ΑΡΙΣΟΣΔΛΔΙΟ ΠΑΝΔΠΙΣΗΜΙΟ ΘΔΑΛΟΝΙΚΗ ΓΔΧΠΟΝΙΚΗ ΥΟΛΗ ΣΟΜΔΑ ΟΠΧΡΟΚΗΠΔΤΣΙΚΧΝ ΚΑΙ ΑΜΠΔΛΟΤ ΔΡΓΑΣΗΡΙΟ ΓΔΝΓΡΟΚΟΜΙΑ. Υνήζημξ Γ. Μπαγάημξ Γεςπυκμξ Α.Π.Θ., M.

Transcript

1 ΑΡΙΣΟΣΔΛΔΙΟ ΠΑΝΔΠΙΣΗΜΙΟ ΘΔΑΛΟΝΙΚΗ ΓΔΧΠΟΝΙΚΗ ΥΟΛΗ ΣΟΜΔΑ ΟΠΧΡΟΚΗΠΔΤΣΙΚΧΝ ΚΑΙ ΑΜΠΔΛΟΤ ΔΡΓΑΣΗΡΙΟ ΓΔΝΓΡΟΚΟΜΙΑ Υνήζημξ Γ. Μπαγάημξ Γεςπυκμξ Α.Π.Θ., M.Sc ΜΔΛΔΣΗ ΜΔΓΑΛΗ ΚΛΙΜΑΚΑ ΣΗ ΓΟΝΙΓΙΑΚΗ ΔΚΦΡΑΗ ΣΗ ΔΛΙΑ (Olea europaea L.) Δ ΤΝΘΗΚΔ ΚΑΣΑΠΟΝΗΗ ΜΔ NaCl ΓΙΓΑΚΣΟΡΙΚΗ ΓΙΑΣΡΙΒΗ ΘΔΑΛΟΝΙΚΗ 2012

2 Υξήζηνο Γ. Μπαδάθνο Γεσπφλνο Α.Π.Θ., M.Sc ΜΔΛΔΣΗ ΜΔΓΑΛΗ ΚΛΙΜΑΚΑ ΣΗ ΓΟΝΙΓΙΑΚΗ ΔΚΦΡΑΗ ΣΗ ΔΛΙΑ (Olea europaea L.) Δ ΤΝΘΗΚΔ ΚΑΣΑΠΟΝΗΗ ΜΔ NaCl ΓΙΓΑΚΣΟΡΙΚΗ ΓΙΑΣΡΙΒΗ Τπμαθήεδηε ζηδ Γεςπμκζηή πμθή Ηιενμιδκία Πνμθμνζηήξ Δλέηαζδξ: 2 Φεανμοανίμο 2012 Δμεηαζηηθή επηηξνπή Καεδβδηήξ Ι. Θενζυξ, Δπζαθέπςκ Καεδβδηήξ Γ. Βμβζαηγήξ, Μέθμξ Σνζιεθμφξ οιαμοθεοηζηήξ Δπζηνμπήξ Δνεοκδηήξ Α Π. Καθασηγήξ, Μέθμξ Σνζιεθμφξ οιαμοθεοηζηήξ Δπζηνμπήξ Καεδβήηνζα Μ. Κμοημονίημο-Πεηνίδμο, Δλεηάζηνζα Δπίημονμξ Καεδβδηήξ Α. Πμθφδςνμξ, Δλεηαζηήξ Καεδβδηήξ Φ. Ανααακυπμοθμξ, Δλεηαζηήξ Καεδβδηήξ Π. Υαηγυπμοθμξ, Δλεηαζηήξ

3 Υνήζημξ Γ. Μπαγάημξ Α.Π.Θ. ΜΔΛΔΣΗ ΜΔΓΑΛΗ ΚΛΙΜΑΚΑ ΣΗ ΓΟΝΙΓΙΑΚΗ ΔΚΦΡΑΗ ΣΗ ΔΛΙΑ (Olea europaea L.) Δ ΤΝΘΗΚΔ ΚΑΣΑΠΟΝΗΗ ΜΔ NaCl ISBN «Η έβηνζζδ ηδξ πανμφζδξ Γζδαηημνζηήξ Γζαηνζαήξ απυ ηδ Γεςπμκζηή πμθή ημο Ανζζημηεθείμο Πακεπζζηδιίμο Θεζζαθμκίηδξ δεκ οπμδδθχκεζ απμδμπή ηςκ βκςιχκ ημο ζοββναθέςξ» (Ν.5343/1932, άνενμ 202, παν.2)

4 ΔΤΥΑΡΙΣΙΔ Οθμηθδνχκμκηαξ ημ δζδαηημνζηυ ιμο εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς εενιά υθμοξ υζμοξ ζοκέααθακ ζηδκ πναβιαημπμίδζή ημο. Η δζδαηημνζηή ιμο δζαηνζαή εηπμκήεδηε ηαηά ηα έηδ ζημ ενβαζηήνζμ Γεκεηζηήξ ηαζ Βζμηεπκμθμβίαξ Οπςνμηδπεοηζηχκ ημο Μεζμβεζαημφ Αβνμκμιζημφ Ικζηζημφημο Υακίςκ οπυ ηδκ επίαθερδ ημο η. Πακαβζχηδ Καθασηγή. Νζχεμκηαξ εζθζηνζκή εοβκςιμζφκδ εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ημκ η. Καθασηγή βζα ηδκ άρμβδ ζοκενβαζία ιαξ απυ ημ 2005 πμο λεηίκδζα ηζξ ιεηαπηοπζαηέξ ιμο ζπμοδέξ ηαζ βζα ηδκ αδζάθεζπηδ ειπζζημζφκδ ηαζ οπμζηήνζλδ ημο ζε ηάεε αήια ημο δζδαηημνζημφ ιμο. Οζ επμζημδμιδηζηέξ ζοιαμοθέξ, δ ηνζηζηή ακηζιεηχπζζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηαζ δ επζζηδιμκζηή ηαεμδήβδζδ ημο οπήνλακ ζδιείμ ακαθμνάξ ζε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο δζδαηημνζημφ ιμο. Δπίζδξ δεκ εα ιπμνμφζα κα παναθείρς ηδκ μζημκμιζηή οπμζηήνζλδ πμο ιμο πανείπε ιε ηδ ζοιιεημπή ιμο ζε ενεοκδηζηά πνμβνάιιαηα ηαευθδ ηδ δζάνηεζα εηπυκδζδξ ηδξ δζδαηημνζηήξ ιμο δζαηνζαήξ. Ιδζαίηενεξ εενιέξ εοπανζζηίεξ μθείθς ζημ επζαθέπμκηα ημο δζδαηημνζημφ ιμο ηαεδβδηή η. Ιςάκκδ Θενζυ βζα ηδκ ζοκεπή οπμζηήνζλδ, ηζξ πμθφηζιεξ ζοιαμοθέξ ημο, ημ εκδζαθένμκ ημο βζα ηδκ πνυμδμ ιμο ηαεχξ ηαζ βζα ηδκ ακάβκςζδ ηαζ δζυνεςζδ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ. Δπίζδξ εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς εενιά ημκ ηαεδβδηή η. Γδιήηνζμ Βμβζαηγή βζα ημκ ζοιαμοθεοηζηυ ημο νυθμ ζηδκ ηνζιεθή επζηνμπή ηαεχξ ηαζ ηα οπυθμζπα ιέθδ ηδξ επηαιεθμφξ ελεηαζηζηήξ επζηνμπήξ, ηαεδβήηνζα ηα. Μαβδαθδκή Κμοημονίημο- Πεηνίδμο, επίημονμ ηαεδβδηή η. Αθέλζμ Πμθφδςνα, ηαεδβδηή η. Φίθζππμ Ανααακυπμοθμ ηαζ ηαεδβδηή η. Πμθοδεφηδ Υαηγυπμοθμ πμο δέπηδηακ κα ακαθάαμοκ ηδκ ηνζηζηή ακάβκςζδ ηαζ ελέηαζδ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ. Θα ήεεθα επίζδξ κα εοπανζζηήζς εενιά βζα ηδκ θζθμλεκία ημ Ικζηζημφημ Θαθάζζζαξ Βζμθμβίαξ ηαζ Γεκεηζηήξ ημο Δθθδκζημφ Κέκηνμο Θαθαζζίςκ ενεοκχκ Κνήηδξ ηαεχξ ηαζ ημοξ θίθμοξ ιμο Γδιήηνδ, Καηενίκα 2, Διιακμοέθα, Πακαβζχηδ ηαζ φθζα ηαζ ζδζαίηενα ηδκ Έθεκα αννμπμφθμο βζα ηδκ απυθοηδ οπμζηήνζλδ πμο ιμο πανείπακ υπμηε πνεζάζηδηε. Δοπανζζηχ εενιά ημκ η. Γδιήηνζμ Καθεηγυπμοθμ βζα ηδκ θζθμλεκία πμο ιμο πανείπε ζημ ενβαζηήνζμ ημο, ζημ Ικζηζημφημ Μμνζαηήξ Βζμθμβίαξ ηαζ Βζμηεπκμθμβίαξ ημο Ιδνφιαημξ Σεπκμθμβίαξ ηαζ Ένεοκαξ ζηδκ Κνήηδ, ηαεχξ ηαζ βζα ηδκ πμθφηζιδ 1

5 ζοιαμθή ηαζ ηαεμδήβδζδ ημο βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ εθζάξ. Φοζζηά, δεκ εα ιπμνμφζα κα παναθείρς κα εοπανζζηήζς ημκ η. Γζχνβμ Παπαβζακκάηδ βζα ηδκ πμθφηζιδ αμήεεζα ηαζ πνμζπάεεζα ημο ζηδκ εηηφπςζδ ηςκ ιζηνμζοζημζπζχκ. Ιδζαίηενα εενιέξ εοπανζζηίεξ εα ήεεθα κα εηθνάζς ζηδκ Dr. Tala Awada βζα ηδκ θζθμλεκία πμο ιμο πανείπε ζημ ενβαζηήνζμ ηδξ ζημ Πακεπζζηήιζμ ηδξ Νειπνάζηα ζηζξ Η.Π.Α., βζα ηδκ ηάθορδ ηςκ ελυδςκ πνμηεζιέκμο κα εηπαζδεοηχ ζηδκ ηεπκμθμβία ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ ηαεχξ ηαζ βζα ημ ζδζαίηενα θζθζηυ πενζαάθθμκ πμο ιμο πανείπε δ μζημβέκεζά ηδξ ηαηά ηδκ δζάνηεζα ηδξ δζαιμκήξ ιμο ζηδ Νειπνάζηα. Δπίζδξ εοπανζζηχ εενιά ημκ Γζεοεοκηή ημο Μεζμβεζαημφ Αβνμκμιζημφ Ικζηζημφημο Υακίςκ η. Αθηίκμμ Νζημθασδδ βζα ηδκ θζθμλεκία πμο ιμο πανείπε υθα αοηά ηα πνυκζα ζηζξ εβηαηαζηάζεζξ ημο Μ.Α.Ι.Υ. ημ μπμίμ απμηεθεί πνυηοπμ ηαζ ζημθίδζ βζα ηδκ Δθθάδα. Δπίζδξ εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς απυ ηανδζάξ ημκ αδενθζηυ θίθμ, ζοκάδεθθμ, ημοιπάνμ, ζοιθμζηδηή ηαζ ζοβηάημζημ ζημ ίδζμ βναθείμ ςηήνδ Φναβημζηεθακάηδ ή αθθζχξ Άηδ βζα ηδκ δεζηή ζοιπανάζηαζδ ηαζ εκεάννοκζδ πμο αθεζδχξ ιμο πνμζέθενε. Η αβαζηή ζοκενβαζία ιαγί ημο ζε ενεοκδηζηυ ηαζ ζε θζθζηυ επίπεδμ, δ ακηαθθαβή ζδεχκ ηαζ μζ επμζημδμιδηζηέξ ζογδηήζεζξ υθα αοηά ηα πνυκζα ημο δζδαηημνζημφ ιμο, δδιζμφνβδζακ ιζα ζπάκζα δοκαηή θζθία βζα ηδκ μπμία εεςνχ ημκ εαοηυ ιμο ηοπενυ. Δοπανζζηχ ηδ θίθδ, Γζδάηημνα ηαζ επζζηδιμκζηυ ιέθμξ ημο ηιήιαημξ Γεκεηζηήξ ηαζ Βζμηεπκμθμβίαξ Οπςνμηδπεοηζηχκ ημο Μ.Α.Ι.Υ., Μανία Μακζμοδάηδ βζα ηδκ πμθφηζιδ αμήεεζα πμο ιμο πανείπε ζηδκ αζμπθδνμθμνζηή ακάθοζδ ηδξ ιεθέηδξ ιμο, δ μθμηθήνςζδ ηδξ μπμία μθείθεηαζ ζε ζδιακηζηυ ααειυ ζηδ δζηή ηδξ ζοκδνμιή. Δπίζδξ εέθς κα εοπανζζηήζς ζδζαζηένα ημ πνμζςπζηυ ημο Μ.Α.Ι.Υ. βζα ηδκ άνζζηδ ζοκενβαζία ηαζ ηδκ ηαθή πανέα πμο είπαιε υθα αοηά ηα πνυκζα ηαζ ζδζαίηενα ημκ Θμδςνή πακυ βζα ηδκ πμθφηζιδ αμήεεζα ημο ζημ ενβαζηήνζμ υπμηε πνεζάζηδηε. Δοπανζζηχ ζδζαίηενα ημκ Γζχνβμ Κςζηεθέκμ βζα ηδκ πνμιήεεζα ημο θοηζημφ οθζημφ, ημ εδαθμθμβζηυ ενβαζηήνζμ ημο Μ.Α.Ι.Υ. ηαζ ζοβηεηνζιέκα ημκ Ανζζηείδδ ηαιαηάηδ, ηδκ Συκζα Καναβζάκκδ, ηδκ Καηενίκα Μαονμιάηδ ηαζ ηδκ Άκκα Υμοκηαθάηδ ηαεχξ ηαζ ηζξ ηονίεξ μθία Κμφηδ ηαζ Βαζζθζηή Σζαηζνίδμο απυ ημ ηεπκζηυ πνμζςπζηυ ημο Δνβαζηδνίμο Γεκδνμημιίαξ Α.Π.Θ. βζα ηδκ αμήεεζα ημοξ ζηζξ ακαθφζεζξ θοθθμδζαβκςζηζηήξ. 2

6 Ιδζαίηενα εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ημκ θίθμ ηαζ ημοιπάνμ ιμο ηέθζμ πακζυθα βζα ηδκ μοζζαζηζηή ζοιαμθή ημο ηαζ ζηήνζλδ ζημ λεηίκδια ηςκ ιεηαπηφπζαηχκ ιμο ζπμοδχκ, ηζξ επμζημδμιδηζηέξ ζοιαμοθέξ ημο ηαζ ημ αδζάθεζπημ εκδζαθένμκ ημο. Δπίζδξ πμθθά - πμθθά εοπανζζηχ ζε υθμοξ ημοξ θίθμοξ ιμο ηαζ ζδζαίηενα ημκ Γδιήηνδ Νίηθδ δ πανμοζία ηςκ μπμίςκ υθα αοηά ηα πνυκζα ιμο έδζκε ειπζζημζφκδ ηαζ δφκαιδ κα λεπενάζς μπμζαδήπμηε δοζημθία ηαεχξ ηαζ ζε υθα ηα ιέθδ ημο ενβαζηδνίμο βζα ηζξ ημζκέξ εοπάνζζηεξ ζηζβιέξ. Έκα ιεβάθμ εοπανζζηχ είκαζ ημ εθάπζζημ πμο μθείθς ζηδ Δζνήκδ Σζανμφπα βζα ηδκ ακελάκηθδηδ οπμιμκή, ηαηακυδζδ, ζοιπανάζηαζδ ηαζ αβάπδ πμο ιμο πνυζθενε υθα αοηά ηα πνυκζα. Σέθμξ απυ ηα αάεδ ηδξ ηανδζάξ ιμο εοπανζζηχ ημοξ βμκείξ ιμο, Γνδβυνδ ηαζ Δφδ ηαζ ηδκ αδενθή ιμο Δοηοπία βζα ηδκ αζηείνεοηδ αβάπδ, ηδκ ροπμθμβζηή ηαζ μζημκμιζηή οπμζηήνζλδ πμο απθυπενα ιμο έπμοκ πνμζθένεζ ηαευθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ γςήξ ιμο. 3

7 ηελ νηθνγέλεηα κνπ θαη ζηελ Δηξήλε 4

8 ΠΔΡΙΔΥΟΜΔΝΑ ΔΤΥΑΡΙΣΙΔ... 1 ΠΔΡΙΔΥΟΜΔΝΑ... 5 ΚΑΣΑΛΟΓΟ ΥΗΜΑΣΧΝ... 9 ΚΑΣΑΛΟΓΟ ΠΙΝΑΚΧΝ ΠΔΡΙΛΗΦΗ ABSTRACT ΚEΦΑΛΑΙΟ Αθαηυηδηα Δπίδναζδ ηδξ αθαηυηδηαξ ζηα θοηά Αφλδζδ ηςκ θοηχκ Θνεπηζηή ηαηάζηαζδ ηςκ θοηχκ Δκενβέξ ιμνθέξ μλοβυκμο - ROS Φςημζφκεεζδ Μδπακζζιμί Ακημπήξ ηςκ θοηχκ ζηδκ αθαηυηδηα Φοζζμθμβζημί ιδπακζζιμί Μδπακζζιμί πμο εθέβπμοκ ηδκ αφλδζδ ηδξ νίγαξ ηαζ ηςκ θφθθςκ Μδπακζζιμί πμο εθέβπμοκ ηδκ επίδναζδ ηςκ αθάηςκ Μμνζαημί ηαζ ηοηηανζημί ιδπακζζιμί Ωζιςθφηεξ ηαζ Ωζιςπνμζηάηεξ Οιμζυζηαζδ ζυκηςκ οζηήιαηα ιεηαθμνάξ ζυκηςκ Δθζά ηαζ αθαηυηδηα ημπυξ ηδξ ενβαζίαξ Βζαθζμβναθία ΚΔΦΑΛΑΙΟ Πενίθδρδ Δζζαβςβή Τθζηά ηαζ Μέεμδμζ Φοηζηυ οθζηυ Μεηαπείνζζδ αθαηυηδηαξ ηαηζζηζηή Ακάθοζδ Πνμζδζμνζζιυξ ηδξ πδιζηήξ ζφζηαζδξ

9 2.5. Απμιυκςζδ μθζημφ ηοηηανζημφ RNA Καεανζζιυξ ημο μθζημφ ηοηηανζημφ RNA Πμζμηζημπμίδζδ RNA Ηθεηηνμθυνδζδ RNA ζε απμδζαηαηηζηή πδηηή θμνιαθδετδδξ / αβανυγδξ Απμιυκςζδ mrna απυ ζπμνυθοηα εθζάξ Καηαζηεοή cdna αζαθζμεήηδξ απυ ζπμνυθοηα εθζάξ Απμιυκςζδ ακαζοκδοαζιέκςκ πθαζιζδίςκ Ηθεηηνμθυνδζδ κμοηθεσηχκ μλέςκ ζε πδηηή αβανυγδξ Αθθδθμφπδζδ πθαζιζδζαημφ DNA ηαζ ζοζηαδμπμίδζδ ηςκ αθθδθμοπζχκ Ακαγήηδζδ μιμθμβίαξ ηαζ επζζδιείςζδ GO (GO annotation) Καηαζηεοή ιζηνμζοζημζπίαξ (microarray) ήιακζδ RNA Καεανζζιυξ ζδιαζιέκμο cdna Τανζδμπμίδζδ ιζηνμζοζημζπίαξ ιε ηαθοπηνίδα Δημζιαζία ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ Δημζιαζία οθζημφ Πθφζεζξ ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ ιεηά ηδκ οανζδμπμίδζδ άνςζδ ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ ιε laser Ακάθοζδ εζηυκαξ οανζδμπμζδιέκδξ ιζηνμζοζημζπίαξ Ακάθοζδ ηςκ δεδμιέκςκ πμο πνμέηορακ απυ ηζξ οανζδμπμζήζεζξ ιζηνμζοζημζπζχκ Κακμκζημπμίδζδ ηαζ θζθηνάνζζια παιδθχκ εκηάζεςκ Ακαβκχνζζδ ηςκ cdnas ιε δζαθμνζηή έηθναζδ (1) 2-ηθάζεςκ ζογεοβιέκδ SAM Ακαβκχνζζδ ηςκ cdnas ιε δζαθμνζηή έηθναζδ (2) 2-ηθάζεςκ ιδζογεοβιέκδ SAM Ιενανπζηή ζοζηαδoπμίδζδ (Hierarchical cluster analysis) οζηαδμπμίδζδ ιε ημκ αθβυνζειμ Κ-means (KMC) Γίηηοα οπμιμκάδςκ (Module networks) GO επζζδιείςζδ, θεζημονβζηή ακάθοζδ ηςκ οπμιμκάδςκ ηαζ Fisher s exact test Απεζηυκζζδ ηςκ νοειζζηζηχκ δζηηφςκ

10 3. Απμηεθέζιαηα Ακάθοζδ ESTs ηαζ ηαηαζηεοή ιζηνμζοζημζπίαξ Καηαζηεοή αάζδξ δεδμιέκςκ ιε ηα απμηεθέζιαηα απυ ηδκ αθθδθμφπζζδ ηδξ αζαθζμεήηδξ ζπμνυθοημο εθζάξ Αφλδζδ θοηχκ εθζάξ ηαζ πδιζηή ζφζηαζδ νίγαξ, αθαζημφ ηαζ θφθθςκ ηαηά ηδκ ηαηαπυκδζδ NaCl Ακάθοζδ ιζηνμζοζημζπίαξ Olea europaea L. ηαζ ακαβκχνζζδ cdnas ιε δζαθμνζηή έηθναζδ (SAM) Γίηηοα/Μμκμπάηζα Μεηαβναθζηήξ Ρφειζζδξ (Transcriptional Regulatory Networks) Γίηηομ ιεηαβναθζηήξ νφειζζδξ ζηδκ πμζηζθία Καθαιχκ Γίηηομ ιεηαβναθζηήξ νφειζζδξ ζηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ Δκζςιάηςζδ ηδξ δφμ-ηθάζεςκ ιδ-ζογεοβιέκδξ ακάθοζδξ SAM ζηα δίηηοα ιεηαβναθζηήξ νφειζζδξ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ Δκίζποζδ ηςκ οπμιμκάδςκ ιε ηζξ ηαηδβμνίεξ GO (Gene Ontology) φβηνζζδ ηςκ δζηηφςκ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ογήηδζδ οιπενάζιαηα Βζαθζμβναθία ΚΔΦΑΛΑΙΟ Πενίθδρδ Δζζαβςβή Τθζηά ηαζ Μέεμδμζ Φοηζηυ οθζηυ ηαζ πείναια αθαηυηδηαξ Απμιυκςζδ RNA Καηαζηεοή 454-αζαθζμεήηδξ Σειαπζζιυξ ημο RNA (RNA fragmentation) φκεεζδ cdna δζπθήξ αθοζίδαξ Δπζδζυνεςζδ ηςκ άηνςκ ημο εναφζιαημξ (Fragment End Repair) φκδεζδ πνμζανιμζηχκ (Adaptors Ligation) Απμιάηνοκζδ ιζηνχκ εναοζιάηςκ

11 Πμζμηζηή ηαζ πμζμηζηή ακάθοζδ ηδξ αζαθζμεήηδξ Δκίζποζδ ηδξ αζαθζμεήηδξ ιε empcr Αθθδθμφπδζδ ιε ημκ 454-GS FLX Titanium Βζμπθδνμθμνζηή ακάθοζδ Καεανζζιυξ ηαζ μιαδμπμίδζδ ηςκ ιεηαβναθδιάηςκ Δπζζδιείςζδ ηςκ ιεηαβναθδιάηςκ Καεμνζζιυξ ηςκ ιεηαβναθδιάηςκ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ Απμηεθέζιαηα Καηαζηεοή αζαθζμεδηχκ απυ νίγα ηαζ θφθθα ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ βζα αθθδθμφπζζδ ιε ηδκ πθαηθυνια 454 GS FLX Titanium Βζμπθδνμθμνζηή Ακάθοζδ Δπελενβαζία ηςκ κμοηθεμηζδζηχκ αθθδθμοπζχκ πμο πνμέηορακ απυ ηδκ αθθδθμφπζζδ ιε ηδκ πθαηθυνια 454 GS FLX Titanium Δπζζδιείςζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηδξ αθθδθμφπζζδξ Δκημπζζιυξ ηςκ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδ Ρίγα cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζημ θφθθμ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζε υθεξ ηζξ ζοκεήηεξ φβηνζζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηδξ αθθδθμφπζζδξ ιε ηδκ πθαηθυνια 454-GS FLX Titanium ιε ηα απμηεθέζιαηα ηδκ ιζηνμζοζημζπίαξ εθζάξ ογήηδζδ οιπενάζιαηα Βζαθζμβναθία ΓΔΝΙΚΑ ΤΜΠΔΡΑΜΑΣΑ

12 ΚΑΣΑΛΟΓΟ ΥΗΜΑΣΧΝ ρήκα 1.1. Η απυηνζζδ ηδξ αθαζηζηήξ αφλδζδξ ημο θοημφ ζηδκ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ ρήκα 2.1. πδιαηζηή πανάζηαζδ ηδξ ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθήξ ηαζ εκίζποζδξ ημο cdna ρήκα 2.2. Οζ εέζεζξ πενζμνζζιμφ ημο SfiI (A & B) πμο θένμοκ μζ εηηζκδηέξ SMART IV (SfiIA) ηαζ CDS III (SfiIB) ρήκα 2.3. πδιαηζηή πανάζηαζδ ημο ιεηαζπδιαηζζιμφ ηςκ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ Δ.coli ιε ημοξ θμνείξ pdnr-lib πμο πενζέπμοκ ηα cdnas ηδξ αζαθζμεήηδξ ρήκα 2.4. Ακηζπνμζςπεοηζηέξ εζηυκεξ απυ ηδκ πμζμηζηή ακάθοζδ ηςκ πμθθαπθαζζαζιέκςκ πνμσυκηςκ, ηςκ 1211 ηθχκςκ ηδξ cdna αζαθζμεήηδξ ζπμνυθοημο εθζάξ, ζε πδηηή αβανυγδξ ρήκα 2.5. Η εηηοπςιέκδ ιζηνμζοζημζπία Olea europaea ρήκα 2.6. Οκμιαζία ηςκ ηθχκςκ ηδξ cdna αζαθζμεήηδξ ζπμνυθοημο εθζάξ (πμζη. Κμνςκέζηδ) ρήκα 2.7. Γζαηφιακζδ ημο ιήημοξ ηςκ 1956 ορδθήξ πμζυηδηαξ ESTs ρήκα 2.8. Γζαηφιακζδ ημο ιήημοξ ηςκ 1211 ιδ-επακαθαιαακυιεκςκ (nonredundant) ESTs ρήκα 2.9. Η ηαηακμιή ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηδξ Blast ακάθοζδξ ηςκ 1211 contigs 77 ρήκα 2.10.Βζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ, επζπέδμο 3, ηςκ ESTs ορδθήξ πμζυηδηαξ, ιε βκςζηή θεζημονβία ρήκα 2.11.Βάζδ δεδμιέκςκ ιε ηζξ ορδθήξ πμζυηδηαξ αθθδθμοπίεξ ηςκ ηθχκςκ ηδξ cdna αζαθζμεήηδξ απυ ζπμνυθοημ εθζάξ (cv Κμνςκέζηδ) ρήκα 2.12.Ακάγδηδζδ ηθχκςκ ζηδ αάζδ δεδμιέκςκ ιε αάζδ ηδκ πενζβναθή BlastN ηαζ BlastX ρήκα 2.13.Ακάγδηδζδ contigs ζηδ αάζδ δεδμιέκςκ ιε αάζδ ηδκ πενζβναθή BlastN ηαζ BlastX ρήκα 2.14.Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ NaCl ζηδκ επζιήηοκζδ ηςκ αθαζηχκ ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ ρήκα 2.15.Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ NaCl ζηδκ επζιήηοκζδ ηςκ αθαζηχκ ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ

13 ρήκα 2.16.Αοηυννζγα ιμζπεφιαηα εθζάξ εκυξ έημοξ ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ηαζ Καθαιχκ ηαηά ηδκ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ ηαηαπυκδζδξ αθαηυηδηαξ ρήκα 2.17.Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ NaCl, έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ, ζηδκ πενζεηηζηυηδηα Na + ζε νίγα, θφθθα ηαζ αθαζηυ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ρήκα 2.18.Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ NaCl, έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ, ζηδκ ακαθμβία K/Na ζε νίγα, θφθθα ηαζ αθαζηυ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ρήκα 2.19.πέδζμ πεζνάιαημξ οανζδμπμζήζεςκ ηφπμο Γαηηοθίμο (loop design) ρήκα 2.20.Ανζειυξ cdnas βζα ηα μπμία εκημπίζηδηε πενζβναθή ηδξ θεζημονβίαξ ημοξ ζηζξ πμζηζθίεξ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ (2-class paired SAM) ρήκα 2.21.K-means μιαδμπμίδζδ ηςκ 51 cdnas ηδξ Καθαιχκ ιε δζαθμνζηή έηθναζδ ρήκα 2.22.Βζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ηα cdnas ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ ιε βκςζηή επζζδιείςζδ GO ρήκα 2.23.Βζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ηα cdnas ηδξ Καθαιχκ ιε βκςζηή επζζδιείςζδ GO ρήκα 2.24.Iενανπζηή μιαδμπμίδζδ (Hierarchical Clustering) ηςκ cdnas πμο πανμοζζάγμοκ δζαθμνζηή έηθναζδ ιεηαλφ ηαηαπυκδζδξ NaCl ηαζ επακαθμνάξ απυ ηαηαπυκδζδ NaCl ρήκα 2.25.Γζαβνάιιαηα Venn ηςκ δζαθμνζηά εηθναζιέκςκ cdnas πμο πνμέηορακ απυ ζφβηνζζδ ιεηαλφ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ ρήκα 2.26.Πενζβναθή GO επζπέδμο 2 ηςκ αζμθμβζηχκ δζενβαζζχκ ηςκ 21 ημζκχκ cdnas ιεηαλφ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ρήκα 2.27.Πενζβναθή GO επζπέδμο 2 ηςκ αζμθμβζηχκ δζαδζηαζζχκ ηςκ 188 cdnas πμο ειθακίγμοκ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ιυκμ ζηδκ πμζηζθία Καθαιχκ ρήκα 2.28.Πενζβναθή GO επζπέδμο 2 ηςκ αζμθμβζηχκ δζαδζηαζζχκ ηςκ 15 cdnas πμο ειθακίγμοκ δζαθμνζηή έηθναζδ ιυκμ ζηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ

14 ρήκα 2.29.Γμηζιή αηνζαείαξ Fisher βζα ημκ οπμθμβζζιυ ηδξ πζεακυηδηαξ δ παναηδνμφιεκδ ηαηακμιή ηςκ αζμθμβζηχκ υνςκ ζημ ζφκμθμ ηςκ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδ Καθαιχκ κα είκαζ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή (FDR < 0.05) απυ ηδκ ηαηακμιή ηςκ υνςκ ζημ ζφκμθμ ηςκ cdnas ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ ρήκα 2.30.Καηακμιή ημο ανζειμφ ηςκ cdnas ζηζξ νοειζζηζηέξ οπμιμκάδεξ ηςκ πμζηζθζχκ εθζάξ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ρήκα 2.31.Μεηαβναθζηυ νοειζζηζηυ δίηηομ απυηνζζδξ ζε ηαηαπυκδζδ αθάημηδηαξ ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ ρήκα 2.32.Πενζθδπηζηή πανμοζίαζδ ημο ιεηαβναθζημφ νοειζζηζημφ δζηηφμο ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ ρήκα 2.33.Ακαπανάζηαζδ ζε ζενανπζηή δζάηαλδ οπμζοκυθμο ημο δζηηφμο ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ ημ μπμίμ πενζθαιαάκεζ ιυκμ ηζξ νοειζζηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ρήκα 2.34.Μεηαβναθζηυ νοειζζηζηυ δίηηομ απυηνζζδξ ζε ηαηαπυκδζδ αθάημηδηαξ ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ρήκα 2.35.Πενζθδπηζηή πανμοζίαζδ ημο ιεηαβναθζημφ νοειζζηζημφ δζηηφμο ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ρήκα 2.36.Ακαπανάζηαζδ ζε ζενανπζηή δζάηαλδ οπμζοκυθμο ημο δζηηφμο ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ημ μπμίμ πενζθαιαάκεζ ιυκμ ηζξ νοειζζηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ. 117 ρήκα 2.37.cDNAs πμο εκημπίζηδηακ ιε ηδκ SAM ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ηαζ ειπενζέπμκηαζ ζημ δίηηομ ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ ρήκα 2.38.cDNAs πμο εκημπίζηδηακ, ιε ηδκ SAM, ιε ζδιακηζηή δζαθμνζηή έηθναζδ ηαζ πμο ειπενζέπμκηαζ ζημ δίηηομ ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ρήκα 2.39.Γμκζδζαηή έηθναζδ επζθεβιέκςκ οπμιμκάδςκ ηςκ νοειζζηζηχκ δζηηφςκ ηδξ Καθαιχκ ηαζ ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ ρήκα 2.40.φβηνζζδ ηςκ ιεηαβναθζηχκ νοειζζηζηχκ δζηηφςκ ηδξ Καθαιχκ ηαζ ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ ρήκα 3.1. Η δζαδζηαζία ηαηαζηεοήξ cdna αζαθζμεήηδξ βζα αθθδθμφπζζδ ιε ηδκ πθαηθυνια 454 GS FLX Titanium sequencer (Roche), πνδζζιμπμζχκηαξ ημ cdna Rapid Library Preparation Kit (Roche)

15 ρήκα 3.2. Πζεακμί ζοκδοαζιμί πνυζδεζδξ πνμζανιμζηχκ (adaptors) A ηαζ Β ζηα cdna δζπθήξ αθοζίδαξ ρήκα 3.3. φιπηολδ ηςκ εζηυκςκ πμο πνμέηορακ ιε ημ αζμακαθοηή Agilent 2100 ιε ημ μθζηυ RNA ηαζ ημ ηειαπζζιέκμ cdna ηδκ αζαθζμεήηδξ ηδξ νίγαξ πμο εηηέεδηε ζε 120mM NaCl ρήκα 3.4. φιπηολδ ηςκ εζηυκςκ πμο πνμέηορακ ιε ημ αζμακαθοηή Agilent 2100 ιε ημ μθζηυ RNA ηαζ ημ ηειαπζζιέκμ cdna ηδκ αζαθζμεήηδξ ηδξ νίγαξ πμο εηηέεδηε ζε 0mM NaCl ρήκα 3.5. φιπηολδ ηςκ εζηυκςκ πμο πνμέηορακ ιε ημ αζμακαθοηή Agilent 2100 ιε ημ μθζηυ RNA ηαζ ημ ηειαπζζιέκμ cdna ηδκ αζαθζμεήηδξ ηςκ θφθθςκ πμο εηηέεδηακ ζε 120mM NaCl ρήκα 3.6. φιπηολδ ηςκ εζηυκςκ πμο πνμέηορακ ιε ημ αζμακαθοηή Agilent 2100 ιε ημ μθζηυ RNA ηαζ ημ ηειαπζζιέκμ cdna ηδκ αζαθζμεήηδξ ηςκ θφθθςκ πμο εηηέεδηακ ζε 0mM NaCl ρήκα 3.7. Υνδζζιμπμίδζδ ηςκ πνμζανιμζηχκ βζα αθθδθμφπζζδ ιυκμ ηδξ ιίαξ εη ηςκ δφμ αθοζίδςκ ηςκ cdnas δζπθήξ αθοζίδαξ ρήκα 3.8. Πνυζδεζδ ημο πνμζανιμζηή Β ημο 5 -άηνμο ηςκ cdnas ιμκήξ αθοζίδαξ ζημ ζθαζνίδζμ ηαζ πνδζζιμπμίδζδ ημο εηηζκδηή απυ ηδκ αθθδθμοπία ημο πνμζανιμζηή Β βζα ηδκ empcr ρήκα 3.9. φκεεζδ cdna ιε εηηζκδηή αθμφ έπεζ πνμδβδεεί εναφζδ ημο μθζημφ ηοηηανζημφ RNA (Sarropoulou et al., 2011) ρήκα 3.10.Γζάβναιια νμήξ ενβαζζχκ βζα ηδκ επελενβαζία ηςκ κμοηθεμηζδζηχκ αθθδθμοπζχκ (reads) πμο πνμέηορακ απυ ηδκ αθθδθμφπζζδ ιε ηδκ πθαηθυνια 454 GS FLX Titanium ρήκα 3.11.Η ηαηακμιή ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηδξ ακάθοζδξ BlastX ηςκ ηαζ ιμκαδζηχκ cdnas ζηδ νίγα ηαζ ζηα θφθθα, ακηίζημζπα ρήκα 3.12.Οζ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ηα ιμκαδζηά cdnas νίγαξ, ιε βκςζηή επζζδιείςζδ ρήκα 3.13.Οζ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ηα ιμκαδζηά cdnas θφθθςκ, ιε βκςζηή επζζδιείςζδ ρήκα 3.14.Οζ ιμνζαηέξ θεζημονβίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ηα ιμκαδζηά cdnas νίγαξ, ιε βκςζηή επζζδιείςζδ ρήκα 3.15.Οζ ιμνζαηέξ θεζημονβίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ηα ιμκαδζηά cdnas θφθθςκ, ιε βκςζηή επζζδιείςζδ

16 ρήκα 3.16.Σα ηοηηανζηά δζαιενίζιαηα ζηα μπμία εκημπίγμκηαζ ηα ιμκαδζηά cdnas, ιε βκςζηή επζζδιείςζδ ζηδ νίγα ρήκα 3.17.Σα ηοηηανζηά δζαιενίζιαηα ζηα μπμίεξ εκημπίγμκηαζ ηα ιμκαδζηά cdnas, ιε βκςζηή επζζδιείςζδ ζηα θφθθα ρήκα 3.18.Ο ανζειυξ ηςκ μιάδςκ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδκ νίγα έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl ρήκα 3.19.Ο ανζειυξ ηςκ μιάδςκ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηα θφθθα έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl ρήκα 3.20.Η ζοιπενζθμνά ηςκ 235 ημζκχκ μιάδςκ ζε θφθθα ηαζ νίγα ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl ρήκα 3.21.Οζ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ μζ 235 ημζκέξ μιάδεξ ζε θφθθα ηαζ νίγα ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl ρήκα 3.22.Οζ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ μζ 49 ζζημ-εζδζηέξ μιάδεξ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηα θφθθα ρήκα 3.23.Οζ ιμνζαηέξ θεζημονβίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ μζ 49 ζζημ-εζδζηέξ μιάδεξ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηα θφθθα ρήκα 3.24.Γμηζιή αηνζαείαξ Fisher βζα ημκ οπμθμβζζιυ ηδξ πζεακυηδηαξ δ παναηδνμφιεκδ ηαηακμιή ηςκ αζμθμβζηχκ υνςκ ζημ ζφκμθμ ηςκ 186 μιάδςκ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ, πμο πνμέηορακ απυ ηδκ αθθδθμφπζζδ 454, κα είκαζ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή (FDR < 0.05) απυ ηδκ ηαηακμιή ηςκ υνςκ ζημ ζφκμθμ ηςκ 93 cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ πμο πνμέηορακ απυ ηδκ ακάθοζδ ιζηνμζοζημζπίαξ ζηδκ πμζηζθία Καθαιχκ

17 ΚΑΣΑΛΟΓΟ ΠΙΝΑΚΧΝ Πίλαθαο 2.1. Πνμεημζιαζία δείβιαημξ RNA βζα δθεηηνμθυνδζδ Πίλαθαο 2.2. Γζαθφιαηα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ απμιυκςζδ ηςκ πθαζιζδίςκ Πίλαθαο 2.3. οζηαηζηά ακηίδναζδξ Sequencing PCR Πίλαθαο 2.4. Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ αθθδθμφπδζδ ηαζ ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ cdna αζαθζμεήηδξ ηαζ ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ Πίλαθαο 2.5. Σμ επίπεδμ επακαθδρζιυηδηαξ ηδξ cdna αζαθζμεήηδξ ζπμνυθοημο εθζάξ Πίλαθαο 2.6. Σα 10 ιεβαθφηενα contigs ζε ανζειυ ESTs Πίλαθαο 2.7. Οζ ιεηααθδηέξ πμο ακηζπνμζςπεφμοκ ηδκ επίπηςζδ ηδξ ηαηαπυκδζδξ NaCl ζημ φρμξ ηςκ θοηχκ ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ Πίλαθαο 2.8. Οζ ιεηααθήηεξ πμο ακηζπνμζςπεφμοκ ηδκ επίπηςζδ ηδξ ηαηαπυκδζδξ NaCl ζημ φρμξ ηςκ θοηχκ ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ Πίλαθαο 2.9. Σα cdnas ηαζ δ ακηίζημζπδ πενζβναθή ηδξ θεζημονβίαξ ημοξ πμο πενζθαιαάκμκηαζ ζηζξ 4 ζοζηάδεξ πμο πνμέηορακ απυ ηδκ μιαδμπμίδζδ K-means Πίλαθαο Σα 15 απυ ηα 21 ημζκά cdnas ιεηαλφ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ πμο ειθακίγμοκ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ηαζ βζα ηα μπμία ανέεδηε δ πενζβναθή ηδξ θεζημονβίαξ ημοξ ηαζ δ GO επζζδιείςζδ Πίλαθαο Σα 142 απυ ηα 188 cdnas πμο ειθακίγμοκ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ιυκμ ζηδκ πμζηζθία Καθαιχκ ηαζ βζα ηα μπμία ανέεδηε δ πενζβναθή ηδξ θεζημονβίαξ ημοξ ηαζ δ GO επζζδιείςζδ Πίλαθαο Σα 6 απυ ηα 15 cdnas πμο ειθακίγμοκ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ιυκμ ζηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ζηα μπμία ανέεδηε δ πενζβναθή ηδξ θεζημονβίαξ ημοξ ηαζ δ επζζδιείςζδ GO Πίλαθαο Καηδβμνίεξ GO ηςκ οπμιμκάδςκ πμο ζοκεέημοκ ημ δίηηομ ζηδκ Καθαιχκ Πίλαθαο Καηδβμνίεξ GO ηςκ οπμιμκάδςκ πμο ζοκεέημοκ ημ δίηηομ ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ

18 Πίλαθαο 3.1. Πμζμηζημπμίδζδ ηςκ αζαθζμεδηχκ ιε Quantiflur ST Fluorometer (SB Biotechnology Suppliers S.A) Πίλαθαο 3.2. Σα απμηεθέζιαηα ηδξ αθθδθμφπζζδξ ιε ηδκ πθαηθυνια 454 GS FLX Titanium πνζκ (Raw data) ηαζ ιεηά ηδκ επελενβαζία (HQ Trimmed) ιε ημκ αθβυνζειμ cutadapt v0.9 ηαεχξ ηαζ δ μιαδμπμίδζδ ηςκ αθθδθμοπζχκ ιε ημκ αθβυνζειμ CD-HIT-EST Πίλαθαο 3.3. cdnas πμο εκημπίζηδηακ ζηδκ νίγα ηαζ ζηα θφθθα εθζάξ ηαζ είκαζ μιυθμβα ιε βμκίδζα πμο παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ ακημπή ημο θοημφ ζηδκ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ ζφιθςκα ιε ηδκ αζαθζμβναθία (Δvalue 1e -6 ) Πίλαθαο 3.4. cdnas πμο εκημπίζηδηακ ζηδκ νίγα ηαζ ζηα θφθθα εθζάξ ηαζ είκαζ μιυθμβα ιε βμκίδζα πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ιεηαθμνείξ (transporter) ηαζ ακηζιεηαθμνείξ (antiporter) (Δ-value 1e -6 ) Πίλαθαο 3.5. cdnas πμο εκημπίζηδηακ ζηδκ νίγα ηαζ ζηα θφθθα εθζάξ ηαζ είκαζ μιυθμβα ιε βμκίδζα πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ (Δvalue 1e -6 ) Πίλαθαο 3.6. cdnas πμο εκημπίζηδηακ ζηδκ νίγα ηαζ ζηα θφθθα εθζάξ ηαζ είκαζ μιυθμβα ιε βμκίδζα πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ ζφιθςκα ιε ηδκ επζζδιείςζδ GO (Δ-value 1e -6 ) Πίλαθαο 3.7. Οζ μιάδεξ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδ νίγα (R 8) Πίλαθαο 3.8. Οζ μιάδεξ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδ νίγα (R 8)

19 ΠΔΡΙΛΗΦΗ Η εθζά (Olea europaea L.) είκαζ ιζα απυ ηζξ ζδιακηζηυηενεξ ηαθθζένβεζεξ ζηδκ πενζμπή ηδξ Μεζμβείμο. Μεβάθμ ιένμξ ηςκ ηαθθζενβμφιεκςκ εηηάζεςκ ζηδκ Μεζυβεζμ είκαζ οπμααειζζιέκμ ελαζηίαξ ηδξ παιδθήξ πμζυηδηαξ ημο κενμφ άνδεοζδξ, πνμηαθχκηαξ ανκδηζηέξ επζπηχζεζξ ζηδκ αφλδζδ ηαζ ηδκ παναβςβζηυηδηα ηςκ θοηχκ. Πανυθδ ηδκ ζδιακηζηή ηαζ ζοκεπχξ αολακυιεκδ μζημκμιζηή ζδιαζία ηδξ εθζάξ, δ βμκζδζςιαηζηή ηδξ πθδνμθμνία παναιέκεζ εθθζπήξ. Έηζζ, πνδζζιμπμζήεδηε ιζα αβνμκμιζηή πνμζέββζζδ πμο ζοκδφαζε ηδκ αθθδθμφπζζδ ιεβάθδξ-ηθίιαηαξ (highthroughput sequencing) ιε πεζναιαηζηυ ζπεδζαζιυ πμο κα πνμζμιμζάγεζ ηζξ θοζζηέξ ζοκεήηεξ ηαθθζένβεζαξ ιε ζημπυ κα ιεθεηδεεί δ ιμνζαηή αάζδ ηδξ ακεεηηζηυηδηαξ ηδξ εθζάξ ζηδκ αθαηυηδηα. Eηπμκήεδηε πείναια ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl δζάνηεζαξ 135 διενχκ, ζε εκυξ έημοξ δεκδνφθζα εθζάξ, εοαίζεδηδξ (Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ) ηαζ ακεεηηζηήξ πμζηζθίαξ (Καθαιχκ) ζηδκ αθαηυηδηα. Σμ μθζηυ ηοηηανζηυ RNA απυ θφθθα ηαζ νίγα απμιμκχεδηε ζε πέκηε πνμκζηά ζδιεία ημο πεζνάιαημξ ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ακαθφζεζξ ιζηνμζοζημζπίαξ ηαζ αθθδθμφπζζδξ ιεβάθδξ ηθίιαηαξ. Καηαζηεοάζηδηε ηαζ αθθδθμοπίεδηε αζαθζμεήηδ cdna απυ 25-διενχκ ζπμνυθοηα εθζάξ (cv Κμνςκέζηδ) ηαζ πνδζζιμπμζήεδηακ 1121 ιμκαδζηά ESTs βζα ηδκ ηαηαζηεοή ιζηνμζοζημζπίαξ. Δκημπίζηδηακ επηά ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ ηαζ ηαηαζηεοάζηδηακ ζοβηνζηζηά νοειζζηζηά δίηηοα πμο οπμδδθχκμοκ δζαθμνέξ ζηδκ δμιή ηαζ ζηδκ πμθοπθμηυηδηα ηςκ δζηηφςκ ακάιεζα ζηδκ ακεεηηζηή ηαζ ζηδκ εοαίζεδηδ πμζηζθία ζηδκ αθαηυηδηα. Δπζπθέμκ, ηέζζενζξ cdna αζαθζμεήηεξ απυ νίγα ηαζ θφθθα εθζάξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ αθθδθμοπήεδηακ ιε ηδκ πθαηθυνια 454-GS FLX Titanium ιε ζημπυ ηδκ ιεθέηδ ηδξ ιμνζαηήξ αάζδξ ηδξ ακεεηηζηυηδηαξ ηδξ εθζάξ ζηδκ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl ηαζ ηαοηυπνμκα ημκ ειπθμοηζζιυ ημο ιζηνμφ ανζειμφ βκςζηχκ αθθδθμοπζχκ ζημ είδμξ Olea europaea L.. οκμθζηά αθθδθμοπίεδηακ ηαζ ακαθφεδηακ ιε αζμτπμθμβζζηζηά πνμβνάιιαηα cdnas ορδθήξ πμζυηδηαξ βζα ημκ εκημπζζιυ βμκζδίςκ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl ζε θφθθα ηαζ νίγα. Η ιαγζηή πανάθθδθδ αθθδθμφπζζδ ηςκ cdna αζαθζμεδηχκ πανείπε πθδνμθμνζέξ ιεβάθδξ ηθίιαηαξ ζπεηζηά ιε ηζξ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ηαζ ηζξ ιμνζαηέξ θεζημονβίεξ ηςκ ιεηαβναθδιάηςκ ηδξ νίγαξ ηαζ ηςκ θφθθςκ εθζάξ. Η 16

20 ζοβηνζηζηή ακάθοζδ ηςκ ιεηαβναθζηχκ πνμθίθ επέηνερε ηδκ ακαβκχνζζδ ηςκ ιεηαβναθδιάηςκ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ. 17

21 ABSTRACT Olive (Olea europaea L.) is one of the most important crops in the Mediterranean region. A significant part of the Mediterranean agricultural land is saline due to irrigation with low quality water which has negative effects on growth and productivity. Despite its economic significance, genomic information on olive tree is still lacking. An agronomic approach, which combined high throughput olive genomics with an experimental design simulating olive natural cultivation conditions, was used in order to investigate the molecular basis of olive to salt response. To this aim a 135-day NaCl stress experiment was set up with one year-old plants of a salttolerant (cv. Kalamon) and a salt-sensitive (cv. Chondrolia Chalkidikis) olive variety. Total RNA from root and leaf samples was extracted throughout the time course and used for microarray and RNA sequencing. A cdna library from 25-day old olive seedlings (cv. Koroneiki) was constructed and 1121 unique ESTs were identified and used for the construction of custom DNA microarrays. Seven transcription factors related to salt stress were identified and comparative regulatory networks were constructed indicating differences in structure and complexity of the networks between the salt-sensitive and the salt-tolerant variety. Moreover two root and two leaves cdna libraries of cv Kalamon were sequenced using the 454 GS FLX Titanium system in order to investigate the molecular basis of salt tolerance in olive after 90-day NaCl stress conditions and to enrich the very few sequence data currently available for the Olea europaea L. species. A total of high quality transcripts were obtained and analyzed with bioinformatics tools for the identification of NaCl-stress related differentially expressed genes in root and leaves. Massively parallel sequencing of different cdna libraries has provided large-scale information about the biological processes and molecular functions of transcripts in root and leaves. Comparative transcript profiling allowed the identification of differentially expressed genes. 18

22 ΚEΦΑΛΑΙΟ 1 Βηβιηνγξαθηθή Αλαζθφπεζε 1. Αιαηφηεηα Αθαηυηδηα είκαζ ιζα ηαηάζηαζδ ημο εδάθμοξ δ μπμία παναηηδνίγεηαζ απυ ορδθή ζοβηέκηνςζδ οδαημδζαθοηχκ αθάηςκ. Σα εδάθδ εεςνμφκηαζ αθαημφπα υηακ δ δθεηηνζηή αβςβζιυηδηα ημο εηποθίζιαημξ ημνεζιμφ (ECe) είκαζ 4dS/m ή ιεβαθφηενδ, πμο ζζμφηαζ πενίπμο ιε 40mM NaCl ηαζ δ ςζιςηζηή πίεζδ πμο δδιζμονβείηαζ είκαζ πενίπμο 0.2MPa. Αοηυξ μ μνζζιυξ ηδξ αθαηυηδηαξ πνμηφπηεζ απυ ηδκ ηζιή ηδξ δθεηηνζηήξ αβςβζιυηδηαξ ζημ εηπφθζζια ημνεζιμφ (ECe) πμο πνμηαθεί ιείςζδ ηδξ απυδμζδξ ηςκ πενζζζμηένςκ ηαθθζενβεζχκ (Munns and Tester, 2008). Πενζζζυηενα απυ 800 εηαημιιφνζα εηηάνζα βδξ, δδθαδή πενζζζυηενμ απυ ημ 6% ηδξ παβηυζιζαξ έηηαζδξ βδξ, έπμοκ παναηηδνζζηεί ςξ αθαημφπα (FAO, 2008). Σμ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ηςκ αθαημφπςκ εηηάζεςκ δδιζμονβήεδηε απυ θοζζηέξ αζηίεξ, υπςξ δ ιαηνμπνυκζα ζοβηέκηνςζδ αθάηςκ ζε λδνέξ ηαζ διίλδνεξ πενζμπέξ (Rengasamy, 2002). Σα άθαηα αοηά, ιε ηονζυηενμ ημ NaCl, πνμένπμκηαζ είηε απυ ηδκ απμζάενςζδ ιδηνζηχκ πεηνςιάηςκ είηε απυ ηδκ απυεεζδ ηςκ εαθαζζίςκ αθάηςκ πμο ιεηαθένμκηαζ ιε ημκ αένα ηαζ ηδκ ανμπή. Σμ κενυ ηδξ ανμπήξ πενζέπεζ NaCl 6-50 mg/l φδαημξ, ακάθμβα ιε ηδκ απυζηαζδ απυ ηδκ αηηή. Έηζζ, ανμπή πμο πενζέπεζ NaCl 10 mg/l φδαημξ, απμεέηεζ 10 Kg άθαημξ/εηηάνζμ βζα ηάεε 100mm φρμοξ ανμπυπηςζδξ εηδζίςξ (Szabolcs, 1989). Δηηυξ ηδξ θοζζηήξ αθαηυηδηαξ, έκα ιεβάθμ πμζμζηυ ηςκ ηαθθζενβμφιεκςκ βεςνβζηχκ εδαθχκ έβζκακ αθαημφπα ελαζηίαξ ηδξ οπεν-άνδεοζδξ ιε κενυ ηαηήξ πμζυηδηαξ, πμο πνμηάθεζε αφλδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ αθάηςκ ζημ νζγυζηνςια. Αοηυ επζαεααζχκεηαζ απυ ημ βεβμκυξ υηζ αθαημφπα εεςνμφκηαζ ιυκμ ημ 2% ηςκ εδαθχκ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα λδνζηέξ ηαθθζένβεζεξ ζε ακηίεεζδ ιε ημ 20% ηςκ ανδεουιεκςκ εηηάζεςκ. Η ζδιαζία ηςκ ανδεουιεκςκ εηηάζεςκ εκζζπφεηαζ απυ ημ βεβμκυξ υηζ πανυθμ πμο απμηεθμφκ ημ 15% ηδξ ζοκμθζηήξ ηαθθζενβμφιεκδξ βδξ, απμδίδμοκ ημ 1/3 ηδξ παβηυζιζαξ παναβςβήξ ηνμθίιςκ. Σα ορδθά επίπεδα αθάηςκ εηηυξ απυ ηζξ άιεζεξ επζαθααείξ επζδνάζεζξ ζηα θοηά πνμηαθμφκ αφλδζδ ημο ph ηαζ ηαηαζηνμθή ηδξ δμιήξ ημο εδάθμοξ, ιε απμηέθεζια 19

23 μζ απμδυζεζξ ιεθθμκηζηχκ ηαθθζενβεζχκ κα ιεζχκμκηαζ ζδιακηζηά ηαζ εκ ηέθεζ δ ηαθθζενβήζζιδ βδ κα πάκεηαζ αιεηάηθδηα (Nawaz et al., 2010). 2. Δπίδξαζε ηεο αιαηφηεηαο ζηα θπηά Η ηαηαπυκδζδ απυ αθαηυηδηα πνμηαθεί πμζηίθεξ επζδνάζεζξ ζηδκ θοζζμθμβία ηςκ θοηχκ υπςξ αολδιέκμ νοειυ ακαπκμήξ, ημλζηυηδηα ζυκηςκ, ιεηααμθέξ ζηδκ αφλδζδ ημο θοημφ ηαζ ζηδκ ηαηακμιή ηςκ εειεθζςδχκ ιεηαθθζηχκ ζημζπείςκ, ιεηααμθέξ διζπεναηυηδηαξ ηςκ ιειανακχκ πμο πνμηαθείηαζ απυ ηδκ ακηζηαηάζηαζδ ημο αζαεζηίμο ιε κάηνζμ (Marschner, 1986), αθθαβέξ ζηδκ πεναηυηδηα ηςκ ιειανακχκ (Gupta et al., 2002) ηαζ ιεζςιέκμ νοειυ θςημζφκεεζδξ (Hasegawa et al., 2000; Munns, 2002; Ashraf and Shahbaz, 2003; Kao et al., 2003; Sayed, 2003). Η αθαηυηδηα επζδνά υπζ ιυκμ ζηδκ θοζζμθμβία ζε επίπεδμ θοημφ αθθά ηαζ ζε ηοηηανζηυ επίπεδμ ιέζς ςζιςηζηήξ ηαζ ζμκηζηήξ ηαηαπυκδζδξ (Hasegawa et al., 2000; Muranaka et al., 2002; Ranjbarfordoei et al., 2002; Murphy and Durako, 2003). Δπίζδξ δ αθαηυηδηα πνμηαθεί ζμκηζηή ακζζμννμπία (imbalance) πμο επδνεάγεζ ηδκ επζθεηηζηυηδηα ηςκ ιειανακχκ ηαζ πνμηαθεί έθθεζρδ ηαθίμο (Gadallah, 2000). Η ζοζζχνεοζδ ιεβάθςκ πμζμηήηςκ ημλζηχκ αθάηςκ ζημκ απμπθάζηδ ηςκ θφθθςκ μδδβεί ζε αθοδάηςζδ ηαζ ιείςζδ ηδξ ζπανβήξ ηαζ ζηαδζαηά ζημ ηοηηανζηυ εάκαημ ηςκ θφθθςκ (Marschner, 1995). Ωξ ζοκέπεζα αοηχκ ηςκ αθθαβχκ, δ εκενβυηδηα ηςκ δζαθυνςκ εκγφιςκ ηαζ μ ιεηααμθζζιυξ ημο θοημφ επδνεάγμκηαζ (Lacerda et al., 2003). ε ορδθμφξ νοειμφξ δζαπκμήξ, ηα αββεία ηδξ λοθχδμοξ ιμίναξ υθςκ ηςκ θοηζηχκ εζδχκ πενζέπμοκ πμθφ ιζηνυηενεξ ζοβηεκηνχζεζξ πθςνίμο ηαζ καηνίμο απυ υηζ ζημ ελςηενζηυ δζάθοια. Δπζπθέμκ, δ αθαηυηδηα πνμάβεζ ηδκ ζοζζχνεοζδ NaCl ζημοξ πθςνμπθάζηεξ ηςκ θοηχκ, επδνεάγεζ ημκ νοειυ αφλδζδξ ηαζ πνμηαθεί ιείςζδ ημο νοειμφ θςημζφκεεζδξ ηαζ ηδξ ιεηαθμνάξ δθεηηνμκίςκ (Kirst, 1989). Σέθμξ, ζηα ακχηενα θοηά, δ αθαηυηδηα ακαζηέθθεζ ηδκ δναζηδνζυηδηα ημο θςημζοζηήιαημξ-ii (PSII) (Kao et al., 2003; Parida et al., 2003), ακ ηαζ ηάπμζεξ ιεθέηεξ έδεζλακ ακηίεεηα απμηεθέζιαηα (Brugnoli and Björkman, 1992; Morales et al., 1992) Αχμεζε ησλ θπηψλ Η ακηίδναζδ ηςκ θοηχκ ζηδκ αθαηυηδηα, πμο μδδβεί ζε ιείςζδ ηδξ αφλδζήξ ημοξ, πναβιαημπμζείηαζ ζε δομ θάζεζξ: 1) ιε βνήβμνδ πνμζανιμβή ζηδκ αφλδζδ ηδξ ςζιςηζηήξ πίεζδξ ημο δζαθφιαημξ ηαζ 2) ιε πζμ ανβή ακηίδναζδ ελαζηίαξ ηδξ 20

24 ζοζζχνεοζδξ Na + ζηα θφθθα (Munns and Tester, 2007). ηδ πνχηδ θάζδ, δ μπμία λεηζκάεζ έπεζηα απυ ηδκ αολδιέκδ ζοβηέκηνςζδ αθάηςκ ζημ νζγυζηνςια, μ νοειυξ αφλδζδξ ηςκ θοηχκ ιεζχκεηαζ ζδιακηζηά. Η μνζαηή ηζιή ηδξ ζοβηέκηνςζδξ είκαζ πενίπμο 40 mm NaCl βζα ηα πενζζζυηενα θοηά ή ιζηνυηενδ βζα ηα εοαίζεδηα υπςξ ημ νφγζ (Sickler et al., 2007). ημ Γνάθδια 1Α θαίκεηαζ δ επίδναζδ ζημ νοειυ αθαζηζηήξ αφλδζδξ πμο εηθνάγεηαζ ιέζς ημο νοειμφ αφλδζδξ ηδξ λδνήξ ιάγαξ ή ηδξ θοθθζηήξ επζθάκεζαξ. Ο νοειυξ ιε ημκ μπμίμ ηα θφθθα ακαπηφζζμκηαζ ιεζχκεηαζ, ηα κέα θφθθα εηπηφζζμκηαζ αναδφηενα ηαζ μζ πθάβζμζ μθεαθιμί εηπηφζζμκηαζ είηε ιε ανβμφξ νοειμφξ είηε παναιέκμοκ ζε θήεανβμ, ιε απμηέθεζια κα ζπδιαηίγμκηαζ θζβυηενμζ πθάβζμζ αθαζημί. ηα δζημηοθήδμκα είδδ, δ ζδιακηζηυηενδ επίδναζδ είκαζ μ δναιαηζηυξ πενζμνζζιυξ ημο ιεβέεμοξ ηςκ θφθθςκ ηαζ ημο ανζειμφ ηςκ πθάβζςκ αθαζηχκ. Πενζένβςξ, δ αθαζηζηή αφλδζδ είκαζ πενζζζυηενμ εοαίζεδηδ απυ ηδκ αφλδζδ ηδξ νίγαξ, ηάηζ πμο πανμοζζάγεηαζ επίζδξ ζε λδνά εδάθδ. Η εεςνδηζηή ελήβδζδ είκαζ υηζ ιείςζδ ηδξ αφλδζδξ ηδξ θοθθζηήξ επζθάκεζαξ ζε ζοκάνηδζδ ιε ηδκ αφλδζδ ηδξ νίγαξ εθαηηχκεζ ηδκ ακάβηδ ημο θοημφ βζα κενυ ιε ζοκέπεζα κα δζαηδνδεεί δ οβναζία ημο εδάθμοξ ηαζ κα ειπμδζζηεί δ αφλδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ αθάηςκ ζημ έδαθμξ θυβς ζοιπφηκςζδξ ημο εδαθζημφ δζαθφιαημξ (Munns and Tester, 2007). ρήκα 1.1. Η απυηνζζδ ηδξ αθαζηζηήξ αφλδζδξ ημο θοημφ ζηδκ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ. Η πνάζζκδ βναιιή ακηζζημζπεί ζηδκ ιεηααμθή ηδξ αφλδζδξ έπεζηα απυ πνμζεήηδ NaCl. (Α) Η δζαηεημιιέκδ πνάζζκδ βναιιή ακηζζημζπεί ζηδκ οπμεεηζηή απυηνζζδ ημο θοημφ ιε αολδιέκδ ςζιςηζηή ακημπή. (Β) Η δζαηεημιιέκδ ηυηηζκδ βναιιή ακηζζημζπεί ζηδκ αολδιέκδ ζμκηζηή ακημπή (Γ) Η δζαηεημιιέκδ πνάζζκδηυηηζκδ βναιιή ακηζζημζπεί ζηδκ απυηνζζδ ημο θοημφ ιε ςζιςηζηή ηαζ ζμκηζηή ακημπή ζηδκ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ (Πνμζανιμβή απυ Munns and Tester, 2007). 21

25 Η δεφηενδ, (ζμκηζηή) θάζδ ηδξ απυηνζζδξ ημο θοημφ ζηδκ αθαηυηδηα λεηζκάεζ υηακ δ ζοζζχνεοζδ ηςκ αθάηςκ ζηα χνζια θφθθα (ηα μπμία δεκ ακαπηφζζμκηαζ επζπθέμκ ηαζ δεκ ιπμνμφκ κα αναζχζμοκ ηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ αθάηςκ πμο εζζένπμκηαζ ζε αοηά, υπςξ ζοιααίκεζ ζηα κεανά θφθθα) ακέθεεζ ζε ημλζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ ιε ζοκέπεζα ηδκ κέηνςζή ημοξ. Ακ μ νοειυξ κέηνςζδξ ηςκ θφθθςκ είκαζ ιεβαθφηενμξ απυ ημκ νοειυ δδιζμονβίαξ κέςκ θφθθςκ, ηυηε δ θςημζοκεεηζηή θεζημονβία ημο θοημφ δεκ είκαζ ζηακή κα πανέπεζ ηδκ απαζημφιεκδ πμζυηδηα οδαηακενάηςκ ζηα κεανά θφθθα, ιε απχηενδ ζοκέπεζα ηδκ ιείςζδ ημο νοειμφ αφλδζδξ (πήια 1.1Α). Η ςζιςηζηή ηαηαπυκδζδ έπεζ άιεζδ αθθά ηαζ ιεβαθφηενδ επίδναζδ ζηδκ αφλδζδ απυ ηδκ ζμκηζηή, ηδξ μπμίαξ δ επίδναζδ ζηδκ αφλδζδ θαίκεηαζ πμθφ ανβυηενα ηαζ ιε ιζηνυηενδ επίπηςζδ απυ ηδκ ςζιςηζηή ηαηαπυκδζδ, εζδζηά ζε παιδθά ή ιέηνζα επίπεδα αθαηυηδηαξ (πήια 1.1Α). Μυκμ ζε ορδθά επίπεδα αθαηυηδηαξ ή ζε εοαίζεδηα είδδ πμο δεκ ιπμνμφκ κα νοειίζμοκ ηδκ ιεηαθμνά Na +, δ ζμκηζηή ηονζανπεί ηδξ ςζιςηζηήξ επίδναζδξ. Η επίδναζδ ηδξ αολδιέκδξ ακημπήξ ζηδκ ςζιςηζηή ηαηαπυκδζδ, πςνίξ ιεηααμθή ζηδκ ακημπή ζε ζμκηζηή ηαηαπυκδζδ, θαίκεηαζ ζημ πήια 1.1Α. Η αφλδζδ ηδξ ακημπήξ ζε ζμκηζηή ηαηαπυκδζδ πνεζάγεηαζ ιεβαθφηενμ πνμκζηυ δζάζηδια βζα κα ειθακζζηεί (πήια 1.1Β). ε ανηεηά θοηζηά είδδ, έπεζ ηαηαβναθεί βεκεηζηή παναθθαηηζηυηδηα ζημ νοειυ ζοζζχνεοζδξ Na + ηαζ Cl - ζηα θφθθα, ηαεχξ ηαζ ζημκ ααειυ ακημπήξ ημοξ ζε αοηά ηα ζυκηα (Munns et al., 2005). Αφλδζδ ηδξ ακημπήξ ηαζ ζηζξ δομ ηαηαπμκήζεζξ (ςζιςηζηή ηαζ ζμκηζηή) επζηνέπεζ ημ θοηυ κα αολδεεί ιε βνήβμνμ νοειυ ηαευθδ ηδκ δζάνηεζα ημο αζμθμβζημφ ημο ηφηθμο. Αοηή δ ζοκδοαζιέκδ ακημπή θαίκεηαζ ζημ πήια 1.1Γ. ηα πενζζζυηενα είδδ, ημ Na + θεάκεζ ζε ημλζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ πνζκ απυ ημ Cl -, μπυηε μζ πενζζζυηενεξ ιεθέηεξ αζπμθήεδηακ ιε ημκ απμηθεζζιυ ημο Na + ηαζ ημκ έθεβπμ ηδξ ιεηαθμνάξ ημο εκηυξ ημο θοημφ. Ωζηυζμ, ζε ηάπμζα είδδ υπςξ δ ζυβζα, ηα εζπενζδμεζδή ηαζ ημ αιπέθζ, ημ Cl - εεςνείηαζ πενζζζυηενμ ημλζηυ ζυκ απ υηζ ημ Na + (Storey and Walker, 1999; Lauchli, 1984). Αοηυ απμδεζηκφεηαζ απυ ημ βεβμκυξ υηζ οπάνπεζ ζοζπέηζζδ ιεηαλφ ηδξ ακημπήξ ημο θοημφ ζηδκ αθαηυηδηα ηαζ ημο νοειμφ ζοζζχνεοζδξ ζυκηςκ πθςνίμο ζηα θφθθα. Αοηή δ δζαθμνά ιπμνεί κα πνμηφπηεζ επεζδή ημ Na + ηαηαηναηείηαζ απμηεθεζιαηζηά ζηζξ λοθχδεζξ νίγεξ ηαζ αθαζημφξ ηαζ ιε δοζημθία θηάκεζ ζηα θφθθα, εκχ ημ Cl - ζοκεπίγεζ κα ιεηαθένεηαζ ιέπνζ ημ έθαζια ηςκ θφθθςκ, ιε απμηέθεζια κα είκαζ ημ πζμ ημλζηυ ζημζπείμ ημο αθαημφπμο δζαθφιαημξ (Munns and Tester, 2007). 22

26 2.2. Θξεπηηθή θαηάζηαζε ησλ θπηψλ Όπςξ ακαθένεδηε πνμδβμοιέκςξ δ πενίζζεζα οδαημδζαθοηχκ αθάηςκ ζημ πενζαάθθμκ ηδξ νίγαξ πνμηαθεί ςζιςηζηή ηαηαπυκδζδ, δ μπμία ιπμνεί κα πνμηαθέζεζ δζαηάναλδ ηςκ οδαηζηχκ ζπέζεςκ ημο θοημφ ζηδ πνυζθδρδ ηαζ αλζμπμίδζδ ηςκ απαναίηδηςκ ενεπηζηχκ ζημζπείςκ ηαζ επίζδξ ζοζζχνεοζδ ημλζηχκ ζυκηςκ. Αοηέξ μζ αθθαβέξ έπμοκ ςξ ζοκέπεζα κα επδνεάγμκηαζ μζ δναζηδνζυηδηεξ δζαθυνςκ εκγφιςκ ηαεχξ ηαζ μ ιεηααμθζζιυξ ημο θοημφ (Munns, 2002; Lacerda et al., 2003). Η αθθδθεπίδναζδ ηςκ ζυκηςκ ζημ ενεπηζηυ δζάθοια ιπμνεί κα πνμηαθέζεζ ζδιακηζηή ακζζμννμπία ηαζ ηνμθμπεκίεξ (McCue and Hanson, 1990). ηα ηφηηανα πνμηαθείηαζ ζδιακηζηή ζμκηζηή ακζζμννμπία, ελαζηίαξ ηδξ ορδθήξ ζοζζχνεοζδξ Na + ηαζ Cl -, πμο ιεζχκεζ ηδκ πνυζθδρδ άθθςκ ακυνβακςκ ζημζπείςκ, υπςξ K +, Ca +2 ηαζ Mn +2 (Karimi et al., 2005). Η ιζηνή ακαθμβία K + /Na + ελαζηίαξ ηδξ ζοζζχνεοζδξ ορδθχκ ζοβηεκηνχζεςκ ζυκηςκ καηνίμο απεκενβμπμζεί ηα έκγοια ηαζ επδνεάγεζ ηζξ ιεηααμθζηέξ δζενβαζίεξ ζηα θοηά (Booth and Beardall, 1991). Η πενίζζεζα Na + ηαζ Cl - ειπμδίγεζ ηδκ πνυζθδρδ K + ηαζ μδδβεί ζηδκ ειθάκζζδ ζοιπηςιάηςκ έθθεζρδξ K + υπςξ πθχνςζδ ηαζ έπεζηα κέηνςζδ ηςκ θφθθςκ (Gopa and Dube, 2003). Ο νυθμξ ημο K + είκαζ ζδιακηζηυξ ζηδκ ςζιςνφειζζδ ηαζ ζηδκ πνςηεσκμζφκεεζδ, ζηδκ δζαηήνδζδ ηδξ ηοηηανζηήξ ζπανβήξ ηαζ ζηδ νφειζζδ ηδξ θςημζφκεεζδξ (Freitas et al., 2001; Ashraf, 2004). Δπίζδξ, ημ K + αθθά ηαζ ημ Ca +2 παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ δζαηήνδζδ ηδξ αηεναζυηδηαξ ηαζ θεζημονβίαξ ηςκ ηοηηανζηχκ ιειανακχκ (Wenxue et al., 2003). Η δζαηήνδζδ επάνηεζαξ K + ζημκ θοηζηυ ζζηυ οπυ ηδκ επίδναζδ ηδξ αθαηυηδηαξ ελανηάηαζ απυ ηδκ επζθεηηζηή πνυζθδρδ K + ηαζ ηδκ επζθεηηζηή ηοηηανζηή δζαιενζζιαημπμίδζδ ημο K + ηαζ ημο Na + ηαεχξ ηαζ ηδκ ηαηακμιή ημο ζημοξ αθαζημφξ (Carden et al., 2003). Οζ Khadri et al., (2007) έδεζλακ υηζ δ πνμζεήηδ αιπζζζζημφ μλέμξ (ABA) πενζυνζζε ηδκ ιεηαθμνά Na + ζημοξ αθαζημφξ, ιε απμηέθεζια ηδκ αφλδζδ ηδξ ακαθμβίαξ K + /Na +. Η επανηήξ πνυζθδρδ Ca +2 ηαζ δ ιεηαθμνά ημο, ζε ζοκεήηεξ αθαηυηδηαξ παίγεζ ηαεμνζζηζηυ νυθμ ζηδκ ακεεηηζηυηδηα ημο θοημφ ζηδκ αθαηυηδηα (Soussi et al., 2001; Unno et al., 2002). Η αθαηυηδηα ιεζχκεζ ηδκ ακαθμβία Ca +2 /Na + ζηδ νίγα, επδνεάγμκηαξ ηζξ ζδζυηδηεξ ηςκ ιειανακχκ, ελαζηίαξ ηδξ ακηζηαηάζηαζδξ ημο Ca +2 ηςκ ιειανακχκ απυ ημ Na +. Αοηυ ζοκεπάβεηαζ απχθεζα ηδξ επζθεηηζηυηδηαξ ηαζ διζπεναηυηδηαξ ηςκ ιειανακχκ (Kinraide, 1998). Σα αολδιέκα επίπεδα Na + ζηα ηφηηανα ακαζηέθθμοκ ηδκ δναζηδνζυηδηα ηςκ εκγφιςκ ιε απμηέθεζια κα πνμηαθμφκηαζ ιεηααμθέξ ζημκ ηοηηανζηυ ιεηααμθζζιυ ηαζ κα δζαηανάζζεηαζ δ 23

27 πνυζθδρδ ηαζ ηαηακμιή ημο K + ζηα ηφηηανα ηαζ ζε μθυηθδνμ ημ θοηυ. Αοηυ ιπμνεί κα μδδβήζεζ ζε ηθείζζιμ ηςκ ζημιάηςκ ηαζ ιε αοηυ ημκ ηνυπμ κα επζθένεζ ιείςζδ ηδξ ζηακυηδηαξ ημο θοημφ βζα αφλδζδ. Η επζπθέμκ πμνήβδζδ Ca +2 έδεζλε υηζ ιπμνεί κα αμδεήζεζ ηα θοηά κα λεπενάζμοκ ηζξ παναπάκς ανκδηζηέξ επζδνάζεζξ ηδξ αθαηυηδηαξ (Hasegawa et al., 2000). Δπίζδξ αμδεάεζ ζδιακηζηά ζηδκ ςζιςηζηή πνμζανιμβή ηαζ ζηδκ αφλδζδ ημο θοημφ, ιέζς ηδξ αολδιέκδξ ζοζζχνεοζδξ ζοιααηχκ μνβακζηχκ ιεηααμθζηχκ (Girija et al., 2002). Άθθμξ νυθμξ ημο Ca +2 είκαζ δ ζηαεενμπμίδζδ ηςκ ιειανακχκ ηαζ δ ιείςζδ ηδξ μλεζδςηζηήξ ηαηαπυκδζδξ (Larkindale and Knight, 2002) Δλεξγέο κνξθέο νμπγφλνπ - ROS Η έηεεζδ ηςκ θοηχκ ζηδκ αθαηυηδηα ιπμνεί κα επδνεάζεζ ηδκ παναβςβή εκενβχκ ιμνθχκ μλοβυκμο (ROS) υπςξ ημ οπενμλεζδζηυ ακζυκ (O -. 2 ), ημ μλοβυκμ απθήξ ηαηάζηαζδξ ( 1 O 2 ) ηαζ δ νίγα ημο οδνμλοθίμο (HO. ). Πενίζζεζα ROS πνμηαθεί οπενμλείδςζδ θζπζδίςκ, απμδυιδζδ πνςηεσκχκ ηαζ ιεηάθθαλδ ημο DNA (McCord, 2000, Wang et al., 2003; Vinocur and Altman, 2005; Pitzschke et al., 2006). ηα θοηζηά ηφηηανα μζ ROS πανάβμκηαζ ζημοξ πθςνμπθάζηεξ, ζηα ιζημπυκδνζα ηαζ ζημκ απμπθάζηδ (Bowler and Fluhr, 2000; Mittler, 2002) ηαζ ιπμνμφκ κα πνμλεκήζμοκ μλεζδςηζηή αθάαδ ηαηά ηδκ δζάνηεζα ααζμηζηχκ ηαηαπμκήζεςκ. Πνυζθαηεξ ιεθέηεξ έδεζλακ υηζ μζ ROS παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζηα θοηά ςξ ιεηαβςβείξ-ζδιάηςκ (signal transducers) πμο ειπθέημκηαζ ζηδ ειθάκζζδ ακηζδνάζεςκ απυ πνμζαμθή παεμβυκμο, ααζμηζηή ηαηαπυκδζδ, πνμβναιιαηζζιέκμ ηοηηανζηυ εάκαημ ηαζ απυ ακαπηολζαημφξ πανάβμκηεξ (Mittler et al., 2004; Torres and Dangl, 2005). Οζ ιεηααμθέξ ηςκ ζδζμηήηςκ ηαζ ηδξ θεζημονβζηυηδηαξ ηςκ ιειανακχκ πμο επάβμκηαζ απυ ηδκ αθαηυηδηα ζπεηίγμκηαζ ιε αολδιέκδ παναβςβή ROS (Shalata et al., 2001). Αολδιέκδ παναβςβή ROS ιπμνεί κα πνμηαθέζεζ ηθείζζιμ ηςκ ζημιάηςκ, επμιέκςξ ιείςζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ CO 2 ζημοξ πθςνμπθάζηεξ ηαζ ιείςζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ημο NADP + (Foyer and Noctor, 2003). Η αολδιέκδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ROS πνμηαθεί γδιζά ζηδ πνςηεΐκδ D1 ημο PSΙΙ ηαζ μδδβεί ζε θςημακαζημθή. Η αολδιέκδ θςημακαπκμή ηαζ δναζηδνζυηδηα ηδξ NADPH ελαζηίαξ ηδξ ηαηαπυκδζδξ ζοκεζζθένεζ ζηδκ αολακυιεκδ ζοζζχνεοζδ οπενμλεζδίμο ημο οδνμβυκμο, ημ μπμίμ ιπμνεί κα απεκενβμπμζήζεζ ηα έκγοια μλεζδχκμκηαξ ηζξ εεζμθζηέξ ημοξ μιάδεξ. Η ημλζηυηδηα ημο H 2 O 2 αολάκεηαζ ιε ηδκ πανμοζία ιεηάθθςκ επεζδή ηεθζηχξ πανάβεηαζ 24

28 δ οδνμλοθζηή νίγα (HO. ), ιζα απυ ηζξ πθέμκ ημλζηέξ ιμνθέξ μλοβυκμο (Halliwell and Gutteridge, 1989) Φσηνζχλζεζε ε ορδθή ζοβηέκηνςζδ αθάηςκ, δ θςημζφκεεζδ ιπμνεί κα ιεζςεεί θυβς ιεζςιέκδξ εζζυδμο CO 2 ζηα θφθθα (Chaves et al., 2011). Οζ ιεθέηεξ ηςκ Flexas et al. (2004, 2008), Niinemets et al. (2005, 2009) ηαζ Warren and Adams (2006) έδεζλακ υηζ δ οδαηζηή ηαηαπυκδζδ ηαζ δ αθαηυηδηα ιεζχκμοκ ηδκ αβςβζιυηδηα ημο ιεζμθφθθμο ζε ανηεηά είδδ. Δπίζδξ, δ αβςβζιυηδηα ημο ιεζμθφθθμο ακηζδνά άιεζα ζε ελςηενζηά ενεείζιαηα υπςξ θςξ, εενιμηναζία ή CO 2 (Flexas et al., 2008). Αοηυ μδήβδζε ζηδκ οπυεεζδ υηζ δ αβςβζιυηδηα ηςκ ζημιάηςκ ηαζ ημο ιεζμθφθθμο ίζςξ αθθδθεπζδνμφκ ή/ηαζ νοειίγμκηαζ ζοβπνυκςξ (Galmes et al., 2007a,b; Peeva and Cornic, 2009;Warren, 2008a,b). Ωζηυζμ, ηεθεοηαίεξ ιεθέηεξ έδεζλακ υηζ δ οπμηζεέιεκδ μιμνφειζζδ ηδξ αβςβζιυηδηαξ ζημιάηςκ ηαζ ιεζμθφθθμο ελανηάηαζ απυ ηάπμζα ελςηενζηά ενεείζιαηα, υπςξ μζ πενζααθθμκηζηέξ ζοκεήηεξ. Οζ Flexas et al. (2009) έδεζλακ υηζ δ ιείςζδ ηδξ αβςβζιυηδηαξ ημο ιεζμθφθθμο πμο πνμηθήεδηε απυ οδαηζηή ηαηαπυκδζδ ήηακ πθήνςξ ακαζηνέρζιδ ζε ζοκεήηεξ ζοκκεθζαζιέκςκ διενχκ. Δπζπθέμκ μζ Galle et al. (2009) έδεζλακ υηζ μζ επζδνάζεζξ ηδξ οδαηζηήξ ηαηαπυκδζδξ ζηδκ αβςβζιυηδηα ημο ιεζμθφθθμο ηαζ δ ακάηαιρδ ηςκ θοηχκ ιεηά ημ πυηζζια, ήηακ άιεζα ελανηδιέκεξ απυ ηδκ δθζαηή αηηζκμαμθία ηαζ βίκμκηακ πζμ έκημκεξ ιε ορδθή έκηαζδ θςηυξ. Δπίζδξ, ημκίγεηαζ ζδζαίηενα ζηδκ αζαθζμβναθία δ ζοζπέηζζδ ηδξ δμιήξ ημο θφθθμο ιε ηδκ αβςβζιυηδηα ημο ιεζμθφθθμο (Niinemets et al., 2009). Η αβςβζιυηδηα ημο ιεζμθφθθμο έπεζ παναηηδνζζηζηά πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ επζθάκεζα ηαζ ηζξ δζαζηάζεζξ ηςκ ιεζμηοηηάνζςκ πχνςκ (Lawlor and Tezara, 2009; Niinemets et al., 2009). Αοηά ηα θοζζηά παναηηδνζζηζηά ιεηααάθθμκηαζ ελαζηίαξ ηδξ ζοννίηκςζδξ ηςκ ζζηχκ απυ ηδκ λδναζία (Lawlor and Tezara, 2009). Αηυιδ είκαζ βκςζηυ υηζ δ παναηεηαιέκδ οδαηζηή ηαηαπυκδζδ ή αθαηυηδηα, εζδζηά ηαηά ηδκ ακάπηολδ ημο θοημφ, ιπμνεί κα πνμηαθέζεζ έκημκεξ ηνμπμπμζήζεζξ ζηδκ ακαημιία ημο θφθθμο, υπςξ πάποκζδ ηςκ ηοηηανζηχκ ημζπςιάηςκ ηαζ ιζηνυηενα ηαζ πζμ ποηκά δζαηεηαβιέκα ηφηηανα ημο δνοθαηημεζδμφξ πανεβπφιαημξ (Bongi and Loreto, 1989). Αοηυ ίζςξ ιπμνεί κα ελδβήζεζ ηδκ ιαηνμπνυκζα ιείςζδ ηδξ αβςβζιυηδηαξ ημο ιεζυθοθθμο ζηα ηαηαπμκδιέκα απυ αθαηυηδηα θοηά (Niinemets et al., 2009). Δπίζδξ δ αβςβζιυηδηα ημο ιεζμθφθθμο ελανηάηαζ απυ ημκ βεκυηοπμ (Barbour et al., 2010) 25

29 ηαζ ακ θάαμοιε οπ υρζκ ιαξ ηδκ ιεβάθδ βεκεηζηή πμζηζθμιμνθία ιεηαλφ ηςκ εζδχκ, ακαιέκεηαζ κα ανεεμφκ θοηά ιε ιεβαθφηενδ αβςβζιυηδηα ημο ιεζμθφθθμο (Warren, 2008). Βέααζα, εηηυξ απυ ημ βεκυηοπμ ζδιακηζηυ νυθμ δζαδναιαηίγεζ δ ακεναηζηή ακοδνάζδ (CA) δ μπμία πζεακυκ ζπεηίγεηαζ ιε ηδκ ακηαθθαβή CO 2 επδνεάγμκηαξ ηα ιεηααμθζηά ζοζηαηζηά ηδξ αβςβζιυηδηαξ ημο ιεζμθφθθμο (Warren, 2008 a,b), εζδζηά ηάης απυ ζοκεήηεξ ηαηαπυκδζδξ απυ άθαηα. Δηηζιάηαζ υηζ δ δναζηδνζυηδηα ηδξ ηαναμκζηήξ ακοδνάζδξ δζεοημθφκεζ ηδκ δζάποζδ ημο CO 2 ζημοξ πθςνμπθάζηεξ, ιεζχκμκηαξ ηδκ ακηίζηαζδ δζάποζδξ ηαηά 33% (Evans and Von Caemmerer, 1996; Gillon and Yakir, 2000). Δηηυξ ημο νυθμο ημοξ ζηδκ δζάποζδ ημο CO 2 ζημ ιεζυθοθθμ, μζ ηαναμκζηέξ ακοδνάζεξ είκαζ νοειζζηέξ ηδξ εθεβπυιεκδξ ιεηαθμνάξ ημο CO 2 ζηα ηαηαθναηηζηά ηφηηανα (Hu et al., 2010b). Ακαθφζεζξ ημο ιεηαβναθήιαημξ (transcriptome) έδεζλακ υηζ ηα βμκίδζα βca1, βca4, βca6 οπενεηθνάγμκηαζ ζηα ηαηαθναηηζηά ηφηηανα ηαζ ζηα ηφηηανα ημο ιεζμθφθθμο (Leonhardt et al., 2004; Yang et al., 2008). ε ζπμνυθοηα νογζμφ, δ έηθναζδ ημο βμκζδίμο (OsCA1) πμο ηςδζημπμζεί ηδκ ηαναμκζηή ακοδνάζδ ζε θφθθα ηαζ νίγα επάβεηαζ απυ ςζιςηζηή ηαηαπυκδζδ ηαζ αθαηυηδηα (Yu et al., 2007). ημ θοηυ ανααίδμρδ (Arabidopsis thaliana), οπενέηθναζδ ημο βμκζδίμο OsCA1 αεθηίςζε ηδκ αφλδζδ ιεηά απυ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl, ηάηζ πμο δείπκεζ ηδκ εοενβεηζηή επίδναζδ ηδξ δνάζδξ ηδξ ηαναμκζηήξ ακοδνάζδξ ζηδκ αφλδζδ οπυ ζοκεήηεξ αθαηυηδηαξ. Ο νυθμξ ηδξ CA ζηδκ νφειζζδ ηςκ ζημιάηςκ ηαζ ηςκ δζαθμνεηζηχκ ηδξ ζζμιμνθχκ ζηδκ αβςβζιυηδηα ημο ιεζμθφθθμο ενεοκάηαζ αηυιδ (Fabre et al., 2007; Hu et al., 2010a,b). Πανυθμ πμο δ δζαθμνζηή έηθναζδ ηςκ ζπεηζηχκ ιε ηδκ θςημζφκεεζδ βμκζδίςκ, ζε θοηά πμο έπμοκ οπμζηεί ααζμηζηή ηαηαπυκδζδ, έπεζ ιεθεηδεεί εονέςξ (Chaves et al., 2009; Seki et al., 2002b; Wong et al., 2006), ιυκμ εθάπζζημζ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ έπμοκ ζπεηζζηεί ιε αοηή ηδκ δζαδζηαζία. Ακάιεζα ζηα εθάπζζηα παναδείβιαηα είκαζ δ νφειζζδ ηςκ βμκζδίςκ πμο ηςδζημπμζμφκ CAB (CHLOROPHYLL A/B-BINDING) πνςηεΐκεξ ημο PSII. Έκα άθθμ πανάδεζβια είκαζ δφμ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ ζημ ηνζεάνζ (ΜΤΒ-like), HvMCB1 ηαζ HvMCB2, πμο πνμζδέκμκηαζ απμηθεζζηζηά ζε πνμηαεμνζζιέκεξ πενζμπέξ ζημοξ πνμαβςβείξ ηςκ CAB. Αοημί μζ πανάβμκηεξ ιεηαβναθήξ έπμοκ παναηηδνζζηζηά βκςνίζιαηα ιεηαβναθζηχκ εκενβμπμζδηχκ ηαζ απαζημφκηαζ βζα ηδκ ιέβζζηδ έηθναζδ ημο CAB βμκζδίμο αθθά δεκ είκαζ απαναίηδημζ βζα ηδκ έηθναζδ πμο ζπεηίγεηαζ ιε ημ θςξ. Δπίζδξ, είκαζ εκδζαθένμκ υηζ ημ επίπεδμ ιεηαβναθήξ ηςκ βμκζδίςκ HvMCB1 ηαζ 26

30 HvMCB2 ιεζχκεηαζ απυ αθαηυηδηα, ςζιςηζηή ηαζ μλεζδςηζηή ηαηαπυκδζδ (Churin et al., 2003). Αλζμζδιείςημ είκαζ υηζ μζ πανάβμκηεξ ιεηαβναθήξ MYB θαίκεηαζ υηζ ειπθέημκηαζ ζηδκ νφειζζδ ηδξ έηθναζδξ βμκζδίςκ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ θςημζφκεεζδ οπυ ζοκεήηεξ ααζμηζηήξ ηαηαπυκδζδξ. Σα cdnas ηςκ βμκζδίςκ Ppcl ηαζ Gapl πμο ηςδζημπμζμφκ έκα ζζμέκγοιμ CAM (Crassulacean Acid Metabolism) ηδξ θςζθμεκμθμπονμζηαθοθζηήξ ηαναμλοθάζδξ ηαζ ηδξ NAD-ελανηδιέκδξ δετδνμβμκάζδξ ηδξ 3-θςζθμνζηήξ βθοηεναθδεΰδδξ, ακηίζημζπα, αολάκμκηαζ ζε ηαηαπυκδζδ ορδθήξ αθαηυηδηαξ. Οζ πνμαβςβείξ ηαζ ηςκ δομ βμκζδίςκ πενζθαιαάκμοκ ανηεηά ημζκά ιμηίαα αθθδθμοπζχκ πμο έπμοκ ζοβηαηαααηζηέξ εέζεζξ πνυζδεζδξ βζα ημοξ πανάβμκηεξ ιεηαβναθήξ MYB (Schaeffer et al., 1995). Οζ πενζμπέξ, υπμο εκημπίγμκηαζ αοηά ηα ιμηίαα, έπεζ δεζπεεί υηζ είκαζ απαναίηδηεξ βζα ηδκ ιεηαβναθζηή νφειζζδ ζηδκ αθαηυηδηα ηαζ βζα αοηυ πνμηείκεηαζ υηζ μζ πανάβμκηεξ ιεηαβναθήξ ηφπμο ΜΤΒ εθέβπμοκ ηδκ έηθναζδ ηςκ βμκζδίςκ Ppcl ηαζ Gapl ζηα θοηά, ζε ζοκεήηεξ ηαηαπυκδζδξ απυ αθαηυηδηα. Δηηυξ ηςκ ΜΤΒ, ίζςξ ηαζ άθθεξ μζημβέκεζεξ παναβυκηςκ ιεηαβναθήξ κα ειπθέημκηαζ ζηδκ θςημζοκεεηζηή ακηίδναζδ ζε ηαηαπυκδζδ. Ο πανάβμκηαξ LONG HYPOCOTYL 5 (HY5) είκαζ έκαξ bzip-ηφπμο πανάβμκηαξ ιεηαβναθήξ μ μπμίμξ νοειίγεζ ηδκ ιεηαβναθή δζαθυνςκ βμκζδίςκ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ θςημζφκεεζδ, υπςξ ηα CAB2 ηαζ RBCS1A (RIBULOSE BISPHOSPHATE CARBOXYLASE SMALL SUBUNIT) ηαζ επίζδξ νοειίγεζ ανηεηά βμκίδζα πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ακηίδναζδ ζε ηαηαπυκδζδ (π.π CBF1, DREB2A, RD20 ηαζ MYB59) (Lee et al., 2007; Maxwell et al., 2003). Πνυζθαηδ ιεθέηδ ζημ νφγζ έδεζλε υηζ δ οπεν-έηθναζδ ημο TSRF1, πμο ηςδζημπμζεί έκακ πανάβμκηα απυηνζζδξ ζημ αζεοθέκζμ (ERF) πμο ειπθέηεηαζ ζε απμηνίζεζξ ςζιςηζηήξ ηαζ οδαηζηήξ ηαηαπυκδζδξ, επάβεζ ηδκ έηθναζδ ημο OsRBCS (Quan et al., 2010). Ο C2/H2 ηφπμξ πνςηεσκχκ, STZ and AZF2, ζηδκ ανααίδμρδ θεζημονβεί ςξ ηαηαζημθέαξ ιεηαβναθήξ ζε ζοκεήηεξ ηαηαπυκδζδξ λδναζίαξ, παβεημφ, ηαζ ορδθήξ αθαηυηδηαξ ηαζ δ έηθναζδ ηςκ βμκζδίςκ STZ ηαζ AZF2 επάβεηαζ ηονίςξ ζηα θφθθα ζε ηαηαπυκδζδ λδναζίαξ (Sakamoto et al., 2004). 3. Μεραληζκνί Αληνρήο ησλ θπηψλ ζηελ αιαηφηεηα Δπεζδή ημ NaCl είκαζ ημ πζμ οδαημδζαθοηυ ηαζ δζαδεδμιέκμ άθαξ, είκαζ θοζζηυ υθα ηα θοηά κα έπμοκ ακαπηφλεζ ιδπακζζιμφξ βζα κα νοειίγμοκ ηδκ ζοβηεκηνςζή ημο ηαζ ηδκ ιδ επζθμβή ημο, πνμξ υθεθμξ ηςκ άθθςκ ζυκηςκ πμο ηονίςξ ανίζημκηαζ ζε 27

31 παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ, υπςξ ημ Κ + ηαζ ημ ΝΟ - 3. ηα πενζζζυηενα θοηά, ημ Na + ηαζ ημ Cl - απμηθείμκηαζ απυ ηζξ νίγεξ ηαηά ηδκ απμννυθδζδ ενεπηζηχκ ζημζπείςκ απυ ημ έδαθμξ (Munns, 2005). Σα αθυθοηα, δ θοζζηή δδθαδή πθςνίδα ηςκ οπεναμθζηά αθαημφπςκ εδαθχκ, είκαζ ζηακά κα δζαηδνμφκ ημκ απμηθεζζιυ αθάηςκ ζε ορδθυηενεξ ζοβηεκηνχζεζξ αθαηυηδηαξ απυ υ,ηζ ηα βθοηυθοηα. Γζα πανάδεζβια ημ θοηυ, Hordeum marinum, απμηθείεζ ζηακμπμζδηζηά ημ Na + ηαζ ημ Cl - ζε ζοβηεκηνχζεζξ έςξ ηαζ 450 mm NaCl (Garthwaite et al., 2005). Δπίζδξ, επεζδή δ αθαηυηδηα είκαζ ημζκυ βκχνζζια ηςκ λδνχκ ηαζ διίλδνςκ πενζμπχκ, ηα θοηά έπμοκ ακαπηφλεζ ιδπακζζιμφξ ακημπήξ ζημ παιδθυ οδαηζηυ δοκαιζηυ ημο εδάθμοξ πμο πνμηαθείηαζ απυ ηδκ αθαηυηδηα ηαζ ηδκ λδναζία ιε απμηέθεζια δ ακημπή ζηδκ ςζιςηζηή ηαηαπυκδζδ κα είκαζ παναηηδνζζηζηυ ηςκ πενζζζμηένςκ βθοημθφηςκ ηαζ αθμθφηςκ Φπζηνινγηθνί κεραληζκνί Σμ άθαξ πμο ανίζηεηαζ ζημ εδαθζηυ δζάθοια ακαζηέθθεζ ηδκ αφλδζδ ημο θοημφ βζα δφμ ηονίςξ θυβμοξ. Καηανπάξ ιεζχκεζ ηδ ζηακυηδηα ημο θοημφ κα απμννμθήζεζ κενυ ηαζ ημ μδδβεί ζε πζμ ανβή αφλδζδ. Αοηυ μθείθεηαζ ζηδκ ςζιςηζηή επίδναζδ ηδξ αθαηυηδηαξ. Ο δεφηενμξ θυβμξ είκαζ υηζ ιπμνεί κα εζζέθεεζ ζημ νεφια ηδξ δζαπκμήξ ηαζ ζηαδζαηά κα πνμηαθέζεζ αθάαεξ ζηα ηφηηανα ηςκ θφθθςκ, ιεζχκμκηαξ αηυιδ πενζζζυηενμ ηδκ αφλδζδ. Αοηυ μθείθεηαζ ζηδκ ημλζηή επίδναζδ ηδξ αθαηυηδηαξ θυβς ηδξ πενίζζεζαξ μνζζιέκςκ ζυκηςκ (Munns, 2005). Οζ επζδνάζεζξ πμο ακαθένεδηακ δδιζμονβμφκ ηδ δφμ θάζεςκ αολδηζηή ακηίδναζδ ηςκ θοηχκ ζηδκ αθαηυηδηα (πήια 1.1Β). Η πνχηδ θάζδ ηδξ αολδηζηήξ ακηίδναζδξ πνμένπεηαζ απυ ηδκ επίδναζδ ηςκ αθάηςκ ημο εδαθζημφ δζαθφιαημξ. Σα άθαηα ζημ εδαθζηυ δζάθοια ιεζχκμοκ ηδκ αφλδζδ ηςκ θφθθςκ ηαζ, ζε ιζηνυηενμ ααειυ, ηδξ νίγαξ (Munns, 1993). ε αοηή ηδκ θάζδ ημ Na + ηαζ ημ Cl - δεκ ζοζζςνεφμκηαζ ζημοξ ακαπηοζζυιεκμοξ ζζημφξ ζε ζοβηεκηνχζεζξ πμο κα ακαζηέθθμοκ ηδκ αφλδζδ, ηαεχξ μζ ιενζζηςιαηζημί ζζημί ηνμθμδμημφκηαζ ηονίςξ απυ ηδκ δειχδδ ιμίνα ζηδκ μπμία ηα άθαηα απμηθείμκηαζ απμηεθεζιαηζηά. Ακηίεεηα ηφηηανα πμο εφημθα ηακφμκηαζ ιπμνμφκ κα ακεπεμφκ ηα άθαηα πμο ένπμκηαζ ιέζς ηδξ αββεζχδμοξ ιμίναξ, ιε ηδκ δδιζμονβία κέςκ ποιμημπίςκ. Η δεφηενδ θάζδ ηδξ αολδηζηήξ ακηίδναζδξ πνμηφπηεζ απυ ηδκ ημλζηή επίδναζδ ηςκ αθάηςκ ζημ θοηυ. Σα άθαηα πμο απμννμθήεδηακ απυ ημ θοηυ ζοζζςνεφμκηαζ ζηα χνζια θφθθα ηαζ δ ζοκεπζγυιεκδ ιεηαθμνά ημοξ ζηα θφθθα ιε ηδκ δζαπκμή βζα 28

32 ιεβάθμ πνμκζηυ δζάζηδια μδδβεί ζηαδζαηά ζε πμθφ ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ Na + ηαζ Cl -. Αοηυ έπεζ ςξ ζοκέπεζα ηδκ κέηνςζδ ηςκ θφθθςκ. Αζηία ηδξ κέηνςζδξ είκαζ πζεακυηαηα υηζ δ πμζυηδηα ηςκ αθάηςκ πμο ζοζζςνεφμκηαζ λεπενκάεζ ηδκ ζηακυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ κα ζοβηεκηνχζμοκ ηα άθαηα ζηα ποιμηυπζα. Έηζζ ηα άθαηα ζοζζςνεφμκηαζ πμθφ βνήβμνα ζημ ηοηυπθαζια ηαζ ακαζηέθθμοκ ηδκ δνάζδ ηςκ εκγφιςκ. Ο νοειυξ κέηνςζδξ ηςκ θφθθςκ είκαζ ηνίζζιμξ βζα ηδκ επζαίςζδ ημο θοημφ. Ακ μ νοειυξ δδιζμονβίαξ κέςκ θφθθςκ είκαζ ιεβαθφηενμξ απυ ημκ νοειυ κέηνςζδξ ηςκ χνζιςκ θφθθςκ ηυηε ηα θςημζοκεεηζηά θφθθα είκαζ ανηεηά βζα κα πανάβεζ ημ θοηυ άκεδ ηαζ ηανπμφξ. Ωζηυζμ, ακ ηα χνζια θφθθα κεηνχκμκηαζ βνδβμνυηενα απυ ηδκ ακάπηολδ ηςκ κέςκ θφθθςκ ηυηε ημ θοηυ δεκ είκαζ ζηακυ κα επζαζχζεζ ηαζ κα πανάβεζ ηανπμφξ. Έηζζ, ηα εηήζζα θοηά δίκμοκ αβχκα ιε ημκ πνυκμ βζα κα ακείζμοκ ηαζ κα πανάβμοκ ηανπμφξ υζμ δ θοθθζηή επζθάκεζα είκαζ επανηήξ βζα κα πανάβεζ ημ απαναίηδηα πνμσυκηα θςημζφκεεζδξ. Γζα ηα πμθοεηή είδδ οπάνπεζ δ δοκαηυηδηα κα εζζέθεμοκ ζε ηαηάζηαζδ πανυιμζα ιε θήεανβμ ηαζ έηζζ κα επζαζχζμοκ απυ ηδκ ηαηαπυκδζδ. οιπεναζιαηζηά, δ ανπζηή ιείςζδ ηδξ αφλδζδξ πνμηαθείηαζ απυ ηδκ ςζιςηζηή επίδναζδ ηςκ αθάηςκ, εκχ δ ιεηέπεζηα ιείςζδ ηδξ αφλδζδξ πνμηαθείηαζ απυ ηδκ αδοκαιία κα ειπμδζζηεί δ ιεηαθμνά ιε ημ νεφια δζαπκμήξ ηςκ ημλζηχκ ζυκηςκ κα θηάζμοκ ζε ημλζηά επίπεδα ζηα θφθθα Μεραληζκνί πνπ ειέγρνπλ ηελ αχμεζε ηεο ξίδαο θαη ησλ θχιισλ Οζ ιδπακζζιμί πμο εθέβπμοκ ηδκ αφλδζδ ηδξ νίγαξ ηαζ ηςκ θφθθςκ έπμοκ άιεζδ ζπέζδ ιε ηα άθαηα αθθά νοειίγμκηαζ απυ πανάβμκηεξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε οδαηζηή ηαηαπυκδζδ. Αοηυ πνμηφπηεζ απυ ημ βεβμκυξ υηζ ημ Na + ηαζ Cl - δεκ ανίζημκηαζ ζε ημλζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ ζηα ακαπηοζζυιεκα ηφηηανα ηςκ θφθθςκ (Hu and Schmidhalter, 1998; Fricke, 2004) ηαζ ηςκ νζγχκ (Jeschke, 1984; Jeschke et al., 1986). Δάκ ηαζ ηαηά πυζμ δ οδαηζηή ηαηάζηαζδ, δ μνιμκζηή νφειζζδ ή δ πανμπή πνμσυκηςκ θςημζφκεεζδξ αζημφκ ηονίανπμ έθεβπμ ζηδκ αφλδζδ ηςκ θοηχκ ζε λδνά ή αθαημφπα εδάθδ είκαζ εέια πμο παναιέκεζ αηυιδ αδζεοηνίκζζημ (Munns, 2005). Έηζζ, οπάνπμοκ εκδείλεζξ υηζ ηα μνιμκζηά ζήιαηα, ηαζ υπζ ιυκμ μζ οδαηζηέξ ζπέζεζξ, εθέβπμοκ ηδκ αφλδζδ ζε αθαημφπα εδάθδ. Πεζνάιαηα ιανηονμφκ ηδκ φπανλδ πδιζηχκ ζδιάηςκ πμο πνμένπμκηαζ απυ ηζξ νίγεξ ζε λδνά ή αθαημφπα εδάθδ ηαζ ιεζχκμοκ ηδκ αφλδζδ ηςκ θφθθςκ. Σμ αιπζζζζηυ μλφ (ΑΒΑ) είκαζ πνμθακχξ δ 29

33 οπεφεοκδ μνιυκδ βζα αοηά ηα ζήιαηα, επεζδή εκημπίγεηαζ ζημοξ ακζυκηεξ ποιμφξ ηαζ αολάκεηαζ έπεζηα απυ ηαηαπυκδζδ λδναζίαξ ή αθαηυηδηαξ (Munns and Cramer, 1996). Πάκηςξ ιέπνζ ζηζβιήξ δεκ οπάνπεζ ηάπμζα απυδεζλδ υηζ ημ ΑΒΑ είκαζ ημ ιυκμ οπεφεοκμ ζήια πμο πνμένπεηαζ απυ ηζξ νίγεξ (Dodd, 2005). Ο μνιμκζηυξ έθεβπμξ ηδξ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ είκαζ ειθακήξ ζηα θφθθα, πμο έπμοκ οπμζηεί ηαηαπυκδζδ θυβς αθαηυηδηαξ. Σα θφθθα αοηά έπμοκ ιζηνυηενδ επζθάκεζα ηαζ είκαζ πζμ παπζά, απμδεζηκφμκηαξ υηζ ημ ιέβεεμξ ηαζ ημ ζπήια ηςκ ηοηηάνςκ έπεζ ιεηααθδεεί (James et al., 2002). Δπζπθέμκ, ηα θφθθα ηςκ ηαηαπμκδιέκςκ απυ αθαηυηδηα θοηχκ έπμοκ ορδθυηενδ ακαθμβία αάνμξ/επζθάκεζα (ιεβαθφηενδ απμηεθεζιαηζηυηδηα πνήζδξ κενμφ), ημ μπμίμ είκαζ παναηηδνζζηζηυ ηςκ θοηχκ πμο πνμζανιυγμκηαζ ζε λδνά ηαζ αθαημφπα εδάθδ. Ο μνιμκζηυξ έθεβπμξ ηδξ ηοηηανζηήξ δζαίνεζδξ ηαζ επζιήηοκζδξ ηςκ ηοηηάνςκ είκαζ επίζδξ ειθακήξ ζηζξ νίγεξ. Ανηεηέξ ιεθέηεξ έδεζλακ υηζ δ αθαηυηδηα αζηεί δζαθμνζηέξ επζδνάζεζξ ζημκ νοειυ επζιήηοκζδξ ηδξ νίγαξ ηαζ ζηδκ έηπηολδ πθάβζςκ νζγχκ (Rubinigg et al., 2004) Μεραληζκνί πνπ ειέγρνπλ ηελ επίδξαζε ησλ αιάησλ Οζ ιδπακζζιμί ακημπήξ ημο θοημφ ζηδκ αθαηυηδηα δζαηνίκμκηαζ ζε δομ ηαηδβμνίεξ: α) αοημί πμο εθαπζζημπμζμφκ ηδκ είζμδμ ηςκ αθάηςκ ζημ θοηυ ηαζ α) αοημί πμο εθαπζζημπμζμφκ ηδκ ζοβηέκηνςζδ ηςκ αθάηςκ ζημ ηοηηυπθαζια. Οζ ζοβηεκηνχζεζξ ημο Na + ζημ ηοηυπθαζια ηδξ νίγαξ είκαζ πζεακυηαηα ηδξ ηάλδξ ηςκ 10-30mM (Tester and Davenport, 2003) εκχ ζηα θφθθα παναιέκμοκ άβκςζηεξ. Τπμθμβίγεηαζ υιςξ υηζ είκαζ ιζηνυηενεξ απυ 100mM (Wyn Jones and Gorham, 2002). Όζμκ αθμνά ηδκ πνχηδ ηαηδβμνία, μζ νίγεξ πνέπεζ κα απμηθείμοκ υζμ ημ δοκαηυκ πενζζζυηενμ απυ ημ Na + ηαζ Cl - πμο ανίζημκηαζ ζημ εδαθζηυ δζάθοια. Γζαθμνεηζηά ηα άθαηα ζηαδζαηά εα ζοζζςνεφμκηαζ, χζπμο ιεηά απυ ηάπμζμ πνμκζηυ δζάζηδια κα θηάζμοκ ζε ημλζηά επίπεδα. Σα θοηά δζαπκέμοκ πενίπμο 50 θμνέξ πενζζζυηενμ κενυ απυ ηδκ πμζυηδηα πμο ζοβηναημφκ ζηα θφθθα (Munns, 2005). οκεπχξ, ακ έκα θοηυ αθήζεζ κα εζζέθεεζ ιυκμ ημ 1/50 ηςκ αθάηςκ πμο ανίζημκηαζ ζημ εδαθζηυ δζάθοια, άνα κα απμηθείζεζ ημ 98%, δ ζοκμθζηή ζοβηέκηνςζδ ηςκ αθάηςκ ζημ οπένβεζμ ιένμξ δεκ εα λεπενάζεζ εηείκδ ζημ έδαθμξ ηαζ επμιέκςξ ηα θοηά εα επζαζχκμοκ ζε αθαημφπα εδάθδ (Munns, 2005). Σα πενζζζυηενα θοηά απμηθείμοκ πενίπμο ημ 98% ηςκ αθάηςκ ημο εδαθζημφ δζαθφιαημξ, επζηνέπμκηαξ ιυκμ 2% κα ιεηαθενεεί ιε ηα αββεία ζημοξ αθαζημφξ. οβηεηνζιέκα ημ ζζηάνζ απμηθείεζ πενζζζυηενμ απυ ημ 98% ημο Na + ημο εδαθζημφ δζαθφιαημξ ιε απμηέθεζια κα ιδκ παναηδνμφκηαζ ζηα θφθθα 30

34 ζοβηεκηνχζεζξ ιεβαθφηενεξ απυ 50mM (Husain et al., 2004). Ακηίεεηα, ημ ηνζεάνζ απμηθείεζ θζβυηενμ απυ ημ 98% ημο Na + ημο εδαθζημφ δζαθφιαημξ ιε απμηέθεζια μζ ζοβηεκηνχζεζξ ζηα θφθθα ημο κα ακένπμκηαζ ζε πμθφ ορδθά επίπεδα, έςξ ηαζ 500mM (Rawson et al., 1988). Η ιεηαθμνά ηςκ αθάηςκ απυ ηα θφθθα ζηδκ δειχδδ ιμίνα ιπμνεί ςξ έκα ζδιείμ κα δζαηδνήζεζ ηδκ ζοβηέκηνςζδ ημοξ παιδθή. Ωζηυζμ παναηδνείηαζ ιζα ζπεηζηά ιζηνή επακαιεηαθμνά ηςκ αθάηςκ απυ ηα θφθθα ζηδκ δειχδδ ιμίνα, ζε ζπέζδ ιε ηδκ είζμδμ ημοξ ζημ νεφια δζαπκμήξ. Αοηυ επζαεααζχκεηαζ απυ ηδκ ζοκεπζγυιεκδ ειθάκζζδ ηςκ αθάηςκ ζηα θφθθα βζα ιεβάθμ πνμκζηυ δζάζηδια ιεηά απυ ηδκ απμιάηνοκζδ ηςκ αθάηςκ απυ ημ νζγυζηνςια. Μεηνήζεζξ ηςκ ζυκηςκ ζημ θθμζχδεξ πανέβποια έδεζλακ υηζ ηα ακεεηηζηά ζηδκ αθαηυηδηα είδδ απμηθείμοκ ημ Na + ηαζ Cl - απυ ημ θθμίςια ζε ιεβάθμ πμζμζηυ, εκχ ηα θζβυηενμ ακεεηηζηά είδδ δεκ πανμοζζάγμοκ αοηυ ημ παναηηδνζζηζηυ (Munns et al., 1986, 1988). Απμηθεζζιυξ ηςκ αθάηςκ απυ ηδκ δειχδδ ιμίνα ελαζθαθίγεζ υηζ αοηά δεκ εα ιεηαθενεμφκ ζε ακαπηοζζυιεκμοξ ζζημφξ ημο αθαζημφ. Μμθμκυηζ ηα άθαηα πμο ανίζημκηαζ ζηδκ δειχδδ ιμίνα ηςκ ηαηχηενςκ θφθθςκ ιπμνεί κα ιεηαθενεμφκ ζηζξ νίγεξ, αοηά πμο ανίζημκηαζ ζηδκ δειχδδ ιμίνα κεανυηενςκ θφθθςκ ιπμνεί κα ιεηαθενεμφκ ζημοξ ιενζζηςιαηζημφξ ζζημφξ ημο αθαζημφ (Layzell et al., 1981). Τπάνπεζ ζζπονή ζοζπέηζζδ ιεηαλφ ηδξ ζηακυηδηαξ απμηθεζζιμφ ηςκ αθάηςκ ηαζ ηδξ ακεεηηζηυηδηαξ ζηδκ αθαηυηδηα ζε πμθθά είδδ (Greenway and Munns, 1980; Lauchli, 1984; Yeo and Flowers, 1986; Munns and James, 2003; Tester and Davenport, 2003). Όζμκ αθμνά ηδκ δεφηενδ ηαηδβμνία, ιενζηά θοηά έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα δζαιενζζιαημπμίδζδξ ηςκ αθάηςκ πμο θεάκμοκ ζημκ αθαζηυ, υπμο ιπμνμφκ κα ηα ζοβηεκηνχζμοκ ζηδκ αάζδ ημο θφθθμο ή ζημκ ιίζπμ, ηαεχξ ηαζ κα ηα ιεηαθένμοκ απυ ηα κεανά θφθθα ζηα βδναζυηενα. Αοηυ είκαζ ζδζαίηενα ζδιακηζηυ βζα ηα θοηζηά είδδ πμο δεκ ιπμνμφκ κα απμηθείζμοκ πενζζζυηενμ απυ ημ 98% ηςκ αθάηςκ απυ ημ νεφια δζαπκμήξ. Σα είδδ πμο δεκ ιπμνμφκ κα απμηθείζμοκ ημ 98% ηςκ αθάηςκ απυ ημ νεφια δζαπκμήξ (π.π ημ ηνζεάνζ) πνέπεζ κα είκαζ ζηακά κα δζαιενζζιαημπμζμφκ ηα άθαηα ζηα ποιμηυπζα, πνμζηαηεφμκηαξ έηζζ ημ ηοηυπθαζια απυ ηδκ ημλζηυηδηα ηςκ ζυκηςκ ηαζ ειπμδίγμκηαξ ηδκ ζοβηέκηνςζδ ημοξ ζημ ηοηηανζηυ ημίπςια βεβμκυξ πμο ιπμνεί κα πνμηαθέζεζ αθοδάηςζδ (Flowers and Yeo, 1986). ε ακηίεεηδ πενίπηςζδ δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ αθάηςκ ζηα βδναζυηενα θφθθα ζηαδζαηά εα αολδεεί, έςξ υημο πνμηαθέζεζ κέηνςζδ ηςκ ηοηηάνςκ. Απυ ηδκ ζηζβιή πμο ημ Na + ηαζ Cl - ιεηαθενεμφκ ζηα ποιμηυπζα ημο ηοηηάνμο, ημ K + ηαζ μζ μνβακζημί ιεηααμθίηεξ 31

35 πνέπεζ κα ζοζζςνεοημφκ ζημ ηοηυπθαζια ηαζ ζηα μνβακίδζα ημο ηοηηάνμο βζα κα ελζζμννμπδεεί δ ςζιςηζηή πίεζδ ηςκ ποιμημπίςκ Μνξηαθνί θαη θπηηαξηθνί κεραληζκνί Η ορδθή αθάηυηδηα πνμηαθεί ςζιςηζηή ηαηαπυκδζδ ηαζ ζμκηζηή ακζζμννμπία, πμο ιε ηδκ ζεζνά ημοξ αζημφκ δεοηενμβεκείξ επζδνάζεζξ (Hasegawa et al., 2000b; Zhu, 2000). Η ααζζηή ακηίδναζδ ηςκ θοηχκ ζηδκ αθαηυηδηα είκαζ είηε κα ειπμδίγμοκ ηδκ απμννυθδζδ αθάηςκ είηε κα ακέπμκηαζ ηδκ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ. Αοηυ ζδιαίκεζ υηζ είηε παναιέκμοκ ζε θακεάκμοζα ηαηάζηαζδ ηαηά ηδκ δζάνηεζα ηδξ αθαηυηδηαξ είηε πνμζανιυγμκηαζ βζα κα ακέπμκηαζ ημ αθαημφπμ πενζαάθθμκ. Η θεζημονβία ηςκ ιδπακζζιχκ ακημπήξ είκαζ κα ιεζχζμοκ ηδκ ςζιςηζηή ηαηαπυκδζδ ή ηδκ ζμκηζηή ακζζμννμπία ή κα ιεηνζάζμοκ ηζξ επαηυθμοεεξ δεοηενμβεκείξ επζδνάζεζξ πμο πνμηαθμφκηαζ απυ αοηέξ ηζξ ηαηαπμκήζεζξ. Σμ πδιζηυ δοκαιζηυ ημο αθαημφπμο δζαθφιαημξ ανπζηά πνμηαθεί δζαηαναπή ημο οδαηζημφ δοκαιζημφ ιεηαλφ ημο απμπθάζηδ ηαζ ημο ζοιπθάζηδ ιεζχκμκηαξ ηδ ζπανβή, πμο ακ είκαζ ζδιακηζηή μδδβεί ζε ιείςζδ ηδξ αφλδζδξ (Bohnert et al., 2005). Η ηοηηανζηή αθοδάηςζδ λεηζκάεζ υηακ δ δζαθμνά οδαηζημφ δοκαιζημφ είκαζ ιεβαθφηενδ απυ υηζ ιπμνεί κα ακηζζηαειζζηεί απυ ηδκ απχθεζα ζπανβήξ (Taiz and Zeiger, 1998). Η ηοηηανζηή απυηνζζδ ζηδκ ιείςζδ ηδξ ζπανβήξ ηαθείηαζ ςζιςηζηή πνμζανιμβή. Η ςζιςηζηή πνμζανιμβή ζηα ηφηηανα ηαζ μνβακίδζα ημο ηοηηάνμο επζηοβπάκεηαζ ιε ηδκ ζοζζχνεοζδ ζοιααηχκ ςζιςθοηχκ ηαζ ςζιςπνμζηαηεοηζηχκ εκχζεςκ (Bohnert et al., 2005; Bohnert and Jensen, 1996). Ωζηυζμ, ημ Na + ηαζ Cl - είκαζ αδάπακμζ ςζιςθφηεξ ζηα αθυθοηα βζα ςζιςηζηή πνμζανιμβή ηαζ βζα αοηυ ημκ θυβμ δζαιενζζιαημπμζμφκηαζ ζηα ποιμηυπζα βζα κα ιεζχζμοκ ηδκ ηοηηανμημλζηυηδηα (Niu et al., 2005), ημ μπμίμ πνμτπμεέηεζ ζοκεπή δδιζμονβία κέςκ ποιμημπίςκ, δδθαδή ζοκεπή αφλδζδ. Η δζαιενζζιαημπμίδζδ ιπμνεί κα επζηεοπεεί ιε εθάπζζηδ ή ηαευθμο έηεεζδ ημο ηοημπθάζιαημξ ζηα ημλζηά ζυκηα. Σμ ιεβαθφηενμ ιένμξ ηδξ ιεηαθμνάξ ημο Na + ηαζ Cl - απυ ημκ απμπθάζηδ ζημ ποιμηυπζμ ζοιααίκεζ ιε ηα ζοζηήιαηα ιεηαθμνάξ ζυκηςκ πμο εκημπίγμκηαζ ζημ πθαζιαθήιια ηαζ ζημκ ημκμπθάζηδ. Πνμθακχξ απαζηείηαζ ηαθά ζοκημκζζιέκδ νφειζζδ ηςκ ζοζηδιάηςκ ιεηαθμνάξ ζυκηςκ χζηε κα εθέβπεηαζ δ ηαεανή εζζνμή Na + ηαζ Cl - δζαιέζμο ημο πθαζιαθήιιαημξ ηαζ δ δζαιενζζιαημπμίδζδ ημοξ ζηα ποιμηυπζα. ηα βθοηυθοηα δ ςζιςηζηή πνμζανιμβή επζηοβπάκεηαζ ιε ζφκεεζδ μνβακζηχκ εκχζεςκ υπςξ πνμθίκδ, αεηαΐκδ ηθπ. 32

36 Χζκσιχηεο θαη Χζκσπξνζηάηεο Όπςξ έπεζ ήδδ ακαθενεεί δ ακεεηηζηυηδηα ζηα άθαηα πνμτπμεέηεζ ζοζζχνεοζδ ζοιααηχκ ιεηααμθζηχκ, ζημ ηοηυπθαζια ηαζ ζηα μνβακίδζα ημο ηοηηάνμο υπμο αοηά θεζημονβμφκ, βζα ηδκ ςζιςηζηή πνμζανιμβή ηαζ ςζιςπνμζηαζία (Rhodes and Hanson, 1993). Κάπμζμζ ζοιααημί ςζιςθφηεξ είκαζ απαναίηδηα ζυκηα, υπςξ ημ Κ +, αθθά δ πθεζμρδθία είκαζ μνβακζημί ιεηααμθίηεξ. Η ζοζζχνεοζδ ζοιααηχκ ιεηααμθζηχκ ςξ απυηνζζδ ζηδκ ςζιςηζηή ηαηαπυκδζδ είκαζ ζοκήεδξ ζημοξ μνβακζζιμφξ απυ ημοξ ηαηχηενμοξ ηαζ ηα (ααηηήνζα), ςξ ηα ακχηενμοξ (θοηά ηαζ γχα). Ωζηυζμ, μζ ιεηααμθίηεξ πμο ζοζζςνεφμκηαζ πμζηίθμοκ ιεηαλφ ηςκ θοηζηχκ εζδχκ. Η ηονζυηενδ ηαηδβμνία μνβακζηχκ ςζιςηζηχκ ιεηααμθζηχκ απανηίγεηαζ απυ ζάηπανα (θνμοηηυγδ, βθοηυγδ), ζαηπανμ-αθημυθεξ (βθοηενυθδ, ζμναζηυθδ ηαζ ιεεοθζςιέκδ ζκμζζηυθδ) ηαζ πμθοζαηπανίηεξ (ηνεπαθυγδ, ναθζκυγδ ηαζ θνμοηηάκεξ) (Bohnert and Jensen, 1996). Άθθμζ ζδιακηζημί ςζιςθφηεξ είκαζ ηεηανημηαβή πανάβςβα αιζκμλέςκ (πνμθίκδ, βθοηίκδ αεηαΐκδ, α-αθακίκδ αεηαΐκδ, πνμθίκδαεηαΐκδ), ηνζημηαβείξ αιίκεξ (1,4,5,6-ηεηνατδνμ-2-ιεεοθ-4-ηαναμλφθ πονζδίκδ), ηαζ εκχζεζξ ζμοθθμκίμο (δζιέεοθμ πνμπζμκζηυ ζμοθθυκζμ) (Nuccio et al., 1999). Ανηεημί μνβακζημί ςζιςθφηεξ εεςνμφκηαζ υηζ θεζημονβμφκ ςξ ςζιςπνμζηάηεξ, επεζδή ηα επίπεδα ζοζζχνεοζήξ ημοξ είκαζ ακεπανηή βζα κα ζοιαάθθμοκ ζηδκ ςζιςηζηή πνμζανιμβή. Η βθοηίκδ-αεηαΐκδ ζοκηδνεί ηδκ δμιή ηςκ εοθαημεζδχκ ηαζ ημο πθαζιαθήιιαημξ ιεηά απυ έηεεζδ ζε αθαημφπα δζαθφιαηα, ρφπμξ ή ορδθέξ εενιμηναζίεξ (Rhodes and Hanson, 1993) ηαζ πανειπμδίγεζ ηδκ ιείςζδ ηδξ δνάζδξ ηδξ Rubisco απυ ηδκ αθαηυηδηα ή ηδκ απμζηαεενμπμίδζδ ημο PSII. Δπζπθέμκ, ιζα άθθδ αζμπδιζηή θεζημονβία ηςκ ςζιςπνμζηαηχκ υπςξ δ ζμναζηυθδ, ιακκζηυθδ ηαζ πνμθίκδ είκαζ δ απεκενβμπμίδζδ ηςκ ROS (Bohnert and Jensen, 1996). Κμζκυ παναηηδνζζηζηυ ηςκ ζοιααηχκ ιεηααμθζηχκ είκαζ υηζ ιπμνμφκ κα ζοζζςνεοημφκ ζε ορδθά επίπεδα πςνίξ κα δζαηανάλμοκ ηδκ εκδμηοηηανζηή αζμπδιεία (Bohnert and Jensen, 1996). Δπίζδξ, έπμοκ ηδκ δοκαηυηδηα κα ιεζχκμοκ ηδκ ανκδηζηή επίδναζδ ημο NaCl υζμ αθμνά ηδκ εκενβυηδηα ηςκ εκγφιςκ. Η ζφκεεζδ ηςκ ζοιααηχκ ςζιςθοηχκ ζοπκά επζηοβπάκεηαζ ιε αθθαβή ηδξ πμνείαξ αζμζφκεεζδξ ηςκ ααζζηχκ εκδζάιεζςκ ιεηααμθζηχκ ζε αζμπδιζηέξ ακηζδνάζεζξ. οπκά, δ ηαηαπυκδζδ πνμάβεζ ηδκ αθθαβή πμνείαξ ημο ιεηααμθζζιμφ. Έηζζ, ηα ακχηενα θοηά ζοκεέημοκ βθοηίκδ-αεηαΐκδ απυ πμθίκδ ιέζς δφμ ακηζδνάζεςκ μζ μπμίεξ ηαηαθφμκηαζ ηαηά ζεζνά απυ ηα έκγοια ιμκμ-μλοβεκάζδ 33

37 πμθίκδξ (CMO) ηαζ αεηαΐκδ-δετδνμβμκάζδ αθδεΰδδξ (BADH) (Rhodes and Hanson, 1993) Οκνηφζηαζε ηφλησλ Οιμζυζηαζδ ζυκηςκ είκαζ μζ δζαδζηαζίεξ πμο ειπθέημκηαζ βζα ηδκ δζαηήνδζδ ηδξ ζζμννμπίαξ ηςκ ζυκηςκ ζε έκακ μνβακζζιυ ή ηφηηανμ. Σμ NaCl είκαζ ημ ζοκδεέζηενμ άθαξ πμο πνμηαθεί ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ. Έηζζ ηα ζοζηήιαηα ιεηαθμνάξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ αλζμπμίδζδ ημο Na + ςξ ςζιςηζημφ ιεηααμθίηδ έπμοκ ιεθεηδεεί εηηεκχξ (Hasegawa et al., 2000b; Niu et al., 2005). Δνεοκδηζηέξ ενβαζίεξ ηςκ ηεθεοηαίςκ 30 πνυκςκ έδεζλακ υηζ δ εκδμηοηηανζηή μιμζυζηαζδ Na + ηαζ δ ακημπή ζηδκ αθαηυηδηα νοειίγμκηαζ απυ ημ Ca +2 ηαζ υηζ δ ορδθή ζοβηέκηνςζδ Na + ζημ έδαθμξ επδνεάγεζ ανκδηζηά ηδκ πνυζθδρδ Κ + (Rains and Epstein, 1967). Σμ Na + ακηαβςκίγεηαζ ημ Κ + ζηδκ απμννυθδζή ημο ιέζς θμνέςκ (carriers) υηακ δ ελςηενζηή ζοβηέκηνςζδ Na + ζε αθαημφπα πενζαάθθμκηα είκαζ ορδθυηενδ απυ ηδκ ελςηενζηή ζοβηέκηνςζδ ημο Κ +. Σμ Ca +2 πνμάβεζ ηδκ επζθεηηζηή ζοζζχνεοζδ ημο Κ + ζημ ηφηηανμ έκακηζ ημο Na + (Maathuis et al., 1996; Rains and Epstein, 1967). Δπίζδξ, κευηενεξ ιεθέηεξ πνμζδζυνζζακ ιμνζαηέξ μκηυηδηεξ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδ μιμζυζηαζδ Na + ηαζ K + ηαζ ηαοηυπνμκα πνμζδζυνζζακ ηδκ θεζημονβία ημο Ca +2 ζηδκ νφειζζδ ηςκ πνμακαθενεέκηςκ ζοζηδιάηςκ ιεηαθμνάξ. Πνυζθαηα, ημ SOS ιμκμπάηζ ζδιαημδυηδζδξ ηαηαπυκδζδξ (stress signaling pathway) ανέεδηε υηζ είκαζ νοειζζηήξ ηδξ ζμκηζηήξ μιμζυζηαζδξ ημο θοημφ ηαζ ηδξ ακημπήξ ημο ζηδκ αθαηυηδηα (Hasegawa et al., 2000b; Sanders, 2000). Αοηυ ημ ιμκμπάηζ ζδιαηυδμηδζδξ ιμζάγεζ θεζημονβζηά ιε ηδκ ηθζιαηςηή ακηίδναζδ ηαθζζκεονίκδξ πμο εθέβπεζ ηδκ εζζνμή ηαζ εηνμή Na + δζαιέζμο ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ (Bressan et al., 1998). Η έηθναζδ ιζαξ εκενβμφ ιμνθήξ ηαθζζκεονίκδξ ζε γοιμιφηδηεξ ή θοηά αεθηζχκεζ ηδκ ακεεηηζηυηδηα ζηδκ αθαηυηδηα ηαζ δείπκεζ ηδκ θεζημονβζηή μιμζυηδηα ιεηαλφ ηδξ ηαθζζκεονίκδξ ηαζ ηςκ ιμκμπαηζχκ SOS (Mendoza et al., 1996; Pardo et al., 1998). Οζ Jian-Kang Zhu et al. (2000) ακαβκχνζζακ ηνεζξ βεκεηζηά ζοκδεδειέκμοξ ηυπμοξ (loci) ζηδκ ανααίδμρδ (SOS 1, SOS 2 ηαζ SOS 3 ), μζ μπμίμζ είκαζ ιένδ εκυξ ιμκμπαηζμφ ζδιαημδυηδζδξ ηαηαπυκδζδξ πμο εθέβπεζ ηδκ ζμκηζηή μιμζυζηαζδ ηαζ ηδκ ακημπή ζηδκ αθαηυηδηα (Hasegawa et al., 2000a; Sanders, 2000). Γεκεηζηή ακάθοζδ ηδξ εοαζζεδζίαξ Na + /Li + απέδεζλε υηζ ημ sos1 είκαζ επζζηαηζηυ ζημ sos2 ηαζ sos3 (Zhu, 2000). Αοηά ηα sos ιεηαθθάβιαηα επζδεζηκφμοκ θαζκυηοπμ ακεπάνηεζαξ Κ + ζε ενεπηζηυ ιέζμ πμο πενζείπε K + ηαζ Ca +2, εκχ ζηα ιεηαθθάβιαηα sos2 ηαζ sos3 δ 34

38 ακεπάνηεζα Na + ηαζ K + ηαηαζηέθθεηαζ ιε ελςηενζηή πμνήβδζδ Ca +2 (Zhu et al., 1998). Σμ sos1, ζε ακηίεεζδ ιε ηα sos2 ηαζ sos3, ειθακίγεζ οπενςζιςηζηή εοαζζεδζία. Έηζζ, αοηά ηα απμηεθέζιαηα απμηεθμφκ έκδεζλδ υηζ ημ SOS ιμκμπάηζ ζδιαημδυηδζδξ νοειίγεζ ηδκ μιμζυζηαζδ Na + ηαζ K + ηαζ εκενβμπμζείηαζ ιε ημ Ca +2 (Hussain and Majeed, 2010). Σμ SOS 3 ηςδζημπμζεί ιζα πνςηεΐκδ πμο πνμζδέκεηαζ ζημ Ca +2 ηαζ έπεζ πανυιμζα αθθδθμοπία αιζκμλέςκ ιε ηδκ νοειζζηζηή Β οπμιμκάδα ηδξ ηαθζζκεονίκδξ ηαζ ημοξ κεονςκζημφξ αζζεδηήνεξ ημο Ca +2 (Ishitani et al., 2000; Liu and Zhu, 1998). Η δνάζδ ημο SOS 3, εκηυξ ημο θοημφ, ςξ πανάβμκηαξ ακεεηηζηυηδηαξ ζηδκ αθαηυηδηα (Ishitani et al., 2000), δ αθθδθεπίδναζδ ημο SOS 3 ιε ηδκ SOS 2 ηζκάζδ (Liu et al., 2000) ηαζ δ εκενβμπμίδζδ ημο SOS 2 ελανηχκηαζ απυ ημ Ca +2 (Halfter et al., 2000). H SOS 2 ηζκάζδ ηδξ ζενίκδξ/ενεμκίκδξ (446 αιζκμλέα) έπεζ ιζα Ν-αηνμηεθζηή ηαηαθοηζηή πενζμπή ιε 267 αιζκμλέα δ μπμία έπεζ πανυιμζα αημθμοεία αιζκμλέςκ ιε ηδκ SF1 ηζκάζδ ημο γοιμιφηδηα ηαζ ηδκ ΑΜΡΚ (AMPεκενβμπμζμφιεκδ ηζκάζδ) ηςκ εδθαζηζηχκ (Liu et al., 2000; Zhu, 2000). Η δνάζδ ηδξ ηζκάζδξ ημο SOS 2 είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ ακεεηηζηυηδηα ζηδκ αθαηυηδηα (Zhu, 2000). Η SOS 2 C-αηνμηεθζηή νοειζζηζηή πενζμπή αθθδθεπζδνά ιε ηδκ πενζμπή ηδξ ηζκάζδξ ηαζ πνμηαθεί αοημ-ακαζημθή. Μζα μιάδα 21 αιζκμλέςκ ζηδκ νοειζζηζηή πενζμπή ημο SOS 2 είκαζ δ εέζδ υπμο ημ SOS 3 αθθδθεπζδνά ιε ηδκ ηζκάζδ ηαζ είκαζ δ πενζμπή αοημ-ακαζημθέαξ ηδξ ηζκάζδξ (Guo et al., 2001). Η πνυζδεζδ ημο SOS 3 ζε αοηή ηδ εέζδ πανειπμδίγεζ ηδκ αοημ-ακαζημθή ηδξ δνάζδξ ηδξ SOS 2 ηζκάζδξ. Απάθεζρδ ηδξ πενζμπήξ πμο είκαζ αοημ-ακαζημθέαξ έπεζ ςξ ζοκέπεζα ηδκ ζοκεπή εκενβμπμίδζδ ημο SOS 2, ακελάνηδηα ημο SOS 3. Μεηαλφ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ημο ιμκμπαηζμφ ζδιαημδυηδζδξ ηςκ SOS είκαζ ηα ζοζηήιαηα ιεηαθμνάξ πμο δζεκενβμφκ ηδκ ζμκηζηή μιμζυζηαζδ. Ο Na + /H + ακηζιεηαθμνέαξ SOS 1 πμο ανίζηεηαζ ζημ πθαζιαθήιια εθέβπεηαζ απυ ημ SOS ιμκμπάηζ ζε ιεηαβναθζηυ ηαζ ιεηα-ιεηαβναθζηυ επίπεδμ (Guo et al., 2001; Zhu, 2001) πζηήκαηα κεηαθνξάο ηφλησλ Οζ ακηθίεξ Η + ζημ πθαζιαθήιια ηαζ ζημκ ημκμπθάζηδ εκενβμπμζμφκ ηδκ ιεηαθμνά ηςκ ακαβηαίςκ ιεηααμθζηχκ βζα ηδκ δζαιενζζιαημπμίδζδ ηςκ ημλζηχκ βζα ημ ηφηηανμ ζυκηςκ εηηυξ ημο ηοημπθάζιαημξ (Maeshima, 2000; Maeshima, 2001; Morsomme and Boutry, 2000; Ratajczak, 2000). Η ακηθία Η + πμο ανίζηεηαζ ζημ πθαζιαθήιια είκαζ ιζα ιμνθή ΑΣΡάζδξ πμο είκαζ οπεφεοκδ βζα ημ ορδθυ ph ηαζ 35

39 ηδκ δζααάειζζδ ημο δθεηηνζημφ δοκαιζημφ ηαηά ιήημξ ηδξ ιειανάκδξ (Morsomme and Boutry, 2000). Η Η + -ΑΣΡάζδ ηαζ δ πονμθςζθαηάζδ ηςκ ποιμημπίςκ δζαιμνθχκμοκ ημ ph ηαζ ημ δοκαιζηυ ημο ημκμπθάζηδ (Drozdowicz and Rea, 2001; Maeshima, 2001). Η δναζηδνζυηδηα ηςκ Η + -ακηθζχκ αολάκεηαζ ιε ηδκ επίδναζδ ηδξ αθαηυηδηαξ πμο ηαοηυπνμκα ζπεηίγεηαζ ιε αφλδζδ ηδξ δναζηδνζυηδηαξ ημο ακηζιεηαθμνέα Na + /H + (Maeshima, 2001). Πνυζθαηεξ ιεθέηεξ επζαεααίςζακ ημκ νυθμ ηδξ Η + -ΑΣΡάζδξ ημο πθαζιαθήιιαημξ ςξ ηαεμνζζηζημφ πανάβμκηα ακεεηηζηυηδηαξ ζηδκ αθαηυηδηα ιε αάζδ ακαθφζεζξ ηςκ θαζκμηφπςκ πμο πνμήθεακ απυ διζ-οπενέπμοζα (semi dominant) ιεηάθθαλδ ημο aha4-1 (Vitart et al., 2001). Η ιεηάθθαλδ ζημ ΑΗΑ4, πμο εηθνάγεηαζ ηονίςξ ζηζξ νίγεξ, πνμηαθεί ιείςζδ ηδξ αφλδζδξ ηδξ νίγαξ ηαζ ηςκ αθαζηχκ (ζε ζπέζδ ιε ημκ ηακμκζηυ ηφπμ) ηςκ θοηχκ πμο ακαπηφζζμκηαζ ζε οπυζηνςια πμο πενζέπεζ 75mM NaCl. Σμ ιεζςιέκμ ιήημξ ηδξ νίγαξ ηςκ ηαηαπμκδιέκςκ απυ αθαηυηδηα aha4-1 θοηχκ μθείθεηαζ ζε ιείςζδ ηδξ επζιήηοκζδξ ηςκ ηοηηάνςκ. ε οπμζηνχιαηα ιε NaCl, ηα θφθθα ηςκ aha4-1 θοηχκ ζοζζςνεφμοκ ζδιακηζηά πενζζζυηενμ Νa + ηαζ θζβυηενμ K + απυ υηζ αοηά ημο ηακμκζημφ ηφπμο. Έηζζ θαίκεηαζ υηζ ημ ΑΗΑ4 δνα ζημκ έθεβπμ ηδξ νμήξ Νa + δζαιέζμο ηδξ εκδμδενιίδαξ (Vitart et al., 2001). Οζ Blumwald et al. (1987) οπμζηήνζλακ ηδκ φπανλδ ημο ακηζιεηαθμνέα Na + /H + ζηα ηοζηίδζα ημο ημκμπθάζηδ ηςκ ζαηπανυηεοηθςκ ααζζγυιεκμζ ζηδκ απυηνζζδ ζε Na + ηδξ ph-ελανηχιεκδξ ζαέζδξ ημο πμνημηαθυπνμοκ θεμνζζιμφ ηδξ αηνζδίκδξ (acridine orange fluorescence quenching). Έςξ ζήιενα πάκηςξ, δεκ οπάνπμοκ ιεθέηεξ πμο κα πενζθαιαάκμοκ απεοεείαξ ιέηνδζδ ηδξ απμννυθδζδξ ημο Na + ή επζαεααίςζδ αοηχκ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ιε δζαθμνεηζημφξ ακζπκεοηέξ. Δκ ημφημζξ, ηα έςξ ζήιενα απμηεθέζιαηα θαίκμκηαζ εομίςκα βζα ημ δφζημθμ ένβμ απμιυκςζδξ ηαζ ακαβκχνζζδξ ημο ιειανακζημφ ιεηαθμνέα ζυκηςκ. ε ηοηηανζηυ επίπεδμ, δ ζηαεενή ζοβηέκηνςζδ Na + δζαηδνείηαζ είηε ιε ημκ πμθφ απμηεθεζιαηζηυ απμηθεζζιυ ημο Na + ή ιε ηδκ απέηηνζζδ ηςκ εζςηενζηχκ απμεειάηςκ Na +. Κακέκα θοηυ δεκ απμηθείεζ εκηεθχξ ημ Na + ηαεχξ αηυιδ ηαζ ηα πζμ εοαίζεδηα θοηά έπμοκ ζδιακηζηά επίπεδα Na + ζηζξ νίγεξ ημοξ. Ακηίεεηα βνήβμνμζ νοειμί ακαπθήνςζδξ είκαζ ημζκμί ζηα βθοηυθοηα ηαζ αθυθοηα (Cheeseman, 1988). Η απμννυθδζδ ημο Na + είκαζ παεδηζηή υηακ δ ιεηαθμνά βίκεηαζ απυ ημ ιεβαθφηενμ πνμξ ημ ιζηνυηενμ δθεηηνμπδιζηυ δοκαιζηυ ηαζ είκαζ ακελάνηδηδ ηδξ εζζυδμο H + ή Κ +. Η θφζδ ηςκ ζοζηδιάηςκ ιεηαθμνάξ πμο ειπθέημκηαζ ζηδκ ηαηακμιή ηαζ δζαιενζζιαημπμίδζδ ημο Na + ζε επίπεδμ θοηζημφ μνβακζζιμφ είκαζ ζπεδυκ άβκςζηδ. 36

40 4. Διηά θαη αιαηφηεηα Η εθζά ηαθθζενβείηαζ ζοκήεςξ ζε πενζμπέξ πμο ακηζιεηςπίγμοκ πνυαθδια αθαηυηδηαξ είηε θυβς ηςκ λδνμεενιζηχκ ζοκεδηχκ πμο επζηναημφκ είηε θυβς ηδξ ζοκεπμφξ οπμαάειζζδξ ηδξ πμζυηδηαξ ημο κενμφ άνδεοζδξ. Ακ ηαζ δ εθζά εεςνείηαζ ιεηνίςξ ακεεηηζηή ζηδκ αθαηυηδηα, ζφιθςκα ιε ανηεηέξ ενεοκδηζηέξ ενβαζίεξ δ ακεεηηζηυηδηα ηδξ ελανηάηαζ απυ ημκ ηφπμ ημο άθαημξ ηαζ ημκ πνυκμ έηεεζδξ ζε αοηυ, εκχ είκαζ άιεζα ζοκδεδειέκδ ιε ηδκ πμζηζθία (Therios and Misopolinos, 1988; Bouaziz, 1990; Tattini et al., 1992, 1994; Benlloch et al., 1994; Marin et al., 1995; Gucci and Tattini, 1997; Chartzoulakis et al., 2002; Arag s et al., 2005; Chartzoulakis, 2005; Demiral, 2005). φιθςκα θμζπυκ ιε αοηέξ ηζξ ενβαζίεξ ςξ ακεεηηζηέξ εεςνμφκηαζ μζ πμζηζθίεξ: Μεβανίηζηδ, Λζακμθζά Κένηοναξ, Καθαιχκ, Κμενέζηδ, Frantoio, Arbequina, Picual, Lechin de Sevilla ηαζ Chemlali. Μεηνίςξ ακεεηηζηέξ είκαζ μζ πμζηζθίεξ: Αιθίζζδξ, Κμνςκέζηδ, Μαζημεζδήξ, Βαθακμθζά, Αδναιοηζκή, Coratina, Moraiolo ηαζ Maurino εκχ εοαίζεδηεξ είκαζ μζ πμζηζθίεξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ, Θνμοιπμθζά, Leccino, Nabal, Chetoui ηαζ Meski. Οζ ααζζηέξ θοζζμθμβζηέξ απμηνίζεζξ ηδξ εθζάξ ζηδκ αθαηυηδηα έπμοκ ιεθεηδεεί εηηεκχξ (Gucci and Tattini, 1997; Vigo et al., 2002; Chartzoulakis, 2005; Tattini et al., 2009; Therios, 2009). Αοημί μζ ιδπακζζιμί απυηνζζδξ ζηδκ ορδθή αθαηυηδηα ζπεηίγμκηαζ ηονίςξ ιε απμηθεζζιυ ηδξ ιεηαθμνάξ ηςκ αθάηςκ απυ ηδκ νίγα ζηα θφθθα (Heimler et al., 1995; Tattini and Traversi, 2009), ζοζζχνεοζδ ζοιααηχκ ιεηααμθζηχκ βζα ςζιςηζηή πνμζανιμβή (Tattini et al., 1996; Gucci et al., 1997), ιείςζδ ηδξ αθαζηζηήξ αφλδζδξ θυβς ηδξ ιεζςιέκδξ αφλδζδξ ηςκ θφθθςκ (Tabatabaei, 2006), παιδθυ νοειυ θςημζφκεεζδξ (Chartzoulakis et al., 2002; Loreto et al., 2003) ηαζ ιείςζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ Κ + ελαζηίαξ ημο ακηαβςκζζιμφ Κ + /Νa + (Therios and Karagiannidis, 1991). 5. θνπφο ηεο εξγαζίαο Οζ ααζμηζηέξ ηαηαπμκήζεζξ πνμηαθμφκηαζ ζηα θοηά απυ πενίζζεζα ή έθθεζρδ εκυξ ή πενζζζμηένςκ παναβυκηςκ ζημ θοζζηυ ή ημ πδιζηυ πενζαάθθμκ ηςκ θοηχκ. Οζ ακηζδνάζεζξ ηςκ θοηχκ ζε πενζαάθθμκ ηαηαπυκδζδξ, υπςξ δ έθθεζρδ κενμφ πμο ιπμνεί κα πνμηθδεεί απυ αθαηυηδηα, πενζθαιαάκμοκ νοειίζεζξ ζε θοζζμθμβζηυ, 37

41 ιεηααμθζηυ ηαζ βμκζδζςιαηζηυ επίπεδμ. Έηζζ πμθθέξ πνμζπάεεζεξ έπμοκ ηαηααθδεεί βζα ηδκ ααεφηενδ ηαηακυδζδ ηδξ απυηνζζδξ ηςκ θοηχκ ζε ααζμηζηέξ ηαηαπμκήζεζξ. Η εθζά είκαζ απυ μζημκμιζηήξ ηαζ δζαηνμθζηήξ άπμρδξ απυ ηζξ ζδιακηζηυηενεξ ηαζ πζμ εηηεηαιέκεξ ηαθθζένβεζεξ ηςκ πςνχκ ηδξ Μεζμβείμο. Η έθθεζρδ κενμφ ηαεχξ ηαζ δ πμζμηζηή ημο οπμαάειζζδ ελαζηίαξ ηδξ αφλδζδξ αθαηυηδηαξ δδιζμονβμφκ πνμαθήιαηα ζηδκ ηαθθζένβεζα ηδξ εθζάξ. Πανυθμ πμο ημ θοηυ ηδξ εθζάξ ιεθεηήεδηε εηηεκχξ ζε θοζζμθμβζηυ επίπεδμ υζμ αθμνά ηδκ ζοιπενζθμνά ημο ζε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ, ζε ιμνζαηυ επίπεδμ παναιέκεζ ζπεδυκ ακελενεφκδημ. Αοηυ μθείθεηαζ ζημ υηζ πανμοζζάγεζ δοζημθία ζηδκ βεκεηζηή ημο ιεηαπείνζζδ, δεκ έπεζ παναηηδνζζιέκα ιεηαθθάβιαηα, εθάπζζηα βμκίδζα ηδξ έπμοκ παναηηδνζζηεί ηαζ έπεζ ιεβάθδ δζάνηεζα γςήξ. ηδκ πανμφζα δζδαηημνζηή δζαηνζαή πνδζζιμπμζήεδηε ιζα βεςπμκζηή πνμζέββζζδ (agronomic approach) πμο ζοκδφαζε ορδθήξ-απυδμζδξ ακαθφζεζξ βμκζδζςιαηζηήξ ζηδκ εθζά ιε πεζναιαηζηυ ζπεδζαζιυ πμο πνμζμιμίαζε ηζξ θοζζηέξ ζοκεήηεξ ηαθθζένβεζάξ ηδξ ιε ζημπυ κα ιεθεηδεεί δ ιμνζαηή αάζδ ηδξ απυηνζζδξ ηδξ εθζάξ ζηδκ ηαηαπυκδζδ απυ NaCl. Γζα ηδκ πεζναιαηζηή δζαδζηαζία επζθέπεδηακ ηαζ οπμαθήεδηακ βζα 90 διένεξ ζε ηαηαπυκδζδ NaCl ηαζ αημθμφεςξ βζα 45 διένεξ επακαθμνά ημοξ ζε ηακμκζηέξ ζοκεήηεξ ηαθθζένβεζαξ, ιμκμεηή νζγμαμθδιέκα ιμζπεφιαηα εθζάξ ηδξ ακεεηηζηήξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ ηαζ ηδξ εοαίζεδηδξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. ε δζάθμνεξ πνμκζηέξ ζηζβιέξ έβζκε ζοθθμβή θφθθςκ ηαζ νίγαξ βζα απμιυκςζδ RNA ηαζ πδιζηή ακάθοζδ ημοξ. ηδκ ζοκέπεζα δ ορδθήξ απυδμζδξ βμκζδζςιαηζηή ακάθοζδ έβζκε ιε ηδκ πνήζδ ηςκ ηεπκμθμβζχκ ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ (microarray) ηαζ ηδξ ιεβάθδξηθίιαηαξ αθθδθμφπδζδξ RNA (454-Pyrosequencing technology). 38

42 Βηβιηνγξαθία Arag s, R., Puy, A., Royo, A. and Espada, J.L. (2005) Three-year field response of young olive trees (Olea europaea L., cv. Arbequina ) to soil salinity: trunk growth and leaf ion accumulation. Plant and Soil 271, Ashraf M. (2004) Some important physiological selection criteria for salt tolerance in plants. Flora 199: Ashraf M. and Shahbaz M. (2003) Assessment of genotypic variation in salt tolerance of early CIMMYT hexaploid wheat germplasm using photosynthetic capacity and water relations as selection criteria. Photosynthetica 41: Barbour M.M., Warren C.R., Farquhar G.D., Forrester G. and Brown, H. (2010) Variability in mesophyll conductance between barley genotypes, and effects on transpiration efficiency and carbon isotope discrimination. Plant, Cell and Environment 33: Benlloch, M., Marín, L. and Fernández-Escobar, R. (1994) Salt tolerance of various olive varieties. Acta Horticulturae 356: Blumwald E., Poole, R.J. (1987) Salt tolerance in suspension-cultures of sugar-beet - induction of Na + /H + antiport activity at the tonoplast by growth in salt. Plant Physiology 83(4): Bohnert H.J., Jensen R.G. (1996) Strategies for engineering water stress tolerance in plants. Trends in Biotechnology 14, Bohnert H.J., Nelson D.E. and Jensen R.G. (2005) Adaptations to environmental stresses. Plant Cell, 7: Bongi, G. and Loreto, F. (1989) Gas-exchange properties of salt-stressed olive (Olea europea L) leaves. Plant Physiology 90, Booth W.A. and Beardall J. (1991) Effect of salinity on inorganic carbon utilization and carbonic anhydrase activity in the halotolerant algae Dunaliella salina (Chlorophyta). Phycologia 30: Bouaziz, A. (1990) Behavior of some olive varieties irrigated with brackish water and grown intensively in the central part of Tunisia. Acta Horticulturae 286, Bowler C. and Fluhr R. (2000) The role of calcium and activated oxygen as signals for controlling cross-tolerance. Trends in Plant Science 5:

43 Bressan R.A., Hasegawa P.M. and Pardo J.M. (1998) Plants use calcium to resolve salt stress. Trends in Plant Science 3: Brugnoli E. and Bjorkman O. (1992) Growth of cotton under continuous salinity stress: influence on allocation pattern, stomatal and non stomatal components and dissipation of excess light energy. Planta 187: Carden D.E., Walker D.J., Flowers T.J. and Miller AJ (2003) Single-cell measurements of the contributions of cytosolic Na + and K + to salt tolerance. Plant Physiology 131: Chartzoulakis K., Loupassaki M., Bertaki M. and Androulakis I. (2002) Effects of NaCl salinity on growth, ion content and CO 2 assimilation rate of six olive cultivars. Scientia Horticulturae 96, Chartzoulakis K.S. (2005) Salinity and olive: growth, salt tolerance, photosynthesis and yield. Agricultural Water Management 78, Chaves M. M., Flexas J. and Pinheiro C. (2009) Photosynthesis under drought and salt stress: Regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany 103, Chaves M.M., Costa M.J. and Saibo N.M. (2011). Recent advances in photosynthesis under drought and salinity. Advances in Botanical Research 57: Cheeseman J.M. (1988) Mechanisms of Salinity Tolerance in Plants. Plant Physiology 87: Churin Y., Adam E., Kozma-Bognar L., Nagy F. and Borner T. (2003) Characterization of two Myb-like transcription factors binding to CAB promoters in wheat and barley. Plant Molecular Biology 52: Demiral M.A. (2005) Comparative response of two olive (Olea europaea L.) cultivars to salinity. Turkish Journal of Agriculture and Forestry 29: Dodd I.C. (2005) Root-to-shoot signalling: assessing the roles of 'up' in the up and down world of long-distance signalling in planta. Plant and Soil 274: Drozdowicz Y.M. and Rea P.A. (2001) Vacuolar H(+ ) pyrophosphatases: from the evolutionary backwaters into the mainstream. Trends in Plant Science 6: Evans, J. R. and Loreto, F. (2000). Acquisition and diffusion of CO 2 in higher plant leaves. In Photosynthesis: Physiology and Metabolism, (R. C. Leegood, T. D. Sharkey and S. von Caemmerer, eds.), pp Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 40

44 Fabre N., Reiter I.M., Becuwe-Linka N., Genty B. and Rumeau D. (2007) Characterization and expression analysis of genes encoding alpha and beta carbonic anhydrases in Arabidopsis. Plant, Cell and Environment 30, FAO. (2008) FAO Land and Plant Nutrition Management Service. Flexas J., Bota J., Loreto F., Cornic G. and Sharkey T. D. (2004) Diffusive and metabolic limitations to photosynthesis under drought and salinity in C-3 plants. Plant Biology 6: Flexas J., Ribas-Carbo M., Diaz-Espejo A., Galmes J. and Medrano H. (2008) Mesophyll conductance to CO 2 : Current knowledge and future prospects. Plant, Cell and Environment 31: Flexas J., Baron M., Bota J., Ducruet J. M., Galle A., Galmes J., Jimenez M., Pou A., Ribas-Carbo M., Sajnani C., Tomas M. and Medrano H. (2009). Photosynthesis limitations during water stress acclimation and recovery in the drought-adapted Vitis hybrid Richter-110 (V-berlandieri x V-rupestris). Journal of Experimental Botany 60: Flowers T.J. and Yeo A.R. (1986) Ion relations of plants under drought and salinity. Australian Journal of Plant Physiology 13: Foyer C.H. and Noctor G. (2003) Redox sensing and signaling associated with reactive oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria. Plant Physiology, 119: Freitas J.B.S., Chagas R.M., Almeida I.M.R., Cavalcanti F.R. and Silveira J.A.G. (2001) Expression of physiological traits related to salt tolerance in two contrasting cowpea cultivars. Documentos Embrapa MeioNorte 56: Fricke W. (2004) Rapid and tissue-specific accumulation of solutes in the growth zone of barley leaves in response to salinity. Planta 219: Gadallah M.A.A. (2000) Effects of acid mist and ascorbic acid treatment on the growth, stability of leaf membranes, chlorophyll content and some mineral elements of Carthamus tinctorius, the safflower. Water, Air & Soil Pollution 118: Galle A., Florez-Sarasa I. D., Tomas M., Pou A., Medrano H., Ribas-Carbo M. and Flexas J. (2009) The role of mesophyll conductance during water stress and recovery in tobacco (Nicotiana sylvestris): Acclimation or limitation? Journal of Experimental Botany 60,

45 Galmes J., Pou A., Alsina M. M., Tomas M., Medrano H. and Flexas J. (2007a). Aquaporin expression in response to different water stress intensities and recovery in Richter-110 (Vitis sp.): Relationship with ecophysiological status. Planta 226: Galmes J., Medrano H. and Flexas J. (2007b) Photosynthetic limitations in response to water stress and recovery in Mediterranean plants with different growth forms. The New Phytologist 175: Garthwaite A.J., von Bothmer R. and Colmer T.D. (2005) Salt tolerance in wild Hordeum species is associated with restricted entry of Na+ and Cl into the shoots. Journal of Experimental Botany 56: Gillon J. S. and Yakir D. (2000) Naturally low carbonic anhydrase activity in C-4 and C-3 plants limits discrimination against (COO)-O-18 during photosynthesis. Plant, Cell and Environment 23: Girija C., Smith B.N. and Swamy P.M. (2002) Interactive effects of sodium chloride and calcium chloride on the accumulation of proline and glycinebetaine in peanut (Arachis hypogaea L.). Environmental and Experimental Botany 47:1-10. Gopa R. and Dube B.K. (2003) Influence of variable potassium on barley metabolism. Annals of Agricultural Research 24: Greenway H. and Munns R. (1980) Mechanisms of salt tolerance in nonhalophytes. Annual Review of Plant Physiology 31: Gucci R. and Tattini M. (1997) Salinity tolerance in olive. Horticultural Review 21: Gucci R., Lombardini L., and Tattini M. (1997) Analysis of leaf water relations in leaves of two olive (Olea europaea) cultivars differing in tolerance to salinity. Tree Physiology 17(1): Guo Y., Halfter U., Ishitani M. and Zhu J.K. (2001) Molecular characterization of functional domains in the protein kinase SOS 2 that is required for plant salt tolerance. Plant Cell 13(6): Gupta N.K., Meena S.K., Gupta S. And Khandelwal S.K. (2002) Gas exchange, membrane permeability, and ion uptake in two species of Indian jujube differing in salt tolerance. Photosynthetica 40: Halfter U., Ishitani M. and Zhu J.K. (2000) The Arabidopsis SOS2 protein kinase physically interacts with and is activated by the calcium binding protein SOS3. 42

46 Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 97: Halliwell B. and Gutteridge J.M.C. (1989) Free Radicals in Biology and Medicine, Clarendon Press. Hasegawa P.M., Bressan R.A. and Pardo J.M. (2000a) The dawn of plant salt to tolerance genetics. Trends in Plant Science 5: Hasegawa P.M., Bressan R.A., Zhu J.K. and Bohnert H.J. (2000b) Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 51: Heimler D., Tattini M., Ticci S., Coradeschi M.A. and Traversi M.L. (1995) Growth, ion accumulation, and lipid-composition of 2 olive genotypes under salinity. Journal of Plant Nutrition 18(8): Hu Y. and Schmidhalter U. (1998) Spatial distributions and net deposition rates of mineral elements in the elongating wheat (Triticum aestivum L.) leaf under saline soil conditions. Planta 204: Hu, H. H., Boisson-Dernier, A., Israelsson-Nordstrom, M., Bohmer, M., Xue, S. W., Ries, A., Godoski, J., Kuhn, J. M. and Schroeder, J. I. (2010a) Carbonic anhydrases are upstream regulators of CO 2 -controlled stomatal movements in guard cells. Nature Cell Biology 12: Hu, L. X., Wang, Z. L. and Huang, B. R. (2010b) Diffusion limitations and metabolic factors associated with inhibition and recovery of photosynthesis from drought stress in a C-3 perennial grass species. Physiologia Plantarum 139: Husain S., von Caemmerer S. and Munns R. (2004) Control of salt transport from roots to shoots of wheat in saline soil. Functional Plant Biology 31: Hussain K., Nisar M.F, Majeed A., Nawaz K., Bhatti K.H., Afghan S., Shahazad A., Zia-ul-Hussnian S. (2010) What molecular mechanism is adapted by plants during salt stress tolerance?. African Journal of Biotechnology 9(4): Ishitani M., Liu J., Halfter U., Kim C.S., Shi W., Zhu J.K. (2000) SOS3 function in plant salt tolerance requires N-myristoylation and calcium binding. Plant Cell 12: James R.A., Rivelli A.R., Munns R., von Caemmerer S. (2002) Factors affecting CO 2 assimilation, leaf injury and growth in salt-stressed durum wheat. Functional Plant Biology 29:

47 Jeschke W.D. (1984) K + -Na + exchange at cellular membranes, intracellular compartmentation of cations, and salt tolerance. In: Staples RC, ed. Salinity Tolerance in Plants: Strategies for Crop Improvement. New York, USA: Wiley, Jeschke W.D., Aslam Z. and Greenway H. (1986) Effects of NaCI on ion relations and carbohydrate status of roots and on osmotic regulation of roots and shoots of Atriplex amnicola. Plant, Cell & Environment 9: Kao W.Y., Tsai T.T., Shih C.N. (2003) Photosynthetic gas exchange and chlorophyll a fluorescence of three wild soybean species in response to NaCl treatments. Photosynthetica 41: Karimi G., Ghorbanli M., Heidari H., Khavarinejad R.A. and Assareh M.H. (2005) The effects of NaCl on growth, water relations, osmolytes and ion content in Kochia prostrate. Plant Biology 49: Khadri M., Tejera N.A. and Lluch C. (2007) Sodium chloride ABA interaction in two common bean (Phaseolus vulgaris) cultivars differing in salinity tolerance. Environmental and Experimental Botany 60: Kinraide T.B. (1998) Three mechanisms for the calcium alleviations of mineral toxicity. Plant Physiology 118: Kirst G.O. (1989) Salinity tolerance of eukaryotic marine algae. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 40: Lacerda C.F., Cambraia J., Cano M.A.O., Ruiz H.A. and Prisco J.T. (2003). Solute accumulation and distribution during shoot and leaf development in two sorghum genotypes under salt stress. Environmental and Experimental Botany 49: Larkindale J. and Knight M.R. (2002) Protection against heat stress-induced oxidative damage in Arabidopsis involves calcium, abscisic acid, ethylene, and salicylic acid. Plant Physiology 128: Lauchli A. (1984) Salt exclusion: an adaptation of legumes for crops and pastures under saline conditions. In Salinity Tolerance in Plants: Strategies for Crop Improvement, ed. RC Staples, pp New York:Wiley Lawlor D.W. and Tezara W. (2009) Causes of decreased photosynthetic rate and metabolic capacity in water-deficient leaf cells: A critical evaluation of mechanisms and integration of processes. Annals of Botany 103:

48 Layzell D.B., Pate J.S., Atkins C.A. and Canvin D.T. (1981) Partitioning of carbon and nitrogen and the nutrition of root and shoot apex in a nodulated legume. Plant Physiology 67: Lee J., He K., Stolc V., Lee H., Figueroa P., Gao Y., Tongprasit W., Zhao H., Lee I. and Deng X.W. (2007) Analysis of transcription factor HY5 genomic binding sites revealed its hierarchical role in light regulation of development. The Plant Cell 19: Leonhardt N., Kwak J.M., Robert N., Waner D., Leonhardt G. and Schroeder J.I. (2004) Microarray expression analyses of Arabidopsis guard cells and isolation of a recessive abscisic acid hypersensitive protein phosphatase 2C mutant. The Plant Cell 16: Liu J. and Zhu J.K. (1998) A calcium sensor homolog required for plant salt tolerance. Science 280: Liu J., Ishitani M., Halfter U., Kim C.S. and Zhu J.K. (2000) The Arabidopsis thaliana SOS2 gene encodes a protein kinase that is required for salt tolerance. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 97: Loreto F., Centritto M. and Chartzoulakis K. (2003) Photosynthetic limitations in olive cultivars with different sensitivity to salt stress. Plant and Cell Environment 26: Maathuis F.J.M., Verlin D., Smith F.A., Sanders D., Ferneáßndez J.A., Walker N.A. (1996) The physiological relevance of Na + -coupled K + -transport. Plant Physiology 112: Maeshima M. (2000) Vacuolar H(+)-pyrophosphatase. Biochimica et Biophysica Acta 1465: Maeshima M. (2001) Tonoplast transporters: Organization and function. Annual Review of Plant Physiology & Plant Molecular Biology 52: Marín L., Benlloch M. and Fernández-Escobar R. (1995) Screening of olive cultivars for salt tolerance. Scientia Horticulturae 64: Marschner H. (1986) Mineral Nutrition in Higher Plants. Acad. Press, London. pp Marschner H. (1995) Mineral nutrition of higher plants. 2nd ed. Acad. Pr., San Diego. Kindly p

49 Maxwell B.B., Andersson C.R., Poole D.S., Kay S.A. and Chory J. (2003) HY5, Circadian Clock-Associated 1, and a cis-element, DET1 dark response element, mediate DET1 regulation of chlorophyll a/b-binding protein 2 - expression. Plant Physiology 133: McCord J.M. (2000). The evolution of free radicals and oxidative stress. American Journal of Medicine 108: McCue K.F. and Hanson A.D. (1990) Salt inducible betaine aldehyde dehyrogenase from sugar beet: cdna cloning and expression. Trends in Biotechnology 8: Mendoza I., Quintero F.J., Bressan R.A., Hasegawa P.M. and Pardo J.M. (1996) Activated calcineurin confers high tolerance to ion stress and alters the budding pattern and cell morphology of yeast cells. The Journal of Biological Chemistry 271: Mittler R. (2002) Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science 7: Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M. and Breusegem F.V. (2004) Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science 9: Morales F., Abadía A., Gómez-Aparisi J. and Abadía J. (1992) Effect of combined NaCl and CaCl 2 salinity on photosynthetic parameters of barley grown in nutrient solution. Plant Physiology 86: Morsomme P., Boutry M. (2000) The plant plasma membrane H( + )-ATPase: structure, function and regulation. Biochimica et Biophysica Acta 1465:1-16. Munns R., Fisher D.B. and Tonnet M.L. (1986) Na + and C1 - transport in the phloem from leaves of NaCl-treated barley. Australian Journal of Plant Physiology 13: Munns R., Tonnet M.L., Shennan C. and Gardner P.A. (1988) Effect of high external NaCl concentrations on ion transport within the shoot of Lupinus albus. Plant, Cell & Environment 11: Munns R. (1993) Physiological processes limiting plant growth in saline soil: some dogmas and hypotheses. Plant, Cell & Environment 16: Munns R. and Cramer G.R. (1996) Is coordination of leaf and root growth mediated by abscisic acid? (Opinion) Plant and Soil 185: Munns R. (2002) Comparative physiology of salt and water stress. Plant, Cell & Environment 25:

50 Munns R. and James R.A. (2003) Screening methods for salt tolerance: a case study with tetraploid wheat. Plant and Soil 253: Munns R. (2005) Genes and salt tolerance: bringing them together. New Phytologist 167: Munns R. and Tester M. (2008) Mechanisms of salinity tolerance. Annual Review of Plant Biology 59: Muranaka S., Shimizu K. and Kato M. (2002) Ionic and osmotic effects of salinity on single leaf photosynthesis in two wheat cultivars with different drought tolerance. Photosynthetica 40: Murphy K.S.T. and Durako M.J. (2003) Physiological effects of short-term salinity changes on Ruppia maritima. Aquatic Botany 75: Nawaz K., Hussain K., Majeed A., Khan F., Afghan S. and Ali K. (2010). Fatality of salt stress to plants: Morphological, physiological and biochemical aspects. African Journal of Biotechnology 9(34): Niinemets U., Cescatti A., Rodeghiero M. and Tosens T. (2005) Leaf internal diffusion conductance limits photosynthesis more strongly in older leaves of Mediterranean evergreen broad-leaved species. Plant, Cell and Environment 28: Niinemets U., Diaz-Espejo A., Flexas J., Galmes J. and Warren C. R. (2009) Role of mesophyll diffusion conductance in constraining potential photosynthetic productivity in the field. Journal of Experimental Botany 60: Niu X., Bressan R.A., Hasegawa P.M. and Pardo J.M. (2005) Ion homeostasis in NaCl stress environments. Plant Physiology 109: Nuccio M.L., Rhodes D., McNeil S.D. and Hanson A.D. (1999) Metabolic engineering of plants for osmotic stress resistance. Current Opinions in Plant Biology 2: Pardo J.M., Reddy M.P., Yang S., Maggio A., Huh G.H., Matsumoto T., Coca M.A., Paino-D'Urazo M., Koiwa H., Yun D.J., Watad A.A., Bressan R.A. and Hasegawa P.M. (1998) Stress signaling through Ca 2+ /calmodulin-dependent protein phosphatase calcineurin mediates salt adaptation in plants. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 95: Parida A.K., Das A.B. and Mittra B. (2003) Effects of NaCl stress on the structure, pigment complex composition, and photosynthetic activity of mangrove Bruguiera parviflora chloroplasts. Photosynthetica 41:

51 Peeva V. and Cornic G. (2009). Leaf photosynthesis of Haberlea rhodopensis before and during drought. Environmental and Experimental Botany 65: Pitzschke A., Forzani C. and Hirt H. (2006) Reactive oxygen species signaling in plants. Antioxidants and Redox Signaling 8: Quan R.D., Hu S.J., Zhang Z.L., Zhang H.W., Zhang Z.J. and Huang R.F. (2010) Overexpression of an ERF transcription factor TSRF1 improves rice drought tolerance. Plant Biotechnology Journal 8: Rains D. and Epstein E. (1967) Sodium absorption by barley roots. Its mediation by mechanisms 2 of alkali cation transport. Plant Physiology 42: Ranjbarfordoei A., Samson R., Lemeur R., Damme P.V. (2002) Effects of osmotic drought stress induced by combination of NaCl and polyethylene glycol on leaf water status, photosynthetic gas exchange, and water use efficiency of Pistacia khinjuk and P. mutica. Photosynthetica 40: Ratajczak R. (2000) Structure, function and regulation of the plant vacuolar H( + )- translocating ATPase. Biochimica et Biophysica Acta 1465: Rawson H.M., Long M.J. and Munns R. (1988) Growth and development in NaCltreated plants. Australian Journal of Plant Physiology 15: Rengasamy P. (2002) Transient salinity and subsoil constraints to dryland farming in Australian sodic soils: an overview. Australian Journal of Experimental Agriculture 42: Rhodes D. and Hanson A.D. (1993) Quaternary ammonium and tertiary sulfonium compounds in higher plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 44: Rubinigg M., Wenisch J., Elzenga J.T.M. and Stulen I. (2004) NaCI salinity affects lateral root development in Plantago maritima. Functional Plant Biology 31: Sakamoto H., Maruyama K., Sakuma Y., Meshi T., Iwabuchi M., Shinozaki K. and Yamaguchi-Shinozaki K. (2004) Arabidopsis Cys2/His2-type zincfinger proteins function as transcription repressors under drought, cold, and high-salinity stress conditions. Plant Physiology 136: Sanders D. (2000) Plant biology: The salty tale of Arabidopsis. Current Biology 10: Sayed O.H. (2003) Chlorophyll fluorescence as a tool in cereal crop research. Photosynthetica 41:

52 Schaeffer H.J., Forstheoefel N.R. and Cushman J.C. (1995) Identification of enhancer and silencer regions involved in salt-responsive expression of Crassulacean acid metabolism (CAM) genes in the facultative halophyte Mesembryanthemum crystallinum. Plant Molecular Biology 28: Seki M., Narusaka M., Ishida J., Nanjo T., Fujita M., Oono Y., Kamiya A., Nakajima M., Enju A., Sakurai T., Satou M. Akiyama K. et al. (2002b). Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought, cold and highsalinity stresses using a full-length cdna microarray. The Plant Journal 31: Shalata A., Mittova V., Volokita M., Guy M. and Taj M. (2001) Response of cultivated tomato and its wild salt-tolerant relative Lycopersicon pennellii to saltdependent oxidative stress: the root antioxidative system. Plant Physiology 112: Sickler C.M., Edwards G.E., Kiirats O., Gao Z. and Loescher W. (2007) Response of mannitol producing Arabidopsis thaliana to abiotic stress. Functional Plant Biology 34: Soussi M., Santamaria M., Cana A., Lluch C. (2001) Effects of salinity on protein and lipopolysaccharide pattern in a salt-tolerant strain of Mesorhizobium ciceri. Journal of Applied Microbiology 90: Storey R., Walker R.R. (1999) Citrus and salinity. Scientia Horticulturae 78:39 81 Szabolcs I. (1989) Salt-Affected Soils. Boca Raton, FL: CRC Press Tabatabaei S.J. (2006) Effects of salinity and N on the growth, photosynthesis and N status of olive (Olea europaea L.) trees. Scientia Horticulturae 108: Taiz L. and Zeiger E. (1998) Plant Physiology. Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates, Inc. Tanksley S.D. and McCouch S.R. (1997) Seed banks and molecular maps: unlocking genetic potential from the wild. Science 277: Tattini M., Bertoni P. and Caselli S. (1992) Genotypic responses of olive plants to sodium chloride. Journal of Plant Nutrition 15: Tattini M., Gucci R., Romani A., Baldi A. and Everand J.D. (1996) Changes in nonstructural carbohydrates in olive (Olea europaea) leaves during root zone salinity stress. Physiologia Plantarum 98(1):

53 Tattini M., Traversi M.L. (2009) On the mechanism of salt tolerance in olive (Olea europaea L.) under low- or high-ca(2+) supply. Environmental and Experimental Botany 65(1): Tattini M., Traversi M.L., Castelli S., Biricolti S., Guidi L. and Massai R., (2009) Contrasting response mechanisms to root-zone salinity in three co-occurring Mediterranean woody evergreens: a physiological and biochemical study. Functional Plant Biology 36(6): Tester M. and Davenport R. (2003) Na + tolerance and Na + transport in higher plants. Annals of Botany 91: Therios I.N. and Misopolinos N.D. (1988) Genotypic response to sodium chloride salinity of four major olive cultivars (Olea europaea L.). Plant and Soil 106: Therios I. and Karagiannidis N. (1991) Effect of NaCl on growth and chemical composition of four olive cultivars. Scientific Annals, School of Agriculture, Aristotle University of Thessaloniki 28: Therios I. N. (2009) Olives. CABI, U.K. Torres M.A., Dangl J.L. (2005) Functions of the respiratory burst oxidase in biotic interactions, abiotic stress and development. Current Opinion in Plant Biology 8: Unno H., Maeda Y., Yamamoto S., Okamoto M. and Takenaga H. (2002) Relationships between salt tolerance and Ca 2+ retention among plant species. Japanese Journal of Soil Science & Plant Nutrition 73: Vigo C., Therios I., Patakas A., Karatassou A and Nastou A. (2002) Changes in photosynthetic parameters and nutrient distribution of olive plants (Olea europaea L.) cultivar Chondrolia Chalkidikis under NaCl, Na2SO4 and KCl salinities. Agrochimica 46: Vinocur B. and Altman A. (2005) Recent advances in engineering plant tolerance to abiotic stress: achievements and limitations. Current Opinion in Biotechnology 16: Vitart V., Baxter I., Doerner P. and Harper J.F. (2001) Evidence for a role in growth and salt resistance of a plasma membrane H + -ATPase in the root endodermis. Plant Journal 27:

54 Wang W.X., Vinocur B., Altaman A. (2003) Plant responses to drought, salinity and extreme temperatures: towards genetic engineering for stress tolerance. Planta 218:1-14. Warren C.R. and Adams M.A. (2006) Internal conductance does not scale with photosynthetic capacity: Implications for carbon isotope discrimination and the economics of water and nitrogen use in photosynthesis. Plant, Cell and Environment 29: Warren C.R. (2008a) Stand aside stomata, another actor deserves centre stage: the forgotten role of the internal conductance to CO2 transfer. Journal of Experimental Botany 59: Warren C.R. (2008b) Soil water deficits decrease the internal conductance to CO2 transfer but atmospheric water deficits do not. Journal of Experimental Botany 59: Wenxue W., Bilsborrow P.E., Hooley P., Fincham D.A., Lombi E. and Forster B.P. (2003) Salinity induced difference in growth, ion distribution and partitioning in barley between the cultivar Maythorpe and its derived mutant Golden Promise. Plant Soil 250: Wong C.E., Li Y., Labbe A., Guevara D., Nuin P., Whitty B., Diaz C., Golding G.B., Gray G.R., Weretilnyk E.A., Griffith M. and Moffatt B.A. (2006) Transcriptional profiling implicates novel interactions between abiotic stress and hormonal responses in Thellungiella, a close relative of Arabidopsis. Plant Physiology 140: Wyn Jones R.G. and Gorham J. (2002) Intra- and inter-cellular compartmentatioonf ions. In: Lauchli A, Liuttge U, eds. Salinity: Environment - Plants - Molecules. Dordrecht, the Netherlands: Kluwer, Yang Y.Z., Costa A., Leonhardt N., Siegel R.S. and Schroeder J.I. (2008) Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and its potential as a research tool. Plant Methods 4: Yu S., Zhang X., Guan Q., Takano T. and Liu S. (2007) Expression of a carbonic anhydrase gene is induced by environmental stresses in rice (Oryza sativa L.). Biotechnology Letters 29: Zhu J.K., Liu J. and Xiong L. (1998) Genetic analysis of salt tolerance in Arabidopsis: Evidence for a critical role to potassium nutrition. Plant Cell 10:

55 Zhu J.K. (2000) Genetic analysis of plant salt tolerance using Arabidopsis. Plant Physiology 124: Zhu J.K. (2001) Cell signaling under salt, water and cold stresses. Current Opinion in Plant Biology 4(5):

56 ΚΔΦΑΛΑΙΟ 2 Αλάιπζε γνληδηαθήο έθθξαζεο ηεο ειηάο ζε θαηαπφλεζε αιαηφηεηαο κε ηελ ρξήζε κηθξνζπζηνηρίαο Πεξίιεςε Η εθζά (Olea europaea L.) είκαζ απυ μζημκμιζηήξ ηαζ δζαηνμθζηήξ άπμρδξ είκαζ απυ ηζξ ζδιακηζηυηενεξ ηαζ πζμ εηηεηαιέκεξ ηαθθζένβεζεξ ηςκ πςνχκ ηδξ Μεζμβείμο. Kαθθζενβείηαζ ζοκήεςξ ζε πενζμπέξ πμο ακηζιεηςπίγμοκ πνυαθδια αθαηυηδηαξ είηε θυβς ηςκ λδνμεενιζηχκ ζοκεδηχκ πμο επζηναημφκ είηε θυβς ηδξ ζοκεπμφξ οπμαάειζζδξ ηδξ πμζυηδηαξ ημο κενμφ άνδεοζδξ (ζοβηέκηνςζδ άθαημξ), ηδκ εενζκή πενίμδμ. Πανυθμ πμο ημ δέκδνμ ηδξ εθζάξ έβζκε εηηεηαιέκα ημ ακηζηείιεκμ ένεοκαξ ζε θοζζμθμβζηυ ηαζ αζμπδιζηυ επίπεδμ βζα ηζξ ααζμηζηέξ ηαηαπμκήζεζξ ζε υθα ηα ζηάδζα ακάπηολδξ ημο θοημφ, ζε ιμνζαηυ επίπεδμ παναιέκεζ ζπεδυκ ακελενεφκδημ. Γζα αοηυ ημ θυβμ, ανπζηά ηαηαζηεοάζηδηε ιζα ιζηνμζοζημζπία απυ 1121 cdnas ζπμνυθοημο εθζάξ ( Κμνςκέζηδ ) δ μπμία πνδζζιμπμζήεδηε ζηδκ ιεθέηδ ηδξ ιμνζαηήξ αάζδξ ηδξ ακημπήξ δομ πμζηζθζχκ εθζάξ, ιζαξ ακεεηηζηήξ ( Καθαιχκ ) ηαζ ιζαξ εοαίζεδηδξ ( Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ), ζηδκ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl ηάης απυ θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ ακάπηολδξ ηςκ δεκδνοθθίςκ ηδκ πενίμδμ ημο ηαθμηαζνζμφ βζα 135 διένεξ. ηυπμξ ημο πεζνάιαημξ ήηακ δ πνμζμιμίςζδ πναβιαηζηχκ ζοκεδηχκ ακάπηολδξ ηςκ δεκδνοθθίςκ βζα ηδκ ακάθοζδ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ ηδξ εθζάξ ζε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ ιε ηδκ πνήζδ ιζηνμζοζημζπίαξ. Ανπζηά ιεθεηήεδηακ ηα cdna ιε δζαθμνμπμζδιέκδ έηθναζδ ηαηά ηδκ δζάνηεζα υθμο ημο πεζνάιαημξ ιε απμηέθεζια ημκ εκημπζζιυ 51 cdnas βζα ηδκ Καθαιχκ ηαζ ιυκμ έλζ βζα ηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. Αοηυ ήηακ ιζα ανπζηή έκδεζλδ υηζ μ ιδπακζζιυξ ακεεηηζηυηδηαξ ζε αθαηυηδηα είκαζ ειθακήξ ζε ιεηαβναθζηυ επίπεδμ. Έπεζηα ιε ηδκ εθανιμβή ημο αθβυνζειμο δομ-ηθάζεςκ ιδ ζογεοβιέκδ SAM (Significant Analysis of Microarrays) ακαθφεδηε λεπςνζζηά δ πενίμδμξ ηαηαπυκδζδξ απυ ηδκ πενίμδμ επακαθμνάξ ζε ηακμκζηέξ ζοκεήηεξ ηαζ εκημπίζηδηακ 209 cdnas πμο εηθνάγμκηαζ δζαθμνεηζηά ζηδκ Καθαιχκ ηαζ 36 ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. ηδκ ζοκέπεζα, πνμζδζμνίζηδηε δ πζεακή ζοιιεημπή ηςκ ζδιακηζηά δζαθμνμπμζδιέκςκ βμκζδίςκ ζε δίηηοα/ιμκμπάηζα ιεηαβναθζηήξ νφειζζδξ, ηαεχξ ηα 53

57 δίηηοα αοηά απμηεθμφκ ημκ αηνμβςκζαίμ θίεμ ηςκ αζμθμβζηχκ δζηηφςκ. Γζα ηδκ ακάθοζδ αοηή πνδζζιμπμζήεδηε μ αθβυνζειμξ ακαγήηδζδξ ιεηαβναθζηχκ θεζημονβζηχκ οπμιμκάδςκ LeMoNe ηαζ εκημπίζηδηακ επηά ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ ζηδκ Καθαιχκ ηαζ έλζ ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ πμο νοειίγμοκ εκκέα ηαζ 12 θεζημονβζηέξ οπμιμκάδεξ ακηίζημζπα. Η δδιζμονβία ηςκ νοειζζηζηχκ δζηηφςκ βμκζδίςκ ακέδεζλε ηδ ζδιαζία ζοβηεηνζιέκςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ζηδκ ακημπή ζε ζοκεήηεξ αθαηυηδηαξ 54

58 1. Δηζαγσγή Η εθζά (Οlea europaea L.) είκαζ έκα απυ ηα πζμ ζδιακηζηά ηαθθζενβμφιεκα δεκδνχδδ είδδ ζηδκ Μεζμβεζαηή γχκδ πμο υιςξ ηαηά ηδκ δζάνηεζα ημο ηαθμηαζνζμφ ανδεφεηαζ ιε παιδθήξ πμζυηδηαξ, ηονίςξ αθαημφπμ, κενυ. Η έκκμζα ηδξ ακμπήξ ζηδκ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ ηςκ πενζζζμηένςκ απυ ηα Μεζμβεζαηά αεζεαθή ζηθδνυθοθθα, υπςξ δ εθζά, ακαθένεηαζ ηονίςξ ζηδκ ζηακυηδηα ημο θοημφ κα επζαζχζεζ πανά ζηδ ιείςζδ ημο νοειμφ αφλδζδξ (Munns, 2002; Tattini et al., 2002; Munns, 2005; Tattini and Traversi, 2009). Ωζηυζμ, ημ αθαημφπμ κενυ επδνεάγεζ ανκδηζηά ηδκ αθαζηζηή αφλδζδ ηδξ εθζάξ ελαζηίαξ ηδξ ιεζςιέκδξ θοθθζηήξ αφλδζδξ (Tattini et al., 1992; Klein et al., 1994; Tabataei, 2006), πνμηαθεί ιμνθμθμβζηέξ αθθαβέξ ζηα θφθθα (Therios, 2009) ηαζ ιεζχκεζ ηδκ παναβςβζηυηδηα (Cresti et al., 1994). Δπζπθέμκ, μζ ιδπακζζιμί απυηνζζδξ ζηδκ ορδθή αθαηυηδηα ζπεηίγμκηαζ ηονίςξ ιε απμηθεζζιυ ηςκ αθάηςκ απυ ηα θφθθα (Heimler et al., 1995; Tattini and Traversi, 2009) ηαζ ζοβηέκηνςζδ ζοιααηχκ ιεηααμθζηχκ βζα ςζιςνφειζζδ (Tattini et al., 1996; Gucci et al., 1997), ιείςζδ ημο νοειμφ θςημζφκεεζδξ (Chartzoulakis et al., 2002; Loreto et al., 2003) ηαζ εθάηηςζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ Κ + ελαζηίαξ ημο ακηαβςκζζιμφ Κ + - Na + ιε απμηέθεζια κα ελαζεεκεί δ θεζημονβία K + ζηα ηαηαπμκδιέκα απυ αθαηυηδηα θοηά (Therios and Karagiannidis, 1991). Η εθζά είκαζ ιεηνίςξ ακεεηηζηή ζηδκ αθαηυηδηα (NaCl) (Rugini and Fedeli, 1990; Therios 2009). Ωζηυζμ, θαιαάκμκηαξ οπυρδ ηδκ ιεβάθδ παναθθαηηζηυηδηα ημο βεκεηζημφ οθζημφ ηδξ εθζάξ, εκημπίγμκηαζ βμκυηοπμζ πμο δζαθένμοκ ζημκ ααειυ ακμπήξ ζηα άθαηα. Οζ ακεεηηζημί βμκυηοπμζ δζαηνίκμκηαζ απυ ιεβαθφηενδ ζηακυηδηα απμηθεζζιμφ ηςκ ημλζηχκ ζυκηςκ ηαζ εθέβπμο ηδξ εζζαβςβήξ αθάηςκ ζημκ αθαζηυ (Gucci and Tattini, 1997), ιε απμηέθεζια κα πενζμνίγμοκ ηδκ ζοζζχνεοζδ Na + ηαζ Cl - ζηα εκενβά ακαπηοζζυιεκα θφθθα ηαζ αθαζημφξ (Melgar et al., 2009). Αοηή δ ζηναηδβζηή ειπμδίγεζ ηονίςξ ηδκ ιεηαηίκδζδ ηςκ αθάηςκ εκηυξ ημο θοημφ πανά ηδκ απμννυθδζδ ημοξ απυ ημ θοηυ (Benlloch et al., 1991; Tattini et al., 1995; Demiral, 2005). Μζα ημζκή ζηναηδβζηή πμο αημθμοεείηαζ βζα ηδκ ακαβκχνζζδ βμκζδίςκ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ είκαζ δ ζοβηνζηζηή ιεθέηδ ζοββεκζηχκ εζδχκ ή πμζηζθζχκ ιε δζαθμνεηζηή ακμπή ζηδκ ζοβηεηνζιέκδ ααζμηζηή ηαηαπυκδζδ (Deyhollos, 2010). Η ζηναηδβζηή αοηή ααζίγεηαζ ηονίςξ ζηδκ ζοβηνζηζηή ακάθοζδ ιεηαβναθδιάηςκ, πνδζζιμπμζχκηαξ ιζηνμζοζημζπίεξ. φιθςκα ιε ανηεηέξ ακαθμνέξ, 55

59 πθδεχνα ζοβηνίζεςκ έπεζ πναβιαημπμζδεεί ακάιεζα ζε εοαίζεδηεξ ηαζ ακεεηηζηέξ ζηα άθαηα πμζηζθίεξ θοηχκ, υπςξ ημ θοηυ πνυηοπμ ανααίδμρδ (Taji et al. 2004; Gong et al. 2005; Wong et al. 2006), ημ νφγζ (Rabello et al. 2008), δ ημιάηα (Sun et al., 2010), δ θεφηδ (Cohen et al., 2010), δ παηάηα (Mane et al., 2008) ημ ζζηάνζ (Mohammadi et al., 2008; Ergen et al. 2009) ηαζ ημ ζαηπανμηάθαιμ (Rodrigues et al., 2009). Αοηέξ μζ ιεθέηεξ αμήεδζακ ζηδκ ακαβκχνζζδ πενζζζμηένςκ απυ 30 μζημβεκεζχκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ, υπςξ μζ DREB, CBF, MYB ηαζ bzip, πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ααζμηζηή ηαηαπυκδζδ ηαζ ζοβηεηνζιέκα αθαηυηδηα (He et al., 2011; Chen et al., 2002). Πανά ηδκ φπανλδ ιεβάθμο ανζειμφ δδιμζζεφζεςκ βζα ημκ ιδπακζζιυ απυηνζζδξ ηδξ εθζάξ ζηδκ αθαηυηδηα, υθεξ ακαθένμκηαζ απμηθεζζηζηά ζε μζημθοζζμθμβζηυ επίπεδμ. οκεπχξ, δ ιμνζαηή αάζδ ηδξ ακμπήξ ηδξ εθζάξ ζηδκ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ δεκ έπεζ αηυιδ ενεοκδεεί. ηδκ πανμφζα ενβαζία πναβιαημπμζήεδηε ζοβηνζηζηή ιεθέηδ ιεηαλφ ιζαξ εοαίζεδηδξ ( Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ) (Therios, 2009) ηαζ ιζαξ ακεεηηζηήξ ( Καθαιχκ ) (Chartzoulakis, 2002) πμζηζθζάξ ζηδκ αθαηυηδηα, βζα ηδκ δζενεφκδζδ ηδξ ιμνζαηήξ απυηνζζδξ ζε επίπεδμ ιεηαβναθήιαημξ (transcriptome level) ιε ηδκ πνήζδ ιζηνμζοζημζπίαξ ηαζ ημο αθβυνζειμο LeMoNe (Michoel et al., 2007; Bonnet et al., 2010) ιε ζημπυ ηδκ ακαβκχνζζδ ηςκ θεζημονβζηχκ οπμιμκάδςκ ηαεχξ ηαζ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ απυ ημοξ μπμίμοξ νοειίγμκηαζ. Σα πεζνάιαηα πμο πναβιαημπμζήεδηακ οπυ θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ ηαζ πνδζζιμπμζήεδηακ εκυξ έημοξ νζγμαμθδιέκα ιμζπεφιαηα εθζάξ ηα μπμία οπέζηδζακ ιεηαπείνζζδ ιε 120 mm NaCl βζα 90 διένεξ ηαζ επακαθμνά ζε θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ βζα 45 διένεξ. Σμ δζάνηεζαξ 135-διενχκ πείναια πναβιαημπμζήεδηε ηαηά ηδκ δζάνηεζα ημο ηαθμηαζνζμφ, υπμο μζ ακάβηεξ βζα άνδεοζδ ιεβζζημπμζμφκηαζ ηαζ δ πμζυηδηα ημο κενμφ πεζνμηενεφεζ. 56

60 2. Τιηθά θαη Μέζνδνη 2.1. Φπηηθφ πιηθφ Υνδζζιμπμζήεδηακ θοηά εθζάξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ δθζηίαξ εκυξ έημοξ, πνμενπυιεκα απυ ημ θοηχνζμ Κςζηεθέκμξ (Πυνμξ Σνμζγδκίαξ). Σα κεανά θοηά ιεηαθοηεφηδηακ ζε ιείβια πενθίηδ:άιιμο 1:1 ιέζα ζε ιαφνεξ πθαζηζηέξ ζαημφθεξ ηςκ 3 θίηνςκ ηαζ ανδεφμκηακ ιε 50% δζάθοια Hoagland (Hoagland and Arnon, 1950) επί έκα ιήκα πνμ ηδξ έκανλδξ ημο πεζνάιαημξ αθαηυηδηαξ Μεηαρείξηζε αιαηφηεηαο Σμ πείναια πναβιαημπμζήεδηε ζηζξ εβηαηαζηάζεζξ ημο Μεζμβεζαημφ Αβνμκμιζημφ Ικζηζημφημο Υακίςκ (Μ.Α.Ι.Υ.) ζε θοζζηέξ ζοκεήηεξ εενιμηναζίαξ ηαζ θςημπενζυδμο, λεηίκδζε ζηζξ 15 Μαΐμο 2010 ηαζ είπε ζοκμθζηή δζάνηεζα 4½ ιήκεξ. Σα θοηά ανδεφμκηακ διενδζίςξ ιε 150ml 50% δζάθοια Hoagland πμο ζοβπνυκςξ πενζείπε NaCl ζε ζοβηεκηνχζεζξ 0 ηαζ 120mM βζα 15, 45 ηαζ 90 διένεξ ηαζ ιε 50% δζάθοια Hoagland βζα 15 ηαζ 45 διένεξ ιεηά απυ ηδκ ηαηαπυκδζδ NaCl. Σα δζαθφιαηα πνμεημζιάζηδηακ ιε κενυ ανφζδξ. Γζα ημ πείναια έβζκε επζθμβή υζμ ημ δοκαηυκ πζμ μιμζυιμνθςκ θοηχκ ηαζ δ ηάεε ιεηαπείνζζδ εθανιυζηδηε ζε 40 θοηά απυ ηάεε πμζηζθία. ε ηάεε πνμκζηυ ζδιείμ πναβιαημπμζμφκηακ ιέηνδζδ ημο φρμοξ υθςκ ηςκ δεκδνοθθίςκ ηαηηζηηθή Αλάιπζε Η ζηαηζζηζηή επελενβαζία ηςκ δεδμιέκςκ έβζκε ιε ημ ηεθείςξ ηοπαζμπμζδιέκμ ζπέδζμ. Υνδζζιμπμζχκηαξ ημ ζηαηζζηζηυ πνυβναιια SPSS (v20.0.0) βζα Mac OSX έβζκε δ ακάθοζδ δζαηφιακζδξ (ANOVA) ηαζ δ ζφβηνζζδ ηςκ ιέζςκ υνςκ έβζκε ιε ημ ηνζηήνζμ Duncan (Duncan s multiple range test) βζα P 0, Πξνζδηνξηζκφο ηεο ρεκηθήο ζχζηαζεο ε ηάεε πνμκζηυ ζδιείμ ημο πεζνάιαημξ πναβιαημπμζμφκηακ δεζβιαημθδρία θφθθςκ, αθαζημφ ηαζ νίγαξ ηνζχκ θοηχκ ηάεε πμζηζθίαξ, βζα πνμζδζμνζζιυ ηδξ ζοβηεκηνςζήξ ηςκ ακυνβακςκ ζημζπείςκ ημοξ. Σμ θοηζηυ οθζηυ πθφεδηε ιε απζμκζζιέκμ κενυ ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα λδνάεδηε ζημοξ 65 0 C βζα 2 διένεξ. Σμ λδνυ 57

61 θοηζηυ οθζηυ, ιεηά ημ άθεζια ηαζ ηδκ απμηέθνςζδ ημο (λδνή ηαφζδ) ζημοξ C βζα 5 χνεξ, δζαθοημπμζήεδηε ιε 6Ν HCl. Αημθμφεδζε πνμζδζμνζζιυξ ηςκ ζημζπείςκ Na, K, Ca, Mg, Fe, Mn ηαζ Zn ιε ζοζηεοή αημιζηήξ απμννυθδζδξ (Perkin-Elmer 2340). Η ζοβηέκηνςζδ P πνμζδζμνίζεδηε ζε θαζιαημθςηυιεηνμ μναημφ θςηυξ ζε ιήημξ ηφιαημξ 470nm ιε ηδκ ιέεμδμ ημο θςζθμαακαδμιμθοαδαζκζημφ αιιςκίμο. Σμ Ν πνμζδζμνίζηδηε ιε ηδκ ιέεμδμ Kjedahl ζε ακαθοηή Kjeltec 1030 (Tecator) εκχ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο αμνίμο πνδζζιμπμζήεδηε δ ιέεμδμξ Azomethine-H (Wolf, 1971) ιεηά απυ απμηέθνςζδ ημο θοηζημφ οθζημφ ζημοξ C βζα 6 χνεξ Απνκφλσζε νιηθνχ θπηηαξηθνχ RNA ε ηάεε πνμκζηυ ζδιείμ ηέζζενα θοηά απυ ηάεε πμζηζθία ηαζ ιεηαπείνζζδ αθαζνέεδηακ απυ ημ οπυζηνςια ηαζ αθμφ μζ νίγεξ ημοξ ηαεανίζηδηακ ιε απζμκζζιέκμ κενυ, απμζηεζνχεδηακ ιε 0,5% οπμπθςνζχδεξ κάηνζμ ηαζ θεζμηνζαήεδηακ ιε βμοδί ηαζ βμοδμπένζ ζε οβνυ άγςημ. Η απμιυκςζδ μθζημφ ηοηηανζημφ RNA έβζκε ιε ιζηνέξ ηνμπμπμζήζεζξ ηδξ ιεευδμο ηςκ Bachem et al., Ακαθοηζηά, ζε ζςθήκα falcon ηςκ 50ml ημπμεεηήεδηακ 2 g ζζημφ ηαζ 11 ml νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ εηπφθζζδξ RNA ηαζ θαζκυθδξ ζε ακαθμβία 1:1 (100 mm Tris-HCl, ph 8; 100 mm LiCl; 10mM EDTA, 80 0 C). Σμ ιείβια ακαδεφηδηε ζζπονά ζε ιδπακζηυ ακαδεοηήνα (vortex) βζα 2 min ηαζ θοβμηεκηνήεδηε βζα 20 min ζηζξ rpm ζημοξ 20 0 C. Η οπενηείιεκδ θάζδ ιεηαθένεδηε ζε κέμ ζςθήκα, ακαιίπεδηε ιε ίζμ υβημ πθςνμθμνιίμο, ακαδεφηδηε ηαζ θοβμηεκηνήεδηε 20 min ζηζξ rpm ζημοξ 20 0 C. Η εηπφθζζδ ιε πθςνμθυνιζμ επακαθήθεδηε ηνείξ θμνέξ. Σα νζαμκμοηθεσηά μλέα ηαηαηνδικίζηδηακ ιε 1/3 ημο υβημο ηδξ οπενηείιεκδξ θάζδξ 8 Μ LiCl βζα 16 h ζημοξ 4 0 C. Σμ ίγδια ημο RNA παναθήθεδηε ιε θοβμηέκηνδζδ ζηζξ rpm ζημοξ 4 0 C βζα 30 min. ηδκ ζοκέπεζα ημ ίγδια επακαναζχεδηε ιε 400 ιl ddh 2 O, ιεηαθένεδηε ζε ζςθήκα Eppendorf, ακαιίπεδηε ιε 2,5 υβημοξ 100% αζεακυθδξ ηαζ 0,1 θμνά υβημ NaOAc ηαζ αθέεδηε βζα 8 h ζημοξ C. Σμ ίγδια ημο RNA παναθήθεδηε ιε θοβμηέκηνδζδ ζηζξ rpm ζημοξ 4 0 C βζα 20 min ηαζ εηπθφπεδηε ιε δζάθοια 70% αζεακυθδξ. Αημθμφεςξ ημ ίγδια αθέεδηε κα ζηεβκχζεζ ζε εενιμηναζία 37 0 C βζα 5 min ηαζ επακαναζχεδηε ζε 50 ιl ddh 2 O. Σμ κενυ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ επακαναίςζδ ημο RNA ηαεχξ ηαζ ημ κενυ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ παναζηεοή ηςκ δζαθοιάηςκ είπε οπμζηεί ιεηαπείνζζδ ιε δζαζεοθμπονακεναηζηυ (DEPC) βζα ηδκ απεκενβμπμίδζδ ηςκ νζαμκμοηθεαζχκ. 58

62 2.6. Καζαξηζκφο ηνπ νιηθνχ θπηηαξηθνχ RNA Σμ μθζηυ ηοηηανζηυ RNA πμο απμιμκχεδηε απυ ηζξ νίγεξ εθζάξ ηαζ πνμμνίγμκηακ βζα ζήιακζδ ηαζ οανζδμπμίδζδ ζε ιζηνμζοζημζπία (microarray) ηαεανίζηδηε ιε ημ Nucleospin RNA Clean-up XS kit (Macherey-Nagel) ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή. οβηεηνζιέκα ζε ηάεε δείβια RNA πνμζηίεεηαζ ίζμξ υβημξ δζαθφιαημξ RCU, ακαιζβκφεηαζ, ιεηαθένεηαζ ζε ζηήθδ NucleoSpin RNA XS ηαζ θοβμηεκηνείηαζ βζα 30 sec ζηα x g. ηδκ ζοκέπεζα ημ δείβια λεπθέκεηαζ 2 θμνέξ ιε 400 ιl δζαθφιαημξ RA3. Σμ ηαεανυ RNA εηθμφεηαζ απυ ηδκ ζηήθδ ιε 30 ιl κενμφ απαθθαβιέκμο απυ RNases Πνζνηηθνπνίεζε RNA Η ζοβηέκηνςζδ ημο RNA πνμζδζμνίζηδηε ιε ιέηνδζδ ηδξ μπηζηή ποηκυηδηαξ ηςκ δεζβιάηςκ ζηα 260 nm ζε θαζιαημθςηυιεηνμ (Hitachi, Model U-2001 UV/Visible Spectrophotometer) ηαζ οπμθμβίζηδηε ιε ηδκ ελίζςζδ: [RNA] = οκηεθεζηήξ αναίςζδξ Υ OD 260 X 50 ιg/ml Η ηαεανυηδηα ημο RNA πνμζδζμνίζηδηε απυ ηδκ ακαθμβία ηδξ μπηζηήξ απμννυθδζδξ OD 260 /OD 280 nm Ηιεθηξνθφξεζε RNA ζε απνδηαηαθηηθή πεθηή θνξκαιδευδεο / αγαξφδεο Οπηζηή παναηήνδζδ ημο απμιμκςιέκμο RNA πναβιαημπμζήεδηε ιεηά απυ δθεηηνμθυνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ ιε πδηηή απμδζάηαλδξ ιε θμνιαθδεΰδδ, ζφιθςκα ιε ημ πνςηυημθθμ ηςκ Sambrook et al., Σμ RNA ακαθφεηαζ δθεηηνμθμνδηζηά ζε πδηηή αβανυγδξ 1.5 % πμο πενζέπεζ 2.2 Μ θμνιαθδεΰδδ ηαζ 0.5 M νοειζζηζηυ δζάθοια MOPS. Σμ δείβια RNA ακαιεζβκφεηαζ ιε 2.2 Μ θμνιαθδεΰδδ, θμνιαιίδζμ ηαζ 0.5 Μ MOPS ζε ζοκμθζηυ υβημ 20 ιl (Πίκαηαξ 2.1). Σμ δείβια επςάγεηαζ ζημοξ 65 0 C βζα 15 min, ημπμεεηείηαζ ζημκ πάβμ ηαζ πνμζηίεεκηαζ 0.2X GelRed TM (Biotium) ηαζ 2 ιl ηοακμφκ ηδξ ανςιμθαζκυθδξ. ηδκ ζοκέπεζα ημ δείβια ημπμεεηείηαζ ζηδ πδηηή αβανυγδξ πνμηεζιέκμο κα ακαθοεεί δθεηηνμθμνδηζηά, ζε ζοκεήηεξ ζηαεενήξ ηάζδξ (90 V). Η δθεηηνμθυνδζδ βίκεηαζ ζε δζάθοια TAE (Tris-Acetate-EDTA). Μεηά ημ πέναξ ηδξ δθεηηνμθυνδζδξ δ παναηήνδζδ ημο RNA έβζκε ζε οπενζχδεξ θςξ (UV) ιε ζφζηδια απεζηυκζζδξ (BIORAD). 59

63 Πίλαθαο 2.1. Πξνεηνηκαζία δείγκαηνο RNA γηα ειεθηξνθφξεζε Τιηθά Όγθνο (κl) 3 ιg RNA M Φμνιαθδεΰδδ M MOPS 2 Φμνιαιίδζμ 10 φκμθμ Απνκφλσζε mrna απφ ζπνξφθπηα ειηάο Γζα ηδκ απμιυκςζδ mrna πνδζζιμπμζήεδηακ 630 ιg μθζημφ ηοηηανζημφ RNA πμο απμιμκχεδηε απυ ζπμνυθοηα εθζάξ ιε ηδκ ιέεμδμ ηςκ Bachem et al., Η απμιυκςζδ mrna έβζκε ιε ημ Dynabeads mrna DIRECT Kit (Invitrogen) ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή Καηαζθεπή cdna βηβιηνζήθεο απφ ζπνξφθπηα ειηάο Υνδζζιμπμζήεδηακ ζοκμθζηά 0,337 ιg mrna πμο πνμένπμκηακ απυ ζπμνυθοηα εθζάξ (πμζη. Κμνςκέζηδ) 25 διενχκ ηαζ ημ μπμίμ απμιμκχεδηε ιε ημ Dynabeads mrna DIRECT Kit (Invitrogen). Η cdna αζαθζμεήηδ ηαηαζηεοάζηδηε ιε ημ Creator TM SMART TM cdna Library Construction Kit (BD Bioscience-Clontech, Mountain View, Canada), ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή, ημ μπμίμ δίκεζ ηδκ δοκαηυηδηα κα πνδζζιμπμζδεεί ιζηνή πμζυηδηα RNA (0,025-0,5 ιg mrna ή 0,05-1 ιg Οθζηυ RNA) βζα ηδκ ακάηηδζδ ημο πθήνμοξ ιήημοξ cdna, ιε ηδκ ιεζμθάαδζδ εκυξ αήιαημξ πμθθαπθαζζαζιμφ ημο cdna ιε αθοζζδςηή ακηίδναζδ ηδξ πμθοιενάζδξ ιεβάθδξαπυζηαζδξ (LD PCR) (Barnes et al., 1994; Cheng et al., 1994). φιθςκα ιε αοηυ ημ πνςηυημθθμ, έκαξ ηνμπμπμζδιέκμξ oligo(dt) εηηζκδηήξ (CDS III/3 PCR Primer) εέηεζ ζε θεζημονβία ηδκ ακηίδναζδ ζφκεεζδξ ηδξ πνχηδξ αθοζίδαξ ηαζ ημ SMART IV Oligo ελοπδνεηεί ςξ έκα ιζηνυ, εηηαηζηυ εηιαβείμ ζημ 5 άηνμ ημο mrna (Δζηυκα 1). Όηακ δ ακηίζηνμθδ ιεηαβναθάζδ θηάζεζ ζημ 5 άηνμ, δ ηεθζηή ιεηαθενάζδ ημο εκγφιμο πνμζεέηεζ ιενζηά επζπθέμκ κμοηθεμηίδζα, ηονίςξ δεμλοηοηζδίκδ (dc), ζημ 3 άηνμ ημο cdna. Σμ SMART IV Oligo, ημ μπμίμ έπεζ ιζα μθζβμ-δεμλοβμοακίκδ (dg) αθθδθμοπία ζημ 3 άηνμ ημο, γεοβανχκεζ ηζξ αάζεζξ ημο ιε ημ άηνμ ηδξ δεμλοηοηζδίκδξ δδιζμονβχκηαξ έηζζ έκα εηηαηζηυ εηιαβείμ. Σμ πθήνμοξ ιήημοξ cdna ιμκήξ αθοζίδαξ (full-length ss-cdna) πμο πνμηφπηεζ, 60

64 πενζέπεζ ημ πθήνεξ 5 άηνμ ημο mrna ηαεχξ ηαζ ηδκ ζοιπθδνςιαηζηή αθθδθμοπία ζημ SMART IV Oligo πμο πνδζζιεφεζ ςξ ημζκή ημπμεεζία εηηίκδζδξ ζε οπμηείιεκμ πμθθαπθαζζαζιυ ιε LD PCR (Chenchik et al., 1998) (πήια 2.1). ρήκα 2.1. πδιαηζηή πανάζηαζδ ηδξ ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθήξ ηαζ εκίζποζδξ ημο cdna (SMART cdna Library Construction Kit, BD Biosciences Clontech, USA) Αοηυ έπεζ ςξ απμηέθεζια κα απμθεφβεηαζ επζιυθοκζδ απυ βεκςιζηυ DNA ηαζ poly A - RNA ηαεχξ πνδζζιμπμζμφκηαζ ςξ εηιαβεία βζα πμθθαπθαζζαζιυ ιε LD PCR ιυκμ ηα ss cdnas πμο έπμοκ αοηή ηδκ SMART αθθδθμοπία. Οζ εηηζκδηέξ πμο έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί θένμοκ ηζξ εέζεζξ πενζμνζζιμφ SfiI A&B (πήια 2.2). ρήκα 2.2. Οζ εέζεζξ πενζμνζζιμφ ημο SfiI (A & B) πμο θένμοκ μζ εηηζκδηέξ SMART IV (SfiIA) ηαζ CDS III (SfiIB). 61

65 Σμ cdna δζπθήξ αθοζίδαξ οπμαθήεδηε ζε ηαεανζζιυ ηαζ πέρδ ιε ηδκ πενζμνζζηζηή εκδμκμοηθεάζδ SfiI. Κθαζιάηςζδ (fractionation) ημο πνμσυκημξ ηδξ πέρδξ έβζκε ιε ηζξ ζηήθεξ CHROMA SPIN-400 (BD Clontech) ηαζ ηα ηθάζιαηα ακαθφεδηακ ζε πδηηή αβανυγδξ 1,1% απυ ηδκ μπμία εηποθίζηδηακ ηα ηιήιαηα ιε ιέβεεμξ ιεβαθφηενμ απυ 600bp. Η πδβή αοηή ηςκ cdnas πνδζζιμπμζήεδηε ζε ακηζδνάζεζξ ζφκδεζδξ (ligation reactions) ιε θμνέα pdnr-lib (BD Clontech) πμο θένεζ ηζξ ίδζεξ εέζεζξ πενζμνζζιμφ πμο επζηνέπμοκ ηδκ πνμζακαημθζζιέκδ ηθςκμπμίδζδ ηςκ cdnas δζπθήξ αθοζίδαξ ζημ θμνέα (πήια 2.3). ρήκα 2.3. πδιαηζηή πανάζηαζδ ημο ιεηαζπδιαηζζιμφ ηςκ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ Δ.coli ιε ημοξ θμνείξ pdnr-lib πμο πενζέπμοκ ηα cdnas ηδξ αζαθζμεήηδξ (SMART cdna Library Construction Kit, BD Biosciences Clontech, USA) Γζα ημκ ιεηαζπδιαηζζιυ ηςκ δεηηζηχκ ηοηηάνςκ E. coli MegaX DH10B T1 (Invitrogen), ιε ηδκ ιέεμδμ ηδξ δθεηηνμδζάηνδζδξ (electroporation) πνδζζιμπμζήεδηε 1 ιl ακηίδναζδξ ζφκδεζδξ. Μεηά απυ επχαζδ 20 ςνχκ ζε ενεπηζηυ οθζηυ LB ιε 30 ιg/ml πθςναιθαζκζηυθδ, ζημοξ 37 0 C, παναηδνήεδηε ακάπηολδ 62

66 πθδεχναξ ααηηδνζαηχκ απμζηζχκ. Ο ιεηαζπδιαηζζιυξ ηςκ ηοηηάνςκ, ιε ηδκ ιέεμδμ ηδξ δθεηηνμδζάηνδζδξ ζοκεπίζηδηε ιέπνζ ηδκ απυηηδζδ 10 6 ακελάνηδηςκ απμζηζχκ (cfu, colony forming units) πμο απμεδηεφηδηακ ζημοξ 4 0 C ιέπνζ ηδκ ζοθθμβή ημοξ. Γζα ηδκ ζοθθμβή ηαζ απμεήηεοζδ ηδξ ααηηδνζαηήξ αζαθζμεήηδξ, ζε ηάεε ηνζαθίμ Petri 150mm πνμζηέεδηακ 5 ml ενεπηζημφ οθζημφ LB ιε πθςναιθαζκζηυθδ ηαζ 25% βθοηενυθδ. Οζ απμζηίεξ ιε ηδκ αμήεεζα απμζηεζνςιέκμο οάθζκμο δζακμιέα, δζαθφεδηακ ηαζ ημ εκαζχνδια ηςκ ηοηηάνςκ πμο πνμέηορε απυ ηα ηνζαθία ημπμεεηήεδηε ζε απμζηεζνςιέκμ δμπείμ (~20 ml). Σμ εκαζχνδια δζαιμζνάζηδηε ζε 20 ζςθήκεξ Eppendorf. Η αζαθζμεήηδ απμεδηεφηδηε ζε ηαηάρολδ C Απνκφλσζε αλαζπλδπαζκέλσλ πιαζκηδίσλ ε 3 ηνζαθία Petri 150mm πνμζηέεδηακ 5 ml ενεπηζημφ οθζημφ LB ιε 30 ιg/ml πθςναιθαζκζηυθδ ηαζ 1x10-5 ιl απυ ηδκ ααηηδνζαηή αζαθζμεήηδ ημο ζπμνυθοημο εθζάξ. Η ακάπηολδ έβζκε ζημοξ 37 0 C, οπυ ακάδεοζδ, βζα 16 χνεξ. οκμθζηά απμιμκχεδηακ 2592 ακαζοκδοαζιέκα πθαζιίδζα ζφιθςκα ιε ημ ιενζηχξ ηνμπμπμζδιέκμ πνςηυημθθμ ηςκ Harris et al., Ακαθοηζηά, ζε 27 πζάηα ηςκ 96- εέζεςκ (96-deep well plate) πνμζηέεδηε 2ml ενεπηζηυ οθζηυ LB ιε 30 ιg/ml πθςναιθαζκζηυθδ ηαζ ιζα ααηηδνζαηή απμζηία ζε ηάεε εέζδ. Η ακάπηολδ έβζκε ζημοξ 37 0 C, οπυ ακάδεοζδ, βζα 24 χνεξ. Σμ ηάεε πζάημ θοβμηεκηνήεδηε βζα 30 min ζηζξ 3700 rpm, ζημοξ 4 0 C. ηδκ ζοκέπεζα, ημ ίγδια ηςκ ααηηδνίςκ, πμο δδιζμονβήεδηε απυ ηδκ θοβμηέκηνδζδ, επακαναζχεδηε ιε 170 ιl ηνφμ δζάθοια P1 ηαζ 170 ιl δζάθοια P2 (Πίκαηαξ 2.2). Έπεζηα αθέεδηε βζα 5 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ηαζ πνμζηέεδηε 170 ιl ηνφμο δζαθφιαημξ P3. Σμ πζάημ ηαθφθεδηε ιε πθαζηζηή ηαζκία ηαζ ακαδεφηδηε 3 θμνέξ. Αθμφ αθέεδηε ζημκ πάβμ βζα 5 min, ηα δζαθφιαηα ηςκ 96- εέζεςκ ιεηαθένεδηακ ζε πζάημ ιε θίθηνμ (Uniplate 96well, 2ml: Whatman Scleicher & Schuell, Whatman Inc., USA) ημ μπμίμ ημπμεεηήεδηε πάκς ζε άθθμ πζάημ πμο πενζείπε 540 ιl ζζμπνμπακυθδ. Αημθμφεςξ δ ηαηαζηεοή ηςκ 2 πζάηςκ ηςκ 96- εέζεςκ θοβμηεκηνήεδηε βζα 60 min ζηζξ 3700 rpm, ζημοξ 4 0 C. Η οπενηείιεκδ θάζδ απμννίθεδηε ηαζ ημ ίγδια εηπθφεδηε ιε 70% ηνφα αζεακυθδ. Αημθμφεςξ ημ ίγδια αθέεδηε κα ζηεβκχζεζ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 2 χνεξ ηαζ επακαναζχεδηε ζε 20 ιl ddh 2 O. Η ζοβηέκηνςζδ ηςκ πθαζιζδίςκ πνμζδζμνίζηδηε ιε ιέηνδζδ ηδξ μπηζηήξ ποηκυηδηαξ ηςκ δεζβιάηςκ ζηα 260 nm ζε θαζιαημθςηυιεηνμ NanoDrop (Thermo Scientific) ηαεχξ ηαζ ιε μπηζηή παναηήνδζδ ιεηά απυ δθεηηνμθυνδζδ ηςκ 63

67 δεζβιάηςκ ιε πδηηή αβανυγδξ, ζφιθςκα ιε ημ πνςηυημθθμ ηςκ Sambrook et al., Πίλαθαο 2.2. Γζαθφιαηα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ απμιυκςζδ ηςκ πθαζιζδίςκ GTE ξπζκηζηηθφ δηάιπκα P1 δηάιπκα P2 δηάιπκα P3 δηάιπκα 50mM Glucose GTE νοειζζηζηυ δζάθοια 1% SDS 3M KAAc ph=5,5 25mM Tris-HCl ph=8 RNase A 0,2N NaOH (0,15mg/ml) 10mM EDTA ddh 2 O ddh 2 O Ηιεθηξνθφξεζε λνπθιετθψλ νμέσλ ζε πεθηή αγαξφδεο Σα δείβιαηα DNA ακαθφεδηακ ιε αάζδ ημ ιμνζαηυ ημοξ αάνμξ, ιε δθεηηνμθυνδζδ ζε πδηηή αβανυγδξ 1,2-1,7% w/v (ακάθμβα ιε ημ ακαιεκυιεκμ ιέβεεμξ ημο δείβιαημξ) ζε δζάθοια ΣΑΔ (1mM EDTA, 40 mm Tris-CH 3 COOH, ph 8,0). Η δθεηηνμθυνδζδ έβζκε ζε ζηαεενή ηάζδ (Volts) ακάθμβα ιε ημ ιέβεεμξ ηδξ πδηηήξ. Ωξ νοειζζηζηυ δζάθοια δθεηηνμθυνδζδξ πνδζζιμπμζήεδηε ημ ΣΑΔ. Γζα ηδκ δζεοηυθοκζδ ηδξ ημπμεέηδζδξ ηςκ δεζβιάηςκ ζηδ πδηηή αβανυγδξ ηαζ βζα κα είκαζ δοκαηή δ παναημθμφεδζδ ηδξ δθεηηνμθυνδζδ ζε μναηυ θςξ, ημ DNA ακαιείπεδηε πνζκ ηδκ δθεηηνμθυνδζδ ιε πνςζηζηή (0,05% w/v ηοακμφκ ημο λοθεκίμο, 0.05% w/v ηοακυ ηδξ ανςιμθαζκυθδξ ηαζ 5% v/v βθοηενυθδ). Η πδηηή ιεηά ηδκ δθεηηνμθυνδζδ ειααπηίζηδηε βζα 30 θεπηά ζε 1% δζάθοια SYBR Gold (Molecular Probes, Invitrogen) βζα ηδκ απεζηυκζζδ ημο DNA, θεμνίγμκηαξ οπυ οπενζχδδ αηηζκμαμθία (UV). Η έκηαζδ ηδξ αηηζκμαμθίαξ είκαζ ακάθμβδ ηδξ πμζυηδηαξ ημο DNA (Sambrook et al., 1989) Αιιεινχρεζε πιαζκηδηαθνχ DNA θαη ζπζηαδνπνίεζε ησλ αιιεινπρηψλ Η αθθδθμφπδζδ ηςκ 2592 πθαζιζδζαηχκ DNΑ έβζκε ζημ Ικζηζημφημ Θαθάζζζαξ Βζμθμβίαξ ηαζ Γεκεηζηήξ (Ι.ΘΑ.ΒΙ.Γ) ημο Δθθδκζημφ Κέκηνμο Θαθαζζίςκ Δνεοκχκ ζημ Ηνάηθεζμ Κνήηδξ. Γζα ηδκ ακηίδναζδ ηδξ αθθδθμφπδζδξ πνδζζιμπμζήεδηε ημ BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems). Οζ ακηζδνάζεζξ πναβιαημπμζήεδηακ ζε εενιμακαηοηθςηέξ DNA Engine Dyad Thermal Cycler (BioRad Laboratories) ιε ηζξ αηυθμοεεξ ζοκεήηεξ: 94 0 C βζα 4 min ηαζ ηαηυπζκ 94 0 C βζα 30 s, 50 0 C βζα 30 s ηαζ 72 0 C βζα 30 s βζα 35 ηφηθμοξ, εκχ ημ ιείβια 64

68 ηδξ ακηίδναζδξ ηδξ PCR θαίκεηαζ ζημκ Πίκαηα 2.3. Υνδζζιμπμζήεδηακ ηα πζάηα 96- εέζεςκ, Thermowell 96-well Polycarbonate PCR microplate, Model M (Corning). Πίλαθαο 2.3. οζηαηζηά ακηίδναζδξ Sequencing PCR. πζηαηηθά αληίδξαζεο Όγθνο sequencing-pcr BigDye Terminator v3.1 1ιl BigDye Buffer 1,5ιl pdnr-for 10 mm 0,16ιl DNA 600 ng ddh 2 O Δχξ ηα 10 ιl Σα πνμσυκηα ηδξ PCR ιεηαθένεδηακ ζε ηαζκμφνβζμ πζάημ 96-εέζεςκ, MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate (Applied Biosystems), ζοιααηυ ιε ημκ αθθδθμοπδηή ABI ε ηάεε εέζδ πνμζηέεδηακ 22.3 ιl (EDTA 0,5M; NaOAc 0,1M; EtOH 100%), ημ ιείβια ακαδεφηδηε, αθέεδηε ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 1 χνα ηαζ θοβμηεκηνήεδηε βζα 35 min ζηζξ 3700 rpm, ζημοξ 20 0 C. ηδκ ζοκέπεζα πνμζηέεδηακ 70 ιl EtOH (70%), ηα ιείβιαηα ακαιίπεδηακ ηαζ θοβμηεκηνήεδηακ ζημοξ 20 0 C βζα 15 min ζηζξ 3700 rpm. Σα ζγήιαηα αθέεδηακ ζημ ζημηάδζ, ζημοξ 37 0 C, βζα 45 min, έπεζηα πνμζηέεδηακ 10 ιl Hi-Di Formamide (Applied Biosystems) ηαζ ζηδ ζοκέπεζα αθέεδηακ ζημοξ 95 0 C βζα 7 min ηαζ αιέζςξ ημπμεεηήεδηακ ζημκ πάβμ. Η αθθδθμφπδζδ πναβιαημπμζήεδηε ιε ημκ αθθδθμοπδηή (sequencer) ΑΒΙ Η αθαίνεζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ ημο θμνέα, δ αλζμθυβδζδ ηδξ πμζυηδηαξ ηαζ δ μιαδμπμίδζδ (clustering) ηςκ αθθδθμοπζχκ πμο πνμέηορακ πναβιαημπμζήεδηε ιε ημ θμβζζιζηυ SeqManII (DNAstar Inc.). Μεηά ηδκ μιαδμπμίδζδ, ηάεε αθθδθμοπία πμο απμηηήεδηε απυ ιζα μιάδα αθθδθμοπζχκ (cluster) μκμιάζηδηε contig εκχ μζ αθθδθμοπίεξ πμο ειθακίζηδηακ ιυκμ ιζα θμνά μκμιάζηδηακ singletons. Σμ ζφκμθμ ηςκ contig ηαζ singletons απμηεθμφκ ηζξ ιμκαδζηέξ αθθδθμοπίεξ (unique sequences) Αλαδήηεζε νκνινγίαο θαη επηζεκείσζε GO (GO annotation) Υνδζζιμπμζήεδηε ημ θμβζζιζηυ Blast2GO (Conesa et al., 2005) βζα ηδκ ακαγήηδζδ BLASTX ηδξ αζμθμβζηήξ δζαδζηαζίαξ (Biological Process BP), ημκ οπμηοηηανζηυ εκημπζζιυ (Cellular Component CC) ημοξ ηαζ ηδκ ιμνζαηή θεζημονβία (Molecular Fuction MF) ζηδκ μπμία ζοιιεηέπμοκ ηα 1956 ορδθήξ πμζυηδηαξ cdnas. Η ακηζζημίπζζδ πενζβναθχκ ζηζξ αθθδθμοπίεξ έβζκε ζφιθςκα ιε ηδ αάζδ δεδμιέκςκ Γμκζδζαηήξ Οκημθμβίαξ (Gene Ontology αnnotation, GO). 65

69 2.15. Καηαζθεπή κηθξνζπζηνηρίαο (microarray) Οζ 1121 ιμκαδζημί ηθχκμζ ηδξ αζαθζμεήηδξ απυ ζπμνυθοηα εθζάξ οπμαθήεδηακ ζε αθοζζδςηή ακηίδναζδ πμθοιενάζδξ (PCR) πνδζζιμπμζχκηαξ ηδκ Taq πμθοιενάζδ (Minotech, Heraklion, Greece) χζπμο κα παναθδθεμφκ ημοθάπζζημκ 4 ιg απυ ημ ηάεε πνμσυκ. πεδζάζηδηακ ημζκμί εηηζκδηέξ ιε ημ πνυβναιια PRIMER3 (Whitehead Institute for Biomedical Research, χζηε κα οανζδμπμζμφκ εηαηένςεεκ ημο ζδιείμο ηθςκμπμίδζδξ ημο θμνέα (Πίκαηαξ 2.4). Η εηηίιδζδ ηδξ πμζυηδηαξ ηςκ πνμσυκηςκ ηδξ ακηίδναζδξ PCR έβζκε ζε πδηηή αβανυγδξ 1,5% (πήια 2.4) ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα ηαεανίζηδηακ πνδζζιμπμζχκηαξ ημ Nucleofast 96 columns (Macherey-Nagel, Duren, Germany), ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή. Καηυπζκ, 3 ιg απυ ηα ηαεανζζιέκα πνμσυκηα ιεηαθένεδηακ ζε πζάηα εηηφπςζδξ απυ πμθοπνμποθέκζμ ηςκ 384 εέζεςκ (Genetix, Cat.#X7020). Αθμφ ζηέβκςζακ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο επακαδζαθφεδηακ ζε δζάθοια εηηφπςζδξ (450mΜ NaCl, 45mM ηζηνζηχκ ph 7.0, 5% θμνιαιίδζμ ηαζ 0,01% ιαθημζίδζμ) ζε ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ 200 ng/ιl. Δπζπθέμκ, ζε ηάεε block οπάνπμοκ ημοηηίδεξ (spot) ανκδηζημφ εθέβπμο πμο απμηεθμφκηαζ είηε απυ ημ δζάθοια εηηφπςζδξ είηε είκαζ ηεκέξ. ρήκα 2.4. Ακηζπνμζςπεοηζηέξ εζηυκεξ απυ ηδκ πμζμηζηή ακάθοζδ ηςκ πμθθαπθαζζαζιέκςκ πνμσυκηςκ, ηςκ 1211 ηθχκςκ ηδξ cdna αζαθζμεήηδξ ζπμνυθοημο εθζάξ, ζε πδηηή αβανυγδξ 66

70 Η εηηφπςζδ πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδ πνήζδ ημο Packard SpotArray24 spotter απυ ημκ Γζχνβμ Παπαβζακκάηδ (Δνβαζηήνζμ Γμκζδζςιαηζηήξ ηαζ Μεηαβμκζδζςιαηζηήξ Ένεοκαξ, ΙΜΒΒ-ΙΣΔ). Η εηηφπςζδ έβζκε ζε 4 block ζε βοάθζκα πθαηίδζα επζζηνςιέκα ιε αιζκμζζθάκζμ ηαζ ημ ηάεε cdna ηοπχεδηε ηνείξ θμνέξ, χζηε κα αολδεεί δ αλζμπζζηία ηςκ ιεηνήζεςκ ηαζ κα οπάνπεζ δ δοκαηυηδηα απυννζρδξ ηάπμζςκ ημοηηίδςκ πςνίξ κα πάκεηαζ δ ιέηνδζδ βζα ημ ζοβηεηνζιέκμ cdna. Πίλαθαο 2.4. Οζ εηηζκδηέξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ αθθδθμφπδζδ ηαζ ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ cdna αζαθζμεήηδξ ηαζ ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ. Ολνκαζία εθθηλεηή SMART IV CDS III Αιιεινπρία 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3' 5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N 1N-3' (N = A, G, C, or T; N 1 = A, G, or C) Υξήζε cdna αζαθζμεήηδ cdna αζαθζμεήηδ M13-F 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' cdna αζαθζμεήηδ M13-R 5'-AGGGAAACAGCTATGAC-3' cdna αζαθζμεήηδ pdnr-for 5'-TAAAACGACGGCCAGTA-3' Αθθδθμφπδζδ PDNR-FW 5'- CCGCATAACTTCGTATAGC - 3' Μζηνμζοζημζπία PDNR-REV 5'-CATGTTCACTTACCTACTGG-3' Μζηνμζοζημζπία ήκαλζε RNA Γζα ηδκ ζήιακζδ ημο μθζημφ ηοηηανζημφ RNA πνδζζιμπμζήεδηε ημ SuperScript Plus Direct cdna Labeling System (Invitrogen), ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή. οκμπηζηά, πνδζζιμπμζήεδηε πμζυηδηα 15 ιg RNA βζα ηδκ ζφκεεζδ cdna δ μπμία πναβιαημπμζήεδηε ιε ημ έκγοιμ ηδξ ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθάζδξ Superscript III (Invitrogen), πνδζζιμπμζχκηαξ ημκ εηηζκδηή Oligo(dT) 17. Ανπζηά ακαιείπεδηακ ζε ζςθήκα 2 ιl Oligo(dT) 17 (500 ιg/ml) ηαζ 15ιg RNA ζε ηεθζηυ υβημ 15 ιl. Σμ ιείβια εενιάκεδηε ζημοξ 70 0 C βζα 10 min ηαζ ημπμεεηήεδηε αιέζςξ ζημκ πάβμ βζα ημοθάπζζημκ 1 min. Έπεζηα ημ ιείβια θοβμηεκηνήεδηε ζφκημια ηαζ πνμζηέεδηακ 6 ιl νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (First Strand Buffer 5X), 3 ιl DTT (0.1M), 1 ιl RNaseOUT (40U/ιl), 2 ιl εκγφιμο ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθάζδξ SuperScript III (400 U/ιl) ηαζ 3 ιl dntps ιε ηδκ πνςζηζηή Alexa Fluor 555-aha-dUTP ή ηδκ πνςζηζηή Alexa Fluor 647-aha-dUTP. Αημθμφεδζε επχαζδ ζημοξ 46 0 C βζα 3 χνεξ. ηδκ ζοκέπεζα αημθμφεδζε ακηίδναζδ οδνυθοζδξ, βζα ηδκ απμδυιδζδ ημο ανπζημφ 67

71 RNA, ηαηά ηδκ μπμία πνμζηέεδηακ ζημ ιείβια 15 ιl 0.1M NaOH ηαζ επχαζδ βζα 30 min ζημοξ 70 0 C. Η ηζιή ph=7 επζηεφπεδηε ιε πνμζεήηδ 15 ιl 0.1M HCl Καζαξηζκφο ζεκαζκέλνπ cdna Σμ γεοβάνζ ηςκ ζδιαζιέκςκ cdna πμο εα οανζδμπμζμφκηακ ζηδκ ιζηνμζοζημζπία εκχεδηε ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα μ ηαεανζζιυξ έβζκε ιε ημ PureLink PCR Purification System (Invitrogen), ζφιθςκα ιε ιενζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ απυ ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή. οβηεηνζιέκα, ζημ ιείβια ηςκ ζδιαζιέκςκ cdna πνμζηέεδηε 1.4 ml Binding Buffer (Invitrogen) ηαζ αθμφ ακαιείπεδηε, ιεηαθένεδηε ζε ζηήθδ Low- Elution Volume Spin Cartridges (Invitrogen). Αημθμφεδζε θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 3300 x g, ηαηυπζκ πνμζηέεδηακ 600 ιl Wash Buffer (Invitrogen) ηαζ ιεηά απυ θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 3300 x g, πνμζηέεδηακ 20 ιl νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ οανζδμπμίδζδξ (Low Temp Hybridization buffer - ARRAYIT) ηα μπμία εηθμφμκηαζ ιε θοβμηέκηνδζδ ζηζξ x g. Σα δείβιαηα θοθάζζμκηακ ζημ ζημηάδζ ζημοξ C ιέπνζ κα οανζδμπμζδεμφκ Τβξηδνπνίεζε κηθξνζπζηνηρίαο κε θαιππηξίδα Δηνηκαζία ηεο κηθξνζπζηνηρίαο Ανπζηά επζζδιαίκμκηαζ ηα υνζα ηςκ ημοηηίδςκ δζυηζ ιεηά ηδκ εημζιαζία ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ δεκ εα είκαζ ειθακείξ μζ ημοηηίδεξ. Έπεζηα δ ακηζηεζιεκμθυνμξ πθάηα εκοδαηχκεηαζ ιε οδναηιμφξ, απυ ηδκ πθεονά πμο ανίζημκηαζ μζ ημοηηίδεξ, ιε ημπμεέηδζδ πάκς απυ δμπείμ ιε κενυ ζημοξ 65 0 C βζα 10 sec. ηδκ ζοκέπεζα δ ακηζηεζιεκμθυνμξ πθάηα βζα κα ζηεβκχζεζ εενιαίκεηαζ πάκς ζε ιεηαθθζηή επζθάκεζα 90 0 C βζα 5 sec, απυ ηδκ ακηίεεηδ πθεονά απυ ηδκ μπμία ανίζημκηαζ μζ ημοηηίδεξ. Η παναπάκς δζαδζηαζία επακαθαιαάκεηαζ ηνείξ θμνέξ. Έπεζηα δ ακηζηεζιεκμθυνμξ πθάηα ημπμεεηείηαζ ζε εάθαιμ UV ζηα 240 mj ηαζ ιεηά πθέκεηαζ ιε 1% SDS βζα 5 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Σμ SDS απμιαηνφκεηαζ ιε αφεζζδ ηδξ ακηζηεζιεκμθυνμο πθάηαξ ζε ddh 2 O 20 θμνέξ ηαζ ζε ηαεανή αζεακυθδ 10 θμνέξ. Η ακηζηεζιεκμθυνμξ πθάηα ζηεβκχκεηαζ ιε θοβμηέκηνζζδ (750rpm) βζα 5 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ηαζ είκαζ έημζιδ βζα οανζδμπμίδζδ. 68

72 Δηνηκαζία πιηθνχ Σμ ζδιαζιέκμ cdna, αναζςιέκμ ιε 20 ιl νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ οανζδμπμίδζδξ, ακαιζβκφεηαζ ιε 3.5 ιl DNA απυ ζπένια ζμθςιμφ (5 ml/ml) (Invitrogen) ηαζ 2 ιl trna γοιμιφηδηα (9.2 mg/ml) (Sigma-Aldrich). Σμ ιείβια αθμφ θοβμηεκηνείηαζ ζηζξ 2000 rpm βζα 30 sec βζα απμιάηνοκζδ ηςκ θοζαθίδςκ, εενιαίκεηαζ ζημοξ 60 0 C βζα 5 min ηαζ παναιέκεζ ζημοξ 45 0 C ιέπνζ κα ημπμεεηδεεί ζηδκ ακηζηεζιεκμθυνμ. Μυθζξ ημπμεεηδεεί ζηδκ ακηζηεζιεκμθυνμ, ηαθφπηεηαζ ιε ηδκ ηαθοπηνίδα-hybrislip HS60 (GRACE BIO-LABS) ηαζ ημπμεεηείηαζ ζημ εζδζηυ εάθαιμ οανζδμπμίδζδξ. Δπίζδξ ημπμεεηείηαζ κενυ ζηζξ εζδζηέξ εέζεζξ βζα δζαηήνδζδ ηδξ οβναζίαξ ηαζ ηθείκεηαζ μ εάθαιμξ. Η οανζδμπμίδζδ πναβιαημπμζείηαζ ζε οδαηυθμοηνμ ζημοξ 43 0 C βζα χνεξ ζημ ζημηάδζ Πιχζεηο ηεο κηθξνζπζηνηρίαο κεηά ηελ πβξηδνπνίεζε Γζα ιείςζδ ημο εμνφαμο (background) ηαζ ηδξ ιδ εζδζηήξ οανζδμπμίδζδξ, δ ακηζηεζιεκμθυνμξ πθφεδηε δομ θμνέξ ιε γεζηαιέκμ ζημοξ 43 0 C Ροειζζηζηυ Γζάθοια Πθφζδξ 1 (1Υ SSC, 0.03% SDS), ιζα θμνά ιε Ροειζζηζηυ Γζάθοια Πθφζδξ 2 (0.2X SSC) ηαζ άθθεξ δομ θμνέξ ιε Ροειζζηζηυ Γζάθοια Πθφζδξ 3 (0.05Υ SSC). ηδκ ζοκέπεζα δ ιζηνμζοζημζπία ζηεβκχκεηαζ ιε θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 750 rpm βζα 4 min ηαζ είκαζ έημζιδ βζα ζάνςζδ ιε ημ laser άξσζε ηεο κηθξνζπζηνηρίαο κε laser Οζ ιζηνμζοζημζπίεξ ζανχεδηακ ιε ηδκ πνήζδ ημο GSI Lumonics ScanArray5000. Η ακίπκεοζδ ηςκ cdna πμο είπακ ζδιακεεί ιε Alexa Fluor 555-aha-dUTP βίκεηαζ ιε δζέβενζδ laser ζηα 543 nm ηαζ ακίπκεοζδ ηδξ εηπμιπήξ ιε θίθηνμ ζηα 570 nm, εκχ βζα ηδκ Alexa Fluor 647-aha-dUTP δ δζέβενζδ ημο laser βίκεηαζ ζηα 633 nm ηαζ δ ακίπκεοζδ εηπμιπήξ ιε θίθηνμ ζηα 670 nm. Ανπζηά έβζκε πνμεπζζηυπδζδ ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ ιε ακάθοζδ ζηα 50 ιm, ζζπφ laser ζημ 80% ηαζ PMT gain ζημ 80%. ηδκ ζοκέπεζα νοειίζηδηε δ εζηζαηή απυζηαζδ ημο laser αάζεζ ζδιείςκ πμο είκαζ μναηά ηαζ ζηα δομ ιήηδ ηφιαημξ ηαεχξ ηαζ δ ηεθζηή ζζπφξ ημο, δ μπμία ήηακ 90% ηαζ βζα ηα δφμ ηακάθζα (πνάζζκμ ηαζ ηυηηζκμ). Η ηεθζηή ζάνςζδ ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ έβζκε ζε ακάθοζδ 5 ιm. Οζ εζηυκεξ απμεδηεφηδηακ ζε ανπεία ιμνθήξ tiff (πήια 2.5). 69

73 ρήκα 2.5 Η εηηοπςιέκδ ιζηνμζοζημζπία Olea europaea. Με ημ πνάζζκμ ηαζ ηυηηζκμ πνχια είκαζ ηα cdna ιε ζήιακζδ Alexa Fluor 555-aha-dUTP ηαζ Alexa Fluor 647-aha-dUTP ακηίζημζπα. Η ηνίηδ εζηυκα πνμηφπηεζ απυ ημκ ζοκδοαζιυ ηςκ 2.tiff ανπείςκ Αλάιπζε εηθφλαο πβξηδνπνηεκέλεο κηθξνζπζηνηρίαο Η αθθδθεπζηάθορδ ηςκ δφμ εζηυκςκ (πνάζζκδ ηαζ ηυηηζκδ) ηαζ δ ακάθοζδ ημοξ έβζκε ιε ημ GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, LLC). Ωξ δεδμιέκα θμνηχεδηακ μζ δφμ εζηυκεξ ιε επέηηαζδ.tiff, αθθδθεπζηαθφθεδηακ ιε απμηέθεζια κα δδιζμονβδεεί ιζα ρεοδυ-έβπνςιδ εζηυκα ζηδκ μπμία ημπμεεηήεδηε ημ πθέβια (grid) ιε ηζξ εέζεζξ ηςκ ημοηηίδςκ (πήια 2.5). Έπεζηα ζδιεζχεδηακ μζ ιδ επζεοιδηέξ ημοηηίδεξ ςξ bad υηακ δεκ ήηακ μιμζυιμνθεξ ή ιε πμθφ ορδθυ ευνοαμ (background) εκχ ςξ absent υηακ δ έκηαζδ ημοξ ήηακ παιδθυηενδ απυ ηδκ έκηαζδ ημο εμνφαμο. Υνδζζιμπμζήεδηε δ πνμηαεμνζζιέκδ ιέεμδμξ αθαίνεζδξ ημπζημφ εμνφαμο (background). Αημθμφεςξ έβζκε δ πμζμηζημπμίδζδ βζα υθεξ ηζξ εζηυκεξ ηαζ δ απμεήηεοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ βζα πεναζηένς ζηαηζζηζηή ακάθοζδ. 70

74 2.21. Αλάιπζε ησλ δεδνκέλσλ πνπ πξνέθπςαλ απφ ηηο πβξηδνπνηήζεηο κηθξνζπζηνηρηψλ Έπεζηα απυ ηδκ ακάθοζδ ηςκ εζηυκςκ, ηα δεδμιέκα απυ ηδκ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ημοηηίδςκ απμεδηεφηδηακ ςξ ανπεία GenePix Results (.gpr), ηα μπμία ιεηαηνάπδηακ ζε ανπεία TIGR MultiΔxperiment Viewer (.mev) ιε ηδκ πνήζδ ημο πνμβνάιιαημξ ExpressConverter V2.1 (Saeed et al., 2003). Σμ ενβαθείμ ExpressConverter δίκεζ ηδκ εκζαία ηζιή έκηαζδξ (Integrated Intensity Value IIV) βζα ηδκ ηάεε ημοηηίδα, δ μπμία είκαζ δ ζοκμθζηή έκηαζδ πμο ιεηνζέηαζ απυ ημ αζμθμβζηυ δείβια πμο είκαζ ηοπςιέκμ ζηδ ημοηηίδα (Sioson et al., 2006). Αοηέξ μζ ηζιέξ πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ ανπείμ εζζυδμο ζημ πνυβναιια MIDAS V Καλνληθνπνίεζε θαη θηιηξάξηζκα ρακειψλ εληάζεσλ Η ηακμκζημπμίδζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ είκαζ δ δζαδζηαζία ιε ηδκ μπμία βίκεηαζ δζυνεςζδ ημο ζοζηδιαηζημφ ζθάθιαημξ πμο έπμοκ μζ ηζιέξ έκηαζδξ θεμνζζιμφ ηαζ πναβιαημπμζήεδηε ιε ημ πνυβναιια MIDAS V2.21. Η ιέεμδμξ ηακμκζημπμίδζδξ ηαζ θζθηνανίζιαημξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε ζημ MIDAS απμηεθμφκηακ απυ ηα παναηάης αήιαηα: (1) ιέεμδμξ ηακμκζημπμίδζδξ LOWESS (LOcally Weighted Scatterplot Smoothing) ιε ζημπυ ηδκ εφνεζδ ιδ-βναιιζηχκ ζθαθιάηςκ ηςκ πνςζηζηχκ, (2) ακάθοζδ ηςκ επακαθήρεςκ εκηυξ ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ (in slide replicate analysis) ιε ζημπυ ηδκ ηακμκζημπμίδζδ ηςκ ηνζχκ επακαθήρεςκ ημο ηάεε cdna εκηυξ ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ ηαζ (3) θζθηνάνζζια παιδθήξ έκηαζδξ, ιε ηδκ μπμία αθαζνμφκηαζ ηζιέξ έκηαζδξ <1000 ιε ζημπυ ηδκ απμθοβή θακεαζιέκςκ ιεηνήζεςκ ηδξ έκηαζδξ ημο ζήιαημξ. Οζ ημοηηίδεξ παιδθήξ πμζυηδηαξ απμηθείζηδηακ ιε ηδκ πνήζδ δζαθυνςκ ιεευδςκ θζθηνανίζιαημξ υπςξ ιε ημκ έθεβπμ εμνφαμο ηαζ ζηα δφμ ηακάθζα ιε υνζμ ζήιαημξ/εμνφαμο ιεβαθφηενμ ημο 2.0 ηαζ πνήζδ επζζδιάκζεςκ (flags) βζα ηα δφμ ηακάθζα. Η επίδναζδ ηδξ ιεευδμο ηακμκζημπμίδζδξ αλζμθμβήεδηε ιε ηδκ δδιζμονβία βναθδιάηςκ ηδξ ακαθμβίαξ ηδξ έκηαζδξ (Ratio Intensity - RI) ζημ ηέθμξ ηδξ δζαδζηάζζαξ ηακμκζημπμίδζδξ, ζφιθςκα ιε ημοξ Quackenbush et al. (2002) Αλαγλψξηζε ησλ cdnas κε δηαθνξηθή έθθξαζε (1) 2-θιάζεσλ ζπδεπγκέλε SAM Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ cdnas ιε δζαθμνζηή έηθναζδ ζε υθμ ημ πείναια πνδζζιμπμζήεδηε δ δομ-ηθάζεςκ ζογεοβιέκδ SAM (Significance Analysis of Microarrays) δ μπμία εθανιυγεηαζ ιέζς ημο θμβζζιζημφ TIGR MEV (Saeed et 71

75 al., 2003). Σα ζογεοβιέκα δεδμιέκα πμο εζζήπεδζακ βζα ηδκ ακάθοζδ SAM ήηακ μζ ηακμκζημπμζδιέκεξ log 2 ηζιέξ ηδξ έκηαζδξ ημο ιάνηονα (C) ηαζ ηδξ ιεηαπείνζζδξ ιε NaCl (Σ) ζε ηάεε πνμκζηυ ζδιείμ (Σ_15d vs C_15d, T_45d vs C_45d, T_90d vs C_90d, T_15dr vs C_15dr and T_45dr vs C_45dr). ημζπεία ιε εθθζπείξ ηζιέξ βζα ηάπμζα απυ ηζξ ζοκεήηεξ απμηθείζηδηακ απυ ηδκ ακάθοζδ. ε υθεξ ηζξ ακαθφζεζξ εηηεθέπεδηακ 100 ηοπαίμζ ζοκδοαζιμί ηςκ δεδμιέκςκ βζα κα επζθεπεμφκ ηα cdnas ιε δζαθμνζηή έηθναζδ ηαζ ηαοηυπνμκα επζθέπεδηε μ πανάβμκηαξ S0 ζφιθςκα ιε ηδκ ιέεμδμ ηςκ Tusher et al. (2001). Η ηζιή δ νοειίζηδηε (δ = 0.81 βζα ηδκ Καθαιχκ ηαζ δ = 0.47 βζα ηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ) χζηε κα πνμηφρεζ νοειυξ ρεοδχκ ακαηαθφρεςκ (false discovery rate - FDR) < Αλαγλψξηζε ησλ cdnas κε δηαθνξηθή έθθξαζε (2) 2-θιάζεσλ κεζπδεπγκέλε SAM Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνμπμζδιέκδ έηθναζδ ιεηαλφ ηδξ ηαηαπυκδζδξ NaCl ηαζ ηδξ επακαθμνάξ ζε θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ, πνδζζιμπμζήεδηε δ δομ-ηθάζεςκ ιδ-ζογεοβιέκδ SAM (Significance Analysis of Microarrays) δ μπμία εθανιυγεηαζ ιέζς ημο θμβζζιζημφ TIGR MEV (Saeed et al., 2003). Σα ιδ-ζογεοβιέκα δεδμιέκα πμο εζζήπεδζακ βζα ακάθοζδ SAM ήηακ μζ ηακμκζημπμζδιέκεξ log 2 (Treated/Control) ηζιέξ ηδξ έκηαζδξ ιεηαλφ ηςκ πνμκζηχκ ζδιείςκ ηδξ ηαηαπυκδζδξ (stress) ηαζ ηδξ επακαθμνάξ (recovery). ημζπεία ιε εθθζπείξ ηζιέξ βζα ηάπμζεξ απυ ηζξ ζοκεήηεξ απμηθείζηδηακ απυ ηδκ ακάθοζδ SAM. ε υθεξ ηζξ ακαθφζεζξ εηηεθέζηδηακ 100 ηοπαίμζ ζοκδοαζιμί ηςκ δεδμιέκςκ βζα κα επζθεπεμφκ ηα cdnas ιε δζαθμνζηή έηθναζδ ηαζ ηαοηυπνμκα επζθέπεδηε μ πανάβμκηαξ S0 ζφιθςκα ιε ηδκ πνμεπζθεβιέκδ ιέεμδμ ηςκ Tusher et al. (2001). Η ηζιή δ νοειίζηδηε χζηε κα πνμηφρεζ νοειυξ ρεοδχκ ακαηαθφρεςκ (FDR) < Ιεξαξρηθή ζπζηαδoπνίεζε (Hierarchical cluster analysis) Σα ηακμκζημπμζδιέκα log 2 δείβιαηα μιαδμπμζήεδηακ ζενανπζηά πνδζζιμπμζχκηαξ ημ θμβζζιζηυ MeV (Multi-Experiment Viewer) (Quackenbush 2002). Γζα κα εηηζιδεεί δ δοκαιζηή ηςκ δδιζμονβμφιεκςκ ζοζηάδςκ, δ ακάθοζδ πναβιαημπμζήεδηε πνδζζιμπμζχκηαξ 2 δζαθμνεηζηέξ ιεηνζηέξ μιμζυηδηαξ (ζοζπεηζζιυξ Pearson ηαζ εοηθείδζα απυζηαζδ) ηαζ ηνεζξ δζαθμνεηζηέξ ιεευδμοξ ζφκδεζδξ (ιέζδξ ζφκδεζδξ, πθήνμοξ ζφκδεζδξ ηαζ ιμκήξ ζφκδεζδξ). Σα δεκδνμβνάιιαηα ζοζηάδςκ δδιζμονβήεδηακ ηεθζηά ιε ηδκ Δοηθείδεζα ιεηνζηή 72

76 (Euclidean metric) ηαζ ημκ αθβυνζειμ πθήνμοξ ζφκδεζδξ ζοζηάδςκ (complete linkage clustering algorithm) (Quackenbush 2002) πζηαδνπνίεζε κε ηνλ αιγφξηζκν Κ-means (KMC) Σα cdnas μιαδμπμζήεδηακ ζε 4 ζοζηάδεξ ιε ημκ αθβυνζειμ k-means ιε ηδκ πνήζδ ημο θμβζζιζημφ MeV (Mult-Experiment Viewer) (Quackenbush 2002) πνδζζιμπμζχκηαξ ηα ηακμκζημπμζδιέκα δεδμιέκα log 2 (Treated/Control). Ωξ ιεηνζηή πνδζζιμπμζήεδηε δ πνμεπζθεβιέκδ Δοηθείδεζα απυζηαζδ ηαζ μ ιέβζζημξ ανζειυξ ηςκ επακαθήρεςκ ήηακ Γίθηπα ππνκνλάδσλ (Module networks) Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ηςκ δζηηφςκ οπμιμκάδςκ βζα ηάεε ιία απυ ηζξ δφμ πμζηζθίεξ πνδζζιμπμζήεδηε μ αθβυνζειμξ LeMoNe (Michoel et al., 2007; Bonnet et al., 2010). Ο αθβυνζειμξ πνδζζιμπμζεί πζεακμηναηζηέξ ιεευδμοξ αεθηζζημπμίδζδξ βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ζοζηάδςκ απυ ζοκ-εηθναγυιεκα ιεηαβναθήιαηα, ηαεχξ ηαζ ημοξ νοειζζηέξ ημοξ (Bonnet et al., 2010). Ανπζηά μ αθβυνζειμξ ακαγδηεί ζοζηάδεξ ζοκεηθναγυιεκςκ ιεηαβναθδιάηςκ ηαζ αημθμφεςξ πνμζδζμνίγεζ έκα νοειζζηζηυ πνυβναιια βζα ηάεε ζοζηάδα. Ωξ δεδμιέκα εζζυδμο δίκμκηαζ ζημκ αθβυνζειμ ηα πνμθίθ έηθναζδξ ηςκ ιεηαβναθδιάηςκ ηαε υθδ ηδκ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ ηαεχξ ηαζ έκαξ ηαηάθμβμξ ιε ημοξ πζεακμφξ νοειζζηέξ. ηδκ πανμφζα ιεθέηδ μζ ηακμκζημπμζδιέκεξ ηζιέξ log 2 (Treatment/Control) ηςκ δομ πμζηζθζχκ πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ δεδμιέκα εζζυδμο έηθναζδξ ιεηαβναθδιάηςκ. Υνδζζιμπμζχκηαξ ηδκ πενζβναθή ηδξ GO επζζδιείςζδξ ηαζ ηδκ επζθμβή ηςκ υνςκ transcription factor activity, nucleic acid binding, DNA binding, regulation of transcription, transcription regulator activity ηαζ transcription activator activity εκημπίζηδηακ ζοκμθζηά 30 ιεηαβναθήιαηα ςξ πζεακμί νοειζζηέξ. Γζα ηάεε πμζηζθία μ αθβυνζειμξ εθανιυζηδηε βζα 10 ακελάνηδηεξ δεζβιαημθδρίεξ Gibbs λεηζκχκηαξ ιε 216 ηαζ 186 ζοζηάδεξ βζα ηδκ Καθαιχκ ηαζ ηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ακηίζημζπα, ακηζπνμζςπεφμκηαξ ημ ιζζυ πθήεμξ ηςκ ιεηαβναθδιάηςκ ηδξ ηάεε πμζηζθίαξ. Ο αθβυνζειμξ ακηζζημίπζζε ημοξ νοειζζηέξ ζε ηάεε ζοζηάδα παναηηδνζγυιεκμοξ ιε έκα αάνμξ. Σμ ηεθζηυ ζφκμθμ ηςκ νοειζζηχκ μνίζηδηε κα είκαζ αοημί πμο δεκ οπενααίκμοκ ημ υνζμ ημο 10% ηδξ ιέβζζηδξ αανφηδηαξ ηδξ ηάεε πμζηζθίαξ. 73

77 Σμ ηεθζηυ απμηέθεζια ημο αθβυνζειμο είκαζ ιζα μιάδα απυ ζοζηάδεξ πμο απμηεθμφκηαζ απυ αιμζααία απμηθεζζηζηά ζοκ-εηθναγυιεκα ιεηαβναθήιαηα, ιε έκα ηαηάθμβμ απυ νοειζζηέξ ορδθήξ αανφηδηαξ πμο επζζοκάπημκηαζ ζε ηάεε ζοζηάδα GO επηζεκείσζε, ιεηηνπξγηθή αλάιπζε ησλ ππνκνλάδσλ θαη Fisher s exact test Υνδζζιμπμζχκηαξ ημ δδιυζζα δζαεέζζιμ παηέημ Blast2GO V (Conesa et al., 2005), έβζκε δ επζζδιείςζδ ηςκ ιεηαβναθδιάηςκ ιε ημκ ακηίζημζπμ GO υνμ πμο πνμέηορε απυ ημ BLAST. Ανπζηά πναβιαημπμζήεδηε blastx ιέζς ημο QBlast ζηδ αάζδ δεδμιέκςκ NCBI nr-database Οζ οπυθμζπεξ πανάιεηνμζ ημο blast πανέιεζκακ ζηζξ πνμεπζθεβιέκεξ ηζιέξ μνίγμκηαξ ημ e-value ιε ηαηχηενμ υνζμ ημ 1e -3 ηαζ ημ θίθηνμ hsp ίζμ ιε 33. ηδ ζοκέπεζα αημθμφεδζε δ πανημβνάθδζδ (mapping) ηαζ έπεζηα δ επζζδιεζχζδ (annotation) δ μπμία πναβιαημπμζήεδηε πνδζζιμπμζχκηαξ e-value ιε ηαηχηενμ υνζμ ημ 1e -6. ηζξ αημθμοείεξ πμο δεκ ανέεδηε επζζδιείςζδ έβζκε έκα επζπθέμκ αήια πνδζζιμπμζχκηαξ ημ InterProScan (Labarga et al., 2007), ημο δζαημιζζηή ΔΒΙ. Έηζζ ηάεε cdna επζζδιάκεδηε ζφιθςκα ιε ηδκ πθδνμθμνία πμο πνμέηορε απυ ηδκ ακάθοζδ BlastX ηαζ InterProScan. Γζα ηάεε ζοζηάδα ηςκ δομ πμζηζθζχκ ανέεδηε δ επζζδιείςζδ GO πμο οπενηενεί πνδζζιμπμζχκηαξ ημ ενβαθείμ FatiGO (Al-Shahrour et al., 2007), πμο ανίζηεηαζ εκζςιαηςιέκμ ζημ θμβζζιζηυ Blast2GO (Conesa et al., 2005), ιε 0,01 επίπεδμ ζδιακηζηυηδηαξ (p-value) Απεηθφληζε ησλ ξπζκηζηηθψλ δηθηχσλ Η απεζηυκζζδ ηςκ νοειζζηζηχκ δζηηφςκ έβζκε ιε ημ Cytoscape V (Shannon et al., 2003). To δίηηομ δζαημιήξ ηαηαζηεοάζηδηε πνδζζιμπμζχκηαξ ημ επζπνυζεεημ ενβαθείμ Network Analyzer βζα ημ Cytoscape (Assenov et al., 2008). 74

78 3. Απνηειέζκαηα 3.1. Αλάιπζε ESTs θαη θαηαζθεπή κηθξνζπζηνηρίαο Η cdna αζαθζμεήηδ ηαηαζηεοάζηδηε απυ mrna πμο απμιμκχεδηε απυ ζπμνυθοηα εθζάξ (πμζη. Κμνςκέζηδ) 25 διενχκ ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηοπαία αθθδθμφπζζδ 2643 cdna ηθχκςκ. Καηά ηδκ αθθδθμφπζζδ ηδξ αζαθζμεήηδξ μνίζηδηε δ μκμιαζία ηδξ ηαηά ηδκ μπμία ζε ηάεε ηθχκμ ακηζζημζπεί έκα ιμκαδζηυ υκμια πμο εα δζεοημθφκεζ ηδκ ακαγήηδζδ βζα μπμζάδδπμηε ιεθθμκηζηή ιεηαπείνζζδ ημο (πήια 2.6). ημ υκμια ημο ηθχκμο ακαθένεηαζ ημ θοηυ, δ πμζηζθία ηαζ μ ζζηυξ απυ ημκ μπμίμ πνμήθεε δ cdna αζαθζμεήηδ ηαεχξ ηαζ δ ιμκαδζηή εέζδ ημο ηθχκμο ζηα πζάηα απμιυκςζδξ ηςκ ακαζοκδοαζιέκςκ πθαζιζδίςκ ηδξ αζαθζμεήηδξ. ρήκα 2.6. Οκμιαζία ηςκ ηθχκςκ ηδξ cdna αζαθζμεήηδξ ζπμνυθοημο εθζάξ (πμζη. Κμνςκέζηδ). Έπεζηα απυ επελενβαζία ηαζ ακάθοζδ ηςκ αθθδθμοπζχκ πνμέηορακ 1956 ορδθήξ πμζυηδηαξ ESTs (Expressed Sequence Tags) ιε ιέζμ ιήημξ 381 bp (πήια 2.7). ρήκα 2.7. Γζαηφιακζδ ημο ιήημοξ ηςκ 1956 ορδθήξ πμζυηδηαξ ESTs Με ηδκ πνήζδ ημο θμβζζιζημφ SeqManII (DNAstar Inc) ηα 960 απυ ηα 1956 ESTs μιαδμπμζήεδηακ ζε 215 μιάδεξ (contigs) εκχ ηα οπυθμζπα 996 ESTs έπμοκ ιμκαδζηή εηπνμζχπδζδ (singletons). Έηζζ, ημ επίπεδμ επακαθδρζιυηδηαξ ηςκ ESTs (redundancy level), ημ μπμίμ πνμηφπηεζ δζαζνχκηαξ ημκ ανζειυ ηςκ ESTs ιε ημκ 75

79 ζοκμθζηυ ανζειυ ηςκ ESTs, είκαζ 49%. Η ζπεηζηά παιδθή επακαθδρζιυηδηα πνμέηορε απυ ημ βεβμκυξ υηζ ηα 185 απυ ηα 215 contigs απμηεθμφκηαζ απυ παιδθυ ανζειυ ESTs (2-4) εκχ ιυκμ 14 contigs πενζέπμοκ πάκς απυ 10 ESTs (Πίκαηαξ 2.5). Πίλαθαο 2.5. Σμ επίπεδμ επακαθδρζιυηδηαξ ηδξ cdna αζαθζμεήηδξ ζπμνυθοημο εθζάξ Ανζειυξ ESTs/contig Ανζειυξ contigs Η ιαγζηή ακαγήηδζδ μιμθμβζχκ BlastX ηςκ 1211 ιδ-επακαθαιαακυιεκςκ (nonredundant) ESTs, ιε ιέζμ ιήημξ 412 bp (πήια 2.8) πναβιαημπμζήεδηε ιε ημ θμβζζιζηυ Blast2GO (Conesa et al., 2005) πνδζζιμπμζχκηαξ ςξ πανάιεηνμ E-value ιζηνυηενδ ημο 1e -6. ρήκα 2.8. Γζαηφιακζδ ημο ιήημοξ ηςκ 1211 ιδ-επακαθαιαακυιεκςκ (nonredundant) ESTs Πίλαθαο 2.6. Σα 10 ιεβαθφηενα contigs ζε ανζειυ ESTs Ανζειυξ Οιμθμβία Blastx E-value ESTs/contig 90 Μδ ζδιακηζηή μιμζυηδηα 71 Glycine-rich protein (Citrus unshiu) 1e Pathogen related protein (Salvia miltiorhiza) 1e Metallothionein-like protein (Vitis vinifera) Άβκςζηδ πνςηεΐκδ (Vitis vinifera) 8e Auxin repressed protein (Manihot esculenta) 9.4e Lipid transfer protein (Olea europaea) 1.14e Metallothionein-like protein (Pimpinella brachycarpa) 3.95e Metallothionein-like protein (kiwi fruit) 2e Tonoplast intrinsic protein (Nicotiana tabacum) 1.43e

80 Η μιμθμβία BlastX ηςκ 10 contigs ιε ηα πενζζζυηενα ESTs θαίκεηαζ ζημκ Πίκαηα 2.6. Μεβάθμ ιενίδζμ ηςκ 1211 ιδ-επακαθαιαακυιεκςκ ESTs (33.5%) ηςδζημπμζεί πνςηεΐκεξ ιε άβκςζηδ θεζημονβία εκχ βζα ημ 26.5% ηςκ ESTs δεκ ανέεδηε ζδιακηζηή μιμθμβία ιε ηάπμζα αθθδθμοπία ζηζξ αάζεζξ δεδμιέκςκ (πήια 2.9). Σα πενζζζυηενα απυ ηα ESTs ιε βκςζηή θεζημονβία (annotated) ζπεηίγμκηαζ ιε ααζζηέξ, ηοηηανζηέξ, ιαηνμιμνζαηέξ ηαζ ιεηααμθζηέξ δζενβαζίεξ (πήια 2.10). Ωζηυζμ, ηα ESTs πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ααζμηζηέξ ηαζ αζμηζηέξ ηαηαπμκήζεζξ ακηζπνμζςπεφμοκ ηδκ δεφηενδ ζε ιέβεεμξ μιάδα. ρήκα 2.9. Η ηαηακμιή ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηδξ Blast ακάθοζδξ ηςκ 1211 contigs 77

81 ρήκα 2.10 Βζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ, επζπέδμο 3, ηςκ ESTs ορδθήξ πμζυηδηαξ, ιε βκςζηή θεζημονβία, ζφιθςκα ιε ηδκ Blast2GO αάζδ δεδμιέκςκ. 78

82 Μεηά απυ PCR πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ ηαεανζζιυ ηςκ παναπάκς ιδ επακαθαιαακυιεκςκ ESTs, ηοπχεδηακ 200 ιζηνμζοζημζπίεξ αιζκμζζθακίμο πμο πενζθάιαακακ 1121 cdnas ζε ηνείξ επακαθήρεζξ (triplicates). Η πμζυηδηα ηςκ ηοπςιέκςκ ιζηνμζοζημζπζχκ εθέβπεδηε πνζκ ηζξ οανζδμπμζήζεζξ ημο πεζνάιαημξ αθαηυηδηαξ Καηαζθεπή βάζεο δεδνκέλσλ κε ηα απνηειέζκαηα απφ ηελ αιιεινχρηζε ηεο βηβιηνζήθεο ζπνξφθπηνπ ειηάο Σα απμηεθέζιαηα ηδξ αθθδθμφπζζδξ ηαεχξ ηαζ μζ επζζδιεζχζεζξ GO εκζςιαηχεδηακ ζε ιζα αάζδ δεδμιέκςκ πνδζζιμπμζχκηαξ ημ θμβζζιζηυ FileMaker Pro Advanced 11.0v1. Η δδιζμονβία αοηήξ ηδξ αάζδξ είπε ςξ ζημπυ ηδκ εφημθδ ακαγήηδζδ ηδξ αθθδθμοπίαξ ημο ηθχκμο ιε αάζδ ημ υκμια ημο ή ακηίζηνμθα (πήια 2.11) ηαζ ηδκ ακαγήηδζδ ηθχκςκ (πήια 2.12) ή contigs ιε αάζδ (πήια 2.13) ηδκ πενζβναθή BlastX ηαζ BlastN. ρήκα Βάζδ δεδμιέκςκ ιε ηζξ ορδθήξ πμζυηδηαξ αθθδθμοπίεξ ηςκ ηθχκςκ ηδξ cdna αζαθζμεήηδξ απυ ζπμνυθοημ εθζάξ (cv Κμνςκέζηδ) 79

83 ρήκα Ακάγδηδζδ ηθχκςκ ζηδ αάζδ δεδμιέκςκ ιε αάζδ ηδκ πενζβναθή BlastN (ανζζηενά) ηαζ BlastX (δελζά) 80

84 ρήκα Ακάγδηδζδ contigs ζηδ αάζδ δεδμιέκςκ ιε αάζδ ηδκ πενζβναθή BlastN (ανζζηενά) ηαζ BlastX (δελζά) 81

85 3.3. Αχμεζε θπηψλ ειηάο θαη ρεκηθή ζχζηαζε ξίδαο, βιαζηνχ θαη θχιισλ θαηά ηελ θαηαπφλεζε NaCl Φοηά εθζάξ εκυξ έημοξ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ εηηέεδηακ ζε 120 mμ NaCl, οπυ θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ, βζα δζάζηδια 90 διενχκ ημ μπμίμ αημθμοεήεδηε απυ 45-διενχκ πενίμδμ επακαθμνάξ απυ ηδκ ηαηαπυκδζδ. ηδκ πμζηζθία Καθαιχκ παναηδνείηαζ έκημκδ ιείςζδ ηδξ αφλδζδξ έπεζηα απυ 45 διένεξ πμο εκηείκεηαζ ζηζξ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ NaCl (πήια 2.14), εκχ ηαηά ηδκ πενίμδμ επακαθμνάξ ζηζξ θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ δ αφλδζδ ηςκ θοηχκ επακένπεηαζ ζε ηακμκζηά επίπεδα (πήια 2.14). Ακηίεεηα ζηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ δ ιείςζδ ηδξ αφλδζδξ ηςκ θοηχκ βίκεηαζ αζζεδηή ιεηά απυ 15 διένεξ ηαηαπυκδζδ NaCl ηαζ ζηαιαηάεζ εκηεθχξ ιεηά ηζξ 45 διένεξ ηαηαπυκδζδξ εκχ πμθφ ιζηνή αφλδζδ ηςκ θοηχκ λακανπίγεζ ιεηά ηζξ 45 διένεξ επακαθμνάξ ζε θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ (πήια 2.15). Δπζπθέμκ υζμκ αθμνά ημκ νοειυ αφλδζδξ (Πίκαηαξ 2.7 ηαζ 2.8), δ ηθίζδ ηδξ ηαιπφθδξ πμο ακηζπνμζςπεφεζ ηδκ επίπηςζδ ηδξ αθαηυηδηαξ ζημ φρμξ είκαζ ανκδηζηή ηαζ βζα ηζξ δομ πμζηζθίεξ, ιε ηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ κα πανμοζζάγεζ ιεβαθφηενδ ανκδηζηή ηζιή (Β = -16,065) ζε ζπέζδ ιε ηδκ πμζηζθία Καθαιχκ (Β = -9,947). 82

86 ρήκα 2.14 Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ NaCl ζηδκ επζιήηοκζδ ηςκ αθαζηχκ ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ. Σμ ηοπζηυ ζθάθια οπμθμβίζηδηε απυ n ανζειυ δεζβιάηςκ (12 n 40) (P 0,05). ρήκα Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ NaCl ζηδκ επζιήηοκζδ ηςκ αθαζηχκ ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. Σμ ηοπζηυ ζθάθια οπμθμβίζηδηε απυ n ανζειυ δεζβιάηςκ (12 n 40) (P 0,05). 83

87 Πίλαθαο 2.7. Οζ ιεηααθδηέξ πμο ακηζπνμζςπεφμοκ ηδκ επίπηςζδ ηδξ ηαηαπυκδζδξ NaCl ζημ φρμξ ηςκ θοηχκ ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ Μμκηέθμ Μδ ηακμκζημπμζδιέκεξ Μεηααθδηέξ Κακμκζημπμζδιέκεξ Μεηααθδηέξ Β Σοπζηυ ζθάθια Beta ηαεενά 85,441 2,225 Αθαηυηδηα -16,065 1,407-0,528 Πίλαθαο 2.8. Οζ ιεηααθήηεξ πμο ακηζπνμζςπεφμοκ ηδκ επίπηςζδ ηδξ ηαηαπυκδζδξ NaCl ζημ φρμξ ηςκ θοηχκ ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ Μμκηέθμ Μδ ηακμκζημπμζδιέκεξ Μεηααθδηέξ Κακμκζημπμζδιέκεξ Μεηααθδηέξ Β Σοπζηυ ζθάθια Beta ηαεενά 87,006 2,737 Αθαηυηδηα -9,947 1,731-0,298 Σα ζοιπηχιαηα ηδξ επίδναζδξ ηδξ ηαηαπυκδζδξ NaCl, υπςξ κέηνςζδ ηδξ ημνοθήξ ηςκ θφθθςκ ηαζ ημο αθαζημφ ηαεχξ ηαζ πηχζδ ηςκ θφθθςκ, έβζκακ μναηά ιε μπηζηή παναηήνδζδ ιεηά απυ 45 διένεξ ζηδκ εοαίζεδηδ ιυκμ πμζηζθία (Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ) εκχ έβζκακ πζμ έκημκα ζηζξ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ (πήια 2.16). Η έηπηολδ κέςκ θφθθςκ ζηδ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ επακήθεε ιέζα ζε 45 διένεξ ιεηά ηδκ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ (πήια 2.16). ηδκ πμζηζθία Καθαιχκ εηηυξ απυ ηδκ ιεζςιέκδ αθαζηζηή αφλδζδ, ιεηά απυ 45 διένεξ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl, δεκ παναηδνήεδηε ηακέκα άθθμ ζφιπηςια ημλζηυηδηαξ NaCl (πήια 2.16). 84

88 ρήκα Αοηυννζγα ιμζπεφιαηα εθζάξ εκυξ έημοξ ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ (πάκς) ηαζ Καθαιχκ (ηάης) ηαηά ηδκ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ ηαηαπυκδζδξ αθαηυηδηαξ. 1) Μάνηοναξ (control), 2-4) 15, 45, 90 διένεξ ηαηαπυκδζδ NaCl ακηίζημζπα ηαζ 5-6) 15 ηαζ 45 διένεξ επακαθμνά απυ ηδκ ηαηαπυκδζδ NaCl. Η ανηεηά παιδθυηενδ ζοβηέκηνςζδ Na + ζηα θφθθα ηαζ ζημ αθαζηυ ζηδκ Καθαιχκ ζε ζφβηνζζδ ιε ηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ιεηά απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ NaCl, είκαζ εκδεζηηζηή ηδξ πενζμνζζιέκδξ ιεηαθμνάξ ημο Na + απυ ηδκ νίγα ζηα θφθθα ζηδκ ακεεηηζηή πμζηζθία (πήια 2.17). Δπζπθέμκ, έκδεζλδ επζθεηηζηυηδηαξ K +, έκακηζ ημο Νa +, ηδξ ακεεηηζηήξ πμζηζθίαξ είκαζ δ ορδθυηενδ ακαθμβία K + /Na + ζηα θφθθα ηδξ Καθαιχκ ζε ζφβηνζζδ ιε ηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ (πήια 2.18). Αοηή δ δζαθμνεηζηή απυηνζζδ ζηδκ αθαηυηδηα, ζε επίπεδμ πενζεηηζηυηδηαξ ζυκηςκ, ίζςξ ελδβεί εκ ιένεζ ηδκ παναηδνμφιεκδ ακεεηηζηυηδηα ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ. 85

89 ρήκα Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ NaCl, έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ, ζηδκ πενζεηηζηυηδηα Na + ζε νίγα, θφθθα ηαζ αθαζηυ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. Οζ ηάεεηεξ βναιιέξ ακηζπνμζςπεφμοκ ημ ηοπζηυ ζθάθια ηςκ 3 επακαθήρεςκ (P 0,05). 86

90 ρήκα Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ NaCl, έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ, ζηδκ ακαθμβία K/Na ζε νίγα, θφθθα ηαζ αθαζηυ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ (P 0,05). 87

91 3.4. Αλάιπζε κηθξνζπζηνηρίαο Olea europaea L. θαη αλαγλψξηζε cdnas κε δηαθνξηθή έθθξαζε (SAM) Πναβιαημπμζήεδηε δεζβιαημθδρία ζζημφ απυ ηδκ νίγα, έπεζηα απυ 15, 45 ηαζ 90 διένεξ απυ ηαηαπμκδιέκα ιε NaCl θοηά ηαζ ημοξ ιάνηονεξ (control) ηαεχξ ηαζ 15 ηαζ 45 διένεξ ιεηά απυ επακαθμνά ζε ηακμκζηέξ ζοκεήηεξ. Οθζηυ RNA απμιμκχεδηε απυ ηζξ νίγεξ ηςκ παναπάκς δεζβιάηςκ ηαζ πνδζζιμπμζήεδηε βζα οανζδμπμζήζεζξ ιε ηζξ ιζηνμζοζημζπίεξ Olea europaea. Ο πεζναιαηζηυξ ζπεδζαζιυξ ηςκ οανζδμπμζήζεςκ πμο αημθμοεήεδηε είκαζ ημ ζπέδζμ δαηηοθίμο (loop design) (πήια 2.19) υπςξ πνμηείκεηαζ απυ ημοξ Yang & Speed (2002). Βαζζηυ πθεμκέηηδια ημο ζπεδζαζιμφ αοημφ ζε ζπέζδ ιε ημ ζπεδζαζιυ ακαθμνάξ (reference design), είκαζ υηζ οπάνπμοκ άιεζεξ ζοζπεηίζεζξ ιεηαλφ υθςκ ηςκ δεζβιάηςκ εκχ μ ζοκμθζηυξ ανζειυξ οανζδμπμζήζεςκ πμο απαζημφκηαζ είκαζ ζδιακηζηά ιζηνυηενμξ. Καηά ημκ πεζναιαηζηυ ζπεδζαζιυ, έβζκε πνήζδ ηεπκζηχκ επακαθήρεςκ (technical replicates), υπςξ δ πανμοζία ηνζχκ επακαθήρεςκ ημοηηίδςκ ζηδκ ίδζα ιζηνμζοζημζπία, δ οανζδμπμίδζδ ημο ίδζμο οθζημφ ζε δζαθμνεηζηέξ ιζηνμζοζημζπίεξ (ζοκμθζηά ηέζζενζξ αζμθμβζηέξ επακαθήρεζξ), ζοκήεςξ ζδιαζιέκμο ιε δζαθμνεηζηή πνςζηζηή dye swap, βζα κα ιεζςεεί ζδιακηζηά δ πανμοζία εζθαθιέκα εεηζηχκ απμηεθεζιάηςκ (false positives) (πήια 2.19). ρήκα πέδζμ πεζνάιαημξ οανζδμπμζήζεςκ ηφπμο Γαηηοθίμο (loop design). C: Μάνηοναξ, Σ: Μεηαπείνζζδ ιε NaCl, 1: 15 διένεξ ηαηαπυκδζδ, 2: 45 διένεξ ηαηαπυκδζδ, 3: 90 διένεξ ηαηαπυκδζδ, 4: 15 διένεξ επακαθμνά απυ ηδκ ηαηαπυκδζδ, 5: 45 διένεξ επακαθμνά απυ ηδκ ηαηαπυκδζδ. Κάεε αέθμξ 88

92 ακηζπνμζςπεφεζ οανζδμπμίδζδ δομ-πνςζηζηχκ ιεηαλφ ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ πμο ζοκδέεζ. Έηζζ, ηάεε ιεηαπείνζζδ οανζδμπμζήεδηε ζοκμθζηά ηέζζενζξ θμνέξ ιε ηδκ πνδζζιμπμίδζδ δζαθμνεηζημφ θοημφ ηάεε θμνά, πανέπμκηαξ ηέζζενζξ αζμθμβζηέξ επακαθήρεζξ ακά ιεηαπείνζζδ. Η ηεθαθή ηαζ δ μονά ημο αέθμοξ ακηζπνμζςπεφεζ ηζξ πνςζηζηέξ Alexa Fluor 555-aha-dUTP ηαζ Alexa Fluor 647-aha-dUTP ακηίζημζπα. Πίλαθαο 2.9. Σα cdnas ηαζ δ ακηίζημζπδ πενζβναθή ηδξ θεζημονβίαξ ημοξ πμο πενζθαιαάκμκηαζ ζηζξ 4 ζοζηάδεξ πμο πνμέηορακ απυ ηδκ μιαδμπμίδζδ K-means Μεηά ηδκ ακάθοζδ ηδξ εζηυκαξ ηςκ οανζδμπμζήζεςκ, αημθμφεδζε δ ηακμκζημπμίδζδ ιε ηδκ μπμία βίκεηαζ δζυνεςζδ ημο ζοζηδιαηζημφ ζθάθιαημξ πμο έπμοκ μζ ηζιέξ ηςκ εκηάζεςκ θεμνζζιμφ ηαζ μθείθεηαζ ζε ιδ αζμθμβζηέξ δζαθμνέξ. Οζ ηεθζηέξ ηζιέξ έηθναζδξ υθςκ ηςκ cdnas θήθεδζακ βζα ηάεε πνμκζηή ζηζβιή ηαηαπυκδζδξ. οκμθζηά ιεηά ηδκ ηακμκζημπμίδζδ πνμέηορακ βζα ακάθοζδ 432 cdnas ζηδκ Καθαιχκ ηαζ 372 ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. Αημθμφεςξ πναβιαημπμζήεδηε ακάθοζδ ιε ημκ αθβυνζειμ δομ-ηθάζεςκ ζογεοβιέκδ SAM (2- class paired Significant Analysis of Microarray) πνδζζιμπμζχκηαξ ημ θμβζζιζηυ MeV (Quackenbush 2002) βζα κα ανεεμφκ ηα cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ιεηαλφ ηδξ ηαηάζηαζδξ ηαηαπυκδζδξ (NaCl stress) ηαζ ακαθμνάξ (control) ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ. ηδκ πμζηζθία Καθαιχκ εκημπίζηδηακ 51 cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ έπμκηαξ ακαθμβία FDR ίζμ ιε 4.93 (9.68%) ηαζ δ- value Δπζπθέμκ δ μιαδμπμίδζδ Κ-means ειθάκζζε ηέζζενα δζαηνζηά ιμηίαα έηθναζδξ. Μζα μιάδα (cluster) ακηζπνμζςπεφεζ ηα cdnas πμο ζηαδζαηά αολάκμκηαζ (upregulated), άθθδ μιάδα πενζέπεζ cdnas πμο ιεζχκμκηαζ (downregulated) εκχ δφμ μιάδεξ πενζθαιαάκμοκ cdnas πμο ηαηαζηέθθεηαζ ζδιακηζηά δ έηθναζή ημοξ (πήια 2.21). Σα cdnas ηδξ ηάεε μιάδαξ υπςξ ηαζ δ ακηίζημζπδ πενζβναθή ηδξ θεζημονβίαξ (annotation) ημοξ θαίκμκηαζ ζημκ Πίκαηα 2.9. πζηάδα I Όλνκα Σαπηφηεηα Πεξηγξαθή Κιψλνπ GO Όξνο GO se001_b11 1-aminocyclopropane-1- carboxylate oxidase GO: oxidation reduction 1-aminocyclopropane-1-1-aminocyclopropane-1- GO: carboxylate oxidase carboxylate oxidase activity se007_e3 chorismate mutase GO: chorismate mutase activity chorismate mutase GO: aromatic amino acid family biosynthetic process se023_d8 multiple stress-responsive zincfinger protein GO: zinc ion binding se015_g7 phospholipase D GO: cell growth phospholipase D GO: positive regulation of nitrogen utilization 89

93 phospholipase D GO: root development phospholipase D GO: phospholipid catabolic process phospholipase D GO: membrane lipid metabolic process phospholipase D GO: cell division phospholipase D GO: cellular response to potassium ion starvation phospholipase D GO: phospholipase D activity phospholipase D GO: response to osmotic stress phospholipase D GO: post-embryonic development phospholipase D phospholipase D GO: GO: cellular response to nitrogen starvation cellular response to phosphate starvation phospholipase D GO: plasma membrane se016_d11 sucrose phosphate synthase GO: metabolic process sucrose phosphate synthase GO: transferase activity, transferring glycosyl groups se022_g8 ---NA--- GO: ubiquinol-cytochrome-c reductase activity se023_d4 dsrna-binding protein GO: Cajal body dsrna-binding protein GO: nuclear dicing body dsrna-binding protein GO: response to cytokinin stimulus dsrna-binding protein dsrna-binding protein GO: GO: production of mirnas involved in gene silencing by mirna mrna cleavage involved in gene silencing by mirna dsrna-binding protein GO: mirna binding dsrna-binding protein GO: identical protein binding dsrna-binding protein GO: production of ta-sirnas involved in RNA interference dsrna-binding protein GO: double-stranded RNA binding dsrna-binding protein GO: response to auxin stimulus dsrna-binding protein GO: response to abscisic acid stimulus se013_b12 one helix protein 2 GO: response to light intensity one helix protein 2 GO: chloroplast thylakoid membrane Όλνκα Κιψλνπ se011_a8 se015_b4 πζηάδα II Πεξηγξαθή Σαπηφηεηα GO ubiquitin-associated ts-n domain-containing protein GO: ubiquitin-associated ts-n domain-containing protein GO: glycoside hydrolase family 28 protein GO: glycoside hydrolase family 28 protein GO: glycoside hydrolase family 28 protein GO: Όξνο GO intracellular zinc ion binding cell part polygalacturonase activity carbohydrate metabolic process Όλνκα Κιψλνπ se023_e3 Πεξηγξαθή mitochondrial import inner membrane translocase subunit tim9 Cluster III Σαπηφηεηα GO GO: Όξνο GO transmembrane transport mitochondrial import inner GO: P-P-bond-hydrolysis-driven protein 90

94 membrane translocase subunit transmembrane transporter activity TIM9 mitochondrial import inner embryonic development ending in membrane translocase subunit GO: seed dormancy TIM 9 mitochondrial import inner membrane translocase subunit GO: mitochondrial inner membrane TIM 9 mitochondrial import inner membrane translocase subunit TIM 9 GO: metal ion binding mitochondrial import inner protein import into mitochondrial membrane translocase subunit GO: inner membrane TIM 9 mitochondrial import inner mitochondrial intermembrane space membrane translocase subunit GO: protein transporter complex TIM 9 se013_d9 mal d GO: defense response mal d GO: response to biotic stimulus se011_b7 pollen ole e 1 allergen and extensin family protein GO: cell part se007_e10 hect ubiquitin-protein ligase 3 GO: DNA endoreduplication hect ubiquitin-protein ligase 3 GO: binding hect ubiquitin-protein ligase 3 GO: protein modification process hect ubiquitin-protein ligase 3 GO: intracellular hect ubiquitin-protein ligase 3 GO: trichome branching hect ubiquitin-protein ligase 3 GO: ubiquitin-protein ligase activity se011_a4 nuclear inhibitor of protein phosphatase- GO: regulation of developmental growth nuclear inhibitor of protein phosphatase- GO: cell proliferation nuclear inhibitor of protein phosphatase- GO: RNA binding nuclear inhibitor of protein phosphatase- GO: protein binding nuclear inhibitor of protein production of mirnas involved in GO: phosphatase- gene silencing by mirna nuclear inhibitor of protein phosphatase- GO: nucleus nuclear inhibitor of protein phosphatase- GO: cytosol se015_e4 26s proteasome regulatory eukaryotic translation initiation GO: subunit factor 3 complex 26s proteasome regulatory subunit GO: translational initiation 26s proteasome regulatory subunit GO: translation initiation factor activity 26s proteasome regulatory subunit GO: membrane 26s proteasome regulatory subunit GO: nucleus se016_a11 RCD1 (radical-induced cell death1) protein binding GO: programmed cell death RCD 1 (radical-induced cell death1) protein binding GO: lateral root morphogenesis RCD 1 (radical-induced cell death1) protein binding GO: response to ozone RCD 1 (radical-induced cell death1) protein binding GO: response to water deprivation 91

95 RCD 1 (radical-induced cell jasmonic acid mediated signaling GO: death1) protein binding pathway RCD 1 (radical-induced cell death1) protein binding GO: response to salt stress RCD 1 (radical-induced cell death1) protein binding GO: embryonic development RCD 1 (radical-induced cell death1) protein binding GO: protein binding RCD 1 (radical-induced cell death1) protein binding GO: response to superoxide RCD 1 (radical-induced cell death1) protein binding GO: cytoplasm RCD 1 (radical-induced cell death1) protein binding GO: response to hydrogen peroxide RCD 1 (radical-induced cell death1) protein binding GO: nitric oxide biosynthetic process RCD 1 (radical-induced cell defense response to bacterium, GO: death1) protein binding incompatible interaction RCD 1 (radical-induced cell death1) protein binding GO: nucleus RCD 1 (radical-induced cell ethylene mediated signaling GO: death1) protein binding pathway se015_d5 protein GO: chloroplast envelope protein GO: protein metabolic process protein GO: protein binding protein GO: ATP binding protein GO: chloroplast stroma protein GO: thylakoid se014_h11 3-deoxy-d-arabinoheptulosonate 7-phosphate GO: shikimate biosynthetic process synthase 3-deoxy-d-arabinoheptulosonate 7-phosphate synthase GO: chorismate biosynthetic process 3-deoxy-d-arabinoheptulosonate 7-phosphate synthase 3-deoxy-d-arabinoheptulosonate 7-phosphate synthase 3-deoxy-d-arabinoheptulosonate 7-phosphate synthase 3-deoxy-d-arabinoheptulosonate 7-phosphate synthase GO: GO: GO: GO: aromatic amino acid family biosynthetic process membrane plastid 3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase activity se022_a6 GHMP kinase family protein GO: cellular metabolic process GHMP kinase family protein GO: transferase activity, transferring phosphorus-containing groups se015_a5 GHMP kinase family protein GO: nucleotide binding NADH-ubiquinone mitochondrial electron transport, GO: oxidoreductase b18 NADH to ubiquinone NADH -ubiquinone GO: respiratory chain complex I oxidoreductase b18 NADH -ubiquinone NADH dehydrogenase GO: oxidoreductase b18 (ubiquinone) activity NADH-ubiquinone GO: photorespiration oxidoreductase b18 92

96 NADH -ubiquinone oxidoreductase b18 GO: plastid NADH -ubiquinone oxidoreductase b18 GO: mitochondrial membrane se011_d4 chaperone protein GO: response to stress chaperone protein GO: nucleus chaperone protein GO: heat shock protein binding se007_g9 CCR4-associated factor GO: poly(a)-specific ribonuclease activity CCR 4-associated factor GO: nucleic acid binding CCR 4-associated factor GO: nucleus CCR 4-associated factor GO: RNA modification Όλνκα Κιψλνπ se015_b12 se015_a1 se015_d11 πζηάδα IV Πεξηγξαθή Σαπηφηεηα GO GRAS family transcription factor GO: GRAS family transcription factor GO: GRAS family transcription factor GO: GRAS family transcription factor GO: small glutamine-rich tetratricopeptide repeatcontaining GO: protein small glutamine-rich tetratricopeptide repeatcontaining GO: protein multidrug pheromone mdr abc transporter family GO: multidrug pheromone mdr abc transporter family GO: multidrug pheromone mdr abc transporter family GO: multidrug pheromone mdr abc transporter family GO: Όξνο GO response to gibberellin stimulus regulation of transcription transcription factor activity nucleus response to salt stress positive regulation of abscisic acid mediated signaling pathway cellular process basipetal auxin transport positive gravitropism ATPase activity, coupled to transmembrane movement of substances multidrug pheromone mdr abc transporter family GO: photomorphogenesis multidrug pheromone mdr abc transporter family GO: response to blue light multidrug pheromone mdr abc transporter family GO: acropetal auxin transport multidrug pheromone mdr abc transporter family GO: response to auxin stimulus multidrug pheromone mdr abc transporter family GO: regulation of cell size multidrug pheromone mdr abc auxin efflux transmembrane GO: transporter family transporter activity multidrug pheromone mdr abc anthocyanin accumulation in tissues GO: transporter family in response to UV light multidrug pheromone mdr abc transporter family GO: protein binding multidrug pheromone mdr abc transporter family GO: stamen development multidrug pheromone mdr abc GO: lateral root development 93

97 se021_h12 transporter family multidrug pheromone mdr abc transporter family multidrug pheromone mdr abc transporter family multidrug pheromone mdr abc transporter family amp-dependent synthetase and ligase amp-dependent synthetase and ligase amp-dependent synthetase and GO: GO: GO: GO: GO: GO: response to far red light plasma membrane ATP binding chloroplast phylloquinone biosynthetic process o-succinylbenzoate-coa ligase activity ligase se023_b3 act domain-containing protein GO: chloroplast envelope act domain-containing protein GO: response to cold act domain-containing protein GO: amino acid binding act domain-containing protein GO: stromule act domain-containing protein GO: chloroplast stroma act domain-containing protein GO: metabolic process act domain-containing protein GO: chloroplast thylakoid membrane se013_g10 inosine-5 -monophosphate dehydrogenase GO: IMP dehydrogenase activity inosine-5 -monophosphate dehydrogenase GO: GMP biosynthetic process inosine-5 -monophosphate dehydrogenase GO: metal ion binding inosine-5 -monophosphate dehydrogenase GO: oxidation reduction se022_f6 hexokinase 2 GO: programmed cell death hexokinase 2 GO: plastid outer membrane hexokinase 2 GO: mitochondrion hexokinase 2 GO: carbohydrate metabolic process hexokinase 2 GO: ATP binding hexokinase 2 GO: hexokinase-dependent signaling hexokinase 2 GO: chloroplast hexokinase 2 GO: glucokinase activity hexokinase 2 GO: cellular metabolic process hexokinase 2 GO: fructokinase activity Η πενζβναθή ηδξ θεζημονβίαξ ηςκ cdnas ιε δζαθμνζηή έηθναζδ έδεζλε υηζ ηα 22 απυ ηα 51 cdnas ζπεηίγμκηαζ ιε απυηνζζδ ζε ενεείζιαηα ηαηαπμκήζεςκ, αζμθμβζηχκ νοειίζεςκ ηαζ ακαπηολζαηχκ δζαδζηαζζχκ (πήιαηα 2.20 ηαζ 2.23). Ακηίζημζπα, ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ εκημπίζηδηακ ιυκμ έλζ cdnas πμο εηθνάγμκηαζ δζαθμνζηά ιε ακαθμβία FDR 1.5 (25%) ηαζ δ-value 0.47 ηαε υθδ ηδκ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ. Η πενζβναθή ηδξ θεζημονβίαξ (GO) ηςκ έλζ cdnas έδεζλε υηζ ειπθέημκηαζ ζε ηοηηανζηέξ ηαζ ιεηααμθζηέξ δζενβαζίεξ (πήια 2.20 ηαζ 2.22). 94

98 ρήκα Ανζειυξ cdnas βζα ηα μπμία εκημπίζηδηε πενζβναθή ηδξ θεζημονβίαξ ημοξ (επζζδιείςζδ) ζηζξ πμζηζθίεξ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ (2-class paired SAM). Βνέεδηε πενζβναθή βζα ηα 22/51 cdnas ζηδκ Καθαιχκ ηαζ 5/6 βμκίδζα ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ πνδζζιμπμζχκηαξ ςξ υνζμ ημ 1e -6 ζηδκ ακαγήηδζδ BlastX ιε ημ θμβζζιζηυ Blast2GO. ρήκα K-means μιαδμπμίδζδ ηςκ 51 cdnas ηδξ Καθαιχκ ιε δζαθμνζηή έηθναζδ. Η Log2(Μεηαπείνζζδ/Μάνηοναξ) βμκζδζαηή έηθναζδ εηπνμζςπείηαζ απυ 4 μιάδεξ Κ-means πμο πενζθαιαάκμοκ ηα ελήξ ιμηίαα έηθναζδξ: (Ι) ιυκζια ανκδηζηή έηθναζδ, (ΙΙ) ιυκζια εεηζηή έηθναζδ, (ΙΙΙ) εεηζηή ζηδκ ανπή ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα βίκεηαζ εθαθνχξ ανκδηζηή ηαζ (IV) εεηζηή ζηδκ ανπή ηαζ ζηδκ ζοκέπεζα βίκεηαζ έκημκα ανκδηζηή. ε ηάεε μιάδα ακαθένεηαζ μ ανζειυξ ηςκ cdnas. Η νμγ βναιιή ζε ηάεε μιάδα ακαπανζζηά ημ βεκζηυ ιμηίαμ έηθναζδξ. 95

99 ρήκα Βζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ηα cdnas ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ ιε βκςζηή επζζδιείςζδ GO. ρήκα Βζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ηα cdnas ηδξ Καθαιχκ ιε βκςζηή επζζδιείςζδ GO. ηδκ ζοκέπεζα ιε ηδκ εθανιμβή ημο αθβυνζειμο δομ-ηθάζεςκ ιδ-ζογεοβιέκδ SAM (Significant Analysis of Microarrays) ακαθφεδηε λεπςνζζηά δ πενίμδμξ ηαηαπυκδζδξ απυ ηδκ πενίμδμ επακαθμνάξ ηαζ εκημπίζηδηακ 209 cdnas πμο εηθνάγμκηαζ δζαθμνεηζηά ζηδκ Καθαιχκ ηαζ 36 ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ιε ζδιακηζηέξ αθθαβέξ ζηα επίπεδα έηθναζδξ θυβς ηαηαπυκδζδξ, ιε ακαθμβία FDR ιζηνυηενδ απυ 6.5%. Η ζενανπζηή μιαδμπμίδζδ (Hierarchical clustering) αοηχκ ηςκ cdnas ειθάκζζε δομ μιάδεξ βζα ηάεε πμζηζθία ιε δζαθμνεηζηά ιμηίαα έηθναζδξ 96

100 ζηδκ απυηνζζδ ηαηαπυκδζδξ NaCl (πήια 2.24). ηδκ πνχηδ ζοζηάδα ηδξ Καθαιχκ, δ μπμία πενζθαιαάκεζ 50 cdnas, δ έηθναζδ ημοξ ιεζχκεηαζ έπεζηα απυ 15 διένεξ ηαηαπυκδζδξ, αολάκεηαζ ζηζξ 45 διένεξ ηαζ λακαιεζχκεηαζ ζηζξ 90 διένεξ ιεηαπείνζζδξ ιε NaCl (πήια 2.24Α). Η δεφηενδ ζοζηάδα ηςκ 159 cdnas ειθάκζζε δζαθμνεηζηυ ιμηίαμ έηθναζδξ ηαεχξ ζδιεζχεδηε αφλδζδ ηαευθδ ηδ δζάνηεζα ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl (πήια 2.24Α). ηδκ πμζηζθία Καθαιχκ, υθα ηα cdnas ιεζχκμοκ ηδκ έηθναζδ ημοξ ζδιακηζηά ζε υθδ ηδκ πενίμδμ επακαθμνάξ απυ ηδκ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl. ηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ δ έηθναζδ ηδξ πνχηδξ μιάδαξ ηςκ 16 cdnas πανμοζζάγεζ ζηαδζαηή ιείςζδ ιεηά απυ 45 ηαζ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ NaCl, εκχ αολάκεηαζ ζδιακηζηά έπεζηα απυ 15 διένεξ επακαθμνάξ ζε θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ (πήια 2.24Β). Η δεφηενδ μιάδα ηςκ 20 cdnas, ειθάκζζε αηνζαχξ ημ ακηίεεημ ιμηίαμ έηθναζδξ. Η έηθναζδ ηςκ cdnas αολάκεηαζ ηονίςξ ιεηά απυ 45 ηαζ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ εκχ ιεζχκεηαζ ζδιακηζηά ιεηά απυ επακαθμνά ζε ηακμκζηέξ ζοκεήηεξ 15 ηαζ ηονίςξ 45 διενχκ (πήια 2.24Β). 97

101 ρήκα 2.24 Iενανπζηή μιαδμπμίδζδ (Hierarchical Clustering) ηςκ cdnas πμο πανμοζζάγμοκ δζαθμνζηή έηθναζδ ιεηαλφ ηαηαπυκδζδξ NaCl ηαζ επακαθμνάξ απυ ηαηαπυκδζδ NaCl. Α) ηδκ πμζηζθία Καθαιχκ, 209 cdnas εηθνάγμκηαζ δζαθμνεηζηά ιεηαλφ ηαηαπυκδζδξ ηαζ επακαθμνάξ ζε θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ. Αοηά ηα cdnas μιαδμπμζμφκηαζ ζενανπζηά ζε δφμ ηφνζεξ μιάδεξ (ζδιεζχκμκηαζ ιε 2 έβπνςιεξ ηάεεηεξ νάαδμοξ). Β) ηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ, 36 cdnas εηθνάγμκηαζ δζαθμνζηά ιεηαλφ ηαηαπυκδζδξ ηαζ επακαθμνάξ ζε θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ. Αοηά ηα cdnas μιαδμπμζμφκηαζ ζενανπζηά ζε δφμ ηφνζεξ μιάδεξ (ζδιεζχκμκηαζ ιε δφμ έβπνςιεξ ηάεεηεξ νάαδμοξ). Δπζπθέμκ, ζφβηνζζδ ηςκ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ιεηαλφ ηςκ δομ πμζηζθζχκ ηαηαδεζηκφεζ ιμκαδζηά αθθά ηαζ ημζκά cdnas, ηα μπμία πανμοζζάγμκηαζ ζπδιαηζηά ιε ημ δζάβναιια Venn (πήια 2.25). οβηεηνζιέκα, μζ δφμ πμζηζθίεξ έπμοκ 21 ημζκά cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ, ζε απυηνζζδ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl (Πίκαηαξ 2.10), ηα μπμία ζπεηίγμκηαζ ιε ηοηηανζηέξ 98

102 ηαζ ιεηααμθζηέξ δζενβαζίεξ ηαεχξ ηαζ ζε απυηνζζδ ενεείζιαημξ ηαηαπυκδζδξ (πήια 2.26). Σα 188 cdnas πμο ειθακίγμοκ δζαθμνεηζηή έηθναζδ ιυκμ ζηδκ πμζηζθία Καθαιχκ (Πίκαηαξ 2.11) ζπεηίγμκηαζ ηονίςξ ιε ηοηηανζηέξ ηαζ ιεηααμθζηέξ δζενβαζίεξ εκχ 24 cdnas ζοκδέμκηαζ ιε απυηνζζδ ζε ενέεζζια ηαηαπυκδζδξ (πήια 2.27). Ακηίεεηα, ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ηακέκα απυ ηα 15 cdnas ιε δζαθμνζηή έηθναζδ (Πίκαηαξ 2.12) δεκ ζπεηίγεηαζ ιε απυηνζζδ ζηδκ ηαηαπυκδζδ (πήια 2.28). ρήκα Γζαβνάιιαηα Venn ηςκ δζαθμνζηά εηθναζιέκςκ cdnas πμο πνμέηορακ απυ ζφβηνζζδ ιεηαλφ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ. ρήκα Πενζβναθή GO επζπέδμο 2 ηςκ αζμθμβζηχκ δζενβαζζχκ ηςκ 21 ημζκχκ cdnas ιεηαλφ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. 99

103 Πίλαθαο Σα 15 απυ ηα 21 ημζκά cdnas ιεηαλφ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ πμο ειθακίγμοκ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ηαζ βζα ηα μπμία ανέεδηε δ πενζβναθή ηδξ θεζημονβίαξ ημοξ ηαζ δ GO επζζδιείςζδ. Όλνκα Κιψλνπ se002_b06 se013_f2 Πεξηγξαθή auxin-repressed protein S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase se024_e11 metallothionein-like protein F:metal ion binding se007_c11 se018_h7 se021_h1 autophagy-related protein 8 precursor plasma membrane intrinsic protein 60s ribosomal protein GOs P:response to glucose stimulus; P:response to fructose stimulus; P:response to sucrose stimulus P:response to cadmium ion; C:mitochondrion; P:metabolic process; F:methyltransferase activity F:receptor activity P:transmembrane transport; C:integral to membrane; F:transporter activity C:vacuole; F:structural constituent of ribosome; C:plasma membrane; C:cytosolic large ribosomal subunit; P:translation se021_f1 MLP28 (mlp-like protein 28) P:defense response; P:response to biotic stimulus se016_c3 aldehyde dehydrogenase P:oxidation reduction; F:3-chloroallyl aldehyde dehydrogenase activity; F:retinal dehydrogenase activity; F:aldehyde dehydrogenase (NAD) activity se024_h12 transcription factor F:DNA binding; C:nucleus se019_a3 se013_g9 se003_c11 catalase soul heme-binding family protein acyl- synthetase-like protein se007_g5 at1g64350 f15h21_2 C:membrane se023_b10 se012_b6 cytochrome p450 NF-YB13 (nuclear factor subunit b13) transcription factor P:response to oxidative stress; F:iron ion binding; F:catalase activity; P:oxidation reduction C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle; C:vacuole; F:binding; C:plasma membrane P:fatty acid biosynthetic process; C:plasma membrane F:monooxygenase activity; F:electron carrier activity; F:heme binding; P:oxidation reduction F:sequence-specific DNA binding; P:regulation of transcription; F:transcription factor activity; C:nucleus 100

104 ρήκα Πενζβναθή GO επζπέδμο 2 ηςκ αζμθμβζηχκ δζαδζηαζζχκ ηςκ 188 cdnas πμο ειθακίγμοκ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ιυκμ ζηδκ πμζηζθία Καθαιχκ. Πίλαθαο Σα 142 απυ ηα 188 cdnas πμο ειθακίγμοκ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ιυκμ ζηδκ πμζηζθία Καθαιχκ ηαζ βζα ηα μπμία ανέεδηε δ πενζβναθή ηδξ θεζημονβίαξ ημοξ ηαζ δ GO επζζδιείςζδ. Όλνκα Κιψλνπ se012_c12 se011_b6 se015_a7 Πεξηγξαθή xyloglucan endotransglycosylase nucleic acid binding protein auxin-repressed protein se005_g2 nucleotide-binding protein 1 se025_d6 metallothionein-like protein F:metal ion binding se021_c11 se021_d5 se015_a1 metallothionein-like protein protein kinase interacting protein small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing protein Όξνη GO F:hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds; P:cellular glucan metabolic process; C:apoplast; C:cell wall; F:xyloglucan:xyloglucosyl transferase activity; F:DNA topoisomerase (ATPhydrolyzing) activity; F:ATP binding; P:DNA topological change C:nucleus; C:plasma membrane; F:nucleic acid binding F:molecular_function; P:biological_process; C:cellular_component C:cytosol; F:protein homodimerization activity; F:iron-sulfur cluster binding P:alanine metabolic process; F:alanine racemase activity F:kinase activity; F:molecular_function; P:biological_process; C:cellular_component P:response to salt stress; P:positive regulation of abscisic acid mediated signaling pathway se013_d9 mal d P:defense response; P:response to biotic stimulus se015_g11 metallothionein-like protein F:metal ion binding 101

105 se010_h11 ubiquitin P:ubiquitin-dependent protein catabolic process; P:response to UV-B; C:nucleolus; P:response to salicylic acid stimulus; P:protein ubiquitination; F:protein binding; P:aging; C:vacuole; C:cytosolic large ribosomal subunit se021_f6 ubiquitin extension protein C:ribosome; F:structural constituent of ribosome; C:nucleus; P:translation se016_f7 cysteine proteinase inhibitor F:cysteine-type endopeptidase inhibitor activity se011_g7 cysteine inhibitor 1 F:peptidase inhibitor activity se015_b11 protein C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle se007_g11 translation factor P:translational initiation; F:translation initiation factor activity; P:regulation of translation se012_f7 histone H3 C:nucleosome; F:DNA binding; P:nucleosome assembly; C:nucleus se006_a6 cyclophilin P:protein folding; F:peptidyl-prolyl cis-trans isomerase activity se011_c6 40s ribosomal protein s5 C:vacuole; F:structural constituent of ribosome; C:plasma membrane; F:RNA binding; C:cell wall; C:cytosolic small ribosomal subunit; C:chloroplast; P:translation se013_c12 protein P:response to stress se014_h8 se023_g8 se023_d6 se013_f6 se023_g6 ubiquitin-like protein smt3 protease inhibitor seed storage lipid transfer protein family protein protein ap2 domain containing protein hydrophobic protein lti6b C:cytoplasm; F:protein tag; P:protein sumoylation; F:protein binding; C:nucleus; P:response to heat; F:magnesium ion binding; F:inorganic diphosphatase activity; P:phosphate metabolic process C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle; F:peptidase activity; P:lipid transport; F:lipid binding; C:anchored to membrane; C:endomembrane system C:plastid; P:pentose-phosphate shunt; F:6- phosphogluconolactonase activity P:cellular process; F:transcription regulator activity; F:DNA binding; P:response to ethylene stimulus; C:intracellular part C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle; C:integral to membrane se013_h9 actin depolymerizing factor 2 F:actin binding; C:intracellular se013_a1 gtp-binding protein ara-3 se006_f9 elongation factor 1- se013_f4 se013_c5 thioredoxin-like 4a 60s ribosomal protein bbc1 protein se012_h12 phytoalexin deficient 4 se016_d9 se001_b11 eukaryotic translation initiation factor 5a isoform iv 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase C:vacuole; F:GTP binding; C:plasma membrane; F:hydrolase activity; P:ethylene mediated signaling pathway; P:small GTPase mediated signal transduction; P:protein transport F:nucleotidyltransferase activity; F:nucleotide binding C:U5 snrnp; C:spliceosomal complex; F:protein binding; P:mitosis; P:spliceosome assembly; F:catalytic activity; C:plastid; P:cell division F:structural constituent of ribosome; C:plasma membrane; P:ribosome biogenesis; C:cell wall; C:cytosolic large ribosomal subunit; P:translation C:cytoplasmic part; C:intracellular membranebounded organelle F:nucleic acid binding; P:regulation of translation P:oxidation reduction; F:1-aminocyclopropane-1- carboxylate oxidase activity 102

106 se012_b11 protein C:ribosome; F:structural constituent of ribosome; P:translation; C:mitochondrion se013_a9 secretory peroxidase F:heme binding; P:oxidation reduction; F:peroxidase activity; F:protein binding; P:response to oxidative stress se002_h08 cathepsin b-like cysteine proteinase C:endomembrane system; C:vacuole; P:proteolysis; P:regulation of catalytic activity; F:cysteine-type endopeptidase activity se024_f5 major latex-like protein P:defense response; P:response to biotic stimulus se005_g4 se018_h5 60s acidic ribosomal protein p3 40s ribosomal protein se012_g8 ubiquitin conjugating F:ligase activity se025_f5 se014_c11 se002_g12 60s ribosomal protein l23a pollen ole e 1 allergen and extensin family protein catr_atrnu ame: full=caltractin ame: full=centrin C:cytosolic ribosome; F:structural constituent of ribosome; C:nucleus; P:translational elongation C:vacuole; F:structural constituent of ribosome; C:plasma membrane; F:RNA binding; C:cytosolic small ribosomal subunit; C:chloroplast; P:translation; P:response to salt stress P:response to high light intensity; P:response to cold; P:response to oxidative stress; F:RNA binding; C:cell wall; C:cytosolic large ribosomal subunit; C:membrane; P:translation C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle F:binding; P:cellular process; F:catalytic activity; C:intracellular part se021_h10 ctp:phosphocholine F:choline-phosphate cytidylyltransferase activity; cytidylyltransferase P:biosynthetic process se015_d1 P:nucleosome assembly; C:nucleus; P:DNA repair; nucleosome chromatin assembly C:cytoplasm; P:DNA mediated transformation; factor group F:DNA binding se012_g3 nc domain-containing protein F:molecular_function; P:biological_process; C:cellular_component se017_d9 40s ribosomal protein s11 F:structural constituent of ribosome; C:cell wall; P:embryonic development ending in seed dormancy; C:cytosolic small ribosomal subunit; C:chloroplast; C:membrane; P:translation; F:rRNA binding se016_a7 enzyme of the cupin superfamily C:chloroplast se015_b7 se008_b11 se022_f9 photosystem I reaction center subunit n cytochrome p450 protein se010_h6 at1g22630 f12k8_2 C:chloroplast C:chloroplast thylakoid lumen; P:photosynthetic electron transport in photosystem I; C:chloroplast photosystem I; F:calmodulin binding C:microsome; F:(S)-limonene 6-monooxygenase activity; P:oxidation reduction; F:(S)-limonene 3- monooxygenase activity; C:membrane; F:electron carrier activity; F:heme binding F:trehalose-phosphatase activity; P:trehalose biosynthetic process se006_b11 protein P:response to salt stress; C:mitochondrion; P:oxygen and reactive oxygen species metabolic process; F:NAD+ ADP-ribosyltransferase activity se015_g3 pollen-specific protein c13 C:extracellular space; F:molecular_function; P:biological_process se006_d11 nitrilase-associated protein F:molecular_function; P:biological_process se015_f9 protein P:biological_process; C:cellular_component; C:plasma membrane 103

107 se006_c11 UDP-glucoronosyl UDP-glucosyl transferase family protein F:transferase activity, transferring hexosyl groups se016_d7 RNA helicase F:ATP-dependent helicase activity; F:nucleotide binding F:protein binding; P:protein deneddylation; se016_d4 cop9 signalosome complex subunit P:ubiquitin-dependent protein catabolic process; 6a P:photomorphogenesis; C:signalosome; C:plastid; P:signalosome assembly C:mitochondrial respiratory chain complex III; se017_a11 ubiquinol-cytochrome c reductase F:ubiquinol-cytochrome-c reductase activity; complex kda protein P:mitochondrial electron transport, ubiquinol to cytochrome c se016_h11 ubiquitin-like protein 5 F:molecular_function; C:cellular_component se016_c8 protein F:structural molecule activity; F:protein binding; P:intracellular protein transport; P:vesicle-mediated transport; C:clathrin coat of trans-golgi network vesicle; C:clathrin coat of coated pit se017_a10 GRAS family transcription factor P:maintenance of protein location in nucleus; P:regulation of transcription; C:plastid; F:sequencespecific DNA binding; P:asymmetric cell division; F:transcription factor activity; P:radial pattern formation; P:gravitropism; F:protein homodimerization activity; C:nucleus se017_a1 purple acid phosphatase-like protein C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle; F:metal ion binding; F:protein serine/threonine phosphatase activity; F:acid phosphatase activity se010_h8 mitochondrial processing peptidase F:metalloendopeptidase activity; P:proteolysis; F:zinc ion binding se011_a9 NAM-like protein 1 P:regulation of transcription; F:DNA binding se010_h3 brix domain-containing protein C:cellular_component; F:molecular_function; P:biological_process se010_h12 DNA-binding protein P:regulation of transcription, DNA-dependent; F:sequence-specific DNA binding; P:transcription; P:regulation of transcription; F:transcription regulator activity; C:nucleus; F:transcription factor activity; F:DNA binding se010_h1 esterase lipase thioesterase family C:plasma membrane; F:catalytic activity protein se010_f8 ubx domain-containing protein C:cytosol se010_g10 se016_b4 se015_f5 se006_c7 se016_c12 protein vitamin-b12 independent methionine 5- methyltetrahydropteroyltriglutamatehomocysteine UDP-galactose 4-epimerase-like protein surfeit locus protein 2 family protein surf2 family protein unnamed protein product [Vitis vinifera] F:molecular_function; P:biological_process; C:cellular_component C:cytoplasm; P:methionine biosynthetic process; F:zinc ion binding; F:5- methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine S-methyltransferase activity F:protein dimerization activity; P:response to stress; P:cell wall biogenesis; F:UDP-glucose 4-epimerase activity; P:galactose metabolic process; F:coenzyme binding; C:cytosol F:molecular_function; P:biological_process; C:cellular_component F:transferase activity; P:auxin biosynthetic process; F:protein serine/threonine kinase activity; F:protein kinase activity; P:protein amino acid phosphorylation; F:nucleotide binding; F:ATP binding; F:kinase activity; F:protein binding; F:calcium ion binding 104

108 se006_b10 cys2-his2 type zinc finger protein C:intracellular; F:zinc ion binding se015_a9 se015_d5 PREDICTED: hypothetical protein isoform 2 [Vitis vinifera] protein F:nucleic acid binding; F:nucleotidyltransferase activity; F:exonuclease activity; F:transferase activity; F:DNA-directed DNA polymerase activity; C:intracellular C:chloroplast envelope; P:protein metabolic process; F:protein binding; F:ATP binding; C:chloroplast stroma; C:thylakoid se021_c1 protein P:intracellular transport; F:nucleotide binding unnamed protein product [Vitis C:nucleus; F:DNA binding se023_f11 vinifera] se006_g8 peroxisomal targeting signal 1 receptor F:peroxisome matrix targeting signal-1 binding; P:protein targeting to peroxisome; F:protein binding; P:response to auxin stimulus se021_c7 protein - se014_h6 protein F:protein domain specific binding se021_h7 galactosyltransferase family protein C:endomembrane system; F:galactosylxylosylprotein 3-betagalactosyltransferase activity; C:Golgi apparatus; P:protein amino acid glycosylation; C:integral to membrane se014_h9 stress-induced protein F:molecular_function; P:biological_process se014_f10 se015_d11 se021_h12 se021_h11 se023_c8 se014_c4 se013_h5 se023_c11 protein multidrug pheromone mdr abc transporter family AMP-dependent synthetase and ligase vesicle-associated membrane protein 725 plastidic phosphate translocator-like protein1 predicted protein [Populus trichocarpa] conserved hypothetical protein [Ricinus communis] r3h domain containing se018_d11 peroxidase 17 se007_d7 se023_h6 glutamine-dependent NAD(+) transferring glycosyl groups P:glycolysis; F:fructose-bisphosphate aldolase activity P:cellular process; P:basipetal auxin transport; P:positive gravitropism; F:ATPase activity, coupled to transmembrane movement of substances; P:photomorphogenesis; P:response to blue light; P:acropetal auxin transport; P:response to auxin stimulus; P:regulation of cell size; F:auxin efflux transmembrane transporter activity; P:anthocyanin accumulation in tissues in response to UV light; F:protein binding; P:stamen development; P:lateral root development; P:response to far red light; C:plasma membrane; F:ATP binding C:chloroplast; P:phylloquinone biosynthetic process; F:o-succinylbenzoate-CoA ligase activity C:integral to membrane; C:endosome; P:vesiclemediated transport; C:plasma membrane F:organic anion transmembrane transporter activity; C:membrane C:chloroplast C:chloroplast stroma F:nucleic acid binding; P:biological_process; C:cellular_component C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle; F:peroxidase activity; P:response to oxidative stress; F:heme binding; P:oxidation reduction P:nitrogen compound metabolic process; F:ATP binding; F:ligase activity; F:hydrolase activity, acting on carbon-nitrogen (but not peptide) bonds; P:NAD biosynthetic process; F:NAD+ synthase (glutamine-hydrolyzing) activity F:UDP-glycosyltransferase activity; F:transferase activity, transferring hexosyl groups; P:metabolic 105

109 process se007_c3 ring-h2 finger protein atl2c F:metal ion binding; F:zinc ion binding; F:protein binding; P:embryonic development ending in seed dormancy se023_d5 ccaat-binding transcription C:cytoplasm; F:sequence-specific DNA binding; F:transcription factor activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent se023_g7 s3 self-incompatibility locus-linked C:membrane pollen protein se010_g9 NADH ubiquinone oxidoreductase F:catalytic activity; C:mitochondrion; C:respiratory b14 subunit chain complex I se013_c7 ubiquitin-conjugating enzyme e2 P:ubiquitin-dependent protein catabolic process; F:ubiquitin-protein ligase activity; P:regulation of protein metabolic process; P:post-translational protein modification se012_f12 xylose isomerase C:vacuole; P:D-xylose metabolic process; C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle; C:plasma membrane; F:xylose isomerase activity; F:magnesium ion binding; P:pentose-phosphate shunt; C:endoplasmic reticulum se025_f4 protein F:molecular_function; P:response to oxidative stress; C:cellular_component se021_h4 cytochrome p450 monooxygenase F:metal ion binding se013_f10 protein P:response to stimulus se021_g12 disease resistance response protein C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle 206 se016_f6 bglu11 (beta glucosidase 11) catalytic cation binding hydrolyzing F:hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds; P:carbohydrate metabolic process o-glycosyl compounds se024_b4 dead box ATP-dependent rna F:binding; F:ATP-dependent helicase activity se008_a7 MAP3Ka [Nicotiana benthamiana] F:ATP binding; F:protein kinase activity; F:nucleotide binding; P:protein amino acid phosphorylation; P:auxin biosynthetic process; F:protein serine/threonine kinase activity se011_g8 pathogen induced protein 2-4 F:protein binding; P:response to desiccation se015_a5 se017_a12 nadh-ubiquinone oxidoreductase b18 acetyl- c-acetyltransferase se013_b12 one helix protein 2 se010_f9 se021_c10 se001_b02 photosystem II protein d1 shikimate kinase family protein thaumatin-like protein P:mitochondrial electron transport, NADH to ubiquinone; C:respiratory chain complex I; F:NADH dehydrogenase (ubiquinone) activity; P:photorespiration; C:plastid; C:mitochondrial membrane C:peroxisome; F:acetyl-CoA C-acetyltransferase activity; P:embryonic development ending in seed dormancy; P:metabolic process P:response to light intensity; C:chloroplast thylakoid membrane P:photosynthetic electron transport in photosystem II; P:response to herbicide; F:electron transporter, transferring electrons within the cyclic electron transport pathway of photosynthesis activity; F:iron ion binding; C:photosystem II; P:transport; C:integral to membrane; C:plasma membrane lightharvesting complex; C:chloroplast thylakoid membrane; C:mitochondrion F:binding; F:kinase activity; P:aromatic amino acid family biosynthetic process; C:chloroplast stroma P:response to biotic stimulus; P:defense response; C:vacuole 106

110 se012_a5 se014_g7 se011_c8 se015_d10 se014_f7 se010_f2 se006_b1 annexin a4 protein vesicle-associated membrane photosystem II protein I protein phosphatase 60s ribosomal protein l23 alpha-galactosidase alpha-n- se016_b9 centromeric protein - P:response to water deprivation; P:response to salt stress; P:response to red or far red light; F:calciumdependent phospholipid binding; F:calcium ion binding; P:response to cold; P:response to heat P:photoinhibition; F:serine-type peptidase activity; C:chloroplast; P:proteolysis C:cytosol; C:peripheral to membrane of membrane fraction; C:nuclear membrane; C:integral to membrane; C:endosome; P:response to auxin stimulus; P:ER to Golgi vesicle-mediated transport; P:mRNA export from nucleus; C:endoplasmic reticulum; F:GTP binding; C:plasma membrane C:photosystem II reaction center; C:integral to membrane; P:photosynthesis; C:chloroplast thylakoid membrane C:protein serine/threonine phosphatase complex; F:metal ion binding; F:protein serine/threonine phosphatase activity; C:plasma membrane; P:protein amino acid dephosphorylation C:nucleolus; F:structural constituent of ribosome; P:embryonic development ending in seed dormancy; C:cytosolic large ribosomal subunit; P:translation; C:mitochondrion P:carbohydrate metabolic process; C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle; C:vacuole; F:alphagalactosidase activity se010_d8 oxysterol-binding family protein F:phosphoinositide binding; P:signal transduction; P:steroid metabolic process; C:plastid; F:oxysterol binding se026_c2 phospholipase d P:lipid catabolic process; F:NAPE-specific phospholipase D activity; C:intracellular membranebounded organelle; F:calcium ion binding; F:phospholipase D activity; C:cytoplasmic part; C:membrane; P:phosphatidylcholine metabolic process se011_b3 nuclear acid binding F:nucleic acid binding; F:nucleotide binding se011_b10 ribosomal protein C:ribosome; F:5S rrna binding; F:structural constituent of ribosome; P:translation se008_c8 aspartyl protease family protein P:proteolysis; F:hydrolase activity; F:aspartic-type endopeptidase activity; F:peptidase activity; C:endomembrane system; C:apoplast; P:regulation of salicylic acid metabolic process; P:defense response to bacterium; P:regulation of hydrogen peroxide metabolic process se011_c10 protein F:molecular_function; P:biological_process se010_b8 thap domain-containing protein 4 se011_c12 se011_c2 glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase glycine-rich RNA-binding F:molecular_function; P:biological_process; C:cellular_component; P:transport C:cytoplasm; F:S-(hydroxymethyl)glutathione dehydrogenase activity; P:ethanol oxidation; P:formaldehyde metabolic process; P:oxidation reduction; P:heat acclimation; P:cell death; F:alcohol dehydrogenase (NAD) activity; F:zinc ion binding; P:seed development; F:S-nitrosoglutathione reductase activity F:nucleic acid binding; F:nucleotide binding; F:RNA binding; P:biological_process; C:cellular_component 107

111 se011_h9 se002_h07 se013_a12 se008_a6 se024_d7 se012_h1 se012_a3 se010_f12 se012_g11 thioredoxin h ATP-dependent clp protease proteolytic protein unnamed protein product [Vitis vinifera] protein 60s ribosomal protein l39 protein mitochondrial import receptor subunit SNF7 family protein P:cell redox homeostasis; F:electron carrier activity; P:glycerol ether metabolic process; F:protein disulfide oxidoreductase activity F:peptidase activity C:chloroplast thylakoid membrane; C:chloroplast envelope C:membrane; F:zinc ion binding; C:intracellular P:primary shoot apical meristem specification; F:protein binding F:structural constituent of ribosome; C:cytosolic large ribosomal subunit; P:translation; C:mitochondrion P:regulation of transcription, DNA-dependent; P:two-component signal transduction system (phosphorelay); F:two-component response regulator activity; P:regulation of transcription; F:DNA binding; F:molecular_function; P:biological_process; C:cellular_component F:P-P-bond-hydrolysis-driven protein transmembrane transporter activity; C:mitochondrial inner membrane presequence translocase complex; C:mitochondrial outer membrane translocase complex; F:receptor activity; P:protein import into mitochondrial outer membrane P:protein transport; P:endosome transport via multivesicular body sorting pathway; P:growth; P:embryonic axis specification ρήκα Πενζβναθή GO επζπέδμο 2 ηςκ αζμθμβζηχκ δζαδζηαζζχκ ηςκ 15 cdnas πμο ειθακίγμοκ δζαθμνζηή έηθναζδ ιυκμ ζηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. 108

112 Πίλαθαο Σα 6 απυ ηα 15 cdnas πμο ειθακίγμοκ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ιυκμ ζηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ζηα μπμία ανέεδηε δ πενζβναθή ηδξ θεζημονβίαξ ημοξ ηαζ δ επζζδιείςζδ GO. Όλνκα θιψλνπ se025_h8 se023_c10 se023_b7 se023_a4 Πεξηγξαθή translationally controlled tumor protein serine c-palmitoyltransferase like protein conserved hypothetical protein [Ricinus communis] pathogenesis-related thaumatinlike protein C:cytoplasm GOs C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle; P:sphingolipid biosynthetic process; F:protein binding; P:cell growth; F:serine C- palmitoyltransferase activity; C:endoplasmic reticulum - - se021_h8 ATP-dependent rna helicase P:auxin biosynthetic process; F:ATP-dependent helicase activity; F:nucleic acid binding; P:embryonic development ending in seed dormancy; F:ATP binding; C:membrane; C:mitochondrion se018_f5 se016_a4 plastocyanin chloroplast protein P:response to copper ion; C:chloroplast thylakoid lumen; F:copper ion binding; F:electron carrier activity P:ubiquitin-dependent protein catabolic process; F:ATP binding; F:ubiquitin-protein ligase activity; P:regulation of protein metabolic process; P:posttranslational protein modification se013_g11 cytochrome b561 C:integral to membrane se011_d7 bromodomain-containing protein C:mitochondrion; P:biological_process; F:DNA binding Δπζπνυζεεηα, βζα οπμθμβζζιυ ηδξ πζεακυηδηαξ δ παναηδνμφιεκδ ηαηακμιή ηςκ GO υνςκ ζηδκ Καθαιχκ κα δζαθένεζ ζδιακηζηά (FDR<0.05) απυ ηδκ ηαηακμιή ηςκ GO υνςκ ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ, πνδζζιμπμζήεδηε δ δμηζιή αηνζαείαξ Fisher (Fisher s exact test). Οζ GO υνμζ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε απυηνζζδ ζε ηαηαπυκδζδ ηαζ ζε ααζμηζηυ ενέεζζια ηαηαπυκδζδξ ειθακίγμκηαζ ιυκμ ζηδκ Καθαιχκ, δείπκμκηαξ ιζα ανηεηά πζμ ζοβηεηνζιέκδ απυηνζζδ ζε ηαηαπυκδζδ ιε NaCl ηςκ δζαθμνεηζηά εηθναζιέκςκ cdnas ζηδκ Καθαιχκ, ζε ζφβηνζζδ ιε ηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ (πήια 2.29). 109

113 ρήκα Γμηζιή αηνζαείαξ Fisher βζα ημκ οπμθμβζζιυ ηδξ πζεακυηδηαξ δ παναηδνμφιεκδ ηαηακμιή ηςκ αζμθμβζηχκ υνςκ ζημ ζφκμθμ ηςκ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδ Καθαιχκ κα είκαζ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή (FDR < 0.05) απυ ηδκ ηαηακμιή ηςκ υνςκ ζημ ζφκμθμ ηςκ cdnas ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ. 110

114 3.5. Γίθηπα/Μνλνπάηηα Μεηαγξαθηθήο Ρχζκηζεο (Transcriptional Regulatory Networks) Η ζοζηάδα ηςκ cdnas πμο ζοκ-εηθνάγμκηαζ (co-expressed) ζοκεέημοκ ιζα θεζημονβζηή οπμιμκάδα (module) εκχ ζοκάενμζζδ ηςκ θεζημονβζηχκ οπμιμκάδςκ, ηςκ ιεηαβναθζηχκ νοειζζηχκ ημοξ (transcription regulators) ηαζ ηςκ ιεηαλφ ημοξ νοειζζηζηχκ ζπέζεςκ ζοκεέημοκ ημ θεζημονβζηυ δίηηομ (module network) (Μακζμοδάηδ, 2010). οκμθζηά ηαηαζηεοάζηδηακ δφμ νοειζζηζηά θεζημονβζηά δίηηοα (regulatory module networks), έκα βζα ηάεε πμζηζθία, πνδζζιμπμζχκηαξ ημκ αθβυνζειμ ακαγήηδζδξ ιεηαβναθζηχκ θεζημονβζηχκ οπμιμκάδςκ LeMoNe (Yu, et al. 2006) ιε ημκ μπμίμ ακαθφεδηακ ηα δεδμιέκα ηδξ έηθναζδξ ηςκ cdnas πμο πνμέηορακ απυ ηδκ ιζηνμζοζημζπία. Σμ απμηέθεζια ημο αθβυνζειμο είκαζ έκα ζφκμθμ απυ θεζημονβζηέξ οπμιμκάδεξ πμο πενζθαιαάκμοκ ζοζηάδεξ ζοκεηθναγυιεκςκ cdnas, ιε ιζα θίζηα απυ ορδθήξ ααειμθμβίαξ (high-scoring) ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ, πμο ακηζζημζπμφκ ζε ηάεε ζοζηάδα Γίθηπν κεηαγξαθηθήο ξχζκηζεο ζηελ πνηθηιία Καιακψλ ηδκ πμζηζθία Καθαιχκ ηαηαζηεοάζηδηακ 22 ζοκμθζηά θεζημονβζηέξ οπμιμκάδεξ μζ μπμίεξ απμηεθμφκηαζ απυ 7-36 ιεηαβναθήιαηα δ ηάεε ιζα (πήια 2.30). Δπζπθέμκ, ημ θζβυηενμ έκαξ ορδθήξ ααειμθμβίαξ (high scoring) νοειζζηζηυξ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ εκημπίζηδηε βζα 9 απυ ηζξ 22 θεζημονβζηέξ οπμιμκάδεξ. ρήκα Καηακμιή ημο ανζειμφ ηςκ cdnas ζηζξ νοειζζηζηέξ οπμιμκάδεξ ηςκ πμζηζθζχκ εθζάξ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. Σμ δίηηομ ηδξ Καθαιχκ απμηεθείηαζ απυ 22 οπμιμκάδεξ ζηζξ μπμίεξ ειπενζέπμκηαζ 432 cdnas. Δκκέα απυ ηζξ 22 οπμιμκάδεξ (ζδιεζςιέκεξ ιε αζηένζ) πμο πενζθαιαάκμοκ 186 cdnas, νοειίγμκηαζ απυ έκα ημοθάπζζημκ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα. Σμ δίηηομ ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ απμηεθείηαζ απυ 20 οπμιμκάδεξ ζηζξ μπμίεξ ειπενζέπμκηαζ 372 cdnas. Γχδεηα απυ ηζξ 22 οπμιμκάδεξ (ζδιεζςιέκεξ ιε αζηένζ) πμο 111

115 πενζθαιαάκμοκ 237 cdnas, νοειίγμκηαζ απυ έκα ημοθάπζζημκ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα. Σμ θεζημονβζηυ δίηηομ ιε ηδκ ιεβαθφηενδ ααειμθμβία (highest score) απμηεθείηαζ απυ 186 cdnas, ζοζηαδμπμζδιέκα ζε εκκέα ιδ-επζηαθοπηυιεκεξ θεζημονβζηέξ οπμιμκάδεξ πμο νοειίγμκηαζ απυ επηά ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ (πήια 2.31). Μζα απθμπμζδιέκδ ιμνθή ημο θεζημονβζημφ δζηηφμο (πήια 2.32) δείπκεζ ηδκ ζοκημκζζιέκδ πνμζπάεεζα ηδξ νφειζζδξ ηδξ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ ζηδκ ακεεηηζηή πμζηζθία Καθαιχκ, ιε έλζ απυ ημοξ επηά ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ κα ζοκεέημοκ έκα νοειζζηζηυ ιμκμπάηζ (regulatory cascade) (πήια 2.33). Σνεζξ μιυθμβμζ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ, bzip (Se013_B10), NF-YC (Se023_D5) ηαζ NF-Y (Se012_B6) ημπμεεηήεδηακ ζηδκ ημνοθή ημο ζενανπζημφ δζηηφμο οπμδεζηκφμκηαξ νφειζζδ ηδξ δνάζδξ ηνζχκ επζπθέμκ μιυθμβςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ, JERF (Se024_H1), HMG (Se024_H12) ηαζ GRAS (Se015_B12), δεδμιέκμο υηζ δ ιεηαβναθζηή νφειζζδ είκαζ ιζα πμθοεπίπεδδ ζενανπζηή δζενβαζία (πήια 2.33) (Yu et al., 2006). Σα μιυθμβα ηςκ JERF ηαζ bzip νοειίγμοκ ηδκ οπμιμκάδα 13 πμο απμηεθείηαζ απυ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ηα μπμία ζφιθςκα ιε ηδκ ακάθοζδ ζενανπζηήξ μιαδμπμίδζδξ αολάκμοκ ηδκ έηθναζδ ημοξ ηαηά ηδκ δζάνηεζα ηαηαπυκδζδξ εκχ ηδκ ιεζχκμοκ ηαηά ηδκ επακαθμνά απυ ηδκ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl. ε αοηή ηδκ οπμιμκάδα πενζθαιαάκμκηαζ cdnas πμο ηςδζημπμζμφκ ημκ ιεηαθμνέα κμοηθεμηζδίμο-ζαηπάνμο (nucleotide-sugar transporter se023_c8), έκα έκγοιμ πνυζδεζδξ μοιπζηζηίκδξ (ubiquitin conjugating enzyme se012_g8) ηαζ ιζα δετδνμβμκάζδ αθδεΰδδξ (aldehyde dehydrogenase se016_c3). Ο εεηζηυξ νυθμξ ηςκ εκγφιςκ πνυζδεζδξ μοιπζημοζηίκδξ ζε ακεεηηζηυηδηα λδναζίαξ ηαζ αθαηυηδηαξ έπεζ απμδεζπεεί ζε ιεθέηεξ οπεν-έηθναζδξ ζηδκ Ανααίδμρδ (Wan et al., 2011). 112

116 ρήκα Μεηαβναθζηυ νοειζζηζηυ δίηηομ απυηνζζδξ ζε ηαηαπυκδζδ αθάημηδηαξ ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ. οκμθζηά 186 cdnas ζοιιεηέπμοκ ζημ νοειζζηζηυ πνυβναιια, ζοζηαδμπμζδιέκα ζε εκκέα ιδ-αθθδθεπζηαθοπηυιεκεξ οπμιμκάδεξ. Οζ οπμιμκάδεξ είκαζ πνςιαηζζιέκεξ ζφιθςκα ιε ημ έκεεια ζηδκ ηάης ανζζηενή βςκία. Σα cdnas ιε ζπήια νυιαμο ( ) ακηζπνμζςπεφμοκ ημοξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ εκχ αοηά ιε ζπήια ζθαίναξ ( ) είκαζ ηα cdnas πμο νοειίγμκηαζ. Η ηαηεφεοκζδ ηδξ νφειζζδξ δείπκεηαζ ιε αέθδ πμο ηαηεοεφκμκηαζ απυ ημκ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα ζημ cdna ζηυπμ. 113

117 ρήκα Πενζθδπηζηή πανμοζίαζδ ημο ιεηαβναθζημφ νοειζζηζημφ δζηηφμο ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ. Κάεε οπμιμκάδα ακαπανζζηάηαζ ςξ ζθαίνα ( ) δ μπμία έπεζ ιέβεεμξ ακάθμβμ ημο ανζειμφ cdnas ηδξ οπμιμκάδαξ. Οζ νυιαμζ ( ) ακαπανζζημφκ ημοξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ. Η ηαηεφεοκζδ ηδξ νφειζζδξ δείπκεηαζ ιε αέθδ πμο ηαηεοεφκμκηαζ απυ ημκ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα ζηδκ οπμιμκάδα ζηυπμ. Σμ πθάημξ ημο αέθμοξ είκαζ ακάθμβμ ηδξ αανφηδηαξ ημο νοειζζηή βζα ηδκ οπμιμκάδα ζηυπμ. ρήκα Ακαπανάζηαζδ ζε ζενανπζηή δζάηαλδ οπμζοκυθμο ημο δζηηφμο ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ ημ μπμίμ πενζθαιαάκεζ ιυκμ ηζξ νοειζζηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ( ). Σμ πνχια ηςκ ιεηαβναθζηχκ 114

118 παναβυκηςκ είκαζ ζφιθςκα ιε ημ πνςιαηζζιυ ηςκ οπμιμκάδςκ. Η ηαηεφεοκζδ ηδξ νφειζζδξ δείπκεηαζ ιε αέθδ πμο ηαηεοεφκμκηαζ απυ ημ νοειζζηή ζημ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα ζηυπμ Γίθηπν κεηαγξαθηθήο ξχζκηζεο ζηελ πνηθηιία Υνλδξνιηά Υαιθηδηθήο Η ακάθοζδ ηςκ οπμιμκάδςκ ημο δζηηφμο ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ απμηάθορε 20 θεζημονβζηέξ οπμιμκάδεξ μζ μπμίεξ απμηεθμφκηαζ απυ 6-35 cdnas δ ηάεε ιία (πήια 2.34). Σμ δίηηομ οπμιμκάδςκ ιε ηδ ιεβαθφηενδ ααειμθμβία (highest score) απμηεθείηαζ απυ 237 cdnas, ζοζηαδμπμζδιέκα ζε 12 ιδ-αθθδθμηαθοπηυιεκεξ οπμιμκάδεξ ηα μπμία νοειίγμκηαζ απυ έλζ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ (πήια 2.34). Πανυθμ πμο δ απθμπμζδιέκδ ιμνθή ημο δζηηφμο οπμιμκάδςκ ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ (πήια 2.35) δεκ δζαθένεζ απυ ημ δίηηομ ηδξ Καθαιχκ ζε επίπεδμ πμθοπθμηυηδηαξ, ημ νοειζζηζηυ ιμκμπάηζ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ απμηεθείηαζ απυ ηνείξ ιυκμ ιεηαβναθζημφ πανάβμκηεξ πμο αθθδθεπζδνμφκ ιεηαλφ ημοξ (πήια 2.36). Αοηυ ζοκεπάβεηαζ παιδθυηενμο επζπέδμο ζοκημκζζιυ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ζηδκ εοαίζεδηδ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ, ζε ζφβηνζζδ ιε ηδκ ακεεηηζηή ζηδκ αθαηυηδηα πμζηζθία Καθαιχκ. 115

119 ρήκα Μεηαβναθζηυ νοειζζηζηυ δίηηομ απυηνζζδξ ζε ηαηαπυκδζδ αθάημηδηαξ ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. οκμθζηά 237 cdnas ζοιιεηέπμοκ ζημ νοειζζηζηυ πνυβναιια, ζοζηαδμπμζδιέκα ζε 12 ιδ-αθθδθεπζηαθοπηυιεκεξ οπμιμκάδεξ. Οζ οπμιμκάδεξ είκαζ πνςιαηζζιέκεξ ζφιθςκα ιε ημ έκεεια ζηδ πάκς δελζά βςκία. Σα cdnas ιε ζπήια νυιαμο ( )ακηζπνμζςπεφμοκ ημοξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ εκχ αοηά ιε ζπήια ζθαίναξ ( ) είκαζ ηα cdnas πμο νοειίγμκηαζ. Η ηαηεφεοκζδ ηδξ νφειζζδξ δείπκεηαζ ιε αέθδ πμο ηαηεοεφκμκηαζ απυ ημκ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα ζημ cdna ζηυπμ. ρήκα Πενζθδπηζηή πανμοζίαζδ ημο ιεηαβναθζημφ νοειζζηζημφ δζηηφμο ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. Κάεε οπμιμκάδα ακαπανζζηάηαζ ςξ ζθαίνα ( ) δ μπμία έπεζ ιέβεεμξ ακάθμβμ ημο ιεβέεμοξ ηδξ οπμιμκάδαξ. Οζ νυιαμζ ( ) ακαπανζζημφκ ημοξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ. Η ηαηεφεοκζδ ηδξ νφειζζδξ δείπκεηαζ ιε αέθδ πμο ηαηεοεφκμκηαζ απυ ημκ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα ζηδκ οπμιμκάδα ζηυπμ. Σμ πθάημξ ημο αέθμοξ είκαζ ακάθμβμ ηδξ αανφηδηαξ ημο νοειζζηή βζα ηδκ οπμιμκάδα ζηυπμ. 116

120 ρήκα 2.36 Ακαπανάζηαζδ ζε ζενανπζηή δζάηαλδ οπμζοκυθμο ημο δζηηφμο ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ημ μπμίμ πενζθαιαάκεζ ιυκμ ηζξ νοειζζηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ιεηαλφ ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ. Η ηαηεφεοκζδ ηδξ νφειζζδξ δείπκεηαζ ιε αέθδ πμο ηαηεοεφκμκηαζ απυ ημ νοειζζηή ζημ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα ζηυπμ. Σμ πνχια ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ είκαζ ζφιθςκα ιε ημ πνςιαηζζιυ ηςκ οπμιμκάδςκ Δλζσκάησζε ηεο δχν-θιάζεσλ κε-ζπδεπγκέλεο αλάιπζεο SAM ζηα δίθηπα κεηαγξαθηθήο ξχζκηζεο ησλ πνηθηιηψλ Καιακψλ θαη Υνλδξνιηά Υαιθηδηθήο Σα cdnas ιε δζαθμνζηή έηθναζδ ζφιθςκα ιε ηδκ δομ-ηθάζεςκ ιδ-ζογεοβιέκδξ ακάθοζδξ SAM ακάιεζα ζηδκ πενίμδμ ηαηαπυκδζδξ NaCl ηαζ ηδκ πενίμδμ επακαθμνάξ εκημπίζηδηακ ζηα δίηηοα ιεηαβναθζηήξ νφειζζδξ ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ (πήιαηα 2.37 ηαζ 2.38). ηδκ πμζηζθία Καθαιχκ, μηηχ απυ ηζξ εκκέα οπμιμκάδεξ απμηεθμφκηαζ απυ cdnas πμο πανμοζζάγμοκ δζαθμνζηή έηθναζδ εκχ ζε επηά απυ αοηέξ ημοθάπζζημκ ημ 50% ηςκ cdnas πμο πενζθαιαάκμοκ πανμοζζάγεζ δζαθμνζηή έηθναζδ. Δπζπθέμκ, ηα πνμθίθ έηθναζδξ ηςκ cdnas είκαζ έκημκα ελανηδιέκα απυ ηζξ οπμιμκάδεξ ζφιθςκα ιε ηδκ ζενανπζηή ζοζηαδμπμίδζδ. οβηεηνζιέκα, μζ οπμιμκάδεξ 4,8 ηαζ 14 πανμοζζάγμοκ ιεζςιέκδ έηθναζδ εκχ μζ οπμιμκάδεξ 7,9,10,13 ηαζ 20 πανμοζζάγμοκ αολδιέκδ έηθναζδ ηαηά ηδκ πενίμδμ ηαηαπυκδζδξ. Ωζηυζμ ζηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ, μζ επηά απυ ηζξ 12 οπμιμκάδεξ απμηεθμφκηαζ απυ cdnas πμο έπμοκ δζαθμνζηή έηθναζδ. ηζξ έλζ οπμιμκάδεξ θζβυηενμ απυ ημ 36% ηςκ cdnas πανμοζζάγεζ δζαθμνζηή έηθναζδ εκχ ιία, δ οπμιμκάδα 12, απμηεθείηαζ ιυκμ απυ ιεηαβναθήιαηα ιε δζαθμνζηή έηθναζδ. 117

121 ρήκα 2.37 cdnas πμο εκημπίζηδηακ ιε ηδκ SAM ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ηαζ ειπενζέπμκηαζ ζημ δίηηομ ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ. Σα ηνίβςκα ( ) είκαζ ηα cdnas ηα μπμία εκημπίγμκηαζ ζηδ 2 δ ζοζηάδα ημο ζπήιαημξ 2.24Α, εκχ ηα ακάπμδα ηνίβςκα ( ) είκαζ ηα cdnas ηα μπμία εκημπίγμκηαζ ζηδ 1 δ ζοζηάδα ημο ζπήιαημξ 2.24Α. 118

122 ρήκα 2.38 cdnas πμο εκημπίζηδηακ, ιε ηδκ SAM, ιε ζδιακηζηή δζαθμνζηή έηθναζδ ηαζ πμο ειπενζέπμκηαζ ζημ δίηηομ ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. Σα ηνίβςκα ( ) είκαζ ηα cdnas ηα μπμία εκημπίγμκηαζ ζηδ 1 δ ζοζηάδα ημο ζπήιαημξ 2.24B, εκχ ηα ακάπμδα ηνίβςκα ( ) είκαζ ηα cdnas ηα μπμία εκημπίγμκηαζ ζηδ 2 δ ζοζηάδα ημο ζπήιαημξ 2.24Β Δλίζρπζε ησλ ππνκνλάδσλ κε ηηο θαηεγνξίεο GO (Gene Ontology) Γζα υθεξ ηζξ οπμιμκάδεξ ηαζ ηςκ δφμ δζηηφςκ ανέεδηακ μζ ηαηδβμνζέξ GO πνδζζιμπμζχκηαξ ςξ ενβαθείμ ημ FatiGO (Al-Shahrour et al., 2007), ημ μπμίμ 119

123 πανέπεηαζ ιέζς ημο θμβζζιζημφ Blast2GO (Conesa et al., 2005). οκμθζηά 15 απυ ηζξ 22 οπμιμκάδεξ ζηδκ πμζηζθία Καθαιχκ ηαζ 16 απυ ηζξ 20 ζηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ειθακίγμοκ ημοθάπζζημκ ιζα ηαηδβμνία GO ζε επίπεδμ ζδιακηζηυηδηαξ 0.01 (p-value). οκμθζηά εκημπίζηδηακ 122 δζαθμνεηζηέξ ηαηδβμνίεξ GO ζηδκ Καθαιχκ ηαζ 115 ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ (Πίκαηαξ 2.13 ηαζ 2.14). ε ανηεηέξ οπμιμκάδεξ ηαζ ηςκ δομ πμζηζθζχκ εκημπίγμκηαζ ηαηδβμνίεξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε απυηνζζδ ζε ενεείζιαηα ηαηαπυκδζδξ ηαζ ζοβηεηνζιέκα ζηζξ οπμιμκάδεξ 2,7,9,10 ηαζ 22 ζηδκ Καθαιχκ ηαζ ζηζξ 6,7,12 ηαζ 20 ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. Πίλαθαο Καηδβμνίεξ GO ηςκ οπμιμκάδςκ πμο ζοκεέημοκ ημ δίηηομ ζηδκ Καθαιχκ Αξηζκφο Αξηζκφο Βηνινγηθή δηαδηθαζία / Μνξηαθή Σαπηφηεηα GO Τπνκνλάδαο cdnas ιεηηνπξγία / Κπηηαξηθφο εληνπηζκφο P-Value GO: growth 1,71E-03 GO: poly(a)-specific ribonuclease activity 9,63E-03 GO: exonuclease activity, active with either riboor deoxyribonucleic acids and producing 5'- 9,63E-03 phosphomonoesters GO: exoribonuclease activity 9,63E-03 GO: exonuclease activity 9,63E-03 GO: exoribonuclease activity, producing 5'- phosphomonoesters 9,63E GO: '-5' exonuclease activity 9,63E-03 GO: '-5'-exoribonuclease activity 9,63E-03 GO: serine C-palmitoyltransferase activity 9,63E-03 GO: palmitoyltransferase activity 9,63E-03 GO: C-palmitoyltransferase activity 9,63E-03 GO: sphingolipid biosynthetic process 9,63E-03 GO: membrane lipid biosynthetic process 9,63E-03 GO: pentose-phosphate shunt, oxidative branch 9,63E-03 GO: glucose-6-phosphate dehydrogenase activity 9,63E-03 GO: antiporter activity 9,63E-03 GO: cell proliferation 9,63E-03 GO: metal ion binding 2,24E GO: cation binding 2,85E-04 GO: ion binding 2,85E-04 GO: response to metal ion 9,17E GO: chloroplast 2,95E Γεκ ανέεδηακ GOs GO: DNA metabolic process 2,94E-03 GO: nucleotidyltransferase activity 3,93E-03 GO: mrna guanylyltransferase activity 6,74E GO: RNA guanylyltransferase activity 6,74E-03 GO: mrna capping 6,74E-03 GO: RNA capping 6,74E-03 GO: RNA-dependent DNA replication 6,74E-03 GO: RNA-directed DNA polymerase activity 6,74E

124 6 18 Γεκ ανέεδηακ GOs GO: response to ethylene stimulus 2,46E-03 GO: regulation of biosynthetic process 9,14E GO: regulation of cellular biosynthetic process 9,14E-03 GO: regulation of macromolecule biosynthetic process 9,14E-03 GO: membrane 2,46E-03 GO: organelle membrane 5,02E GO: membrane part 6,55E-03 GO: thylakoid 7,35E-03 GO: intracellular organelle part 9,52E-03 GO: organelle part 9,52E GO: response to stimulus 1,75E-03 GO: cellular metabolic compound salvage 5,06E GO: response to temperature stimulus 7,52E-03 GO: response to abiotic stimulus 9,22E Γεκ ανέεδηακ GOs Γεκ ανέεδηακ GOs GO: chloroallyl aldehyde dehydrogenase activity 9,63E-03 GO: protein import into mitochondrial outer membrane 9,63E-03 GO: outer mitochondrial membrane organization 9,63E-03 GO: mitochondrial outer membrane translocase complex 9,63E-03 GO: mitochondrial inner membrane presequence translocase complex 9,63E-03 GO: auxin homeostasis 9,63E-03 GO: pollen tube growth 9,63E-03 GO: reproductive cellular process 9,63E-03 GO: regulation of cell growth 9,63E GO: root epidermal cell differentiation 9,63E-03 GO: trichoblast differentiation 9,63E-03 GO: developmental maturation 9,63E-03 GO: cell maturation 9,63E-03 GO: trichoblast maturation 9,63E-03 GO: root hair cell differentiation 9,63E-03 GO: developmental cell growth 9,63E-03 GO: root hair elongation 9,63E-03 GO: root hair cell tip growth 9,63E-03 GO: developmental growth involved in morphogenesis 9,63E-03 GO: unidimensional cell growth 9,63E-03 GO: cell tip growth 9,63E-03 GO: organic anion transmembrane transporter activity 9,63E-03 GO: anatomical structure development 1,05E-03 GO: regulation of anatomical structure size 3,41E GO: regulation of cellular component size 3,41E-03 GO: regulation of cell size 3,41E-03 GO: multicellular organismal development 4,65E-03 GO: ATPase activity 4,87E

125 GO: ATPase activity, coupled 4,87E-03 GO: multicellular organismal process 5,74E-03 GO: transferase activity, transferring glycosyl groups 6,53E-03 GO: organ development 6,53E-03 GO: ATP-dependent helicase activity 6,99E-03 GO: helicase activity 6,99E-03 GO: purine NTP-dependent helicase activity 6,99E-03 GO: system development 7,47E-03 GO: post-embryonic development 7,63E-03 GO: developmental process 8,45E-03 GO: root system development 9,22E-03 GO: root development 9,22E GO: ribonucleoprotein complex 9,89E-03 GO: anaphase-promoting complex 9,63E-03 GO: nuclear ubiquitin ligase complex 9,63E-03 GO: inflorescence development 9,63E-03 GO: phosphatidylcholine metabolic process 9,63E-03 GO: glycerolipid metabolic process 9,63E-03 GO: ethanolamine and derivative metabolic process 9,63E GO: glycerophospholipid metabolic process 9,63E-03 GO: NAPE-specific phospholipase D activity 9,63E-03 GO: neutral amino acid transmembrane transporter activity 9,63E-03 GO: acidic amino acid transmembrane transporter activity 9,63E-03 GO: amine transmembrane transporter activity 9,63E-03 GO: amino acid transmembrane transporter activity 9,63E Γεκ ανέεδηακ GOs GO: cellular aromatic compound metabolic process 1,07E-03 GO: regulation of salicylic acid metabolic process 6,74E GO: regulation of cellular ketone metabolic process 6,74E-03 GO: salicylic acid metabolic process 6,74E-03 GO: SUMO ligase activity 6,74E-03 GO: O-hydroxycinnamoyltransferase activity 6,74E GO: hydroxycinnamoyltransferase activity 6,74E-03 Γεκ ανέεδηακ GOs GO: galactose metabolic process 3,85E-03 GO: UDP-glucose 4-epimerase activity 3,85E-03 GO: racemase and epimerase activity, acting on carbohydrates and derivatives 3,85E-03 GO: mrna export from nucleus 3,85E-03 GO: RNA localization 3,85E-03 GO: establishment of RNA localization 3,85E-03 GO: nucleic acid transport 3,85E-03 GO: nuclear export 3,85E-03 GO: RNA transport 3,85E-03 GO: mrna transport 3,85E

126 GO: RNA export from nucleus 3,85E-03 GO: nuclear membrane 3,85E-03 GO: peripheral to membrane of membrane fraction 3,85E-03 GO: ER to Golgi vesicle-mediated transport 7,70E-03 GO: Golgi vesicle transport 7,70E-03 GO: nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid transport 7,70E Γεκ ανέεδηακ GOs 22 9 GO: defense response to fungus 8,65E-03 Πίλαθαο Καηδβμνίεξ GO ηςκ οπμιμκάδςκ πμο ζοκεέημοκ ημ δίηηομ ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ Αξηζκφο Τπνκνλάδαο Αξηζκφο cdnas Σαπηφηεηα Βηνινγηθή δηαδηθαζία / Μνξηαθή GO ιεηηνπξγία / Κπηηαξηθφο εληνπηζκφο P-Value GO: methyltetrahydropteroyltriglutamatehomocysteine S-methyltransferase activity 8,67E-03 GO: methyltetrahydropteroyltri-L-glutamatedependent methyltransferase activity 8,67E-03 GO: S-methyltransferase activity 8,67E-03 GO: nitric oxide biosynthetic process 8,67E-03 GO: nitric oxide metabolic process 8,67E-03 Γεκ ανέεδηακ GOs 3 25 GO: magnesium ion binding 4,56E-03 GO: peptidyl-prolyl cis-trans isomerase activity 1,82E-03 GO: cis-trans isomerase activity 1,82E-03 GO: protein folding 7,48E-03 GO: Atg8 ligase activity 7,71E-03 GO: vacuolar lumen 7,71E-03 GO: APG8 activating enzyme activity 7,71E-03 GO: small protein activating enzyme activity 7,71E-03 GO: APG8-specific protease activity 7,71E small conjugating protein-specific protease GO: activity 7,71E-03 GO: neutral amino acid transmembrane transporter activity 7,71E-03 GO: acidic amino acid transmembrane transporter activity 7,71E-03 GO: amine transmembrane transporter activity 7,71E-03 GO: amino acid transmembrane transporter activity 7,71E GO: growth 5,06E-03 GO: ATP-dependent helicase activity 1,07E-03 GO: helicase activity 1,07E-03 GO: purine NTP-dependent helicase activity 1,07E-03 GO: chloroplast part 4,97E-03 GO: plastid part 6,53E GO: plastid stroma 7,48E-03 GO: chloroplast stroma 7,48E-03 GO: plasma membrane light-harvesting complex 7,71E-03 GO: light-harvesting complex 7,71E-03 GO: plasma membrane-derived chromatophore 7,71E-03 GO: response to herbicide 7,71E

127 GO: response to toxin 7,71E-03 GO: photosynthetic electron transport in photosystem II 7,71E-03 GO: deoxy-7-phosphoheptulonate synthase activity 7,71E-03 GO: chorismate biosynthetic process 7,71E-03 GO: dicarboxylic acid biosynthetic process 7,71E-03 GO: shikimate biosynthetic process 7,71E-03 GO: shikimate metabolic process 7,71E-03 GO: ATPase activity 8,33E-03 GO: ATPase activity, coupled 8,33E-03 GO: photosystem I 3,41E GO: cellular response to stimulus 6,42E-03 GO: binding 9,05E-03 GO: cellular response to organic substance 9,57E Γεκ ανέεδηακ GOs GO: structural constituent of ribosome 6,54E-03 GO: macromolecule biosynthetic process 8,56E-03 GO: cellular macromolecule biosynthetic process 8,56E-03 GO: gene expression 8,81E GO: structural molecule activity 9,00E-03 GO: mitotic spindle elongation 9,63E-03 GO: microtubule cytoskeleton organization 9,63E-03 GO: spindle organization 9,63E-03 GO: spindle elongation 9,63E-03 GO: mitotic spindle organization 9,63E-03 GO: anthocyanin accumulation in tissues in response to UV light 6,74E-03 GO: pigment accumulation 6,74E-03 GO: pigmentation 6,74E-03 GO: pigment accumulation in tissues 6,74E-03 GO: pigment accumulation in response to UV light 6,74E-03 GO: pigment accumulation in tissues in response to UV light 6,74E-03 GO: auxin efflux transmembrane transporter activity 6,74E-03 GO: efflux transmembrane transporter activity 6,74E GO: acropetal auxin transport 6,74E-03 GO: positive gravitropism 6,74E-03 GO: intracellular cyclic nucleotide activated cation channel activity 6,74E-03 GO: cyclic nucleotide-gated ion channel activity 6,74E-03 GO: intracellular ligand-gated ion channel activity 6,74E-03 GO: potassium ion transport 6,74E-03 GO: inward rectifier potassium channel activity 6,74E-03 GO: ligand-gated channel activity 6,74E-03 GO: potassium channel activity 6,74E-03 GO: ligand-gated ion channel activity 6,74E-03 GO: voltage-gated potassium channel activity 6,74E-03 GO: cyclic nucleotide binding 6,74E GO: cellular aromatic compound metabolic process 4,52E

128 GO: response to cadmium ion 3,17E-04 GO: plasma membrane part 7,26E-04 GO: response to metal ion 2,96E GO: plasma membrane 5,27E-03 GO: vesicle-mediated transport 6,36E-03 GO: endomembrane system 7,59E-03 GO: response to inorganic substance 9,17E Γεκ ανέεδηακ GOs GO: o-succinylbenzoate-coa ligase activity 2,89E-03 GO: phylloquinone biosynthetic process 2,89E-03 GO: quinone cofactor metabolic process 2,89E-03 GO: fat-soluble vitamin metabolic process 2,89E-03 GO: quinone cofactor biosynthetic process 2,89E-03 GO: vitamin K metabolic process 2,89E GO: fat-soluble vitamin biosynthetic process 2,89E-03 GO: phylloquinone metabolic process 2,89E-03 GO: vitamin K biosynthetic process 2,89E-03 GO: ligase activity, forming carbon-sulfur bonds 5,77E-03 GO: acid-thiol ligase activity 5,77E-03 GO: CoA-ligase activity 5,77E-03 GO: coenzyme biosynthetic process 5,77E Γεκ ανέεδηακ GOs GO: chromoplast 7,70E-03 GO: structural molecule activity 3,46E-03 GO: macromolecular complex 5,46E-03 GO: S rrna binding 7,71E-03 GO: clathrin binding 7,71E-03 GO: positive regulation of glycine hydroxymethyltransferase activity 7,71E glutamine family amino acid metabolic GO: process 7,71E-03 GO: glutamate synthase (ferredoxin) activity 7,71E-03 GO: oxidoreductase activity, acting on the CH- NH2 group of donors, iron-sulfur protein as 7,71E-03 acceptor GO: glutamate synthase activity 7,71E GO: nucleolus 6,68E-03 GO: shoot morphogenesis 2,08E-03 GO: tissue development 3,53E GO: shoot system development 4,39E-03 GO: shoot development 4,39E-03 GO: anatomical structure morphogenesis 9,95E-03 GO: response to copper ion 5,78E-03 GO: carbon-monoxide oxygenase activity 5,78E GO: oxidoreductase activity, acting on the aldehyde or oxo group of donors, 5,78E-03 cytochrome as acceptor GO: RNA-dependent DNA replication 5,78E-03 GO: RNA-directed DNA polymerase activity 5,78E-03 Η οπμιμκάδα 9 ηδξ Καθαιχκ ζπεηίζηδηε ιε απυηνζζδ ζε ενέεζζια ηαηαπυκδζδξ (p-value 1.75e -3 ) ηαζ νοειίγεηαζ απυ ηνεζξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ (πήια 2.32). 125

129 Ακάθοζδ BlastX ημο cdna ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα se013_b10 έδεζλε 63% μιμζυηδηα ιε ηδκ bzip μζημβέκεζα ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ. Μέθδ ηδξ bzip μζημβέκεζαξ έπμοκ ακαθενεεί υηζ παίγμοκ ηεκηνζηυ νυθμ ζηδκ απυηνζζδ ηαηαπυκδζδξ απυ αθαηυηδηα ζηδκ Ανααίδμρδ (Liao et al., 2008; Jakoby et al., 2002). Σμ ιεηαβνάθδια ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα se012_b6 πανμοζζάγεζ μιμζυηδηα ηαηά 96% ιε ιζα πνςηεΐκδ DR1-like δ μπμία έπεζ ζοζπεηζζηεί ιε απυηνζζδ ζε ααζμηζηή ηαηαπυκδζδ ζηδκ Ανααίδμρδ (Bae et al., 2003). Αοημί μζ δομ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ νοειίγμοκ ηδκ οπμιμκάδα 7 ζηδκ Υμκδνμθζά (πήια 2.35) δ μπμία, ζφιθςκα ιε ηζξ ηαηδβμνίεξ GO, ζπεηίγεηαζ ιε ηοηηανζηή απυηνζζδ ζε ενέεζζια ηαηαπυκδζδξ (response to stimulus) ηαζ ηοηηανζηή απυηνζζδ ζε μνβακζηή μοζία (cellular response to organic substance). Σμ cdna ημο ηνίημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα, se023_d5, έδεζλε 95% μιμθμβία ιε έκα CCAAT-binding ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα. Σμ νοειζζηζηυ ιμηίαμ CCAAT πνμζδέκεηαζ απυ ημκ πονδκζηυ πανάβμκηα Τ (Nuclear Factor Y) πενζθαιαάκμκηαξ ιζα DR1 πνςηεΐκδ (Stephenson et al., 2007), δ μπμία παίγεζ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ απυηνζζδ ημο εκδμπθαζιαηζημφ δζηηφμο ζε ηαηαπυκδζδ ζηδκ Ανααίδμρδ (Liu et al., 2010) ηαζ ζε απυηνζζδ μλεζδςηζηήξ ηαηαπυκδζδξ ζημοξ εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ (Thon et al., 2009). Δπζπθευκ οπήνλακ ηαζ άθθεξ οπμιμκάδεξ, ζηδκ Καθαιχκ, ζηζξ μπμίεξ εκημπίζηδηακ θεζημονβζηέξ ηαηδβμνίεξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε απυηνζζδ ζε ενεείζιαηα ηαηαπυκδζδξ, υπςξ πνυζδεζδ ζυκηςκ (οπμιμκάδα 2), απυηνζζδ ζε ενέεζζια αζεοθεκίμο (οπμιμκάδα 7), απυηνζζδ ζε ααζμηζηυ ενέεζζια (οπμιμκάδα 10) ηαζ απυηνζζδ ζε πνμζαμθή απυ ιφηδηεξ (οπμιμκάδα 22) (Πίκαηαξ 2.13). ηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ, οπμιμκάδεξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηαηαπυκδζδ είκαζ δ οπμιμκάδα 6 (απυηνζζδ ζε ημλίκδ), δ οπμιμκάδα 12 (απυηνζζδ ζε ηάδιζμ, ιεηαθθζηά ζυκηα ηαζ ακυνβακεξ μοζίεξ) ηαζ δ οπμιμκάδα 20 (απυηνζζδ ζε ζυκηα παθημφ) χγθξηζε ησλ δηθηχσλ ησλ πνηθηιηψλ Καιακψλ θαη Υνλδξνιηά Υαιθηδηθήο οβηνίκμκηαξ ηα δίηηοα ηδξ Καθαιχκ ηαζ ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ πνμηφπηεζ υηζ ηαζ ζηα δφμ δίηηοα εκημπίγμκηαζ οπμιμκάδεξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηαηαπυκδζδ ηαζ νοειίγμκηαζ απυ ημοξ ίδζμοξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ. Έηζζ, ηα μιυθμβα bzip (se013_b10) ηαζ NF-YB (se012_b6) cdnas νοειίγμοκ οπμιμκάδεξ ηαζ ηςκ δομ πμζηζθζχκ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ακηζδνάζεζξ ζε ενεείζιαηα ηαηαπμκήζεςκ (οπμιμκάδα 7 ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ηαζ οπμιμκάδα 9 ζηδκ Καθαιχκ) (πήια 2.40). 126

130 Πανυθμ πμο μζ ζοβηεηνζιέκεξ οπμιμκάδεξ αημθμοεμφκ πανυιμζμ ιμηίαμ έηθναζδξ ηαζ ζηζξ δομ πμζηζθίεξ ςξ ηζξ 45 διένεξ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl, δ έηθναζδ ηςκ δφμ ημζκχκ ιεηαβναθζηχκ ημοξ παναβυκηςκ έπεζ ημ αηνζαχξ ακηίεεημ ιμηίαμ έηθναζδξ (πήια 2.39). Ο ηνίημξ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ, NF Y-C (se023_d5), ειθακίγεηαζ ςξ ζοκ-νοειζζηήξ ζηδκ οπμιμκάδα 9 ζηδκ Καθαιχκ ηαζ νοειίγεζ ηαοηυπνμκα ηζξ οπμιμκάδεξ 21 ηαζ 22. ηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ δεκ νοειίγεζ ηδκ οπμιμκάδα 7 αθθά ηζξ οπμιμκάδεξ 5, 8 ηαζ 15. Δπζπθέμκ ηα δίηηοα ηςκ πμζηζθζχκ Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ (πήια 2.40) ιμζνάγμκηαζ 69 αθθδθεπζδνάζεζξ μζ μπμίεξ ζοκημκίγμκηαζ απυ ηνεζξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ. Δπίζδξ δ ζφβηνζζδ ηςκ δζηηφςκ ηδξ Καθαιχκ ηαζ ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ, δείπκεζ 36 απμιμκςιέκμοξ ηυιαμοξ (nodes) μζ μπμίμζ ακηαπμηνίκμκηαζ ζε cdnas πμο εκημπίγμκηαζ ηαζ ζηα δομ δίηηοα αθθά αημθμοεμφκ δζαθμνεηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ. Μεηαλφ αοηχκ είκαζ ηα cdnas ηςκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ, CCR4-associated factor1 (CAF1) (se020_b7) ηαζ GRAS (se015_b12) πμο ζπεηίγμκηαζ ιε απυηνζζδ ζε ενεείζιαηα ηαηαπμκήζεςκ ζφιθςκα ιε ηδκ επζζδιείςζδ GO. Δπίζδξ ζημ ζπήια 2.40 θαίκεηαζ υηζ δζαθμνεηζηά cdnas νοειίγμκηαζ απυ ημ ίδζμ μιυθμβμ ημο bzip ζηζξ δφμ πμζηζθίεξ. Δπζπθέμκ, ζε αοηά ηα cdnas πενζθαιαάκμκηαζ ανηεηά πμο ζπεηίγμκηαζ ιε απυηνζζδ ζε ηαηαπμκήζεζξ υπςξ δ auxin repressed protein (se002_b6), catalase (se019_a3) ηαζ major latex protein (se021_f1) (Hwang et al., 2005; Sun et al., 2010). Δηηυξ απυ ηα cdnas πμο νοειίγμκηαζ απυ ημ bzip ηαζ πανμοζζάγμοκ δζαθμνεηζηή έηθναζδ ηαζ ζηζξ δομ πμζηζθίεξ, εκημπίγμκηαζ ηάπμζα ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ιυκμ ζε ιζα πμζηζθία. Σμ ζδιακηζηυηενμ είκαζ ημ cdna (se014_h8) πμο ηςδζημπμζεί ιζα μιυθμβδ SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier) πνςηεάζδ. Η SUMO ειπθέηεηαζ ζε ααζμηζηέξ ηαηαπμκήζεζξ, ζηδ ζδιαημδυηδζδ ημο αιπζζζζημφ μλέμξ, ζημ πνυκμ άκεδζδξ ηαζ ζηδκ εκίζποζδ ηδξ άιοκαξ ημο θοημφ ζηα παεμβυκα (Miura et al., 2007; Conti et al., 2008). 127

131 ρήκα Γμκζδζαηή έηθναζδ επζθεβιέκςκ οπμιμκάδςκ ηςκ νοειζζηζηχκ δζηηφςκ ηδξ Καθαιχκ ηαζ ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ. Σα A1,B1 πθαίζζα ακηζπνμζςπεφμοκ ηδκ έηθναζδ ηςκ νοειζζηχκ ηαζ ηα Α2,Β2 ηδκ έηθναζδ ηςκ cdnas ζηδκ οπμιμκάδα, ακηίζημζπα. Κάεε ζηήθδ ακηζπνμζςπεφεζ δζαθμνεηζηυ πνμκζηυ ζδιείμ. Η έηθναζδ ηςκ cdnas ηαζ ηςκ νοειζζηχκ δείπκεηαζ ιε πνχιαηα. Σμ ζημφνμ ιπθε ακηζπνμζςπέοεζ παιδθή έηθναζδ εκχ ημ ηίηνζκμ ορδθή έηθναζδ. Α) Τπμιμκάδα 9 ημο δζηηφμο ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ ηαζ Β) οπμιμκάδα 7 ημο δζηηφμο ηδξ πμζηζθίαξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ. 128

132 ρήκα 2.40 φβηνζζδ ηςκ ιεηαβναθζηχκ νοειζζηζηχκ δζηηφςκ ηδξ Καθαιχκ ηαζ ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ. 69 ηυιαμζ ιμζνάγμκηαζ έκα αέθμξ ημ μπμίμ ακηζπνμζςπεφεζ ιζα νοειζζηζηή αθθδθεπίδναζδ ιεηαλφ εκυξ ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα ηαζ εκυξ cdna εκχ οπάνπμοκ ηαζ 36 ηυιαμζ ιε πανμοζία ηαζ ζηα δφμ δίηηοα αθθά ιε δζαθμνεηζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ. Οζ ηυιαμζ ιε ζπήια νυιαμο ακηζπνμζςπεφμοκ ημοξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ, εκχ μζ ζθαζνζημί ηυιαμζ ηα cdnas πμο νοειίγμκηαζ. Οζ πνάζζκμζ ηυιαμζ είκαζ ηα cdnas ιε δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδκ πμζηζθία Καθαιχκ ηαζ μζ ηυηηζκμζ ηυιαμζ είκαζ ηα cdnas ιε δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. 129

133 4. πδήηεζε ηδκ πανμφζα ενβαζία εηπμκήεδηε πείναια ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl, δζάνηεζαξ 135 διενχκ, ζε θοηά εθζάξ εκυξ έημοξ οπυ θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ εένμοξ βζα ηδκ ζοβηνζηζηή ιεθέηδ ζε επίπεδμ ιεηαβναθήιαημξ, ιεηαλφ ιζαξ εοαίζεδηδξ (Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ) (Therios, 2009) ηαζ ιζαξ ακεεηηζηήξ (Καθαιχκ) (Chartzoulakis, 2002) πμζηζθζάξ ζηδκ αθαηυηδηα. Υνδζζιμπμζχκηαξ πναβιαηζηέξ ζοκεήηεξ ηαθθζένβεζαξ, δ απυηνζζδ ηςκ θοηχκ είκαζ πζμ ακηζπνμζςπεοηζηή ηδξ πναβιαηζηήξ απυηνζζδξ ημοξ ζηδκ αθαηυηδηα. Η ακάθοζδ ημο ιεηαβναθήιαημξ έβζκε ιε ηδκ πνήζδ ιζηνμζοζημζπίαξ πμο απμηεθμφκηακ απυ 1121 ιδ-επακαθαιαακυιεκα ESTs ηα μπμία απμιμκχεδηακ απυ cdna αζαθζμεήηδ μθυηθδνμο ζπμνυθοημο εθζάξ πμζηζθίαξ Κμνςκέζηδξ. Σμ πεζναιαηζηυ ζπέδζμ πμο αημθμοεήεδηε βζα ηζξ οανζδμπμζήζεζξ ήηακ ηφπμο Γαηηοθίμο (loop design) υπςξ πνμηείκεηαζ απυ ημοξ Yang and Speed (2002). Αοηυ ημ ζπέδζμ οανζδμπμζήζεςκ εεςνείηαζ ςξ ημ πζμ αλζυπζζημ ηαεχξ πενζθάιαακεζ ηέζζενζξ αζμθμβζηέξ ηαζ δφμ ηεπκζηέξ επακαθήρεζξ βζα ηάεε πνμκζηυ ζδιείμ ηαζ ιεηαπείνζζδ. Πανά ημ ιζηνυ ανζειυ ημοηηίδςκ απυ ημκ μπμίμ απμηεθμφκηακ μζ ιζηνμζοζημζπίεξ εθζάξ, ηαηαζηεοάζηδηακ ιεηαβναθζηά νοειζζηζηά δίηηοα απυ ηδκ εοαίζεδηδ (Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ) ηαζ ηδκ ακεεηηζηή (Καθαιχκ) πμζηζθία ζηδκ αθαηυηδηα. Δπζπθέμκ, εκημπίζηδηακ ανηεημί ζενανπζηά μιαδμπμζδιέκμζ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ πμο ειπθέημκηαζ ζηδκ απυηνζζδ ζε ηαηαπμκήζεζξ, ζοιπενζθαιαακμιέκδξ ηδξ αθαηυηδηαξ. ηδκ πμζηζθία Καθαιχκ, ζφιθςκα ιε ηδκ ζενανπζηή μιαδμπμίδζδ, ζηα 159 απυ ηα 209 cdnas επάβεηαζ δ έηθναζδ ημοξ ηαευθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ ηαηαπυκδζδξ εκχ ζηα οπυθμζπα 50 επάβεηαζ ιυκμ ιεηά απυ 45 διένεξ ηαηαπυκδζδξ. Καηά ηδκ πενίμδμ επακαθμνάξ απυ ηδκ ηαηαπυκδζδ, δ έηθναζδ ηςκ cdnas ιεζχκεηαζ. Ωζηυζμ, ζηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ιυκμ 20 cdnas, ήημζ 8 θμνέξ θζβυηενα απυ ηδκ πμζηζθία Καθαιχκ, αολάκμκηαζ ηαηά ηδκ πενζυδμ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl οπμδδθχκμκηαξ ιεζςιέκδ ιεηαβναθζηή εκενβμπμίδζδ ζηδκ εοαίζεδηδ πμζηζθία. Η έθθεζρδ ιεηαβναθζηήξ εκενβμπμίδζδξ ιπμνεί εκ ιένεζ κα είκαζ οπεφεοκδ βζα ηδκ εοαζζεδζία ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ ζοβηνζκυιεκδ ιε ηδκ Καθαιχκ, ζε επίπεδμ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ. Δπίζδξ, ζφιθςκα ιε ηδκ δμηζιή αηνζαείαξ Fisher, ηα 209 cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδκ Καθαιχκ πενζθαιαάκμοκ επζζδιεζχζεζξ GO βζα απυηνζζδ ζε ηαηαπυκδζδ, ααζμηζηά ενεείζιαηα ηαζ ιεηαθμνά 130

134 ζυκηςκ, πμο δεκ ειθακίγμκηαζ ζηα 36 cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. Αοηέξ μζ επζζδιεζχζεζξ GO ζπεηίγμκηαζ άιεζα ιε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ, επζαεααζχκμκηαξ ηδκ έθθεζρδ απυηνζζδξ, ζε επίπεδμ ιεηαβναθήιαημξ, ηδξ εοαίζεδηδξ πμζηζθίαξ. Πανυθμ πμο ζηδκ πμζηζθία Καθαιχκ δ έηθναζδ ηςκ πενζζζμηένςκ cdnas ιεζχκεηαζ ηδκ πενίμδμ επακαθμνάξ απυ ηδκ ηαηαπυκδζδ, ζηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ιζα μιάδα 16 cdnas αολάκεζ ηδκ έηθναζδ ηδξ. Η επζζδιείςζδ GO αοηχκ ηςκ cdnas έδεζλε υηζ αοηά ειπθέημκηαζ ζε ιεηααμθζηέξ, ηοηηανζηέξ ηαζ ακαπηολζαηέξ δζαδζηαζίεξ πζεακυκ βζα έηπηολδ κέςκ θφθθςκ, ηαεχξ υθα ηα παθζά είπακ κεηνςεεί ηαζ απμημπεί ηδκ πενίμδμ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl. Σα νοειζζηζηά ιεηαβναθζηά δίηηοα ηαηαζηεοάζηδηακ ζημ πθαίζζμ ακαβκχνζζδξ ιδπακζζιχκ πνμζανιμβήξ ηδξ εθζάξ ζε ηαηαπυκδζδ ιε NaCl, ηαεχξ δεκ είπε ακαβκςνζζηεί πνμδβμοιέκςξ ζπεηζηυ δίηηομ ζε ηάπμζμ δεκδνμημιζηυ είδμξ. Δπζπθέμκ εεςνήεδηε υηζ δ ζηακυηδηα πνμζανιμβήξ ημο θοημφ ζηδκ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ ιπμνεί πζεακυκ κα αολδεεί ιέζς ημο ζοκημκζζιμφ ηδξ έηθναζδξ ηςκ βμκζδίςκ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε αθαηυηδηα ηαζ πενζθαιαάκμκηαζ ζηα νοειζζηζηά δίηηοα. Αοηή δ ζηναηδβζηή απαζηεί ανπζηά ημ παναηηδνζζιυ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ηδκ αθθαβή ηδξ έηθναζδξ ηςκ ζδιακηζηχκ ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ιε ζημπυ ηδκ αεθηίςζδ ηδξ ακμπήξ ημο θοημφ ζηδκ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ (Golldack et al., 2011). Γζα αοηυ ημ θυβμ ζηδκ πανμφζα ενβαζία παναηηδνίζηδηακ ανηεηά μιυθμβα ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ζηδκ εθζά. Σμ μιυθμβμ ημο JERF (Jasmonate Ethylene Response Factor) ζηδκ εθζά ακήηεζ ζηδκ μζημβέκεζα ηςκ παναβυκηςκ απυηνζζδξ ζημ αζεοθέκζμ (Ethylene Response Factors ERFs). Οζ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ JERF είκαζ βκςζηυ υηζ ειπθέημκηαζ ζε απμηνίζεζξ ααζμηζηχκ ηαηαπμκήζεςκ ηαζ ζοβηεηνζιέκα αθαηυηδηαξ ιέζς ηδξ νφειζζδξ ηδξ έηθναζδξ ηςκ βμκζδίςκ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε απυηνζζδ ηαηαπυκδζδξ (stress-responsive) ηαζ αζμζφκεεζδξ αιπζζζζημφ μλέμξ (ABA biosynthesis) (Zhang et al., 2004). Πανυθμ πμο μ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ JERF πενζθαιαάκεηαζ ζημ νοειζζηζηυ δίηηομ ηδξ Καθαιχκ ηαζ δ έηθναζδ ημο αολάκεηαζ ιεηά απυ 45 διένεξ αθαηυηδηαξ, απμοζζάγεζ απυ ημ δίηηομ ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ βεβμκυξ πμο δείπκεζ ζδιακηζηή δζαθμνά ζηδ νφειζζδ ιεηαλφ ηδξ ακεεηηζηήξ ηαζ ηδξ εοαίζεδηδξ πμζηζθίαξ. Δπμιέκςξ, ημ μιυθμβμ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα JERF ίζςξ δζαδναιαηίγεζ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ πνμζανιμβή ηδξ εθζάξ ζηδκ αθαηυηδηα. Σμ ιμηίαμ ηδξ έηθναζδξ ημο μιυθμβμο JERF πνέπεζ κα ιεθεηδεεί ηαηά ηδκ δζάνηεζα ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl ηαζ άθθα άθαηα ζε πενζζζυηενμοξ 131

135 εοαίζεδημοξ ηαζ ακεεηηζημφξ βμκυηοπμοξ εθζάξ πνμηεζιέκμο κα εηηζιδεεί δ πνμμπηζηή ημο κα πνδζζιμπμζδεεί ςξ ιμνζαηυξ δείηηδξ βζα ηδκ ακημπή ηδξ εθζάξ ζηδκ αθαηυηδηα. Δπίζδξ, ημ μιυθμβμ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα bzip ζηδκ εθζά ειθακίγεηαζ κα παίγεζ ζδιακηζηυ νυθμ ζηα ιεηαβναθζηά δίηηοα ηαζ ηςκ δομ πμζηζθζχκ νοειίγμκηαξ, εηηυξ απυ ιεβάθμ ανζειυ cdnas, ανηεημφξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ ηςκ δζηηφςκ. Η έηθναζδ ημο μιυθμβμο bzip ζηδ εθζά αολάκεηαζ ζηδ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ηαζ παναιέκεζ ζηαεενή ζηδ Καθαιχκ ιεηά ηζξ 45 διένεξ ιεηαπείνζζδ ιε NaCl (πήια 2.36). Αοηά ηα ιμηίαα έηθναζδξ ημο bzip ηδξ εθζάξ ένπμκηαζ ζε ζοιθςκία ιε ηα ιμηίαα έηθναζδξ ημο bzip24 ζηδκ ανααίδμρδ ηαζ ζημ ζοββεκζηυ ακεεηηζηυ είδμξ ζηδκ αθαηυηδηα Lobularia maritime. ηδκ ανααίδμρδ, εοαίζεδηδ ζηδκ αθαηυηδηα, ημ bzip24 ιε μιμθμβία ζημ bzip ηδξ εθζάξ αολάκεηαζ εκχ ζημ είδμξ Lobularia maritime δ έηθναζή ημο ιεζχκεηαζ (Yang et al., 2009). Δπζπθέμκ, ημ bzip ηδξ εθζάξ νοειίγεζ οπμιμκάδεξ ημο δζηηφμο πμο απμηεθμφκηαζ απυ cdnas πμο επάβεηαζ δ έηθναζδ ημοξ ζηδκ Καθαιχκ ηαζ ηαηαζηέθθεηαζ ζηδ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ζε ζοκεήηεξ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl. Αοηυ ένπεηαζ ζε ζοιθςκία ιε ηδκ ιεθέηδ ηαηαζημθήξ ημο bzip24 mrna ιέζς RNAi ζηδκ ανααίδμρδ δ μπμία αφλδζε ηδκ ακμπή ζηδκ αθαηυηδηα ελαζηίαξ ηδξ ιεηαβναθζηήξ εκενβμπμίδζδξ ιεβάθμο ανζειμφ βμκζδίςκ πμο ειπθέημκηαζ ζηδκ ηοηημπθαζιαηζηή μιμζυζηαζδ ζυκηςκ, ζηδκ ςζιςηζηή νφειζζδ ηαζ ζηδκ αφλδζδ ηαζ ακάπηολδ ημο θοημφ (Yang et al., 2009; Yoshida et al., 2010). Δπίζδξ, μ AREB1 πμο ακήηεζ ζηδκ μιάδα Α ημο bzip, έδεζλε υηζ παίγεζ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδ ζδιαημδυηδζδ ημο αιπζζζζημφ μλέμξ ζε ηαηαπυκδζδ λδναζίαξ (Yoshida et al., 2010). Δπζπνυζεεηα, δ ζενανπζηή ζπέζδ ακάιεζα ζηα μιυθμβα bzip ηαζ JERF ζηδκ Καθαιχκ είκαζ υιμζα ιε αοηή πμο πνμηείκεηαζ απυ ημοξ Golldack et al. (2011) ηαηά ηδκ μπμία μ bzip νοειίγεζ ημκ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα JERF θακενχκμκηαξ μιμζυηδηεξ ζηα δίηηοα ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ακάιεζα ζηδκ ανααίδμρδ ηαζ ζε έκα δεκδνμημιζηυ είδμξ υπςξ δ εθζά. Σμ μιυθμβμ ημο bzip ζηδκ εθζά νοειίγεζ ιυκμ ημο ή ζε ζοκδοαζιυ ιε άθθμοξ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ πέκηε απυ ηζξ εκκέα οπμιμκάδεξ ζηδκ πμζηζθία Καθαιχκ. Ακάιεζα ζηζξ πέκηε οπμιμκάδεξ, εκημπίγμκηαζ ηέζζενζξ πμο πενζέπμοκ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ, ακαδεζηκφμκηαξ ημκ ηεκηνζηυ νυθμ ημο bzip ζηδκ απυηνζζδ αθαηυηδηαξ. Μζα απυ αοηέξ ηζξ οπμιμκάδεξ, δ 13, νοειίγεηαζ απυ ηα μιυθμβα bzip ηαζ JERF πνμηείκμκηαξ ζοκενβζζηζηή δνάζδ ιεηαλφ ηςκ 132

136 ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ. ημ δίηηομ ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ μ bzip έπεζ ηεκηνζηυ νυθμ, ζηδκ απυηνζζδ ζε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ, νοειίγμκηαξ ηζξ 10 απυ ηζξ 12 οπμιμκάδεξ. Δπζπθέμκ, δομ NF-Y ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ ημπμεεηήεδηακ ζενανπζηά ακμδζηά ηαζ ζηα δφμ νοειζζηζηά δίηηοα, πανμοζζάγμκηαξ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ απυηνζζδ ηδξ εθζάξ ζηδκ αθαηυηδηα (πήια 2.33). Αοηυ ένπεηαζ ζε ζοιθςκία ιε ηδκ αεθηζςιέκδ ακμπή ζηδκ λδναζία ζε ζοκεήηεξ αβνμφ πμο πανμοζίαζακ ηα βεκεηζηά ηνμπμπμζδιέκα ηαθαιπυηζα έπεζηα απυ οπεν-έηθναζδ ημο ιεηαβναθζημφ πανάβμκηα ZmNF-YB2 (Nelson et al., 2007). Η ιεβαθφηενδ πμθοπθμηυηδηα ημο δζηηφμο ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ηδξ Καθαιχκ ζε ζφβηνζζδ ιε αοηυ ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ πζεακυκ κα είκαζ έκδεζλδ ιεβαθφηενδξ πνμζανιμβήξ ημο θοημφ ζηδκ αθαηυηδηα. Πνέπεζ θμζπυκ ιεβαθφηενμξ ακηζπνμζςπεοηζηυξ ανζειυξ cdnas κα ιεθεηδεεί βζα κα ελαπεμφκ αζθαθέζηενα ζοιπενάζιαηα, ζπεηζηά ιε ηδκ απυηνζζδ ηδξ εθζάξ ζηδκ αθαηυηδηα. Η εφνεζδ ορδθήξ πμθοπθμηυηδηαξ ιεηαβναθζηχκ νοειζζηζηχκ δζηηφςκ ζε έκα δεκδνμημιζηυ είδμξ υπςξ δ εθζά οπμδδθχκεζ ηδκ φπανλδ πανυιμζςκ νοειζζηζηχκ ιδπακζζιχκ απυηνζζδξ ζε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ ζηα θοηζηά είδδ, ακελάνηδηα απυ ημ εάκ είκαζ δεκδνμημιζηά είδδ. Αοημί μζ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ εα ιπμνμφζακ κα πνδζζιμπμζδεμφκ ςξ ιμνζαημί δείηηεξ βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ ακμπήξ ζηδκ αθαηυηδηα ημο βεκεηζημφ οθζημφ εθζάξ. 133

137 5. πκπεξάζκαηα Αθθδθμοπήεδηακ 2642 ηθχκμζ απυ αζαθζμεήηδ cdna ζπμνυθοημο εθζάξ (πμζη. Κμνςκέζηδ) ηαζ ηαηαζηεοάζηδηε δ πνχηδ ιζηνμζοζημζπία βζα ηδκ εθζά ιε ιμκαδζηά cdnas. Η ιζηνμζοζημζπία πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ιεθέηδ ηδξ ηδξ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ δομ πμζηζθζχκ εθζάξ ( Καθαιχκ ηαζ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ) ζε ηαηαπυκδζδ ιε NaCl, πνμζμιμζάγμκηαξ θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ ακάπηολδξ ηςκ δεκδνοθθίςκ εθζάξ. Η δζαθμνεηζηή ακεεηηζηυηδηα ηςκ δομ πμζηζθζχκ ζηδκ αθαηυηδηα αμήεδζε ζηδκ ελαβςβή πνήζζιςκ ζοιπεναζιάηςκ ζπεηζηά ιε ημ ιδπακζζιυ ακημπήξ ηαζ απυηνζζδξ ηδξ εθζάξ ζηδκ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ ιε NaCl. οκμθζηά εκημπίζηδηακ 209 ηαζ 36 cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδκ Καθαιχκ ηαζ ζηδκ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ακηίζημζπα. ηδκ Καθαιχκ 8 θμνέξ πενζζζυηενα cdnas αολάκμκηαζ ηαηά ηδκ πενζυδμ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl βεβμκυξ πμο ζδιαίκεζ ιεζςιέκδ ιεηαβναθζηή εκενβμπμίδζδ ζηδκ εοαίζεδηδ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. Η έθθεζρδ ιεηαβναθζηήξ εκενβμπμίδζδξ ιπμνεί εκ ιένεζ κα είκαζ οπεφεοκδ βζα ηδκ εοαζζεδζία ηδξ Υμκδνμθζάξ Υαθηζδζηήξ ζοβηνζκυιεκδ ιε ηδκ Καθαιχκ, ζε επίπεδμ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ. ηδκ πενίμδμ επακαθμνάξ απυ ηδκ ηαηαπυκδζδ υθα ηα cdnas ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ ιεζχκμκηαζ εκχ ζηδκ πμζηζθία Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ ιζα μιάδα 16 cdnas αολάκεζ ηδκ έηθναζδ ηδξ. Η επζζδιείςζδ GO αοηχκ ηςκ cdnas έδεζλε υηζ ειπθέημκηαζ ζε ιεηααμθζηέξ, ηοηηανζηέξ ηαζ ακαπηολζαηέξ δζαδζηαζίεξ πζεακυκ βζα ηδκ έηπηολδ κέςκ θφθθςκ, ηαεχξ υθα ηα παθζά είπακ κεηνςεεί ηαζ απμημπεί ηδκ πενίμδμ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl. ηδκ ζοκέπεζα ηαηαζηεοάζηδηακ νοειζζηζηά ιεηαβναθζηά δίηηοα ζημ πθαίζζμ ακαβκχνζζδξ ιδπακζζιχκ πνμζανιμβήξ ηδξ εθζάξ ζε ηαηαπυκδζδ ιε NaCl, ηαεχξ δεκ είπε ακαβκςνζζηεί πνμδβμοιέκςξ ζπεηζηυ δίηηομ ζε ηάπμζμ δεκδνμημιζηυ είδμξ. Σα νοειζζηζηά ιεηαβναθζηά δίηηοα απμηεθμφκηαζ απυ επηά ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ ηαζ 186 cdnas ζηδκ Καθαιχκ ηαζ έλζ ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ ηαζ 237 ιεηαβναθήιαηα ζηδ Υμκδνμθζά Υαθηζδζηήξ. Μεηαβναθζημί πανάβμκηεξ υπςξ μζ bzip, JERF, NF-Y ηαζ GRAS μζ μπμίμζ είκαζ βκςζηυ απυ ηδ αζαθζμβναθία υηζ ειπθέημκηαζ ζε ααζμηζηέξ ηαηαπμκήζεζξ, παίγμοκ ζδιακηζηυ νοειζζηζηυ νυθμ ζηα δίηηοα ηδξ εθζάξ. Ο ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ JERF πμο εκημπίζηδηε ιυκμ ζηδκ ακεεηηζηή πμζηζθία Καθαιχκ είκαζ βκςζηυ υηζ ειπθέηεηαζ ζε απμηνίζεζξ ααζμηζηχκ ηαηαπμκήζεςκ ηαζ ζοβηεηνζιέκα αθαηυηδηαξ. 134

138 Δπζπθέμκ δ νοειζζηζηή ζπέζδ ακάιεζα ζηα μιυθμβα bzip ηαζ JERF ζηδκ Καθαιχκ είκαζ πανυιμζα ιε αοηή πμο πνμηείκεηαζ ζηδκ αζαθζμβναθία ηαηά ηδκ μπμία μ bzip νοειίγεζ ημκ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα JERF θακενχκμκηαξ μιμζυηδηεξ ζηα δίηηοα ιεηαβναθζηχκ παναβυκηςκ ακάιεζα ζηδκ ανααίδμρδ ηαζ ζε έκα δεκδνμημιζηυ είδμξ υπςξ δ εθζά. Αοημί μζ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ εα ιπμνμφζακ κα πνδζζιμπμζδεμφκ ςξ ιμνζαημί δείηηεξ βζα ηδκ εηηίιδζδ ηδξ ακεεηηζηυηδηαξ ζηδκ αθαηυηδηα ημο βεκεηζημφ οθζημφ εθζάξ. Σέθμξ, δ ακαβκχνζζδ ορδθήξ πμθοπθμηυηδηαξ ηςκ ιεηαβναθζηχκ νοειζζηζηχκ δζηηφςκ ζε έκα δεκδνμημιζηυ είδμξ, υπςξ δ εθζά, οπμδδθχκεζ ηδκ φπανλδ πανυιμζςκ νοειζζηζηχκ ιδπακζζιχκ απυηνζζδξ ζε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ ζηα θοηζηά είδδ. 135

139 6. Βηβιηνγξαθία Al-Shahrour F., Minguez P., Tarraga J., Medina I., Alloza E., Montaner D., Dopazo J. (2007) FatiGO +: a functional profiling tool for genomic data. Integration of functional annotation, regulatory motifs and interaction data with microarray experiments. Nucleic acids research 35(Web Server issue):w Assenov Y., Ramirez F., Schelhorn S.E., Lengauer T., Albrecht M. (2008) Computing topological parameters of biological networks. Bioinformatics 24(2): Bachem C.W.B., Oomen R.J.F.J., and Visser R.G.F. (1998) Transcript imaging with cdna-aflp: A Step-by-Step Protocol. Plant Molecular Biology Reporter 16(2), Bae M.S., Cho E.J., Choi E.Y. and Park O.K. (2003) Analysis of the Arabidopsis nuclear proteome and its response to cold stress. Plant Journal 36(5): Barnes W.M. (1994) PCR Amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from θ bacteriophage templates. Proceedings of National Academic Science of USA 91: Benlloch M., Arboleda F., Barranco D. and Fernandez-Escobar R. (1991) Response of Young Olive trees to sodium and boron excess in irrigation water. HortScience 26(7): Bonnet E., Michoel T. and Van de Peer Y. (2010) Prediction of a gene regulatory network linked to prostate cancer from gene expression, microrna and clinical data. Bioinformatics 26(18):i Bonnet E., Tatari M., Joshi A., Michoel T., Marchal K., Berx G. and Van de Peer Y. (2010) Module network inference from a cancer gene expression data set identifies microrna regulated modules. PloS one 5(4):e Chartzoulakis K., Loupassaki M., Bertaki M. and Androulakis I. (2002) Effects of NaCl salinity on growth, ion content and CO 2 assimilation rate of six olive cultivars. Scientia Horticulturae 96, Chen W., Provart N.J., Glazebrook J., Katagiri F., Chang H.S., Eulgem T., Mauch F., Luan S., Zou G., Whitham S.A, Budworth P.R., Tao Y., Xie Z., Chen X., Lam S., Kreps J.A., Harper J.F., Si-Ammour A., Mauch-Mani J., Heinlein M., Kobayashi K., Hohn T., Dangl J.L., Wang X. and Zhu T. (2002) Expression Profile Matrix of Arabidopsis Transcription Factor Genes Suggests Their Putative Functions in Response to Environmental Stresses. The Plant Cell 14:

140 Chenchik A., Diatchenko L., Chang C. and Kuchibhatla S. (1994) Great LengthsTM cdna Synthesis Kit for high yields of full-length cdna. CLONTECHniques IX(1):9 12. Cheng S., Fockler C., Barnes W.M. and Higuchi R. (1994) Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. Proceedings of National Academic Science of USA 91: Cohen D., Bogeat-Triboulot M.B., Tisserant E., Balzergue S., Martin-Magniette M.L, Lelandais G., Ningre N., Renou J.P, Tamby J.P.,Le Thiec D. and Hummel I. (2010) Comparative transcriptomics of drought responses in Populus: a metaanalysis of genome-wide expression profiling in mature leaves and root apices across two genotypes. BMC Genomics 11:630. Conesa A., Gotz S., Garcia-Gomez J.M., Terol J., Talon M. and Robles M. (2005) Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics 21(18): Conti L., Price G., O Donnell E., Schwessinger B., Dominy P. and Sadanandom A. (2008) Small Ubiquitin-Like Modifier Proteases OVERLY TOLERANT TO SALT1 and -2 Regulate Salt Stress Responses in Arabidopsis. The Plant Cell 20(10): Cresti M., Ciampolini F., Tattini M., Cimato A. (1994) Effect of salinity on productivity and oil quality of olive (Olea europaea L.) plants. Advances in Horticultural Science 8(4): Demiral M.A. (2005) Comparative response of two olive (Olea europaea L.) cultivars to salinity. Turkish Journal of Agriculture and Forestry 29: Deyhollos M.K. (2010) Making the most of drought and salinity transcriptomics. Plant, Cell and Environment 33: Ergen N.Z., Thimmapuram J., Bohnert H.J. and Budak H. (2009) Transcriptome pathways unique to dehydration tolerant relatives of modern wheat. Functional & Integrative Genomics 9: Golldack D., King I.L. and Yang O. (2011) Plant tolerance to drought and salinity: stress regulating transcription factors and their functional significance in the cellular transcriptional network. Plant Cell Reports 30: Gong Q.Q., Li P.H., Ma S.S., Rupassara S.I. & Bohnert H.J. (2005) Salinity stress adaptation competence in the extremophile Thellungiella halophila in comparison with its relative Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 44:

141 Gucci R., Lombardini L., and Tattini M. (1997) Analysis of leaf water relations in leaves of two olive (Olea europaea) cultivars differing in tolerance to salinity. Tree Physiology 17(1): Gucci R. and Tattini M. (1997) Salinity tolerance in olive. Horticultural Review 21: He X.L., Hou X.N., Shen Y.Z. and Huang Z.J. (2011) TaSRG, a wheat transcription factor, significantly affects salt tolerance in transgenic rice and Arabidopsis. FEBS LETTERS 585(8): Heimler D., Tattini M., Ticci S., Coradeschi M.A. and Traversi M.L. (1995) Growth, ion accumulation, and lipid-composition of 2 olive genotypes under salinity. Journal of Plant Nutrition 18(8): Hoagland D.R., and Arnon D.S. (1950). The water culture method for growing plants without soil. California Agriculture 374:1 32. Hwang E.W., Kim K.A., Park S.C., Jeong M.J., Byun M.K. and Kwon H.B (2005) Expression profiles of hot pepper (Capsicum annuum) genes under cold stress conditions. Journal of Bioscience 30(5): Jakoby M., Weisshaar B., Droge-Laser W., Vicente-Carbajosa J., Tiedemann J., Kroj T. and Parcy F. (2002) bzip transcription factors in Arabidopsis. Trends in plant science 7(3): Klein I., Ben-Tal Y., Lavee S., Malach Y. and David I. (1994) Saline irrigation of cv. Manzanillo and Uovo di Piccione trees. Acta Horticulturae 356: Labarga A., Valentin F., Anderson M., Lopez R. (2007) Web services at the European bioinformatics institute. Nucleic acids research 35(Web Server issue): W6-11. Liao Y., Zou H.F., Wei W., Hao Y.J., Tian A.G., Huang J., Liu Y.F., Zhang J.S., Chen S.Y. (2008) Soybean GmbZIP44, GmbZIP62 and GmbZIP78 genes function as negative regulator of ABA signaling and confer salt and freezing tolerance in transgenic Arabidopsis. Planta 228(2): Liu J.X. and Howell S.H. (2010) bzip28 and NF-Y transcription factors are activated by ER stress and assemble into a transcriptional complex to regulate stress response genes in Arabidopsis. The Plant cell 22(3): Loreto F., Centritto M. and Chartzoulakis K. (2003) Photosynthetic limitations in olive cultivars with different sensitivity to salt stress. Plant and Cell Environment 26:

142 Mane S.P., Robinet C.V., Ulanov A., Schafleitner R., Tincopa L., Gaudin A., Nomberto G., Alvarado C., Solis C., Bolivar L.A., Blas R., Ortega O., Solis J., Panta A., Rivera C., Samolski I., Carbajulca D.H., Bonierbale M., Pati A., Heath L.S., Bohnert H.J., Grene R. (2008) Molecular and physiological adaptation to prolonged drought stress in the leaves of two Andean potato genotypes. Functional Plant Biology 35: Μακζμοδάηδ Μανία, (2010) Τπμθμβζζηζηά ενβαθεία βζα ημκ εκημπζζιυ ηαζ ιεθέηδ ηδξ θεζημονβίαξ ηαζ ηςκ αθθδθεπζδνάζεςκ νοειζζηζηχκ δζηηφςκ. Διδακτορική διατριβή, Πακεπζζηήιζμ Κνήηδξ ηαζ Ικζηζημφημ Σεπκμθμβίαξ ηαζ Ένεοκαξ. Melgar JC., Mohamed Y., Serrano N., Garcia-Galavis P.A., Navarro C., Parra M.A., Benlloch M., Fernandez-Escobar R. (2009) Long term responses of olive trees to salinity Agricultural water management 96(7): Michoel T., Maere S., Bonnet E., Joshi A., Saeys Y., Van den Bulcke T., Van Leemput K., van Remortel P., Kuiper M. and Marchal K. (2007) Validating module network learning algorithms using simulated data. BMC bioinformatics 8 Suppl 2:S5. Miura K., Jing, B.J., Lee, J., Chan, Y.Y., Stirm, V., Miura, T., Ashworth, E.N., Bressan, R.A., Yun, D.-J. and Hasegawa, P.M. (2007) SIZ1-mediated sumoylation of ICE1 controls CBF3/DREB1A expression and freezing tolerance in Arabidopsis. Plant Cell 19(4): Mohammadi M., Kav H.N.V. and Deyholos M.K. (2008) Transcript expression profile of water-limited roots of hexaploid wheat (Triticum aestivum Opata ). Genome 51: Munns R. (2002) Comparative physiology of salt and water stress. Plant, Cell & Environment 25: Munns R. (2005) Genes and salt tolerance: bringing them together. New Phytologists 167: Nelson D.E., Repetti P.P., Adams T.R., Creelman R.A., Wu J., Warner DC., Anstrom D.C., Bensen R.J., Castiglioni P.P., Donnarummo M.G., Hinchey B.S., Kumimoto R.W., Maszle D.R., Canales R.D., Krolikowski K.A., Dotson S.B., Gutterson N., Ratcliffe O.J. and Heard J.E. (2007) Plant nuclear factor Y (NF-Y) B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on waterlimited acres. Proceedings of the national academy of sciences of USA 104(42):

143 Quackenbush J. (2002) Microarray data normalization and transformation. Nature genetics 32Suppl: Rabello A.R., Guimaraes C.M., Rangel P.H.N., da Silva F.R., Seixas D., de Souza E., Brasileiro A.C.M., Spehar C.R., Ferreira M.E. and Mehta Â. (2008) Identification of drought-responsive genes in roots of upland rice (Oryza sativa L). BMC Genomics 9: 485. Rodrigues F.A., de Laia M.L. and Zingaretti S.M. (2009) Analysis of gene expression profiles under water stress in tolerant and sensitive sugarcane plants. Plant Science 176: Rugini E. and Fedeli E. (1990) Olive (Olea europaea L.) as an oilseed crop. In: Bajaj, Y.P.S. (ed.), Biotechnology in Agriculture and Forestry Legume and Oilseed Crops, Vol. I. Springer, Berlin, pp Saeed A.I., Sharov V., White J., Li J., Liang W., Bhagabati N., Braisted J., Klapa M., Currier T., Thiagarajan M. Sturn A., Snuffin M., Rezantsev A., Popov D., Ryltsov A., Kostukovich E., Borisovsky I., Liu Z., Vinsavich A., Trush V. and Quackenbush J. (2003) TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. BioTechniques 34(2): Sambrook J., Maniatis T. and Fritsch E.F. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor laboratory. Cold Spring Harbor, NY. Shannon P., Markiel A., Ozier O., Baliga N.S., Wang J.T., Ramage D., Amin N., Schwikowski B. and Ideker T. (2003) Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome research 13(11): Sioson A.A., Mane S.P., Li P., Sha W., Heath L.S., Bohnert H.J. and Grene R. (2006) The statistics of identifying differentially expressed genes in Expresso and TM4: a comparison. BMC bioinformatics 7:215. Stephenson T.J., McIntyre C.L., Collet C. and Xue G.P. (2007) Genome-wide identification and expression analysis of the NF-Y family of transcription factors in Triticum aestivum. Plant molecular biology 65(1-2): Sun W., Xu X., Zhu H., Liu A., Liu L., Li J. and Hua X. (2010) Comparative Transcriptomic Profiling of a Salt-Tolerant Wild Tomato Species and a Salt- Sensitive Tomato Cultivar. Plant Cell Physiology 51(6): Tabatabaei S.J. (2006) Effects of salinity and N on the growth, photosynthesis and N status of olive (Olea europaea L.) trees. Scientia Horticulturae 108:

144 Taji T., Seki M., Satou M., Sakurai T., Kobayashi M., Ishiyama K., Narusaka Y., Narusaka M., Zhu J.-K. and Shinozaki K. (2004) Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis thaliana and Arabidopsis related halophyte salt cress using Arabidopsis microarray. Plant Physiology 135: Tattini M., Bertoni P. and Caselli S. (1992) Genotypic responses of olive plants to sodium chloride. Journal of Plant Nutrition 15: Tattini M., Gucci R., Romani A., Baldi A. and Everand J.D. (1996) Changes in nonstructural carbohydrates in olive (Olea europaea) leaves during root zone salinity stress. Physiologia Plantarum 98(1): Tattini M. and Traversi M.L. (2009) On the mechanism of salt tolerance in olive (Olea europaea L.) under low- or high-ca(2+) supply. Environmental and Experimental Botany 65(1): Tattini M., Gucci R., Coradeschi M.A., Ponzio C. and Everard J.D. (1995) Growth, gas exchange and ion content in Olea europaea plants during salinity stress and subsequent relief. Physiologia Plantarum 95(2): Tattini M., Montagni G. and Traversi M.L. (2002) Gas exchange, water relations and osmotic adjustment in Phillyrea latifolia grown at various salinity concentrations. Tree physiology 22(6): Therios I. and Karagiannidis N. (1991) Effect of NaCl on growth and chemical composition of four olive cultivars. Scientific Annals, School of Agriculture, Aristotle University of Thessaloniki 28: Therios I. N. (2009) Olives. CABI, U.K. Thon M., Al Abdallah Q., Hortschansky P., Scharf D.H., Eisendle M., Haas H. and Brakhage A.A. (2009) The CCAAT-binding complex coordinates the oxidative stress response in eukaryotes. Nucleic acids research 38(4): Tusher V.G., Tibshirani R. and Chu G. (2001) Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 98(9): Wan X., Mo A., Liu S.,Yang L. and Li L. (2011) Constitutive expression of a peanut ubiquitin-conjugating enzyme gene in Arabidopsis confers improved water-stress tolerance through regulation of stress-responsive gene expression. Journal of Bioscience and Bioengineering 111(4):

145 Wolf B. (1971) The determination of boron in soil extracts, plant materials, composts, manures, water and nutrient solutions. Communications in Soil Science and Plant Analysis 2: Wong C.E., Li Y., Labbe A., et al. (2006) Transcriptional profiling implicates novel interactions between abiotic stress and hormonal responses in Thellungiella, a close relative of Arabidopsis. Plant Physiology 140: Wu L., Zhang Z., Zhang H., Wang X.C., and Huang R. (2007). Transcriptional modulation of ethylene response factor protein JERF3 in the oxidative stress response enhances tolerance of tobacco seedlings to salt, drought, and freezing. Plant Physiology 148: Yang Y.H. and Speed T. (2002) Design issues for cdna microarray experiments. Nature Reviews Genetics 3(8): Yoshida T., Fujita Y., Sayama H., Kidokoro S., Maruyama K., Mizoi J., Shinozaki K. and Yamaguchi-Shinozaki K. (2010) AREB1, AREB2, and ABF3 are master transcription factors that cooperatively regulate ABRE-dependent ABA signaling involved in drought stress tolerance and require ABA for full activation. Plant Journal 61(4): Yu H. and Gerstein M. (2006) Genomic analysis of the hierarchical structure of regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 103(40): Zhang H., Huang Z., Xie B., Chen Q., Tian X., Zhang X., Zhang H., Lu X., Huang D., and Huang R. (2004). The ethylene-, jasmonate-, abscisic acid- and NaClresponsive tomato transcription factor JERF1 modulates expression of GCC boxcontaining genes and salt tolerance in tobacco. Planta 220: Zhang Z., Li F., Li D., Zhang H. and Huang R. (2010). Expression of ethylene response factor JERF1 in rice improves tolerance to drought. Planta 232:

146 ΚΔΦΑΛΑΙΟ 3 Αλάιπζε γνληδηαθήο έθθξαζεο ηεο αλζεθηηθήο πνηθηιίαο ειηάο Καιακψλ ζε θαηαπφλεζε αιαηφηεηαο κε ηελ ρξήζε αιιεινχρεζεο κεγάιεο θιίκαθαο Πεξίιεςε Η εθζά (Olea europaea L.) είκαζ ιζα απυ ηζξ ζδιακηζηυηενεξ ηαθθζένβεζεξ ζηδκ πενζμπή ηδξ Μεζμβείμο. Μεβάθμ ιένμξ ηςκ ηαθθζενβμφιεκςκ εηηάζεςκ ζηδκ Μεζυβεζμ είκαζ αθαημφπμ ελαζηίαξ ηδξ παιδθήξ πμζυηδηαξ ημο κενμφ άνδεοζδξ, πνμηαθχκηαξ ανκδηζηέξ επζπηχζεζξ ζηδκ αφλδζδ ηαζ ηδκ παναβςβζηυηδηα ηςκ θοηχκ. Πανυθδ ηδκ ζδιακηζηή ηαζ ζοκεπχξ αολακυιεκδ μζημκμιζηή ζδιαζία ηδξ εθζάξ, μ παναηηδνζζιυξ ημο βμκζδζχιαημξ ηδξ εθζάξ ανίζηεηαζ ζε πνμηαηανηηζηυ ζηάδζμ. Υνδζζιμπμζήεδηε ιζα αβνμκμιζηή πνμζέββζζδ πμο ζοκδφαζε πεζναιαηζηυ ζπεδζαζιυ πμο κα πνμζμιμζάγεζ ηζξ θοζζηέξ ζοκεήηεξ ηαθθζένβεζαξ ιε ιεβάθδξ ηθίιαηαξ αθθδθμφπζζδ (high-throughput sequencing) ιε ζημπυ κα ιεθεηδεεί δ ιμνζαηή αάζδ ηδξ ακεεηηζηυηδηαξ ηδξ εθζάξ ζηδκ αθάημηδηα ζε επίπεδμ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ ηαζ κα ειπθμοηζζηεί δ ιζηνή οπάνπμοζα αάζδ δεδμιέκςκ ιε αθθδθμοπίεξ cdna εθζάξ. Φφθθα ηαζ νίγα ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ, πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ιεθέηδ ηδξ ακεεηηζηυηδηαξ ηδξ έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl. Σέζζενζξ cdna αζαθζμεήηεξ απυ θφθθα ηαζ νίγα αθθδθμοπίεδηακ ιε ηδκ πθαηθυνια 454 GS FLX Titanium. Πνμέηορακ ορδθήξ πμζυηδηαξ ESTs ηα μπμία ακαθφεδηακ ιε αζμτπμθμβζζηζηά πνμβνάιιαηα βζα ημκ εκημπζζιυ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ, ζε θφθθα ηαζ νίγα, έπεζηα απυ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl. Η ιαγζηή πανάθθδθδ αθθδθμφπδζδ ηςκ cdna αζαθζμεδηχκ πανείπε ιεβάθδξ ηθίιαηαξ πθδνμθμνία ζπεηζηά ιε ηζξ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ηαζ ηδκ ιμνζαηή θεζημονβία ηςκ cdnas πμο εηθνάγμκηαζ ζε θφθθα ηαζ νίγα εθζάξ. Η ζφβηνζζδ ηςκ πνμθίθ έηθναζδξ ιεηαλφ ηςκ ιεηαπεζνίζεςκ NaCl ηαζ ηςκ ζζηχκ επέηνερε ημκ εκημπζζιυ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζε ηαηαπυκδζδ 90-διενχκ ιε NaCl. 143

147 1. Δηζαγσγή Η ηαθθζένβεζα ηδξ εθζάξ είκαζ ελαζνεηζηά ζδιακηζηή ζηζξ πενζμπέξ ηδξ Μεζμβείμο ιε αλζυθμβα μζημκμιζηά ηαζ μζημθμβζηά απμηεθέζιαηα (Loumou and Giourga, 2003). H ζοκεπήξ επέηηαζδ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ηδξ εθζάξ ηαζ ηαοηυπνμκα δ άνδεοζδ ιε παιδθήξ πμζυηδηαξ κενυ, ηονίςξ αθαημφπμ, ζδίςξ ηαηά ηδκ δζάνηεζα ηδξ εενζκήξ πενζυδμο είκαζ μζ ηονζυηενεξ αζηίεξ πμο πνμηαθμφκ πνμαθήιαηα αθαηυηδηαξ ζημοξ εθαζχκεξ (Cimato et al., 2010; Benlloch et al., 1991; Tattini, 1994). Σμ NaCl είκαζ ημ πζμ εοδζάθοημ ηαζ εονέςξ δζαδεδμιέκμ άθαξ πμο επδνεάγεζ ανκδηζηά ηδκ αθαζηζηή αφλδζδ (Tattini et al., 1992; Klein et al., 1994) ηαζ παναβςβζηυηδηα ηδξ εθζάξ (Cresti et al., 1994), ιεζχκεζ ημ νοειυ θςημζφκεεζδξ (Loreto et al., 2003; Tabatabaei, 2006) ηαζ πνμηαθεί ιμνθμθμβζηέξ αθθαβέξ ζηα θφθθα (Therios, 2009). Η εθζά είκαζ ιεηνίςξ ακεεηηζηή ζημ NaCl (Rugini and Fedeli, 1990) θυβς υιςξ ηδξ ιεβάθδξ βεκεηζηήξ πμζηζθμιμνθίαξ ηδξ, εκημπίγμκηαζ ζδιακηζηέξ δζαθμνέξ ιεηαλφ ηςκ ηαθθζενβμφιεκςκ πμζηζθζχκ ζηδκ ακεεηηζηυηδηα ημοξ ζε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ (Therios and Misopolinos, 1988; Marin et al., 1995; Chartzoulakis et al., 2005). Οζ ακεεηηζημί, ζε ακηίεεζδ ιε ημοξ εοαίζεδημοξ βεκυηοπμοξ πανμοζζάγμοκ ιεβαθφηενδ ζηακυηδηα απμηθεζζιμφ ηςκ ημλζηχκ ζυκηςκ ηαζ εθέβπμοκ απμηεθεζιαηζηυηενα ηδκ ιεηαθμνά αθάηςκ ζημοξ αθαζημφξ (Gucci and Tattini, 1997). Οζ νίγεξ ελαζηίαξ ηδξ άιεζδξ έηεεζήξ ημοξ ζηα άθαηα απμηεθμφκ ημ πζμ εοαίζεδημ ηιήια ημο θοημφ. Ωζηυζμ, μ νοειυξ αφλδζδξ ηαζ δ ζμκηζηή ηαηάζηαζδ ηδξ νίγαξ δεκ επδνεάγμκηαζ ζδιακηζηά, ςξ έκα ααειυ αθαηυηδηαξ, θυβς ηςκ ιδπακζζιχκ πμο έπμοκ ακαπηφλεζ ηα πενζζζυηενα θοηά βζα νφειζζδ ηδξ ζοζζχνεοζδξ αθάηςκ ηαζ ηδκ επζθεηηζηυηδηα ημοξ βζα ηα ενεπηζηά ζημζπεία πμο ανίζημκηαζ ζε παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ζημ εδαθζηυ δζάθοια. Αοηυ επζηοβπάκεηαζ ιέζς ημο απμηθεζζιμφ ημο Na + ηαζ ημο Cl - ηαηά ηδκ απμννυθδζδ ημοξ απυ ημ έδαθμξ (Munns, 2005). Η ακοπανλία αθθδθμοπζχκ ημο βμκζδζχιαημξ ηδξ εθζάξ ηαεχξ ηαζ ημ βεβμκυξ υηζ είκαζ δεκδνμημιζηυ είδμξ είκαζ μζ ηονζυηενεξ αζηίεξ πμο δ ιμνζαηή αάζδ ηδξ ακεεηηζηυηδηαξ ηδξ εθζάξ ζηδκ αθαηυηδηα παναιέκεζ αηυιδ ακελενεφκδηδ. Η απμοζία βμκζδζχιαημξ ακαθμνάξ ειπμδίγεζ ηζξ οπάνπμοζεξ πνμζεββίζεζξ βζα ηδκ ακαβκχνζζδ ηαζ ημκ παναηηδνζζιυ ιεβάθμο ανζειμφ βμκζδίςκ ζηδκ εθζά (Salem et al., 2010). Γζα αοημφξ ημοξ θυβμοξ, δ ηεπκμθμβία αθθδθμφπζζδξ ιεβάθδξ ηθίιαηαξ (ultra high throughput sequencing technology) ημο ιεηαβναθήιαημξ πνμαάθθεζ ςξ ιζα 144

148 ηαπεία, απμηεθεζιαηζηή ηαζ εθηοζηζηή εκαθθαηηζηή πνμζέββζζδ ζε ζπέζδ ιε ηζξ ιζηνμζοζημζπίεξ, βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο πνμθίθ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ (Wang et al., 2009; Marioni et al., 2008). Οζ ιζηνμζοζημζπίεξ απμηεθμφκ ζδιακηζηυ ενβαθείμ βζα ιεβάθδξ ηθίιαηαξ ακάθοζδ ημο ιεηαβναθήιαημξ, πανμοζζάγεζ υιςξ πενζμνζζιμφξ υπςξ ιεζςιέκδξ αηνίαεζαξ πμζμηζημπμίδζδ ηδξ έηθναζδξ βμκζδίςκ πμο δεκ ανίζημκηαζ ζε αθεμκία, ηα παναηηδνζζηζηά οανζδμπμίδζδξ ηςκ ακζπκεοηχκ (probes) ιπμνεί κα δζαθένμοκ ζδιακηζηά (Gautier et al., 2004) ηαζ μζ ζοζημζπίεξ πενζμνίγμκηαζ ζηδκ ζοζπέηζζδ ιεηαβναθδιάηςκ ιε βκςζημφξ ακζπκεοηέξ (probes). οκεπχξ ηα απμηεθέζιαηα απυ ιζα ιυκμ οανζδμπμίδζδ ίζςξ κα ιδκ πανέπμοκ ιζα αλζυπζζηδ εζηυκα ηδξ ζπεηζηήξ έηθναζδξ ηςκ δζαθυνςκ ιεηαβναθδιάηςκ ηαζ βζα αοηυ απαζημφκηαζ ανηεηέξ αζμθμβζηέξ ηαζ ηεπκζηέξ επακαθήρεζξ (Marioni et al., 2008). Ακηζεέηςξ, μζ πνμζεββίζεζξ πμο ααζίγμκηαζ ζε ιεβάθδξ ηθίιαηαξ αθθδθμφπζζδ έπμοκ ηδκ δοκαιζηή κα ακηζιεηςπίγμοκ αοημφξ ημοξ πενζμνζζιμφξ ηαζ κα πνμζθένμοκ ημ πθεμκέηηδια υηζ ιπμνμφκ κα ακζπκεφζμοκ ηζξ εηθνάζεζξ ηςκ ιεηαβναθδιάηςκ δζαθμνεηζηχκ ζζηχκ ή ζοκεδηχκ πςνίξ ηδκ ακάβηδ ελεγδηδιέκςκ ηακμκζημπμζήζεςκ ηςκ δεδμιέκςκ (Mortazavi et al., 2008; Cloonan et al., 2008). Ανηεηέξ ιεθέηεξ έπμοκ ακαθενεεί ζηδκ πνήζδ ηδξ αθθδθμφπζζδξ 454 Life Sciences (Roche) ςξ έκα ελαζνεηζηυ ενβαθείμ βζα ηδκ ιεθέηδ επζπέδςκ έηθναζδξ ημο mrna (Margulies et al., 2005; Weber et al., 2007; Sugarbaker et al., 2008; Torres et al., 2008; Wang et al., 2009). οβηνζηζηέξ ιεθέηεξ ιεηαβναθδιάηςκ θοηχκ ιε ηδκ πνήζδ αθθδθμφπδζδξ ιεβάθδξ ηθίιαηαξ έπμοκ εκημπίζεζ δζαθμνέξ ζηδκ βμκζδζαηή έηθναζδ πμο μθείθεηαζ ζημ βεκυηοπμ, ζημ είδμξ ζζημφ ή ζε θοζζμθμβζηέξ αθθαβέξ ζε δζάθμνα θοηά υπςξ ηαθαιπυηζ (Ohtsu et al., 2007), ηαζηακζά (Barakat et al., 2009), αιπέθζ (Rwahnih et al., 2011) ηαζ εοηάθοπημξ (Novaes et al., 2008). Δπίζδξ, ιυθζξ πνυζθαηα ιεθεηήεδηε δ βμκζδζαηή έηθναζδ ηαηά ηδκ δζάνηεζα ακάπηολδξ ημο ηανπμφ ηδξ εθζάξ ηςκ πμζηζθζχκ Coratina ηαζ Tendellone (Alagna et al., 2009). Η ζοβηεηνζιέκδ ιεθέηδ ειπθμφηζζε ζδιακηζηά ηζξ εθάπζζηεξ οπάνπμοζεξ βκςζηέξ αθθδθμοπίεξ cdna ηδξ εθζάξ πενζμνίζηδηε υιςξ ζημκ ηανπυ. ημπυξ αοηήξ ηδξ ενβαζίαξ είκαζ κα πνδζζιμπμζδεεί δ ηεπκμθμβία αθθδθμφπζζδξ 454 Life Science βζα κα ιεθεηδεεί δ ιμνζαηή απυηνζζδ ηδξ ακεεηηζηήξ ζηδκ αθαηυηδηα πμζηζθίαξ εθζάξ Καθαιχκ, ιε ακάθοζδ cdnas θφθθςκ ηαζ νίγαξ βζα ημκ εκημπζζιυ βμκζδίςκ ιε δζαθμνεηζηή έηθναζδ έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl πνμζμιμζάγμκηαξ πναβιαηζηέξ ζοκεήηεξ ακάπηολδξ ηςκ δεκδνοθθίςκ. 145

149 2. Τιηθά θαη Μέζνδνη 2.1. Φπηηθφ πιηθφ θαη πείξακα αιαηφηεηαο Υνδζζιμπμζήεδηακ θοηά εθζάξ, ηδξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ, δθζηίαξ εκυξ έημοξ, πνμενπυιεκα απυ ημ θοηχνζμ Κςζηεθέκμξ. Σα κεανά θοηά πνζκ ηαζ ηαηά ηδκ δζάνηεζα ημο πεζνάιαημξ αθαηυηδηαξ πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ απμιυκςζδ RNA υπςξ πενζβνάθεηαζ ακαθοηζηά ζηζξ παναβνάθμοξ 2.1 ηαζ 2.2 ημο ηεθαθαίμο Απνκφλσζε RNA Έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ NaCl, ζοθθέπεδηακ νίγεξ ηαζ θφθθα ηεζζάνςκ θοηχκ απυ ηάεε ιεηαπείνζζδ, ηαεανίζηδηακ ιε απζμκζζιέκμ κενυ, απμζηεζνχεδηακ ιε 0,5% οπμπθςνζχδεξ κάηνζμ ηαζ θεζμηνζαήεδηακ ιε βμοδί ηαζ βμοδμπένζ ζε οβνυ άγςημ. Ο ζζηυξ απυ ηα ηέζζενα θοηά ακαιίπεδηε ηαζ μθζηυ ηοηηανζηυ RNA απμιμκχεδηε απυ ηζξ νίγεξ ηαζ ηα θφθθα (ηαηαπμκδιέκα ηαζ ιάνηονεξ) λεπςνζζηά ζφιθςκα ιε ηδ ιέεμδμ ηςκ Bachem et al. (1998), ιε ιζηνέξ ηνμπμπμζήζεζξ υπςξ πενζβνάθμκηαζ ακαθοηζηά ζηδκ πανάβναθμ 2.5 ημο 2 μο ηεθαθαίμο. Σα δείβιαηα RNA επςάζηδηακ ιε ημ έκγοιμ DNAse I (Fermentas). Ο ηαεανζζιυξ ημο μθζημφ ηοηηανζημφ RNA έβζκε ιε Nucleospin RNA Clean-up XS kit (Macherey-Nagel) ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή υπςξ πενζβνάθεηαζ ακαθοηζηά ζηδκ πανάβναθμ 2.6 ημο 2 μο ηεθαθαίμο. Η πμζμηζημπμίδζδ ημο RNA έβζκε ιε ημ θαζιαημθςηυιεηνμ NanoDrop ημο Ικζηζημφημο Θαθάζζζαξ Βζμθμβίαξ ηαζ Γεκεηζηήξ ζημ Ηνάηθεζμ Κνήηδξ (Ι.ΘΑ.ΒΙ.Γ). Η πμζυηδηα ημο RNA εθέβπεδηε ιε ημ ζφζηδια Agilent 2100 Bioanalyzer Καηαζθεπή 454-βηβιηνζήθεο Η ηαηαζηεοή ηδξ cdna αζαθζμεήηδξ βζα αθθδθμφπδζδ ιε ηδκ πθαηθυνια 454 GS FLX Titanium sequencer (Roche) πναβιαημπμζήεδηε ιε ημ cdna Rapid Library Preparation Kit (Roche) ιε ιενζηέξ ηνμπμπμζήζεζξ απυ ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή (πήια 3.1), μζ μπμίεξ ελδβμφκηαζ ζηδκ ζοκέπεζα ακαθοηζηά. 146

150 ρήκα 3.1. Η δζαδζηαζία ηαηαζηεοήξ cdna αζαθζμεήηδξ βζα αθθδθμφπζζδ ιε ηδκ πθαηθυνια 454 GS FLX Titanium sequencer (Roche), πνδζζιμπμζχκηαξ ημ cdna Rapid Library Preparation Kit (Roche) Σεκαρηζκφο ηνπ RNA (RNA fragmentation) Γζα ημκ ηειαπζζιυ (fragmentation) ημο RNA πνδζζιμπμζήεδηακ 2 ιg μθζημφ ηοηηανζημφ RNA ηαζ 2 ιl δζαθφιαημξ ηειαπζζιμφ (fragmentation solution) (Roche) ζε ζοκμθζηυ υβημ 18 ιl. Σμ ιείβια ακαδεφηδηε ζε ιδπακζηυ ακαδεοηήνα (vortex) ηαζ επςάζηδηε ζημοξ 72 0 C βζα 30 s ηαζ αιέζςξ ιεηά ημπμεεηήεδηε ζε πάβμ. ηδκ ζοκέπεζα πνμζηέεδηακ 2 ιl EDTA (0.5 Μ, ph 8.0) ηαζ 28 ιl Tris HCl (10mM, ph 7.5). Σμ ιείβια αθμφ ακαδεφηδηε, πνμζηέεδηακ 80 ιl RNAClean (Roche) ζημ μπμίμ πενζέπμκηαζ ηα SPRI ζθαζνίδζα (beads) ηαζ επςάζηδηε ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 10 min. Έπεζηα ημ θζαθίδζμ πμο πενζείπε ημ ιείβια ημπμεεηήεδηε ζηδκ ζοζηεοήιαβκήηδ MPC (Magnetic Particle Concentrator) χζηε ηα ιαβκδηζηά ζθαζνίδζα ζηα μπμία είκαζ πνμζδεδειέκμ ημ RNA κα δδιζμονβήζμοκ ίγδια. Η οπενηείιεκδ θάζδ απμιαηνφκεδηε, ημ ίγδια λεπθφεδηε 3 θμνέξ ιε 70% αζεακυθδ ηαζ αθέεδηε κα ζηεβκχζεζ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 3 min. Σμ θζαθίδζμ απμιαηνφκεδηε απυ ημκ ιαβκήηδ MPC, πνμζηέεδηακ 19 ιl Tris HCl (10mM, ph 7.5), ακαδεφηδηε ηαζ λακαημπμεεηήεδηε ζημκ ιαβκήηδ MPC. Αοηή ηδκ θμνά δ οπενηείιεκδ θάζδ πμο 147

151 πενζέπεζ ηαζ ημ ηειαπζζιέκμ RNA (fragmented RNA), ιεηαθένεδηε ζε ηαζκμφνβζμ θζαθίδζμ χλζεζε cdna δηπιήο αιπζίδαο Γζα ηδκ ζφκεεζδ ηδξ πνχηδξ αθοζίδαξ cdna πνμζηέεδηακ ζημ ηειαπζζιέκμ RNA 4 ιl απυ ημκ εηηζκδηή 5 -TTTTTTCTTGTTTTCTTTTCTTV-3 (400 ιm/ml) (Sarropoulou et al., 2011), ημ ιείβια ακαδεφηδηε βζα 10 s, εενιάκεδηε ζημοξ 70 0 C βζα 10 min ηαζ ημπμεεηήεδηε αιέζςξ ζημκ πάβμ βζα ημοθάπζζημκ 2 min. Καηυπζκ ημ ιείβια θοβμηεκηνήεδηε ζφκημια ηαζ πνμζηέεδηακ 8 ιl νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (5Υ RT-buffer AMV), 4 ιl DTT (0.1M), 4 ιl dntps (10mM), 1 ιl Protector RNase Inhibitor (25 U/ιl) ηαζ 2 ιl εκγφιμο ακηίζηνμθδξ ιεηαβναθάζδξ AMV (25 U/ιl). Αημθμφεδζε επχαζδ ζημοξ 25 0 C βζα 10 min ηαζ ζημοξ 42 0 C βζα 60 min. ηδκ ζοκέπεζα, βζα ηδκ ζφκεεζδ ηδξ δεφηενδξ αθοζίδαξ cdna πνμζηέεδηακ ζημ ιείβια 30 ιl νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (5Υ 2nd strand synthesis buffer), 72 ιl κενυ, 1.5 ιl dntps (10mM) ηαζ 6.5 ιl έκγοιμ (2nd strand enzyme). Αημθμφεδζε επχαζδ ζημοξ 16 0 C βζα 2 χνεξ. Έπεζηα πνμζηέεδηακ 20 ιl T4 DNA Polymerase, επςάζηδηε βζα 5 min ζημοξ 16 0 C ηαζ πνμζηέεδηακ 17 ιl EDTA (0.2M, ph 8.0). Ο ηαεανζζιυξ ημο cdna δζπθήξ αθοζίδαξ πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδκ πνμζεήηδ 300 ιl ζθαζνζδίςκ AMPure (Roche). Σμ ιείβια ακαδεφηδηε βζα 10 s, επςάζηδηε βζα 5 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ηαζ ημπμεεηήεδηε ζημκ ιαβκήηδ MPC (Roche). Μυθζξ ηα ζθαζνίδζα δδιζμφνβδζακ ίγδια, δ οπενηείιεκδ θάζδ απμιαηνφκεδηε, ηαεανίζηδηακ 3 θμνέξ ιε 800 ιl 70% αζεακυθδ ηαζ αθέεδηακ κα ζηεβκχζμοκ βζα 3 min ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Σμ θζαθίδζμ απμιαηνφκεδηε απυ ημκ ιαβκήηδ MPC, πνμζηέεδηακ 16 ιl Tris HCl (10mM, ph 7.5), ακαδεφηδηε ηαζ λακαημπμεεηήεδηε ζημκ ιαβκήηδ MPC. Αοηή ηδκ θμνά δ οπενηείιεκδ θάζδ πμο πενζέπεζ ηαζ ημ δζπθήξ αθοζίδαξ cdna, ιεηαθένεδηε ζε ηαζκμφνβζμ θζαθίδζμ Δπηδηφξζσζε ησλ άθξσλ ηνπ ζξαχζκαηνο (Fragment End Repair) Η επζδζυνεςζδ ηςκ άηνςκ ημο εναφζιαημξ πναβιαημπμζήεδηε ιε ημ Rapid Library Prep Kit (Roche), ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή. ηα 16 ιl cdna δζπθήξ αθοζίδαξ πνμζηέεδηακ 2.5 ιl νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ (RL 10X Buffer), 2.5 ιl RL ΑΣΡ, 1 ιl RL dntp, 1 ιl RL T4 Polymerase, 1 ιl RL PNK ηαζ 1 ιl Taq Polymerase. Σμ ιείβια ακαδεφηδηε βζα 5 s, θοβμηεκηνήεδηε βζα 5 s ηαζ 148

152 επςάζηδηε ζε εενιμακαηοηθςηέξ DNA Engine Dyad Thermal Cycler (BioRad Laboratories) ζημοξ 25 0 C βζα 20 min ηαζ ηαηυπζκ ζημοξ 75 0 C βζα 20 min χλδεζε πξνζαξκνζηψλ (Adaptors Ligation) Μυθζξ ημ πνυβναιια ζημ εενιμακαηοηθςηή ηεθείςζε, πνμζηέεδηε ζημ δείβια 1 ιl πνμζανιμζηχκ RL (RL adaptors - Roche) ηαζ 1 ιl θζβάζδ RL (RL ligase - Roche). Σμ ιείβια ακαδεφηδηε βζα 5 s ηαζ επςάζηδηε ζημοξ 25 0 C βζα 10 min. ημ ηέθμξ ηδξ δζαδζηαζίαξ ζηα cdna δζπθήξ αθοζίδαξ είπακ πνμζδεεεί μζ πνμζανιμζηέξ Α ηαζ Β (πήια 3.2) ρήκα 3.2. Πζεακμί ζοκδοαζιμί πνυζδεζδξ πνμζανιμζηχκ (adaptors) A ηαζ Β ζηα cdna δζπθήξ αθοζίδαξ Απνκάθξπλζε κηθξψλ ζξαπζκάησλ Μεηά ηδκ επχαζδ πνμζηέεδηακ ζημκ δείβια ζθαζνίδζα AMPure πμο είπακ οπμζηεί δζαπςνζζιυ ημο ιεβέεμοξ ηςκ εναοζιάηςκ ιε εζδζηυ δζάθοια (Sizing Solution Roche). Αθμφ ακαδεφηδηε, επςάζηδηε ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 5 min ηαζ πνμζηέεδηακ 100 ιl νοειζζηζηυ δζάθοια ΣΔ ηαζ 500 ιl Sizing Solution (Roche). Έπεζηα ημ ιείβια ακαδεφηδηε, επςάζηδηε ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα 5 min, ημ θζαθίδζμ ημπμεεηήεδηε ζημ ιαβκήηδ MPC ηαζ ιυθζξ ηα ζθαζνίδζα ιαγεφηδηακ ζηα ημζπχιαηα ημο θζαθζδίμο, δ οπενηείιεκδ θάζδ απμιαηνφκεδηε. ηδ ζοκέπεζα, ηα 149

153 ζθαζνίδζα ηαεανίζηδηακ δομ θμνέξ ιε 1 ml αζεακυθδξ (70%) ηαζ ημ θζαθίδζμ απμιαηνφκεδηε απυ ημκ ιαβκήηδ MPC ηαζ πνμζηέεδηακ 53 ιl νοειζζηζηυ δζάθοια ΣΔ. Καηυπζκ, ημ θζαθίδζμ λακαημπμεεηήεδηε ζημ ιαβκήηδ MPC ηαζ 50 ιl απυ ηδκ οπενηείιεκδ θάζδ πμο πενζείπε ηδκ αζαθζμεήηδ ιεηαθένεδηε ζε ηαζκμφνβζμ θζαθίδζμ Πνζνηηθή θαη πνηνηηθή αλάιπζε ηεο βηβιηνζήθεο Η πμζμηζημπμίδζδ ηδξ αζαθζμεήηδξ έβζκε ιε ημ Quantiflur ST Fluorometer (SB Biotechnology Suppliers S.A) ηαζ πνδζζιμπμζήεδηακ 1e 7 ιυνζα απυ ηδκ ηάεε αζαθζμεήηδ βζα ηδκ αθθδθμφπζζδ (Πίκαηαξ 3.1). Πίλαθαο 3.1. Πμζμηζημπμίδζδ ηςκ αζαθζμεδηχκ ιε Quantiflur ST Fluorometer (SB Biotechnology Suppliers S.A) Βζαθζμεήηδ Φεμνζζιυξ Μυνζα/ιl Ρίγα 120mM e 8 Ρίγα 0mM e 8 Φφθθα 120mM e 8 Φφθθα 0mM e 8 Η πμζμηζηή ακάθοζδ ηςκ αζαθζμεδηχκ πναβιαημπμζήεδηε ιε ημ αζμακαθοηή Agilent 2100 Bioanalyzer. Σμ μθζηυ ηοηηανζηυ RNA απυ ηδ ηάεε αζαθζμεήηδ έηνελε λεπςνζζηά απυ ημ ηαηαηειαπζζιέκμ cdna αθθά δ ηεθζηή είημκα πνμήθεε απυ ζφιπηολδ ηςκ δφμ εζηυκςκ (πήιαηα ). 150

154 ρήκα 3.3. φιπηολδ ηςκ εζηυκςκ πμο πνμέηορακ ιε ημ αζμακαθοηή Agilent 2100 ιε ημ μθζηυ RNA ηαζ ημ ηειαπζζιέκμ cdna ηδκ αζαθζμεήηδξ ηδξ νίγαξ πμο εηηέεδηε ζε 120mM NaCl. ρήκα 3.4. φιπηολδ ηςκ εζηυκςκ πμο πνμέηορακ ιε ημ αζμακαθοηή Agilent 2100 ιε ημ μθζηυ RNA ηαζ ημ ηειαπζζιέκμ cdna ηδκ αζαθζμεήηδξ ηδξ νίγαξ πμο εηηέεδηε ζε 0mM NaCl. 151

155 ρήκα 3.5. φιπηολδ ηςκ εζηυκςκ πμο πνμέηορακ ιε ημ αζμακαθοηή Agilent 2100 ιε ημ μθζηυ RNA ηαζ ημ ηειαπζζιέκμ cdna ηδκ αζαθζμεήηδξ ηςκ θφθθςκ πμο εηηέεδηακ ζε 120mM NaCl. ρήκα 3.6. φιπηολδ ηςκ εζηυκςκ πμο πνμέηορακ ιε ημ αζμακαθοηή Agilent 2100 ιε ημ μθζηυ RNA ηαζ ημ ηειαπζζιέκμ cdna ηδκ αζαθζμεήηδξ ηςκ θφθθςκ πμο εηηέεδηακ ζε 0mM NaCl. 152

156 Δλίζρπζε ηεο βηβιηνζήθεο κε empcr Έπεζηα απυ ηδκ πνμζεήηδ πνμζανιμζηχκ (adaptors) ηαζ ηδκ απμιάηνοκζδ ηςκ ιζηνχκ εναοζιάηςκ πνδζζιμπμζήεδηε ημ GS FLX Titanium SV empcr kit (Lib-L) (Roche), ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή βζα ηδκ εκίζποζδ ηςκ εναοζιάηςκ ηδξ αζαθζμεήηδξ ηαζ ηδκ πνμεημζιαζία ημοξ βζα αθθδθμφπδζδ ιε ημ 454 GS FLX Titanium (Roche). Με ηδκ empcr πμθθαπθαζζάγμκηαζ ιυκμ ηα cdnas ιμκήξ αθοζίδαξ ζηα μπμία έπεζ πνμζδεεεί μ πνμζανιμζηήξ Α ζημ 3 -αηνμ ηαζ μ πνμζανιμζηήξ Β ζημ 5 -άηνμ (πήια 3.7Α&Β). ηα ζθαζνίδζα Enrichment Beads-B (Roche) πνμζδέκεηαζ ημ 5 άηνμ ημο cdna ζημ μπμίμ είκαζ πνμζδεδειέκμξ μ πνμζανιμζηήξ Β εκχ βζα ηδκ empcr πνδζζιμπμζμφκηαζ εηηζκδηέξ απυ ηδκ αθθδθμοπία ημο πνμζανιμζηή Α πμο είκαζ πνμζδεδειέκμξ ζημ 3 -άηνμ ημο cdna (πήια 3.8). ρήκα 3.7. Υνδζζιμπμίδζδ ηςκ πνμζανιμζηχκ βζα αθθδθμφπζζδ ιυκμ ηδξ ιίαξ εη ηςκ δφμ αθοζίδςκ ηςκ cdnas δζπθήξ αθοζίδαξ. Α) Δπζθμβή ηςκ cdnas ιμκήξ αθοζίδαξ πμο πενζέπμοκ ημκ πνμζανιμζηή Β. Β) Δπζθμβή ηςκ cdnas ιμκήξ αθοζίδαξ πμο πενζέπμοκ ημκ πνμζανιμζηή Α ζημ 3 -άηνμ. 153

157 ρήκα 3.8. Πνυζδεζδ ημο πνμζανιμζηή Β ημο 5 -άηνμο ηςκ cdnas ιμκήξ αθοζίδαξ ζημ ζθαζνίδζμ ηαζ πνδζζιμπμίδζδ ημο εηηζκδηή απυ ηδκ αθθδθμοπία ημο πνμζανιμζηή Β βζα ηδκ empcr Αιιεινχρεζε κε ηνλ 454-GS FLX Titanium Η αθθδθμφπδζδ ηςκ αζαθζμεδηχκ έβζκε ιε ηδκ πθαηθυνια GS FLX Titanium (Roche) πμο ααζίγεηαζ ζηδκ ηεπκμθμβία αθθδθμφπζζδξ «ηαηά ηδκ ζφκεεζδ» (454- Pyrosequencing) πμο ακήηεζ ζημ Ικζηζημφημ Θαθάζζζαξ Βζμθμβίαξ ηαζ Γεκεηζηήξ (Ι.ΘΑ.ΒΙ.Γ) ημο Δθθδκζημφ Κέκηνμο Θαθαζζίςκ Δνεοκχκ ζημ Ηνάηθεζμ Κνήηδξ. Γζα ηδκ αθθδθμφπδζδ πνδζζιμπμζήεδηε ημ GS FLX Titanium Sequencing Kit XLR70 (Roche). Η ηαεειία απυ ηζξ ηέζζενζξ αζαθζμεήηεξ πςνίζηδηε ζε δφμ ιένδ ηαζ έηζζ πνδζζιμπμζήεδηακ ηα 8/16 ηδξ πθαηέηαξ GS FLX Titanium PicoTiterPlate Kit 70X75 (Roche), ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ηαηαζηεοαζηή Βηνπιεξνθνξηθή αλάιπζε Καζαξηζκφο θαη νκαδνπνίεζε ησλ κεηαγξαθεκάησλ Ο έθεβπμξ ηδξ πμζυηδηαξ ηαζ μ ηαεανζζιυξ (trimming) ηςκ αθθδθμοπζχκ απυ ηζξ αθθδθμοπίεξ ηςκ εηηζκδηχκ ηαζ ηςκ πνμζανιμζηχκ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ αθθδθμφπζζδ ηςκ cdnas έβζκε ιε ημκ αθβυνζειμ cutadapt v0.9. ηδκ ζοκέπεζα έβζκε δ μιαδμπμίδζδ (clustering) ηςκ αθθδθμοπζχκ ιε ημ πνυβναιια CD-HIT-EST. Οζ πανάιεηνμζ πμο μνίζηδηακ ήηακ 95% ςξ εθάπζζημ πμζμζηυ μιμζυηδηαξ ηαζ 100 αάζεζξ ςξ ημ εθάπζζημ ιήημξ ηςκ αθθδθμοπζχκ. Με ημκ αθβυνζειμ έβζκε έθεβπμξ επίζδξ βζα ηδκ ακάζηνμθδ ζοιπθδνςιαηζηή ηάεε αθθδθμοπίαξ ιε ηζξ οπυθμζπεξ χζηε κα απμθεοπεεί μπμζμδήπμηε ζθάθια ηαηά ηδκ μιαδμπμίδζδ. 154

158 Δπηζεκείσζε ησλ κεηαγξαθεκάησλ Υνδζζιμπμζχκηαξ ημ δδιυζζα δζαεέζζιμ παηέημ Blast2GO V (Conesa et al., 2005), έβζκε δ επζζδιείςζδ υθςκ ηςκ ιεηαβναθδιάηςκ, νίγαξ ηαζ θφθθςκ, ιε ημκ ακηίζημζπμ υνμ GO (GO term) πμο πνμέηορε απυ ηδ ιαγζηή ακάθοζδ μιμθμβζχκ (BLAST). Ανπζηά πναβιαημπμζήεδηε blastx ιέζς ημο QBlast ζηδ αάζδ δεδμιέκςκ NCBI nr-database Οζ οπυθμζπεξ πανάιεηνμζ ημο blast πανέιεζκακ ζηζξ πνμεπζθεβιέκεξ ηζιέξ, μνίγμκηαξ ημ Δ-value ιε ακχηενμ υνζμ ημ 1e -6 ηαζ ημ θίθηνμ hsp ίζμ ιε 33. ηδ ζοκέπεζα αημθμφεδζε δ πανημβνάθδζδ (mapping) ηαζ έπεζηα δ επζζδιείςζδ (annotation) δ μπμία πναβιαημπμζήεδηε πνδζζιμπμζχκηαξ Δ-value ιε ακχηενμ υνζμ ημ 1e Καζνξηζκφο ησλ κεηαγξαθεκάησλ κε ζεκαληηθά δηαθνξεηηθή έθθξαζε Γζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο ανζειμφ ηςκ ESTs βζα ηάεε μιάδα (clusters) εθανιυζηδηε δ ζηαηζζηζηή ιέεμδμξ R test (Stekel et al., 2000). Όθεξ μζ μιάδεξ ηςκ ESTs ιε R 8 (αθδεχξ εεηζηυ πμζμζηυ ~98%) εεςνήεδηακ ςξ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ. 155

159 3. Απνηειέζκαηα 3.1. Καηαζθεπή βηβιηνζεθψλ απφ ξίδα θαη θχιια ηεο πνηθηιίαο Καιακψλ γηα αιιεινχρηζε κε ηελ πιαηθφξκα 454 GS FLX Titanium Έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl πναβιαημπμζήεδηε δεζβιαημθδρία ζζημφ, θφθθα ηαζ νίγεξ, ηεζζάνςκ θοηχκ πμζηζθίαξ Καθαιχκ απυ ηάεε ιεηαπείνζζδ (0 ηαζ 120mM NaCl). Οζ ζζημί ηςκ ηεζζάνςκ θοηχκ αθμφ θεζμηνζαήεδηακ λεπςνζζηά ζε οβνυ άγςημ, έπεζηα ακαιίπεδηακ (pooling) ιε απμηέθεζια κα πνμηφρμοκ ηα ελήξ ηέζζενα δείβιαηα απυ ηα μπμία απμιμκχεδηε μθζηυ ηοηηανζηυ RNA: 1) Ρίγεξ - 0mM NaCl (R-U), 2) Ρίγεξ - 120mM NaCl (R-T), 3) Φφθθα - 0mM NaCl (L-U), 4) Φφθθα - 120mM NaCl (L-T). Σμ μθζηυ RNA πμο απμιμκχεδηε απυ ηα παναπάκς δείβιαηα πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηςκ αζαθζμεδηχκ Rapid Library (Roche). Η ζοβηεηνζιέκδ αζαθζμεήηδ πνμζθένεηαζ βζα ιεθέηεξ ιεηαβναθδιάηςκ πμο πνδζζιμπμζμφκ ηδκ πθαηθυνια αθθδθμφπζζδξ 454 GS FLX Titanium, επεζδή μ ηειαπζζιυξ ημο RNA πναβιαημπμζείηαζ πνζκ ηδκ ζφκεεζδ ημο cdna ιε ημοξ oligodt εηηζκδηέξ (πήια 3.9). Έηζζ επζαεααζχκεηαζ δ αθθδθμφπζζδ ιυκμ εκυξ ηιήιαημξ ακά cdna, ιε απμηέθεζια κα βίκεηαζ εθζηηυξ μ πνμζδζμνζζιυξ ηδξ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηήξ έηθναζδξ ιεηαλφ ηςκ ζοκεδηχκ. Δπίζδξ έκα ζδιακηζηυ ιεζμκέηηδια ηδξ πθαηθυνιαξ 454 GS FLX Titanium είκαζ δ αδοκαιία αθθδθμφπζζδξ μιμπμθοιενχκ αημθμοεζχκ (>7-8 αάζεζξ). Αοηυ ζοιααίκεζ ελαζηίαξ ηδξ παναβςβήξ πμθφ ορδθήξ θάιρδξ ηαηά ηδ θήρδ ηςκ εζηυκςκ αθθδθμφπδζδξ ιε απμηέθεζια κα αθθμζχκμκηαζ ηα απμηεθέζιαηα υπζ ιυκμ ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ αθθδθμοπίαξ αθθά ηαζ ηςκ παναηείιεκςκ αθθδθμοπζχκ. Σμ ζοβηεηνζιέκμ πνυαθδια ιπμνεί κα βίκεζ πζμ έκημκμ υηακ βζα ηδκ ζφκεεζδ ημο cdna πνδζζιμπμζμφκηαζ εηηζκδηέξ oligodt. Έηζζ ακ ηαηά ηδκ αθθδθμφπδζδ ημ εναφζια είκαζ ιζηνυηενμ απυ 400 αάζεζξ εα βίκεζ αθθδθμφπζζδ ηδξ πμθφ-a μονάξ ηαζ εα αθθμζχζεζ ηα απμηεθέζιαηα. Γζα ηδκ απμθοβή αοημφ ημο πνμαθήιαημξ, ζπεδζάζηδηε εηηζκδηήξ oligodt, υπςξ πενζβνάθεηαζ ζηδκ πανάβναθμ ημο πανυκημξ ηεθαθαίμο, ημο μπμίμο δ αθθδθμοπία δζαηυπηεηαζ απυ ηέζζενα άθθα dntps (πήια 3.9). 156

160 ρήκα 3.9. φκεεζδ cdna ιε εηηζκδηή αθμφ έπεζ πνμδβδεεί εναφζδ ημο μθζημφ ηοηηανζημφ RNA (Sarropoulou et al., 2011). ηδκ ζοκέπεζα, μζ ηέζζενζξ αζαθζμεήηεξ αθθδθμοπίεδηακ ιε ηδκ πθαηθυνια 454 GS FLX Titanium ιε ζημπυ ηδκ ιεθέηδ ηςκ ESTs θφθθςκ ηαζ νίγαξ εθζάξ ηαεχξ ηαζ ηδκ ακάδεζλδ ηςκ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ έπεζηα απυ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ Βηνπιεξνθνξηθή Αλάιπζε Έπεζηα απυ ηδκ αθθδθμφπζζδ ιε ηδκ πθαηθυνια GS FLX Titanium πνμέηορακ μηηχ ανπεία ηφπμο «.sff» (Standard Flowgram File) ζηα μπμία πενζέπμκηακ ηα δζααάζιαηα ηαζ μζ πθδνμθμνίεξ απυ ηδκ αθθδθμφπζζδ. Γζα ηδκ επελενβαζία ηςκ ανπείςκ «.sff» ήηακ απαναίηδηδ δ ιεηαηνμπή ημοξ ζε ανπεία «.fasta» ιε ημ πνυβναιια Newbler v2.5.3 (Roche). Η δζαδζηαζία πμο αημθμοεήεδηε βζα ηδκ αζμπθδνμθμνζηή ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ πενζβνάθεηαζ ζημ πήια Ανπζηά έβζκε ηαεανζζιυξ ιε απμιάηνοκζδ ηςκ ηαηήξ πμζυηδηαξ αθθδθμοπζχκ ηαζ ηδκ αθαίνεζδ ηςκ κμοηθεμηζδίςκ ηςκ εηηζκδηχκ ηαζ ηςκ πνμζανιμζηχκ. ηδκ ζοκέπεζα μιαδμπμζήεδηακ μζ αθθδθμοπίεξ ηαζ ιεθεηήεδηακ μζ μιάδεξ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδκ νίγα ηαζ ζηα θφθθα. 157

161 ρήκα Γζάβναιια νμήξ ενβαζζχκ βζα ηδκ επελενβαζία ηςκ κμοηθεμηζδζηχκ αθθδθμοπζχκ (reads) πμο πνμέηορακ απυ ηδκ αθθδθμφπζζδ ιε ηδκ πθαηθυνια 454 GS FLX Titanium Δπεμεξγαζία ησλ λνπθιενηηδηθψλ αιιεινπρηψλ πνπ πξνέθπςαλ απφ ηελ αιιεινχρηζε κε ηελ πιαηθφξκα 454 GS FLX Titanium Έπεζηα απυ επελενβαζία ηςκ κμοηθεμηζδζηχκ αθθδθμοπζχκ πμο πνμήθεακ απυ ηδκ αθθδθμφπζζδ ηςκ μηηχ αζαθζμεδηχκ, ιε ηδκ πθαηθυνια 454 GS FLX Titanium, πνμέηορακ ηαζ ορδθήξ πμζυηδηαξ αθθδθμοπίεξ, απυ ηδκ νίγα ηαζ ηα θφθθα, ακηίζημζπα. Σμ ιέζμ ιήημξ ηοιαίκμκηακ απυ αάζεζξ, ακάθμβα ιε ηδκ αζαθζμεήηδ (Πίκαηαξ 3.2). Με ζημπυ κα εηηζιδεεί μ ανζειυξ ηςκ ESTs βζα ηάεε cdna (EST redundancy) μζ αθθδθμοπίεξ μιαδμπμζήεδηακ ιε ηδκ αμήεεζα ημο αθβυνζειμο CD-HIT-EST. Γζα ηδκ μιαδμπμίδζδ ηςκ αθθδθμοπζχκ μνίζηδηε ημ 95% ςξ εθάπζζημ πμζμζηυ μιμθμβίαξ (homology) ηαζ μζ 100 αάζεζξ ςξ ημ εθάπζζημ ιήημξ. Δπζπθέμκ εθέπεδηε δ μιμθμβία ηαζ ηδξ ακάζηνμθδξ ζοιπθδνςιαηζηήξ ηδξ ηάεε αθθδθμοπίαξ. οκεπχξ μζ μιάδεξ πενζθαιαάκμοκ ESTs πμο είκαζ πζεακυκ ακηίβναθα ημο ίδζμο cdna. Έηζζ, πνμέηορακ 1624 μιάδεξ ζηδ νίγα ηαζ 2642 ζηα θφθθα. Σα ESTs ιε ιμκαδζαία εηπνμζχπδζδ (singletons) πμο δεκ ηδνμφζακ ηα ηνζηήνζα επζηάθορδξ ιε ηαιία απυ ηζξ οπυθμζπεξ είκαζ ηαζ ζηδ νίγα ηαζ ζηα θφθθα, ακηίζημζπα (Πίκαηαξ 158

162 3.2). Η ιεβαθφηενδ μιάδα ζηδ νίγα πενζθαιαάκεζ ESTs εκχ ζηα θφθθα Σμ ζφκμθμ ηςκ μιάδςκ ηαζ ηςκ singletons ακαθένμκηαζ ςξ ιμκαδζηά cdnas (unique transcripts) ηαζ είκαζ ζοκμθζηά Πίλαθαο 3.2. Σα απμηεθέζιαηα ηδξ αθθδθμφπζζδξ ιε ηδκ πθαηθυνια 454 GS FLX Titanium πνζκ (Raw data) ηαζ ιεηά ηδκ επελενβαζία (HQ Trimmed) ιε ημκ αθβυνζειμ cutadapt v0.9 ηαεχξ ηαζ δ μιαδμπμίδζδ ηςκ αθθδθμοπζχκ ιε ημκ αθβυνζειμ CD- HIT-EST. Πξνέιεπζε Βηβιηνζήθεο Άζξνηζκα Αιιεινπρηψλ (Raw data) Τςειήο πνηφηεηαο αιιεινπρίεο (HQ Trimmed) Αξηζκφο Ννπθιενηηδηθψλ βάζεσλ (bp) Μέζν Μήθνο (bp) Οκάδεο (Clusters) ESTs κε κνλαδηαία εθπξνζψπεζε (singletons) Ρίγα 0mM NaCl Ρίγα 120mM NaCl Φφθθα 0mM NaCl Φφθθα 120mM NaCl χλνιν , Δπηζεκείσζε ησλ απνηειεζκάησλ ηεο αιιεινχρηζεο Με ζημπυ ηδκ εφνεζδ cdnas (unigenes) ηδξ εθζάξ πμο ηςδζημπμζμφκ πνςηεΐκεξ ιε βκςζηή θεζημονβία πναβιαημπμζήεδηε επζζδιείςζδ (annotation) ααζζγυιεκδ ζηδ ιαγζηή ακαγήηδζδ μιμθμβζχκ BlastX ηςκ ηαζ ιμκαδζηχκ cdnas ζηδ νίγα ηαζ ζηα θφθθα, ακηίζημζπα. Η επζζδιείςζδ έβζκε ιε ημ θμβζζιζηυ Blast2GO (Conesa et al., 2005) πνδζζιμπμζχκηαξ ςξ πανάιεηνμ E-value ιζηνυηενδ ημο 1e -6. πεδυκ βζα ημ 50% ηςκ cdnas δεκ εκημπίζηδηε μιμθμβία, εκχ βζα θζβυηενα απυ cdnas (32%) ανέεδηε επζζδιείςζδ GO (πήια 3.11). 159

163 ρήκα Η ηαηακμιή ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηδξ ακάθοζδξ BlastX ηςκ ηαζ ιμκαδζηχκ cdnas ζηδ νίγα ηαζ ζηα θφθθα, ακηίζημζπα. Σμ ιζηνυ πμζμζηυ μιυθμβςκ αθθδθμοπζχκ ιε επζζδιείςζδ μθείθεηαζ ηονίςξ ζημ ιζηνυ υβημ πθδνμθμνίαξ πμο οπάνπεζ βζα ημ βμκζδίςια ηδξ εθζάξ. Οζ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ζοιιεηέπμοκ ηα cdnas ιε βκςζηή μιμθμβία ηαζ επζζδιείςζδ GO είκαζ πανυιμζεξ ζηδ νίγα ηαζ ζηα θφθθα ηαζ ζπεηίγμκηαζ ηαηά ημ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ιε ιεηααμθζηέξ ηαζ ηοηηανζηέξ δζαδζηαζίεξ (metabolic and cellular process), ιε ακηίδναζδ ζε ενεείζιαηα (response to stimulus) ηαεχξ ηαζ ιε δζάθμνεξ αζμθμβζηέξ νοειίζεζξ (biological regulation) (πήια 3.12 ηαζ 3.13). Άθθεξ ζδιακηζηέξ ηαηδβμνίεξ αζμθμβζηχκ δζαδζηαζζχκ είκαζ δ μνβάκςζδ ηοηηανζημφ ημζπχιαημξ (cell wall organization), μνβάκςζδ ηοηηανζηχκ ζοζηαηζηχκ (cellular component organization), δζαδζηαζίεξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ αφλδζδ ηαζ ακάπηολδ (developmental processes) ηαζ αζμβέκεζδ ηςκ ηοηηανζηχκ ζοζηαηζηχκ (cellular component biogenesis) (πήια 3.12 ηαζ 3.13). Οζ δζαδζηαζίεξ πμο ειθακίγμκηαζ ζηδ νίγα ηαζ υπζ ζηα θφθθα ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ αζμθμβζηή πνμζηυθθδζδ (biological adhesion) ηαζ ημκ ηοηηανζηυ εάκαημ (cell killing) (πήια 3.12), εκχ δ δζαδζηαζία αλζμπμίδζδξ ημο άκεναηα (carbon utilization) ειθακίγεηαζ ιυκμ ζηα θφθθα (πήια 3.13). 160

164 ρήκα Οζ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ηα ιμκαδζηά cdnas νίγαξ, ιε βκςζηή επζζδιείςζδ. 161

165 ρήκα Οζ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ηα ιμκαδζηά cdnas θφθθςκ, ιε βκςζηή επζζδιείςζδ. 162

166 Η ιμνζαηή θεζημονβία ηςκ ιμκαδζηχκ cdnas, ζε θφθθα ηαζ νίγα, ζπεηίγεηαζ ηονίςξ ιε πνυζδεζδ (binding) ηαζ ηαηαθοηζηή δναζηδνζυηδηα (catalytic activity) (πήια 3.14 ηαζ 3.15). Η ηνίηδ ιεβαθφηενδ ηαηδβμνία αθμνά δναζηδνζυηδηεξ ιεηαθμνέςκ (transporter activity) εκχ μζ οπυθμζπεξ ηαηδβμνίεξ αθμνμφκ δναζηδνζυηδηεξ εκγοιζηχκ (enzyme regulator activity) ηαζ ιεηαβναθζηχκ (transcription regulator activity) νοειζζηχκ, ακηζμλεζδςηζηχκ (antioxidant activity), ιεηαθμνέςκ δθεηηνμκίςκ (electron carrier activity) ηαζ δμιζηχκ ιμνίςκ (structural molecule activity) (πήια 3.14 ηαζ 3.15). οβηνίκμκηαξ ηζξ ιμνζαηέξ θεζημονβίεξ ζημ θφθθμ ηαζ ζηδκ νίγα, δ ηαηδβμνία πμο αθμνά δναζηδνζυηδηα ιεηαθθμζαπενυκδξ (metallochaperone activity) ειθακίγεηαζ ιυκμ ζηδ νίγα εκχ υθεξ μζ άθθεξ ηαηδβμνίεξ οθίζηακηαζ ηαζ ζημοξ δομ ζζημφξ (πήια 3.14). Η φπανλδ ιεβάθμο ανζειμφ ESTs ιε ιμνζαηή θεζημονβία ιεηαθμνέςκ οπμδδθχκεζ επαβςβή ηδξ έηθναζδξ ηςκ ακηίζημζπςκ βμκζδίςκ ζε ζοκεήηεξ αθαηυηδηαξ ηαζ ηαηα ζοκέπεζα νφειζζδ ζημ επίπεδμ ηδξ ιεηαβναθήξ. Δπζπνυζεεηα, μ ιεβάθμξ ανζειυξ ESTs ιε ιμνζαηή θεζημονβία ζηδ ιεηαβναθζηή νφειζζδ οπμδδθχκεζ ζδιακηζηή ζοιιεημπή ηδξ ιεηαβναθζηήξ δναζηδνζυηδηαξ ζηδκ απυηνζζδ ζε ζοκεήηεξ αθαηυηδηαξ. Σα ηοηηανζηά δζαιενίζιαηα ημο θφθθμο ηαζ ηδξ νίγαξ ζηα μπμία εκημπίγεηαζ δ θεζημονβία αοηχκ ηςκ ιμκαδζηχκ cdnas είκαζ ηα μνβακίδζα (organelle) ηαζ ημ ηφηηανμ (cell) ηονίςξ, ημ ιαηνμιμνζαηυ ζφιπθμημ (macromolecular complex), μ ελςηοηηάνζμξ πχνμξ (extracellular region), μ ζοιπθάζηδξ (symplast) ηαζ ημ εζςηενζηυ ημο ιειανακζημφ ηοζηζδίμο (membrane-enclosed lumen) (πήια 3.16 ηαζ 3.17). Απυ ηδκ ζφβηνζζδ ηςκ δομ ζζηχκ υθεξ μζ ηαηδβμνίεξ ήηακ ημζκέξ εηηυξ απυ δφμ cdnas ζηδ νίγα πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ημ ζμζςιάηζμ, πνμθακχξ θυβς ηδξ φπανλδξ ηάπμζμο ζμφ, ηα μπμία αθαζνέεδηακ ζηα πεναζηένς ζηάδζα ακάθοζδξ (πήια 3.16). 163

167 ρήκα Οζ ιμνζαηέξ θεζημονβίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ηα ιμκαδζηά cdnas νίγαξ, ιε βκςζηή επζζδιείςζδ. 164

168 ρήκα Οζ ιμνζαηέξ θεζημονβίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ηα ιμκαδζηά cdnas θφθθςκ, ιε βκςζηή επζζδιείςζδ. 165

169 ρήκα Σα ηοηηανζηά δζαιενίζιαηα ζηα μπμία εκημπίγμκηαζ ηα ιμκαδζηά cdnas, ιε βκςζηή επζζδιείςζδ, ζηδ νίγα. 166

170 ρήκα Σα ηοηηανζηά δζαιενίζιαηα ζηα μπμίεξ εκημπίγμκηαζ ηα ιμκαδζηά cdnas, ιε βκςζηή επζζδιείςζδ, ζηα θφθθα. 167

171 ηδκ ζοκέπεζα αημθμφεδζε θεπημιενήξ ακάθοζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ απυ ηδκ ακαγήηδζδ μιμθμβζχκ BlastX ηςκ ιμκαδζηχκ cdnas, ιε ζημπυ ημκ εκημπζζιυ βμκζδίςκ πμο έπμοκ ακαθενεεί ζηδκ αζαθζμβναθία υηζ ζπεηίγμκηαζ ιε ακημπή ζηδκ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ. Ανπζηά εκημπίζηδηακ βμκίδζα πμο ηςδζημπμζμφκ έκγοια ηα μπμία παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ ζφκεεζδ ςζιςπνμζηαηεοηζηχκ ιμνίςκ υπςξ δ ζοκεεηάζδ 1-θςζθμνζηήξ ιομ-ζκμζζηυθδξ (myo-inositol 1-phosphate synthase) (Kreps et al., 2002), ζοκεεηάζδ 6- θςζθμνζηήξ ηνεπαθυγδξ (trehalose-6-phosphate synthase) (Garg et al., 2002), αθοδνμβμκάζδ ηδξ πνμθίκδξ (proline dehydrogenase) (Atienza et al., 2004) ηαζ αθοδνμβμκάζδ ηδξ αθδεΰδδξ αεηαΐκδξ (betaine aldehyde dehydrogenase) (Ueda et al., 2004) (Πίκαηαξ 3.3). Δπζπθέμκ ανέεδηακ αθθδθμοπίεξ πμο ηςδζημπμζμφκ πνςηεΐκεξ υπςξ δ ακαβςβάζδ ηδξ βθμοηαεεζυκδξ (glutathione reductase) ηαζ οπενμλεζδζηή δζζιμοηάζδ (superoxide dismutase) (Kreps et al., 2002) πμο ειπθέημκηαζ ζηδκ μλεζδςηζηή ηαηαπυκδζδ ηαζ ζπεηίγμκηαζ άιεζα ιε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ (Πίκαηαξ 3.3). ηα θφθθα, επίζδξ, εκημπίζηδηακ cdnas πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ θςημζφκεεζδ ηαζ δ έηθναζδ ημοξ επδνεάγεηαζ άιεζα απυ ηδκ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl, υπςξ μζ πνςηεΐκεξ πμο πνμζδέκμκηαζ ζηδ πθςνμθφθθδ (chlorophyll a & b-binding proteins) (Ozturk et al., 2002; Atienza et al., 2004; Gu et al., 2004) (Πίκαηαξ 3.3). ηδ νίγα, ηα βμκίδζα πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ακημπή ζηδκ αθαηυηδηα ειπθέημκηαζ ηονίςξ ζημκ έθεβπμ ηδξ πνυζθδρδξ ζυκηςκ ηαζ ηδκ ιεηαθμνά ημοξ ζημοξ αθαζημφξ ηαζ ηα θφθθα ηαεχξ ηαζ ηδκ νφειζζδ ηδξ ζμκηζηήξ μιμζυζηαζδξ ηαζ ηδξ οδαηζηήξ ηαηάζηαζδξ ηδξ νίγαξ. Έηζζ εκημπίζηδηακ υθα ηα cdnas πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ιεηαθμνείξ ηαζ ακηζιεηαθμνείξ ζυκηςκ πμο εθέβπμοκ ηδκ πνυζθδρδ ηαζ ιεηαθμνά Na + ηαζ Cl - απυ ημ ελςηενζηυ δζάθοια ηαζ ηδκ δζαιενζζιαημπμίδζδ ημοξ ζηα ποιμηυπζα. Σα cdna αοηά είκαζ μιυθμβα ιε βμκίδζα πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ιεηαθμνείξ υπςξ salt overly sensitive 1 (SOS1), Na + -H + antiporter, Ca 2+ antiporter cation exchanger, copper-transporting ATPase ran1-like ηαζ cation-transporting ATPase (Πίκαηαξ 3.4). Δηηυξ απυ ημοξ ιεηαθμνείξ ζυκηςκ ανέεδηακ cdnas πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ιεηαθμνείξ ςζιςθοηχκ υπςξ ζκμζζηυθδξ (inositol transporter 1), ζμναζηυθδξ (sorbitol transporter) ηαζ πμθουθδξ (polyol transporter 5-like) (Πίκαηαξ 3.4). Δπίζδξ ζδιακηζηυ νυθμ παίγμοκ μζ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ πμο νοειίγμοκ ιμκμπάηζα ζδιαημδυηδζδξ (signaling pathways) ζηα μπμία ειπθέημκηαζ βμκίδζα πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ααζμηζηέξ ηαηαπμκήζεζξ ηαζ ζοβηεηνζιέκα ιε ηαηαπυκδζδ ιε NaCl. 168

172 ηα ιμκαδζηά cdnas εκημπίζηδηακ 71 ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ (Πίκαηαξ 3.5), ανηεημί εη ηςκ μπμίςκ ζπεηίγμκηαζ άιεζα ιε ακημπή ζε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ ηαζ έπμοκ ιεθεηδεεί απυ πνμδβμφιεκεξ ενβαζίεξ ηαεχξ ηαζ ζημ ηεθάθαζμ 2 ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ. Δκδεζηηζηά ακαθένμκηαζ μζ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ bzip114, bzip16, CCR4-not, ERF3, ERF4, ERF5, GRAS, Heat-Shock1, HMG-b1, MYB, MYC, scarecrow1 ηαζ JERF1 (Πίκαηαξ 3.5). Υνδζζιμπμζχκηαξ ςξ ηνζηήνζμ ημκ υνμ GO (GO: response to salt stress) πμο πνμέηορε απυ ηδκ επζζδιείςζδ, ακαγδηήεδηακ cdnas πμο κα ζπεηίγμκηαζ ιε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ. οκμθζηά εκημπίζηδηακ 72 δζαθμνεηζηά cdnas, ιεηαλφ ηςκ μπμίςκ βμκίδζα πμο ηςδζημπμζμφκ έκγοια υπςξ alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, S-adenosyl methionine synthetase, aldo keto reductase, cinnamoylreductase, malate oxidoreductase, isocitrate dehydrogenase calcium-dependent protein kinase ηαζ monodehydroascorbate reductase ηαεχξ ηαζ βμκίδζα πμο ηςδζημπμίμοκ πνςηεΐκεξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ακημπή ζηδκ αθαηυηδηα υπςξ cobra protein, kinase family protein, heat shock protein ηαζ Αbscisic Αcid-insensitive 5-like protein (Munns 2005) (Πίκαηαξ 3.6). 169

173 Πίλαθαο 3.3. cdnas πμο εκημπίζηδηακ ζηδκ νίγα ηαζ ζηα θφθθα εθζάξ ηαζ είκαζ μιυθμβα ιε βμκίδζα πμο παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ ακημπή ημο θοημφ ζηδκ ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ ζφιθςκα ιε ηδκ αζαθζμβναθία (Δ-value 1e -6 ). ID Αιιεινπρίαο Διηάο 09FM5BP 12HCONU 12HC5WA 12HDTPT 11GW49N Οκνινγία BlastX Φπηφ Δπηζεκείσζε GO Βηβιηνγξαθία betaine aldehyde dehydrogenase chlorophyll a b-binding glutathione reductase myo-inositol-1-phosphate synthase proline dehydrogenase Populus trichocarpa Sorghum bicolor Populus trichocarpa Arabidopsis thaliana Raphanus sativus 10F3L4F Salt Overly Sensitive 1 Vitis vinifera 13HZDE5 09FIDP5 superoxide dismutase trehalose-6-phosphate synthase Solanum lycopersicum Nicotiana tabacum F:3-chloroallyl aldehyde dehydrogenase activity; P:response to water deprivation; F:aldehyde dehydrogenase (NAD) activity; C:peroxisome; P:oxidation reduction; P:response to abscisic acid stimulus; C:cytosol; F:betaine-aldehyde dehydrogenase activity; F:nucleotide binding C:chloroplast stromal thylakoid; C:plastoglobule; P:photosynthesis, light harvesting; P:response to blue light; F:chlorophyll binding; P:nonphotochemical quenching; C:PSII associated light-harvesting complex II; P:response to far red light; P:response to red light; C:photosystem II antenna complex P:response to oxidative stress; P:gamete generation; C:cytosol; C:peroxisome; P:response to ionizing radiation; P:meiotic DNA double-strand break processing; P:cell redox homeostasis; P:oxidation reduction; P:glutathione metabolic process; F:glutathione-disulfide reductase activity; F:phosphogluconate dehydrogenase (decarboxylating) activity; F:3-hydroxybutyrate dehydrogenase activity; F:FAD binding; F:NADP or NADPH binding C:cytoplasm; F:binding; P:phospholipid biosynthetic process; F:inositol-3- phosphate synthase activity; P:inositol biosynthetic process P:glutamate biosynthetic process; P:response to water deprivation; F:1-pyrroline- 5-carboxylate dehydrogenase activity; P:proline catabolic process; P:response to osmotic stress; P:oxidation reduction; F:proline dehydrogenase activity; C:mitochondrion C:integral to membrane; P:metabolic process; P:sodium ion transport; F:catalytic activity; P:transmembrane transport; F:solute:hydrogen antiporter activity C:chloroplast envelope; P:circadian rhythm; P:response to copper ion; F:copper ion binding; P:response to cadmium ion; C:plasma membrane; P:removal of superoxide radicals; F:superoxide dismutase activity; C:chloroplast stroma; C:thylakoid; C:cytosol; C:mitochondrion F:alpha,alpha-trehalose-phosphate synthase (UDP-forming) activity; C:cytosol; F:trehalose-phosphatase activity; P:trehalose biosynthetic process Ueda et al., 2004 Ozturk et al., 2002 Atienza et al., 2004 Gu et al., 2004 Kreps et al., 2002 Kreps et al., 2002 Atienza, 2004 Zhu, 2003 Kreps et al., 2002 Garg et al.,

174 Πίλαθαο 3.4. cdnas πμο εκημπίζηδηακ ζηδκ νίγα ηαζ ζηα θφθθα εθζάξ ηαζ είκαζ μιυθμβα ιε βμκίδζα πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ιεηαθμνείξ (transporter) ηαζ ακηζιεηαθμνείξ (antiporter) (Δ-value 1e -6 ). ID Αιιεινπρίαο Οκνινγία BlastX Φπηφ Δπηζεκείσζε GO 16JYLG1 aquaporin pip2 Olea europaea P:transmembrane transport; C:integral to membrane; F:transporter activity 10GD2G7 Ca 2+ antiporter cation exchanger Malus x domestica P:sodium ion transport; P:cellular manganese ion homeostasis; P:cellular zinc ion homeostasis; P:response to salt stress; P:phosphate ion homeostasis; P:cellular calcium ion homeostasis; C:plant-type vacuole membrane; F:calcium ion transmembrane transporter activity; P:phosphorus metabolic process; F:calcium:hydrogen antiporter activity; P:cold acclimation; F:protein binding; P:calcium ion transport; P:lithium ion transport; P:response to nematode; P:response to calcium ion P:cellular response to phosphate starvation; P:stem cell fate determination; C:integral to 13H59NM cation-transporting atpase membrane; P:drug transmembrane transport; P:pollen germination; P:pollen maturation; Arabidopsis F:metal ion binding; P:ATP biosynthetic process; P:cation transport; F:calcium-transporting thaliana ATPase activity; C:endoplasmic reticulum; P:ATP catabolic process; C:plasma membrane; P:meristem maintenance; F:ATP binding; P:cellular metal ion homeostasis 13HZISO copper-transporting atpase ran1- like Glycine max 10GDOWB EIN2 -like nramp transporter Populus trichocarpa 11GZ1U1 inositol transporter 1 Mesembryanthemum crystallinum 10GBOGJ vacuolar Na + -H + antiporter Populus tomentosa P:copper ion export; C:apoplast; F:protein binding; P:regulation of stomatal movement; P:ethylene mediated signaling pathway; P:response to salt stress; F:copper-exporting ATPase activity; F:GTP binding; C:integral to membrane; C:cell wall; C:Golgi apparatus; C:cytosol; P:ATP biosynthetic process; P:response to cadmium ion; F:GTPase activity; C:plasma membrane; F:copper ion binding; P:protein import into nucleus; F:ATP binding P:negative regulation of defense response; F:protein binding; P:regulation of stomatal movement; C:membrane; P:response to salt stress; P:response to jasmonic acid stimulus; P:defense response to fungus; P:defense response to bacterium; P:establishment of planar polarity; P:sugar mediated signaling pathway; P:root hair cell differentiation; P:leaf senescence; P:callose deposition in cell wall during defense response; P:auxin polar transport; F:transporter activity; P:cell death; P:response to heat; P:response to molecule of bacterial origin; P:jasmonic acid and ethylene-dependent systemic resistance, ethylene mediated signaling pathway; P:positive regulation of abscisic acid mediated signaling pathway; P:response to oxidative stress; P:cellular response to iron ion P:myo-inositol transport; C:plant-type vacuole membrane; C:cytoplasmic membranebounded vesicle; P:transmembrane transport; P:oxidation reduction; F:sugar:hydrogen symporter activity; P:carbohydrate transport; C:integral to membrane; F:myoinositol:hydrogen symporter activity; F:2-alkenal reductase activity F:sodium ion transmembrane transporter activity; P:lithium ion transport; C:endosome; F:sodium:hydrogen antiporter activity; P:transmembrane transport; P:regulation of ph; C:integral to membrane; P:sodium ion transport 171

175 13HVSNC polyol transporter 5-like Orobanche ramosa 10F55QE 09FL244 sorbitol transporter V-type H + -transporting atpase subunit i Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana F:transmembrane transporter activity; F:substrate-specific transmembrane transporter activity; C:integral to membrane; C:membrane; P:transmembrane transport; P:transport; F:transporter activity F:glucose transmembrane transporter activity; F:D-xylose transmembrane transporter activity; C:plasma membrane; F:mannitol transmembrane transporter activity; F:galactose transmembrane transporter activity; P:transmembrane transport; F:glycerol transmembrane transporter activity; F:sugar:hydrogen symporter activity; C:integral to membrane; F:myoinositol transmembrane transporter activity; F:sorbitol transmembrane transporter activity; F:D-ribose transmembrane transporter activity P:cellular response to salt stress; F:hydrogen ion transmembrane transporter activity; C:proton-transporting two-sector ATPase complex, proton-transporting domain; C:mitochondrion; P:cellular response to nutrient levels; P:ATP synthesis coupled proton transport; C:plant-type vacuole membrane; F:ATPase activity; P:ATP hydrolysis coupled proton transport; C:chloroplast; F:hydrogen-translocating pyrophosphatase activity; C:plasma membrane Πίλαθαο 3.5. cdnas πμο εκημπίζηδηακ ζηδκ νίγα ηαζ ζηα θφθθα εθζάξ ηαζ είκαζ μιυθμβα ιε βμκίδζα πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ιεηαβναθζημφξ πανάβμκηεξ (Δ-value 1e -6 ). ID Αιιεινπρίαο Οκνινγία BlastX Δπηζεκείσζε GO 09FPIGE abscisic acid-insensitive 5-like protein 5 F:sequence-specific DNA binding; F:protein dimerization activity; F:transcription factor activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 11GVRZ0 ap2 domain class transcription factor F:transcription factor activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 12HECJ3 ap2 ERF domain-containing transcription factor F:transcription factor activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 12HKDD4 auxin response factor 2 P:fruit dehiscence; P:positive regulation of flower development; P:negative regulation of cell proliferation; F:sequence-specific DNA binding; P:ovule development; P:floral organ abscission; P:response to abscisic acid stimulus; F:protein dimerization activity; F:transcription factor activity; P:leaf senescence; P:negative regulation of transcription, DNAdependent; C:chloroplast; P:auxin mediated signaling pathway; C:nucleus 10GB94K auxin response factor 9 F:protein dimerization activity; F:transcription factor activity; P:auxin mediated signaling pathway; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 13H3XEC basic leucine zipper transcription factor-like protein P:regulation of transcription, DNA-dependent; P:transcription, DNA-dependent; F:sequencespecific DNA binding; F:protein dimerization activity; C:nucleus; F:transcription factor activity; F:DNA binding; C:cytosol 16JR9NC bhlh transcription factor upa20 F:transcription regulator activity; P:regulation of transcription; C:nucleus 172

176 blh4 (bel1-like homeodomain 4) dna binding P:leaf morphogenesis; F:sequence-specific DNA binding; F:transcription factor activity; 15I69TH transcription factor C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 14ISQK3 bzip transcription factor bzip114 C:plasmodesma; C:plasma membrane 15JAUBS bzip transcription factor bzip16 F:DNA binding; C:nucleus; F:protein heterodimerization activity 10F600A c2h2l domain class transcription factor F:zinc ion binding; C:intracellular 12HLK59 c3hl domain class transcription factor F:nucleic acid binding; F:zinc ion binding 13HX5BU callus-expressing factor F:transcription factor activity; F:DNA binding; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNAdependent 16J1TSR calmodulin-binding transcription activator F:transcription regulator activity; P:regulation of transcription; C:nucleus; C:cytosol; F:calmodulin binding 11GV2T5 CCR4-NOT transcription complex subunit 3 F:transcription regulator activity; P:negative regulation of transcription, DNA-dependent; C:nucleus 09FSV2L dehydration responsive element-binding protein 1 P:transcription, DNA-dependent; F:DNA binding 10F34CW DNA repair and transcription factor xpb1 F:helicase activity; F:nucleic acid binding; F:ATP binding; F:hydrolase activity; P:nucleotideexcision repair; F:ATP-dependent DNA helicase activity; F:DNA binding; P:response to UV- B; F:ATP-dependent helicase activity; P:response to toxin; C:nucleus; C:cytoplasm; P:response to UV 16JW85I EIN3-like protein F:transcription regulator activity; C:nucleus 09FSEW0 enhancer of polycomb-like transcription factor protein F:molecular_function; P:biological_process; F:nucleic acid binding 15JDI89 Ethylene Response Factor 4 P:regulation of transcription, DNA-dependent; P:transcription; P:regulation of transcription; C:nucleus; F:transcription factor activity; F:DNA binding 10F77PP Ethylene-Responsive transcription Factor P:defense response; F:DNA binding; P:transcription, DNA-dependent; P:ethylene mediated signaling pathway 10F5FJG Ethylene-Responsive transcription Factor 3 P:defense response; P:negative regulation of ethylene mediated signaling pathway; F:protein binding; F:transcription factor activity; P:negative regulation of transcription, DNAdependent; C:nucleus 14IPTWC Ethylene-Responsive transcription Factor 5-like F:transcription factor activity; F:DNA binding; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNAdependent 11GRAKW 11GXZY7 f-box family protein g-box binding protein F:zinc ion binding; P:phloem or xylem histogenesis; F:transcription factor activity; P:positive regulation of transcription, DNA-dependent; P:procambium histogenesis; C:nucleus F:sequence-specific DNA binding; F:protein dimerization activity; F:transcription factor activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 173

177 12HFBCI GATA domain class transcription factor P:negative regulation of flower development; F:zinc ion binding; P:response to cytokinin stimulus; P:response to light stimulus; P:regulation of transcription, DNA-dependent; P:negative regulation of seed germination; C:plastid; P:circadian rhythm; F:sequence-specific DNA binding; P:glucose mediated signaling pathway; F:protein binding; F:transcription factor activity; P:gibberellic acid mediated signaling pathway 14IRAZ4 general transcription factor 3c polypeptide 3-like F:RNA binding; F:binding; P:RNA-dependent DNA replication; F:RNA-directed DNA polymerase activity 13HZF9S general transcription factor iie subunit 1-like P:transcription initiation from RNA polymerase II promoter; P:translational initiation; F:translation initiation factor activity 09FQJAZ global transcription factor group F:histone acetyltransferase activity; P:histone acetylation; C:plastid 11G0INA GRAS family transcription factor F:transcription factor activity; P:regulation of transcription, DNA-dependent 15I56UY hd domain class transcription factor F:sequence-specific DNA binding; F:transcription factor activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 09FJ3QZ hd-zip iv family transcription factor ocl4 F:sequence-specific DNA binding; F:transcription factor activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 12HHPR4 heat shock transcription factor 1 F:sequence-specific DNA binding; P:response to stress; F:transcription factor activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 14IJARD heat stress transcription factor b-2b-like P:regulation of transcription, DNA-dependent; F:sequence-specific DNA binding; F:transcription factor activity; P:response to stress; C:nucleus 10GCV66 High Mobility Group family P:DNA repair; P:regulation of transcription, DNA-dependent; P:oxidation reduction; P:DNA replication; F:2-alkenal reductase activity; P:vegetative to reproductive phase transition of meristem; C:nuclear euchromatin; F:transcription factor activity; C:FACT complex 11GXF3F High Mobility Group protein b1 P:chromatin assembly or disassembly; C:chromatin; C:nucleus; F:transcription factor activity; F:structural constituent of chromatin; F:chromatin binding 14IMAWA knox transcription factor F:transcription factor activity; F:sequence-specific DNA binding; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 12HEL7J leucine zipper transcription factor tga F:sequence-specific DNA binding; F:protein dimerization activity; F:transcription factor activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 11GVD6N MADS-box protein F:protein binding; F:transcription factor activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 16JQN7Q MYB transcription factor P:regulation of transcription, DNA-dependent; P:response to salicylic acid stimulus; F:transcription factor activity; P:gibberellin biosynthetic process; F:catalytic activity; P:cellular response to phosphate starvation; C:nucleus 15I9BZO MYB transcription factor myb56 F:DNA binding; P:regulation of transcription; C:nucleus 174

178 11G0N0N MYC transcription factor 10GCK0B Nuclear transcription Factor Y subunit a-3 09FMQQV Nuclear transcription Factor Y subunit a-7 14ISTC1 Nuclear transcription Factor Y subunit b-1 11GQ3FG 09FSS92 11G0HIO 11GWO6H pathogenesis-related homeodomain protein phd transcription factor pseudo response regulator rav1-like protein 10F4F5M scarecrow regulator 1 09FJ5NA 16JUX44 soc1-like protein suf4 (suppressor of frigida4) dna binding protein heterodimerization protein homodimerization transcription factor F:transcription regulator activity; C:nucleus; P:oxidation reduction; F:oxidoreductase activity; F:2-alkenal reductase activity; F:protein binding; P:response to wounding; P:response to desiccation; ; F:transcription factor activity; F:DNA binding; P:positive regulation of transcription, DNA-dependent; P:response to abscisic acid stimulus; P:jasmonic acid mediated signaling pathway; P:regulation of transcription factor activity; P:response to jasmonic acid stimulus; P:response to chitin; P:positive regulation of flavonoid biosynthetic process; P:regulation of transcription from RNA polymerase II promoter in response to oxidative stress C:CCAAT-binding factor complex; F:transcription factor activity; P:negative regulation of transcription, DNA-dependent C:CCAAT-binding factor complex; F:transcription factor activity; P:negative regulation of transcription, DNA-dependent P:response to water deprivation; P:regulation of transcription, DNA-dependent; F:sequencespecific DNA binding; C:CCAAT-binding factor complex; F:protein binding; F:transcription factor activity F:sequence-specific DNA binding; P:response to auxin stimulus; F:protein binding; P:positive regulation of transcription, DNA-dependent P:oxidation reduction; F:oxidoreductase activity, acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen, 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors; C:nucleus; F:DNA binding; P:regulation of transcription, DNA-dependent; P:two-component signal transduction system (phosphorelay); F:two-component response regulator activity P:photoperiodism, flowering; F:transcription factor activity; C:chloroplast; P:negative regulation of transcription, DNA-dependent; C:nucleus; P:ethylene mediated signaling pathway F:hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds; P:carbohydrate metabolic process; P:response to chitin; F:transcription factor activity; P:regulation of transcription, DNAdependent F:sequence-specific DNA binding; F:transcription factor activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent P:negative regulation of flower development; P:regulation of transcription; F:DNA binding; F:protein heterodimerization activity; F:protein homodimerization activity; C:nucleus 14IL1W0 tcp transcription factor 13-13H6FK7 tga transcription factor F:transcription factor activity; F:sequence-specific DNA binding; F:protein dimerization activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 14IKAWB transcription factor apetala2 P:transcription, DNA-dependent 10F658A transcription factor bhlh148 F:transcription factor activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 175

179 13HWZ1D transcription factor bhlh49-like P:regulation of transcription, DNA-dependent; C:nucleus 09FORGY transcription factor bim2 F:DNA binding 13H7X2E transcription factor gte8-like F:transferase activity; P:histone acetylation; F:histone acetyltransferase activity; F:transferase activity, transferring acyl groups 13H3IVA transcription factor hbp-1b F:transcription factor activity; F:sequence-specific DNA binding; F:protein dimerization activity; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNA-dependent 16JZHC8 transcription factor iib F:translation initiation factor activity; P:translational initiation; F:zinc ion binding; P:transcription initiation; P:regulation of transcription, DNA-dependent; F:transcription activator activity; F:protein binding; C:nucleus; P:positive regulation of transcription 14IMBPB transcription factor ilr3 P:regulation of transcription, DNA-dependent; C:nucleus 14INXHL transcription factor JERF1 F:transcription factor activity; F:DNA binding; C:nucleus; P:regulation of transcription, DNAdependent 09FMG3R transcription factor jumonji domain-containing protein P:oxidation reduction; F:peptide-aspartate beta-dioxygenase activity; F:transcription factor activity; P:regulation of circadian rhythm 09FHLYK transcription factor lhy P:regulation of transcription, DNA-dependent; C:nucleus; F:DNA binding 13H2HXX transcription factor pif5-like P:regulation of transcription, DNA-dependent; C:nucleus 11GTJ2F transcription initiation factor subunit taf1 F:transcription cofactor activity; P:DNA mediated transformation; P:response to light stimulus; F:DNA binding; P:histone acetylation; F:histone acetyltransferase activity; C:transcription factor TFIID complex; C:membrane 13H1I7L trihelix transcription factor gt-2-like F:DNA binding 09FQ497 type-b response regulator F:two-component response regulator activity; P:primary root development; P:regulation of transcription, DNA-dependent; P:regulation of anthocyanin metabolic process; P:regulation of stomatal movement; F:protein binding; F:transcription factor activity; P:leaf senescence; P:phosphorylation; F:kinase activity; P:regulation of chlorophyll biosynthetic process; P:shoot development; P:cytokinin mediated signaling pathway; C:nucleus; P:ethylene mediated signaling pathway 12HKWO5 WRKY transcription factor 22 F:sequence-specific DNA binding; C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle; F:transcription factor activity; P:regulation of transcription, DNA-dependent 10GE4BF WRKY transcription factor 41 F:sequence-specific DNA binding; F:transcription factor activity; P:regulation of transcription, DNA-dependent 176

180 Πίλαθαο 3.6. cdnas πμο εκημπίζηδηακ ζηδκ νίγα ηαζ ζηα θφθθα εθζάξ ηαζ είκαζ μιυθμβα ιε βμκίδζα πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ηαηαπυκδζδ αθαηυηδηαξ ζφιθςκα ιε ηδκ επζζδιείςζδ GO (Δ-value 1e -6 ). ID Αιιεινπρίαο 09FS90T 11GY4KU Οκνινγία BlastX 60s acidic ribosomal protein p0 a chain characterization and engineering of the bifunctional n- and o-glucosyltransferase involved in xenobiotic metabolism in plants 09FRU20 abscisic acid-insensitive 5-like protein 5 16JYBPL 11GRVAJ 09FMR39 10GDYRX 11GWG6W 15JCQHT achain crystal structure of the plant stress-response enzyme akr4c9 aconitate hydratase aldehyde dehydrogenase family 7 member a1 aldo keto reductase family protein aldose reductase alpha- -glucan-protein synthase Δπηζεκείσζε GO C:cytosol; F:copper ion binding; C:nucleolus; P:response to salt stress; C:plasmodesma; P:response to cold; F:structural constituent of ribosome; F:DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase activity; P:translational elongation; P:ribosome biogenesis; P:response to zinc ion; C:chloroplast; P:response to cadmium ion; C:cytosolic ribosome P:response to salt stress; F:hydroquinone glucosyltransferase activity; P:xenobiotic catabolic process; P:response to toxin P:response to water deprivation; P:response to salt stress; F:sequence-specific DNA binding; P:glucose mediated signaling pathway; F:protein dimerization activity; F:transcription factor activity; P:abscisic acid mediated signaling pathway; P:positive regulation of transcription, DNA-dependent; C:nucleus F:steroid dehydrogenase activity; P:response to water deprivation; P:response to salt stress; F:aldo-keto reductase activity; P:response to cold P:response to oxidative stress; P:glyoxylate cycle; C:cytosol; F:copper ion binding; C:cell wall; P:ethylene biosynthetic process; P:cellular response to iron ion; C:mitochondrion; P:response to salt stress; F:1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase activity; C:plasmodesma; P:cellular response to fatty acid; F:4 iron, 4 sulfur cluster binding; F:aconitate hydratase activity; P:detection of ethylene stimulus; P:isocitrate metabolic process; P:cellular response to nitric oxide; C:chloroplast; P:positive regulation of seed germination; P:response to cadmium ion; P:citrate metabolic process P:response to abscisic acid stimulus; C:cytosol; P:response to desiccation; P:response to salt stress; P:metabolic process; F:oxidoreductase activity P:response to water deprivation; P:response to cold; F:NADP binding; P:response to cadmium ion; P:oxidation reduction; F:steroid dehydrogenase activity; F:aldehyde reductase activity; C:cytosol; P:response to salt stress P:response to water deprivation; P:response to cold; F:NADP binding; F:alcohol dehydrogenase (NADP+) activity; P:oxidation reduction; F:steroid dehydrogenase activity; F:aldehyde reductase activity; C:chloroplast; P:response to salt stress C:cell junction; P:response to salt stress; C:Golgi trans cisterna; P:cellulose biosynthetic process; P:cellular cell wall organization; F:glycogenin glucosyltransferase activity; C:plant-type cell wall; F:cellulose synthase (UDP-forming) activity; P:plant-type cell wall biogenesis; P:response to cadmium ion 177

181 14IRWXN ammecr1 protein C:cytosol; P:response to salt stress 16JR3QL ankyrin repeat-containing F:protein binding; C:plasma membrane; P:response to salt stress 16JZHQJ aspartic proteinase C:vacuole; P:response to salt stress; P:proteolysis; F:aspartic-type endopeptidase activity; P:lipid metabolic process 13H32TD ATP synthase alpha subunit P:cellular response to salt stress; F:zinc ion binding; F:DNA binding; F:ATP binding; P:positive regulation of translation; F:hydrolase activity 09FKM2T ATP synthase d mitochondrial F:copper ion binding; C:mitochondrial proton-transporting ATP synthase complex; F:zinc ion binding; C:nucleolus; P:response to salt stress; C:vacuolar membrane; C:chloroplast thylakoid membrane; C:cytosolic ribosome 09FPFDL basic 7s globulin 2 precursor small C:plant-type cell wall; C:plasmodesma; F:aspartic-type endopeptidase activity; P:proteolysis; C:cytosol; P:response to salt stress 10F3E3J btb and taz domain protein 1 P:response to wounding; F:zinc ion binding; P:response to hydrogen peroxide; F:histone acetyltransferase activity; F:transcription cofactor activity; P:auxin mediated signaling pathway; P:regulation of transcription, DNA-dependent; P:response to salt stress; P:response to jasmonic acid stimulus; C:cytoplasm; P:response to salicylic acid stimulus; F:nucleic acid binding; P:positive regulation of telomerase activity; P:sugar mediated signaling pathway; P:regulation of response to stress; P:pollen development; P:response to nitrate; P:embryo sac development; P:response to cold; P:abscisic acid mediated signaling pathway; F:ribonuclease H activity; F:calmodulin binding; C:nucleus; P:histone acetylation; P:circadian rhythm 09FH12V calcium-dependent protein kinase F:calcium ion binding; P:response to salt stress; C:plasmodesma; F:ATP binding; F:protein binding; P:abscisic acid mediated signaling pathway; C:cytoplasm; F:calmodulindependent protein kinase activity; C:nucleus; F:calcium-dependent protein kinase C activity; P:protein amino acid phosphorylation 10F4ECC calreticulin P:response to oxidative stress; C:cytosol; F:calcium ion binding; C:mitochondrion; P:protein folding; P:response to salt stress; C:plasmodesma; C:vacuolar membrane; C:endoplasmic reticulum lumen; P:calcium ion homeostasis; F:unfolded protein binding; C:chloroplast; P:response to cadmium ion; F:sugar binding 14IMQBM cbs domain protein P:metabolic process; P:response to salt stress; F:catalytic activity; C:mitochondrion; F:cobalt ion binding 12HBH1I chaperone protein htpg family protein C:cytosol; F:RNA binding; P:RNA-dependent DNA replication; P:response to water deprivation; C:mitochondrion; P:protein folding; P:embryonic development ending in seed dormancy; P:response to salt stress; P:response to chlorate; F:RNA-directed DNA polymerase activity; C:chloroplast envelope; P:response to heat; C:vacuolar membrane; F:ATP binding; C:chloroplast stroma; F:unfolded protein binding; P:de-etiolation 10GB14O chromatin remodeling complex subunit P:response to water deprivation; P:response to salt stress; F:ATP binding; F:helicase activity; F:DNA binding; F:transferase activity; P:response to heat 178

182 13H2TKE cinnamoyl- reductase 11GUBOT copper chaperone 10GBM9J cyanate hydratase 15JEOD3 cysteine proteinase rd19a 10F4W0U endoplasmin-like protein 10F7T97 enolase (2-phospho-d-glycerate hydroylase) 12HFXHU eukaryotic translation initiation factor 3 F:histone methyltransferase activity (H3-K36 specific); P:carotenoid metabolic process; P:anther development; F:dihydrokaempferol 4-reductase activity; P:regulation of plant-type hypersensitive response; P:negative regulation of flower development; P:response to salt stress; P:positive regulation of histone methylation; P:lignin biosynthetic process; C:chloroplast; C:cell wall; C:peroxisome; C:nucleolus; C:cytosol; P:response to zinc ion; F:cinnamoyl-CoA reductase activity; P:protein amino acid phosphorylation; F:protein serine/threonine kinase activity; F:coenzyme binding; P:pollen development; P:secondary shoot formation; P:embryo sac development; P:response to cold; F:RNA binding; F:histone methyltransferase activity (H3-K4 specific); P:response to abscisic acid stimulus; C:plasmodesma; P:oxidation reduction; P:histone H3-K36 methylation; F:receptor activity; F:protein homodimerization activity; C:plasma membrane; F:ATP binding; P:regulation of gene expression, epigenetic; P:ovule development C:chromatin; C:magnesium chelatase complex; F:histone-lysine N-methyltransferase activity; P:high-affinity iron ion transport; P:specification of floral organ identity; P:regulation of transcription, DNA-dependent; P:response to salt stress; P:aging; F:magnesium chelatase activity; P:cellular copper ion homeostasis; C:chloroplast inner membrane; P:response to reactive oxygen species; F:copper chaperone activity; P:chlorophyll biosynthetic process; F:DNA regulatory region binding; P:response to cadmium ion; P:histone H3-K4 methylation; P:regulation of flower development; C:plasma membrane; C:nucleus; F:phosphatidylinositol-5-phosphate binding; C:mitochondrion F:identical protein binding; F:sequence-specific DNA binding; C:cytosol; P:cyanate catabolic process; F:hydro-lyase activity; P:response to salt stress; F:cyanate hydratase activity P:defense response to bacterium; C:vacuole; P:response to desiccation; F:cysteine-type endopeptidase activity; P:proteolysis; C:nucleus; P:response to salt stress P:translation; C:cytosol; C:ribosome; P:protein secretion; P:response to water deprivation; C:mitochondrion; P:protein folding; P:response to salt stress; P:regulation of meristem growth; C:plasmodesma; P:response to cold; F:structural constituent of ribosome; C:vacuolar membrane; F:ATP binding; C:endoplasmic reticulum lumen; P:regulation of meristem structural organization; F:unfolded protein binding; C:chloroplast; P:response to cadmium ion; C:nucleus F:copper ion binding; P:response to salt stress; P:response to light stimulus; C:plasmodesma; P:response to cold; C:phosphopyruvate hydratase complex; C:cell surface; F:DNA binding; P:response to abscisic acid stimulus; F:magnesium ion binding; P:glycolysis; C:mitochondrial envelope; C:chloroplast; P:response to cadmium ion; F:hydrolase activity; F:phosphopyruvate hydratase activity; C:nucleus; C:apoplast F:translation initiation factor activity; P:translational initiation; C:cytosol; P:transcription initiation; P:response to salt stress; P:photomorphogenesis; P:flower development; C:signalosome; C:eukaryotic translation initiation factor 3 complex; F:protein binding; 179

183 13H7JYV far-red elongated hypocotyls 3 protein 09FRXBH fumarate hydratase 2 09FNH3U galactinol synthase 13HY521 GDP-mannose pyrophosphorylase 11GPQVG glycine-rich rna-binding protein 14IMP0C glycogen synthase kinase-3 10F29RK GTP-binding nuclear protein ran-2 C:plasma membrane F:fatty-acyl-CoA reductase (alcohol-forming) activity; P:response to wounding; F:protein binding; F:zinc ion binding; P:red, far-red light phototransduction; P:suberin biosynthetic process; P:response to salt stress; P:far-red light signaling pathway; C:chloroplast; F:oxidoreductase activity, acting on the CH-CH group of donors; F:dipeptidase activity; P:microsporogenesis; F:long-chain-fatty-acyl-CoA reductase activity; F:transcription factor activity; P:proteolysis; P:positive regulation of transcription, DNA-dependent; P:positive regulation of circadian rhythm; C:nucleus C:tricarboxylic acid cycle enzyme complex; P:response to oxidative stress; P:pollen tube development; P:nitrate assimilation; F:protein binding; P:fumarate metabolic process; P:tricarboxylic acid cycle; C:cytosol; P:response to salt stress; C:mitochondrion; F:fumarate hydratase activity P:response to water deprivation; P:response to high light intensity; P:response to cold; P:carbohydrate biosynthetic process; P:response to hydrogen peroxide; P:galactose metabolic process; F:inositol 3-alpha-galactosyltransferase activity; P:response to heat; P:response to salt stress C:cytosol; P:response to jasmonic acid stimulus; F:mannose-1-phosphate guanylyltransferase activity; P:response to ozone; P:response to salt stress; P:cellulose biosynthetic process; P:defense response to bacterium; P:response to heat; F:mannose-1- phosphate guanylyltransferase (GDP) activity; P:L-ascorbic acid biosynthetic process; P:response to ammonium ion P:protein amino acid phosphorylation; P:DNA duplex unwinding; P:carotenoid biosynthetic process; P:regulation of stomatal movement; P:etioplast organization; P:mRNA export from nucleus; P:response to salt stress; P:lignin biosynthetic process; C:chloroplast; F:single-stranded DNA binding; C:peroxisome; C:cytosol; P:response to zinc ion; F:cinnamoyl-CoA reductase activity; F:protein serine/threonine kinase activity; P:vegetative to reproductive phase transition of meristem; F:carotenoid isomerase activity; P:response to cadmium ion; P:response to cold; F:RNA binding; C:plasmodesma; F:double-stranded DNA binding; C:endomembrane system; F:receptor activity; F:protein homodimerization activity; P:innate immune response; C:nucleus; F:ATP binding; P:RNA secondary structure unwinding; P:circadian rhythm P:protein amino acid autophosphorylation; F:protein binding; P:hyperosmotic response; F:ubiquitin-protein ligase activity; C:cytosol; F:protein serine/threonine kinase activity; P:response to salt stress; F:nucleotide binding C:cytosol; C:cell wall; C:nucleolus; P:response to salt stress; P:small GTPase mediated signal transduction; P:protein import into nucleus; P:GTP catabolic process; F:protein binding; P:signal transduction; F:GTPase activity; P:response to cadmium ion; F:GTP binding; C:plasma membrane; C:apoplast 180

184 09FR6DI heat shock protein FRX2Z heat shock protein 90 09FQ2RT heavy metal atpase 09FNA3Y histone deacetylase complex subunit sap18 10GCW2F isocitrate dehydrogenase 14IS3GP kinase family protein 11GT0RH malate oxidoreductase (malic enzyme) 11GVWRP methionine synthase C:cytosol; C:cell wall; P:response to water deprivation; C:mitochondrion; P:protein folding; P:response to salt stress; P:heat acclimation; C:plasmodesma; P:negative regulation of seed germination; P:flower development; P:protein stabilization; F:ATP binding; F:ATPase activity; P:leaf development; F:unfolded protein binding; P:defense response to bacterium, incompatible interaction; C:nucleus P:translation; C:cytosol; C:ribosome; P:protein secretion; P:response to water deprivation; C:mitochondrion; P:protein folding; P:response to salt stress; P:regulation of meristem growth; C:plasmodesma; P:response to cold; F:structural constituent of ribosome; C:vacuolar membrane; C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle; F:ATP binding; C:endoplasmic reticulum lumen; P:regulation of meristem structural organization; F:unfolded protein binding; C:chloroplast; P:response to cadmium ion; C:nucleus P:copper ion export; C:apoplast; F:protein binding; P:regulation of stomatal movement; P:ethylene mediated signaling pathway; P:response to salt stress; F:copper-exporting ATPase activity; F:GTP binding; C:integral to membrane; C:cell wall; C:Golgi apparatus; C:cytosol; P:ATP biosynthetic process; P:response to cadmium ion; F:GTPase activity; C:plasma membrane; F:copper ion binding; P:protein import into nucleus; F:ATP binding P:response to abscisic acid stimulus; C:nucleolus; P:response to salt stress; F:protein binding P:glyoxylate cycle; C:cytosol; F:copper ion binding; P:NADP metabolic process; P:response to salt stress; P:defense response to bacterium; C:plasmodesma; P:oxidation reduction; P:tricarboxylic acid cycle; F:NAD or NADH binding; F:isocitrate dehydrogenase (NADP+) activity; F:magnesium ion binding; P:isocitrate metabolic process; P:response to zinc ion; C:chloroplast; P:response to cadmium ion; C:apoplast P:protein amino acid autophosphorylation; F:protein binding; P:hyperosmotic response; C:cytosol; F:protein serine/threonine kinase activity; P:response to salt stress F:zinc ion binding; F:oxidoreductase activity, acting on NADH or NADPH, NAD or NADP as acceptor; P:response to salt stress; F:cobalt ion binding; F:malate dehydrogenase (decarboxylating) activity; P:oxidation reduction; P:malate metabolic process; F:ATP binding; F:NAD or NADH binding; C:mitochondrial matrix; F:protein homodimerization activity; F:oxaloacetate decarboxylase activity; C:chloroplast; F:malate dehydrogenase (oxaloacetate-decarboxylating) activity C:cytosol; P:methionine biosynthetic process; F:methionine synthase activity; F:zinc ion binding; P:response to salt stress; F:oxidoreductase activity, acting on the CH-CH group of donors, NAD or NADP as acceptor; C:plasmodesma; C:chloroplast envelope; P:pollen exine formation; F:5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine S- methyltransferase activity; P:methylation; P:response to cadmium ion; F:fatty-acyl-CoA reductase (alcohol-forming) activity; C:apoplast 181

185 11GTMNR 10GBINC 12HGO4V 10F5UL5 14IJ70W 09FP5PJ 13H5PHQ 09FPDF0 14IMF70 09FTK0G mitogen-activated protein kinase kinase monodehydroascorbate reductase NAC domain ipr NAD -linked oxidoreductase-like protein NADH-ubiquinone oxireductase oligosaccharyl transferase phantastica ortholog phd finger family protein plasma membrane Η + ΑΣPase poly -binding protein P:response to wounding; F:MAP kinase kinase activity; F:protein binding; P:systemic acquired resistance, salicylic acid mediated signaling pathway; F:protein kinase activator activity; P:protein amino acid autophosphorylation; P:ethylene biosynthetic process; P:ethylene mediated signaling pathway; P:defense response to oomycetes; P:camalexin biosynthetic process; P:response to salt stress; P:defense response to bacterium; F:protein serine/threonine kinase activity; P:auxin polar transport; P:positive regulation of transcription, DNA-dependent; F:ATP binding; C:mitochondrion P:response to cadmium ion; P:cell redox homeostasis; F:monodehydroascorbate reductase (NADH) activity; P:response to zinc ion; P:oxidation reduction; F:FAD binding; C:cytosol; P:response to salt stress P:response to oxidative stress; C:nucleolus; P:response to salt stress; P:pollen development; F:transcription factor activity; P:leaf senescence; F:protein heterodimerization activity; P:regulation of flavonoid biosynthetic process; F:protein homodimerization activity; P:positive regulation of transcription, DNA-dependent; C:cytoplasm; P:response to high light intensity P:response to water deprivation; P:response to cold; F:NADP binding; F:alcohol dehydrogenase (NADP+) activity; P:oxidation reduction; F:steroid dehydrogenase activity; F:aldehyde reductase activity; C:chloroplast; P:response to salt stress P:cellular metabolic process; C:mitochondrial respiratory chain complex I; F:coenzyme binding; F:catalytic activity; P:response to salt stress C:plasma membrane; P:protein amino acid glycosylation; F:dolichyldiphosphooligosaccharide-protein glycotransferase activity; C:endoplasmic reticulum; P:response to salt stress P:response to virus; P:polarity specification of adaxial/abaxial axis; P:response to jasmonic acid stimulus; P:leaf formation; P:response to gibberellin stimulus; C:nucleolus; P:response to salt stress; P:defense response to bacterium; P:response to salicylic acid stimulus; F:DNA binding; P:response to auxin stimulus; P:asymmetric cell division; F:transcription factor activity; C:condensed chromosome; F:protein homodimerization activity; P:negative regulation of transcription, DNA-dependent; P:response to cadmium ion; P:regulation of innate immune response; P:defense response to fungus P:cellular response to salt stress; C:cytosol; F:zinc ion binding; F:methylated histone residue binding; P:regulation of transcription, DNA-dependent; F:DNA binding; F:ATP binding; P:positive regulation of translation; F:hydrolase activity; C:nucleus F:hydrogen-exporting ATPase activity, phosphorylative mechanism; P:response to salt stress; C:integral to membrane; F:metal ion binding; P:ATP catabolic process; P:ATP biosynthetic process; F:ATP binding; P:cation transport; C:plasma membrane P:translational initiation; P:response to cadmium ion; F:RNA binding; F:translation initiation factor activity; C:cytosol; P:response to salt stress; F:nucleotide binding 182

186 14IJCJX 09FLQQK 12HI08P 16JYNUQ 10F84PO protein cobra kinase family protein heat shock protein 90 abscisic acid-insensitive 5-like protein protein disulfide isomerase pyrophosphate-energized vacuolar membrane proton pump 1 RCD1 (radical-induced cell death1) protein binding RNA helicase 12HLJK0 S-adenosyl methionine synthetase 2 P:multidimensional cell growth; F:ubiquinol-cytochrome-c reductase activity; C:external side of plasma membrane; P:response to salt stress; P:cellulose microfibril organization; C:mitochondrial respiratory chain complex III; C:plant-type cell wall; C:longitudinal side of cell surface; P:aerobic respiration; C:anchored to plasma membrane P:glycerol ether metabolic process; F:protein disulfide isomerase activity; P:electron transport chain; P:response to endoplasmic reticulum stress; P:response to salt stress; P:cell redox homeostasis; F:electron carrier activity; C:vacuolar membrane; C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle; C:endoplasmic reticulum lumen; C:chloroplast; F:dolichyldiphosphooligosaccharide-protein glycotransferase activity; P:response to cadmium ion; F:protein disulfide oxidoreductase activity; C:plasma membrane C:cytosol; P:establishment or maintenance of transmembrane electrochemical gradient; P:response to water deprivation; C:mitochondrion; P:response to salt stress; P:auxin polar transport; C:chloroplast envelope; C:plant-type vacuole membrane; C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle; F:magnesium ion binding; F:inorganic diphosphatase activity; P:leaf development; C:endosome membrane; P:proton transport; F:hydrogen-translocating pyrophosphatase activity; C:integral to plasma membrane P:programmed cell death; P:lateral root morphogenesis; P:response to ozone; P:response to water deprivation; P:jasmonic acid mediated signaling pathway; P:response to salt stress; P:embryonic development; F:protein binding; P:response to superoxide; C:cytoplasm; P:response to hydrogen peroxide; P:nitric oxide biosynthetic process; P:defense response to bacterium, incompatible interaction; C:nucleus; P:ethylene mediated signaling pathway P:response to water deprivation; P:response to cold; F:ATP-dependent helicase activity; F:RNA binding; F:ATP binding; C:chloroplast; P:response to salt stress C:cytosol; C:cell wall; P:ethylene biosynthetic process; P:cellular response to iron ion; P:response to salt stress; F:methionine adenosyltransferase activity; P:Sadenosylmethionine biosynthetic process; P:one-carbon metabolic process; F:ATP binding; F:magnesium ion binding; P:response to cadmium ion; C:plasma membrane 14IMAW2 salt responsive protein 2 F:hydrolase activity, acting on ester bonds; P:response to salt stress; 12HB3OQ serine threonine protein kinase P:protein amino acid phosphorylation; F:protein binding; F:ATP binding; P:response to abscisic acid stimulus; C:nucleus; C:cytosol; F:protein serine/threonine kinase activity; P:response to salt stress 16JT0BE shd ATP binding unfolded protein binding P:translation; C:ribosome; P:protein secretion; P:response to water deprivation; C:mitochondrion; P:protein folding; P:response to salt stress; P:regulation of meristem growth; P:response to cold; F:structural constituent of ribosome; F:ATP binding; C:endoplasmic reticulum lumen; P:regulation of meristem structural organization; F:unfolded protein binding; C:chloroplast; C:vacuole; P:response to cadmium ion; C:plasma membrane 183

187 09FLSQZ skp1-like protein 3 09FLJVF thaumatin-like protein 13H2ELZ tubulin beta chain 15I8E35 udp-glucose pyrophosphorylase 14IQOPG V-type proton atpase catalytic subunit a 16JX8R2 vacuolar type atpase subunit a 11GYRT2 vesicle-associated membrane 09FM8L5 vq motif-containing protein 11GYH4A white-brown-complex abc transporter family 13H2P6U WWE protein-protein interaction domain family protein P:ubiquitin-dependent protein catabolic process; F:protein kinase activity; P:embryonic development ending in seed dormancy; P:response to salt stress; C:SCF ubiquitin ligase complex; F:ubiquitin-protein ligase activity; F:protein binding; C:cytoplasm; C:nucleus; P:protein amino acid phosphorylation C:endomembrane system; C:vacuole; P:defense response to bacterium, incompatible interaction; P:response to salt stress; P:defense response to fungus, incompatible interaction P:response to salt stress; C:microtubule; C:tubulin complex; P:protein polymerization; P:GTP catabolic process; P:microtubule-based movement; F:protein binding; F:GTPase activity; F:structural constituent of cytoskeleton; C:cytoplasm; C:membrane; F:GTP binding P:response to cadmium ion; P:metabolic process; P:response to salt stress; C:cytoplasm; F:UTP:glucose-1-phosphate uridylyltransferase activity; C:plasma membrane C:plant-type vacuole; C:vacuolar membrane; F:proton-transporting ATPase activity, rotational mechanism; C:chloroplast envelope; C:proton-transporting V-type ATPase, V1 domain; F:hydrogen ion transporting ATP synthase activity, rotational mechanism; P:response to salt stress; P:ATP hydrolysis coupled proton transport; C:cell wall; C:cytosol; P:Golgi organization; P:plasma membrane ATP synthesis coupled proton transport; P:pollen development; F:protease binding; C:plasmodesma; C:plasma membrane; F:ATP binding C:cell wall; F:hydrogen ion transporting ATP synthase activity, rotational mechanism; P:response to salt stress; C:plant-type vacuole; P:ATP synthesis coupled proton transport; C:vacuolar membrane; F:ATP binding; P:pollen development; F:proton-transporting ATPase activity, rotational mechanism; P:Golgi organization; C:chloroplast; C:protontransporting V-type ATPase, V1 domain; C:plasma membrane P:cellular membrane fusion; P:intermembrane transport; P:stomatal movement; C:plasma membrane; C:vacuolar membrane; P:vesicle-mediated transport; P:response to abscisic acid stimulus; C:integral to membrane; P:response to salt stress P:response to water deprivation; P:regulation of salicylic acid metabolic process; C:nucleus; P:response to salt stress; F:calmodulin binding P:wax biosynthetic process; P:response to salt stress; F:phosphonate transmembranetransporting ATPase activity; P:ATP catabolic process; C:cytoplasmic membrane-bounded vesicle; F:ATP binding; P:response to abscisic acid stimulus; C:membrane P:programmed cell death; P:lateral root morphogenesis; P:response to ozone; P:response to water deprivation; P:jasmonic acid mediated signaling pathway; P:response to salt stress; F:protein binding; P:response to superoxide; ; C:cytoplasm; P:response to hydrogen peroxide; P:nitric oxide biosynthetic process; P:defense response to bacterium, incompatible interaction; C:nucleus; P:embryonic development; P:ethylene mediated signaling pathway 184

188 Δληνπηζκφο ησλ cdnas κε ζεκαληηθά δηαθνξεηηθή έθθξαζε Σα ESTs ιζαξ μιάδαξ (cluster) απμηεθμφκ εναφζιαηα cdnas ημο ίδζμο βμκζδίμο ή, ιε ιζηνυηενδ πζεακυηδηα, ιέθδ ηδξ ίδζαξ μζημβέκεζαξ βμκζδίςκ. Δπζπνυζεεηα, μ ζοκμθζηυξ ανζειυξ ημοξ ζηδκ μιάδα ακηακαηθά ημκ ανζειυ ακηζβνάθςκ ημο ακηίζημζπμο mrna ιμνίμο ζημ μθζηυ ηοηηανζηυ RNA πμο απμιμκχεδηε απυ ημοξ πνμξ ακάθοζδ ζζημφξ νίγαξ ηαζ θφθθςκ. Με άθθα θυβζα ακηζπνμζςπεφεζ πμζμηζηά ημ επίπεδμ έηθναζδξ ημο ζοβηεηνζιέκμο βμκζδίμο ζημ ζοβηεηνζιέκμ εηπφθζζια RNA. Ωζηυζμ, μζ δζαθμνέξ ζημκ ανζειυ εναοζιάηςκ cdnas εκυξ βμκζδίμο ιεηαλφ ηςκ δζαθυνςκ δεζβιάηςκ ιπμνεί κα μθείθμκηαζ ζε εζθαθιέκεξ ιεηνήζεζξ πανά ζε πναβιαηζηέξ, αζμθμβζηήξ πνμέθεοζδξ δζαθμνέξ ζηδκ βμκζδζαηή έηθναζδ. Έηζζ, βζα ημκ εκημπζζιυ ηςκ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηζξ ηέζζενζξ cdna αζαθζμεήηεξ (θφθθα ηαζ νίγα) πμο αθθδθμοπίεδηακ, εθανιυζηδηε δ ζηαηζζηζηή ιέεμδμξ R test (Stekel et al., 2000). Σμ R test πνδζζιεφεζ ςξ έκα ιέηνμ ημο ααειμφ, ηαηά ημκ μπμίμ μζ παναηδνμφιεκεξ δζαθμνέξ ζηδκ βμκζδζαηή έηθναζδ ακηζηαημπηνίγμοκ ηδκ πναβιαηζηή εηενμβέκεζα ημοξ. Γζα αοηυ ημκ θυβμ, ημ R test εθανιυζηδηε βζα ηδκ ιεθέηδ ημο πθδεοζιμφ cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδ νίγα, ζηα θφθθα ηαεχξ ηαζ βζα ηδκ ζφβηνζζδ ηδξ έηθναζδξ ημο πθδεοζιμφ cdnas ζηδ νίγα ηαζ ζηα θφθθα ηαοηυπνμκα cdnas κε ζεκαληηθά δηαθνξεηηθή έθθξαζε ζηε Ρίδα ηζξ 1624 μιάδεξ ηδξ νίγαξ ανέεδηακ 24 μιάδεξ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζε ηαηαπυκδζδ ιε NaCl έπεζηα απυ ηδκ εθανιμβή ημο R test (R 8) (Πίκαηαξ 3.7). Απυ ηζξ 24 μιάδεξ ιε R 8 δ έηθναζδ ηςκ 9 (37,5%) ήηακ ηαεμδζηή εκχ ηςκ 15 (62,5%) ακμδζηή έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl (πήια 3.18). Οζ μιάδεξ 81 ηαζ 121 πανμοζίαζακ ηδκ ιεβαθφηενδ άκμδμ έηθναζδξ ιε 4 ηαζ 3,8 θμνέξ (fold), ακηίζημζπα. Η εφνεζδ ηςκ αζμθμβζηχκ δζαδζηαζζχκ ηαζ ιμνζαηχκ θεζημονβζχκ ηςκ 24 μιάδςκ ιε δζαθμνεηζηή έηθναζδ ήηακ αδφκαηδ θυβς ηδξ ακοπανλίαξ μιμθμβίαξ ιε βκςζηά βμκίδζα ηαεχξ ηαζ δ έθθεζρδ επζζδιεζχζεςκ GO. 185

189 ρήκα Ο ανζειυξ ηςκ μιάδςκ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδκ νίγα έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl. Πίλαθαο 3.7. Οζ μιάδεξ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδ νίγα (R 8) Οκάδα R 7 79, , , , , , , , , , , , , , , , , ,38 8 9, , , , , , cdnas κε ζεκαληηθά δηαθνξεηηθή έθθξαζε ζην θχιιν Έπεζηα απυ ηδκ εθανιμβή ημο R test ζηζξ 2642 μιάδεξ ημο θφθθμο ανέεδηακ 70 μιάδεξ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζε ηαηαπυκδζδ ιε NaCl (Πίκαηαξ 3.8). 186

190 Πίλαθαο 3.8. Οζ μιάδεξ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηδ νίγα (R 8) Οκάδα R test Οκάδα R Οκάδα R 1 256, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,00 Απυ ηζξ 70 μιάδεξ ιε R 8 δ έηθναζδ ηςκ 14 (37,5%) ηζκείηαζ ηαεμδζηά εκχ ηςκ 56 (62,5%) ηζκείηαζ ακμδζηά έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl (πήια 3.19). Οζ μιάδεξ 91, 133, 172 ηαζ 267 πανμοζίαζακ άκμδμ ιεβαθφηενδ απυ 30 θμνέξ (fold), εκχ ζδιακηζηή ιείςζδ ιεβαθφηενδ απυ 30 θμνέξ ειθακίζηδηε ζηζξ μιάδεξ 192 ηαζ 213. ρήκα Ο ανζειυξ ηςκ μιάδςκ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηα θφθθα έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl. Η εφνεζδ ηςκ αζμθμβζηήξ θεζημονβίαξ ηςκ 70 μιάδςκ ιε δζαθμνεηζηή έηθναζδ ήηακ αδφκαηδ θυβς ηδξ ιζηνήξ μιμθμβίαξ ιε βκςζηά βμκίδζα ηαεχξ ηαζ δ έθθεζρδ 187

191 επζζδιεζχζεςκ GO ζηζξ ζοβηεηνζιέκεξ αθθδθμοπίεξ. Οιμθμβία ιε βκςζηά βμκίδζα ανέεδηε ιυκμ βζα ηζξ 5 απυ ηζξ 70 μιάδεξ, μζ μπμίεξ είπακ ιυκμ ιζα επζζδιείςζδ GO πμο ζπεηίγμκηακ ιε μλεζδμακαβςβή (oxidation reduction) cdnas κε ζεκαληηθά δηαθνξεηηθή έθθξαζε ζε φιεο ηηο ζπλζήθεο Δηηυξ απυ ηδκ ιεθέηδ ηςκ μιάδςκ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ λεπςνζζηά ζηα θφθθα ηαζ ηδ νίγα, ηα ESTs απυ ηζξ ηέζζενζξ αζαθζμεήηεξ επελενβάζηδηακ ηαοηυπνμκα ιε ημκ αθβυνζειμ CD-HIT-EST ιε ζημπυ κα δδιζμονβδεμφκ μιάδεξ πμο κα πενζθαιαάκμοκ ESTs ηαζ απυ ηζξ ηέζζενζξ ζοκεήηεξ (Φφθθα ηαζ Ρίγα - 0 ηαζ 120mΜ NaCl). Έηζζ πνμέηορακ ιμκαδζηά cdnas πμο απμηεθμφκηακ απυ μιάδεξ, πμο πενζείπακ απυ 2 έςξ ESTs, ηαζ singletons. Οζ μιάδεξ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ έζης ζε ιζα απυ ηζξ 4 ζοκεήηεξ είκαζ 235. ε 34 μιάδεξ δ έηθναζδ ιεζχκεηαζ ηαζ ζε 95 αολάκεηαζ ηαοηυπνμκα ζε θφθθμ ηαζ νίγα (πήια 3.20). Δπζπθέμκ ζε 37 μιάδεξ αολάκεηαζ δ έηθναζδ ζηα θφθθα ηαζ ιεζχκεηαζ ζηδ νίγα εκχ ακηίεεηα ζε 17 αολάκεηαζ δ έηθναζδ ζηδ νίγα ηαζ ιεζχκεηαζ ζηα θφθθα (πήια 3.20). Δπίζδξ ειθακίγμκηαζ 49 ηαζ 3 μιάδεξ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ιυκμ ζηα θφθθα ηαζ ζηδ νίγα ακηίζημζπα. ρήκα Η ζοιπενζθμνά ηςκ 235 ημζκχκ μιάδςκ ζε θφθθα ηαζ νίγα ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl. 1) Σαοηυπνμκδ ιείςζδ ηδξ έηθναζδξ ζε θφθθα ηαζ νίγα 34 μιάδςκ, 2) Σαοηυπνμκδ αφλδζδ ηδξ έηθναζδξ ζε θφθθα ηαζ νίγα 95 μιάδςκ, 3) 37 μιάδεξ πμο αολάκεηαζ δ έηθναζδ ζηα θφθθα αθθά ιεζχκεηαζ ζηδ νίγα, 4) 17 μιάδεξ πμο ιεζχκεηαζ δ έηθναζδ ζηα θφθθα ηαζ αολάκεηαζ ζηδ νίγα, 5) 33 μιάδεξ πμο ειθακίγμκηαζ ιυκμ ζηα θφθθα ηαζ αολάκεηαζ δ έηθναζδ ημοξ 6) 16 μιάδεξ πμο ειθακίγμκηαζ ιυκμ ζηα θφθθα ηαζ 188

192 ιεζχκεηαζ δ έηθναζδ ημοξ ηαζ 7) 3 μιάδεξ πμο ειθακίγμκηαζ ιυκμ ζηδκ νίγα ηαζ αολάκεηαζ δ έηθναζδ ημοξ. Οζ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ηςκ 235 μιάδςκ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ θαίκεηαζ ζημ πήια Οζ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ηδξ πθεζμρδθίαξ ηςκ μιάδςκ ιε επζζδιείςζδ GO ζπεηίγμκηαζ ιε ηοηηανζηέξ ηαζ ιεηααμθζηέξ δζενβαζίεξ. Δπζπθέμκ εκημπίζηδηακ μηηχ μιάδεξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ακηίδναζδ ζε ενέεζζια ηαηαπυκδζδξ (response to stimulus). ρήκα Οζ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ μζ 235 ημζκέξ μιάδεξ ζε θφθθα ηαζ νίγα ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl. Δπζπνυζεεηα, ανέεδηακ μζ επζζδιεζχζεζξ GO ηςκ ζζημ-εζδζηχκ μιάδςκ βζα κα ιεθεηδεμφκ μζ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ηαζ δ ιμνζαηή θεζημονβία ημοξ. Γζα ηζξ ηνείξ μιάδεξ πμο ειθακίγμοκ δζαθμνεηζηή έηθναζδ ιυκμ ζηδκ νίγα δεκ ανέεδηακ επζζδιεζχζεζξ GO ηαεχξ δεκ οπήνπε μιμθμβία ιε βκςζηέξ αθθδθμοπίεξ βμκζδίςκ. Ακηίεεηα βζα ηζξ μιάδεξ πμο εηθνάγμκηαζ ιυκμ ζηα θφθθα ανέεδηακ ανηεηέξ επζζδιεζχζεζξ GO. Σμ ιεβαθφηενμ πμζμζηυ ηςκ 49 μιάδςκ πμο εηθνάγμκηαζ ιυκμ ζηα θφθθα ζπεηίγεηαζ ιε ιεηααμθζηέξ δζαδζηαζίεξ (cellular, primary and macromolecule metabolic processes) εκχ εκδζαθένμκ πανμοζζάγεζ υηζ 6 cdnas ζπεηίγμκηαζ ιε απυηνζζδ ζε ηαηαπυκδζδ ηαζ έλζ ιε ακηίδναζδ ζε ενέεζζια 189

193 πδιζηήξ ηαηαπυκδζδξ (πήια 3.22). Δηηυξ απυ ηδκ ιεθέηδ ηςκ αζμθμβζηχκ δζαδζηαζζχκ πμο ζοιιεηέπμοκ αοηέξ μζ μιάδεξ, ελεηάζηδηε ηαζ μ αζμπδιζηυξ ημοξ νυθμξ ηαζ δζαπζζηχεδηε υηζ ηονίςξ ζπεηίγμκηαζ ιε ηδκ θςημζφκεεζδ (15 μιάδεξ) ηαζ ιε ηδκ πνυζδεζδ ζυκηςκ (ion binding) (19 μιάδεξ), βεβμκυξ πμο επζαεααζχκεζ ηδκ έηθναζδ αοηχκ ηςκ cdnas απμηθεζζηζηά ζηα θφθθα (πήια 3.23). 190

194 ρήκα Οζ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ μζ 49 ζζημ-εζδζηέξ μιάδεξ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηα θφθθα. 191

195 ρήκα Οζ ιμνζαηέξ θεζημονβίεξ ζηζξ μπμίεξ ειπθέημκηαζ μζ 49 ζζημ-εζδζηέξ μιάδεξ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ζηα θφθθα. 192

196 3.3. χγθξηζε ησλ απνηειεζκάησλ ηεο αιιεινχρηζεο κε ηελ πιαηθφξκα 454-GS FLX Titanium κε ηα απνηειέζκαηα ηελ κηθξνζπζηνηρίαο ειηάο. ημ Κεθάθαζμ 2 πνδζζιμπμζχκηαξ ηδκ ιζηνμζοζημζπία (microarray) εθζάξ έβζκε ιεθέηδ ηςκ cdnas ηδξ νίγαξ πμο πανμοζζάγμοκ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ έπεζηα απυ 15, 45, 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl ηαζ 15, 45 διένεξ επακαθμνάξ απυ ηδκ ηαηαπυκδζδ, εκχ ζημ πανυκ ηεθάθαζμ έβζκε ιεθέηδ ηςκ cdnas ηδξ νίγαξ ηαζ ηςκ θφθθςκ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl πνδζζιμπμζχκηαξ ηδκ πθαηθυνια αθθδθμφπζζδξ 454-GS FLX Titanium. Οζ δφμ πνμζεββίζεζξ είπακ ςξ επζηάθορδ ηδ ιεθέηδ ηςκ cdnas ηδξ νίγαξ, ηδξ ακεεηηζηήξ πμζηζθίαξ Καθαιχκ, έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδξ ιε NaCl. Γζα αοηυ ημ θυβμ έβζκε ζφβηνζζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηςκ δφμ πνμζεββίζεςκ. Απυ ηδκ πνμζέββζζδ ηδξ ιζηνμζοζημζπίαξ πνδζζιμπμζήεδηακ μζ υνμζ GO ηςκ 93 cdnas πμο πανμοζζάγμοκ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ έπεζηα απυ 90 διένεξ ηαηαπυκδζδ ιε NaCl, εκχ βζα ηδκ πνμζέββζζδ ηδξ 454-αθθδθμφπζζδξ αθαζνέεδηακ μζ 49 μιάδεξ πμο εηθνάγμκηαζ ιυκμ ζηα θφθθα ηαζ πνδζζιμπμζήεδηακ μζ υνμζ GO ηςκ 186 μιάδςκ πμο ειθακίγμοκ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ ιυκμ ζηδ νίγα ή ζηδ νίγα ηαζ ζηα θφθθα ηαοηυπνμκα. Γζα ημκ οπμθμβζζιυ ηδξ πζεακυηδηαξ δ παναηδνμφιεκδ ηαηακμιή ηςκ υνςκ GO ηςκ 186 μιάδςκ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή ηδξ δεφηενδξ πνμζέββζζδξ (454 αθθδθμφπζζδ) κα δζαθένμοκ ζδιακηζηά (FDR<0.05) απυ ηδκ ηαηακμιή ηςκ GO υνςκ ηςκ 93 cdnas πμο πνμέηορακ απυ ηδκ πνχηδ πνμζέββζζδ (ιζηνμζοζημζπία), πνδζζιμπμζήεδηε ημ Fisher s exact test. Η ζφβηνζζδ ηςκ δφμ πνμζεββίζεςκ ιε ημ Fisher s exact test έδεζλε υηζ ιε ελαίνεζδ ηδκ επζζδιείςζδ GO πμο αθμνά ηδκ δναζηδνζυηδηα ιμκμμλοβεκάζδξ (monooxygenase activity), πμζμηζηά μζ δφμ πνμζεββίζεζξ ειθακίγμοκ cdnas ιε πανυιμζεξ ιμνζαηέξ θεζημονβίεξ ηαζ αζμθμβζηέξ δζαδζηαζίεξ (πήια 3.24). Ακηίεεηα δ πμζμηζηή ζφβηνζζδ ιεηαλφ ηςκ δφμ πνμζεββίζεςκ ειθακίγεζ δζαθμνέξ. Αοηυ μθείθεηαζ ηονίςξ ζημ δζαθμνεηζηυ ανζειυ cdnas πμο ακαθφεδηακ ζε ηάεε πνμζέββζζδ (πήια 3.24). 193

197 ρήκα Fisher s test βζα ημκ οπμθμβζζιυ ηδξ πζεακυηδηαξ δ παναηδνμφιεκδ ηαηακμιή ηςκ αζμθμβζηχκ υνςκ ζημ ζφκμθμ ηςκ 186 μιάδςκ ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ, πμο πνμέηορακ απυ ηδκ αθθδθμφπζζδ 454, κα είκαζ ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή (FDR < 0.05) απυ ηδκ ηαηακμιή ηςκ υνςκ ζημ ζφκμθμ ηςκ 93 cdnas ιε ζδιακηζηά δζαθμνεηζηή έηθναζδ πμο πνμέηορακ απυ ηδκ ακάθοζδ ιζηνμζοζημζπίαξ ζηδκ πμζηζθία Καθαιχκ. 194