 ιl 7,4 ιl 20 ιl * ROX Low: Ζ ROX Low είκαζ πνςζηζηή ακαθμνάξ δ μπμία πνμζηίεεηαζ ζε ηάεε ακηίδναζδ βζα κα ελζζμννμπεί ηζξ ιζηνέξ απμηθίζεζξ πμο πνμηαθμφκηαζ ακάιεζα ζε δζαθμνεηζηέξ ακηζδνάζεζξ θυβς θάεμοξ ζημ πζπεηάνζζια ή δζαηοιάκζεςκ ημο ιδπακήιαημξ. Ο θεμνζζιυξ θυβς ηδξ πνςζηζηήξ ROX πνέπεζ κα παναιέκεζ ζηαεενυξ ζε ηάεε πείναια, ελαζθαθίγμκηαξ ιία ζηαεενή βναιιή αάζδξ. 205

206 Πίλαθαο Οζ εενιμηοηθμπμζδηζηέξ ζοκεήηεξ βζα ηδκ πμζμηζημπμίδζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ιε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο Δκενβμπμίδζδ εκγφιμο 95 o C 3 min 1 ηφηθμξ Aπμδζάηαλδ Τανζδμπμίδζδ Δπζιήηοκζδ 95 o C AOB 55 o C AOA 53 o C 72 o C 15sec 30sec 30sec 45sec ΑΟΒ: 40 ηφηθμοξ ΑΟΑ: 45 ηφηθμοξ 95 o C 1min Καιπφθδ απμδζάηαλδξ ΑΟΒ 55 o C ΑΟΑ 51 o C 30sec 30sec 1 ηφηθμξ 95 o C 30 sec Καηαζθεπή θακπύιεο αλαθνξάο Αληηδξαζηήξηα PCR clean up kit (Macherey-Nagel) pgem-t Easy vector systems (Promega) ΝucleoSpin Plasmid Kit (MACHEREY-NAGEL) Γεηηζηά E.coli ηφηηανα (DH5a) Θνεπηζηυ ιέζμ LB: 10g NaCl, 10g ηαγεΐκδ, 5g Yeast extract ηαζ 15g άβαν (βζα ηδκ παναζηεοή ηνοαθίςκ LB) δζαθφμκηαζ ζε 1L απζμκζζιέκμ H 2 O ηαζ απμζηεζνχκμκηαζ. Αιπζηζθθίκδ: ζοβηέκηνςζδ πνυηοπμο δζαθφιαημξ 100mg ml -1 ζε κενυ, απμζηείνςζδ ιε θίθηνμ. Υνδζζιμπμζείηαζ ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 100ιg ml -1 (θοθάζζεηαζ ζημοξ -20:C). IPTG (0.1M): 0.238g IPTG δζαθφμκηαζ ζε 10ml d.d.h 2 O ηαζ ημ δζάθοια απμζηεζνχκεηαζ ιε θίθηνμ (θοθάζζεηαζ ζημοξ 4:C). X-GAL (2%): 0.2g X-GAL δζαθφμκηαζ ζε 10ml δζιεεοθμθμνιαιίδζμ ηαζ ημ δζάθοια απμζηεζνχκεηαζ (θοθάζζεηαζ ζημοξ -20:C). 206

207 Κακπύιεο αλαθνξάο Γζα ηδκ απυθοηδ πμζμηζημπμίδζδ ημο ανζειμφ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ζηα πενζααθθμκηζηά δείβιαηα απυ ηα πεζνάιαηα εενιμηδπίμο ηαζ αβνμφ, ηαηαζηεοάζηδηακ ηαιπφθεξ ακαθμνάξ. Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ημοξ πνδζζιμπμζήεδηακ αναζχζεζξ πθαζιζδίςκ βκςζηήξ ζοβηέκηνςζδξ πμο πενζείπακ ςξ έκεεια ημ βμκίδζμ amoa. Παναηάης πενζβνάθεηαζ ακαθοηζηά δ ζοκμθζηή δζαδζηαζία πμο αημθμοεήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηςκ πνυηοπςκ ηαιποθχκ ακαθμνάξ, βζα ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ. Ανπζηά, πναβιαημπμζήεδηε PCR εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ (εηηζκδηέξ: amoa1f ηαζ amoa2r) ηαζ ΑΟΑ (εηηζκδηέξ: Arch-amoAF ηαζ ArchamoAR) απυ έκα πενζααθθμκηζηυ δείβια. Αημθμφεδζε ηαεανζζιυξ ηςκ πνμσυκηςκ ηδξ PCR ακηίδναζδξ ιε ημ ηζη NucleoSpin Extract II ηδξ Macherey-Nagel. ηδ ζοκέπεζα αημθμφεδζε έκεεζδ ημο ηαεανζζιέκμο ηιήιαημξ DNA ζημκ πθαζιζδζαηυ θμνέα pgem-t Easy (Promega) ζφιθςκα ιε ημ πνςηυημθθμ ημο ηαηαζηεοαζηή. Αημθμφεδζε εζζαβςβή ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα ιε ιεηαζπδιαηζζιυ ζε δεηηζηά ηφηηανα E.coli DH5α υπςξ πενζβνάθεηαζ παναηάης. οβηεηνζιέκα, ζε 90 ιl δεηηζηχκ ηοηηάνςκ πνμζηέεδηακ 5 ιl απυ ηδκ ακηίδναζδ ηδξ θζβάζδξ ηαζ ημ ιίβια ακαηζκήεδηε εθαθνά. Αημθμφεδζε επχαζδ ζημκ πάβμ βζα 30min ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πνμηθήεδηε εενιζηυ ζμη ζημοξ 42:C βζα 55 sec. Σα ηφηηανα επακαημπμεεηήεδηακ ζημκ πάβμ βζα 2 min ηαζ πνμζηέεδηακ 200ιl LB. Αημθμφεδζε επχαζδ ζημοξ 37:C βζα 60 min. ηδ ζοκέπεζα, πνμζηέεδηακ ζηα ηφηηανα 50 ιl X-GAL (2%) ηαζ 10 ιl IPTG (0,1Μ) ηαζ μ ζοκμθζηυξ υβημξ ηδξ ηαθθζένβεζαξ επζζηνχεδηε ζε ηνοαθία ενεπηζημφ οπμζηνχιαημξ LB ιε αιπζηζθθίκδ (100 ιg ml -1 ). Σα ηνοαθία επςάζηδηακ ζημοξ 37:C βζα 16 χνεξ. Μεηά ηδκ ακάπηολδ ηςκ απμζηζχκ, πναβιαημπμζήεδηε επζθμβή θεοηχκ απμζηζχκ ηαζ ειαμθζαζιυξ ημοξ ζε 5 ml ενεπηζημφ δζαθφιαημξ LB ιε αιπζηζθθίκδ. Αημθμφεδζε επχαζδ ιε ζοκεπή ακάδεοζδ ζημοξ 37:C βζα 16 χνεξ. Μεηά ημ πέναξ ηςκ 16 ςνχκ, πναβιαημπμζήεδηε απμιυκςζδ ημο πθαζιζδζαημφ DNA ιε ημ ηζη ΝucleoSpin Plasmid (MACHEREY-NAGEL) ηαζ ζφιθςκα ιε ημ πνςηυημθθμ ημο ηαηαζηεοαζηή. ηα πθαζιίδζα πμο απμιμκχεδηακ εθανιυζηδηε PCR ιε ηα γεφβδ εηηζκδηχκ amoa1f/amoa2r βζα ηα ΑΟΒ ηαζ Arch-amoAF/ArchamoAR βζα ηα ΑΟΑ βζα ηδκ επζαεααίςζδ ηδξ φπανλδξ ημο amoa βμκζδίμο. Αημθμφεδζε θςημιέηνδζδ (260nm) ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ πθαζιζδίςκ (Eppendorf Biophotometer) ηαζ ιεηαηνμπή ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ζε ανζειυ ακηζβνάθςκ ζφιθςκα ιε ημκ ηφπμ (Whelan et al., 2003): 207

208 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) Σέθμξ, πναβιαημπμζήεδηακ δζαδμπζηέξ αναζχζεζξ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηςκ ηαιποθχκ ακαθμνάξ ηαηηζηηθή αλάιπζε ησλ απνηειεζκάησλ ηεο PCR πξαγκαηηθνύ ρξόλνπ Οζ ανζειμί ηςκ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΒ ηαζ ηςκ ΑΟΑ ζηα δείβιαηα εδάθμοξ απυ ηα πεζνάιαηα εενιμηδπίμο ηαζ αβνμφ πμο πνμέηορακ απυ ηδκ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ιεηαηνάπδηακ ζε ανζειμφξ ακηζβνάθςκ βμκζδίςκ ακά ng DNA, πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ηεθζηά ζηδκ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ. Ζ επίδναζδ ηςκ δζαθμνεηζηχκ δυζεςκ ημο nicosulfuron αθθά ηαζ ημο πνυκμο δεζβιαημθδρίαξ ηαζ μζ πζεακέξ αθθδθεπζδνάζεζξ αοηχκ ηςκ παναβυκηςκ ζημοξ ανζειμφξ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΒ ηαζ ηςκ ΑΟΑ ζημ πείναια αβνμφ αλζμθμβήεδηε ιε Ακάθοζδ Γζαηφιακζδξ Γομ Παναβυκηςκ (two-way ANOVA) ηαζ βζα ηδ ζφβηνζζδ ηςκ ιέζςκ υνςκ πνδζζιμπμζήεδηε posthoc Duncan ηεζη. Ζ επίδναζδ ηςκ δζαθμνεηζηχκ δυζεςκ ημο nicosulfuron ζημοξ ανζειμφξ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΒ ηαζ ηςκ ΑΟΑ ζημ πείναια εενιμηδπίμο αλζμθμβήεδηε ιε Ακάθοζδ Γζαηφιακζδξ Δκυξ Πανάβμκηα (one-way ANOVA), ζηα απμηεθέζιαηα ηάεε ηφηθμο επέιααζδξ λεπςνζζηά. Γζα ηδκ ακίπκεοζδ ζηαηζζηζηά ζδιακηζηχκ δζαθμνχκ ιεηαλφ ηςκ δζαθμνεηζηχκ δυζεςκ ημο nicosulfuron, ζημκ ίδζμ ηφηθμ επέιααζδξ, πνδζζιμπμζήεδηε ημ Duncan ηεζη. Ζ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ζε ηάεε πενίπηςζδ έβζκε ιε ημ ζηαηζζηζηυ παηέημ IBM SPSS

209 3.4. Απνηειέζκαηα Δπίδξαζε ηνπ nicosulfuron ζηε ζύζηαζε ηεο θνηλόηεηαο ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο PCR ελίζρπζε ηκήκαηνο ηνπ 16S rrna ησλ ΑΟΒ Γζα ηδκ εκίζποζδ ημο 16S rrna βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ, πναβιαημπμζήεδηακ 3 δζαδμπζηέξ PCR ακηζδνάζεζξ. ηδκ πνχηδ ημ εδαθζηυ DNA εκζζπφεδηε ιε πνήζδ ηςκ εηηζκδηχκ βαμοf ηαζ βαμοr ηαζ ημ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ είπε ιέβεεμξ 1100 bp (Δζηυκα 3.9). L bp Εικόνα 3.9. Ενδεικτικι εικόνα θλεκτροφόρθςθσ ςε πθκτι αγαρόηθσ 1 % των προϊόντων που προζκυψαν από PCR ενίςχυςθ του γονιδίου 16S rrna των ΑΟΒ του εδάφουσ με τουσ εκκινθτζσ βamof-βamor. L: 1kb DNA Ladder, 1: Αρνθτικόσ μάρτυρασ, 2-13: PCR προϊόν από δείγματα εδάφουσ του πειράματοσ αγροφ, 2 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ με το nicosulfuron, ςε δόςεισ 0x (2-5), 1x (6-9), 5x (10-13). ε κάκε γραμμι φορτϊκθκαν 10μl προϊόντοσ PCR. ηδ ζοκέπεζα ημ πνμσυκ ηςκ 1100 bp οπμαθήεδηε ζε κέα ακηίδναζδ PCR ιε πνήζδ ηςκ εηηζκδηχκ CTO189fABC ηαζ CTO654r, βζα ηδκ εκίζποζδ ηιήιαημξ ηδξ αθθδθμοπίαξ ημο 16S rrna ηςκ ΑΟΒ. Σμ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ είπε ιέβεεμξ 465 bp (Δζηυκα 3.10). 500bp Εικόνα Ενδεικτικι εικόνα θλεκτροφόρθςθσ ςε πθκτι αγαρόηθσ 1.2% των προϊόντων που προζκυψαν από PCR εςωτερικισ ζνκεςθσ του γονιδίου 16S rrna των ΑΟΒ του εδάφουσ με τουσ εκκινθτζσ CTO189f-CTO654r. L: 1kb DNA Ladder, 1: Αρνθτικόσ μάρτυρασ, 2-10: PCR προϊόν από δείγματα εδάφουσ του πειράματοσ κερμοκθπίου, πρϊτοσ κφκλοσ επζμβαςθσ, με εφαρμογι του nicosulfuron ςε δόςεισ 0x (2-4), 10x (5-7), 100x (8-10). ε κάκε γραμμι φορτϊκθκαν 5μl προϊόντοσ PCR. 209

210 Σέθμξ, ημ πνμσυκ ηδξ δεφηενδξ PCR (465 bp) οπμαθήεδηε ζε κέα PCR εζςηενζηήξ έκεεζδξ ιε ημοξ εηηζκδηέξ 357f+GC ηαζ 534r, πνμηεζιέκμο κα πνμηφρεζ πνμσυκ ηαηάθθδθμ (194 bp) βζα ακάθοζδ ιε ηδ ιέεμδμ DGGE (Δζηυκα 3.11). L bp Εικόνα Ενδεικτικι εικόνα θλεκτροφόρθςθσ ςε πθκτι αγαρόηθσ 1.2% των προϊόντων που προζκυψαν από PCR εςωτερικισ ζνκεςθσ του γονιδίου 16S rrna των ΑΟΒ με τουσ εκκινθτζσ 357f+GC-534. L: 1kb DNA Ladder, 1: Αρνθτικόσ μάρτυρασ, 2-13: PCR προϊόν από δείγματα εδάφουσ του πειράματοσ κερμοκθπίου, τζταρτοσ κφκλοσ επζμβαςθσ, με εφαρμογι nicosulfuron ςε δόςεισ 0x (2-4), 10x (5-7), 100x (8-10), 1000x (11-13). ε κάκε γραμμι φορτϊκθκαν 5μl προϊόντοσ PCR Δλίζρπζε ηνπ amoa γνληδίνπ ησλ AOA Γζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ AOA πνδζζιμπμζδεήηακ μζ εηηζκδηέξ Α23f ηαζ Α616r ηαζ ημ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ είπε ιέβεεμξ 620 bp (Δζηυκα 3.12). L bp Εικόνα Ενδεικτικι εικόνα θλεκτροφόρθςθσ ςε πθκτι αγαρόηθσ 1.2% προϊόντων που πρόεκυψαν από PCR ενίςχυςθ του γονιδίου amoa των ΑΟΑ του εδάφουσ. L: 1kb DNA Ladder, 1: Αρνθτικόσ μάρτυρασ, 2-13: PCR προϊόν από δείγματα εδάφουσ του πειράματοσ κερμοκθπίου, δεφτεροσ κφκλοσ επζμβαςθσ, με εφαρμογι nicosulfuron ςε δόςεισ 0x (2-4), 10x (5-7), 100x (8-10), 1000x (11-13). ε κάκε γραμμι φορτϊκθκαν 5μl προϊόντοσ PCR. 210

211 ΠΔΗΡΑΜΑ ΘΔΡΜΟΚΖΠΗΟΤ Αλάιπζε DGGE ηεο θνηλόηεηαο ησλ AOB Ακάθοζδ DGGE ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ ζηα δείβιαηα εδάθμοξ απυ ημ πείναια εενιμηδπίμο έδεζλε ιζα ζπεηζηά παιδθήξ πμζηζθυηδηαξ ημζκυηδηα ιε ιμνζαηά απμηοπχιαηα πμο απμηεθμφκηακ απυ 8-12 γχκεξ. Απυ ηδκ μπηζηή παναηήνδζδ ηςκ πδηηχκ ηαζ ηδκ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ Κφνζςκ οκηεηαβιέκςκ πμο εθανιυζηδηε ζηα δεδμιέκα δοαδζηήξ ιμνθήξ θαίκεηαζ υηζ μζ δζαδμπζηέξ εθανιμβέξ μδήβδζακ ζε ιεηααμθέξ ζηδκ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ ζδζαίηενα ζημοξ ηφηθμοξ επειαάζεςκ 2, 3 ηαζ 5. Δζδζηυηενα: 1) Μεηά ημκ πνχημ ηφηθμ επέιααζδξ (Γζάβναιια 3.1α) δεκ παναηδνήεδηε λεηάεανμξ δζαπςνζζιυξ ηςκ εδαθζηχκ δεζβιάηςκ ζε ζπέζδ ιε ηδ δυζδ εθανιμβήξ ημο nicosulfuron. 2) Μεηά ημκ δεφηενμ ηφηθμ επέιααζδξ, ηα εδαθζηά δείβιαηα ηδξ ιεηαπείνζζδξ 100x δζαπςνίγμκηαζ απυ ηα δείβιαηα ηςκ οπμθμίπςκ ιεηαπεζνίζεςκ ςξ πνμξ ηδκ PCo2, εκχ ηα εδαθζηά δείβιαηα ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ 10x ηαζ 1000x δζαπςνίγμκηαζ απυ αοηά ημο ιάνηονα (x0) ςξ πνμξ ηδκ PCo1 (Γζάβναιια 3.1α). 3) Μεηά ημκ ηνίημ ηφηθμ επέιααζδξ, υθεξ μζ ιεηαπεζνίζεζξ δζαπςνίγμκηαζ απυ ημ ιάνηονα ςξ πνμξ ηδκ PCo2, εκχ ηα δείβιαηα ηδξ ιεηαπείνζζδξ x100 δζαπςνίγμκηαζ απυ ηα δείβιαηα ηςκ οπμθμίπςκ ιεηαπεζνίζεςκ ςξ πνμξ ηδκ PCo1 (Γζάβναιια 3.1β) 4) Μεηά ημκ ηέηανημ ηφηθμ επέιααζδξ δ ιεηαπείνζζδ 1000x δζαπςνίγεηαζ απυ υθεξ ηζξ οπυθμζπεξ ιεηαπεζνίζεζξ, ςξ πνμξ ηδκ PCo2 (Γζάβναιια 3.1δ). 5) Μεηά ημκ πέιπημ ηφηθμ επέιααζδξ παναηδνείηαζ δζαπςνζζιυξ ηςκ εδαθζηχκ δεζβιάηςκ ημο ιάνηονα (x0) απυ ηα δείβιαηα ηδξ ιεηαπείνζζδξ x10 ςξ πνμξ ηδκ PCo2 ηαζ απυ ηα δείβιαηα ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ x100 ηαζ x1000 ςξ πνμξ ηδκ PCo1 (Γζάβναιια 3.1ε). Γεκζηυηενα μζ δζαδμπζηέξ εθανιμβέξ ημο nicosulfuron ζε δυζεζξ x10, x100 ηαζ x1000 μδήβδζακ ζε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδκ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ ηαζ ζδζαίηενα ιεηά ημκ δεφηενμ ηφηθμ επειαάζεςκ πςνίξ υιςξ κα οπάνπεζ έκα ζηαεενυ ηαζ λεηάεανμ δμζμ-ελανηχιεκμ πνυηοπμ. 211

212 Διάγραμμα 3.1. Μοριακό αποτφπωμα DGGE τθσ κοινότθτασ των ΑΟΒ (δεξιά) και αντίςτοιχθ ανάλυςθ πολυμεταβλθτότθτασ Κφριων υντεταγμζνων (αριςτερά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των διαδοχικϊν εφαρμογϊν του nicosulfuron ςε δόςεισ x0, x10, x100, x1000 τθσ ςυνιςτϊμενθσ ςτθν κοινότθτα των ΑΟΒ ςτο ζδαφοσ ςτο πείραμα κερμοκθπίου. Σα δεδομζνα παρουςιάηονται για κάκε κφκλο επζμβαςθσ: (α) Κφκλοσ 1, (β) Κφκλοσ 2, (γ) Κφκλοσ 3, (δ) Κφκλοσ 4 και (ε) Κφκλοσ 5. Μ: Marker για βακτιρια. 212

213 Αλάιπζε DGGE ηεο θνηλόηεηα ησλ AOA Ακάθοζδ DGGE ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΑ ζηα εδαθζηά δείβιαηα ημο πεζνάιαημξ εενιμηδπίμο έδεζλε ηδκ πανμοζία πενζμνζζιέκμο ανζειμφ γςκχκ (6-10 γχκεξ) ηαζ ζπεηζηά πενζμνζζιέκδ παναθθαηηζηυηδηα ζημ πνμθίθ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΑ ζηζξ δζάθμνεξ ιεηαπεζνίζεζξ. Αοηυ επζαεααζχεδηε ηαζ απυ ηδκ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ δεδμιέκςκ ιε ηδκ ιέεμδμ ηςκ Κονίςκ οκηεηαβιέκςκ πμο δεκ έδεζλε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΑ ζηζξ δζάθμνεξ ιεηαπεζνίζεζξ (Γζάβναιια 3.2). Μμκαδζηή ελαίνεζδ απμηέθεζακ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ ηδκ ορδθυηενδ δυζδ nicosulfuron (x1000) ζημ πέιπημ ηφηθμ επέιααζδξ πμο δζαπςνίγμκηαζ λεηάεανα απυ ηα δείβιαηα ηδξ ιεηαπείνζζδξ 1x ηαζ ημ ιάνηονα ακαθμνάξ ηυζμ ςξ πνμξ ηδκ PCo1, υζμ ηαζ ςξ πνμξ ηδκ PCo2 (Γζάβναιια 3.2ε). 213

214 Διάγραμμα 3.2. Μοριακό αποτφπωμα DGGE τθσ κοινότθτασ των ΑΟΑ (δεξιά) και αντίςτοιχθ ανάλυςθ πολυμεταβλθτότθτασ Κφριων υντεταγμζνων (αριςτερά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των διαδοχικϊν εφαρμογϊν του nicosulfuron ςε δόςεισ x0, x10, x100, x1000 τθσ ςυνιςτϊμενθσ ςτθν κοινότθτα των ΑΟΑ ςτο ζδαφοσ ςτο πείραμα κερμοκθπίου. Σα δεδομζνα παρουςιάηονται για κάκε κφκλο επζμβαςθσ: (α) Κφκλοσ 1, (β) Κφκλοσ 2, (γ) Κφκλοσ 3, (δ) Κφκλοσ 4 και (ε) Κφκλοσ 5. τα διαγράμματα (α) και (γ) δεν παρουςιάηονται διαγράμματα από τθν κατανομι των δειγμάτων ςφμφωνα με ανάλυςθ Κυρίων υντεταγμζνων διότι όλα τα δείγματα παρουςίαςαν πανομοιότυπο αποτφπωμα. 214

215 ΠΔΗΡΑΜΑ ΑΓΡΟΤ Αλάιπζε DGGE ηεο θνηλόηεηαο ησλ ΑΟΒ ηδκ πενίπηςζδ DGGE ακάθοζδξ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ, παναηδνήεδηε βεκζηά ορδθή παναθθαηηζηυηδηα ςξ πνμξ ημ ιζηνμαζαηυ απμηφπςια ιεηαλφ ηςκ επακαθήρεςκ ηδξ ίδζαξ ιεηαπείνζζδξ. οκμθζηά ακζπκεφηδηακ 8-12 γχκεξ ζηα ιμνζαηά απμηοπχιαηα ηςκ δζαθυνςκ ιεηαπεζνίζεςκ. Απυ ηδκ Ακάθοζδ Κφνζςκ οκηεηαβιέκςκ (Principal Coordinate Analysis) ηαζ ηδκ ηαηακμιή ηςκ δεζβιάηςκ ζηζξ δφμ ηφνζεξ ζοκηεηαιέκεξ δεκ πνμέηορε μιαδμπμίδζδ ηςκ δεζβιάηςκ ςξ πνμξ ημοξ δφμ ηφνζμοξ πανάβμκηεξ δδθ. ηδ δυζδ εθανιμβήξ nicosulfuron ηαζ ημκ πνυκμ δεζβιαημθδρίαξ (Γζάβναιια 3.3). Παναηδνήεδηε υιςξ υηζ μζ δφμ Κφνζεξ οκηεηαβιέκεξ PCo1 (20,8%) ηαζ PCo2 (15.1%) πενζβνάθμοκ ιυκμ ημ 35.9% (<50%) ηδξ ζοκμθζηήξ παναθθαηηζηυηδηαξ ηςκ δεδμιέκςκ. Γζα ημ θυβμ αοηυ αημθμφεδζε δζαδμπζηή ακάθοζδ ηςκ δεδμιέκςκ πμο πνμέηορακ απυ ηδκ PCoA ιε ηδ ιέεμδμ ηςκ Κακμκζηχκ Μεηααθδηχκ (Canonical Variates Analysis: CVA). Απυ ηδ CVA δεκ πνμέηορε ηαζ πάθζ ηάπμζμ πνυηοπμ επίδναζδξ ημο nicosulfuron ή ημο πνυκμο δεζβιαημθδρίαξ. Οζ ιυκεξ ελαζνέζεζξ ήηακ ηα εδαθζηά δείβιαηα πμο ζοθθέπεδηακ πνζκ ηδκ εθανιμβή ημο nicosulfuron απυ ηα πεζναιαηζηά ηειάπζα ημο ιάνηονα (0x) ηαζ ηα δείβιαηα πμο ζοθθέπεδηακ 2 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ηδξ x5 δυζδξ ημο nicosulfuron πμο δζαπςνίζηδηακ απυ υθεξ ηζξ οπυθμζπεξ ιεηαπεζνίζεζξ ςξ πνμξ ηδ CV1, αθθά ηαζ ιεηαλφ ημοξ ςξ πνμξ ηδκ CV2. Σα εδαθζηά δείβιαηα βζα υθεξ ηζξ οπυθμζπεξ ιεηαπεζνίζεζξ δεκ θαίκεηαζ κα δζαθένμοκ ςξ πνμξ ηδκ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ. Οζ δφμ Κακμκζηέξ Μεηααθδηέξ 1 ηαζ 2 πενζβνάθμοκ ζοκμθζηά ημ 77.1% (CV1: 51.3%, CV2: 25.8%) ηδξ παναθθαηηζηυηδηαξ (Γζάβναιια 3.4). Πεναζηένς ακάθοζδ εζηίαζε ζηδκ δζαηνίαςζδ πζεακχκ ζδιακηζηχκ δμζoελανηχιεκςκ ιεηααμθχκ ζηδκ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ ζε ηάεε δεζβιαημθδρία λεπςνζζηά. Έηζζ ακάθοζδ PCoA έδεζλε υηζ πνζκ ηδκ εθανιμβή ημο nicosulfuron, ηα δείβιαηα εδάθμοξ πμο πνυηεζηαζ κα δεπημφκ δυζεζξ 0x ηαζ 5x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ, δζαπςνίγμκηαζ απυ εηείκα ηδξ δυζδξ 1x ςξ πνμξ ηδκ PCo2 (Γζάβναιια 3.5α). Γφμ διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ παναηδνείηαζ δζαπςνζζιυξ ςξ πνμξ ηδκ PCo1 ηςκ δεζβιάηςκ πμο δέπηδηακ εθανιμβή nicosulfuron ζε δυζεζξ 0x ηαζ 1x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ απυ εηείκα πμο δέπηδηακ εθανιμβή δυζδξ 5x (Γζάβναιια 3.5α). Ακηίεεηα, ζημοξ πνυκμοξ δεζβιαημθδρίαξ 28 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ, αθθά ηαζ 215

216 ζημ ηέθμξ ημο πεζνάιαημξ δεκ θαίκεηαζ κα οπάνπεζ λεηάεανμξ δζαπςνζζιυξ ηςκ εδαθζηχκ δεζβιάηςκ ζε ζπέζδ ιε ηδ δυζδ εθανιμβήξ (Γζάβναιια 3.5β,δ). Διάγραμμα 3.3. Κατανομι των εδαφικϊν δειγμάτων από το πείραμα αγροφ ςφμφωνα με ανάλυςθ πολυμεταβλθτότθτασ Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=3) ςτα δεδομζνα που προζκυψαν απο τθν μοριακι αποτφπωςθ τθσ κοινοτθτασ των ΑΟΒ. Οι δφο άξονεσ περιγράφουν το 20,8% (Κφρια υντεταγμζνθ 1) και 15.1 % (Κφρια υντεταγμζνθ 2) τθσ ςυνολικισ παραλλακτικότθτασ. 216

217 1 before: 0x 2 before: 1x 3 before: 5x 4 2days: 0x 5 2days: 1x 6 2days: 5x 7 28days: 0x 8 28days: 1x 9 28days: 5x 10 end: 0x 11 end: 1x 12 end: 5x Διάγραμμα 3.4. Κατανομι των δειγμάτων εδάφουσ από τισ διάφορεσ μεταχειρίςεισ ςτο πείραμα αγροφ φςτερα από ανάλυςθ Κανονικϊν Μεταβλθτϊν ςτα δεδομζνα που προζκυψαν απο τθν ανάλυςθ PCoA των δεδομζνων από τθν μοριακι αποτφπωςθ τθσ κοινοτθτασ των ΑΟΒ. Οι δφο άξονεσ περιγράφουν το 51.3 % (Κανονικι Μεταβλθτι 1) και 25.8 % (Κανονικι Μεταβλθτι 2) τθσ ςυνολικισ παραλλακτικότθτασ. Οι κφκλοι που περιβάλλουν τα δείγματα αποτελοφν 95% όρια εμπιςτοςφνθσ κάκε μεταχείριςθσ. Αλλθλοεπικάλυψθ μεταξφ των κφκλων παραπζμπει ςε μθ ςθμαντικζσ διαφορζσ μεταξφ μεταχειρίςεων. 217

218 (α) (β) (γ) (δ) Διάγραμμα 3.5. Μοριακό αποτφπωμα DGGE τθσ κοινότθτασ των ΑΟΒ (δεξιά) και αντίςτοιχθ ανάλυςθ πολυμεταβλθτότθτασ Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=3) που προζκυψε από το μοριακό αποτφπωμα (αριςτερά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των διαφορετικϊν δόςεων του nicosulfuron ςτθν κοινότθτα των ΑΟΒ ςτο ζδαφοσ. Σα δεδομζνα παρουςιάηονται για κάκε δειγματολθψία ξεχωριςτά: (α) πριν τθν επζμβαςθ, (β) 2 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ, (γ) 28 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ και (δ) ςτο τζλοσ τθσ βλαςτικισ περιόδου (116 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ). Μ: Marker για βακτιρια που αποτελείται από μίγμα 16S rrna-pcr προϊόντων (ςυγκζντρωςθ 20 ng/μl) των βακτθρίων που ακολουκοφν με ςειρά εμφάνιςθσ από πάνω προσ τα κάτω: Pseudomonas sp., Flavobacterium sp., Acinetobacter sp., Variovorax sp., Citrobacter sp., Stenotrophomonas sp., Rhizobium sp., Ochrobactrum sp. 218

219 before 2 days 28days end M 0x 1x 5x M 0x 1x 5x M 0x 1x 5x M 0x 1x 5x M Εικόνα Μοριακό αποτφπωμα DGGE τθσ κοινότθτασ των ΑΟΒ ςε δείγματα εδάφουσ που ςυλλζχκθκαν από το πείραμα αγροφ. Σα δείγματα δζχτθκαν εφαρμογι διαφορετικϊν δόςεων nicosulfuron (0x, 1x, 5x). Σα μοριακά αποτυπϊματα παρουςιάηονται με βάςθ τον χρόνο ςυλλογισ τουσ μετά τθν εφαρμογι του nicosulfuron: (α) πριν τθν επζμβαςθ (before), (β) 2 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ (2days), (γ) 28 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ (28days) και (δ) ςτο τζλοσ τθσ βλαςτικισ περιόδου (116 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ) (end). Μ: Marker για βακτιρια που αποτελείται από μίγμα 16S rrna-pcr προϊόντων (ςυγκζντρωςθ 20 ng/μl) των βακτθρίων που ακολουκοφν με ςειρά εμφάνιςθσ ςτθν πθκτι από πάνω προσ τα κάτω: Pseudomonas sp., Flavobacterium sp., Acinetobacter sp., Variovorax sp., Citrobacter sp., Stenotrophomonas sp., Rhizobium sp., Ochrobactrum sp (αναλυτικά θ ςφςταςθ του Marker ςτθν Εικόνα 3.13) 219

220 Αλάιπζε DGGE ηεο θνηλόηεηαο ησλ ΑΟΑ Ζ DGGE ακάθοζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ανπαίςκ ζημ πείναια αβνμφ έδεζλε πενζμνζζιέκμ ανζειυ γςκχκ (ι.μ 6-8) ηαζ πακμιμζυηοπμ απμηφπςια ακελάνηδηα απυ ηδκ εθανιμβή ημο nicosulfuron ηαζ ημκ πνυκμ δεζβιαημθήρζαξ. Ζ ακάθοζδ ηςκ δοαδζηχκ δεδμιέκςκ πμο πνμέηορακ απυ ηδκ επελενβαζία ηςκ ιμνζαηχκ απμηοπςιάηςκ ιε ηδκ ιέεμδμ ηςκ Κφνζςκ οκηεηαβιέκςκ (Principal Coordinate Analysis, PCoA) δεκ έδεζλε ηαιία μιαδμπμίδζδ ζηδκ ηαηακμιή ηςκ δεζβιάηςκ ςξ πνμξ ηδκ δυζδ εθανιμβήξ ημο nicosulfuron ή ημκ πνυκμ δεζβιαημθδρίαξ (Γζάβναιια 3.6). Απυ ηδκ ανπζηή ακάθοζδ Κονίςκ οκηεηαβιέκςκ πνυεηορε υηζ μζ δφμ Κφνζεξ οκηεηαβιέκεξ πενζβνάθμοκ ζοκμθζηά ημ 53.3% (PCo1: 34.5%, PCo2: 18.8%) ηδξ παναθθαηηζηυηδηαξ ηςκ δεδμιέκςκ (Γζάβναιια 3.6). Πανυθα αοηά εθανιυζηδηε ηαζ ζε αοηή ηδκ πενίπηςζδ ακάθοζδ Κακμκζηχκ Μεηααθδηχκ (CVA) πνμηεζιέκμο κα ακζπκεοημφκ ηοπυκ μνζαηέξ δζαθμνέξ ιεηαλφ ηςκ επζιένμοξ ιεηαπεζνίζεςκ πμο δεκ ήηακ δοκαηυ κα ακζπκεοεμφκ ιε ηδκ πνμδβμφιεκδ ακάθοζδ. Απυ ηδκ CVA πνμέηορε υηζ ηα δείβιαηα δεκ δζαθμνμπμζμφκηαζ ςξ πνμξ ηδκ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΑ ακελάνηδηα απυ ηδκ δυζδ εθανιμβήξ ημο nicosulfuron αθθά ηαζ ημκ πνυκμ δεζβιαημθδρίαξ (Γζάβναιια 3.7). Μμκαδζηέξ ελαζνέζεζξ απμηέθεζακ ηα δείβιαηα πμο ζοθθέπεδηακ πνζκ απυ ηδκ εθανιμβή ηαζ ζηζξ 116 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ηδξ ζοκζζηχιεκδξ δυζδξ ημο nicosulfuron (x1). Οζ δφμ Κακμκζηέξ Μεηααθδηέξ πενζβνάθμοκ ημ 74.9% (CV1: 58.8% ηαζ CV2: 16.2%) ηδξ ζοκμθζηήξ παναθθαηηζηυηδηαξ (Γζάβναιια 3.7). Πεναζηένς ακάθοζδ εζηίαζε ζηδκ δζαηνίαςζδ πζεακχκ ζδιακηζηχκ δμζoελανηχιεκςκ ιεηααμθχκ ζηδκ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΑ ζε ηάεε δεζβιαημθδρία λεπςνζζηά. Έηζζ ακάθοζδ PCoA έδεζλε υηζ 1) πνζκ ηδκ εθανιμβή ημο nicosufuron ηα δείβιαηα πμο ζοθθέπηδηακ απυ ηα πεζναιαηζηά ηειάπζα πμο εα δέπμκηακ ηδκ ζοκζζηχιεκδ δυζδ (1x) δζαπςνίγμκηαζ ςξ πνμξ ηδκ PCo1 απυ ηα δείβιαηα πμο εα δέπμκηακ εθανιμβή ηδξ ορδθυηενδξ δυζδξ (5x) (Γζάβναιια 3.8α), 2) ιεηά ηδκ εθανιμβή ημο nicosulfuron δεκ παναηδνήεδηε ζαθήξ δζαπςνζζιυξ ηςκ δεζβιάηςκ πμο ζοθθέπεδηακ ζηζξ 2 ηαζ ζηζξ 28 διένεξ ζε ζπέζδ ιε ηδ δυζδ εθανιμβήξ (Γζάβναιια 3.8 α,β), 3) Σέθμξ ηα δείβιαηα πμο ζοθθέπεδηακ ζηζξ 116 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή θαίκεηαζ κα δζαπςνίγμκηαζ ιε αάζδ ηδκ δυζδ εθανιμβήξ, ηαζ εζδζηυηενα ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ ηδ ζοκζζηχιεκδ δυζδ (1x) κα 220

221 δζαπςνίγμκηαζ απυ ηα δείβιαηα ηςκ οπμθμίπςκ δφμ ιεηαπεζνίζεςκ (0x, 5x) ςξ πνμξ ηδ PCo1 (Γζάβναιια 3.8δ). Διάγραμμα 3.6. Κατανομι των εδαφικϊν δειγμάτων ςτο πείραμα αγροφ, ςφμφωνα με ανάλυςθ πολυμεταβλθτότθτασ Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=4) ςτα δεδομζνα που προζκυψαν απο τθν μοριακι αποτφπωςθ τθσ κοινοτθτασ των ΑΟΑ. Οι δφο άξονεσ περιγράφουν το 34.5% (Κφρια υντεταγμζνθ 1) και 18.8 % (Κφρια υντεταγμζνθ 2) τθσ ςυνολικισ παραλλακτικότθτασ. 221

222 1 before: 0x 2 before: 1x 3 before: 5x 4 2days: 0x 5 2days: 1x 6 2days: 5x 7 28days: 0x 8 28days: 1x 9 28days: 5x 10 end: 0x 11 end: 1x 12 end: 5x Διάγραμμα 3.7. Κατανομι των δειγμάτων εδάφουσ που ςυλλζχκθκαν από το πείραμα αγροφ ςφμφωνα φςτερα από ανάλυςθ Κανονικϊν Μεταβλθτϊν ςτα δεδομζνα που προζκυψαν απο τθν ανάλυςθ PCoA των δεδομζνων από τθν μοριακι αποτφπωςθ τθσ κοινοτθτασ των ΑΟΑ. Οι δφο άξονεσ περιγράφουν το 58.8 % (Κανονικι Μεταβλθτι 1) και 16.2 % (Κανονικι Μεταβλθτι 2) τθσ ςυνολικισ παραλλακτικότθτασ. Οι κφκλοι αποτελοφν 95% όρια εμπιςτοςφνθσ. Αλλθλοεπικάλυψθ μεταξφ των κφκλων παραπζμπει ςε μθ ςτατιςτικϊσ ςθμαντικζσ διαφορζσ μεταξφ μεταχειρίςεων. 222

223 (α) (β) (γ) (δ) Διάγραμμα 3.8. Μοριακό αποτφπωμα DGGE τθσ κοινότθτασ των ΑΟΑ (δεξιά) και αντίςτοιχθ ανάλυςθ πολυμεταβλθτότθτασ Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=3) που προζκυψε από το μοριακό αποτφπωμα (αριςτερά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των διαφόρων επιπζδων δόςεων του nicosulfuron ςτθν κοινότθτα των ΑΟΑ ςτο ζδαφοσ. Σα δεδομζνα παρουςιάηονται για κάκε δειγματολθψία ξεχωριςτά: (α) πριν τθν επζμβαςθ, (β) 2 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ, (γ) 28 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ και (δ) ςτο τζλοσ τθσ βλαςτικισ περιόδου (116 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ). 223

224 before 2 days 28days end 0x 1x 5x 0x 1x 5x 0x 1x 5x 0x 1x 5x Εικόνα Μοριακό αποτφπωμα DGGE τθσ κοινότθτασ των ΑΟΑ ςτα δείγματα εδάφουσ που ςυλλζχκθκαν κατά τθν διάρκεια του πειράματοσ αγροφ από πειραματικά τεμάχια που δζχτθκαν διαφορετικζσ δόςεισ του ηιηανιοκτόνου nicosulfuron (0x, 1x, 5x). Σα δείγματα ςυλλζχκθκαν (α) πριν τθν επζμβαςθ (before), (β) 2 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ (2days),(γ) 28 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ (28days) και (δ) ςτο τζλοσ τθσ βλαςτικισ περιόδου (116 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ) (end). 224

225 Αμηνιόγεζε ηεο επίδξαζεο ηνπ nicosulfuron ζηελ αθζνλία ησλ AOB θαη ΑΟΑ - Απνηειέζκαηα PCR πξαγκαηηθνύ ρξόλνπ Ζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ημζκμηήηςκ ηςκ ΑΟΒ ηαζ ηςκ ΑΟΑ ζηα πενζααθθμκηζηά δείβιαηα εενιμηδπίμο ηαζ αβνμφ, πναβιαημπμζήεδηε ιε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ζημπεφμκηαξ ζημ amoa βμκίδζμ. Ο πνμζδζμνζζιυξ ημο ανζειμφ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ζηα δείβιαηα έβζκε ιε ηδ πνήζδ ηαιποθχκ ακαθμνάξ πμο ηαηαζηεοάζηδηακ ιε δζαδμπζηέξ αναζχζεζξ ακαζοκδοαζιέκςκ πθαζιζδίςκ βκςζηήξ ζοβηέκηνςζδξ πμο πενζείπακ ημ βμκίδζμ amoa. Γζα ηδκ ηαιπφθδ ακαθμνάξ ηςκ ΑΟΒ πνδζζιμπμζήεδηακ μζ αναζχζεζξ 11x10 5 έςξ 11x10 1 ηςκ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο ηυζμ βζα ημ πείναια εενιμηδπίμο υζμ ηαζ βζα ημ πείναια αβνμφ. Ακηίζημζπα, βζα ηα ΑΟΑ πνδζζιμπμζήεδηακ μζ αναζχζεζξ 10x10 7 έςξ 10x10 1 ηςκ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο, βζα ημ πείναια εενιμηδπίμο ηαζ 10x10 6 έςξ 10x10 0 ακηίβναθα βμκζδίμο, βζα ημ πείναια αβνμφ. ηδκ πενίπηςζδ ηςκ ΑΟΒ βζα ημ πείναια εενιμηδπίμο δ απμηεθεζιαηζηυηδηα ηδξ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ήηακ 81.7%, ιε r 2 =0.996 ηαζ ηθίζδ ηαιπφθδξ Οζ ακηίζημζπεξ ηζιέξ βζα ηα ΑΟΒ ζημ πείναια αβνμφ, ήηακ 94.5%, ηαζ Οιμίςξ, ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ΑΟΑ ζημ πείναια εενιμηδπίμο δ απμηεθεζιαηζηυηδηα εκίζποζδξ ήηακ 87.7%, ιε r 2 =0.997 ηαζ ηθίζδ ηαιπφθδξ , εκχ ζημ πείναια αβνμφ μζ ακηίζημζπεξ ηζιέξ ήηακ 99.5%, ηαζ ηζξ Δζηυκεξ πμο αημθμοεμφκ πανμοζζάγμκηαζ μζ ηαιπφθεξ ακαθμνάξ, ηαιπφθεξ εκίζποζδξ ηαζ ηαιπφθεξ απμδζάηαλδξ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ ιε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ζημ πείναια εενιμηδπίμο ηαζ ζημ πείναια αβνμφ. 225

226 Εικόνα Πείραμα κερμοκθπίου: Ενίςχυςθ του γονιδίου amoa των ΑΟΒ με PCR πραγματικοφ χρόνου. (α) καμπφλθ αναφοράσ, (β) καμπφλθ ενίςχυςθσ και (γ) καμπφλθ αποδιάταξθσ. 226

227 Εικόνα Πείραμα αγροφ: Ενίςχυςθ του γονιδίου amoa των ΑΟΒ με PCR πραγματικοφ χρόνου. (α) καμπφλθ αναφοράσ, (β) καμπφλθ ενίςχυςθσ και (γ) καμπφλθ αποδιάταξθσ. 227

228 Εικόνα Πείραμα κερμοκθπίου: Ενίςχυςθ του γονιδίου amoa των ΑΟΑ με PCR πραγματικοφ χρόνου. (α) καμπφλθ αναφοράσ, (β) καμπφλθ ενίςχυςθσ και (γ) καμπφλθ αποδιάταξθσ. 228

229 Εικόνα Πείραμα αγροφ: Ενίςχυςθ του γονιδίου amoa των ΑΟΑ με PCR πραγματικοφ χρόνου. (α) καμπφλθ αναφοράσ, (β) καμπφλθ ενίςχυςθσ και (γ) καμπφλθ αποδιάταξθσ. 229

230 ηδκ πενίπηςζδ ημο πεζνάιαημξ εενιμηδπίμο, μζ ηζιέξ βζα ηα ΑΟΒ ηοιάκεδηακ απυ 8.4 x10 2 έςξ 8.1x10 4 ακηίβναθα ng -1 DNA εκχ βζα ηα ΑΟΑ απυ 9.8x10 2 έςξ 1.9x10 5 ακηίβναθα ng -1 DNA. Ο θυβμξ ημο ανζειμφ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΑ πνμξ ημκ ακηίζημζπμ ηςκ ΑΟΒ ηοιάκεδηε απυ 0.06 έςξ 3.20 ιε ηζξ ορδθυηενεξ ηζιέξ κα ηαηαβνάθμκηαζ ζηα δείβιαηα πμο ζοθθέπηδηακ ζημοξ ηεθεοηαίμοξ δφμ ηφηθμοξ εθανιμβήξ ιε ηζξ ηζιέξ ημο θυβμο κα αολάκμκηαζ ιε ηδκ δυζδ εθανιμβήξ ημο nicosulfuron (Γζάβναιια 3.9). Διάγραμμα 3.9. Πείραμα κερμοκθπίου: Αρικμοί αντιγράφων του amoa γονιδίου ng -1 DNA για τα ΑΟΒ και ΑΟΑ. Για κάκε μεταχείριςθ παρουςιάηεται και ο λόγοσ ημο ανζειμφ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΑ πνμξ ημκ ακηίζημζπμ ηςκ ΑΟΒ. 230

231 Γζα ημ πείναια αβνμφ, μζ ηζιέξ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηοιάκεδηακ απυ 8.9 x10 2 έςξ 2.4x10 5 ακηίβναθα ng -1 DNA βζα ηα ΑΟΒ ηαζ απυ 1.2x10 3 έςξ 9.4x10 3 ακηίβναθα ng -1 DNA βζα ηα ΑΟΑ. Ο θυβμξ ημο ανζειμφ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΑ πνμξ ημκ ακηίζημζπμ ηςκ ΑΟΒ ηοιάκεδηε ζε ηζιέξ <1 ιε ιμκαδζηή ελαίνεζδ ηα δείβιαηα πμο ζοθθέπεδηακ απυ ηα πεζναιαηζηά ηειάπζα ημο ιάνηονα ακαθμνάξ (x0) 2 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ημο nicosulfuron υπμο θυβμξ είπε ηζιή 1.13 (Γζάβναιια 3.10 ). Διάγραμμα Πείραμα αγροφ: Αρικμοί αντιγράφων του amoa γονιδίου ng -1 DNA για τα ΑΟΒ και ΑΟΑ. Για κάκε μεταχείριςθ παρουςιάηεται και ο λόγοσ ημο ανζειμφ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΑ πνμξ ημκ ακηίζημζπμ ηςκ ΑΟΒ. 231

232 ΠΔΗΡΑΜΑ ΘΔΡΜΟΚΖΠΗΟΤ Δπίδξαζε ηνπ nicosulfuron ζηελ αθζνλία ησλ ΑΟΒ ηδκ πενίπηςζδ ημο πεζνάιαημξ εενιμηδπίμο μζ επζδνάζεζξ ηδξ δυζδξ ημο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ αλζμθμβήεδηακ βζα ηάεε ηφηθμ επέιααζδξ λεπςνζζηά πνδζζιμπμζχκηαξ Ακάθοζδ Γζαηφιακζδξ Δκυξ Πανάβμκηα (one-way ANOVA) ηαζ posthoc Duncan ηεζη. Έηζζ, ιεηά ημκ πνχημ ηφηθμ επέιααζδξ παναηδνήεδηε ιζα ζδιακηζηή ιείςζδ ημο ανζειμφ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ηδξ ορδθυηενδξ δυζδξ nicosulfuron (x1000) ζε ζπέζδ ηα ακηίζημζπα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή παιδθυηενςκ δυζεςκ (x10 ηαζ x100) εκχ δεκ παναηδνήεδηακ ζδιακηζηέξ δζαθμνέξ ζε ζπέζδ ιε ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα (Γζάβναιια 3.11). ημ δεφηενμ ηφηθμ επέιααζδξ, δ παναπάκς ηάζδ ειθακίζηδηε πζμ λεηάεανα ιε αφλδζδ ηδξ αθεμκίαξ ηςκ ΑΟΒ ζηζξ δυζεζξ 10x ηαζ 100x ζε ζπέζδ ιε ηδ δυζδ 1000x ηαζ ημ ιάνηονα (0x) πμο δεκ δζαθένμοκ ζηαηζζηζηά ιεηαλφ ημοξ. ημκ ηνίημ ηφηθμ επέιααζδξ, δεκ παναηδνήεδηακ ζδιακηζηέξ δζαθμνέξ ζημκ ανζειυ ακηζβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ζηζξ δζάθμνεξ ιεηαπεζνίζεζξ. ημκ ηέηανημ ηφηθμ επέιααζδξ, παναηδνήεδηε ιζα ζδιακηζηή ιείςζδ ημο ανζειμφ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΒ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή nicosulfuron (ζε υθα ηα επίπεδα δυζεςκ) ζε ζπέζδ ιε ημ ιάνηονα ακαθμνάξ. Σέθμξ, ζημκ πέιπημ ηφηθμ επέιααζδξ, δζαπζζηχεδηε αφλδζδ ημο ανζειμφ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΒ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ηδξ ορδθυηενδξ δυζδξ ημο nicosulfuron (1000x) εκχ μζ οπυθμζπεξ ιεηαπεζνίζεζξ (10x ηαζ 100x) δεκ δζαθένμοκ ζδιακηζηά ζε ζπέζδ ιε ημ ιάνηονα ακαθμνάξ. 232

233 P=0.034 P=0.001 P=0.207 P=0.207 P=0.012 P=0.073 P=0.073 Διάγραμμα Πείραμα κερμοκθπίου: Οι μεταβολζσ ςτον αρικμό των αντιγράφων του γονιδίου amoa των ΑΟΒ φςτερα από τθν επαναλαμβανόμενθ εφαρμογι του ηιηανιοκτόνου nicosulfuron ςε διαφορετικά επίπεδα δόςεων (x0, x10, x100, x1000 τθσ ςυνιςτϊμενθσ). Σα αποτελζςματα παρουςιάηονται ξεχωριςτά για κάκε κφκλο επζμβαςθσ. Κάκε τιμι αντιςτοιχεί ςτο μζςο όρο 3 επαναλιψεων ± τυπικι απόκλιςθ. Ράβδοι που ζχουν ςθμανκεί με το ίδιο γράμμα δεν διαφζρουν ςθμαντικά ςτον ίδιο κφκλο επζμβαςθσ. 233

234 Δπίδξαζε ηνπ nicosulfuron ζηελ αθζνλία ησλ ΑΟΑ ημ πείναια εενιμηδπίμο μζ επζδνάζεζξ ηδξ δυζδξ ημο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ αλζμθμβήεδηακ βζα ηάεε ηφηθμ επέιααζδξ λεπςνζζηά ιε Ακάθοζδ Γζαηφιακζδξ Δκυξ Πανάβμκηα (one-way ANOVA) ηαζ posthoc Duncan ηεζη. Έηζζ ζημκ πνχημ, ηνίημ ηαζ ηέηανημ ηφηθμ δ εθανιμβή ηςκ δζαθμνεηζηχκ δυζεςκ nicosulfuron δεκ πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζημκ ανζειυ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ (Γζάβναιια 3.12). Ακηίεεηα, ζημκ δεφηενμ ηφηθμ εθανιμβήξ παναηδνήεδηε ιείςζδ ημο ανζειμφ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ ιε εθανιμβή ημο nicosulfuron ζε δυζεζξ 100x ηαζ 1000x, ζε ζπέζδ ιε ηδ δυζδ 10x. Καιία ςζηυζμ απυ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ πμο δέπηδηακ εθανιμβή nicosulfuron δεκ δζέθενε ζδιακηζηά απυ ημ ιάνηονα. Σέθμξ, ζημκ πέιπημ ηφηθμ, δ εθανιμβή ηδξ ορδθυηενδξ δυζδξ ημο nicosulfuron μδήβδζε ζε ζδιακηζηή αφλδζδ ανζειμφ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ ζε ζπέζδ ιε ηδκ παιδθυηενδ δυζδ (x10) ηαζ ημκ ιάνηονα ακαθμνάξ. 234

235 P=0.210 P=0.063 P=0.779 P=0.333 P=0.022 Διάγραμμα Πείραμα κερμοκθπίου: Οι μεταβολζσ ςτον αρικμό των αντιγράφων του γονιδίου amoa των ΑΟΑ φςτερα από τθν επαναλαμβανόμενθ εφαρμογι του ηιηανιοκτόνου nicosulfuron ςε διαφορετικά επίπεδα δόςεων (x0, x10, x100, x1000 τθσ ςυνιςτϊμενθσ). Σα αποτελζςματα παρουςιάηονται ξεχωριςτά για κάκε κφκλο επζμβαςθσ. Κάκε τιμι αντιςτοιχεί ςτο μζςο όρο 3 επαναλιψεων ± τυπικι απόκλιςθ. Ράβδοι που ζχουν ςθμανκεί με το ίδιο γράμμα δεν διαφζρουν ςτατιςτικϊσ ςθμαντικά ςτον ίδιο κφκλο επζμβαςθσ. 235

236 ΠΔΗΡΑΜΑ ΑΓΡΟΤ Δπίδξαζε ηνπ nicosulfuron ζηελ αθζνλία ησλ ΑΟΒ ηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ (two-way ANOVA, Duncan Test) έδεζλε υηζ δ δυζδ εθανιμβήξ ημο nicosulfuron, ςξ ηφνζμξ πανάβμκηαξ, δεκ επδνέαζε ζδιακηζηά ηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ ζημ έδαθμξ (p=0.479), υπςξ αοηή εηθνάγεηαζ απυ ημκ ανζειυ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ακά ng DNA. Ακηίεεηα, μ πνυκμξ δεζβιαημθδρίαξ, ςξ ηφνζμξ πανάβμκηαξ, θαίκεηαζ υηζ πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p=0.027) ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ ζημ έδαθμξ ιε ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ αθεμκίαξ κα ειθακίγεηαζ αιέζςξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ημο nicosulfuron ηαζ ζε υθεξ ηζξ οπυθμζπεξ δεζβιαημθδρίεξ ζε ζπέζδ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ πνζκ ηδκ εθανιμβή ημο nicosulfuron. Σέθμξ, μζ αθθδθεπζδνάζεζξ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ (επίπεδμ δυζδξ nicosulfuron x πνυκμξ δεζβιαημθδρίαξ) δεκ θαίκεηαζ κα πνμηαθμφκ ζδιακηζηέξ (p=0.458) ιεηααμθέξ ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ ζημ έδαθμξ (Γζάβναιια 3.13). Διάγραμμα Πείραμα αγροφ: Οι μεταβολζσ ςτον αρικμό αντιγράφων του γονιδίου amoa των ΑΟΒ ςτον χρόνο φςτερα από τθν εφαρμογι διαφορετικϊν δόςεων του ηιηανιοκτόνο nicosulfuron (x0, x1, x5 τθσ ςυνιςτϊμενθσ). Κάκε τιμι αντιςτοιχεί ςτο μζςο όρο 4 επαναλιψεων ± τυπικι απόκλιςθ. 236

237 Δπίδξαζε ηνπ nicosulfuron ζηελ αθζνλία ησλ ΑΟΑ ηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ (two-way ANOVA, Duncan Test) έδεζλε υηζ μζ δφμ ηφνζμζ πανάβμκηεξ δδθ. δυζεζξ nicosulfuron ηαζ πνυκμξ δεζβιαημθδρίαξ πνμηάθεζακ ζηαηζζηζηά ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p=0.032 ηαζ p<0.001, ακηίζημζπα) ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ ζημ έδαθμξ. Ακαθμνζηά ιε ηδκ επίδναζδ ηδξ δυζδξ ημο nicosulfuron (ςξ ηφνζμξ πανάβμκηαξ) δ εθανιμβή ηδξ δυζδξ 5x μδήβδζε ζε ζδιακηζηή ιείςζδ (p<0.05) ημο ανζειμφ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΑ ζημ έδαθμξ ζε ζπέζδ ιε ηζξ οπυθμζπεξ ιεηαπεζνίζεζξ (0x, 1x). Ακαθμνζηά ιε ηδκ επίδναζδ ημο πνυκμο δεζβιαημθδρίαξ, ςξ ηφνζμο πανάβμκηα, ζδιακηζηά ορδθυηενεξ ηζιέξ ημο ανζειμφ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΑ ηαηαβνάθδηακ ζηζξ 2 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ημο nicosulfuron ζε ζπέζδ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ πνζκ ηδκ εθανιμβή ημο γζγακζμηηυκμο. Ακηίεεηα, ζδιακηζηά παιδθυηενεξ ηζιέξ ημο ανζειμφ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΑ ηαηαβνάθδηακ ιε ημ ηέθμξ ημο πεζνάιαημξ (116 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ) ζε ζπέζδ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ ζε υθεξ ηζξ πνμδβμφιεκεξ δεζβιαημθδρίεξ. οκμθζηά, δ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ ακελανηήηςξ δυζδξ εθανιμβήξ πανμοζίαζε ζδιακηζηή αφλδζδ αιέζςξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ημο nicosulfuron αημθμοεμφιεκδ απυ ζηαδζαηή ιείςζδ ηδξ αθεμκίαξ ημοξ πμο έθηαζε ζηα παιδθυηενα επίπεδα ζημ ηέθμξ ημο πεζνάιαημξ αβνμφ. Σέθμξ δεκ παναηδνήεδηακ ζδιακηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ (επίπεδμ δυζδξ nicosulfuron x πνυκμξ δεζβιαημθδρίαξ) (p=0.267) (Γζάβναιια 3.14). 237

238 Πίνακασ Πείραμα αγροφ: Οι μεταβολζσ ςτον αρικμό αντιγράφων του γονιδίου amoa των ΑΟΑ ςτον χρόνο φςτερα από τθν εφαρμογι διαφορετικϊν δόςεων του ηιηανιοκτόνο nicosulfuron (x0, x1, x5 τθσ ςυνιςτϊμενθσ). Κάκε τιμι αντιςτοιχεί ςτο μζςο όρο 4 επαναλιψεων ± τυπικι απόκλιςθ πδήηεζε ηδκ πανμφζα ιεθέηδ εηηζιήεδηακ μζ επζδνάζεζξ ημο εονέςξ πνδζζιμπμζμφιεκμο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονίςκ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ηυζμ ζε επίπεδμ εενιμηδπίμο υζμ ηαζ ζε επίπεδμ αβνμφ. ηδκ πνχηδ πενίπηςζδ (πείναια εενιμηδπίμο) αλζμθμβήεδηε δ επίδναζδ ημο nicosulfuron ζημοξ ΑΟΜ ζε ζδζαίηενα ορδθά επίπεδα έηεεζδξ ηαζ ιε επακαθαιαακυιεκεξ εθανιμβέξ χζηε κα επζηεοπεεί ιαηνμπνυκζα έηεεζδ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζημ γζγακζμηηυκμ. Ακηίεεηα ζημ πείναια αβνμφ, αλζμθμβήεδηε δ επίδναζδ ημο nicosulfuron ζημοξ ΑΟΜ ζε παιδθυηενα επίπεδα έηεεζδξ πμο πνμζμιμζάγμοκ ηδκ ημζκή βεςνβζηή πναηηζηή. Έηζζ αημθμοεήεδηε έκαξ ζπεδζαζιυξ αλζμθυβδζδξ ηδξ ημλζηυηδηαξ ημο nicosulfuron ζημοξ ΑΟΜ, πμο επζθέπεδηακ ςξ δείηηεξ ιζηνμαζαηήξ θεζημονβίαξ, ζε επίπεδμ ακάθοζδξ Η (Tier I, Worst case scenario) ηαζ ΗΗ (Tier II) ζπεδζαζιυξ πμο απμηεθεί ημζκή πναηηζηή βζα ηδκ αλζμθυβδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζε μνβακζζιμφξ ιδζηυπμοξ ζφιθςκα ιε ηδκ Δονςπασηή Νμιμεεζία (ΔΚ 1107/2009). 238

239 Ανηεημί ενεοκδηέξ έπμοκ ιεθεηήζεζ ηδκ επίδναζδ ηδξ εενιμηναζίαξ (Avrahami et al., 2003) ημο ph (Nicol et al., 2008), ηδξ αθαηυηδηαξ (Santoro et al., 2008) ηαζ ηςκ αγςημφπςκ θζπαζιάηςκ (Shen et al., 2008) ζηδκ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ ηαζ ηςκ ΑΟΑ. Χζηυζμ, πενζμνζζιέκεξ είκαζ μζ ιεθέηεξ πμο έπμοκ δζελαπεεί βζα ηδ δζενεφκδζδ ηδξ επίδναζδξ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηζξ ημζκυηδηεξ ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ πμο απμηεθμφκ ζδιακηζηέξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ βζα ηδκ θεζημονβία ημο ηφηθμο ημο Ν. Δπζπνυζεεηα, ζήιενα δεκ οπάνπμοκ ακαθμνέξ ζπεηζηά ιε ηδκ επίδναζδ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ ηαζ εζδζηυηενα ημο nicosulfuron, ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ, ηυζμ ζε επίπεδμ αβνμφ υζμ ηαζ ζε επίπεδμ ιζηνυημζιςκ Δπίδξαζε ηνπ nicosulfuron ζηε ζύζηαζε ηεο θνηλόηεηαο ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο Ζ επίδναζδ ημο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ, εηηζιήεδηε ιε PCR-DGGE ακάθοζδ ζε επίπεδμ DNA. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, πναβιαημπμζήεδηε εκίζποζδ (1) ημο 16S rrna βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ ηαζ (2) ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ. Ζ δζαθμνεηζηή αοηή πνμζέββζζδ πνμέηορε θυβς αδοκαιίαξ παναθααήξ, ζηαεενά ηαζ επακαθαιαακυιεκα, πνμσυκηςκ εκίζποζδξ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ, ιε εηηζκδηέξ ημοξ amo1f+gc ηαζ amo2r (Nicolaisen and Ramsing, 2002). Ακάθμβα πνμαθήιαηα ιε ημ ζοβηεηνζιέκμ γεφβμξ εηηζκδηχκ έπμοκ ακαθενεεί ηαζ απυ άθθμοξ ενεοκδηέξ πμο ηαηέθδλακ πςξ βζα ηδκ αδοκαιία αοηή εοεφκεηαζ είηε δ πανμοζία ηδξ πθμφζζαξ ζε γεφβδ βμοακίκδξ-ηοημζίκδξ (GC clamp) αθθδθμοπίαξ ζημ 5 άηνμ ημο amo1f+gc εηηζκδηή (Nicol et al., 2008), είηε μ παιδθυξ πθδεοζιυξ ηςκ ΑΟΒ ζημ έδαθμξ (Offre et al., 2009). Σα ηφνζα ιεζμκεηηήιαηα ημο 16S rrna βμκζδίμο ςξ ιμνζαημφ δείηηδ είκαζ: (α) υηζ δεκ ζπεηίγεηαζ απαναίηδηα ιε ηδ θοζζμθμβία ηςκ μνβακζζιχκ ζηυπςκ ηαζ (α) δ ακ ηαζ ζπεηζηά πενζμνζζιέκδ, έθθεζρδ ελεζδίηεοζδξ, πμο ιπμνεί κα δζεονφκεζ ημ θάζια ηςκ αθθδθμοπζχκ πμο εκζζπφμκηαζ ηαηά ηδκ PCR ακηίδναζδ χζηε κα πενζθάαεζ θοθμβεκεηζηά ζοββεκείξ αθθά θοζζμθμβζηά ηαζ μζημθμβζηά δζαθμνεηζημφξ μνβακζζιμφξ (Junier et al., 2010). Χζηυζμ, ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ πνδζζιμπμζήεδηε ημ γεφβμξ ηςκ CTO εηηζκδηχκ (CTO189fABC ηαζ CTO654r) πμο πενζβνάθδηε ανπζηά απυ ημοξ Kowalchuk et al., (1997) ηαζ πνμμνίγεηαζ εζδζηά ηαζ απμηθεζζηζηά βζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ α-πνςηεμααηηδνίςκ. 239

240 ημ πείναια εενιμηδπίμο παναηδνήεδηακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ απυ ημκ δεφηενμ ηφηθμ επέιααζδξ ηαζ ιεηά. Ακηίεεηα, ζηαεενή πανέιεζκε ζε βεκζηέξ βναιιέξ δ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΑ. Σα απμηεθέζιαηα ηδ πανμφζαξ ιεθέηδξ ανίζημκηαζ ζε ακηίεεζδ ιε εηείκα ηςκ Saeki ηαζ Toyota (2004) πμο ανήηακ υηζ ημ γζγακζμηηυκμ bensulfuron-methyl ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ υηακ πνδζζιμπμζήεδηε ζε δυζεζξ 1x ηαζ 10x δεκ πνμηάθεζε ιεηααμθέξ ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ υπςξ αοηή πνμζδζμνίζηδηε ιε 16S rdna DGGE ακάθοζδ. Ζ δζαθμνά αοηή ιπμνεί κα απμδμεεί ζηδκ ιζηνυηενδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ ιε ημ bensulfuron-methyl (60 διένεξ έκακηζ 116 διένεξ), αθθά ηαζ ζηδ ιζα ηαζ ιμκαδζηή επέιααζδ πμο πναβιαημπμζήεδηε ιε ημ γζγακζμηηυκμ ζε ακηίεεζδ ιε ημοξ 5 επακαθαιαακυιεκμοξ ηφηθμοξ εθανιμβχκ πμο πναβιαημπμζήεδηακ ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ. ε πανυιμζεξ ιεθέηεξ μζ Hernandez et al., (2011), ζηδνζγυιεκμζ ζε ακάθοζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΜ, παναηήνδζακ υηζ εθανιμβή ημο γζγακζμηηυκμο simazine ζε δυζεζξ 4-5 θμνέξ ορδθυηενδ ηδξ ζοκζζηχιεκδξ, πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ ζημ έδαθμξ, εκχ δ ημζκυηδηα ηςκ ΑΟΑ δεκ επδνεάζηδηε. Ακάθμβα ήηακ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ ιεθέηδξ ηςκ Crouzet et al., (2009) πμο ηαηέθδλακ υηζ ημ γζγακζμηηυκμ mesotrione ζε δυζδ 100x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ, εκχ ηα ΑΟΑ απμδείπεδηακ πζμ ακεεηηζηά ζηδκ επίδναζδ ημο βεςνβζημφ θανιάημο. Ακηίεεηα μζ Puglisi et al., (2012) παναηήνδζακ υηζ ηα ιοηδημηηυκα penconazole ηαζ cyprodinil πνμηάθεζακ ζδιακηζηυηενεξ αθθαβέξ ζηδ δμιή ηςκ ημζκμηήηςκ ηςκ ΑΟΑ ζοβηνζηζηά ιε αοηέξ ηςκ ΑΟΒ. Ζ δζαθμνά αοηή ζε ζπέζδ ιε ηζξ πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ ιπμνεί κα μθείθεηαζ ζηδ δζαθμνεηζηή θφζδ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ (ιοηδημηηυκα έκακηζ γζγακζμηηυκμο) αθθά ηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ δ ιεθέηδ ηςκ Puglisi et al. (2012) πναβιαημπμζήεδηε υπζ ζε έδαθμξ αθθά ζε ζηνχια μνβακζηχκ οθζηχκ. ηδκ πανμφζα ιεθέηδ δεκ ήηακ δοκαηή δ απεοεείαξ ζφβηνζζδ ηδξ εοαζζεδζίαξ/ακηίδναζδξ ηςκ ΑΟΒ έκακηζ ηςκ ΑΟΑ ζηδκ έηεεζδ ημοξ ζημ nicosulfuron ηαεχξ δ ιμνζαηή απμηφπςζδ ηςκ δφμ ημζκμηήηςκ ζηδνίπηδηε ζε δζαθμνεηζημφξ βμκζδζαημφξ ηυπμοξ (16S rrna vs amoa). ε ακηίεεζδ ιε ημ πείναια εενιμηδπίμο ζημ πείναια αβνμφ δεκ παναηδνήεδηακ δμζμ-ελανηχιεκεξ ιεηααμθέξ ζηδ δμιή ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ πμο ιεθεηήεδηακ. Ζ ιδ παναηήνδζδ εηηεηαιέκςκ ιεηααμθχκ ζηδκ ημζκυηδηα ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ ζημ πείναια αβνμφ ζε ζπέζδ ιε ημ πείναια εενιμηδπίμο ιπμνεί κα 240

241 απμδμεεί 1) ζηα ζδιακηζηά παιδθυηενα επίπεδα δυζεςκ πμο αλζμθμβήεδηακ ζημκ αβνυ ηαζ 2) ζηδκ ιζα εθανιμβή ημο γζγακζμηηυκμο ηαηά ηδκ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ αβνμφ (ζφιθςκα ιε ηδκ βεςνβζηή πναηηζηή) ζε ζπέζδ ιε ηζξ επακαθαιαακυιεκεξ εθανιμβέξ πμο πναβιαημπμζήεδηακ ζημ πείναια εενιμηδπίμο. Μέπνζ ζήιενα δεκ οπάνπμοκ ζηδ αζαθζμβναθία ιεθέηεξ πμο κα έπμοκ ελεηάζεζ ηδκ επίδναζδ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ δμιή ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ιε πεζνάιαηα αβνμφ ηαζ ςξ εη ημφημο δεκ είκαζ δοκαηυκ κα πνμαμφιε ζε ακάθμβεξ ζοβηνίζεζξ. Πανυθαοηα ηα απμηεθέζιαηα ιαξ δείπκμοκ υηζ δ εθανιμβή ημο nicosulfuron ζηδκ ζοκζζηχιεκδ ή έζης ηαζ 5 θμνέξ πμθθαπθάζζα ηδξ ζοκζζηχιεκδξ δυζδξ δεκ θαίκεηαζ κα πνμηαθεί ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδκ ημζκυηδηα ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ Δπίδξαζε ηνπ nicosulfuron ζηελ αθζνλία ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο Οζ πζεακέξ επζδνάζεζξ ημο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ πνμζδζμνίζηδηακ ιε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ιέζς ηδξ ιέηνδζδξ ημο ανζειμφ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ζημ έδαθμξ. Ο ανζειυξ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟB ήηακ ορδθυηενμξ ημο ακηίζημζπμο ηςκ ΑΟA ζηζξ πενζζζυηενεξ ιεηαπεζνίζεζξ ηαζ πνυκμοξ, ζημ πείναια αβνμφ ζε ακηίεεζδ ιε ημ πείναια εενιμηδπίμο υπμο μ ανζειυξ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΑ ήηακ ορδθυηενμξ ημο ακηίζημζπμο ηςκ ΑΟΒ ζηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ (Γζάβναιια 3.10). Ανηεηέξ πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ ζε πεζνάιαηα ιζηνυημζιςκ έπμοκ δείλεζ υηζ ηα AOA οπενηενμφκ ανζειδηζηά ηςκ ΑΟΒ (Erguder et al., 2009, Chen et al., 2008, Adair and Schwartz, 2008, Leininger et al., 2006, Nicol and Schleper, 2006). Χζηυζμ, ζηδ δζεεκή αζαθζμβναθία οπάνπμοκ ακαθμνέξ υπμο μζ ημζκυηδηεξ ηςκ ΑΟΒ οπενζζπφμοκ πθδεοζιζαηά αοηχκ ηςκ ΑΟΑ (Jia and Conrad, 2009, Prosser and Nicol, 2008, Shen et al., 2008). ηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ ημ βεβμκυξ αοηυ απμδίδεηαζ ζε δζαθμνέξ ζηζξ ηζιέξ ημο εδαθζημφ ph. Γεκζηά, ηα ΑΟΑ οπενηενμφκ ανζειδηζηά ζε εδάθδ ιε υλζκμ ph, εκχ δ αθεμκία ημοξ ιεζχκεηαζ ηαεχξ ημ ph αολάκεηαζ ηαζ παίνκεζ ηζιέξ πάκς απυ 7.0 (Nicol et al., 2008). Δπίζδξ ηα ΑΟΑ οπενζζπφμοκ ανζειδηζηά έκακηζ ηςκ ΑΟΒ ζε ιεβαθφηενα εδαθζηά αάεδ (Leininger et al., 2006). ηδκ πνμηεζιέκδ πενίπηςζδ, ημ εδαθζηυ ph έπεζ ηζιή 6.96 ηαζ ηα δείβιαηα εδάθμοξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζοθθέπεδηακ απυ αάεμξ 0-10 cm. 241

242 Ακηίεεηα, ζημ πείναια εενιμηδπίμο μζ πθδεοζιμί ηςκ ΑΟΑ ειθακίγμκηαζ ίδζμζ ή ηαζ ορδθυηενμζ ηςκ ακηζζημίπςκ ηςκ ΑΟΒ, πζεακυκ θυβς ηδξ έκημκδξ πίεζδξ πμο αζημφκ μζ επακαθαιαακυιεκμζ ηφηθμζ επέιααζδξ, δεδμιέκμο υηζ ηα ΑΟΑ ιπμνμφκ ηαζ πνμζανιυγμκηαζ ζε εονφ θάζια ζοκεδηχκ, πανμοζζάγμοκ εοπνμζάνιμζημ ιεηααμθζζιυ, εκχ πζεακμθμβείηαζ υηζ έπμοκ ηδ δοκαηυηδηα κα ακαπηφζζμκηαζ ιζηηυηνμθα αθμιμζχκμκηαξ μνβακζηέξ εκχζεζξ ςξ πδβέξ άκεναηα (Prosser and Nicol, 2008, Leininger et al., 2006, Nicol and Schleper, 2006). ημ πείναια εενιμηδπίμο, παναηδνήεδηε ορδθή παναθθαηηζηυηδηα ιεηαλφ ηςκ επακαθήρεςκ ηδξ ίδζαξ ιεηαπείνζζδξ, εκχ δεκ παναηδνήεδηε ηάπμζμ ζαθέξ πνυηοπμ επίδναζδξ ηςκ δζαθυνςκ επζπέδςκ δυζεςκ ημο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ ζημ έδαθμξ. Δλαίνεζδ απμηέθεζε δ ζηαεενή αφλδζδ ηδξ αθεμκίαξ ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ηδξ ορδθυηενδξ δυζδξ nicosulfuron (1000x) ζημκ πέιπημ ηφηθμ επέιααζδξ. Ζ παναηήνδζδ αοηή ανίζηεηαζ ζε ακηίεεζδ ιε ηδ ιεθέηδ ηςκ Chang et al., (2001) πμο ανήηακ υηζ δ εθανιμβή ιίβιαημξ γζγακζμηηυκςκ ιε δζαθμνεηζηυ ηνυπμ δνάζδξ ζε δυζδ ίζδ ιε 100 ppm, πνμηάθεζε ιείςζδ ηδξ αθεμκίαξ ημο πθδεοζιμφ ηςκ ΑΟΒ. ε πανάθθδθεξ ιεηνήζεζξ πμο δζελάπεδηακ ζημ πείναια εενιμηδπίμο βζα κα δζαπζζηςεεί δ ζοιπενζθμνά ημο nicosulfuron φζηενα απυ ημοξ επακαθαιαακυιεκμοξ ηφηθμοξ επέιααζδξ, βζα ηδ ιέβζζηδ δυζδ επέιααζδξ (1000x), παναηδνήεδηε ιζα ιείςζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο nicosulfuron ιεηαλφ πνχημο ηαζ δεφηενμο ηφηθμο επέιααζδξ, εκχ ζηδ ζοκέπεζα ζημοξ επυιεκμοξ 3 δζαδμπζημφξ ηφηθμοξ επέιααζδξ παναηδνήεδηε ζηαδζαηή αφλδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο nicosulfuron μδδβχκηαξ ζηδκ ζηαδζαηή ζοζζχνεοζδ ημο γζγακζμηηυκμ ζημ έδαθμξ ζε ζδζαίηενα ορδθά επίπεδα (Γζάβναιια 3.15). Ζ αφλδζδ ηδξ αθεμκίαξ ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ αφλδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο nicosulfuron ζημ έδαθμξ ζημκ πέιπημ ηφηθμ εθανιμβήξ εα ιπμνμφζε κα απμδμεεί ζηδκ έκημκδ πίεζδ επζθμβήξ πμο αζηείηαζ ζημοξ ζοβηεηνζιέκμοξ πθδεοζιμφξ ζηα πθαίζζα ηςκ επακαθαιαακυιεκςκ ηφηθςκ εθανιμβήξ, ιε απμηέθεζια κα επζαζχκμοκ ηαζ κα πμθθαπθαζζάγμκηαζ ηαπφηενα μζ ακεεηηζηυηενμζ απυ αοημφξ. Σέθμξ, ζπεδυκ απίεακμ εεςνείηαζ ημ εκδεπυιεκμ μζ ιζηνμμνβακζζιμί κα πνδζζιμπμζμφκ ηδκ πενίζζεζα ημο nicosulfuron ςξ πδβή αφλδζδξ ηαζ ακάπηολδξ, ηαεχξ μζ κζηνςδμπμζδηέξ είκαζ πδιεζμθζεμαοηυηνμθμζ ιζηνμμνβακζζιμί ηαζ παναηηδνίγμκηαζ βεκζηά απυ παιδθμφξ νοειμφξ ακάπηολδξ (Kowalchuck and Stephen, 2001, Scleper and Nicol, 2010). 242

243 Nicosulfuron (μg kg -1 ξηπού βάποςρ εδάφοςρ) Κύκλοι Επέμβαζηρ Διάγραμμα Μεταβολι τθσ ςυγκζντρωςθσ του nicosulfuron ςτουσ διαδοχικοφσ κφκλουσ επζμβαςθσ για τθ δόςθ 1000x, ςτο πείραμα κερμοκθπίου (όπωσ προςδιορίςτθκε ςτα πλαίςια του προγράμματοσ τθσ SEE-ERA-NET). ημ πείναια αβνμφ παναηδνήεδηε ιείςζδ ηδξ αθεμκίαξ ηςκ ΑΟΑ ζε δείβιαηα πμο δέπηδηακ επέιααζδ ιε ηδκ ορδθυηενδ δυζδ (5x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ) nicosulfuron, ζε ζπέζδ ιε ηα ακηίζημζπα πμο δέπηδηακ επέιααζδ ιε ηδκ ζοκζζηχιεκδ δυζδ (1x) ηαζ ημ ιάνηονα (ηφνζα επίδναζδ). ε ζπέζδ ιε ημ πνυκμ δεζβιαημθδρίαξ παναηδνήεδηε αφλδζδ ηδξ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ 2 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ ιε ημ nicosulfuron ηαζ ακηίζημζπδ ιείςζδ ιέπνζ ημ ηέθμξ ημο πεζνάιαημξ (ηφνζα επίδναζδ). Ακηίεεηα, δ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ δεκ επδνεάζηδηε απυ ηδ δυζδ εθανιμβήξ, αθθά ιυκμ απυ ημ πνυκμ ηδξ δεζβιαημθδρίαξ. οβηεηνζιέκα, παναηδνήεδηε ιείςζδ ηδξ αθεμκίαξ ηςκ ΑΟΒ ζε υθμοξ ημοξ πνυκμοξ ιεηά ηδκ επέιααζδ. Ακάθμβεξ ιεηααμθέξ ζηδ ζφζηαζδ ηςκ ημζκμηήηςκ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ζε ζοκάνηδζδ ιε ημ πνυκμ, έπμοκ παναηδνδεεί ζημ πανεθευκ ζε πεζνάιαηα ιζηνυημζιςκ πμο αθμνμφζακ ζηδ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ βεςνβζηχκ θανιάηςκ (Spyrou et al., 2009) ηαζ ζε ιεευδμοξ ηαπκζζιμφ ημο εδάθμοξ (Omirou et al., 2010) ηαζ απμδίδμκηαζ ζηδ ααειζαία ιείςζδ ηςκ δζαεέζζιςκ ενεπηζηχκ ζημζπείςκ βζα ηδ ιζηνμαζαηή αζμιάγα. Πανά ηζξ υπμζεξ ηφνζεξ επζδνάζεζξ ηςκ ηονίςκ παναβυκηςκ, δυζδ επέιααζδξ ηαζ πνυκμξ δεζβιαημθδρίαξ, δεκ παναηδνήεδηε ηάπμζμ πνμκζηυ πνυηοπμ δμζμ-ελανηχιεκςκ ιεηααμθχκ ζηδ αθεμκία ηςκ πθδεοζιχκ ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ. Σα απμηεθέζιαηα απυ ημ πείναια αβνμφ απμηεθμφκ ηδκ πνχηδ ακαθμνά 243

244 ιεθέηδξ ηδξ επίδναζδξ ελςβεκχκ ηαηαπμκήζεςκ υπςξ είκαζ δ εθανιμβή βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ πκπεξάζκαηα ηδκ πανμφζα ιεθέηδ εηηζιήεδηακ μζ επζδνάζεζξ ημο εονέςξ πνδζζιμπμζμφιεκμο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονίςκ ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ηυζμ ζε επίπεδμ ιζηνμηυζιςκ (πείναια εενιμηδπίμο) υζμ ηαζ ζημκ αβνυ. ημ πείναια εενιμηδπίμο, πμο απμηέθεζε έκα ζδζαίηενα ζοκηδνδηζηυ ζεκάνζμ αλζμθυβδζδξ ηδξ ημλζηυηδηαξ ημο nicosulfuron ζημοξ ΑΟΜ (Tier I), μζ δζαδμπζημί ηφηθμζ επέιααζδξ ιε ζδζαίηενα ορδθέξ δυζεζξ ημο nicosulfuron μδήβδζακ ζε ιεηααμθέξ ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ ζδζαίηενα απυ ημκ δεφηενμ ηφηθμ επέιααζδξ ηαζ ιεηά εκχ δ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΑ δεκ επδνεάζηδηε ζδιακηζηά. Ακηίεεηα, δ ζδζαίηενα ορδθή ηαζ ιαηνμπνυκζα έηεεζδ ηςκ ΑΟΜ ζημ nicosulfuron δεκ θάκδηε κα πνμηαθεί λεηάεανεξ δμζμ-ελανηχιεκεξ ιεηααμθέξ ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ. Πεναζηένς ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ημο nicosulfuron ζε πενζζζυηενμ νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ αβνμφ (παιδθυηενεξ δυζεζξ ηαζ ιία εθανιμβή) έδεζλε υηζ δ εθανιμβή ημο nicosulfuron ζε ζοκεήηεξ αβνμφ δεκ πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ, πμο κα ζπεηίγμκηαζ ιε ηδ δυζδ εθανιμβήξ, εκχ επίζδξ δεκ παναηδνήεδηε ζαθέξ πνυηοπμ επίδναζδξ ηςκ δζαθμνεηζηχκ επζπέδςκ δυζεςκ ημο nicosulfuron ζηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζε ζπέζδ ιε ημ πνυκμ δεζβιαημθδρίαξ. Σα απμηεθέζιαηα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ απμηεθμφκ ηδκ πνχηδ ςξ ηχνα ακαθμνά ζπεηζηά ιε ηδκ επίδναζδ ημο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονίςκ ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ απαναίηδηςκ βζα ηδκ μθμηθήνςζδ ημο ηφηθμο ημο αγχημο, κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ. 244

245 3.7. Βηβιηνγξαθία Adair, K.L., Schwartz, E. (2008) Evidence that ammonia-oxidizing archaea are more abundant than ammonia-oxidizing bacteria in semiarid soils of Northern Arizona, USA. Microbiol Ecol 56: Allievi, L., Gigliotti, C. (2001) Response of the bacteria and fungi of two soils to the sulfonylurea herbicide cinosulfuron. J Environ Sci Health B 36: Avrhami, S., Conrad, R. (2003) Patterns of community change among ammonia oxidizers in meadow soils upon long-term incubation at different temperatures. Appl Environ Microb 69: Boldt, T.S., Jacobsen, C.S. (1998) Different toxic effects of the sulfonylurea herbicides metsulfuron methyl and trifensulfuron methyl on fluorescent pseudomonads isolated from an agricultural soil. FEMS Microbiol Lett 161: Chang, Y-J., Anwar Hussain, A.K.M., Stephen, J.R., Mullen, M.D., White, D.C., Peacock, A. (2001) Impact of herbicides on the abundance and structure of indigenous α-subgroup ammonia-oxidizer communities in soil microcosms. Environ Toxicol Chem 20: Chen, X.-P., Zhu, Y.-G., Xia, Y., Shen, J.-P., He J.-Z. (2008) Ammonia-oxidizing archaea: important players in paddy rhizosphere soil? Environmental Microbiology 10: Crouzet, O., Besse-Hogan, P., Batisson, I., Bonnemoy, F., Bohatier, J., Mallet, C. (2009) Responses of soil microorganisms to the herbicide mesotrione in microcosm experiments: from whole microbial communities to functional groups. Proceedings of the Symposium in Pesticide behaviour in soils, water and air. York, UK, September 14-16, pp Damalas, C.A., Lithourgidis, A.S., Eleftherohorinos, I.G. (2012) Echinochloa species control in maize (Zea mays L.) with sulfonylurea herbicides applied alone and in mixtures with broadleaf herbicides. Crop Protection 34: Djuric, S., Jarak, M. (2006) The effect of sulphonylurea herbicides on the microbial activity in soil under maize. Annals of the Faculty of Engineering Hunedoara, Tome IV, Fascicole 2, (ISSN ). 245

246 Erguder, T.H., Boon, N., Wittebolle, L., Marzorati, M., Verstraete, W. (2009) Environmental factors shaping the ecological niches of ammonia-oxidizing archaea. FEMS Microbiol Rev 33: Filimon, M.N., Borozan, A.B., Bordean, D.M., Popescu, R., Gotia, S.R., Verdes, D., Adrian, S. (2011) Sulphonylureic herbicidal risk in the detection of soil fungi communities. Afr J Microbiol Res 5: Filimon, M.N., Popescu, R., Borozan, A.B., Bordean, D.M.,Dumitrescu, G., Voia, S.O. (2012) Influence of xenobiotic substances on actinomycete communities in soil. Animal Science and Biotechnologies 45: Forlani, G., Mantelli, M., Branzoni, M., Nielsen, E., Favilli, F. (1995) Differential sensitivity of plant-associated bacteria to sulfonylurea and imidazolinone herbicides. Plant Soil 176: Francis, C.A., Roberts, K.J., Beman, J.M., Santoro, A.E., Oakley, B.B. (2005) Ubiquity and diversity of ammonia-oxidizing archaea in water columns and sediments of the ocean. PNAS 102: Green, S.J. (2005) A guide to DGGE (V2). In: pbnxzdgvmyw5qz3jlzw58z3g6nzzhzmu0m2i2ndcwngq0nq. Hernández, M., Jia, Z., Conrad, R., Seeger, M. (2011) Simazine application inhibits nitrification and changes the ammonia-oxidizing bacterial communities in a fertilized agricultural soil. FEMS Microbiol Ecol 78: Ismail, B.S., Goh, K.M., Kader, J. (1996) Effects of metsulfuron-methyl on microbial biomass and populations in soils. J Environ Sci Health B 31: Jia, Z.J., Conrad, R. (2009). Bacteria rather than Archaea dominate microbial ammonia oxidation in an agricultural soil. Environ Microbiol 11: Junier, P., Molina, V., Dorador, C., Hadas, O., Kim, O.-S., Junier, T., Witzel, K.-P., Imhoff, J.F. (2010) Phylogenetic and functional marker genes to study ammonia-oxidising microorganisms (AOM) in the environment. Appl Microbiol Biotechnol 85: Karpouzas, D.G., Ntougias, S., Iskidou, E., Rousidou, C., Papadopoulou K.K., Zervakis, G.I., Ehaliotis, C. (2010) Οlive mill wastewater affects the structure of soil bacterial communities. Applied Soil Ecology 45: Kowalchuk, G.A., Stephen, J.R, De Boer, W., Prosser, J.I, Embley, T.M., Woldendorp, J.W. (1997) Analysis of ammonia-oxidizing bacteria of the beta 246

247 subdivision of the class Proteobacteria in coastal sand dunes by denaturing gradient gel electrophoresis and sequencing of PCR-amplified 16S ribosomal DNA fragments. Appl Environ Microbiol 63: Kowalchuk, G.A., Stephen, J.R. (2001) Ammonia-oxidizing bacteria: a model for molecular microbial ecology. Ann Rev Microbiol 55: Leininger, S., Urich, T., Schloter, M., Schwark, L., Qi, J., Nicol, G.W., Prosser, J.I., Schuster, S.C., Schleper, C., (2006). Archaea predominate among ammoniaoxidizing prokaryotes in soils. Nature 442: Li, X., Zhang, H., Wu, M., Su, Z., Zhang, C. (2008) Impact of acetochlor on ammonia-oxidizing bacteria in microcosm soils. Journal of Environmental Sciences 20: Liu, Y.-R., Zheng, Y.-M., He, J.-Z. (2012) Toxicity of profenofos to the springtail, Folsomia candida, and ammonia-oxidizers in two agricultural soils. Ecotoxicology 21: Mertens, J., Broos, K., Wakelin, S.A., Kowalchuck, G.A., Springael, D., Smolders, E. (2009) Bacteria, not archaea, restore nitrification in a zinc-contaminated soil. ISME J 3: Mertens, J., Wakelin, S.A., Broos K., McLaughlin, M.J., Smolders, E. (2010) Extent of copper tolerance and consequences for functional stability of the ammoniaoxidizing community in long-term copper contaminated soils. Environ Toxicol Chem 29: Nicol, G.W., Leininger, S., Schleper, C., Prosser, J.I. (2008) The influence of soil ph on the diversity, abundance and transcriptional activity of ammonia oxidizing archaea and bacteria. Environ Microbiol 10: Nicol, G.W., Schleper, C. (2006) Ammonia-oxidising Crenarchaeota: important players in the nitrogen cycle? Trends Microbiol 14: Nicolaisen, M. H., Ramsing, N. B. (2002) Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) approaches to study the diversity of ammonia-oxidizing bacteria. J Microbiol Meth 50: Offre, P., Prosser, J.I., Nicol, G.W. (2009) Growth of ammoniaoxidizing archaea in soil microcosm is inhibited by acetylene. FEMS Microbiol Ecol 70: Omirou, M., Rousidou, C., Bekris, F., Papadopoulou, K.K., Ehaliotis, E., Menkissoglu-Spiroudi, U., Karpouzas, D.G. (2011) Σhe impact of 247

248 biofumigation and chemical fumigation methods on the structure and function of the soil microbial community. Microb Ecol 61: Pereira e Silva, M.C., Semenov, A.V. Schmitt, H., van Elsas, J.D., Salles, J.F. (2013) Microbe-mediated processes as indicators to establish the normal operating range of soil functioning. Soil Biol Biochem (in press, /j.soilbio ). Petric, I., Philippot, L., Abbate, C., Bispo, A., Chesnot, T., Hallin, S., Laval, K., Lebeau, T., Lemanceau, P., Leyval, C., Lindström, K., Pandard, P., Romero, E., Sarr, A., Schloter, M., Simonet, P., Smalla, K., Wilke, B.-M., Martin-Laurent, F. (2011) Inter-laboratory evaluation of the ISO standard Soil quality- Method to directly extract DNA from soil samples. J Microbiol Methods 84: Prosser, J.I., Nicol, G.W. (2008) Relative contributions of archaea and bacteria to aerobic ammonia oxidation in the environment. Environ Microbiol 10: Puglisi, E., Vasiliadis, S., Demiris, C., Bassi, D., Karpouzas, D.G., Capri E., Cocconcelli, P.S., Trevisan, M. (2012) Fungicides impact on the diversity and function of non-target ammonia oxidizing microorganisms residing in a litter soil cover. Microb Ecol 64: Radivojevic, L., Gasic, S., Santric, L., Umiljendic, J.G., Vljevic, D.M. (2012) Shorttime effects of the herbicide nicosulfuron on the biochemical activity of Chernozem soil. Journal of the Serbian Chemical Society 77: Regitano, J.B., Koskinen, W.C. (2008) Characterization of nicosulfuron availability in aged soils. Journal Agricultural Food and Chemistry 56: Rotthauwe, J.H., Witzel, K.P., Liesack, W. (1997) The ammonia monooxygenase structural gene amoa as a functional marker: molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing populations. Appl Environ Microbiol 63: Ruyters, S., Mertens, J., Springael, D., Smolders, E. (2010) Stimulated activity of the soil nitrifying community accelerates community adaptation to Zn stress. Soil Biol Biochem 42: Saeki, M., Toyota, K. (2004) Effect of bensulfuron-methyl (a sulfonylurea herbicide) on the soil bacterial community of a paddy soil microcosm. Biol Fertil Soils 40:

249 Santoro, A.E., Francis, C.A., De Sieyes, N.R., Boehm, A.B. (2008) Shifts in the relative abundance of ammonia-oxidizing bacteria and archaea across physicochemical gradients in a subterranean estuary. Environ Microbiol 10: Schleper, C., Nicol, G.W. (2010) Ammonia oxidizing archaea: Genomes, physiology and ecology. Adv Microb Physiol 57: Seghers, D., Siciliano, S.D., Top, E.M., Verstraete, W. (2005) Combined effect of fertilizer and herbicide applications on the abundance, community structure and performance of the soil methanotrophic community. Soil Biol Biochem 37: Shen, J.-P., Zhang, L.-M., Zhu, Y.-G., Zhang, J.-B., He, J.-Z. (2008) Abundance and composition of ammonia oxidizing bacteria and ammonia-oxidizing archaea communities of an alkaline sandy loam. Environ Microbiol 10: Spyrou, I.M., Karpouzas, D.G., Menkissoglu-Spiroudi, U. (2009) Do botanical pesticides alter the structure of the soil microbial community. Microb Ecol 58: Tourna, M., Freitag, T.E., Nicol, G.W., Prosser, J.I. (2008) Growth, activity and temperature responses of ammonia-oxidizing archaea and bacteria in soil microcosms. Environ Microbiol 10: Wessen, E., Hallin, S. (2011) Abundance of archaeal and bacterial ammonia oxidizers Possible bioindicator for soil monitoring. Ecol Indic 11: Whelan, J.A., Russel, N.B., Whelan, M.A. (2003). A method for the absolute quantification of cdna using real time PCR. J Immunol Meth 278: Zhang, L.-M., Offre, P.R., He, J.-Z., Verhamme, D.T., Nicol, G.W., Prosser, J.I. (2010) Autotrophic ammonia oxidation by soil Thaumarchaea. PNAS 107: Zhang, T., Fang, H.H.P. (2006) Applications of real-time polymerase chain reaction for quantification of microorganisms in environmental samples. Appl Microbiol Biotechnol 70: Οιήνμο, Μ. (2009) Δπίδναζδ αγςημφπμο ηαζ εεζζηήξ θίπακζδξ ζηδκ παναβςβή βθοημζζκμθζηχκ ζημοξ ζζημφξ ηδξ νυηαξ (Eruca sativa) ηαζ ημο ιπνυημθμο (Brassica oleracea var. italica) ηαζ επζπηχζεζξ ηδξ εκζςιάηςζδξ ηςκ οπμθεζιιάηςκ ημο ιπνυημθμο ηαζ ηςκ βθοημζζκμθζηχκ ζηζξ ιζηνμαζαηέξ 249

250 ημζκυηδηεξ ημο εδάθμοξ. Γζδαηημνζηή δζαηνζαή, Γεςπμκζηυ Πακεπζζηήιζμ Αεδκχκ, Σιήια Αλζμπμίδζδξ Φοζζηχκ Πυνςκ ηαζ Γεςνβζηήξ Μδπακζηήξ. Ρμοζίδμο, Κ. (2010) Δπίδναζδ ζοκεεηζηχκ ηαζ αζμθμβζηχκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ααηηδνίςκ ηαζ ανπαίςκ. Μεηαπηοπζαηή δζαηνζαή, Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθίαξ, Σιήια Βζμπδιείαξ ηαζ Βζμηεπκμθμβία. 250

251 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 4. Δπίδξαζε ηνπ nicosulfuron ζηελ θνηλόηεηα ησλ Γελδξόκνξθσλ Μπθνξξηδηθώλ Μπθήησλ 4.1. Πεξίιεςε Ο ζδιακηζηυξ νυθμξ πμο δζαδναιαηίγμοκ μζ Γεκδνυιμνθμζ Μοημννζγζημί Μφηδηεξ (ΓΜΜ) ζηδ δζαηήνδζδ ηδξ βμκζιυηδηαξ ημο εδάθμοξ ηαεχξ ηαζ δ εοαζζεδζία πμο επζδεζηκφμοκ ζηδκ έηεεζδ ζε βεςνβζηά θάνιαηα, ημοξ ηαεζζημφκ ζηακμφξ αζμδείηηεξ βζα πνήζδ ζε πεζνάιαηα εηηίιδζδξ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ζηδκ εδαθζηή ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα. ηδκ πανμφζα ιεθέηδ, αλζμθμβήεδηε δ επίδναζδ ημο γζγακζμηηυκμο παιδθήξ δυζδξ ηαζ ορδθήξ δναζηζηυηδηαξ nicosulfuron, ζηδ δμιή ηδξ εκδμνζγζηήξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ αημθμοεχκηαξ ιζα ζηαδζαηή αλζμθυβδζδ ανπζηά ζε επίπεδμ εενιμηδπίμο ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ζε επίπεδμ αβνμφ ιε ηδ πνήζδ ηαηάθθδθςκ ιμνζαηχκ ηεπκζηχκ υπςξ PCR-DGGE. H ζηναηδβζηή αοηή αημθμοεήεδηε πνμηεζιέκμο κα αλζμθμβδεεί δ επίδναζδ ημο nicosulfuron 1) ζε ζοκεήηεξ αηναίαξ έηεεζδξ (πείναια εενιμηδπίμο) ιε επακαθαιαακυιεκεξ εθανιμβέξ ημο γζγακζμηηυκμο ζε εφνμξ δυζεςκ (x0, x10, x100 ηαζ x1000 ηδξ ζοκζζηχιεκδξ δυζδξ) ηαζ 2) ζε νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ (x0, x1, x2 ηαζ x5 ηδξ ζοκζζηχιεκδξ δυζδξ) ζημκ αβνυ. ημ πείναια εενιμηδπίμο πνμέηορε υηζ ιυκμ δ εθανιμβή ηςκ δυζεςκ 100x ηαζ 1000x μδήβδζε ζε δναζηζηή ιείςζδ ηδξ πμζηζθυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ ζηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ, βεβμκυξ πμο ζοκέπεζε ιε ηδ ζηαδζαηή ζοζζχνεοζδ ορδθχκ ζοβηεκηνχζεςκ ημο γζγακζμηηυκμο απυ ηζξ επακαθαιαακυιεκεξ εθανιμβέξ ημο ζημ έδαθμξ. Βζαθζμεήηεξ ηθχκςκ πμο δδιζμονβήεδηακ έδεζλακ υηζ ηα ιέθδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ πμο πανμοζζάζακ εοαζζεδζία ζε ορδθέξ δυζεζξ nicosulfuron ακήημοκ ζηδκ πθεζμρδθία ημοξ ζηδκ εονφηενδ μιάδα ηςκ Glomus. Ακηίεεηα δφμ νζαυηοπμζ πμο ακήημοκ θοθμβεκεηζηά ζηδκ μζημβέκεζα Paraglomeraceae ηαζ ζημ είδμξ Glomus etunicatum εκημπίζηδηακ ζηαεενά ζηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ, ζε υθμοξ ημοξ ηφηθμοξ επέιααζδξ ηαζ ηζξ δυζεζξ εθανιμβήξ, οπμδδθχκμκηαξ ακεεηηζηυηδηα ζηδκ επίδναζδ ημο nicosulfuron. οκμθζηά, μζ ημλζηέξ ζοκέπεζεξ ημο nicosulfuron ζημοξ ΓΜΜ πμο πνμηθήεδηακ ζηδκ πενίπηςζδ εθανιμβήξ ηςκ ορδθυηενςκ δυζεςκ ιπμνμφκ κα απμδμεμφκ είηε ζε άιεζδ ημλζηυηδηα ζημοξ ιφηδηεξ είηε ζε ημλζηυηδηα πμο εηδδθχκεηαζ ζηα θοηά πμο μδδβμφκ ζε ακηίζημζπεξ ανκδηζηέξ 251

252 επζπηχζεζξ ζηδ ζοιαζςηζηή ημοξ ζπέζδ ιε ημοξ ΓΜΜ. ηδκ πενίπηςζδ ημο πεζνάιαημξ αβνμφ δεκ παναηδνήεδηακ ανκδηζηέξ επζδνάζεζξ ζημοξ ΓΜΜ Δηζαγσγή Οζ Γεκδνυιμνθμζ Μοημννζγζημί Μφηδηεξ (ΓΜΜ) είκαζ οπμπνεςηζηά ζοιαζςηζημί ιζηνμμνβακζζιμί ηαζ ακαπηφζζμοκ ζπέζεζξ αιμζααζυηδηαξ ιε ηδκ ζοκηνζπηζηή πθεζμρδθία ηςκ βκςζηχκ θοηζηχκ εζδχκ (Helgason and Fitter 2005). Μέζς αοηήξ ηδξ ζοιαζςηζηήξ ζπέζδξ, μζ ΓΜΜ επςθεθμφκηαζ πνδζζιμπμζχκηαξ ηα πνμσυκηα ηδξ θςημζφκεεζδξ ηςκ θοηχκ βζα κα ηαθφρμοκ ηζξ εκενβεζαηέξ ημοξ ακάβηεξ ηαζ πανέπμοκ ζηα θοηά ςξ ακηάθθαβια αολδιέκδ ζηακυηδηα πνυζθδρδξ θςζθυνμο (P) ηαζ άθθςκ ακυνβακςκ μοζζχκ, ακημπή ζε ζοκεήηεξ λδναζίαξ ηαζ ακεεηηζηυηδηα έκακηζ θοημπαναζίηςκ ηαζ αζεεκεζχκ (Kiers et al., 2011). ηα αβνμηζηά ζοζηήιαηα ηαθθζένβεζαξ, μζ ΓΜΜ εηηίεεκηαζ ζε πθήεμξ ελςβεκχκ παναβυκηςκ υπςξ είκαζ ηα θζπάζιαηα ηαζ ηα βεςνβζηά θάνιαηα. διακηζηυξ ανζειυξ ιεθεηχκ έπεζ ηαηαδείλεζ ηδκ ανκδηζηή επίδναζδ ηςκ θζπαζιάηςκ ζημοξ ΓΜΜ (Mäder et al., 2000, Smith et al., 2011). Ακηίεεηα, ημ απμηέθεζια ηςκ αθθδθεπζδνάζεςκ ιεηαλφ ΓΜΜ ηαζ β.θ.. δεκ είκαζ ημ ίδζμ λεηάεανμ ιε ημοξ ΓΜΜ κα ακηαπμηνίκμκηαζ πμζηζθμηνυπςξ ζηδκ έηεεζδ ημοξ ζηα β.θ.. Έηζζ, απυ ηδ ιζα πθεονά, ιοηδημηηυκα υπςξ ηα fenpropimorph ηαζ fenhexamid είπακ ζαθή ακαζηαθηζηή δνάζδ ζηδκ ιεηααμθζηή δναζηζηυηδηα (Zocco et al. 2011) ηαζ ηδκ ακάπηολδ (Campagnac et al. 2008) ηςκ ΓΜΜ, εκχ απυ ηδκ άθθδ εκημιμηηυκα υπςξ ηα aldicarb, fenamiphos ηαζ dimethoate δεκ επδνέαζακ (Nemec et al. 1985, Schweiger and Jacobsen, 1998) ή αηυια ηαζ εκίζποζακ ημκ απμζηζζιυ ηςκ ΓΜΜ ηαζ ηδκ πνυζθδρδ Ρ απυ ηα θοηά (Spokes et al. 1981). Πνυζθαηεξ ιεθέηεξ ακέδεζλακ κέεξ ιμνθέξ αθθδθεπζδνάζεςκ ιεηαλφ ΓΜΜ ηαζ β.θ.. οβηεηνζιέκα, μζ ΓΜΜ ανέεδηακ κα εοκμμφκ ηδ δζάζπαζδ (Wang et al. 2011) ή ηδκ πνυζθδρδ απυ ηα θοηά β.θ.. ιε δζαζοζηδιαηζηή δνάζδ (Huang et al. 2007) ηαζ επίζδξ κα δνμοκ ζοκενβζζηζηά ιε ηα β.θ. πανέπμκηαξ ζηα θοηά πνμζηαζία έκακηζ ηςκ πνμζαμθχκ απυ θοημπαεμβυκα είδδ κδιαηςδχκ (Deliopoulos et al. 2010). Ζ ζπεηζηά ορδθή ζηακυηδηα ακηαπυηνζζδξ ηςκ ΓΜΜ ζηδκ έηεεζδ ημοξ ζηα β.θ. ζε ζοκδοαζιυ ιε ημκ ζδζαίηενμ νυθμ πμο δζαδναιαηίγμοκ ζηδ δζαηήνδζδ ηδξ βμκζιυηδηαξ ηςκ εδαθχκ ηαζ ηδξ βεκζηυηενδξ θεζημονβίαξ ημο μζημζοζηήιαημξ, ηαεζζημφκ ημοξ μνβακζζιμφξ αοημφξ πζεακμφξ αζμδείηηεξ βζα ηδκ αλζμθυβδζδ ηδξ ημλζηήξ δνάζδξ ηςκ β.θ. ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ (Wan and Rae 1998; 252

253 Giovannetti et al., 2006). Με αάζδ ηα παναπάκς, αθθά ηαζ ηδκ δζαπζζηςιέκδ έθθεζρδ ηοπμπμζδιέκςκ πνςημηυθθςκ βζα ηδκ εηηίιδζδ ηςκ επζδνάζεςκ ηςκ β.θ. ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ (Martin-Laurent et al., 2012), δ εκ δοκάιεζ πνήζδ ηςκ ΓΜΜ ςξ αζμδείηηεξ πνήγεζ πεναζηένς δζενεφκδζδξ. ηζξ πενζζζυηενεξ απυ ηζξ ιεθέηεξ πμο έπμοκ δζελαπεεί ςξ ηχνα ζπεηζηά ιε ηζξ επζδνάζεζξ ηςκ β.θ. ζημοξ ΓΜΜ, ςξ ηεθζηά ζδιεία ακαθμνάξ βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ πζεακήξ ημλζηυηδηαξ ακαθένμκηαζ δ ακάπηολδ ηςκ θοηχκ, μ ααειυξ απμζηζζιμφ ηαζ δ πνυζθδρδ Ρ, εκχ εθάπζζηα είκαζ βκςζηά ζπεηζηά ιε ηδκ επίδναζδ ηςκ β.θ. ζηδκ ηαλζκμιζηή πμζηζθυηδηα ηαζ ηδ δμιή ηαζ ηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ. Ζ εηηίιδζδ ηςκ επζδνάζεςκ ηςκ β.θ.. ζηδκ πμζηζθυηδηα ηςκ ΓΜΜ είκαζ απαναίηδηδ ακ ακαθμβζζηεί ηακείξ ημκ πνςηανπζηυ νυθμ ηςκ ΓΜΜ ζηδκ πμζηζθυηδηα ηςκ θοηζηχκ εζδχκ ηαζ ηδ θεζημονβία ημο οπένβεζμο μζημζοζηήιαημξ (van der Heijden et al., 1998). Ζ ακάπηολδ ηςκ ιμνζαηχκ ιεευδςκ ακάθοζδξ ηαηά ηα ηεθεοηαία πνυκζα αεθηίςζε ζδιακηζηά ηζξ βκχζεζξ ιαξ βζα ηδκ μζημθμβία ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ ηαζ μδήβδζε ζηδκ απμηάθορδ εκυξ άβκςζημο ηιήιαημξ ηδξ πμζηζθυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ (Rosendahl, 2007). Απυ ηα πνδζζιμπμζμφιεκα ζηδκ βεςνβζηή πνάλδ β.θ., ηα γζγακζμηηυκα ιπμνμφκ κα επδνεάζμοκ ημοξ πθδεοζιμφξ ηςκ ΓΜΜ άιεζα ή αηυια ηαζ έιιεζα επζδνχκηαξ θοημημλζηά ζηα θοηά λεκζζηέξ ημοξ (Druille et al., 2013). Σμ nicosulfuron είκαζ γζγακζμηηυκμ πμο παναηηδνίγεηαζ απυ ορδθή αζμπδιζηή δναζηζηυηδηα ηαζ εηθεηηζηυηδηα, ζε παιδθέξ δυζεζξ εθανιμβήξ. Ακήηεζ ζηδκ μιάδα ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ βζα ημκ ιεηαθοηνςηζηυ έθεβπμ εηήζζςκ αβνςζηςδχκ ηαζ πθαηφθοθθςκ γζγακίςκ ζε ηαθθζένβεζεξ ανααυζζημο (Tapia et al. 1996). Γεκ είκαζ ζδζαζηένςξ έιιμκμ ζημ έδαθμξ (Poppell et al. 2002) ηαζ δ ιζηνμαζαηή απμδυιδζδ είκαζ δ ηφνζα δζενβαζία πμο ηαεμνίγεζ ηδκ απμιάηνοκζδ ημο απυ ημ έδαθμξ (Zhang et al. 2012). Σμ Nicosulfuron ακαζηέθεζ ηδ ζφκεεζδ ημο εκγφιμο μλζημβαθαηηζηή ζοκεάζδ (ALS) ή ζοκεάζδ ημο οδνμλο-μλζημφ μλέμξ (AHAS), πμο ζοιιεηέπεζ ζημ πνχημ ζηάδζμ ηδξ αζμζφκεεζδξ ηςκ αιζκμλέςκ ιε δζαηθαδζζιέκδ αθοζίδα αηυιςκ άκεναηα, ααθίκδ, θεοηίκδ ηαζ ζζμθεοηίκδ (Babczinski and Zelinski, 1991). Σμ έκγοιμ αοηυ εηηυξ απυ ηα θοηά, απακηάηαζ ζηα ααηηήνζα ηαζ ημοξ ιφηδηεξ. Πνμδβμφιεκεξ in vitro ιεθέηεξ έπμοκ δείλεζ υηζ μζ ALS-ακαζημθείξ, υπςξ ημ nicosulfuron, ιπμνμφκ κα ακαζηείθμοκ ηδ δνάζδ ημο ζοβηεηνζιέκμο εκγφιμο ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ (Falco and Dumas, 1985, LaRossa and Schloss, 1984). Χζηυζμ, εθάπζζηα είκαζ ςξ ζήιενα βκςζηά, υζμκ αθμνά ζηζξ επζδνάζεζξ ημο 253

254 γζγακζμηηυκμο ζε μνβακζζιμφξ ιδ-ζηυπμοξ υπςξ μζ ιζηνμμνβακζζιμί ημο εδάθμοξ, ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ηαζ ηςκ ΓΜΜ. ηδ ιμκαδζηή ςξ ηχνα δζαεέζζιδ ιεθέηδ, πμο ααζίγεηαζ ζηδ πνήζδ ζφβπνμκςκ ιμνζαηχκ ηεπκζηχκ ακάθοζδξ (DGGE-16S rrna, qpcr), ανέεδηε υηζ ημ nicosulfuron δεκ πνμηαθεί ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ζηδκ αθεμκία ηαζ ηδ θεζημονβία ηςκ ιεεακυηνμθςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ, εκχ παναηδνήεδηακ πανμδζηέξ αθθαβέξ ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ εκ θυβς μνβακζζιχκ (Seghers et al., 2005). ηυπμξ ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ ήηακ μ πνμζδζμνζζιυξ ηδξ επίδναζδξ ημο nicosulfuron, πμο επζθέπεδηε ςξ ακηζπνμζςπεοηζηυξ εηπνυζςπμξ ηςκ β.θ.. ιε ηφνζμ παναηηδνζζηζηυ ηδ παιδθή δυζδ εθανιμβήξ, ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ οπυ αηναίεξ ηαζ νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ, ζημ ενβαζηήνζμ ηαζ ημκ αβνυ, ακηίζημζπα. Γζα ημ ζημπυ αοηυ πνδζζιμπμζήεδηακ ιμνζαηέξ ηεπκζηέξ βζα ηδκ απμηφπςζδ ηδξ εκδμνζγζηήξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ αθθά ηαζ βζα ηδκ πεναζηένς ηαοημπμίδζδ ηςκ ιεθχκ ηδξ ημζκυηδηαξ πμο ειθάκζζακ ακεεηηζηυηδηα ή εοαζζεδζία ζηζξ ιεηαπεζνίζεζξ ημο nicosulfuron. Ζ ιεθέηδ αοηή απμηέθεζε ιένμξ ημο ενεοκδηζημφ πνμβνάιιαημξ ECOFUN- MICROBIODIV πμο πνδιαημδμηήεδηε ζηα πθαίζζα ηδξ πνυηθδζδξ SEE.ERA.NETplus ηαζ ηαηά ηδκ δζάνηεζα ημο μπμίμο αλζμθμβήεδηε δ ημλζηυηδηα ημο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron ζηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. ημ πθαίζζμ αοηήξ ηδξ πνμζπάεεζαξ πναβιαημπμζήεδηακ πανάθθδθεξ ιεηνήζεζξ απυ άθθμοξ ενεοκδηέξ. Έηζζ πνμζδζμνίζηδηε δ πμνεία ηδξ απμδυιδζδξ ημο γζγακζμηηυκμο ζηα πεζνάιαηα εενιμηδπίμο ηαζ αβνμφ, ηα επίπεδα ιοημννζγζημφ απμζηζζιμφ ηαεχξ ηαζ δ θοηζηή αζμιάγα ημο οπένβεζμο ηαζ νζγζημφ ζοζηήιαημξ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ. Σα απμηεθέζιαηα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ ζογδημφκηαζ ζε ζοκδοαζιυ ιε ηα απμηεθέζιαηα ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ πανάθθδθςκ ιεηνήζεςκ. 4.3.Τιηθά θαη Μέζνδνη Πεηξακαηηθόο ρεδηαζκόο Ο πεζναιαηζηυξ ζπεδζαζιυξ ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ πενζβνάθδηε ακαθοηζηά ζημ Κεθάθαζμ 3 ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ, πανάβναθμξ 3.3.1, ζηδκ πενίπηςζδ ηυζμ ημο πεζνάιαημξ εενιμηδπίμο, υζμ ηαζ ημο πεζνάιαημξ αβνμφ ηαζ ζημ πανυκ ηεθάθαζμ πανμοζζάγεηαζ ιία ζφκημιδ πενζβναθή ηςκ πεζναιάηςκ ηαζ δίκμκηαζ πνυζεεηεξ 254

255 θεπημιένεζεξ βζα ηδκ ζοθθμβή ηςκ θοηχκ, ζηζξ νίγεξ ηςκ μπμίςκ ιεθεηήεδηε δ ημζκυηδηα ηςκ ΓΜΜ Πείξακα ζεξκνθεπίνπ πιινγή δεηγκάησλ ηα πθαίζζα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ, πναβιαημπμζήεδηε πείναια εενιμηδπίμο βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ επίδναζδξ ημο nicosulfuron ζημοξ ΓΜΜ οπυ ζοκεήηεξ ορδθήξ ηαζ ιαηνμπνυκζαξ έηεεζδξ ζημ γζγακζμηηυκμ. Σμ έδαθμξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε ζοθθέπεδηε απυ ημκ αβνυ υπμο πναβιαημπμζήεδηε ηαζ ημ πείναια αβνμφ ζηδκ πενζμπή Rimski Sancevi (19 o 51,321 ιε 45 o 19,928), ημο NoviSad, ηδξ εναίαξ. Σμ ημζηζκζζιέκμ έδαθμξ (100 kg) δζακειήεδηε ζε 20 πθαζηζηά θοημδμπεία (πενίπμο 4.5 Kg ακά θοημδμπείμ) ηαζ δ οβναζία ημο πνμζανιυζηδηε ζημ 40% ηδξ οδαημπςνδηζηυηδηαξ. Σα θοημδμπεία μιαδμπμζήεδηακ ζε 4 μιάδεξ ηςκ πέκηε ηαζ θοηεφεδηακ 10 ζπυνμζ ηαθαιπμηζμφ πμο ιεηά ηδκ θφηνςζδ ημοξ αναζχεδηακ ζε 4 θοηάνζα ακά θοημδμπείμ. Σα θοηά ακαπηφπεδηακ ζημ εενιμηήπζμ οπυ εθεβπυιεκεξ ζοκεήηεξ εενιμηναζίαξ (23-25 C), θςημπενζυδμο (11-h θςξ ακά διένα) ηαζ 60% ζπεηζηή οβναζία. Ζ πενζεπυιεκδ εδαθζηή οβναζία δζαηδνήεδηε ιε ηαεδιενζκυ πυηζζια (α/μ). ημ ζηάδζμ ηςκ 3-4 θφθθςκ ηα θοηά ηαθαιπμηίμο δέπηδηακ εθανιμβή ιε ημ nicosulfuron ςξ ελήξ: μζ ηνεζξ πνχηεξ μιάδεξ δέπηδηακ εθανιμβή δυζεςκ x10, x100 ηαζ x1000 ηδξ ζοκζζηχιεκδξ δυζδξ ημο nicosulfuron. Ζ ηεθεοηαία μιάδα θοημδμπείςκ δέπηδηε ηδκ ίδζα πμζυηδηα κενμφ πμο εθανιυζηδηε ιε ημ γζγακζμηηυκμ αθθά πςνίξ αοηυ ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε ςξ ιάνηοναξ. Σα θοημδμπεία οπυηεζκηαζ ηάεε εαδμιάδα ζε ηοπαζμπμίδζδ εκηυξ ημο εενιμηδπίμο. Με ηδκ μθμηθήνςζδ 6 εαδμιάδςκ απυ ηδκ διένα ηδξ εθανιμβήξ ημο γζγακζμηηυκμο ηα θοηά ζοβημιίζηδηακ ιε ημπή ημοξ ζηδ αάζδ ημο ιίζπμο/ ζηεθέπμοξ. Αιέζςξ ιεηά, μζ νίγεξ λεπθφεδηακ βζα ηδκ απμιάηνοκζδ ημο εδάθμοξ ηαζ απμεδηεφηδηακ ακά ιεηαπείνζζδ ζημοξ -20ºC ιέπνζ ηδκ πεναζηένς ιμνζαηή ημοξ ακάθοζδ. ε πανάθθδθεξ ιεηνήζεζξ πμο δεκ απμηέθεζακ ιένμξ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ αθθά ηα δεδμιέκα ημοξ εα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα ηδκ ελήβδζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ αοημφ ημο ηεθαθαίμο ιεηνήεδηακ πανάιεηνμζ υπςξ α) ημ λδνυ αάνμξ ηδξ νίγαξ ηαζ ηςκ αθαζηχκ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηίμο, α) μ ιοημννζγζηυξ απμζηζζιυξ ζηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηαζ β) ηα επίπεδα ημο nicosulfuron ζημ έδαθμξ ζημ ηέθμξ ηάεε ηφηθμο επέιααζδξ. Με ηδκ αθαίνεζδ ηςκ θοηχκ απυ ηα θοημδμπεία ημ έδαθμξ δέπηδηε κέα εθανιμβή nicosulfuron ιε ηζξ ίδζεξ δυζεζξ ηαζ αημθμοεήεδηε δ ίδζα δζαδζηαζία. οκμθζηά πναβιαημπμζήεδηακ πέκηε εθανιμβέξ. Όπςξ δζεοηνζκίζηδηε ηαζ ζημ Κεθ. 3., δ 255

256 επζθμβή ηςκ δζαδμπζηχκ εθανιμβχκ ημο nicosulfuron ζε ζδζαίηενα ορδθέξ δυζεζξ ζε ζπέζδ ιε ηδκ ζοκζζηχιεκδ αημθμοεήεδηε χζηε κα αλζμθμβδεεί δ ημλζηυηδηα ημο nicosulfuron ζημοξ ΓΜΜ ζε ζοκεήηεξ ζδζαίηενα ορδθήξ ηαζ ιαηνμπνυκζαξ έηεεζδξ ζε ζοιθςκία ιε ηδκ εηηίιδζδ ηδξ μζημημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ανπζηά ζε ζδζαίηενα ζοκηδνδηζηέξ ζοκεήηεξ (Tier I) Πείξακα αγξνύ πιινγή δεηγκάησλ Σμ πείναια αβνμφ πναβιαημπμζήεδηε ζημ NoviSad, ηδξ εναίαξ, ιε ζημπυ ηδκ εηηίιδζδ ηδξ επίδναζδξ nicosulfuron ζημοξ ΓΜΜ οπυ νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ. Δηζζ αημθμοεήεδηε έκα πθήνςξ ηοπαζμπμζδιέκμ ζπέδζμ ιε ηέζζενα επίπεδα εθανιμβήξ ημο nicosulfuron ηαζ ηέζζενα πεζναιαηζηά ηειάπζα (6 m x 5 m) βζα ηάεε ιεηαπείνζζδ. Οζ δζαδζηαζίεξ ζπμνάξ ηαζ θφηεοζδξ ημο ηαθαιπμηζμφ πενζβνάθμκηαζ ιε θεπημιένεζεξ ζημ Κεθ. 3. Μυθζξ ηα θοηά ηαθαιπμηζμφ έθηαζακ ζημ ηαηάθθδθμ ζηάδζμ πναβιαημπμζήεδηε επέιααζδ ιε ημ nicosulfuron (ACCENT, 750 mg kg -1, DuPont TM ) ζηα δζαθμνεηζηά πεζναιαηζηά ηειάπζα ζε 3 επίπεδα δυζεςκ: x1, x2 and x5 ηδξ ζοκζζηχιεκδξ (60 g a.i. ha -1 ). ημ πείναια ζοιπενζθήθεδηε επίζδξ, ιζα ιεηαπείνζζδ υπμο δεκ εθανιυζηδηε ημ γζγακζμηηυκμ πνμηεζιέκμο κα πνδζζιμπμζδεεί ςξ ιάνηοναξ. Εικόνα 4.1. Προετοιμαςία του πειραματικοφ αγροτεμαχίου και ψεκαμόσ με το ηιηανιοκτόνο nicosulfuron (οι φωτογραφίεσ παραχωρικθκαν από Dr. Simonida Djuric, Γεωπονικι χολι Πανεπιςτθμίου Novi Sad). ηζξ 28 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ ιε ημ nicosulfuron (Accent 75DF), 5 θοηά απυ ηάεε πεζναιαηζηυ ηειάπζμ εηνζγχεδηακ ιε ηδ αμήεεζα θηοανζμφ ηαζ ηυπδηακ ζημ επίπεδμ ημο εδάθμοξ. Οζ νίγεξ απμιαηνφκεδηακ, πθφεδηακ βζα κα απμιαηνοκεεί ημ έδαθμξ ηαζ αθμφ μιαδμπμζήεδηακ ακά ιεηαπείνζζδ (4 επακαθήρεζξ), απμεδηεφηδηακ ζημοξ -20ºC ιέπνζ ηδκ πεναζηένς ιμνζαηή ημοξ ακάθοζδ. 256

257 Δπίδξαζε ηνπ nicosulfuron ζηε ζύζηαζε ηεο θνηλόηεηαο ησλ Γελδξόκνξθσλ Μπθνξξηδηθώλ Μπθήησλ Δμαγσγή ηνπ DNA από ηηο ξίδεο ησλ θπηώλ θαιακπνθηνύ Γζα ηδκ ελαβςβή ημο DNA απυ ηα δείβιαηα ηςκ νζγχκ ηαθαιπμηζμφ πμο πνμήθεακ απυ ηα πεζνάιαηα εενιμηδπίμο ηαζ αβνμφ, πναβιαημπμζήεδηε ανπζηά μιμβεκμπμίδζδ ηςκ νζγζηχκ ζζηχκ, ιδπακζηά ιε θομθζθμπμίδζδ ηςκ ζζηχκ ζε βμοδί, ιε βμοδμπένζ ηαζ πνήζδ οβνμφ αγχημο. ηδ ζοκέπεζα, g μιμβεκμπμζδιέκμο δείβιαημξ νζγχκ (wet weight) ιεηαθένεδηακ ζε απμζηεζνςιέκα ζςθδκάνζα θοβμηέκηνδζδξ, πμθοπνμποθεκίμο (1.8 ml, eppendorfs) ηαζ αημθμφεδζε δ ελαβςβή ημο DNA ιε πνήζδ ημο ειπμνζημφ παηέημο Nucleospin Plant kit (Macherey-Nagel, Germany), ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή. Ζ ηαεανυηδηα ηςκ δεζβιάηςκ DNA πμο πνμέηορακ εθέβπεδηε θαζιαημθςημιεηνζηά (θυβμζ 260/280 ηαζ 260/230 nm). Γζα ημκ άιεζμ έθεβπμ ηδξ ζοκάθεζαξ ή ηοπυκ ηαηαηενιαηζζιμφ ημο DNA ηςκ επζιένμοξ δεζβιάηςκ, πναβιαημπμζήεδηε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ DNA ζε πδηηέξ αβανυγδξ 0.8%, ζφιθςκα ιε ημκ ηνυπμ πμο πενζβνάθεηαζ ζηδκ πανάβναθμ , ημο ηεθαθαίμο 3, ηδξ δζαηνζαήξ. Σέθμξ, μ πνμζδζμνζζιυξ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο DNA (ng ιl -1 DNA) ζηα δείβιαηα ηςκ επζιένμοξ ιεηαπεζνίζεςκ πναβιαημπμζήεδηε ιε θςημιέηνδζδ ημο δίηθςκμο DNA (ds DNA) (Eppendorf Biophotometer) PCR ελίζρπζε ηκήκαηνο ηνπ 18S rrna γνληδίνπ ησλ Γελδξόκνξθσλ Μπθνξξηδηθώλ Μπθήησλ Γζα ηδκ εκίζποζδ ημο 18S rrna βμκζδίμο ηςκ ΓΜΜ πναβιαημπμζήεδηακ ζοκμθζηά δφμ δζαδμπζηέξ PCR ακηζδνάζεζξ υπςξ έπεζ πενζβναθεί απυ ημοξ Ipsilantis et al. (2012). ηδκ πνχηδ PCR ακηίδναζδ πνδζζιμπμζήεδηακ μζ εηηζκδηέξ AML1 ηαζ AML2 (Lee et al., 2008) (Πίκαηαξ 4.1) ηαζ ημ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ είπε ιέβεεμξ 800 bp. ηδ δεφηενδ ακηίδναζδ PCR (PCR εζςηενζηήξ έκεεζδξ), ημ πνμσυκ ηδξ πνχηδξ ακηίδναζδξ εκζζπφεδηε ιε ημοξ εηηζκδηέξ NS31-GC (Kowalchuk et al., 2002) ηαζ Glo1 (Cornejo et al., 2004) (Πίκαηαξ 4.1) ηαζ ημ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ είπε ιέβεεμξ 300 bp. Σα οθζηά ηαζ μζ εενιμηοηθμπμζδηζηέξ ζοκεήηεξ εηηέθεζδξ ηςκ δφμ δζαδμπζηχκ PCR ακηζδνάζεςκ πανμοζζάγμκηαζ ζημοξ Πίκαηεξ 4.2, 4.3 βζα ηδκ πνχηδ PCR (Lee et al., 2008) ηαζ ζημοξ Πίκαηεξ 4.4, 4.5 βζα ηδκ δεφηενδ PCR (Liang et al., 2008). 257

258 Πίνακασ 4.1. Εκκινθτζσ που χρθςιμοποιικθκαν για τθν ενίςχυςθ του 18S rrna γονιδίου των ΔΜΜ. Δθθηλεηήο Αιιεινπρία Αλαθνξά AML1 5 ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA 3 AML2 5 GAACCCAAACACTTTGGTTTCC 3 Lee et al., 2008 NS31-GC 5 CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTG CC 3 Kowalchuk et al., 2002 Glo1 5 GCCTGCTTTAAACACTCTA 3 Cornejo et al., 2004 Πίνακασ 4.2. Σα υλικά που χρθςιμοποιικθκαν ςτθν πρϊτθ PCR για τθν ενίςχυςθ τμιματοσ του 18S rrna γονιδίου των ΔΜΜ από το DNA των ριηϊν φυτϊν καλαμποκίου. Αληηδξαζηήξηα Όγθνο Σειηθή ζπγθέληξσζε 10x KAPATaq Buffer (+ 15mM MgCl 2 ) 2ιl 1x buffer, 1.5mM MgCl 2 dntps (10mM) 0.5 ιl 250ιΜ απυ ημ ηαεέκα AML1 (20pmol/ιl) 1 ιl 1ιM AML2 (20pmol/ιl) 1 ιl 1ιM BSA (10ιg/ιl) 2 ιl 1ιg/ιl KapaTaq Polymerase (5U/ιl) 0.2 ιl 1U/20ιl DNA d.d.h 2 O οκμθζηυξ υβημξ 1 ιl 13.3 ιl 20 ιl 258

259 Πίνακασ 4.3. Οι κερμοκυκλοποιθτικζσ ςυνκικεσ πραγματοποίθςθσ τθσ πρϊτθσ PCR αντίδραςθσ ενίςχυςθσ του 18S rrna γονιδίου των ΔΜΜ. Ανπζηή απμδζάηαλδ 94 o C 3min Απμδζάηαλδ 94 o C 1min Τανζδμπμίδζδ 50 o C 1min 35 ηφηθμοξ Δπζιήηοκζδ 72 o C 1min Σεθζηή επζιήηοκζδ 72 o C 10min Πίνακασ 4.4. Σα υλικά που χρθςιμοποιικθκαν ςτθν δεφτερθ PCR εςωτερικισ ζνκεςθσ για τθν ενίςχυςθ τμιματοσ του 18S rrna γονιδίου των ΔΜΜ. Αληηδξαζηήξηα Όγθνο Σειηθή ζπγθέληξσζε 10x KAPATaq Buffer (+ 15mM MgCl 2 ) 5ιl 1x buffer, 1.5mM MgCl 2 dntps (10mM) 1 ιl 200ιΜ απυ ημ ηαεέκα NS31-GC (20pmol/ιl) 1 ιl 0.4ιM Glo1 (20pmol/ιl) 1 ιl 0.4ιM KapaTaq Polymerase (5U/ιl) 0.2 ιl 1U/50ιl DNA 1 ιl Αναίςζδ 1:10 d.d.h 2 O οκμθζηυξ υβημξ 40.8 ιl 50 ιl 259

260 Πίνακασ 4.5. Οι κερμοκυκλοποιθτικζσ ςυνκικεσ τθσ PCR εςωτερικισ ζνκεςθσ για τθν ενίςχυςθ του 18S rrna γονιδίου των ΔΜΜ. Ανπζηή απμδζάηαλδ 95 o C 5min Απμδζάηαλδ 95 o C 1min Τανζδμπμίδζδ 52 o C 45sec 30 ηφηθμοξ Δπζιήηοκζδ 72 o C 45sec Σεθζηή επζιήηοκζδ 72 o C 10min Ζιεθηξνθόξεζε ησλ PCR πξντόλησλ ζε πεθηή αγαξόδεο Σα επζιένμοξ πνμσυκηα ηςκ ακηζδνάζεςκ PCR, δθεηηνμθμνήεδηακ ζε πδηηέξ αβανυγδξ 1,2%, βζα ημκ έθεβπμ ηδξ πανμοζίαξ ηδξ αθθδθμοπίαξ κμοηθεμηζδίςκ ημο επζεοιδημφ ιεβέεμοξ. Οζ πδηηέξ αβανυγδξ παναζηεοάζηδηακ υπςξ πενζβνάθεηαζ ζηδκ πανάβναθμ , ημο 3 μο ηεθαθαίμο ηδξ δζαηνζαήξ Ζιεθηξνθόξεζε ησλ PCR πξντόλησλ ζε πεθηή αθξπιακίδεο κε βαζκίδσζε απνδηαηαθηηθώλ νπζηώλ (DGGE) Σα πνμσυκηα ηδξ PCR εζςηενζηήξ έκεεζδξ δθεηηνμθμνήεδηακ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ ζοβηέκηνςζδξ 8% (α/μ), ιε ααειίδςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ 35-50% (Ipsilantis et al., 2012). Γζα ηδκ δθεηηνμθυνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ αημθμοεήεδηε δ δζαδζηαζία πμο πενζβνάθεηαζ θεπημιενχξ ζηδκ πανάβναθμ , ημο ηεθαθαίμο 3. ημκ πίκαηα 4.6, ακαθένμκηαζ μζ υβημζ ηςκ δζαθοιάηςκ 0% ηαζ 100% ηςκ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ πμο ακαιίπεδηακ χζηε κα πνμηφρμοκ ηα επζιένμοξ δζαθφιαηα παιδθήξ (35%) ηαζ ορδθήξ ζοβηέκηνςζδξ (50%), ηεθζημφ υβημο 25 ml. ε ηάεε πενίπηςζδ, δθεηηνμθμνήεδηε 1ιl πνμσυκημξ ηδξ PCR εζςηενζηήξ έκεεζδξ πμο ακαιζβκφμκηακ ιε 5 ιl δζαθφιαημξ θυνηςζδξ. Ζ δθεηηνμθυνδζδ πναβιαημπμζήεδηε ζηα 75V βζα 960 min ηαζ δ εενιμηναζία ηδξ δελαιεκήξ νοειίζηδηε ζημοξ 60⁰C. 260

261 Πίνακασ 4.6. Παραςκευι διαλυμάτων με υψθλι και χαμθλι ςυγκζντρωςθ αποδιατακτικϊν ουςιϊν. Οκάδα κηθξννξγαληζκώλ % πγθέληξσζε απνδηαηαθηηθώλ νπζηώλ Όγθνο δηαιύκαηνο 0% (ml) Όγθνο δηαιύκαηνο 100% (ml) Γελδξόκνξθνη Μπθνξξηδηθνί Μύθεηεο Γεκηνπξγία Βηβιηνζεθώλ Κιώλσλ ηδκ πενίπηςζδ ημο πεζνάιαημξ ημο εενιμηδπίμο δδιζμονβήεδηακ αζαθζμεήηεξ ηθχκςκ βζα ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ υπμο παναηδνήεδηακ γχκεξ/νζαυηοπμζ ΓΜΜ πμο ειθάκζγακ ακεεηηζηυηδηα ή εοαζζεδζία ζηδκ έηεεζδ ημοξ ζημ nicosulfuron. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, ηα πνμσυκηα ηδξ πνχηδξ PCR (Πίκαηεξ 4.2, 4.3) απυ ηζξ ηνεζξ επακαθήρεζξ πμο πναβιαημπμζήεδηακ βζα ημ ηάεε δείβια, μιμβεκμπμζήεδηακ πνμηεζιέκμο κα πνμηφρεζ ζηακμπμζδηζηή πμζυηδηα DNA βζα ηδ δζαδζηαζία ηδξ ηθςκμπμίδζδξ πμο εα αημθμοεμφζε (δεδμιέκδξ ηαζ ηδξ παιδθήξ παναθθαηηζηυηδηαξ πμο παναηδνήεδηε ζηδκ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ιεηαλφ ηςκ επακαθήρεςκ ηδξ ίδζαξ ιεηαπείνζζδξ). Αημθμφεδζε ηαεανζζιυξ ηςκ πνμσυκηςκ PCR ιε ημ ηζη NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel, Germany), ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή. Σμ ηαεανυ DNA θςημιεηνήεδηε (Eppendorf Biophotometer), ζηα 260nm (dsdna) βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ (ng ml -1 ) ηάεε επζιένμοξ δείβιαημξ. ηδ ζοκέπεζα πναβιαημπμζήεδηε έκεεζδ ημο ηαεανμφ DNA ζημκ πθαζιζδζαηυ θμνέα pgem-t Easy (Promega, Madison, USA). Γζα ημ ζημπυ αοηυ, ακαιίπεδηακ ζε ζςθδκάνζμ πμθοπνμποθεκίμο (eppendorf) 5ιl 2x Ροειζζηζημφ δζαθφιαημξ έκεεζδξ (Ligation Buffer), 0.5 ιl ημο πθαζιζδζαημφ θμνέα pgem -T, 1 ιl T4 DNA εκγφιμο θζβάζδξ (Promega) ηαζ έςξ 3.5 ιl DNA (PCR πνμσυκ) ηαζ μ υβημξ ζοιπθδνχεδηε ζηα 10ιl ιε ηδκ πνμζεήηδ δζξ απμζηαβιέκμο ηαζ απμζηεζνςιέκμο κενμφ. Καηυπζκ ημ ιίβια επςάζηδηε ζημοξ 4 C βζα 16 χνεξ. Ο οπμθμβζζιυξ ηδξ πμζυηδηαξ ημο DNA 261

262 πμο πνδζζιμπμζμφκηακ βζα έκεεζδ ζε ηάεε πενίπηςζδ, οπμθμβίγμκηακ ιε αάζδ ημκ ηφπμ: (Proomega, 2005). Ο θμνέαξ pgem -T, ζημκ μπμίμ πναβιαημπμζήεδηε δ έκεεζδ ημο ηιήιαημξ DNA ηςκ ΓΜΜ, εζζήπεδηε ζηδ ζοκέπεζα ζε δεηηζηά ηφηηανα E.coli DH5α (New England Biolabs), ιε ακεεηηζηυηδηα ζημ ακηζαζμηζηυ αιπζηζθίκδ. οβηεηνζιέκα, ζε 25ιl δεηηζηχκ ηοηηάνςκ πνμζηέεδηε 1ιl πνμσυκημξ ηδξ ακηίδναζδξ ηδξ θζβάζδξ (πθαζιίδζμ) πμο πενζβνάθδηε ακαθοηζηά παναπάκς ηαζ αημθμφεδζε ήπζα ακάιζλδ. Σμ δείβια επςάζηδηε ζηδ ζοκέπεζα ζε πάβμ βζα 30min ηαζ αημθμφεδζε εενιζηυ ζμη ιε άιεζδ ημπμεέηδζδ ημο δείβιαημξ ζημοξ 42:C βζα 30sec. Σα ηφηηανα επακαημπμεεηήεδηακ ζημκ πάβμ βζα 5min ηαζ ηαηυπζκ πνμζηέεδηακ 300ιl δζαθφιαημξ SOC (New England Biolabs, Outgrowth Medium). Αημθμφεδζε επχαζδ ζημοξ 37:C βζα 60min. ηδ ζοκέπεζα, πνμζηέεδηακ ζηα ηφηηανα 50ιl X-GAL (2%) ηαζ 10ιl IPTG (0,1Μ) ηαζ μ ζοκμθζηυξ υβημξ ηδξ ηαθθζένβεζαξ επζζηνχεδηε ζε ηνοαθία απμζηεζνςιέκμο ζηενεμφ ενεπηζημφ οπμζηνχιαημξ Luria Bertani (LB) ιε αιπζηζθθίκδ (100ιg ml -1 ). Σα ηνοαθία επςάζηδηακ ζημοξ 37:C βζα 16 χνεξ. Μεηά ηδκ ακάπηολδ ηςκ απμζηζχκ, πναβιαημπμζήεδηε επζθμβή 50 πενίπμο θεοηχκ απμζηζχκ ακά ιεηαπείνζζδ/αζαθζμεήηδ, ιε ηδ πνήζδ απμζηεζνςιέκςκ μδμκημβθοθίδςκ ηαζ αημθμφεδζε ειαμθζαζιυξ ημοξ ζε 150 ιl απμζηεζνςιέκμο οβνμφ ενεπηζημφ δζαθφιαημξ LB ιε αιπζηζθθίκδ, πμο είπακ πνμδβμοιέκςξ ημπμεεηδεεί ζηα ηεθζά ιζηνμπθάηαξ 96 εέζεςκ. Αημθμφεδζε επχαζδ ημο πζάημο ζημοξ 37:C βζα 16 χνεξ, ιε ζημπυ ηδκ ακάπηολδ ηςκ απμζηζχκ πμο επζθέπεδηακ ηαζ απμεήηεοζδ ημο πζάημο ζημοξ 4:C βζα ιεθθμκηζηή πνήζδ. Πανάθθδθα ιε ηδ ιεηαθμνά ηςκ επζθεβιέκςκ θεοηχκ απμζηζχκ ζημ οβνυ οπυζηνςια βζα ακάπηολδ, ηφηηανα ηςκ ίδζςκ απμζηζχκ ειααπηίζηδηακ ζε ηεθζά πζάημο 96 εέζεςκ εζδζημφ βζα colony PCR. Ο ζοκμθζηυξ υβημξ ηάεε ακηίδναζδξ ήηακ 20ιl. Σα ακηζδναζηήνζα ηαζ μζ ζοκεήηεξ πναβιαημπμίδζδξ ηδξ colony PCR πανμοζζάγμκηαζ ζημοξ Πίκαηεξ 4.7 ηαζ 4.8, ακηίζημζπα. Σα πνμσυκηα ηδξ ακηίδναζδξ αημθμφεςξ δθεηηνμθμνήεδηακ ζε πδηηή αβανυγδξ 1.2% ηαζ ζηα δείβιαηα υπμο ακζπκεφεδηε έκεεια DNA ημο ακαιεκυιεκμο ιεβέεμοξ, εθανιυζηδηε δ ηεπκζηή ηδξ δθεηηνμθυνδζδξ ζε πδηηή πμθοαηνοθαιίδδξ ιε ααειίδςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ (DGGE), ιε ημκ ηνυπμ πμο πενζβνάθεηαζ ζηδκ πανάβναθμ ημο πανυκημξ ηεθαθαίμο. 262

263 Πίλαθαο 4.7. Σα οθζηά πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζηδκ colony PCR βζα ηδκ εκίζποζδ ηιήιαημξ του 18S rrna βμκζδίμο των ΔΜΜ. Αληηδξαζηήξηα Όγθνο Σειηθή ζπγθέληξσζε 10x Buffer for colony PCR * 2ιl 1x buffer dntps (10mM) 0.4 ιl 200ιΜ απυ ημ ηαεέκα NS31-GC (20pmol/ιl) 0.4 ιl 0.4ιM Glo1 (20pmol/ιl) 0.4 ιl 0.4ιM KapaTaq Polymerase (5U/ιl) 0.2 ιl 1U/20ιl 15mM MgCl ιl 0.9mM MgCl 2 d.d.h 2 O οκμθζηυξ υβημξ 15.4 ιl 20 ιl * Γζα ηδκ παναζηεφδ 10 ml colony PCR buffer, πνδζζιμπμζήεδηακ: 5ml KCL 1M 1ml Tris HCL 1M (pζ 9.0) 0,1ml Triton X-100 3,9 ml ddh2o Πίλαθαο 4.8. Οι κερμοκυκλοποιθτικζσ ςυνκικεσ τθσ colony PCR για τθν ενίςχυςθ του 18S rrna γονιδίου των ΔΜΜ. Ανπζηή απμδζάηαλδ 95 o C 5min Απμδζάηαλδ 95 o C 45sec Τανζδμπμίδζδ 52 o C 45sec 35 ηφηθμοξ Δπζιήηοκζδ 72 o C 30sec Σεθζηή επζιήηοκζδ 72 o C 10min H ηζκδηζηυηδηα ηςκ εεηζηχκ ηθχκςκ ζηζξ πδηηέξ πμθοαηνοθαιίδδξ, ζοβηνίεδηε ιε ημ πνυηοπμ γςκχκ ημο πενζααθθμκηζημφ δείβιαημξ απυ ημ μπμίμ πνμήθεακ. Ακηζπνμζςπεοηζημί ηθχκμζ πμο επέδεζλακ ηαοηυζδιδ ηζκδηζηή ζοιπενζθμνά ιε 263

264 ζοβηεηνζιέκεξ γχκεξ ημο ανπζημφ πενζααθθμκηζημφ δείβιαημξ επζθέπεδηακ ηαζ αθθδθμοπήεδηακ (Δζηυκα 4.2). Γζα ημ ζημπυ αοηυ, πθαζιζδζαηυ DNA απμιμκχεδηε απυ ημοξ επζθεβιέκμοξ ηθχκμοξ ιε ηδ πνήζδ ημο ειπμνζημφ ηζη NucleoSpin plasmid kit (Macharey-Nagel, Germany) ηαζ απμζηάθεδηε βζα ακάθοζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ ημο εκεέιαημξ ζημ ενβαζηήνζμ Ακμζμθμβίαξ, ημο Σιήιαημξ Ηαηνζηήξ ημο Πακεπζζηδιίμο Θεζζαθίαξ. Πνμηεζιέκμο κα επζαεααζςεεί δ οπυεεζδ υηζ μζ ηθχκμζ ιε πανυιμζα ηζκδηζηή ζοιπενζθμνά ζηζξ πδηηέξ αηνοθαιζδίμο πανμοζζάγμοκ ηαοηυζδιεξ αθθδθμοπίεξ, αθθδθμοπήεδηακ ζοκμθζηά 3-5 ηθχκμζ βζα ηάεε γχκδ πμο ιεθεηήεδηε, εηηυξ απυ ηζξ πενζπηχζεζξ υπμο θζβυηενμζ απυ 3 ηθχκμζ ήηακ δζαεέζζιμζ βζα ιζα ζοβηεηνζιέκδ γχκδ. Οζ πνμηφπημοζεξ αθθδθμοπίεξ αθμφ αλζμθμβήεδηακ βζα ηδκ πμζυηδηα ηαζ αηνίαεζα ηδξ αθθδθμφπζζδξ ηαζ ηδκ πανμοζία πζιαζνζηχκ αθθδθμοπζχκ, ηαηαηέεδηακ ζηδ αάζδ δεδμιέκςκ ημο Δονςπασημφ Δνβαζηδνίμο Μμνζαηήξ Βζμθμβίαξ (European Molecular Biology Laboratory: EMBL) υπμο ηαζ ηαηαπςνήεδηακ ιε ημοξ ανζειμφξ απμδμπήξ: HF έςξ HF Ο έθεβπμξ ηδξ μιμθμβίαξ ηςκ οπυ ιεθέηδ αθθδθμοπζχκ ιε βκςζηέξ αθθδθμοπίεξ ημο 18S rrna βμκζδίμο πμο ανίζημκηαζ ηαηαπςνδιέκεξ ζηδκ πνμακαθενεείζα αάζδ δεδμιέκςκ, πναβιαημπμζήεδηακ πνδζζιμπμζχκηαξ ημ online ενβαθείμ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST, Εικόνα 4.2. Ενδεικτικι εικόνα αξιολόγθςθσ τθσ βιβλιοκικθσ κλϊνων ςε ςφςτθμα DGGE ;όπου και αξιολογικθκε θ κινθτικότθτα των επιλεγμζνων κλϊνων ςυγκριτικά με το πρότυπο ηωνϊν του περιβαλλοντικοφ δείγματοσ (ΠΔ: 0x nicosulfuron, τρίτοσ κφκλοσ επζμβαςθσ) από το οποίο προιλκαν. M: δείκτθσ ΔΜΜ που αποτελείται από μίγμα PCR προϊόντων τουσ 18S rrna γονιδίου ςτελεχϊν ΔΜΜ που ανικουν ςτθν ςυλλογι τθσ ερευνθτικισ ομάδασ Βιοτεχνολογίασ Φυτϊν και Περιβάλλοντοσ, Σμιμα Βιοχθμείασ και Βιοτεχνολογίασ, Πανεπιςτιμιο Θεςςαλίασ και παρουςιάηονται με τθν ςειρά εμφάνιςθσ τουσ ςτθν πθκτι από πάνω προσ τα κάτω: Glomus mosseae A, G. mosseae B, G. intraradices και G. etunicatum. Οι ηϊνεσ που κακορίηονται με τουσ αρικμοφσ αλλθλουχικθκαν και θ ταυτότθτα των ςχετικϊν ριβοτφπων από τουσ οποίουσ προιλκαν παρουςιάηονται ςτον Πίνακα

265 ηαηηζηηθή αλάιπζε Οζ εζηυκεξ ηςκ πδηηςιάηςκ DGGE ιεηαηνάπδηακ ζε δεδμιέκα δοαδζηήξ ιμνθήξ, ακάθμβα ιε ηδκ πανμοζία ή απμοζία γςκχκ DNA ζημ ιμνζαηυ απμηφπςια, ιε πνήζδ ημο θμβζζιζημφ παηέημο CrossChecker (Wageningen, Netherlands). Σα δεδμιέκα δοαδζηήξ ιμνθήξ οπμαθήεδηακ ζηδ ζοκέπεζα ζε ζενανπζηή ακάθοζδ ηαηά ζοζηάδεξ (cluster analysis), υπμο ςξ ιέηνμ απυζηαζδξ πνδζζιμπμζήεδηε ημ Jaccards distance matrix. Ζ ζηαηζζηζηή επελενβαζία ηςκ δεδμιέκςκ πναβιαημπμζήεδηε ιε πνήζδ ημο θμβζζιζημφ Genstat 11.0v. 4.4.Απνηειέζκαηα Δμαγσγή DNA θαη PCR ελίζρπζε ηκήκαηνο ηνπ 18S rrna γνληδίνπ ησλ ΓΜΜ Ανπζηά πναβιαημπμζήεδηε ελαβςβή DNA απυ ηα δείβιαηα ηςκ νζγχκ ηαθαιπμηζμφ. Ο έθεβπμξ ηδξ απυδμζδξ ηδξ ελαβςβήξ, έβζκε ιε δθεηηνμθυνδζδ μνζζιέκδξ πμζυηδηαξ απυ ηα δείβιαηα DNA ζε πδηηή αβανυγδξ 0.8% (Δζηυκα 4.3). 10Kb Εικόνα 4.3. Ενδεικτικι εικόνα θλεκτροφόρθςθσ ςε πθκτι αγαρόηθσ 0.8% DNA που εξάχκθκε από τα δείγματα των ριηϊν καλαμποκιοφ των διαφόρων μεταχειρίςεων, ςε χρόνο 28 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ με το nicosulfuron, ςτο πείραμα αγροφ. L: 1kb DNA Ladder, 1-3: 0x, 4-6: 1x, 7-9: 2x, 10-12: 5x. ε κάκε γραμμι φορτϊκθκαν 10μl DNA. Γζα ηδκ εκίζποζδ ηιήιαημξ ημο 18S rrna βμκζδίμο ηςκ ΓΜΜ, πναβιαημπμζήεδηακ 2 δζαδμπζηέξ PCR ακηζδνάζεζξ. Καηά ηδκ πνχηδ ακηίδναζδ, ημ DNA πμο ελάπεδηε απυ ηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ εκζζπφεδηε ιε πνήζδ ηςκ εηηζκδηχκ AML1 ηαζ AML2 ηαζ ημ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ είπε ιέβεεμξ 800 bp (Δζηυκα 4.4). 265

266 1000bp Εικόνα 4.4. Ενδεικτικι εικόνα θλεκτροφόρθςθσ ςε πθκτι αγαρόηθσ 1.2%, των PCR προϊόντων από τθν ενίςχυςθ τμιματοσ του γονιδίου 18S rrna των ΔΜΜ με τουσ εκκινθτζσ AML1-AML2. L: 1kb DNA Ladder, 1: Αρνθτικόσ μάρτυρασ, 2-7: PCR προϊόν από δείγματα του πειράματοσ κερμοκθπίου, πρϊτοσ κφκλοσ επζμβαςθσ, με εφαρμογι nicosulfuron ςε δόςεισ 100x (2-4), 1000x (5-7). ε κάκε γραμμι φορτϊκθκαν 5μl προϊόντοσ PCR. ηδ δεφηενδ ακηίδναζδ PCR εζςηενζηήξ έκεεζδξ, ημ πνμσυκ ηδξ πνχηδξ PCR εκζζπφεδηε ιε ημοξ εηηζκδηέξ ΝS31-GC ηαζ Glo1 ηαζ πνμέηορε πνμσυκ ιεβέεμοξ 300 bp, ηαηάθθδθμ βζα ακάθοζδ ιε ηδ ιέεμδμ DGGE (Δζηυκα 4.5). 500bp Εικόνα 4.5. Ενδεικτικι εικόνα θλεκτροφόρθςθσ ςε πθκτι αγαρόηθσ 1.2%, των προϊόντων PCR εςωτερικισ ζνκεςθσ του γονιδίου 18S rrna των ΔΜΜ με τουσ εκκινθτζσ NS31+GC Glo1. L: 1kb DNA Ladder, 1: Αρνθτικόσ μάρτυρασ, 2-7: PCR προϊόν από δείγματα του πειράματοσ κερμοκθπίου, δεφτεροσ κφκλοσ επζμβαςθσ, με εφαρμογι nicosulfuron ςε δόςεισ 0x (2-4), 1x (5-7). ε κάκε γραμμι φορτϊκθκαν 5μl προϊόντοσ PCR. 266

267 ΠΔΗΡΑΜΑ ΘΔΡΜΟΚΖΠΗΟΤ Δπίδξαζε ηνπ nicosulfuron ζηελ θνηλόηεηα ησλ ΓΜΜ DGGE κνξηαθή απνηύπσζε ηδκ πενίπηςζδ ημο πεζνάιαημξ εενιμηδπίμο, δ επέιααζδ ιε ημ nicosulfuron πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ, υπςξ θαίκεηαζ ανπζηά απυ ηζξ εζηυκεξ ηςκ πδηηχκ αηνοθαιίδδξ ηαζ επζαεααζχεδηε ζηδ ζοκέπεζα ιε ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ηαηά ζοζηάδεξ. οβηεηνζιέκα, ιεηά ημκ πνχημ ηφηθμ εθανιμβήξ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ιε ηδ ορδθυηενδ δυζδ nicosulfuron (1000x) δδιζμφνβδζακ ιζα λεπςνζζηή ζοζηάδα ζοβηνζηζηά ιε εηείκα πμο δέπηδηακ δυζεζξ 10x ηαζ 100x ηα μπμία μιαδμπμζήεδηακ ιαγί ηαζ δζαθμνμπμζήεδηακ ζαθχξ απυ ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα (Γζάβναιια 4.1). ημοξ ηφηθμοξ επέιααζδξ πμο αημθμφεδζακ, παναηδνήεδηε ααειζαία ζονίηκςζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ ζηα δείβιαηα πμο είπακ δεπηεί δυζεζξ εθανιμβήξ ίζδ ιε 100x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ, ιε απμηέθεζια ηα ζοβηεηνζιέκα δείβιαηα κα μιαδμπμζμφκηαζ ζε λεπςνζζηέξ ζοζηάδεξ ζε ζπέζδ ιε ηα δείβιαηα ηςκ οπμθμίπςκ ιεηαπεζνίζεςκ (Γζάβναιια 4.2α,α ηαζ 4.3α). Θα πνέπεζ κα ημκζζηεί υηζ δείβιαηα ηδξ ορδθυηενδξ δυζδξ (1000x) δεκ ακαθφεδηακ ζημοξ οπυθμζπμοξ ηφηθμοξ εθανιμβήξ ηαεχξ ηα θοηά ηαθαιπμηίμο δεκ ηαηάθενακ κα ακαπηοπεμφκ θυβς θοημημλζηυηδηαξ ημο γζγακζμηηυκμο ζηα επίπεδα αοηά. Σα δείβιαηα πμο δέπηδηακ επέιααζδ ιε δυζδ ίζδ ιε 10x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ, μιαδμπμζήεδηακ ιαγί ιε ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα απυ ημκ δεφηενμ ηφηθμ εθανιμβήξ ηαζ ιεηά (Γζάβναιια 4.2α,α ηαζ 4.3α). Μμκαδζηή ελαίνεζδ απυηεθεζε μ ηέηανημξ ηφηθμξ εθανιμβήξ υπμο δ δυζδ 100x πνμηάθεζε θοημημλζηυηδηα ζηα θοηά ηαθαιπμηζμφ (Δζηυκα 4.6) ιε απμηέθεζια αοηά ηα δείβιαηα κα ιδκ ζοιπενζθδθεμφκ ζηζξ ακαθφζεζξ ηςκ πεζναιάηςκ (Γζάβναιια 4.3α) Σαπηνπνίεζε κειώλ ηεο θνηλόηεηαο ησλ ΓΜΜ κε ηελ ρξήζε βηβιηνζεθώλ θιώλσλ Απυ ηζξ αζαθζμεήηεξ ηθχκςκ πμο δδιζμονβήεδηακ δζαπζζηχεδηε υηζ ζηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ μζ γχκεξ απυ ηζξ δζαθμνεηζηέξ ιεηαπεζνίζεζξ ηαζ/ ή ημοξ δζαδμπζημφξ ηφηθμοξ επέιααζδξ πμο επέδεζλακ πακμιμζυηοπδ δθεηηνμθμνδηζηή ηζκδηζηυηδηα ακηζπνμζχπεοακ ημκ ίδζμ νζαυηοπμ ιοηήηςκ. Γζα ημ θυβμ αοηυ, ζε υθεξ ηζξ επζιένμοξ γχκεξ πμο παναηδνήεδηακ δυεδηε έκαξ ηςδζηυξ ανζειυξ απμηεθμφιεκμξ απυ 2 ρδθία υπμο ημ πνχημ ρδθίμ δδθχκεζ ημκ ηφηθμ ηδξ επέιααζδξ 267

268 ηαζ ημ δεφηενμ ρδθίμ ζπεηίγεηαζ ιε ηδκ δθεηηνμθμνδηζηή ηζκδηζηυηδηα. Χξ εη ημφημο, μζ γχκεξ ιε ίδζμ πνχημ ρδθίμ πνμέηορακ απυ ιεηαπεζνίζεζξ ημο ίδζμο ηφηθμο επέιααζδξ, εκχ γχκεξ ιε ημζκυ ημ δεφηενμ ρδθίμ οπμδδθχκμοκ υηζ πανμοζίαγακ πακμιμζυηοπμ πνυηοπμ δθεηηνμθμνδηζηήξ ηζκδηζηυηδηαξ ακελάνηδηα απυ ημκ ηφηθμ επέιααζδξ απυ ημ μπμίμ πνμέηορακ. Απυ ηδκ ακάθοζδ ηςκ δεδμιέκςκ ηςκ αζαθζμεδηχκ ηθχκςκ πνμηφπηεζ υηζ ζηδκ εκδμνζγζηή ημζκυηδηα ηςκ ΓΜΜ ζηα θοηά ηαθαιπμηζμφ πμο ελεηάζεδηακ, ηονζάνπδζακ νζαυηοπμζ ημο βέκμοξ Glomus (γχκεξ x.2, x.3, x.4, x.7 ηαζ x9), ιε ελαίνεζδ ιζα γχκδ πμο πνμήθεε απυ είδμξ ηδξ μζημβέκεζαξ Paraglomeraceae (γχκδ x.8) ηαζ ιζα γχκδ πμο απμδυεδηε ζε νζαυηοπμ ημο βέκμοξ Diversispora (γχκδ x.9), (Πίκαηαξ 4.7). οκμθζηά 22 ηθχκμζ ηδξ γχκδξ x.2 (1.2, 2.2, 3.2, 4.2 ηαζ 5.2), ηςκ μπμίςκ δ αθθδθμοπία πανμοζίαζε ορδθυηενδ μιμθμβία ιε έκα πενζααθθμκηζηυ ηθχκμ ημο βέκμοξ Glomus (Πίκαηαξ 4.7), ανέεδηακ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ ιεηαπείνζζδ ιε δυζδ ημο nicosulfuron ίζδ ιε 10x ηδκ ζοκζζηχιεκδ, αθθά ελαθακίζηδηακ απυ ημ ιμνζαηυ απμηφπςια ζηα ακηίζημζπα δείβιαηα πμο δέπηδηακ ιεηαπείνζζδ ιε δυζδ ίζδ ιε 1000x (πνχημξ ηφηθμξ επέιααζδξ) ηαζ δυζδ ίζδ ιε 100x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ (ηφηθμζ επέιααζδξ 2, 3 ηαζ 5). Ζ γχκδ x.3, πμο απμηέθεζε ηδκ ηονίανπδ γχκδ ζημ ιμνζαηυ απμηφπςια ημο ιάνηονα ακαθμνάξ ηαζ ηςκ δεζβιάηςκ πμο δέπηδηακ δυζδ ίζδ ιε 10x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ ζε υθμοξ ημοξ ηφηθμοξ επέιααζδξ, απμδείπηδηε εοαίζεδηδ ζηζξ ορδθέξ δυζεζξ εθανιμβήξ ημο nicosulfuron ηαζ ελαθακίζηδηε απυ ημ ιμνζαηυ απμηφπςια ηςκ δεζβιάηςκ πμο δέπηδηακ εθανιμβή ηδξ δυζδξ 100x απυ ημκ δεφηενμ ηφηθμ επέιααζδξ ηαζ ιεηά. Οζ ακηίζημζπμζ ηθχκμζ πμο ακαθφεδηακ βζα ηδκ ζοβηεηνζιέκδ γχκδ πανμοζίαζακ ιέβζζηδ μιμθμβία ιε ηδκ αθθδθμοπία ημο 18S rrna βμκζδίμο εκυξ ζηεθέπμοξ ημο είδμοξ Glomus mosseae. Πανυιμζμ πνυηοπμ απυηνζζδξ ζηδκ έηεεζδ ζημ nicosulfuron παναηδνήεδηε ηαζ βζα ηδκ γχκδ x.4 πμο μζ ακηίζημζπμζ ηθχκμζ πμο ακαθφεδηακ πανμοζίαζακ ιέβζζηδ μιμθμβία ιε ηζξ αθθδθμοπίεξ δζαθμνεηζηχκ ιδ ηαθθζενβήζζιςκ πενζααθθμκηζηχκ ηθχκςκ ημο βέκμοξ Glomus. Απυ ηδκ άθθδ πθεονά, μζ γχκεξ 2.7, 2.5 ηαζ 2.6, απμδείπηδηακ ηονίανπεξ ζηα δείβιαηα ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ πμο δέπηδηακ δυζδ εθανιμβήξ 100x ζημκ δεφηενμ ηφηθμ επέιααζδξ, οπμδδθχκμκηαξ αολδιέκδ ακημπή ζημ γζγακζμηηυκμ nicosulfuron. Χζηυζμ, αοηέξ μζ γχκεξ δεκ επέδεζλακ ακάθμβμ πνυηοπμ ζημοξ επυιεκμοξ ηφηθμοξ επέιααζδξ. Οζ ακηίζημζπμζ ηθχκμζ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ γςκχκ πμο ακαθφεδηακ πανμοζίαζακ ιέβζζηδ μιμθμβία αθθδθμοπζχκ ιε πενζααθθμκηζημφξ ηθχκμοξ ημο βέκμοξ Glomus (Πίκαηαξ 4.9). Σέθμξ, μζ γχκεξ x.8 ηαζ x.9 ειθακίζηδηακ ζε υθεξ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ ηαζ 268

269 ημοξ ηφηθμοξ επέιααζδξ ηαζ δεκ θαίκεηαζ κα επδνεάζηδηακ απυ ηζξ επειαάζεζξ ιε ημ nicosulfuron, αηυια ηαζ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ορδθχκ δυζεςκ εθανιμβήξ (Γζάβναιια 4.1, 4.2 ηαζ 4.3). Οζ ηθχκμζ πμο ακηζζημζπμφκ ζηζξ ζοβηεηνζιέκεξ γχκεξ πανμοζίαζακ ορδθή μιμθμβία αθθδθμοπζχκ αάζεςκ ιε δζαθμνεηζημφξ πενζααθθμκηζημφξ ηθχκμοξ ημο βέκμοξ Glomus (1.8, 4.8, 5.8) ή ιε ηθχκμ ηδξ μζημβέκεζαξ Paraglomeraceae (2.8), εκχ ηθχκμζ πμο ακηζζημζπμφκ ζηδκ γχκδ x.9 επέδεζλακ ιέβζζηδ μιμθμβία ιε έκα ζηέθεπμξ ημο είδμοξ Glomus etunicatum (1.9 έςξ 5.9). Εικόνα 4.6. Εκδιλωςθ φυτό-τοξικότθτασ ςτθν περίπτωςθ επζμβαςθσ με το ηιηανιοκτόνο nicosulfuron ςε δόςεισ 10x και 100x τθσ ςυνιςτϊμενθσ για εφαρμογι ςτον αγρό (φωτογραφία που παραχωρικθκε από τον Dr Fabrice Martin-Laurent, INRA, Γαλλία). 269

270 Διάγραμμα 4.1. Μοριακό αποτφπωμα DGGE και αντίςτοιχθ ανάλυςθ κατά ςυςτάδεσ (Jaccards similarity index) τθσ κοινότθτασ των ΔΜΜ ςτισ ρίηεσ των φυτϊν καλαμποκιοφ από το πείραμα κερμοκθπίου που δζχτθκαν επζμβαςθ με διαφορετικά επίπεδα δόςεων (x0, x10, x100, x1000) του nicosulfuron, με τθν ολοκλιρωςθ του πρϊτου κφκλου επζμβαςθσ. M: δείκτθσ ΔΜΜ που αποτελείται από μίγμα PCR προϊόντων τουσ 18S rrna γονιδίου ςτελεχϊν ΔΜΜ που ανικουν ςτθν ςυλλογι τθσ ερευνθτικισ ομάδασ Βιοτεχνολογίασ Φυτϊν και Περιβάλλοντοσ, Σμιμα Βιοχθμείασ και Βιοτεχνολογίασ, Πανεπιςτιμιο Θεςςαλίασ και παρουςιάηονται με τθν ςειρά εμφάνιςθσ τουσ ςτθν πθκτι από πάνω προσ τα κάτω: Glomus mosseae A, G. mosseae B, G. intraradices και G. etunicatum. Οι ηϊνεσ που κακορίηονται με τουσ αρικμοφσ αλλθλουχικθκαν και θ ταυτότθτα των ςχετικϊν ριβοτφπων από τουσ οποίουσ προιλκαν παρουςιάηονται ςτον Πίνακα

271 (α) (β) Διάγραμμα 4.2. Μοριακό αποτφπωμα DGGE και αντίςτοιχθ ανάλυςθ κατά ςυςτάδεσ (Jaccards similarity index) τθσ κοινότθτασ των ΔΜΜ ςτισ ρίηεσ των φυτϊν καλαμποκιοφ από το πείραμα κερμοκθπίου που δζχτθκαν επζμβαςθ με διαφορετικά επίπεδα δόςεων (x0, x10, x100, x1000) του nicosulfuron, με τθν ολοκλιρωςθ του (α) δεφτερου κφκλου επζμβαςθσ, και (β) τρίτου κφκλου επζμβαςθσ. Σα επίπεδα δόςεων για τα οποία τα αποτελζςματα απουςιάηουν είναι αυτά ςτα οποία εκδθλϊκθκε φυτοτοξικότθτα ςτα φυτά καλαμποκιοφ. M: δείκτθσ ΔΜΜ που αποτελείται από μίγμα PCR προϊόντων τουσ 18S rrna γονιδίου ςτελεχϊν ΔΜΜ που ανικουν ςτθν ςυλλογι τθσ ερευνθτικισ ομάδασ Βιοτεχνολογίασ Φυτϊν και Περιβάλλοντοσ, Σμιμα Βιοχθμείασ και Βιοτεχνολογίασ, Πανεπιςτιμιο Θεςςαλίασ και παρουςιάηονται με τθν ςειρά εμφάνιςθσ τουσ ςτθν πθκτι από πάνω προσ τα κάτω: Οι ηϊνεσ που κακορίηονται με τουσ αρικμοφσ αλλθλουχικθκαν και θ ταυτότθτα των ςχετικϊν ριβοτφπων από τουσ οποίουσ προιλκαν παρουςιάηονται ςτον Πίνακα

272 (α) (β) Διάγραμμα 4.3. Μοριακό αποτφπωμα DGGE και αντίςτοιχθ ανάλυςθ κατά ςυςτάδεσ (Jaccards similarity index) τθσ κοινότθτασ των ΔΜΜ ςτισ ρίηεσ των φυτϊν καλαμποκιοφ από το πείραμα κερμοκθπίου που δζχτθκαν επζμβαςθ με διαφορετικά επίπεδα δόςεων (x0, x10, x100, x1000) του nicosulfuron, με τθν ολοκλιρωςθ του (α) τζταρτου κφκλου επζμβαςθσ, και (β) πζμπτου κφκλου επζμβαςθσ. Οι μεταχειρίςεισ για τισ οποίεσ δεν παρουςιάηονται αποτελζςματα δεν αναλφκθκαν λόγω εμφάνιςθσ φυτοτοξικότθτασ ςτα φυτά καλαμποκιοφ. M: δείκτθσ ΔΜΜ που αποτελείται από μίγμα PCR προϊόντων τουσ 18S rrna γονιδίου ςτελεχϊν ΔΜΜ που ανικουν ςτθν ςυλλογι τθσ ερευνθτικισ ομάδασ Βιοτεχνολογίασ Φυτϊν και Περιβάλλοντοσ, Σμιμα Βιοχθμείασ και Βιοτεχνολογίασ, Πανεπιςτιμιο Θεςςαλίασ και παρουςιάηονται με τθν ςειρά εμφάνιςθσ τουσ ςτθν πθκτι από πάνω προσ τα κάτω: Οι ηϊνεσ που κακορίηονται με τουσ αρικμοφσ αλλθλουχικθκαν και θ ταυτότθτα των ςχετικϊν ριβοτφπων από τουσ οποίουσ προιλκαν παρουςιάηονται ςτον Πίνακα

273 Πίνακασ 4.9. Σαυτοποίθςθ επιλεγμζνων DGGE ηωνϊν από κλϊνουσ ΔΜΜ που παραλιφκθκαν από τισ ρίηεσ των φυτϊν καλαμποκιοφ ςτο πείραμα κερμοκθπίου. Σο πρϊτο ψθφίο υποδθλϊνει τον αρικμό του κφκλου επζμβαςθσ με το nicosulfuron (κφκλοι 1 5) και το δεφτερο ψθφίο το πρότυπο θλεκτροφορθτικισ κινθτικότθτασ τθσ κάκε ηϊνθσ. Ζϊνεσ με ίδιο το δεφτερο ψθφίο προιλκαν από διαφορετικοφσ κφκλουσ επζμβαςθσ και διαφορετικζσ μεταχειρίςεισ αλλά παρουςίαςαν πανομοιότυπο πρότυπο θλεκτροφορθτικισ κινθτικότθτασ. No. Εχκδξ οκμθζηυξ ανζειυξ ηθχκςκ πμο αθθδθμοπήεδηακ Πθδζζέζηενδ ακηζζημίπζζδ ιε ηα δεδμιέκα ημο GenBank (ζφιθςκα ιε ηδκ % μιμθμβία αθθδθμοπζχκ ζημ BLAST) Ανζειυξ πνυζααζδξ ζηδκ GenBank Uncultured Glomus clone U06-31 (99.7%) AB Uncultured Glomus isolate AVE clone 1-15 (98.7%) HE Glomus mosseae isolate MC10 (99.3%) FR Uncultured Glomus clone G+I9-12 (99.7%) FR Uncultured Glomus clone G3-7 (99.7%) FR Uncultured Glomus clone 0168 (97.5%) AB Glomus etunicatum isolate UFPE06 (99.1%) AJ Uncultured Glomus isolate AVE clone 1-15 (98.6%) HE B 1 Uncultured Diversispora clone 3904_PAF_NF31 (100%) FJ Glomus mosseae isolate MC10 (99.9%) FR Uncultured Glomus clone G+I9-12 (99.6%) FR Glomus irregulare clone 14 (99.9%) FJ Glomus irregulare clone 14 (99.9%) FJ Uncultured Glomus clone G3-7 (99.7%) FR Uncultured Paraglomeraceae clone 253AM1_1 (99.6%) JN Glomus etunicatum isolate UFPE06 (99.9%) AJ Uncultured Glomus isolate AVE clone 1-15 (98.6%) HE B 2 Uncultured Diversispora clone 3904_PAF_NF31 (99.2%) FJ Glomus mosseae isolate MC10 (99.5%) FR Uncultured Glomus clone G+I9-12 (99.6%) FR

274 3.7A 3 Uncultured Glomus clone G3-7 (99.7%) FR B 4 Uncultured Glomus clone G3-7 (99.7%) FR Uncultured Paraglomeraceae clone 253AM1_1 (99.6%) JN Glomus etunicatum isolate UFPE06 (100%) AJ Uncultured Glomus clone U06-31 (99.3%) AB Uncultured Glomus isolate AVE clone 1-15 (98.7%) HE B 1 Uncultured Diversispora clone 3904_PAF_NF31 (99.2%) FJ Glomus mosseae isolate MC10 (99.5%) FR B 1 Glomus mosseae strain INVAM UT101 (99.9%) NG C 3 Uncultured Glomus clone Ku_4_2 (99.2%) AB Uncultured Glomus clone G+I9-12 (100%) FR A 1 Uncultured Glomus clone G3-7 (99.5%) FR B 3 Uncultured Glomus clone G3-7 (99.7%) FR Uncultured Glomus clone j-18.3r (100%) GQ Glomus etunicatum isolate UFPE06 (99.5%) AJ Uncultured Glomus isolate AVE clone 1-15 (98.1%) HE B 1 Uncultured Diversispora clone 3904_PAF_NF31 (99.2%) FJ Glomus mosseae isolate MC10 (99.2%) FR Uncultured Glomus clone G+I9-12 (99.6%) FR Glomus irregulare clone 14 (99.9%) FJ Uncultured Glomus clone G3-7 (99.7%) FR Uncultured Glomus clone j-18.3r (100%) GQ Glomus etunicatum isolate UFPE06 (99.9%) AJ ΠΔΗΡΑΜΑ ΑΓΡΟΤ Δπίδξαζε ηνπ nicosulfuron ζηελ θνηλόηεηα ησλ ΓΜΜ Απυ ηδκ DGGE ακάθοζδ ζημ πείναια αβνμφ, παναηδνήεδηε δ πανμοζία ζπεηζηά πθμφζζαξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ ζηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ (Δζηυκα 4.7). Απυ ηδκ ακάθοζδ ηαηά ζοζηάδεξ ηςκ ιμνζαηχκ απμηοπςιάηςκ ηςκ δεζβιάηςκ πμο 274

275 ζοθθέπεδηακ 28 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ ιε ημ nicosulfuron δεκ παναηδνήεδηε ζαθήξ επίδναζδ ημο γζγακζμηηυκμο ηαζ ηα δείβιαηα μιαδμπμζήεδηακ ζε δφμ ηφνζεξ ζοζηάδεξ (Γζάβναιια 4.4). Σα δείβιαηα ηδξ πνχηδξ ζοζηάδαξ δζαπςνίζηδηακ πεναζηένς ζε δφμ οπμμζοζηάδεξ α) ιε ηδκ πνχηδ κα απμηεθείηαζ απυ ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα, ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ επέιααζδ ιε δυζδ 2x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ ηαζ έκα απυ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ επέιααζδ ιε ηδκ ορδθυηενδ δυζδ (5x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ) ηαζ α) ηδκ δεφηενδ οπμμιάδα κα πενζθαιαάκεζ υθα ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ ηδκ ζοκζζηχιεκδ δυζδ (1x). Σέθμξ, ηα οπυθμζπα ηνία δείβιαηα ηδξ ιεηαπείνζζδξ 5x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ ζπδιάηζζακ ηδ δεφηενδ ηφνζα ζοζηάδα. Διάγραμμα 4.4. Ανάλυςθ κατά ςυςτάδεσ (Jaccards similarity index) με βάςθ τθ δυαδικι απεικόνιςθ των αποτελεςμάτων του μοριακοφ αποτυπϊματοσ που προζκυψε από τθν DGGE ανάλυςθ τθσ κοινότθτασ των ΔΜΜ ςτισ ρίηεσ των φυτϊν καλαμποκιοφ που δζχτθκαν επζμβαςθ με το ηιηανιοκτόνο nicosulfuron (NS) ςε δόςεισ x0 (Control), x1, x2 και x5 τθσ ςυνιςτϊμενθσ ςτον αγρό. 275

276 Εικόνα 4.7. Μοριακό αποτφπωμα DGGE τθσ κοινότθτασ των ΔΜΜ ςτισ ρίηεσ φυτϊν καλαμποκίου που δζχτθκαν εφαρμογι διαφορετικϊν δόςεων του ηιηανιοκτόνου nicosulfuron (0x, 1x, 5x) ςτο πείραμα αγροφ και ςυλλζχκθκαν 28 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ (28days). Μ: Marker για μυκκόριηεσ που αποτελείται από μίγμα 18S rrna-pcr προϊόντων (ςυγκζντρωςθ 20 ng/μl) ςτελεχϊν ΔΜΜ από τθν ςυλλογι τθσ Ερευνθτικισ Ομάδασ Βιοτεχνολογίασ Φυτϊν και Περιβάλλοντοσ του Σμιματοσ Βιοχθμείασ και Βιοτεχνολογίασ του Πανεπ. Θεςςαλίασ που ακολουκοφν με ςειρά εμφάνιςθσ από πάνω προσ τα κάτω: Glomus mosseae A, G. mosseae B, G. intraradices και G. etunicatum. 276

277 4.5. πδήηεζε Σα βεςνβζηά θάνιαηα απμηεθμφκ αηυιδ ηαζ ζήιενα ζδιακηζηυ ενβαθείμ βζα ηδ ζφβπνμκδ βεςνβία ηαζ μζ αθθδθεπζδνάζεζξ ημοξ ιε εδαθζημφξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ιδζηυπμοξ υπςξ μζ ΓΜΜ, πμο παίγμοκ ηαεμνζζηζηυ νυθμ ζηδκ πμζηζθυηδηα ηςκ θοηχκ ηαζ ζηδ θεζημονβία ημο μζημζοζηήιαημξ, πνήγμοκ ζδζαίηενδξ δζενεφκδζδξ. ηδκ πανμφζα ιεθέηδ, αλζμθμβήεδηε δ επίδναζδ ημο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ, πμο επζθέπεδηε ζακ μοζία πνυηοπμ εηπνμζςπχκηαξ ηα βεςνβζηά θάνιαηα πμο εθανιυγμκηαζ ζε παιδθέξ δυζεζξ εθανιμβήξ, ζηδκ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ, ζε ηαθθζένβεζα ηαθαιπμηζμφ ζε δφμ δζαθμνεηζηά ζεκάνζα: α) ε επίπεδμ εενιμηδπίμο (Tier I) οπυ ζδζαίηενα αηναίεξ ζοκεήηεξ ιαηνμπνυκζαξ έηεεζδξ (δυζεζξ πμθθαπθάζζεξ ηδξ ζοκζζηχιεκδξ ηαζ επακαθαιαακυιεκεξ εθανιμβέξ) ηαζ α) ε επίπεδμ αβνμφ (Tier II) οπυ νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ ζημ γζγακζμηηυκμ. ημ πείναια εενιμηδπίμο μζ επακαθαιαακυιεκεξ επειαάζεζξ ιε ημ nicosulfuron ζε δυζεζξ ζδιακηζηά ορδθυηενεξ απυ εηείκεξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζημ πείναια αβνμφ μδήβδζακ ζε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδκ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ ζηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ. Με ημ πανυκ πεζναιαηζηυ ζπέδζμ ελεηάζηδηακ δομ δζαθμνεηζηέξ οπμεέζεζξ ζπεηζηά ιε ηδκ επίδναζδ ηςκ επακαθαιαακυιεκςκ επειαάζεςκ ημο nicosulfuron ζημοξ ΓΜΜ. φιθςκα ιε ηδκ πνχηδ οπυεεζδ δ επακαθαιαακυιεκδ εθανιμβή ημο nicosulfuron ακαιέκμκηακ κα μδδβήζεζ ζε ααειζαία πνμζανιμβή ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ ζημ γζγακζμηηυκμ, ιε απμηέθεζια ηδκ επζηαποκυιεκδ ιζηνμαζαηή απμδυιδζδ ημο nicosulfuron πμο εα εηδδθχκμκηακ ηεθζηά ιε ηδκ απμοζία μπμζμκδήπμηε ανκδηζηχκ επζδνάζεςκ ζημ θοηυ-λεκζζηή ηαζ ζηδκ ημζκυηδηα ηςκ ΓΜΜ. Ακηίεεηα, ζφιθςκα ιε ηδ δεφηενδ οπυεεζδ μζ δζαδμπζηέξ επειαάζεζξ ιε ημ γζγακζμηηυκμ ζημ εφνμξ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ πμο επζθέπεδηε, εα ιπμνμφζε κα μδδβήζεζ ζε πζεακή ααειζαία αφλδζδ ηςκ οπμθεζιιάηςκ ημο nicosulfuron ιε ανκδηζηέξ ζοκέπεζεξ ηυζμ βζα ηα θοηά ηαθαιπμηζμφ υζμ ηαζ βζα ημοξ πθδεοζιμφξ ηςκ ΓΜΜ. Απυ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ επαθδεεφηδηε δ δεφηενδ οπυεεζδ. Οζ δζαδμπζηέξ εθανιμβέξ ημο nicosulfuron πανειπυδζζακ δναζηζηά (x100) ή πνμηάθεζακ πθήνδ ακάζπεζδ ηδξ ακάπηολδξ ημο ηαθαιπμηζμφ (x1000) απυ ημκ δεφηενμ ηφηθμ επέιααζδξ ηαζ ιεηά, θυβς ηδξ εηδήθςζδξ θαζκμιέκςκ θοημημλζηυηδηαξ (Δζηυκα 4.6). Σαοηυπνμκα, απυ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ DGGE 277

278 ακάθοζδξ, δζαπζζηχεδηε δναζηζηή ιείςζδ ζηδκ πμζηζθυηδηα ηςκ ΓΜΜ ζηζξ δυζεζξ 1000x ηαηά ημκ πνχημ ηφηθμ επέιααζδξ ηαζ ζηδ δυζδ 100x απυ ημ δεφηενμ ηφηθμ επέιααζδξ ηαζ ιεηά, ιε ελαίνεζδ ημκ ηέηανημ ηφηθμ επέιααζδξ υπμο δ δυζδ 100x επέδεζλε θοημημλζηή επίδναζδ ζηα θοηά ημο ηαθαιπμηζμφ. Ακηίεεηα, δ εθανιμβή ηδξ 10x δυζδξ δεκ θάκδηε κα πνμηαθεί ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδκ ημζκυηδηα ηςκ ΓΜΜ ζοβηνζηζηά ιε ημ ιάνηονα πμο δεκ εηηέεδηε ζημ nicosulfuron. Οζ παναπάκς παναηδνήζεζξ ανίζημκηαζ ζε ζοιθςκία ιε ηα απμηεθέζιαηα ηςκ πανάθθδθςκ ιεηνήζεςκ (πμο δεκ απμηέθεζακ ακηζηείιεκμ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ ηαζ πναβιαημπμζήεδηακ απυ άθθα ενβαζηήνζα) ζπεηζηά ιε ηδκ οπμθεζιιαηζηυηδηα ημο nicosulfuron ζημ έδαθμξ ηαζ ηα επίπεδα ιοημννζγζημφ απμζηζζιμφ. οβηεηνζιέκα, δ επακαθαιαακυιεκδ εθανιμβή ημο nicosulfuron πνμηάθεζε ζηαδζαηή αφλδζδ ηςκ οπμθεζιιάηςκ ημο β.θ. απυ ημκ ηνίημ ηφηθμ επέιααζδξ ηαζ ιεηά (Γζάβναιια 4.5, δεδμιέκα Η. Pertric, Rudgers Boskovic Institute, Κνμαηία), εκχ δ εθανιμβή ηδξ παιδθυηενδξ δυζδξ (10x) πνμηάθεζε ιείςζδ ηδξ ζοκμθζηήξ αζμιάγαξ ηςκ θοηζηχκ αθαζηχκ ηαζ νζγχκ ιυκμ ηαηά ημοξ ηεθεοηαίμοξ δφμ ηφηθμοξ (Γζάβναιια 4.6, δεδμιέκα απυ F. Martin-Laurent, INRA), υηακ δ ζοβηέκηνςζδ ημο γζγακζμηηυκμο ζημ έδαθμξ είπε αολδεεί ζε επίπεδα ζδιακηζηά ορδθυηενα απυ ημ ανπζηυ επίπεδμ δυζδξ (Γζάβναιια 4.5). ε πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ, έπεζ ανεεεί πςξ ημ ηαθαιπυηζ είκαζ βεκζηά ακεεηηζηυ ζηδκ ιεηαθοηνςηζηή εθανιμβή ημο nicosulfuron (Hinz and Owen, 1995). Φαίκεηαζ πςξ ηα επίπεδα ζοβηεκηνχζεςκ ημο γζγακζμηηυκμο πμο ζοζζςνεφηδηακ ζημ έδαθμξ ιεηά απυ ηζξ επακαθαιαακυιεκεξ επειαάζεζξ ήηακ πζεακυκ πμθφ ορδθά βζα κα ιπμνέζεζ δ ηαθθζένβεζα κα ακηαπελέθεεζ. Ακηίζημζπα, παναηδνήεδηε ζδιακηζηή ακαζημθή ημο ιοημννζγζημφ απμζηζζιμφ ζηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ ζηδκ πενίπηςζδ εθανιμβήξ ημο nicosulfuron ζε δυζδ 100x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ (Γζάβναιια 4.7, δεδμιέκα απυ Ηςάκκδξ Τρδθάκηδξ, ΑΠΘ). 278

279 Διάγραμμα 4.5. υγκζντρωςθ του nicosulfuron ςτο ζδαφοσ ςτο τζλοσ κάκε κφκλου επζμβαςθσ (κφκλοι 2 ζωσ 5, πείραμα κερμοκθπίου), όπωσ αυτι εκφράςτθκε ωσ % διαφορά από τθν ςυγκζντρωςθ του ηιηανιοκτόνου ςτον πρϊτο κφκλο επζμβαςθσ. Κάκε τιμι αποτελεί το μζςο όρο 5 επαναλιψεων ± τυπικι απόκλιςθ του μζςου όρου. Διαφορετικά γράμματα υποδθλϊνουν ςτατιςτικά ςθμαντικζσ διαφορζσ μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο (p<0.05) (δεδομζνα από Ι. Pertric, Rudgers Boskovic Institute, Κροατία). Διάγραμμα 4.6. Βιομάηα βλαςτϊν και ριηϊν φυτϊν καλαμποκιοφ που ςυλλζχκθκαν ςτο τζλοσ κάκε κφκλου επζμβαςθσ, κφκλοσ 1 (α), 2 (β), 3 (γ), 4 (δ) and 5 (ε) ςτο πείραμα κερμοκθπίου. Κάκε τιμι αποτελεί το μζςο όρο 5 επαναλιψεων ± τυπικι απόκλιςθ του μζςου όρου. Διαφορετικά γράμματα υποδθλϊνουν ςτατιςτικά ςθμαντικζσ διαφορζσ μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο (p<0.05) (δεδομζνα από F. Martin-Laurent, INRA). 279

280 οκμθζηά δ ακαζηαθηζηή δνάζδ ηςκ ορδθχκ δυζεςκ εθανιμβή ημο nicosulfuron ζημοξ ΓΜΜ ιπμνεί κα μθείθεηαζ είηε ζε άιεζδ ημλζηυηδηα ημο γζγακζμηηυκμο επί ηςκ ΓΜΜ πμο πανειπμδίγμοκ ηδκ ακάπηολδ ηςκ οθχκ ημοξ ζημ έδαθμξ ηαζ ημκ απμζηζζιυ ηςκ νζγχκ ή ζε έιιεζδ επίδναζδ ζημ ηαθαιπυηζ ςξ θοηυ λεκζζηή. Σμ nicosulfuron δνα ακαζηέθθςκηαξ ηδκ δνάζδ ημο εκγφιμο ALS πμο είκαζ ανηεηά ζοκηδνδιέκμ έκγοιμ ηαζ ειθακίγεηαζ ηυζμ ζε θοηά υζμ ηαζ ζε ιφηδηεξ ηαζ ααηηήνζα. οκεπχξ, δ πζεακυηδηα απεοεείαξ ημλζηυηδηαξ ημο nicosulfuron ζημοξ ΓΜΜ δζαιέζμο ακαζημθήξ ημο εκγφιμο ALS δεκ ιπμνεί κα απμηθεζζηεί. Πνυζθαηεξ in vitro ιεθέηεξ έδεζλακ άιεζδ ανκδηζηή επίδναζδ ηςκ γζγακζμηηυκςκ prometryn ηαζ acetochlor ζηδ θοζζμθμβία ηαζ ηδ ιεηααμθζηή δναζηζηυηδηα ιζάξ απμιυκςζδξ ημο είδμοξ G. etunicatum (Li et al., 2013). Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, δ ζοζζχνεοζδ ορδθχκ ζοβηεκηνχζεςκ nicosulfuron ζημ έδαθμξ είκαζ πζεακυ κα πνμηάθεζε ελμοδεηένςζδ ημο ιδπακζζιμφ απμημλζημπμζήζδξ - δζάζπαζδξ ημο nicosulfuron ζημ ηαθαιπυηζ (Carey et al. 1997) ηαζ ςξ εη ημφημο κα μδήβδζε ζε ακαζημθή ηδξ ζφκεεζδξ ηςκ αιζκμλέςκ ιε δζαηθαδζζιέκδ αθοζίδα αηυιςκ άκεναηα ηαζ ζε πενζμνζζιέκδ ακάπηολδ (Babczinski and Zelinski 1991). Οζ Trappe et al. (1984) ηαηέθδλακ υηζ ηα γζγακζμηηυκα, ζε ζοκάνηδζδ ιε ημκ ηνυπμ δνάζδξ ημοξ, ιπμνμφκ κα επδνεάζμοκ ανκδηζηά ημ ιεηααμθζζιυ ηςκ θοηχκ-λεκζζηχκ πνμηαθχκηαξ πενζμνζζιέκδ παναβςβή ηαζ δζαεεζζιυηδηα ζαηπάνςκ ζημ θοηυ πμο ζηδ ζοκέπεζα ιπμνεί κα πενζμνίζεζ ηδκ ακάπηολδ ιοημννζγζηχκ ζοιαζςηζηχκ ζπέζεςκ ηαζ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ιεηαλφ ηςκ ΓΜΜ ηαζ ηςκ θοηχκ λεκζζηχκ, επδνεάγμκηαξ άιεζα ηδκ ημζκυηδηα ηςκ ΓΜΜ. Απυ ηδκ ακάθοζδ ηςκ ιμνζαηχκ απμηοπςιάηςκ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ ηαηά ημ δεφηενμ ηφηθμ επέιααζδξ, παναηδνήεδηε ελάθεζρδ ηςκ ηονίανπςκ ιεθχκ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ ζηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ πμο δέπηδηακ επέιααζδ ιε ηδ δυζδ 100x, ζε ζπέζδ ιε ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα ηαζ ηδξ δυζδξ 10x. Πανάθθδθα παναηδνήεδηε ιζα ζηαδζαηή ακηζηαηάζηαζδ αοηχκ ηςκ ηονίανπςκ ΓΜΜ απυ άθθα ιέθδ (γχκεξ 2.5, 2.6 ηαζ 2.7) πμο ήηακ ζηακά κα απμζηίζμοκ ηζξ νίγεξ ηαθαιπμηζμφ πανά ηδκ θοζζμθμβζηή ηαηαπυκδζδ ημο θοημφ-λεκζζηή (Γζάβναιια 4.2 α ) απυ ηδκ έηεεζδ ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ημο nicosulfuron. Ο επζθεηηζηυξ απμηθεζζιυξ ζοβηεηνζιέκςκ ιεθχκ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ απυ ηδκ εθανιμβή ημο nicosulfuron ζε ορδθέξ δυζεζξ είκαζ δοκαηυκ κα μδήβδζε ζηδ δδιζμονβία εκυξ πενζαάθθμκημξ ήπζμο ακηαβςκζζιμφ βζα ημοξ θζβυηενμ ηονίανπμοξ ηαζ ακεεηηζημφξ ζημ nicosulfuron ΓΜΜ δίκμκηαξ ημοξ ηδκ εοηαζνία κα πμθθαπθαζζαζημφκ ηαζ κα απμζηίζμοκ εονέςξ 280

281 ημ θοηυ απμοζία ηςκ οπμθμίπςκ παναβςβζηχκ ακηαβςκζζηζηχκ εζδχκ. Ζ οπυεεζδ αοηή εκζζπφεηαζ απυ ηα απμηεθέζιαηα ηςκ πανάθθδθςκ πεζναιάηςκ απμζηζζιμφ, υπμο δζαπζζηχεδηε ζδιακηζηή αφλδζδ ζημκ απμζηζζιυ ηςκ θοηχκ πμο δέπηδηακ εθανιμβή δυζδξ 100x ζημκ δεφηενμ ηφηθμ επέιααζδξ, πανά ηδ βεκζηή ηάζδ ιείςζδξ πμο πενζβνάθδηε πνμδβμοιέκςξ (Γζάβναιια 4.7, δεδμιέκα απυ Ηςάκκδξ Τρδθάκηδξ, ΑΠΘ). Πανυιμζα ήηακ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ ιεθέηδξ ηςκ Ipsilantis et al (2012) πμο ηαηέθδλακ υηζ δ επέιααζδ ιε ημ azadirachtin πνμηάθεζε αφλδζδ ημο ζοκμθζημφ ιοημννζγζημφ απμζηζζιμφ ηςκ νζγχκ θοηχκ πζπενζάξ ηαζ ηδκ ίδζα ζηζβιή επζθεηηζηά πανειπμδίζηδηε δ ακάπηολδ εκυξ απυ ηα ιέθδ ημο ειαμθίμο ηςκ ΓΜΜ πμο είπε εθανιμζηεί ζηα θοηά πνζκ ηδκ εθανιμβή ημο β.θ. ιεζχκμκηαξ έηζζ ημκ ακηαβςκζζιυ βζα ηα οπυθμζπα δφμ ιέθδ ημο. Διάγραμμα 4.7. Αποικιςμόσ των ριηϊν καλαμποκιοφ απο τουσ ΔΜΜ (υφζσ, δενδρόμορφοι ςχθματιςμοί και κφςτεισ) ςτο τζλοσ κάκε κφκλου επζμβαςθσ με το ηιηανιοκτόνο nicosulfuron: κφκλοσ 1 (α), 2 (β), 3 (γ), 4 (δ) and 5 (ε) ςτο πείραμα κερμοκθπίου. Κακζ τιμι αποτελεί τον μζςο όρο 5 επαναλιψεων ± τυπικι απόκλιςθ του μζςου όρου. Διαφορετικά γράμματα υποδθλϊνουν ςτατιςτικά ςθμαντικζσ διαφορζσ μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο (p<0.05) (δεδμιέκα απυ Ηςάκκδξ Τρδθάκηδξ, ΑΠΘ). 281

282 Ζ δδιζμονβία αζαθζμεδηχκ ηθχκςκ απμηάθορε υηζ μζ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ απμζηίζηδηακ ηονίςξ απυ ιέθδ ημο πμθοπθδεέζηενμο, ζδζαίηενα ζε ηαθθενβμφιεκα εδάθδ, βέκμοξ ηςκ ΓΜΜ Glomus (Krüger et al. 2011). Ζ παναηήνδζδ αοηή ανίζηεηαζ ζε ζοιθςκία ιε ηζξ πενζζζυηενεξ ςξ ηχνα ιεθέηεξ ζε εκηαηζηά ηαθθζενβμφιεκα εδάθδ πμο παναηηδνίγμκηαζ απυ αολδιέκεξ εζζνμέξ λεκμαζμηζηχκ παναβυκηςκ ηαζ εκηαηζηέξ ηαθθζενβδηζηέξ ενβαζίεξ (Daniell et al. 2001, Hirji et al. 2006). οβηεηνζιέκα ιέθδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ επέδεζλακ εοαζζεδζία ζε ορδθέξ δυζεζξ ημο nicosulfuron ηαζ απέηοπακ κα απμζηίζμοκ ηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ, ζοβηνζηζηά ιε άθθμοξ ιφηδηεξ πμο ακηζπνμζςπεφμκηαζ απυ ηζξ γχκεξ x.8 (πενζααθθμκηζημί ηθχκμζ Glomus ή Paraglomeraceae) ηαζ x.9 (ζηέθεπμξ Glomus etunicatum) μζ μπμίμζ δεκ επδνεάζηδηακ απυ ηδκ πνμζεήηδ ημο nicosulfuron ηαζ απμίηζζακ ηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηάης απυ υθεξ ηζξ ζοκεήηεξ. Μζα άθθδ πενίπηςζδ πμο αλίγεζ κα ακαθενεμφιε πεναζηένς ήηακ δ ακηίδναζδ ηςκ νζαμηφπςκ πμο ακηζπνμζςπεφμκηαζ απυ ηζξ γχκεξ 2.5, 2.6 ηαζ 2.7 ζηδκ εθανιμβή ημο nicosulfuron. Οζ ζοβηεηνζιέκμζ ΓΜΜ ακ ηαζ απμίηζζακ ηαπέςξ ηζξ νίγεξ ηαθαιπμηζμφ πμο εηηέεδηακ ζηδ δυζδ x100 ζημκ δεφηενμ ηφηθμ επέιααζδξ, δεκ ηαηάθενακ κα απμζηίζμοκ ηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ζημοξ επυιεκμοξ ηφηθμοξ. Σμ ζοβηεηνζιέκμ πνυηοπμ απμζηζζιμφ ιπμνεί κα απμδμεεί ζηζξ αολακυιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ ημο γζγακζμηηυκμο ζημ έδαθμξ ζημοξ επυιεκμοξ ηφηθμοξ πμο δεκ επέηνερακ ημκ απμζηζζιυ απυ ηα ζοβηεηνζιέκα είδδ ΓΜΜ ηαζ απμηεθεί απυδεζλδ βζα ηδκ φπανλδ εκυξ μνίμο ζοβηέκηνςζδξ ημο nicosulfuron πμο πνμηαθεί ακαζημθή ηαζ πμο πμζηίθεζ ακάιεζα ζηα ιέθδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ ζε δεδμιέκμ εδαθζηυ μζημζφζηδια. Οζ παναπάκς παναηδνήζεζξ ανίζημκηαζ ζε ζοιθςκία ιε αοηέξ ηςκ Trappe et al. (1984) πμο ηαηέθδλακ υηζ οπάνπεζ έιθοηδ βεκεηζηή πμζηζθυηδηα ακάιεζα ζημοξ ΓΜΜ ζε ακηζζημζπία ιε ηδκ ακεεηηζηυηδηα ημοξ ζηα β.θ.. Ζ μνευηδηα ηδξ οπυεεζδξ αοηήξ εκζζπφεδηε απυ ηα απμηεθέζιαηα επυιεκςκ ιεθεηχκ ηαζ πνμέηορε υηζ ηάηζ ηέημζμ ιπμνμφζε κα μδδβήζεζ ζε ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ οπυ ζοκεήηεξ ηαηαπυκδζδξ ιε απνμζδζυνζζηεξ ζοκέπεζεξ βζα ηδκ ακάπηολδ ηαζ ηδκ πμζηζθυηδηα ηςκ θοηχκ, ηαεχξ ηαζ ηδκ εδαθζηή ζηαεενυηδηα (Schreiner and Bethlenfalvay, 1997). Ζ ακεεηηζηυηδηα πμο επέδεζλε μ νζαυηοπμξ ημο είδμοξ G. etunicatum (γχκδ x.9) ζημ nicosulfuron ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ ανίζηεηαζ ζε ζοιθςκία ιε ηα απμηεθέζιαηα πνμδβμφιεκςκ ιεθεηχκ. Οζ Ipsilantis et al., (2012) ανήηακ έκα νζαυηοπμ ημο G. etunicatum ιε αολδιέκδ ακεεηηζηυηδηα ζημ azadirachtin. Οιμίςξ, μζ Schreiner and 282

283 Bethlenfalvay (1997) παναηήνδζακ ορδθή ακεεηηζηυηδηα ημο G. etunicatum ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ δζαθμνεηζηχκ ιοηδημηηυκςκ ζοβηνζηζηά ιε ηα οπυθμζπα είδδ Glomus πμο ιεθεηήεδηακ. Ακ ηαζ ηα απμηεθέζιαηα αοηά απμηεθμφκ ηδκ πνχηδ έκδεζλδ ιζαξ πζεακήξ θοθμβεκεηζηά ελανηχιεκδξ ακεεηηζηυηδηαξ ζηα β.θ. επζπθέμκ ιεθέηεξ απαζημφκηαζ πνμηείιεκμο κα επζαεααζςεεί ακ αοηή δ ζοβηεηνζιέκδ ζοιπενζθμνά ημο G. etunicatum είκαζ ηθδνμκμιήζζιμ παναηηδνζζηζηυ πμο πνμηφπηεζ απυ ηα παναηηδνζζηζηά ηδξ θοζζμθμβίαξ ημο. ε ακηίεεζδ ιε ημ πείναια εενιμηδπίμο, μζ επειαάζεζξ ζημκ αβνυ ιε ημ nicosulfuron ζε επίπεδα δυζεςκ έςξ ηαζ 5 θμνέξ ορδθυηενα απυ ηδ ζοκζζηχιεκδ δεκ επδνέαζακ ηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ ζηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ. Σα επίπεδα δυζεςκ ημο nicosulfuron πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζημ πείναια αβνμφ ήηακ ζδιακηζηά παιδθυηενα απυ ηα ακηίζημζπα ζημ πείναια εενιμηδπίμο ελαζηίαξ ηεπκζηχκ πενζμνζζιχκ πμο οπεζζένπμκηαζ ζημκ πεζναιαηζηυ ζπεδζαζιυ ηςκ πεζναιάηςκ αβνμφ ιε πνήζδ β.θ., απμηθείμκηαξ ηδκ άιεζδ ακηζπανααμθή ηςκ απμηεθεζιάηςκ ιεηαλφ ηςκ πεζναιάηςκ αβνμφ ηαζ εενιμηδπίμο. Μέπνζ ζήιενα, δεκ οπάνπμοκ δζαεέζζιεξ πθδνμθμνίεξ ζπεηζηά ιε ηδκ επίδναζδ ηςκ επειαάζεςκ ιε γζγακζμηηυκα ζε πεζνάιαηα αβνμφ ζηδκ εκδμνζγζηή ημζκυηδηα ηςκ ΓΜΜ, ιε απμηέθεζια κα ιδκ ιπμνμφιε κα πνμαμφιε ζε ακάθμβεξ ζοβηνίζεζξ. Σα παναπάκς απμηεθέζιαηα ςζηυζμ, ανίζημκηαζ ζε ζοιθςκία ιε αοηά ηςκ πανάθθδθςκ, ιεηνήζεςκ πμο πναβιαημπμζήεδηακ ζπεηζηά ιε ηδκ ζηακυηδηα ιοημννζγζημφ απμζηζζιμφ υπμο επίζδξ δεκ παναηδνήεδηακ επζδνάζεζξ ηαηά ηδκ επέιααζδ ιε δυζεζξ έςξ ηαζ πεκηαπθάζζεξ ηδξ ζοκζζηχιεκδξ βζα εθανιμβή ζημκ αβνυ (απμηεθέζιαηα Η. Τρδθάκηδξ, ΑΠΘ). Σέθμξ, αλίγεζ κα ζδιεζςεεί πςξ ηαζ ηα πνυηοπα δζάζπαζδξ ημο nicosulfuron ακελάνηδηα απυ ημ επίπεδμ δυζδξ πμο εθανιυζηδηε ανίζημκηαζ ζε ζοιθςκία ιε ηδκ έθθεζρδ μπμζμκδήπμηε επζδνάζεςκ ζηδκ ημζκυηδηα ηςκ ΓΜΜ ζηα επίπεδα δυζεςκ πμο ιεθεηήεδηακ (Γζάβναιια 4.8, δεδμιέκα απυ Η. Pertric, Rudgers Boskovic Institute, Κνμαηία). 283

284 Διάγραμμα 4.8. Πορεία αποδόμθςθσ του ηιηανιοκτόνου nicosulfuron ςτο πείραμα αγροφ. Κακζ τιμι αποτελεί τον μζςο όρο 4 επαναλιψεων ± τυπικι απόκλιςθ του μζςου όρου (από από Ι. Pertric, Rudgers Boskovic Institute, Κροατία) πκπεξάζκαηα ηδκ πανμφζα ιεθέηδ εηηζιήεδηε δ επίδναζδ ημο nicosulfuron ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ ζε ηαθθζένβεζα ηαθαιπμηζμφ, ηυζμ ζε επίπεδμ εενιμηδπίμο οπυ ζοκεήηεξ ορδθήξ ηαζ ιαηνμπνυκζαξ έηεεζδξ ζημ γζγακζμηηυκμ υζμ ηαζ ζε επίπεδμ αβνμφ οπυ νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ εθανιμβήξ. Σμ nicosufluron πνμηάθεζε δναζηζηή ιείςζδ ζηδκ πμζηζθυηδηα ηςκ ΓΜΜ ζηζξ νίγεξ ηςκ θοηχκ ηαθαιπμηζμφ, ιυκμ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ θοηχκ πμο εηηέεδηακ ζε επακαθαιαακυιεκεξ εθανιμβέξ ιε δυζδ 100x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ, εκχ δεκ παναηδνήεδηε ζδιακηζηή επίδναζδ ζηδκ πενίπηςζδ πμο ημ nicosulfuron εθανιυζηδηε ζε παιδθυηενεξ δυζεζξ (δδθαδή ζε δυζεζξ ίζεξ ή ιζηνυηενεξ ηδξ 10x), ηυζμ ζημ πείναια αβνμφ (x1, x2, x5), υζμ ηαζ ζημ πείναια ημο εενιμηδπίμο (x10). Σαοηυπνμκα ιε ηα παναπάκς απμηεθέζιαηα βζα ημοξ ΓΜΜ δ εθανιμβή ημο nicosulfuron ζηα ακηίζημζπα επίπεδα δυζεςκ πνμηάθεζε θοημημλζηυηδηα ζηα θοηά ηαθαιπμηζμφ οπμδεζηκφμκηαξ υηζ μζ επζδνάζεζξ ζημκ ζπδιαηζζιυ ηςκ ζοιαζςηζηχκ ζπέζεςκ ιεηαλφ ηςκ ΓΜΜ ηαζ ηςκ νζγχκ ιπμνμφκ κα μθείθμκηαζ ζηδκ θοζζμθμβζηή ηαηαπυκδζδ ηςκ θοηχκ απυ ηδκ έηεεζδ ημοξ ζημ γζγακζμηηυκμ. Απυ ηδκ ιμνζαηή ακάθοζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ ηαζ ηδ δδιζμονβία αζαθζμεδηχκ ηθχκςκ πμο αημθμφεδζε, ηαοημπμζήεδηακ ζδιακηζηά ιέθδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ πμο επέδεζλακ ηδκ ζηακυηδηα απμζηζζιμφ ηςκ νζγχκ ηςκ θοηχκ, πανά ηζξ ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ημο nicosulfuron πμο ζοζζςνεφμκηαζ ηαζ ηδκ θοζζμθμβζηή ηαηαπυκδζδ ημο θοημφ-λεκζζηή. Ζ απμιυκςζδ ηαζ μ έθεβπμξ αοηχκ ηςκ ζηεθεπχκ ηςκ ΓΜΜ εα ιπμνμφζε κα μδδβήζεζ ιεθθμκηζηά ζε αλζυθμβα 284

285 ζοιπενάζιαηα ζπεηζηά ιε ημοξ ιδπακζζιμφξ ακεεηηζηυηδηαξ ηαζ ηδκ πζεακή πνήζδ ημοξ ςξ ζοιαζςηζημφξ πανάβμκηεξ αφλδζδξ ηαζ ακάπηολδξ ηςκ θοηχκ ζε ζοζηήιαηα εκηαηζηήξ βεςνβίαξ Βηβιηνγξαθία Babczinski, P., Zelinski, T. (1991) Mode of action of herbicidal ALS-inhibitors on acetolactate synthase from green plant cell cultures, yeast, and Escherichia coli. Pesticide Science 31: Carey, J.B., Penner, D., Kells, J.J. (1997) Physiological basis for nicosulfuron and primisulfuron selectivity in five plants. Weed Science 42: Campagnac, E., Fontaine, J., Lounes-Hadj Sahraoui, A., Laruelle, F., Durand, R., Grandmougin-Ferjani (2008) Differential effects of fenpropimorph and fenhexamid, two sterol biosynthesis inhibitor fungicides, on arbuscular mycorrhizal development and sterol metabolism in carrot roots. Phytochemistry 69: Cornejo, P., Azcón-Aguilar, C., Barea, J.M., Ferrol, N., (2004) Temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE) as a tool for the characterization of arbuscular mycorrhizal fungi. FEMS Microbiology Letters 241: Daniell, T.J., Husband, R., Fitter, A.H., Young, J.P.W. (2001) Molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi colonizing arable crops. FEMS Microbiology Ecology 36: Deliopoulos, T., Minnis, S.T., Jones, P.W., Haydock, P.P.J. (2010) Enhancement of the efficacy of a carbamate nematicide against the potato cyst nematode, Globodera pallida, through mycorrhization in commercial potato fields. Journal of Nematology 42: Druille, M., Cabello, M.N., Omacini, M., Golluscio, R.A. (2013) Glyphosate reduces spore viability and root colonization of arbuscular mycorrhizal fungi. Applied Soil Ecology 64: Falco, S.C., Dumas, K.S. (1985) Genetic analysis of mutants of Saccharomyces cerevisiae resistant to the herbicide sulfometuron methyl. Genetics 109: Giovannetti, M., Turrini, A., Strani, P., Sbrana, C., Avio, L., Pietrangeli, B. (2006) Mycorrhizal fungi in ecotoxicological studies: soil impact of fungicides, insecticides and herbicides. Prevention Today 2:

286 Helgason, T., Fitter, A. (2005) The ecology and evolution of the arbuscular mycorrhizal fungi. Mycologist 19: Hijri, I., Sykorova, Z., Oehl, F., Ineichen, K., Mader, P., Wiemken, A., Redecker, D. (2006) Communities of arbuscular mycorrhizal fungi in arable soils are not necessarily low in diversity. Molecular Ecology 15: Hinz, J.R.R., Owen, M.D.K. (1996) Nicosulfuron and primisulfuron selectivity in corn (Zea mays) and two annual grass weeds. Weed Science 44: Huang, H., Zhang, S., Shan, X-Q., Chen, B-D., Zhu, Y-G., Bell, J.N.B. (2007) Effect of arbuscular mycorrhizal fungus (Glomus caledonium) on the accumulation and metabolism of atrazine in maize (Zea mays L.) and atrazine dissipation in soil. Environmental Pollution 146: Ipsilantis, I., Samourelis, C., Karpouzas, D.G. (2012) The impact of botanical pesticides on arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Biology & Biochemistry 45: Kiers, T.E., Duhamel, M., Beesetty, Y., Mensah, J.A. et al. (2011) Reciprocal rewards stabilize cooperation in the mycorrhizal symbiosis. Science 333: Kowalchuk, G.A., de Souza, F.A., van Veen, J.A. (2002) Community analysis of arbuscular mycorrhizal fungi associated with Ammophila arenaria in Dutch coastal sand dunes. Molecular Ecology 11: Krüger M., Krüger C., Walker C., Stockinger H., Schubler A. (2011) Phylogenetic reference data for systematics and phylotaxonomy of arbuscular mycorrhizal fungi from phylum to species level. New Phytologist 193: LaRossa, R.A., Schloss, J.V. (1984) The sulfonylurea herbicide sulfometuron methyl is an extremely potent and selective inhibitor of acetolactate synthase in Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry 259: Lee, J., Lee, S., Young, J.P.W. (2008) Improved PCR primers for the detection and identification of arbuscular mycorrhizal fungi. FEMS Microbiology Ecology 65: Li, X., Miao, W., Gong, C., Jiang, H., Ma, W., Zhu, S. ( 2013). Effects of prometryn and acetochlor on arbuscular mycorrhizal fungi and symbiotic system. Letters in Applied Microbiology 57, Liang, Z., Drijber, R.A., Lee, D.J., Dwiekat, I.M., Harris, S.D., Wedin, D.A. (2008) A DGGE-cloning method to characterize arbuscular mycorrhizal community structure in soil. Soil Biology & Biochemistry 40:

287 Mäder, P., Edenhofer, S., Boller, T., Wiemken, A., Niglii, U. (2000) Arbuscular mycorrhizae in a long-term field trial comparing low-input (organic, biological) and high-input (conventional) farming systems in a crop rotation. Biology and Fertility of Soils 31: Martin-Laurent, F., Kandeler, E., Pertic, I., Djuric, S., Karpouzas, D.G. (2013) ECOFUN-MICROBIODIV: an FP7 European project for developing and evaluating innovative tools for assessing the impact of pesticides on soil functional microbial diversity-towards new pesticide registration regulation? Environmental Science and Pollution Research 20: Mujica, M., Fracchia, S., Ocampo, J.A., Godeas, A. (1999) Influence of the herbicides chlorsulfuron and glyphosate on mycorrhizal soybean intercropped with the weeds Brassica campestris or Sorghum halepensis. Symbiosis 27: Nemec, S. (1985) Influence of selected pesticides on Glomus species and their infection in citrus. Plant and Soil 84: Poppell, C.A., Hayes, R.M., Mueller, T.C. (2002) Dissipation of nicosulfuron and rimsulfuron in surface soil. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50: Proomega (2005) pgem -T and pgem -T Easy Vectors. Proomega Technical Manual. Ramos-Zappata, J.A., Marrufo-Zappata, D., Guadarrama, P., Carillo-Sanchez, L., Henrandez-Cuevas, L., Caamal-Maldonado, A (2012) Impact of weed control on arbuscular mycorrhizal fungi in a tropical agroecosystem: a long-term experiment. Mycorrhiza 22: Rosendahl, S. (2008) Communities, populations and individuals of arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist 178: Schweiger, P.F., Jakobsen, I. (1998) Dose-response relationships between four pesticides and phosphorus uptake by hyphae of arbuscular mycorrhizas. Soil Biology and Biochemistry 30: Seghers, D., Siciliano, S.D., Top, E.M., Verstraete, W. (2005) Combined effect of fertilizer and herbicide applications on the abundance, community structure and performance of the soil methanotrophic community. Soil Biology and Biochemistry 37:

288 Smith, T.F., Noack, A.J., Cosh, S.M. (1981) The effect of some herbicides on vesicular arbuscular endophyte abundance in the soil and on infection of host roots. Pesticide Science 12: Smith, S.E., Jakobsen, I., Grønlund, M., Smith, F.A. (2011) Roles of arbuscular mycorrhizas in plant phosphorus nutrition: interactions between pathways of phosphorus uptake in arbuscular mycorrhizal roots have important implications for understanding and manipulating plant phosphorus acquisition. Plant Physiology 156: Spokes, J.R., MacDonald, R.M., Hayman, S. (1981) Effects of plant protection chemicals on vesicular-arbuscular mycorrhizas. Pesticide Science 12: Schreiner, R.P., Bethlenfalvay, G.J. (1997) Mycorrhizae, biocides, and biocontrol 3. Effects of three different fungicides on developmental stages of three AM fungi. Biology and Fertility of Soils 24: Tapia, L. S., Bauman, T. T., Harvey, R. G., Kells, J. J., Kapusta, G., Loux, M. M., Lueschen, W. E., Owen, M. D. K., Hageman, L. H., Strachan, S. D. (1997) Post-emergence herbicide application timing effects on annual grass control and corn (Zea mays) grain yield. Weed Science 45: Trappe, J.M., Molina, R., Castellano, M. (1984) Reactions of mycorrhizal fungi and mycorrhiza formation to pesticides. Annual Review of Phytopathology 22: van der Heijden, M.G.A., Klironomos, J.N., Ursic, M., Moutoglis, P., Streitwolf- Engel, R., Boller, T., Wiemken, A., Sanders, I.R., (1998) Mycorrhizal fungal diversity determines plant biodiversity, ecosystem variability and productivity. Nature 396: Wan, M.T., Rahe, J.E. (1998) Impact of azadirachtin on Glomus intraradices and vesicular-arbuscular mycorrhiza in root inducing transferred DNA transformed roots of Daucus carota. Environmental Toxicology and Chemistry 17: Wang, F.Y., Tong R.J., Shi Z.Y., Xu X.F., He X.H. (2011) Inoculations with abuscular mycorrhizal fungi increase vegetable yields and decrease phoxim concentrations in carrot and green onion and their soils. PlosOne 6(2): e Zhang, H., Zhang, X., Mu, W., Wang, J., Pan, H., Li, Y. (2010) Biodegradation of nicosulfuron by the bacterium Serratia marcescens N80. Journal of Environmental Science and Health Part B 45:

289 Zocco, D., Van Aarle, I.M., Oger, E., Lanfranco, L., Declerck, S. (2011) Fenpropimorph and fenhexamid impact phosphorus translocation by arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza 21:

290 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 5. Δπίδξαζε κπθεηνθηόλσλ θαη αληηνμεηδσηηθώλ πνπ ρξεζηκνπνηνύληαη ζε ζπζθεπαζηήξηα θξνύησλ ζηε κηθξνβηαθή θνηλόηεηα ηνπ εδάθνπο Πεξίιεςε Σα ιοηδημηηυκα thiabendazole (TBZ), imazalil (IMZ), ortho-phenylphenol (OPP) ηαζ μζ ακηζμλεζδςηζηέξ μοζίεξ diphenylamine (DPA) ηαζ ethoxyquin (EQ), πνδζζιμπμζμφκηαζ εονέςξ ζηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ βζα ημκ έθεβπμ ηςκ ιοηδημθμβζηχκ πνμζαμθχκ ηαζ ηδξ θοζζμθμβζηήξ οπμαάειζζδξ ηςκ ηανπχκ ηςκ απμεδηεοιέκςκ θνμφηςκ. Πανά ηδ ιεηαζοθθεηηζηή ηαζ εθεβπυιεκδ, εκηυξ ηςκ ζοζηεοαζηδνίςκ εθανιμβή ημοξ, ζδιακηζηέξ πμζυηδηεξ ηςκ εκ θυβς β.θ.. ηαηαθήβμοκ ηεθζηά ζημ έδαθμξ, ιέζς ηδξ πανάκμιδξ απυννζρδξ ηςκ παναβυιεκςκ οβνχκ απμαθήηςκ ζημ πενζαάθθμκ. Λαιαάκμκηαξ οπυρδ ημκ πνςηανπζηυ νυθμ πμο δζαδναιαηίγμοκ μζ ιζηνμμνβακζζιμί ημο εδάθμοξ ζηδκ θεζημονβία ημο εδαθζημφ μζημζοζηήιαημξ, ιεθεηήεδηε ζε επίπεδμ ιζηνμηυζιςκ, δ επίδναζδ ηςκ β.θ.. πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ, ζηδ δμιή ηαζ ηδ θεζημονβία ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ ζε ζοκάνηδζδ ιε ηδκ οπμθεζιιαηζηυηδηα ημοξ ζημξ έδαθμξ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, ακαπηφπεδηακ ανπζηά ακαθοηζηέξ ιέεμδμζ εηπφθζζδξ ηαζ παναθααήξ ηςκ β.θ.. απυ ημ έδαθμξ ηαζ εηηζιήεδηε δ πμνεία ηδξ απμδυιδζδξ ημοξ ζε πνμκζηυ δζάζηδια ζοκμθζηήξ δζάνηεζαξ 100 διενχκ. Ζ απμδυιδζδ υθςκ ηςκ β.θ.. πμο ιεθεηήεδηακ πενζβνάθεηαζ ζηακμπμζδηζηά απυ ημ δζθαζζηυ ιμκηέθμ Hockey Stick. Σα ιοηδημηηυκα ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ, πανμοζίαζακ ηδκ ορδθυηενδ οπμθεζιιαηζηυηδηα ζημ έδαθμξ (DT ηαζ διένεξ, ακηίζημζπα) ζε ακηίεεζδ ιε ημ ΟΡΡ ηαζ ημ ακηζμλεζδςηζηυ DPA πμο απμδμιήεδηακ ηαπφηαηα (DT ηαζ 1.30 διένεξ, ακηίζημζπα). ηδκ πενίπηςζδ ημο EQ (DT διένεξ) δζαπζζηχεδηε ηαπφηαημξ ιεηααμθζζιυξ ημο ιδηνζημφ ιμνίμο αιέζςξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημο ζημ έδαθμξ, πνμξ παναβςβή δφμ μλεζδςηζηχκ παναβχβςκ, ημο 2,6- dihydro-2,2,4-trimethyl-6-quinone imine (QI) ηαζ ημο 2,4-dimethyl-6-ethoxyquinoline (EQNL). Οζ επζδνάζεζξ ηςκ β.θ.., ζηδ ζφζηαζδ ηαζ ημ ιέβεεμξ ηδξ εδαθζηήξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ πνμζδζμνίζηδηακ ιε ηδ ιέεμδμ PLFAs, εκχ πζεακέξ επζδνάζεζξ ζε ααζζηέξ ιζηνμαζαηέξ θεζημονβίεξ εηηζιήεδηακ ιε ηδκ ιέηνδζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ααζζηχκ εκγφιςκ (α-βθοημζζδάζδ, υλζκεξ ηαζ αθηαθζηέξ θςζθαηάζεξ 290

291 ηαζ οδνμθάζεξ) ηαζ ιζηνμαζαηχκ δζενβαζζχκ υπςξ, (ααζζηή ακαπκμή ηαζ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ). Ζ εθανιμβή ηςκ ΟΡΡ ηαζ DPA μδήβδζε ζε ιζα βεκζηυηενδ ιείςζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ υπςξ αοηή πνμζδζμνίζηδηε ιε ηδκ ιέεμδμ PLFAs πςνίξ υιςξ κα ειθακζζηεί ηάπμζμ λεηάεανμ δμζμ-ελανηχιεκμ πνυηοπμ ζημκ πνυκμ. Απυ ηζξ θεζημονβίεξ πμο ιεθεηήεδηακ δ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ πανμοζίαζε ηδκ ορδθυηενδ εοαζζεδζία ζηδκ εθανιμβή ηςκ β.θ.. οβηεηνζιέκα, δ πνμζεήηδ ΣΒΕ πνμηάθεζε αφλδζδ ημο νοειμφ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζε ακηίεεζδ ιε ηδκ πνμζεήηδ ηςκ ΔQ ηαζ ΟΡΡ πμο πνμηάθεζακ ζδιακηζηή ιείςζδ ημο νοειμφ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ πμο ήηακ πθήνδξ (EQ) ή πανμδζηή (ΟΡΡ). Πνμηεζιέκμο κα δζενεοκδεεί πεναζηένς μ ιδπακζζιυξ ηδξ ηαεμθζηήξ ακαζημθήξ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ απυ ημ ακηζμλεζδςηζηυ EQ, πναβιαημπμζήεδηακ ζοιπθδνςιαηζηά πεζνάιαηα υπμο αλζμθμβήεδηε δ επίδναζδ ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημο ΔQ ζηδκ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ. Σα απμηεθέζιαηα έδεζλακ υηζ ημ ηφνζμ ιεηααμθζηυ πνμσμκ ημο EQ ζημ έδαθμξ, ημ QI θαίκεηαζ κα είκαζ οπεφεοκμ βζα ηδκ ακαζημθή ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ. ε δεφηενμ επίπεδμ, ιεθεηήεδηε δ επίδναζδ ηςκ β.θ. ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ζημ έδαθμξ, αθθά ηαζ ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία, ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ, ιε ιμνζαηέξ ηεπκζηέξ ακάθοζδξ (PCR-DGGE, Real Time PCR). Ζ ακάθοζδ πμθοιεηααθδηυηδηαξ ηςκ δεδμιέκςκ πμο πνμέηορακ απυ ηδ ιέεμδμ ιζηνμαζαηήξ απμηφπςζδξ DGGE, ηαηέδεζλε ζδιακηζηή επίδναζδ ηςκ β.θ.. ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ηαζ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ζημ έδαθμξ πςνίξ υιςξ αοηέξ μζ ιεηααμθέξ κα αημθμοεμφκ ζηαεενυ πνυηοπμ ζημ πνυκμ. Ζ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ (ακηίβναθα amoa ng -1 DNA) δεκ θαίκεηαζ κα επδνεάζηδηε ζδιακηζηά απυ ηζξ επζιένμοξ ιεηαπεζνίζεζξ. Πνμηεζιέκμο κα δζενεοκδεεί εζδζηυηενα δ επίδναζδ ημο EQ ζηδκ αθεμκία ηςκ θεζημονβζηά εκενβχκ κζηνςδμπμζδηζηχκ μνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ, πναβιαημπμζήεδηε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ηδξ ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθάζδξ (RT-qPCR) υπμο ηαζ παναηδνήεδηε ιζα πανμδζηή ιείςζδ ηδξ έηθναζδξ ημο βμκζδίμο amoa (ιεηάβναθα amoa βμκζδίμο ng -1 RNA) ζηζξ 3 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ημο ΔQ. Σα απμηεθέζιαηα ηδξ πανμφζαξ ιεθέηδξ, απμηεθμφκ ηζξ πνχηεξ εκδείλεζξ βζα ηδκ φπανλδ ακεπζεφιδηςκ επζδνάζεςκ ηςκ β.θ.. πμο πενζέπμκηαζ ζηα οβνά απυαθδηα ηςκ ζοζηεοαζηδνίςκ θνμφηςκ ζε ααζζηέξ θεζημονβίεξ ημο εδαθζημφ μζημζοζηήιαημξ ηαζ ηαηαδεζηκφμοκ ηδκ ακάβηδ βζα άιεζδ ηαζ απμηεθεζιαηζηή επελενβαζία ηςκ οβνχκ απμαθήηςκ απυ ηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ. 291

292 5.2. Δηζαγσγή Καηά ηδκ απμεήηεοζδ ηςκ θνμφηςκ ζηζξ ιμκάδεξ ηςκ ζοζηεοαζηδνίςκ, παναηδνείηαζ ζοπκά οπμαάειζζδ ηδξ πμζυηδηαξ ηαζ ηδξ ειπμνζηήξ ημοξ αλίαξ, πμο ζηζξ πενζζζυηενεξ πενζπηχζεζξ μθείθεηαζ ζηδ δνάζδ θοημπαεμβυκςκ ιοηήηςκ (El Ghaouth et al., 2002), αθθά ηαζ ζε δζαηαναπέξ ηδξ θοζζμθμβίαξ ηςκ ηανπχκ θυβς ηδξ παναηεηαιέκδξ δζάνηεζαξ απμεήηεοζδξ (Mattheis and Rudell, 2008, Rudell et al., 2006). Πνμηεζιέκμο κα εθαπζζημπμζδεμφκ ακάθμβα θαζκυιεκα, ηα θνμφηα εκηυξ ηςκ ζοζηεοαζηδνίςκ οπυηεζκηαζ ζε ιεηαπεζνίζεζξ, ιε ηαηάθθδθα β.θ.. ιέζς ρεηαζιχκ πμο επζηεθμφκηαζ ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο ηενχιαημξ ηςκ ηανπχκ ή ιε ειααπηίζεζξ ζε ποηκά οδαηζηά δζαθφιαηα ηςκ β.θ.. Καζ μζ δφμ παναπάκς ηνυπμζ επέιααζδξ, πανμοζζάγμοκ αολδιέκεξ απαζηήζεζξ ζε κενυ ηαζ μδδβμφκ ζηδκ παναβςβή ιεβάθμο υβημο οβνχκ απμαθήηςκ πμο πενζέπμοκ ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ( mg L -1 ) οπμθεζιιαηζηχκ πδιζηχκ μοζζχκ υπςξ είκαζ ηα ιοηδημηηυκα thiabendazole (TBZ), imazalil (IMZ), ortho-phenylphenol (OPP) ηαζ μζ ακηζμλεζδςηζηέξ μοζίεξ diphenylamine (DPA) ηαζ ethoxyquin (EQ). Σα ΣΒΕ, ΗΜΕ ηαζ ΟΡΡ, πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδκ πνμζηαζία εζπενζδμεζδχκ ηαζ ιδθμεζδχκ (βζβανημηάνπςκ) απυ ιφηδηεξ ημο βέκμοξ Penicilium ηαζ Geotrichum sp. (Smilanick et al., 2006, Holmes and Eckert, 1999) (Δζηυκα 5.1), εκχ ηα DPA ηαζ ΔQ πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδκ πνμζηαζία ηςκ ιήθςκ απυ ηδ θοζζμθμβζηή οπμαάειζζδ ηδξ πμζυηδηαξ ημοξ, πμο εηδδθχκεηαζ ιε ηδ ιμνθή ηδξ ηαζηακυπνςζδξ (scald) ηδξ επζδενιίδαξ ηςκ ηανπχκ (Robatscher et al., 2012, Moggia et al,. 2010, Johnson et al., 2006) (Δζηυκα 5.1). Λυβς ηδξ εκδεπυιεκδξ ανκδηζηήξ επίδναζδξ πμο ιπμνεί κα αζηήζμοκ μζ παναπάκς λεκμαζμηζηέξ μοζίεξ ζημ πενζαάθθμκ, o υβημξ ηςκ παναβυιεκςκ οβνχκ απμαθήηςκ, πνήγεζ επελενβαζίαξ ηαζ απμημλζημπμίδζδξ πνζκ ηδκ μνζζηζηή απυννζρδ ημο. 292

293 Δηθόλα 5.1. Πνμζαμθή απθαδζχκ απυ ιφηδηεξ ημο βέκμοξ Penicillium sp. (ανζζηενά) ηαζ ειθάκζζδ ημο επζθακεζαημφ εβηαφιαημξ (apple scald) ζε ιήθα (δελζά). Ζ ακάβηδ επελενβαζίαξ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ απμαθήηςκ έπεζ επζζδιακεεί απυ ηδκ Δονςπασηή Κμζκυηδηα. Ζ έβηνζζδ πνήζδξ ηςκ ιοηδημηηυκςκ ΣΒΕ, IMZ ηαζ ΟΡΡ, ακακεχεδηε έςξ ημ έημξ 2015, 2021 ηαζ 2019, ακηίζημζπα, οπυ ηδκ αοζηδνή πνμτπυεεζδ υηζ εα θδθεμφκ ιέηνα απυ ηα ηνάηδ-ιέθδ βζα ηδκ επελενβαζία ηςκ οβνχκ απμαθήηςκ πμο πανάβμκηαζ απυ ηδκ πνήζδ ημοξ (EC, 2011, 2010). Πανυιμζμζ πνμαθδιαηζζιμί έπμοκ εηθναζηεί ακηίζημζπα ηαζ βζα ηζξ ακηζμλεζδςηζηέξ μοζίεξ DPA (EFSA 2008) ηαζ EQ (EFSA 2010b) ηςκ μπμίςκ δ έβηνζζδ πνήζδξ ζηδκ ΔΔ, δεκ ακακεχεδηε ανπζηά ηαζ ηαηυπζκ ηαηάεεζδξ πνυζεεηςκ ζημζπείςκ, ανίζηεηαζ αοηή ηδ ζηζβιή οπυ επακελέηαζδ. Καηά ηδκ ανπζηή εηηίιδζδ ηςκ μοζζχκ αοηχκ, απμθαζίζηδηε μ απμηθεζζιυξ ημοξ απυ ημ Πανάνηδια I ηδξ ημζκμηζηήξ μδδβίαξ 91/414, ζηδκ πενίπηςζδ ημο DPA, θυβς πζεακχκ επζδνάζεςκ ημο ζημοξ ηαηακαθςηέξ αθθά ηαζ ηδξ ημλζηυηδηαξ πζεακχκ πνμσυκηςκ ιεηααμθζζιμφ ημο ηαηά ηδκ απμεήηεοζδ ηςκ θνμφηςκ, εκχ ζηδκ πενίπηςζδ ημο EQ θυβς ακεπανηχκ δεδμιέκςκ ζπεηζηά ιε ηδκ μζημημλζηυηδηα ηαζ ηδκ επίδναζδ ημο ζε μνβακζζιμφξ ιδζηυπμοξ. Οζ αηνζαείξ δζαηοπχζεζξ πμο ζοιπενζθαιαάκμκηαζ ζηα έββναθα έβηνζζδξ πνήζδξ ηςκ παναπάκς β.θ.. ζε πχνεξ ηδξ Δονςπασηήξ Έκςζδξ ηαζ αθμνμφκ ζηδκ δζαπείνζζδ ηςκ οβνχκ απμαθήηςκ πμο πανάβμκηαζ απυ ηδκ πνήζδ ημοξ παναηίεεκηαζ ζημκ Πίκαηα

294 Πίνακασ 5.1. Οι εγκρίςεισ των γεωργικϊν φαρμάκων που χρθςιμοποιοφνται ςτα ςυςκευαςτιρια φροφτων ςτθν ΕΕ. Γεςνβζηά Φάνιαηα Imazalil Thiabendazole 2-phenylphenol Έβηνζζδ Γζαηφπςζδ Πδβή Έγθξηζε ρξήζεο ζε Κφπνμ Γαθθία Δθθάδα Ηζπακία Ηηαθία Πμνημβαθία σο θαη 31/7/2021 Έγθξηζε ρξήζεο Κφπνμ Γαθθία Ηζπακία Ηηαθία Πμνημβαθία σο θαη 31/12/2015 Έγθξηζε ρξήζεο ζε Κύπξν Διιάδα Ηζπαλία σο θαη 31/12/2019 Member States should pay particular attention to: ensure that appropriate waste management practices to handle the waste solution remaining after application, including for instance the cleaning water of the drenching system and the discharge of the processing waste are put in place. Prevention of any accidental spillage of treatment solution. Member States permitting the release of waste water into the sewage system shall ensure that a local risk assessment is carried out Particular conditions to be taken into account on short term basis by Member-States in relation to the granting of authorisations of plant protection products containing thiabendazole: Suitable risk management measures (e.g. depuration with diatom earth or activated carbon) have to be implemented to protect surface waters from unacceptable levels of contamination via wastewater from post-harvest and potato seed treatments In this overall assessment Member States must pay particular attention: to put in place appropriate waste management practices to handle the waste solution remaining after application, including the cleaning water of the drenching and other application systems. Member States permitting the release of wastewater into the sewage system, shall ensure that a COMMISSION DIRECTIVE 2010/57/EU of 26 August 2010 amending Annex I to Council Directive 91/414/EEC to renew the inclusion of imazalil as active substance Official Journal of the European Union L225/ :0005:0009:EN:PDF Review report for the active substance thiabendazole Finalised in the Standing Committee on Plant Health at its meeting on 12 December 2000 in view of the inclusion of thiabendazole in Annex I of Directive 91/414/EEC tive/list1-26_en.pdf Final Review report for the active substance 2- phenylphenol. Finalised in the Standing Committee on the Food Chain and Animal Health at its meeting on 27 November 2009 in view of the inclusion of 2- phenylphenol in Annex I of Directive 91/414/EEC 294

295 local risk assessment is carried out. tive/list_2_phenylphenol_en.pdf Diphenylamine ethoxyquin Γελ έρεη έγθξηζε ζηελ ΔΔ Καηά πανέηηθζζδ έβηνζζδ 120 διενχκ ζε Δθθάδα, Ηζπακία ηαζ Πμνημβαθία Γελ έρεη έγθξηζε ζηελ ΔΔ Particular conditions proposed to be taken into account to manage the risk(s) identified: Therefore management measures tailored to local practice and legislation need to be put in place to control the waste disposal of spent application solution and prevent accidental spillage entering sewers or surface water drains. (Member States indicated that they may wish to have additional environmental data to support and inform the management measures that they have to put in place. For example the proposal made in the DAR (section B.8.4.4) that holding the solution in lagoons to allow photolysis to degrade diphenylamine before being applied to soil, may be ill advised in the absence of any soil degradation or mobility data, or data on effects on soil dwelling organisms of the known aqueous photodegradation products). Particular conditions proposed to be taken into account to manage the risk(s) identified: Management measures tailored to local practice and legislation need to be put in place to control the waste disposal of spent application solution and prevent accidental spillage entering sewers or surface water drains (e.g. to collect all the waste water, transport to a waste management facility and burn or handle as hazardous chemical waste) EFSA Scientific Report (2012) 10(1), 2486 Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance diphenylamine Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance ethoxyquin, EFSA Journal 2010;8(9):

296 Γεδμιέκμο υηζ μζ εβηνίζεζξ ζηα ηνάηδ ιέθδ ηδξ ΔΔ βζα ηα ζοβηεηνζιέκα β.θ.. ζοκμδεφμκηαζ απυ ηδκ απαίηδζδ ηδξ απμηεθεζιαηζηήξ δζαπείνζζδξ ηςκ απμαθήηςκ ημοξ, έπμοκ ακαπηοπεεί ζοζηήιαηα ορδθχκ ηεπκμθμβζηχκ απαζηήζεςκ, υπςξ αοηυ βζα ηδκ δζαπείνζζδ οβνχκ απμαθήηςκ πμο πενζέπμοκ ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ημο ιοηδημηηυκμο ΣΒΕ (Δζηυκα 5.2), ηαημπονςιέκα ιε δίπθςια εονεζζηεπκίαξ (CONTROL TEC ECO, Technidex, Ηζπακία). Ζ θεζημονβία ημο ζοβηεηνζιέκμο ζοζηήιαημξ ααζίγεηαζ ζηδκ πνμζνυθδζδ ηςκ β.θ.. ζηδκ επζθάκεζα ηυηηςκ εκενβμφ άκεναηα (Garcia Portillo et al. 2004). Πανυθμ πμο ημ ζφζηδια αοηυ απμδείπηδηε ελαζνεηζηά απμηεθεζιαηζηυ, ηαεχξ ηαηάθενε κα ιεζχζεζ ηαηά 7000 θμνέξ ηδκ ζοβηέκηνςζδ ημο ΣΒΕ (ΔU 2000), δ πνήζδ ημο ζε εονεία ηθίιαηα ήηακ ζδζαίηενα πενζμνζζιέκδ θυβς ημο ζδζαίηενα ορδθμφ ηυζημοξ εβηαηάζηαζδξ ηαζ εθανιμβήξ ημο. Οιμίςξ, μζ Flaim and Toller, (1989), πνυηεζκακ ηδ πνήζδ εκυξ ζοζηήιαημξ δζήεδζδξ ιε θίθηνμ απμηεθμφιεκμ απυ ιείβια ανομηφνθδξ (peat moss), ημπνζάξ, ανβίθμο ηαζ άιιμο δμθμιίηδ (dolomite sand), βζα ηδκ απμημλζημπμίδζδ ηςκ οβνχκ απμαθήηςκ. Ζ απμηεθεζιαηζηυηδηά ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ ιεευδμο ζηδκ απμιάηνοκζδ ηςκ οπμθεζιιάηςκ ηςκ ΣΒΕ, benomyl ηαζ DPA απυ οβνά απυαθδηα ανέεδηε κα λεπενκά ημ 98%. Χζηυζμ, ημ παναπάκς ζφζηδια οζηενμφζε ζηδκ επελενβαζία ιεβάθςκ υβηςκ οβνχκ απμαθήηςκ, εκχ δ πνήζδ οθζηχκ υπςξ δ ανομηφνθδ ηαζ δ άνβζθμξ, εκίζποε ημ ηυζημξ εθανιμβήξ ημο ηαζ βζα ημκ θυβμ αοηυ εβηαηαθείθηδηε. Δηθόλα 5.2. Σμ ζφζηδια CONTROL-TEC ECO πμο δζαηίεεηαζ βζα ηδκ επελενβαζία οβνχκ απμαθήηςκ πμο πενζέπμοκ TBZ ηαζ πανάβμκηαζ απυ ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ. 296

297 Με δεδμιέκδ ηδκ απμοζία εκυξ απμηεθεζιαηζημφ ηαζ ηαοηυπνμκα μζημκμιζηά ζοιθένμκημξ ζοζηήιαημξ δζαπείνζζδξ ηςκ οβνχκ απμαθήηςκ πμο πανάβμκηαζ απυ ηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ, δ άιεζδ ηαζ ζοζηδιαηζηή απυννζρδ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ οβνχκ απμαθήηςκ (α) ζε οδάηζκμοξ θμνείξ πμο βεζηκζάγμοκ ιε ηα ζοζηεοαζηήνζα, (α) ζε παναηείιεκμοξ εβηαηαθεζιιέκμοξ αβνμφξ, (β) ζημ ζφζηδια απμπέηεοζδξ, ζηδκ πενίπηςζδ ζοζηεοαζηδνίςκ πμο ανίζημκηαζ εκηυξ ζπεδίμο πυθδξ ή (δ) ζε ιμκάδεξ επελενβαζίαξ αζηζηχκ απμαθήηςκ (αζμθμβζημφξ ηαεανζζιμφξ), απμηεθεί ημζκή πναηηζηή. Ζ άιεζδ απυννζρδ ηςκ οβνχκ απμαθήηςκ ζε θοζζημφξ οδάηζκμοξ πυνμοξ, πςνίξ πνχηα κα οπμζημφκ επελενβαζία, έπεζ απμδεζπεεί υηζ απμηεθεί ζδιακηζηή πδβή νφπακζδξ ηςκ οδάηζκςκ μζημζοζηδιάηςκ (Flaim and Toller 1989). Υαναηηδνζζηζηυ πανάδεζβια απμηεθεί δ νφπακζδ πμηαιμφ ζηδκ Κυζηα Ρίηα ζηα κενά ημο μπμίμο ακζπκεφεδηακ ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ ιοηδημηηυκςκ ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζε παναηείιεκα ζοζηεοαζηήνζα ιπακάκαξ (Castillo et al. 2000). Ζ απυννζρδ ηςκ οβνχκ απμαθήηςκ απυ ηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ ζε παναηείιεκμοξ εβηαηαθεθεζιέκμοξ αβνμφξ απμηεθεί ζδιακηζηυ ηίκδοκμ βζα ημ εδαθζηυ μζημζφζηδια. Χζηυζμ, δεκ οπάπμοκ ζημζπεία βζα ηδκ επίδναζδ ηέημζςκ πναηηζηχκ ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. Ζ πακηεθήξ έθθεζρδ ηέημζςκ δεδμιέκςκ μθείθεηαζ ζηδκ ιεηαζοθθεηηζηή πνήζδ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ μοζζχκ ηαεχξ εεςνείηαζ υηζ ιε αάζδ ημκ πνμηεζκυιεκμ ηνυπμ εθανιμβήξ μζ εκ θυβς δναζηζηέξ μοζίεξ δεκ ηαηαθήβμοκ ζημ έδαθμξ. Πνυζθαηεξ ιεηνήζεζξ ζε δείβιαηα εδάθμοξ απυ αβνμφξ υπμο απμννίπημκηακ ζοζηδιαηζηά ηαζ επί ζεζνά εηχκ απυαθδηα απυ ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ ζηδκ πενζμπή ηδξ Λάνζζαξ, πμο πναβιαημπμζήεδηακ απυ ηδκ Δνεοκδηζηή Οιάδα Βζμηεπκμθμβίαξ Φοηχκ ηαζ Πενζαάθθμκημξ ημο Σιήιαημξ Βζμπδιείαξ ηαζ Βζμηεπκμθμβίαξ ημο Πακεπζζηδιίμο Θεζζαθίαξ, έδεζλακ υηζ μζ ζοβηεκηνχζεζξ ημο ιοηδημηηυκμο ΗΜΕ λεπενκμφζακ ηα 500 mg kg -1 λδνμφ αάνμοξ εδάθμοξ. Ζ πανμοζία ορδθχκ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ β.θ.. πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδ ιεηαζοθθεηηζηή ιεηαπείνζζδ ηςκ θνμφηςκ, ζημ έδαθμξ, είκαζ δοκαηυκ κα έπεζ ανκδηζηέξ ζοκέπεζεξ βζα ημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ, ιεηααάθθμκηαξ ηδ ιεηααμθζηή ημοξ δναζηδνζυηδηα, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ηδ θοζζμθμβζηή ηαζ αζμπδιζηή ημοξ ηαηάζηαζδ. Σέημζμο ηφπμο ιεηααμθέξ είκαζ δοκαηυκ κα μδδβήζμοκ ζε ιεηααμθέξ ηδξ θεζημονβίαξ ημο εδαθζημφ μζημζοζηήιαημξ θυβς ημο ζδιακηζημφ νυθμο πμο δζαδναιαηίγμοκ μζ ιζηνμμνβακζζιμί ζηδ δζαηήνδζδ ηδξ βμκζιυηδηαξ ημο εδάθμοξ ηαζ ζηδκ αφλδζδ ηδξ παναβςβζηυηδηαξ ηςκ θοηχκ (Hayat et al., 2010, Falkowski et al., 2008, Miransari, 2011). 297

298 ηυπμξ ηδξ ένεοκαξ πμο πανμοζζάγεηαζ ζημ πανυκ ηεθάθαζμ, ήηακ δ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ηςκ ιοηδημηηυκςκ ΣΒΕ, ΗΜΕ ηαζ ΟΡΡ ηαζ ηςκ ακηζμλεζδςηζηχκ DPA ηαζ EQ, πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ, ζηδ δμιή ηαζ ηδ θεζημονβία ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ. Πανάθθδθα παναημθμοεήεδηε ηαζ δ πμνεία απμδυιδζδξ ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ χζηε κα ακαδεζπεμφκ πζεακέξ ζοζπεηίζεζξ ιεηαλφ οπμθεζιιαηζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ηαζ πνμκζηχκ ιεηααμθχκ ζηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ηαζ ζηζξ θεζημονβίεξ ηδξ. Γζα ημ θυβμ αοηυ ακαπηφπεδηακ ανπζηά ακαθοηζηέξ ιέεμδμζ εηπφθζζδξ ηαζ παναθααήξ ηςκ οπυ ιεθέηδ β.θ.. απυ ημ έδαθμξ. ηδ ζοκέπεζα, ιεθεηήεδηε δ επίδναζδ ηςκ β.θ. ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ πναβιαημπμζήεδηε ανπζηά ακάθοζδ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ (PLFAs) βζα ηδκ εηηίιδζδ ημο ιεβέεμοξ ηαζ ηδξ ζφζηαζδξ ηδξ γχζαξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ. Οζ εκγοιζηέξ δναζηζηυηδηεξ ηςκ α- βθοημζζδαζχκ ηαζ ηςκ υλζκςκ ηαζ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ, ηαεχξ ηαζ μ νοειυξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ, πνμζδζμνίζηδηακ ςξ ιέηνμ αλζμθυβδζδξ ηδξ επίδναζδξ ηςκ β.θ.. ζηδκ θεζημονβία ηςκ αζμβεςπδιζηχκ ηφηθςκ C, P ηαζ Ν, ακηίζημζπα. Σέθμξ, ιεθεηήεδηακ δ οδνμθοηζηή δναζηζηυηδηα ηδξ 3,6-δζαηεηοθμ-θθμομνμζηεΐκδξ (FDA) ηαζ δ εδαθζηή ιζηνμαζαηή ακαπκμή, ςξ βεκζημί δείηηεξ ηδξ ιεηααμθζηήξ δναζηδνζυηδηαξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ. Σα απμηεθέζιαηα πμο πνμέηορακ απυ ηζξ ιεηνήζεζξ απμδυιδζδξ ηαζ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ βζα ηδκ ακηζμλεζδςηζηή μοζία EQ, απμηέθεζακ ηίκδηνμ βζα ηδκ δζελαβςβή ζοιπθδνςιαηζηχκ πεζναιάηςκ πνμηεζιέκμο κα δζενεοκδεεί πεναζηένς μ ιδπακζζιυξ ακαζημθήξ ηδξ κζηνμπμίδζδξ απυ ημ EQ. ε δεφηενμ επίπεδμ ιεθεηήεδηε δ επίδναζδ ηςκ β.θ. ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ζημ έδαθμξ, αθθά ηαζ ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία (ανζειδηζηή ηαζ θεζημονβζηή) ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ, ιε ιμνζαηέξ ηεπκζηέξ ακάθοζδξ (PCR-DGGE, qpcr, RT-qPCR). Οζ ααζζδζμιφηδηεξ παίγμοκ ηονζάνπμ νυθμ ζηδκ απμζφκεεζδ ηδξ μνβακζηήξ μοζίαξ ζημ έδαθμξ (Casieri et al., 2010, Hassett et al., 2009) ηαζ βζα αοηυ ημκ θυβμ ιεθεηήεδηακ. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, μζ κζηνςδμπμζδηζημί ιζηνμνβακζζιμί, νοειίγμοκ ημ βεςπδιζηυ ηφηθμ ημο Ν, ιέζς ηδξ έηθναζδξ ημο εκγφιμο ιμκμ-μλοβμκάζδ ηδξ αιιςκίαξ, πμο ηαηαθφεζ ηδκ μλείδςζδ ηδξ αιιςκίαξ (Prosser and Nicol, 2008). Πνυζθαηα ανηεημί ενεοκδηέξ πνυηεζκακ ηδκ πνήζδ ημοξ ςξ αζμ-δείηηεξ εηηίιδζδξ ηδξ ηαηαπυκδζδξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ (Wessen and Halin 2011, Pereira e Silva et al., 2012). 298

299 5.3. Τιηθά θαη Μέζνδνη Πεηξακαηηθόο ζρεδηαζκόο ηδκ πανμφζα ιεθέηδ πνδζζιμπμζήεδηε αθηαθζηυ πδθχδεξ έδαθμξ πμο ζοθθέπεδηε απυ αβνμηειάπζμ ημο αβνμηηήιαημξ ημο Ανζζημηεθείμο Πακεπζζηδιίμο Θεζζαθμκίηδξ, ζηδκ πενζμπή ηδξ Θένιδξ Θεζζαθμκίηδξ. οκμθζηά, ζοθθέπεδηακ 15 kg εδάθμοξ ηαζ αενμλδνάκεδηακ ιενζηχξ βζα δζάζηδια 48 ςνχκ. Αημθμφεδζε ημζηίκζζια ημο εδάθμοξ ιε ηυζηζκμ δζαιεηνήιαημξ πυνςκ 2 mm. Καηυπζκ, δ ζοκμθζηή πμζυηδηα ημο εδάθμοξ δζαπςνίζηδηε ζε 6 επζιένμοξ δείβιαηα ηςκ 2,5 kg. ε ηάεε έκα απυ ηα επζιένμοξ δείβιαηα εδάθμοξ πνμζηέεδηακ 50 ml οδαηζημφ δζαθφιαημξ εκυξ εη ηςκ TBZ, IMZ, OPP, DPA ηαζ EQ, πμο παναζηεοάζηδηε απυ ηα ακηίζημζπα ειπμνζηά ζηεοάζιαηα (Βθέπε ), χζηε κα επζηεοπεεί ζοβηέκηνςζδ ζημ έδαθμξ 50 mg δ.μ kg -1 λδνμφ αάνμοξ εδάθμοξ. Αημθμφεδζε πνμζεήηδ ηαηάθθδθδξ πμζυηδηαξ κενμφ (18.6 ml) χζηε κα πνμζανιμζηεί δ οβναζία ημο εδάθμοξ ζημ 40% ηδξ οδαημπςνδηζηυηδηαξ. ημ ηεθεοηαίμ δείβια εδάθμοξ πνμζηέεδηε ακάθμβδ πμζυηδηα κενμφ (68.6 ml) πςνίξ β.θ.. πνμηεζιέκμο κα πνδζζιμπμζδεεί ςξ ιάνηοναξ. Σα δείβιαηα εδάθμοξ ζηδκ ζοκέπεζα, αθμφ ακαιίπεδηακ επζιεθχξ αθέεδηακ βζα 2-4 χνεξ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (25±1:C) χζηε κα επέθεεζ ζζμννμπία ηαζ κα επζηεοπεεί μιμζυιμνθδ ηαηακμιή ηςκ β.θ.. Καηυπζκ, ηα δείβιαηα δζαπςνίζηδηακ πεναζηένς ζε οπμ-δείβιαηα ηα μπμία ημπμεεηήεδηακ ζε πθαζηζηέξ αενμζηεβείξ ζαημφθεξ ηαζ επςάζηδηακ ζημ ζημηάδζ, ζημοξ 27 C. Γζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ πμνείαξ ηδξ απμδυιδζδξ ηςκ β.θ.. ηνία δείβιαηα απυ ηάεε ιεηαπείνζζδ ζοθθέπεδηακ ζε πνυκμοξ 0, 4, 7, 14, 28, 42, 56, 70 ηαζ 100 διένεξ, ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ β.θ. ηαζ απμεδηεφηδηακ ζημοξ -20 C ιέπνζ κα ακαθοεμφκ ζε ζφζηδια οβνήξ πνςιαημβναθίαξ ορδθήξ πίεζδξ ή απυδμζδξ (HPLC). ηζξ πενζπηχζεζξ υπμο παναηδνήεδηε άιεζδ δζάζπαζδ ηςκ μοζζχκ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηςκ 4 πνχηςκ διενχκ ιεηά ηδκ επέιααζδ (ΟΡΡ, DPA, EQ), πναβιαημπμζήεδηε ζοιπθδνςιαηζηυ πείναια υπμο δείβιαηα απυ ημ ίδζμ έδαθμξ επζαανφκεδηακ ιε ηα εκ θυβς β.θ. ηαηά ακάθμβμ ηνυπμ ηαζ παναημθμοεήεδηε δ απμδυιδζδ ημοξ ζε δείβιαηα πμο ζοθθέπεδηακ 2, 4, 12 ηαζ 24 χνεξ (ΟΡΡ ηαζ DPA) ή 0, 30 min, 1h, 4h, 12h ηαζ 24h (EQ) ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ β.θ.. Γζα ηδ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ηςκ β.θ.. ζηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ ιε δζάθμνεξ ιεευδμοξ (PLFAs, DGGE, PCR πναβιαηζημφ πνυκμο, εκγοιζηή δναζηζηυηδηα, δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ ηαζ ιζηνμαζαηή ακαπκμή), ηνία δείβιαηα απυ ηάεε ιεηαπείνζζδ ζοθθέπεδηακ 3, 10, 30, 60 ηαζ

300 διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ β.θ. ζημ έδαθμξ ηαζ απμεδηεφηδηακ ζημοξ -20 C (δείβιαηα πμο πνμμνίγμκηακ βζα ακάθοζδ ιε ιμνζαηέξ ηεπκζηέξ) ή ζημοξ 4 C (δείβιαηα ακάθοζδξ PLFAs ηαζ δναζηζηυηδηαξ εκγφιςκ, δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ) ιέπνζ κα ακαθοεμφκ πεναζηένς. Οζ ακαθφζεζξ PLFAs, υλζκδξ ηαζ αθηαθζηήξ θςζθαηάζδξ, α-βθοημζζδάζδξ, δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ηαζ FDA πναβιαημπμζμφκηακ πάκηα εκηυξ 2 διενχκ. Σέθμξ, δείβιαηα εδάθμοξ απυ ηάεε ιεηαπείνζζδ πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ιέηνδζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ακαπκμήξ ζε πνυκμοξ 1, 3, 5, 7, 9, 11, 14, 18, 21, 28, 35 διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ β.θ., υπςξ πενζβνάθεηαζ ακαθοηζηά παναηάης ( ) Πξνζδηνξηζκόο ησλ θπζηθνρεκηθώλ ραξαθηεξηζηηθώλ ηνπ εδάθνπο Οζ θοζζημπδιζηέξ ζδζυηδηεξ ημο εδάθμοξ, πνμζδζμνίζηδηακ ιε ακαθφζεζξ πμο πναβιαημπμζήεδηακ ζημ Δνβαζηήνζμ Δδαθμθμβίαξ ηδξ Γεςπμκζηήξ πμθήξ ημο Α.Π.Θ ηαζ ζοκμρίγμκηαζ ζημκ Πίκαηα 5.2. Ο πνμζδζμνζζιυξ ημο ph, ηδξ πενζεπυιεκδξ οβναζίαξ ηαζ ηδξ οδαημπςνδηζηυηδηαξ ημο εδάθμοξ, ηαεχξ ηαζ δ πνμζανιμβή οβναζίαξ ημο εδάθμοξ ζε επζεοιδηυ πμζμζηυ οδαημπςνδηζηυηδηαξ πναβιαημπμζήεδηακ ζφιθςκα ιε ηζξ δζαδζηαζίεξ πμο πενζβνάθμκηαζ ακαθοηζηά, ζηδκ πανάβναθμ ημο ηεθαθαίμο

301 Πίλαθαο 5.2. πανμφζα ιεθέηδ. Φοζζημπδιζηέξ ζδζυηδηεξ ημο εδάθμοξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε ζηδκ Ηδηόηεηεο Έδαθνο ph (ζε Ζ 2 Ο) 7.85±0.03 Ονβακζηυξ C (%) 0.14±0.01 Οθζηυ Ν (%) 0.1±0.002 CEC (cmol c kg -1 ) 20.1±2.3 Γζαεέζζια ιαηνμζημζπεία (mg Kg -1 ) Ν Ρ Κ 37±1.9 11± ±0 Άιιμξ (%) 50±0 Ηθφξ (%) 41±1.4 Άνβζθμξ (%) 9±1.4 Μδπακζηή ζφζηαζδ Πδθχδεξ Γεσξγηθά Φάξκαθα Γζα ηδκ πνμεημζιαζία ηςκ οδαηζηχκ δζαθοιάηςκ ηςκ β.θ.. πμο εθανιυζηδηακ ζημ έδαθμξ, πνδζζιμπμζήεδηακ ζοκμθζηά ηα παναηάης ειπμνζηά ζηεοάζιαηα: 1. Thiabendazole: HYKEEP (ΔC) 30% 2. Imazalil: FUNGAZIL (EC) 50% 3. Ortho-phenylphenol: FOAMER (SL) 12.8% 4. Diphenylamine: NO SCALD (EC) 31.8% 5. Ethoxyquin: XEDAQUINE (EC) 72% Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ οπμθεζιιάηςκ ηςκ β.θ.. ζε HPLC, πνδζζιμπμζήεδηακ ηα αηυθμοεα ακαθοηζηά πνυηοπα : Thiabendazole (4-(1H-1,3-benzodiaozol-2-yl)-1,3-thiazole), 99.8% Fluka analytical, Penstanal 301

302 Imazalil ((RS)-1-(β-allyloxy-2,4-dichlorophenylethyl)imidazole, 99.7% Fluka analytical, Penstanal ortho-phenylphenol, 99.9% Fluka analytical, Penstanal Diphenylamine, 99,9% Fluka analytical, Penstanal Ethoxyquin, 97.8% Fluka analytical, Penstanal Μειέηε ηεο πνξείαο απνδόκεζεο ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζην έδαθνο Αλάπηπμε αλαιπηηθώλ κεζόδσλ γηα ηνλ πξνζδηνξηζκό ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζην έδαθνο Σα β.θ.. πμο ιεθεηήεδηακ, πνδζζιμπμζμφκηαζ εκηυξ ηςκ ζοζηεοαζηήνζςκ θνμφηςκ ηαζ ιεηά ηδ ζοβημιζδή ηςκ ηανπχκ, ιε απμηέθεζια πενζμνζζιέκμξ ανζειυξ ιεευδςκ κα έπεζ ακαπηοπεεί ιέπνζ ζήιενα βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημοξ ζε εδαθζηά δείβιαηα. Γζα ημ θυβμ αοηυ ηαζ πνμηεζιέκμο κα ιεθεηδεεί δ πμνεία ηδξ απμδυιδζδξ ημοξ ζημ έδαθμξ ακαπηφπεδηακ ανπζηά ηαηάθθδθεξ ιέεμδμζ εηπφθζζδξ ηαζ παναθααήξ ηςκ β.θ.. απυ ημ έδαθμξ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ακάθοζδξ ηαζ πνμζδζμνζζιμφ ημοξ ζε ζφζηδια οβνήξ πνςιαημβναθίαξ (HPLC). Αλαιπηηθή κέζνδνο πξνζδηνξηζκνύ ηνπ κπθεηνθηόλνπ thiabendazole (TBZ) Γζα ηδκ ακάθοζδ ηςκ δεζβιάηςκ πμο δέπηδηακ επέιααζδ ιε ημ ιοηδημηηυκμ thiabendazole (ΣΒΕ) ακαπηφπεδηε ιέεμδμξ εηπφθζζδξ ιε μνβακζηυ δζαθφηδ ιεεακυθδ (MeOH). οβηεηνζιέκα, 5g εδάθμοξ ιεηαθένεδηακ ζε ηςκζηή θζάθδ ηςκ 100 ml, υπμο πνμζηέεδηακ 10 ml ιεεακυθδξ ηαζ αημθμφεδζε ακάδεοζδ ζε μνζγυκηζμ ακαδεοηήνα (orbital shaker) βζα 1 χνα, ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Γζα ηδκ απμθοβή ηοπυκ επίδναζδξ ημο θςηυξ, μζ ηςκζηέξ θζάθεξ ηαθφθεδηακ επζιεθχξ ελςηενζηά ιε αθμοιζκυπανημ, εκχ ηα ζηυιζα ημοξ ηαθφθεδηακ ιε parafilm. Αημθμφεδζε θοβμηέκηνδζδ ημο ιίβιαημξ βζα 5 min ζε 7500 rpm ηαζ παναθααή ημο οπενηείιεκμο δζαθφιαημξ. Σμ δείβια εδάθμοξ πμο πανέιεζκε ζηδκ ηςκζηή θζάθδ ιεηά ηδκ πνχηδ εηπφθζζδ, οπμαθήεδηε εη κέμο ζε δεφηενδ εηπφθζζδ δζάνηεζαξ 1 χναξ, ιε ηδκ πνμζεήηδ 10 ml ιεεακυθδξ ηαζ ηαηυπζκ αημθμφεδζε θοβμηέκηνδζδ (5 min ζε 7500 rpm), παναθααή ηαζ ζοκέκςζδ ηςκ οπενηεζιέκςκ (ζοκμθζηυξ υβημξ 20 ml πενίπμο) ζε ηςκζηή θζάθδ ηςκ 50ml. Ο ζοκμθζηυξ υβημξ ηςκ οπενηείιεκςκ δζαθοιάηςκ δζδεήεδηε απυ εζδζηυ μλοακεεηηζηυ θίθηνμ (glass fibre filters) πνμηεζιέκμο κα ακαθοεεί ζηδ ζοκέπεζα ζε ζφζηδια HPLC (Πίκαηαξ 5.3). 302

303 Αλαιπηηθή κέζνδνο πξνζδηνξηζκνύ ηνπ κπθεηνθηόλνπ imazalil (IMZ) Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ οπμθεζιιάηςκ ημο ιοηδημηηυκμο imazalil (ΗΜΕ) ζημ έδαθμξ, 5 g εδάθμοξ γοβίζηδηακ ηαζ ιεηαθένεδηακ ζε ηςκζηή θζάθδ ηςκ 100 ml. ηδ ζοκέπεζα, πνμζηέεδηε ζημ εδαθζηυ δείβια 1 ml δζαθφιαημξ NaOH 1N βζα κα δζαηδνδεεί δ ηζιή ημο ph > pka, πμο ζηδκ πενίπηςζδ ημο ΗΜΕ είκαζ pka=6.53, ζημοξ 20:C, χζηε ημ IMZ (αζεεκήξ αάζδ) κα ανίζηεηαζ ζημ δζάθοια εηπφθζζδξ ζε αδζάζηαηδ -ιδ ζμκηζηή- ιμνθή (undissociated form), ηαζ αημθμφεδζε εηπφθζζδ ιε 10ml δζαθφηδ ιεεακυθδ. Οζ ηςκζηέξ θζάθεξ ηαθφθεδηακ ελςηενζηά ιε αθμοιζκυπανημ ηαζ ημ ζηυιζμ ημοξ ιε parafilm ηαζ ακάδεοηδηακ βζα 30 min ζε μνζγυκηζμ ακαδεοηήνα (orbital shaker), ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Αημθμφεδζε θοβμηέκηνδζδ ημο ιίβιαημξ, βζα 5 min ζε 7500 rpm ηαζ παναθααή ημο οπενηείιεκμο. Σμ δείβια εδάθμοξ πμο πανέιεζκε ζηδκ ηςκζηή θζάθδ ιεηά ηδκ πνχηδ εηπφθζζδ, οπμαθήεδηε ζε δεφηενδ εηπφθζζδ δζάνηεζαξ 30 min, ιε ηδκ πνμζεήηδ επζπθέμκ 10 ml ιεεακυθδξ ηαζ ηαηυπζκ θοβμηέκηνδζδ (5 min ζε 7500 rpm), παναθααή ηαζ ζοκέκςζδ ηςκ οπενηεζιέκςκ (ζοκμθζηυξ υβημξ 20 ml πενίπμο) ζε ηςκζηή θζάθδ ηςκ 50 ml. Ο ζοκμθζηυξ υβημξ ηςκ οπενηείιεκςκ δζαθοιάηςκ δζδεήεδηε απυ εζδζηυ μλοακεεηηζηυ θίθηνμ (glass fibre filters) πνμηεζιέκμο κα ακαθοεεί ζηδ ζοκέπεζα ζε ζφζηδια HPLC (Πίκαηαξ 5.3). Αλαιπηηθή κέζνδνο πξνζδηνξηζκνύ ηνπ κπθεηνθηόλνπ ortho-phenylphenol (OPP) Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο ιοηδημηηυκμο ortho-phenylphenol (OPP), 10g εδάθμοξ γοβίζηδηακ ζε ηςκζηέξ θζάθεξ ηςκ 100 ml ηαζ ακαιίπεδηακ ιε 25ml μνβακζημφ δζαθφηδ αηεημκζηνίθζμ (MeCN). Κάεε ηςκζηή θζάθδ ηαθφθεδηε ελςηενζηά ιε αθμοιζκυπανημ ηαζ ημ ζηυιζμ ηδξ ζθναβίζηδηε ιε parafilm. Αημθμφεδζε έκαξ ηφηθμξ ακάδεοζδξ δζάνηεζαξ 30min, θοβμηέκηνδζδ βζα 5 min ζε 7500 rpm, παναθααή ημο οπενηείιεκμο, δζήεδζδ απυ εζδζηυ μλοακεεηηζηυ θίθηνμ (glass fibre filters) ηαζ ακάθοζδ ζε ζφζηδια HPLC (Πίκαηαξ 5.3). 303

304 Αλαιπηηθή κέζνδνο πξνζδηνξηζκνύ ηνπ αληηνμεηδσηηθνύ diphenylamine (DPA) Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο ακηζμλεζδςηζημφ diphenylamine (DPA) ζηα εδαθζηά δείβιαηα πνδζζιμπμζήεδηε δ ίδζα αηνζαχξ ιέεμδμξ εηπφθζζδξ (10 g εδάθμοξ, 25 ml MeCN, ιζα εηπφθζζδ δζάνηεζαξ 30 min) ιε αοηή βζα ημ ιοηδημηηυκμ ΟΡΡ. Αλαιπηηθή κέζνδνο πξνζδηνξηζκνύ ηνπ αληηνμεηδσηηθνύ ethoxyquin (EQ) Καηά ηδ δζαδζηαζία ηδξ ακάπηολδξ ακαθοηζηήξ ιεευδμο πνμζδζμνζζιμφ ημο ακηζμλεζδςηζημφ EQ, παναηδνήεδηε ηαπφηαηδ δζάζπαζδ ημο EQ αιέζςξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημο ζημ έδαθμξ. Ακάθοζδ ζε ζφζηδια LC/MS/MS έδεζλε μλείδςζδ ημο EQ (ημνοθέξ ζε m/z 218 [Μ+Ζ] +, 202 [M + -CH 3 ], 174 [202-C 2 H 4 ] ηαζ Rt 9.9) ηαζ ζπδιαηζζιυ δφμ παναβχβςκ ημο ηα μπμία ηαοημπμζήεδηακ ςξ (1) 2,6-dihydro-2,2,4- trimethyl-6-quinone imine (QI) (ημνοθέξ ζε m/z 188 [M+1] +, 172 [M + - CH 3 ], 159 [M + - CO], 144 [159-CH 3 ], Rt 9.2) ηαζ (2) 2,4-dimethyl-6-ethoxyquinoline (EQNL) (ημνοθέξ ζε m/z 202 [M+1] +, 173 [M + - C 2 H 4 ], 144 [173-CHO], Rt 10.1). Χξ εη ημφημο, δ ζοβηέκηνςζδ ημο EQ ζηα επζιένμοξ εδαθζηά δείβιαηα, οπμθμβίζηδηε ςξ ζοκμθζηή ζοβηέκηνςζδ ημο EQ ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημο ζημ έδαθμξ. Γεδμιέκμο υηζ δεκ ηοηθμθμνμφκ ζημ ειπυνζμ πνυηοπα ζηεοάζιαηα ηςκ δφμ παναπάκς ιεηααμθζηχκ ημο EQ, πναβιαημπμζήεδηε ζφκεεζδ ηςκ μοζζχκ αοηχκ ζημ ενβαζηήνζμ Βζμμνβακζηήξ Υδιείαξ ημο Σιήιαημξ Βζμπδιείαξ ηαζ Βζμηεπκμθμβίαξ ημο Πακεπζζηδιίμο Θεζζαθίαξ απυ ημκ Καεδβδηή η. Γ. Κμιιζχηδ ηαζ ηδκ Γν. Μακηά (Papadopoulou et al 2012), ζφιθςκα ιε ηζξ ιεευδμοξ πμο πενζβνάθμκηαζ απυ ημκ Brannegan (2000). Οζ μοζίεξ ηαοημπμζήεδηακ ιε θαζιαημζημπία NMR ηαζ πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ ακαθοηζηά πνυηοπα βζα ηδκ παναημθμφεδζδ ηαζ ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ οπμθεζιιάηςκ EQ. Ζ παναθααή ημο ακηζμλεζδςηζημφ ethoxyquin (EQ) ηαζ ηςκ δφμ ηφνζςκ ιεηααμθζηχκ ημο απυ ημ έδαθμξ πναβιαημπμζήεδηε ζφιθςκα ιε ηδ ιέεμδμ QuΔChERS (Anastassiades et al., 2003), ιε εθάπζζηεξ ηνμπμπμζήζεζξ. Ζ ιέεμδμξ αοηή ζηδ ζοκέπεζα πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ οπμθεζιιαηζηυηδηαξ ημο EQ ζημ έδαθμξ. Ζ ιέεμδμξ QuΔChERS πενζθαιαάκεζ δφμ επζιένμοξ ζηάδζα: (1) ημ ζηάδζμ ηδξ εηπφθζζδξ ηαζ (2) ημ ζηάδζμ ημο ηαεανζζιμφ. Καηά ημ ζηάδζμ ηδξ εηπφθζζδξ, 5g εδαθζημφ δείβιαημξ γοβίζηδηακ ηαζ ιεηαθένεδηακ ζε ζςθήκα Teflon πςνδηζηυηδηαξ 50ml, ιε ηαπάηζ, ηαζ ακαιείπεδηακ ιε 5ml ηνφμο (4:C) 304

305 απεζηαβιέκμο H 2 O. Αημθμφεδζε ζφκημιδ ακαηίκδζδ, πνμζεήηδ 10ml δζαθφηδ αηεημκζηνίθζμο ηαζ έκημκδ ακάδεοζδ ζε Vortex βζα 1 min. ηδ ζοκέπεζα, πνμζηέεδηε ιίβια αθάηςκ απμηεθμφιεκμ απυ 4g MgSO 4, 1g NaCl ηαζ 1.5g C 6 H 5 Na 3 O 7 2 H 2 O ηαζ αημθμφεδζε έκημκδ ακάδεοζδ ζε Vortex βζα 1 min ηαζ θοβμηέκηνδζδ βζα 5 min ζε 7500 rpm. Σμ οπενηείιεκμ δζάθοια ζοθθέπεδηε ηαζ οπμαθήεδηε ζε ηαεανζζιυ. οβηεηνζιέκα, ηθάζια υβημο 1 ml απυ ημ οπενηείιεκμ ιεηαθένεδηε ζε eppendorf (πςνδηζηυηδηαξ 1.5ml) πμο πενζείπε 150mg MgSO 4 and 25mg PSA ηαζ αημθμφεδζε ακάδεοζδ ζε Vortex βζα 30sec ηαζ θοβμηέκηνδζδ βζα 1min ζε 3000 rpm. Καηυπζκ ημ δείβια δζδεήεδηε δζαιέζμο θίθηνμο ζφνζββαξ 0.45ιm ηαζ ακαθφεδηε πνςιαημβναθζηά ζφιθςκα ιε ηζξ ζοκεήηεξ πμο πανμοζζάγμκηαζ ζημκ Πίκαηα 5.3. Όθα ηα ζηάδζα ηδξ ιεευδμο βζα ηδκ εηπφθζζδ ηαζ παναθααή ημο EQ ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημο απυ ημ έδαθμξ, υπςξ αοηή πενζβνάθηδηε παναπάκς, πναβιαημπμζήεδηακ ζε ζημηεζκυ ροπνυ εάθαιμ, ζε εενιμηναζία 4:C, ιε ζημπυ ηδκ επζανάδοκζδ ηδξ ιεηαηνμπήξ ημο ακηζμλεζδςηζημφ. HPLC ρξσκαηνγξαθηθή αλαιπζε Ο πνμζδζμνζζιυξ υθςκ ηςκ β.θ.., πναβιαημπμζήεδηε ιε ακάθοζδ ηςκ ακηίζημζπςκ εηποθζζιάηςκ ζε ζφζηδια HPLC 1100 ΖΡ Agilent, ιε UV ακζπκεοηή ηαζ ζηήθδ C18 GraceSmart (Rigas Labs) δζαζηάζεςκ 4.6 mm x 150mm, 5 ιm. ε ηάεε πενίπηςζδ, μ υβημξ ηδξ έβποζδξ ήηακ 20ιl. Γζα ηδ δζαζθάθζζδ ηδξ ηαεανυηδηαξ ηςκ πνμξ ακάθοζδ δεζβιάηςκ, πνζκ ηδκ έβποζδ ζημ πνςιαημβνάθμ, υβημξ απυ ηα πενζααθθμκηζηά δείβιαηα ηδξ ηάεε ιεηαπείνζζδξ ίζμξ ιε 1 ml δζδεμφκηακ απυ εζδζηά θίθηνα ζφνζββαξ 0.45ιm (Syringe Filters, LabSolution). Οζ ζοκεήηεξ πνςιαημβναθζηήξ ακάθοζδξ ηςκ επζιένμοξ β.θ.. πανμοζζάγμκηαζ ζοκμπηζηά ζημκ Πίκαηα 5.3. Ζ ζφκεεζδ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ ήηακ ιεεακυθδ: H 2 O+1%NH 3 ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ ηαζ αηεημκζηνίθζμ: H 2 O+1% NH 3, ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ΟΡΡ, DPA, EQ ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημο. Ζ νμή ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ ήηακ ζε ηάεε πενίπηςζδ 1 ml min -1. Ο πμζμηζηυξ πνμζδζμνζζιυξ ηςκ β.θ. ζηα πενζααθθμκηζηά δείβιαηα έβζκε ιε αάζδ ημ ειααδυκ ηδξ ημνοθήξ πμο ακηζζημζπμφζε ζε ηάεε μοζία ηαζ ηδ πνήζδ ηαηάθθδθςκ ηαιποθχκ ακαθμνάξ (Βθέπε ). Αληηδξαζηήξηα Μεεακυθδ (ChemLab, 99.9% HPLC Grade) Αηεημκζηνίθζμ (ChemLab, 99.9 % HPLC Grade) 305

306 H 2 O (ChemLab, HPLC Grade, 0.4ιm filtrated) Ολζηυξ Αζεοθεζηέναξ (ChemLab 99.8%) Ολζηυ Αιιχκζμ (Analar) MgSO 4 άκοδνμ (ChemLab 98%) NaCl (Panreac) Κζηνζηυ κάηνζμ έκοδνμ (C 6 H 5 Na 3 O 7 2 H 2 O ) (Merck) PSA (Supelco USA Bonded Silica) 306

307 Πίνακασ 5.3. υνκικεσ ανάλυςθσ των υπό μελζτθ γεωργικϊν φαρμάκων και των μεταβολιτϊν τουσ ςε ςφςτθμα HPLC. Γεσξγηθό Φάξκαθν Κηλεηή θάζε Αλαινγία δηαιπηώλ θηλεηήο θάζεο Μήθνο θύκαηνο (nm) Υξόλνο έθινπζεο (min) Thiabendazole ΜeOH: H 2 O+1%NH 3 70: Imazalil ΜeOH: H 2 O+1%NH 3 80: ortho-phenylphenol MeCN:H 2 O+1%NH 3 70: Diphenylamine MeCN:H 2 O+1%NH 3 80: Ethoxyquin MeCN:H 2 O+1%NH 3 70: Quinone Imine MeCN:H 2 O+1%NH 3 70: ,4-dimethyl-6- MeCN:H 2 O+1%NH 3 ethoxyquinoline 70:

308 Έιεγρνο αμηνπηζηίαο ησλ κεζόδσλ αλάιπζεο Πνζκ απυ ηδκ ακάθοζδ ηςκ εδαθζηχκ δεζβιάηςκ ηςκ δζαθμνεηζηχκ ιεηαπεζνίζεςκ ηνίεδηε απαναίηδηδ δ αλζμθυβδζδ ηςκ πνδζζιμπμζμφιεκςκ ιεευδςκ ακάθοζδξ. Γζα ηδκ αλζμθυβδζδ ηδξ αλζμπζζηίαξ ηάεε ιεευδμο πνμζδζμνίζηδηακ δ βναιιζηυηδηα ημο ακζπκεοηή, δ επίδναζδ ημο οπμζηνχιαημξ (matrix effect), δ ζπεηζηή ηοπζηή απυηθζζδ (Relative Standard Deviation: RSD), ηα υνζα ακίπκεοζδξ (LOD) ηαζ πμζμηζημφ πνμζδζμνζζιμφ (LOQ) ηαζ ημ πμζμζηυ ακάηηδζδξ. Γξακκηθόηεηα ηεο θακπύιεο αλαθνξάο Ζ βναιιζηυηδηα ηδξ ακηαπυηνζζδξ ημο ακζπκεοηή ζε ζοκάνηδζδ ιε ηδ ζοβηέκηνςζδ ηάεε δναζηζηήξ μοζίαξ εθέβπεδηε ιε ηδκ ηαηαζηεοή πνυηοπδξ ηαιπφθδξ ζε εφνμξ ζοβηεκηνχζεςκ 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25 ηαζ 50 ιg ml -1 ηαζ ηαοηυπνμκμ οπμθμβζζιυ ημο ζοκηεθεζηή πνμζανιμβήξ R 2. Γεκζηά, ςξ απμδεηηέξ εεςνμφκηαζ ηζιέξ ζοκηεθεζηή πνμζανιμβήξ R 2 > 0.98 (Κανακάζζμξ 2011). Έιεγρνο επίδξαζεο ππνζηξώκαηνο θαη θακπύιεο αλαθνξάο Χξ επίδναζδ οπμζηνχιαημξ (matrix effect) ακαθένεηαζ δ ζοκδοαζιέκδ επίδναζδ υθςκ ηςκ ζοζηαηζηχκ ημο εδαθζημφ δείβιαημξ, ζημκ πμζμηζηυ πνμζδζμνζζιυ ηδξ πνμξ ακάθοζδ δναζηζηήξ μοζίαξ. Γζα ηδκ απμθοβή ηοπυκ ζθαθιάηςκ ζηδκ απυηνζζδ ημο πνςιαημβναθζημφ ζήιαημξ, ελαζηίαξ ηδξ παναπάκς επίδναζδξ, πναβιαημπμζήεδηε ηαηαζηεοή πνυηοπδξ ηαιπφθδξ ακαθμνάξ, βζα ηδκ ηάεε έκςζδ πμο ακαθφεδηε, ιε ηδ πνήζδ πνυηοπςκ δζαθοιάηςκ ηςκ δναζηζηχκ μοζζχκ (analytical standards) ζε εηποθίζιαηα ημο εδαθζημφ οπμζηνχιαημξ ακηί ζε ηαεανυ μνβακζηυ δζαθφηδ. Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ηςκ επζιένμοξ πνυηοπςκ ηαιποθχκ πνδζζιμπμζήεδηακ δζαθφιαηα ζοβηεκηνχζεςκ 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25 ηαζ 50 ιg ml -1, πμο παναζηεοάζηδηακ ιε δζαδμπζηέξ αναζχζεζξ ημο ανπζημφ ποηκμφ πνυηοπμο δζαθφιαημξ ηάεε δναζηζηήξ μοζίαξ, ζοβηέκηνςζδξ 1 mg ml -1 (ζε ηαηάθθδθμ μνβακζηυ δζαθφηδ) ζημ εδαθζηυ δζάθοια πμο πνμέηορε απυ ηδκ εηπφθζζδ ιδ επζαανοιέκμο εδάθμοξ (ιάνηοναξ) αημθμοεχκηαξ ηδκ ακηίζημζπδ ιέεμδμ εηπφθζζδξ βζα ημ ηάεε β.θ. πςνζζηά. 308

309 Πξνζδηνξηζκόο ζρεηηθήο ηππηθήο απόθιηζεο (RSD) Ζ αηνίαεζα ηαζ δ επακαθδρζιυηδηα ηςκ ακαθοηζηχκ ιεευδςκ πμο ακαπηφπεδηακ βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ απμδυιδζδξ ηςκ β.θ. ζημ έδαθμξ εθέβπεδηε ιε πνμζδζμνζζιυ ηςκ ηζιχκ ηδξ ζπεηζηήξ ηοπζηήξ απυηθζζδξ (RSD) ή αθθζχξ ημο ζοκηεθεζηή παναθθαηηζηυηδηαξ (coefficient variation), ζφιθςκα ιε ημκ ηφπμ: RSD % = 100 * Γεκζηά, δ ζπεηζηή ηοπζηή απυηθζζδ εηθνάγεζ ημ ιέβεεμξ ηδξ δζαζπμνάξ ηςκ ιεηνήζεςκ. Έηζζ, υζμ ιζηνυηενδ είκαζ δ ηζιή ηδξ ζπεηζηήξ ηοπζηήξ απυηθζζδξ (%), ηυζμ ιζηνυηενδ είκαζ δ παναθθαηηζηυηδηα πμο εκημπίγεηαζ ζημ ζφκμθμ ηζιχκ πμο ελεηάγεηαζ, εκχ ορδθυηενεξ ηζιέξ ζπεηζηήξ ηοπζηήξ απυηθζζδξ (%), ηαηαδεζηκφμοκ ιεβαθφηενεξ απμηθίζεζξ ιεηαλφ ηςκ ηζιχκ εκυξ ζοκυθμο. ε ηάεε πενίπηςζδ, βζα κα εεςνδεεί ιζα ιέεμδμξ αηνζαήξ ηαζ επακαθήρζιδ, δ ηζιή ημο RSD (%) δεκ εα πνέπεζ κα λεπενκά ημ 20%. Πξνζδηνξηζκόο ησλ νξίσλ αλίρλεπζεο (LOD) θαη πνζνηηθνύ πξνζδηνξηζκνύ (LOQ) Χξ υνζμ ακίπκεοζδξ (LOD) μνίγεηαζ δ ιζηνυηενδ ζοβηέκηνςζδ ιζαξ μοζίαξ ζε έκα δείβια, πμο ιπμνεί κα ακζπκεοηεί πμζμηζηά, αθθά υπζ κα πνμζδζμνζζηεί πμζμηζηά, οπυ ζοβηεηνζιέκεξ ακαθοηζηέξ ζοκεήηεξ. Ακηίεεηα, ςξ υνζμ πμζμηζημφ πνμζδζμνζζιμφ μνίγεηαζ δ ιζηνυηενδ ζοβηέκηνςζδ ιζαξ μοζίαξ ζε έκα δείβια, πμο ιπμνεί κα πνμζδζμνζζηεί πμζμηζηά ιε απμδεηηή αηνίαεζα ηαζ αεααζυηδηα. ηδκ πνάλδ, ημ LOD πνμζδζμνίζηδηε ςξ δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ δναζηζηήξ μοζίαξ ζημ δείβια πμο δίκεζ ζήια ηνζπθάζζμ ημο εμνφαμο (Noise) ημο πνςιαημβναθζημφ ζήιαημξ (Signal) (θυβμξ ζήιαημξ S/N=3), εκχ ημ LOQ πνμζδζμνίζηδηε ςξ δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ δναζηζηήξ μοζίαξ ζημ δείβια πμο δίκεζ ζήια δεηαπθάζζμ ημο εμνφαμο ημο πνςιαημβναθζημφ ζήιαημξ (θυβμξ ζήιαημξ S/N=10). Δπίπεδα αλαθηήζεσλ ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζην έδαθνο Γζα ημκ έθεβπμ ηδξ μνευηδηαξ ηςκ ακαθοηζηχκ ιεευδςκ πνςιαημβναθζηήξ ακάθοζδξ πμο ακαπηφπεδηακ βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ πμνείαξ απμδυιδζδξ ηςκ β.θ. ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημοξ ζημ έδαθμξ (5.3.4), πναβιαημπμζήεδηακ πεζνάιαηα ακάηηδζδξ πμο 309

310 πενζεθάιαακακ ηδκ επζαάνοκζδ ημο οπυ ελέηαζδ εδάθμοξ ιε βκςζηή ζοβηέκηνςζδ δναζηζηήξ μοζίαξ. Ο πνμζδζμνζζιυξ ηςκ πμζμζηζαίςκ ακαηηήζεςκ ηςκ β.θ.. ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημοξ έβζκε ζφιθςκα ιε ηδ ιέεμδμ ημο ελςηενζημφ πνμηφπμο. οβηεηνζιέκα, δζάθοια βκςζηήξ ζοβηέκηνςζδξ ηδξ πνυηοπδξ μοζίαξ ηάεε β.θ.. ζε ηαηάθθδθμ μνβακζηυ δζαθφηδ (μλζηυξ αζεοθεζηέναξ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ TBZ, IMZ, OPP ηαζ DPA ηαζ αηεημκζηνίθζμ ζηδκ πενίπηςζδ ημο EQ ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημο QI ηαζ EQNL), πνμζηέεδηε λεπςνζζηά ζημ έδαθμξ, χζηε κα επζηεοπεεί επζαάνοκζδ ημο εδάθμοξ ζε 3 δζαθμνεηζηά επίπεδα ζοβηέκηνςζδξ (1, 5 ηαζ 50 ιg g -1 ). Μεηά ηδκ επζαάνοκζδ αημθμφεδζε ήπζα ακάιζλδ ηςκ δεζβιάηςκ εδάθμοξ βζα ηδκ επίηεολδ μιμζμβεκμφξ ηαηακμιήξ ηςκ β.θ. ηαζ παναιμκή ηςκ δεζβιάηςκ βζα 1 χνα ζε ηαηάζηαζδ δνειίαξ, πνμηεζιέκμο κα απμιαηνοκεεί μ μνβακζηυξ δζαθφηδξ πνζκ ηδκ πεναζηένς επελενβαζία ηςκ δεζβιάηςκ. Αημθμφεδζε εηπφθζζδ ιε ηδκ ακηίζημζπδ βζα ημ ηάεε β.θ.. ακαθοηζηή ιέεμδμ ηαζ ακάθοζδ ζε ζφζηδια HPLC. Σμ πμζμζηυ ακάηηδζδξ πμο οπμθμβίζηδηε βζα ηάεε επίπεδμ επζαάνοκζδξ απμηεθεί ηδ ιέζδ ηζιή ηνζχκ επακαθήρεςκ. Γεκζηά, ηα απμδεηηά υνζα ακάηηδζδξ ηοιαίκμκηαζ ιεηαλφ ηςκ μνίςκ %, εκχ δ ιέζδ ηζιή ηδξ ακάηηδζδξ ηαεμνίγεζ ηδκ εοαζζεδζία (S: sensitivity) ηδξ ηάεε ιεευδμο Δπηινγή καζεκαηηθνύ κνληέινπ γηα ηελ πεξηγξαθή ηεο θηλεηηθήο ηεο απνδόκεζεο ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζην έδαθνο Ζ πενζβναθή ηδξ πμνείαξ απμδυιδζδξ ηςκ β.θ.. ζημκ πνυκμ πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδκ πνήζδ ηαηάθθδθςκ ιαεδιαηζηχκ ιμκηέθςκ ηζκδηζηήξ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, ηα δεδμιέκα πμο πνμέηορακ απυ ηζξ ιεηνήζεζξ οπμθεζιιαηζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ απεζημκίζηδηακ βναθζηά ζε ζφζηδια αλυκςκ, υπμο μ μνζγυκηζμξ άλμκαξ ακηζπνμζςπεφεζ ημ πνυκμ απυ ηδκ εθανιμβή ημο β.θ.. ζημ έδαθμξ ηαζ μ ηαηαηυνοθμξ ηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ οπμθεζιιάηςκ εηθναζιέκδ ςξ πμζμζηυ επί ηδξ ανπζηήξ ζοβηέκηνςζδξ. Χξ ανπζηή ζοβηέκηνςζδ μνίζηδηε δ ιεηνμφιεκδ ζοβηέκηνςζδ ημο β.θ.. αιέζςξ ιεηά ηδκ εθανιμβή (t=0) ηαζ υπζ δ εεςνδηζηά εθανιμγυιεκδ πμζυηδηα. Γζα ηδκ αλζυπζζηδ πενζβναθή ηςκ απμηεθεζιάηςκ απμδυιδζδξ πνδζζιμπμζήεδηακ δεδμιέκα απυ 9 δζαθμνεηζηά πνμκζηά ζδιεία δεζβιαημθδρίαξ (0, 4, 7, 14, 28, 42, 56, 70 ηαζ 100 διένεξ), ανζειυξ πμο οπενααίκεζ ηδκ εθάπζζηδ απαίηδζδ βζα 6 πνυκμοξ/ζδιεία δεζβιαημθδρίαξ πμο πνμηείκεηαζ ζηδκ μδδβία OECD (No 307, 2002). ηδ ζοκέπεζα, αλζμθμβήεδηε δ ηαηαθθδθυηδηα πενζβναθήξ ηδξ βναθζηήξ ηαζ ιαεδιαηζηήξ απμηφπςζδξ ηςκ απμηεθεζιάηςκ απμδυιδζδξ βζα ηάεε β.θ. ιε ημ 310

311 ιμκηέθμ ηζκδηζηήξ απμδυιδζδξ πνχηδξ ηάλδξ (Single First Order kinetics: SFO). ηζξ πενζπηχζεζξ πμο δ πμνεία ηδξ απμδυιδζδξ ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ δεκ ιπμνμφζε κα πενζβναθεί ζηακμπμζδηζηά ιε ηδ πνήζδ ηδξ ηζκδηζηήξ ελίζςζδξ πνχηδξ ηάλδξ, πνδζζιμπμζήεδηε εκαθθαηηζηά ημ δζθαζζηυ ιμκηέθμ Ζockey-Stick. Κηλεηηθή 1 εο ηάμεο Ζ απθή ηζκδηζηή πνχηδξ ηάλδξ (SFO) είκαζ ημ πζμ ζοπκά πνδζζιμπμζμφιεκμ ιμκηέθμ βζα ηδκ πενζβναθή ηδξ πμνείαξ απμδυιδζδξ ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ. Βαζίγεηαζ ζηδκ οπυεεζδ υηζ μ ανζειυξ ηςκ ιμνίςκ ημο β.θ. είκαζ ιζηνυηενμξ ζοβηνζηζηά ιε ημκ ανζειυ ηςκ απμδμιδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ηαζ ηςκ εκγφιςκ ημοξ ή ημο ανζειμφ ηςκ ιμνίςκ κενμφ ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ ααζμηζηήξ οδνυθοζδξ. Αοηυ έπεζ ςξ απμηέθεζια, μ νοειυξ ηδξ ιείςζδξ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο β.θ. (dc/dt) κα είκαζ ζε ηάεε πνμκζηή ζηζβιή ακάθμβμξ ηδξ πναβιαηζηήξ ζοβηέκηνςζδξ ημο β.θ.. Χξ εη ημφημο, μ πνυκμξ πμο απαζηείηαζ βζα ηδ ιείςζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο β.θ. ηαηά έκα ζοβηεηνζιέκμ πμζμζηυ είκαζ ζηαεενυξ ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ ηαζ δεκ ελανηάηαζ απυ ηδκ ανπζηή ζοβηέκηνςζδ ημο β.θ.. Ζ ηζκδηζηή πνχηδξ ηάλδξ, πενζβνάθεηαζ ιαεδιαηζηά απυ ιία απθή εηεεηζηή ελίζςζδ δφμ παναιέηνςκ (C 0, k): C= C 0 * e kt υπμο, C: δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ μοζίαξ ζε πνυκμ t C 0 : δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ μοζίαξ ζε πνυκμ t=0 k: μ νοειυξ απμδυιδζδξ ηδκ πενίπηςζδ αοηή μ πνυκμξ πμο απαζηείηαζ χζηε δ ζοβηέκηνςζδ ημο β.θ. κα ιεζςεεί ζημ 50% ή ημ 90% ηδξ ανπζηήξ ζοβηέκηνςζδξ (DT 50 ηαζ DT 90, ακηίζημζπα), οπμθμβίγεηαζ ζφιθςκα ιε ημκ παναηάης ηφπμ: DTx= Έηζζ, DT 50 = ηαζ DT 90 = (FOCUS, 2006). 311

312 Μνληέιν Hockey Stick (HS) Σμ ιμκηέθμ Hockey-Stick (HS) απμηεθείηαζ απυ δφμ δζαδμπζηέξ ελζζχζεζξ πνχηδξ ηάλδξ. Ζ ζοβηέκηνςζδ ημο β.θ. ανπζηά ιεζχκεηαζ ιε νοειυ k 1, ζφιθςκα ιε ηδκ ηζκδηζηή 1 δξ ηάλδξ. ε έκα ζοβηεηνζιέκμ πνμκζηυ ζδιείμ, βκςζηυ ςξ πνυκμξ δζαθμνμπμίδζδξ (breakpoint time, t b ), μ ζηαεενυξ νοειυξ απμδυιδζδξ ιεηααάθθεηαζ ηαζ παίνκεζ ηδκ ηζιή k 2. Ζ ηαιπφθδ πμο πενζβνάθεζ ημ ιμκηέθμ hockey stick δεκ είκαζ ζηαεενή ζημ πνυκμ. οκήεςξ, μ νοειυξ απμδυιδζδξ k 1 είκαζ ιεβαθφηενμξ ημο k 2, ακ ηαζ οπάνπμοκ πενζπηχζεζξ υπμο δ ηαπφηδηα ηδξ απμδυιδζδξ είκαζ ιζηνή ηαηά ηζξ πνχηεξ ιένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή (θάζδ οζηένδζδξ) εκχ ζηδ ζοκέπεζα αημθμοεεί πενίμδμξ ηαπείαξ απμδυιδζδξ. Ζ εηηίιδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο β.θ. ζε αοηή ηδκ πενίπηςζδ, είκαζ πζμ πενίπθμηδ ζοβηνζηζηά ιε ηδκ ηζκδηζηή πνχηδξ ηάλδξ ηαεχξ απαζηεί ημκ πνμζδζμνζζιυ ηεζζάνςκ παναιέηνςκ (C 0, k 1, k 2, t b ) ηαζ δ επζθμβή ηδξ ελίζςζδξ πμο εα πνδζζιμπμζδεεί ηεθζηά ζημοξ οπμθμβζζιμφξ ελανηάηαζ απυ ημ ακ μ πνυκμξ διζγςήξ (DT 50 ) είκαζ ιζηνυηενμξ (ελίζςζδ 5.3) ή ιεβαθφηενμξ (ελίζςζδ 5.4) ημο πνυκμο δζαθμνμπμίδζδξ (t b ) (FOCUS, 2006). C = C 0 * e k 1t, (t tb) (5.1) C = C 0 * e k t 1 * e- k (t-tb) 2, (t > tb) (5.2) DTx =, (t tb) (5.3) DTx =, (t > tb) (5.4) Αμηνιόγεζε ηεο θαηαιιειόηεηαο ησλ θηλεηηθώλ κνληέισλ O ααειυξ πνμζανιμβήξ ηςκ πεζναιαηζηχκ δεδμιέκςκ ζηα ηζκδηζηά ιμκηέθα πμο ιεθεηήεδηακ αλζμθμβήεδηε ιε αάζδ ηζξ ηζιέξ δφμ παναιέηνςκ α) ημο ζθάθιαημξ π 2 (%) ηαζ (2) ημο ζοκηεθεζηή παθζκδνυιδζδξ r 2. Σμ ζθάθια π 2, ακηζηαημπηνίγεζ ηζξ απμηθίζεζξ ιεηαλφ παναηδνμφιεκςκ ηαζ εηηζιχιεκςκ ηζιχκ βζα ηάεε ιμκηέθμ, θαιαάκμκηαξ οπυρδ ηδκ ααεααζυηδηα ηδξ ιέηνδζδξ. Μαεδιαηζηά οπμθμβίγεηαζ ζφιθςκα ιε ημκ ηφπμ: π 2 = ( ) ( ) 312

313 Όπμο, C: δ εηηζιχιεκδ ηζιή Ο: δ παναηδνμφιεκδ ηζιή Ǭ: δ ιέζδ ηζιή υθςκ ηςκ ιεηνήζεςκ err: ημ πμζμζηζαίμ ζθάθια ηδξ ιέηνδζδξ. Χξ εθάπζζημ πμζμζηζαίμ ζθάθια βζα ημ μπμίμ δ δμηζιή π 2 εεςνείηαζ επζηοπήξ, μνίζηδηε ηζιή ιζηνυηενδ ή ίζδ ημο 15%, ζε επίπεδμ ζδιακηζηυηδηαξ 5% (FOCUS, 2006). Ο ζοκηεθεζηήξ παθζκδνυιδζδξ είκαζ ημ ηεηνάβςκμ ημο ζοκηεθεζηή ζοζπέηζζδξ ημο Pearson (r), πμο πνμζδζμνίγεζ ημ ααειυ ζημκ μπμίμ μζ ηζιέξ δφμ ιεηααθδηχκ αημθμοεμφκ εοεφβναιιδ ζοιιεηααμθή. Μπμνεί ςζηυζμ, κα πνδζζιμπμζδεεί ηαζ ζε πενζπηχζεζξ ιδ εοεφβναιιδξ ζοιιεηααμθήξ ιεηαλφ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο β.θ.. ηαζ ημο πνυκμο πμο ιεζμθααεί απυ ηδκ εθανιμβή ημο ηαζ εηθνάγεηαζ ιαεδιαηζηά απυ ημκ ηφπμ: r 2 = ( ) ( ) υπμο, n: μ ζοκμθζηυξ ανζειυξ ηςκ παναηδνήζεςκ Οi: δ i παναηδνμφιεκδ ηζιή Ci: δ ηζιή i εηηζιχιεκδ ιε ημ επζθεβιέκμ ιμκηέθμ Ǭ: δ ιέζδ ηζιή ηςκ παναηδνμφιεκςκ ηζιχκ (FOCUS, 2006). Σζιέξ ημο ζοκηεθεζηή παθζκδνυιδζδξ ιεβαθφηενεξ ημο 0.8 θακενχκμοκ αλζμπζζηία ζηδκ πενζβναθή ηδξ ηζκδηζηήξ πμνείαξ απμδυιδζδξ (Karanasios et al., 2010), εκχ ζηζξ πενζπηχζεζξ πνήζδξ ηδξ ηζκδηζηήξ ελίζςζδξ πνχηδξ ηάλδξ, ηζιή ιεβαθφηενδ ημο 0.7 ιπμνεί κα εεςνδεεί απμδεηηή (Beulke and Brown, 2001). Αλάιπζε ησλ δεδνκέλσλ H εηηίιδζδ ηςκ επζιένμοξ παναιέηνςκ ηςκ ηζκδηζηχκ ιμκηέθςκ, έβζκε ιε ηδ ιέεμδμ ηδξ ιδ βναιιζηήξ παθζκδνυιδζδξ (Non Linear Regression), ιε πνήζδ ημο ζηαηζζηζημφ παηέημο SPSS IBM Ο οπμθμβζζιυξ ημο ζθάθιαημξ ηδξ δμηζιήξ π 2 ηαζ ημο ζοκηεθεζηή παθζκδνυιδζδξ r 2, πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδ αμήεεζα οπμθμβζζηζηχκ θφθθςκ (Excel) ηδξ Microsoft Office ηαζ ημο ζηαηζζηζημφ παηέημο SPSS IBM

314 Μειέηε ηεο επίδξαζεο ησλ γ.θ. ζην κέγεζνο θαη ηε ζύζηαζε ηεο κηθξνβηαθήο θνηλόηεηα ηνπ εδάθνπο κε ηε κέζνδν ησλ PLFAs Ο πνμζδζμνζζιυξ ηδξ επίδναζδξ ηςκ β.θ. ζημ ιέβεεμξ ηαζ ηδ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ έβζκε ζφιθςκα ιε ηδ αεθηζζημπμζδιέκδ ιέεμδμ ακάθοζδξ PLFAs υπςξ πενζβνάθεηαζ ακαθοηζηά ζηδκ εκυηδηα ημο ηεθαθαίμο 2. Οιμίςξ, δ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ έβζκε υπςξ πενζβνάθεηαζ ζηδκ εκυηδηα ημο ηεθαθαίμο 2 ηδξ δζαηνζαήξ Μεηξήζεηο ελδπκηθήο δξαζηηθόηεηαο θαη κηθξνβηαθήο ιεηηνπξγηάο Πξνζδηνξηζκόο ηεο ελδπκηθήο δξαζηηθόηεηαο όμηλσλ θαη αιθαιηθώλ θσζθαηαζώλ ζην έδαθνο Ο πνμζδζμνζζιυξ ηδξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ υλζκςκ ηαζ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ έβζκε ζφιθςκα ιε ηδ ιέεμδμ ημο Tabatabai (1994). Ζ ιέεμδμξ αοηή ααζίγεηαζ ζηδκ πνμζεήηδ ζημ έδαθμξ, ηαηάθθδθμο οπμζηνχιαημξ βζα ηδκ δνάζδ ηςκ θςζθαηαζχκ, (θςζθμνζηή π-κζηνμθαζκυθδ) πμο μδδβεί ζηδκ οδνυθοζδ ημο θςζθμεζηενζημφ δεζιμφ ημο ηαζ ζηδκ εθεοεένςζδ π-κζηνμθαζκυθδξ (Δζηυκα 5.3) πμο ιπμνεί κα πνμζδζμνζζηεί θςημιεηνζηά. θςζθμνζηή π-κζηνμθαζκμθδ π-κζηνμθαζκυθδ Δηθόλα 5.3. Ζ ακηίδναζδ οδνυθοζδξ ηδξ θςζθμνζηήξ π-κζηνμθαζκμθδξ ιε ηδκ δνάζδ θςζθαηαζχκ πμο μδδβεί ζηδκ παναβςβή π-κζηνμθαζκυθδξ. Αληηδξαζηήξηα Γζα ηδ ιέηνδζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ υλζκςκ ηαζ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ πνδζζιμπμζήεδηακ ηα ελήξ ακηζδναζηήνζα: Σνινπέλην Pestanal, Riedel-de-Haën. 314

315 MUB (Modified Universal Buffer): 12.1 g THAM (ηνζξ-οδνμλοιέεοθαιζκμιεεάκζμ), 11.6 g ιαθεσηυ μλφ, 14 g ηζηνζηυ μλφ ηαζ 6.3 g αμνζηυ μλφ (H 3 BO 3 ) δζαθφεδηακ ζε 488 ml 1Ν NaOH ηαζ μ υβημξ ζοιπθδνχεδηε ζημ 1L ιε απμζηαβιέκμ H 2 O. MUB, ph=6.5: ε 200 ml MUB πνμζηέεδηε ηαηάθθδθμξ υβημξ δζαθφιαημξ HCl 0.1 M, βζα πνμζανιμβή ημο ph ζηδκ ηζιή 6.5 ηαζ αημθμφεδζε πνμζεήηδ απμζηαβιέκμο κενμφ βζα πνμζανιμβή ημο δζαθφιαημξ ζημκ επζεοιδηυ υβημ (1L). MUB, ph=11: ε 200 ml MUB πνμζηέεδηε ηαηάθθδθμξ υβημξ δζαθφιαημξ 0.1 Μ ΝaOH βζα πνμζανιμβή ημο ph ζηδκ ηζιή 11 ηαζ αημθμφεδζε πνμζεήηδ απμζηαβιέκμο κενμφ βζα πνμζανιμβή ημο δζαθφιαημξ ζημκ επζεοιδηυ υβημ (1L). Γηάιπκα θσζθνξηθήο π-ληηξνθαηλόιεο (PNP) 0.05 M: g έκοδνμο π- κζηνμθαζκοθμ-θςζθμνζημφ καηνίμο (disodium p-nitrophenyl phosphate tetrahydrate) (Sigma Aldrich) δζαθφεδηακ ζε 40 ml MUB ph 6.5 βζα ηζξ υλζκεξ θςζθαηάζεξ ή ζε 40 ml MUB ph 11 βζα ηζξ αθηαθζηέξ θςζθαηάζεξ ηαζ ηαηυπζκ μ υβημξ ζοιπθδνχεδηε ζηα 50 ml ιε πνμζεήηδ ακηίζημζπμο ph MUB. CaCl 2 0.5M: 73.5 g CaCl 2.2Ζ 2 Ο δζαθφεδηακ ζε 700 ml απμζηαβιέκμο κενμφ ηαζ αημθμφεδζε ζοιπθήνςζδ ημο υβημο ζημ 1L ιε απμζηαβιέκμο κενυ. NaOH 0.5M: 20 g NaOH δζαθφεδηακ ζε 700 ml απμζηαβιέκμο κενμφ ηαζ ζοιπθήνςζδ ιε απμζηαβιέκμ Ζ 2 Ο ιέπνζ ημ 1 L. Γηάιπκα αλαθνξάο π-ληηξνθαηλόιεο: 1 g π-κζηνμθαζκυθδξ δζαθφεδηε ζε 700 ml απμζηαβιέκμ κενυ ηαζ αημθμφεδζε πνμζεήηδ Ζ 2 Ο ιέπνζ ημ 1 L. Πεηξακαηηθή δηαδηθαζία ε ηςκζηέξ θζάθεξ ηςκ 50 ml ημπμεεηήεδηε 1 g εδάθμοξ απυ ηάεε δείβια ηαζ αιέζςξ ιεηά πνμζηέεδηακ 0.2 ml ημθμοέκζμ βζα ηδκ πθαζιμθοηζηή ηαζ απμθοιακηζηή ημο δνάζδ, 4 ml MUB (ιε ph 6.5 βζα ηζξ υλζκεξ ηαζ ιε ph 11 βζα ηζξ αθηαθζηέξ θςζθαηάζεξ) χζηε κα πνμζανιμζηεί ημ ph ζε αέθηζζηα επίπεδα βζα ηδ δνάζδ ηςκ υλζκςκ ηαζ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ, ακηίζημζπα ηαζ 1 ml δζαθφιαημξ θςζθμνζηήξ π- κζηνμθαζκυθδξ (PNP) πμο απμηεθεί ημ οπυζηνςια ημ μπμίμ ιεηά ηδκ επχαζδ ημο ιε ημ εδαθζηυ δείβια ηαζ ηα οπυθμζπα ακηζδναζηήνζα, απμδίδεζ ημ θςημιεηνζηά 315

316 ακζπκεφζζιμ πνμσυκ ηδξ ακηίδναζδξ δδθαδή ηδκ π-κζηνμθαζκυθδ. Αημθμφεδζε ζφκημιδ ακάδεοζδ ζε vortex βζα ακάιζλδ ηςκ επζιένμοξ οθζηχκ ηαζ ηαηυπζκ μζ ηςκζηέξ θζάθεξ, αθμφ ζθναβίζηδηακ ιε parafilm, ημπμεεηήεδηακ βζα 1 χνα ζε ζημηεζκυ εάθαιμ επχαζδξ ζημοξ 37 μ C οπυ ακάδεοζδ. Ζ ακάδεοζδ ηςκ δεζβιάηςκ ηαηά ηδ επχαζδ εηηζιάηαζ μηζ επδνεάγεζ ηζξ ηζιέξ ηδξ Km (ζηαεενά Michaelis) ηαζ ηδκ μιμζμβέκεζά ημοξ ιεηαλφ ηςκ δεζβιάηςκ (Tabatabai and Bremner, 1971, Eivazi and Tabatabai, 1977). Μεηά ημ πέναξ ηδξ ιίαξ χναξ, αημθμφεδζε πνμζεήηδ 1 ml CaCl 2 0.5M ηαζ 4 ml NaOH 0.5M ιε ζημπυ i) ηδκ ακαζημθή ηδξ δνάζδξ ηςκ θςζθαηαζχκ, ii) ηδκ ακάπηολδ ημο ηίηνζκμο πνχιαημξ πμο παναηηδνίγεζ ηδκ παναβυιεκδ κζηνμθαζκυθδ ηαζ iii) ηδκ ακάηηδζδ ηδξ π-κζηνμθαζκυθδξ απυ ηα εδαθζηά δείβιαηα ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηα δείβιαηα ακαδεφηδηακ εθαθνχξ. Αημθμφεδζε δζήεδζδ ηςκ εδαθζηχκ δζαθοιάηςκ ιε πνήζδ δειχκ Whatman no. 2, ζε πάβμ (Δζηυκα 5.4), χζηε κα εθαπζζημπμζδεεί μ ζπδιαηζζιυξ CaPO -3 4 πμο πνμηαθεί εμθενυηδηα ζημ δζήεδια. Πανάθθδθα ιε ηα πνμξ ακάθοζδ δείβιαηα, παναζηεοαζηήηακ δείβιαηα ηα μπμία πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ ιάνηονεξ. ε ακηίεεζδ ιε ηα οπυθμζπα δείβιαηα, ζηα δείβιαηα ημο ιάνηονα δ πμζυηδηα 1ml ημο PNP δζαθφιαημξ πνμζηέεδηε αιέζςξ ιεηά ηα CaCl 2 0.5M ηαζ NaOH 0.5M (δδθαδή αηνζαχξ πνζκ ηδ δζήεδζδ). ημ ηεθεοηαίμ αήια πναβιαημπμζήεδηε ιέηνδζδ ηδξ απμννυθδζδξ ημο εηποθίζιαημξ πμο πνμέηορε (Δζηυκα 5.4), ζηα 420 nm, υπμο ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα ηαεμνίγμοκ ημ ιδδέκ ηδξ απμννυθδζδξ. Ο πνμζδζμνζζιυξ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ υλζκςκ ηαζ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ ζημ έδαθμξ έβζκε ιε ηδ αμήεεζα πνυηοπδξ ηαιπφθδξ ηδξ πάρα-κζηνμθαζκυθδξ. Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ πνυηοπδξ ηαιπφθδξ, παναζηεοάζηδηακ ανπζηά πνυηοπα δζαθφιαηα ζοβηεκηνχζεςκ 0, 1, 2, 3, 4 ηαζ 5 ιg ml -1 π-κζηνμθαζκυθδξ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, 1 ml απυ ημ πνυηοπμ δζάθοια π-κζηνμθαζκυθδξ (1000 ιg ml -1 ) δζαθφεδηε ζε 100 ml Ζ 2 Ο ηαζ αημθμφεδζε ακάδεοζδ. ηδ ζοκέπεζα, 0, 1, 2, 3, 4, ηαζ 5 ml απυ ημ αναζςιέκμ πνυηοπμ δζάθοια ιεηαθένεδηακ ζε δμηζιαζηζημφξ ζςθήκεξ υπμο πνμζηέεδηε κενυ 5, 4, 3, 2, 1 ηαζ 0 ml ακηίζημζπα, χζηε μ ηεθζηυξ υβημξ κα είκαζ 5 ml. Σέθμξ, πνμζηέεδηακ 1ml CaCl 2 0.5M ηαζ 4ml NaOH 0.5M ηαζ αημθμφεδζε δζήεδζδ ηαζ θςημιέηνδζδ ζηα 420nm (Tabatabai, 1994). 316

317 Δηθόλα 5.4. Φςημβναθίεξ απυ ηδκ δζαδζηαζία πνμζδζμνζζιμφ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ θςζθαηαζχκ ημο εδάθμοξ: (ανζζηενά) ζηάδζμ δζήεδζδξ ηςκ εδαθζηχκ δζαθοιάηςκ ζε πάβμ ηαζ (δελζά) ηεθζηά δζδεήιαηα πνζκ ηδκ θςημιέηνδζδ Πξνζδηνξηζκόο ηεο δξαζηηθόηεηαο ηνπ ελδύκνπ β-γιπθνζηδάζε ζην έδαθνο Ο πνμζδζμνζζιυξ ηδξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ ηδξ α-βθοημζζδάζδξ έβζκε ζφιθςκα ιε ηδ ιέεμδμ ηςκ Eivazi and Tabatabai, (1988). Οζ α-βθοημζζδάζεξ ηαηαθφμοκ ηδκ οδνυθοζδ ηςκ α-d-βθοημζζδίςκ. Σα πνμσυκηα ηδξ οδνυθοζδξ ηςκ α- βθοημζζδαζχκ απμηεθμφκ ζδιακηζηή πδβή εκένβεζαξ βζα ημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. H ιέεμδμξ αοηή είκαζ ααζζζιέκδ ζημκ θςημιεηνζηυ πνμζδζμνζζιυ ηδξ π- κζηνμθαζκυθδξ πμο απεθεοεενχκεηαζ απυ ηδ δνάζδ ηδξ α-βθοημζζδάζδξ, υηακ ηα δείβιαηα εδάθμοξ επςάγμκηαζ ιε ηαηάθθδθμ οπυζηνςια υπςξ ημ π-κζηνμθαίκοθμ-β- D-βθοημζίδζμ (Eivazi and Tabatabai, 1988). + Ζ 2 Ο + π-νιηροθαίνυλο-β-d-γλυκοζίδιο π-νιηροθαινόλη Δηθόλα 5.5. Ζ ακηίδναζδ οδνυθοζδξ ημο π-κζηνμθαίκοθμ-β-d-βθοημζίδζμ απυ ηζξ α- βθοημζζδάζεξ ιε ηεθζηυ πνμσυκ ηδκ παναβςβή π-κζηνμθαζκυθδξ. 317

318 Αληηδξαζηήξηα Σνινπέλην Γηάιπκα π-ληηξνθαίλπιν-β-d-γιπθνζηδίνπ (PNG) 0.05M: g PNG δζαθφεδηακ ζε 40 ml MUB ph 6.0 ηαζ μ υβημξ ζοιπθδνχεδηε ιε ημ νοειζζηζηυ δζάθοια ιέπνζ ηα 50 ml. Ρπζκηζηηθό δηάιπκα THAM 0.1M, ph 12: 12.2 g THAM δζαθφεδηακ ζε 800 ml κενμφ ηαζ ηαηυπζκ ημ ph νοειίζηδηε ζηδκ ηζιή 12 ιε δζάθοια NaOH 0.5M. Ο υβημξ ημο δζαθφιαημξ ζοιπθδνχεδηε ζημ1 L ιε απμζηαβιέκμ κενυ. Ρπζκηζηηθό δηάιπκα MUB ph 6.0: 200 ml δζαθφιαημξ MUB ιεηαθένμκηαζ ζε ηςκζηή θζάθδ ηςκ 500 ml ηαζ νοειίγεηαζ ημ ph ζηδκ ηζιή 6 ιε δζάθοια HCl 0.1M. Ο υβημξ ημο δζαθφιαημξ πνμζανιυζηδηε ζημ 1L ιε απμζηαβιέκμ κενυ. CaCl 2 0.5M: 73.5 g CaCl 2.H 2 O δζαθφεδηακ ζε 700 ml απμζηαβιέκμ κενυ ηαζ πνμζηέεδηε H 2 O έςξ ημ 1L. Γηάιπκα αλαθνξάο π-ληηξνθαηλόιεο: 1 g π-κζηνμθαζκυθδξ δζαθφεδηε ζε 700 ml απμζηαβιέκμ κενυ ηαζ αναζχεδηε ιε Ζ 2 Ο έςξ ημ 1L. Πεηξακαηηθή δηαδηθαζία Πμζυηδηα 1 g εδάθμοξ απυ ηάεε δείβια ημπμεεηήεδηε ζε ηςκζηέξ θζάθεξ ηςκ 50 ml. Αημθμφεςξ πνμζηέεδηακ ζηζξ ηςκζηέξ θζάθεξ 0.25 ml ημθμοέκζμ, 4 ml MUB ph 6.0 πμο ζφιθςκα ιε εονήιαηα ηςκ Eivazi and Tabatabai (1988) απμηεθεί ηδκ ηαηάθθδθδ ηζιή ph βζα ηδκ εηδήθςζδ ηδξ αέθηζζηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ α-βθοημζζδαζχκ ηαζ 1 ml PNG πμο απμηεθεί ημ οπυζηνςια οδνυθοζδξ ηςκ α-βθοημζζδαζχκ βζα ηδκ απεθεοεένςζδ ηδξ π-κζηνμθαζκυθδξ. ηδ ζοκέπεζα, ηα δείβιαηα ακαδεφηδηακ ζε Vortex ηαζ αθμφ ηαθφθεδηακ ιε parafilm ημπμεεηήεδηακ ζε ζημηεζκυ εάθαιμ επχαζδξ βζα 1 χνα ζημοξ 37 μ C. Αιέζςξ ιεηά ζηα δείβιαηα πνμζηέεδηακ 1ml CaCl 2 0.5M ηαζ 4ml THAM buffer 0.1M, ph 12, βζα ημοξ ίδζμοξ θυβμοξ πμο ακαθένεδηακ ζηδκ πενίπηςζδ πνμζδζμνζζιμφ ηδξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ υλζκςκ ηαζ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ ζημ έδαθμξ (πανάβναθμξ ) ηαζ αθμφ ακαδεφηδηακ εθαθνά αημθμφεδζε δζήεδζδ ιε δειυ Whatman 42 (Δζηυκα 5.6). Γζα ηδκ πνμεημζιαζία ηςκ δεζβιάηςκ ημο ιάνηονα ακαθμνάξ, αημθμοεήεδηε δ ίδζα δζαδζηαζία ιε ηδ δζαθμνά υηζ ηo δζάθοια PNG πνμζηέεδηε αηνζαχξ πνζκ απυ ηδκ δζήεδζδ. Σα δείβιαηα ημο ιάνηονα ακαθμνάξ πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ημκ ηαεμνζζιυ ημο ζδιείμο ιδδέκ ηδξ 318

319 απμννυθδζδξ, εκχ ηα δζδεήιαηα θςημιεηνήεδηακ ζηα 420 nm (Eivazi and Tabatabai, 1988). Ο πμζμηζηυξ πνμζδζμνζζιυ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ α- βθοημζζδαζχκ ζημ έδαθμξ, έβζκε ιε ηδ αμήεεζα πνυηοπδξ ηαιπφθδξ ηδξ μοζίαξ π- κζηνμθαζκυθδξ, δ μπμία παναζηεοάζηδηε ιε ημκ ίδζμ ηνυπμ πμο πενζβνάθηδηε ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ υλζκςκ ηαζ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ ( ). Δηθόλα 5.6. Φςημβναθίεξ απυ ηδκ δζαδζηαζία πνμζδζμνζζιμφ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ α-βθοημζζδαζχκ ημο εδάθμοξ: (ανζζηενά) ζηάδζμ δζήεδζδξ ηςκ εδαθζηχκ δζαθοιάηςκ ηαζ (δελζά) ηεθζηά δζδεήιαηα πνζκ ηδκ θςημιέηνδζδ Πξνζδηνξηζκόο ηνπ ξπζκνύ δπλεηηθήο ληηξνπνίεζεο Οζ πζεακέξ επζδνάζεζξ ηςκ β.θ.. ζηδκ ζηακυηδηα κζηνμπμίδζδξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ εηηζιήεδηακ ιέ ηδκ ιέηνδζδ ημο νοειμφ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ. Ζ δζαδζηαζία ηδξ κζηνμπμίδζδξ μθμηθδνχκεηαζ ζε δφμ αήιαηα: 1) Ανπζηά δ αιιςκία ή ζυκηα αιιςκίμο μλεζδχκμκηαζ ζε κζηνχδδ ηαζ 2) ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηα κζηνχδδ ιεηαηνέπμκηαζ ζε κζηνζηά ζυκηα. Οζ ζοβηεηνζιέκεξ δζαδμπζηέξ ακηζδνάζεζξ πναβιαημπμζμφκηαζ ζε αενυαζεξ ζοκεήηεξ απυ δζαθμνεηζημφξ ιζηνμαζαημφξ πθδεοζιμφξ (Κεθάθαζμ 1, πανάβναθμξ 1.2.1, ζεθ. 48). Ο πνμζδζμνζζιυξ ημο νοειμφ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζημ έδαθμξ πναβιαημπμζήεδηε ζφιθςκα ιε ηδκ ιέεμδμ ηδξ Kandeler (1995). ΝΖ Ο 2 NO H + + H 2 O (1) NO ½ O 2 NO 3 - (2) 319

320 Αληηδξαζηήξηα Γηάιπκα (NH 4 ) 2 SO 4 10mM: g (NH 4 ) 2 SO 4 δζαθφεδηακ ζε 1L απμζηαβιέκμο κενμφ. Γηάιπκα (NH 4 ) 2 SO 4 1mM: Παναζηεοάζηδηε ιε αναίςζδ 100ml δζαθφιαημξ (NH 4 ) 2 SO 4 1mM, ζε ηεθζηυ υβημ 1L ιε απμζηαβιέκμο κενυ. Γηάιπκα NaClO 3 1.5M: g NaClO 3 δζαθφεδηακ ζε 100ml απμζηαβιέκμο κενμφ. Γηάιπκα KCl 2M: g KCl δζαθφεδηακ ζε 1L απμζηαβιέκμο κενμφ. Ρπζκηζηηθό δηάιπκα NH 4 Cl 0.19M, ph 8.5: g NH 4 Cl δζαθφεδηακ ζε 1L απμζηαβιέκμο κενμφ ηαζ ημ ph νοειίζηδηε ζηδκ ηζιή 8.5. Υξσκαηηθόο δείθηεο: 2 g ζμοθθακζθαιίδζμ ηαζ 0.1 g οδνμπθςνζηή N-(1- καθεοθ)-αζεοθεκμ-δζαιίκδ δζαθφεδηακ ζε 150 ml απμζηαβιέκμο κενμφ ηαζ αημθμφεδζε πνμζεήηδ 20 ml ποηκμφ ορθο-θςζθμνζημφ μλέμξ ηαζ ζοιπθήνςζδ ημο υβημο δζαθφιαημξ ζηα 200 ml ιε απμζηαβιέκμ κενυ. Ππθλό δηάιπκα NaNO 2 (1000κmol NO N ml -1 ): g NaNO 2 δζαθφεδηακ ζε 1L απμζηαβιέκμο κενμφ. Γηάιπκα εξγαζίαο NaNO 2 (10κmol NO N ml -1 ): Πνμέηορε ιε αναίςζδ 5 ml ημο ποηκμφ δζαθφιαημξ NaNO 2 ζε ηεθζηυ υβημ 500 ml ιε απμζηαβιέκμ κενυ. Πεηξακαηηθή δηαδηθαζία 5 g απυ ηα επζιένμοξ εδαθζηά δείβιαηα γοβίζηδηακ ηαζ ιεηαθένεδηακ ζε ηςκζηέξ θζάθεξ ηςκ 250 ml ηαζ ηαηυπζκ πνμζηέεδηακ 20 ml δζαθφιαημξ (ΝΖ 4 ) 2 SO 4 1mM, ςξ αιιςκζαηυ οπυζηνςια βζα ηδ ιεηαηνμπή ημο ζε ΝΟ - 2 απυ ημοξ κζηνςδμπμζδηζημφξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ηαζ 0.1ml NaClO 3 1.5M ςξ ακηαβςκζζηζηυξ ακαζημθέαξ ηδξ πεναζηένς μλείδςζδξ ηςκ κζηνςδχκ πνμξ κζηνζηά ζυκηα ιε ζημπυ ηδκ ηεθζηή ζοζζχνεοζδ κζηνςδχκ (ΝΟ - 2 ) ακηί κζηνζηχκ (ΝΟ - 3 ) ζυκηςκ (Belser and Mays, 1980) ηαζ αημθμφεδζε ήπζα ακάδεοζδ ημο ιίβιαημξ. Γζα ηάεε ιεηαπείνζζδ, πνδζζιμπμζήεδηακ 3 επακαθήρεζξ, εκχ πανάθθδθα ιε ηα πνμξ ακάθοζδ δείβιαηα παναζηεοάγμκηακ έκα δείβια βζα ηάεε ιεηαπείνζζδ πμο εα πνδζίιεοε ζημκ οπμθμβζζιυ ημο νοειμφ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ςξ ιάνηοναξ ακαθμνάξ. Σα δείβιαηα πνμξ ακάθοζδ ημπμεεηήεδηακ βζα επχαζδ ζημοξ 20 μ C βζα 5 χνεξ οπυ ζοκεπή ακάδεοζδ, εκχ ηα δείβιαηα-ιάνηονεξ απμεδηεφηδηακ βζα ημ ίδζμ πνμκζηυ 320

321 δζάζηδια ζημοξ -20 μ C, ιε ζημπυ ηδκ απεκενβμπμίδζδ ηςκ εκγφιςκ ηαζ ηδκ ακαζημθή ηδξ κζηνςδμπμίδζδξ. Μεηά ημ πέναξ ηςκ 5 ςνχκ, υθα ηα δείβιαηα αθέεδηακ κα επακέθεμοκ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ηαζ αιέζςξ ιεηά αημθμφεδζε πνμζεήηδ 5 ml δζαθφιαημξ KCl 2M βζα ηδ δέζιεοζδ ηςκ ζυκηςκ NH + 4 ηαζ ΝΟ - 3, ζφκημιδ ακάδεοζδ ηαζ δζήεδζδ (Δζηυκα 5.7). Γζα ηδκ θςημιεηνζηή ακάθοζδ, ακαιίπεδηακ ζε δμηζιαζηζηυ ζςθήκα 5 ml απυ ημ εηπφθζζια πμο παναθήθεδηε ιεηά ηδ δζήεδζδ, 3 ml νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ πθςνζμφπμο αιιςκίμο (NH 4 Cl 0.19Μ) ηαζ 2 ml δζαθφιαημξ πνςιαηζημφ δείηηδ πμο ακηζδνά ιε ηα ΝΟ - 2 πμο έπμοκ παναπεεί ηαζ ιε ηδ θςημιέηνδζδ ηαηαδεζηκφεζ ηδκ ζοβηέκηνςζή ημοξ ζηα δζαθφιαηα. Αημθμφεδζε ακάδεοζδ ηαζ μιμβεκμπμίδζδ ημο ιίβιαημξ ηαζ παναιμκή βζα 15 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο, βζα ηδκ πθήνδ ακάπηολδ ημο πνχιαημξ. Σα δζαθφιαηα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ημ ιδδεκζζιυ ημο θςημιέηνμο παναζηεοάζηδηακ ακαιζβκφμκηαξ 5 ml απμζηαβιέκμ κενυ ιε 3 ml NH 4 Cl 0.19Μ ηαζ 2 ml πνςιαηζημφ δείηηδ. Ζ θςημιέηνδζδ πναβιαημπμζήεδηε ζηα 520nm (Δζηυκα 5.7). Γζα ημκ πμζμηζηυ πνμζδζμνζζιυ ηςκ παναβυιεκςκ ζηα εδαθζηά δείβιαηα κζηνςδχκ ζυκηςκ, πνδζζιμπμζήεδηε πνυηοπδ ηαιπφθδ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ. Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ πνυηοπδξ ηαιπφθδξ παναζηεοάζηδηακ πνυηοπα δζαθφιαηα NaNO 2 δζαθμνεηζηχκ ζοβηεκηνχζεςκ. οβηεηνζιέκα, 0 (ιάνηοναξ), 2, 4, 8 ηαζ 10 ml δζαθφιαημξ NaNO 2 (10ιmol NO N ml -1 ), ιεηαθένεδηακ ζε μβημιεηνζηυ ηφθζκδνμ ηςκ 100 ml, υπμο πνμζηέεδηακ 20 ml δζαθφιαημξ KCl 2M ηαζ μ υβημξ ζοιπθδνχεδηε ιέπνζξ ηα 100 ml, ιε απμζηαβιέκμ κενυ. Με ημκ ηνυπμ αοηυ πνμέηορακ δζαθφιαηα ζοβηεκηνχζεςκ 0, 0.2, 0.4, 0.8 ηαζ 1.0 ιmol NO N ml -1. Καηυπζκ 5 ml απυ ηα παναπάκς πνυηοπα δζαθφιαηα (ηεθζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ 0, 0.1, 0.2, 0.4 ηαζ 0.5 ιmol NO N ml -1 ) ακαιίπεδηακ ιε 3 ml νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ πθςνζμφπμο αιιςκίμο (NH 4 Cl 0.19Μ) ηαζ 2 ml δζαθφιαημξ πνςιαηζημφ δείηηδ ηαζ αημθμφεδζε θςημιέηνδζδ ζηα 520nm (Kandeler, 1995). 321

322 Δηθόλα 5.7. Φςημβναθία απυ ηδκ δζαδζηαζία πνμζδζμνζζιμφ ημο νοειμφ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ υπμο θαίκμκηαζ ηα δζδεήιαηα πμο είκαζ έημζια πνμξ θςημιέηνδζδ Πξνζδηνξηζκόο ηεο γεληθήο πδξνιπηηθήο ελδπκηθήο δξαζηηθόηεηαο ζην έδαθνο κε ηελ κέζνδν πδξόιπζεο ηεο 3,6-δηαθεηπιν-θινπνξνζθεΐλεο (FDHA) H ιέεμδμξ FDHA πνδζζιμπμζείηαζ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ ζοκμθζηήξ οδνμθοηζηήξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ. Δζδζηυηενα, ημ οπυζηνςια 3,6-δζαηεηοθμ-θθμομνμζηεΐκδ (FDA: 3,6- diacetylfluorescein) οδνμθφεηαζ ιδ ελεζδζηεοιέκα απυ έκακ ανζειυ εκγφιςκ υπςξ πνςηεάζεξ, εζηενάζεξ ηαζ θζπάζεξ. Σμ θεμνίγςκ πνμσυκ αοηήξ ηδξ εκγοιζηήξ ιεηαηνμπήξ είκαζ δ θθμομνμζηεΐκδ (Swisher and Carroll, 1980). Ζ βεκζηή οδνμθοηζηή εκγοιζηή δναζηζηυηδηα ζημ έδαθμξ πνμζδζμνίζηδηε ιε ηδκ ιέεμδμ FDHA υπςξ έπεζ πενζβναθεί απυ ημοξ Adam and Duncan, (2001). + 3Ζ 2 Ο + 2CΖ 3 CΟOH FDA (3,6 διακεηυλο-θλουοροζκεΐκδ) θλουοροζκεΐκδ Δηθόλα 5.8. Τδνυθοζδ ημο οπμζηνχιαημξ 3,6-δζαηεηοθμ-θθμομνμζηεΐκδ (FDA: 3',6'- diacetylfluorescein) απυ πνςηεάζεξ, εζηενάζεξ θζπάζεξ πνμξ θθμομνμζηεΐκδ (fluorescein) δ πμζυηδηα ηδξ μπμίαξ πνμζδζμνίγεηαζ θςημιεηνζηά. 322

323 Αληηδξαζηήξηα Ρπζκηζηηθό δηάιπκα όμηλνπ θσζθνξηθνύ θαιίνπ, 60mM, ph 7.6: 8.7 g Κ 2 ΖΡΟ 4 ηαζ 1.3 g ΚΖ 2 ΡΟ 4 δζαθφεδηακ ζε 1L Ζ 2 Ο. Γηάιπκα 3,6-δηαθεηπιν-θινπνξνζθεΐλεο (FDA), 1000κg ml -1 : 0.1 g FDA δζαθφεδηακ ζε 80 ml αηεηυκδξ ηαζ μ υβημξ ημο δζαθφιαημξ ζοιπθδνχεδηε ζηα 100ml ιε αηεηυκδ. Γηάιπκα ρισξνθόξκην:κεζαλόιε (2:1 ν/ν): ml πθςνμθμνιίμο ημπμεεηήεδηακ ζε μβημιεηνζηή θζάθδ ηαζ ηαηυπζκ πνμζηέεδηε ιεεακυθδ ιέπνζ ημ 1L. Ππθλό δηάιπκα θινπνξνζθεΐλεο (2000 κg L -1 ) : g άθαημξ καηνίμο ηδξ θθμομνμζηεΐκδξ, δζαθφεδηακ ζε 100 ml νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ υλζκμο θςζθμνζημφ ηαθίμο, 60 mm, ph 7.6. Γηάιπκα θινπνξνζθεΐλεο (20 κg L -1 ) : 1ml απυ ημ ποηκυ δζάθοια (2000 ιg L -1 ) ιεηαθένεδηε ζε μβημιεηνζηή θζάθδ ηαζ αναζχεδηε ζηα 100 ml ιε νοειζζηζηυ δζάθοια. Πεηξακαηηθή δηαδηθαζία Πμζυηδηα 2 g εδάθμοξ απυ ηάεε δείβια ιεηαθένεδηε ζε ηςκζηέξ θζάθεξ ηςκ 50 ml ηαζ ηαηυπζκ πνμζηέεδηακ 15 ml νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ θςζθμνζημφ ηαθίμο 60 mm ph 7.6, χζηε κα δζαζθαθζζηεί δ αέθηζζηδ δναζηζηυηδηα ηςκ εκγφιςκ πμο οδνμθφμοκ ηδκ FDA (Swisher and Carroll, 1980). Αημθμφεδζε πνμζεήηδ 0.2 ml δζαθφιαημξ ακαθμνάξ FDA (1000ιg ml -1 ) ςξ οπυζηνςια βζα ηα δζάθμνα ιζηνμαζαηά έκγοια πμο εα μδδβήζμοκ ζηδ ιεηαηνμπή ηδξ ζηδ θςημιεηνζηά πνμζδζμνίζζιδ θθμομνμζηεΐκδ, έκημκδ ακαηίκδζδ ιε ημ πένζ ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα ακάδεοζδ ζε ακαδεοηήνα βζα 20 θεπηά ζημοξ 30 μ C ιε ζημπυ ηδκ μιμβεκμπμίδζδ ηςκ δεζβιάηςκ ηαζ ηδκ εθεοεένςζδ εκγφιςκ πμο ιπμνεί κα είκαζ δεζιεοιέκα ζε ζοζζςιαηχιαηα ημο εδάθμοξ (Βreeuwer et al., 1995, Soderstrom, 1976). Αιέζςξ ιεηά, πνμζηέεδηακ ζηα επζιένμοξ δείβιαηα 15ml δζαθφιαημξ πθςνμθμνιίμο : ιεεακυθδξ (2:1, μ/μ) πνμηεζιέκμο κα επέθεεζ ηενιαηζζιυξ ηδξ οδνυθοζδξ. Σμ πθςνμθυνιζμ αμδεάεζ ζηδκ εηπφθζζδ ηδξ θθμομνμζηεΐκδξ απυ ηζξ ηοηηανζηέξ ιειανάκεξ, ηαεχξ δ ιδ πμθζηή θφζδ ημο FDA ελαζθαθίγεζ ηδκ είζμδμ ημο ζηα ηφηηανα αθθά ημ πμθζηυ πνμσυκ οδνυθοζδξ (θθμομνμζηεΐκδ) πμο ζπδιαηίγεηαζ, απεηηνίκεηαζ ιυκμ υηακ ημ υνζμ ηδξ 323

324 πςνδηζηυηδηαξ ηςκ ηοηηάνςκ έπεζ λεπεναζηεί (Rotman and Papermaster, 1966). H ιεεακυθδ αμδεάεζ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ημο πθςνμθμνιίμο ιε ημ έδαθμξ ηαζ ημκ ηενιαηζζιυ ηδξ ακηίδναζδξ. ηδ ζοκέπεζα, ηα δείβιαηα δζδεήεδηακ ζε δειυ Whatman 42, ζε θζάθδ ηεκμφ ηφπμο Buchner, ιε ηδ αμήεεζα ακηθίαξ ηεκμφ (Δζηυκα 5.9) ηαζ ημ ηάεε δζήεδια ιεηαθένεδηε ζε βοάθζκμοξ δμηζιαζηζημφξ ζςθήκεξ ηαζ αημθμφεδζε μ δζαπςνζζιυξ ηςκ δφμ θάζεςκ πμο ζπδιαηίζηδηακ (Δζηυκα 5.9). Ζ θθμομνμζηεΐκδ πμο πανάπεδηε ιε ημ παναηηδνζζηζηυ ηίηνζκμ πνχια, ηζκήεδηε πνμξ ηδκ πζμ πμθζηή άκς θάζδ ημο δζαθφιαημξ πμο απμηεθεί ιίβια υλζκμο θςζθμνζημφ ηαθίμο ηαζ ιεεακυθδξ, ημ μπμίμ ηαζ ζοθθέπεδηε ιε ζζθχκζμ ηαζ πζπέηα Pasteur ηαζ ιεηαθένεδηε ζε κέμ δμηζιαζηζηυ ζςθήκα βζα ηδκ ιέηνδζδ ηδξ απμννυθδζδξ ζηα 490 nm. Σμ νοειζζηζηυ δζάθοια θςζθμνζηχκ πνδζζιμπμζήεδηε ςξ ιάνηοναξ βζα ημκ ηαεμνζζιυ ημο ζδιείμο ιδδέκ ηδξ απμννυθδζδξ. Γζα ημκ πμζμηζηυ πνμζδζμνζζιυ ηδξ παναβυιεκδξ θθμομνμζηεΐκδξ ζηα οπυ ιεθέηδ εδαθζηά δείβιαηα ηαηαζηεοάζηδηε πνυηοπδ ηαιπφθδ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ παναζηεοάζηδηακ δζαθφιαηα θθμομνμζηεΐκδξ ιε ζοβηεκηνχζεζξ απυ 0 ςξ 5 ιg L -1. Απυ ημ δζάθοια θθμομνμζηεΐκδξ ζοβηέκηνςζδξ 20 ιg L -1, ιε δζαδμπζηέξ αναζχζεζξ παναζηεοάζηδηακ δζαθφιαηα ζοβηέκηνςζδξ 1, 2, 3, 4, 5 ιg L -1 θθμομνμζηεΐκδξ ηαζ δ απμννυθδζδ ημοξ πνμζδζμνίζηδηε ζηα 490nm (Adam and Duncan, 2001). Eηθόλα 5.9. Γείβιαηα πνμξ δζήεδζδ (ανζζηενά), δζήεδζδ ιε θζάθδ ηεκμφ Βuchner (ηέκηνμ) ηαζ δζδεήιαηα δφμ θάζεςκ πνζκ ημκ δζαπςνζζιυ (δελζά). 324

325 Δθηίκεζε ηεο κηθξνβηαθήο δξαζηεξηόηεηαο ζην έδαθνο κε ηε κέζνδν ηεο κηθξνβηαθήο αλαπλνήο Ζ ιέηνδζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ακαπκμήξ απμηεθεί ιζα απυ ηζξ ζοκδεέζηενεξ ιεευδμοξ εηηίιδζδξ ηδξ βεκζηυηενδξ ιζηνμαζαηήξ δναζηδνζυηδηαξ ζημ έδαθμξ. Οζ ιεηααμθζηά εκενβμί ιζηνμμνβακζζιμί πμο ανίζημκηαζ ζημ έδαθμξ, ιεηαηνέπμοκ ημκ μνβακζηυ C, ζε ακυνβακμ, οπυ ηδ ιμνθή, CO 2 (Paul and Clark, 1989, Alexander, 1977). Ζ εθανιμβή αοηήξ ηδξ ιεευδμο ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ έπεζ ςξ ζημπυ ηδκ εηηίιδζδ ηδξ επίδναζδξ ηςκ πέκηε οπυ ιεθέηδ β.θ.. (ΣΒΕ, ΗΜΕ, ΟΡΡ, DPA, EQ) ζηδκ βεκζηυηενδ δναζηδνζυηδηα ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ. Αληηδξαζηήξηα Γηάιπκα ΝaOH, 0.5M: 20 g NaOH δζαθφεδηακ ζε απμζηαβιέκμ κενυ (<1L) ηαζ ηαηυπζκ μ υβημξ ζοιπθδνχεδηε ιέπνζ ημ 1L. Γηάιπκα ΖCl, 0.25M: Παναζηεοάζηδηε ιε ηαηάθθδθδ αναίςζδ ποηκμφ δζαθφιαημξ ΖCl 12Μ. Γηάιπκα BaCl 2, 2M: 122 g BaCl 2.2H 2 O δζαθφεδηακ ζε 250 ml απμζηαβιέκμο κενμφ. Γείθηεο θαηλνινθζαιεΐλεο: 1 g θαζκμθμθεαθεΐκδξ δζαθφεδηε ζε 100 ml αζεακυθδξ. Πεηξακαηηθή δηαδηθαζία Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο παναβυιεκμο CO 2 εθανιυζηδηε δ ιέεμδμξ ημο Zibilske, 1994, πμο ααζίγεηαζ ζηδκ απμννυθδζδ αάζδξ, αημθμοεμφιεκδ απυ μβημιέηνδζδ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ πνδζζιμπμζήεδηακ 18 ζοκμθζηά βοάθζκα δμπεία (3 επακαθήρεζξ ακά ιεηαπείνζζδ) ιε αενμζηεβχξ εθανιμγυιεκμ ηαπάηζ (αάγα), ζε ηαεέκα απυ ηα μπμία ημπμεεηήεδηακ 50 g εδάθμοξ (Δζηυκα 5.10). Ζ οβναζία ηςκ δεζβιάηςκ εδάθμοξ πνμζανιυζηδηε ζημ 40% ηδξ οδαημπςνδηζηυηδηαξ (WHC) πνζκ ηδκ έκανλδ ημο πεζνάιαημξ ηαζ ηαηά ακαθμβία ιε ηζξ οπυθμζπεξ ιεηνήζεζξ πμο ακαθένεδηακ παναπάκς. ε ηάεε αάγμ ημπμεεηήεδηε έκα πμηήνζ γέζεςξ (50 ml) πμο πενζείπε 10 ςξ 15 ml NaOH, ιε ζημπυ ηδκ δέζιεοζδ ημο παναβυιεκμο CO 2 απυ ηδκ ακαπκμή ηςκ εκενβά ιεηααμθζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ηαζ ηδ ιεηαηνμπή -2 ημο ζε CO 3 (ακηίδναζδ 1). Μένμξ ημο δζμλεζδίμο ημο άκεναηα πμο ακηζδνμφζε ηάεε θμνά ιε ημ NaOH ηδξ παβίδαξ, πνμένπμκηακ απυ ημκ αένα πμο είπε εβηθςαζζηεί ιέζα 325

326 ζημ δμπείμ ηαζ υπζ απυ ηδ ιζηνμαζαηή δναζηδνζυηδηα. Ο ιεβαθφηενμξ υβημξ NaOH (15 ml ) πνδζζιμπμζήεδηε ηαηά ηζξ πνχηεξ ηνείξ δεζβιαημθδρίεξ (1, 2 ηαζ 5 διένεξ) θυβς ηδξ ακαιεκυιεκδξ ορδθυηενδξ παναβςβήξ CO 2 ηαηά ηα πνχηα ζηάδζα ημο πεζνάιαημξ χζηε κα απμθεοπεεί ημνεζιυξ ημο δζαθφιαημξ NaOH. Σα αάγα ηαθφθεδηακ ιε αθμοιζκυπανημ βζα κα πενζμνζζηεί δ πνυζααζδ ημο θςηυξ ζημ εζςηενζηυ ημοξ ηαζ ημπμεεηήεδηακ ζε ζημηεζκυ εάθαιμ επχαζδξ ζημοξ 27ºC βζα 35 διένεξ. ε ηάεε δεζβιαημθδρία, ηα αάγα απμιαηνφκεδηακ απυ ημ εάθαιμ επχαζδξ ηαζ αθμφ αθαζνέεδηε δ πμζυηδηα NaOH απυ ημ πμηήνζ γέζεςξ ηαζ ακηζηαηαζηάεδηε ιε ίζδ πμζυηδηα θνέζημο δζαθφιαημξ NaOH, ιεηαθένoκηακ ηαζ πάθζ ζημ εάθαιμ επχαζδξ. ε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ επχαζδξ, δ οβναζία ημο εδάθμοξ δζαηδνμφκηακ ζηα ανπζηά επίπεδα πμο είπε πνμζανιμζηεί, ιε πνμζεήηδ ηαηάθθδθμο υβημο κενμφ ζε ηάεε δεζβιαημθδρία. Σμ δζάθοια ΝaOH πμο ζοθθέπεδηε ζε ηάεε δεζβιαημθδρία ιεηαθένεδηε ζε ηςκζηή θζάθδ ηςκ 250 ml ηαζ ημ πμηήνζ γέζεςξ ηδξ «παβίδαξ» λεπθφεδηε ιε 10ml απμζηαβιέκμ κενυ, πμο επίζδξ πνμζηέεδηε ζηδκ ηςκζηή θζάθδ. Σμ δζάθοια πμο πνμέηοπηε εηηυξ απυ NaOH πενζείπε ηαζ Na 2 CO 3 ηαζ δεκ ήηακ δοκαηυ κα ηζηθμδμηδεεί ιε HCl, ηαεχξ ηαζ ηα δφμ αοηά ζοζηαηζηά ακηζδνμφκ ιε ημ μλφ. Γζα ημ θυβμ αοηυ αημθμοεμφζε ηάεε θμνά πνμζεήηδ 10 ml απμζηαβιέκμο κενμφ ηαζ 5 ml δζαθφιαημξ BaCl 2 2M, χζηε κα πναβιαημπμζδεεί ηαηαηνήικζζδ ημο Na 2 CO 3 πμο πανάβεηαζ απυ ηδκ ακηίδναζδ ημο CO 2 ιε ημ ΝαΟΖ ιε ηδ ιμνθή BaCO 3 (ακηίδναζδ 2).. Σέθμξ, πνμζηέεδηε δείηηδξ θαζκμθμθεαθεΐκδξ (6 ζηαβυκεξ) ηαζ αημθμφεδζε ηζηθμδυηδζδ ιε δζάθοια HCl 0.25M, οπυ ζοκεπή ακάδεοζδ ημο δζαθφιαημξ (Δζηυκα 5.10). Ο υβημξ ημο HCl πμο ηαηακαθχεδηε ηαηαβνάθδηε ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε ζημκ οπμθμβζζιυ ημο παναβυιεκμο CO 2. Πανάθθδθεξ ιεηνήζεζξ πναβιαημπμζήεδηακ ζε ηέζζενα δμπεία πμο δεκ πενζείπακ έδαθμξ πανά ιυκμ πμηήνζ γέζεςξ ιε δζάθοια ΝaOH ηαζ πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ ιάνηονεξ (Zibilske, 1994). Γεδμιέκμο υηζ ημ δζάθοια ζηδκ ηςκζηή θζάθδ ήηακ/πανέιεκε αθηαθζηυ ιέπνζ ημ ηέθμξ, ημ BaCO 3 δεκ ακηζδνμφζε ιε ημ μλφ. Έηζζ ημ HCl ακηζδνμφζε ιυκμ ιε ημ οπυθμζπμ NaOH (ακηίδναζδ 3). O υβημξ ημο HCl πμο ηαηακαθχεδηε ηαηά ηδκ ηζηθμδυηδζδ, ακηζπνμζςπεφεζ ηδκ πμζυηδηα ημο NaOH πμο δεκ ακηέδναζε ιε ημ ζφκμθμ ημο CO 2 πμο πνμένπεηαζ απυ ηδκ ιζηνμαζαηή ακαπκμή ηαζ απυ ημκ αένα ημο αάγμο. Ακηίζημζπα, ζηα αάγα πμο ακηζζημζπμφζακ ζημοξ ιάνηονεξ ακαθμνάξ (blank), 326

327 ημ NaOH ακηέδναζε ιε ημ CO 2 πμο πνμένπμκηακ ελμθμηθήνμο απυ ημκ αένα πμο εβηθςαίζηδηε ζημ δμπείμ. Δηθόλα Φςημβναθίεξ απυ ημ βοάθζκμ δμπείμ υπμο θαίκεηαζ ημ έδαθμξ ηαζ ημ πμηήνζ γέζεςξ ιε ημ δζάθοια NaOH (παβίδα) (ανζζηενά), δ δζαδζηαζία ηζηθμδυηδζδξ ημο δζαθφιαημξ NaOH ιε αναζυ δζάθοια HCl (ηέκηνμ) ηαζ μ πνςιαηζζιυξ ημο δζαθφιαημξ ΝaOH πνζκ (αθηαθζηυ, δείηηδξ θαζκμθμθεαθεσκδξ θμφλ) ηαζ ιεηά ηδκ ηζηθμδυηδζδ (δζάθακμ) (ανζζηενά). 2NaOH + CO 2 Na 2 CO 3 + H 2 O (1) Na 2 CO 3 + BaCl 2 BaCO 3 + 2NaCl (2) NaOH + HCl NaCl + H 2 O (3) Ο πνμζδζμνζζιυξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ακαπκμήξ ημο εδάθμοξ ιε αάζδ ημκ υβημ ηδξ ηζηθμδυηδζδξ ζηδνίπηδηε ζηδκ παναηάης ελίζςζδ: mg CO 2 = (B-V)* (NE) υπμο, Β: μ υβημξ (ml) ημο HCl πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηζηθμδυηδζδ ημο δζαθφιαημξ NaOH απυ ημ δείβια ημο ιάνηονα. V: μ υβημξ (ml) ημο HCl πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηζηθμδυηδζδ ημο δζαθφιαημξ NaOH απυ ηo εδαθζηυ δείβια. Ν: δ ηακμκζηυηδηα ημο μλέμξ ζε πζθζμσζμδφκαια ml -1. E: ημ ζζμδφκαιμ αάνμξ ημο C (E=6 ή Δ=22, ακ ηα δεδμιέκα εηθναζημφκ οπυ ιμνθή ηδξ παναβυιεκδξ πμζυηδηαξ C (π.π. mg CO-C) ή CO 2 (mg CO 2 ), ακηίζημζπα. 327

328 Ζ ακαπκεοζηζηή δναζηδνζυηδηα εηθνάζηδηε ηεθζηά ςξ ιg CO 2 g -1 λδνμφ αάνμοξ εδάθμοξ πμο πανάπεδηακ ζε ζοκμθζηυ δζάζηδια 35 διενχκ (Zibilske, 1994) ηαηηζηηθή αλάιπζε Γζα ηδκ ακάθοζδ ηςκ δεδμιέκςκ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ, δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ηαζ ιζηνμαζαηήξ ακαπκμήξ πνδζζιμπμζήεδηε ακάθοζδ δζαηφιακζδξ δομ παναβυκηςκ (two-way-anova). Οζ δφμ πανάβμκηεξ πμο αλζμθμβήεδηακ βζα ηδκ επίδναζδ ημοξ ζηζξ ιζηνμαζαηέξ θεζημονβίεξ, ήηακ μ πνυκμξ (διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή) ηαζ ημ είδμξ ημο β.θ.. πμο εθανιυζηδηε ζηα εδαθζηά δείβιαηα (ιεηαπεζνίζεζξ). ηζξ πενζπηχζεζξ υπμο παναηδνήεδηακ ζδιακηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ δφμ αοηχκ παναβυκηςκ, εθανιυζηδηε δ ιέεμδμξ ηςκ Δθάπζζηςκ διακηζηχκ Γζαθμνχκ (LSD Test) ζε επίπεδμ ζδιακηζηυηδηαξ 0.05%, πνμηεζιέκμο κα εκημπζζημφκ μζ δζαθμνέξ ιεηαλφ ηςκ δζαθμνεηζηχκ ιεηαπεζνίζεςκ ζημ ίδζμ πνυκμ αθθά ηαζ ιεηαλφ ηδξ ίδζαξ ιεηαπείνζζδξ ζημοξ δζαθμνεηζημφξ πνυκμοξ. ηδκ πενίπηςζδ ιεθέηδξ ηδξ επίδναζδξ ηςκ β.θ.. ζηδκ ιζηνμαζαηή ακαπκμή ημο εδάθμοξ, ζηδ ζοκμθζηή δζάνηεζα ηςκ 35 διενχκ, πνδζζιμπμζήεδηε ακηίζημζπα ακάθοζδ δζαηφιακζδξ εκυξ πανάβμκηα (one-way-anova) ηαζ LSD Test ζε επίπεδμ ζδιακηζηυηδηαξ 0.05%, βζα ηδ ζφβηνζζδ ηςκ ηζιχκ ηςκ ιέζςκ υνςκ ηδξ ηάεε ιεηαπείνζζδξ. Γζα ηδκ ακάθοζδ υθςκ ηςκ παναπάκς πεζναιαηζηχκ δεδμιέκςκ πνδζζιμπμζήεδηε ημ ζηαηζζηζηυ παηέημ GenStat 11.v Δπίδξαζε ηνπ αληηνμεηδσηηθνύ EQ θαη ησλ πξντόλησλ κεηαβνιηζκνύ ηνπ ζηε δπλεηηθή ληηξνπνίεζε ζε ζπλάξηεζε κε ηελ πνξεία απνδόκεζεο ηνπο ζην έδαθνο Πνμηεζιέκμο κα ιεθεηδεεί πεναζηένς μ ιδπακζζιυξ ακαζημθήξ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ απυ ημ EQ (υπςξ παναηδνήεδηε ζημ ανπζηυ πείναια πμο πενζβνάθδηε παναπάκς), πναβιαημπμζήεδηε ζοιπθδνςιαηζηυ πείναια ζημ μπμίμ ιεθεηήεδηε δ επίδναζδ ηυζμ ημο EQ, υζμ ηαζ ηαεεκυξ απυ ηα πνμσυκηα ιεηααμθζζιμφ ημο, QI ηαζ EQNL ιειμκςιέκα αθθά ηαζ ζε ζοκδοαζιυ (MIX: QI+ EQNL) ζηδ κζηνμπμίδζδ ζημ έδαθμξ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, πνμζδζμνίζηδηε υπςξ πενζβνάθδηε παναπάκς μ νοειυξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζημ έδαθμξ εκχ πανάθθδθα πνμζδζμνίζηδηε ηαζ δ πμνεία απμδυιδζδξ ημο EQ ηαζ ηςκ πνμσυκηςκ ιεηααμθζζιμφ ημο ζε υθα ηα δείβιαηα. οβηεηνζιέκα πνδζζιμπμζήεδηακ ζοκμθζηά 2 kg εδάθμοξ, ίδζμο ιε ημ ανπζηυ πείναια, πμο δζαπςνίζηδηακ πεναζηένς ζε 5 οπμδείβιαηα ηςκ 400 g. ε ηάεε 328

329 οπμδείβια εδάθμοξ πνμζηέεδηε ηαηάθθδθμξ υβημξ απμζηαβιέκμο Ζ 2 Ο (11 ml, ζοκμθζηά), βζα νφειζζδ ηδξ οβναζίαξ ζημ 40% ηδξ οδαημπςνδηζηυηδηαξ. Γζα ηδκ επζαάνοκζδ ημο εδάθμοξ ιε ημ EQ πνδζζιμπμζήεδηε ηαηάθθδθδξ ζοβηέκηνςζδξ οδαηζηυ δζαθοια ημο ζηεφαζιαημξ XEDAQUINE 72%. Ακηίζημζπα, βζα ηδκ επζαάνοκζδ ηςκ δεζβιάηςκ εδάθμοξ ιε ημοξ ιεηααμθίηεξ ημο EQ, πνμζηέεδηακ ζημ έδαθμξ 5 ml απυ δζαθφιαηα ηαηάθθδθδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ πνυηοπςκ μοζζχκ QI ηαζ EQNL ζε αηεημκζηνίθζμ. Σα δείβιαηα ηςκ οπμθμίπςκ ιεηαπεζνίζεςκ (δείβιαηα EQ ηαζ ιανηοναξ) δέπηδηακ επίζδξ πνμζεήηδ 5 ml αηεημκζηνζθίμο (υπςξ πενζβνάθεηαζ ακαθοηζηά παναηάης) χζηε κα ιδκ επδνεάζμοκ ηζξ ιεηνήζεζξ πζεακέξ ακαζηαθηζηέξ επζδνάζεζξ ημο δζαθφηδ ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. Έηζζ, ζημ πνχημ δείβια πνμζηέεδηακ 8 ml οδαηζημφ δζαθφιαημξ EQ (XEDAQUINE 72%), χζηε κα επζηεοπεεί ζοβηέκηνςζδ ζημ έδαθμξ 50 mg δ.μ kg -1 λ.α. εδάθμοξ, 3 ml απμζηαβιέκμο Ζ 2 Ο βζα ηδκ ζοιπθήνςζδ ημο υβημο κενμφ ζηα 11ml ηαζ νφειζζδ ηδξ οβναζίαξ ζημ 40% ηδξ οδαημπςνδηζηυηδηαξ ηαζ 5 ml αηεημκζηνίθζμ ηαζ ημ δείβια ακαιείπεδηε επζιεθχξ. ημ δεφηενμ οπμ-δείβια, πνμζηέεδηακ 5 ml δζαθφιαημξ QI ζε αηεημκζηνίθζμ, έηζζ χζηε δ ηεθζηή ημο ζοβηέκηνςζδ ζημ έδαθμξ κα είκαζ 16 mg δ.μ. kg -1 λ.α. εδάθμοξ ηαζ 11 ml απμζηαβιέκμο Ζ 2 Ο. ημ ηνίημ δείβια, πνμζηέεδηακ 5 ml δζαθφιαημξ EQNL ζε αηεημκζηνίθζμ χζηε δ ηεθζηή ημο ζοβηέκηνςζδ ζημ έδαθμξ κα είκαζ 1.4 mg δ.μ. kg -1 λ.α. εδάθμοξ ηαζ 11 ml απμζηαβιέκμο Ζ 2 Ο. Ζ επζθμβή ηςκ παναπάκς ζοβηεκηνχζεςκ βζα ηα πνμσυκηα ιεηααμθζζιμφ ημο EQ έβζκε ιε αάζδ ηζξ ιέβζζηεξ ζοβηεκηνχζεζξ ημοξ πμο ακζπκεφηδηακ ζημ έδαθμξ ηαηά ηδκ δζάνηεζα ημο πνχημο πεζνάιαημξ πμο πενζβνάθδηε παναπάκς (πανάβναθμξ ). ημ ηέηανημ δείβια, πνμζηέεδηακ ηαηάθθδθμζ υβημζ (άενμζζια υβηςκ 5 ml) απυ ηα δζαθφιαηα ηςκ QI ηαζ EQNL λεπςνζζηά, χζηε δ ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ ημοξ ζημ έδαθμξ κα είκαζ 16 ηαζ 1.4 mg kg -1, ακηίζημζπα. Καηυπζκ ζημ ζοβηεηνζιέκμ δείβια πνμζηέεδηακ 11 ml απμζηαβιέκμο Ζ 2 Ο. Σέθμξ, ημ πέιπημ δείβια δέπηδηε πνμζεήηδ 11 ml απμζηαβιέκμο Ζ 2 Ο ηαζ 5 ml αηεημκζηνζθίμο ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε ςξ ιάνηοναξ. Σα δείβιαηα δζαπςνίζηδηακ πεναζηένς ζε οπμ-δείβιαηα ηα μπμία ημπμεεηήεδηακ ζε πθαζηζηέξ αενμζηεβείξ ζαημφθεξ ηαζ επςάζηδηακ ζημ ζημηάδζ, ζημοξ 27 C. Γζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ πμνείαξ ηδξ απμδυιδζδξ ημο EQ ηαζ ηςκ πνμσυκηςκ ιεηααμθζζιμφ ημο, ηνία δείβιαηα απυ ηάεε ιεηαπείνζζδ ζοθθέπεδηακ ζε πνυκμοξ 0, 3, 10, 30, 60 ηαζ 90 διένεξ, ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ μοζζχκ ηαζ απμεδηεφηδηακ ζημοξ -20 C ιέπνζ κα ακαθοεμφκ ζε ζφζηδια HPLC υπςξ έπεζ ήδδ πενζβναθεί (πανάβναθμξ ). 329

330 Ακηίζημζπα, βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ημο EQ ηαζ ηςκ πνμσυκηςκ ιεηααμθζζιμφ ημο ζηδ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ, ηνία δείβιαηα απυ ηάεε ιεηαπείνζζδ ζοθθέπεδηακ 3, 10, 30, 60 ηαζ 90 διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ μοζζχκ ζημ έδαθμξ ηαζ ακαθφεδηακ υπςξ έπεζ ήδδ πενζβναθεί ζηζξ παναβνάθμοξ ηαζ Ζ ζηαηζζηζηή επελενβαζία ηςκ δεδμιέκςκ πμο πνμέηορακ έβζκε ιε ημκ ηνυπμ πμο πενζβνάθεηαζ ζηδκ πανάβναθμ Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηε δνκή ηεο θνηλόηεηαο ησλ βαζηδηνκπθήησλ θαη ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο. Δμαγσγή DNA από ην έδαθνο Ζ ελαβςβή ημο DNA απυ ημ έδαθμξ έβζκε ιε ηδ πνήζδ ημο ειπμνζημφ ηζη PowerSoil DNA Isolation Kit (MμBζμ Laboratories, Inc. USA), ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή. Ζ ανπή ηδξ ιεευδμο ααζίγεηαζ ζηδκ ηεπκζηή ηδξ άιεζδξ θφζδξ ηςκ ηοηηάνςκ, ιε ζοκδοαζιυ ιδπακζηχκ ηαζ πδιζηχκ ιεευδςκ. Παναηάης, πενζβνάθμκηαζ ακαθοηζηά ηα ζηάδζα πμο αημθμοεήεδηακ: 1. ε ζςθήκεξ πμο πενζείπακ ζθαζνίδζα θεπημφ δζαιενζζιμφ (beads) ηαζ ηαηάθθδθμ νοειζζηζηυ δζάθοια, ιεηαθένεδηακ 500 mg εδάθμοξ ηαζ αημθμφεδζε ήπζα ακάδεοζδ. Σμ νοειζζηζηυ δζάθοια: (α) αμδεά ζηδ δζαζπμνά ηςκ ζςιαηζδίςκ ημο εδάθμοξ, (α) ζοιιεηέπεζ ζηδ δζάθοζδ ηςκ πμοιζηχκ μλέςκ ηαζ (β) πνμζηαηεφεζ ηα κμοηθεσηά μλέα απυ ηοπυκ δζάζπαζδ. 2. Αημθμφεςξ πνμζηέεδηακ 60 ιl δζαθφιαημξ (C1) πμο πενζέπεζ SDS ηαζ άθθμοξ πανάβμκηεξ δζάνδλδξ ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ ηαζ πναβιαημπμζήεδηε ζφκημιδ ακάδεοζδ ζε vortex βζα ηδ δζάζπαζδ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηαζ ηςκ θζπζδίςκ ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ. 3. ηδ ζοκέπεζα μζ ζςθήκεξ ημπμεεηήεδηακ ζε ζοζηεοή ηαπείαξ ακάδεοζδξ (Vortex with tube holder) ηαζ ακαηζκήεδηακ ζηδ ιέβζζηδ ηαπφηδηα βζα 10 min. Καηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ακάδεοζδξ ζοκηεθείηαζ ιδπακζηή ηαζ πδιζηή θφζδ ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ, ιε ηδ δνάζδ ηςκ ζθαζνζδίςκ ηαζ ημο δζαθφιαημξ SDS, ακηίζημζπα. Αιέζςξ ιεηά ηδκ ακάδεοζδ πναβιαημπμζήεδηε θοβμηέκηνδζδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 30 sec, ζηα x g. 4. Σμ οπενηείιεκμ δζάθοια ιεηαθένεδηε ζε ηαεανά ζςθδκάνζα πμθοπνμποθεκίμο, (2ml) ηαζ αημθμφεδζε πνμζεήηδ 250ιl δζαθφιαημξ (C2) πμο πενζέπεζ έκα ακηζδναζηήνζμ πμο πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ ηαηαηνήικζζδ ακυνβακςκ ηαζ 330

331 μνβακζηχκ ζοζηαηζηχκ, υπςξ πμοιζηά μλέα, ηοηηανζηά εναφζιαηα ηαζ πνςηεΐκεξ ηαζ ακάιζλδ ζε Vortex. Σμ δείβια επςάζηδηε ζημοξ 4:C βζα 5min ηαζ ηαηυπζκ θοβμηεκηνήεδηε ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 1min, ζηα x g. 5. Όβημξ ίζμξ ιε 600ιl απυ ημ οπενηείιεκμ, ιεηαθένεδηε ζε ηαεανά ζςθδκάνζα πμθοπνμποθεκίμο (2 ml) ηαζ εκ ζοκεπεία πνμζηέεδηακ 200 ιl δζαθφιαημξ (C3), πμο πενζέπεζ έκα δεφηενμ ακηζδναζηήνζμ εζδζηυ βζα ηδκ πεναζηένς ηαηαηνήικζζδ πμοιζηχκ μλέςκ, ηοηηανζηχκ εναοζιάηςκ ηαζ πνςηεσκχκ. Αημθμφεδζε ζφκημιδ ακαηίκδζδ ζε vortex, επχαζδ ζημοξ 4:C βζα 5 min ηαζ θοβμηέκηνδζδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 1 min, ζηα x g. 6. Όβημξ ίζμξ ιε 750 ιl απυ ημ οπενηείιεκμ, ιεηαθένεδηε ζε ηαεανά ζςθδκάνζα πμθοπνμποθεκίμο (2ml) ηαζ αημθμφεςξ πνμζηέεδηακ 1.2 ml δζαθφιαημξ αθάηςκ ορδθήξ ζοβηέκηνςζδξ (C4), βζα ηδκ πνμεημζιαζία πνυζδεζδξ ημο DNA ζημ επυιεκμ ζηάδζμ. Αιέζςξ ιεηά πναβιαημπμζήεδηε ακάδεοζδ ζε vortex βζα 5 sec ιl απυ ημ παναπάκς δζάθοια ιεηαθένεδηακ ζε ιζηνμ-ζηήθδ ιε ιειανάκδ πονζηίμο ηαζ θοβμηεκηνήεδηακ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 1min, ζηα x g, ιε ζημπυ ηδκ ηαηαηνάηδζδ ημο DNA. Σμ δζάθοια πμο εηπθφεδηε απυ ηδ ζηήθδ απμννίθεδηε ηαζ δ δζαδζηαζία επακαθήθεδηε 2 θμνέξ βζα ημ οπυθμζπμ δείβια. 8. ηδ ζοκέπεζα ιεηαθένεδηακ ζηδ ιειανάκδ πονζηίμο υπμο πνμζδέεδηε ημ DNA, 500 ιl δζαθφιαημξ (C5) ιε αάζδ ηδκ αζεακυθδ βζα ηδκ απμιάηνοκζδ αθάηςκ, πμοιζηχκ μλέςκ ηαζ άθθςκ ακαζημθέςκ ηαζ ηδκ ηαθφηενδ πνυζδεζδ ημο DNA ζηδ ιειανάκδ. Αημθμφεδζε θοβμηέκηνδζδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 30sec, ζηα x g. Σμ δζάθοια πμο εηπθφεδηε απυ ηδ ζηήθδ απμννίθεδηε ηαζ δ δζαδζηαζία ηδξ θοβμηέκηνδζδξ επακαθήθεδηε, βζα ηδκ απμιάηνοκζδ ηςκ οπμθεζιιάηςκ ημο δζαθφιαημξ αζεακυθδξ. 9. Ζ παναθααή ημο DNA πναβιαημπμζήεδηε ιε ιεηαθμνά ζηδ ζηήθδ ιε ηδ ιειανάκδ πονζηίμο, 50ιl δζαθφιαημξ 10mM Tris (C6). Σμ δείβια θοβμηεκηνήεδηε βζα 30sec, ζηα x g ηαζ ημ εηθμουιεκμ DNA ζοθθέπεδηε ζε ζςθήκα πμθοπνμποθεκίμο (1.5 ml). Ζ ηαεανυηδηα ηςκ δεζβιάηςκ DNA πμο πνμέηορακ απυ ηδκ παναπάκς δζαδζηαζία εθέβπεδηε θςημιεηνζηά (θυβμζ 260/280 ηαζ 260/230 nm). Γζα ημκ άιεζμ έθεβπμ ηδξ πμζυηδηαξ (εναφζδ ή θφζδ) ημο DNA πμο εηποθίζηδηε απυ ηα επζιένμοξ δείβιαηα πναβιαημπμζήεδηε δθεηηνμθυνδζδ ηςκ DNA ζε πδηηέξ αβανυγδξ 0.8%, 331

332 υπςξ πενζβνάθεηαζ ζηδκ πανάβναθμ , ημο Κεθαθαίμο 3. Ο ηεθζηυξ πνμζδζμνζζιυξ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο DNA (ng ιl -1 ) ζηα δείβιαηα πναβιαημπμζήεδηε ζε θαζιαημθςημιεηνζηυ ζφζηδια NanoDrop (ND-1000 Spectrophotometer, V3.5) Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηε δνκή ηεο θνηλόηεηαο ησλ βαζηδηνκπθήησλ ηνπ εδάθνπο Δλίζρπζε ηεο ITS πεξηνρήο ησλ βαζηδηνκπθήησλ κε ηε ηερληθή ηεο PCR εκηεζσηεξηθήο έλζεζεο (semi-nested PCR) ηδκ πενίπηςζδ αοηή, ιεθεηήεδηακ επζθεηηζηά μζ ιεηαπεζνίζεζξ ηςκ β.θ.. ζημοξ πνυκμοξ 3, 30 ηαζ 90 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ. Αληηδξαζηήξηα θαη ζεξκνθπθινπνηεηηθέο ζπλζήθεο PCR αληηδξάζεσλ DyNAzyme EXT DNA πμθοιενάζδ, 1U/ιl (Finnzymes) 10x Mg 2+ -free DyNAzyme EXT νοειζζηζηυ δζάθοια ζοβηέκηνςζδξ 15mΜ Μίβια 5 ηνζθςζθμνζηχκ δεμλονζαμκμοηθεμηζδίςκ, dntps (HT Biotechnology, UK) Αθαμοιίκδ ημο μνμφ ημο Βμδζμφ (Bovine Serum Albumin : ΒSA) (New England Biolabs, USA) Γζξ απμζηαβιέκμ ηαζ απμζηεζνςιέκμ Ζ 2 Ο (d.d H 2 O) Καηάθθδθμζ Δηηζκδηέξ Πναβιαημπμζήεδηακ ζοκμθζηά δφμ δζαδμπζηέξ PCR ακηζδνάζεζξ. ηδκ πνχηδ ακηίδναζδ PCR πνδζζιμπμζήεδηακ μζ εηηζκδηέξ ITS1F ηαζ ITS4Β πμο ειθακίγμοκ ελεζδίηεοζδ ςξ πνμξ ιφηδηεξ ηαζ ααζζδζμιφηδηεξ, ακηίζημζπα (Πίκαηαξ 5.4), ιε ζημπυ ηδκ εκίζποζδ ηδξ ITS πενζμπήξ ημο rdna ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ απυ ημ ζοκμθζηυ DNA πμο εηποθίζηδηε απυ ημ έδαθμξ (Gardes and Bruns, 1993). Σμ πνμσυκ πμο πνμέηορε είπε ιέβεεμξ πενίπμο 700 bp. ηδ δεφηενδ ακηίδναζδ PCR (PCR διζεζςηενζηήξ έκεεζδξ), ημ πνμσυκ ηδξ πνχηδξ ακηίδναζδξ εκζζπφεδηε ιε ημοξ εηηζκδηέξ ITS1F-GC ηαζ ITS2 (Anderson and Cairney, 2004) (Πίκαηαξ 5.4). Ο ITS1F-GC εηηζκδηήξ είκαζ υιμζμξ ιε ημκ ITS1F, ιε ηδ δζαθμνά υηζ θένεζ αθθδθμοπία 40 κμοηθεμηζδίςκ πθμφζζα ζε γεφβδ βμοακίκδξ-ηοημζίκδξ (GC clamp) ζημ 5 άηνμ ημο. Με ηδ δεφηενδ ακηίδναζδ PCR πανάβμκηαζ ιζηνυηενα ITS ηιήιαηα (πενίπμο 300 bp) ηα μπμία θένμοκ ζημ 5 άηνμ ηδξ αθθδθμοπίαξ ημ GC-clamp ημ μπμίμ είκαζ απαναίηδημ βζα κα απμθεοπεεί δ μθζηή απμδζάηαλδ ημο dsdna ηαηά ηδκ δζάνηεζα ηδξ 332

333 δθεηηνμθυνδζδξ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ ιε ααειίδςζδ ζοβηέκηνςζδξ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ (DGGE). Σα οθζηά ηαζ μζ εενιμηοηθμπμζδηζηέξ ζοκεήηεξ εηηέθεζδξ ηςκ δφμ δζαδμπζηχκ PCR ακηζδνάζεςκ πανμοζζάγμκηαζ ζημοξ Πίκαηεξ 5.5, 5.6 (1 δ PCR ακηίδναζδ) ηαζ 5.7, 5.8 (2 δ PCR ακηίδναζδ). Πίλαθαο 5.4. Δηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ εκίζποζδ ηδξ ITS πενζμπήξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ Δθθηλεηήο Αιιεινπρία Αλαθνξά ITS1F 5 CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA 3 ITS4B 5 CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG 3 Gardes and Bruns, 1993 ITS1F-GC 5 CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCG GGGGCACGGGGGGCTTGGTCATTTAGAGGAAGT AA 3 Anderson and Cairney, 2004 ITS2 5 GCTGCGTTCTTCAT GATGC 3 Πίλαθαο 5.5. Οζ ζοβηεκηνχζεζξ ηαζ μζ πμζυηδηεξ ηςκ ακηζδναζηδνίςκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ PCR εκίζποζδ ηδξ ITS πενζμπήξ ημο rdna ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ιε ημοξ εηηζκδηέξ ITS1F-ITS4B. Αληηδξαζηήξηα Όγθνο Σειηθή ζπγθέληξσζε Buffer (10x optimized) 5 ιl 1x (1.5mM MgCl 2 ) dntps (10mM) 1 ιl 200ιΜ απυ ημ ηαεέκα ITS1F (20pmol/ιl) 0.5 ιl 0.2ιM ITS4B (20pmol/ιl) 0.5 ιl 0.2ιM BSA (10ιg/ιl) 2 ιl 400ng/ιl Πμθοιενάζδ (1U/ιl) 1 ιl 1U/50ιl DNA ddh 2 O οκμθζηυξ υβημξ 1 ιl 39 ιl 50 ιl 333

334 Πίλαθαο 5.6. Οζ εενιμηοηθμπμζδηζηέξ ζοκεήηεξ πναβιαημπμίδζδξ ηδξ πνχηδξ PCR εκίζποζδξ ηδξ ITS πενζμπήξ ημο rdna ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ιε ημοξ εηηζκδηέξ ITS1F-ITS4B. Ανπζηή απμδζάηαλδ 94 o C 5min Απμδζάηαλδ 94 o C 1min Τανζδμπμίδζδ 50 o C 1min 35 ηφηθμοξ Δπζιήηοκζδ 72 o C 1:30min Σεθζηή επζιήηοκζδ 72 o C 10min Πίλαθαο 5.7. Οζ ζοβηεκηνχζεζξ ηαζ μζ πμζυηδηεξ ηςκ ακηζδναζηδνίςκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ PCR διζεζςηενζηήξ έκεεζδξ ηδξ ITS πενζμπήξ ημο rdna ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ιε ημοξ εηηζκδηέξ ITS1F+GC-ITS2. Αληηδξαζηήξηα Όγθνο Σειηθή Buffer (10x optimized) 2.5 ιl 1x (1.5mM MgCl 2 ) dntps (10mM) 0.5 ιl 200ιΜ απυ ημ ITS1F-GC (20pmol/ιl) 0.5 ιl 0.4ιΜ ITS2 (20pmol/ιl) 0.5 ιl 0.4ιΜ Πμθοιενάζδ (1U/ιl) 1 ιl 1U/25ιl DNA (πνμσυκ ηδξ πνχηδξ ακηίδναζδξ) ddh 2 O οκμθζηυξ υβημξ 1 ιl 19 ιl 25 ιl 334

335 Πίλαθαο 5.8. Οζ εενιμηοηθμπμζδηζηέξ ζοκεήηεξ πναβιαημπμίδζδξ ηδξ δεφηενδξ PCR διζεζςηενζηήξ έκεεζδξ βζα ηδκ εκίζποζδ ηδξ ITS πενζμπήξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ιε ημοξ εηηζκδηέξ ITS1F+GC-ITS2. Ανπζηή απμδζάηαλδ 94 o C 5min Απμδζάηαλδ Τανζδμπμίδζδ Δπζιήηοκζδ 94 o C 55 o C 72 o C 30sec 30sec 1min Σεθζηή επζιήηοκζδ 72 o C 10min 30 ηφηθμοξ Ζιεθηξνθόξεζε ησλ PCR πξντόλησλ ζε πεθηή αγαξόδεο Σα επζιένμοξ πνμσυκηα PCR πμο πνμέηορακ δθεηηνμθμνήεδηακ ζε πδηηέξ αβανυγδξ 1,2%, χζηε κα εθεπεεί εάκ ημ ιέβεεμξ ηδξ αθθδθμοπίαξ πμο εκζζπφεδηε ήηακ ημ επζεοιδηυ. Ζιεθηξνθόξεζε ζε πεθηή αθξπιακίδεο κε βαζκίδσζε απνδηαηαθηηθώλ νπζηώλ (DGGE) Σα πνμσυκηα ηδξ δεφηενδξ PCR διζεζςηενζηήξ έκεεζδξ δθεηηνμθμνήεδηακ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ ζοβηέκηνςζδξ 8% (α/μ), ιε ααειίδςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ 30-55%. Γζα ηδκ δθεηηνμθυνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ αημθμοεήεδηε δ δζαδζηαζία πμο πενζβνάθεηαζ θεπημιενχξ ζηδκ πανάβναθμ , ημο Κεθαθαίμο 3. ημκ πίκαηα 5.9, θαίκμκηαζ μζ υβημζ ηςκ δζαθοιάηςκ 0% ηαζ 100% ηςκ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ πμο ακαιίπεδηακ χζηε κα πνμηφρμοκ ηα επζιένμοξ δζαθφιαηα παιδθήξ (30%) ηαζ ορδθήξ ζοβηέκηνςζδξ (55%), ηεθζημφ υβημο 25 ml. ε ηάεε πενίπηςζδ, δθεηηνμθμνμφκηακ 1ιl PCR πνμσυκημξ αθμφ ακαιζβκφμκηακ ιε 5 ιl δζαθφιαημξ θυνηςζδξ. Ζ δθεηηνμθυνδζδ πναβιαημπμζήεδηε ζηα 75V βζα 960 min ηαζ δ εενιμηναζία ηδξ δελαιεκήξ νοειίζηδηε ζημοξ 60C. 335

336 Πίλαθαο 5.9. Παναζηεοή δζαθοιάηςκ ιε ορδθή ηαζ παιδθή ζοβηέκηνςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ. Οκάδα κηθξννξγαληζκώλ % πγθέληξσζε απνδηαηαθηηθώλ νπζηώλ Όγθνο δηαιύκαηνο 0% (ml) Όγθνο δηαιύκαηνο 100% (ml) Βαζηδηνκύθεηεο Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηε δνκή ηεο θνηλόηεηαο ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο Δλίζρπζε ηνπ amoa γνληδίνπ ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ αξραίσλ θαη βαθηεξίσλ ηδκ πενίπηςζδ αοηή, ιεθεηήεδηακ επζθεηηζηά μζ ιεηαπεζνίζεζξ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζημοξ πνυκμοξ 3, 10, 30 ηαζ 90 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ. Αληηδξαζηήξηα θαη ζπλζήθεο πξαγκαηνπνίεζεο PCR αληηδξάζεσλ KAPATaq DNA Πμθοιενάζδ 10x KAPATaq νοειζζηζηυ δζάθοια πμθοιενάζδξ πμο πενζέπεζ 15 mμ MgCl 2 Μίβια 5 ηνζθςζθμνζηχκ δεμλονζαμκμοηθεμηζδίςκ, dntps (HT Biotechnology, UK) Αθαμοιίκδ ημο μνμφ ημο Βμδζμφ (Bovine Serum Albumin : ΒSA) (New England Biolabs, USA) Γζξ απμζηαβιέκμ ηαζ απμζηεζνςιέκμ Ζ 2 Ο (d.d H 2 O) Καηάθθδθμζ Δηηζκδηέξ Γζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ανπαίςκ (ΑΟΑ) πνδζζιμπμζδεήηακ μζ εηηζκδηέξ Α23f (5'-ATGGTCTGGCTWAGACG-3') ηαζ Α616r (5'-GCCATCCATCTGTATGTCCA-3'), υπςξ πενζβνάθεηαζ απυ ημοξ Tourna et al., (2008). Ο ζοκμθζηυξ υβημξ ηδξ ακηίδναζδξ ήηακ 50ιl ηαζ ημ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ είπε ιέβεεμξ 620 bp. Σμ πνμσυκ αοηυ ιπμνεί κα δθεηηνμθμνδεεί απεοεείαξ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ ιε ααειίδςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ, πςνίξ κα απαζηείηαζ δ ιεζμθάαδζδ πνυζεεηδξ ακηίδναζδξ PCR εζςηενζηήξ έκεεζδξ βζα ηδκ πνμζεήηδ γεοβχκ βμοακίκδξ-ηοημζίκδξ ζημ 5 άηνμ (GC-clamp). Σα επζιένμοξ ζοζηαηζηά πμο πνδζζιμπμζήεδηακ, ηαεχξ ηαζ μζ ζοκεήηεξ PCR πενζβνάθμκηαζ ακαθοηζηά ζηδκ πανάβναθμ , ημο Κεθαθαίμο 3 (Πίκαηεξ 3.8 ηαζ 3.9, ακηίζημζπα), ιε ιυκδ 336

337 δζαθμνά υηζ δεκ πνεζάζηδηε κα πναβιαημπμζδεεί αναίςζδ ημο DNA ημο εδάθμοξ ηαεχξ δεκ παναηδνήεδηε ακαζημθή. Γζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ πνδζζιμπμζδεήηακ μζ εηηζκδηέξ amo1f+gc (5 CGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCGGGGTTTCTACTGG TGGT-3 ) ηαζ amo2r (5'-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3') [K = G ή T, S = G ή C] υπςξ πενζβνάθεηαζ απυ ημοξ (Nicolaisen and Ramsing, 2002). Ο ζοκμθζηυξ υβημξ ηδξ ακηίδναζδξ ήηακ 50 ιl ηαζ ημ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ ιπμνμφζε κα δθεηηνμθμνδεεί απεοεείαξ ζε DGGE Σα επζιένμοξ ζοζηαηζηά πμο πνδζζιμπμζήεδηακ, ηαεχξ ηαζ μζ ζοκεήηεξ εηηέθεζδξ ηδξ ακηίδναζδξ, πενζβνάθμκηαζ ακαθοηζηά ζημοξ Πίκαηεξ 5.10 ηαζ 5.11, ακηίζημζπα. Πίλαθαο Οζ ζοβηεκηνχζεζξ ηαζ μζ πμζυηδηεξ ηςκ ακηζδναζηδνίςκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ PCR εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ AOB ιε ημοξ εηηζκδηέξ amo1f+gc amo2r. Αληηδξαζηήξηα Όγθνο Σειηθή ζπγθέληξσζε 10x KAPATaq Buffer (+ 15mM MgCl 2 ) 5 ιl 1x buffer, 1.5mM MgCl 2 dntps (10mM) 1 ιl 200ιΜ απυ ημ ηαεέκα amo1f+gc (20pmol/ιl) 1.25 ιl 0.5ιM amo2r (20pmol/ιl) 1.25 ιl 0.5ιM BSA (10ιg/ιl) 2 ιl 400ng/ιl KapaTaq Polymerase (5U/ιl) 0.2 ιl 1U/50ιl DNA d.d.h 2 O οκμθζηυξ υβημξ 1 ιl 38.3 ιl 50 ιl 337

338 Πίλαθαο Οζ εενιμηοηθμπμζδηζηέξ ζοκεήηεξ πναβιαημπμίδζδξ ηδξ PCR ακηίδναζδξ βζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ααηηδνίςκ ΑΟΒ ιε ημοξ εηηζκδηέξ amo1f+gc amo2r. Ανπζηή απμδζάηαλδ 94 o C 5 min Απμδζάηαλδ 94 o C 30 sec Τανζδμπμίδζδ 54 o C 30 sec 35 ηφηθμοξ Δπζιήηοκζδ 72 o C 1 min Σεθζηή επζιήηοκζδ 72 o C 10 min Ζιεθηξνθόξεζε ησλ PCR πξντόλησλ ζε πεθηή αγαξόδεο Σα επζιένμοξ πνμσυκηα PCR πμο πνμέηορακ δθεηηνμθμνήεδηακ ζε πδηηέξ αβανυγδξ 1,2%, χζηε κα εθεπεεί εάκ ημ ιέβεεμξ ηδξ αθθδθμοπίαξ πμο εκζζπφεδηε ήηακ ημ επζεοιδηυ. Ζιεθηξνθόξεζε ζε πεθηή αθξπιακίδεο κε βαζκίδσζε απνδηαηαθηηθώλ νπζηώλ (DGGE) Σα πνμσυκηα ηδξ PCR βζα ηα ΑΟΑ ηαζ ηα ΑΟΒ δθεηηνμθμνήεδηακ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ ζοβηέκηνςζδξ 8% (α/μ), ιε ααειίδςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ 35-52% ηαζ 55-70%, ακηίζημζπα. Γζα ηδκ δθεηηνμθυνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ αημθμοεήεδηε δ δζαδζηαζία πμο πενζβνάθεηαζ θεπημιενχξ ζηδκ πανάβναθμ , ημο Κεθαθαίμο 3. ημκ Πίκαηα 5.12., πανμοζζάγμκηαζ μζ υβημζ ηςκ δζαθοιάηςκ απμδζαηαηηζηχκ μοζίςκ ζοβηέκηνςζδξ 0% ηαζ 100% πμο ακαιίπεδηακ χζηε κα πνμηφρμοκ ηα επζιένμοξ δζαθφιαηα παιδθήξ ηαζ ορδθήξ ζοβηέκηνςζδξ ηεθζημφ υβημο 25 ml. ε ηάεε πενίπηςζδ, δθεηηνμθμνήεδηακ 3ιl PCR πνμσυκημξ αθμφ ακαιίπεδηακ ιε 7 ιl δζαθφιαημξ θυνηςζδξ. Ζ δθεηηνμθυνδζδ πναβιαημπμζήεδηε ζηα 75V βζα 960 min ηαζ δ εενιμηναζία νοειίζηδηε ζημοξ 60 C. 338

339 Πίλαθαο Παναζηεοή δζαθοιάηςκ ιε ορδθή ηαζ παιδθή ζοβηέκηνςζδ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ Οκάδα κηθξννξγαληζκώλ % πγθέληξσζε απνδηαηαθηηθώλ νπζηώλ Όγθνο δηαιύκαηνο 0% (ml) Όγθνο δηαιύκαηνο 100% (ml) Νηηξσδνπνηεηηθά Αξραία Νηηξσδνπνηεηηθά Βαθηήξηα ηαηηζηηθή αλάιπζε ησλ απνηειεζκάησλ ηεο κεζόδνπ DGGE Ζ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηδξ DGGE ακάθοζδξ βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ηςκ β.θ.., ζε ζοκάνηδζδ ιε ημ πνυκμ, ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ηαζ ηςκ ΑΜΟ ημο εδάθμοξ, πναβιαημπμζήεδηε υπςξ πενζβνάθεηαζ ζηδκ πανάβναθμ , ημο Κεθαθαίμο Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηελ αθζνλία ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο Πνμηεζιέκμο κα εηηζιδεεί δ επίδναζδ ηςκ οπυ ιεθέηδ β.θ.. ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ, πναβιαημπμζήεδηε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο (qpcr) ζηα δείβιαηα DNA πμο εηποθίζηδηακ απυ ηα δείβιαηα εδάθμοξ ηςκ επζιένμοξ ιεηαπεζνίζεςκ ζε πνυκμοξ 3, 30 ηαζ 90 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ. Γζα ημ θυβμ αοηυ πνδζζιμπμζδεήηακ ηα γεοβάνζα εηηζκδηχκ Arch-amoAF/Arch-amoAR (ΑΟΑ) ηαζ amoa1f/amoa2r (ΑΟΒ). Σα οθζηά ηαζ μζ ζοκεήηεξ πναβιαημπμίδζδξ ηςκ ακηζδνάζεςκ ηδξ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο, ηαεχξ ηαζ δ δζαδζηαζία ηαηαζηεοήξ ηςκ πνυηοπςκ ηαιποθχκ ακαθμνάξ, πενζβνάθμκηαζ θεπημιενχξ ζηδκ πανάβναθμ , ημο Κεθαθαίμο ηαηηζηηθή αλάιπζε ησλ απνηειεζκάησλ Οζ ανζειμί ηςκ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΑ ηαζ ηςκ ΑΟΒ ζηα δείβιαηα εδάθμοξ υπςξ πνμζδζμνίζηδηακ ιε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο 339

340 ιεηαηνάπδηακ ζε ανζειμφξ ακηζβνάθςκ βμκζδίςκ ακά ng DNA ηαζ ιε ηδ ιμνθή αοηή ακαθφεδηακ ζηαηζζηζηά. Ζ επίδναζδ ηςκ δζαθμνεηζηχκ β.θ.. αθθά ηαζ ημο πνυκμο ηαζ μζ πζεακέξ αθθδθεπζδνάζεζξ αοηχκ ηςκ παναβυκηςκ ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ υπςξ αοηή εηθνάγεηαζ απυ ημκ ανζειυ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa εηηζιήεδηε ιε Ακάθοζδ Παναθθαηηζηυηδηαξ Γομ Παναβυκηςκ (two-way ANOVA), εκχ δ ζφβηνζζδ ηςκ ιέζςκ υνςκ έβζκε ιε ημ Σεζη ηςκ Δθαπίζηςκ διακηζηχκ Γζαθμνχκ (LSD Test). Ζ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ πναβιαημπμζήεδηε ιε ημ ζηαηζζηζηυ παηέημ GenStat 11.v Δπίδξαζε ηνπ ethoxyquin ζηελ ιεηηνπξγία ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ κε ηελ ρξήζε reverse transcription PCR πξαγκαηηθνύ ρξόλνπ Ζ αθεμκία θεζημονβζηχκ βμκζδίςκ, υπςξ ημο amoa βζα ημοξ ΑΜΟ, δεκ ζπεηίγεηαζ απαναίηδηα ιε ημ ααειυ πναβιαημπμίδζδξ ηδξ ακηίζημζπδξ θεζημονβίαξ, δδθαδή ηδξ κζηνςδμπμίδζδξ (Prosser and Nicol, 2008). Πνμηεζιέκμο κα πνμζδζμνζζηεί δ επίδναζδ ημο ακηζμλεζδςηζημφ EQ, ζηδκ ζηακυηδηα κζηνμπμίδζδξ ηςκ ΑΜΟ, πνμζδζμνίζηδηε δ έηθναζδ ημο βμκζδίμο amoa ζε εδαθζηά δείβιαηα πμο είπακ δεπηεί πνμζεήηδ EQ ηαεχξ ηαζ ζε ακηίζημζπα δείβιαηα ημο ιάνηονα ζηζξ 3, 30 ηαζ 90 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, πναβιαημπμζήεδηε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο (qpcr) ζε cdna πμο πνμέηορε απυ ακηίζηνμθδ ιεηαβναθή ημο RNA πμο επηοθίζηδηε απυ ηα οπυ ιεθέηδ εδαθζηά δείβιαηα. Δμαγσγή RNA από ην έδαθνο Ζ ελαβςβή ημο RNA απυ ημ έδαθμξ έβζκε ιε ηδ πνήζδ ημο ειπμνζημφ ηζη RNA PowerSoil Total RNA Isolation Kit (MOBIO Laboratories, Inc. USA) ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή. Όπςξ ηαζ ζηδκ πενίπηςζδ ελαβςβήξ DNA απυ δείβιαηα εδάθμοξ, δ ανπή ηδξ ιεευδμο ααζίγεηαζ ζηδκ ηεπκζηή ηδξ άιεζδξ θφζδξ ηςκ ηοηηάνςκ, ιε ζοκδοαζιυ ιδπακζηχκ ηαζ πδιζηχκ ιεευδςκ. Παναηάης, πενζβνάθμκηαζ ακαθοηζηά ηα ζηάδζα πμο αημθμοεήεδηακ: 1. ε ζςθήκεξ πμο πενζείπακ ζθαζνίδζα θεπημφ δζαιενζζιμφ (beads), ιεηαθένεδηακ 2 g εδάθμοξ ηαζ πνμζηέεδηακ 2.5 ml νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ. Αημθμφεδζε ήπζα ακάδεοζδ ζε vortex. Καηυπζκ πνμζηέεδηακ 0.25 ml δζαθφιαημξ SDS (SR1) ηαζ αημθμφεδζε λακά ήπζα ακάδεοζδ ζε vortex. Σμ νοειζζηζηυ δζάθοια αμδεά ζηδ δζαζπμνά ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ ζςιαηζδίςκ ημο εδάθμοξ. Σμ δζάθοια SR1, πενζέπεζ εηηυξ απυ ημ SDS ηαζ άθθμοξ πανάβμκηεξ δζάνδλδξ ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ πμο 340

341 αμδεμφκ ζηδκ μθμηθδνςηζηή θφζδ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ ηδ δζάζπαζδ θζπανχκ μλέςκ ηαζ θζπζδίςκ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηζξ ηοηηανζηέξ ιειανάκεξ δζαθυνςκ μνβακζζιχκ. 2. ηδ ζοκέπεζα πνμζηέεδηακ 0.8 ml δζαθφιαημξ SR2 ηαζ μζ ζςθήκεξ ημπμεεηήεδηακ ζε ζοζηεοή ηαπείαξ ακάδεοζδξ (vortex with tube holder) ηαζ ακαηζκήεδηακ ζηδ ιέβζζηδ ηαπφηδηα βζα 5 min. Σμ δζάθοια SR2 αμδεά ζηδκ ηαηαηνήικζζδ μνβακζηχκ ηαζ ακυνβακςκ οθζηχκ υπςξ πμοιζηέξ εκχζεζξ, ηοηηανζηά εναφζιαηα ηαζ πνςηεΐκεξ, εκχ δ έκημκδ ακάδεοζδ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ μιμβεκμπμίδζδ ηαζ ηδ θφζδ ηςκ ηοηηάνςκ. 3. Αημθμφεςξ, ζε ηάεε ζςθήκα πνμζηέεδηακ 3.5 ml δζαθφιαημξ θαζκυθδξ: πθςνμθμνιίμο:ζζμαιοθζηήξ αθημυθδξ (25:24:1 o/o/o) (ph ) ηαζ πναβιαημπμζήεδηε ακάδεοζδ ιέπνζ κα ελαθακζζηεί δ θάζδ δζπθήξ ζημζαάδαξ πμο ζπδιαηίζηδηε. Καηυπζκ, μζ ζςθήκεξ επακαημπμεεηήεδηακ ζηδκ ζοζηεοή ηαπείαξ ακάδεοζδξ ηαζ ακαηζκήεδηακ ζηδ ιέβζζηδ ηαπφηδηα βζα 10 min. Σμ δζάθοια θαζκυθδξ :πθςνμθμνιίμο:ζζμαιοθζηήξ αθημυθδξ αμδεά ζηδ ιεβζζημπμίδζδ ηδξ απμηεθεζιαηζηυηδηαξ ηδξ πδιζηήξ θφζδξ ηςκ ηοηηάνςκ. Σα ηοηηανζηά ζοζηαηζηά παβζδεφμκηαζ ζηδ θάζδ ημο μνβακζημφ δζαθφηδ ηαζ μζ πνςηεΐκεξ ιεημοζζχκμκηαζ εθεοεενχκμκηαξ ηα κμοηθεσηά μλέα ζημ δζάθοια. Ζ έκημκδ ακάδεοζδ ζοιαάθθεζ ζηδ ιδπακζηή θφζδ. 4. Αημθμφεδζε θοβμηέκηνδζδ βζα 10 min ζηα 2500 x g, ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Καηά ηδκ θοβμηέκηνδζδ επζηοβπάκεηαζ δζαπςνζζιυξ θάζεςκ ζημ ιίβια. Ζ ηαηχηενδ μνβακζηή θάζδ πενζέπεζ πνςηεΐκεξ ηαζ ηοηηανζηά εναφζιαηα. Ζ εκδζάιεζδ θάζδ πενζέπεζ πμοιζηά ηαζ άθθα μνβακζηά ηαζ ακυνβακα οθζηά ηαζ δ ακχηενδ θάζδ πενζέπεζ ηα κμοηθεσηά μλέα. 5. ημ επυιεκμ αήια δ ακχηενδ οδαηζηή θάζδ ζοθθέπεδηε ηαζ ιεηαθένεδηε ζε ηαεανυ ζςθήκα υβημο 15 ml, ζημκ μπμίμ πνμζηέεδηακ 1.5 ml δζαθφιαημξ SR3 βζα ηδκ πεναζηένς ηαηαηνήικζζδ πνςηεσκχκ ηαζ ηοηηανζηχκ εναοζιάηςκ ηαζ πναβιαημπμζείηαζ ζφκημιδ ακάδεοζδ ηαζ επχαζδ ζημοξ 4:C βζα 10 min. Αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 4000 rpm βζα 10 min. 6. Σμ οπενηείιεκμ δζάθοια ζημ μπμίμ πενζέπμκηαζ ηα κμοηθεσηά μλέα ιεηαθένεδηε ζε κέμ ζςθήκα υβημο 15ml ηαζ ηαηυπζκ πνμζηέεδηακ 5ml δζαθφιαημξ ζζμπνμπακυθδξ 100% (SR4). Αημθμφεδζε ζφκημιδ ακαηίκδζδ, επχαζδ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 30 min ηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 4000rpm βζα 30min. 341

342 7. Ζ οπενηείιεκδ ζζμπνμπακυθδ απμιαηνφκεδηε ηαζ μ ζςθήκαξ ιε ημ ίγδια πμο πενζέπεζ ημπμεεηήεδηε ακάπμδα ζε θφθθμ απμννμθδηζημφ πανηζμφ, πνμηεζιέκμο κα απμιαηνοκεμφκ πθήνςξ ηα οπμθείιιαηα ζζμπνμπακυθδξ. 8. ηδ ζοκέπεζα ημ ίγδια επακαδζάθοεδηε ιε ηδκ πνμζεήηδ 1 ml ηαηάθθδθμο δζαθφιαημξ αθάηςκ (SR5) ηαζ αημθμφεδζε ακάδεοζδ ζε vortex. 9. Μεηά ηδκ επακαδζάθοζδ ημο ημ ίγδια ιεηαθένεδηε ζε εζδζηή ζηήθδ βζα ηδ ζοβηνάηδζδ ηαζ ημκ ηαεανζζιυ ημο RNA. Ζ ζηήθδ ημπμεεηήεδηε εκηυξ ζςθήκα υβημο 15 ml ιε ημ εθεφεενμ άηνμ ηδξ κα αζςνείηαζ. Πνζκ ηαζ ιεηά ηδ ιεηαθμνά ημο ζγήιαημξ, δ ζηήθδ λεπθφεδηε ιε 2 ml ηαζ 1 ml δζαθφιαημξ SR5, ακηίζημζπα, βζα ηδκ απμιάηνοκζδ ηοπυκ παναβυκηςκ επζιυθοκζδξ. 10. Ζ ζηήθδ ζηδκ μπμία ηαηαηναηήεδηε ημ RNA ιεηαθένεδηε ζε κέμ ζςθήκα ηαζ αημθμφεδζε πνμζεήηδ 1 ml ηαηάθθδθμο δζαθφιαημξ αθάηςκ (SR6) ιε ζημπυ ηδκ επζθεηηζηή έηθμοζδ ημο RNA. 11. Μεηά ηδκ παναθααή ημο ημ RNA ιεηαθένεδηε ζε ηαεανυ ζςθήκα (2.2 ml) ζημκ μπμίμ πνμζηέεδηε 1 ml δζαθφιαημξ ζζμπνμπακυθδξ 100%. Αημθμφεδζε ήπζα ακαηίκδζδ, επχαζδ ζημοξ -20:C βζα 10 min ηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηα x g βζα 15 min, ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. 12. Σμ οπενηείιεκμ απμννίθεδηε ηαζ ζςθήκαξ ημπμεεηήεδηε ακάπμδα ζε απμννμθδηζηυ πανηί βζα 10 min χζηε κα απμιαηνοκεμφκ πθήνςξ ηοπυκ οπμθείιιαηα ζζμπνμπακυθδξ. 13. Σέθμξ, ημ RNA επακαδζαθφεδηε ζε 100 ιl RNase/DNase-free ηαζ EDTA-free κενυ. Σα δείβιαηα RNA πμο πνμέηορακ δθεηηνμθμνήεδηακ βζα 5-10 min ζε πδηηέξ αβανυγδξ 1.5%, πμο παναζηεοάζηδηακ ζφιθςκα ιε ημκ ηνυπμ πμο πενζβνάθεηαζ ζηδκ πανάβναθμ , ημο Κεθαθαίμο 3 πνμηεζιέκμο κα εθεβπεεί άιεζα εακ έπεζ οπμζηεί οδνυθοζδ. Ζ πμζυηδηα ημο RNA ηςκ επζιένμοξ δεζβιάηςκ εθέβπεδηε ηαηυπζκ ηαζ θαζιαημθςημιεηνζηά (θυβμζ 260/280 ηαζ 260/230 nm) εκχ ηαοηυπνμκα πνμζδζμνίζηδηε δ ζοβηέκηνςζδ ημο RNA (ng ιl -1 RNA) ζημ ηάεε δείβια, ζε ζφζηδια NanoDrop (ND Spectrophotometer, V3.5). 342

343 Έιεγρνο παξνπζίαο DNA ζηα δείγκαηα RNA Πνμηεζιέκμο κα εθεβπεεί δ πανμοζία DNA ζηα επζιένμοξ δείβιαηα RNA πμο εηποθίζηδηακ απυ ηα δείβιαηα εδάθμοξ, πναβιαημπμζήεδηε PCR ακηίδναζδ βζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ, υπμο ςξ εηιαβείμ πνδζζιμπμζήεδηε 1ιl RNA. ηδκ πενίπηςζδ αοηή πνδζζιμπμζδεήηακ ηα γεοβάνζα εηηζκδηχκ ArchamoAF/Arch-amoAR (Francis et al., 2005) ηαζ amoa1f/amoa2r (Rotthauwe et al., 1997) βζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ, ακηίζημζπα (Πίκαηεξ 3.12, 3.13, Kεθάθαζμ 3). Σα οθζηά ηαζ μζ ζοκεήηεξ πναβιαημπμίδζδξ ηςκ ακηζδνάζεςκ ηδξ PCR θαίκμκηαζ ζημοξ πίκαηεξ πμο αημθμοεμφκ (AOΑ: Πίκαηεξ 5.13, 5.14 ηαζ ΑΟΒ: Πίκαηεξ 5.15, 5.16). Σα πνμσυκηα ηςκ ακηζδνάζεςκ PCR δθεηηνμθμνήεδηακ ηεθζηά ζε πδηηέξ αβανυγδξ 1.3% βζα ημκ έθεβπμ ηδξ πανμοζίαξ πνμσυκηςκ. Πίλαθαο οβηεκηνχζεζξ ηαζ πμζυηδηεξ ηςκ ακηζδναζηδνίςκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ PCR εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ απυ RNA πμο εηποθίζηδηε απυ δείβιαηα εδάθμοξ Αληηδξαζηήξηα Όγθνο Σειηθή ζπγθέληξσζε 10x KAPATaq Buffer (+ 15mM MgCl 2 ) 2.5 ιl 1x buffer, 1.5mM MgCl 2 dntps (10mM) 0.5 ιl 200ιΜ απυ ημ ηαεέκα Arch-amoAF (20pmol/ιl) 0.5 ιl 0.4ιM Arch-amoAR (20pmol/ιl) 0.5 ιl 0.4ιM BSA (10ιg/ιl) 1 ιl 400ng/ιl KapaTaq Polymerase (5U/ιl) 0.1 ιl 0.5U/25ιl RNA d.d.h 2 O οκμθζηυξ υβημξ 1 ιl 18.9 ιl 25 ιl 343

344 Πίλαθαο Οζ εενιμηοηθμπμζδηζηέξ ζοκεήηεξ ηδξ PCR βζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ απυ RNA πμο εηποθίζηδηε απυ δείβιαηα εδάθμοξ. Ανπζηή απμδζάηαλδ 95 o C 5 min Απμδζάηαλδ 95 o C 45 sec Τανζδμπμίδζδ 53 o C 1min 35 ηφηθμοξ Δπζιήηοκζδ 72 o C 1 min Σεθζηή επζιήηοκζδ 72 o C 15 min Πίλαθαο οβηεκηνχζεζξ ηαζ πμζυηδηεξ ηςκ ακηζδναζηδνίςκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ PCR εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟB απυ RNA πμο εηποθίζηδηε απυ δείβιαηα εδάθμοξ. Αληηδξαζηήξηα Όγθνο Σειηθή ζπγθέληξσζε 10x KAPATaq Buffer (+ 15mM MgCl 2 ) 2.5 ιl 1x buffer, 1.5mM MgCl 2 dntps (10mM) 0.5 ιl 200ιΜ απυ ημ ηαεέκα amoα1f (20pmol/ιl) 0.5 ιl 0.4ιM amoa2r (20pmol/ιl) 0.5 ιl 0.4ιM BSA (10ιg/ιl) 1 ιl 400ng/ιl KapaTaq Polymerase (5U/ιl) 0.1 ιl 0.5U/25ιl RNA d.d.h 2 O οκμθζηυξ υβημξ 1 ιl 18.9 ιl 25 ιl 344

345 Πίλαθαο Οζ εενιμηοηθμπμζδηζηέξ ζοκεήηεξ πναβιαημπμίδζδξ ηδξ PCR ακηίδναζδξ βζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ απυ RNA πμο εηποθίζηδηε απυ δείβιαηα εδάθμοξ. Ανπζηή απμδζάηαλδ 95 o C 5 min Απμδζάηαλδ 95 o C 45 sec Τανζδμπμίδζδ 56 o C 1min 30 ηφηθμοξ Δπζιήηοκζδ 72 o C 1 min Σεθζηή επζιήηοκζδ 72 o C 10 min Καζαξηζκόο ησλ δεηγκάησλ RNA Σα δείβιαηα RNA ζηα μπμία δζαπζζηχεδηε δ πανμοζία DNA, οπμαθήεδηακ ζε ακηίδναζδ ηαεανζζιμφ ιε πνήζδ ημο εκγφιμο DNase Η (Amplification Grade). Γζα ημ ζημπυ αοηυ, πνδζζιμπμζήεδηακ ανπζηά: 1 ιl 10x DNase I Reaction Buffer (Invitrogen ) 1 ιl DNase I, Amp Grade (1U/ ιl) (Invitrogen ) 0.5 ιl RnaseOut (Invitrogen ) 250ng RNA Καηάθθδθμξ υβημξ δζξ απμζηαβιέκμο ηαζ απμζηεζνςιέκμο H 2 O βζα ζοιπθήνςζδ ημο υβημο ακηίδναζδξ ζηα 10 ιl. Tα παναπάκς ακηζδναζηήνζα ακαιίπεδηακ ζημοξ πνμηεζκυιεκμοξ ακά ακηίδναζδ υβημοξ ηαζ ημ δείβια επςάζηδηε ζημοξ 37:C βζα 1 χνα. Αημθμφεδζε πνμζεήηδ 1ιl EDTA 25mM, ήπζα ακάδεοζδ ηαζ επχαζδ ημο δείβιαημξ ζημοξ 65 :C βζα 10min βζα απεκενβμπμίδζδ ημο εκγφιμο. Καηυπζκ ημ ζφκμθμ ηςκ δεζβιάηςκ οπμαθήεδηε εη κέμο ζε ακηίδναζδ PCR βζα ημκ έθεβπμ ηδξ πανμοζίαξ DNA (AOΑ: Πίκαηεξ 5.13, 5.14 ηαζ ΑΟΒ: Πίκαηεξ 5.15, 5.16). 345

346 ύλζεζε ζπκπιεξσκαηηθνύ DNA (cdna) από RNA παξνπζία ηεο αληίζηξνθεο κεηαγξαθάζεο Μεηά ηδκ ελαβςβή ηαζ ημκ ηαεανζζιυ ημο RNA, αημθμφεδζε ζφκεεζδ ζοιπθδνςιαηζημφ DNA (cdna) ιε ηδ ιέεμδμ ηδξ PCR ηδξ ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθάζδξ (Reverse Transcription PCR). Γζα ημ ζημπυ αοηυ πνδζζιμπμζήεδηε ημ έκγοιμ SuperScript II Reverse Transcriptase ηαζ αημθμοεήεδηε ημ πνςηυημθθμ πμο πνμηείκεηαζ απυ ημοξ ηαηαζηεοαζηέξ (Invitrogen ). Μεθεηήεδηακ ζοκμθζηά δφμ δζαθμνεηζηέξ πνμζεββίζεζξ βζα ηδκ ζφκεεζδ cdna: (Α) ιε πνήζδ ηοπαίςκ ελαιενχκ (random hexamers) ηαζ (Β) ιε πνήζδ ελεζδζηεοιέκμο ςξ πνμξ ημ βμκίδζμ-ζηυπμ εηηζκδηή (gene specific reverse primer), Arch-amoAR ηαζ amoa2r, βζα ηα ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ, ακηίζημζπα. Α. ύλζεζε cdna κε ρξήζε ηπραίσλ εμακεξώλ Υνδζζιμπμζήεδηε ιίβια ακηζδναζηδνίςκ ζοκμθζημφ υβημο 12 ιl, πμο πενζείπε: 9.5 ιl ( 250 ng) RNA 1.5 ιl Random Hexamers (50ιΜ, Takara) 1.0 ιl dntps (10mM) ηδκ πενίπηςζδ πμο μ υβημξ ημο RNA ήηακ ιζηνυηενμξ απυ 9.5 ιl, μ ζοκμθζηυξ υβημξ ηδξ ακηίδναζδξ ζοιπθδνχκμκηακ ζηα 12 ιl, ιε δζξ απμζηαβιέκμ ηαζ απμζηεζνςιέκμ Ζ 2 Ο. Μεηά ηδκ ακάιζλδ ηςκ παναπάκς ζοζηαηζηχκ, ηα δείβιαηα επςάζηδηακ ζημοξ 65:C βζα 5 min, χζηε κα επζηεοπεεί απμδζάηαλδ ημο RNA ηαζ ιεηαθένεδηακ ζε πάβμ, υπμο αημθμφεδζε πνμζεήηδ: 4 ιl νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ 5x First Strand Buffer 2 ιl DTT 0.1M 1 ιl RNaseOUT (40U/ ιl) ηδ ζοκέπεζα ηαζ αθμφ πνμδβήεδηε ήπζα ακάδεοζδ ηςκ ζοζηαηζηχκ ζε ηάεε δείβια, αημθμφεδζε επχαζδ ζημοξ 25:C βζα 2 min. Αιέζςξ ιεηά ζε ηάεε δείβια πνμζηέεδηε 1 ιl SuperScript II (200U/ ιl) ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθάζδξ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ηαζ δ επχαζδ ζοκεπίζηδηε ζημοξ 42:C βζα 50 min. Σα έκγοια αδνακμπμζήεδηακ ιε επχαζδ βζα 15min ζημοξ 70:C ηαζ ημ cdna πμο παναθήθεδηε ζηδκ ζοκέπεζα απμεδηεφηδηε ζημοξ -80:C ιέπνζ ηδκ πεναζηένς ακάθοζδ ημο ιε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο. 346

347 Β. ύλζεζε cdna κε ρξήζε εμεηδηθεπκέλνπ εθθηλεηή Όπςξ ηαζ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ηοπαίςκ ελαιενχκ, πνδζζιμπμζήεδηε ιίβια ζοζηαηζηχκ ζοκμθζημφ υβημο 12 ιl, πμο πενζείπε: 10 ιl ( 250ng) RNA 1.0 ιl Arch-amoAR (2 pmol ιl -1 ) βζα ηα ΑΟΑ ή 1.0 ιl amoa2r (2 pmol ιl -1 ) βζα ηα ΑΟΒ, (HPLC grade) 1.0 ιl dntps (10mM) ηδκ πενίπηςζδ πμο μ υβημξ ημο RNA ήηακ ιζηνυηενμξ απυ 10 ιl, μ ζοκμθζηυξ υβημξ ηδξ ακηίδναζδξ ζοιπθδνχκμκηακ ζηα 12 ιl ιε δζξ απμζηαβιέκμ ηαζ απμζηεζνςιέκμ Ζ 2 Ο. Μεηά ηδκ ακάιζλδ ηςκ παναπάκς ζοζηαηζηχκ, ηα δείβιαηα επςάζηδηακ ζημοξ 65:C βζα 5min χζηε κα επζηεοπεεί απμδζάηαλδ ημο RNA ηαζ αημθμφεςξ ιεηαθένεδηακ ζε πάβμ υπμο ηαζ αημθμφεδζε πνμζεήηδ: 4 ιl νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ 5x First Strand Buffer 2 ιl DTT 0.1M 1 ιl RNaseOUT (40U/ ιl) ηδ ζοκέπεζα ηαζ αθμφ πνμδβήεδηε ήπζα ακάδεοζδ, ηάεε δείβια, επςάζηδηε ζημοξ 42:C βζα 2 min. ε ηάεε δείβια αημθμφεςξ πνμζηέεδηε 1 ιl SuperScript II (200U/ ιl) ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθάζδξ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ηαζ δ επχαζδ ζοκεπίζηδηε ζημοξ 42:C βζα 50 min. Με ηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ επχαζδξ, ηα έκγοια αδνακμπμζήεδηακ ιε επχαζδ βζα 15 min ζημοξ 70:C ηαζ ημ cdna πμο παναθήθεδηε, απμεδηεφηδηε ζημοξ -80:C ιέπνζ κα ακαθοεεί ιε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο. Αληίδξαζε PCR πξαγκαηηθνύ ρξόλνπ κε εθκαγείν cdna Σμ παναβυιεκμ cdna, απυ ηζξ δφμ δζαθμνεηζηέξ πνμζεββίζεζξ πνδζζιμπμζήεδηε πεναζηένς βζα ηδκ πμζμηζημπμίδζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ ιε ηδ ιέεμδμ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο. Γζα ημ ζημπυ αοηυ πνδζζιμπμζήεδηακ ηα γεοβάνζα εηηζκδηχκ Arch-amoAF/Arch-amoAR ηαζ amoa1f/amoa2r βζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ, ακηίζημζπα. Σα οθζηά ηαζ μζ ζοκεήηεξ πναβιαημπμίδζδξ ηςκ ακηζδνάζεςκ ηδξ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ηαεχξ ηαζ δ δζαδζηαζία ηαηαζηεοήξ ηςκ πνυηοπςκ ηαιποθχκ ακαθμνάξ, πενζβνάθμκηαζ θεπημιενχξ ζηδκ πανάβναθμ , ημο Κεθαθαίμο 3. Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ηαηάθθδθςκ ηαιποθχκ ακαθμνάξ ζηδκ πνμηεζιέκδ πενίπηςζδ μζ αναζχζεζξ ηςκ 347

348 πθαζιζδίςκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ πνμήθεακ απυ πνμσυκ PCR εκίζποζδξ ημο cdna ηςκ πενζααθθμκηζηχκ δεζβιάηςκ. Οζ ανζειμί ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΑ ηαζ ηςκ ΑΟΒ πμο πνμέηορακ απυ ηδκ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ιεηαηνάπδηακ ζε ανζειμφξ ιεηαβνάθςκ βμκζδίςκ ακά ng RNA ηαζ πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ πμο πναβιαημπμζήεδηε υπςξ πενζβνάθεηαζ ζηδκ πανάβναθμ , ημο πανυκημξ ηεθαθαίμο Απνηειέζκαηα Έιεγρνο αμηνπηζηίαο ησλ κεζόδσλ αλάιπζεο θαη πξνζδηνξηζκνύ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ηα πθαίζζα ηδξ αλζμθυβδζδξ ηδξ αλζμπζζηίαξ ηςκ ιεευδςκ ακάθοζδξ πμο ακαπηφπεδηακ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ οπυ ιεθέηδ β.θ.. ηαζ ηςκ πνμσυκηςκ ιεηααμθζζιμφ ημοξ ζημ έδαθμξ, εηηζιήεδηακ ανπζηά δ επίδναζδ ημο οπμζηνχιαημξ ιε ηδκ ηαηαζηεοή ηαηάθθδθςκ πνυηοπςκ ηαιποθχκ, δ βναιιζηυηδηα ημο ακζπκεοηή ηαζ ηα υνζα ακίπκεοζδξ (LOD) ηαζ πμζμηζημφ πνμζδζμνζζιμφ (LOQ). Σα απμηεθέζιαηα ηςκ παναπάκς ακαθφζεςκ πανμοζζάγμκηαζ ζημκ Πίκαηα Οζ ελζζχζεζξ ηςκ πνυηοπςκ ηαιποθχκ ακαθμνάξ ζπδιαηίζηδηακ ιε ηδ αμήεεζα δζαθοιάηςκ ηςκ πνυηοπςκ μοζζχκ ζε εηποθίζιαηα ημο εδαθζημφ οπμζηνχιαημξ ακηί ζε ηαεανυ μνβακζηυ δζαθφηδ ζε ζοβηεκηνχζεζξ 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50 ιg ml -1. Ζ ελίζςζδ ηάεε πνυηοπδξ ηαιπφθδξ απμηεθεί ημκ ιέζμ υνμ 3 δζαθμνεηζηχκ ηαιποθχκ πμο ηαηαζηεοάζηδηακ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ακάθοζδξ ηςκ εδαθζηχκ δεζβιάηςκ. Οζ ηζιέξ ημο ζοκηεθεζηή ζοιιεηααμθήξ R 2, ζε υθεξ ηζξ πενζπηχζεζξ ηοιάκεδηακ απυ έςξ 1.000, θακενχκμκηαξ ηδκ φπανλδ εοεφβναιιδξ ζοζπέηζζδξ ιεηαλφ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ β.θ. ηαζ ηδξ πνςιαημβναθζηήξ ακηαπυηνζζδξ (ειααδυκ ημνοθήξ: area), βζα ημ εφνμξ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ πμο ιεθεηήεδηε. Σα υνζα ακίπκεοζδξ ηοιάκεδηακ απυ έςξ ιg ml -1, εκχ ςξ υνζμ πμζμηζημφ πνμζδζμνζζιμφ μνίζηδηε δ ηζιή 0.05 ιg ml -1, πμο απμηεθεί ηδ παιδθυηενδ ζοβηέκηνςζδ πμο πνμζδζμνίζηδηε πμζμηζηά. 348

349 Πίνακασ Όριο ανίχνευςθσ (LOD), όριο ποςοτικοφ προςδιοριςμοφ (LOQ), εξίςωςθ πρότυπθσ καμπφλθσ και γραμμικότθτα τθσ πρότυπθσ καμπφλθσ, ωσ αποτζλεςμα 8 επιπζδων ςυγκζντρωςθσ των γ.φ. και των προϊόντων μεταβολιςμοφ τουσ, εφρουσ από 0.05 ζωσ 50 μg ml -1 (3 επαναλιψεισ για κάκε επίπεδο). Γεσξγηθό Φάξκαθν LOD (κg ml -1 ) LOQ (κg ml -1 ) Δμίζσζε Πξόηππεο Κακπύιεο πληειεζηήο πκκεηαβνιήο (R 2 ) Δύξνο πγθεληξώζεσλ (κg ml -1 ) ΣΒΕ y=99.859x-8, ΗΜΕ y=139.18x ΟΡΡ y=59.435x+29, DPA y=144.92x EQ y=43.199x QI y=59.4x EQNL y=21.843x ηδ ζοκέπεζα, πνμζδζμνίζηδηακ ημ πμζμζηυ ακάηηδζδξ ηαζ δ ζπεηζηή ηοπζηή απυηθζζδ (Relative Standard Deviation: RSD) βζα ηάεε ιέεμδμ λεπςνζζηά ηαζ ηα απμηεθέζιαηα πανμοζζάγμκηαζ ζημκ Πίκαηα Σα πμζμζηά ακάηηδζδξ ηςκ βεςνβζηχκ θανιάηςκ ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημοξ, ηοιάκεδηακ απυ 69.7% (EQNL, 50 mg kg -1 ) έςξ 107,0 % (QI, 1 mg kg -1 ). Ζ ζπεηζηή ηοπζηή απυηθζζδ ηοιάκεδηε απυ 1.13% (ΗΜΕ, 1 mg kg -1 ) έςξ 18.0 (EQNL, 1 mg kg -1 ) ηαζ ζε ηάεε πενίπηςζδ ήηακ ιζηνυηενδ απυ 20%, βεβμκυξ πμο ηαηαδεζηκφεζ ηδκ ζηακμπμζδηζηή επακαθδρζιυηδηα ηςκ ιεευδςκ πνμζδζμνζζιμφ. Σέθμξ, δ εοαζζεδζία ηδξ ηάεε ακαθοηζηήξ ιεευδμο εηθναζιέκδ ςξ ηζιή ηδξ ιέζδξ ακάηηδζδξ ηοιάκεδηε απυ ζηδκ πενίπηςζδ ημο ΣΒΕ έςξ ζηδκ πενίπηςζδ ηδξ QI. 349

350 Πίνακασ Οι ανακτιςεισ των γ.φ.. ςτο ζδαφοσ ςε 3 διαφορετικά επίπεδα επιβάρυνςθσ, θ ςχετικι τυπικι απόκλιςθ και θ ευαιςκθςία τθσ κάκε μεκόδου. Η τιμι τθσ ποςοςτιαίασ ανάκτθςθσ ςε κάκε επίπεδο επιβάρυνςθσ αποτελεί τον μζςο όρο 3 επαναλιψεων. Γεωργικό Φάρμακο ή Μεταβολίτησ Επίπεδο φόρτιςησ (mg kg -1 ) Ανάκτηςη (%) (Μζςη Τιμή, n=3) Τυπική Απόκλιςη Σχετική Τυπική Απόκλιςη (%) Ευαιςθηςία (S) TBZ IMZ OPP DPA EQ QI EQNL Ζ πνξεία απνδόκεζεο ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζην έδαθνο Ζ πνξεία απνδόκεζεο ησλ ΣΒΕ, ΗΜΕ, ΟΡΡ θαη DPA ζην έδαθνο Σα πνυηοπα απμδυιδζδξ ηςκ ΣΒΕ, ΗΜΕ, ΟΡΡ ηαζ DPA ζημ έδαθμξ πανμοζζάγμκηαζ ζηα Γζαβνάιιαηα 5.1. έςξ 5.4. Ζ πμνεία απμδυιδζδξ ημο ακηζμλεζδςηζημφ EQ πανμοζζάγεηαζ ακαθοηζηά ζηδκ επυιεκδ πανάβναθμ (Βθέπε ). Σα ιοηδημηηυκα ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ πανμοζζάζακ ζδζαίηενα ορδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα ζημ έδαθμξ. Πενζζζυηενμ έιιμκμ ειθακίγεηαζ ημ ΗΜΕ ιε πμζμζηυ ίζμ ιε 68,6% ηδξ ανπζηήξ ζοβηέκηνςζδξ κα ακζπκεφεηαζ ζημ έδαθμξ ιεηά απυ δζάζηδια 100 διενχκ (Γζαβνάιιαηα 5.1 ηαζ 5.2). Ακηίεεηα, δ απμδυιδζδ ηςκ 350

351 ΟΡΡ ηαζ DPA ζημ έδαθμξ ήηακ ηαπεία, ιε ημ ΟΡΡ κα είκαζ ημ θζβυηενμ οπμθεζιιαηζηυ αημθμοεμφιεκμ απυ ημ DPA. Ζ ηαπφηαηδ ιείςζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ ΟΡΡ ηαζ DPA ζημ έδαθμξ ηαηά ηζξ πνχηεξ 4 διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημοξ ζημ έδαθμξ (Γζαβνάιιαηα 5.3 ηαζ 5.4) ιαξ μδήβδζακ κα ιεθεηήζμοιε ζε κέμ πείναια ζημ ίδζμ έδαθμξ ηδκ απμδυιδζδ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ β.θ.. ηαηά ηζξ πνχηεξ 24 χνεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημοξ ζημ έδαθμξ. Σα απμηεθέζιαηα απυ αοηυ ημ πείναια πανμοζζάγμκηαζ ζηα Γζαβνάιιαηα 5.5 ηαζ 5.6. Έηζζ βζα ημ ΟΡΡ παναηδνήεδηε ιζα ηαπφηαηδ ιείςζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο ζημ έδαθμξ (80%) ηαηά ηζξ πνχηεξ 5 χνεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημο ζημ έδαθμξ (Γζάβναιια 5.5) ζε ακηίεεζδ ιε ημ DPA βζα ημ μπμίμ παναηδνήεδηε απμδυιδζδ ιυκμ ημο 20% ηδξ ανπζηήξ ζοβηέκηνςζδξ ζε δζάζηδια 24 ςνχκ (Γζάβναιια 5.6). Διάγραμμα 5.1. Πορεία αποδόμθςθσ του μυκθτοκτόνου thiabendazole ςτο ζδαφοσ. Διάγραμμα 5.2. Πορεία αποδόμθςθσ του μυκθτοκτόνου imazalil ςτο ζδαφοσ. 351

352 Διάγραμμα 5.3. Πορεία αποδόμθςθσ του μυκθτοκτόνου ortho-phenyl phenol ςτο ζδαφοσ. Διάγραμμα 5.4. Πορεία αποδόμθςθσ του αντιοξειδωτικοφ diphenylamine ςτο ζδαφοσ. 352

353 Διάγραμμα 5.5. Πορεία αποδόμθςθσ του μυκθτοκτόνου ortho-phenyl phenol ςτισ 24 πρϊτεσ ϊρεσ μετά τθν εφαρμογι του ςτο ζδαφοσ. Διάγραμμα 5.6. Πορεία αποδόμθςθσ του αντιοξειδωτικοφ diphenylamine ςτισ 24 πρϊτεσ ϊρεσ μετά τθν εφαρμογι του ςτο ζδαφοσ. 353

354 Γφμ δζαθμνεηζηά ιμκηέθα ηζκδηζηήξ, ημ ιμκηέθμ ηζκδηζηήξ πνχηδξ ηάλδξ ηαζ ημ δζθαζζηυ ιμκηέθμ Ζockey-Stick, αλζμθμβήεδηακ βζα κα πενζβνάρμοκ ηδκ πμνεία απμδυιδζδξ ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ. O ααειυξ πνμζανιμβήξ ηςκ πεζναιαηζηχκ δεδμιέκςκ ζηα ηζκδηζηά ιμκηέθα πμο ιεθεηήεδηακ, αλζμθμβήεδηε ιε εηηίιδζδ ημο ζθάθιαημξ ηδξ δμηζιήξ (π 2 ) ηαζ ημο ζοκηεθεζηή παθζκδνυιδζδξ (r 2 ). Πανάθθδθα πνμζδζμνίζηδηε μ πνυκμξ διζγςήξ DT 50. Σα δεδμιέκα ηδξ ακάθοζδξ πανμοζζάγμκηαζ ζημκ Πίκαηα Ζ πμνεία απμδυιδζδξ υθςκ ηςκ β.θ.. πμο ιεθεηήεδηακ πενζβνάθδηε ζηακμπμζδηζηά απυ ημ δζθαζζηυ ιμκηέθμ Hockey-Stick (x 2 < 15, r 2 > 0.75). Ζ πμνεία απμδυιδζδξ ηςκ IMZ ηαζ ΟΡΡ ζημ έδαθμξ πενζβνάθδηε ελίζμο ζηακμπμζδηζηά ηαζ απυ ημ ιμκηέθμ ηζκδηζηήξ πνχηδξ ηάλδξ. Χζηυζμ, ιζηνυηενεξ ηζιέξ ημο ζθάθιαημξ ηδξ δμηζιήξ (π 2 ) ηαζ ιεβαθφηενεξ ηζιέξ ημο ζοκηεθεζηή παθζκδνυιδζδξ (r 2 ), βζα ηα δφμ αοηά β.θ.. ηαηαβνάθδηακ ζηδκ πενίπηςζδ εθανιμβήξ ημο ιμκηέθμο Hockey- Stick. Ακηίεεηα, ημ ιμκηέθμ ηζκδηζηήξ πνχηδξ ηάλδξ απέηοπε κα πενζβνάρεζ ιε αηνίαεζα ηδκ πμνεία απμδυιδζδξ ηςκ ΣΒΕ ηαζ DPA ηαεχξ ζε ηάεε πενίπηςζδ μζ ηζιέξ ημο π 2 ήηακ >>15 (Πίκαηαξ 5.19). Γεκζηά, υπςξ πνμηφπηεζ ηαζ απυ ηα δζαβνάιιαηα απμδυιδζδξ, δ απμδυιδζδ ηςκ ΟΡΡ ηαζ DPA ζημ έδαθμξ ήηακ ηαπεία, ιε πνυκμοξ διζγςήξ 0.6 διένεξ βζα ημ ΟΡΡ ηαζ 1.3 διένεξ βζα ημ DPA. Ακηίεεηα, ηα ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ πανμοζίαζακ ζδζαίηενα ορδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα ζημ έδαθμξ ιε DT 50s 47.8 ηαζ διένεξ ακηίζημζπα (Πίκαηαξ 5.19). 354

355 Πίνακασ Ο χρόνοσ θμιηωισ (DT 50 ), ο ρυκμόσ αποδόμθςθσ k, ο ςυντελεςτισ παλινδρόμθςθσ r 2 και το ςφάλμα χ 2 όπωσ υπολογίςτθκαν για τα γ.φ.. που μελετικθκαν χρθςιμοποιϊντασ τα μοντζλα κινθτικισ πρϊτθσ τάξθσ και Hockey-Stick. Μοντζλο Κινητικήσ πρώτησ τάξησ Γεσξγηθό r 2 ρ 2 DT 50 k Φάξκαθν (εκέξεο) ΣΒΕ 0,481 70, ,007 ΗΜΕ 0,76 2,4 138,6 0,005 ΟΡΡ ,1 0,6 1,102 DPA 0,977 22,0 1,5 0,468 EQ+Met 0,978 38,1 2,2 0,309 Μνληέιν Hockey Stick Γεσξγηθό r 2 ρ 2 DT 50 t b k 1 k 2 Φάξκαθν ΣΒΕ 0,896 7,3 47,0 3,7 0,141 0,004 ΗΜΕ 0,785 1,7 150,8 10,0 0,013 0,004 ΟΡΡ 1,000 0,4 0,6 4,6 1,110 0,020 DPA 0,998 5,5 1,3 4,2 0,522 0,029 EQ+Met 0,992 5,5 2,2 9,9 0,312 0, Πνξεία απνδόκεζεο θαη κεηαβνιηζκόο ηνπ ethoxyquin ζην έδαθνο Καηά ηδκ πνμζπάεεζα ακάπηολδξ ηδξ ακαθοηζηήξ ιεευδμο βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο ακηζμλεζδςηζημφ EQ ζηα εδαθζηά δείβιαηα, παναηδνήεδηε ηαπφηαηδ ιεηαηνμπή ημο ιδηνζημφ ιμνίμο ζε QI ηαζ EQNL (Δζηυκα 5.11). Εικόνα HPLC χρωματογράφθμα του ethoxyquin και των προϊόντων μεταβολιςμοφ του quinone imine και 2,4 dimethyl-6-ethoxyquinoline (α) μίγμα πρότυπων διαλυμάτων (κόκκινθ γραμμι) και (β) εκχφλιςμα εδάφουσ επιβαρυμζνου με ethoxyquin (μπλζ γραμμι). 355

356 Ακαθοηζηά μζ ζοβηεκηνχζεζξ ημο EQ ηαζ ηςκ επζιένμοξ ιεηααμθζηχκ ημο πανμοζζάγμκηαζ ζημ Γζάβναιια 5.8. ημ πνυκμ ιδδέκ, δδθαδή αιέζςξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ημο ΔQ παναηδνήεδηε άιεζδ ιεηαηνμπή ημο EQ πνμξ QI ηαζ EQNL. Σμ QI απμηέθεζε ημ ηφνζμ ιεηααμθζηυ πνμσυκ (22.8 % ηδξ ζοκμθζηήξ ζοβηέκηνςζδξ πμο ακζπκεφεδηε ζημ έδαθμξ ζε πνυκμ 0) ηαζ αημθμφεδζε ημ EQNL (2.2% επί ηδξ ζοκμθζηήξ ζοβηέκηνςζδξ). Σα EQ ηαζ QI έδεζλακ παιδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα ηαζ δεκ ακζκπεφεδηακ ζημ έδαθμξ ζηζξ 4 ηαζ 7 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ ακηίζημζπα. Ακηίεεηα, μ έηενμξ ιεηααμθίηδξ, EQNL, πανέιεζκε ζημ έδαθμξ ζε παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ηαευθδ ηδκ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ (Γζάβναιια 5.8). Ζ απμδυιδζδ ηςκ ζοκμθζηχκ οπμθεζιιάηςκ ημο EQ (ΔQ+QI+EQNL) ζε ζοκάνηδζδ ιε ημκ πνυκμ πενζβνάθδηε ζηακμπμζδηίηα ιυκμ απυ ημ δζθαζζηυ ιμκηέθμ ηζκδηζηήξ Hockey-Stick (Πίκαηαξ 5.19) ιε ηζιή DT 50 = 2.2 διένεξ. Διάγραμμα 5.8. Η πορεία αποδόμθςθσ, QI και EQNL, ςτο ζδαφοσ. Κάκε τιμι είναι ο μζςοσ όροσ τριϊν επαναλιψεων + τθν τυπικι απόκλιςθ. Ζ ηαπφηαηδ απμδυιδζδ ηςκ ζοκμθζηχκ οπμθεζιιάηςκ ημο ΔQ ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημο πμο παναηδνήεδηε ζημ ανπζηυ πείναια ηαηά ηζξ πνχηεξ 4 διένεξ ιαξ μδήβδζε ζηδκ πναβιαημπμίδζδ εκυξ αηυθμοεμο πεζνάιαημξ ζημ ίδζμ έδαθμξ χζηε, υπςξ ηαζ βζα ηα OPP ηαζ DPA, κα ιεθεηδεεί δ απμδυιδζδ ηαζ μ ιεηααμθζζιυξ ημο ΔQ ηαηά ηζξ πνχηεξ 24 χνεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή (Γζάβναιια 5.9). Καζ πάθζ παναηδνήεδηε ηαπφηαηδ ιεηαηνμπή ημο ΔQ ζε QI αιέζςξ ιεηά ηδκ εθανιμβή (πνυκμξ 0). Αημθμφεςξ παναηδνήεδηε ιζα ηαπφηαηδ ιείςζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο 356

357 EQ πμο ζοκμδεφηδηε απυ πανάθθδθδ αφλδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηδξ QI ηαηά ηζξ πνχηεξ 8 χνεξ υπμο ηαζ παναηδνήεδηε δ ιέβζζηδ ζοβηέκηνςζδ ημο QI (16.1 ιg g -1 εδάθμοξ). Ακηίεεηα, ημ EQNL ζπδιαηίζηδηε ζημ έδαθμξ ζε παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ μζ μπμίεξ πανέιεζκακ ζηαεενέξ ηαευθδ ηδκ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ (24 χνεξ). Διάγραμμα 5.9. Η αποδόμθςθ του EQ και των κφριων μεταβολικϊν προϊόντων του, QI και EQNL, ςτο ζδαφοσ κατά τισ πρϊτεσ 24 ϊρεσ μετά τθν εφαρμογι του. Κάκε τιμι είναι ο μζςοσ όροσ τριϊν επαναλιψεων + τθν τυπικι απόκλιςθ Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζην κέγεζνο θαη ηε ζύζηαζε ηεο κηθξνβηαθήο θνηλόηεηαο ηνπ εδάθνπο. ηζξ ακαθφζεζξ ηςκ εδαθζηχκ δεζβιάηςκ ιε ηδκ ιέεμδμ PLFAs ακζπκεφεδηακ ζηαεενά ζε υθα ηα δείβιαηα ηαζ ζε ζπεηζηή αθεμκία > 0.5%, 20 θζπανά μλέα ηςκ θςζθμθζπζδζχκ ιζηνμαζαηήξ πνμέθεοζδξ. Αοηά ήηακ ηα παναηάης: (1) ηα 15:0, a-15:0, i-15:0, i-16:0, 17:0, i-17:0 πμο απακημφκ ζηα εεηζηά ηαηά Gram ααηηήνζα, (2) ηα 16:1ς7, cy17:0, cy19:0 πμο απακημφκ ζηα ανκδηζηά ηαηά Gram ααηηήνζα, (3) ημ 16:0 πμο απμηεθεί βεκζηυ ιζηνμαζαηή δείηηδ ηαζ απακηά ζηζξ ηοηηανζηέξ ιειανάκεξ ηυζμ ααηηδνίςκ υζμ ηαζ ιοηήηςκ, (4) ηα 18:1ς9cis ηαζ 18:1ς9trans πμο απακημφκ ηονίςξ ζε εηενυηνμθα ανκδηζηά ηαηά Gram ααηηήνζα (π.π. Pseudomonas) ηαζ ζημοξ ιφηδηεξ, 357

358 (5) ημ 18:2ς6,9 πμο απακηά ζημοξ ιφηδηεξ, (6) ηα 10Me16:0, 10Me17:0 ηαζ 10Me18:0 πμο απακημφκ ζηα αηηζκμααηηήνζα, (7) ηα 23:0 ηαζ 24:0 πμο απακημφκ ζε εοηανοςηζημφξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ηαζ (8) ηα 14:0, 18:0 ηαζ 20:0 πμο δεκ ζοκδέμκηαζ ιε ηάπμζα ζοβηεηνζιέκδ μιάδα ιζηνμμνβακζζιχκ (Findlay, 2004). Απυ ηδκ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ (two-way ANOVA, LSD Test) πνμέηορε υηζ δ επέιααζδ ιε ηα β.θ.. ηαζ μ πνυκμξ, ςξ ηφνζμζ πανάβμκηεξ, πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p<0.001) ζημ ιέβεεμξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ. ηδκ πενίπηςζδ ηςκ β.θ., δ επέιααζδ ιε ηα ΟΡΡ ηαζ DPA, μδήβδζε ζε ζδιακηζηή ιείςζδ (p<0.001) ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ PLFAs ζημ έδαθμξ ζε ζπέζδ ιε ημ ιάνηονα, εκχ ζηδκ πενίπηςζδ ημο πνυκμο, παναηδνήεδηε ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ PLFAs ζημ έδαθμξ (Πίκαηαξ 5.20). Δπίζδξ παναηδνήεδηακ ζδιακηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ (p<0.001) πςνίξ ςζηυζμ κα ιπμνεί κα δζαηνζεεί ηάπμζμ λεηάεανμ πνυηοπμ επίδναζδξ ηςκ β.θ.. ζημ πνυκμ. Δλαίνεζδ απμηέθεζακ δ πανμδζηή ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ PLFAs πμο παναηδνήεδηε ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ επέιααζδ ιε ΟΡΡ ηαζ ζοθθέπηδηακ ζηζξ 30 ηαζ 60 διένεξ (Γζάβναιια 5.10). Πίνακασ Επίδραςθ των γ.φ.. και του χρόνου επϊαςθσ ωσ κφριοι παράγοντεσ - ςτθ ςυνολικι ςυγκζντρωςθ των PLFAs (nanomoles g -1 εδάφουσ) που εκχυλίςτθκαν από τα δείγματα εδάφουσ. Διαφορετικά γράμματα υποδθλϊνουν ςτατιςτικά ςθμαντικζσ διαφορζσ μεταξφ των διαφορετικϊν μεταχειρίςεων. πγθέληξσζε PLFAs (nmol g - 1 soil) Δπίδξαζε Γεσξγηθνύ Φαξκάθνπ Δπίδξαζε Υξόλνπ (εκέξεο) (p<0.001) (p<0.001) Control 51.91A A TBZ 50.00AB B IMZ 47.03AB BC OPP 45.86B D DPA 44.63Β CD EQ 47.18AB 358

359 Διάγραμμα υγκζντρωςθ των PLFAs (nanomoles g -1 εδάφουσ) ςτα δείγματα εδάφουσ που δζχτθκαν επεμβάςεισ με διαφορετικά γ.φ.. και ςε δείγματα του μάρτυρα (Control). Κάκε τιμι αντιπροςωπεφει το μζςο όρο των τριϊν επαναλιψεων + τυπικι απόκλιςθ του μζςου όρου. Διαφορετικά γράμματα υποδθλϊνουν ςτατιςτικά ςθμαντικζσ διαφορζσ μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο (p<0.05). 359

360 Σα απμηεθέζιαηα ζπεηζηήξ αθεμκίαξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ ακαθφεδηακ ιε ηδκ ιέεμδμ ηςκ ηονίςκ ζοκζζηςζχκ (PCA) χζηε κα ακζκπεοεμφκ πζεακέξ επζδνάζεζξ ηςκ β.θ.. ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ. Απυ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ ακάθοζδξ δεκ πνμέηορε ζαθέξ πνυηοπμ επίδναζδξ ηςκ οπυ ιεθέηδ β.θ.. ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ (Γζάβναιια 5.11). Ακηίεεηα, θαίκεηαζ πςξ ακελάνηδηα απυ ημ β.θ.. πμο εθανιυγεηαζ, ηα εδαθζηά δείβιαηα μιαδμπμζμφκηαζ ιε αάζδ ημ πνυκμ πμο ιεζμθααεί απυ ηδκ επέιααζδ (Γζάβναιια 5.12). Πζμ ζοβηεηνζιέκα ηα δείβιαηα απυ υθεξ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ πμο ζοθθέπεδηακ 60 ηαζ 90 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή δζαπςνίζηδηακ απυ ηα δείβιαηα ηςκ οπμθμίπςκ πνυκςκ (3, 10 ηαζ 30 διένεξ) ςξ πνμξ ηδκ πνχηδ ηφνζα ζοκζζηχζα PC1 πμο πενζβνάθεζ ηαζ ημ ιέβζζημ πμζμζηυ ηδξ παναθθαηηζηυηδηαξ (36.8%). 360

361 Διάγραμμα Κατανομι των δειγμάτων εδάφουσ ωσ προσ τθ ςφςταςθ τουσ ςε μικροβιακά PLFAs όταν ωσ παράγοντασ απεικόνιςθσ χρθςιμοποιικθκε το είδοσ του γ.φ.. που χρθςιμοποιικθκε. Η ανάλυςθ ζγινε με τθ μζκοδο των Κφριων υνιςτωςϊν και οι δφο άξονεσ περιγράφουν το 36.8% (PC1) και το 25.8% (PC2) τθσ παραλλακτικότθτασ. 361

362 Γηάγξακκα Κατανομι των δειγμάτων εδάφουσ ωσ προσ τθ ςφςταςθ τουσ ςε μικροβιακά PLFAs όταν ωσ παράγοντασ απεικόνιςθσ χρθςιμοποιικθκε ο χρόνοσ μετά τθν επζμβαςθ με τα γεωργικά φάρμακα. Η ανάλυςθ ζγινε με τθ μζκοδο των Κφριων υνιςτωςϊν και οι δφο άξονεσ περιγράφουν το 36.8% (PC1) και το 25.8% (PC2) τθσ παραλλακτικότθτασ. 362

363 Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηε δξαζηηθόηεηα ησλ όμηλσλ θαη αιθαιηθώλ θσζθαηαζώλ Όμηλεο θσζθαηάζεο φιθςκα ιε ηδκ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηυζμ ηα οπυ ιεθέηδ βεςνβζηά θάνιαηα υζμ ηαζ μ πνυκμξ, ςξ ηφνζμζ πανάβμκηεξ, πνμηάθεζακ ζηαηζζηζηά ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p<0.001) ζηδκ δναζηζηυηδηα ηςκ υλζκςκ θςζθαηαζχκ ζημ έδαθμξ. διακηζηή αφλδζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ υλζκςκ θςζθαηαζχκ, πνμηάθεζε δ πνμζεήηδ ηονίςξ ημο ΟΡΡ (32.5 ιg g -1 dwt h -1 ) ηαζ δεοηενεουκηςξ ηςκ ΗΜΕ (26.7 ιg g -1 dm h -1 ) ηαζ DPA (26.9 ιg g -1 dm h -1 ), ζε ακηίεεζδ ιε ηα οπυθμζπα β.θ.. πμο δεκ επδνέαζακ ζδιακηζηά ηδκ δναζηζηυηδηα ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ εκγφιςκ ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα (23.5 ιg g -1 dm h -1 ). Ακαθμνζηά ιε ηδκ επίδναζδ ημο πνυκμο, παναηδνήεδηε ιζα ζδιακηζηή ιείςζδ ηςκ ηζιχκ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ ζε υθεξ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ ζηζξ 10 διένεξ (13.7 ιg g -1 dwt h -1 ) ιεηά ηδκ επέιααζδ ζε ζπέζδ ιε υθμοξ ημο οπυθμζπμοξ πνυκμοξ (36.36 ιg g -1 dwt h -1 ). Δηηυξ ηςκ παναπάκς παναηδνήεδηακ ζδιακηζηέξ αθθδθεπίδναζεζξ ιεηαλφ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ (p<0.001) πςνίξ υιςξ κα ειθακζζηεί ηάπμζμ λεηάεανμ πνυηοπμ επίδναζδξ ηςκ β.θ.. ζηδ δναζηζηυηδηα ηςκ υλζκςκ θςζθαηαζχκ ζημοξ δζάθμνμοξ πνυκμοξ (Γζάβναιια 5.13). Μμκαδζηή ελαίνεζδ απμηέθεζε δ ζδιακηζηή αφλδζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ υλζκςκ θςζθαηαζχκ ζε υθα ηα εδάθδ πμο δέπηδηακ εθανιμβή β.θ.. ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα ζηδκ πνχηδ δεζβιαημθδρία 3 διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ. Ζ ζδιακηζηή αφλδζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ υλζκςκ θςζθαηαζχκ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ΟΡΡ ηαζ ζοθθέπεδηακ 90 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή δεκ ιπμνεί κα απμδμεεί ζε ηάπμζμ πνμθακέξ αίηζμ ηαζ ίζςξ κα μθείθεηαζ ζε ζθάθια ηαηά ηδκ ιέηνδζδ. 363

364 Διάγραμμα Εκτίμθςθ τθσ επίδραςθσ των γ.φ.. ςτθν δραςτικότθτα των όξινων φωςφαταςϊν ςτο ζδαφοσ. Παρουςία των ίδιων γραμμάτων επάνω από κάκε ράβδο καταδεικνφει μθ ςτατιςτικά ςθμαντικζσ (p>0.05) διαφορζσ μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο. Αιθαιηθέο θσζθαηάζεο Όπςξ ηαζ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ υλζκςκ θςζθαηαζχκ, ηυζμ ηα επζιένμοξ β.θ.. υζμ ηαζ μ πνυκμξ επχαζδξ, ςξ ηφνζμζ πανάβμκηεξ, πνμηάθεζακ ζηαηζζηζηά ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p<0.001) ζηδκ δναζηζηυηδηα ηςκ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ ζημ έδαθμξ. Έηζζ απυ ηα β.θ.. πμο αλζμθμβήεδηακ ημ EQ πνμηάθεζε ζδιακηζηή ιείςζδ (p<0.001) ζηδκ δναζηζηυηδηα ηςκ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ (93.5 ιg g -1 dm h -1 ) ζοβηνζηζηά ιε ημκ ιάνηονα (105.7 ιg g -1 dm h -1 ). Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, παναηδνήεδηε ζηαδζαηή ηαζ ζδιακηζηή αφλδζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ ζε υθεξ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ ιέπνζ ηζξ 30 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ ( ιg g -1 dm h -1 ), πμο αημθμοεήεδηε απυ ζδιακηζηή ιείςζδ ηςκ ηζιχκ βζα υθεξ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ ζημοξ επυιεκμοξ πνυκμοξ επςαζδξ. Χζηυζμ, μζ ηζιέξ ηδξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ ζημοξ πνυκμοξ 60 (101.8 ιg g -1 dm h -1 ) ηαζ 90 (92.9 ιg g -1 dm h -1 ) διένεξ ήηακ ζδιακηζηά ορδθυηενεξ ζε ζπέζδ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ ζηζξ 3 (67.0 ιg 364

365 g -1 dm h -1 ) ηαζ 10 (80.7 ιg g -1 dm h -1 ) διένεξ. Δηηυξ απυ ηζξ ηφνζεξ επζδνάζεζξ ηαζ μζ αθθδθεπζδνάζεζξ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ (p<0.001) ιεηααμθέξ ζηδκ δναζηζηυηδηα ηςκ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ, πςνίξ ςζηυζμ κα ιπμνεί κα δζαηνζεεί ηάπμζμ ζαθέξ πνμκμελανηχιεκμ πνυηοπμ επίδναζδξ. Πανμδζηή ακαζημθή ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ ζοβηνζηζηά ιε ημκ ιάνηονα παναηδνήεδηε ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή EQ ηαζ ζοθθέπεδηακ ζηζξ 30 διένεξ ηαζ ζηα δείβιαηα ημο ΗΜΕ ζηζξ 60 ηαζ 90 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ (Γζάβναιια 5.14). Διάγραμμα Εκτίμθςθ τθσ επίδραςθσ των γ.φ. ςτθν δραςτικότθτα των αλκαλικϊν φωςφαταςϊν ςτο ζδαφοσ. Παρουςία των ίδιων γραμμάτων ςε κάκε ράβδο καταδεικνφει μθ ςτατιςτικά ςθμαντικζσ (p>0.05) διαφορζσ μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο Δπίδξαζε ησλ γ.θ.. ζηε δξαζηηθόηεηα ησλ β-γιπθνζηδαζώλ Tα οπυ ιεθέηδ β.θ.. ηαζ μ πνυκμξ, ςξ ηφνζμζ πανάβμκηεξ, πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p<0.001) ζηδκ δναζηζηυηδηα ηςκ α-βθοημζζδαζχκ ζημ έδαθμξ. οβηεηνζιέκα, δ εθανιμβή ΟΡΡ (55.2 ιg g -1 dm h -1 ) μδήβδζε ζε ζδιακηζηή αφλδζδ (p<0.05) ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ α-βθοημζζδαζχκ ζε ζπέζδ ιε ηζξ οπυθμζπεξ ιεηαπεζνίζεζξ ζοιπενζθαιαακμιέκμο ηαζ ημο ιάνηονα. Πανάθθδθα ηαηαβνάθδηε ιζα 365

366 ζηαδζαηή ηαζ ζδιακηζηή αφλδζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ α-βθοημζζδαζχκ ζε υθεξ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ ςξ ηζξ 60 διένεξ. Δηηυξ ηςκ ηφνζςκ επζδνάζεςκ ηαζ μζ αθθδθεπζδνάζεζξ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ (p<0.001) ιεηααμθέξ ζηδκ δναζηζηυηδηα ηςκ α-βθοημζζδαζχκ. ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ πνμζεήηδ EQ παναηδνήεδηε πανμδζηή αθθά ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ δναζηζηυηδηαξ ηςκ α-βθοημζζδαζχκ ζηζξ 10 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ, εκχ ακηίεεηα ζηα δείβιαηα ημο ΟΡΡ δ δναζηζηυηδηα ημο εκγφιμο εκζζπφεδηε πανμδζηά ζηζξ 60 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ζοβηνζηζηά ιε ημ ιάνηονα ακαθμνάξ. Γζα υθα ηα οπυθμζπα β.θ.. πμο ιεθεηήεδηακ δεκ ειθακίζηδηε ηάπμζμ λεηάεανμ πνυηοπμ επίδναζδξ ζημκ πνυκμ (Γζάβναιια 5.15). Διάγραμμα Εκτίμθςθ τθσ επίδραςθσ των γ.φ.. ςτθν δραςτικότθτα των β- γλυκοςιδαςϊν ςτο ζδαφοσ. Παρουςία των ίδιων γραμμάτων ςε κάκε ράβδο καταδεικνφει μθ ςτατιςτικά ςθμαντικζσ (p>0.05) διαφορζσ μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηελ πδξνιπηηθή δξαζηηθόηεηα ησλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο όπσο εθηηκήζεθε κε ηελ κέζνδν FDHA Σα οπυ ιεθέηδ β.θ.. ηαζ μ πνυκμξ, ςξ ηφνζμζ πανάβμκηεξ, πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p<0.001) ζηδκ οδνμθοηζηή εκγοιζηή δναζηζηυηδηα ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ υπςξ αοηή εηηζιήεδηε ιε ηδκ ιέεμδμ FDHA. οβηεηνζιέκα, δ εθανιμβή ημο DPA μδήβδζε ζε ζδιακηζηή αφλδζδ ηδξ οδνμθοηζηήξ δναζηζηυηδηαξ 366

367 (37.3 ιg θθμομνμζηεΐκδξ g -1 λ.α. εδάθμοξ) ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα (30.2 ιg g -1 ). Πανάθθδθα, παναηδνήεδηε ιζα ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ οδνμθοηζηήξ δναζηζηυηδηαξ ζε υθεξ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ ζηζξ 30 ηαζ 90 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ. Οζ αθθδθεπίδναζεζξ ιεηαλφ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδκ οδνμθοηζηή δναζηζηυηδηα ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ (p<0.001) πμο βζα μνζζιέκα β.θ.. πανμοζζάζε λεηάεανμ πνυηοπμ δζαηφιακζδξ ζημκ πνυκμ. Δζδζηυηενα δ πνμζεήηδ ΣΒΕ, DPA ηαζ ΟΡΡ μδήβδζε ζε ζδιακηζηή αφλδζδ ηδξ οδνμθοηζηήξ δναζηζηυηδηαξ ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα, ηαηά ηζξ πνχηεξ 30 διένεξ ημο πεζνάιαημξ. Ακηίεεηα, ιε ηδκ μθμηθήνςζδ ημο πεζνάιαημξ (90 διένεξ) δ οδνμθοηζηή δναζηζηυηδηα ειθακίγεηαζ ζδιακηζηά ιεζςιέκδ ζε αοηέξ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ ζε ζπέζδ ιε ημ ιάνηονα. Σέθμξ, ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ΗΜΕ παναηδνήεδηε ιζα πζμ πανμδζηή άολδζδ ηδξ οδνμθοηζηήξ δναζηζηυηδηαξ ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα πμο δζήνηδζε 10 διένεξ. (Γζάβναιια 5.16). Διάγραμμα Εκτίμθςθ τθσ επίδραςθσ των γ.φ.. ςτθν ενηυμικι υδρολυτικι δραςτικότθτα των μικροοργανιςμϊν του εδάφουσ, όπωσ αυτι εκφράηεται από τθ ςυγκζντρωςθ τθσ φλουοροςκεΐνθσ που ελευκερϊνεται ςτο ζδαφοσ από τθν υδρόλυςθ του υποςτρϊματοσ FDA. Παρουςία των ίδιων γραμμάτων ςε κάκε ράβδο καταδεικνφει μθ ςτατιςτικά ςθμαντικζσ διαφορζσ (p>0.05) μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο. 367

368 Δπίδξαζε ησλ γ.θ.. ζηε κηθξνβηαθή αλαπλνή ηνπ εδάθνπο Ζ επίδναζδ ηςκ β.θ.. ζηδ ιζηνμαζαηή ακαπκμή ημο εδάθμοξ εηηζιήεδηε ιε αάζδ ηδ ζοκμθζηή πμζυηδηα CO 2 (ιg) πμο εθεοεενχεδηε ακά g εδάθμοξ ζε ζοκμθζηυ πνμκζηυ δζάζηδια 35 διενχκ. Απυ ηδκ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ πνμέηορε υηζ δ ιζηνμαζαηή ακαπκμή δεκ επδνεάζηδηε απυ ηακέκα απυ ηα β.θ.. πμο ιεθεηήεδηακ (p = 0,715) (Γζάβναιια 5.17). ηδ ζοκέπεζα, εηηζιήεδηε ζςνεοηζηά δ εθεοεένςζδ CO 2 ζηζξ δζάθμνεξ ιεηαπεζνίζεζξ ηαζ παναηδνήεδηε πενζμνζζιέκδ δζαθμνμπμίδζδ ιεηαλφ ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ ηαηαδεζηκφμκηαξ ηδκ πενζμνζζιέκδ επίδναζδ ηςκ β.θ.. ζηδκ ιζηνμαζαηή ακαπκμή ημο εδάθμοξ (Γζάβναιια 5.18). Διάγραμμα Επίδραςθ των γ.φ.. ςτθν μικροβιακι αναπνοι του εδάφουσ, με βάςθ τθ ςυνολικι ποςότθτα του CO 2 (μg) που ελευκερϊκθκε ανά g εδάφουσ ςε διάςτθμα 35 θμερϊν. Κάκε τιμι αποτελεί το μζςο όρο 3 επαναλιψεων ± τθν τυπικι απόκλιςθ. 368

369 Διάγραμμα ωρευτικι ποςότθτα του CO 2 που ελευκερϊκθκε ανά g εδάφουσ ςτο διάςτθμα των 35 θμερϊν από τα δείγματα εδάφουσ που δζχτθκαν εφαρμογι των διαφόρων γ.φ.. και από τα δείγματα του μάρτυρα. Κάκε ράβδοσ αντιςτοιχεί ςτο τυπικό ςφάλμα του μζςου όρου 3 επαναλιψεων Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηε δπλεηηθή ληηξνπνίεζε Συζμ ηα β.θ.. υζμ ηαζ μ πνυκμξ, ςξ ηφνζμζ πανάβμκηεξ, είπακ ζδιακηζηέξ επζδνάζεζξ (p<0.001) ζηδκ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ. οβηεηνζιέκα, ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ πνμηάθεζε δ εθανιμβή ηςκ ΟΡΡ (8.45 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h -1 ) ηαζ ΔQ (3.2 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h -1 ), εκχ ακηίεεηα, δ εθανιμβή ηςκ ΣΒΕ (13.54 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h -1 ) ηαζ DPA (12.57 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h -1 ) πνμηάθεζε ζδιακηζηή αφλδζδ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα (11.05 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h -1 ). Πανάθθδθα, παναηδνήεδηε ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζε υθεξ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ ζηζξ 10 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ (6.61 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h -1 ) πμο αημθμοεήεδηε απυ ζδιακηζηή αφλδζδ ζηζξ 30 (12.3 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h -1 ) ηαζ 60 διένεξ (13.9 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h -1 ) υπμο ηαζ ηαηαβνάθδηακ μζ ορδθυηενεξ ηζιέξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ακελάνηδηα ηδξ ιεηαπεζνίζεζξ. διακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ (p<0.001) πνμηάθεζε επίζδξ ηαζ δ αθθδθεπίδναζδ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ. οβηεηνζιέκα, δ εθανιμβή ημο ΣΒΕ μδήβδζε ζε ζδιακηζηή αφλδζδ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζε ζπέζδ ιε ημκ 369

370 ιάνηονα ζηζξ 10 ηαζ 30 διένεξ. Δπίζδξ, δ εθανιμβή DPA μδήβδζε ζε ζδιακηζηή αφλδζδ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμζδζδξ, ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα, ηαηά ηζξ πνχηεξ 10 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ ζημ έδαθμξ. Ακηίεεηα, δ εθανιμβή ημο ΟΡΡ πνμηάθεζε ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα απυ ηζξ 30 διένεξ ηαζ ιέπνζ ηδκ μθμηθήνςζδ ημο πεζνάιαημξ. Ακηίζημζπα, δ εθανιμβή ημο ΔQ μδήβδζε ζε ζδιακηζηή, ιδ ακηζζηνεπηή, ιείςζδ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζε ζπέζδ ιε υθεξ ηζξ οπυθμζπεξ ιεηαπεζνίζεζξ ηαζ ζδζαίηενα ιε ημκ ιάνηονα (Γζάβναιια 5.19). Διάγραμμα Εκτίμθςθ τθσ επίδραςθσ των γ.φ.. ςτθ δυνθτικι νιτροποίθςθ, θ οποία - εκφράηεται ωσ θ ποςότθτα ΝΟ 2 (μg) που ελευκερϊκθκε από 1 g ξθροφ βάρουσ εδάφουσ ςε διάςτθμα 5 ωρϊν. Παρουςία των ίδιων γραμμάτων ςε κάκε ράβδο καταδεικνφει μθ ςτατιςτικά ςθμαντικζσ διαφορζσ (p>0.05) μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο. 370

371 Δπίδξαζε ηνπ ethoxyquin θαη ησλ κεηαβνιηηώλ ζηε δπλεηηθή ληηξνπνίεζε ζε ζπλάξηεζε κε ηελ πνξεία απνδόκεζεο ηνπο ζην έδαθνο Γπλεηηθή Νηηξνπνίεζε Απυ ηδ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ πνμέηορε υηζ ηυζμ μζ επζιένμοξ ιεηαπεζνίζεζξ (ιδηνζηυ ιυνζμ (ΔQ) ηαζ ιεηααμθίηεξ (QI +ΔQNL) υζμ ηαζ μ πνυκμξ, ςξ ηφνζμζ πανάβμκηεξ, πνμηάθεζακ ζηαηζζηζηά ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p<0.001) ζηδ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ. ηδκ πενίπηςζδ επίδναζδξ ημο πνυκμο ςξ ηφνζμο πανάβμκηα, μζ ορδθυηενεξ ζοβηεκηνχζεζξ ΝΟ 2 ζδιεζχεδηακ ζηζξ 60 ηαζ 90 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή (25,1 ηαζ 13,4 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h -1, ακηίζημζπα) ηαζ μζ παιδθυηενεξ ζηζξ 3, 10 ηαζ 30 διένεξ (3,0, 1,53 ηαζ 3,32 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h -1, ακηίζημζπα). ηδκ πενίπηςζδ πμο ιεθεηήεδηε δ ιεηαπείνζζδ ςξ ηφνζμξ παναβυκηαξ, ζδιακηζηά ορδθυηενεξ ζοβηεκηνχζεζξ ΝΟ 2 παναηδνήεδηακ ζηα δείβιαηα μπμο εθανιυζηδηε ημ ΔQNL (10,76 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h -1 ) ζε ζπέζδ ιε ηα δείβιαηα ηςκ ΔQ (8,46 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h - 1 ) ηαζ QI (9,83 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h -1 ). Χζηυζμ, ηαιία απυ ηζξ επζιένμοξ ιεηαπεζνίζεζξ δεκ δζέθενε ζδιακηζηά ιε ημ ιανηονα (9.32 ιg ΝΟ 2 g -1 dm 5h -1 ). διακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ (p<0.001) πνμηάθεζε επίζδξ ηαζ δ αθθδθεπίδναζδ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ, ιε ηζξ πζμ ειθακείξ δζαθμνέξ κα παναηδνμφκηαζ ιεηαλφ ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ ηαηά ηζξ πνχηεξ 30 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή (Γζάβναιια 5.20). οβηεηνζιέκα, ζηζξ 3, 10 ηαζ 30 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ηςκ δζαθυνςκ μοζίςκ παναηδνήεδηε ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζοβηνζηζηά ιε ημ ιάνηονα ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή EQ, QI ηαζ ιίβιαημξ QI+EQNL. Ακηίεεηα, ζημ ίδζμ πνμκζηυ δζάζηδια, δ εθανιμβή ημο EQNL πνμηάθεζε ζδιακηζηή αφλδζδ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα ζηζξ 3 διένεξ, εκχ ζηδ ζοκέπεζα ηαζ ιέπνζ ηδκ μθμηθήνςζδ ημο πεζνάιαημξ δεκ παναηδνήεδηακ δζαθμνέξ ζε ζπέζδ ιε ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα (Γζάβναιια 5.20). 371

372 Γιάγραμμα Εκτίμθςθ τθσ επίδραςθσ του EQ και των προϊόντων μεταβολιςμοφ του ςτθ δυνθτικι νιτροποίθςθ. Παρουςία των ίδιων γραμμάτων ςε κάκε ράβδο καταδεικνφει μθ ςτατιςτικά ςθμαντικζσ διαφορζσ (p>0.05) μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο Παξαθνινύζεζε ηεο πνξείαο απνδνκεζεο ηνπ ethoxyquin θαη ησλ πξντόλησλ κεηαβνιηζκνύ ηνπ Ζ πμνεία απμδυιδζδξ ημο EQ ηαζ ηςκ πνμσυκηςκ ιεηααμθζζιμφ (QI ηαζ EQNL) ζημ έδαθμξ υηακ αοηά εθανιυζηδηακ ιειμκςιέκα ή ζε ιίβια (QI + ΔQNL) απεζημκίγμκηαζ ζημ Γζάβναιια ηδκ πενίπηςζδ πνμζεήηδξ ημο ζηεοάζιαημξ ημο EQ ζημ έδαθμξ, δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ζοκμθζηχκ οπμθεζιιάηςκ ημο EQ ηαζ ηςκ πνμσυκηςκ ιεηααμθζζιμφ ημο ζημ πνυκμ ιδδέκ ήηακ 29.9 ιg g -1 (60% ηδξ εεςνδηζηά εθανιμγυιεκδξ) ηαζ απμηεθμφκηακ απυ EQ ( 20.4 ιg g -1 ), QI (8.21 ιg g -1 ) ηαζ EQNL (1.37 ιg g -1 ). Ζ απμδυιδζδ ημο EQ ήηακ ηαπεία ιε απμηέθεζια ζηζξ 3 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή κα ακζπκεφεηαζ ζημ έδαθμξ ζε ζδζαίηενα παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ (0.28 ιg g -1 ). Ο ηφνζμξ ιεηααμθίηδξ QI απμδμιήεδηε πθήνςξ εκηυξ 10 διενχκ εκχ ζηαεενή πανέιεζκε δ ζοβηέκηνςζδ ημο EQNL ζημ έδαθμξ (Γζάβναιια 5.21α). ηδκ πενίπηςζδ πνμζεήηδξ ζημ έδαθμξ ημο QI, δ ανπζηή ιεηνμφιεκδ ζοβηέκηνςζδ ζημ πνυκμ ιδδέκ ήηακ ιg g -1 (87.6 % ηδξ εεςνδηζηά εθανιμγυιεκδξ). Γεκζηά, παναηδνήεδηε ηαπεία δζάζπαζδ ημο QI ηαηά ηζξ πνχηεξ 10 διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημο ζημ έδαθμξ (Γζάβναιια 5.21α). Ζ ηαπεία απμδυιδζδ ημο QI ζηδκ ζοβηεηνζιέκδ ιεηαπείνζζδ είκαζ ζε ζοιθςκία ιε ηδκ επίζδξ ηαπεία 372

373 απμδυιδζδ ηδξ πμζυηδηαξ QI πμο ζπδιαηίζηδηε φζηενα απυ ηδκ πνμζεήηδ ζημ έδαθμξ ζηεφαζιαημξ EQ ηδκ πενίπηςζδ πνμζεήηδξ ζημ έδαθμξ ημο EQNL δ ανπζηή ιεηνμφιεκδ ζοβηέκηνςζδ ζημ πνυκμ 0 ήηακ 1.4 ιg g -1 (100% ηδξ εεςνδηζηά εθανιμγυιεκδξ ζοβηέκηνςζδξ). Ζ ζοβηέκηνςζδ ημο EQNL ζημ έδαθμξ ηαηά ηδκ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ δεκ πανμοζίαζε ιεβάθεξ ιεηααμθέξ ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ (Γζάβναιια 5.21β) ζε ζοιθςκία ιε ηδκ ζοιπενζθμνά ημο ΔQNL πμο ζπδιαηίζηδηε απυ ηδκ εθανιμβή ημο ζηεοάζιαημξ ημο ΔQ ζημ έδαθμξ. Σέθμξ, υηακ μζ δφμ ιεηααμθίηεξ ημο EQ, εθανιυζηδηακ ζημ έδαθμξ ςξ ιίβια, μζ ανπζηά ιεηνμφιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ ζημ πνυκμ 0, ήηακ ηαζ 1.37 ιg g -1, βζα ημ QI ηαζ ημ EQNL, ακηίζημζπα. Γεκζηυηενα, δ απμδυιδζδ ηςκ δφμ μοζζχκ αημθμφεδζε πακμιμζυηοπδ πμνεία ιε αοηή πμο ηαηαβνάθδηε υηακ μζ δφμ μοζίεξ πνμζηέεδηακ ζημ έδαθμξ ιειμκςιέκα. Έηζζ, παναηδνήεδηε βνήβμνδ απμδυιδζδ ημο QI ηαηά ηζξ 10 πνχηεξ διένεξ, εκχ ζηαεενή πανέιεζκε δ ζοβηέκηνςζδ ημο EQNL ηαευθδ ηδκ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ (Γζάβναιια 5.21δ). 373

374 Διάγραμμα Η πορεία αποδόμθςθσ του EQ και των προιόντων μεταβολιςμοφ του QI (2,6-dihydro-2,2,4-trimethyl-6-quinone imine) και EQNL (2,4-dimethyl-6-ethoxyquinoline) φςτερα από προςκικθ ςτο ζδαφοσ (α) ςκευάςματοσ ΕQ (β) QI, (γ) EQNL και (δ) μίγματοσ προτφπων ουςιϊν QI και EQNL. Κάκε ςθμείο είναι ο μζςοσ όροσ τριϊν επαναλιψεων + τθν τυπικι απόκλιςθ. 374

375 Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηε δνκή ηεο θνηλόηεηαο ησλ βαζηδηνκπθήησλ θαη ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο Δμαγσγή DNA από ην έδαθνο Ανπζηά πναβιαημπμζήεδηε ελαβςβή DNA απυ ηα δείβιαηα εδάθμοξ. Γζα ημκ έθεβπμ ηδξ πμζυηδηαξ ηαζ ηδξ ηαηάζηαζδξ ημο, μνζζιέκδ πμζυηδηα απυ ηα δείβιαηα DNA δθεηηνμθμνήεδηε ζε πδηηή αβανυγδξ 0.8% (Δζηυκα 5.12). 10Kb p Εικόνα Ενδεικτικι εικόνα θλεκτροφόρθςθσ ςε πθκτι αγαρόηθσ 0.8%, DNA που εκχυλίςτθκε από τα δείγματα εδάφουσ των διαφόρων μεταχειρίςεων. L: 1kb DNA Ladder, 1-3: ΣΒΖ, 4-6: ΙΜΖ, 7-9: ΟΡΡ, 10-12: DPA. ε κάκε γραμμι φορτϊκθκαν 10μl DNA Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηε δνκή ηεο θνηλόηεηαο ησλ βαζηδηνκπθήησλ ηνπ εδάθνπο. Δλίζρπζε ηεο ITS πεξηνρήο ησλ βαζηδηνκπθήησλ κε ηε ηερληθή ηεο PCR εκηεζσηεξηθήο έλζεζεο (semi-nested PCR) Γζα ηδκ εκίζποζδ ηδξ ITS πενζμπήξ ημο rdna ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ πναβιαημπμζήεδηακ δφμ δζαδμπζηέξ PCR ακηζδνάζεζξ. Καηά ηδκ πνχηδ, ημ εδαθζηυ DNA εκζζπφεδηε ιε ημοξ εηηζκδηέξ ITS1F ηαζ ITS4Β ηαζ ημ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ είπε ιέβεεμξ πενίπμο 700 bp. 500bp Εικόνα Ενδεικτικι εικόνα θλεκτροφόρθςθσ ςε πθκτι αγαρόηθσ 1.2 %, PCR προϊόντων τθσ ITS περιοχισ του rdna των βαςιδιομυκιτων του εδάφουσ. L: 1kb DNA Ladder, 1: Αρνθτικόσ μάρτυρασ, 2-13: PCR προϊόν από δείγματα εδάφουσ που δζχτθκαν εφαρμογι ΣΒΖ (2-4), ΙΜΖ (5-7), ΟΡΡ (8-10), DPA (11-13) και ςυλλζχκθκαν 30 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ. ε κάκε γραμμι φορτϊκθκαν 5μl προϊόντοσ PCR. 375

376 ηδ δεφηενδ PCR (διζεζςηενζηήξ έκεεζδξ), ημ πνμσυκ ηδξ πνχηδξ ακηίδναζδξ εκζζπφεδηε ιε ημοξ εηηζκδηέξ ITS1F-GC ηαζ ITS2 ηαζ πνμέηορε πνμσυκ ιεβέεμοξ πενίπμο 300 bp, ηαηάθθδθμ βζα ακάθοζδ ιε ηδ ιέεμδμ DGGE. 500bp Εικόνα Ενδεικτικι εικόνα θλεκτροφόρθςθσ ςε πθκτι αγαρόηθσ 1.2 %, PCR προϊόντων τθσ ITS περιοχισ του rdna των βαςιδιομυκιτων του εδάφουσ L: 1kb DNA Ladder, 1: Αρνθτικόσ μάρτυρασ, 2-16: PCR προϊόν από δείγματα εδάφουσ που δεν δζχτθκαν επζμβαςθ (2-4) ι δζχτθκαν επζμβαςθ με ΣΒΖ (5-7), ΙΜΖ (8-10), ΟΡΡ (11-13), DPA (14-16) και ςυλλζχκθκαν 90 θμζρεσ αργότερα. ε κάκε γραμμι φορτϊκθκαν 5μl προϊόντοσ PCR. Σα εδαθζηά δείβιαηα ζηα μπμία πνμζηέεδηε ημ ακηζμλεζδςηζηυ EQ δεκ ζοιπενζθήθεδηακ ζηδκ ακάθοζδ, ηαεχξ δεκ ηαηέζηεζ δοκαηή δ παναθααή πνμσυκημξ PCR εκίζποζδξ ηδξ ITS πενζμπήξ rdna ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ. Απνηειέζκαηα DGGE αλάιπζεο γηα ηελ θνηλόηεηα ησλ βαζηδηνκπθήησλ ζην έδαθνο Απυ ηδκ DGGE ακάθοζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ζημ έδαθμξ, πνμέηορακ πδηηέξ αηνοθαιζδίμο υπμο απμηοπχεδηακ ζοκμθζηά 30 γχκεξ ζηζξ δζάθμνεξ ιεηαπεζνίζεζξ ηαζ πνυκμοξ επχαζδξ, πμο ιεθεηήεδηακ. Απυ ηδκ Ακάθοζδ Κφνζςκ οκηεηαβιέκςκ (Principal Coordinate Analysis) ηςκ δεδμιέκςκ δοαδζηήξ ιμνθήξ πνμέηορε υηζ δ πνμζεήηδ ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ επέθενε ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ, ζε ζπέζδ ιε ημ ιάνηονα. οβηεηνζιέκα, ζηζξ 3 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ ιε ηα β.θ.., ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα μιαδμπμζήεδηακ ιε αοηά ημο TBZ ηαζ δζαπςνίζηδηακ απυ ηα δείβιαηα ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ IMZ ηαζ DPA ςξ πνμξ ηδκ Κφνζα οκηεηαβιέκδ 1 (PCo1) ηαζ απυ ηα δείβιαηα ημο ΟΡΡ ηαζ ςξ πνμξ ηδκ Κφνζα οκηεηαβιέκδ 2 (PCo2) (Γζάβναιια 5.22). ηζξ 30 διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ β.θ. ζημ έδαθμξ, ηα δείβιαηα υθςκ ηςκ 376

377 ιεηαπεζνίζεςκ δζαθμνμπμζήεδηακ λεηάεανα απυ ηα ακηίζημζπα ημο ιάνηονα ακαθμνάξ ςξ πνμξ ηδκ PCo1 ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ, ςξ πνμξ ηδκ PCo2 ζηδκ πενίπηςζδ ημο DPA, αθθά ηαζ ςξ πνμξ ηζξ δφμ Κφνζεξ οκηεηαβιέκεξ (PCo1 ηαζ PCo2) ζηδκ πενίπηςζδ ημο ΟΡΡ (Γζάβναιια 5.23). Σέθμξ, ζηζξ 90 διένεξ, υθεξ μζ ιεηαπεζνίζεζξ δζαθμνμπμζήεδηακ ζε ζπέζδ ιε ημ ιάνηονα. Σα δείβιαηα ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ ΣΒΕ ηαζ ΟΡΡ μιαδμπμζήεδηακ ηαζ δζαπςνίζηδηακ απυ ηα ακηίζημζπα ημο ιάνηονα ςξ πνμξ ηζξ PCo1 ηαζ PCo2, εκχ ηα δείβιαηα ηςκ ΗΜΕ ηαζ DPA μιαδμπμζήεδηακ ηαζ δζαθμνμπμζήεδηακ απυ αοηά ημο ιάνηονα ακαθμνάξ ςξ πνμξ ηδκ PCo2 (Γζάβναιια 5.24). 377

378 Διάγραμμα Μοριακό αποτφπωμα DGGE (αριςτερά) και ανάλυςθ Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=3) των δεδομζνων δυαδικισ μορφισ που προζκυψαν από τθν ψθφιοποίθςθ του μοριακοφ αποτυπϊματοσ (δεξιά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των γ.φ.. ςτθν κοινότθτα των βαςιδιομυκιτων ςτο ζδαφοσ 3 θμζρεσ μετά τθν προςκικθ των γ.φ.. Μ: Marker που αποτελείται από μίγμα ITS rdna-pcr προϊόντων (ςυγκζντρωςθ 25 ng/μl) των μυκιτων που ακολουκοφν με ςειρά εμφάνιςθσ από πάνω προσ τα κάτω: Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici, Fusarium solani, Trametes versicolor, Trichoderma sp., Pleurotus ostreatus, Phanerochaete chrysosporium. 378

379 . Διάγραμμα Μοριακό αποτφπωμα DGGE (αριςτερά) και Ανάλυςθ Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=3) των δεδομζνων δυαδικισ μορφισ που προζκυψαν από τθν ψθφιοποίθςθ του μοριακοφ αποτυπϊματοσ (δεξιά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των γ.φ.. ςτθν κοινότθτα των βαςιδιομυκιτων ςτο ζδαφοσ 30 θμζρεσ μετά τθν προςκικθ των γ.φ.. Μ: Marker που αποτελείται από μίγμα ITS rdna-pcr προϊόντων (ςυγκζντρωςθ 25 ng/μl) των μυκιτων που ακολουκοφν με ςειρά εμφάνιςθσ από πάνω προσ τα κάτω: Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici, Fusarium solani, Trametes versicolor, Trichoderma sp., Pleurotus ostreatus, Phanerochaete chrysosporium. 379

380 Διάγραμμα Μοριακό αποτφπωμα DGGE (αριςτερά) και Ανάλυςθ Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=3) των δεδομζνων δυαδικισ μορφισ που προζκυψαν από τθν ψθφιοποίθςθ του μοριακοφ αποτυπϊματοσ (δεξιά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των γ.φ.. ςτθν κοινότθτα των βαςιδιομυκιτων ςτο ζδαφοσ 90 θμζρεσ μετά τθν προςκικθ των γ.φ.. Μ: Marker που αποτελείται από μίγμα ITS rdna-pcr προϊόντων (ςυγκζντρωςθ 25 ng/μl) των μυκιτων που ακολουκοφν με ςειρά εμφάνιςθσ από πάνω προσ τα κάτω: Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici, Fusarium solani, Trametes versicolor, Trichoderma sp., Pleurotus ostreatus, Phanerochaete chrysosporium. 380

381 Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηε δνκή ηεο θνηλόηεηαο ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο Δλίζρπζε ηνπ amoa γνληδίνπ ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ βαθηεξίσλ Γζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ααηηδνίςκ (ΑΟΒ) πνδζζιμπμζδεήηακ μζ εηηζκδηέξ amo1f+gc ηαζ amo2r ηαζ ημ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ είπε ιέβεεμξ πενίπμο 500 bp. L bp Εικόνα Ενδεικτικι εικόνα θλεκτροφόρθςθσ ςε πθκτι αγαρόηθσ 1.2 %, PCR προϊόντων του amoa γονιδίου των ΑΟΒ ςτο ζδαφοσ L: 1kb DNA Ladder, 1: αρνθτικόσ μάρτυρασ (νερό αντί DNA), Γραμμζσ 2-19: PCR προϊόν από δείγματα εδάφουσ που δζχτθκαν είτε δεν δζχτθκαν επζμβαςθ με γ.φ.. (2-4), είτε δζχτθκαν επζμβαςθ με ΣΒΖ (5-7), ΙΜΖ (8-10), ΟΡΡ (11-13), DPA (14-16), EQ (17-19) και ςυλλζχκθκαν 30 θμζρεσ μετά τθν επζμβαςθ. ε κάκε γραμμι φορτϊκθκαν 5μl προϊόντοσ PCR. Δλίζρπζε ηνπ amoa γνληδίνπ ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ αξραίσλ Γζα ηδκ εκίζποζδ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ανπαίςκ (ΑΟΑ) πνδζζιμπμζδεήηακ μζ εηηζκδηέξ Α23f ηαζ Α616r ηαζ ημ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ εκίζποζδξ είπε ιέβεεμξ 620 bp. 500bp Εικόνα Ενδεικτικι εικόνα θλεκτροφόρθςθσ ςε πθκτι αγαρόηθσ 1.2 %, PCR προϊόντων του amoa γονιδίου των ΑΟΑ ςτο ζδαφοσ L: 1kb DNA Ladder, 1-9: PCR προϊόν από δείγματα εδάφουσ που δζχτθκαν επζμβαςθ με τα μυκθτοκτόνα, ΣΒΖ (1-3), ΙΜΖ (4-6), ΟΡΡ (7-9) και ςυλλζχκθκαν 3 θμζρεσ αργότερα. ε κάκε γραμμι φορτϊκθκαν 5μl προϊόντοσ PCR. 381

382 Απνηειέζκαηα DGGE αλάιπζεο γηα ηελ θνηλόηεηα ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ βαθηεξίσλ ηδκ πενίπηςζδ DGGE ακάθοζδξ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ AOB, παναηδνήεδηακ ζοκμθζηά 12 γχκεξ ζηζξ δζάθμνεξ ιεηαπεζνίζεζξ ηαζ ημοξ πνυκμοξ πμο ελεηάζεδηακ. Γεκζηά, δ πνμζεήηδ ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ επέθενε αθθαβέξ ζηδ δμιή ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ ζημ έδαθμξ, ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ πςνίξ ςζηυζμ κα ιπμνεί κα δζαηνζεεί ζαθέξ πνυηοπμ επίδναζδξ ζημ πνυκμ. Απυ ηδκ Ακάθοζδ Κφνζςκ οκηεηαβιέκςκ (Principal Coordinate Analysis) πνμέηορε υηζ ζηζξ 3 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ηςκ β.θ.., ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα μιαδμπμζήεδηακ ιε ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ΣΒΕ ηαζ δζαπςνίζηδηακ λεηάεανα απυ ηα δείβιαηα ηςκ οπμθμίπςκ ιεηαπεζνίζεςκ ςξ πνμξ ηδκ PCo1. Μεηαλφ ηςκ οπμθμίπςκ ιεηαπεζνίζεςκ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ΗΜΕ, ΟΡΡ ηαζ DPA μιαδμπμζήεδηακ ιαγί ηαζ δζαπςνίζηδηακ απυ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή EQ λεηάεανα ςξ πνμξ ηδκ PCo2 (Γζάβναιια 5.25). ηζξ 10 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή DPA, TBZ μιαδμπμζήεδηακ ιε ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα ηαζ δζαπςνίζηδηακ ςξ πνμξ ηδκ PCo1 απυ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ΗΜΕ, ΟΡΡ ηαζ EQ πμο μιαδμπμζήεδηακ ιαγί (Γζάβναιια 5.26). ηζξ 30 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ, υθεξ μζ ιεηαπεζνίζεζξ δζαπςνίζηδηακ απυ ημκ ιάνηονα. οβηεηνζιέκα, ηα δείβιαηα ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ ΣΒΕ, ΟΡΡ ηαζ DPA μιαδμπμζήεδηακ ιαγί ηαζ δζαπςνίζηδηακ απυ ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα ςξ πνμξ ηδκ PCo1, εκχ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ΗΜΕ ηαζ EQ μιαδμπμζήεδηακ ιαγί ηαζ δζαπςνίζηδηακ απυ ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα ηονίςξ ςξ πνμξ ηδκ PCo2 (Γζάβναιια 5.27). ημ ηέθμξ ημο πεζνάιαημξ, 90 διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ β.θ.., δεκ παναηδνήεδηακ δζαθμνέξ ςξ πνμξ ηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ααηηδνίςκ ιεηαλφ ηςκ δεζβιάηςκ ηςκ δζαθμνεηζηχκ ιεηαπεζνίζεςκ ηαζ ημ ζφκμθμ ηδξ παναθθαηηζηυηδηαξ (100%) ηςκ δεδμιέκςκ πενζβνάθεηαζ απυ ηδκ Κφνζα οκηεηαβιέκδ 1 (Δζηυκα 5.17). 382

383 Διάγραμμα Μοριακό αποτφπωμα DGGE (αριςτερά) και ανάλυςθ πολυμεταβλθτότθτασ των Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=3) (δεξιά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των διαφορετικϊν μεταχειρίςεων ςτθν κοινότθτα των νιτρωδοποιθτικϊν βακτθρίων, 3 θμζρεσ μετά τθν προςκικθ των γεωργικϊν φαρμάκων ςτο ζδαφοσ. Ωσ δείκτθσ (Μ: Marker) χρθςιμοποιικθκε ςτακερά ζνα από τα προσ ανάλυςθ περιβαλλοντικά δείγματα (Σ30 C1). 383

384 Διάγραμμα Μοριακό αποτφπωμα DGGE (αριςτερά) και ανάλυςθ πολυμεταβλθτότθτασ των Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=3) (δεξιά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των διαφορετικϊν μεταχειρίςεων ςτθν κοινότθτα των νιτρωδοποιθτικϊν βακτθρίων, 10 θμζρεσ μετά τθν προςκικθ των γεωργικϊν φαρμάκων ςτο ζδαφοσ. Ωσ δείκτθσ (Μ: Marker) χρθςιμοποιικθκε ςτακερά ζνα από τα προσ ανάλυςθ περιβαλλοντικά δείγματα (Σ30 C1). 384

385 Διάγραμμα Μοριακό αποτφπωμα DGGE (αριςτερά) και ανάλυςθ πολυμεταβλθτότθτασ των Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=3) (δεξιά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των διαφορετικϊν μεταχειρίςεων ςτθν κοινότθτα των νιτρωδοποιθτικϊν βακτθρίων, 30 θμζρεσ μετά τθν προςκικθ των γεωργικϊν φαρμάκων ςτο ζδαφοσ. Ωσ δείκτθσ (Μ: Marker) χρθςιμοποιικθκε ςτακερά ζνα από τα προσ ανάλυςθ περιβαλλοντικά δείγματα (Σ30 C1). 385

386 Εικόνα Μοριακό αποτφπωμα DGGE για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των διαφορετικϊν μεταχειρίςεων ςτθν κοινότθτα των νιτρωδοποιθτικϊν βακτθρίων, 90 θμζρεσ μετά τθν προςκικθ των γεωργικϊν φαρμάκων ςτο ζδαφοσ. Ωσ δείκτθσ (Μ: Marker) χρθςιμοποιικθκε ςτακερά ζνα από τα προσ ανάλυςθ περιβαλλοντικά δείγματα (Σ30 C1). 386

387 Απνηειέζκαηα DGGE αλάιπζεο γηα ηελ θνηλόηεηα ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ αξραίσλ ηδκ πενίπηςζδ ηςκ ΑΟΑ, ζηζξ πδηηέξ αηνοθαιζδίμο ειθακίζηδηακ ηαηά ιέζμ υνμ γχκεξ. Aκάθοζδ Κφνζςκ οκηεηαβιέκςκ (Principal Coordinate Analysis) έδεζλε υηζ δ πνμζεήηδ ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ πνμηάθεζε ιεηααμθέξ ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΑ. Χζηυζμ, ιυκμ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή EQ δζέθενακ ζηαεενά ηαζ ζε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ απυ ηα ακηίζημζπα ημο ιάνηονα. Ακηίεεηα, βζα ηζξ οπυθμζπεξ ιεηαπεζνίζεζξ δεκ παναηδνήεδηε λεηάεανμ πνυηοπμ επίδναζδξ ζημ πνυκμ. Όηακ μζ επζδνάζεζξ ηςκ β.θ.. ιεθεηήεδηακ ζε ηάεε πνυκμ δεζβιαημθδρίαξ λεπςνζζηά, ζηζξ 3 διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ β.θ. ζημ έδαθμξ, ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα δζαπςνίζηδηακ λεηάεανα απυ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή β.θ.. ςξ πνμξ ηδκ PCo1, εκχ ηαζ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή EQ δζαπςνίζηδηακ απυ ηα οπυθμζπα δείβιαηα ςξ πνμξ ηδκ PCo2 (Γζάβναιια 5.28). ηζξ 10 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή, ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ΟΡΡ ηαζ ΔQ δζαπςνίζηδηακ απυ ηα δείβιαηα ηςκ οπμθμίπςκ ιεηαπεζνίζεςκ ζοιπενζθαιαακμιέκμο ηαζ ημο ιάνηονα ςξ πνμξ ηδκ PCo1 ηαζ PCo2 ακηίζημζπα (Γζάβναιια 5.29). ηζξ 30 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ΣΒΕ, ΗΜΕ ηαζ DPA μιαδμπμζήεδηακ ιαγί ιε ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα ηαζ δζαπςνίζηδηακ λεηάεανα απυ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ πνμζεήηδ ΟΡΡ ή ΔQ ςξ πνμξ ηζξ PCo2 ηαζ ΡCo1, ακηίζημζπα (Γζάβναιια 5.30). Σέθμξ, ζηζξ 90 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ, ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ΣΒΕ ηαζ ΟΡΡ μιαδμπμζήεδηακ ιε ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα. ε ακηίεεζδ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ πνμζεήηδ DPA δζαπςνίζηδηακ απυ ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα ςξ πνμξ ηδκ PCo2, εκχ ηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή IMZ ηαζ EQ δζαπςνίζηδηακ απυ ηα δείβιαηα ημο ιάνηονα ςξ πνμξ ηδκ PCo1 (Γζάβναιια 5.31). 387

388 Διάγραμμα Μοριακό αποτφπωμα DGGE (αριςτερά) και Ανάλυςθ Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=3) των δεδομζνων δυαδικισ μορφισ που προζκυψαν από τθν ψθφιοποίθςθ του μοριακοφ αποτυπϊματοσ (δεξιά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των διαφορετικϊν ςτθν κοινότθτα των ΑΟΑ ςτο ζδαφοσ 3 θμζρεσ μετά τθν προςκικθ των γ.φ.. Ωσ δείκτθσ (Μ: Marker) χρθςιμοποιικθκε ςτακερά ζνα από τα προσ ανάλυςθ περιβαλλοντικά δείγματα (Σ30 C1). 388

389 Διάγραμμα Μοριακό αποτφπωμα DGGE (αριςτερά) και Ανάλυςθ Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=3) των δεδομζνων δυαδικισ μορφισ που προζκυψαν από τθν ψθφιοποίθςθ του μοριακοφ αποτυπϊματοσ (δεξιά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των διαφορετικϊν γ.φ.. ςτθν κοινότθτα των ΑΟΑ ςτο ζδαφοσ 10 θμζρεσ μετά τθν προςκικθ των γ.φ... Ωσ δείκτθσ (Μ: Marker) χρθςιμοποιικθκε ςτακερά ζνα από τα προσ ανάλυςθ περιβαλλοντικά δείγματα (Σ30 C1). 389

390 Διάγραμμα Μοριακό αποτφπωμα DGGE (αριςτερά) και Ανάλυςθ Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=3) των δεδομζνων δυαδικισ μορφισ που προζκυψαν από τθν ψθφιοποίθςθ του μοριακοφ αποτυπϊματοσ (δεξιά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των διαφορετικϊν γ.φ.. ςτθν κοινότθτα των ΑΟΑ ςτο ζδαφοσ 30 θμζρεσ μετά τθν προςκικθ των γ.φ... Ωσ δείκτθσ (Μ: Marker) χρθςιμοποιικθκε ςτακερά ζνα από τα προσ ανάλυςθ περιβαλλοντικά δείγματα (Σ30 C1). 390

391 Διάγραμμα Μοριακό αποτφπωμα DGGE (αριςτερά) και Ανάλυςθ Κφριων υντεταγμζνων (Μζςθ τιμι ομάδασ, n=3) των δεδομζνων δυαδικισ μορφισ που προζκυψαν από τθν ψθφιοποίθςθ του μοριακοφ αποτυπϊματοσ (δεξιά) για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ των διαφορετικϊν γ.φ.. ςτθν κοινότθτα των ΑΟΑ ςτο ζδαφοσ 90 θμζρεσ μετά τθν προςκικθ των γ.φ.. Ωσ δείκτθσ (Μ: Marker) χρθςιμοποιικθκε ςτακερά ζνα από τα προσ ανάλυςθ περιβαλλοντικά δείγματα (Σ30 C1). 391

392 Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηελ αθζνλία ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ ηνπ εδάθνπο Ζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ημζκμηήηςκ ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ ζηα οπυ ιεθέηδ πενζααθθμκηζηά δείβιαηα πναβιαημπμζήεδηε ιε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ζημπεφμκηαξ ζημ amoa βμκίδζμ. Ο πνμζδζμνζζιυξ ημο ανζειμφ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ζηα δείβιαηα έβζκε ιε ηδ πνήζδ ηαιποθχκ ακαθμνάξ πμο ηαηαζηεοάζηδηακ ιε δζαδμπζηέξ αναζχζεζξ ακαζοκδοαζιέκςκ πθαζιζδίςκ βκςζηήξ ζοβηέκηνςζδξ πμο πενζείπακ ημ βμκίδζμ amoa. Γζα ηδκ ηαιπφθδ ακαθμνάξ ηςκ ΑΟΒ πνδζζιμπμζήεδηακ μζ αναζχζεζξ 1.3x10 8 έςξ 1.3x10 2 ακηίβναθα amoa ιl -1, εκχ βζα ηα ΑΟΑ πνδζζιμπμζήεδηακ μζ αναζχζεζξ 8.5x10 7 έςξ 8.5x10 1 ακηίβναθα amoa ιl -1. ηδκ πενίπηςζδ ηςκ ΑΟΒ δ απμηεθεζιαηζηυηδηα ηδξ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ήηακ 80.0%, r 2 = ηαζ ηθίζδ ηαιπφθδξ Οζ ακηίζημζπεξ ηζιέξ βζα ηα ΑΟΑ ήηακ απμηεθεζιαηζηυηδηα 94.0%, ιε r 2 = ηαζ ηθίζδ ηαιπφθδξ ηζξ εζηυκεξ 5.18 ηαζ 5.19 πανμοζζάγμκηαζ μζ ηαιπφθεξ ακαθμνάξ, εκίζποζδξ ηαζ απμδζάηαλδξ βζα ηα ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ, ακηίζημζπα. Ο ανζειυξ ακηζβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο πμο πνμέηορε βζα ηάεε δείβια, ιεηαηνάπδηε ζε ανζειυ ακηζβνάθςκ ακά ng DNA πμο πνδζζιμπμζήεδηε ζηδκ ακάθοζδ. ηδκ πενίπηςζδ AOB μζ ηζιέξ ηοιάκεδηακ απυ 3.1x10 3 έςξ 2.6 x10 4 ακηίβναθα ng -1 DNA ηαζ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ AOA απυ 2.9x10 2 έςξ 2.9x10 3 ακηίβναθα ng -1 DNA. 392

393 Εικόνα Ενίςχυςθ του γονιδίου amoa των ΑΟΒ με τθν τεχνικι τθσ PCR πραγματικοφ χρόνου. (α) καμπφλθ αναφοράσ, (β) καμπφλθ ενίςχυςθσ και (γ) καμπφλθ αποδιάταξθσ. 393

394 Εικόνα Ενίςχυςθ του γονιδίου amoa των ΑΟΑ με τθν τεχνικι τθσ PCR πραγματικοφ χρόνου. (α) καμπφλθ αναφοράσ, (β) καμπφλθ ενίςχυςθσ και (γ) καμπφλθ αποδιάταξθσ. ηαηζζηζηή επελενβαζία ηςκ δεδμιέκςκ πμο πνυεηορακ βζα ηα ΑΟΒ (Two-way Anova, LSD Test) έδεζλε υηζ ιυκμ ηα β.θ.., ςξ ηφνζμξ πανάβμκηαξ, πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p=0.005) ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ ζημ έδαθμξ. οβηεηνζιέκα, δ επέιααζδ ιε ημ ιοηδημηηυκμ ΗΜΕ μδήβδζε ζε ζδιακηζηή αφλδζδ ηςκ ΑΟΒ ζημ 394

395 έδαθμξ (1.7 x10 4 ακηίβναθα ng -1 DNA), ζε ακηίεεζδ ιε υθεξ ηζξ οπυθμζπεξ ιεηαπεζνίζεζξ πμο δεκ δζέθενακ ζδιακηζηά απυ ημ ιάνηονα (1.0x10 4 ακηίβναθα ng -1 DNA). Ακηίεεηα, ηυζμ μ πνυκμξ ςξ ηφνζμξ πανάβμκηαξ, υζμ ηαζ δ αθθδθεπίδναζδ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ δεκ θαίκεηαζ κα πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p=0.065 ηαζ p=0.122, ακηίζημζπα) ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ ζημ έδαθμξ (Γζάβναιια 5.33). Διάγραμμα Επίδραςθ των γ.φ.. ςτθν αφκονία των ΑΟΒ όπωσ αυτι εκφράηεται ϊσ αρικμόσ αντιγράφων του γονιδίου amoa των ΑΟΒ ng -1 DNA. Κάκε τιμι αντιςτοιχεί ςτο μζςο όρο τριϊν επαναλιψεων ± τυπικι απόκλιςθ. Διαφορετικά γράμματα υποδθλϊνουν ςτατιςτικά ςθμαντικζσ διαφορζσ (p< 0.05) μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο. ηαηζζηζηή επελενβαζία ηςκ απμηεθεζιάηςκ (Two-way Anova, LSD Test), έδεζλε υηζ ηυζμ ηα β.θ.. πμο πνδζζιμπμζήεδηακ υζμ ηαζ μ πνυκμξ, ςξ ηφνζμζ πανάβμκηεξ, πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p=0.016 ηαζ p=0.003, ακηίζημζπα) ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ ζημ έδαθμξ. Γζα ηδκ επίδναζδ ηςκ β.θ.., δ επέιααζδ ιε DPA μδήβδζε ζε ζδιακηζηή αφλδζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ ΑΟΑ ζημ έδαθμξ (1.7 x10 3 ακηίβναθα ng -1 DNA), ζε ακηίεεζδ ιε υθεξ ηζξ οπυθμζπεξ ιεηαπεζνίζεζξ πμο δεκ δζέθενακ ζδιακηζηά ζε ζπέζδ ιε ημ ιάνηονα (1.1x10 3 ακηίβναθα ng -1 DNA). ηδκ πενίπηςζδ ηδξ επίδναζδξ ημο πνυκμο ςξ ηφνζμο πανάβμκηα, παναηδνήεδηε ζδιακηζηή ιείςζδ ημο 395

396 ανζειμφ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ ζηζξ 90 διένεξ (9.3x10 2 ακηίβναθα ng -1 DNA) ιεηά ηδκ επέιααζδ ζε ζπέζδ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ ζηζξ 3 (1.5 x10 3 ακηίβναθα ng -1 DNA) ηαζ 30 (1.4 x10 3 ακηίβναθα ng -1 DNA) διένεξ. διακηζηή ήηακ επίζδξ ηαζ δ αθθδθεπίδναζδ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ (p=0.044) μδδβχκηαξ ιαξ κα ιεθεηήζμοιε ηζξ ιεηααμθέξ πμο πνμηάθεζε δ εθανιμβή ηςκ δζαθυνςκ β.θ.. ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ ζημοξ επζιένμοξ πνυκμοξ. οβηεηνζιέκα, παναηδνήεδηε ζδιακηζηή αφλδζδ ημο ανζειμφ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή DPA ηαζ ζοθθέπεδηακ 3 ηαζ 30 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ ηαζ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ΟΡΡ ηαζ ζοθθέπεδηακ 3 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ πάκηα ζε ζπέζδ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ ζηα δείβιαηα ημο ιάνηονα. ημ ηέθμξ ημο πεζνάιαημξ (90 διένεξ), ηαιία απυ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ δεκ δζέθενε ζδιακηζηά απυ ημ ιάνηονα (Γζάβναιια 5.32). Διάγραμμα Επίδραςθ των γ.φ.. ςτθν αφκονία των ΑΟΑ όπωσ αυτι εκφράηεται ϊσ αρικμόσ αντιγράφων του γονιδίου amoa των ΑΟΑ ng -1 DNA. Κάκε τιμι αντιςτοιχεί ςτο μζςο όρο τριϊν επαναλιψεων ± τυπικι απόκλιςθ. Διαφορετικά γράμματα υποδθλϊνουν ςτατιςτικά ςθμαντικζσ διαφορζσ (p< 0.05) μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο. 396

397 Δπίδξαζε ηνπ ethoxyquin ζηελ ιεηηνπξγία ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ κηθξννξγαληζκώλ όπσο πξνζδηνξίζηεθε κε RT-PCR πξαγκαηηθνύ ρξόλνπ Δμαγσγή RNA από ην έδαθνο Γζα ηδ ιεθέηδ ηδξ επίδναζδξ ημο ακηζμλεζδςηζημφ ethoxyquin ζηδκ θεζημονβία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ, πναβιαημπμζήεδηε ανπζηά ελαβςβή RNA απυ ηα δείβιαηα εδάθμοξ. Γζα ημκ έθεβπμ ηδξ απυδμζδξ ηδξ ελαβςβήξ, μνζζιέκδ πμζυηδηα απυ ηα δείβιαηα RNA δθεηηνμθμνήεδηε ζε πδηηή αβανυγδξ 1.5%, (Δζηυκα 5.20). 10Kb p 10Kb p Εικόνα Ενδεικτικι εικόνα θλεκτροφόρθςθσ για 20 min ςε πθκτι αγαρόηθσ 1.5%, RNA που εκχυλίςτθκε από τα εδαφικά δείγματα των μεταχειρίςεων του μάρτυρα και του ethoxyquin, (α) ςε χρόνο 30 θμζρεσ μετά τθν εφαρμογι και (β) ςε χρόνο 90 θμζρεσ μετά τθν εφαρμογι. L: 1kb DNA Ladder. ε κάκε γραμμι φορτϊκθκαν 10μl RNA. Δπίδξαζε ηνπ ethoxyquin ζηνλ αξηζκό ησλ κεηαγξάθσλ ηνπ γνληδίνπ amoa ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ βαθηεξίσλ ζην έδαθνο Γζα ηδκ ηαιπφθδ ακαθμνάξ ηςκ ΑΟΒ πνδζζιμπμζήεδηακ μζ αναζχζεζξ 1.0x10 1 έςξ 1.0x10 9 ιεηάβναθα ημο amoa βμκζδίμο ακά ιl DNA. Ζ απμηεθεζιαηζηυηδηα ηδξ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ήηακ 96.4%, ιε r 2 = ηαζ ηθίζδ ηαιπφθδξ ηδκ Eζηυκα 5.21 πανμοζζάγμκηαζ μζ ηαιπφθεξ ακαθμνάξ, εκίζποζδξ ηαζ απμδζάηαλδξ ηςκ ΑΟΒ. Ο ανζειυξ ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο πμο πνμέηορε βζα ηάεε δείβια απυ ηδκ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο, ιεηαηνάπδηε ζε ανζειυ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ακά ng RNA πμο πνδζζιμπμζήεδηε ζηδκ ακηίδναζδ. Oζ ηζιέξ βζα ηα ΑΟΒ ζηδκ πενίπηςζδ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ηα ηοπαία ελαιενή ηοιάκεδηακ απυ 1.0x

398 έςξ 7.7x10 0 ιεηάβναθα ng -1 DNA, εκχ ζηδκ πενίπηςζδ ημο ελεζδζηεοιέκμο εηηζκδηή απυ 8.1 x10 1 έςξ 1.9x10 3. Σα ορδθυηενα επίπεδα ιεηαβνάθςκ πμο ακζπκεφεδηακ ζηα δζάθμνα δείβιαηα υηακ πνδζζιμπμζήεδηε ελεζδζηεοιέκμξ εηηζκδηήξ ακηί ηοπαίςκ ελαιενχκ ήηακ ςξ έκα ααειυ ακαιεκυιεκδ, ηαεχξ δ ιεηαβναθζηή δναζηζηυηδηα ζηδκ πενίπηςζδ ημο ελεζδζηεοιέκμο εηηζκδηή ζημπεφεζ ζε ζοβηεηνζιέκδ αθθδθμοπία (βμκίδζμ-ζηυπμξ) ηαζ δεκ ακαθχκεηαζ ζημ ζφκμθμ ημο ηνακζηνζπηχιαημξ (rrna ηαζ mrna) υπςξ ζοιααίκεζ ζηδκ πενίπηςζδ ζφκεεζδξ cdna ιε πνήζδ ηοπαίςκ ελαιενχκ. Απυ ηδκ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ζηδκ πενίπηςζδ ζφκεεζδξ ημο cdna ιε ηδ πνήζδ ηςκ ηοπαίςκ ελαιενχκ, ηυζμ ηα β.θ.. πμο πνδζζιμπμζήεδηακ υζμ ηαζ μ πνυκμξ, ςξ ηφνζμζ πανάβμκηεξ, δεκ πνμηάθεζακ ζηαηζζηζηά ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p=0.076 ηαζ p=0.077, ακηίζημζπα) ζηδκ αθεμκία ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ. Οιμίςξ, δ αθθδθεπίδναζδ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ δεκ μδήβδζε ζε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p=0.111) ζηδκ αθεμκία ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ. (Γζάβναιια 5.34α). Ακηίεεηα, ζηδκ πενίπηςζδ πμο πνδζζιμπμζήεδηε ελεζδζηεοιέκμξ εηηζκδηήξ βζα ηδ ζφκεεζδ ημο cdna, μζ δφμ ηφνζμζ πανάβμκηεξ πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p=0.013 ηαζ p=0.001, ακηίζημζπα) ζηδκ αθεμκία ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ. Γεκζηά, μ ανζειυξ ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ήηακ ζδιακηζηά παιδθυηενμξ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ επέιααζδ ιε EQ (3.7x10 2 ιεηάβναθα ng -1 RNA) ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα (6.7 x10 2 ιεηάβναθα ng -1 RNA). Ακαθμνζηά ιε ηδκ επίδναζδ ημο πνυκμο, παναηδνήεδηακ ζδιακηζηά παιδθυηενεξ ηζιέξ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ζηζξ 30 (4.3x10 2 ιεηάβναθα ng -1 RNA) ηαζ 90 διένεξ (2.7x10 2 ιεηάβναθα ng -1 RNA) ιεηά ηδκ επέιααζδ ζε ζπέζδ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ ζηζξ 3 διένεξ (8.5x10 2 ιεηάβναθα ng -1 RNA). Σέθμξ, παναηδνήεδηε ζδιακηζηή αθθδθεπίδναζδ ιεηαλφ ηςκ δφμ παναβυκηςκ (p=0.001) μπυηε ηαζ ιεθεηήεδηε παναπένα δ δζαθμνά ζηδκ αθεμκία ηςκ ιεηαβνάθςκ ιεηαλφ ηςκ δφμ ιεηαπεζνίζεςκ ζημ ηάεε πνυκμ λεπςνζζηά. Έηζζ παναηδνήεδηε ιζα ζδιακηζηή ιείςζδ ζηδκ αθεμκία ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ επέιααζδ EQ ηαζ ζοθθέπεδηακ 3 διένεξ ιεηά ζε ζπέζδ ιε ηα ακηίζημζπα δείβιαηα ιάνηονεξ (Γζάβναιια 5.34β). 398

399 Εικόνα Ενίςχυςθ του γονιδίου amoa των ΑΟB με τθν τεχνικι τθσ PCR πραγματικοφ χρόνου, όταν ωσ εκμαγείο χρθςιμοποιικθκε cdna. (α) καμπφλθ αναφοράσ, (β) καμπφλθ ενίςχυςθσ και (γ) καμπφλθ αποδιάταξθσ. 399

400 Διάγραμμα Επίδραςθ του ethoxyquin ςτον αρικμό των μεταγράφων του γονιδίου amoa των ΑΟΒ όταν για τθ ςφνκεςθ του cdna χρθςιμοποιικθκαν (β) τυχαία εξαμερι ι (γ) εξειδικευμζνοσ εκκινθτισ. Για λόγουσ ςφγκριςθσ παρουςιάηονται και τα αντίςτοιχα αποτζλεςματα του αρικμοφ αντιγράφων του γονιδίου amoa των ΑΟΒ. Κάκε τιμι αντιςτοιχεί ςτο μζςο όρο 3 επαναλιψεων ± τυπικι απόκλιςθ. Διαφορετικά γράμματα υποδθλϊνουν ςτατιςτικά ςθμαντικζσ διαφορζσ μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο (p< 0.05). Δπίδξαζε ηνπ ethoxyquin ζηνλ αξηζκό ησλ κεηαγξάθσλ ηνπ γνληδίνπ amoa ησλ ληηξσδνπνηεηηθώλ αξραίσλ ζην έδαθνο Γζα ηδκ ηαιπφθδ ακαθμνάξ ηςκ ΑΟΑ πνδζζιμπμζήεδηακ μζ αναζχζεζξ 5.3x10 1 έςξ 5.3x10 8 ιεηάβναθα ακά ιl RNA. Ζ απμηεθεζιαηζηυηδηα ηδξ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ήηακ 89.7%, ιε r 2 = ηαζ ηθίζδ ηαιπφθδξ ηδκ Eζηυκα 5.22 θαίκμκηαζ μζ ηαιπφθεξ ακαθμνάξ, εκίζποζδξ ηαζ απμδζάηαλδξ ηςκ ΑΟΑ. 400

401 Ο ανζειυξ ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο πμο πνμέηορε βζα ηάεε πενζααθθμκηζηυ δείβια, ιεηαηνάπδηε ζε ανζειυ ιεηαβνάθςκ ακά ng RNA πμο πνδζζιμπμζήεδηε ζηδκ ακηίδναζδ. Oζ ηζιέξ βζα ηα ΑΟΑ, ζηδκ πενίπηςζδ πμο βζα ηδκ παναβςβή cdna πνδζζιμπμζήεδηακ ηοπαία ελαιενή ηοιάκεδηακ απυ 5.98 x10 0 έςξ 1.1 x10 3 ιεηάβναθα ng -1 RNA, εκχ ζηδκ πενίπηςζδ πμο βζα ηδκ παναζηεοή cdna πνδζζιμπμζήεδηε ελεζδζηεοιέκμξ εηηζκδηήξ απυ 2.9 x10 2 έςξ 8.1 x10 3. Όπςξ ήηακ ακαιεκυιεκμ ηαζ ζε αοηή ηδκ πενίπηςζδ δ πνήζδ ημο ελεζδζηεοιέκμο εηηζκδηή μδήβδζε ζε ιεβαθφηενδ ακάηηδζδ υζμκ αθμνά ζηδ ζφκεεζδ ημο cdna. φιθςκα ιε ηδκ ζηαηζζηζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ (Two-way Anova, LSD Test), ζηδκ πενίπηςζδ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ηοπαία ελαιενή ηυζμ ηα β.θ.. πμο πνδζζιμπμζήεδηακ υζμ ηαζ μ πνυκμξ, ςξ ηφνζμζ πανάβμκηεξ, πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p=0.010 ηαζ p=0.009, ακηίζημζπα) ζημκ ανζειυ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ ζημ έδαθμξ. Έηζζ, δ επέιααζδ ιε EQ μδήβδζε ζε ζδιακηζηή ιείςζδ ημο ανζειμφ ιεηαβνάθςκ ημο βμκζδίμο amoa ηςκ ΑΟΑ (5.2x10 1 ιεηάβναθα ng -1 RNA) ζε ζπέζδ ιε ημ ιάνηονα (2.9 x10 2 ιεηάβναθα ng -1 RNA). Ακαθμνζηά ιε ηδκ επίδναζδ ημο πνυκμο, μζ ορδθυηενεξ ηζιέξ ανζειμφ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ παναηδνήεδηακ ζηζξ 3 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ (3.7 x10 2 ιεηάβναθα ng -1 RNA). διακηζηή ήηακ επίζδξ ηαζ δ αθθδθεπίδναζδ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ (p=0.006) πμο μδήβδζε ζε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζημκ ανζειυ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ ζημ έδαθμξ. οβηεηνζιέκα, παναηδνήεδηε ζδιακηζηή ιείςζδ ημο ανζειμφ ηςκ ιεηαβνάθςκ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ επέιααζδ ιε EQ ζηζξ 3 διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημο ζημ έδαθμξ ζε ζπέζδ ιε ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ ζηα δείβιαηα ημο ιάνηονα. Ζ ζδιακηζηή αοηή δζαθμνά δεκ ήηακ ειθακήξ ζηζξ 30 ηαζ 90 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή (Γζάβναιια 5.35α). Ακάθμβα ήηακ ηα απμηεθέζιαηα ζηδκ πενίπηςζδ πμο πνδζζιμπμζήεδηε ελεζδζηεοιέκμξ εηηζκδηήξ βζα ηδ ζφκεεζδ ημο cdna. Έηζζ ηυζμ ηα β.θ.. υζμ ηαζ μ πνυκμξ, πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ (p=0.025 ηαζ p=0.008, ακηίζημζπα) ζηδκ αθεμκία ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΑ. Γεκζηά, μ ανζειυξ ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ήηακ ζδιακηζηά παιδθυηενμξ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ επέιααζδ ιε EQ (1.6 x10 3 ιεηάβναθα ng -1 RNA) ζε ζπέζδ ιε ηα ακηίζημζπα ημο ιάνηονα (3.2 x10 3 ιεηάβναθα ng -1 RNA). Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, ακελάνηδηα ιε ηδκ ιεηαπείνζζδ παναηδνήεδηε ζδιακηζηά παιδθυηενδ αθεμκία ιεηαβνάθςκ ζηζξ 90 διένεξ απυ ηδκ επέιααζδ (7.2x10 2 ιεηάβναθα ng -1 RNA), ζοβηνζηζηά ιε ηζξ ακηίζημζπεξ ηζιέξ ζηζξ 3 (2.4 x10 3 ιεηάβναθα ng -1 RNA) ηαζ ζηζξ

402 διένεξ (2.1x10 3 ιεηάβναθα ng -1 RNA). Σέθμξ, παναηδνήεδηακ ζδιακηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ δφμ ηφνζςκ παναβυκηςκ (p=0.018) ιε ζδιακηζηά παιδθυηενεξ ηζιέξ ανζειμφ ιεηαβνάθςκ κα ηαηαβνάθμκηαζ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ EQ ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα ζηζξ 3 διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημο ζημ έδαθμξ (Γζάβναιια 5.35β). Εικόνα Ενίςχυςθ του γονιδίου amoa των ΑΟΑ με τθν τεχνικι τθσ PCR πραγματικοφ χρόνου, όταν ωσ εκμαγείο χρθςιμοποιικθκε cdna. (α) καμπφλθ αναφοράσ, (β) καμπφλθ ενίςχυςθσ και (γ) καμπφλθ αποδιάταξθσ. 402

403 Διάγραμμα Επίδραςθ του ethoxyquin ςτον αρικμό των μεταγράφων του γονιδίου amoa των ΑΟΑ όταν για τθ ςφνκεςθ του cdna χρθςιμοποιικθκαν (β) τυχαία εξαμερι ι (γ) εξειδικευμζνοσ εκκινθτισ. Για λόγουσ ςφγκριςθσ παρουςιάηονται και τα αντίςτοιχα αποτζλεςματα του αρικμοφ αντιγράφων του γονιδίου amoa των ΑΟΑ. Κάκε τιμι αντιςτοιχεί ςτο μζςο όρο 3 επαναλιψεων ± τυπικι απόκλιςθ. Διαφορετικά γράμματα υποδθλϊνουν ςτατιςτικά ςθμαντικζσ διαφορζσ μεταξφ των μεταχειρίςεων ςτον ίδιο χρόνο (p< 0.05) πδήηεζε ηδκ πανμφζα ιεθέηδ αλζμθμβήεδηε δ επίδναζδ ηςκ β.θ.., πμο πενζέπμκηαζ ζηα απυαθδηα ηςκ ζοζηεοαζηδνίςκ θνμφηςκ, ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Πανάθθδθα, πνμζδζμνίζηδηε δ πμνεία ηδξ απμδυιδζδξ ημοξ ζημ έδαθμξ χζηε κα ιεθεηδεμφκ πζεακέξ ζοζπεηίζεζξ ιεηαλφ ηδξ οπμθεζιιαηζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ηαζ πζεακχκ επζδνάζεςκ ζηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα. H αλζμθυβδζδ ηςκ επζδνάζεςκ έβζκε ζε επίπεδα ζοβηεκηνχζεςκ πμο ακαιέκμκηαζ κα ανεεμφκ ζημ έδαθμξ εάκ ηα 403

404 απυαθδηα απυ ηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ απμννζθεμφκ ζημ έδαθμξ πςνίξ πνμδβμφιεκδ επελενβαζία. Μέπνζ ζήιενα δεκ οπάνπμοκ αζαθζμβναθζηέξ ακαθμνέξ ζπεηζηά ιε ηδκ επίδναζδ ηςκ β.θ.. πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ, ζηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ ηαζ ζδζαίηενα ζηζξ ααζζηέξ ιζηνμαζαηέξ θεζημονβίεξ πμο απμηεθμφκ ακαπυζπαζημ ημιιάηζ ηδξ μιαθήξ θεζημονβίαξ ημο μζημζοζηήιαημξ. Δπζπθέμκ, πενζμνζζιέκα είκαζ ηα ζημζπεία πμο αθμνμφκ ζηδκ ηφπδ ηαζ ηδ ζοιπενζθμνά ηςκ εκ θυβς μοζζχκ ζημ έδαθμξ ηαζ πνμηφπημοκ ςξ επί ημ πθείζημκ απυ ηα δεδμιέκα πμο ζοκμδεφμοκ ηζξ αζηήζεζξ έβηνζζδξ ηοηθμθμνίαξ ημοξ (EFSA 2012, 2010a, 2008, EC 2001). Σμ βεβμκυξ αοηυ μθείθεηαζ ζηδκ εζθαθιέκδ εεχνδζδ υηζ δ πζεακυηδηα κα ηαηαθήλμοκ ζημ έδαθμξ είκαζ πενζμνζζιέκδ, θυβς ηδξ εθανιμβήξ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ β.θ. ζε ηθεζζηυ πχνμ (εκηυξ ηςκ ζοζηεοαζηδνίςκ). Πανυθα αοηά δ έθθεζρδ ιεευδςκ βζα ηδκ επελενβαζία ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ απμαθήηςκ εοκμεί ηδκ απυννζρδ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ απμαθήηςκ πςνίξ πνμδβμφιεκδ επελενβαζία ζε παναηείιεκμοξ αβνμφξ ιε απμηέθεζια ηδκ αολδιέκδ πζεακυηδηα έηεεζδξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ β.θ.. Αλάπηπμε κεζόδσλ αλάιπζεο θαη πξνζδηνξηζκνύ ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ θαη επηιεγκέλσλ πξντόλησλ κεηαβνιηζκνύ ηνπο ζην έδαθνο Γζάθμνεξ ιέεμδμζ έπμοκ ακαπηοπεεί βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ β.θ. πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ιεηαζοθθεηηζηά ζηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ. Οζ πενζζζυηενεξ απυ αοηέξ αθμνμφκ ζηδκ παναθααή ηςκ β.θ.. απυ οπμζηνχιαηα υπςξ θνμφηα ηαζ θαπακζηά (Koesukwiwat et al., 2010, Lehotay 2004, Yamazaki and Ninomiya, 1999), ηνέαξ (Brannegan, 2000), ράνζα (He and Ackman, 2000), γςμηνμθέξ (Schreier and Greene, 1997), ιπαπανζηά (Viñas et al., 1999), κενυ (Wu et al, 2009) ηαζ οβνά αζμιδπακζηά απυαθδηα (Victor et al., 1984). H πζμ δζαδεδμιέκδ ιέεμδμξ ζηδκ πενίπηςζδ ακάθοζδξ ηςκ οπμθεζιιάηςκ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ β.θ.. ηονίςξ ζε θνμφηα, ιδθμεζδή ηαζ εζπενζδμεζδή, είκαζ δ ιέεμδμξ QuEChERS (Anastassiades et al., 2003) πμο απμηεθεί ιζα βνήβμνδ, εφημθδ, μζημκμιζηή, απμηεθεζιαηζηή ηαζ αζθαθή ιέεμδμ, υπςξ πνμηφπηεζ ηαζ απυ ηα ανπζηά πμο ζοκεέημοκ ημ μκμιά ηδξ (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe). Ζ ιέεμδμξ QuEChERS ααζίγεηαζ ζε ιζα ζφκημιδ εηπφθζζδ ημο δείβιαημξ ιε αηεημκζηνίθζμ, αημθμοεμφιεκδ απυ έκα ζηάδζμ ηαεανζζιμφ ιε πνήζδ αθάηςκ. Δπίζδξ έπμοκ ακαπηοπεεί ηαζ ακθένμκηαζ ζηδ αζαθζμβναθία άθθεξ ιέεμδμζ, πενζζζυηενμ πμθφπθμηεξ, πμο πενζθαιαάκμοκ εηπφθζζδ ιε ηδ πνήζδ 404

405 μνβακζηχκ δζαθοηχκ, αοηυκμια ή ζε ιίβια ηαζ επαηυθμοεα ζηάδζα ηαεανζζιμφ ιε πνςιαημβναθία ζηήθδξ, νφειζζδ ph, ηαηακμιή οβνμφ-οβνμφ ή ακαθοηζηά μνβάκα ορδθήξ ηεπκμθμβίαξ (Wu et al, 2009, Yoshioka et al., 2004, Rodríguez et al 2002). Χζηυζμ, εθάπζζηεξ είκαζ ζηδ αζαθζμβναθία oζ δζαεέζζιεξ ιέεμδμζ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ αοηχκ ηςκ β.θ. ζημ έδαθμξ (Wu et al, 2009, Cayley and Lord, 2006, Solel et al, 1979) ηαζ αθμνμφκ ηονίςξ ζηδκ παναθααή ημο ιοηδημηηυκμο TBZ, ημ μπμίμ πνδζζιμπμζείηαζ ηαζ πνμζοθθεηηζηά ζημκ αβνυ βζα ηδκ πνμζηαζία θνμφηςκ ηαζ θαπακζηχκ απυ ιοηδημθμβζηέξ πνμζαμθέξ (Schirra et al., 2002). Γεδμιέκδξ ηδξ πενζμνζζιέκδξ δζαεεζζιυηδηαξ ιεευδςκ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ β.θ.. πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ ζε εδαθζηά δείβιαηα, ζηδκ πανμφζα ενβαζία ανπζηά ακαπηφπεδηακ ηαζ επζηονχεδηακ ακαθοηζηέξ ιέεμδμζ εηπφθζζδξ ηαζ παναθααήξ ηςκ δναζηζηχκ μοζζχκ (ηαεχξ ηαζ επζθεβιέκςκ ιεηααμθζηχκ ημοξ) απυ ημ έδαθμξ. Οζ ιέεμδμζ πμο ακαπηφπεδηακ πνδζζιμπμζήεδηακ ζηδ ζοκέπεζα βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ πμνείαξ απμδυιδζδξ ημοξ ζημ έδαθμξ. ηυπμξ ήηακ δ επίηεολδ ορδθχκ επζπέδςκ ακάηηδζδξ ζε ιεβάθμ εφνμξ ζοβηεκηνχζεςκ ηαζ ιε ζηακμπμζδηζηή επακαθδρζιυηδηα ηςκ ιεηνήζεςκ. Χξ πνμτπμεέζεζξ βζα ηδκ ηεθζηή επζθμβή ηςκ ιεευδςκ ηέεδηακ (1) δ εοημθία ηδξ ιεευδμο ηαζ μ ζφκημιμξ πνυκμξ βζα ηδκ ακάθοζδ ηςκ εδαθζηχκ δεζβιάηςκ ηαζ (2) ημ ηυζημξ ηαζ δ πμζυηδηα ηςκ απαζημφιεκςκ ακηζδναζηδνίςκ ηαζ θμζπχκ ακαθςζίιςκ ηαζ μνβάκςκ. Ζ απμηεθεζιαηζηυηδηα υθςκ ηςκ ιεευδςκ πμο ακαπηφπεδηακ ήηακ απμδεηηή ηαζ μζ ηζιέξ ηδξ ιέζδξ ακάηηδζδξ ηοιάκεδηακ απυ 69.7 έςξ % (SANCO Doc, 2011). Ζ ζπεηζηή ηοπζηή απυηθζζδ (RSD), πμο πνδζζιμπμζήεδηε ςξ ιέηνμ ηδξ επακαθδρζιυηδηαξ ηςκ ιεευδςκ ακάθοζδξ, ήηακ ζε ηάεε πενίπηςζδ < 20%. Σμ παιδθυηενμ πμζμζηυ ακάηηδζδξ (69.7%) ηαζ ηαοηυπνμκα μζ ορδθυηενεξ ηζιέξ ηοπζηήξ απυηθζζδξ (18.0%) παναηδνήεδηακ ζηδκ εηπφθζζδ ημο EQNL, μλεζδςηζημφ παναβχβμο ημο ΔQ. ημ εφνμξ ζοβηεκηνχζεςκ πμο ιεθεηήεδηακ παναηδνήεδηε βναιιζηή ζοζπέηζζδ ιεηαλφ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ηςκ οπυ ιεθέηδ β.θ. ηαζ ηδξ ακηαπυηνζζδξ ημο πνςιαημβνάθμο ηαζ δ ηζιή ημο ζοκηεθεζηή πνμζανιμβήξ (R 2 ) ήηακ ζε ηάεε πενίπηςζδ ηζξ επζιένμοξ ιεευδμοξ πμο ακαπηφπεδηακ πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ επί ημ πθείζημκ ημζκμί μνβακζημί δζαθφηεξ (ιεεακυθδ ηαζ αηεημκζηνίθζμ), μ ιέβζζημξ πνυκμξ εηπφθζζδξ ήηακ 2 χνεξ (πενίπηςζδ ΣΒΕ) ηαζ μ ιέβζζημξ υβημξ δζαθφηδ εηπφθζζδξ ήηακ 25 ml (πενίπηςζδ ΟΡΡ ηαζ DPA), εκχ δ ηαοημπμίδζδ ηαζ μ πμζμηζηυξ πνμζδζμνζζιυξ πναβιαημπμζήεδηε ζε απθυ ζφζηδια HPLC ιε UV ακζπκεοηή. φιθςκα ιε ηα παναπάκς, μζ ακαθοηζηέξ ιέεμδμζ πμο 405

406 ακαπηφπεδηακ ζημ πθαίζζμ ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ, ιπμνμφκ κα εθανιμζημφκ ζε εονεία ηθίιαηα βζα ημκ πμζμηζηυ ηαζ πμζμηζηυ πνμζδζμνζζιυ ηςκ οπυ ιεθέηδ β.θ.. ηαζ επζθεβιέκςκ ιεηααμθζηχκ ημοξ ζημ έδαθμξ. Μειέηε ηεο πνξείαο απνδόκεζεο ηεο γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζην έδαθνο Οζ ιέεμδμζ ακάθοζδξ ηαζ πνμζδζμνζζιμφ πμο ακαπηφπεδηακ εθανιυζηδηακ βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ πμνείαξ απμδυιδζδξ ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ. Ζ πμνεία ηδξ απμδυιδζδξ υθςκ ηςκ β.θ. πμο ιεθεηήεδηακ ζημ έδαθμξ πενζβνάθδηε ζηακμπμζδηζηά απυ ημ δζθαζζηυ ιμκηέθμ Hockey-Stick (x 2 < 15, r 2 > 0.75), εκχ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ IMZ ηαζ ΟΡΡ, δ πνμκζηή ελέθζλδ ηδξ απμδυιδζδξ πενζβνάθδηε ελίζμο ζηακμπμζδηζηά ηαζ απυ ημ ιμκηέθμ ηζκδηζηήξ πνχηδξ ηάλδξ. Σα απμηεθέζιαηα αοηά ανίζημκηαζ ζε ζοιθςκία ιε πνμδβμφιεκεξ ακαθμνέξ ζπεηζηά ιε ηδκ ηζκδηζηή απμδυιδζδξ ηςκ ΗΜΕ (Omirou et al., 2012, EFSA 2010a) ηαζ ΟΡΡ (EFSA 2008). Ακηίεεηα, πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ απυ ημοξ Omirou et al., (2012), ακαθένμοκ υηζ δ απμδυιδζδ ημο ΣΒΕ ζε έδαθμξ ηαζ δζάθμνα μνβακζηά οπμζηνχιαηα αημθμφεδζε ηζκδηζηή πνχηδξ ηάλδξ. Σέθμξ, ακαθμνζηά ιε ηα ακηζμλεζδςηζηά DPA ηαζ EQ δεκ οπάνπμοκ ζηδ αζαθζμβναθία ακάθμβα ζημζπεία (EFSA 2012, 2010b). Σμ πενζζζυηενμ οπμθεζιιαηζηυ β.θ.. απυ αοηά πμο ιεθεηήεδηακ απμδείπεδηε υηζ ήηακ ημ ΗΜΕ ιε ηζιή DT διένεξ ηαζ αημθμφεδζε ημ ΣΒΕ ιε DT διένεξ. Ακηίεεηα, δ απμδυιδζδ ηςκ ΟΡΡ, DPA ηαζ EQ ήηακ ηαπεία ιε ηζιέξ DT 50 0,6, 1,3 ηαζ 2,2 διένεξ ακηίζημζπα (Πίκαηαξ 5.18). Πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ απυ ημοξ Omirou et al., (2012) ζε αθηαθζηυ έδαθμξ (ph 7.9) μδήβδζακ ζε παιδθυηενεξ ηζιέξ DT 50, 77.8 ηαζ 28.6 διένεξ, βζα ηα ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ, ακηίζημζπα. Ακάθμβεξ ιεηνήζεζξ πμο πναβιαημπμζήεδηακ ζημ πθαίζζμ αλζμθυβδζδξ ηςκ θαηέθςκ βζα ηδκ έβηνζζδ πνήζδξ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ β.θ.. έδεζλακ ηζιέξ DT 50 πμο ηοιαίκμκηακ απυ διένεξ βζα ημ ΗΜΕ (EFSA 2010a) ηαζ διένεξ βζα ημ ΣΒΕ (EPA 2000, Aharonson and Kafkafi, 1975) ηαζ δζαθένμοκ απυ ηζξ ηζιέξ πμο ηαηαβνάθδηακ ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ. Ακαθμνζηά ιε ημ ΟΡΡ, ηα απμηεθέζιαηα ιαξ είκαζ ζε ζοιθςκία ιε πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ πμο πανμοζίαζακ ηζιέξ DT 50 = 0.11 ιένεξ ζε αιιμπδθχδεξ έδαθμξ, ιε ph 6.0 ηαζ πενζεηηζηυηδηα ζε μνβακζηυ άκεναηα 2.5% (EFSA 2008). Σέθμξ, βζα ηα ακηζμλεζδςηζηά DPA ηαζ EQ δεκ οπάνπμοκ ζηδ αζαθζμβναθία ακάθμβα ζημζπεία (EFSA 2012, 2010b) ηαζ ηα απμηεθέζιαηα ιαξ απμηεθμφκ ηζξ πνχηεξ ιεθέηεξ ζοιπενζθμνάξ ηαζ οπμθεζιιαηζηυηδηαξ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ ακηζμλεζδςηζηχκ μοζζχκ ζημ έδαθμξ. 406

407 Ζ πμνεία ηδξ απμδυιδζδξ ιζαξ μοζίαξ ζημ έδαθμξ είκαζ ζοκάνηδζδ πθήεμοξ παναβυκηςκ υπςξ είκαζ δ εενιμηναζία, δ ανπζηή ζοβηέκηνςζδ ηδξ μοζίαξ ζημ έδαθμξ ηαζ ηα ζδζαίηενα παναηηδνζζηζηά ημο εδάθμοξ, υπςξ δ πενζεηηζηυηδηα ζε μνβακζηή μοζία ηαζ άνβζθμ, ημ ph, δ οβναζία ημο εδάθμοξ ηαζ ηα δζαεέζζια ακυνβακα ζοζηαηζηά (Chowdhury et al., 2008, Pal et al., 2006). Δπμιέκςξ, μζ δζαθμνέξ πμο παναηδνμφκηαζ ιεηαλφ ηςκ δζαθμνεηζηχκ ιεθεηχκ ςξ πνμξ ηδκ ηζκδηζηή ηαζ ημοξ πνυκμοξ διζζείαξ γςήξ ηςκ β.θ. είκαζ πζεακυ κα μθείθμκηαζ ζε δζαθμνμπμζήζεζξ εκυξ ή ηαζ πενζζζμηένςκ απυ ημοξ παναπάκς πανάβμκηεξ. ε ηάεε πενίπηςζδ ηα παναπάκς απμηεθέζιαηα επζαεααζχκμοκ ηδκ βεκζηυηενδ εηηίιδζδ υηζ ηα ιοηδημηηυκα ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ απμηεθμφκ ζδζαίηενα οπμθεζιιαηζηά ιυνζα ζημ έδαθμξ ζε ακηίεεζδ ιε ηα ΟΡΡ, DPA ηαζ EQ, πμο δζαζπχκηαζ ηαπφηαηα ζημ έδαθμξ. Απνδόκεζε θαη κεηαβνιηζκόο ηνπ ethoxyquin ζην έδαθνο Ηδζαίηενμ εκδζαθένμκ πανμοζίαζε δ ζοιπενζθμνά ημο ΔQ ζημ έδαθμξ ηαεχξ παναηδνήεδηε υηζ αιέζςξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημο ζημ έδαθμξ μλεζδχκεηαζ ηαπφηαηα πνμξ QI ηαζ EQNL. Γζα ημκ θυβμ αοηυ ιεθεηήεδηε δ πμνεία απμδυιδζδξ ημο EQ ηαζ ηςκ παναβχβςκ ημο ηυζμ ιειμκςιέκα υζμ ηαζ ςξ ζοκμθζηά ημλζηά οπμθείιιαηα. Ζ ηεθεοηαία επζθμβή μθείθεηαζ ζηδ δζαπίζηςζδ υηζ δ ιεηαηνμπή ημο EQ πνμξ QI ηαζ EQNL πναβιαημπμζμφκηακ ιενζηχξ ηαζ ηαηά ηδκ δζάνηεζα ηδξ δζαδζηαζίαξ εηπφθζζδξ. ε ακάθμβεξ παναηδνήζεζξ ηαηέθδλακ ηαζ άθθμζ ενεοκδηέξ, ζημ πανεθευκ υπςξ μ Brannegan (2000) πμο παναηήνδζε ηαπφηαηδ ιεηαηνμπή ημο EQ ζε ηνία ηφνζα μλεζδςηζηά πανάβςβα (EQNL, QI, ηαζ ημ δζιενέξ ημο ΔQ) ηαηά ηδ δζαδζηαζία εηπφθζζδξ ημο απυ δείβιαηα ιμζπανίζζμο ηνέαημξ. Ακηίζημζπα, μζ Gallagher and Stahr (1980) δζαπίζηςζακ ηδκ πανμοζία ημο ιεηααμθίηδ EQNL ζε γςμηνμθέξ ηαζ μζ He and Ackman (2000) δζαπίζηςζακ ηδκ πανμοζία ηςκ QI ηαζ 1,8 δζιενμφξ ημο EQ ζε ζζημφξ ρανζμφ ηαζ ζε ηνμθή βζα ράνζα. Απυ ηα παναπάκς πνμηφπηεζ υηζ ημ είδμξ ηςκ παναβυιεκςκ ιεηααμθζηχκ ελανηάηαζ ζε ιεβάθμ ααειυ απυ ημ είδμξ ημο οπμζηνχιαημξ. Σμ ιυνζμ ημο EQ ζοβηεκηνχκεζ έκα πθήεμξ ζδζαίηενςκ παναηηδνζζηζηχκ πμο δζηαζμθμβμφκ ςξ έκα ααειυ ηδκ παναπάκς ζοιπενζθμνά ημο ζημ έδαθμξ ηαζ ηα οπυθμζπα οπμζηνχιαηα. οβηεηνζιέκα, ημ EQ είκαζ αζεεκήξ αάζδ (pκa=4.56, ζημοξ 25 C), δζαζπάηαζ άιεζα πανμοζία μλοβυκμο ή θςηυξ, οπυηεζηαζ ζε εενιζηή δζάζπαζδ, πανμοζζάγεζ αζηάεεζα ζημοξ πενζζζυηενμοξ μνβακζημφξ δζαθφηεξ, έπεζ ζζπονή ακηζμλεζδςηζηή δνάζδ ηαζ ηαηά ηδκ ακηίδναζδ ημο ιε ημ μλοβυκμ 407

408 ιεηαηνέπεηαζ ζημοξ μλεζδςιέκμοξ ιεηααμθίηεξ ημο (Thorisson et al., 1992, Viñas et al., 1991, Perfetti et al., 1981, Skaare and Dahle, 1975). ηδκ πανμφζα ιεθέηδ, υθα ηα ακαθοηζηά πνυηοπα δζαθφιαηα ημο EQ ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημο πνμεημζιάζηδηακ ζε δζαθφηδ αηεημκζηνίθζμ, πμο ζφιθςκα ιε ηδ αζαθζμβναθία (Perfetti et al., 1981), αθθά ηαζ ιε πνμζςπζηέξ παναηδνήζεζξ, δεκ επδνεάγεζ ηδ ζηαεενυηδηα ημο ιμνίμο ημο EQ, εκχ ηαζ δ εηπφθζζδ ηαζ παναθααή ηδξ μοζίαξ απυ ηα εδαθζηά δείβιαηα έβζκε ιε πνήζδ ημο ίδζμο δζαθφηδ. Δπζπθέμκ, υθεξ μζ δζαδζηαζίεξ πμο αθμνμφκ ζηδκ εηπφθζζδ πναβιαημπμζήεδηακ ζημοξ 4 C, ζε ζημηεζκυ ροπνυ εάθαιμ πνμηεζιέκμο κα πενζμνζζηεί ζημ εθάπζζημ δ επίδναζδ ηςκ παναβυκηςκ ηδξ εενιμηναζία ηαζ ημο θςηυξ. Σέθμξ, πνδζζιμπμζήεδηε ηνμπμπμζδιέκδ δ ιέεμδμξ QuΔChERS (Anastassiades et al., 2003), ιε ζημπυ ημκ πενζμνζζιυ ζημ εθάπζζημ δοκαηυ ημο πνυκμο εηπφθζζδξ, πμο ιε αάζδ ανπζηέξ παναηδνήζεζξ ιαξ ζηα πθαίζζα ακάπηολδξ ηδξ ιεευδμο, θαίκεηαζ κα επδνεάγεζ ημ ααειυ απμδυιδζδξ ημο ιμνίμο. οβηεηνζιέκα υζμ ιεβαθφηενμξ είκαζ μ πνυκμξ ηδξ εηπφθζζδξ ηαζ ζοκεπχξ μ πνυκμξ ηδξ επαθήξ ηδξ δναζηζηήξ μοζίαξ ιε ημ οπυζηνςια ημο εδάθμοξ ηυζμ ιεβαθφηενμξ ανέεδηε κα είκαζ μ ααειυξ ηδξ απμδυιδζδξ ημο (Βθέπε Πανάνηδια Δζηυκεξ Π4, Π5). Πνμηεζιέκμο ςζηυζμ κα απμηθεζζηεί εκηεθχξ ημ εκδεπυιεκμ δ πανμοζία ηςκ δφμ ιεηααμθζηχκ ζηα εδαθζηά δείβιαηα πμο ιεθεηήεδηακ κα μθείθεηαζ ζηζξ ζοκεήηεξ ηαηά ηδ δζαδζηαζία ηδξ ακαθοηζηήξ ιεευδμο, πναβιαημπμζήεδηακ ζοιπθδνςιαηζηά πεζνάιαηα ακάηηδζδξ (Βθέπε Πανάνηδια) ζε υλζκμ άιιμπδθχδεξ έδαθμξ (ph 4.53) ιε δζαθμνεηζηά θοζζημπδιζηά παναηηδνζζηζηά απυ αοηά ημο εδάθμοξ πμο ιεθεηήεδηε ζηα πεζνάιαηα πμο πανμοζζάζηδηακ ζημ πανυκ Κεθάθαζμ. Δπίζδξ, ελεηάζηδηε δ ακάηηδζδ ημο EQ ηαζ μ ιεηααμθζζιυξ ημο ηαηά ηδκ δζαδζηαζία εηπφθζζδξ ζε απμζηεζνςιέκμ δείβια εδάθμοξ απυ ημ ανπζηυ αθηαθζηυ έδαθμξ. ημπυξ ηςκ παναπάκς πεζναιάηςκ ήηακ κα απμηθεζζηεί δ πζεακυηδηα δ ηαπφηαηδ ιεηαηνμπή ημο EQ κα μθείθεηαζ ζημ ph ή ζε άθθα θοζζημπδιζηά παναηηδνζζηζηά ημο εδάθμοξ ή ζηδ δνάζδ ιζηνμμνβακζζιχκ, ακηίζημζπα. Καζ ζηζξ δφμ παναπάκς πενζπηχζεζξ παναηδνήεδηε ηαπφηαηδ ιεηαηνμπή ημο EQ ζημοξ δφμ ηφνζμοξ ιεηααμθίηεξ ημο ιε νοειμφξ ακάθμβμοξ ιε αοημφξ πμο παναηδνήεδηακ ζημ ανπζηυ έδαθμξ. Ακηίεεηα, υηακ δ ιέεμδμξ εηπφθζζδξ εθανιυζηδηε ζε επζαανοιέκδ ιε EQ παθαγζαηή άιιμ, πμο απμηεθεί ζε βεκζηέξ βναιιέξ έκα αδνακέξ οθζηυ, ημ ιμκαδζηυ πνμσυκ πμο πνμζδζμνίζηδηε ήηακ ημ EQ, ιε ακάηηδζδ πενίπμο 99%. Με αάζδ υθα ηα παναπάκς, ηαηαθήβμοιε ζημ ζοιπέναζια υηζ ημ EQ αθθδθεπζδνά άιεζα ιε 408

409 μνζζιέκα ζοζηαηζηά ημο εδάθμοξ πμο ηαηαθφμοκ ηδκ ηαπφηαηδ ιεηαηνμπή ημο ζε QI ηαζ EQNL. Απυ ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ ζοβηεκηνχζεςκ ημο EQ ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημο ζηα επζιένμοξ εδαθζηά δείβιαηα, πνμέηορε υηζ ζηδκ πενίπηςζδ ημο οπυ ιεθέηδ εδάθμοξ ηφνζμξ ιεηααμθίηδξ ήηακ ημ QI εκχ ημ EQNL ανέεδηε ζε ιζηνέξ πμζυηδηεξ. Παναημθμφεδζδ ηδξ απμδυιδζδξ ημο EQ ηαζ ηςκ μλεζδςιέκςκ παναβχβςκ ημο ζημ έδαθμξ έδεζλε ιζα ηαπφηαηδ ιεηαηνμπή ημο ιδηνζημφ ιμνίμο πνμξ QI εκηυξ ηςκ πνχηςκ 8 ςνχκ ιεηά ηδκ εθανιμβή ημο ΔQ ζημ έδαθμξ. Σμ QI ζηδκ ζοκέπεζα απμδμιήεδηε πθήνςξ ζηζξ επυιεκεξ 14 διένεξ απμδεζηκφμκηαξ υηζ ηυζμ ημ ιδηνζηυ ιυνζμ υζμ ηαζ μ ηφνζμξ ιεηααμθίηδξ ημο QI, πανμοζζάγμοκ πενζμνζζιέκδ οπμθεζιιαηζηυηδηα ζημ έδαθμξ. Ακηίεεηα, μ έηενμξ ιεηααμθίηδξ, EQNL, πμο ζπδιαηίζηδηε ζε παιδθέξ πμζυηδηεξ απυ ηδκ ανπή ημο πεζνάιαημξ ζημ έδαθμξ ειθάκζζε ιαηνά οπμθεζιιαηζηυηδηα ηαζ πανέιεζκε ζηαεενυξ ηαευθδ ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ. οκμθζηά ηα απμηεθέζιαηα ιαξ δείπκμοκ υηζ ημ EQ ιεηαηνέπεηαζ άιεζα ζε QI ηαζ EQNL (Δζηυκα 5.23) ιε ημ πνχημ πνμσυκ κα απμιαηνφκεηαζ ζπεηζηά βνήβμνα απυ ημ έδαθμξ ζε ακηίεεζδ ιε ημ δεφηενμ πμο έδεζλε ορδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα πανά ηζξ παιδθέξ πμζυηδηεξ ζηζξ μπμίεξ ζπδιαηίγεηαζ. Αοηέξ είκαζ μζ πνχηεξ ηαζ ιμκαδζηέξ ιεθέηεξ ςξ ζήιενα βζα ηδκ ζοιπενζθμνά ημο EQ ζημ έδαθμξ. Δηθόλα πδιαηζηή απεζηυκζζδ ημο ιεηααμθζζιμφ ημο ethoxyquin ζημ έδαθμξ υπςξ παναηδνήεδηε ζηδκ πανμφζα ενβαζία. 409

410 Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηε ιεηηνπξγία, ηελ ζύζηαζε θαη ην κέγεζνο ηεο κηθξνβηαθήο θνηλόηεηα ηνπ εδάθνπο Ανπζηά, εηηζιήεδηε δ επίδναζδ ηςκ β.θ. πμο πενζέπμκηαζ ζηα απυαθδηα ηςκ ζοζηεοαζηδνίςκ θνμφηςκ ζημ ιέβεεμξ ηαζ ηδ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ ιε ηδ ιέεμδμ PLFAs. Απυ ηδκ επελενβαζία ηςκ πεζναιαηζηχκ δεδμιέκςκ, πνμέηορε υηζ δ επέιααζδ ιε ηα ΟΡΡ ηαζ DPA, ακελάνηδηα απυ ημ πνυκμ επχαζδξ, μδήβδζε ζε ζδιακηζηή ιείςζδ (p<0.001) ηδξ γχζαξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ ζημ έδαθμξ, Χζηυζμ, δεκ πνμέηορε ζαθέξ πνμκμ-ελανηχιεκμ πνυηοπμ επίδναζδξ ηςκ β.θ.. ζημ ιέβεεμξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ. Ακηίεεηα, παναηδνήεδηε ιζα ζηαδζαηή ιείςζδ ηδξ ζοκμθζηήξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ ιε ημκ πνυκμ επχαζδξ. Απυ ηδ ιεθέηδ ηδξ ζφζηαζδξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ δεκ πνμέηορε ζαθέξ πνυηοπμ επίδναζδξ ηςκ β.θ.. ζε ζοκάνηδζδ ιε ημ πνυκμ. Πανά ημ βεβμκυξ υηζ ηα β.θ. πμο εθανιυζηδηακ ήηακ ζηδκ πθεζμρδθία ημοξ ιοηδημηηυκα ηαζ εα ήηακ ακαιεκυιεκμ κα οπάνπμοκ επζδνάζεζξ ζηδ ιζηνμαζαηή ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ιοηήηςκ, δ ζπεηζηή αθεμκία (relative abundance) ηςκ PLFAs δεζηηχκ ηςκ ιοηήηςκ, υπςξ βζα πανάδεζβια ημο 18:2ς6,9 (δείηηδξ ιοηήηςκ), αθθά ηαζ ηςκ 18:1ς9cis/trans (δείηηεξ ιοηήηςκ ηαζ ημπζμηνμθζηχκ ανκδηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ υπςξ αοηά ημο βέκμοξ Pseudomonas) ηαζ ημο 16:0 (βεκζηυξ ιζηνμαζαηυξ δείηηδξ ααηηδνίςκ ηαζ ιοηήηςκ), δεκ επδνεάζηδηε ζδιακηζηά απυ ηδκ εθανιμβή ηςκ επζιένμοξ β.θ.. Σμ βεβμκυξ αοηυ ιαξ μδήβδζε ζηδ ζοκέπεζα ζηδ ιεθέηδ ηςκ επζδνάζεςκ ηςκ β.θ. ζηδκ ημζκυηδηα ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ πνδζζιμπμζχκηαξ ιμνζαηέξ πνμζεββίζεζξ πμο επζηνέπμοκ πζμ εκδεθεπή ακάθοζδ πζεακχκ επζδνάζεςκ ελςβεκχκ ηαηαπμκήζεςκ ζε επίπεδμ θφθμο ή αηυιδ ηαζ μζημβέκεζαξ. Απυ ηδκ άθθδ, μ πανάβμκηαξ πνυκμξ επδνέαζε ζδιακηζηά ηδ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ζηα εδαθζηά δείβιαηα υπςξ αοηή πνμζδζμνίζηδηε ιε ηδκ ιέεμδμ PLFA. Ακάθμβεξ ιεηααμθέξ ζηδ ζφζηαζδ ηςκ ιζηνμαζαηχκ ημζκμηήηςκ ημο εδάθμοξ ζε ζοκάνηδζδ ιε ημ πνυκμ, έπμοκ παναηδνδεεί ζε πεζνάιαηα ιζηνυημζιςκ ιε πνήζδ ηςκ ιοηδημηηυκςκ penconazole ηαζ cyprodinil (Puglisi et al., 2012), αμηακζηήξ πνμέθεοζδξ βεςνβζηχκ θανιάηςκ (Spyrou et al., 2009) αθθά ηαζ δζαθμνχκ ιεευδςκ ηαπκζζιμφ ημο εδάθμοξ (Omirou et al., 2012) ηαζ απμδυεδηακ ζηδ ααειζαία ιείςζδ ηςκ δζαεέζζιςκ πυνςκ βζα ηδ ιζηνμαζαηή αζμιάγα ζε πεζνάιαηα ενβαζηδνίμο πμο πενζθαιαάκμοκ ιαηνμπνυκζεξ επςάζεζξ. 410

411 Αημθμφεςξ αλζμθμβήεδηε δ επίδναζδ ηςκ β.θ.. ζηδκ δναζηζηυηδηα εκγφιςκ πμο ζοιιεηέπμοκ ζημοξ ηφηθμοξ C (α-βθοημζζδάζεξ), Ρ (υλζκεξ ηαζ αθηαθζηέξ θςζθαηάζεξ) ηαζ ηδ βεκζηυηενδ οδνμθοηζηή δναζηζηυηδηα (FDΖA), αθθά ηαζ ζε ααζζηέξ ιζηνμαζαηέξ θεζημονβίεξ υπςξ δ κζηνμπμίδζδ (ηφηθμξ Ν) ηαζ δ ακαπκμή. Γεκζηά, δ εθανιμβή ηςκ β.θ.. επδνέαζε ηζξ δναζηζηυηδηεξ υθςκ ηςκ εκγοιζηχκ ζοζηδιάηςκ πμο ιεθεηήεδηακ. Χζηυζμ, δεκ παναηδνήεδηε ηάπμζμ λεηάεανμ πνυηοπμ επίδναζδξ ζημ πνυκμ, ιε ελαίνεζδ ηδ βεκζηή οδνμθοηζηή δναζηζηυηδηα υπμο παναηδνήεδηε ζδιακηζηή, ακ ηαζ πανμδζηή, αφλδζδ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ ΣΒΕ, ΗΜΕ, ΟΡΡ ηαζ DPA. Ακηίεεηα, δ εθανιμβή ηςκ β.θ.. δεκ πνμηάθεζε ηαιία ιεηααμθή ζηδκ ιζηνμαζαηή ακαπκμή ημο εδάθμοξ. Σέθμξ, δ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ απμηέθεζε ημκ πζμ εοαίζεδημ δείηηδ ηαζ επδνεάζηδηε ζδιακηζηά απυ ηα δζάθμνα β.θ.. πμο αλζμθμβήεδηακ. ε ακάθμβα πεζνάιαηα ενβαζηδνίμο δζάνηεζαξ 90 διενχκ, μζ Munoz- Leoz et al., (2011), παναηήνδζακ υηζ εθανιμβή ημο ιοηδημηηυκμο tebuconazole ζε 3 δυζεζξ εθανιμβήξ (5, 50, 500 mg Kg -1 λ. α. εδάθμοξ), επδνέαζε ανκδηζηά ηδκ ααζζηή ακαπκμή (BSR), ηδκ ακαπκμή οπμζηνχιαημξ (SIR) ηαζ ηζξ δναζηζηυηδηεξ ηςκ θςζθαηαζχκ ηαζ ηδξ α-βθοημζζδάζδξ. ημ ίδζμ πείναια, μ νοειυξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ επδνεάζηδηε επίζδξ ανκδηζηά αθθά ιυκμ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηςκ 30 πνχηςκ διενχκ. Ακηίεεηα, μζ Javorekova et al., (2010), παναηήνδζακ αφλδζδ ηςκ επζπέδςκ ημο παναβυιεκμο CO 2 ηαηά ηζξ 21 πνχηεξ διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ημο ιοηδημηηυκμο benomyl ζηδ ζοκζζηχιεκδ δυζδ. ε ακηίζημζπεξ ιεθέηεξ μζ Demanou et al., (2006), παναηήνδζακ υηζ δ ζοκδοαζιέκδ εθανιμβή mefenoxam ηαζ παθημφ δεκ επδνέαζε ηζξ δναζηζηυηδηεξ ηςκ θςζθαηαζχκ ηαζ ηδξ α-βθοημζζδάζδξ. Δπίζδξ, μζ Cernohlavkova et al., (2009), παναηήνδζακ υηζ πνήζδ ημο ιοηδημηηυκμο mancozeb ζε δυζεζξ 1x ηαζ 10x ηδ ζοκζζηχιεκδξ πνμηάθεζε ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ κζηνμπμίδζδξ, εκχ ζφιθςκα ιε ημοξ Pal et al., (2005), δ πνμζεήηδ ημο ιοηδημηηυκμο pencycuron ζε δυζεζξ 1x, 2x ηαζ 10x ηδξ ζοκζζηχιεκδξ βζα εθανιμβή ζημκ αβνυ επέθενε ιυκμ πανμδζηή ιείςζδ ηδξ οδνμθοηζηήξ εκγοιαηζηήξ δναζηζηυηδηαξ ηδξ 3,6- δζαηεηοθμ-θθμομνμζηεΐκδξ οκμθζηά, απυ ηα β. θ. πμο αλζμθμβήεδηακ ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ ανέεδηε υηζ ηo ΣΒΕ είπε εεηζηέξ επζδνάζεζξ ζε ανηεηέξ ιζηνμαζαηέξ θεζημονβίεξ ηαεχξ πνμηάθεζε ιζα ζηαεενή αφλδζδ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ ηαζ ηδξ βεκζηυηενδξ οδνμθοηζηήξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ ηαηά ηζξ 30 πνχηεξ διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημο ζημ έδαθμξ, εκχ δεκ δζαπζζηχεδηε κα επδνέαζε ανκδηζηά ηαιία απυ ηζξ οπυθμζπεξ θεζημονβίεξ ηαζ ηζξ εκγοιζηέξ δναζηζηυηδηεξ πμο 411

412 ιεθεηήεδηακ. Σμ βεβμκυξ αοηυ, ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ ζπεηζηά ιαηνά οπμθεζιιαηζηυηδηα ημο ζημ έδαθμξ (DT 50 = 47 διένεξ) ηαηαδεζηκφεζ πςξ ημ ιοηδημηηυκμ ΣΒΕ αηυιδ ηαζ ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ δεκ επδνεάγεζ ανκδηζηά ηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Σα παναπάκς απμηεθέζιαηα ανίζημκηαζ ζε ζοιθςκία ιε αοηά ηςκ Carbonell et al., (2000) πμο παναηήνδζακ υηζ εθανιμβή ημο ΣΒΕ ζημ έδαθμξ, ζε δυζδ ίζδ ιε 40 g ha -1, δεκ επδνέαζε ηδ δναζηζηυηδηα ημο εκγφιμο αθοδνμβμκάζδ, εκχ είπε εεηζηή επίδναζδ ζηδ δναζηζηυηδηα ηδξ α- βαθαηημζζδάζδξ. Σμ ιοηδημηηυκμ ΗΜΕ πνμηάθεζε ιζα βεκζηυηενδ αφλδζδ ζηδκ δναζηζηυηδηα ηςκ υλζκςκ θςζθαηαζχκ ηαζ απμηέθεζε ημ ιμκαδζηυ β.θ.. απυ αοηά πμο ιεθεηήεδηακ πμο δεκ πνμηάθεζε ηαιία ζδιακηζηή επίδναζδ ζηδ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ πανά ημ βεβμκυξ υηζ απμηέθεζε ημ πζμ οπμθεζιιαηζηυ ιυνζμ (DT 50 = διένεξ). Γεδμιέκα ζπεηζηά ιε ηδκ επίδναζδ ημο ΗΜΕ ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ δεκ έπμοκ ακαθενεεί ςξ ζήιενα ζηδκ δζεεκή αζαθζμβναθία. Σα ιυκα δεδμιέκα πμο είκαζ δζαεέζζια πνμένπμκηαζ απυ ημκ θάηεθμ έβηνζζδξ πνήζδξ ημο ΗΜΕ ζηδκ ΔΔ υπμο ακαθένεηαζ υηζ δ εθανιμβή ημο ζηεοάζιαημξ ιε δναζηζηή μοζία ημ IMZ (FUNGAZIL ) ζε ζοβηέκηνςζδ ιg g -1 λ.α. εδάθμοξ πνμηάθεζε 16% ηαζ 4.3% ιείςζδ ζηδκ ζηακυηδηα ακμνβακμπμίδζδξ Ν ηαζ C, ακηίζημζπα (EFSA 2010a). Ακάθμβδ δμηζιή ιε ημκ ηφνζμ ιεηααμθίηδ ημο IMZ ζημ έδαθμξ, ημ ΗΜΕ ethanol, μδήβδζε ζε δναζηζηή ιείςζδ ηδξ ακμνβακμπμίδζδξ ημο Ν ζημ έδαθμξ (ςξ ηαζ 270% ιείςζδ ζε ζπέζδ ιε ημκ ιάνηονα) ζε ζοβηεκηνχζεζξ απυ 0.4 ςξ ηαζ 2 ιg g- 1. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά ημ ΗΜΕ ηαζ μ ιεηααμθίηδξ ημο δεκ ανέεδηε κα έπμοκ ζδιακηζηή ανκδηζηή επίδναζδ ζηδκ ιζηνμαζαηή ακαπκμή ζημ έδαθμξ, υπςξ παναηδνήεδηε ηαζ ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ. Γεδμιέκα απυ ημκ Γζεεκή Ονβακζζιυ Σνμθίιςκ ηαζ Γεςνβίαξ (FAO, 2001), ακαθένμοκ υηζ ημ IMZ δεκ εδεζλε ζδιακηζηή επζδνάζδ ζηδκ ακμνβακμπμίδζδ ημο C ηαζ ημο N υηακ εθανιυζηδηε ζε ζοβηέκηνςζδ ίζδ ιε 1 mg kg -1 εδάθμοξ. Οζ ζοβηεκηνχζεζξ ημο ΗΜΕ πμο εθανιυζηδηακ ζημ έδαθμξ ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ, είκαζ ηαηά πμθφ ορδθυηενεξ απυ ηζξ παναπάκς ηζιέξ (EFSA 2010a, FAO 2011) ηαηαδεζηκφμκηαξ υηζ αηυιδ ηαζ ζε ορδθά επίπεδα δυζεςκ ημ ΗΜΕ δεκ επδνεάγεζ ανκδηζηά ηζξ θεζημονβίεξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ. Ζ πνμζεήηδ ημο ιοηδημηηυκμο ΟΡΡ πνμηάθεζε ηυζμ εεηζηέξ υζμ ηαζ ανκδηζηέξ επζδνάζεζξ ζηζξ δζάθμνεξ ιζηνμαζαηέξ παναιέηνμοξ πμο ιεθεηήεδηακ. Έηζζ, δ πνμζεήηδ ημο ΟΡΡ ζημ έδαθμξ εκενβμπμίδζε α) ηδκ βεκζηή εκγοιζηή οδνμθοηζηή δναζηζηυηδηα ημο εδάθμοξ βζα δζάζηδια 60 διενχκ απυ ηδκ πνμζεήηδ ημο ζημ 412

413 έδαθμξ, α) ηδκ δναζηζηυηδηα ηςκ α-βθοημζζδαζχκ ηαζ ηςκ υλζκςκ θςζθαηαζχκ ζημ έδαθμξ. Ακηίεεηα δ πνμζεήηδ ημο ΟΡΡ πνμηάθεζε ζδιακηζηή ιείςζδ α) ηδξ ζοκμθζηήξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ υπςξ αοηή πνμζδζμνίζηδηε απυ ηζξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ PLFAs ζηα εδαθζηά δείβιαηα πςνίξ ζαθέξ πνμκμ-ελανηχιεκμ πνυηοπμ επίδναζδξ ηαζ α) ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ απυ ηζξ 30 διένεξ ηαζ ιεηά. Πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ βζα ηδκ επίδναζδ ημο ΟΡΡ ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ δεκ οπάνπμοκ ζηδκ δζεεκή αζαθζμβναθία αθθά μφηε ηαζ ζηα ζημζπεία ημο θαηέθμο έβηνζζδξ ημο ζοβηεηνζιέκμο ιοηδημηηυκμο. Πνμηαηανηηζηέξ ιεθέηεξ έδεζλακ υηζ δ ηζιή EC 50 ημο ΟΡΡ βζα ημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ζοζηδιάηςκ εκενβμπμζδιέκδξ ίθομξ πμο επελενβάγμκηαζ οβνά αζηζηά απυαθδηα ήηακ 56 mg L -1 (EFSA, 2008). Ζ εθανιμβή ημο DPA ανεεδηε υηζ δεκ είπε ανκδηζηέξ ζοκέπεζεξ ζηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Έηζζ, παναηδνήεδηε ιζα ζδιακηζηή αφλδζδ ζηδκ δναζηζηυηδηα ηςκ υλζκςκ θςζθαηαζχκ ηαζ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ πςνίξ ςζηυζμ κα οπάνπεζ ηάπμζμ ζαθέξ πνυηοπμ επίδναζδξ ζημ πνυκμ ηαζ ηαοηυπνμκα μδήβδζε ζε πανμδζηή αφλδζδ ηδξ βεκζηήξ οδνμθοηζηήξ εκγοιζηήξ δναζηζηυηδηαξ, πμο ήηακ ειθακήξ ηαηά ηζξ 30 πνχηεξ διένεξ ημο πεζνάιαημξ. Δλαίνεζδ ζηζξ παναπάκς εεηζηέξ επζδνάζεζξ απμηέθεζε δ ιείςζδ ηδξ ζοκμθζηήξ ιζηνμαζαηήξ αζμιάγαξ πμο πνμέηορε απυ ηδκ ακάθοζδ ηςκ PLFAs ζηα δείβιαηα ημο DPA. Πνμδβμφιεκεξ ένεοκεξ ζπεηζηά ιε ημ DPA, έπμοκ δείλεζ ηδκ ακαζηαθηζηή επίδναζδ ημο ζηδκ θςημζοκεεηζηή δναζηδνζυηδηα θςηυηνμθςκ ααηηδνίςκ (Goodwin, 1980). Δπίζδξ, μζ Sharp et al. (1999a,b) παναηήνδζακ πςξ ημ DPA ακαζηέθθεζ ημ ηοηηυπνςια bcl ημο ααηηδνίμο Rhodobacter capsulatus. Σμ DPA θαίκεηαζ υηζ απμδμιείηαζ ηαπέςξ απυ ημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ζημ έδαθμξ, αθθά ηαζ ζε ζοζηήιαηα επελενβαζίαξ οβνχκ απμαθήηςκ, πνμξ ακζθίκδ ηαζ ηαηεπυθδ (Christodoulatos et al., 1997, Shin and Spain, 2009), ιε ηδκ ακζθίκδ κα είκαζ βκςζηυ υηζ πνμηαθεί ζδιακηζηέξ ανκδηζηέξ επζδνάζεζξ ζε κζηνςδμπμζδηζηά ααηηήνζα ημο βέκμοξ Nitrosomonas (You et al., 2009, Nicol and Schleper, 2006, Purkhold et al., 2000). Χζηυζμ, ζηδκ πανμφζα ιεθέηδ πανά ηδκ ηαπεία δζάζπαζδ ημο DPA ζηα οπυ ιεθέηδ εδαθζηά δείβιαηα, δεκ παναηδνήεδηε ακηίζημζπδ παναβςβή ηςκ παναπάκς ιεηααμθζηχκ ηαζ δ θεζημονβία ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ επδνεάζηδηε εεηζηά. Σέθμξ, βζα ημ EQ δζαπζζηςεδηε υηζ πνμηάθεζε ανκδηζηέξ επζδνάζεζξ ζηδκ δναζηζηυηδηα ηςκ αθηαθζηχκ θςζθαηαζχκ ακελάνηδηα απυ ημ πνυκμ ηαζ πνμηάθεζε ιζα ζδιακηζηή ηαζ ιδ ακαζηνέρζιδ ζηδκ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ ιείςζδ ηδξ 413

414 δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ. Μέπνζ ζήιενα δεκ οπάνπμοκ ακάθμβεξ ακαθμνέξ ζπεηζηά ιε ηδκ επίδναζδ ημο ΔQ ηαζ ηςκ μλεζδςηζηχκ ημο παναβχβςκ ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ ηαζ ζηζξ δζάθμνεξ ιζηνμαζαηέξ θεζημονβίεξ (EFSA 2010b) ηαζ δ πανμφζα ιεθέηδ απμηεθεί ηδκ πνχηδ ακάθμβδ ακαθμνά. Ζ ιδ ακηζζηνεπηή ιείςζδ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ απυ ημ EQ ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ πμνεία απμδυιδζδξ ηαζ ιεηααμθζζιμφ ημο ιδηνζημφ ιμνίμο ζημ έδαθμξ ιαξ μδήβδζακ ζηδκ δζελαβςβή εκυξ ζοιπθδνςιαηζημφ πεζνάιαημξ χζηε κα δζαπζζηςεεί εάκ ημ ιδηνζηυ ιυνζμ ή ηα πνμσυκηα ημο ιεηααμθζζιμφ ημο είκαζ οπεφεοκα βζα ηδκ ανκδηζηή επίδναζδ πμο παναηδνήεδηε. Απυ ηζξ ιεηνήζεζξ απμδυιδζδξ παναηδνήεδηε πθήνδξ απμιάηνοκζδ ημο ιδηνζημφ ιμνίμο ηαηά ηζξ 3 πνχηεξ διένεξ ημο πεζνάιαημξ. Κφνζμξ ιεηααμθίηδξ ήηακ δ QI ηαζ δ πανμοζία ηδξ ζηα εδαθζηά δείβιαηα ακζπκεφηδηε ιέπνζ ηαζ ηζξ 10 πνχηεξ διένεξ ημο πεζνάιαημξ ζε ιεζμφιεκεξ ζοβηεκηνχζεζξ, εκχ δ πανμοζία ημο δεοηένμο ιεηααμθίηδ ΔQNL ακζπκεφμκηακ ζηαεενά ζε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ. Πανάθθδθα εκημπίζηδηε ζδιακηζηή (p<0.001) ακαζημθή ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζηζξ ιεηαπεζνίζεζξ EQ, QI ηαζ QI+EQNL, ηαηά ηζξ πνχηεξ 30 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή. Ακηίεεηα ζηα δείβιαηα ζηα μπμία έβζκε πνμζεήηδ ημο ιεηααμθίηδ EQNL παναηδνήεδηε αφλδζδ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζηζξ 3 πνχηεξ διένεξ, εκχ ζηδ ζοκέπεζα ηαζ ιέπνζ ηδκ μθμηθήνςζδ ημο πεζνάιαημξ δεκ παναηδνήεδηακ δζαθμνέξ ζοβηνζηζηά ιε ημ ιάνηονα. Σα παναπάκς δεδμιέκα ζοβηθίκμοκ ζημ ζοιπέναζια υηζ βζα ηδκ ακαζημθή ηδξ δζαδζηαζίαξ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ πζεακυηαηα εοεφκεηαζ ημ QI πμο ζπδιαηίγεηαζ ςξ ηφνζμ πνμσυκ ιεηααμθζζιμφ ημο EQ ηαζ ειιέκεζ ζημ έδαθμξ βζα ημοθάπζζημκ δφμ εαδμιάδεξ. οκμθζηά ηα παναπάκς απμηεθέζιαηα δείπκμοκ υηζ, ηα ιοηδημηηυκα ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ, πανά ηδκ ζδζαίηενα ιαηνά οπμθεζιιαηζηυηδηα ημοξ ζημ έδαθμξ δεκ επδνέαζακ ανκδηζηά ημ ιέβεεμξ, ηδκ ζφζηαζδ ηαζ ηδκ θεζημονβία ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ. Οιμίςξ ημ DPA πμο πανμοζίαζε παιδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα ζημ έδαθμξ δεκ πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ ηαζ ζε επζθεβιέκεξ θεζημονβίεξ ηδξ πμο ιεθεηήεδηακ. Ακηίεεηα, ηα ΟΡΡ ηαζ EQ πανά ηδκ πενζμνζζιέκδ οπμθεζιιαηζηυηδηα ημοξ ζημ έδαθμξ επδνέαζακ ανκδηζηά ζδιακηζηέξ ιζηνμαζαηέξ θεζημονβίεξ, ιε πζμ παναηηδνζζηζηυηενδ πενίπηςζδ ηδκ ακαζημθή, πανμδζηή (ΟΡΡ) ή ιυκζιδ (ΔQ) ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ. Σμ βεβμκυξ αοηυ δεκ εα πνέπεζ κα ιαξ δδιζμονβεί έηπθδλδ ηαεχξ απυ ηα δεδμιέκα ηδξ δζεεκμφξ αζαθζμβναθίαξ είκαζ βκςζηυ υηζ, ιεηά ηδκ επίδναζδ ελςβεκχκ παναβυκηςκ, δ 414

415 ζφζηαζδ ηςκ πενζζζυηενςκ ιζηνμαζαηχκ μιάδςκ ιεηααάθθεηαζ ηαζ δεκ επακένπεηαζ άιεζα ζημ ανπζηυ επίπεδμ, ακελάνηδηα απυ ημ ηαλζκμιζηυ εφνμξ ηδξ μιάδαξ ή ημκ ηφπμ ημο ελςβεκμφξ πανάβμκηα επίδναζδξ. ε μνζζιέκεξ πενζπηχζεζξ ιάθζζηα δ επίδναζδ αοηή ιπμνεί κα έπεζ δζάνηεζα πμο ακένπεηαζ ζε μνζζιέκα έηδ (Allison and Martiny, 2008). Δπίδξαζε ησλ γεσξγηθώλ θαξκάθσλ ζηε δνκή θαη ηελ αθζνλία ιεηηνπξγηθώλ νκάδσλ κηθξννξγαληζκώλ ηδκ ζοκέπεζα ηςκ πεζναιάηςκ εηηζιήεδηε δ επίδναζδ ηςκ β.θ.. ζηδκ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ζδιακηζηχκ ιζηνμαζαηχκ μιάδςκ, υπςξ είκαζ μζ ααζζδζμιφηδηεξ ηαζ ηα ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ, ιε ηδκ πνήζδ ιμνζαηχκ ηεπκζηχκ (PCR-DGGE, qpcr, RTqPCR). Ζ ημζκυηδηα ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ επζθέπεδηε ελαζηίαξ ημο ζδιακηζημφ νυθμο ηδξ ζηδκ απμζφκεεζδ ηδξ μνβακζηήξ μοζίαξ ηαζ ζοκεπχξ ζηδκ μθμηθήνςζδ ημο ηφηθμο ημο C (Casieri et al., 2010, Hassett et al., 2009, Baldrian, 2008). Δπίζδξ, δεδμιέκμο υηζ ηα οπυ ιεθέηδ β.θ. ήηακ ζηδκ πθεζμρδθία ημοξ ιοηδημηηυκα ακαιέκμκηακ ιεβαθφηενμξ ααειυξ επίδναζδξ ζημοξ πθδεοζιμφξ ηςκ ιοηήηςκ, ηάηζ πμο υπςξ ακαθένεδηε ηαζ παναπάκς δεκ παναηδνήεδηε ηαηά ηδ ιεθέηδ ηδξ ζφζηαζδξ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ ιε ηδ ιέεμδμ ηςκ PLFAs. Ακηίζημζπα, δ ιζηνμαζαηή μιάδα ηςκ κζηνςδμπμζδηχκ ημο εδάθμοξ, επζθέπεδηε, ελαζηίαξ ηδξ ηαηαθοηζηήξ ζοιιεημπήξ ηδξ ζημ νοειυ-ηαεμνζζηζηυ ζηάδζμ ηδξ μλείδςζδξ ηδξ αιιςκίαξ ζημ ηφηθμ ημο Ν (Prosser and Nicol, 2008) αθθά ηαζ ααζζγυιεκμζ ζηδκ επίδναζδ ζοβηεηνζιέκςκ β.θ. ζηδκ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ πμο παναηδνήεδηακ ζημ ίδζμ πείναια. Πνάβιαηζ, δ πνμζεήηδ υθςκ ηςκ β.θ.. πμο ελεηάζηδηακ ηαζ ζδζαίηενα ηςκ ΗΜΕ, ΟΡΡ ηαζ DPA επέθενε ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ζημ έδαθμξ πμο πανέιεζκακ δζαηνζηέξ αηυιδ ηαζ 90 διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ. Χζηυζμ, ηα εδαθζηά δείβιαηα ζηα μπμία πνμζηέεδηε ημ ακηζμλεζδςηζηυ EQ δεκ ζοιπενζθήθεδηακ ζηδκ ακάθοζδ, θυβς αδοκαιίαξ παναθααήξ πνμσυκημξ PCR εκίζποζδξ ηδξ ITS πενζμπήξ rdna ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ. Σμ βεβμκυξ αοηυ πζεακυηαηα μθείθεηαζ ζηδκ πενζμνζζιέκδ αθεμκία ηςκ πθδεοζιχκ ηςκ ααζζδζμιοηήηςκ ζηα εδαθζηά δείβιαηα πμο δέπηδηακ ιεηαπείνζζδ ιε ημ EQ ηαζ υπζ ζηδκ πανμοζία ηάπμζμο ακαζηαθηζημφ βζα ηδκ εκίζποζδ πανάβμκηα πμο απμοζζάγεζ απυ ηα οπυθμζπα εδαθζηά δείβιαηα. ηδκ πενίπηςζδ ιεθέηδξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ, δ πνμζεήηδ 415

416 ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ, ιεηέααθε ηδ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΑ, ςζηυζμ ιυκμ ημ EQ πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ηαζ έιιμκεξ ιεηααμθέξ ζηδκ ημζκυηδηα ηςκ ΑΟΑ ζε ακηίεεζδ ιε ηα οπυθμζπα β.θ.. βζα ηα μπμία δεκ παναηδνήεδηε ηάπμζμ λεηάεανμ πνυηοπμ επίδναζδξ ζημ πνυκμ. Απυ ηδκ άθθδ ιενζά δ πνμζεήηδ ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ επέθενε ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ζηδ δμιή ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ ΑΟΒ ιε ημ ΔQ ηαζ πάθζ κα απμηεθεί ημ β.θ.. ιε ηζξ πζμ ζηαεενέξ επζδνάζεζξ ζε ακηίεεζδ ιε ηα οπυθμζπα β.θ.. βζα ηα μπμία δεκ ειθακίζηδηε ηάπμζμ λεηάεανμ πνυηοπμ επίδναζδξ ζε ζοκάνηδζδ ιε ημ πνυκμ. Χζηυζμ, ζημ ηέθμξ ημο πεζνάιαημξ ηαιία απυ ηζξ επζιένμοξ ιεηαπεζνίζεζξ δεκ δζέθενε απυ ημ ιάνηονα ακαθμνάξ απμδεζηκφμκηαξ ηδκ πανμδζηυηδηα ηςκ επζδνάζεςκ ηςκ β.θ.. ζηδκ ημζκυηδηα ηςκ ΑΟΒ. οκμθζηά, δ ημζκυηδηα ηςκ ΑΟΑ ακηαπμηνίεδηε πενζζζυηενμ ζηδκ εθανιμβή ηςκ β.θ.. ηαζ ζδζαίηενα ημο EQ πμο ηαοηυπνμκα πνμηάθεζε ηαζ ιδ ακηζζηνεπηή ακαζημθή ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζημ ίδζμ πείναια. Ζ παναηήνδζδ αοηή ανίζηεηαζ ζε ζοιθςκία ιε ηα απμηεθέζιαηα ηςκ Puglisi et al., (2012) πμο ανήηακ υηζ ηα ιοηδημηηυκα penconazole ηαζ cyprodinil πνμηάθεζακ ζδιακηζηυηενεξ αθθαβέξ ζηδ δμιή ηςκ ημζκμηήηςκ ηςκ ΑΟΑ ζοβηνζηζηά ιε αοηέξ ηςκ ΑΟΒ. Αημθμφεςξ, εηηζιήεδηε δ επίδναζδ ηςκ οπυ ιεθέηδ β.θ. ζηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδςπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ ιε PCR πναβιαηζημφ πνυκμο. Γεκζηά, παναηδνήεδηε ζπεηζηή ηονζανπία ηςκ ΑΟΒ (3.0 x10 3 έςξ 2.6 x10 4 ακηίβναθα ng -1 DNA) ζε ζπέζδ ιε ηα ΑΟΑ (2.85 x10 2 έςξ 2.89 x10 3 ακηίβναθα ng -1 DNA) ζημ έδαθμξ πμο ιεθεηήεδηε. Σμ απμηέθεζια αοηυ ένπεηαζ ζε ακηίεεζδ ιε ανηεηέξ πνυζθαηεξ ιεθέηεξ πμο ηαηαδεζηκφμοκ ιζα οπενμπή ηςκ ΑΟΑ έκακηζ ηςκ ΑΟΒ ζηα πενζζζυηενα εδάθδ (Erguder et al., 2009, Chen et al., 2008, Adair and Schwartz, 2008, Leininger et al., 2006, Nicol and Schleper, 2006). Χζηυζμ, ημ αθηαθζηυ ph ημο εδάθμοξ (ph 7.85) θαίκεηαζ υηζ εοκυδζε ηδκ ζπεηζηή ηονζανπία ηςκ ΑΟΒ επί ηςκ ΑΟΑ ζε ζοιθςκία ιε πνμδβμφιεκεξ ιεθέηεξ πμο ημκίγμοκ ημκ ζδιακηζηυ νμθμ ημο ph ζηδκ επζθμβή ηδξ μιάδαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ πμο εα ηονζανπήζεζ ζημ έδαθμξ (Nicol et al., 2008). Οζ πθδεοζιμί ηςκ ΑΟΑ ειθακίζηδηακ αολδιέκμζ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ εθανιμβή ιε ημ DPA, ακελάνηδηα απυ ημ πνυκμ επχαζδξ. Ακηίεεηα, ηακέκα απυ ηα β.θ. πμο πνδζζιμπμζήεδηακ δεκ θαίκεηαζ κα επδνέαζε ανκδηζηά ηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΒ. Καζ ζε αοηή ηδκ πενίπηςζδ μ πθδεοζιυξ ηςκ ΑΟΑ θαίκεηαζ κα ακηαπμηνίεδηε πενζζζυηενμ ζηδκ εθανιμβή ηςκ β.θ. ζε ζφβηνζζδ ιε ηδκ παιδθυηενδ εοαζζεδζία ηςκ ΑΟΒ. Ζ αφλδζδ ημο πθδεοζιμφ ηςκ ΑΟΑ ζηδκ πενίπηςζδ ιεηαπείνζζδξ ηςκ εδαθζηχκ δεζβιάηςκ ιε ημ ακηζμλεζδςηζηυ 416

417 DPA, ανίζηεηαζ ζε ζοιθςκία ιε ηδ εεηζηή επίδναζδ ημο ζοβηεηνζιέκμο β.θ. ζηδ δζαδζηαζία ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ. Ακηίεεηα, δεκ παναηδνήεδηε ηαιία ανκδηζηή επίδναζδ ζηδκ αθεμκία ηςκ ΑΟΑ/ΑΟΒ ζηα δείβιαηα πμο δέπηδηακ επέιααζδ ιε ηα EQ ηαζ ΟΡΡ πανά ηδκ ανκδηζηή επίδναζδ ηςκ εκ θυβς β.θ.. ζηδκ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ. Καηα ακαθμβία, δ εθανιμβή ημο ΣΒΕ πμο έδεζλε υηζ εοκμεί ηδκ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ δεκ πνμηάθεζε ηαιία ακάθμβδ αφλδζδ ζηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ. Με αάζδ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ PCR πναβιαηζημφ πνυκμο ζε επίπεδμ DNA, εηηζιήεδηε ημ ιέβεεμξ ημο ζοκμθζημφ πθδεοζιμφ ηςκ ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ ζηα επζιένμοξ εδαθζηά δείβιαηα ηαζ εηθνάζηδηε ιε ηδ ιμνθή ακηζβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ng -1 DNA. Χζηυζμ, δ ακίπκεοζδ ημο amoa βμκζδίμο δεκ ζδιαίκεζ απαναίηδηα υηζ μζ ιζηνμμνβακζζιμί πμο ηα θένμοκ ζοιιεηέπμοκ εκενβά ζηδκ ακηίζημζπδ δζενβαζία (Prosser and Nicol, 2008, Leininger et al., 2006). Με αάζδ ηα παναπάκς ηαζ ηδκ ακακηζζημζπία ιεηαλφ ηςκ δεδμιέκςκ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ηαζ αθεμκίαξ ηςκ ΑΜΟ βζα ημ EQ, εηηζιήεδηε ιέζς RT-PCR πναβιαηζημφ πνυκμο δ επίδναζδ ημο ΔQ ζημκ πθδεοζιυ ηςκ θεζημονβζηά εκενβχκ ΑΟΑ ηαζ ΑΟΒ ααζζγυιεκδ ζημ ανζειυ ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο. Γζα ηδ ζφκεεζδ ημο ζοιπθδνςιαηζημφ cdna αλζμθμβήεδηακ δφμ δζαθμνεηζηέξ πνμζεββίζεζξ: (1) πνήζδ ηοπαίςκ ελαιενχκ ή (2) πνήζδ ελεζδζηεοιέκμο εηηζκδηή βζα ημ amoa βμκίδζμ. ηδκ πενίπηςζδ πνήζδξ ηςκ ηοπαίςκ ελαιενχκ ιεηαβνάθεηαζ ημ ζοκμθζηυ RNA πμο παναθήθεδηε απυ ηα εδαθζηά δείβιαηα πνμξ cdna, ημ μπμίμ εκζζπφεηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηαηά ηδκ RT-qPCR ιε πνήζδ ελεζδζηεοιέκςκ εηηζκδηχκ (Bustin et al., 2005). Θα πνέπεζ κα ημκζζηεί υηζ ζηδκ πενίπηςζδ ζφκεεζδξ cdna ιε πνήζδ ηςκ ηοπαίςκ ελαιενχκ, ημ 96% ημο RNA πμο ιεηαβνάθεηαζ είκαζ rrna (Rashtchian, 1994). ηδ πνμζέββζζδ αοηή ιπμνεί κα δδιζμονβδεμφκ πνμαθήιαηα υηακ ημ mrnaζηυπμξ ανίζηεηαζ ζε παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ, υπςξ θαίκεηαζ κα ζζπφεζ ζηδ δζηή ιαξ πενίπηςζδ, ηαεχξ αοηυ δεκ εα ιπμνέζεζ κα ιεηαβναθεί ακαθμβζηά ιε απμηέθεζια δ αηυθμοεδ εκίζποζδ ημο κα ιδκ είκαζ μνεή πμζμηζηά. ηδκ πνάλδ, έπεζ παναηδνδεεί υηζ δ πνήζδ ηςκ ηοπαίςκ ελαιενχκ ιπμνεί κα μδδβήζεζ ζε εζθαθιέκδ εηηίιδζδ έςξ ηαζ 19 θμνέξ ιεβαθφηενμο ανζειμφ ιεηαβνάθςκ. Δπζπθέμκ, δ ακηίδναζδ ηδξ ζφκεεζδξ ημο cdna ιε ηδ πνήζδ ηοπαίςκ ελαιενχκ είκαζ βναιιζηή ζε ζηεκυηενμ εφνμξ ζοβηνζηζηά ιε ηδκ ακηίζημζπδ ζηδκ πενίπηςζδ πνήζδξ ελεζδζηεοιέκμο εηηζκδηή, ιε απμηέθεζια κα ιεζχκεηαζ δ αηνίαεζα ηδξ πμζμηζημπμίδζδξ (Bustin and Nolan, 2004, Bustin et al., 2005). 417

418 Απυ ηδκ άθθδ πθεονά, δ πνμζέββζζδ ηδξ ζφκεεζδξ cdna ιε πνήζδ ελεζδζηεοιέκμο ςξ πνμξ ημ βμκίδζμ εηηζκδηή πθεμκεηηεί ζε αηνίαεζα ηαζ εοαζζεδζία (Lekanne Deprez et al., 2002) ηαζ ημ ιυκμ ιεζμκέηηδια πμο πανμοζζάγεζ είκαζ υηζ απαζηείηαζ λεπςνζζηή ζφκεεζδ cdna βζα ηάεε ελεζδζηεοιέκμ ζηυπμ mrna, ιε απμηέθεζια κα απαζημφκηαζ πενζζζυηενμξ πνυκμξ ηαζ ακαθχζζια (Bustin and Nolan, 2004, Bustin et al., 2005) ηαζ κα οπεζζένπεηαζ μ πανάβμκηαξ ηδξ παναθθαηηζηυηδηαξ θυβς ηςκ δζαθμνεηζηχκ ακηζδνάζεςκ ζφκεεζδξ ημο cdna πμο πναβιαημπμζμφκηαζ (Pfaffl, 2004). Δπίζδξ, μζ ελεζδζηεοιέκμζ εηηζκδηέξ θεζημονβμφκ ηαθφηενα ζε ζοκδοαζιυ ιε ηζξ δζαδμπζηά αολακυιεκεξ εενιμηναζίεξ ηαηά ηδ δζαδζηαζία ηδξ ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθήξ χζηε κα πενζμνίγεηαζ ηεθζηά μ ανζειυξ ηςκ πεζιενζηχκ ιεηαβνάθςκ (Pfaffl, 2004, Freeman et al., 1999). ηδκ πανμφζα ιεθέηδ, ηυζμ ζηδκ πενίπηςζδ ηςκ ΑΟΒ, υζμ ηαζ ζηδ πενίπηςζδ ηςκ ΑΟΑ, παναηδνήεδηε ζδιακηζηά ορδθυηενμξ ανζειυξ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο υηακ βζα ηδ ζφκεεζδ ημο cdna πνδζζιμπμζήεδηε ελεζδζηεοιέκμξ εηηζκδηήξ. Σμ βεβμκυξ αοηυ ιπμνεί κα μθείθεηαζ ζηδ θφζδ ημο amoa βμκζδίμο (Nolan et al., 2006), αθθά ηαζ ζηδ ζημπεοιέκδ δνάζδ ημο ελεζδζηεοιέκμο εηηζκδηή πμο δεκ ακαθχκεηαζ ζηδκ εκίζποζδ ηιδιαηχκ RNA πμο δεκ απμηεθμφκ ζηυπμ ιεηαβναθήξ. Με αάζδ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ RT-qPCR, ζηδκ πενίπηςζδ ζφκεεζδξ ημο cdna ιε πνήζδ ελεζδζηεοιέκμο εηηζκδηή, παναηδνήεδηε ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ έηθναζδξ ημο βμκζδίμο amoa βμκζδίμο ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ, 3 διένεξ ιεηά ηδκ επέιααζδ ιε ΔQ, εκχ δ έηθναζδ ημο ζοβηεηνζιέκμο βμκζδίμο επακήθεε ζε επίπεδα ακάθμβα ιε ημο ιάνηονα ζηζξ 30 διένεξ ιεηά ηδκ εθανιμβή. Σα εονήιαηα αοηά δεκ ακηαπμηνίκμκηαζ ζηδκ απμοζία μπμζαζδήπμηε επίδναζδξ ημο ΔQ ζημκ ανζειυ ηςκ ακηζβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο βζα ηα ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ υηακ ζακ ιυνζμ-ζηυπμξ πνδζζιμπμζήεδηε ημ DNA. Ζ δζαθμνμπμίδζδ ιεηαλφ ηςκ δφμ αοηχκ ιεηνήζεςκ πζεακυηαηα μθείθεηαζ ζηδκ άιεζδ ημλζηυηδηα ημο ΔQ ζηα ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ πμο μδήβδζε ζε εάκαημ κζηνμδςπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ αιέζςξ ιεηά ηδκ εθανιμβή ημο EQ (3 διένεξ). οκέπεζα αοημφ ήηακ δ άιεζδ θφζδ ηςκ ιεηαβνάθςκ ημο amoa βμκζδίμο ζε ακηίεεζδ ιε DNA ακηίβναθα ημο βμκζδίμο amoa πμο είκαζ πενζζζυηενμ ζηαεενά ζημ εδαθζηυ πενζαάθθμκ ηαζ ιπμνμφκ κα δζαηδνδεμφκ ακζπκεφζζια βζα ιεβαθφηενμ πνμκζηυ δζάζηδια. Σα παναπάκς δεδμιέκα απμδεζηκφμοκ υηζ δ πνήζδ RNA (ακηί DNA) απμηεθεί ηδκ εκδεδεζβιέκδ ηαζ αηνζαέζηενδ πνμζέββζζδ βζα ηδκ ακίπκεοζδ πζεακχκ επζδνάζεςκ λεκμαζμηζηχκ μοζζχκ ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. Ακάθμβα απμηεθέζιαηα έπμοκ παναηδνδεεί απυ ημοξ Puglisi et al., (2012) ηαζ Tourna et al. 418

419 (2010). Ακηίεεηα, ηα δεδμιέκα ηδξ RT-qPCR ζοιθςκμφκ ιενζηχξ ιε ηα απμηεθέζιαηα ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ βζα ημ ζοβηεηνζιέκμ β.θ.. ηαεχξ δ ακαζημθή ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζημ ίδζμ πείναια πανέιεζκε ειθακήξ ηαευθδ ηδκ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ (90 διένεξ). Ζ ακακηζζημζπία αοηή ιεηαλφ ηςκ δφμ αοηχκ ιεηνήζεςκ είκαζ πζεακυ κα μθείθεηαζ ζηδ δζαθμνεηζηή εοαζζεδζία πμο παναηηδνίγεζ ηζξ δφμ ιεευδμοξ. οβηεηνζιέκα, δ RT-qPCR είκαζ ιζα ζδζαίηενα εοαίζεδηδ ιέεμδμξ πμο πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ πμζμηζημπμίδζδ ηδξ έηθναζδξ ηςκ βμκζδίςκ (ιε ηδ ιμνθή rrna ή mrna, ιεηαβνάθςκ) (Smith and Osborn, 2009) επζηνέπμκηαξ ηαοηυπνμκα ημκ πνμζδζμνζζιυ ζπάκζςκ ιεηαβνάθςκ ηαζ ιζηνχκ ιεηααμθχκ ζηδκ έηθναζδ ηςκ βμκζδίςκ (Pfaffl, 2001). Σμ mrna πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδ ζφκεεζδ ημο cdna εηιαβείμο ιε ηδ πνήζδ ημο ελεζδζηεοιέκμο εηηζκδηή παναηηδνίγεηαζ απυ ζδζαζηένςξ ζφκημιμ πνυκμ διζγςήξ (Vogel and Marcotte, 2013, Rauhut and Klug, 1999) ηαζ δίκεζ ηδ δοκαηυηδηα άιεζδξ παναηήνδζδξ ηδξ επίδναζδξ ηςκ β.θ. ζε ηάεε δεδμιέκδ πνμκζηή ζηζβιή. Ζ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ απυ ηδκ άθθδ πθεονά, πνδζζιμπμζείηαζ ςξ δείηηδξ ηδξ ημλζηήξ επίδναζδξ λεκμαζμηζηχκ μοζζχκ, υπςξ ζηδ δεδμιέκδ πενίπηςζδ ημ ακηζμλεζδςηζηυ EQ, ζηδκ αθεμκία ηαζ ηδ δναζηζηυηδηα εκγφιςκ, ιζηνμμνβακζζιχκ ελεζδζηεοιέκςκ κα ιεηαηνέπμοκ αιιςκία ή αιιςκζαηά ζυκηα ζε κζηνχδδ (Maliszewska-Kordybach et al., 2007). Θα πνέπεζ κα ημκζζηεί υηζ μζ δφμ ιέεμδμζ (δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ vs RT-qPCR) πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηδξ κζηνμπμίδζδξ ζε επίπεδμ ιζηνμαζαηήξ θεζημονβίαξ δεκ ιεηνμφκ ημ νοειυ ίδζςκ δζενβαζζχκ ηαζ ηαηά ζοκέπεζα ηα απμηεθέζιαηα ημοξ δεκ ιπμνεί κα είκαζ απυθοηα ζοβηνίζζια. Έηζζ δ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ ιεηνά ηδκ ζοβηέκηνςζδ ηςκ NO - 2 πμο απμηεθμφκ ημ ηεθζηυ πνμσυκ ηδξ κζηνςδμπμίδζδξ ηαζ πνμηφπημοκ απυ ηδκ δνάζδ δφμ εκγφιςκ (AMO ηαζ ΖΑΟ) ζε ακηίεεζδ ιε ηδκ RT-qPCR πμο ζηδκ ζοβηεηνζιέκδ πενίπηςζδ ζηυπεοε ζηδκ ιέηνδζδ ηδξ ιεηαηνμπήξ ηδξ αιιςκίαξ ζε οδνμλοθαιίκδ απυ ημ έκγοιμ ΑΜΟ άνα δεκ ζοιπενζεθάιαακε ηαζ ηδκ δνάζδ ηδξ ΖΑΟ. Με αάζδ ηα παναπάκς δεκ ιπμνεί κα απμηθεζζηεί δ πενίπηςζδ ημ ΔQ κα πανμοζζάγεζ ιζα ζοβηεηνζιέκδ αθθά πανμδζηή ημλζηή επίδναζδ ζηδκ θεζημονβία ημο εκγφιμο ΑΜΟ ηςκ ΑΟΒ ηαζ ΑΟΑ, πμο ηαηαβνάθδηε απυ ηδκ RT-qPCR, αθθά κα επζδζηκφεζ ιζα πενζζζυηενμ έιιμκδ ανκδηζηή επίδναζδ ζημ έκγοιμ ΖΑΟ δ μπμία κα μδδβεί ζε ιεζςιέκδ παναβςβή ΝΟ - 2. Ζ απμδμπή ηδξ παναπάκς οπυεεζδξ πνμτπμεέηεζ υηζ δ κζηνςδμπμίδζδ επζηεθείηαζ ηονίςξ απυ ΑΟΒ ηαεχξ ηα ΑΟΑ δεκ ηαηέπμοκ ημ έκγοιμ ΖΑΟ, ηάηζ ημ μπμίμ δεκ 419

420 θαίκεηαζ κα ζοιααίκεζ ζφιθςκα ιε ηζξ οπυθμζπεξ ιεηνήζεζξ ιαξ. Πεναζηένς ιεθέηεξ εα επζηεκηνχζμοκ ζηδκ παναημθμφεδζδ ηδξ έηθναζδξ ημο βμκζδίμο HAO πμο ηςδζημπμζεί ηδκ μλεζδμακαβςβάζδ ηδξ οδνμλοθαιίκδξ ζηα δείβιαηα εδάθμοξ απυ ημ πανυκ πείναια. Σα παναπάκς απμηεθέζιαηα ζε ζοκδοαζιυ 1) ιε ηδκ πμνεία απμδυιδζδξ ημο ΔQ ηαζ ηςκ ιεηααμθζηχκ ημο ζημ έδαθμξ υπμο ημ QI απμηέθεζε ημκ ηφνζμ πνμσυκ ιεηααμθζζιμφ ημο EQ ζημ έδαθμξ ηαηά ηζξ πνχηεξ 14 διένεξ ιεηά ηδκ πνμζεήηδ ημο EQ ηαζ 2) ιε ηα απμηεθέζιαηα ακαζημθήξ ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμίδζδξ ζε υθεξ ηζξ ιεηαπεζνίζεζξ πμο πενζείπακ QI κα απμηεθμφκ ααζζηέξ εκδείλεζξ βζα ηδκ εκενβή ζοιιεημπή ημο QI ζηδκ ακαζημθή ηδξ κζηνμπμίδζδξ. Χζηυζμ, βζα ηδκ πθήνδ ηεηιδνίςζδ αοηήξ ηδξ οπυεεζδξ εα πνέπεζ κα δζελαπεμφκ ζοιπθδνςιαηζηέξ ιεηνήζεζξ ιε RT-PCR πναβιαηζημφ πνυκμο βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ έηθναζδξ ημο βμκζδίμο amoa ζηα δείβιαηα εδάθμοξ πμο δέπηδηακ εθανιμβή EQ ηαζ ηςκ πνμσυκηςκ ιεηααμθζζιμφ ημο ηυζμ ιειμκςιέκα υζμ ηαζ ζε ιίβια πκπεξάζκαηα ηδκ πανμφζα ιεθέηδ πναβιαημπμζήεδηε ιία πμθοδζάζηαηδ πνμζέββζζδ εηηίιδζδξ ηδξ επίδναζδξ ηςκ β.θ.. πμο πενζέπμκηαζ ζηα οβνά απυαθδηα ηςκ ζοζηεοαζηδνίςκ ηςκ θνμφηςκ ζηδ θεζημονβία ηαζ ηδκ πμζηζθυηδηα ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. ημ πθαίζζμ αοηυ εθανιυζηδηε έκα εονφ θάζια αζμπδιζηχκ ηαζ ιμνζαηχκ ηεπκζηχκ εκχ πανάθθδθα παναημθμοεήεδηε δ πμνεία απμδυιδζδξ ηςκ β.θ.. χζηε κα δζαπζζηςεμφκ πζεακέξ ζοζπεηίζεζξ ιεηαλφ ιζηνμαζαηήξ ακαζημθήξ ηαζ οπμθεζιιαηζηυηδηαξ. Σα ιοηδημηηυκα ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ πανμοζίαζακ ζδζαίηενα ορδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα ζημ έδαθμξ ζε ακηίεεζδ ιε ηα ΟΡΡ, DPA ηαζ EQ, πμο απμδμιήεδηακ ηαπφηαηα. Δζδζηυηενα ημ EQ απμδείπεδηε ζδζαίηενα αζηαεέξ ζημ εδαθζηυ πενζαάθθμκ ηαζ μλεζδχεδηε ηαπφηαηα πνμξ QI, ηαζ EQNL. Σμ πνχημ απμηέθεζε ημκ ηφνζμ ιεηααμθίηδ ηαζ είπε ζφκημιδ οπμθεζιιαηζηή δζάνηεζα ζημ έδαθμξ, εκχ ημ EQNL ζπδιαηίζηδηε ζε παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ πμο πανμοζίαζακ ορδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα ζημ έδαθμξ. Σα ιοηδημηηυκα ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ, πανά ηδκ ιαηνά οπμθεζιιαηζηή ημοξ δζάνηεζα ζημ έδαθμξ δεκ πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ανκδηζηέξ επίδναζεζξ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ, ζε ακηίεεζδ ιε ηα EQ ηαζ ΟΡΡ πμο ακ ηαζ πανμοζίαζακ παιδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα ζημ έδαθμξ πνμηάθεζακ ζε μνζζιέκεξ πενζπηχζεζξ έιιμκεξ ή ιαηνμπνυκζεξ ανκδηζηέξ επζδνάζεζξ ζηδκ δμιή ηαζ 420

421 ζηδκ θεζημονβία ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ. Ζ δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ απμδείπεδηε μ πζμ εοαίζεδημξ θεζημονβζηυξ αζμδείηηδξ ηαζ επδνεάζηδηε ανκδηζηά ηονίςξ απυ ηδκ εθανιμβή ημο ακηζμλεζδςηζημφ EQ ηαζ δεοηενεουκηςξ απυ ημ ιοηδημηηυκμ ΟΡΡ. ηδκ πενίπηςζδ ημο EQ, δ πανμοζία ζηα εδαθζηά δείβιαηα ημο ηφνζμο ιεηααμθίηδ ημο QI, θαίκεηαζ κα εοεφκεηαζ βζα ηδκ ιενζηή ακαζημθή ηδξ θεζημονβίαξ ηδξ κζηνμπμίδζδξ. Σα εονήιαηα ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ ιεθέηδξ ηαηαδεζηκφμοκ βζα πνχηδ θμνά ημ εφνμξ ηςκ ανκδηζηχκ επζδνάζεςκ πμο ιπμνεί κα πνμηαθέζεζ δ απυννζρδ ηςκ οβνχκ απμαθήηςκ απυ ηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ, ηαζ εζδζηυηενα αοηχκ πμο πενζέπμοκ ΔQ (ιήθα ηαζ απθάδζα) ηαζ ΟΡΡ (εζπενζδμεζδή) ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ ηαζ επζζδιάκμοκ ηδ ζδιαζία θήρδξ ηαηάθθδθςκ ιέηνςκ δζαπείνζζδξ ηαζ ηεθζηήξ δζάεεζήξ ημοξ

422 5.7. Βηβιηνγξαθία Adair, K.L., Schwartz, E. (2008) Evidence that ammonia-oxidizing archaea are more abundant than ammonia-oxidizing bacteria in semiarid soils of Northern Arizona, USA. Microbiol Ecol 56: Adam, G., Duncan, H. (2001) Development of a sensitive and rapid method for the measurement of total microbial activity using fluorescein diacetate (FDA) in a range of soils. Soil Biol Biochem 33: Aharonson, N., Kafkafi, U. (1975) Adsorption, mobility and persistence of thiabendazole and methyl-2-benzimidazole-carbamate in soils. J Agric Food Chem 23: Alexander, M. (1977) Introduction to soil microbiology. 2 nd ed. John Wiley and Sons, New York. Allison, S.D., Martiny, J.B.H. (2008) Resistance, resilience, and redundancy in microbial communities. PNAS 105: Anastassiades, M., Lehotay, S.J., Stajnbaher, D., Schenck, F.J. (2003) Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and "dispersive solid-phase extraction" for the determination of pesticide residues in produce. J AOAC Int 86: Anderson, I.C., Cairney, J.W.G. (2004) Diversity and ecology of soil fungal communities: Increased understanding through the application of molecular techniques. Environ Microbiol 6: Baldrian, P. (2008) Enzymes of saprotrophic basidiomycetes. British Mycological Society Symposia Series 28 (C): Belser, L.W., Mays, E.L. (1980) Specific inhibition of nitrite oxidation by chlorate and its use in assessing nitrification in soils and sediments. Appl Environ Microb 39: Belser, L.W., Mays, E.L. (1980) Specific inhibition of nitrite oxidation by chlorate and its use in assessing nitrification in soils and sediments. Appl Environ Microb 39: Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Stryer, L. (2002) Eukaryotic Transcription and Translation Are Separated in Space and TimeBiochemistry. 5th edition. Section New York: W H Freeman,

423 Beulke, S., Brown, C.D. (2001) Evaluation of methods to derive pesticide degradation parameters for regulatory modeling. Biol Fertil Soils 33: Brannegan, D.R. (2000) Analysis of ethoxyquin and its oxidation products using supercritical fluid extraction and High Performance Liquid Chromatography with chemiluminescent nitrogen detection. Master thesis. Breeuwer, P., Drocourt, J.L., Bunschoten, N., Zwietering, M.H., Rombouts, F.M., Abee, T. (1995) Characterization of uptake and hydrolysis of fluorescein diacetate and carboxyfluorescein diacetate by intracellular esterases in Saccharomyces cerevisiae, which result in accumulation of fluorescein product. Appl Environ Microb 61: Bustin, S.A., Benes, V., Nolan, T., Pfaffl, M.W. (2005) Quantitative real-time RT- PCR- a perspective. J Molec Endocrin 34: Bustin, S.A., Nolan, T. (2004) Pitfalls of quantitative real-time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction. J Biomol Techniq 15: Carbonell, G., Pablos, M.V., García, P., Ramos, C., Sánchez, P., Fernández, C., Tarazona, J.V. (2000) rapid and cost-effective multiparameter toxicity tests for soil microorganisms. The Science of the Total Environment 247: Casieri, L., Anastasi, A., Prigione, V., Varese, G.C. (2010) Survey of ectomycorrhizal, litter-degrading, and wood-degrading Basidiomycetes for dye decolorization and ligninolytic enzyme activity. Antoniee van Leeuwenhoek 98: Castillo, L.E., Reupert, C., Solis, F. (2000) Pesticide residues in the aquatic environment of banana plantation areas in the North Atlantic Zone of Costa Rica. Environ Toxicol Chem 19: Cernohlavkova, J., Jarkovsky, J., Hofman, J. (2009) Effects of fungicides mancozeb and dinocap on carbon and nitrogen mineralization in soils. Ecotoxicology and Environmental Safety 72: Chen, X.-P., Zhu, Y.-G., Xia, Y., Shen, J.-P., He J.-Z. (2008) Ammonia-oxidizing archaea: important players in paddy rhizosphere soil? Environm Microbiol 10: Chowdhury, A., Pradhan, S., Saha, M., Sanyal, N. (2008) Impact of pesticides on soil microbiological parameters and possible bioremediation strategies. Indian J Microbiol 48:

424 Christodoulatos, C., Koutsospyros, A.D., Brodman, B.W., Korfiatis, G.P. (1997) Biodegradation of diphenylamine by selected microbial cultures. J Environm Sci Health Part A 32:15-30 Cayley, G. R., Lord, K. A. (1980) The extraction and assay of thiabendazole in strongly adsorbing soils. Pesticide Science 11: Demanou, J., Sharma, S., Dorfler,U., Schroll, R., Pritsch, K., Njine, T., Bausenwein, U., Monkiedje, A., Munch, J.C., Schloter, M. (2006) Structural and functional diversity of soil microbial communities as a result of combined applications of copper and mefenoxam. Soil Biol Biochem 38: Eivazi, F., Tabatabai, M.A. (1977) Phosphatase in soils. Soil Biol Biochem 9: Eivazi, F., Tabatabai, M.A. (1988). Glucosidases and galactosidases in soils. Soil Biol Biochem 20: El Ghaouth, A., Wilson, C.L., Wisniewski, M., Droby, S., Smilanick, J.L., Korsten, L. (2002) Biological control of postharvest diseases of citrus fruits. In: Gnanamanickam SS (ed) Biological Control of Crop Diseases. University of Madras-Guindy Chennai, Tamil Nadu, India, pp Environmental Protection Agency (EPA) USA (2000) Review report for the active substance thiabendazole. 7603/VI/97-final, pp. 41. Erguder, T.H., Boon, N., Wittebolle, L., Marzorati, M., Verstraete, W. (2009) Environmental factors shaping the ecological niches of ammonia-oxidizing archaea. FEMS Microbiol Rev 33: European Commission (EC), (2010). Review report for the active substance imazalil finalised in the Standing Committee on the Food Chain and Animal Health at its meeting on 9 July 2010 in view of the renewal of inclusion of Imazalil in Annex I of Directive 91/414/EEC. SANCO/11318/2010 rev.2, p. 8. European Commission (EC), Review report for the active substance thiabendazole finalised in the Standing Committee on Plant Health at its meeting on 12 December 2000 in view of the inclusion of thiabendazole in Annex I of Directive 91/414/EEC. 7603/VI/97-final, p. 41. European Food Safety Authority, (2012) Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance diphenylamine. EFSA Journal 10: 2486 (pp.59). 424

425 European Food Safety Authority, (2010a) Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance imazalil. EFSA Journal 8: 1526 (pp.69) (in: doi: /j.efsa ). European Food Safety Authority, (2010b) Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance ethoxyquin. EFSA Journal 8: 1710 (pp.38) (in: doi: /j.efsa ). European Food Safety Authority (EFSA), (2008) Peer review of the pesticide risk assessment of the active substance 2-phenylphenol. EFSA J. 217: European Union, (2000) Opinion of the scientific committee on plants regarding the evaluationof thiabendazole in the contex of council directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market-the Scientific Committee on Plants, SCP/THIABEN/002-Final, p. 7. Falkowski, P.G., Fenchel, T., Delong, E.F. (2008) The microbial engines that drive earth s biogeochemical cycles. Science 320: Findlay, R.H. (2004) Determination of microbial community structure using phospholipids fatty acid profiles. Molecular Microbial Ecology Manual, Second Edition 4.08, Kluwer Academic Publishers, Netherlands, pp Flaim, G.M., Toller, G. (1989) Treatment of postharvest pesticide residues. Agric Ecos Environ 27: FOCUS. Guidance Document on Estimating Persistence and Degradation Kinetics from Environmental Fate Studies on Pesticides in EU Registration. Report of the FOCUS Work Group on Degradation Kinetics, EC Document Reference Sanco/10058/2005 version 2.0, 2006, 434pp. Food and Agriculture Organization (FAO), (2001) FAO specifications and evaluations for plant protection products. IMAZALIL: (±)-allyl-1-(2,4- dichlorophenyl)-2-imidazol-1-ylethyl ether. Evaluation report 335/2001. In: pecs/imazalil.pdf. Francis, C.A., Roberts, K.J., Beman, J.M., Santoro, A.E., Oakley, B.B. (2005) Ubiquity and diversity of ammonia-oxidizing archaea in water columns and sediments of the ocean. PNAS 102: Freeman, W.M., Walker, S.J., Vrana, K.E. (1999) Quantitative RT-PCR: Pitfalls and potential. Biotechniques 26:

426 Gallagher, R. T., Stahr, H.M. (1980) Identification of a potential interference in the analysis of aflatoxin 2,4-dimethyl-6-ethoxyquinolinea, reaction product of ethyoxyquin. J Agric Food Chem 28: Garcia Portillo M, Avino ES, Vicente JO, De Andres RL, Jimenez MdlAS, Blanco JPL (2004) Purification system for wastewater coming from fruit and vegetable processing plants and phytosanitary treatments in the field. United States Patent, US 6,709,585 B1, p. 9. Gardes, M., Bruns, T.D. (1993) ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes application to the identification of mycorrhizae and rusts. Molecular Ecology 2: Goodwin, T.W. (1980) The Biochemistry of Carotenoids, vol. 1. Chapman and Hall, London, New York. Hassett, J., Zak, D.R., Blackwood, C.B., Pregitzer, K.S. (2009) Are basidiomycete laccase gene abundance and composition related to reduced lignolytic activity under elevated atmospheric NO _ 3 deposition in northern hardwood forest? Microbial Ecology 57: Hayat, R., Ali, S., Amara, U., Khalid, R., Ahmed, I. (2010) Soil beneficial bacteria and their role in plant growth promotion: a review. Ann Microbiol (In :doi: /s ). He, P., Ackman, G. (2000) Residues of ethoxyquin and ethoxyquin dimer in oceanfarmed salmonids determined by High-Pressure Liquid Chromatography. Journal of Food Science 65: Holmes, G.J., Eckert, J.W. (1999) Sensitivity of Penicillium digitatum and P. italicum to postharvest citrus fungicides in California. Phytopathology 89: Javorekova, S., Svrcekova, I., Makova, J. (2010) Influence of benomyl and prometryn on the soil microbial activities and community structures in pasture grasslands of Slovakia. Journal of Environmental Science and Health Part B 45: Johnson, D.S., Allen, J.G., Warman, T.M. (2006) Post-harvest application of diphenylamine and ethoxyquin for the control of superficial scald on Bramley s seedling apples. J Sci Food Agric 31: Kandeler, E. (1995) Potential nitrification. In: Schinner, F., Őhlinger, R., Kandeler, E., Margesin, R. (Eds.), Methods in Soil Biology. Springer-Verlag, Heidelberg, p

427 Karanasios, E., Tsiropoulos, N.G., Karpouzas, D.G., Ehaliotis, C. (2010) Degradation and adsorption of pesticides in compost-based biomixtures as potential substrates for biobeds in Southern Europe. J Agric Food Chem 58: Koesukwiwat, U., Lehotay, S.J., Miao, S., Leepipatpiboon, N. (2010) High troughput analysis of 150 pesticides in fruits and vegetables using QuEChERS and lowpressure gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A 1217: Leininger, S., Urich, T., Schloter, M., Schwark, L., Qi, J., Nicol, G.W., Prosser, J.I., Schuster, S.C., Schleper, C., (2006). Archaea predominate among ammoniaoxidizing prokaryotes in soils. Nature 442: Lehotay, S. J. (2004) Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe (QuEChERS) approach for determining pesticide residues. In press: Pesticide Analysis in Methods in Biotechnology, Eds. J.L. Vidal Martinez and A. Garrido Frenich, Humana Press, USA. Lekanne Deprez, R.H., Fijnvandraat, A.C., Ruijter, J.M., Moorman, A.F.M. (2002) Sensitivity and accuracy of quantitative real-time polymerase chain reaction using SYBR green I depends on cdna synthesis conditions. Analytical Biochemistry 307: Maliszewska-Kordybach, B., Klimkowicz-Pawlas, A., Smreczak, B. (2007) Ecotoxic eefect of phenanthrene on nitryfing bacteria in soils of different properties. J Environ Qual 36: Mattheis, J.M., Rudell, D.R. (2008) Diphenylamine metabolism in «Braeburn» apples stored under conditions conducive to the development of internal browning. J. Agric. Food Chem. 56: Miransari, M. (2011) Soil microbes and plant fertilization. Appl Microbiol Biotechnol 92: Moggia, C., Moya-Leon, M.A., Pereira, M., Yuri, J.A., Lobos, G.A. (2010) Effect of DPA and 1-MCP on chemical compounds related to superficial scald of Granny Smith apples. Spanish Journal of Agricultural Research 8: Munoz-Leoz, B., Ruiz-Romera, E., Antiguedad, I., Garbisu, C. (2011) Tebuconazole application decreases soil microbial biomass and activity. Soil Biol Biochem 43:

428 Nicol, G.W., Leininger, S., Schleper, C., Prosser, J.I. (2008) The influence of soil ph on the diversity, abundance and transcriptional activity of ammonia oxidizing archaea and bacteria. Environ Microbiol 10: Nicol, G.W., Schleper, C. (2006) Ammonia-oxidising Crenarchaeota: important players in the nitrogen cycle? Trends Microbiol 14: Nicolaisen, M. H., Ramsing, N. B. (2002) Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) approaches to study the diversity of ammonia-oxidizing bacteria. J Microbiol Meth 50: Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. (2006) Quantification of mrna using real-time RT-PCR. Nature Protocols 1: OECD (2002) OECD Guidelines for the testing of chemicals. Section 3: Degradation and accumulation. Test No 307: Aerobic and Anaerobic Transformation in Soil. Omirou, M., Dalias, P., Costa, C., Papastefanou, C., Dados, A., Ehaliotis, C., Karpouzas, D.G. (2012) Exploring the potential of biobeds for the depuration of pesticide-contaminate wastewaters from the citrus production chain: Laboratory, column and field studies. Environmental Pollution 166: Omirou, M., Rousidou, C., Bekris, F., Papadopoulou, K.K., Ehaliotis, E.K., Menkissoglu-Spiroudi, U., Karpouzas, D.G., (2011) Σhe impact of biofumigation and chemical fumigation methods on the structure and function of the soil microbial community. Microb Ecol 61: Pal, R., Chakrabati, K., Chakraborty, A., Chowdhury, A. (2006) Degradation and effects of pesticides on soil microbiological parameters- A review. International Journal of Agricultural Research 1: Pal, R., Chakrabarti, K., Chakraborty, A., Chowdhury, A. (2005) Pencycuron application to soils: Degradation and effect on microbiological parameters. Chemosphere 60: Papadopoulou, E.S., Menkissoglu-Spiroudi, U., Manta, S., Komiotis, D., Karpouzas, D.G. (2012) Residue analysis of ethoxyquin and its oxidation products in a Greek loam topsoil. MGPR Annual Meeting 2012, Belgrade, Serbia. Paul, E.A., Clark, F.E. (1989) Soil microbiology and biochemistry. Academic Press, San Diego. 428

429 Pereira e Silva, M.C., Semenov, A.V. Schmitt, H., van Elsas, J.D., Salles, J.F. (2013) Microbe-mediated processes as indicators to establish the normal operating range of soil functioning. Soil Biology and Biochemistry (in press, /j.soilbio ). Perfetti, G.A., Warner, C.R., Fazio, T. (1981) High pressure liquid chromatographic determination of ethoxyquin in paprika and chili powder. J Assoc Off Anal Chem 64: Pfaffl, M.W. (2001) A new mathematical model for relative quantification in realtime RT-PCR. Nucleic Acids Research 29: Pfaffl, M.W. (2004) Quantification strategies in real-time PCR. In: A-Z of quantitative PCR (Editor: S.A. Bustin), International University Line (IUL), chapter 3, pp. Prosser, J.I., Nicol, G.W. (2008) Relative contributions of archaea and bacteria to aerobic ammonia oxidation in the environment. Environ Microbiol 10: Puglisi, E., Vasiliadis, S., Demiris, C., Bassi, D., Karpouzas, D.G., Capri E., Cocconcelli, P.S., Trevisan, M. (2012) Fungicides impact on the diversity and function of non-target ammonia oxidizing microorganisms residing in a litter soil cover. Microb Ecol 64: Purkhold, U., Pommerening-Röser, A., Juretschko, S., Schmid, M. C., Koops, H.-P., Rauhut, R., Klug, G. (1999) mrna degradation in bacteria. FEMS Microbiology Reviews 23: Rashtchian, A. (1994) Amplification of RNA. Genome Res 4:S83-S91. Robatscher, P., Eisenstecken, D., Sacco, F., Pohl, H., Berger, J., Zanella, A., Oberhuber, M. (2012) Diphenylamine residues in apples caused by contamination in fruit storage facilities. Journal of Agricultural and Food Chemistry 60: Rodríguez, R., Pico, Y., Font, G., Manes, J. (2002) Analysis of thiabendazole and procymidone in fruits and vegetables by capillary electrophoresis electrospray mass spectrometry. Journal of Chromatography A 949: Rotman, B., Papermaster, B.W. (1966) Membrane properties of living mammalian cells as studied by enzymatic hydrolysis of fluorogenic esters. Proc Natn Acad Sci USA 55:

430 Rotthauwe, J.H., Witzel, K.P., Liesack, W. (1997) The ammonia monooxygenase structural gene amoa as a functional marker: molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing populations. Appl Environ Microbiol 63: Rudell, D.R., Matttheis, J.P., Fellman, J.K. (2006) Influence of ethylene action, storage duration on diphenylamine and diphenylamine derivative content of Granny Smith apple peel. J. Agric. Food Chem. 54: SANCO Doc (2011) Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed Document. N SANCO/12495/2011. Schirra, M., Cabras, P., Angioni, A., D Hallewin, G., Pala, M. (2002) Residue uptake and storage responses of tarocco blood oranges after preharvest Thiabendazole spray and postharvest heat treatment. J Agric Food Chem 50: Schreier, C.J., Greene, R.J. (1997) Determination of ethoxyquin in feeds by liquid chromatography: collaborative study. J AOAC Int. 80: Skaare, J. U., Dahle, H.K. (1975) Gas chromatographic-mass spectrometric studies of ethoxyquin in some organic solvents I. J Agric Food Chem 23: Smilanick, J.L., Mansour, M.F., Sorenson, D. (2006) Pre- and postharvest treatments to control green mold of citrus fruitduring ethylene degreening. Plant Dis 90: Smith, C. J., Osborn, A. M. (2009) Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol 67: Söderström, B.E. (1976) Vital staining of fungi in pure cultures and in soil with fluorescein diacetate. Soil Biol Biochem 9: Solel, Z., Sandier, D., Dinoor, A. (1979) Mobility and persistence of carbendazim and thiabendazole applied to soil via drip irrigation. Disease Control and Pest Management 69: Spyrou, I.M., Karpouzas, D.G., Menkissoglu-Spiroudi, U. (2009) Do botanical pesticides alter the structure of the soil microbial community. Microb Ecol 58: Swisher, R., Carroll, G.C. (1980) Fluorescein diacetate hydrolysis as an estimator of microbial biomass on coniferous needle surfaces. Microb Ecol 6: Tabatabai, M.A. (1994) Soil enzymes. In: Weaver, R.W., Angle, J.S., Bottomley, P.S. (Eds.), Methods of Soil Analysis: Microbiological and Biochemical Properties. Part 2. SSSA Book Ser. 5. SSSA, Madison, WI, pp

431 Tabatabai, M.A., Bremner, J.M. (1971) Michaelis constant of soil enzymes. Soil Biol Biochem 3: Thorisson, S., Gunstone, F.D., Hardy, R. (1992) Some oxidation products of ethoxyquin including those found in autoxidising systems. Chemistry and Physics of Lipids 60: Tourna, M., Freitag, T.E., Nicol, G.W., Prosser, J.I. (2010) Stable isotope probing analysis of interactions between ammonia oxidizers. Appl Environ Microbiol 76: Tourna, M., Freitag, T.E., Nicol, G.W., Prosser, J.I. (2008) Growth, activity and temperature responses of ammonia-oxidizing archaea and bacteria in soil microcosms. Environ Microbiol 10: Viñas, P., Hernandez Cordoba, M., Sanchez-Pedrenio, C. (1991) Determination of ethoxyquin in paprika by High-Performance Liquid Chromatography. Food Chemistry 42: Vogel, C., Marcotte, E. M. (2013) Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet 13: Doi: /nrg3185. Wagner, M. (2000). Phylogeny of all recognized species of ammonia oxidizers based on comparative 16S rrna and amoa sequence analysis: implications for molecular diversity surveys. Appl Environ Microbiol 66: Walters, E., McClellan, K., Halden, R.U. (2010) Occurrence and loss over three years of 72 pharmaceuticals and personal care products from biosolids-soil mixtures in outdoor mesocosms. Water Res 44: Wessen E., Hallin, S. (2011) Abundance of archaeal and bacterial ammonia oxidizers Possible bioindicator for soil monitoring. Ecological Indicators 11: Wu, Q., Li, Y., Wang, C., Liu, Z., Zang, Z., Zhou, X., Wang, Z. (2009) Dispersive liquid-liquid microextraction combined with high performance liquid chromatography-fluorescence detection for the determination of carbendazim and thiabendazole in environmental samples. Analytica Chimica Acta 638: Yamazaki, Y., Ninomiya, T. (1999) Determination of benomyl, diphenyl, o- phenylphenol, thiabendazole, chlorpyrifos, methidathion, and methyl parathion in oranges by solid-phase extraction, liquid chromatography, and Gas Chromatography. Journal of AOAC International 82:

432 Yoshioka, N., Akiyama, Y., Teranishi, K. (2004) Rapid simultaneous determination of o-phenylphenol, diphenyl, thiabendazole, imazalil and its major metabolite in citrus fruits by liquid chromatography-mass spectrometry using atmospheric pressure photoionization. Journal of Chromatography A 1022: You, J., Das, A., Dolan, E.M., Hu, Z. (2009) Ammonia-oxidizing archaea involved in nitrogen removal. Water Research 43: Zhang, L., Gurskaya1, N. G., Merzlyak, E. M., Starovero, D. B., Mudrik, N. N., Samarkina, O. N.,Vinokurov, L. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. (2007) Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques 42: Zibilske, L.M. (1994) Carbon mineralization. In: Weaver, R.W., Angle, J.S., Bottomley, P.S. (Eds.), Methods of Soil Analysis: Microbiological and Biochemical Properties. Part 2. SSSA Book Ser. 5. SSSA, Madison, WI, pp Κανακάζζμξ, Δ. (2011) Σφπδ ηαζ ζοιπενζθμνά βεςνβζηχκ θανιάηςκ ζε ζφζηδια αζμηθζκχκ πνμζανιμζιέκςκ ζημκ εθθαδζηυ πχνμ ηαζ αλζμθυβδζδ ημοξ ζημκ πενζμνζζιυ ηδξ, απυ ζδιεζαηέξ πδβέξ νφπακζδξ ιε βεςνβζηά θάνιαηα. Γζδαηημνζηή δζαηνζαή, Σιήια Γεςπμκίαξ, Φοηζηήξ Παναβςβήξ ηαζ Αβνμηζημφ Πενζαάθθμκημξ, Πακεπζζηήιζμ Θεζζαθίαξ. 432

433 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 6. ΓΔΝΗΚΑ ΤΜΠΔΡΑΜΑΣΑ-ΔΠΗΛΟΓΟ Ζ ζφβπνμκδ βεςνβία ζπεηίγεηαζ άιεζα ιε ηδκ εκηαηζηή πνήζδ δζαθυνςκ μιάδςκ β.θ. πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα κα εακαηχζμοκ, κα πανειπμδίζμοκ ή κα επζαναδφκμοκ ηδκ ακάπηολδ ηςκ δζαθυνςκ εζδχκ θοημπαναζίηςκ, ιε ηεθζηυ ζημπυ ηδκ αφλδζδ ηδξ βεςνβζηήξ παναβςβήξ ηαζ ηδκ ηάθορδ ηςκ μθμέκα αολακυιεκςκ απαζηήζεςκ ημο παβηυζιζμο πθδεοζιμφ ζε ηνμθζηά απμεέιαηα. Ζ εκηακηζηή πνήζδ ηςκ β.θ. ζηδ βεςνβία, έπεζ μδδβήζεζ ζηδκ ιεηαθμνά ζδιακηζηχκ πμζμηήηςκ ηυζμ β.θ.. υζμ ηαζ πνμσυκηςκ ιεηααμθζζιμφ ημοξ ζημ έδαθμξ δδιζμονβχκηαξ ζμαανά πνμαθήιαηα ηυζμ βζα ημ πενζαάθθμκ υζμ ηαζ βζα ηδκ οβεία ημο ακενχπμο πμο δζααζεί εκηυξ αοημφ. ημ ζφβπνμκμ πθαίζζμ άζηδζδξ ηδξ βεςνβίαξ ημ εκδζαθένμκ βζα ηδ νφπακζδ ημο πενζαάθθμκημξ απυ ηδ πνήζδ ηςκ β.θ. είκαζ ζδζαίηενα αολδιέκμ. Ζ ηφπδ ηςκ β.θ. ζημ έδαθμξ, ζε ζπέζδ ιε ηδκ απμηεθεζιαηζηυηδηα εθέβπμο ηςκ θοημπαναζίηςκ, ηδκ έηεεζδ ηςκ μνβακζζιχκ ιδ ζηυπςκ ηαζ ηδκ ηζκδηζηυηδηα ημοξ εηηυξ ζηυπμο δνάζδξ, ανίζηεηαζ ζημ επίηεκηνμ ημο εκδζαθένμκημξ, ηονίςξ θυβς ηςκ πζεακχκ ανκδηζηχκ επζπηχζεςκ ηςκ πδιζηχκ αοηχκ εκχζεςκ ζε μνβακζζιμφξ ιδ-ζηυπμοξ. Ζ κμιμεεζία πμο ηαεμνίγεζ ηζξ δζαδζηαζίεξ αλζμθυβδζδξ βζα ηδκ έβηνζζδ πνήζδξ εκυξ β.θ.. ζηδκ ΔΔ έπεζ δδιζμονβήζεζ έκα ζδζαίηενα αοζηδνυ πθαίζζμ βζα ηδκ αλζμθυβδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ζε μνβακζζιμφξ ιδ-ζηυπμοξ. Πανυθαοηα δ ημλζηυηδηα ηςκ β.θ.. ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ ζφιθςκα ιε ηδκ πανμφζα κμιμεεζία ζηδνίγεηαζ ζε δφμ απθέξ δμηζιέξ ακμνβακμπμίδζδξ C ηαζ Ν πμο ζε ηαιία πενίπηςζδ δεκ απμδίδμοκ ηδκ πθήνδ εζηυκα ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ζε επίπεδμ πμζηζθυηδηαξ ηαζ θεζημονβίαξ. Γεδμιέκμο ημο ζδιακηζηυηαημο νυθμο ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ βζα ηδκ θεζημονβία ημο μζημζοζηήιαημξ ηνίκεηαζ απαναίηδηδ δ δδιζμονβία εκυξ παηέημο δζαδζηαζζχκ βζα ηδ νεαθζζηζηή αλζμθυβδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. Σμ παηέηo αοηυ εα πνέπεζ κα πενζθαιαάκεζ πμθοεπίπεδεξ δζαδζηαζίεξ πεζναιαηζζιμφ ηαεχξ ηαζ ηοπμπμζδιέκεξ ιεευδμοξ βζα ηδκ αλζμθυβδζδ ηςκ επζδνάζεςκ ηςκ β.θ.. ηυζμ ζε επίπεδμ πμζηζθυηδηαξ υζμ ηαζ ζε επίπεδμ θεζημονβίαξ. Έκα απυ ηα ααζζηά γδηήιαηα πμο ακαηφπημοκ ζηδκ δδιζμονβία αοημφ ημο παηέημο δζαδζηαζζχκ είκαζ μ ηαεμνζζιυξ επζιένμοξ μιάδςκ ιζηνμμνβακζζιχκ πμο κα ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ ςξ αζμθμβζημί δείηηεξ βζα ηδκ αλζμθυβδζδ ηδξ 433

434 επίδναζδξ ηςκ β.θ.. ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. Σέημζμζ ιζηνμαζαημί αζμδείηεξ εα πνέπεζ ζοβηεκηνχκμοκ ηα παναηάης παναηηδνζζηζηά α) κα επζηεθμφκ ιζα ζδιακηζηή ιζηνμαζαηή θεζημοβία ηαζ α) κα οπάνπμοκ αηνζαείξ ηαζ ζπεηζηά απθέξ ιέεμδμζ βζα ημκ πμζμηζηυ ηαζ πμζμηζηυ πνμζδζμνζζιυ ημοξ ζημ πενζαάθθμκ. Χξ ηέημζμζ ιζηνμαζαημί αζμδείηηεξ έπμοκ πνμηαεεί κα πνδζζιμπμζδεμφκ (1) μζ κζηνςδμπμζδηζημί ιζηνμμνβακζζιμί πμο εθέβπμοκ ημ νοειμηαεμνζζηζηυ ζηάδζμ ημο ηφηθμο ημο Ν, ηδκ ιεηαηνμπή ηδξ αιιςκίαξ ζε κζηνζηά ζυκηα (2) μζ Γεκδνυιμνθμζ Μοημννζγζημί Μφηδηεξ (ΓΜΜ) θυβς ημο ζδζαίηενμο νυθμο ημοξ ζηδ δζαηήνδζδ ηδξ βμκζιυηδηαξ ηςκ εδαθχκ ηαζ ηδξ βεκζηυηενδξ θεζημονβίαξ ημο μζημζοζηήιαημξ. Σμ δεφηενμ γδημφιεκμ ζημκ ηαεμνζζιυ ημο παηέημο δζαδζηαζζχκ είκαζ δ ακάπηολδ ηαζ πνήζδ ηαηάθθδθςκ ηοπμπμζδιέκςκ ηαζ ορδθήξ αηνίαεζαξ ιεευδςκ βζα ηδκ αλζμθυβδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ. Σζξ ηεθεοηαίεξ δεηαεηίεξ, έκαξ εκηοπςζζαηυξ ανζειυξ ιεευδςκ ηαζ ηεπκζηχκ έπεζ ακαπηοπεεί ηαζ πνδζζιμπμζδεεί ιε ζηυπμ ηδκ αλζμθυβδζδ ηδξ επίδναζδξ λεκμαζμηζηχκ παναβυκηςκ ζηδκ ιζηνμαζαηή θεζημονβία ηαζ πμζηζθυηδηα. Χζηυζμ, δ πενζμνζζιέκδ ηοπμπμίδζδ ηςκ ζοβηεηνζιέκςκ ιεευδςκ ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ πακηεθή έθθεζρδ πνυηοπςκ πεζναιαηζηχκ πνμζεββίζεςκ δεκ έπεζ επζηνέρεζ ηδκ ζοβηνζηζηή αλζμθυβδζδ αοηήξ ηδξ πθδεχναξ δεδμιέκςκ. ήιενα, είκαζ θμζπυκ γδημφιεκμ κα πνδζζιμπμζήζμοιε άιεζα ηζξ θίβεξ ηοπμπμζδιέκεξ ιεευδμοξ πμο είκαζ δζαεέζζιεξ (PLFAs, εκγοιζηέξ δναζηζηυηδηεξ, qpcr δζάθμνςκ ηαλζκμιζηχκ μιάδςκ) ηαζ πανάθθδθα κα ηοπμπμζήζμοιε κέεξ ιεευδμοξ πμο εα ιπμνέζμοκ κα δχζμοκ επζπθέμκ πθδνμθμνίεξ βζα ηδκ επίδναζδ ηςκ β.θ.. ζηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ διακηζηυξ ανζειυξ ιεθεηχκ έπεζ αζπμθδεεί ςξ ζήιενα ιε ηδκ αλζμθυβδζδ ηςκ επζδνάζεςκ ηονίςξ ηςκ ζοκεεηζηχκ β.θ. ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Ζ πθεζμρδθία ηςκ παναπάκς ιεθεηχκ έπεζ πναβιαημπμζδεεί ζε επίπεδμ ιζηνμηυζιςκ, εκχ εθάπζζηεξ είκαζ μζ δζαεέζζιεξ πθδνμθμνίεξ ζπεηζηά ιε ηζξ επζδνάζεζξ ηςκ ζοκεεηζηχκ β.θ., ζε νεαθζζηζηά επίπεδα έηεεζδξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ, ζε επίπεδμ πεδίμο. Απυ ηα απμηεθέζιαηα ηςκ πενζζζμηένςκ απυ αοηέξ ηζξ ιεθέηεξ πνμηφπηεζ υηζ μζ επζδνάζεζξ ζηδ δμιή ηαζ ηδ θεζημονβία ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ πμο πνμηαθεί δ εθανιμβή ηδξ ζοκζζηχιεκδξ δυζδξ ζοκεεηζηχκ β.θ. είκαζ αζήιακηεξ ή πανμδζηέξ. Απυ ηδκ άθθδ πθεονά, άβκςζηεξ παναιέκμοκ μζ ζοκέπεζέξ πνήζδξ βζα έκα ιεβάθμ ανζειυ β.θ. ιε έβηνζζή ηοηθμθμνίαξ ηαζ ειπμνίαξ ζηδκ Δ.Δ ηαζ ζδζαίηενα εηείκςκ ηςκ ηαηδβμνζχκ β.θ. πμο εεςνείηαζ υηζ δεκ έπμοκ επζπηχζεζξ ζημ πενζαάθθμκ 434

435 ηαζ ημοξ μνβακζζιμφξ ιδ ζηυπμοξ θυβς ηδξ πνμέθεοζδξ, ημο ηνυπμο δνάζδξ ή ημο ηνυπμο εθανιμβήξ ημοξ. Ακάιεζα ημοξ ζδζαίηενμ εκδζαθένμκ πανμοζζάγμοκ (1) ηα αζμθμβζηά β.θ. πμο θυβς ηδξ αμηακζηήξ ή ιζηνμαζαηήξ πνμέθεοζδξ ημοξ εεςνμφκηαζ αζθαθή βζα ημ πνήζηδ ηαζ ημ πενζαάθθμκ, (2) ηα ζφβπνμκα β.θ., υπςξ ηα γζγακζμηηυκα ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονζχκ, πμο θυβς ηδξ παιδθήξ δυζδξ εθανιμβήξ ηαζ ηδξ εηθεηηζηυηδηαξ πμο επζδεζηκφμοκ εεςνμφκηαζ θζβυηενμ επζαθααή απυ ηα ζοκεεηζηά β.θ. ηδξ πνμδβμφιεκδξ βεκζάξ, βζα ημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ιδ ζηυπμοξ ηαζ (3) ηα β.θ., ηα β.θ. πμο πενζέπμκηαζ ζηα οβνά απυαθδηα ηςκ ζοζηεοαζηδνίςκ θνμφηςκ, πμο θυβς ημο ηνυπμο εθανιμβήξ ημοξ δεκ εεςνείηαζ πζεακυ κα ηαηαθήλμοκ ζημ πενζαάθθμκ. ημ πθαίζζμ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ δζενεοκήεδηακ ζε επίπεδμ ενβαζηδνίμο ηαζ αβνμφ ιε ηδ πνήζδ πθήεμοξ δζαθμνεηζηχκ αζμπδιζηχκ ηαζ ιμνζαηχκ ηεπκζηχκ δζάθμνα β.θ.. πμο ακήημοκ ζηζξ παναπάκς ηαηδβμνίεξ υζμκ αθμνά (1) ζηδ ζοιπενζθμνά ημοξ ζημ έδαθμξ ηαζ (2) ζηδκ επίδναζδ ημοξ ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Δζδζηυηενα, ιεθεηήεδηε ζοκμθζηά δ επίδναζδ 4 κδιαηςδμηηυκςκ (μxamyl, fluensulfone, QL Agri ηαζ BIOACT ), εκυξ γζγακζμηηυκμο (nicosulfuron), 3 ιοηδημηηυκςκ (thiabendazole, imazalil ηαζ ortho-phenyl phenol) ηαζ 2 ακηζμλεζδςηζηχκ μοζζχκ (diphenylamine ηαζ ethoxyquin). Ανπζηυξ ζηυπμξ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ ήηακ δ αεθηζζημπμίδζδ ηδξ ιεευδμο ακάθοζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ (PLFAs) ιε άιεζδ επζδίςλδ ηδκ πνήζδ ηδξ αεθηζζημπμζδιέκδξ ιεευδμο βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ επζδνάζεςκ επζθεβιέκςκ β.θ.. ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. Απχηενμξ ζημπυξ αοηήξ ηδξ πνμζπάεεζαξ, ήηακ δ ακάπηολδ εκυξ εκζαίμο πνςημηυθθμο ιε ηαεμθζηή εθανιμβή ζε υθμοξ ημοξ ηφπμοξ εδαθχκ ηαζ ακελανηήηςξ εδαθζημφ ph. Ζ ιέεμδμξ ακάθοζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηςκ θςζθμθζπζδίςκ (PLFAs) ααζίγεηαζ ιέπνζ ζήιενα ζημ πνςημπoνζαηυ πνςηυημθθμ ηςκ Bligh ηαζ Dyer (1959) ζφιθςκα ιε ημ μπμίμ ζημ ανπζηυ ιίβια εηπφθζζδξ πενζθαιαάκμκηαζ κενυ ή νοειζζηζηυ δζάθοια, έκαξ ιδ πμθζηυξ μνβακζηυξ δζαθφηδξ ηαζ δ ιεεακυθδ. Γζάθμνεξ ηνμπμπμζήζεζξ αοηήξ ηδξ ιεευδμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδ αζαθζμβναθία ηαηά ζοκεήηδ ηαζ αθμνμφκ αθθαβέξ ζημ νοειζζηζηυ δζάθοια, ημκ ιδ πμθζηυ μνβακζηυ δζαθφηδ ηαζ ζημκ ανζειυ ηςκ ηφηθςκ εηπφθζζδξ. Γζα ημ θυβμ αοηυ εηηζιήεδηε δ επίδναζδ ημο μνβακζημφ δζαθφηδ (CHL έκακηζ DCM), ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (Phos έκακηζ Cit), ηαεχξ ηαζ ηςκ επζιένμοξ ζοκδοαζιχκ ημοξ, ζηδκ πμζυηδηα ηαζ ηδ ζφζηαζδ ηςκ PLFAs πμο ακζπκεφηδηακ ιεηά απυ έκακ ή δφμ ζοκεπυιεκμοξ ηφηθμοξ εηπφθζζδξ, δζάνηεζαξ 2 ςνχκ ακά ηφηθμ, ζε δφμ εδάθδ πμο δζέθενακ ςξ πνμξ ημ ph ηαζ ηα οπυθμζπα 435

436 θοζζημπδιζηά παναηηδνζζηζηά. Σμ αεθηζζημπμζδιέκμ πνςηυημθθμ πμο πνμέηορε πνδζζιμπμζήεδηε ζηδ ζοκέπεζα βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ επζθεβιέκςκ ζοκεεηζηχκ (oxamyl ηαζ fluensulfone) ηαζ αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ κδιαηςδμηηυκςκ (QL Agri ηαζ BIOACT ) ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. ε επυιεκμ ζηάδζμ εηηζιήεδηακ μζ επζδνάζεζξ ημο εονέςξ πνδζζιμπμζμφιεκμο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron ηδξ μιάδαξ ηςκ ζμοθθμκοθμονίςκ, πμο παναηηδνίγεηαζ απυ παιδθέξ δυζεζξ εθανιμβήξ ζε δφμ ζδιακηζηέξ θεζημονβζηέξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ: α) ζηδ δμιή ηαζ ηδκ αθεμκία ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ ηαζ α) ζηδκ πμζηζθυηδηα ηςκ ΓΜΜ. Ζ αλζμθυβδζδ ηςκ επζδνάζεςκ επί ηςκ παναπάκς ιζηνμμνβακζζιχκ-δεζηηχκ πνμζδζμνίζηδηε ζε δφμ πεζναιαηζηά επίπεδα: ανπζηά ζε επίπεδμ εενιμηδπίμο/ενβαζηδνίμο οπυ αηναίεξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ (Tier I) ηαζ αημθμφεςξ ζε επίπεδμ αβνμφ οπυ νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ (Tier II). Ζ πμθοθαζζηή αοηή πνμζέββζζδ ακηζηαημπηνίγεζ ηαζ ηδκ ζδιενζκή πναηηζηή πμο αημθμοεείηαζ βζα ηδκ αλζμθυβδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ζε άθθμοξ μνβακζζιμφξ ιδ-ζηυπμοξ, υπςξ οδνυαζμοξ μνβακζζιμφξ, πηδκά ηηθ.. Σέθμξ, πναβιαημπμζήεδηε ιία πμθοεπίπεδδ πνμζέββζζδ εηηίιδζδξ ηδξ επίδναζδξ ηςκ ιοηδημηηυκςκ TBZ, IMZ, OPP ηαζ ηςκ ακηζμλεζδςηζηχκ μοζζχκ DPA ηαζ EQ πμο πενζέπμκηαζ ζοκήεςξ ζηα οβνά απυαθδηα ηςκ ζοζηεοαζηδνίςκ ηςκ θνμφηςκ, ζηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ, οπυ νεαθζζηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ (50 mg Kg -1 εδάθμοξ). οκμθζηά εηηζιήεδηε δ πμνεία απμδυιδζδξ ηςκ β.θ.. ζημ έδαθμξ, ζε πνμκζηυ δζάζηδια δζάνηεζαξ 100 διενχκ ηαζ πανάθθδθα πνμζδζμνίζηδηε δ επίδναζδ ηςκ β.θ. ζηδ δμιή ηαζ ηδ θεζημονβία ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ ιε ηδ πνήζδ εονέςξ απμδεηηχκ αζμπδιζηχκ ηαζ ιμνζαηχκ ιεευδςκ ακάθοζδξ ηα πενζζζυηενα εη ηςκ μπμίςκ έπμοκ ήδδ ηοπμπμζδεεί (PLFAs, εκγοιζηέξ δναζηζηυηδηεξ) ή ανίζημκηαζ ζε δζαδζηαζία ηοπμπμίδζδξ (qpcr) Απυ ηα απμηεθέζιαηα ηςκ πεζναιάηςκ πμο δζελάπεδηακ ζημ πθαίζζμ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ πνμηφπηεζ ζοκμθζηά υηζ: 1. Βεθηζζημπμζήεδηε δ ιέεμδμξ PLFAs ιε ηδκ πνήζδ εηποθζζηζημφ ιίβιαημξ πθςνμθμνιίμο-ιεεακυθδξ-νοειζζηζημφ ηζηνζημφ μλέμξ ζε ζοκδοαζιυ ιε 2x2 h ηφηθμοξ εηπφθζζδξ. 2. Ζ εθανιμβή ηςκ β.θ.. oxamyl, fluensulfone ηαζ ημο αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ QL Agri ζηδ ζοκζζηχιεκδ δυζδ δεκ επδνέαζε ανκδηζηά ηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ υπςξ πνμζδζμνίζηδηε ιε ηδκ αεθηζζημπμζδιέκδ 436

437 ιέεμδμ PLFAs. Ακηίεεηα δ εθανιμβή ημο αίμ-κδιαηςδμηηυκμο BIOACT πνμηάθεζε ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδ ζφζηαζδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ημο εδάθμοξ εοκμχκηαξ ηδκ ακάπηολδ ημπζμηνμθζηχκ ααηηδνίςκ ηαζ ιοηήηςκ πμο δζαηνέθμκηακ επζ ηδξ βθοηυγδξ ηαζ ημο απμαμοηονςιέκμο μνμφ βάθαηημξ πμο πενζέπεηαζ ζημ ζηεφαζια ημο BIOACT ζε ορδθέξ πμζυηδηεξ. Πεναζηένς ιεθέηεξ πμο δεκ απμηέθεζακ ιένμξ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ έδεζλακ υηζ ημ BIOACT πνμηάθεζε ηαζ πανμδζηή ιείςζδ ηδξ αθεμκίαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ πμο υπςξ επζαεααίςζακ πεναζηένς ιεθέηεξ μθείθμκηακ ζηδκ εοενβεηζηή δνάζδ ηςκ ζοκεηδυπςκ ημο ζηεοάζιαημξ, βθοηυγδ ηαζ απμαμοηονςιέκμξ μνυξ βάθαηημξ, ζημοξ εηενυηνμθμφξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ πμο ακαπηφπεδηακ ηαπφηαηα επί αοηχκ ηςκ ζοζηαηζηχκ ηαζ εηηυπζζακ ανπζηά ηα αναδέςξ ακαπηοζζυιεκα πδιεζμαοηυηνμθα κζηνςδμπμζδηζηά ααηηήνζα ηαζ ανπαία. 3. H εηηίιδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ ημο γζγακζμηηυκμο nicosulfuron ζε αηναίεξ ηαζ ζδζαίηενα ζοκηδνδηζηέξ ζοκεήηεξ έηεεζδξ (Tier I) έδεζλε υηζ ημ γζγακζμηηυκμ υηακ εθανιυζηδηε ζε δυζεζξ x100 ηδξ ζοκζζηχιεκδξ ή ηαζ ορδθυηενεξ πνμηάθεζε α) ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδκ ζφζηαζδ ηδξ ημζκυηδηαξ ηςκ κζηνςδμπμζδηζηχκ ιζηνμμνβακζζιχκ δ μπμία δεκ ζοκμδεφηδηε απυ ακάθμβεξ ιεηααμθέξ ζημκ πθδεοζιυ ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ ιζηνμαζαηήξ μιάδαξ ηαζ α) πνμηάθεζε ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ ζηακυηδηαξ απμζηζζιμφ αθθά ηαζ ηδξ πμζηζθυηδηαξ ηςκ ΓΜΜ ζηζξ νίγεξ ημο θοημφ - λεκζζηή 4. Ζ πανάθθδθδ εηηίιδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ ημο nicosulfuron ζε νεαθζζηζηά επίπεδα έηεεζδξ ζημκ αβνυ (Σier II) δεκ έδεζλε ζδιακηζηέξ ανκδηζηέξ επζδνάζεζξ ημο γζγακζμηηυκμο ζηζξ ίδζεξ μιάδεξ ιζηνμμνβακζζιχκ 5. Ζ ζοκδοαζιέκδ αλζμθυβδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ ημο nicosulfuron ζε δζαθμνεηζηά επίπεδα έηεεζδξ ηαζ πεζναιαηζζιμφ πμο αημθμοεήεδηε ζηδκ πανμφζα δζαηνζαή έδεζλε υηζ ημ ζοβηεηνζιέκμ γζγακζμηηυκμ είκαζ απίεακμ κα πνμηαθέζεζ ακεπζεφιδηεξ επζδνάζεζξ ζηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ υηακ πνδζζιμπμζδεεί ζε δυζεζξ ίζεξ ή εθαθνχξ ορδθυηενεξ ηδξ ζοκζζηχιεκδξ ζε ζοκεήηεξ αβνμφ. 6. Σα ιοηδημηηυκα ΣΒΕ ηαζ ΗΜΕ πμο πενζέπμκηαζ ζηα οβνά απυαθδηα απυ ηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ πανμοζζάζακ ορδθή οπμθεζιιαηζηυηδηα ζημ έδαθμξ δ μπμία υιςξ δεκ ζοκδοάζηδηε ιε ακηίζημζπδ ανκδηζηή επίδναζδ 437

438 ζηζξ θεζημονβίεξ ηαζ ημοξ πθδεοζιμφξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ πμο ιεθεηήεδηακ. Ακηίεεηα, ηα θζβυηενμ οπμθεζιιαηζηά β.θ.. ΟΡΡ ηαζ EQ πνμηάθεζακ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδκ θεζημονβία, ζηδκ πμζηζθυηδηα ηαζ ζηδκ αθεμκία επζθεβιέκςκ ιζηνμαζαηχκ μιάδςκ. 7. Σμ EQ απμηέθεζε έκα απυ ηα πζμ δναζηζηά ιυνζα πμο ιεθεηήεδηακ ηαεχξ α) ιεηααμθίγεηαζ ηαπφηαηα ζημ έδαθμξ πνμξ QI ηαζ EQNL α) πνμηάθεζε ζδιακηζηή ιείςζδ ηδξ κζηνμπμίδζδξ πμο απμδείπεδηε ηυζμ ιε αζμπδιζηέξ (δοκδηζηή κζηνμπμίδζδ) υζμ ηαζ ιε ιμνζαηέξ ιεηνήζεζξ (RT-qPCR) 8. Σμ μλεζδςηζηυ πανάβςβμ ημο EQ, QI θαίκεηαζ κα εοεφκεηαζ βζα ηδκ ακαζημθή ηδξ κζηνμπμίδζδξ ζηδκ πενίπηςζδ πνμζεήηδξ ημο EQ ζημ έδαθμξ, ηαεχξ ζηα δείβιαηα πμο ακζπκεφηδηε δ πανμοζία ημο παναηδνήεδηε ακαζημθή ηδξ δοκδηζηήξ κζηνμπμζήζδξ. οκμθζηά ηα εονήιαηα ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ έπμοκ ζδιακηζηέξ πναηηζηέξ πνμεηηάζεζξ ζηδκ ακάπηολδ εκυξ κέμο ιμκηέθμο αλζμθυβδζδξ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. έκακηζ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ: 1) Ζ πμθοθαζζηή πεζναιαηζηή πνμζέββζζδ πμο αημθμοεήεδηε ζηδκ πανμφζα δζαηνζαή ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ πνήζδ ηαθά ηοπμπμζδιέκςκ ιμνζαηχκ ηαζ αζμπδιζηχκ ιεευδςκ πανέπεζ ιζα ειπενζζηαηςιέκδ εηηίιδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ. ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ ηαζ ιπμνεί κα απμηεθέζεζ ηδκ αάζδ βζα ιζα ιεθθμκηζηή ακαπνμζανιμβή ηςκ δζαδζηαζζχκ αλζμθυβδζδξ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ζε επίπεδμ ΔΚ. 2) Ζ εθανιμβή ζοκεεηζηχκ ηαζ αζμθμβζηχκ ζηεοαζιάηςκ ζηζξ ζοκζζηχιεκεξ δυζεζξ δεκ πνμηαθεί ζοκήεςξ ζδιακηζηέξ ιεηααμθέξ ζηδκ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ. 3) Ζ αλζμθυβδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. έκακηζ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ πνμτπμεέηεζ ηδκ πνήζδ ηαηάθθδθςκ θεζημονβζηχκ ιζηνμαζαηχκ μιάδςκ πμο παίγμοκ νυθμ-ηθεζδί ζε ζδιακηζηέξ εδαθζηέξ θεζημονβίεξ. Ζ πανμφζα ιεθέηδ ηαηαδεζηκφεζ υηζ μζ κζηνςδμπμζδηζημί ιζηνμμνβακζζιμί ηαζ μζ ΓΜΜ ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ ςξ ηέημζμζ αζμδείηηεξ ζε έκα κέμ πθαίζζμ αλζμθυβδζδξ ηδξ ημλζηυηδηαξ ηςκ β.θ.. ζημοξ ιζηνμμβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ 4) Ζ αλζμθυβδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ εκυξ β.θ.. ζημοξ ιζηνμμνβακζζιμφξ ημο εδάθμοξ δεκ εα πνέπεζ κα πενζμνίγεηαζ απμηθεζζηζηά ζηδκ δναζηζηή μοζία 438

439 αθθά κα επεηηείκεηαζ ηαζ ζε αλζμθυβδζδ ηδξ ημλζηυηδηαξ ημο ζηεοάζιαημξ αθθά ηαζ πζεακχκ ιεηααμθζηχκ πνμσυκηςκ πμο πανάβμκηαζ ηαηά ηδ δζάνηεζα απμδυιδζδξ ημο β.θ.. ζημ έδαθμξ 5) Ζ οπμθεζιιαηζηυηδηα εκυξ β.θ.. δεκ ζοκδέεηαζ πάκηα ιε ορδθή ημλζηυηδηα έκακηζ μνβακζζιχκ ιδ-ζηυπςκ ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ηαζ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ ημο εδάθμοξ 6) Ζ απυννζρδ ηςκ οβνχκ απμαθήηςκ απυ ηα ζοζηεοαζηήνζα θνμφηςκ δφκαηαζ κα επδνεάζεζ ανκδηζηά ηδ ιζηνμαζαηή ημζκυηδηα ημο εδάθμοξ ηαηαζηέθθμκηαξ ζδιακηζηέξ θεζημονβίεξ υπςξ δ κζηνμπμίδζδ. οκεπχξ, απαναίηδηδ ηνίκεηαζ δ θήρδ ηαηάθθδθςκ ιέηνςκ δζαπείνζζδξ ηαζ ηεθζηήξ δζάεεζήξ ημοξ. 439

440 ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ 7. ΠΑΡΑΡΣΖΜΑ ΜΔΡΟ Α Γείηηεξ βζα ααηηήνζα, ιφηδηεξ ηαζ ιοηυννζγεξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζηζξ δθεηηνμθυνδζεζξ ζε πδηηή αηνοθαιίδδξ ιε ααειίδςζδ ζοβηέκηνςζδξ απμδζαηαηηζηχκ μοζζχκ (DGGE ακαθφζεζξ). Εικόνα Π1. Δείκτθσ (M: Μarker) για βακτιρια. Εικόνα πθκτισ πολυακρυλαμιδίου DGGE ςε βακμίδωςθ αποδιατακτικϊν ουςιϊν 45-62%. ε κάκε γραμμι τθσ πθκτισ φορτϊκθκαν 1 μl από το προϊόν τθσ PCR εςωτερικισ ζνκεςθσ (εκκινθτζσ 537f-GC και 534r) του 16S rrna γονιδίου καταγεγραμμζνων ςτελεχϊν βακτθρίων. Σο προϊόν ανάμιξθσ (Marker: M) περιζχει τθν ίδια ςυγκζντρωςθ (20 ng/μl) για όλα τα βακτιρια που αναλφκθκαν. 440

441 Εικόνα Π2. Δείκτθσ (M: Μarker) για μφκθτεσ. Εικόνα πθκτισ πολυακρυλαμιδίου DGGE ςε βακμίδωςθ αποδιατακτικϊν ουςιϊν 30-55%. ε κάκε γραμμι τθσ πθκτισ φορτϊκθκαν 1 μl από το προϊόν τθσ PCR εςωτερικισ ζνκεςθσ (εκκινθτζσ ITS1F-GC και ITS4b) τθσ ITS περιοχισ του rdna καταγεγραμμζνων ςτελεχϊν μυκιτων. Σο προϊόν ανάμιξθσ (Marker: M) περιζχει τθν ίδια ςυγκζντρωςθ (25 ng/μl) για όλα τα είδθ μυκιτων που αναλφκθκαν. 441

442 Εικόνα Π3. Δείκτθσ (M: Μarker) για μυκόρριηεσ. Εικόνα πθκτισ πολυακρυλαμιδίου DGGE ςε βακμίδωςθ αποδιατακτικϊν ουςιϊν 35-50%. ε κάκε γραμμι τθσ πθκτισ φορτϊκθκαν 1 μl από το προϊόν τθσ PCR θμιεςωτερικισ ζνκεςθσ (εκκινθτζσ NS31-GC και Glo1) τμιματοσ του18s rrna γονιδίου καταγεγραμμζνων ςτελεχϊν Δενδρόμορφων Μυκορριηικϊν Μυκιτων. Σο προϊόν ανάμιξθσ (Marker: M) περιζχει τθν ίδια ςυγκζντρωςθ (25 ng/μl) για όλα τα είδθ μυκιτων που αναλφκθκαν. 442

443 ΜΔΡΟ Β Eθρύιηζε ethoxyquin από δείγκαηα εδάθνπο Δπίδξαζε ηεο δηάξθεηαο εθρύιηζεο ζην κεηαβνιηζκό ηνπ ethoxyquin Εικόνα Π4. HPLC χρωματογράφθμα εκχυλίςματοσ εδάφουσ επιβαρυμζνου με ethoxyquin (5 μg g -1 dwt soil) που προζκυψε μετά από εκχφλιςθ διάρκειασ 30 min με διαλφτθ ακετονιτρίλιο. Εικόνα Π5. HPLC χρωματογράφθμα εκχυλίςματοσ εδάφουσ επιβαρυμζνου με ethoxyquin (5 μg g -1 dwt soil) που προζκυψε μετά από εκχφλιςθ διάρκειασ 90 min με διαλφτθ ακετονιτρίλιο. 443

444 Δπίδξαζε ηνπ ππνζηξώκαηνο ζην κεηαβνιηζκό ηνπ ethoxyquin Εικόνα Π6. HPLC χρωματογράφθμα εκχυλίςματοσ αλκαλικοφ πθλϊδουσ εδάφουσ (ph 7.85) επιβαρυμζνου με ethoxyquin που προζκυψε μετά από εκχφλιςθ με τθ μζκοδο QuEChERs. Εικόνα Π7. HPLC χρωματογράφθμα εκχυλίςματοσ αποςτειρωμζνου αλκαλικοφ πθλϊδουσ εδάφουσ (ph 7.85) επιβαρυμζνου με ethoxyquin που προζκυψε μετά από εκχφλιςθ με τθ μζκοδο QuEChERs. 444

445 Εικόνα Π8. HPLC χρωματογράφθμα εκχυλίςματοσ όξινου αμμό-πθλϊδουσ εδάφουσ (ph 4.53) επιβαρυμζνου με ethoxyquin που προζκυψε μετά από εκχφλιςθ με τθ μζκοδο QuEChERs. Χρόνοσ (min) Εικόνα Π9. HPLC χρωματογράφθμα εκχυλίςματοσ χαλαηιακισ άμμου επιβαρυμζνθσ με ethoxyquin που προζκυψε μετά από εκχφλιςθ με τθ μζκοδο QuEChERs. 445