ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΤΩΝ ΛΕΥΧΑΙΜΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΗΛΙΚΙΩΜΕΝΟΥΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΟΞΕΙΑ ΜΥΕΛΟΓΕΝΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ Β ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Μ. ΡΑΠΤΟΠΟΥΛΟΥ-ΓΙΓΗ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθµ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΤΩΝ ΛΕΥΧΑΙΜΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΗΛΙΚΙΩΜΕΝΟΥΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΟΞΕΙΑ ΜΥΕΛΟΓΕΝΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ ΑΛΕΞΑΝ ΡΑΣ Β. ΤΣΙΓΚΑ ΒΙΟΛΟΓΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2

3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΛΙΣΣΑΒΕΤ ΙΩΑΝΝΙ ΟΥ-ΠΑΠΑΓΙΑΝΝΑΚΗ, ΑΝΑΠΛ.ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΙΩΑΝΝΗΣ ΚΛΩΝΙΖΑΚΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΣΤΥΛΙΑΝΗ ΧΑΡΑΛΑΜΠΙ ΟΥ-ΒΡΑΝΙΤΣΑ, ΑΝΑΠΛ.ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΛΙΣΣΑΒΕΤ ΙΩΑΝΝΙ ΟΥ-ΠΑΠΑΓΙΑΝΝΑΚΗ, ΑΝΑΠΛ.ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΙΩΑΝΝΗΣ ΚΛΩΝΙΖΑΚΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΣΤΥΛΙΑΝΗ ΧΑΡΑΛΑΜΠΙ ΟΥ-ΒΡΑΝΙΤΣΑ, ΑΝΑΠΛ.ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΠΑΠΑ ΟΠΟΥΛΟΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΑΡΙΑ ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΕΛΕΝΗ ΟΡΦΑΝΟΥ-ΚΟΥΜΕΡΚΕΡΙ ΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΑΡΙΑ ΡΑΠΤΟΠΟΥΛΟΥ-ΓΙΓΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η έγκρισις της ιδακτορικής ιατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωµών του συγγραφέως. (Νόµος 5343/32, αρθρ. 202&2 και ν. 1268/82, αρθρ.50&8)

4

5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ

6

7 Στους γονείς µου και στον αδερφό µου Ορέστη Στον αγαπηµένο µου Νίκο Insanity is doing the same thing over and over again and expecting different results Παράνοια θα πει να κάνεις το ίδιο πράγµα ξανά και ξανά και να περιµένεις διαφορετικά αποτελέσµατα» Albert Einstein ( )

8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...17 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία Επιδηµιολογία και Αιτιολογία Παθογένεση Κυτταρικός πολλαπλασιασµός Απόπτωση Κυτταρική διαφοροποίηση Το λευχαιµικό stem cell Ιδιότητες του λευχαιµικού stem cell Προέλευση του LSC και Μοριακή Παθογένεση Προγνωστικοί παράγοντες στην ΟΜΛ Ταξινόµηση της ΟΜΛ Tαξινόµηση κατά FAB Tαξινόµηση κατά WHO Γενετική της ΟΜΛ Mοριακή σηµατοδότηση στην ΟΜΛ Κυτταρογενετικά ευρήµατα στην ΟΜΛ Χρωµοσωµικές µετατοπίσεις & σηµειακές µεταλλάξεις στην ΟΜΛ Ισόρροπες αµοιβαίες χρωµοσωµικές µετατοπίσεις α. Ο παράγοντας CBF β. Το γονίδιο MLL γ. Ο υποδοχέας RARα Σηµειακές µεταλλάξεις στην ΟΜΛ που οδηγούν: α. στην ενεργοποίηση γονιδίων της οικογένειας RAS...53 β. στη συνεχή ενεργοποίηση υποδοχέων τυροσινικής κινάσης...53 γ. στην απώλεια της λειτουργίας των γονιδίων AML1, C/EBPA και GATA

10 1.10. Ηλικιωµένοι και ΟΜΛ Κυτταρικός Θάνατος Απόπτωση ή Προγραµµατισµένος Κυτταρικός Θάνατος Νέκρωση Ο µηχανισµός της απόπτωσης α. Το εξωγενές µονοπάτι β. Το ενδογενές ή µιτοχονδριακό µονοπάτι Η οικογένεια των κασπασών Απόπτωση και αιµατολογικά νοσήµατα ιαταραχή της απόπτωσης και Λευχαιµογένεση Ρύθµιση της απόπτωσης Ρυθµιστικοί παράγοντες της απόπτωσης Μηχανισµοί που ρυθµίζουν την απόπτωση α. ιασταύρωση των αποπτωτικών µονοπατιών β. Οικογένειες πρωτεϊνών µε προ- και αντι- αποπτωτική δράση Η οικογένεια των IAPs Η survivin οµή και οργάνωση του γονιδίου της Ο προαγωγέας της survivin οµή και έκφραση της πρωτεΐνης Ισοµορφές της survivin survivin-2β και survivin- Εx survivin-3β survivin-2α και survivin-3α Ο ρόλος της survivin α. στη µίτωση και την προαγωγή του κυτταρικού κύκλου β. στην αναστολή της απόπτωσης Έκφραση της survivin α. σε φυσιολογικούς ιστούς β. σε καρκινικά κύτταρα Ρύθµιση της έκφρασης της survivin Μεταγραφική ρύθµιση Μετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις

11 Φωσφορυλίωση Ουβικουϊτίνωση Ο ρόλος του προαγωγέα στη ρύθµιση της έκφρασης Η σηµασία της survivin στη θεραπεία του καρκίνου Η survivin ως προγνωστικός δείκτης Μοριακή στόχευση της survivin ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ι. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Ασθενείς Μέθοδοι Ερευνητικό πρωτόκολλο Ανάλυση Καρυότυπου Τεχνικές χρώσεις Η τεχνική των ζωνώσεων G Η µέθοδος για την ανάλυση του καρυότυπου Αποµόνωση RNA Ποσοτικός προσδιορισµός του RNA Τεχνική της RT-PCR PCR ή Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυµεράσης Real-Time PCR Το µοντέλο της σχετικής ποσοτικοποίησης του Pfaffl Ανοσοενζυµική µέθοδος ELISA Στατιστική µεθοδολογία ΙΙ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ A. Αιµατολογικά ευρήµατα των ασθενών Β. Ευρήµατα από τη µελέτη των επιπέδων mrna της survivin στον ΜΟ και το ΠΑ Γ. Ευρήµατα του κυτταρογενετικού ελέγχου Ευρήµατα από τη µελέτη της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης survivin στον ορό

12 ΙΙΙ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α. Ευρήµατα από τη µελέτη των επιπέδων mrna στον µυελό των οστών ιάγνωση Ύφεση Μάρτυρες Β. Ευρήµατα από τη µελέτη των επιπέδων mrna στο περιφερικό αίµα ιάγνωση Ύφεση Μάρτυρες Γ. Ευρήµατα από τη µελέτη της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης στον ορό ιάγνωση Ύφεση Μάρτυρες Συσχέτιση των επιπέδων mrna και της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης µε τα αιµατολογικά ευρήµατα Ε. Συσχέτιση των επιπέδων mrna στον µυελό των οστών και στο περιφερικό αίµα µε γνωστούς προγνωστικούς παράγοντες για την ΟΜΛ και την απάντηση στη θεραπεία Στ. Συσχέτιση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης στον ορό µε γνωστούς προγνωστικούς παράγοντες για την ΟΜΛ και την απάντηση στη θεραπεία Ζ. Η survivin ως προγνωστικός παράγοντας ΙV. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ V. ΠΕΡΙΛΗΨΗ VI. SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

13 ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ AIF Αpoptosis Ιnducing Factor AML Acute Myeloid Leukemia Apaf-1 Apoptosis Protease-Inducing Factor-1 API4 Apoptosis Inhibitor 4 ATP Adenosine triphosphate ATRA All Trans Retinoic Acid BAD Bcl-XL/Bcl-2-Associated Death promoter bfgf basic Fibroblast Growth Factor BIR Baculovirus IAP Repeat BIRC5 Baculoviral IAP Repeat-Containing protein 5 CBF Core Binding Factor Cdc2 Cycle dependent cyclin2 CDE Cell cycle-dependent Element CHR Cell cycle Homology Region CMP Common Myeloid Progenitors CPC Chromosomal Passenger Complex DD Death Domains DED Death Effector Domains DFF DNA Fragmentation Factor DISC Death-Inducing Signaling Complex DNA DeoxyriboNucleic Acid DR Death Receptors EDAR EctoDysplasin A Receptor ERK Extracellular signal-regulated Kinase FAB French-American-British FADD Fas Associated Death Domain protein FasL Fas Ligand FISH Fluorescence In Situ Hybridization FL FLT3 Ligand FLICE FADD-Like IL-1β-Converting Enzyme FLIP FLICE Ιnhibitory Protein FLT3 FMS-Related Tyrosine Kinase 3 G-CSF G- Colony Stimulating Factor GDP Guanosine diphosphate

14 GMP Granulocyte Macrophage Progenitors GTP Guanosine-5'-triphosphate HBXIP Hepatitis B X-interacting Protein HLF Hepatic Leukemia Factor HSC Haemopoietic Stem Cell Hsp90 Heat shock protein-90 IAPs Inhibiotor of Apoptosis Proteins) IL-3 Interleukin-3 INCENP Inner CΕntromere Protein ITDs Internal Tandem Duplications, IκΒ Inhibitor-κΒ JAK JAnus protein tyrosine Kinase JM JuxtaMembrane domain, L Ligand LSC Leukemic Stem Cell, MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase MDR1 Multi Drug Resistance phenotype -1 MEK1 MAP kinase and ERK activator Kinase MSH2 MutS Ηomolog 2 NFI Nuclear Factor I NF-κΒ Nuclear Factor- κβ NGFR Νerve Growth Factor Receptor NLS Nuclear Localization Signal NPM ΝuclePhosMin NUMA Nuclear Mitotic Apparatus protein ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction PI3K PhosphatidylInositol 3 Kinase PLK Polo Like Kinase PML ProMyelocytic Leukemia PODs PML Oncogenic Domains PΙ3K Phosphatidylinositol 3- Kinase RAC RAS-Related C3 Botulinum toxin substrate RARα Retinoic Acid Receptor-α RTK Receptor Tyrosine Kinase RZF RING zinc-finger SCF Stem Cell Factor

15 SEAP SEcreted Alkaline Phosphatase SNR1 Small Nuclear Ribonucleoprotein 1 Sp1 Specificity protein-1 STAT Signal Transducers and Activators of Transcription SWI/SNF SWItch/Sucrose NonFermentable TNF Tumor Necrosis Factor TNFR1 Tumor Necrosis Factor Receptor-1 TRADD TNF Receptor Associated Death Domain TRAIL-R1 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptor 1 UTR UnTranslated Region VEGF Vascular Endothelial Growth Factor WHO World Health Organization XAF1 XIAP-associated factor 1 ΑΜΜΟ Αυτόλογη Μεταµόσχευση Μυελού των Οστών ΟΛΛ Οξείας Λεµφοβλαστικής Λευχαιµίας ΟΜΛ Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία ΟΠΜΛ Οξεία Προµυελοκυτταρική Λευχαιµία ΧΜΛ Χρόνια Μυελογενή Λευχαιµία ΧΜΜΛ Χρόνια Μυελοµονοκυτταρική Λευχαιµία ΜΟ Μυελός των οστών ιάγνωση ΠΑ Περιφερικό Αίµα Υ Ύφεση Μ Μάρτυρες

16

17 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία (ΟΜΛ) είναι µία κακοήθης νόσος του αι- µοποιητικού συστήµατος, που προσβάλει σε ποσοστό µεγαλύτερο του 50%, η- λικιωµένα άτοµα. Η εντατική χηµειοθεραπεία και η µεταµόσχευση του µυελού των οστών βελτίωσαν την πρόγνωση της ΟΜΛ στους νέους και στους µέσης ηλικίας ασθενείς, αλλά ελάχιστα ωφέλησαν τους ηλικιωµένους. Οι νέες αυτές θεραπείες είναι ιδιαίτερα τοξικές, µε αποτέλεσµα να µην είναι ανεκτές από τους ασθενείς µεγάλης ηλικίας, οι οποίοι συχνά εµφανίζουν και άλλα προβλήµατα υγείας, που περιπλέκουν περισσότερο την κατάστασή τους. Έχει βρεθεί επίσης, ότι οι ηλικιωµένοι ασθενείς µε ΟΜΛ εµφανίζουν µεγαλύτερη αντίσταση στη χηµειοθεραπεία, από τα αρχικά στάδια της νόσου, σε σχέση µε τους νέους ασθενείς. Για τον λόγο αυτόν είναι απαραίτητο να βρεθούν νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις, λιγότερο τοξικές, που θα µπορούν να υπερπηδούν δυσµενείς προγνωστικούς παράγοντες, όπως η ηλικία, η αντίσταση στα χηµειοθεραπευτικά φάρ- µακα κ.ά., και θα οδηγούν µε ασφάλεια στην ύφεση της ΟΜΛ στους ηλικιωµένους. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού, πρέπει να µελετηθεί σε βάθος η παθογένεια της ΟΜΛ και να καθορισθεί η δράση των παραγόντων, που διέπουν τους ενδοκυττάριους µοριακούς µηχανισµούς. Σήµερα θεωρείται ότι η ΟΜΛ προκαλείται από διαταραχή της ισορροπίας µεταξύ της αυτοανανέωσης, της διαφοροποίησης και της απόπτωσης των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων του µυελού των οστών. Η απόπτωση, ή αλλιώς o προγραµµατισµένος κυτταρικός θάνατος είναι ο µηχανισµός που ρυθµίζει την ισορροπία µεταξύ του κυτταρικού πολλαπλασιασµού και του κυτταρικού θανάτου, µε τελικό στόχο τη διατήρηση της οµοιόστασης των ιστών. Η µειωµένη ικανότητα των λευχαιµικών κυττάρων να εκτελούν απόπτωση έχει αναγνωριστεί ως ένας σηµαντικός µηχανισµός, που προωθεί την αύξηση και ανάπτυξη του λευχαιµικού κλώνου. Αποτυχία στην εκπλήρωση της απόπτωσης οδηγεί σε αύ-

18 ξηση των µεταλλάξεων και των χρωµοσωµικών αλλοιώσεων και µπορεί να είναι η αιτία της γενωµικής αστάθειας, που αποτελεί χαρακτηριστικό των λευχαιµικών κυττάρων. Τελευταία, µια οικογένεια αναστολέων της απόπτωσης, οι IAPs (Inhibition of Apoptosis Protein family), έχει δειχθεί ότι παίζει σηµαντικό ρόλο στην αναστολή της απόπτωσης σε διάφορα κακοήθη αιµατολογικά νοσήµατα. Η survivin αποτελεί το µικρότερο και νεότερο µέλος των IAPs και παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, διότι υπερεκφράζεται στα περισσότερα καρκινικά κύτταρα του ανθρώπου, αλλά δεν ανιχνεύεται σε τελικά διαφοροποιηµένους φυσιολογικούς ιστούς. Η πρωτεΐνη αυτή έχει διττό ρόλο και εµπλέκεται τόσο στην αναστολή της απόπτωσης, όσο και στην προαγωγή της κυτταρικής διαίρεσης, µε αποτέλεσµα να αποτελεί ένα σηµαντικό αποπτωτικό σηµείο ελέγχου κατά τη διάρκεια της µίτωσης, που ρυθµίζει το ισοζύγιο ανάµεσα στον κυτταρικό θάνατο και την κυτταρική επιβίωση. Στην εργασία αυτή µελετήθηκε για πρώτη φορά η έκφραση της survivin σε ηλικιωµένους ασθενείς µε ΟΜΛ, µε τη µέθοδο της Real-Time RT-PCR. Η Real- Time RT-PCR αποτελεί µια µέθοδο ποσοτικού προσδιορισµού υψηλής ευαισθησίας και ακρίβειας, η οποία µπορεί να αποκαλύψει ακόµη και χαµηλά επίπεδα της έκφρασης mrna ενός γονιδίου. Στην παρούσα εργασία πραγµατοποιήθηκε επίσης για πρώτη φορά, ταυτόχρονη µελέτη των επιπέδων mrna της survivin σε δείγµατα µυελού των οστών και περιφερικού αίµατος, σε ηλικιωµένους ασθενείς µε ΟΜΛ κατά τη διάγνωση, κατά την πλήρη αιµατολογική ύφεση µετά από χηµειοθεραπεία, καθώς και σε υγιείς µάρτυρες. Τα ευρήµατα από τη µελέτη των επιπέδων mrna, που προέκυψαν µε τη µέθοδο της Real-Time RT-PCR συσχετίσθηκαν µε τα ευρήµατα από τη µελέτη του ποσοτικού προσδιορισµού της πρωτεΐνης survivin στον ορό ασθενών και υγιών µαρτύρων, που πραγµατοποιήθηκε µε την ανοσοενζυµική µέθοδο ELISA. Σκοπός της παρούσας µελέτης είναι να απαντηθούν τα εξής ερωτήµατα: Α) Υπάρχει έκφραση survivin σε ηλικιωµένους ασθενείς µε ΟΜΛ και αν ναι, πώς σχετίζεται µε την έκφραση σε φυσιολογικά άτοµα; Β) Μεταβάλλεται η έκφραση της survivin στους ασθενείς κατά τη διάγνωση και την πλήρη αιµατολογική ύφεση, µετά από χηµειοθεραπεία και αν ναι, µε ποιόν τρόπο; Γ) Μπορεί η έκφραση της survivin να αποτελέσει δείκτη της ενεργότητας της νόσου ή δείκτη επερχόµενης υποτροπής; 18

19 ) Μπορεί η έκφραση της survivin να συσχετισθεί µε γνωστούς προγνωστικούς παράγοντες για την ΟΜΛ και την απάντηση των ασθενών στη θεραπεία και να αποτελέσει έναν δυσµενή προγνωστικό παράγοντα, για την πορεία της νόσου ή/και αντίστασης στη χηµειοθεραπευτική αγωγή; Ε) Μπορεί η έκφραση της survivin να αποτελέσει στόχο για τη µοριακή θεραπευτική αντιµετώπιση της ΟΜΛ, µε απώτερο σκοπό την ελάττωση της χρήσης κυτταροτοξικών παραγόντων, γεγονός ιδιαίτερα σηµαντικό για την ευαίσθητη οµάδα των ηλικιωµένων ασθενών; Η µελέτη της έκφρασης της survivin, τόσο σε επίπεδο mrna, όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο µπορεί να βοηθήσει στην κατανόηση των µοριακών µηχανισµών, που εµπλέκονται στην παθογένεση της ΟΜΛ και να συµβάλει στην πρόγνωση της νόσου στους ηλικιωµένους ασθενείς. Η µελέτη αυτή αποτελείται από δύο µέρη, το γενικό και το ειδικό. Στο γενικό µέρος περιγράφεται η Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία και δίνεται έµφαση στην παθογένεση της νόσου, σε προγνωστικούς παράγοντες, στη γενετική της ΟΜΛ και τη µοριακή σηµατοδότηση, στα κυτταρογενετικά ευρήµατα που χαρακτηρίζουν τη νόσο και ιδιαίτερα στις χρωµοσωµικές µετατοπίσεις και τις ση- µειακές µεταλλάξεις και τέλος, στα ιδιαίτερα βιολογικά γνωρίσµατα των ηλικιωµένων ασθενών µε ΟΜΛ, που καθιστούν τη νόσο βιολογικά διακριτή, σε σχέση µε αυτή νεότερων ασθενών. Επιπλέον, στο γενικό µέρος περιγράφεται αναλυτικά η απόπτωση και τα µονοπάτια που τη διέπουν, ενώ γίνεται ιδιαίτερη µνεία στους µηχανισµούς και τους παράγοντες που ρυθµίζουν τον προγραµµατισµένο κυτταρικό θάνατο. Περαιτέρω αναλύεται η οικογένεια των πρωτεϊνών IAPs, που όπως αναφέρθηκε αποτελούν αναστολείς της απόπτωσης και ειδικότερα η πρωτεΐνη survivin. Για τη survivin περιγράφονται η δοµή, ο προαγωγέας της, οι ισοµορφές της, ο ρόλος της καθώς και ο ρόλος των ισοµορφών, η έκφρασή της και η ρύθµιση της έκφρασης, ενώ τέλος αναλύεται η σηµασία της στη θεραπεία του καρκίνου. Στο ειδικό µέρος περιγράφονται οι ασθενείς που έλαβαν µέρος στη µελέτη, το υλικό που χρησιµοποιήθηκε, καθώς και οι τεχνικές και µέθοδοι που εφαρµόσθηκαν. Στη συνέχεια αναλύονται και συγκρίνονται τα αποτελέσµατα που προέκυψαν και ακολουθούν η συζήτηση των αποτελεσµάτων και η συσχέτισή τους µε τα έως τώρα βιβλιογραφικά δεδοµένα. Τέλος, αναφέρονται τα κύρια 19

20 συµπεράσµατα, η περίληψη στην ελληνική και αγγλική και η βιβλιογραφία που χρησιµοποιήθηκε. Η µελέτη αυτή πραγµατοποιήθηκε στο Αιµατολογικό Τµήµα της Β Παθολογικής Κλινικής του Α.Π.Θ. µε υπεύθυνο του Αιµατολογικού Εργαστηρίου τον Καθηγητή Παθολογίας-Αιµατολογίας κ. Ιωάννη Κλωνιζάκη, τον οποίο ιδιαιτέρως ευχαριστώ που πρωτοστάτησε στα όνειρά µας για έρευνα στη Μοριακή Βιολογία και στάθηκε στο τιµόνι, οδηγώντας µας επάξια σε φουρτούνες και µπουνάτσες. Τα λόγια είναι λίγα για να τον ευχαριστήσω για όλα όσα µου έµαθε, για το γεγονός ότι έκανε πραγµατικότητα ότι θεωρούνταν ανέφικτο, µα κυρίως για την αµέριστη υποστήριξη και συµπαράστασή του όλα αυτά τα χρόνια, που λειτούργησε ως «σιδερένια γροθιά σε βελούδινο γάντι». Αισθάνοµαι επίσης την ανάγκη να ευχαριστήσω και να εκφράσω τη βαθιά µου ευγνωµοσύνη στην επιβλέπουσα της παρούσας διατριβής, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παθολογίας-Αιµατολογίας κ. Ελισσάβετ Ιωαννίδου για την ανάθεση του θέµατος, αλλά και για τη συνεχή επίβλεψη, καθοδήγηση και ηθική συ- µπαράσταση καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής, µέχρι την ολοκλήρωσή της. Η υποστήριξη και η αγάπη της ήταν ανεκτίµητες και µε βοήθησαν να αντιµετωπίσω µε σθένος τις δυσκολίες που προέκυψαν, ενώ χωρίς την υποµονή και τη συνεχή ενθάρρυνσή της η ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής δε θα ήταν εφικτή. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παθολογίας-Αιµατολογίας κ. Στυλιανή Χαραλαµπίδου, µέλος της τρι- µελούς συµβουλευτικής επιτροπής, για την αγάπη και τις σοφές συµβουλές της που αποτέλεσαν ορόσηµο για µένα, καθώς και για την ακεραιότητα και ηθικότητα του χαρακτήρα της, που µε ενέπνευσαν τόσο σε προσωπικό, όσο και σε επαγγελµατικό επίπεδο. Στο σηµείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τη ιευθύντρια του Τοµέα Παθολογίας και ιευθύντρια της Β Παθολογικής Κλινικής του Α.Π.Θ. Καθηγήτρια Παθολογίας-Ανοσολογίας κ. Μαρία Ραπτοπούλου-Γιγή, που µε ευχαρίστηση δέχθηκε να εργαστώ στο Αιµατολογικό Εργαστήριο της Β Παθολογικής Κλινικής, µου έδωσε απεριόριστη ελευθερία κινήσεων στη διεξαγωγή της έρευνας και µε ιδιαίτερη προθυµία µε βοήθησε µε τις εύστοχες παρατηρήσεις και υποδείξεις της, στην ολοκλήρωση της διατριβής µου. Ιδιαιτέρως ευχαριστώ τα µέλη της εξεταστικής επιτροπής, τον Αναπληρωτή Καθηγητή Παθολογίας-Αιµατολογίας της Β Προπαιδευτικής Κλινικής του 20

21 Νοσοκοµείου ΑΧΕΠΑ, κ. Αθανάσιο Παπαδόπουλο, τη Λέκτορα Αιµατολογίας της Β Παθολογικής Κλινικής του Νοσοκοµείου ΑΧΕΠΑ κ. Μαρία Παπαϊωάννου και την Καθηγήτρια Βιοπαθολογίας της Β Παθολογικής Κλινικής του Ιπποκράτειου Νοσοκοµείου κ. Ελένη Ορφανού-Κουµερκερίδου για τις σηµαντικές συµβουλές και υποδείξεις τους, καθώς και τη σηµαντική βοήθειά τους στην περάτωση της διατριβής. Πολλές ευχαριστίες επίσης οφείλω στην Αιµατολόγο της Παθολογικής Κλινικής κ Ευδοκία Μανδαλά για τη βοήθειά της στη συλλογή του υλικού, µα κυρίως για τη µεγάλη της προθυµία να απαντήσει σε κάθε µου απορία και να βοηθήσει στη λήψη του ιστορικού και των εργαστηριακών ευρηµάτων, κάθε ασθενούς. Θα ήταν µεγάλη µου παράλειψη να µην ευχαριστήσω τον δάσκαλό µου Παιδίατρο-Γενετιστή της Β Παιδιατρικής Κλινικής του Νοσοκοµείου Α- ΧΕΠΑ, κ. Νικόλαο Βογιατζή για την εκµάθηση των κυτταρογενετικών τεχνικών, για την προθυµία του να λύσει κάθε µικρό και µεγάλο µου πρόβληµα, µα κυρίως για την απεριόριστη υποστήριξη και αγάπη, που µου έδειξαν ο ίδιος και η οικογένειά του. Ευχαριστώ επίσης την Επικ. Καθηγήτρια του Τµήµατος Βιολογίας του Α.Π.Θ. κ Αθηνά Φουντούλη για την αγάπη και υποστήριξή της, που µε βοήθησαν να ξεπεράσω δύσκολες καταστάσεις και µου έδωσαν δύναµη και κουράγιο, καθώς και την Αναπλ. Καθηγήτρια του Τµήµατος Βιολογίας κ. Αναστασία Κουβάτση για την καθοδήγηση και τις συµβουλές της, µα κυρίως για το γεγονός ότι ήταν πάντα διαθέσιµη και πρόθυµη να µε βοηθήσει σε κάθε πειραµατική δυσκολία που αντιµετώπισα. ε θα πρέπει να αµελήσω να ευχαριστώ τον Καθηγητή Παθολογίας-Γηριατρικής κ. ηµήτρη Οικονοµίδη για τη βοήθειά του στη συλλογή του υλικού της παρούσας µελέτης, καθώς και την Αιµατολόγο-Α Επι- µελήτρια Ε.Σ.Υ. κ. Ευθυµία Βλαχάκη για τη βοήθειά της στη συλλογή του υλικού, για τις συµβουλές της σε επιστηµονικό επίπεδο, καθώς και για τη συνεργασία της στα πρωτόκολλα µοριακής βιολογίας. Τις ευχαριστίες µου θέλω επίσης να εκφράσω στον Βιολόγο κ. Αθανάσιο Καλογερίδη για τη βοήθειά του κυρίως στο ξεκίνηµα αυτής της διατριβής, για τις επιστηµονικές συµβουλές του σε πολλά από τα στάδια της πειραµατικής διαδικασίας και για την αγάπη του για τη Μοριακή Βιολογία, που ενέπνευσε πολλές συζητήσεις µας, γύρω από νέες επιστηµονικές ιδέες. 21

22 Ευχαριστώ ακόµη τον φίλο µου ειδικευόµενο Αιµατολόγο κ. Φίλιππο Κλωνιζάκη για την άψογη συνεργασία του καθ όλη τη διάρκεια της διατριβής, για τη βοήθεια και έµπρακτη συµπαράστασή του κατά την εφαρµογή των µοριακών πρωτοκόλλων και τη συγγραφή των επιστηµονικών εργασιών, µα κυρίως για τις ευχάριστες στιγµές που περάσαµε. Τους ειδικευόµενους Παθολόγους κ. Αλέξανδρο Σαραντόπουλο και κ. Κώστα Τσέλιο, καθώς και τον ειδικευόµενο Αιµατολογίας κ Στέφανο ηµούδη ευχαριστώ θερµά για τις συµβουλές τους, την υποστήριξή τους, καθώς και για την ευχάριστη νότα που έδιναν πάντα στο εργαστήριο. Θα ήθελα ακόµη να ευχαριστήσω τον ειδικευόµενο Αιµατολογίας κ. Μιχάλη ιαµαντίδη για τη βοήθειά του στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων, καθώς και τη βιοχηµικό κ. Ιωάννα Κυριακοπούλου για τη συνεργασία της καθ όλη τη διάρκεια της διατριβής. ε θα πρέπει να λησµονήσω επίσης να ευχαριστήσω το διοικητικό στέλεχος κ. Ειρήνη Κωτσίδου για την υποστήριξη και τη συµπαράστασή της, σε όλες τις ευχάριστες και δυσάρεστες στιγµές, τον ειδικευόµενο της Καρδιολογίας κ. Χρόνη Αντωνίτση για τις πολύτιµες συµβουλές του, καθώς και την παρασκευάστρια του Εργαστηρίου Γενετικής της Β Παιδιατρικής Κλινικής του Νοσοκοµείου ΑΧΕΠΑ κ. Ευγενία Βαγγέλη, για τη βοήθειά της στην εκµάθηση των κυτταρογενετικών τεχνικών και τη συµπαράστασή της. Τη φίλη µου και συνάδελφο βιολόγο κ. Αυγητίδου Αγγελική ευχαριστώ θερµά για την βοήθεια και συµπαράστασή της τόσο σε προσωπικό, όσο και σε επιστηµονικό επίπεδο και για το γεγονός ότι µοιράστηκε µαζί µου όλες τις προκλήσεις, τις απογοητεύσεις, µα κυρίως τις ευχάριστες στιγµές αυτής της διατριβής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τη φίλη µου και παρασκευάστρια του Εργαστηρίου Αιµατολογίας κ. Ιωάννα Χριστοδούλου για την βοήθεια που µου παρείχε σε κάθε στάδιο της έρευνάς µου και για το γεγονός ότι µε µεγάλη προθυµία και µε ζεστό χαµόγελο αντιµετώπιζε κάθε µικρή και µεγάλη δυσκολία. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Πρόεδρο και τα µέλη του. Σ. του Ιδρύµατος Μποδοσάκη για την έµπρακτη βοήθειά τους και για τη χορηγία εξοπλισµού και µηχανηµάτων, που όχι µόνο ήταν απαραίτητα για την εφαρµογή των ερευνητικών µοριακών πρωτοκόλλων, αλλά µας επέτρεψαν να κάνουµε πράξη τις επιστηµονικές µας ιδέες και να ικανοποιήσουµε τη δίψα µας για έρευνα. 22

23 Θα ήθελα ακόµη να ευχαριστήσω το Ίδρυµα Κρατικών Υποτροφιών για την οικονοµική ενίσχυση που µου παρείχε, µετά την επιτυχία µου στις γραπτές εξετάσεις του Ιδρύµατος και συγκεκριµένα στην ειδικότητα «Γενετική». Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω µέσα απ όλη µου την καρδιά την οικογένειά µου, τους γονείς µου Βασίλη και Μαρία και τον αδερφό µου Ορέστη, για την αµέριστη συµπαράσταση, για τα πολύτιµα εφόδια που µου παρείχαν και για το γεγονός ότι µε βοήθησαν µε όλες τους τις δυνάµεις και µε ατέλειωτη αγάπη, να σταθώ µε αξιοπρέπεια απέναντι στους άλλους, µα κυρίως απέναντι στον εαυτό µου. Τελευταίο θα ήθελα να ευχαριστήσω τον αγαπηµένο µου Νίκο Στράκα, που µε απεριόριστη υποστήριξη και αγάπη, στάθηκε στο πλευρό µου, µοιράστηκε τα άγχη και τους φόβους µου και ταξίδεψε µαζί µου, δίνοντας φτερά στα όνειρά µου. 23

24

25 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

26

27 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία Η Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία (ΟΜΛ) είναι µια ετερογενής κλωνική διαταραχή των άωρων αιµοποιητικών κυττάρων του µυελού των οστών, τα οποία έχουν χάσει την ικανότητα ρύθµισης της αυτοανανεωτικής τους λειτουργίας και της διαφοροποίησης, προς τα ώριµα κύτταρα του αίµατος 1. Η κλινική εκτίµηση, η θεραπεία και η πρόγνωση της ΟΜΛ έχουν αλλάξει δραµατικά τις τελευταίες δύο δεκαετίες. Οι µοριακές, κυτταρογενετικές και ανοσολογικές αναλύσεις έ- χουν συνεισφέρει στην κατανόηση της παθογένεσης και πρόγνωσης της νόσου. Απουσία θεραπείας, η ΟΜΛ είναι θανατηφόρος νόσος. Ο θάνατος προκαλείται από σοβαρή λοίµωξη, αιµορραγία ή/και οργανική διήθηση µέσα σε χρονικό διάστηµα λίγων µηνών. Η ΟΜΛ αποτελεί την πιο συχνή λευχαιµική διαταραχή και ως εκ τούτου την πιο συχνή αιτία θανάτου από λευχαιµία στους ενήλικες 2. Η αγωγή για ασθενείς κάτω των 60 ετών, περιλαµβάνει εντατική χηµειοθεραπεία (Χ/Θ) και µπορεί να οδηγήσει σε ύφεση σε ποσοστό 20-75%, ανάλογα µε τις κυτταρογενετικές διαταραχές 3. Ωστόσο, η Χ/Θ έχει κατά κανόνα πτωχά αποτελέσµατα στους ηλικιωµένους ασθενείς, εξαιτίας της αντίστασης που παρατηρείται πολύ συχνά στη χηµειοθεραπευτική αγωγή, καθώς και της συνύπαρξης και άλλων προβληµάτων υγείας που περιπλέκουν περισσότερο την κατάστασή τους. Χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι ένα ποσοστό µικρότερο του 10% ηλικιωµένων ασθενών µε ΟΜΛ ωφελείται από τη Χ/Θ Επιδηµιολογία και Αιτιολογία Η ΟΜΛ αποτελεί το 34% όλων των λευχαιµιών και είναι η πιο συχνή οξεία λευχαιµία στους ενήλικες (85% των περιστατικών), ενώ στην παιδική ηλικία συναντάται πιο σπάνια (15-20% των περιστατικών) 1,4. Η µέση ηλικία διάγνωσης της ΟΜΛ είναι τα 64 έτη 5-7. Η συχνότητα εµφάνισης της νόσου είναι 3,8 για κάθε του πληθυσµού, ενώ αυξάνει ραγδαία για ηλικίες άνω των 65 ετών και ανέρχεται στο 17,9 για κάθε Η συχνότητα της ΟΜΛ υπολογίζεται σε 3,5/ στην ηλικία των 50 ετών, 15/ στα 70 και 35/ στην ηλικία των 90 ετών. Έχει βρεθεί ότι στην Ευρώπη προκύπτουν κάθε χρόνο περίπου νέες περιπτώσεις 9, ενώ η ΟΜΛ ευθύνεται για το 1,2% των θανάτων από καρκίνο στις ΗΠΑ 10. Η συχνότητα της δευτεροπαθούς ΟΜΛ, δηλ. 27

28 της ΟΜΛ που προκύπτει µετά από κάποιο άλλο νόσηµα ή ως αποτέλεσµα Χ/Θ ή ακτινοβολίας για άλλη κακοήθεια, φαίνεται να είναι ιδιαίτερα αυξηµένη και α- ποτελεί το 10-20% όλων των περιστατικών της ΟΜΛ στους ενήλικες 11. Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί ότι η νόσος είναι πιο συχνή στους άνδρες σε σχέση µε τις γυναίκες, σε αναλογία 3:2 3, ενώ φαίνεται να παρουσιάζει και γεωγραφική κατανοµή. Τα µεγαλύτερα ποσοστά εµφανίζονται στη Β. Αµερική, στην Ευρώπη και στην Ωκεανία και τα µικρότερα στην Ασία και στη Λατινική Αµερική 12,13. Αν και έχουν περιγραφεί σπάνιες οικογενείς περιπτώσεις ΟΜΛ, φαίνεται ότι στις περισσότερες περιπτώσεις οι λευχαιµογόνες µεταλλάξεις είναι επίκτητες κατά τη διάρκεια της ζωής, παρά κληρονοµικές. Βέβαια υπάρχει η πιθανότητα σποραδικές περιπτώσεις ΟΜΛ να οφείλονται σε προκαθορισµένες βλάβες που συµβαίνουν κατά την εµβρυϊκή ζωή, οι οποίες είτε επιταχύνουν τον ρυθµό απόκτησης νέων µεταλλάξεων (αστάθεια του DNA), είτε οφείλονται σε βλάβες των µηχανισµών επιδιόρθωσης. Παρόλο που ως αιτιολογικοί παράγοντες αναφέρονται το βενζόλιο 14, η ιονίζουσα ακτινοβολία ή οι αλκυλιωτικοί χηµειοθεραπευτικοί παράγοντες 15, οι περισσότεροι ασθενείς δε φαίνεται να σχετίζονται µε έκθεση σε κάποιον από αυτούς τους παράγοντες. Η ιονίζουσα ακτινοβολία µπορεί να προκαλέσει θραύσεις χρωµοσωµάτων. Άτοµα που επέζησαν της ατοµικής βόµβας στο Ναγκασάκι και στη Χιροσίµα 16, αλλά και άτοµα που υποβλήθηκαν σε ακτινοθεραπεία, εµφάνισαν σε αυξηµένο ποσοστό οξεία λευχαιµία. Οι λευχαιµίες εµφανίστηκαν 1,5 έτος µετά την έκθεση στην ακτινοβολία και είχαν µέγιστη συχνότητα στα 6-7 έτη 15. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι η ΟΜΛ εµφανίζεται πιο συχνά στους εργάτες των πυρηνικών εργοστασίων, σε σχέση µε τους κατοίκους παρακείµενων περιοχών 17,18. Για την ανάπτυξη της ΟΜΛ ενοχοποιούνται επίσης το βενζόλιο και τα παράγωγά του 14. Το κάπνισµα αποτελεί την πιο συχνή αιτία έκθεσης σε βενζόλιο και αυξάνει την πιθανότητα εµφάνισης ΟΜΛ κατά 1,2-2,3 φορές 19. Τα τελευταία έτη διερευνάται και η επίδραση άλλων χηµικών ουσιών (χρωστικές µαλλιών, εντοµοκτόνα κ.ά.), χωρίς ωστόσο να προκύπτουν σαφή συµπεράσµατα 15. Ένα ποσοστό 10-15% των ασθενών µε ΟΜΛ αναπτύσσει τη νόσο, µετά από αγωγή µε χηµειοθεραπευτικά φάρµακα, που χρησιµοποιούνται συνήθως για τη θεραπεία συµπαγών όγκων. Υπάρχουν δύο τύποι ΟΜΛ που σχετίζονται µε τη χηµειοθεραπεία 20. Ο πιο κοινός εµφανίζεται 5-10 χρόνια µετά την έκθεση σε 28

29 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ αλκυλιωτικούς παράγοντες και χαρακτηρίζεται από µονοσωµίες ή ελλείµµατα των µακρών σκελών των χρωµοσωµάτων 5 ή 7. Ο δεύτερος τύπος παρατηρείται 1-5 χρόνια, µετά τη θεραπεία µε φάρµακα όπως η doxorubicin ή η etoposide, τα οποία αλληλεπιδρούν µε την DNA τοποϊσοµεράση II. Η περίπτωση αυτή εµφανίζεται καθαρά σε παιδιά που έλαβαν etoposide για τη θεραπεία της Οξείας Λεµφοβλαστικής Λευχαιµίας (ΟΛΛ), από τα οποία ένας αριθµός εµφάνισε ΟΜΛ, σύντοµα µετά τη θεραπεία Οι πιο συχνές κυτταρογενετικές ανωµαλίες περιλαµβάνουν αµοιβαίες αντιµεταθέσεις της χρωµοσωµικής περιοχής 11q23, µε αποτέλεσµα να διακόπτεται η συνέχεια του γονιδίου MLL 20. ευτεροπαθείς ΟΜΛ παρατηρούνται σε επιζώντες µετά από Αυτόλογη Μεταµόσχευση Μυελού των Οστών (ΑΜΜΟ). Οι ασθενείς αυτοί παρουσιάζουν αυξηµένο κίνδυνο εµφάνισης κλωνικής αιµοποίησης και Μυελοδυσπλαστικού Συνδρόµου (Μ Σ). Επίσης, ασθενείς µε νόσο Hodgkin, που θεραπεύτηκαν µε κυτταροστατικά φαρ- µάκα εµφάνισαν σε µικρό ποσοστό ΟΜΛ, µετά από 4-5 έτη 15. Τέλος, θα πρέπει να αναφερθεί ότι κληρονοµικές καταστάσεις που προδιαθέτουν σε χρωµοσωµική αστάθεια, όπως είναι η αναιµία Fanconi, το σύνδροµο Bloom και το σύνδροµο Down ενέχουν αυξηµένο κίνδυνο ανάπτυξης ΟΜΛ. Μελέτες σε οικογένειες λευχαιµικών ασθενών έδειξαν αυξηµένο κίνδυνο εµφάνισης οξείας λευχαιµίας στα υπόλοιπα µέλη της οικογένειας, συγκριτικά µε τον φυσιολογικό πληθυσµό Παθογένεση Οι αιτιολογικοί παράγοντες που αναφέρθηκαν οδηγούν σε χρωµοσωµικές αλλοιώσεις ή κακοήθεις µεταλλάξεις ενός αρχέγονου αιµοποιητκού κυττάρου (stem cell) ή ενός σχετικά πιο διαφοροποιηµένου άωρου προγονικού κυττάρου του αίµατος. Οι αλλοιώσεις αυτές προσφέρουν στο λευχαιµικό κύτταρο ένα πλεονέκτηµα επιβίωσης και αυτοανανέωσης σε συνδυασµό µε αναστολή της διαφοροποίησής του. Έτσι, προκύπτει ένας λευχαιµικός πληθυσµός που κυριαρχεί στους περισσότερους χώρους της αιµοποίησης και καταστέλλει τους φυσιολογικούς πληθυσµούς των αιµοποιητικών κυττάρων. Ο πληθυσµός αυτός καλείται µονοκλωνικός, γιατί προέρχεται από ένα αρχικό κύτταρο και περιέχει τις γενετικές ανωµαλίες του κυττάρου αυτού. Η αναστολή της ανάπτυξης των φυ- 29

30 σιολογικών αιµοποιητικών κυττάρων έχει ως αποτέλεσµα την εµφάνιση αναιµίας, ουδετεροπενίας και θροµβοπενίας. Τα κυριότερα συµπτώµατα, εργαστηριακά ευρήµατα και αίτια θανάτου των ασθενών µε ΟΜΛ οφείλονται στη µεγάλη καταστολή της φυσιολογικής αιµοποίησης. Οι γενετικές µεταλλάξεις της ΟΜΛ είναι δυνατό να επηρεάζουν τις ακόλουθες διαδικασίες των λευχαιµικών κυττάρων: α) τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό, β) την απόπτωση, ή γ) την κυτταρική διαφοροποίηση Κυτταρικός πολλαπλασιασµός Οι Gilliland και συν. τα τελευταία χρόνια πρότειναν ότι τα λευχαιµικά κύτταρα της ΟΜΛ είναι δυνατό να εµφανίζουν δύο τύπους γενετικής βλάβης 21,22. Ο πρώτος τύπος έχει ως αποτέλεσµα τη συνεχή ενεργοποίηση και δραστηριότητα υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας, όπως είναι ο RAS, ή υποδοχέων τυροσινικής κινάσης, όπως είναι ο FLT3 και ο c-kit. Μέσα από έναν καταρράκτη ενδοκυτταρικών αντιδράσεων, η συνεχής ενεργοποίηση αυτών των υποδοχέων προσδίδει ένα πλεονέκτηµα πολλαπλασιασµού, που οδηγεί στην κλωνική εξάπλωση των µεταλλαγµένων αιµοποιητικών προγονικών κυττάρων. Ωστόσο, οι ανωµαλίες των παραπάνω υποδοχέων στους επίµυς παράγουν µια µυελοϋπερπλαστική διαταραχή, και όχι ΟΜΛ. Ο δεύτερος τύπος γενετικής βλάβης χαρακτηρίζεται από υπερέκφραση των HOX γονιδίων ή χιµαιρικών γονιδίων, που προέρχονται από τις κυτταρογενετικές ανωµαλίες t(8;21) και inv(16), οι οποίες εµποδίζουν τη διαφοροποίηση της µυελικής σειράς. Όπως ο πρώτος τύπος, έτσι και ο δεύτερος, δεν προκαλεί λευχαιµία σε µοντέλα επιµύων 23. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η ΟΜΛ πιθανότατα αναπτύσσεται µόνο στην περίπτωση, που και οι δύο τύποι γενετικής βλάβης είναι παρόντες. Το «µοντέλο των δύο χτυπηµάτων» υποστηρίζεται και από το γεγονός ότι πιο συχνά εµφανίζονται ταυτόχρονα δύο βλάβες, µια πρώτου και µια δεύτερου τύπου, παρά δύο βλάβες πρώτου ή δύο βλάβες δεύτερου τύπου, µαζί. Το µοντέλο αυτό εξηγεί και το γιατί η t(8;21) και η inv(16) ΟΜΛ, συχνά συνοδεύονται από µεταλλάξεις των γονιδίων c-kit 24-28, FLT3 29,30 και RAS 31. Πολλά φάρµακα που βρίσκονται σε πειραµατικό στάδιο για τη θεραπεία της ΟΜΛ στοχεύουν στο µεταλλαγµένο FLT3 γονίδιο ή στο σηµατοδοτικό µονοπάτι του RAS 32. Ωστόσο, 30

31 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ το µοντέλο αυτό δεν εξηγεί ικανοποιητικά την παθογένεση της ΟΜΛ µε µονοσωµία 5 ή 7, αλλά µπορεί να τροποποιηθεί αν συµπεριληφθούν και διάφοροι επιγενετικοί παράγοντες 33. Πολλά γονίδια που θεωρούνται ογκοκατασταλτικά υπερµεθυλιώνονται στην ΟΜΛ, µε αποτέλεσµα να σιωπούν και να µη µεταγράφονται 34. Η υπερµεθυλίωση είναι λειτουργικά ισοδύναµη µε τις γενετικές µεταλλάξεις, διότι είναι µόνιµη και δεν αναστρέφεται. εδοµένα για επιγενετικές τροποποιήσεις στην παθογένεση της ΟΜΛ, προκύπτουν από τη δράση παραγόντων υποµεθυλίωσης, όπως είναι το decitabine 35, ή αναστολέων των αποακετυλασών των ιστονών, όπως είναι το βαλπροϊκό οξύ, τα οποία ίσως να επιτρέπουν τη µεταγραφή των γονιδίων που σιωπούν Απόπτωση Σήµερα υπάρχουν αρκετές ενδείξεις που υποστηρίζουν την άποψη ότι τα παθολογικά κύτταρα στην ΟΜΛ, δεν πολλαπλασιάζονται πιο γρήγορα από τα φυσιολογικά. Πράγµατι, η διάρκεια του κυτταρικού κύκλου των λευχαιµικών βλαστών είναι ανάλογη µε αυτή των φυσιολογικών βλαστών 37. Στην περίπτωση των λεµφικών κακοηθειών, υπερέκφραση της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl- 2, λόγω χρωµοσωµικής µετατόπισης που προκαλεί διαταραχή των µεταγραφικών παραγόντων, οδηγεί φανερά σε κακοήθη εξαλλαγή 38,39. Για άγνωστους µέχρι στιγµής λόγους, η µετατόπιση του Bcl-2 δεν είναι συχνή στην ΟΜΛ. Ωστόσο, φαίνεται ότι διαταραχή των φυσιολογικών αποπτωτικών µηχανισµών παίζει ρόλο στην εµφάνιση της νόσου. Έχει αναφερθεί για παράδειγµα, ότι η t(8;21) χιµαιρική πρωτεΐνη AML1-ETO ενεργοποιεί µεταγραφικά το γονίδιο Bcl Μια άλλη οικογένεια πρωτεϊνών, οι IAPs (Inhibiotor of Apoptosis Proteins), φαίνεται επίσης να παίζει σηµαντικό ρόλο στην αναστολή της απόπτωσης. Το µικρότερο και νεότερο µέλος αυτής της οικογένειας, που ονοµάζεται survivin έχει συγκεντρώσει το ενδιαφέρον των ερευνητών, για τον λόγο ότι υπερεκφράζεται στα περισσότερα καρκινικά κύτταρα του ανθρώπου, αλλά δεν ανιχνεύεται σε τελικά διαφοροποιηµένους φυσιολογικούς ιστούς. Αν και η διαταραχή της απόπτωσης στην ΟΜΛ έχει τεκµηριωθεί, η µοριακή έκφραση αυτής δεν έχει διευκρινιστεί και αποτελεί πεδίο αντικρουόµενων απόψεων. 31

32 Κυτταρική διαφοροποίηση Είναι σαφές ότι διαταραχές της διαφοροποίησης ή της ωρίµανσης των κυττάρων της µυελικής σειράς παίζουν σηµαντικό ρόλο στην παθογένεση της ΟΜΛ. Αυτό είναι προφανές λόγω της αδιαφοροποίητης κατάστασης στην οποία βρίσκονται οι λευχαιµικοί βλάστες. Ο ακριβής µηχανισµός µε τον οποίον οι λευχαιµογόνες πρωτεΐνες προκαλούν αναστολή της διαφοροποίησης είναι αβέβαιος. Ωστόσο, πειραµατικές µελέτες δείχνουν την ικανότητα των πρωτεϊνών που προέρχονται από αντιµετάθεση και σύντηξη γονιδίων, να αναστέλλουν τη διαφοροποίηση που επάγεται από αυξητικούς παράγοντες της κοκκιώδους σειράς, σε συστήµατα κυτταρικών καλλιεργειών. Για παράδειγµα, η πρωτεΐνη που παράγεται από την αντιµετάθεση και σύντηξη των γονιδίων AML1-ETO, όταν εκφράζεται στη µυελική κυτταρική σειρά των επιµύων 32D, ανακόπτει την ικανότητα του G-CSF, προς ουδετεροφιλική διαφοροποίηση 41. Πολλά δεδοµένα ωστόσο υποστηρίζουν την άποψη ότι µια παρόµοια αναστολή της διαφοροποίησης, παρόλο που είναι απαραίτητη για την εκδήλωση της ΟΜΛ, µπορεί να µην είναι επαρκής για τη λευχαιµική µεταµόρφωση. Έτσι, η AML1-ETO πρωτεΐνη δεν προκαλεί ανάπτυξη αιµοποιητικών κυτταρικών σειρών, χωρίς την επίδραση αυξητικών παραγόντων και δε φαίνεται να είναι επαρκής για τη µεταµόρφωση των προγονικών αιµοποιητικών κυττάρων, σε µοντέλα επιµύων. Φαίνεται ότι για τη λευχαιµική µεταµόρφωση απαιτούνται πρόσθετα γενετικά γεγονότα, τα οποία ακόµη δεν έχουν καθοριστεί Το λευχαιµικό stem cell Η ύπαρξη του λευχαιµικού stem cell (Leukemic Stem Cell, LSC) είχε υποτεθεί ότι προκαλεί την ΟΜΛ εδώ και τριάντα χρόνια. Ωστόσο, η απόδειξη της ύπαρξής του έγινε δυνατή τα τελευταία χρόνια, µετά την ανάπτυξη µεθόδων κυτταρικής επιλογής και ειδικών λειτουργικών αναλύσεων, που επιτρέπουν να παρατηρηθεί η αναπτυξιακή πορεία επιλεγµένων κυττάρων. Έτσι, σήµερα είναι δυνατή η αποµόνωση και ο χαρακτηρισµός των κακοήθων stem cells, τόσο για την οξεία, όσο και για τη Χρόνια Μυελογενή Λευχαιµία (ΧΜΛ). Πολλές µελέτες αποδεικνύουν τον κεντρικό ρόλο που παίζει το λευχαιµικό stem cell στην 32

33 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΟΜΛ και επισηµαίνουν την ανάγκη θεραπευτικών στρατηγικών, οι οποίες θα στοχεύουν στον πληθυσµό των λευχαιµικών stem cells Ιδιότητες του λευχαιµικού stem cell Η ανακάλυψη του λευχαιµικού stem cell έγινε µε την εφαρµογή µεθόδων που χρησιµοποιήθηκαν αρχικά για τον χαρακτηρισµό του φυσιολογικού αιµοποιητικού stem cell (Haemopoietic Stem Cell, HSC) 42. Βασική ήταν η αποµόνωση κυτταρικών πληθυσµών µε τη χρήση µονοκλωνικών αντισωµάτων που στοχεύουν σε επιφανειακούς υποδοχείς. Κυτταρικοί υποπληθυσµοί που εµφάνιζαν τις απαραίτητες προϋποθέσεις για τον χαρακτηρισµό τους ως stem cells δηλ. είχαν αυτοανανεωτική ικανότητα, πολυδυναµία και ικανότητα πολλαπλασιασµού χωρίστηκαν περαιτέρω µε τη χρήση µονοκλωνικών αντισωµάτων και αναλύθηκαν εκ νέου, εωσότου έγινε δυνατή η αποµόνωση ενός οµογενούς πληθυσµού stem cells. Η ανάλυση της ανάπτυξης του LSC έγινε δυνατή κυρίως µετά την ανάπτυξη των ανοσοκατεσταλµένων NOD/SCID επιµύων, που ανέχονται και επιτρέπουν την ανάπτυξη του ανθρώπινου αιµοποιητικού stem cell, τόσο του φυσιολογικού, όσο και του λευχαιµικού Έτσι, ειδικές κατηγορίες του µυελού των οστών µπορούν να µεταµοσχευθούν σ αυτούς τους επίµυς και στη συνέχεια να µελετηθεί η ανάπτυξή τους. Στην περίπτωση των LSC της ΟΜΛ, ο ανοσοφαινότυπός τους είναι CD34+, CD38-, CD71-, HLA-DR-, CD90-, CD117- και CD123-. Το γεγονός ότι τα τρία τελευταία αντιγόνα CD90, CD117 και CD123 είναι θετικά στα φυσιολογικά αιµοποιητικά stem cells επιτρέπει τον διαχωρισµό των φυσιολογικών, από τα λευχαιµικά stem cells. Εκτός από τον ανοσοφαινότυπο, πρόσφατες µελέτες καθόρισαν τον τρόπο ανάπτυξης, καθώς και την κυτταρική και µοριακή βιολογία του LSC. Ίσως το βασικό κριτήριο του καθορισµού του stem cell είναι η αυτοανανεωτική του ικανότητα. Μελέτες των Bonnet και Dick 47 απέδειξαν ότι τα λευχαιµικά stem cells, που προέρχονται από διάφορες υποκατηγορίες της κατά FAB ταξινόµησης της ΟΜΛ είναι ικανά να αυτοανανεώνονται. Επιπλέον, αναφέρεται ότι υποπληθυσµοί των λευχαιµικών stem cells καθορίστηκαν µέσω της ικανότητάς τους να αυτοανανεώνονται και να αναπτύσσονται in vivo 33

34 (NOD/SCID επίµυες), µε αποτέλεσµα την επανασύσταση του µυελού των επι- µύων, µετά από θανατηφόρο δόση ακτινοβολίας, µε λευχαιµική αιµοποίηση. Συµπερασµατικά, από όλες τις µελέτες αποδεικνύεται ότι το LSC διατηρεί στοιχεία φυσιολογικών stem cells και είναι βιολογικά διαφορετικό από τον µεγάλο αριθµό των λευχαιµικών βλαστών, οι οποίοι δεν αυτοανανεώνονται. Μελέτες που αφορούν στον κυτταρικό κύκλο του LSC, απέδειξαν ότι το LSC βρίσκεται σε φάση ηρεµίας (G0 του κυτταρικού κύκλου), ένα ακόµη χαρακτηριστικό του φυσιολογικού stem cell, το οποίο φαίνεται να διατηρείται και στο λευχαιµικό. Η ηρεµία του LSC ίσως είναι ο κύριος παράγοντας που οδηγεί στην υποτροπή της ΟΜΛ. Από την άλλη υπάρχουν µοναδικά µοριακά δεδοµένα του LSC, όπως η υψηλή δραστηριότητα του NF-κΒ, που έχει αναφερθεί σε εµπλουτισµένους πληθυσµούς του LSC 48. Ενώ ο ρόλος ειδικών γονιδίων και µοριακών οδών χρειάζεται περαιτέρω µελέτη, οι διάφορες λειτουργίες τους µπορεί να προσφέρουν πλεονεκτήµατα για την κατανόηση µηχανισµών που ρυθµίζουν το LSC. Επιπλέον, ειδικά µοριακά στοιχεία του LSC µπορεί να αποτελέσουν χρήσιµους στόχους, για την εφαρµογή νέων πιο ειδικών θεραπευτικών παρεµβάσεων Προέλευση του LSC και Μοριακή Παθογένεση Καθώς γίνονταν οι µελέτες µε στόχο τον χαρακτηρισµό του LSC, ένα ερώτηµα που απασχολούσε τους ερευνητές ήταν ποίοι τύποι stem cells ή προγονικών κυττάρων µεταµορφώνονται σε LSC. Σίγουρα, το πιο πρώιµο αδιαφοροποίητο αιµοποιητικό stem cell είναι ένας πιθανός στόχος µετάλλαξης, καθόσον είναι ένα κύτταρο µε ενδογενείς ιδιότητες, που θα µπορούσαν να βοηθήσουν την κακοήθη εξαλλαγή: µεγάλη αυτοανανεωτική ικανότητα και δυνατότητα αυξη- µένου πολλαπλασιασµού. Επιπλέον, το αιµοποιητικό stem cell είναι ένα κύτταρο µε µεγάλη διάρκεια ζωής, µε αποτέλεσµα να αθροίζει πολλαπλές µεταλλάξεις, απαραίτητες για τη µεταµόρφωσή του. Παρόλα αυτά, νεότερα δεδοµένα υποστηρίζουν ότι και άλλοι τύποι πρώιµων stem cells ή/και προγονικών κυττάρων προσφέρονται ως στόχοι για κακοήθη µεταµόρφωση 37,49. Υπάρχουν δεδοµένα που υποστηρίζουν ότι καθορισµένοι τύποι µεταλλάξεων είναι πιθανόν να παράγουν LSC από προγονικά κύτταρα µάλλον, παρά από αρχέγονα HSC. Επιπλέον, η µεταµόρφωση του HSC έναντι αυτής των προ- 34

35 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ γονικών κυττάρων γίνεται µε διαφορετικές διαδικασίες, π.χ. το HSC έχει την ικανότητα της αυτοανανέωσης, έτσι οι αρχικές µεταλλάξεις στον πληθυσµό των HSC δεν είναι απαραίτητο να σχετίζονται µε τη διαδικασία της αυτοανανέωσης, αλλά µάλλον προκαλούν αλλαγές σε άλλες λειτουργίες, όπως είναι η επιβίωση ή η διαφοροποίηση 50. Αντίθετα, αφού τα προγονικά κύτταρα, όπως τα CMP (Common Myeloid Progenitors) και τα GMP (Granulocyte Macrophage Progenitors) δεν έχουν σηµαντική ικανότητα αυτοανανέωσης, οι αρχικές µεταλλάξεις είναι πολύ πιθανό να επηρεάζουν την αυτοανανεωτική τους ικανότητα. Υπάρχει και η άποψη ότι εξειδικευµένα προγονικά κύτταρα µε περιορισµένο χρόνο επιβίωσης, ίσως δε ζουν αρκετά για να υποστούν τις διαδοχικές µεταλλάξεις, ώστε να µεταλλαχθούν σε ένα πλήρες LSC. Εάν οι θεωρίες που αναφέρονται παραπάνω είναι αληθινές, τότε τα αρχικά στάδια της λευχαιµικής µετα- µόρφωσης µπορεί να διαφέρουν και να εξαρτώνται από τον τύπο του αρχικού κυττάρου. Πιο συγκεκριµένα, τα LSC κύτταρα που προέρχονται από τα HSC, έναντι αυτών που προέρχονται από προγονικά κύτταρα της µυελικής σειράς, µπορεί να έχουν διαφορετικές βιολογικές ιδιότητες και έτσι να απαντούν διαφορετικά στις διάφορες θεραπευτικές µεθόδους 50. Ένα άλλο πεδίο µελέτης που βρίσκεται στα αρχικά στάδια είναι η διερεύνηση των επιδράσεων των διαφόρων µεταλλάξεων στα stem cells ή τα προγονικά κύτταρα. Είναι σίγουρο ότι, οι µεταλλάξεις που προκαλούν παθολογική αυτοανανέωση εµπλέκονται στην παθογένεση της ΟΜΛ. Ωστόσο, άλλες µεταβολές σε διαδικασίες όπως της επιβίωσης-απόπτωσης και της διαφοροποίησης δεν έχουν µελετηθεί επαρκώς και χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση. Καθώς σκοπός των µελετητών είναι να µετατρέπουν τα ερευνητικά δεδοµένα σε κλινικώς χρήσιµες στρατηγικές, θα ήταν ιδιαίτερα σηµαντικό να καθοριστούν εκείνες οι διαδικασίες, που είναι µοναδικές για το LSC και αποτελούν ελκυστικούς στόχους για θεραπευτικές εφαρµογές. 35

36 1.5. Προγνωστικοί παράγοντες στην ΟΜΛ Η ΟΜΛ είναι µια εξαιρετικά ετερογενής νόσος, µε κλινική πορεία που ποικίλει από επιβίωση λίγων ηµερών µέχρι ολική ύφεση ή πιο σπάνια πλήρη αποκατάσταση. Ως εκ τούτου, ένας µεγάλος αριθµός κλινικών και βιολογικών χαρακτηριστικών των ασθενών κατά τη διάγνωση έχει στρατολογηθεί για την πρόβλεψη της πορείας της νόσου, καθώς και την απάντηση στη θεραπεία 51,52. Η µελέτη των προγνωστικών παραγόντων είναι ιδιαίτερα σηµαντική για τις οµάδες υψηλού κινδύνου, όπως είναι οι ηλικιωµένοι ασθενείς, καθώς µπορεί να συµβάλει στην τροποποίηση ή µη εφαρµογή της κυτταροτοξικής αγωγής. Τα τελευταία χρόνια, η µελέτη της µοριακής βιολογίας και γενετικής της ΟΜΛ έδειξε ότι πάνω από 100 γονιδιακές µεταλλάξεις και γενετικές ανωµαλίες εµπλέκονται στην παθογένεση της νόσου και αντανακλούν την ετερογένεια που παρατηρείται Ορισµένες από αυτές, όπως οι µεταλλάξεις των γονιδίων FLT3 και NPM (ΝuclePhosMin) έχουν εξακριβωµένη προγνωστική σηµασία και είναι δυνατό να αποτελέσουν νέους στόχους για τη θεραπευτική προσέγγιση της ΟΜΛ. Ω- στόσο, οι πιο γνωστοί και καλά χαρακτηρισµένοι προγνωστικοί παράγοντες έ- χουν ήδη δείξει την αξία τους στην πρόβλεψη της πορείας της ΟΜΛ, την απάντηση στη χηµειοθεραπευτική αγωγή και τη δυνατότητα επίτευξης µερικής ή πλήρους ύφεσης 57. Οι προγνωστικοί αυτοί παράγοντες, που χωρίζονται σε ευνοϊκούς και δυσµενείς, φαίνονται στον πίνακα 1. Η ηλικία αποτελεί έναν ανεξάρτητο δυσµενή προγνωστικό παράγοντα στην ΟΜΛ και έχει δειχθεί ότι η πορεία της νόσου, η απάντηση στη θεραπεία, η δυνατότητα επίτευξης πλήρους ύφεσης και η επιβίωση ελεύθερη νόσου δυσχεραίνουν όσο αυξάνει η ηλικία. Οι ηλικιωµένοι ασθενείς µε ΟΜΛ, που χρίζουν ι- διαίτερης σηµασίας και φροντίδας, αποτελούν µια οµάδα υψηλού κινδύνου και παρουσιάζονται αναλυτικότερα παρακάτω. Όσον αφορά στο φύλο έχει δειχθεί ότι, οι άνδρες ασθενείς µε ΟΜΛ εµφανίζουν επιβίωση ελεύθερη νόσου λιγότερο συχνά, σε σχέση µε τις γυναίκες. Ωστόσο, η διαφορά αυτή είναι µικρή και δεν είναι ακόµη πλήρως εξακριβωµένο, αν µπορεί να αξιολογηθεί 58. Όσον αφορά στις κυτταρογενετικές ανωµαλίες, αυτές ανευρίσκονται σε ποσοστό 60% των ασθενών µε ΟΜΛ και έχουν υψηλή προγνωστική αξία για την απάντηση στη θεραπεία, καθώς και την πιθανότητα υποκείµενης υποτροπής Οι ανωµαλίες t(8;21), t(15;17) και inv(16), καθώς και τα αντίστοιχα χιµαιρικά γονίδια που προκύπτουν έχουν γενικά ευνοϊκή πρόγνωση και παρατηρούνται συχνότερα 36

37 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ στους νεότερους ασθενείς. Οι ασθενείς που φέρουν αυτές τις χρωµοσωµικές ανωµαλίες απαντούν στη χορηγούµενη θεραπεία, σε ποσοστό µεγαλύτερο του 80% και η πιθανότητα υποκείµενης υποτροπής, σε αυτούς που πετυχαίνουν πλήρη αιµατολογική ύφεση, είναι µόνο 30-40%. Το υπόλοιπο 60-70% εµφανίζει πενταετή επιβίωση ελεύθερη νόσου. Οι παραπάνω ευνοϊκές χρωµοσωµικές ανωµαλίες συσχετίζονται µε συγκεκριµένους υποτύπους της FAB ταξινόµησης. Έτσι, η t(8;21) συναντάται συχνότερα στον τύπο Μ2, η t(15;17) στον Μ3 και η inv(16) στον Μ4 τύπο, µε έκδηλη παρουσία ηωσινόφιλων. Ωστόσο, πρέπει να τονιστεί ότι τα κυτταρογενετικά και µοριακά ευρήµατα, παρά οι τύποι της FAB ταξινόµησης, καθορίζουν την προγνωστική αξία. Αντίθετα, οι ασθενείς που φέρουν µονοσωµίες ή ανωµαλίες των χρωµοσωµάτων 5 και 7 καθώς και της περιοχής 11q23 έχουν γενικά δυσµενή πρόγνωση. Οι ασθενείς αυτοί απαντούν στη χορηγούµενη θεραπεία σε ποσοστό 60%, ενώ το 80% από αυτούς υποτροπιάζει µέσα σε 2 χρόνια, µε αποτέλεσµα η πενταετής επιβίωση να αγγίζει µόνο το 15% 63,64. Στο σηµείο αυτό θα πρέπει να αναφερθεί ότι οι ασθενείς µε φυσιολογικό καρυότυπο είναι δυνατό να φέρουν µεταλλάξεις σε γονίδια, όπως είναι το FLT3 και το MLL, οι οποίες έχουν γενικά δυσµενή πρόγνωση και ανευρίσκονται µόνο µε µοριακές τεχνικές Για τον λόγο αυτόν πολλοί ερευνητές θεωρούν ότι ο φυσιολογικός καρυότυπος µπορεί να είναι ένας δυσµενής προγνωστικός παράγοντας, αν και οι περισσότεροι του προσδίδουν ευνοϊκή πρόγνωση. Αν και η προγνωστική αξία των κυτταρογενετικών ευρηµάτων είναι καλά χαρακτηρισµένη, η σηµασία του ανοσοφαινότυπου στην πρόγνωση δεν έχει πλήρως εξακριβωθεί. Αυτό ισχύει τόσο για τα CD13, CD14, CD15 θετικά αντιγόνα, όσο και για το CD34, για το οποίο υπάρχουν αντιφατικά αποτελέσµατα που αφορούν στην προγνωστική του αξία, τα οποία πιθανότατα αντανακλούν τις διαφορετικές τεχνικές και µεθόδους που χρησιµοποιήθηκαν 68. Όσον αφορά στον αριθµό των λευκών αιµοσφαιρίων έχει δειχθεί ότι οι ασθενείς µε πολύ αυξηµένο αριθµό λευκοκυττάρων περιφερικού αίµατος (WBC > /mm 3 ) έχουν γενικά χαµηλά ποσοστά πλήρους ύφεσης και µεγαλύτερη πιθανότητα υποτροπής 68. Ο αριθµός των λευκών αιµοσφαιρίων παρέχει επίσης µια παράµετρο για τον διαχωρισµό της προγνωστικής ετερογένειας, ανάµεσα στους ασθενείς µε ευνοϊκό καρυότυπο. Έτσι, οι ασθενείς µε t(8;21), t(15;17) ή inv(16) και WBC 37

38 20.000/mm 3 έχουν χειρότερη πρόγνωση από τους ασθενείς µε τα ίδια κυτταρογενετικά ευρήµατα, αλλά µικρότερο αριθµό λευκών αιµοσφαιρίων 58. Πίνακας 1. Οι πιο γνωστοί προγνωστικοί παράγοντες στην ΟΜΛ. Παράγοντας Ευνοϊκός υσµενής Ηλικία < 60 έτη > 60 έτη Φύλο Γυναίκα Άνδρας Λευχαιµία De novo ευτεροπαθής Αριθµός Λευκών Αιµοσφαιρίων < /mm 3 > /mm 3 Μορφολογία κατά FAB M2, M3, M4 M0, M5, M6, M7 Κυτταρογενετικά ευρήµατα t(8;21), t(15;17), inv(16) -7, del(7q), -5, del(5q), t/del(11q23) Φαινότυπος CD34-, CD14-, CD13- CD34+ MDR-1 Απών Παρών 1.6. Ταξινόµηση της ΟΜΛ Tαξινόµηση κατά FAB Η πρώτη ταξινόµηση της ΟΜΛ έγινε το 1976 από µια οµάδα Γάλλων, Α- µερικανών και Άγγλων ερευνητών, µε βάση την πορεία διαφοροποίησης των αιµοποιητικών κυττάρων της λεµφικής σειράς και ονοµάστηκε ταξινόµηση κατά FAB (French-American-British) 70,71. Η FAB ταξινόµηση βασίζεται σε µορφολογικά κριτήρια και εξακολουθεί να χρησιµοποιείται έως σήµερα. Στα πλεονεκτή- µατά της περιλαµβάνεται η ταχύτητα, η ευκολία στην εκτίµηση και η µεγάλη συµφωνία µεταξύ των µελετητών,. σε ποσοστό >80%. Ωστόσο, παρουσιάζει µειονεκτήµατα, όπως η δυσχέρεια αναγνώρισης ορισµένων µορφών ΟΜΛ (Μ0, Μ7, διφαινοτυπική ΟΜΛ) 72,73 και η περιορισµένη αξία στην πρόγνωση της νόσου ή την ανίχνευση υπολειµµατικής νόσου 71. Στον πίνακα 2 φαίνονται οι 8 υ- πότυποι της ΟΜΛ, µε βάση την ταξινόµηση κατά FAB. 38

39 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Πίνακας 2. Ταξινόµηση κατά FAB της ΟΜΛ. Συχνότητα και πρόγνωση σε ενηλίκους ασθενείς. Υπότυπος Κυτταρικός τύπος Συχνότητα Πρόγνωση Μ0 Μ1 Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία µε ελάχιστη διαφοροποίηση Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία χωρίς ωρίµανση Μ2 Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία µε ωρίµανση Μ3 Μ3v M4 M4eo M5a M5b Οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία µε αδρά βασεόφιλα κοκκία στα προ- µυελοκύτταρα Οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία µε λεπτή κοκκίωση Οξεία µυελοµονοκυτταρική λευχαι- µία Οξεία µυελοµονοκυτταρική λευχαι- µία µε παθολογικά ηωσινόφιλα στον µυελό Οξεία µονοβλαστική λευχαιµία, ελαφρά διαφοροποιηµένη Οξεία µονοκυτταρική λευχαιµία, δαιφοροποιηµένη 3-5% υσµενής 15-20% Ενδιάµεση 25-30% Ευνοϊκή 10-15% Άριστη 20-30% Ενδιάµεση Ευνοϊκή 2-9% Ενδιάµεση M6 Οξεία ερυθρολευχαιµία 3-5% υσµενής M7 Οξεία µεγακαρυοβλαστική λευχαιµία 3-5% υσµενής Tαξινόµηση κατά WHO Με επιπλέον κλινικά, κυτταρογενετικά και ανοσοφαινοτυπικά κριτήρια 74,75 προέκυψε η ταξινόµηση κατά WHO (World Health Organization) από τον Παγκόσµιο Οργανισµό Υγείας, το Η κατά WHO ταξινόµηση των οµάδων της ΟΜΛ φαίνεται στον πίνακα

40 Πίνακας 3. Ταξινόµηση κατά WHO της ΟΜΛ και πρόγνωση στους διάφορους υποτύπους. ΟΜΛ µε χαρακτηριστικές κυτταρογενετικές ανωµαλίες ΟΜΛ µε πολυκλωνική δυσπλασία ευτερογενής ΟΜΛ και Μ Σ που εµφανίζονται µετά χορήγηση φαρµάκων Άλλοι τύποι ΟΜΛ ιφαινοτυπικές ΟΛ ΟΜΛ µε t(8;21) (AML1-ETO) ΟΜΛ µε inv(16) ή t(16;16) µε παθολογικά ηωσινόφιλα στον µυελό των οστών (CBFβ-MYH11) ΟΠΜΛ µε t(15;17) (PML-RARα) ΟΜΛ µε ανωµαλίες του 11q23 (MLL) Προηγήθηκε µυελοδυσπλαστικό ή µυελοϋπερπλαστικό σύνδροµο εν προηγήθηκε µυελοδυσπλαστικό ή µυελοϋπερπλαστικό σύνδροµο Αλκυλιωτικοί παράγοντες Αναστολείς της τοποϊσοµεράσης ΙΙ ΟΜΛ µε ελάχιστη διαφοροποίηση που δεν µπορεί να κητηγοριοποιηθεί ΟΜΛ χωρίς ωρίµανση ΟΜΛ µε ωρίµανση ΟΠΜΛ χωρίς ύπαρξη του RARα Οξεία µυελοµονοκυτταρική λευχαι- µία Οξεία µονοβλαστική και µονοκυτταρική λευχαιµία Οξεία ερυθρολευχαιµία Οξεία µεγακαρυοβλαστική λευχαιµία Οξεία βασεοφιλική λευχαιµία Οξεία πανµυέλωση µε µυελοΐνωση Μεγάλη πιθανότητα ολικής ύφεσης. Ευνοϊκή πρόγνωση. Συχνή σε ηλικιωµένους ασθενείς. υσµενής πρόγνωση. Συχνή µετά από χηµειοθεραπεία ή ακτινοβολία. υσµενής πρόγνωση. Η πρόγνωση ποικίλει και εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από τα κυτταρογενετικά ευρήµατα. Η παρουσία λευχαι- µικών κυττάρων που δε µπορούν να ταξινοµηθούν διαφοροποιεί την πρόγνωση. 40

41 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.7. Γενετική της ΟΜΛ Όταν µελετάται η ΟΜΛ ως ξεχωριστή οµάδα, οι τύποι των µεταλλάξεων που σχετίζονται µε αυτή, διαφέρουν από εκείνες που συχνά συναντώνται σε άλλα είδη λευχαιµίας. Οι γενετικές ανωµαλίες που σχετίζονται µε την ΟΜΛ είναι ισοζυγισµένες χρωµοσωµικές µετατοπίσεις, που οδηγούν στο σχηµατισµό χι- µαιρικών πρωτεϊνών. Αυτές οι χιµαιρικές πρωτεΐνες ανήκουν στην οµάδα των µεταγραφικών ρυθµιστών. Η άποψη αυτή στηρίζει τη γενικότερη θεώρηση, σύµφωνα µε την οποία η ΟΜΛ προέρχεται κυρίως από µεταγραφική δυσλειτουργία. Στην περίπτωση της ΟΛΛ µεταγραφική δυσλειτουργία παρατηρείται στις περιπτώσεις υπερέκφρασης δοµικά φυσιολογικών γονιδίων, που µετατοπίζονται σε θέσεις µε υψηλή µεταγραφική ρυθµιστική δραστηριότητα, όπως είναι η θέση ρύθµισης του υποδοχέα των Τ-λεµφοκυττάρων ή των ανοσοσφαιρινών. Τέτοιες υπερεκφράσεις φυσιολογικών πρωτεϊνών δεν εµφανίζονται ή είναι σπάνιες στην ΟΜΛ 78. Ο µηχανισµός µεταµόρφωσης των µυελοϋπερπλαστικών συνδρόµων, όπως είναι η χρόνια µυελογενής και η χρόνια µυελοµονοκυτταρική λευχαιµία (ΧΜΜΛ) σε ΟΜΛ, φαίνεται να είναι διαφορετικός από τον µηχανισµό µε τον οποίον προκύπτει η de novo ΟΜΛ. Αυτά τα σύνδροµα χαρακτηρίζονται τυπικά από τη συνεχή ενεργοποίηση µιας τυροσινικής κινάσης (όπως η BCR-ABL ή η TEL-PDGFR), η οποία οδηγεί σε αύξηση των κυττάρων της µυελικής σειράς, χωρίς την ύπαρξη σαφών διαταραχών της διαφοροποίησης. Τα µυελοϋπερπλαστικά συνδροµα εάν αφεθούν χωρίς θεραπεία, µεταπίπτουν σε οξεία φάση (ΟΜΛ), κατά την οποία παρατηρούνται συχνά επιπρόσθετες χρωµοσωµικές α- νωµαλίες [π.χ. t(8;21) ή t(3;21)]. Οι περισσότερες ΟΜΛ όµως, δεν προέρχονται από µυελοϋπερπλαστικά ή µυελοδυσπλαστικά σύνδροµα. Η παρατήρηση αυτή οδηγεί στο συµπέρασµα ότι παρόµοια σήµατα πολλαπλασιασµού και αναστολής της απόπτωσης, σαν και αυτά που σχετίζονται µε τη ΧΜΛ, µπορεί να συνεργάζονται µε άλλες µοριακές διαταραχές και να δίνουν γένεση σε όλες τις µορφές της ΟΜΛ. 41

42 Mοριακή σηµατοδότηση στην ΟΜΛ Η µοριακή σηµατοδότηση προσφέρει έναν µηχανισµό µε τον οποίον διάφορα µόρια (π.χ. G-CSF, GM-CSF και FLT3-L) δρουν ως εξωκυτταρικά ερεθίσµατα και προκαλούν, µέσω ενός καταρράκτη βιοχηµικών αντιδράσεων, ενδοκυτταρικές αποκρίσεις (πολλαπλασιασµός, διαφοροποίηση και απόπτωση). Τρία είναι τα κύρια µονοπάτια της κυτταρικής σηµατοδότησης στην ΟΜΛ: α) η ενεργοποίηση των υποδοχέων τυροσινικής κινάσης RTK, β) η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών RAS και γ) το µονοπάτι JAK/STAT. Μια απλοποιηµένη σχηµατική απεικόνιση των τριών αυτών µονοπατιών φαίνεται στην εικόνα 1. Εικόνα 1. Οδοί µεταγωγής σήµατος στην ΟΜΛ. 42

43 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Στο αριστερό µέρος της εικόνας 1 φαίνεται η σηµατοδότηση από τους υποδοχείς τυροσινικής κινάσης RTK (Receptor Tyrosine Kinase) µέσω των πρωτεϊνών RAS. Η σύνδεση του προσδέτη (L) στον υποδοχέα (Τ) προκαλεί τον διµερισµό του υποδοχέα, ο οποίος φωσφορυλιώνεται (Ρ) και ενεργοποιείται. Το σή- µα ενεργοποίησης, µέσω της οδού RTK µεταφέρεται στο σύµπλοκο GRB2/SOS, το οποίο επάγει την ενεργοποίηση της RAS πρωτεΐνης µε F (RAS-GTP). Η RAS-GTP µε τη σειρά της φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί τη Raf και άλλους στόχους, όπως η RAC και η PΙ3K. Η ενεργοποίηση αυτών των οδών προκαλεί αλλαγές στη σύνθεση του DNA, στην οργάνωση του κυτταροσκελετού και στον πολλαπλασιασµό. Παρόλο που η RAS έχει κάποια ενδογενή ενεργότητα GTPάσης, πρωτεΐνες όπως είναι η GAP και η NFI προάγουν την απενεργοποίηση της RAS, µετατρέποντας τη RAS-GTP σε RAS-GDP. Στο δεξί µέρος της εικόνας φαίνεται το µονοπάτι JAK/STAT (JAnus protein tyrosine Kinase /Signal Transducers and Activators of Transcription). Η σύνδεση του προσδέτη (L) προκαλεί αλλαγές της διαµόρφωσης µη-rtk υποδοχέων (ΝΤ), που προάγουν την πρόσδεση και φωσφορυλίωση των JAK πρωτεϊνών. Οι ενεργοποιηµένες JAK πρωτεΐνες είναι πιθανό να ενεργοποιούν µε τη σειρά τους το µονοπάτι RAS (διακεκοµµένο βέλος) και να φωσφορυλιώνουν τις πρωτεΐνες STAT. Οι ενεργοποιηµένες STAT πρωτεΐνες σχηµατίζουν οµοδιµερή ή ετεροδιµερή µε άλλα µέλη της ίδιας οικογένειας. Τα διµερή αυτά µεταναστεύουν στον πυρήνα όπου ε- νεργοποιούν τη µεταγραφή συγκεκριµένων γονιδίων Κυτταρογενετικά ευρήµατα στην ΟΜΛ Μη τυχαίες χρωµοσωµικές ανωµαλίες ανευρίσκονται στις περισσότερες περιπτώσεις των ασθενών µε ΟΜΛ και σχετίζονται µε την πρόγνωση της νόσου. Με τη βελτίωση των µοριακών και κυτταρογενετικών τεχνικών βρέθηκε ότι παθολογικός καρυότυπος υπάρχει στο 55-78% των ενηλίκων και στο 79-85% των παιδιών µε ΟΜΛ Περίπου το 55% των ασθενών αυτών έχει µόνο µια απλή κυτταρογενετική ανωµαλία (το 15-20% έχουν ένα επιπλέον ή ένα λιγότερο χρω- µόσωµα), ενώ το υπόλοιπο 45% φέρει δύο ή περισσότερους τύπους χρωµοσω- µικών αλλοιώσεων 79. Οι πιο συχνές χρωµοσωµικές ανωµαλίες στην ΟΜΛ είναι οι εξής: t(15;17), t(8;21), inv(16), τρισωµία 8, τρισωµία 21, del(5q), µονοσωµία 43

44 7, µονοσωµία 8 και µετατοπίσεις της περιοχής 11q23 82,83. Η συσχέτιση ανάµεσα στα κυτταρογενετικά και κλινικοπαθολογικά ευρήµατα οδήγησε στην αναγνώριση διακριτών υποτύπων της ΟΜΛ και βοήθησε στον προσδιορισµό προγνωστικών οµάδων 80, Τεχνικές όπως είναι η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR), η φθορίζουσα in situ υβριδοποίηση (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) και η συγκριτική γενωµική υβριδοποίηση (comparative genomic hybridization) έχουν βελτιώσει την ικανότητα εύρεσης ελλειµµάτων σε µοριακό επίπεδο, όπου εµπεριέχονται ογκογονίδια ή ογκο-κατασταλτικά γονίδια, και έχουν οδηγήσει στον καλύτερο χαρακτηρισµό των υποτύπων της ΟΜΛ. Πιο συγκεκριµένα, η ΟΜΛ µε t(8;21) (εικόνα 2) φαίνεται να έχει σχετικά πιο ώριµους βλάστες, συχνά µε αζουρόφιλα κοκκία και περιστασιακά µε πολύ µεγάλα κοκκία (ψευδο-chédiac-higashi κοκκία) 75. Η ΟΜΛ µε inv(16) ή t(16;16) συνήθως σχετίζεται µε µονοκυτταρική διαφοροποίηση και παθολογικά ηωσινόφιλα στον µυελό των οστών 75,87. Η οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία t(15;17) (εικόνα 3) και οι διάφορες παραλλαγές της διαπιστώνονται από την παρουσία προµυελοκυττάρων µε έντονη κοκκίωση, σε συνδυασµό µε διάχυτη ενδαγγειακή πήξη ( ΕΠ), αλλά επίσης είναι παρούσα και στον υπότυπο µε λεπτή κοκκίωση 88. Εικόνα 2. Η αµοιβαία µετατόπιση t(8;21)(q22;q22). 44

45 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εικόνα 3. Η αµοιβαία µετατόπιση t(15;17)(q22;q21). Άλλες χρωµοσωµικές ανωµαλίες που συσχετίζονται µε µορφολογικές διαφοροποιήσεις στην ΟΜΛ είναι: µετατοπίσεις της περιοχής 11q23 µε ύπαρξη µονοβλαστών 75, t(6;9) και del(12p) µε παρουσία βασεόφιλων 89 και αλλοιώσεις της θέσης 3q21.26 µε παθολογικά αιµοπετάλια και θροµβοκυττάρωση 90. Συγκεκριµένες χρωµοσωµικές ανωµαλίες έχουν συσχετιστεί µε δευτεροπαθή ΟΜΛ, µετά από Μ Σ ή χηµειοθεραπευτική αγωγή. Γενικά, οι ανωµαλίες αυτές δε φανερώνουν στενή συσχέτιση µε συγκεκριµένες υποοµάδες των Μ Σ 91. Οι κυτταρογενετικές ανωµαλίες είναι καλύτερα χαρακτηρισµένες στην ανθεκτική αναιµία µε αύξηση βλαστών (RAEB) και στην ανθεκτική αναιµία µε αύξηση βλαστών σε µεταµόρφωση (RAEB-t), που µεταπίπτουν πιο συχνά σε ΟΜΛ 91. Αξίζει να σηµειωθεί ότι η RAEB-t οµαδοποιείται πλέον µε την ΟΜΛ, σύµφωνα µε την κατάταξη κατά WHO. Τα Μ Σ ή η ΟΜΛ µετά από θεραπεία µε αλκυλιωτικούς παράγοντες παρουσιάζουν υψηλή συχνότητα εµφάνισης ανω- µαλιών, που σχετίζονται µε τα χρωµοσώµατα 5 και 7, καθώς και άλλων πιο σύνθετων, που εµπλέκουν περισσότερα χρωµοσώµατα Καθώς το Μ Σ µεταπίπτει σε ΟΜΛ, παρατηρείται συχνά µια κλωνική έξαρση χρωµοσωµικών α- νωµαλιών. Οι πιο κοινές δευτερεύουσες χρωµοσωµικές αλλοιώσεις περιλαµβάνουν τα χρωµοσώµατα 5, 7, 8, 9, 21, 22, Χ και Υ 61,79. Στον πίνακα 4 φαίνονται οι πιο συχνές χρωµοσωµικές ανωµαλίες στην ΟΜΛ, καθώς και τα γονίδια που εµπλέκονται. 45

46 Πίνακας 4. Οι πιο συχνές χρωµοσωµικές ανωµαλίες στην ΟΜΛ και τα γονίδια που εµπλέκονται. Τύπος χρωµοσωµικής ανωµαλίας Γονίδια Τύπος κατά FAB Συχνό- τητα +8 M2, M4 και M5 9% 7 ή 7q 5 ή 5q inv(16)(p13q22) ή t(16;16)(p13;q22) ε σχετίζεται µε συγκεκριµένο τύπο ε σχετίζεται µε συγκεκριµένο τύπο Πρόγνωση Ενδιάµεση ή δυσµενής 7% υσµενής 7% υσµενής CBFB;MYH11 M4Eo 7% Ευνοϊκή t(15;17)(q22;q11) PML;RARA M3, M3v 7% Ευνοϊκή t(8;21)(q22;q22) RUNX1;RUNX1T M2 µε ραβδία Auer 6% Ευνοϊκή +21 ε σχετίζεται µε συγκεκριµένο τύπο 3% Ενδιάµεση t(9;11)(p21.22;q23) MLL;AF9 M5 2% Ενδιάµεση +11 ή t/del(11q23) MLL1 M1, M2 ή Μ5 2% υσµενής t/del(12p) ε σχετίζεται µε συγκεκριµένο τύπο 2% υσµενής t(9;22)(q34;q11) BCR;ABL M1 και Μ2 1% υσµενής t(6;11)(q27;q23) MLL;AF6 M4 και Μ5 1% υσµενής inv(3)(q21q26) ή t(3;3)(q21;q26) EVI1;RPN1 M1, M4, M6, M7 1% υσµενής t(6;9)(p23;q34) DEK;NUP214 M2, M4 1% υσµενής t(3;5)(q25.1;q35) MLF1;NPM M6 1% Ενδιάµεση 46

47 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.9. Χρωµοσωµικές µετατοπίσεις & σηµειακές µεταλλάξεις στην ΟΜΛ Οι περισσότερες περιπτώσεις της ΟΜΛ, όπως αναφέρθηκε, σχετίζονται µε παθολογικό καρυότυπο και οφείλονται σε αλλοιώσεις γονιδίων των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων του µυελού των οστών. Οι αλλοιώσεις αυτές αφορούν είτε χρωµοσωµικές µετατοπίσεις, που εµπλέκουν µια πληθώρα γονιδίων, είτε σηµειακές µεταλλάξεις σε υποδοχείς τυροσινικών κινασών (FLT3, KIT) και µελών της οικογένειας RAS. Επιπλέον, µεταλλάξεις που σχετίζονται µε απώλεια της λειτουργικότητας έχουν περιγραφεί για διάφορους αιµοποιητικούς µεταγραφικούς παράγοντες, όπως είναι ο AML1, ο C/EBPα και ο GATA-1. Ωστόσο, ένα σηµαντικό ποσοστό ασθενών µε ΟΜΛ έχει φυσιολογικό καρυότυπο. Μένει να αποκαλυφθεί εάν αυτές οι περιπτώσεις είναι πράγµατι δοµικά φυσιολογικές ή εάν υπάρχουν κρυφές χρωµοσωµικές ανωµαλίες, που δεν καθορίζονται µε τις καθιερωµένες τεχνικές µελέτης των χρωµοσωµάτων Ισόρροπες αµοιβαίες χρωµοσωµικές µετατοπίσεις Οι χρωµοσωµικές µετατοπίσεις οδηγούν γενικά σε παθολογική έκφραση γονιδίων, που προκύπτουν από σύντηξη, ή σε παθολογική έκφραση φυσιολογικών κατά τα άλλα γονιδίων, λόγω µετατόπισής τους δίπλα σε ενεργό προαγωγέα ή ενισχυτή 96. Στην ΟΜΛ, η πληθώρα των χρωµοσωµικών µετατοπίσεων οδηγεί στη γέννηση χιµαιρικών γονιδίων (πίνακας 4). Η εξακρίβωση και η µελέτη των γονιδίων που εµπλέκονται σε αυτές τις αντιµεταθέσεις έχει βοηθήσει στην κατανόηση της παθοφυσιολογίας και βιολογίας της ΟΜΛ και έχει αναδείξει ένα φάσµα γονιδίων που είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική αιµοποίηση. Περισσότερες από 100 χρωµοσωµικές ανωµαλίες έχουν παρατηρηθεί σε αιµατολογικά νοσήµατα, αλλά οι κλινικοί φαινότυποι των ασθενών που τις φέρουν είναι πολύ λιγότεροι. Αυτή η παρατήρηση οδηγεί στη θεώρηση ότι, παρά τη γενωµική ποικιλοµορφία των µετατοπίσεων, µερικά από τα χιµαιρικά γονίδια που προκύπτουν πρέπει να στοχεύουν παρόµοια σηµατοδοτικά ή µεταγραφικά µονοπάτια στη λευχαιµία 95. Από τις χρωµοσωµικές µετατοπίσεις στην ΟΜΛ, τρεις κατηγορίες είναι οι πιο καλά µελετηµένες σε µοριακό επίπεδο. Αυτές εµπλέκουν: α) τον παράγοντα που συνδέεται µε τον πυρήνα CBF, β) το 47

48 γονίδιο MLL και γ) τον υποδοχέα α του ρετινοϊκού οξέος, RARα, στην Οξεία Προµυελοκυτταρική Λευχαιµία α. Ο παράγοντας CBF Περισσότερες από 10 γνωστές µετατοπίσεις στην ΟΜΛ εµπλέκουν τον παράγοντα CBF (Core Binding Factor), ο οποίος ρυθµίζει την έκφραση διαφόρων γονιδίων που σχετίζονται µε τη διαφοροποίηση πολλών ιστών 97. Ο CBF είναι µια ετεροδιµερής πρωτεΐνη που αποτελείται από µια υποµονάδα-α (CBFα), η οποία συνδέεται άµεσα µε το DNA και µια υποµονάδα-β (CBFβ), η οποία βοηθά τη σύνδεση της υποµονάδας-α στο DNA. Υπάρχουν τρία διαφορετικά γονίδια που κωδικοποιούν την υποµονάδα-α στον άνθρωπο και είναι τα AML1, AML2 και AML3, ενώ τα αντίστοιχα στους επίµυς είναι τα cbfα2, cbfα3 και cbfα1. Η υποµονάδα-α φέρει µια κοινή περιοχή σύνδεσης µε το DNA, που είναι γνωστή ως rhd (runt homology domain) και είναι οµόλογη µε το γονίδιο runt της δροσόφιλας. Οι υποµονάδες-α, εκτός από την περιοχή rhd, παρουσιάζουν σηµαντική ποικιλοµορφία στην αλληλουχία τους και εµφανίζουν µοναδικά πρότυπα έκφρασης. Στην ανθρώπινη λευχαιµία και τα δύο γονίδια, AML1 και CBFβ, αποτελούν στόχους χρωµοσωµικών αντιµεταθέσεων Οι µεταθέσεις αυτές µαζί µε τα αντίστοιχα χιµαιρικά γονίδια που προκύπτουν είναι οι εξής: 1a) t(8;21)(q22;q22) AML1-ETO, που συναντάται συνήθως στον Μ2 τύπο της ΟΜΛ 1b) t(3;21)(q26;q22) AML1-EVI1, που συναντάται στη βλαστική κρίση της ΧΜΛ 1c) inv16(p13;q22) CBFβ-MYH11, που συναντάται συνήθως στον Μ4 τύπο της ΟΜΛ µε ηωσινοφιλία Αξίζει να σηµειωθεί ότι η ηωσινοφιλία εµφανίζεται σε ορισµένες περιπτώσεις µε την AML1-ETO αντιµετάθεση και η CBFβ-MYH11 συναντάται ενίοτε στον τύπο Μ2. Επιπλέον, και οι δυο χρωµοσωµικές ανωµαλίες t(8;21) και inv(16) σχετίζονται µε ευνοϊκή πρόγνωση και σε πολλά κέντρα οι ασθενείς που τις φέρουν δεν υποβάλλονται σε αλλογενή µεταµόσχευση, κατά τη διάρκεια της πρώτης ύφεσης. Οι παρατηρήσεις αυτές στηρίζουν την άποψη ότι οι δύο χιµαι- 48

49 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ρικές πρωτεΐνες έχουν παρόµοια λειτουργική αλληλουχία. Πολλές µελέτες έχουν δείξει ότι µεταθέσεις που εµπλέκουν το γονίδιο CBF οδηγούν σε απώλεια της λειτουργίας του. Η στόχευση των γονιδίων AML1 και CBFβ, στα γονίδια σύντηξης AML1-ETO και CBFβ-MYH11 αντίστοιχα, σε knock-in επίµυς έχει παρόµοιο αποτέλεσµα µε τους CBF knock-out επίµυς 102,103. Επιπλέον, πειράµατα ενεργοποίησης µεταγραφικών παραγόντων αποδεικνύουν ότι ενώ ο CBF λειτουργεί φυσιολογικά ως µεταγραφικός ενεργοποιητής 104, ο CBF που προκύπτει από µετάθεση του γονιδίου του λειτουργεί ως αναστολέας της µεταγραφής γονιδίων, όπως της IL-3, της µυελοϋπεροξειδάσης, του GM-CSF και του υποδοχέα β των Τ-κυττάρων. Η στρατολόγηση µεταγραφικών καταστολέων από τις λευχαι- µογόνες χιµαιρικές πρωτεΐνες φαίνεται να αποτελεί ένα κοινό σηµείο στην παθογένεια της ΟΜΛ. Η λειτουργία του MYH11 στη CBFβ-MYH11 σύντηξη είναι λιγότερο κατανοητή, παρόλο που εµπλέκεται στον ολιγοµερισµό του CBF και στην απώλεια της λειτουργίας του. Η σύντηξη αυτή αφορά µετατοπίσεις στις οποίες παίρνει µέρος το χρωµόσωµα 16, όπως η inv(16)(p13q22) και η t(16;16)(p13;q22), που παρατηρούνται κυρίως στον υπότυπο Μ4eo της ΟΜΛ. Οι ασθενείς αυτοί, όπως και οι ασθενείς µε t(8;21), έχουν σχετικά καλή πρόγνωση και υψηλή πιθανότητα απάντησης σε σκευάσµατα που περιλαµβάνουν υψηλή δόση κυτοσίνης αραβινοσίδης (cytosine arabidosine) 105. Η χιµαιρική πρωτεΐνη CBFβ-MYH11 αποτελεί κυρίαρχο αναστολέα της δράσης του CBF, όπως συµβαίνει και µε το γονίδιο σύντηξης AML1-ETO 97. Η υπόθεση ότι τα δυο αυτά γονίδια σύντηξης έχουν παρόµοια δράση, υποστηρίζεται από πειράµατα σε επίµυς 102. Οι επίµυες επιδεικνύουν παρόµοιο φαινότυπο, είτε απουσία του γονιδίου AML1, είτε απουσία του CBFβ και εµφανίζουν εµβρυϊκή θνησιµότητα, απουσία αιµοποίησης από το εµβρυϊκό ήπαρ και αιµορραγία του κεντρικού νευρικού συστήµατος. Έτσι, όπως συµβαίνει και µε το AML1-ETO, η έκφραση του CBFβ-MYH11 δεν είναι αρκετή για να προκαλέσει λευχαιµία. Στο σηµείο αυτό θα πρέπει να αναφερθεί ότι δεν αναστέλλονται όλα τα γονίδια στόχοι από τη σύντηξη του CBF. Για παράδειγµα, το γονίδιο του υ- ποδοχέα του GM-CSF µεταγραφικά ενεργοποιείται από την πρωτεΐνη που προέρχεται από τη σύντηξη AML1-ETO 106. Έτσι, ο µηχανισµός µε τον οποίον οι συντήξεις του CBF απορυθµίζουν τη µεταγραφή, µπορεί να είναι πιο περίπλοκος απ ότι αρχικά θεωρήθηκε. Επιπλέον, ενώ µερικά γονίδια θεωρούνται στό- 49

50 χοι του CBF, δεν είναι ακόµη γνωστό ποιός από αυτούς τους στόχους παίζει ση- µαντικό ρόλο στη λευχαιµική µεταµόρφωση. Μέχρι σήµερα δεν έχει αναφερθεί ένα επιτυχές ζωικό µοντέλο µε CBF αντιµετάθεση β. Το γονίδιο MLL Οι χρωµοσωµικές µεταθέσεις που εµπλέκουν τη θέση 11q23 είναι πολύ συχνές στις οξείες λευχαιµίες του ανθρώπου. Στην πλειονότητα εµπλέκεται ένα µόνο γονίδιο, το MLL, που είναι γνωστό και ως ALL1, HRX ή HTRX 107,108. Ενώ µετατοπίσεις της θέσης 11q23 παρατηρούνται σε πολλούς υποτύπους της ΟΜΛ, κατά κύριο λόγο αυτές ανευρίσκονται στους τύπους Μ4 και Μ5. Το γονίδιο MLL κωδικοποιεί µια µεγάλη πρωτεΐνη 430 kd και εµφανίζει εκτενή οµολογία µε την πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο Drosophila trithorax της δροσόφιλας 109. Η φυσιολογική λειτουργία του MLL δεν είναι απολύτως γνωστή αλλά είναι πιθανό να ρυθµίζει την έκφραση γονιδίων, όπως συµβαίνει και µε το γονίδιο Drosophila trithorax. Στη δροσόφιλα, το trithorax ρυθµίζει την έκφραση των γονιδίων antennapedia και bithorax, τα προϊόντα των οποίων στη συνέχεια παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του προσθοπίσθιου άξονα, κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης Πάνω από 30 διαφορετικά συνεταιρικά γονίδια έχουν καθοριστεί για το MLL, τα οποία οδηγούν στην παραγωγή πρωτεϊνών. Μεταξύ αυτών περιλαµβάνεται ένας εσωτερικός διπλασιασµός και αυτοσύζευξη του MLL, όπως προκύπτει σε µερικούς ασθενείς µε τρισωµία Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι ενώ το MLL γονίδιο περιλαµβάνει 23 εξόνια, που εκτείνονται σε µήκος 100 kbp, όλα σχεδόν τα ρήγµατα του γονιδίου συµβαίνουν σε µια περιοχή 8,5 kbp (breakpoint cluster region) 108. Αυτή η διαπίστωση επιτρέπει τον καθορισµό του µεγαλύτερου ποσοστού των αντιµεταθέσεων του MLL, µε έναν απλό ανιχνευτή που είναι κοινός στις περισσότερες περιπτώσεις. Η ικανότητα λευχαιµικής µεταµόρφωσης αρκετών χιµαιρικών πρωτεϊνών έχει αποδειχθεί, τόσο σε συστήµατα µεταβίβασης µε ρετροϊούς 114, όσο και σε knock-in επίµυς 115,116. Τα διάφορα γονίδια που συντήκονται µε το MLL δε φαίνεται να παίζουν αυτά καθαυτά σηµαντικό ρόλο. Μάλλον το κρίσιµο µοριακό γεγονός είναι η διακοπή 50

51 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ της συνέχειας του MLL, αν και έχει δειχθεί ότι µεταλλάξεις που µειώνουν το µέγεθος της MLL πρωτεΐνης δεν είναι συχνές στην ΟΜΛ 78. Στο καρβοξυτελικό άκρο του γονιδίου MLL υπάρχει µια συντηρηµένη περιοχή, που καλείται SET. Η SET περιοχή έχει αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρά µε δύο πρωτεΐνες, την SNR1 και την INI1. Οι πρωτεΐνες αυτές είναι οµόλογες µε το σύµπλοκο SWI/SNF, το οποίο συµµετέχει στην αναδιάταξη της χρωµατίνης, παρουσία ATP 117. Ιδιαίτερη σηµασία παρουσιάζει το γεγονός ότι η SET περιοχή χάνεται κατά τη χρωµοσωµική µετατόπιση του MLL 118. Παρά τον µεγάλο όγκο των επιστηµονικών δεδοµένων, παραµένει αβέβαιο εάν οι χιµαιρικές πρωτεΐνες µεταµορφώνουν τα αιµοποιητικά κύτταρα, µέσω ενός κοινού µηχανισµού, ή υπάρχουν διαφορετικοί µηχανισµοί γ. Ο υποδοχέας RARα Από τις πιο καλά µελετηµένες µορφές της ΟΜΛ είναι η Οξεία Προµυελοκυτταρική Λευχαιµία (ΟΠΜΛ), τύπος Μ3 κατά FAB, η οποία αποτελεί το 5-8% όλων των περιπτώσεων της ΟΜΛ 78. Η χρήση του ATRA (All Trans Retinoic Acid) στη θεραπευτική προσέγγιση της Μ3 αποτελεί µια από τις σηµαντικότερες κατακτήσεις της µοριακής βιολογίας. Το ATRA έχει την ικανότητα να προκαλεί τη διαφοροποίηση των λευχαιµικών κυττάρων της Μ3 προς ουδετερόφιλα. Ακόµη, η κλινική παρατήρηση της επίδρασης του ATRA οδηγεί στην κατανόηση της γενετικής βάσης της ΟΠΜΛ 119. Σχεδόν όλες οι περιπτώσεις της Μ3 σχετίζονται µε τη µετατόπιση t(15;17)(q22;q11). Η αντιµετάθεση αυτή οδηγεί στη σύντηξη του γονιδίου RARα (Retinoic Acid Receptor-α), που βρίσκεται στο χρωµόσωµα 17 και κωδικοποιεί για τον υποδοχέα α του ρετινοϊκού οξέος, µε το γονίδιο PML (ProMyelocytic Leukemia), που εντοπίζεται στο χρωµόσω- µα15 101,120,121. Αποτέλεσµα αυτής της σύντηξης είναι η δηµιουργία της χιµαιρικής πρωτεΐνης PML-RARα, η οποία περιέχει θέση σύνδεσης για το ATRA και θέσεις σύνδεσης µε το DNA. Η ακριβής λειτουργία του φυσιολογικού PML γονιδίου δεν είναι γνωστή, αλλά υπό φυσιολογικές συνθήκες εντοπίζεται µέσα σε ιδιαίτερες πυρηνικές δο- µές, που καλούνται πυρηνικά σωµάτια ή PODs (PML Oncogenic Domains) 122. Σύντηξη του PML µε το RARα οδηγεί σε αλλαγή της θέσης του PML, το οποίο 51

52 εµφανίζει πλέον µεγαλύτερη διασπορά 123. Θεραπεία µε ATRA επαναφέρει το PML στα πυρηνικά σωµάτια, γεγονός που είναι σηµαντικό για τη θεραπευτική διαφοροποίηση µε ATRA. Μια άλλη πρόσφατη ανακάλυψη είναι ότι η χιµαιρική πρωτεΐνη PML-RARα λειτουργεί ως µεταγραφικός καταστολέας, ενώ ο ά- γριος τύπος του RARα λειτουργεί ως µεταγραφικός ενεργοποιητής. Το RARα έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά τόσο µε τη µεταγραφική συσκευή ενεργοποίησης, όσο και µε το NCoR/Sin3/HDAC1 κατασταλτικό σύµπλοκο. Σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις ρετινοϊκού οξέος, η αλληλεπίδραση µε το κατασταλτικό σύµπλοκο διαταράσσεται, µε αποτέλεσµα το RARα να λειτουργεί ως µεταγραφικός ενεργοποιητής. Η σύντηξη του PML µε το RARα οδηγεί σε αυξηµένη αλληλεπίδραση µε το σύµπλοκο, µε αποτέλεσµα να καταπιέζονται συνεχώς τα γονίδια-στόχοι του RARα Θεραπεία µε ATRA παρακάµπτει αυτή την αλλήλεπίδραση, αναστέλλοντας έτσι τη µεταγραφική καταστολή. Η άποψη αυτή ενισχύεται και από το γεγονός ότι διάφοροι αναστολείς της αποακετυλάσης των ιστονών HDAC1, προκαλούν επίσης ωρίµανση των κυττάρων της Μ Σπάνιες µορφές της Μ3 εµπλέκουν σύντηξη του RARα, όχι µε το PML, αλλά µε άλλα γονίδια, όπως είναι το NPM στο χρωµόσωµα 5q31, το NUMA στο 11q13 και το PLZF στο 11q Μια αρχική διαπίστωση ήταν ότι κύτταρα που εξέφραζαν το χιµαιρικό γονίδιο PLZF-RARα δεν ήταν ευαίσθητα στην επίδραση του ATRA ώστε να διαφοροποιηθούν. Το εύρηµα αυτό πρόσφατα εξηγήθηκε όταν διαπιστώθηκε ότι το γονίδιο PLZF λειτουργεί ως µεταγραφικός καταστολέας, µέσω της αλληλεπίδρασής του µε το NCoR/Sin3/HDAC1 κατασταλτικό σύµπλοκο 127,128. Αυτή η αλληλεπίδραση δεν επηρεάζεται από το ATRA. Ωστόσο, θεραπεία µε αναστολείς των HDAC προκαλεί διαφοροποίηση των κυττάρων που εκφράζουν τη χιµαιρική πρωτεΐνη PLZF-RARα. Υπάρχει λοιπόν µια κοινή παθογένεση για την εκδήλωση της ΟΠΜΛ και αυτή αφορά τη συνεχή στρατολόγηση αποακετυλασών των ιστονών και µεταγραφική καταστολή, που επιτυγχάνεται µε επίδραση στους προαγωγείς των γονιδίων-στόχων του RARα. 52

53 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σηµειακές µεταλλάξεις στην ΟΜΛ που οδηγούν: α. στην ενεργοποίηση γονιδίων της οικογένειας RAS Οι RAS είναι πρωτεΐνες που συνδέονται µε GDP/GTP και ρυθµίζουν τη µεταγωγή σήµατος σε µια πληθώρα διαφορετικών µονοπατιών 129,130. Γενικά, είναι µικρές πρωτεΐνες που σχετίζονται µε τη µεµβράνη και έχουν ενεργότητα GTPάσης. Οι RAS κυµαίνονται ανάµεσα σε «ενεργή» και «ανενεργή» κατάσταση ανάλογα µε το εάν είναι συνδεδεµένες µε GTP ή GDP, αντίστοιχα. Προκει- µένου οι RAS να ενεργοποιηθούν πρέπει να µεταφερθούν από το κυτταρόπλασµα στη µεµβράνη. Η διαµονή στη µεµβράνη εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από µια διαδικασία που περιλαµβάνει τροποποίηση των λιπιδίων της πρωτεΐνης RAS 131. Στη διαδικασία αυτή συµµετέχουν δύο τρανσφεράσες, οι οποίες µεταφέρουν πολυµερή ισοπρενοειδή στις RAS πρωτεΐνες 131. Η αδυναµία δράσης των ενζύµων είναι υπεύθυνη για τη διατήρηση των RAS στο χώρο του κυτταροπλάσµατος και αποτελεί την κυρίαρχη ιδέα για µια µοριακή θεραπεία, που θα έχει ως βάση την αναστολή αυτών των ενζύµων 132. Οι µεταλλάξεις των γονιδίων της οικογένειας RAS σχετίζονται µε ΟΜΛ ή µε Μ Σ και οι συχνότητες εµφάνισης ποικίλουν από 25% έως 44%, ανάλογα µε τον πληθυσµό που µελετάται 133. Οι RAS µεταλλάξεις έχουν γενικά πτωχή πρόγνωση 134. β. στη συνεχή ενεργοποίηση υποδοχέων τυροσινικής κινάσης Μεταλλάξεις των υποδοχέων FLT3 και c-kit έχουν αναγνωριστεί και περιγραφεί σε ένα σηµαντικό ποσοστό περιπτώσεων ΟΜΛ. Το FLT3 είναι το γονίδιο που µεταλλάσσεται πιο συχνά στην ανθρώπινη ΟΜΛ, µε συχνότητα που αγγίζει το 35% 135,136. Ο FLT3 είναι ένας υποδοχέας τυροσινικής κινάσης τάξης ΙΙΙ, ο οποίος εκφράζεται σε ανώριµα αιµοποιητικά κύτταρα και είναι απαραίτητος για την αύξηση, ανάπτυξη και διαφοροποίηση των stem cells Ο προσδέτης FL (FLT3 Ligand) του FLT3 είναι µια πρωτεΐνη, η οποία κατά τη σύνδεσή της προκαλεί τον διµερισµό του υποδοχέα. Ο διµερισµός του υποδοχέα FLT3 οδηγεί στην αυτοφωσφορυλίωση ενδοκυτταρικών αµινοξέων τυροσίνης, µε α- ποτέλεσµα να επάγεται ένας καταρράκτης αντιδράσεων κυτταρικής σηµατοδότησης 140. Ο ενεργοποιηµένος FLT3, µαζί µε αυξητικούς αιµοποιητικούς παρά- 53

54 γοντες, προάγει τον πολλαπλασιασµό των προγονικών αιµοποιητικών κυττάρων 141. Έκφραση του FLT3 ανευρίσκεται στην πλειονότητα των ασθενών µε ΟΜΛ, ενώ πολλές µελέτες κάνουν λόγο για τη σηµασία αυτού του υποδοχέα στην επιβίωση και διαίρεση των λευχαιµικών βλαστών 141. Μέχρι τώρα έχουν αναγνωριστεί δύο τύποι µεταλλάξεων που σχετίζονται µε το γονίδιο FLT Ο πρώτος τύπος αφορά στον διαδοχικό διπλασιασµό ε- σωτερικών ακολουθιών (Internal Tandem Duplications, ITDs), που βρίσκονται ανάµεσα στα εξόνια 11 και 12 και έχουν µήκος bp. Το τµήµα αυτό του DNA κωδικοποιεί για την περιοχή του υποδοχέα, που εντοπίζεται πλησίον της µεµβράνης (JuxtaMembrane domain, JM). Οι επαναλαµβανόµενες ακολουθίες που δηµιουργούνται µέσα στην περιοχή αυτή βρίσκονται πάντοτε εντός αναγνωστικού πλαισίου, έχουν ορθόδροµη φορά και οδηγούν στην επιµήκυνση της JM περιοχής 143. Οι ακολουθίες αυτές παράγουν µεταλλαγµένες πρωτεΐνες, οι οποίες ενεργοποιούνται συνεχώς, διότι έχουν την ικανότητα να διµερίζονται και να αυτοφωσφορυλιώνονται απουσία προσδέτη 144. Μια πληθώρα µελετών αποκάλυψε ότι FLT3-ITDs εντοπίζονται στο 1/4 των περιπτώσεων µε ΟΜΛ. Ο δεύτερος τύπος µεταλλάξεων αφορά σηµειακές µεταλλάξεις, που συµβαίνουν συνήθως στον ενεργό βρόχο του FLT3. Ο ενεργός βρόχος υπό φυσιολογικές συνθήκες εµποδίζει την πρόσβαση του ATP και του υποστρώµατος στην περιοχή της κινάσης, εωσότου συνδεθεί ο προσδέτης στον υποδοχέα και προκύψει η φωσφορυλίωση. Η αντικατάσταση της ασπαραγίνης στη θέση 835 από τυροσίνη (Asp835Tyr) είναι η πιο συχνή σηµειακή µετάλλαξη του ενεργού βρόχου και οδηγεί στη συνεχή ενεργοποίηση του υποδοχέα FLT Αυτό έχει ως αποτέλεσµα τη µεταβολή της ρύθµισης των αντιδράσεων που παίρνουν µέρος στη µοριακή σηµατοδότηση και έπονται της ενεργοποίησης του FLT3. Παρόµοιο αποτέλεσµα έχουν και άλλες µεταλλάξεις του ενεργού βρόχου 30,145, οι οποίες σε συνδυασµό µε τις FLT3-ITDs εντοπίζονται στο 1/3 όλων των περιπτώσεων µε ΟΜΛ. Η µεγάλη διάδοση και συχνότητα των FLT3 µεταλλάξεων, καθιστούν αυτόν τον υποδοχέα έναν σηµαντικό µοριακό στόχο για τη θεραπευτική προσέγγιση της ΟΜΛ. Το γονίδιο c-kit κωδικοποιεί για µια άλλη διαµεµβρανική πρωτεΐνη µε δράση κινάσης τυροσίνης και αποτελεί ένα πρωτο-ογκογονίδιο, που θεωρείται ότι παίζει σηµαντικό ρόλο στη φυσιολογική αιµοποίηση. Έκφραση του c-kιτ έχει βρεθεί σε έναν µεγάλο αριθµό αιµοποιητικών κυτταρικών σειρών, σε πρώι- 54

55 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ µους βλάστες ασθενών µε ΟΜΛ και σε µικρότερο ποσοστό σε φυσιολογικά κύτταρα µυελού των οστών 146. Η φωσφορυλίωση της τυροσίνης και η ενεργοποίηση του c-kιτ επάγεται από τον παράγοντα SCF των stem cells (Stem Cell Factor) και οδηγεί στον πολλαπλασιασµό των λευχαιµικών κυττάρων, σε µια µεγάλη οµάδα ασθενών µε ΟΜΛ 147. Η συνεχής ενεργοποίηση του υποδοχέα c- KΙΤ, που συµβαίνει ανεξάρτητα από την ύπαρξη προσδέτη και είναι χαρακτηριστική των λευχαιµικών κυττάρων, υποδηλώνει ότι ο υποδοχέας αυτός εµπλέκεται στον αυξηµένο ρυθµό πολλαπλασιασµού και στην ανώµαλη διαφοροποίηση των καρκινικών κυττάρων 148. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι υπάρχει άµεση συσχέτιση ανάµεσα στα επίπεδα φωσφορυλίωσης του c-kιτ και στον ρυθµό πολλαπλασιασµού κυτταρικών σειρών της ΟΜΛ 149. Εκτός από σηµειακές µεταλλάξεις της θέσης 816 του c-kιτ, έχουν επίσης περιγραφεί διάφορα ελλείµµατα, καθώς και παρεµβολές διαφόρων αλληλουχιών 28,150. Η ανακάλυψη µεταλλάξεων που σχετίζονται µε υποδοχείς τυροσινικής κινάσης είναι µέγιστης σηµασίας για τη θεραπευτική µοριακή στόχευση της ΟΜΛ, όπως κατ αναλογία εφαρµόζεται στη ΧΜΛ, µε παρουσία του χιµαιρικού γονιδίου BCR-ABL (Imatinib Mesylate ή Gleevec) 151,152. γ. στην απώλεια της λειτουργίας των γονιδίων AML1, C/EBPA και GATA-1 Μεταλλάξεις του γονιδίου AML1 προκύπτουν στο 3-5% των ασθενών µε ΟΜΛ, µε µεγαλύτερη συχνότητα στον υπότυπο Μ0 (25%) και στην ΟΜΛ ή στα Μ Σ µε τρισωµία ,154. Μεταλλάξεις του C/EBPA οδηγούν σε µείωση της ικανότητας διαφοροποίησης των αιµοποιητικών κυττάρων. Μελέτες των τελευταίων ετών δείχνουν ότι οι µεταλλάξεις αυτές έχουν γενικά ευνοϊκή πρόγνωση 155. Τέλος, µεταλλάξεις του GATA-1 σχετίζονται µε την οξεία µεγακαρυοβλαστική λευχαιµία, τύπος Μ7 κατά FAB, και συγκεκριµένα µε τις λευχαιµίες που προκύπτουν σε ασθενείς µε σύνδροµο Down (τρισωµία 21) 156. Το γονίδιο GATA-1 φαίνεται να είναι ιδιαίτερα σηµαντικό για τη φυσιολογική ανάπτυξη της ερυθράς και µεγακαρυοκυτταρικής σειράς, ενώ η απουσία του προάγει τη συσσώρευση ανώριµων µεγακαρυοκυττάρων 157. Το γεγονός ότι µεταλλάξεις του GATA-1 προκύπτουν σχεδόν σε κάθε περίπτωση συνδρόµου Down µε µυελοϋπερπλαστική διαταραχή, υποδηλώνει ότι η απορρύθµιση του GATA-1 είναι ένα 55

56 απαραίτητο βήµα για την εµφάνιση της νόσου σε αυτήν την οµάδα των ασθενών Ηλικιωµένοι και ΟΜΛ Η ηλικία αποτελεί έναν από τους πιο σηµαντικούς επιβαρυντικούς παράγοντες στην ΟΜΛ και όπως αναφέρθηκε, η απάντηση στη θεραπεία και η επίτευξη πλήρους ύφεσης δυσχαιρένουν όσο αυξάνει η ηλικία 5,6,159,160. Περισσότερο από το 50% όλων των ασθενών µε ΟΜΛ είναι ηλικίας άνω των 60 ετών 5-7,9. εδοµένου ότι η νόσος είναι άµεσα εξαρτηµένη µε την ηλικία, η συχνότητά της στους ενήλικες αναµένεται να αυξηθεί τα επόµενα χρόνια, καθώς αυξάνεται το προσδόκιµο ζωής των κατοίκων των αναπτυγµένων χωρών Για τον λόγο αυτόν, η ΟΜΛ των ηλικιωµένων θα αποτελέσει ένα σηµαντικό αντικείµενο συζήτησης και έρευνας στα χρόνια που θα έρθουν. Αν και το ηλικιακό όριο προκειµένου να χαρακτηριστεί ένας ασθενής ως «ηλικιωµένος» παραµένει αυθαίρετο, οι διάφορες µελέτες έχουν υιοθετήσει ως κατώφλι τις ηλικίες από 55 έως 70 έτη 64, Ωστόσο, δεδοµένης της αυξανόµενης διάρκειας ζωής, θα πρέπει στο µέλλον το κατώτατο όριο να αυξηθεί στα έτη. Στην παρούσα µελέτη, ηλικιωµένοι θεωρήθηκαν οι ασθενείς µε ηλικία µεγαλύτερη των 60 ετών. Είναι γενικά αποδεκτό ότι, οι ηλικιωµένοι ασθενείς µε ΟΜΛ έχουν πτωχότερη πρόγνωση σε σχέση µε τους νέους 171,172. Αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο στο γεγονός ότι η ΟΜΛ των ηλικιωµένων έχει ιδιαίτερα βιολογικά χαρακτηριστικά, που τη διαφοροποιούν από αυτή νεότερων ασθενών ,166,167,170, Τα κύρια αυτά βιολογικά χαρακτηριστικά που είναι δυνατό να θεωρηθούν ως προγνωστικοί παράγοντες της ΟΜΛ των ηλικιωµένων, είναι τα εξής: α) Η ΟΜΛ προέρχεται από ένα αρχέγονο αιµοποιητικό stem cell 176. β) Υψηλή συχνότητα δυσπλαστικών αλλοιώσεων σε όλες τις κυτταρικές σειρές. γ) Υψηλή συχνότητα αιµατολογικών διαταραχών, όπως κυτταροπενίες που προηγήθηκαν της διάγνωσης της ΟΜΛ. δ) Υψηλή πιθανότητα εµφάνισης δευτεροπαθούς ΟΜΛ µετά από Μ Σ ή µετά από χηµειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. 56

57 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ε) Υψηλή συχνότητα κλωνικών υφέσεων και βραχεία διάρκεια πλήρους ύφεσης. στ) Έκφραση αντιγόνων που σχετίζονται µε τα άωρα αιµοποιητικά κύτταρα, π.χ. έκφραση του CD34. Έχει επίσης προταθεί ότι ενώ στους νεότερους α- σθενείς υπάρχουν ερυθροκύτταρα και αιµοπετάλια που προέρχονται από τα φυσιολογικά stem cells, στους ηλικιωµένους ασθενείς όλα τα αιµοποιητικά κύτταρα προέρχονται από τον λευχαιµικό κλώνο. ζ) Υψηλή συχνότητα χρωµοσωµικών ανωµαλίων που σχετίζονται µε δυσµενή καρυότυπο, όπως 7/7q-, 5/5q-, ανωµαλίες του 11q ή 17p, τρισωµία 8, σύνθετος καρυότυπος ή πολλαπλές κυτταρογενετικές ανωµαλίες 83. η) Χαµηλή συχνότητα χρωµοσωµικών ανωµαλίων που σχετίζονται µε ευνοϊκό καρυότυπο, όπως t(8;21), t(15;17) και inv(16). θ) Υψηλά επίπεδα έκφρασης του γονιδίου MDR1 (Multi Drug Resistance phenotype -1), που ευθύνεται για την αντίσταση στη χηµειοθεραπευτική αγωγή. ι) Υψηλή συχνότητα µεταλλάξεων του γονιδίου και της πρωτεΐνης MSH2, η οποία εµπλέκεται στην επιδιόρθωση του DNA 177. κ) Χαµηλή συχνότητα µεταλλάξεων του παράγοντα CBF, που συνδέεται µε ευνοϊκή πρόγνωση. Η εντατική χηµειοθεραπεία και η µεταµόσχευση του µυελού των οστών έ- χουν βελτιώσει την πρόγνωση της ΟΜΛ στους νέους και στους µέσης ηλικίας ασθενείς, αλλά ελάχιστα ωφέλησαν τους ηλικιωµένους. Οι νέες αυτές θεραπείες είναι ιδιαίτερα τοξικές, µε αποτέλεσµα να µην είναι ανεκτές από τους ασθενείς µεγάλης ηλικίας, οι οποίοι συχνά εµφανίζουν και άλλα προβλήµατα υγείας που περιπλέκουν περισσότερο την κατάστασή τους. Έτσι, όταν αντιµετωπίζονται ηλικιωµένοι ασθενείς µε ΟΜΛ, το κύριο µέληµα είναι να καθοριστεί τί είδους θεραπεία πρέπει να εφαρµοστεί: η κλασική, που κατά κανόνα εφαρµόζεται σε νέους ασθενείς, ή η συντηρητική θεραπεία. Η κλασική θεραπεία της ΟΜΛ περιλαµβάνει τη φάση εφόδου, µε σκοπό την επίτευξη ύφεσης και είναι γνωστή ως σχήµα «3+7», δηλαδή χορήγηση ανθρακυκλίνης για 3 ηµέρες και κυτοσίνης αραβινοσίδης (Ara-C) για 7 ηµέρες. ύο έως τρεις κύκλοι αυτού του σχήµατος µπορεί να προκαλέσουν πλήρη ύφεση της ΟΜΛ σε νέους ασθενείς. Αντίθετα, οι ηλικιωµένοι ασθενείς δεν ανέχονται καλά αυτή τη θεραπεία 160,178,179. Στους ηλικιωµένους ασθενείς, ο µέσος όρος επιβίωσης από την έναρξη της θεραπείας (σχήµα «3+7») έως τον θάνατο, υπολογίζεται σε 5-10 µήνες 6,180. Πλή- 57

58 Πλήρης ύφεση υπολογίζεται ότι επιτυγχάνεται σε ποσοστό περίπου 50% των ηλικιωµένων ασθενών, ωστόσο οι υφέσεις αυτές είναι παροδικές και σπάνια διαρκούν περισσότερο από 12 µήνες. Η πιθανότητα να παραµείνουν οι ασθενείς αυτοί σε ύφεση, τρία χρόνια µετά την έναρξη της θεραπείας, -διάστηµα πέραν του οποίου µπορεί να θεωρηθούν «δυνητικά θεραπευθέντες» είναι µικρότερη του 10%. Σε έναν σηµαντικό βαθµό, τα αποτελέσµατα αυτά αντανακλούν τη συσχέτιση της µεγάλης ηλικίας, µε παράγοντες που προκαλούν ανθεκτικότητα στη θεραπεία της ΟΜΛ, ή τον πρόωρο θάνατο κατά την έναρξη της θεραπείας. Αν και τα δεδοµένα αυτά δεν είναι ευνοϊκά για την εφαρµογή της κλασικής θεραπείας στους ηλικιωµένους ασθενείς, υπάρχουν άλλες µελέτες που δείχνουν ότι τα αποτελέσµατα σε µερικούς από αυτούς παρεκκλίνουν σηµαντικά από τον µέσο όρο των θεραπευτικών αποτελεσµάτων που αναφέρθηκαν 6,164,182,183. Έτσι, είναι ιδιαίτερα σηµαντικό να καθορισθεί εάν ένας ασθενής, αν και η- λικιωµένος, έχει πιθανότητες να ωφεληθεί από την κλασική θεραπεία της ΟΜΛ, λαµβάνοντας πάντα υπόψην άλλους συνυπάρχοντες παράγοντες, που θα µπορούσαν να µετριάσουν τη δυσµενή επίδραση της ηλικίας. Σηµαντικό ρόλο µεταξύ αυτών των παραγόντων παίζουν, η σχετικά µικρότερη ηλικία (π.χ ε- τών), η καλή φυσική κατάσταση, η φυσιολογική λειτουργία των οργάνων, η de novo ΟΜΛ, η ενδιάµεση ή ευνοϊκή κυτταρογενετική ανάλυση, ενώ πιο πρόσφατα προστέθηκε η έλλειψη της έκφρασης του γονιδίου MDR1, που ευθύνεται για την αντίσταση στη φαρµακευτική αγωγή 164. Το γονίδιο MDR1 κωδικοποιεί για µια µεµβρανική γλυκοπρωτεΐνη µεγέθους 170kd, η οποία λειτουργεί ως αντλία εκροής των φαρµάκων 184. Έκφραση του γονιδίου MDR1 βρέθηκε στο 71% ηλικιωµένων ασθενών µε ΟΜΛ και µόλις στο 35% νεότερων ασθενών 184. Αποτελέσµατα της µελέτης των Leith και συν. 164 δείχνουν την επίδραση αυτών των παραγόντων στον επανακαθορισµό της πρόγνωσης. Πιο συγκεκριµένα, ενώ το ποσοστό της πλήρους ύφεσης, µετά την εφαρµογή της κλασικής θεραπείας «3+7», στο σύνολο των ασθενών ήταν 45% (146 ασθενείς µε ΟΜΛ και ηλικία µεγαλύτερη των 55 ετών), σε 27 από αυτούς που είχαν de novo ΟΜΛ, µέτρια ή ευνοϊκή κυτταρογενετική ανάλυση και απουσία έκφρασης του γονιδίου MDR, το ποσοστό της πλήρους ύφεσης έφτανε στο 81% 164. Παροµοίως, σε µία µελέτη που έγινε το 2000 από τους Estey και συν. 185 στο Ογκολογικό Κέντρο «M.D. Anderson» του Πανεπιστηµίου του Τέξας, βρέθηκε ότι σε 64 από τους 886 ασθενείς, ηλικίας ετών, το ποσοστό πλήρους ύφεσης ήταν 72%. Οι 64 58

59 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ασθενείς είχαν καλή γενική κατάσταση (κάτω από 3 στην κλίµακα Zubrob), φυσιολογικά επίπεδα χολερυθρίνης και κρεατινίνης, φυσιολογικό καρυότυπο, ή πολύ σπάνια inv(16) ή t(8;21), και έπασχαν από de novo ΟΜΛ. Το ποσοστό αυτό έρχεται σε αντίθεση µε το ποσοστό πλήρους ύφεσης στους υπόλοιπους 822 ασθενείς, ηλικίας µεγαλύτερης των 65 ετών, που έφθανε στο 48%. Η µέση επιβίωση για την πρώτη οµάδα ήταν 18 µήνες και περίπου 15% αυτών ζούσαν σε πρώτη πλήρη ύφεση για τρία χρόνια. Οι 64 ασθενείς της µελέτης του κέντρου «M.D. Anderson» µε τους ευνοϊκούς παράγοντες και το υψηλότερο ποσοστό πλήρους ύφεσης αποτελεί το 7% των ασθενών που µελετήθηκαν. Τα αποτελέσµατα ήταν απογοητευτικά για τους υπόλοιπους ασθενείς και χειροτέρευαν µε την άνοδο της ηλικίας και την παρουσία µη ευνοϊκών προγνωστικών παραγόντων. Πιο συγκεκριµένα, 194 ασθενείς που είχαν έναν µόνο µη ευνοϊκό παράγοντα, εµφάνιζαν µέσο χρόνο επιβίωσης 10 µήνες, ενώ µόνον 9% από αυτούς επέζησε µε πλήρη ύφεση για τρία χρόνια, µε την εφαρµογή της κλασικής θεραπείας 185. Η γενική άποψη που επικρατεί σήµερα είναι ότι η κλασική θεραπεία σε α- σθενείς ηλικίας µεγαλύτερης των 65 ετών, µε κακή γενική κατάσταση, διαταραγµένη λειτουργία οργάνων, δευτεροπαθή ΟΜΛ ή µη ευνοϊκό καρυότυπο, είναι απογοητευτική και σ αυτές τις περιπτώσεις πρέπει να εφαρµόζεται η συντηρητική αγωγή. Οι ηλικιωµένοι ασθενείς µε ΟΜΛ έχουν περισσότερα µη ευνοϊκά χαρακτηριστικά στην έναρξη της νόσου και η θεραπεία δυσκολεύει από την α- δυναµία τους να αντέχουν την εντατική χηµειοθεραπεία. Επιπλέον, η θεραπεία σταθεροποίησης που εφαρµόζεται µετά την ύφεση, στους ηλικιωµένους ασθενείς περιλαµβάνει χρήση χαµηλότερων δόσεων, για να είναι ανεκτή ακόµη και από τους ασθενείς µε ευνοϊκούς προγνωστικούς παράγοντες 186. Το γεγονός λοιπόν ότι µια βιολογικά µη ευνοϊκή νόσος υποθεραπεύεται είναι κριτικής σηµασίας. Για τον λόγο αυτόν είναι απαραίτητο να βρεθούν νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις, λιγότερο τοξικές, που θα υπερπηδούν δυσµενείς προγνωστικούς παράγοντες και θα οδηγούν µε ασφάλεια στην ύφεση της ΟΜΛ στους ηλικιωµένους ασθενείς. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού, πρέπει να µελετηθεί σε βάθος η παθογένεια της ΟΜΛ και να καθοριστεί η δράση των παραγόντων που διέπουν τους ενδοκυττάριους µοριακούς µηχανισµούς. 59

60 2. Κυτταρικός Θάνατος Ο κυτταρικός θάνατος αποτελεί µια ακριβή, σύνθετη και καλά οργανωµένη κυτταρική λειτουργία που έχει φυσιολογικό ρόλο, τόσο κατά την ανάπτυξη ενός οργανισµού, όσο και κατά την διάρκεια της ενήλικης ζωής του. Τις τρεις τελευταίες δεκαετίες έχουν αναγνωριστεί µε βάση τη µορφολογία και τη βιοχηµεία, δύο διαφορετικοί τύποι κυτταρικού θανάτου: η απόπτωση και η νέκρωση Απόπτωση ή Προγραµµατισµένος Κυτταρικός Θάνατος Η απόπτωση, ή αλλιώς o προγραµµατισµένος κυτταρικός θάνατος, είναι ο µηχανισµός που ρυθµίζει την ισορροπία µεταξύ του κυτταρικού πολλαπλασιασµού και του κυτταρικού θανάτου, µε τελικό στόχο τη διατήρηση της οµοιόστασης των ιστών. Οι πρώτες παρατηρήσεις του µηχανισµού του προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου έγιναν το 1900, ωστόσο ο όρος «απόπτωση», ο ο- ποίος προέρχεται από την ελληνική γλώσσα, χρησιµοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1972, από τους Kehr και συν. 187 Οι ερευνητές αυτοί ήταν οι πρώτοι που µελέτησαν και περιέγραψαν λεπτοµερώς τα µορφολογικά στάδια του φαινοµένου και χρησιµοποίησαν τη λέξη «απόπτωση», η οποία αναφέρεται στον τρόπο µε τον οποίο ένα δένδρο ρίχνει τα φύλλα του, προκειµένου να τονίσουν το γεγονός ότι αυτή η µορφή κυτταρικού θανάτου είναι προγραµµατισµένη και ενεργητική και σε καµία περίπτωση τυχαία ή καταστροφική. Παρόλο που η απόπτωση θεωρήθηκε αρχικά ένας µοναδικός τύπος κυτταρικού θανάτου µε ιδιαίτερα µορφολογικά χαρακτηριστικά, διάφορες µελέτες που έγιναν στην πορεία οδήγησαν στο συµπέρασµα ότι η απόπτωση αποτελεί µάλλον ένα σύνθετο γενετικό πρόγραµµα «κυτταρικής αυτοκτονίας» 187. Έχει δειχθεί ότι τα περισσότερα κύτταρα, αν όχι όλα, διαθέτουν ένα εσωτερικό πρόγραµµα «αυτοκτονίας», που υπό κανονικές συνθήκες βρίσκεται σε καταστολή. Εξωτερική ή εσωτερική ενεργοποίηση των µηχανισµών του προγραµµατισµένου θανάτου οδηγεί το κύτταρο σε θάνατο. Τέτοια αποπτωτικά µονοπάτια έχουν χαρακτηριστεί ως ενδογενή και εξωγενή, µιτοχονδριακά ή µέσω ειδικών «υποδοχέων θανάτου», p53-εξαρτώµενα ή ανεξάρτητα, καθώς και εξαρτηµένα ή µη από κασπάσες, µε βάση τις φάσεις έναρξης, καθορισµού και εκτέλεσης των διαδικασιών της απόπτωσης. 60

61 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η απόπτωση είναι µια θεµελιώδης διαδικασία τόσο για την ανάπτυξη, όσο και για τη διατήρηση της δοµής και της οργάνωσης ενός πολυκύτταρου οργανισµού και σχετίζεται µε ένα ευρύ φάσµα φυσιολογικών και παθολογικών ερεθισµάτων. Στα φυσιολογικά ερεθίσµατα εντάσσονται η επίδραση ορµονών ή άλλων παραγόντων (π.χ. αυξητικοί παράγοντες, TNF, νευροδιαβιβαστές, ουσίες συνδετικού υποστρώµατος, κ. ά.) κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης ή υποστροφής των ιστών, καθώς και κατά την ωρίµανση οργανικών συστηµάτων του ανοσοποιητικού συστήµατος. Στα παθολογικά ερεθίσµατα, περιλαµβάνονται η ιονίζουσα ακτινοβολία, τα κυτταροτοξικά φάρµακα και η ισχαιµία Με τη διαδικασία της απόπτωσης αποµακρύνονται κύτταρα, κυτταρικές δοµές ή τµήµατα ιστών, που έχουν επιτελέσει τον ρόλο τους και είναι πλέον άχρηστα ή βλαβερά για τον οργανισµό στον οποίον ανήκουν. Η απόπτωση είναι επίσης υπεύθυνη για τη διατήρηση σταθερού αριθµού κυττάρων στους ιστούς, καθώς και για τη γρήγορη αντικατάστασή τους, όπως συµβαίνει µε τα ερυθρά αιµοσφαίρια που κυκλοφορούν στο αίµα. Η όλη διαδικασία του κυτταρικού θανάτου δε γίνεται µε τρόπο τυχαίο ή παθητικό, αλλά αποτελεί ενεργητικό φαινόµενο και επιτελείται από συγκεκριµένες πρωτεΐνες και µέσω καθορισµένης οδού, η οποία βρίσκεται κάτω από γονιδιακό έλεγχο Η απόπτωση είναι µια ταχύτατη διαδικασία, κατά την οποία το κύτταρο εξαφανίζεται µέσα σε 4-6 ώρες και επιπλέον λειτουργεί ως ένας α- µυντικός µηχανισµός, καταστρέφοντας κύτταρα που έχουν υποστεί βλάβη στο γενετικό τους υλικό ή έχουν µολυνθεί µε ιούς. Έτσι, παρεµποδίζεται η εξάπλωση βλαβερών µεταλλάξεων, συµπεριλαµβανοµένων και εκείνων που οδηγούν σε καρκινογένεση. Η απόπτωση γενικά δεν αποτελεί µια διαδικασία ξεχωριστών και καθορισµένων γεγονότων, αλλά έναν συνδυασµό εξέλιξης περισσότερων του ενός µονοπατιών, που αλληλορυθµίζονται και αλληλοσυνδέονται. Η διαδικασία του προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου περιλαµβάνει συγκεκριµένες µορφολογικές αλλοιώσεις της κυτταρικής δοµής, οι οποίες έχουν καθορισθεί µε παρατήρηση στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο 187,188 (εικόνα 5). Τα αρχικά ευρήµατα συνίστανται σε συµπύκνωση και περιφερική διάταξη της πυρηνικής χρωµατίνης. Το DNA τεµαχίζεται από ειδικές ενδονουκλεάσες και ο κυτταροσκελετός αποδιοργανώνεται. Οι ενδονουκλεάσες κόβουν το κυτταρικό γονιδίωµα, πρώτα σε µεγάλα θραύσµατα DNA και έπειτα σε µικρότερα τµήµατα 191,192. Ακολουθεί κατακερµατισµός του πυρήνα και στη συνέχεια εµφάνιση 61

62 κυτταροπλασµατικών πτυχώσεων, οι οποίες περιβάλλουν τα διασπασθέντα πυρηνικά τµήµατα. Στο τελικό στάδιο παρατηρείται η διάσπαση του κυττάρου στα επονοµαζόµενα «αποπτωτικά σωµάτια», τα οποία περιβάλλονται από µεµβράνη (εικόνα 4). Εικόνα 4. Φυσιολογικό κύτταρο και κύτταρο που αποπίπτει µε τη χαρακτηριστική µορφολογία των «αποπτωτικών σωµατίων». Ένα σηµαντικό σηµείο στη διαδικασία της απόπτωσης είναι η απώλεια της ασυµµετρίας στη διάταξη των φωσφολιπιδίων της κυτταρικής µεµβράνης, γεγονός που επιτρέπει την αναγνώριση των αποπτωτικών σωµατίων από τα φαγοκύτταρα του οργανισµού και την κινητοποίηση των µηχανισµών φαγοκυττάρωσης και πέψης αυτών. Ο καταβολισµός των κυτταροπλασµατικών και πυρηνικών υπολειµµάτων γίνεται από τα λυσοσωµικά ένζυµα των φαγοκυττάρων. Έ- τσι, τα αποπτωτικά κύτταρα δεν απελευθερώνουν το περιεχόµενό τους, ώστε να προκαλέσουν τοπικά απόκριση φλεγµονής και δε βλάπτουν τα παρακείµενα κύτταρα, όπως συµβαίνει µε τα νεκρωτικά κύτταρα

63 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.2. Νέκρωση Ως νέκρωση αναφέρεται ο τρόπος θανάτου των κυττάρων µετά από αιφνίδια και δριµεία προσβολή από ένα ερέθισµα, π.χ. από υπεριώδη ακτινοβολία ή τοξικές ουσίες. Οι διαφορές της νέκρωσης από την απόπτωσης φαίνονται στην εικόνα 5. Εικόνα 5. Νέκρωση και Απόπτωση. 63

64 Κατά τη νέκρωση παρουσιάζονται γρήγορες αλλαγές στο µέγεθος και τη λειτουργικότητα των µιτοχονδρίων, µε αποτέλεσµα το κύτταρο να αδυνατεί να διατηρήσει τη δοµική του ακεραιότητα και να πεθαίνει. ιαπιστώνεται επίσης µια ασαφής συνάθροιση της πυρηνικής χρωµατίνης, σε αντίθεση µε το πρότυπο της περιφερικής διάταξης και συµπύκνωσης, που χαρακτηρίζει την απόπτωση. Ένα από τα βασικά σηµεία της νεκρωτικής διαδικασίας είναι η αιφνίδια διαταραχή της πλασµατικής µεµβράνης. Μόλις χαθεί η ακεραιότητα της µεµβράνης, τροποποιείται η ωσµωτική πίεση, που οδηγεί στην είσοδο νερού και ηλεκτρολυτών µέσα στο κύτταρο, µε αποτέλεσµα τη διόγκωση του κυττάρου και τελικά τη λύση του. Η λύση του κυττάρου συνεπάγεται την έκλυση των κυτταρικών οργανιδίων στον ενδιάµεσο εξωκυττάριο χώρο και την πρόκληση φλεγµονής. Η ενεργοποίηση τοπικής φλεγµονώδους αντίδρασης, που επιτυγχάνεται µε τη διήθηση φαγοκυττάρων στην πληγείσα περιοχή έχει ως συνέπεια την πρόκληση βλαβών και στα γειτονικά κύτταρα, µε αποτέλεσµα να νεκρώνεται τελικά ένας µεγάλος πληθυσµός κυττάρων. Η κυτταρική νέκρωση, ως παθητικό φαινό- µενο δεν απαιτεί κατανάλωση ενέργειας, δε συνδυάζεται µε µεταγραφή και έκφραση γονιδίων, ενώ η διάσπαση του πυρηνικού DNA γίνεται χωρίς τη δράση ειδικών ενδονουκλεασών, µε εντελώς ακανόνιστο και τυχαίο τρόπο 193, Ο µηχανισµός της απόπτωσης Ένα µεγάλο εύρος φυσιολογικών και παθολογικών ερεθισµάτων είναι υ- πεύθυνα για την έναρξη της διαδικασίας της απόπτωσης Τα ερεθίσµατα αυτά οµαδοποιούνται σε τέσσερεις κατηγορίες. Η πρώτη κατηγορία ερεθισµάτων περιλαµβάνει βλάβες στο DNA που προκαλούνται από διάφορους παράγοντες, όπως η ιονίζουσα ακτινοβολία και τα αλκυλιωτικά φάρµακα. Η δεύτερη κατηγορία περιλαµβάνει ερεθίσµατα, τα οποία ενεργοποιούν «υποδοχείς θανάτου». Η ενεργοποίηση αυτή επιτυγχάνεται, είτε µέσω πρόσδεσης διαφόρων µορίων στους αντίστοιχους υποδοχείς (π.χ. ο FasL στον υποδοχέα Fas, ο TNF στον υποδοχέα TNF-R), είτε µέσω αποµάκρυνσης διαφόρων αυξητικών παραγόντων, όπως είναι η ιντερλευκίνη-3 (IL-3) 198. Η τρίτη κατηγορία περιλαµβάνει βιοχηµικούς παράγοντες, οι οποίοι ενεργοποιούν συστατικά του αποπτωτικού µονοπατιού και περιλαµβάνουν κατά κύριο λόγο φωσφατάσες 196 και αναστολείς κινα- 64

65 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ σών (π.χ. καλφοστίνη C, σταυροσπορίνη). Η τέταρτη κατηγορία περιλαµβάνει τους παράγοντες εκείνους που προκαλούν άµεση βλάβη στις κυτταρικές µεµβράνες, όπως είναι η θερµότητα, η υπεριώδης ακτινοβολία και οι διάφοροι οξειδωτικοί παράγοντες (π.χ. υπεροξείδιο του υδρογόνου, ελεύθερες ρίζες οξυγόνου). Πολλά από τα παραπάνω ερεθίσµατα είναι δυνατό σε µεγαλύτερες δόσεις να προκαλέσουν νέκρωση των κυττάρων. Η απόπτωση ακολουθεί δύο βασικά µονοπάτια, το εξωγενές και το ενδογενές ή µιτοχονδριακό, τα οποία διαφέρουν ως προς την ενεργοποίηση των µονοπατιών µεταγωγής σήµατος, που οδηγούν στον κυτταρικό θάνατο. Τόσο το εξωγενές, όσο και το ενδογενές µονοπάτι διασταυρώνονται στα µιτοχόνδρια. Ένα τρίτο µονοπάτι που συµβαίνει πιο σπάνια, φαίνεται να σχετίζεται µε την ενεργοποίηση των κασπασών από µία πρωτεάση σερίνης (Granzyme B), η οποία συντίθεται στα κυτταροτοξικά λεµφοκύτταρα και εισέρχεται στα κύτταρα µέσω της περφορίνης (perforin) ή σύνδεσης µε τον υποδοχέα Fas 201, α. Το εξωγενές µονοπάτι Το εξωγενές µονοπάτι ενεργοποιείται µέσω των υποδοχέων της οικογένειας TNF (Tumor Necrosis Factor) και παίζει σηµαντικό ρόλο στη διατήρηση της οµοιόστασης των ιστών και στην απόκριση του ανοσοποιητικού συστήµατος 203. Το µονοπάτι αυτό απαιτεί την πρόσδεση ενός µορίου-προσδέτη σε έναν µεµβρανικό υποδοχέα, που ονοµάζεται «υποδοχέας θανάτου» (Death Receptors, DR) και έχει ως τελικό αποτέλεσµα την ενεργοποίηση των κασπασών (εικόνα 6). Οι «υποδοχείς θανάτου» δείχνουν διαφορετική έκφραση στους διάφορους κυτταρικούς τύπους και αριθµούν πολλά µέλη. Οι κυριότεροι είναι ο TNFR1 (Tumor Necrosis Factor Receptor-1), ο Fas (γνωστός και ως Apo1 ή CD95), οι TRAIL-R1 και TRAIL-R2 (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors 1 και 2), ο NGFR (Νerve Growth Factor Receptor) και ο EDAR (EctoDysplasin A Receptor). Τα δύο καλύτερα µελετηµένα µοντέλα είναι του υποδοχέα Fas µε τον προσδέτη FasL (Fas Ligand) και του υποδοχέα TNFR (TNF Receptor) µε τον προσδέτη TNF

66 Εικόνα 6. Το εξωγενές µονοπάτι της απόπτωσης και η ρύθµιση της σηµατοδότησης µέσω των «υποδοχέων θανάτου». Ο υποδοχέας Fas είναι µια διαµεµβρανική πρωτεΐνη, η οποία ενεργοποιείται από την πρόσδεση του FasL στις κυτταρικές µεµβράνες 198. Η ενεργοποίηση οδηγεί στον οµοτριµερισµό του υποδοχέα 204 και στη στρατολόγηση της πρωτεΐνης-προσαρµογής FADD (Fas Associated Death Domain protein). Η FADD προσδένεται µέσω των «περιοχών θανάτου», που καλούνται DD (Death Domains), στις αντίστοιχες DD περιοχές του υποδοχέα, µε συνέπεια να δηµιουργείται µια γέφυρα, για τη µεταγωγή του σήµατος από το εξωτερικό στο εσωτερικό του κυττάρου 205. Το σύµπλοκο του οµοτριµερισµένου υποδοχέα, µε τον προσδέτη και την πρωτεΐνη-προσαρµογής, καλείται DISC (Death-Inducing Signaling Complex). Από την άλλη πλευρά, το µονοπάτι που επάγεται από τον TNF και περιλαµβάνει τον υποδοχέα TNFR, απαιτεί την ύπαρξη µιας ακόµη ενδιάµεσης πρωτεΐνης, της TRADD (TNF Receptor Associated Death Domain), η οποία ενώνεται άµεσα µε τις DD περιοχές της FADD. 66

67 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η µεταγωγή επιτυγάνεται µέσω των αµινοτελικών περιοχών της πρωτεΐνης FADD, που καλούνται DED (Death Effector Domains) και είναι υπεύθυνες για την ένωση µε την προκασπάση-8, γνωστής και ως FLICE (FADD-Like IL-1β- Converting Enzyme). Η ένωση αυτή έχει ως αποτέλεσµα την ενεργοποίηση της προκασπάσης-8, που επιτυγχάνεται µε αυτοκατάλυση. Η ενεργοποιηµένη κασπάση-8 είναι ικανή να επάγει την ενεργοποίσηση της κασπάσης-3 και συνεπώς την απόπτωση. Στη συνέχεια, η κασπάση-8 πρωτεολύει την πρωτεΐνη Bid, που αποτελεί προ-αποπτωτικό µέλος της Bcl-2 οικογένειας και τότε, το µονοπάτι µετατοπίζεται από την κυτταρική µεµβράνη και το κυτταρόπλασµα, στα µιτοχόνδρια (εικόνα 6). Η πρωτεόλυση έχει ως αποτέλεσµα την απελευθέρωση της καρβοξυτελικής περιοχής της Bid, η οποία οδηγεί στην απελευθέρωση του κυτοχρώµατος c από τα µιτοχόνδρια 206. Στη ρύθµιση της απελευθέρωσης σηµαντικό ρόλο παίζει η ικανότητα της οικογένειας των αναστολέων της απόπτωσης IAPs (Inhibitors of Apoptosis Proteins) να προσδένονται και να αναστέλλουν τις ενεργοποιηµένες κασπάσες. Επιπλέον, το µήνυµα για την αναστολή της απόπτωσης µπορεί να τροποποιηθεί ά- µεσα στο επίπεδο των υποδοχέων. Για παράδειγµα, έχει δειχθεί ότι η γλυκοσυλίωση του υποδοχέα Fas ρυθµίζει την απόπτωση, που επάγεται από τον προσδέτη FasL 207. Επιπλέον, η σηµατοδότηση µπορεί να ρυθµίζεται και σε µεταγραφικό επίπεδο. Μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 οδηγεί σε υπερέκφραση του γονιδίου Fas 208. Μια άλλη οµάδα πρωτεϊνών που καλούνται FLIPs (FLICE Ιnhibitory Proteins) αναστέλλουν την απόπτωση, µέσω αλληλεπίδρασης µε το µονοπάτι των υποδοχέων 209. ιάφορα µιτογόνα και αυξητικοί παράγοντες µπορούν επίσης να αναστείλουν την απόπτωση, µέσω της οδού MAPK/ERK (Mitogen-Activated Protein Kinase/ Extracellular signal-regulated Kinase) 210 (εικόνα 6). Η οδός αυτή οδηγεί σε ά- µεση αναστολή της απόπτωσης, καταστέλλοντας τη δράση της κασπάσης-8 211, ή αδρανοποιώντας µε φωσφορυλίωση την προ-αποπτωτική πρωτεΐνη BAD (Bcl- XL/Bcl-2-Associated Death promoter), που ανήκει στην Bcl-2 οικογένεια 212,213. Ο TNFR1 αποτελεί επίσης έναν παράγοντα που επηρεάζεται από ανασταλτικές της απόπτωσης ρυθµίσεις. Η πρωτεΐνη TRAF2 είναι ικανή να ενώνεται µε το σύµπλοκο TNFR1/TRADD και να ενεργοποιεί ένα µονοπάτι, που οδηγεί σε φωσφορυλίωση του ΙκΒ (Inhibitor-κΒ). Ο ΙκΒ είναι ο αναστολέας του µεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ (Nuclear Factor-κΒ), µε τον οποίον βρίσκεται µό- 67

68 νιµα συνδεδεµένος στο κυτταρόπλασµα 214 (εικόνα 6). Η φωσφορυλίωση του ΙκΒ οδηγεί σε διάσπαση του συµπλόκου ΙκΒ/NF-κΒ και σε απελευθέρωση του παράγοντα NF-κΒ, ο οποίος εµφανίζεται να παίζει διττό ρόλο. Ο NF-κΒ λειτουργεί κύρια ως αναστολέας της απόπτωσης, ενεργοποιώντας τη µεταγραφή πολλών αντι-αποπτωτικών γονιδίων (π.χ. FLIP, Bcl-xL, BFL1, XIAP και ciap1) 199, ενώ υπό άλλες συνθήκες λειτουργεί ως ογκοκαταστολέας, προάγοντας το µονοπάτι του κυτταρικού θανάτου, που εξαρτάται από την p Το συµπέρασµα που εξάγεται από τα παραπάνω είναι ότι στην απόπτωση επεµβαίνουν διάφοροι ρυθ- µιστικοί µηχανισµοί, ώστε αυτή να λειτουργεί εντός ορισµένων ορίων β. Το ενδογενές ή µιτοχονδριακό µονοπάτι Το ενδογενές µονοπάτι χαρακτηρίζεται από την έναρξη της απόπτωσης ως αποτέλεσµα διαταραχής της ενδοκυτταρικής οµοιόστασης. Το µονοπάτι αυτό ενεργοποιείται παρουσία παραγόντων, όπως είναι η υπεριώδης ακτινοβολία, το θερµικό ή ωσµωτικό σοκ, η υποξία, η διάσπαση του κυτταροσκελετού και η βλάβη στο DNA. Η αναγνώριση όλων των βλαβών του γενετικού υλικού είναι µέγιστης σηµασίας για την οµοιόσταση των πολυκύτταρων οργανισµών. Το ε- ρέθισµα που είναι υπεύθυνο για την έναρξη του µιτοχονδριακού µονοπατιού, προάγει τη διαπερατότητα της εξωτερικής µεµβράνης των µιτοχονδρίων και την απελευθέρωση του κυτοχρώµατος c στο κυτταρόπλασµα. Στη ρύθµιση του µιτοχονδριακού µονοπατιού σηµαντικό ρόλο παίζει η οικογένεια των Bcl-2 πρωτεϊνών (B-cell leukemia /lymphoma-2) (εικόνα 7). Μέχρι σήµερα έχουν αναγνωριστεί στον άνθρωπο, περισσότερα από 20 µέλη αυτής της οικογένειας, τα οποία οµαδοποιούνται σε δύο κατηγορίες. Στην πρώτη ανήκουν οι πρωτεΐνες που αναστέλλουν την απόπτωση (π.χ. Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, Bfl-1/A1, Bcl-W, Bcl-G) και στη δεύτερη αυτές που την προάγουν (π.χ. Bax, Bak, Bok, Bad, Bid, Bik, Bim, Bcl-Xs, Krk, Mtd, Nip3, Nix, Noxa, Bcl-B) Οι Bcl-2 πρωτεΐνες εντοπίζονται ή µετακινούνται στη µιτοχονδριακή µεµβράνη, όπου ρυθµίζουν την απόπτωση, τροποποιώντας τη διαπερατότητα της εσωτερικής ή/και της εξωτερικής µεµβράνης, µε αποτέλεσµα να επάγεται ή να καταστέλλεται η απελευθέρωση του κυτοχρώµατος c. Οι περισσότερες από αυτές τις 68

69 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, σχηµατίζοντας οµοδιµερή ή ετεροδιµερή, τα οποία δρουν συνεργατικά ή ανταγωνιστικά 216. Εικόνα 7. Ενεργοποίηση της απόπτωσης µέσω του µιτοχονδριακού µονοπατιού. Κάποια µέλη της οικογένειας Bcl-2 είναι απαραίτητα για την απόπτωση, ενώ άλλα για την επιβίωση του κυττάρου. Στο ενδογενές µονοπάτι, η Bcl-2 αποτρέπει την απελευθέρωση του κυτοχρώµατος c, υποδεικνύοντας ότι µε κάποιον τρόπο η πρωτεΐνη αυτή αντιτίθεται στη δράση της Bid. Η Bax αντιτίθεται στην ικανότητα της Bcl-2 να προστατεύει από την απόπτωση, γεγονός που υποδηλώνει ότι για την παροχή προστασίας ίσως να απαιτείται ο σχηµατισµός οµοδιµερών της Bcl-2, κάτι που αποτυγχάνει να κάνει το ετεροδιµερές Βcl-2/Βax. Ω- στόσο, µένει να αποδειχθεί εάν τα οµοδιµερή Bax ή Bcl-xs συµµετέχουν ενεργά στην απόπτωση ή απλώς επιτρέπουν την εξέλιξή της. 69

70 Το συµπέρασµα που προκύπτει είναι ότι οι συνδυασµοί µεταξύ των µελών της Bcl-2 οικογένειας µπορούν να παράγουν διµερή µε διαφορετικές επιδράσεις στην απόπτωση και ενδεχοµένως, µεγαλύτερη σηµασία έχει η σχετική αναλογία των µελών της οικογένειας, που εκφράζονται σε ένα κύτταρο. Η επιδεκτικότητα ενός κυττάρου στην απόπτωση ίσως είναι ανάλογη µε τον λόγο Βax/Bcl2 206,219,220. Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53, φαίνεται να συµµετέχει και αυτό στα µονοπάτια της απόπτωσης, αφού η ενεργοποίησή του µετά από καταστροφή του DNA προκαλεί την περαιτέρω ενεργοποίηση της προ-αποπτωτικής πρωτεϊνης Bax και κατά συνέπεια τον κυτταρικό θάνατο 221. Τα προ-αποπτωτικά µέλη της Bcl-2 οικογένειας Bax/Bak θεωρείται ότι ο- λιγοµερίζονται σε απάντηση διαφορετικών σηµάτων στρες στα µιτοχόνδρια, όπου διαµορφώνουν πόρους στην εξωτερική µεµβράνη. Κατά τη διάρκεια της απόπτωσης απελευθερώνεται Ca 2+ από τις αποθήκες του ενδοπλασµατικού δικτύου, µε αποτέλεσµα να αυξάνει η πρόσληψη Ca 2+ από τα µιτοχόνδρια. Η συσσώρευση Ca 2+ στα µιτοχόνδρια οδηγεί στο άνοιγµα των µιτοχονδριακών πόρων και στην αύξηση της µιτοχονδριακής διαπερατότητας 222. Έτσι, απελευθερώνονται κυτόχρωµα c και άλλες µιτοχονδριακές πρωτεΐνες (όπως είναι η Smac/DIABLO και ο AIF), οι οποίες φαίνεται να σχετίζονται µε προαγωγή ή αναστολή της απόπτωσης Η απελευθέρωση του κυτοχρώµατος c αποτελεί το πιο κρίσιµο σηµείο ε- λέγχου της απόπτωσης και το στάδιο όπου ενώνονται το εξωγενές και το ενδογενές µονοπάτι. Μετά την απελευθέρωση, το κυτόχρωµα c ενώνεται µε τον παράγοντα ενεργοποίησης αποπτωτικής πρωτεάσης Apaf-1 (Apoptosis Protease- Inducing Factor-1) και την προκασπάση-9 226, η οποία ενεργοποιείται και µαζί δηµιουργούν ένα ενζυµικό σύµπλοκο, που καλείται αποπτώσωµα. Το αποπτώσωµα ενεργοποιεί την κασπάση-3 και άλλες εκτελεστικές κασπάσες (όπως οι κασπάσες 6 και 7) και οδηγεί στον κυτταρικό θάνατο 227. Τα στάδια στα οποία παίρνει µέρος η κασπάση 3 δεν είναι απολύτως γνωστά. ιάφορες µελέτες κάνουν λόγο για έναν µηχανισµό, στον οποίον η κασπάση 3 φαίνεται να αποκόπτει µια υποµονάδα από το διµερές DFF (DNA Fragmentation Factor), που αποτελεί τον παράγοντα θραυσµατοποίησης του DNA. Η άλλη υποµονάδα ενεργοποιεί µια νουκλεάση, η οποία αποικοδοµεί το DNA. Ωστόσο, η αποικοδόµηση του DNA µέσω αυτού του µηχανισµού δε φαίνεται να είναι απαραίτητη για τον κυτ- 70

71 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ταρικό θάνατο, ο οποίος δεν αναστέλλεται σε γενετικά τροποποιηµένους επίµυς, που στερούνται του ενζύµου 206. Ο AIF (Αpoptosis Ιnducing Factor) αποτελεί τον παράγοντα επαγωγής της απόπτωσης, ο οποίος απελευθερώνεται από τα µιτοχόνδρια και µεταναστεύει στον πυρήνα όπου προκαλεί θραύση του DNA 206,228,229. Ο παράγοντας αυτός κωδικοποιείται από ένα και µόνο γονίδιο, που βρίσκεται στο χρωµόσωµα Χ 228. Συνήθως εντοπίζεται στα µιτοχόνδρια, αλλά από τη στιγµή που απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασµα, προάγει την απόπτωση µέσω ενός µηχανισµού που παραµένει άγνωστος 230. Η απόπτωση που επάγεται από τον AIF φαίνεται να είναι ανεξάρτητη της δράσης των κασπασών και δεν µπορεί να κατασταλεί από την έκφραση του Bcl-2 228,231. Ένα άλλο µονοπάτι που οδηγεί στην αποικοδόµηση του DNA φαίνεται να πυροδοτείται άµεσα από την απελευθέρωση ενός ενζύµου από τα µιτοχόνδρια. Μέσα στο µιτοχόνδριο, η ενδονουκλεάση G εµπλέκεται στην αντιγραφή του µιτοχονδριακού DNA. Ωστόσο, σε κύτταρα που διενεργούν απόπτωση, το ένζυµο αυτό απελευθερώνεται από το µιτοχόνδριο µέσω του πόρου και αποικοδοµεί το πυρηνικό DNA. Το ένζυµο αυτό φαίνεται να είναι ση- µαντικό για την πορεία της απόπτωσης, αν και δεν είναι απαραίτητο για τον θάνατο του κυττάρου Η οικογένεια των κασπασών Παρόλο που οι κασπάσες δεν αποτελούν το µοναδικό ενζυµικό σύστηµα που συµµετέχει στην απόπτωση, ο ρόλος τους είναι βασικός και πολύ σηµαντικός στην εκτέλεσή της 232,233. Ειδικοί αναστολείς των κασπασών είναι ικανοί να εµποδίζουν τη διεξαγωγή της απόπτωσης, ενώ η έκφραση µεµονωµένων κασπασών σε διάφορες κυτταρικές σειρές είναι ικανή να προάγει σε κάποιο βαθµό την απόπτωση 234,235. Επιπλέον, απώλεια βασικών κασπασών είναι γνωστό ότι οδηγεί σε µια πληθώρα αναπτυξιακών διαταραχών µε πρώιµη θνησιµότητα, ως αποτέλεσµα της διαταραγµένης απόπτωσης Οι κασπάσες αποτελούν µια οικογένεια πρωτεασών κυστεΐνης 239 και µέχρι σήµερα έχουν αναγνωριστεί 14 µέλη αυτής της οικογένειας στα θηλαστικά, αν και δε φαίνεται να έχουν όλα κάποια σχέση µε την απόπτωση 240. Οι κασπάσες διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες ανάλογα µε την εξειδίκευση του υποστρώµα- 71

72 τος, τη δοµικής τους σύσταση και τον ρόλο τους στην απόπτωση 241. Υπάρχουν: α) οι αρχικές (initiators) κασπάσες-2, 8, 9 και 10, β) οι εκτελεστικές (executioners ή effectors) κασπάσες-3, 6 και 7 και γ) οι κασπάσες που συµµετέχουν στην ενεργοποίηση των κυτταροκινών (κασπάσες-1, 4, 5, 11, 12, 13 και 14). Ανάµεσα στις κασπάσες υπάρχει µια ιεραρχική σχέση, µε αποτέλεσµα οι αρχικές κασπάσες να ενεργοποιούνται πριν τις εκτελεστικές. Οι ενεργοποιηµένες εκτελεστικές κασπάσες λύουν πρωτεΐνες-κλειδιά, που είναι υπεύθυνες για τη διατήρηση της οµοιόστασης, µε αποτέλεσµα το κύτταρο να οδηγείται σε διάσπαση και εποµένως στον θάνατο 241. Όλες οι κασπάσες, αρχικές και εκτελεστικές, έχουν έναν ρόλο, άµεσο ή έµµεσο, στην εξέλιξη, πρόοδο και ενίσχυση του αποπτωτικού σήµατος, που οδηγεί στην καταστροφή των κυτταρικών δοµών. Οι κασπάσες υπάρχουν στο κύτταρο σε ανενεργή πρόδροµη µορφή (προκασπάσες ή προένζυµα) και ενεργοποιούνται µε πρωτεολυτική λύση. Οι αρχικές κασπάσες ενεργοποιούνται µε την αυτοσυγκρότησή τους σε πολυµερή πρωτεϊνικά σύµπλοκα, όπως είναι το αποπτώσωµα 242,243. Η ενεργοποίηση αυτή έχει ως αποτέλεσµα την έναρξη ενός καταρράκτη πρωτεολυτικών αντιδράσεων, που οδηγούν στην ενεργοποίηση των εκτελεστικών κασπασών. Στο σηµείο αυτό αξίζει να σηµειωθεί ότι, ενώ οι αρχικές κασπάσες αυτοπρωτεολύονται και ενεργοποιούνται µέσω δηµιουργίας συµπλόκων, οι εκτελεστικές κασπάσες για να ε- νεργοποιηθούν, απαιτούν την ύπαρξη ήδη ενεργοποιηµένων κασπασών. Είναι επίσης πιθανόν, η ενεργοποίηση των εκτελεστικών κασπασών να ενισχύει τα σήµατα που οδηγούν στις αντιδράσεις ενεργοποίησης των αρχικών κασπασών 244. Όπως προαναφέρθηκε, τόσο το ενδογενές, όσο και το εξωγενές αποπτωτικό µονοπάτι συγκλίνουν στο σηµείο ενεργοποίησης των εκτελεστικών κασπασών. Από το σηµείο αυτό, ξεκινά µια επιλεκτική λύση πρωτεϊνών, που σε φυσιολογικές συνθήκες σχετίζονται µε την επιδιόρθωση του DNA, την οργάνωση του κυτταροσκελετού και τη διατήρηση της ακεραιότητας του πυρήνα. Οι µορφολογικές αυτές αλλοιώσεις που υφίσταται το κύτταρο όταν αποπίπτει, είναι υπεύθυνες για την ακόλουθη πέψη του από τα φαγοκύτταρα του οργανισµού. 72

73 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Απόπτωση και αιµατολογικά νοσήµατα Η µειωµένη ικανότητα των λευχαιµικών κυττάρων να εκτελούν απόπτωση, έχει αναγνωριστεί ως ένας σηµαντικός µηχανισµός, που προωθεί την αύξηση και ανάπτυξη του λευχαιµικού κλώνου. Σε πολλά φυσιολογικά κύτταρα κατά τη διάρκεια του πολλαπλασιασµού τους συµβαίνει να αποκτούν κάποια γενετική βλάβη, την οποία είτε επιδιορθώνουν σε ειδικές θέσεις ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (check points), είτε επί αποτυχίας επιδιόρθωσης οδηγούνται στην απόπτωση. Αποτυχία στην εκπλήρωση της απόπτωσης, λόγω ύπαρξης βλάβης που δεν µπορεί να διορθωθεί, οδηγεί σε αύξηση των µεταλλάξεων, συµπεριλαµβανοµένου και των χρωµοσωµικών αλλοιώσεων, και µπορεί να είναι η αιτία της γενωµικής αστάθειας, που αποτελεί χαρακτηριστικό των νεοπλασµατικών κυττάρων 245. Η διαταραγµένη απόπτωση εµπλέκεται σε µία ποικιλία κακοήθων νόσων, καθώς και σε πολλές αιµατολογικές διαταραχές. Η αποτυχία στην εκπλήρωση της αιµοποίησης, όπως συµβαίνει στα µυελοδυσπλαστικά σύνδροµα, η σοβαρή απλαστική αναιµία, καθώς και η έναρξη και εξέλιξη της λευχαιµίας σχετίζονται µε διαταραχή της απόπτωσης 246,247. O πολλαπλασιασµός και η κλωνική ανάπτυξη των αιµοποιητικών κυττάρων βασίζεται σε µεγάλο βαθµό στην ύπαρξη αυξητικών παραγόντων 248. Οι περισσότεροι αυξητικοί παράγοντες που δρουν στα αιµοποιητικά κύτταρα, όπως είναι ο SCF, η IL-3, η IL-2 και η IL-7 προάγουν την επιβίωση και καταστέλουν την απόπτωση Η έλλειψη των αυξητικών παραγόντων οδηγεί σε απόπτωση, υποδηλώνοντας ότι υπάρχει ένα ενδογενές δυναµικό από ώριµα και ανώριµα αιµοποιητικά κύτταρα, τα οποία αυτοµάτα εκτελούν απόπτωση. Σε µοριακό επίπεδο, οι περισσότεροι από αυτούς τους αυξητικούς παράγοντες φαίνεται να ευνοούν την αυξηµένη επιβίωση, διατηρώντας τα υψηλά επίπεδα αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών της Bcl-2 οικογένειας, όπως είναι η Bcl-2 και η Bcl-xl. ιαγονιδιακά ποντίκια, τα οποία υπερεκφράζουν τα γονίδια Bcl-2 και Bcl-xl φαίνεται να έχουν αυξηµένη επιβίωση και διάρκεια ζωής των λεµφοκυττάρων της Β σειράς 254,255. ιαταραχή στην έκφραση αντι-αποπτωτικών ή προαποπτωτικών µελών της Bcl-2 οικογένειας έχει περιγραφεί σε µια ποικιλία νεοπλασιών του ανθρώπου, καθώς και σε πολλά αιµατολογικά νοσήµατα 256. Σε συνδυασµό µε τις Bcl-2 πρωτεΐνες, το σύστηµα του συµπλόκου CD95/FGas/APO-1 είναι επίσης σηµαντικό για τη φυσιολογική ρύθµιση της επιβίωσης και της απόπτωσης των αιµοποιητικών κυττάρων ,

74 Ο σηµαντικός ρόλος της διαταραγµένης απόπτωσης στην πρόοδο της κακοήθους εξαλλαγής επιβεβαιώθηκε µε την ανακάλυψη της πρωτεΐνης-κλειδιού p53 και του ρόλου της στη ρύθµιση της απόπτωσης. Βρέθηκε ότι ο υψηλός ρυθ- µός µεταλλάξεων της p53 σχετίζεται συχνά µε την πρόοδο της νόσου και µε κακή πρόγνωση, σε πολλές νεοπλασίες του ανθρώπου 258,259. Μεταλλάξεις της p53 ανιχνεύονται στο 50% των καρκίνων του ανθρώπου και σχετίζονται µε αντίσταση στη χορηγούµενη θεραπεία. Επίσης, το πρωτο-ογκογονίδιο c-myc που δρα ως µεταγραφικός παράγοντας, επάγει την απόπτωση παρουσία της p53, ενώ έχει δειχθεί ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης c-myc είναι αυξηµένα σε πολλούς όγκους του ανθρώπου 195. Εκτός από την Bcl-2 και την p53, έχει δειχθεί ότι γενετικές και επιγενετικές τροποποιήσεις γονιδίων που ρυθµίζουν την απόπτωση, συµβάλουν στην καρκινογένεση 260. Γενικά, η απόπτωση των καρκινικών και λευχαιµικών κυττάρων φαίνεται να είναι αποτέλεσµα, είτε της αυξηµένης έκφρασης πρόδροµων µορίων επιβίωσης, όπως είναι ο πυρηνικός παράγοντας NF-κΒ και οι πρωτεΐνες IAPs, είτε της µειωµένης έκφρασης «υποδοχέων θανάτου» ή µειωµένης ευαισθησίας παραγόντων που προάγουν την απόπτωση, όπως ο FasL 246,247, εδοµένου του κεντρικού ρόλου των κασπασών στην εκτέλεση του κυτταρικού θανάτου, θα έπρεπε να ανιχνεύεται υψηλή συχνότητα µεταλλάξεων των γονιδίων τους στα καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, η σάρωση του γονιδιώµατος για την εύρεση µεταλλάξεων στις αρχικές και εκτελεστικές κασπάσες δεν αποκάλυψε υψηλή συχνότητα τέτοιων αλλαγών. Είναι πιθανόν η έκφραση και η λειτουργία των κασπασών να επιδέχονται επιγενετικές τροποποιήσεις, όπως είναι η υπερµεθυλίωση του προαγωγέα τους 247, ιαταραχή της απόπτωσης και Λευχαιµογένεση Σήµερα θεωρείται ότι η οξεία λευχαιµία προκαλείται από διαταραχή της ισορροπίας µεταξύ της αυτοανανέωσης, της διαφοροποίησης και της απόπτωσης των λευχαιµικών stem cells του µυελού των οστών. Ιδιαίτερη έµφαση δίνεται στην απόπτωση, η διαταραχή της οποίας συµµετέχει στη συσσώρευση του λευχαιµικού κλώνου και επιπλέον, φαίνεται να µειώνει την ευαισθησία των λευχαι- µικών κυττάρων στη Χ/Θ 265,266. Οι περισσότεροι τύποι της οξείας ή χρόνιας λευχαιµίας και του λεµφώµατος έχουν σχετιστεί µε την ύπαρξη χαρακτηριστικών 74

75 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ χρωµοσωµικών µετατοπίσεων. Γενικά, οι µετατοπίσεις αυτές οδηγούν στην α- πορρύθµιση της έκφρασης γονιδίων, που σχετίζονται µε την επιτάχυνση του πολλαπλασιασµού των κυττάρων, όπως το c-myc, ή την αύξηση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται µε την αναστολή της απόπτωσης, όπως το Bcl-2. Ε- ναλλακτικά, η δηµιουργία χιµαιρικών γονιδίων, όπως το BCR-ABL και το PML-RARα, επάγει την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στα µηνύµατα θανάτου 246,265. H συνεχής έκφραση του γονιδίου c-myc, που είναι αποτέλεσµα της µετατόπισης t(8;14), αποτελεί τον ακρογωνιαίο λίθο του έντονα επιθετικού λεµφώ- µατος Burkitt. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι ενώ η αυξηµένη έκφραση του γονιδίου myc οδηγεί σε ταχύτατο πολλαπλασιασµό των νεοπλασµατικών κυττάρων, τα κύτταρα αυτά είναι επιδεκτικά στην απόπτωση, ίσως εξαιτίας της ακόλουθης ενεργοποίησης των αποπτωτικών οδών, λόγω της αυξηµένης έκφρασης του myc. Οι διαγονιδιακοί-myc επίµυες επίσης αναπτύσσουν γρήγορα επιθετική λευχαιµία ή λέµφωµα. Η υπερέκφραση του Bcl-2 ωστόσο, παράγει έναν ακόµη πιο επιθετικό φαινότυπο, υποδεικνύοντας ότι η αναστολή της απόπτωσης, σε συνδυασµό µε τη διαταραχή του ελέγχου του πολλαπλασιασµού, µπορεί να αποτελεί ένα δευτερεύον πλήγµα στην κακοήθη εξαλλαγή 255. Η χιµαιρική πρωτεΐνη BCR-ABL, που είναι αποτέλεσµα της µετατόπισης t(9;22), αποτελεί το µόριο-κλειδί στη ΧΜΛ. Η διαταραγµένη λειτουργία της τυροσινικής κινάσης ABL οδηγεί στην αύξηση του ρυθµού µεταγραφής της α- ντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-xL, µέσω του µονοπατιού STAT5 (Signal Transducer and Activator of Transcription 5) 267. Η PML-RARα αντιπροσωπεύει άλλη µία χιµαιρική πρωτεΐνη, που προκύπτει από τη µετατόπιση t(15;17) και συναντάται στην οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία (τύπος Μ3) 268. Η πρωτεΐνη αυτή επηρεάζει µέσω µεταγραφικής ρύθµισης, µια πληθώρα ρυθµιστικών συστηµάτων, όπως τα µόρια STAT, οδηγώντας σε αυξηµένη επιβίωση των λευχαιµικών κυττάρων και σε αντίσταση στην απόπτωση. Πολλές συχνές µετατοπίσεις που ανιχνεύονται στην ΟΛΛ βρέθηκε επίσης να αναστέλλουν σήµατα της απόπτωσης 246. Αυτό είναι εξαιρετικά σηµαντικό εφόσον τα Β και Τ λεµφοκύτταρα είναι επιρρεπή σε εγγενή κυτταρικό θάνατο. Η µετατόπιση t(17;19), που σχετίζεται µε τη λεµφοβλαστική λευχαιµία, οδηγεί στη σύντηξη των γονιδίων δύο µεταγραφικών παραγόντων, του E2A και του HLF. Έκφραση του E2A και του HLF σε µη νεοπλασµατικά προ-β-λεµφοκύτταρα εµποδίζει 75

76 την απόπτωση, που προκαλείται από την αποµάκκρυνση της IL-3 ή την έκφραση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53. Επιπλέον, µετατοπίσεις που σχετίζονται µε την Τ-κυτταρική λευχαιµία, φαίνεται να σχετίζονται µε ογκογονίδια που παρεµποδίζουν την απόπτωση. Ενώ οι περισσότερες από αυτές τις χρωµοσωµικές µετατοπίσεις φαίνεται να προωθούν την ευαισθησία των κυττάρων στην απόπτωση, η υπερέκφραση του γονιδίου tal-1 (scl), που είναι αποτέλεσµα της µετατόπισης t(1;14) και συναντάται στην Τ-ΟΛΛ, προάγει επιλεκτικά την αντίσταση στα κυτταροτοξικά φάρµακα και στον υποδοχέα Fas 269. Έχει δειχθεί ότι η εγγενής απόπτωση είναι σηµαντικά υψηλότερη στα φυσιολογικά CD34+ κύτταρα, σε σύγκριση µε τα λευχαιµικά CD34+ κύτταρα, όταν µελετάται η ικανότητα πρόσδεσης στην αννεξίνη V, ενώ είναι µικρότερη, όταν εξετάζονται όλα τα µονοπύρηνα του µυελού των οστών. Η απόπτωση στην ΟΛΛ είναι κατά πολύ µικρότερη, σε σχέση µε την ΟΜΛ και δεν έχει καµία σηµαντική διαφορά από την απόπτωση των φυσιολογικών εµπύρηνων κυττάρων του περιφερικού αίµατος 270,271. ράση κασπάσης-3 έχει δειχθεί µόνο στην περίπτωση κυττάρων από ασθενείς µε ΟΜΛ. Η σηµασία των µεθόδων που χρησιµοποιούνται φαίνεται από το γεγονός ότι ενώ στην ΟΜΛ ανιχνεύθηκε 4 φορές µεγαλύτερη ενεργότητα κασπάσης-3 σε σχέση µε την ΟΛΛ, η ικανότητα πρόσδεσης στην αννεξίνη V ήταν παρόµοια. Από την άλλη πλευρά, υπερέκφραση της ανενεργούς µορφής της κασπάσης-3 παρατηρείται συχνά, τόσο στα βλαστικά κύτταρα ασθενών µε ΟΛΛ, όσο και ασθενών µε ΟΜΛ 272. Σύµφωνα µε πολλές αναφορές, ο χαµηλός βαθµός της απόπτωσης στην ΟΛΛ σχετίζεται, µε την υπερέκφραση του Bcl-2, η οποία καταστέλλει το µονοπάτι της απόπτωσης 273. Στο σηµείο αυτό θα πρέπει να αναφερθεί ότι η πρωτεΐνη Bcl-2 δεν παίζει σηµαντικό ρόλο στην απόπτωση των κυττάρων της παιδικής λευχαιµίας, ενώ έχει δειχθεί ότι υπάρχει ένα διαφορετικό πρότυπο έκφρασης και ρύθµισης των γονιδίων Bcl-2 και Bcl-xL στην παιδική ΟΛΛ 273,274. Η έκφραση ογκοπρωτεϊνών ή αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών µπορεί επίσης να επηρεάσει τον βαθµό της απόπτωσης. Στην ΟΛΛ υπάρχει µια γραµµική συσχέτιση µεταξύ της απόπτωσης και της έκφρασης του ογκογονιδίου Ras 270. Σε µία συστηµατική in vitro µελέτη, οι Murohashi και συν. 275 µελέτησαν τον µυελό των οστών 22 ασθενών µε ΟΜΛ και βρήκαν ότι σε όλες σχεδόν τις περιπτώσεις, οι παράγοντες G-CSF, GM-CSF, IL-3, TNF-α, καθώς και ο παράγοντας των stem cells SCF είναι ικανοί να επάγουν την απόπτωση, µε τη συµµετοχή των 76

77 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ογκογονιδίων c-fos, c-jun, c-myc και των κυκλινών D2 και D3, καθώς επίσης και των αναστολέων τους p16 και p27. Οι Moriai και συν. 276 βρήκαν RNA της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης survivin στην πλειονότητα των κακοήθων κυτταρικών σειρών που µελετήθηκαν, ενώ δεν ανιχνεύθηκε καθόλου survivin στα φυσιολογικά λευκοκύτταρα Ρύθµιση της απόπτωσης Ρυθµιστικοί παράγοντες της απόπτωσης Στη ρύθµιση της απόπτωσης παίρνουν µέρος διάφοροι παράγοντες, κυριότεροι από τους οποίους είναι οι πρωτεΐνες myc, Fas και p53. Το myc αποτελεί ένα ογκογονίδιο, το οποίο συµµετέχει στην απόπτωση µόνο σε περιπτώσεις αυξηµένου κυτταρικού πολλαπλασιασµού. Η ρύθµιση της δράσης του γονιδίου myc εξαρτάται από δύο γονίδια συγγενούς οικογένειας, τα Max και Mad, τα οποία συνδέονται µε το myc και σχηµατίζουν ετεροδιµερή. Η δηµιουργία διµερών δεν παρουσιάζει ενδιαφέρον, όταν το κύτταρο βρίσκεται σε κατάσταση ηρεµίας, οπότε και οι ποσότητες του myc είναι ελάχιστες και µη ανιχνεύσιµες. Όταν όµως το κύτταρο βρεθεί σε φάση έντονου κυτταρικού πολλαπλασιασµού, συνεπεία ποικίλων µιτογόνων παραγόντων, επέρχεται ταχύτατη αύξηση των ενδοκυττάριων συγκεντρώσεων του myc και σχηµατισµός διµερών µε το Max, του οποίου οι συγκεντρώσεις παραµένουν γενικά σε σταθερά επίπεδα. Η ενδοκυττάρια αύξηση της συγκέντρωσης του myc σε καταστάσεις έντονου κυτταρικού πολλαπλασιασµού οδηγεί σε ταχεία αύξηση των διµερών myc/max, τα οποία προκαλούν έναρξη των µηχανισµών απόπτωσης, εξισορροπώντας έτσι τον υπέρµετρο πολλαπλασιασµό των κυττάρων 277,278. Ένας άλλος παράγοντας που σχετίζεται µε τη ρύθµιση της απόπτωσης είναι η πρωτεΐνη Fas , η οποία υπάγεται στην ευρύτερη οµάδα των παραγόντων ΤΝF. H πρωτεΐνη Fas, όπως προαναφέρθηκε, εντοπίζεται στην επιφάνεια της κυτταρικής µεµβράνης και αποτελεί τον κυτταρικό υποδοχέα της πρωτεΐνης FasL, η οποία παράγεται από τα Τ-λεµφοκύτταρα. Η σύνδεση των παραγόντων Fas και FasL πάνω στην κυτταρική µεµβράνη αποτελεί το σήµα για την έναρξη της απόπτωσης και ρυθµίζει τον αποπτωτικό βαθµό. 77

78 Τέλος, το ογκογονίδιο p53 ρυθµίζει την παραγωγή πρωτεϊνών, που είναι απαραίτητες για την επιδιόρθωση του κυτταρικού DNA σε περιπτώσεις βλαβών, λόγω επίδρασης ενδογενών ή εξωγενών παραγόντων (ακτινοβολία, κυτταροτοξικά φάρµακα κ.λ.π.) Η p53, που από πολλούς αναφέρεται και ως η πρωτεΐνη-άγγελος των κυττάρων, κάτω από ορισµένες συνθήκες συµµετέχει στους µηχανισµούς της κυτταρικής διαίρεσης και της απόπτωσης. Σε περιπτώσεις εµφάνισης δοµικών διαταραχών του πυρηνικού DNA παρατηρείται υπερέκφραση του γονιδίου p53. Ο κυτταρικός κύκλος διακόπτεται στη φάση G1 ή G2 και έτσι οι ενδοκυττάριοι ενζυµικοί µηχανισµοί έχουν τον χρόνο για να επιδιορθώσουν τις βλάβες του DNA, ώστε το κύτταρο να µπορέσει να συνεχίσει τη λειτουργική του αποστολή. Η διακοπή του κυτταρικού κύκλου γίνεται από την πρωτεΐνη p21, η παραγωγή της οποίας ακολουθεί τη γονιδιακή υπερέκφραση του p53. Σε περίπτωση που η βλάβη στη δοµή του DNA δεν µπορεί να διορθωθεί, η p53 αλλάζει αποστολή και προάγει τον αποπτωτικό θάνατο του συγκεκριµένου κυττάρου. Η απόπτωση στην περίπτωση αυτή θεωρείται αναγκαία για τη διατήρηση της οµοιόστασης, αφού το κύτταρο αδυνατεί να ανταπεξέλθει στη λειτουργική του αποστολή. Η εξάλειψη του κυττάρου µε τη βοήθεια της απόπτωσης, αποτρέπει τη µεταφορά και διάδοση των µεταλλάξεων σε νέα κύτταρα, που θα ήταν εφικτή µε την αντιγραφή του DNA. Παρατηρείται λοιπόν, µια διαδικασία «φυσικής επιλογής», η οποία µπορεί και απαλλάσσει τον οργανισµό από µη λειτουργικά ή επιβλαβή κύτταρα Μηχανισµοί που ρυθµίζουν την απόπτωση Εκτός από τη δράση των παραγόντων που αναφέρθηκαν, η ρύθµιση της απόπτωσης είναι δυνατή και µέσω δύο µηχανισµών, που λαµβάνουν χώρα στα κύτταρα κάτω από φυσιολογικές συνθήκες. Οι µηχανισµοί αυτοί είναι: α) η διασταύρωση των δύο αποπτωτικών µονοπατιών και β) η αντίθετη δράση προ- και αντι- αποπτωτικών πρωτεϊνών, που διατηρούν την οµοιόσταση προάγοντας ή αναστέλλοντας την απόπτωση. Υπό φυσιολογικές λοιπόν συνθήκες, η απόπτωση είναι ένας στενά ρυθµιζόµενος µηχανισµός, που συµβάλλει στην οµοιόσταση οργάνων και ιστών. 78

79 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ α. ιασταύρωση των αποπτωτικών µονοπατιών Παρά τα γεγονός ότι το ενδογενές και το εξωγενές µονοπάτι της απόπτωσης εξαρτώνται από διαφορετικά σήµατα «θανάτου» και έχουν διαφορετική πορεία, είναι δυνατό σε ορισµένες περιπτώσεις να διασταυρώνονται. Είναι γνωστό ότι η κασπάση-8 πρωτεολύει τον Bid, ένα µέλος της οικογένειας Bcl-2, που προάγει τον κυτταρικό θάνατο 285. Ο πρωτεολυµένος Bid µεταφέρεται στα µιτοχόνδρια και προκαλεί την απελευθέρωση του κυτοχρώµατος c, που έχει ως αποτέλεσµα την εξαρτώµενη από την κασπάση-9 ενεργοποίηση των εκτελεστικών κασπασών. Μελέτες έδειξαν ότι το κυτταρόπλασµα κυττάρων που είχε απωλέσει τον Bid µε ανοσοκατακρήµνιση, δεν ήταν πλέον ικανό να επάγει την απελευθέρωση του κυτοχρώµατος c, υποδεικνύοντας έτσι ότι ο Bid είναι το µοναδικό µόριο µετά την κασπάση-8, που έχει τέτοια ικανότητα 286. Ωστόσο, η απόπτωση που ρυθµίζεται µέσω του Fas ήταν ανεπηρέαστη στα λεµφικά κύτταρα, ενώ ήταν σηµαντικά µειωµένη σε ηπατικά κύτταρα ποντικών, από τα οποία έ- λειπε ο Bid 287. Τα ευρήµατα αυτά υποδηλώνουν ότι η πρωτεόλυση του Bid, µπορεί να µην είναι αναγκαία για την εκτέλεση του κυτταρικού θανάτου σε ό- λους τους τύπους κυττάρων, αλλά η διασταύρωση ανάµεσα στα δύο µονοπάτια, µπορεί να βοηθήσει στην ενίσχυση ασθενών αποπτωτικών σηµάτων και να επιταχύνει την εκτέλεση του κυτταρικού θανάτου, σε συγκεκριµένους τύπους κυττάρων, όπως είναι τα ηπατοκύτταρα β. Οικογένειες πρωτεϊνών µε προ- και αντι- αποπτωτική δράση ύο οικογένειες γονιδίων έχουν χαρακτηριστεί µέχρι σήµερα, οι οποίες φαίνεται να σχετίζονται µε ρύθµιση της απόπτωσης: η οικογένεια Bcl-2 και η οικογένεια των αναστολέων της απόπτωσης IAP (Inhibition of Apoptosis Protein family). Οι πρωτεΐνες της Bcl-2 οικογένειας πιθανότατα σχετίζονται µε τη ρύθµιση της µιτοχονδριακής διαπερατότητας και δρουν επάγοντας ή αναστέλλοντας την απελευθέρωση των µιτοχονδριακών πρωτεϊνών και ειδικότερα του κυτοχρώµατος c. Είναι λοιπόν υπεύθυνες για την πορεία της ενδογενούς οδού της απόπτωσης. Αντίθετα, οι IAPs έχουν µόνο ανασταλτική δράση και δρουν εµποδίζοντας την ενεργοποίηση της κασπάσης-9 στο αποπτώσωµα και αναστέλλοντας τη δράση των εκτελεστικών κασπασών. 79

80 Η οικογένεια των IAPs Οι αναστολείς της απόπτωσης IAPs αποτελούν µια υψηλά συντηρηµένη γονιδιακή οικογένεια, που απαντάται σε ένα ευρύ φάσµα οργανισµών, από τα έντοµα έως τον άνθρωπο. Η πρώτη IAP ανακαλύφθηκε το 1993 σε ιούς εντόµων (Baculovirus), όπου βρέθηκε ότι καταστέλλει την απόπτωση των κυττάρωνξενιστών, που είχαν µολυνθεί από τον ιό 289. Μέχρι σήµερα έχουν αναγνωριστεί στον άνθρωπο οχτώ µέλη της οικογένειας των IAP. Αυτές είναι οι: c-iap1, c- IAP2 290, XIAP 291, NAIP 292, survivin 293, apollon 294, ML-IAP/livin 295,296 και ILP Όλα τα µέλη αυτής της οικογένειας έχουν ένα ή περισσότερα αντίγραφα µιας συντηρηµένης ακολουθίας, που αποτελείται από αµινοξέα, και ονο- µάζεται BIR (Baculovirus IAP Repeat). Η ακολουθία BIR είναι αυτή που προσδίδει στις IAPs την αντι-αποπτωτική τους ικανότητα 298. Σε αντίθεση µε τις πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2, που ασκούν την ρυθµιστική τους δράση µέσω των µιτοχονδρίων, οι IAPs ενώνονται άµεσα και καταστέλλουν τις κασπάσες-3, 7 και 9 και µόνον αυτές 297, (εικόνα 8). Εκτός από την ακολουθία BIR, οι περισσότερες IAPs φέρουν κοντά στο καρβοξυτελικό τους άκρο, έναν σχηµατισµό δάκτυλου ψευδαργύρου (RING zinc-finger, RZF). Οι RZF πρωτεΐνες λειτουργούν τυπικά ως µέσο πρόσδεσης για τη µεταφορά πρωτεϊνών-στόχων σε ένα πολυσύνθετο σύµπλοκο, που συνδέεται µε ουβικουϊτίνη και υπόκειται σε πρωτεοσωµική αποικοδόµηση 303. Πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι οι IAPs που έχουν RZF, όπως είναι η c-iap2 και η XIAP µπορούν και προκαλούν την ουβικουϊτίνωση της κασπάσης-3 και της κασπάσης-7 304,305, υποδηλώνοντας ότι η στόχευση των κασπασών στο πρωτεάσωµα µπορεί να αποτελεί τον αντι-αποπτωτικό µηχανισµό δράσης των IAPs. Ένας άλλος µηχανισµός µπορεί να περιλαµβάνει ουβικουϊτίνωση, όχι των κασπασών, αλλά της Smac/DIABLO, που απελευθερώνεται από τα µιτοχόνδρια και αποτελεί ανταγωνιστή της δράσης των IAPs 306,

81 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εικόνα 8. Μηχανισµός δράσης των IAPs για την αναστολή της απόπτωσης, που επάγεται από τα δύο αποπτωτικά µονοπάτια (ενδογενές και εξωγενές). Τελευταία, έχουν αναγνωριστεί τρεις πρωτεΐνες που δρουν ως αρνητικοί ρυθµιστές και καταστέλλουν τη δράση των IAPs. Αυτές είναι ο παράγοντας XAF1 (XIAP-associated factor 1), η Smac/DIABLO και η Omi/HtrA2 (εικόνα 8). Οι πρωτεΐνες αυτές προσδένονται στις IAPs και καταργούν την αντιαποπτωτική τους δράση 308. Ο XAF1 συσσωρεύεται στον πυρήνα και µπορεί να αποχωρίζει την XIAP από το κυτταρόπλασµα. Αντιθέτως, η Smac/DIABLO και η Omi/HtrA2 µοιάζουν µε το κυτόχρωµα c, δηλ. εντοπίζονται στα µιτοχόνδρια και απελευθερώνονται στο κυτταρόπλασµα µετά από αποπτωτικό στρες. Έχει δειχθεί ότι η Smac/DIABLO ενώνεται µε όλες τις IAPs που δοκιµάστηκαν έως σήµερα, συµπεριλαµβανοµένων της XIAP, των c-iap1 και c-iap2, της survivin και της livin 224,309, ενώ η Omi/HtrA2 αλληλεπιδρά µόνο µε τις XIAP, c-iap1 και c-iap2 310,311. Η ισορροπία µεταξύ των IAPs και των αρνητικών τους ρυθµιστών αποτελεί πιθανότατα ένα αποπτωτικό σηµείο ελέγχου, που εντοπίζεται µετά το σηµείο ελέγχου που περιλαµβάνει τις προ- και αντι- αποπτωτικές πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2. 81

82 Οι IAPs παίζουν κεντρικό ρόλο στη ρύθµιση της απόπτωσης. Υπερέκφραση µιας ή περισσοτέρων IAP, ή µείωση της έκφρασης των αρνητικών ρυθµιστών τους µπορεί να οδηγήσει σε καταστολή της απόπτωσης και στην ανεξέλεγκτη δράση τους. Αυτό είναι σύνηθες γεγονός σε µια πληθώρα νεοπλασµατικών κυτταρικών σειρών και σε διάφορα καρκινικά κύτταρα και αποτελεί τη βάση της έρευνας που αφορά στη δράση των IAPs και άλλων ρυθµιστών της απόπτωσης, µε απώτερο σκοπό να χρησιµοποιηθούν ως µοριακοί θεραπευτικοί στόχοι 316,317. Η survivin έχει εξέχουσα θέση ανάµεσα στις 8 ανθρώπινες IAPs, διότι φέρει ιδιαίτερα µορφολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά που τη διαχωρίζουν από τις υπόλοιπες και την καθιστούν µοναδική. 3. Η survivin 3.1. οµή και οργάνωση του γονιδίου της Η survivin είναι το µικρότερο και νεότερο µέλος της οικογένειας των IAPs. Το γονίδιο της αποµονώθηκε το 1997 από τους Ambrosini και συν. 293 και βρέθηκε ότι κωδικοποιεί για µια πρωτεΐνη µήκους 142 αµινοξέων. Έναν χρόνο αργότερα, έγινε η χαρτογράφηση του γονιδίου στο χρωµόσωµα 17 και στη θέση q Η ανθρώπινη survivin, που είναι γνωστή και ως API4 (Apoptosis Inhibitor 4) ή BIRC5 (Baculoviral IAP Repeat-Containing protein 5) είναι µια ενδοκυτταρική πρωτεΐνη µε µοριακό βάρος 16.5 kd, από την οποία απουσιάζουν το πεπτίδιο σήµατος και η υδροφοβική περιοχή, που είναι υπεύθυνες για τη µετακίνηση µέσω της µεµβράνης. Το γονίδιο της ανθρώπινης survivin περιλαµβάνει ένα ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο (ORF, Open Reading Frame) 426 νουκλεοτιδίων, το οποίο αποτελείται από 4 εξόνια (111, 110, 118 και 87 βάσεων αντίστοιχα) και 3 ιντρόνια 293. Το ORF της survivin προσανατολίζεται σε κατεύθυνση αντίθετη από αυτή του υποδοχέα της EPR1, ο οποίος εντοπίζεται στη συ- µπληρωµατική αλυσίδα 319. Η σχέση αυτή, που µέχρι σήµερα είναι µοναδική στο ανθρώπινο γονιδίωµα 293, παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον και έχει προταθεί ότι ο EPR1 θα µπορούσε να ρυθµίζει τα επίπεδα της survivin, µέσω ενός µηχανισµού «φυσικής» αντι-νοηµατικής έκφρασης

83 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ο προαγωγέας της survivin Ο προαγωγέας της survivin είναι υψηλά συντηρηµένος και όταν εισάγεται στα καρκινικά κύτταρα µπορεί να προκαλέσει αύξηση της έκφρασή της µέχρι και 400 φορές, χωρίς ωστόσο να παρατηρείται σηµαντική αύξηση της αντίστοιχης έκφρασης στα φυσιολογικά κύτταρα Για τον λόγο αυτόν µπορεί να θεωρηθεί ως ένα σηµαντικό εργαλείο στη µεταγραφική στόχευση των όγκων. Ο προαγωγέας του γονιδίου της survivin δεν περιλαµβάνει κουτί TATA, ούτε κουτί CAAT, αλλά έχει πολλές CpG περιοχές, που είναι πλούσιες σε γουανίνηκυτοσίνη (GC) και στις οποίες προσδένεται ο µεταγραφικός παράγοντας Sp1 (Specificity Protein-1) 293,326. Οι CpG περιοχές είναι απαραίτητες για τη ρύθµιση της µεταγραφής του γονιδίου της survivin 327. Ένα άλλο µοναδικό χαρακτηριστικό του προαγωγέα της ανθρώπινης survivin είναι η παρουσία τριών στοιχείων CDE (Cell cycle-dependent Element), που εξαρτώνται από τον κυτταρικό κύκλο, και µιας περιοχής CHR (Cell cycle Homology Region), που επίσης σχετίζεται µε τον κυτταρικό κύκλο 327. Τα στοιχεία CDE και CHR αρχικά εντοπίστηκαν στην παρακείµενη του προαγωγέα περιοχή πολλών γονιδίων, που η έκφραση τους ρυθµίζεται από τον κυτταρικό κύκλο. Τέτοια στοιχεία είναι απαραίτητα για την καταστολή της µεταγραφής, κατά τις φάσεις G0 και G1, γονιδίων όπως είναι η κυκλίνη Α, η Cdc25C, η Cdc2, η PLK (Polo Like Kinase), η p130 και η κυκλίνη B2. Τα γονίδια αυτά εκφράζονται επιλεκτικά κατά τη G2/M φάση και κάποια από αυτά θεωρούνται µόρια-κλειδιά στη ρύθµιση της G2/M µετάβασης. Τα στοιχεία CDE και CHR εντοπίζονται γενικά στις περιοχές κοντά στον προαγωγέα, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα γονίδια που τα φέρουν, υπόκεινται σε κοινό ρυθµιστικό έλεγχο 328. Ολική αφαίρεση ή µεταλλάξεις αυτών των στοιχείων, οδηγούν σε απώλεια της περιοδικής και κυκλικά ρυθµιζόµενης έκφρασης της survivin ιάφοροι ερευνητές µελέτησαν τις πρωτεΐνες που προσδένονται στα CDE και CHR στοιχεία και βρήκαν ότι το CDF-1 σύµπλοκο ενώνεται µε το CDE στοιχείο 332, ενώ το CHF σύµπλοκο ενώνεται µε το CHR στοιχείο 333. Ωστόσο, όλες οι πρωτεΐνες που ενώνονται µε τα παραπάνω στοιχεία δεν έχουν πλήρως αποµονωθεί και χαρακτηριστεί. Μελέτες της µεταγραφής του γονιδίου της survivin εντόπισαν το σηµείο έναρξης της µεταγραφής στη θέση -72 και προσδιόρισαν παρακείµενες περιοχές πλούσιες σε GC. Η CpG µεθυλίωση θεωρείται κρίσιµη για τη µεταγραφική ρύθ- 83

84 µιση των πλούσιων GC προαγωγέων. Παραδόξως, οι CpG περιοχές του προαγωγέα της survivin δεν υφίστανται µεθυλίωση, ούτε στους φυσιολογικούς, αλλά ούτε και στους καρκινικούς ιστούς 327. Αντιθέτως, έχει βρεθεί ότι η αποµεθυλίωση των CpG περιοχών του εξονίου 1 της survivin, ρυθµίζει την έκφραση της survivin σε νεοπλασίες των ωοθηκών οµή και έκφραση της πρωτεΐνης Σε αντίθεση µε τα υπόλοιπα µέλη της οικογένειας των IAPs, η survivin φέρει ένα και µοναδικό αντίγραφο της ακολουθίας BIR στο αµινοτελικό της ά- κρο 335, ενώ στο καρβοξυτελικό άκρο δεν έχει δάκτυλο ψευδαργύρου (RING finger), αλλά µια µακριά α-έλικα (α-helix). Αν και οι α-έλικες σχετίζονται γενικά µε τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ πρωτεϊνών για τη δηµιουργία διµερών, στην περίπτωση της survivin ο διµερισµός δεν προκύπτει µέσω της α-έλικας, αλλά µε συµµετοχή δυο άλλων υδρόφοβων περιοχών Αυτό έχει ως αποτέλεσµα η α-έλικα της survivin να παραµένει ελεύθερη για συνδέσεις µε άλλες πρωτεΐνες. Έχει δειχθεί ότι η περιοχή αυτή της survivin συµµετέχει στις αλληλεπιδράσεις µε τους πολυµερισµένους µικροσωληνίσκους της µιτωτικής ατράκτου 329,339. Είναι πολύ πιθανό η αντι-αποπτωτική δράση της survivin να οφείλεται τόσο στην περιοχή BIR, όσο και στις αλληλεπιδράσεις της καρβοξυτελικής περιοχής µε τους πολυµερισµένους µικροσωληνίσκους. Η survivin είναι η µόνη IAP που ο- µοδιµερίζεται σε διαλύµατα και το οµοδιµερές που σχηµατίζεται έχει µορφή φιόγκου (bow tie-shaped homodimer) ,340. Αν και τα διµερή αυτά συναντώνται in vivo 341, δεν υπάρχουν αναφορές που να δείχνουν ότι ο διµερισµός έχει λειτουργική σηµασία. Η survivin εντοπίζεται κατά κύριο λόγο στο κυτταρόπλασµα (56,5%) και σε µικρότερο ποσοστό στον πυρήνα (17,%) και στα µιτοχόνδρια (13%). Σε ακόµη µικρότερα ποσοστά ανευρίσκεται στην κυτταροπλασµατική µεµβράνη (4,3%), στο ενδοπλασµατικό δίκτυο (4,3%) και στα λυσοσώµατα (4,3%) 342. Ένα από τα σηµαντικότερα γνωρίσµατα της survivin είναι ότι εκφράζεται σε εµβρυικούς ιστούς, αλλά δεν ανιχνεύεται σε εφησυχάζοντα κύτταρα και σε τελικά διαφοροποιηµένους φυσιολογικούς ιστούς. Σε κύτταρα που διαιρούνται η έκφραση της survivin σχετίζεται µε τον κυτταρικό κύκλο και η µέγιστη τιµή της προκύ- 84

85 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ πτει κατά τη φάση G2/M. Το 1997, πρώτοι οι Ambrosini και συν. 293 παρατήρησαν µε Northern blot ανάλυση, έκφραση της survivin στον εµβρυικό νεφρό και στο ήπαρ και σε µικρότερο ποσοστό στον εµβρυικό πνεύµονα και εγκέφαλο. εν παρατηρήθηκε έκφραση της survivin σε τελικά διαφοροποιηµένους φυσιολογικούς ιστούς, εκτός από τον θύµο αδένα και τον πλακούντα. Οι Adida και συν. 343 παρατήρησαν έκφραση survivin σε πολλούς εµβρυικούς ιστούς του ανθρώπου, µέχρι και την 21 η εβδοµάδα της κύησης, καθώς και σε έµβρυα ποντικών µέχρι την 11 η, αλλά όχι µετά την 14 η µέρα της κύησης. Η ανοσοϊστοχηµική ανάλυση και η in situ υβριδοποίηση διαφόρων καρκινικών ιστών, αποκάλυψε την ισχυρή έκφραση survivin σε αδενοκαρκινώµατα του πνεύµονα, του παγκρέατος, του στήθους και του προστάτη 293. Παρακείµενοι µη νεοπλασµατικοί ιστοί δεν εξέφραζαν survivin. Η ισχυρή, µοναδική και κυρίαρχη έκφραση της survivin στους καρκινικούς ιστούς οδήγησε στο χαρακτηρισµό της ως ένα από τα πιο όγκο-ειδικά γονίδια του ανθρώπου 335, Ισοµορφές της survivin Η διαφορική διασύνδεση (alternative splicing) του γονιδίου της survivin παίζει σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της έκφρασής της και αντικατοπτρίζει την πολυποίκιλη δράση της και τον εντοπισµό της σε διαφορετικά σηµεία, µέσα στο κύτταρο. Το γονίδιο της survivin αποτελείται από 4 εξόνια, τα οποία µε τη διαδικασία της διαφορικής διασύνδεσης παράγουν 6 διαφορετικά mrna, που µε τη σειρά τους κωδικοποιούν 6 διακριτές πρωτεΐνες (εικόνες 9 και 10). Στον άνθρωπο αυτές είναι: η survivin, η survivin-2β 345, η survivin- Εx3 345, η survivin-3β 346, η survivin-2α 347 και η survivin-3α survivin-2β και survivin- Εx3 Η ανθρώπινη survivin αποτελείται από 142 αµινοξέα και κωδικοποιείται από τα εξόνια 1 έως 4. Η survivin-2β αποτελείται από 167 αµινοξέα και περιλαµβάνει µια επιπλέον περιοχή 69bp, που αναφέρεται ως εξόνιο 2Β και προέρχεται από το ιντρόνιο 2. Η εισαγωγή του εξονίου 2Β διαταράσσει την BIR περιοχή, µε αποτέλεσµα η survivin-2β να χάνει την αντι-αποπτωτική της δράση και να θεωρείται προ-αποπτωτική πρωτεΐνη

86 Εικόνα 9. ηµιουργία των πέντε διαφορετικών ισοµορφών της survivin, από ένα αρχικό pre-mrna µε τη διαδικασία της διαφορικής διασύνδεσης. Εικόνα 10. Οι αλληλουχίες των αµινοξέων των πέντε ισοµορφών της survivin. 86

87 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η survivin- Εx3 αποτελείται από 137 αµινοξέα και περιλαµβάνει τα εξόνια 1, 2 και 4, καθώς και µια επέκταση του αναγνωστικού της πλαισίου, µέσα στο αναγνωστικό πλαίσιο της 3 µη µεταφραζόµενης περιοχής (3 UTR, UnTranslated Region). Η survivin- Εx3 διατηρεί την αντι-αποπτωτική της δράση παρά το γεγονός ότι η BIR περιοχή είναι αλλοιωµένη 345,349,350. Είναι πιθανόν, το νέο καρβοξυτελικό άκρο να έχει δυνατότητα αναστολής της απόπτωσης. Πράγµατι, µέσα στη περιοχή αυτή υπάρχει µια πιθανή BH2 θέση για την πρόσδεση µε την πρωτεΐνη Bcl Είναι πιθανό η survivin-2β να δρα ως ένας φυσικά επερχόµενος το κυτταρόπλασµα, ενώ η survivin- Εx3 εντοπίζεται στον πυρήνα, λόγω της ύπαρξης ενός πυρηνικού σήµατος εντοπισµού, που καλανταγωνιστής της survivin ή/και της survivin- Εx3 345,352,353. Στα µεσοφασικά κύτταρα, η survivin-2β εντοπίζεται σείται NLS (Nuclear Localization Signal) 353,354. Κατά τη διάρκεια της µίτωσης, οι δύο αυτές ισοµορφές βρίσκονται διάσπαρτες µέσα στο κυτταρόπλασµα, αλλά δεν εντοπίζονται στα χρωµοσώµατα, στα µεσοσωµάτια και στη µιτωτική άτρακτο 353. Με παρατήρηση σε φθορίζον µικροσκόπιο βρέθηκε ότι η survivin-2β και η survivin- Εx3 δε σχετίζονται µε τα µεταφασικά χρωµοσώµατα και κατά συνέπεια, δεν παίζουν κανένα ρόλο στη µίτωση 355. Από πολλούς ερευνητές αναφέρθηκε ότι η survivin- 2Β εντοπίζεται και στα µιτοχόνδρια, αν και ο εντοπισµός αυτός µπορεί να διαφέρει στους διάφορους κυτταρικούς τύπους 356. Τελευταία, βρέθηκε ότι η survivin- Εx3, εκτός από τον πυρήνα εντοπίζεται και στα µιτοχόνδρια, αλλά σε µικρότερο ποσοστό 342, καθώς και στους πυρηνίσκους, όπου µπορεί και αποικοδοµείται γρήγορα από το πρωτεάσωµα 354. Είναι γνωστό ότι η survivin οµοδιµερίζεται σε διαλύµατα. Ωστόσο, υπάρχει ένα υποθετικό µοντέλο που εκτιµά ότι η survivin-2β ή/και η survivin- Εx3 ετεροδιµερίζονται µε τη survivin, σε µια προσπάθεια συντονισµού του ρόλου της στη ρύθµιση της µίτωσης ή/και της απόπτωσης 357. Η ποσοτική µελέτη των ισοµορφών της survivin σε ανθρώπινη καρκινική κυτταρική σειρά έδειξε ότι η αναλογία survivin:survivin-2β:survivin- Εx3 είναι περίπου 5-7: 1: Είναι πιθανόν, ανάµεσα στις διάφορες ισοµορφές να διαµορφώνεται ένα ρυθµιστικό ισοζύγιο, το οποίο καθορίζει την απάντηση στα προ-αποπτωτικά ερεθίσµατα, τόσο των καρκινικών, όσο και των εµβρυικών ιστών 342,345,

88 Oι ισοµορφές survivin-2β και survivin- Εx3 θεωρούνται πιο ειδικοί µάρτυρες της εκάστοτε νόσου, σε σχέση µε τη survivin 358,και φαίνεται να παίζουν διαφορετικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου 359. Είναι πιθανόν, η survivin-2β να σχετίζεται αρνητικά µε την πρόοδο του καρκίνου 360, ενώ έχει δειχθεί ότι υ- πάρχει µικρή, αλλά σηµαντική συσχέτιση της survivin- Εx3, µε το µέγεθος του όγκου και τον αριθµό των µεταστάσεων 349. Στον καρκίνο του πνεύµονα, η έκφραση της survivin-2β σχετίζεται µε αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων και µε αυξηµένη απόπτωση 361. ιαφορική έκφραση των µεταγράφων της survivin, της survivin-2β και της survivin- Εx3 έχει περιγραφεί σε πολλούς καρκινικούς ιστούς του ανθρώπου και η παρουσία/απουσία των διαφόρων ισο- µορφών έχει συσχετιστεί µε την πρόγνωση διαφόρων νοσηµάτων 359. Ωστόσο, σε κάθε περίπτωση ο άγριος-τύπος της survivin είναι το κυρίαρχο µετάγραφο 345, survivin-3β Η survivin-3β αποτελείται από 5 εξόνια, δηλ. από τα 4 γνωστά και από ένα επιπλέον που αναφέρεται ως 3Β και προέρχεται από µια περιοχή 165bp του ι- ντρονίου 3. Η ισοµορφή αυτή παράγει µια µικρότερη πρωτεΐνη 120 αµινοξέων, εξαιτίας της ύπαρξης ενός κωδικονίου τερµατισµού, µέσα στο νέο εξόνιο 3Β 346. Η survivin-3β περιλαµβάνει την ακολουθία BIR, που είναι υπεύθυνη για την αναστολή της απόπτωσης, αλλά δεν περιέχει ελικοειδή δοµή, όπως η survivin και οι άλλες ισοµορφές, υποδηλώνοντας ότι η έκφρασή της δε ρυθµίζεται από τον κυτταρικό κύκλο 346. Πιθανότατα, η λειτουργία αυτής της ισοµορφής να είναι διαφορετική από τη λειτουργία της survivin. Έκφραση της survivin-3β παρατηρήθηκε στον καρκίνο του παχέος εντέρου και σε κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινωµάτων του πεπτικού συστήµατος, καθώς και σε ασθενείς µε Μ Σ ή ΟΜΛ 346. Οι Vegran και συν. 363 πρόσφατα ανακοίνωσαν ότι η survivin-3β απαντάται πιο συχνά σε υψηλού βαθµού καρκινώµατα του µαστού και σχετίζεται µε µεταλλάξεις της p53, υποδεικνύοντας έναν θετικό ρόλο για αυτήν την ισοµορφή στην αναστολή της απόπτωσης. 88

89 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ survivin-2α και survivin-3α Η survivin-2α αποτελείται από τα εξόνια 1 και 2, καθώς και από ένα νέο εξόνιο που ονοµάζεται 2α και είναι µέρος του ιντρονίου 2. Το εξόνιο 2α φέρει ένα κωδικόνιο τερµατισµού στην αρχή του, µε αποτέλεσµα η πρωτεΐνη που παράγεται από την ισοµορφή -2α να έχει µέγεθος µόνο 74 αµινοξέα 347. Η survivin- 2α αλληλεπιδρά µε τη survivin και στρατολογείται στα κεντροµέρη και στο µεσοσωµάτιο, µετά από έκφρασή της σε άλλα σηµεία του κύτταρου 347. Εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασµα σε ποσοστό 39% και στον πυρήνα σε ποσοστό 34,8%. Περαιτέρω µελέτες είναι απαραίτητες προκειµένου να καθοριστεί ο α- κριβής ρόλος της survivin-2α κατά τη διάρκεια τη µίτωσης. Η survivin-3α ανακαλύφθηκε το 2005, από τους Vietri και συν. 348 σε κύτταρα οξείας µυελογενούς λευχαιµίας. Η πρωτείνη αποτελείται από 78 αµινοξέα και έχει µοριακό βάρος 8,9 kd. Εντοπίζεται κατά κύριο λόγο στο κυτταρόπλασµα (40%) και στον πυρήνα (35%). Περαιτέρω µελέτες είναι απαραίτητες προκειµένου να διευκρινιστεί και να καθοριστεί ο ακριβής βιολογικός ρόλος των διαφόρων ισοµορφών της survivin στην αύξηση, ανάπτυξη και διαφοροποίηση των κυττάρων, καθώς και στην καρκινογένεση Ο ρόλος της survivin Οι διάφοροι ερευνητές που περιέγραψαν τη δοµή και τα βιοχηµικά χαρακτηριστικά της survivin κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι η πρωτεΐνη αυτή έχει διττό ρόλο. Είναι πλέον γνωστό ότι η survivin συµµετέχει τόσο στην αναστολή της απόπτωσης, όσο και στην προαγωγή του κυτταρικού κύκλου και ρύθµιση της κυτταρικής διαίρεσης και υπάρχει ένας µεγάλος όγκος µελετών, που υποστηρίζει αυτά τα δεδοµένα 357. α. στη µίτωση και την προαγωγή του κυτταρικού κύκλου Η survivin είναι απαραίτητη για τη σωστή διεξαγωγή της µίτωσης και της κυτταρικής διαίρεσης 364. Ενώ ο µηχανισµός δράσης της απαιτεί περαιτέρω µελέτη, τα αρχικά ευρήµατα που αφορούσαν τη θέση της survivin µέσα στο κύτταρο 89

90 διέγειραν το ενδιαφέρον της επιστηµονικής κοινότητας. Το 1998, οι Li και συν. έδειξαν ότι η έκφραση της survivin ρυθµίζεται από τον κυτταρικό κύκλο και η µέγιστη τιµή της παρατηρείται κατά τη φάση G2/M 329. Κατά τη διάρκεια της µίτωσης, η survivin αλληλεπιδρά µε τους µικροσωληνίσκους της µιτωτικής ατράκτου, µέσω των α-ελίκων που βρίσκονται στο καρβοξυτελικό της ά- κρο 293. ιαταραχή αυτής της σχέσης, οδηγεί σε απώλεια της αντι-αποπτωτικής λειτουργίας της survivin και σε αυξηµένη δραστικότητα της κασπάσης-3, που προάγει τον κυτταρικό θάνατο. Η διαταραγµένη λειτουργία της survivin σχετίζεται µε ελαττωµατική κυτταρική διαίρεση, που χαρακτηρίζεται από υπεράριθµα κεντροσωµάτια, σχηµατισµό πολυπολικών ατράκτων και αδυναµία στη διεξαγωγή της κυτταροκίνησης, µε αποτέλεσµα να προκύπτουν πολυπλοειδή και πολυπύρηνα κύτταρα 339,365. Ο κρίσιµος ρόλος της survivin στη µίτωση α- ποδείχθηκε και µε πειράµατα σε knockout επίµυς. Οµόζυγη µετάλλαξη του γονιδίου της survivin οδήγησε σε εµβρυικό θάνατο την 4-5 η ηµέρα, αποκαλύπτοντας αδυναµία στην εκτέλεση της κυτταροκίνησης και στον σχηµατισµό των µικροσωληνίσκων 366. Παρά το γεγονός ότι η µέγιστη έκφραση της survivin παρατηρείται κατά τη G2/M φάση, το ερώτηµα που µένει να απαντηθεί είναι εάν προκύπτει κάποιος ρόλος για τη survivin, έξω από τη µίτωση, στην προαγωγή του κυτταρικού κύκλου. Τα ευρήµατα διαφόρων µελετών υποδεικνύουν ότι η survivin συµµετέχει στη µετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S, καθώς και στην προαγωγή του κυτταρικού κύκλου τόσο στα καρκινικά κύτταρα, όσο και στα φυσιολογικά κύτταρα. Επιπλέον βρέθηκε ότι η survivin αλληλεπιδρά µε τον ρυθµιστή του κυτταρικού κύκλου Cdk4, οδηγώντας σε ενεργοποίηση του συµπλόκου Cdk2/κυκλίνη Ε. Αυξηµένη έκφραση της survivin έχει ως αποτέλεσµα την επιτάχυνση της φάσης S και την αδυναµία ακινητοποίησης στη φάση G1 367,368. Η επαγωγή της survivin από αυξητικούς παράγοντες ή/και κυτταροκίνες φαίνεται να είναι πολύ σηµαντική για την ωρίµανση των προγονικών αιµοποιητικών κυττάρων και τη µετάβαση από τη φάση G0/G1 στη φάση S 368. Ωστόσο, παραµένει άγνωστο εάν κάτι τέτοιο είναι συνηθισµένο για τα φυσιολογικά µη διαφοροποιηµένα κύτταρα και σε ποιό βαθµό. Είναι κατανοητό ότι περαιτέρω µελέτη και διερεύνηση του ρόλου της survivin κατά τη G1/S µετάβαση θα βοηθήσει στην κατανόηση της λειτουργίας και της δράσης της, στη ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου. Η survivin αποτελεί κύριο συστατικό του χρωµοσωµικού συµπλέγµατος 90

91 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ CPC (Chromosomal Passenger Complex), µαζί µε δύο καλά χαρακτηρισµένες χρωµοσωµικές πρωτεΐνες-µεταφορείς, µε τις οποίες ενώνεται άµεσα και ισχυρά. Αυτές είναι η κινάση της σερίνης/θρεονίνης Aurora B 370 και η πρωτεΐνη IN- CENP (Inner CΕntromere Protein) 366,371. Το CPC ευθύνεται για τη ρύθµιση πολλών γεγονότων που σχετίζονται µε τη µίτωση, όπως είναι η ευθυγράµµιση των χρωµοσωµάτων στο κέντρο της µιτωτικής ατράκτου και η µετακίνησή τους στους πόλους του κυττάρου, η χηµική τροποποίηση των ιστονών και τέλος η κυτταροκίνηση 372. Το σύµπλοκο survivin/aurora B/INCENP εντοπίζεται στα κεντροµερή των χρωµοσωµάτων, στους κινητοχώρους και στη µιτωτική άτρακτο και είναι υπεύθυνο για την προαγωγή της µιτωτικής διαίρεσης 357. Αν και ο ακριβής µηχανισµός δράσης των τριών αυτών πρωτεϊνών παραµένει υπό διερεύνηση, είναι γνωστό ότι απουσία του RNA ενός εκ των τριών µπορεί να οδηγήσει σε διαταραχή της µιτωτικής διαδικασίας 373. Αντιφατικά παραµένουν τα ευρήµατα για το αν η survivin προάγει 371,373 ή όχι 357 τη δράση της Aurora B in vitro. Πρόσφατες µελέτες αναφέρουν ότι η in vitro φωσφορυλίωση της survivin στη θέση Thr117 από την Aurora B ευθύνεται για τον εντοπισµό της στα κεντροµερή, κατά τη διάρκεια της µίτωσης 374. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι τουλάχιστον στα καρκινικά κύτταρα υπάρχει ένα πρόσθετο συστατικό, που ονοµάζεται Dasra B/borealin, το οποίο φαίνεται να παίζει σηµαντικό ρόλο στη σταθεροποίηση της survivin και στην αποτελεσµατική σύνδεσή της µε τον INCENP. Αποµάκρυνση της Dasra B/borealin µειώνει τα επίπεδα της survivin κατά 60-70% 375 και συνεπάγεται αδυναµία σύνδεσης µε τον INCENP και µιτωτικές ανωµαλίες 376. Ωστόσο, σε ορισµένες εξειδικευµένες φυσιολογικές καταστάσεις είναι πιθανόν η survivin να µην εµπλέκεται στη µίτωση. Έχει αναφερθεί ότι η πρωτεΐνη δεν ανιχνεύεται σε κανένα στάδιο του ενδοµιτωτικού κυτταρικού κύκλου των µεγακαρυοκυττάρων του µυελού των οστών, αν και παρατηρούνται χαµηλά επίπεδα mrna 377,378. Με πειράµατα διαπιστώθηκε ότι η απουσία της πρωτεΐνης της survivin δεν ήταν αποτέλεσµα της πρωτεασωµικής αποικοδόµησης 377. Στην περίπτωση της ενδοµίτωσης των λείων αγγειακών µυϊκών κυττάρων, οι Nagata και συν. 379 έδειξαν ότι η survivin δεν εντοπίζεται µαζί µε την Aurora B ή τον INCENP, παρά το γεγονός ότι παρατηρείται µια διάχυτη έκφραση survivin. Η µειωµένη, σχεδόν µη ανιχνεύσιµη, έκφραση της survivin σε φυσιολογικούς ι- στούς έρχεται σε αντίθεση µε την αυξηµένη έκφρασή της στους όγκους και στα 91

92 καρκινικά κύτταρα. Απαιτείται λοιπόν περαιτέρω έρευνα για την εξακρίβωση του ρόλου της survivin, τόσο στα καρκινικά, όσο και στα φυσιολογικά κύτταρα. Οι Yang και συν. 324 πρόσφατα ανέφεραν ότι τα φυσιολογικά κύτταρα δεν απαιτούν survivin για την επιβίωσή τους. Από τα παραπάνω γίνεται κατανοητό ότι, η έκφραση της survivin στους νεοπλασµατικούς ιστούς είναι διαρκής και ότι το σηµατοδοτικό µονοπάτι της διαφέρει στα καρκινικά, σε σχέση µε τα φυσιολογικά κύτταρα, ως αποτέλεσµα της δράσης διαφορετικών σηµάτων και ερεθισµάτων 380. β. στην αναστολή της απόπτωσης Ο εντοπισµός της survivin σε πολλές και ποικίλες θέσεις µέσα στο κύτταρο συµφωνεί µε την πολλαπλή της ταυτότητα και λειτουργία. Εκτός από τη ρύθµιση της µιτωτικής διαίρεσης, η survivin παίζει κύριο ρόλο στην αναστολή της απόπτωσης. Αν και ο µηχανισµός δράσης της δεν είναι ακόµη πλήρως κατανοητός, πρέπει να τονιστεί ότι η αναστολή της απόπτωσης από τη survivin γίνεται κατά τη διάρκεια της µίτωσης. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα τη δηµιουργία ενός νέου αποπτωτικού σηµείου ελέγχου, που είναι υπεύθυνο για τη διατήρηση της ισορροπίας ανάµεσα στον κυτταρικό θάνατο και την κυτταρική επιβίωση. Οι διάφοροι µηχανισµοί που έχουν προταθεί για την αναστολή της απόπτωσης από τη survivin φαίνονται στην εικόνα 11. Ο µηχανισµός της αναστολής της κασπάσης-3 από τη survivin δεν έχει πλήρως εξακριβωθεί και τα ευρήµατα που προκύπτουν από τις διάφορες µελέτες είναι αντιφατικά. Υπάρχουν αναφορές για άµεση σύνδεση της survivin µε την κασπάση-3 και αναστολή της δράσης της in vitro Ωστόσο, είναι γνωστό ότι από την πρωτεΐνη της survivin απουσιάζουν τα δοµικά εκείνα στοιχεία που εντοπίζονται σε άλλες IAPs και είναι υπεύθυνα για αλληλεπιδράσεις µε την κασπάση-3 205,383,384,386. Άλλες µελέτες επικεντρώνονται στις ο- µοιότητες της survivin µε µια άλλη IAP, την XIAP, η οποία φέρει τρεις BIR περιοχές. Η BIR3 περιοχή της XIAP συνδέεται µε την κασπάση-9 και την καταστέλλει 205. Η BIR περιοχή της survivin έχει παρόµοια τρισδιάστατη δοµή µε την BIR3 περιοχή, γεγονός που µπορεί να υποδηλώνει την δυνατότητα άµεσης σύνδεσης της survivin µε την κασπάση Μια άλλη θεωρία αναφέρει ότι η sur- 92

93 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ vivin απαιτεί πιθανότατα τον παράγοντα HBXIP (Hepatitis B X-interacting Protein) για να δράσει, ο οποίος ενώνεται µε την προκασπάση-9 και έτσι αναστέλλεται η απόπτωση, µέσω της ενδογενούς οδού 388. Εικόνα 11. Πιθανοί µηχανισµοί δράσης της survivin στην αναστολή της απόπτωσης. Η survivin µπορεί να αναστέλλει την απόπτωση είτε (Α) άµεσα, συνδεό- µενη µε τις κασπάσες που είναι υπεύθυνες για την επαγωγή και εκτέλεση της απόπτωσης, είτε (Β) έµµεσα, µέσω σύνδεσης µε τη Smac/DIABLO και απελευθέρωσης των IAP πρωτεϊνών. Αν και η άµεση σύνδεση της survivin µε τις κασπάσες δεν έχει επιβεβαιωθεί, είναι πιθανόν η αναστολή της απόπτωσης να επιτυγχάνεται µε έµµεσο τρόπο, δηλαδή µε τη βοήθεια ενδιάµεσων µορίων. Η Smac/DIABLO είναι µια προαποπτωτική πρωτεΐνη, η οποία απελευθερώνεται από τα µιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασµα, µαζί µε το κυτόχρωµα c. Η Smac/DIABLO ενώνεται µε τις IAPs και καταστέλλει την ανασταλτική τους δράση, µε αποτέλεσµα να προάγεται η απόπτωση 224. Η survivin δρα πιθανότατα, µέσω δηµιουργίας συµπλόκου µε τη Smac/DIABLO, η οποία αδυνατεί πλέον να συνδεθεί µε τις άλλες IAPs, που ελευθερώνονται για να αναστείλουν την απόπτωση 224,225,389. Μια σηµειακή µετάλλαξη στο αµινοξύ Asp71 της survivin έχει ως αποτέλεσµα την αδυναµία συνένωσής της µε τη Smac/DIABLO. Έχει δειχθεί ότι η άµεση συνένωση των δύο 93

94 πρωτεϊνών είναι απαραίτητη για την αναστολή της απόπτωσης σε HeLa κύτταρα, που βρίσκονται υπό την επίδραση Taxol, ενός αντικαρκινικού φαρµάκου που επάγει την απόπτωση 390. Η µελέτη των καρκινικών νευρικών κυττάρων έδωσε νέες πληροφορίες σχετικά µε τον ρόλο της survivin στην αναστολή της απόπτωσης 391. Η χρήση συµπληρωµατικών ολιγονουκλεοτιδίων έναντι της survivin είχε ως αποτέλεσµα την καταστολή της πρωτεΐνης, αλλά όχι και την αντίστοιχη ενεργοποίηση της κασπάσης-3. Τα ευρήµατα αυτά υποδεικνύουν ότι στον κυτταρικό θάνατο είναι δυνατό να εµπλέκεται ένας µηχανισµός, που δεν εξαρτάται από τις κασπάσες. Η survivin λοιπόν µπορεί να ρυθµίζει τόσο ένα εξαρτώµενο, όσο και ένα ανεξάρτητο από τις κασπάσες κυτταρικό µονοπάτι θανάτου, ανάλογα µε τον εκάστοτε κυτταρικό τύπο. Ο ρόλος της survivin ως αναστολέας της απόπτωσης, σε σχέση µε τη ρύθ- µιση της κυτταρικής διαίρεσης έχει διερευνηθεί in vivo σε διαγονιδιακούς Κ14- survivin επίµυς, οι οποίοι εκφράζουν συνεχώς survivin στα κερατινοκύτταρα 392. Υπερέκφραση της survivin σε αυτούς τους επίµυς δεν επηρεάζει τη φυσιολογική διαφοροποίηση του δέρµατος ή τον βασικό ρυθµό πολλαπλασιασµού των κερατινοκυττάρων. Ωστόσο, οι Κ14-survivin επίµυες εµφάνισαν µείωση κατά 60% στην απόπτωση µετά από έκθεση σε ακτινοβολία UVB, σε σχέση µε φυσιολογικούς επίµυς. Τα ευρήµατα αυτά δείχνουν ότι η συνεχόµενη έκφραση της survivin αναστέλλει την απόπτωση στα κερατινοκύτταρα, αν και ο ρυθµός του κυτταρικού πολλαπλασιασµού παραµένει ανεπηρέαστος. Αυτό υποδηλώνει ότι η έκφραση της survivin στα καρκινικά κύτταρα δεν πρέπει να απεικονίζει απλά µια αύξηση στον αριθµό των διαιρούµενων νεοπλασµατικών κυττάρων 392. Οι Dohi και συν. 393 έδειξαν ότι υπάρχει µια µιτοχονδριακή δεξαµενή survivin στα καρκινικά κύτταρα, που είναι απαραίτητη για την αναστολή της απόπτωσης, που επάγεται από τα µιτοχόνδρια. Μετά την επίδραση σηµάτωνθανάτου, η µιτοχονδριακή survivin απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασµα, όπου εµποδίζει την ενεργοποίηση των κασπασών και αναστέλλει την απόπτωση, που εξαρτάται από την κασπάση Η survivin-2β µπορεί και επάγει την απόπτωση, εµποδίζοντας την απελευθέρωση της survivin των µιτοχονδρίων στο κυτταρόπλασµα, µέσω της φυσικής αλληλεπίδρασής τους. 94

95 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3.5. Έκφραση της survivin α. σε φυσιολογικούς ιστούς Η survivin εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα κατά τη διάρκεια της εµβρυικής ανάπτυξης, γεγονός που φανερώνει τη σηµασία της στη διατήρηση της οµοιόστασης και στη διαδικασία της διαφοροποίησης. Το γονίδιο της survivin δεν εκφράζεται στους περισσότερους τελικά διαφοροποιηµένους φυσιολογικούς ιστούς. Ανάµεσα στις πρωτεΐνες της οικογένειας των IAPs, η survivin δείχνει την πιο περιορισµένη έκφραση στους ιστούς των ενηλίκων, αλλά έχει αναγνωριστεί σε πολλούς εµβρυικούς ιστούς 343. Φυσιολογικοί ενήλικοι ιστοί του ανθρώπου που εκφράζουν survivin είναι ο θύµος αδένας 293, τα CD34+ αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα του µυελού των οστών 394 και το βασικό επιθήλιο του παχέος εντέρου 395 και του γαστρικού βλεννογόνου 396. Το υποσύνολο των ανθρώπινων Τ κυττάρων µε διπλό φαινότυπο CD4+/CD8+ εκφράζει τα υψηλότερα επίπεδα survivin, σε σχέση µε τα υπόλοιπα Τ λεµφοκύτταρα 397. Ωστόσο, µειωµένη έκφραση survivin παρατηρείται στα CD4+ ή CD8+ Τ κύτταρα, ενώ δεν ανιχνεύεται καθόλου στα Τ κύτταρα του περιφερικού αίµατος, οδηγώντας στο συµπέρασµα ότι ίσως είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των Τ κυττάρων. Η survivin εκφράζεται επίσης, κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, στα CD34+ αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα, γεγονός που φανερώνει ότι θεραπευτική στόχευση της survivin στα καρκινικά κύτταρα, θα µπορούσε να διαταράξει τη φυσιολογική αιµοποίηση 398. Τα CD34+ κύτταρα εκφράζουν survivin σε όλα τα στάδια του κυτταρικού κύκλου, ενώ τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν τη survivin ειδικά κατά τη G2/M φάση. Ωστόσο, η υπερέκφραση της survivin δεν είναι τόσο µεγάλη όσο στα λευχαιµικά κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η survivin υφίσταται µια γενική απορρύθµιση στη λευχαιµία. Είναι πιθανόν τα CD34+ κύτταρα, κάτω από την επίδραση αυξητικών αιµοποιητικών παραγόντων, να απαιτούν µικρές µόνο ποσότητες survivin, για να εκτελέσουν κυτταρική διαίρεση µάλλον παρά απόπτωση 399. Έκφραση της survivin παρατηρείται επίσης σε φυσιολογικούς εντερικούς ιστούς και σε υπερπλαστικές προκαρκινικές και καρκινικές αλλοιώσεις του παχέος εντέρου 395. Αυτό υποδεικνύει ότι η survivin δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως ειδικός δείκτης του καρκίνου του παχέος εντέρου. Στον άνθρωπο, όπως και στον επίµυ, υπάρχει ισχυρή πυρηνική έκφραση της survivin στα επιθηλιακά 95

96 κύτταρα του βλεννογόνου του στοµάχου, οδηγώντας στο συµπέρασµα ότι ή παίζει σηµαντικό ρόλο στην ακεραιότητα του γαστρικού βλεννογόνου 399. β. σε καρκινικά κύτταρα Το πιο σηµαντικό κλινικό γνώρισµα της survivin, που καθιστά επιτακτική τη µελέτη της είναι η µεγάλη κατανοµή και ισχυρή έκφραση σε πολλά είδη καρκίνου και η περιορισµένη, σχεδόν ανύπαρκτη έκφραση σε τελικά διαφοροποιηµένους φυσιολογικούς ιστούς. Στην ιατρική, η µελέτη της έκφρασης της survivin µε ανοσοϊστοχηµικές χρώσεις αποτελεί µια σηµαντική προγνωστική παράµετρο σε µια πληθώρα καρκίνων, όπως καρκινώµατα, σαρκώµατα και αιµατολογικά νεοπλάσµατα. Υψηλή έκφραση survivin σε όγκους σχετίζεται µε µεγαλύτερη επιθετικότητα και διεισδυτικότητα και εποµένως, αναµένεται νόσος χειρότερης πρόγνωσης και µειωµένης απόκρισης στα χηµειοθεραπευτικά φάρµακα 394, Πολλά καρκινώµατα του ανθρώπου παρουσιάζουν υψηλά επίπεδα έκφρασης survivin, όπως του πνεύµονα 405, του µαστού 408, του παχέος εντέρου 404, του στοµάχου 410, του οισοφάγου 403, του παγκρέατος 411, της ουροδόχου κύστης 407, της µήτρας 412, των ωοθηκών 413, του ήπατος 414, καθώς και του καρκίνου του δέρ- µατος 415. Η υπερέκφραση της survivin συχνά συνδέεται µε κακή πρόγνωση και επιθετικότερη νόσο, σε σχέση µε τις περιπτώσεις όπου δεν παρατηρείται έκφραση. Ανίχνευση survivin στα ούρα αποτελεί διαγνωστικό κριτήριο για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης 416. Η παρουσία της πρωτεΐνης στα ούρα χρησιµοποιείται στη διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και στον διαχωρισµό των νεοπλασµατικών καταστάσεων από τις φλεγµονώδεις περιπτώσεις, µε ευαισθησία 100% και ειδικότητα 95%. Υπερέκφραση της survivin έχει δειχθεί επίσης στις λευχαιµίες 401,417, στο νευροβλάστωµα 400,402, στο µελάνωµα 418, στο σάρκω- µα µαλακού ιστού 419 και στο υψηλού βαθµού non-hodgkin λέµφωµα 293, ενώ το χαµηλού βαθµού non-hodgkin λέµφωµα δεν εκφράζει survivin

97 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3.6. Ρύθµιση της έκφρασης της survivin Η πολυπλοκότητα του ρόλου της survivin στην αναστολή της απόπτωσης και στην προαγωγή της κυτταρικής διαίρεσης, αναδεικνύει µια πρόκληση για την εύρεση τρόπων αναστολής της δράσης της, µε σκοπό τη θεραπευτική προσέγγιση του καρκίνου. Η µελέτη της µεταγραφικής και µετα-µεταγραφικής ρύθµισης της survivin θα βοηθήσει προς αυτήν την κατεύθυνση και θα προτείνει µοριακούς µηχανισµούς που θα στοχεύουν στην έκφρασή της. Το κρίσιµο ερώτηµα που πρέπει να απαντηθεί είναι µε ποιόν τρόπο η survivin εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, αλλά όχι σε τελικά διαφοροποιηµένους φυσιολογικούς ιστούς Μεταγραφική ρύθµιση Χρησιµοποιώντας ένζυµα περιορισµού που είναι ευαίσθητα στη µεθυλίωση, πάνω σε γενωµικό DNA από φυσιολογικούς, εµβρυικούς και καρκινικούς ιστούς βρέθηκε ότι το πρότυπο µεθυλίωσης της survivin διαφέρει σηµαντικά. Το γονίδιό της παρουσιάζει µια περιορισµένη και επιλεκτική CpG µεθυλίωση στα φυσιολογικά κύτταρα, η οποία παύει να υφίσταται κατά τη διάρκεια της εξαλλαγής των κυττάρων αυτών σε καρκινικά 327,334. Το γεγονός ότι η survivin δε µεθυλιώνεται στους καρκινικούς ιστούς έρχεται σε αντίθεση µε τον γενικό κανόνα, που υποστηρίζει ότι γονίδια πλούσια σε CpG περιοχές, όπως είναι τα ογκοκατασταλτικά και τα ογκοσχετιζόµενα γονίδια, συχνά υπερµεθυλιώνονται προκειµένου να καταστέλλεται η δράση τους στα καρκινικά κύτταρα 420. Ωστόσο, η α- πουσία µεθυλίωσης της survivin στα καρκινικά κύτταρα έρχεται σε συµφωνία µε νεότερα δεδοµένα, που υποστηρίζουν ότι η υποµεθυλίωση των καρκινικών κυττάρων είναι εξίσου σηµαντική µε την υπερµεθυλίωση 421. Στην εικόνα 12 φαίνονται διάφοροι παράγοντες που ρυθµίζουν την έκφραση της survivin σε καρκινικά, ενδοθηλιακά και CD34+ κύτταρα. Είναι πιθανό στην επαγωγή της έκφρασης της survivin στα καρκινικά κύτταρα να εµπλέκονται µονοπάτια, που περιλαµβάνουν πρωτο-ογκογονίδια ή ογκοκατασταλτικά γονίδια. Έχει δειχθεί ότι ο άγριο τύπος της p53 (wt-p53) καταστέλλει τη µεταγραφή της survivin Η υπερέκφραση της survivin είναι δυνατό να αναστέλλει την απόπτωση, που εξαρτάται από την p53 και η οποία επάγεται από την 97

98 αδριαµυκίνη (adriamycin) 423 ή την υπεριώδη ακτινοβολία 422. Τα έως τώρα δεδο- µένα που αφορούν τον τρόπο µε τον οποίον η p53 καταστέλλει τη survivin είναι ακόµη αντιφατικά. Αν και πολλοί υποστηρίζουν ότι υπάρχει άµεση σύνδεση της p53 µε τον προαγωγέα της survivin 422, δεν είναι λίγοι αυτοί που ισχυρίζονται ότι η αλλαγή της διαµόρφωσης της χρωµατίνης µέσα στον προαγωγέα της survivin και η επερχόµενη µείωση της πρόσβασης του προαγωγέα, είναι υπεύθυνες για την καταστολή της survivin από την p Απώλεια της δράσης της wt-p53 σε καρκινικά κύτταρα, ίσως να ευθύνεται για την υπερέκφραση της survivin και την αντίσταση των κυττάρων στα αντικαρκινικά φάρµακα. Φαίνεται λοιπόν ότι το µονοπάτι p53-survivin είναι πολύ σηµαντικό για τη διαχείριση της απόπτωσης µέσω της p Εικόνα 12. Παράγοντες που ρυθµίζουν την έκφρασης της survivin σε καρκινικά, ενδοθηλιακά και CD34+ κύτταρα. 98

99 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Αναστολή άλλων σηµατοδοτικών µονοπατιών που επάγονται από το STAT3 (Signal Transducer and Activator Transcription-3) οδηγούν σε καταστολή της έκφρασης της survivin σε λεµφώµατα PEL (Primary Effusion Lymphoma) 426 και σε αστροκυτώµατα 427, µε αποτέλεσµα την επαγωγή της απόπτωσης. Ωστόσο, η καταστολή της έκφρασης της survivin δεν έχει αντίκτυπο στην έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-2, Bcl-xl και Mcl Η συνεχόµενη λοιπόν ενεργοποίηση του STAT3, που παρατηρείται συχνά σε καρκινικούς όγκους, συµβάλλει και στην αύξηση της έκφρασης της survivin. Επίσης, η υπερέκφραση της survivin από την ογκοπρωτεΐνη c-h-ras έχει δειχθεί ότι δε σχετίζεται µε τον κυτταρικό κύκλο ή την κυτταρική διαίρεση 428. Αυτό ενισχύει την υπόθεση ότι τα αυξηµένα επίπεδα της survivin δεν είναι απλά το αποτέλεσµα της αύξησης του αριθµού των G2/M κυττάρων, που έπεται της Ras-εξαρτώµενης µεταβολής του κυτταρικού κύκλου 428. Επιπλέον, αναστολείς της PI3K (PhosphatidylInositol 3 Kinase) και της MEK1 (MAP kinase and ERK activator Kinase) οδηγούν σε µείωση της survivin, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα ενδοκυτταρικά Ras µονοπάτια εµπλέκονται στη ρύθµιση της έκφρασης της survivin 428. Η ρύθµιση της survivin έχει µελετηθεί επίσης σε µη καρκινικές κυτταρικές σειρές. Έχει βρεθεί ότι το mrna της και η έκφραση της πρωτεΐνης αυξάνουν στα CD34+ κύτταρα του µυελού των οστών, µε τρόπο που εξαρτάται από τον κυτταρικό κύκλο, µετά από την επίδραση τριών αυξητικών αιµοποιητικών παραγόντων: της θροµβοποιητίνης, του συνδέτη FLT3 και του παράγοντα των stem cells SCF 398,429. Αποµάκρυνση αυτών των αυξητικών παραγόντων έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση των επιπέδων του mrna και της πρωτεΐνης, τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την αύξηση του αριθµού των αποπτωτικών κυττάρων 398. Επιπλέον, αναστολή των οδών της PI3K/AKT και της MAPKp42/22 (Mitogen-Activated Protein Kinase) οδηγούν σε µείωση της έκφρασης της survivin σε διεγερµένα CD34+ κύτταρα, πριν τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου 429. Είναι πιθανόν τα µονοπάτια αυτά να εµπλέκονται άµεσα στην έκφραση της survivin, που επάγεται από κυτταροκίνες σε CD34+ κύτταρα και η ρύθµιση από τους αυξητικούς παράγοντες να µην αντανακλά απλά την προαγωγή του κυτταρικού κύκλου, αλλά τη συµβολή της survivin στην επιβίωση των CD34+ κυττάρων. Η survivin επάγεται επίσης από εφησυχάζοντα ενδοθηλιακά κύτταρα µετά από διέγερση µε τον αυξητικό παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου VEGF 99

100 (Vascular Endothelial Growth Factor) ή τον βασικό αυξητικό παράγοντα των ινοβλαστών bfgf (basic Fibroblast Growth Factor) 430. Μοριακή στόχευση της survivin οδηγεί σε απώλεια της προστασίας των κυττάρων που παρέχεται από τον VEGF, έναντι της απόπτωσης που επάγεται από τον TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α). Τα παραπάνω δεδοµένα δείχνουν ότι ο VEGF αναστέλλει την α- πόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης, µε υπερέκφραση της survivin 425. Επιπλέον, η αντίσταση των ενδοθηλιακών κυττάρων που παρέχεται από τον VEGF, στα χηµειοθεραπευτικά φάρµακα Taxol και βινµπλαστίνη (vinblastine), πηγάζει από την υπερέκφραση της survivin µέσω ενεργοποίησης του PI3-K/PKB µονοπατιού 431, ενώ η επαγωγή της survivin από τον VEGF φαίνεται να προστατεύει τη δοµή των κυττάρων, έναντι των δύο αυτών φαρµάκων, διατηρώντας την ακεραιότητα των µικροσωληνίσκων. Η αγγειοποιητίνη-1 φαίνεται επίσης να προάγει την έκφραση της survivin στα ενδοθηλιακά κύτταρα, µέσω του PI3K/AKT µονοπατιού, προστατεύοντάς τα από ερεθίσµατα που επάγουν την απόπτωση 432. Ωστόσο, η παρουσία ενός αρνητικού µεταλλάγµατος της survivin οδηγεί σε απώλεια αυτής της ικανότητας της αγγειοποιητίνης-1, οδηγώντας τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε απόπτωση. Έτσι, η στόχευση της survivin θα µπορούσε µεταξύ άλλων να αναστείλει την ανάπτυξη ενός όγκου, αναγκάζοντας τα ενδοθηλιακά κύτταρα του αγγειακού πλέγµατος που τροφοδοτεί τον όγκο, να οδηγηθούν στον κυτταρικό θάνατο. Ένας µεγάλος αριθµός αναφορών έχει δείξει ότι η έκφραση της survivin µπορεί να ρυθµίζεται από αυξητικούς παράγοντες/κυτταροκίνες 433,434, αντικαρκινικά φάρµακα 435,436, ορµόνες 437 και αναστολείς των κινασών 438, όµως ο µηχανισµός µε τον οποίον γίνεται αυτή η ρύθµιση παραµένει άγνωστος Μετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις Φωσφορυλίωση Η survivin περιέχει στο µόριό της στη θέση 34, µια θρεονίνη (Thr34), η οποία παίζει σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της έκφρασής της. Η κινάση p34cdc2/κυκλίνηβ1 εντοπίζεται µαζί µε τη survivin στη µιτωτική συσκευή και φωσφορυλιώνει τη survivin στη Thr34, τόσο in vivo όσο και in vitro 385. Αύξηση 100

101 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ της δραστικότητας της κινάσης, ως αποτέλεσµα λάθους στο σηµείο ελέγχου, οδηγεί σε αυξηµένη έκφραση της survivin 439. Η αύξηση της survivin δεν προκύπτει από αύξηση των επιπέδων του RNA, ούτε της δραστικότητας του προαγωγέα, υποδηλώνοντας ότι η τροποποίηση της survivin γίνεται µετα-µεταφραστικά από την p34cdc2/κυκλίνηβ1. Η φωσφορυλίωση στη Thr34 είναι απαραίτητη για τη σταθεροποίηση των αλληλεπιδράσεων µεταξύ πρωτεϊνών, στις οποίες συµµετέχει η BIR περιοχή της survivin 337. Αδυναµία φωσφορυλίωσης στη Thr34, όπως προκύπτει στο µετάλλαγµα Thr34Αla (T34A), οδηγεί στην αποδέσµευση της κασπάσης-9 από τη survivin και κατά συνέπεια στην επαγωγή της απόπτωσης, κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης 385. Η survivin φωσφορυλιώνεται επίσης, από την κινάση Aurora B στη θέση Thr117, που βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο της 374. Μετάλλαξη της θρεονίνης117 σε αλανίνη (Τ117Α) που δεν µπορεί να φωσφορυλιωθεί, οδηγεί σε απώλεια της ικανότητας φωσφορυλίωσης της survivin in vitro από την Aurora B. Αν και η survivin-τ117α εντοπίζεται υπό φυσιολογικές, δεν έχει ακόµα αποδειχθεί ότι η Thr117 φωσφορυλιώνεται και in vivo από την Aurora B Ουβικουϊτίνωση Η ουβικουϊτίνωση είναι µια µετα-µεταφραστική τροποποίηση, η οποία ση- µαδεύει τις πρωτεΐνες για αναγνώριση και αποικοδόµηση από το πρωτεάσωµα. Γενικά, η ουβικουϊτίνη ενώνεται µε αµινοξέα λυσίνης, αλλά επίσης µπορεί και στοχεύει το αµινοτελικό άκρο διαφόρων πρωτεϊνών. Η ουβικουϊτίνωση της survivin, που διεξάγεται και in vitro, ενισχύεται από την προσθήκη της Smac/DIABLO 441. Ωστόσο, δεν είναι ακόµη γνωστό ποιές από τις 16 εκτεθειµένες λυσίνες της survivin τροποποιούνται κατά την ουβικουϊτίνωση. ύο σηµειακές µεταλλάξεις της survivin που επάγουν τη απόπτωση, η survivin-τ34α και η survivin-d53a, φαίνεται να ουβικουϊτινώνονται πιο γρήγορα, σε σχέση µε τον άγριο τύπο της survivin 341,385, όπως συµβαίνει µε την ισοµορφή survivin- Εx H σταθερότητα της survivin είναι δυνατό να ρυθµίζεται θετικά από τη «µοριακήνταντά» Hsp90 («molecular-chaperone» Heat shock protein-90), η οποία προσδένεται στη BIR περιοχή της survivin, µέσω της δικιάς της ATPάσης περιοχής

102 Οι Vong και συν. 443 έδειξαν ότι η ουβικουϊτίνωση της survivin κατά τη διάρκεια της µίτωσης δεν οδηγεί στην αποικοδόµηση της πρωτεΐνης, αλλά είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση της survivin και της Aurora B, στα κεντροµερή και στους κινητοχώρους. Η απο-ουβικουϊτίνωση της survivin, που επάγεται από το ένζυµο hfam, είναι απαραίτητη για την αποµάκρυνσή της από τα χρωµοσώµατα. Από τα παραπάνω γίνεται κατανοητό ότι το επίπεδο ουβικουϊτίνωσης της survivin ρυθµίζει τη σύνδεσή της µε τα χρωµοσώµατα της µιτωτικής ατράκτου και κατά συνέπεια την ευθυγράµµιση και µετακίνηση των χρωµοσωµάτων, κατά τη διάρκεια της µίτωσης. Ήδη από το 2004 διάφοροι ερευνητές είχαν προτείνει ότι η Aurora B είναι ικανή να συντονίζει τη συσχέτιση της survivin µε τη χρω- µατίνη των κεντροµερών και ότι παρατηρείται γρήγορη αναδιοργάνωσή της στα κεντροµερή, κατά τη διάρκεια της µίτωσης 444, Ο ρόλος του προαγωγέα στη ρύθµιση της έκφρασης Όπως προαναφέρθηκε, η survivin εκφράζεται συνεχώς σε διάφορους καρκινικούς ιστούς και η έκφρασή της ρυθµίζεται από τον κυτταρικό κύκλο, µε τη µέγιστη τιµή να προκύπτει κατά τη G2/M φάση 327,329,330. Ένα ερώτηµα που προκύπτει είναι ποιός µηχανισµός προκαλεί τη συνεχόµενη και κύκλο-εξαρτώµενη έκφραση της survivin στα καρκινικά κύτταρα και πώς δουλεύει. Προηγούµενες µελέτες αποκάλυψαν ότι ο µεταγραφικός παράγοντας Sp1 έχει κύριο ρόλο στη συνεχή έκφραση της πρωτεΐνης, όταν µελετήθηκε η δραστικότητα της λουσιφεράσης στον προαγωγέα της ανθρώπινης survivin 327. Τελευταίες µελέτες κάνουν λόγο για ένα πολύ πιο σύνθετο σύστηµα που ελέγχει τη συνεχή έκφραση της survivin και περιλαµβάνει ποικίλες αλληλεπιδράσεις µε µεταγραφικούς παράγοντες, µέσα και έξω από τον προαγωγέα της 357. Όπως προαναφέρθηκε, η κυκλικά ρυθµιζόµενη έκφραση της survivin οφείλεται στην παρουσία CDE και CHR στοιχείων στον προαγωγέα του γονιδίου. Ωστόσο, ο µηχανισµός σύνδεσης των µεταγραφικών παραγόντων προκειµένου να γίνει η ρύθµιση της έκφρασης, παραµένει άγνωστος. Τελευταία έχει δειχθεί ότι συγκεκριµένοι πολυµορφισµοί του προαγωγέα σχετίζονται µε υπερέκφραση της survivin στα καρκινικά κύτταρα 328. Ανάλυση του προαγωγέα της ανθρώπινης survivin αποκάλυψε την ύπαρξη ενός πυρήνα (-105 έως -15), που περιλαµβάνει θέσεις σύνδεσης για την p53, οι 102

103 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ οποίες είναι ικανές και αναγκαίες για την επίδειξη της κατασταλτικής δράσης της p53. Αφαίρεση αυτού του πυρήνα αναιρεί τη δυνατότητα καταστολής της survivin από την p Επιπλέον, απώλεια µιας περιοχής της p53 που είναι υπεύθυνη για την ένωση µε τον συµπαράγοντα Sin3, οδηγεί σε µείωση της κατασταλτικής δύναµης της p53, υποδηλώνοντας ότι ο Sin3 είναι απαραίτητος για την καταστολή της survivin από την p Η σηµασία της survivin στη θεραπεία του καρκίνου Η survivin ως προγνωστικός δείκτης Η survivin εκφράζεται σε πολλά κακοήθη νοσήµατα του ανθρώπου, τόσο συµπαγή όσο και αιµατολογικά, και υπάρχουν πολλές εργασίες, από την πρώτη περιγραφή της survivin µέχρι σήµερα, που αναδεικνύουν την προγνωστική ση- µασία της έκφρασής της 394,401,402, Ωστόσο, η έκφραση της survivin µπορεί να είναι απλά ένας δείκτης µιτωτικής ενεργότητας, εφόσον είναι γνωστό ότι ποικίλει κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και παρουσιάζει µέγιστη τιµή κατά τη G2/M φάση. Η παρουσία της µίτωσης συνδέεται µε τον αυξηµένο πολλαπλασιασµό στους όγκους και είναι ένας καλά χαρακτηρισµένος δυσµενής προγνωστικός δείκτης. Κάθε µελέτη που προσδοκεί να χαρακτηρίσει άµεσα τη survivin ως προγνωστικό δείκτη, πρέπει πρώτα να αφαιρέσει την επίδραση του ανεξάρτητου κυτταρικού πολλαπλασιασµού. Αν και µέχρι πρόσφατα, δεν υπήρχαν µελέτες που συσχέτιζαν την έκφραση της survivin στα καρκινικά κύτταρα µε την ύπαρξη µεταλλάξεων, οι Xu και συν. 328 βρήκαν το 2004, ότι µια µετάλλαξη στον προαγωγέα της ανθρώπινης survivin σχετίζεται µε υπερέκφρασή της στα καρκινικά κύτταρα. Η µεθυλίωση του προαγωγέα φαίνεται επίσης να παίζει κάποιο ρόλο 453, παρόλο που παρατηρείται αυξηµένη έκφραση σε συνθήκες υποξίας 454. Τέλος, η µελέτη των σχετικών επιπέδων έκφρασης των διαφόρων ισο- µορφών της survivin µπορεί να λειτουργήσει ως προγνωστικός δείκτης ή ως δείκτης υπολειπόµενης νόσου

104 Μοριακή στόχευση της survivin Η µοναδική δοµή και θέση της survivin, η έκφρασή της που είναι ιδιαίτερα αυξηµένη στους καρκινικούς όγκους, η λειτουργία της που σχετίζεται τόσο µε την απόπτωση, όσο και µε την κυτταρική διαίρεση και τέλος, η ρύθµισή της που εξαρτάται από τον κυτταρικό κύκλο, δικαιολογούν το µεγάλο ενδιαφέρον που έχει προκύψει τα τελευταία χρόνια γι αυτήν την πρωτεΐνη 344. Μια αντικαρκινική θεραπευτική στόχευση µε βάση τη survivin αναµένεται να έχει περιορισµένη τοξικότητα για τους φυσιολογικούς ιστούς και µεγαλύτερη αποτελεσµατικότητα στην καταστολή των µηχανισµών, που διατηρούν τη επιβίωση των καρκινικών κυττάρων 242. Τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει πολυάριθµες προσπάθειες για τη µοριακή στόχευση του γονιδίου της survivin, τόσο in vitro όσο και in vivo. Με τη βοήθεια αυτών των προσεγγίσεων είναι δυνατόν τα κύτταρα να απωλέσουν την αντι-αποπτωτική τους δράση και να ενισχυθεί η απόπτωση, που επάγεται από τα χηµειοθεραπευτικά και ακτινοθεραπευτικά µέσα 242,456,457. Ο προαγωγέας της survivin αποτελεί ένα ιδανικό εργαλείο για την κατευθυνόµενη έκφραση γονιδίων, που σχετίζονται µε τον καρκίνο. Οι Bao και συν. 323 χρησιµοποίησαν τον προαγωγέα της survivin για την επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου SEAP (SEcreted Alkaline Phosphatase), που δεν εκφράζεται υπό φυσιολογικές συνθήκες, και διαπίστωσαν ότι ο προαγωγέας ήταν πιο ενεργός σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, απ ότι σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα ωοθηκών. Έχει δειχθεί ότι η έκφραση της survivin στον καρκίνο σχετίζεται µε δυσµενή πρόγνωση, εξέλιξη ή/και επανεµφάνιση της νόσου, αντίσταση στη χηµειοθεραπεία και χαµηλό προσδόκιµο ζωής 357. Οι παρατηρήσεις αυτές οδήγησαν σε µια σειρά προσεγγίσεων, που οδηγούν στη µοριακή στόχευση της survivin και έχουν ως εξής: i) Αντι-νοηµατική έκφραση της survivin. Η προσέγγιση αυτή αφορά είτε στην έκφραση ολόκληρου του cdna της survivin ή τµήµατος σε κατεύθυνση αντίθετη από την κανονική 318,458,459, είτε στη δηµιουργία συνθετικών αντινοηµατικών ολιγονουκλεοτιδίων 339,365,460,461. Το αποτέλεσµα είναι να προκύπτουν διάφορα συµπληρωµατικά τµήµατα, που υβριδίζονται µε το cdna της survivin και το καθιστούν ανενεργό. ii) Χρήση ενός κυρίαρχου αρνητικού µεταλλάγµατος της survivin. Μέχρι σή- µερα το πιο γνωστό αρνητικό µετάλλαγµα είναι η survivin-τ34α, που αδυνατεί 104

105 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ να φωσφορυλιωθεί στη Thr34 από την κινάση CDC2/κυκλίνη B1. Η φωσφορυλίωση της survivin στη Thr34 µπορεί να ανασταλεί, µε τη χρήση φαρµάκων που αποτελούν ανταγωνιστές της κινάσης. Ένα τέτοιο φάρµακο είναι η φλαβοπιριδόλη, που καταστέλλει τη δράση κινασών, που εξαρτώνται από κυκλίνες, όπως είναι η κινάση CDC2 385,439,462,463. Ένα άλλο µετάλλαγµα που έχει ήδη χρησιµοποιηθεί σε µεγάλο αριθµό κυτταρικών µοντέλων είναι η survivin-c84a, στην οποία διακόπτεται η BIR περιοχή, µε αποτέλεσµα να µην είναι δυνατή η αναστολή της απόπτωσης 329,339,418,458. Οι παραπάνω προσεγγίσεις είναι ωφέλιµες για τη µελέτη της βιοχηµικής οδού της survivin, αλλά δεν µπορούν να βοηθήσουν στην απ ευθείας θεραπευτική προσέγγιση. iii) Χρήση ειδικών ριβοενζύµων. Η προσέγγιση αυτή αφορά στη µείωση της έκφρασης της survivin µε τη βοήθεια ριβοενζύµων, που αναγνωρίζουν επιλεκτικά το mrna της survivin και το λύουν 464,465. Η προσέγγιση αυτή επίσης δεν είναι κατάλληλη για την άµεση κλινική θεραπεία του καρκίνου. iv) Παρεµβολή του RNA (RNAi, RNA interference). Πρόσφατες µελέτες δείχνουν ότι η τεχνολογία του RNAi είναι πολύ σηµαντική για την ανακάλυψη της λειτουργίας πολλών γονιδίων στα θηλαστικά 466,467. ύο προσεγγίσεις σχετίζονται µε αυτήν την τεχνολογία, το sirna (small inhibitory RNA), που αποτελείται από νουκλεοτίδια, και το snrna (short hairpin RNA), που αποτελείται από νουκλεοτίδια. Ωστόσο, λίγες µελέτες αναφέρουν ότι η έκφραση της survivin µπορεί να ανασταλεί και µε τις δύο αυτές τεχνικές. v) Χρήση µικρών οργανικών µορίων ή µικρών ανταγωνιστών (π.χ. πεπτίδια). Η προσέγγιση αυτή είναι πολύ σηµαντική διότι µπορεί να χρησιµοποιηθεί στην κλινική πράξη. Μικρά χηµικά µόρια είναι δυνατό να αναστείλουν την έκφραση της survivin ή να διαταράξουν τις αλληλεπιδράσεις µε τις κασπάσες. Το πρώτο παράδειγµα χηµικού µορίου, που αναστέλλει την έκφραση της survivin είναι η δοξορουβικίνη (αδριαµυκίνη) Ωστόσο, δεν έχει βρεθεί ακόµη κάποιο µόριο που να διαταράσσει άµεσα τη σχέση survivin/κασπάση

106

107 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

108

109 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ I. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 1. Ασθενείς Στην παρούσα εργασία µελετήθηκαν 40 ηλικιωµένοι ασθενείς µε οξεία µυελογενή λευχαιµία (ΟΜΛ) που προσήλθαν στη Β και στη Παθολογική Κλινική του Α.Π.Θ., στο Ιπποκράτειο Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης. Οι ασθενείς (24 άντρες και 16 γυναίκες) ήταν ηλικίας άνω των 60 ετών (µέσος όρος ηλικίας 67,72 ± 11,47 έτη, εύρος έτη), µε διαγνωσµένη ΟΜΛ και δεν είχαν λάβει καµία θεραπευτική αγωγή. Σύµφωνα µε την ταξινόµηση κατά FAB ήταν: 2 Μ0, 6 Μ1, 12 Μ2, 5 Μ3, 10 Μ4, 3 Μ5 και 2 Μ6. Από τους ασθενείς αυτούς, οι 25 είχαν πρωτοπαθή ΟΜΛ και οι 15 παρουσίαζαν εκτροπή προς ΟΜΛ µετά από Μ Σ. Οι 40 ασθενείς που µελετήθηκαν στη διάγνωση είχαν υψηλό ποσοστό βλαστών στον µυελό των οστών (50-90%) και αποτέλεσαν την πρώτη υπό µελέτη οµάδα. Από αυτούς, οι 18 (10 άντρες και 8 γυναίκες) απάντησαν στη χορηγούµενη θεραπεία, πετυχαίνοντας πλήρη αιµατολογική ύφεση (βλάστες <5%) και µελετήθηκαν και µετά τη χηµειοθεραπεία. Οι ασθενείς αυτοί αποτέλεσαν τη δεύτερη οµάδα και ήταν κατά FAB: 2 Μ1, 6 Μ2, 3 Μ3, 4 Μ4, 2 Μ5 και 1 Μ6. Από αυτούς, οι 14 είχαν πρωτοπαθή ΟΜΛ και οι 4 δευτεροπαθή ΟΜΛ µετά από Μ Σ. Ο κυτταρογενετικός έλεγχος πραγµατοποιήθηκε σε όλους τους ασθενείς κατά τη διάγνωση, αλλά αποτέλεσµα καρυότυπου προέκυψε µόνο για 18 από αυτούς (10 άντρες και 8 γυναίκες). Όλοι οι ασθενείς ήταν ενήµεροι για την ε- ρευνητική µελέτη, ενώ τα δείγµατα µυελού των οστών και περιφερικού αίµατος ήταν µέρος της διαδικασίας της διάγνωσης. Εκτός από τους ασθενείς, στην παρούσα µελέτη συµµετείχαν και 25 υγιείς µάρτυρες παρόµοιας ηλικίας (µέσος όρος 62,54 ± 8,42 έτη, εύρος έτη) µε φυσιολογική αιµοποίηση, οι οποίοι αποτέλεσαν την τρίτη οµάδα. Οι µάρτυρες αυτοί δέχθηκαν να χορηγήσουν περιφερικό αίµα, ενώ οι 7 ήταν επιπλέον δότες µυελού των οστών. 109

110 2. Μέθοδοι 2.1. Ερευνητικό πρωτόκολλο Η παρούσα µελέτη εκπονήθηκε εξ ολοκλήρου στο Αιµατολογικό Τµήµα της Β Παθολογικής Κλινικής του Α.Π.Θ. Το ερευνητικό πρωτόκολλο περιλάµβανε τα παρακάτω στάδια: 1. Λήψη του ιστορικού και καταγραφή των εργαστηριακών ευρηµάτων για κάθε ασθενή. 2. Λήψη µυελού των οστών και περιφερικού αίµατος από κάθε ασθενή, (καθώς και από οµάδα υγιών ατόµων) για: α) τη διάγνωση και ταξινόµηση της νόσου β) την καρυοτυπική ανάλυση γ) τον προσδιορισµό των επιπέδων mrna της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης survivin. Η ανάλυση αυτή περιλάµβανε τα εξής στάδια: Αποµόνωση ολικού RNA από κύτταρα περιφερικού αίµατος και µυελού των οστών, µε τη βοήθεια ειδικού kit Φωτοµέτρηση των δειγµάτων RNA, για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσής τους Μετατροπή του RNA σε cdna, µε την τεχνική της RT-PCR. Έλεγχος των προϊόντων της RT-PCR µε την τεχνική της PCR. Εφαρµογή της Real-Time RT-PCR, για τη survivin και για το γονίδιο αναφοράς abl Εισαγωγή των δεδοµένων της Real-Time RT-PCR στο λογισµικό Relative Expression Software Tool-XL (REST-XL -Version2) 468 και ανάλυση των αποτελεσµάτων, µε τη µέθοδο της σχετικής ποσοτικοποίησης 469 δ) τη µέτρηση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης survivin στον ορό, µε την ανοσοενζυµική µέθοδο ELISA 3. Μεταφορά των δεδοµένων στο λογισµικό SPSS11.5 (SPSS Inc.) για τη στατιστική επεξεργασία. 110

111 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.2. Ανάλυση Καρυότυπου Ο αριθµός, το µέγεθος και η µορφολογία των χρωµοσωµάτων αποτελούν τον καρυότυπο ενός είδους. Ο καρυότυπος είναι χαρακτηριστικό γνώρισµα του είδους, καθώς δύο πολύ στενά συγγενικά είδη παρουσιάζουν διαφορετικούς καρυότυπους. Για παράδειγµα, δύο στενά συγγενικά είδη ελαφιών, το Muntiacus muntjac και το Muntiacus reevesi, αν και έχουν ίδιο το συνολικό µήκος των χρωµοσωµάτων και την ποσότητα του DNA ανά απλοειδές κύτταρο, έχουν πολύ διαφορετικούς καρυότυπους 470. Ο άνθρωπος σε κάθε σωµατικό του κύτταρο έχει φυσιολογικά 46 χρωµοσώµατα. Αυτά διακρίνονται σε 22 ζεύγη αυτοσωµάτων και στα δύο φυλετικά χρωµοσώµατα Χ και Υ. Για την περιγραφή της µορφολογίας των χρωµοσωµάτων χρησιµοποιούνται οι παρακάτω παράµετροι : Το σχετικό µήκος: το µήκος κάθε χρωµοσώµατος εκφρασµένο επί τοις εκατό (ως ποσοστό) του συνολικού µήκους όλων των χρωµοσωµάτων, µιας κανονικής απλοειδούς χρωµοσωµικής σειράς. Ο βραχιονικός δείκτης: η αναλογία του µήκους του µεγαλύτερου χρωµοσω- µικού βραχίονα, προς το µήκος του βραχύτερου βραχίονα. Ο κεντροµερικός δείκτης: η αναλογία του µήκους του µικρότερου βραχίονα, προς το ολικό µήκος του χρωµοσώµατος, εκφρασµένο επί τοις εκατό Τεχνικές χρώσεις Οι διάφορες τεχνικές χρώσης των µεταφασικών χρωµοσωµάτων έκαναν εφικτή την παρατήρησή τους στο οπτικό µικροσκόπιο και επέτρεψαν την αναγνώριση χρωµοσωµικών ανωµαλιών, που πριν δεν ήταν δυνατό να εντοπιστούν. Οι τεχνικές χρώσης των χρωµοσωµάτων µπορούν να διακριθούν σε δύο κατηγορίες: σε αυτές που δε δηµιουργούν ζωνώσεις και σε αυτές που οδηγούν στον σχηµατισµό ζωνώσεων. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν βασικές χρωστικές, όπως η ορκεΐνη και η Giemsa, που βάφουν τα χρωµοσώµατα οµοιόµορφα, αλλά δεν οδηγούν στον σχηµατισµό χαρακτηριστικών ζωνώσεων. Με τις χρωστικές αυτές µπορούν να αποκαλυφθούν διάφορες δοµικές περιοχές του χρωµοσώµατος, όπως η πρωτογενής περίσφιξη και η δευτερογενής περίσφιξη, καθώς και οι δορυφόροι, οι οποίοι αποτελούν µικρούς χρωοµοσωµικούς σχηµατισµούς, που συνδέονται µε 111

112 λεπτό µίσχο µε το υπόλοιπο χρωµόσωµα. Με την τεχνική χρώσης χωρίς ζωνώσεις, η αναγνώριση όλων των χρωµοσωµάτων είναι σχετικά δυσχερής και τα χρωµοσώµατα κατηγοριοποιούνται σε 7 οµάδες (A έως G), ανάλογα µε το µέγεθος και τον βραχιονικό δείκτη. Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν χρωστικές, που δεσµεύονται επιλεκτικά στο DNA, ανάλογα µε τα ποσοστά σε Α-Τ και G-C 471, µε αποτέλεσµα να δηµιουργούνται χαρακτηριστικά πρότυπα διαδοχικών ανοιχτόχρωµων και σκουρόχρωµων περιοχών. Η φθορίζουσα χρωστική κουϊνακρίνη αλληλεπιδρά µε τα χρωµοσώµατα πολλών ειδών, µε συνέπεια µερικά τµήµατά τους να φθορίζουν πολύ έντονα και άλλα αµυδρά. Έτσι, δηµιουργείται µια κατά µήκος διαφοροποίηση των χρωµοσωµάτων σε ζώνες ποικίλου πλάτους και έντασης φθορισµού, που ονοµάζονται ζώνες Q 472. Οι ζώνες που προκύπτουν µε αυτόν τον τρόπο είναι χαρακτηριστικές για κάθε χρωµόσωµα και αντιπροσωπεύουν συγκεκριµένες περιοχές, εντός των χρωµοσωµάτων. Η συγκεκριµένη τεχνική επέτρεψε για πρώτη φορά την αξιόπιστη ταυτοποίηση όλων των ανθρώπινων χρωµοσωµάτων. Από τότε µέχρι σήµερα έχουν αναπτυχθεί περισσότερες από 15 τεχνικές χρώσης, που κάθε µία παρέχει ιδιαίτερο πρότυπο ζωνώσεων στα µεταφασικά χρω- µοσώµατα Η τεχνική των ζωνώσεων G Η τεχνική των ζωνώσεων G ανακαλύφθηκε το και αποτελεί έως σήµερα την πιο διαδεδοµένη τεχνική χρώσης των χρωµοσωµάτων. Στην τεχνική αυτή γίνεται αρχικά επίδραση µε ένα πρωτεολυτικό ένζυµο (όπως η θρυψίνη) που αποµακρύνει τις ιστόνες από το DNA, και ακολουθεί χρώση των χρω- µοσωµάτων µε χρωστική Giemsa. Το αποτέλεσµα είναι η εµφάνιση φωτεινών και σκοτεινών περιοχών, που είναι χαρακτηριστικές για κάθε χρωµόσωµα και καλούνται ζωνώσεις G. Οι σκοτεινές περιοχές περιέχουν λίγα ενεργά γονίδια και είναι πλούσιες σε Α+Τ 473. Με την τεχνική G, που είναι ιδιαίτερα αξιόπιστη και χρησιµοποιείται ευρέως σε πολλά εργαστήρια κυτταρογενετικής µπορούν να αποκαλυφθούν περί τις ζώνες στα µεταφασικά χρωµοσώµατα. 112

113 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Η µέθοδος για την ανάλυση του καρυότυπου Η µέθοδος που εφαρµόστηκε στην παρούσα µελέτη για την κυτταρογενετική ανάλυση περιλάµβανε την καλλιέργεια εµπύρηνων κυττάρων µυελού των οστών και τη χρώση των χρωµοσωµάτων µε την τεχνική των ζωνώσεων G. Οι καλλιέργειες που εφαρµόσθηκαν ήταν δύο ειδών: άµεσες και µετά από επώαση για 24 ή 48 ώρες. Η διαδικασία ήταν η εξής : 1. Μετά τη λήψη του µυελού των οστών ακολουθεί µεταφορά ποσότητας 2-3 ml σε ειδικό δοκιµαστικό σωλήνα, που περιέχει λίθιο και ηπαρίνη (BD Vacutainer, LH 170 I.U.). 2. Προσθήκη 5ml θρεπτικού υλικού και ποσότητας µυελού των οστών, ανάλογης του αριθµού των λευκών αιµοσφαιρίων, σε ειδικούς δοκιµαστικούς σωλήνες καλλιέργειας (SARSTEDT). Το υλικό της καλλιέργειας αποτελείται από τα ακόλουθα συστατικά: Θρεπτικό µέσο RPMI 1640 Medium, χωρίς L-γλουταµίνη (Gibco ) 10% εµβρυϊκό βόειο ορό FBS, που είναι απενεργοποιηµένος µε θέρ- µανση (Fοetal Bovine Serum, EU Approved origin, Gibco ) 2% πενικιλίνη και στρεπτοµυκίνη (10.000U/ml, Gibco ) 1% L γλουταµίνη 200mM (100X, Gibco ) 3. Στην άµεση καλλιέργεια προστίθενται αµέσως 70µl κολχικίνης (KaryoMax Colcemid 10µg/ml, Gibco ) και ακολουθεί επώαση σε επωαστικό κλίβανο στους 37 ο C και σε ατµόσφαιρα 5% CO 2, για 2-3 ώρες. Εναλλακτικά, οι καλλιέργειες των 24 και 48 ωρών πραγµατοποιούνται χωρίς την άµεση προσθήκη κολχικίνης, η οποία προστίθεται µετά το πέρας των 24 ή 48 ωρών, αντίστοιχα, και ακολουθεί επώαση στις ίδιες συνθήκες, για 45 λεπτά. Η κολχικίνη, συνδεόµενη σε ειδική θέση της α-σωληνίνης, παρεµποδίζει τον σχηµατισµό των µικροσωληνίσκων και διακόπτει τη µιτωτική διαίρεση στο στάδιο της µετάφασης, όπου τα χρωµοσώµατα είναι καλά σχηµατισµένα και ορατά µε το οπτικό µικροσκόπιο. 4. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 1600 στροφές για 10 λεπτά. 5. Αποµάκρυνση του υπερκείµενου και προσθήκη 7ml υπότονου διαλύµατος KCl 0,1Μ στο ίζηµα. Η προσθήκη γίνεται πολύ αργά και συνοδεύεται από καλή ανάδευση του ιζήµατος σε vortex. 113

114 6. Επώαση στους 37 ο C για 20 λεπτά. Στο διάστηµα αυτό, το KCl προκαλεί διόγκωση των κυττάρων, χωρίς όµως να παρατηρείται ωσµωτική λύση της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης. Ταυτόχρονα, ο πυρήνας διογκώνεται και διαρρηγνύεται, µε αποτέλεσµα να απλώνουν τα χρωµοσώµατα στο κυτταρόπλασµα και να γίνονται ορατά χωρίς να αλληλεπικαλύπτονται. 7. Στο τέλος της επώασης προστίθενται 5ml διαλύµατος µονιµοποίησης (3V µεθανόλη: 1V οξικό οξύ). 8. Οι δοκιµαστικοί σωλήνες µεταφέρονται στους -20 ο C για 1-2 ηµέρες. 9. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 1600 στροφές για 10 λεπτά. 10. Το υπερκείµενο αφαιρείται και το ίζηµα καθαρίζεται µε διάλυµα µονιµοποίησης. Στο τέλος παραµένει µικρή ποσότητα µονιµοποιητικού διαλύµατος, κατάλληλη για την επίστρωση. 11. Η επίστρωση πραγµατοποιείται µε τη ρίψη δυο σταγόνων εναιωρήµατος σε υγρές αντικειµενοφόρους πλάκες. Η υγρασία οδηγεί στη διάρρηξη της πλασµατικής µεµβράνης των κυττάρων και στην απορρόφηση νερού από τα χρωµοσώµατα, τα οποία διογκώνονται και απλώνουν. 12. Μετά την επίστρωση, τα επιχρίσµατα τοποθετούνται σε κλίβανο 90 ο C για 1 ώρα. Η παλαίωση αυτή εξυπηρετεί την καλύτερη χρώση και δηµιουργία πιο ευδιάκριτων ζωνώσεων στα χρωµοσώµατα. 13. Ακολουθεί η χρώση των χρωµοσωµάτων µε δύο τεχνικές: α) Απλή χρώση. Επιτυγχάνεται µε εµβάπτιση των επιχρισµάτων σε διάλυµα χρωστικής Giemsa για 10 λεπτά και χρησιµεύει για τον ποιοτικό έλεγχο των µεταφάσεων. Με αυτή τη χρώση δεν προκύπτουν ζωνώσεις, οπότε η κατάταξη των χρωµοσωµάτων µπορεί να γίνει µόνο σε οµάδες και να διαπιστωθούν µόνο αριθµητικές ανωµαλίες. Για την αναγνώριση δοµικών χρωµοσωµικών ανωµαλιών είναι απαραίτητη η χρώση µε την τεχνική των ζωνώσεων G. β) Χρώση για τη δηµιουργία ζωνώσεων G. Η διαδικασία που εφαρµόστηκε περιλαµβάνει τα εξής στάδια: i) Εµβάπτιση του επιχρίσµατος για 1-7 λεπτά σε διάλυµα που περιέχει: - 40 ml 0,9% NaCl (0,9 gr NaCl / 100 ml H 2 O) - 10 ml θρυψίνη (Trypsin-EDTA 1x in HBSS w/o Ca&Mg w/edta.4na) σταγόνες ΗCl 1Ν (µέχρι το ph να προσεγγίσει την τιµή 7,2) 114

115 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Το διάλυµα πρέπει µετά από την ανακίνηση να αποκτήσει ροδακινί χρώµα. Η εµφάνιση ροζ χρώµατος δείχνει ότι το διάλυµα είναι αλκαλικό, ενώ το κίτρινο χρώµα δείχνει ότι είναι όξινο και ακατάλληλο για χρώση. ii) Ξέπλυµα της αντικειµενοφόρου πλάκας σε διάλυµα που περιέχει 50ml 0,9 % NaCl (2 φορές). iii) Χρώση της πλάκας σε διάλυµα της χρωστικής Giemsa για 10 λεπτά. 14. Ακολουθεί η παρατήρηση στο οπτικό µικροσκόπιο. Για κάθε περιστατικό εξετάζονται 20 µεταφάσεις, ενώ αν εντοπιστεί µια χρωµοσωµική ανωµαλία εξετάζονται περισσότερες µεταφάσεις. 15. Οι καλύτερες µεταφάσεις κάθε περιστατικού φωτογραφίζονται και οι εικόνες µεταφέρονται σε ηλεκτρονικό υπολογιστή. Κάθε φωτογραφία επεξεργάζεται ψηφιακά, εκτυπώνεται και από αυτήν αναλύεται ο καρυότυπος για κάθε ασθενή Αποµόνωση RNA Για την αποµόνωση του ολικού RNA από κύτταρα περιφερικού αίµατος και µυελού των οστών χρησιµοποιήθηκε το ειδικό kit της εταιρείας QIAGEN (QIAamp RNA Blood Mini Kit). Το πρωτόκολλο σε ορισµένες περιπτώσεις τροποποιήθηκε προκειµένου να βελτιστοποιηθεί η ποιότητα του αποµονωµένου RNA. Η διαδικασία της αποµόνωσης έχει ως εξής: 1. Ανάµειξη ενός όγκου περιφερικού αίµατος ή µυελού των οστών µε 5πλάσιο όγκο διαλύµατος EL (Erythrocyte Lysis buffer). Το διάλυµα EL καταστρέφει τα ερυθρά αιµοσφαίρια, τα οποία δε διαθέτουν πυρήνα, µέσω ωσµωτικής πίεσης. Ακολουθεί φυγοκέντρηση (2500 στροφές για 15 λεπτά) και λήψη του ιζήµατος, που περιλαµβάνει πλέον µόνο εµπύρηνα κύτταρα. 2. Στο ίζηµα προστίθεται διάλυµα RLT, το οποίο περιέχει β-µερκαπτοαιθανόλη. Ο όγκος του διαλύµατος RLT είναι ανάλογος του αριθµού των κυττάρων (350µl για κύτταρα έως 5x10 6 και 600µl για κύτταρα >5x10 6 έως 1x10 7 ). Το RLT είναι ένα ρυθµιστικό διάλυµα υψηλής αλατότητας µε έντονη αποδιατακτική ικανότητα, το οποίο είναι υπεύθυνο για τη διάσπαση ό- λων των κυτταροπλασµατικών και πυρηνικών µεµβρανών. Η διάσπαση αυτή οδηγεί στην απελευθέρωση των νουκλεϊκών οξέων (DNA και RNA), αλ- 115

116 λά και διαφόρων ενζύµων, όπως οι RNάσες, που θα µπορούσαν να καταστρέψουν το RNA. Η β-µερκαπτοαιθανόλη είναι υπεύθυνη για την αδρανοποίηση αυτών των ενζύµων. Το διάλυµα λύσης τοποθετείται σε ειδική στήλη µε φίλτρο (QIAshredder spin column) και φυγοκεντρείται (14000 στροφές για 2 λεπτά). Το φίλτρο δεσµεύει τις πρωτεΐνες καθώς και τµήµατα του κυττάρου, που έχουν προκύψει από τη λύση του, µε αποτέλεσµα να λαµβάνονται καθαρά τα νουκλεϊκά οξέα. 3. Στο οµογενές µίγµα των νουκλεϊκών οξέων προστίθεται ίσος όγκος διαλύ- µατος αιθανόλης 70%. Τα νουκλεϊκά οξέα µε τον τρόπο αυτόν αφυδατώνονται και κατακρηµνίζονται, µε αποτέλεσµα να προκύπτει η χαρακτηριστική µορφή «κουβαριού», που είναι ορατή µε γυµνό µάτι. 4. Το εναιώρηµα µεταφέρεται σε νέα στήλη της QIAamp µε φίλτρο, το οποίο δεσµεύει το DNA και το RNA. Ακολουθεί φυγοκέντρηση (10000 στροφές για 25 δευτερόλεπτα). 5. Προσθήκη 50µl DNάσης και επώαση για µία ώρα. Η DNάση είναι υπεύθυνη για την καταστροφή των δεοξυριβονουκλεϊκών οξέων (DNA), που βρίσκονται δεσµευµένα στο φίλτρο. Ακολουθεί έκπλυση και αποµάκρυνση του κατεστραµµένου DNΑ, ενώ το RNA εξακολουθεί να βρίσκεται δεσµευµένο στο φίλτρο. 6. Το φίλτρο µεταφέρεται σε νέο σωληνάριο, όπου προστίθενται 700µl διαλύ- µατος RW1. Το διάλυµα αυτό αποµακρύνει τυχόν προσµίξεις του RΝΑ µε άλλες ουσίες, ενώ ταυτόχρονα διατηρεί τις RNάσες απενεργοποιηµένες. Ακολουθεί φυγοκέντρηση (12000 στροφές για 25 δευτερόλεπτα). 7. Ακολουθεί προσθήκη διαλύµατος RPE, στο οποίο έχει προστεθεί τετραπλάσιος όγκος αιθανόλης, και φυγοκέντρηση (12000 στροφές για 25 δευτερόλεπτα). Το διάλυµα αυτό βοηθάει στην αποµάκρυνση των αλάτων και όλων των ανόργανων ουσιών. 8. Το δείγµα µεταφέρεται σε καθαρό σωληνάριο και φυγοκεντρείται για την αποµάκρυνση των υπολειµµάτων των παραπάνω διαλυµάτων. 9. Τέλος, στο δείγµα προστίθενται 50µl απεσταγµένου νερού ελεύθερου από RNάσες, µε αποτέλεσµα τα καθαρά ριβονουκλεϊκά οξέα (RNA) που βρίσκονται στο φίλτρο να επαναδιαλύονται σε τελικό όγκο 50µl. 10. Τα δείγµατα διατηρούνται στους -70 ο C. 116

117 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.4. Ποσοτικός προσδιορισµός του RNA Ο ποσοτικός προσδιορισµός του RNA και η εκτίµηση της καθαρότητας πραγµατοποιήθηκαν σε φωτόµετρο, µε µέτρηση της οπτικής απορρόφησης σε µήκη κύµατος 260nm (A 260 ) και 280nm (Α 280 ). Σε µήκος κύµατος 260nm ελέγχεται η περιεκτικότητα του δείγµατος σε DNA, ενώ σε µήκος κύµατος 280nm ελέγχεται η πιθανή πρόσµιξη πρωτεϊνών. Οι απορροφήσεις και στα δύο µήκη κύµατος θεωρήθηκαν αποδεκτές όταν ήταν µεγαλύτερες από 0,15. Απορρόφηση µιας µονάδας στα 260nm αντιστοιχεί σε συγκέντρωση 40µg RNA/ml. Η εκτίµηση της καθαρότητας έγινε µε τον προσδιορισµό του λόγου A 260 /Α 280. Υψηλής καθαρότητας RNA µε ελάχιστες προσµίξεις έχει λόγο που κυµαίνεται από 1,7 έως 2. Η αραίωση των δειγµάτων που φωτοµετρήθηκαν ήταν 1/10 (5µl RNA και 45µl απεσταγµένου νερού ελεύθερου από RNάσες), ενώ ως τυφλό χρησιµοποιήθηκε απεσταγµένο νερό. Όλα τα δείγµατα που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα µελέτη ήταν υψηλής καθαρότητας και συγκέντρωσης Τεχνική της RT-PCR Η RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction) είναι µια τεχνική µετατροπής του µονόκλωνου RNA σε δίκλωνο DNA (cdna ή complementary DNA), µε τη βοήθεια του ενζύµου ανάστροφη µεταγραφάση (ή τρανσκριπτάση). Η κύρια εφαρµογή της RT-PCR συνίσταται στον ποιοτικό προσδιορισµό των επιπέδων mrna ενός γονιδίου, όπως είναι η survivin. Το mrna αποτελεί το ενδιάµεσο µόριο, στο οποίο µεταγράφεται το DNA, προκειµένου να γίνει η σύνθεση µιας πρωτεΐνης και δεν περιλαµβάνει ιντρόνια, παρά µόνο εξόνια. Η ανάστροφη µεταγραφάση είναι ένα ένζυµο, που περιλαµβάνει µια RNA εξαρτηµένη DNA πολυµεράση και µια DNA εξαρτηµένη DNA πολυµεράση, που δρουν µαζί για την αντίστροφη µεταγραφή. Αρχικά συντίθεται η µια µόνο αλυσίδα του DNA που είναι συµπληρωµατική της αρχικής µονόκλωνης αλυσίδας του RNA, µε τη δράση της RNA εξαρτηµένης DNA πολυµεράσης. Έπειτα η ανάστροφη µεταγραφάση, που έχει και δράση νουκλεάσης, υδρολύει την αλυσίδα του RNA, ενώ µε τη δράση της DNA εξαρτηµένης DNA πολυµεράσης συνθέτει τη συµπληρωµατική DNA αλυσίδα, σχηµατίζοντας τελικά ένα γραµµικό 117

118 δίκλωνο µόριο DNA. Αναλυτικά το πρωτόκολλο της RT-PCR περιλαµβάνει τα παρακάτω στάδια: 1. Μεταφορά των δειγµάτων σε πάγο για την καταστολή της δράσης των RNασών. 2. Λήψη ποσότητας 500ng RNA από κάθε δείγµα και προσθήκη 1µl τυχαίων εκκινητών (Random Primers, 3µg/µl, Invitrogen ). Το διάλυµα συµπληρώνεται µε απεσταγµένο νερό µέχρι τελικού όγκου 12µl. 3. Ακολουθεί αποδιάταξη σε PCR συσκευή, σε θερµοκρασία 70 ο C για 10 λεπτά. 4. Τα δείγµατα µεταφέρονται σε πάγο. Σε κάθε δείγµα προστίθενται 8µl από το µείγµα αντίδρασης (reaction mix), που αποτελείται από τα εξής συστατικά: 4µl ρυθµιστικού διαλύµατος 5X First-Strand Buffer 2µl DTT 0,1M 2µl διαλύµατος dntps (5 τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια) 100mM το καθένα (datp : dttp : dgtp : dctp = 1: 1: 1: 1) 5. Τα δείγµατα τοποθετούνται στους 42 C για 2 λεπτά, σε συσκευή ΡCR. Στο σηµείο αυτό προστίθεται σε κάθε δείγµα 1µl ανάστροφης µεταγραφάσης SuperScript II RNase H(-) Reverse Transcriptase (200U/µl, Invitrogen ), η οποία ενεργοποιείται άµεσα, λόγω της κατάλληλης θερµοκρασίας των δειγµάτων. 6. Ακολουθεί ένα πρόγραµµα στην PCR συσκευή, µε τις εξής συνθήκες: 25 C για 10 λεπτά (ενεργοποίηση των τυχαίων εκκινητών) 42 C για 50 λεπτά (έναρξη δράσης της ανάστροφης µεταγραφάσης) 95 C για 5 λεπτά (µετουσίωση και αδρανοποίηση της πολυµεράσης) 7. Τα δείγµατα cdna, που λαµβάνονται µετά το τέλος του προγράµµατος, διατηρούνται στους -20 C. Προκειµένου να ελεγχθούν τα προϊόντα της RT-PCR εφαρµόζεται µια απλή PCR αντίδραση, στην οποία ανιχνεύεται η έκφραση ενός γονιδίου αναφοράς (housekeeping gene), χρησιµοποιώντας ως µήτρα cdna. Το γονίδιο αναφοράς έχει σταθερή έκφραση σε όλα τα κύτταρα και τους ιστούς, κατά τα διάφορα αναπτυξιακά στάδια και για τον λόγο αυτό χρησιµοποιείται ως µάρτυρας σω- 118

119 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ στής διεξαγωγής της αντίδρασης RT-PCR. Στην παρούσα µελέτη, ως γονίδιο αναφοράς χρησιµοποιήθηκε το γονίδιο abl, που µε βάση τη βιβλιογραφία είναι το πιο κατάλληλο για τη µελέτη αιµατολογικών νοσηµάτων PCR ή Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυµεράσης Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης ή PCR (Polymerase Chain Reaction) περιγράφηκε για πρώτη φορά από τους Mullis και συν. 475,476 και έχει αποτελέσει την κορωνίδα της µοριακής, αναπτυξιακής και εξελικτικής βιολογίας, καθώς και της γενετικής. Είναι µια πολύ ειδική, ταχεία και απλή µέθοδος, που µπορεί να χρησιµοποιηθεί για πολλούς σκοπούς, σε µια ποικιλία δειγµάτων. Η αντίδραση της PCR επιτρέπει τον ενζυµικό in vitro πολλαπλασιασµό συγκεκριµένου δίκλωνου τµήµατος DΝΑ, που µπορεί να έχει µέγεθος από 50 έως >2000 bp. Με την αντίδραση αυτή λαµβάνονται σε µικρό χρονικό διάστηµα πάνω από 1Ο 6 αντίγραφα της ακολουθίας που µελετάται, η οποία µπορεί να είναι µέρος ενός εξονίου, ενός ιντρονίου ή ακόµη να αποτελεί ένα ολόκληρο γονίδιο. Για την εφαρµογή της PCR είναι απαραίτητη η ύπαρξη µιας µικρής ποσότητας DΝΑ, η οποία θα λειτουργήσει ως µήτρα, για την ενίσχυση του υπό µελέτη τµήµατος του γονιδίου. Σε αυτό το DΝΑ θα υβριδιστεί αρχικά ένα ζεύγος ειδικών ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών (primers), οι οποίοι είναι συµπληρωµατικοί µε τα άκρα του προς ενίσχυση τµήµατος 477. Για κάθε έναν από τους δύο εκκινητές ισχύει η παρακάτω σχέση: Tm=2X(A+T)+4X(G+C), όπου Tm είναι η θερµοκρασία στην οποία αποδιατάσσεται το 50% των δίκλωνων µορίων, που σχηµατίζονται ανάµεσα στον εκκινητή και τη µητρική αλυσίδα. Οι τιµές της θερµοκρασίας αυτής καθορίζονται από τη σύσταση του κάθε εκκινητή σε αδενίνη (Α) και θυµίνη (Τ), µεταξύ των οποίων αναπτύσσονται δύο δεσµοί υδρογόνου, και από τη σύσταση σε γουανίνη (G) και κυτοσίνη (C), µεταξύ των οποίων αναπτύσσονται τρεις δεσµοί υδρογόνου. Από τον υπολογισµό της Tm για κάθε έναν από τους δύο εκκινητές προκύπτει και η τιµή της θερµοκρασίας υβριδισµού των εκκινητών (θερµοκρασία annealing), κατά την αντίδραση της PCR. Η αντίδραση PCR αξιοποιεί τις ιδιότητες του ενζύµου DΝΑ πολυµεράση. Το ένζυµο αυτό έχει την ιδιότητα να συνθέτει συµπληρωµατική έλικα DΝΑ µε µήτρα µονόκλωνο DΝΑ, προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο ελεύθερο 3 άκρο και µε κα- 119

120 τέυθυνση 5 3. Η DΝΑ πολυµεράση, που χρησιµοποιείται στις αντιδράσεις PCR, έχει αποµονωθεί από το θερµόφιλο βακτήριο Τhermus aquaticus (Ταq polymerase) και είναι ανθεκτική στη θερµότητα 475. Για την αντίδραση της PCR απαιτούνται τα εξής: 1. DΝΑ που θα αποτελέσει τη µήτρα της αντίδρασης 2. Ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές, µεγέθους 18-30bp ο καθένας 3. Ένζυµο DΝΑ πολυµεράση (Ταq polymerase), που έχει βέλτιστη θερµοκρασία δράσης στους 72 C, αλλά παραµένει σταθερή µέχρι και τους 94 C 4. Ιόντα Μg 2+ (MgCl 2 ) σε κατάλληλη συγκέντρωση, απαραίτητα για την ενζυµική δράση της πολυµεράσης 5. Ελεύθερα 5' τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps) σε ισοµοριακές συγκεντρώσεις για κάθε αζωτούχο βάση (dατρ, dgτρ, dττρ και dcτρ). Τα dntps αποτελούν τα δοµικά συστατικά των νεοσχηµατιζόµενων µορίων DΝΑ και παρέχουν την ενέργεια για τον πολυµερισµό 6. Ειδικό ρυθµιστικό διάλυµα (PCR buffer), που ρυθµίζει το pη της αντίδρασης για τη βέλτιστη δράση της πολυµεράσης Ο τελικός όγκος της αντίδρασης PCR είναι 50µl. Για τη διεξαγωγή της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης, το παραπάνω µείγµα τοποθετείται σε ειδικό θερµικό κυκλοποιητή (συσκευή PCR), ο οποίος µεταβάλλει προγραµµατισµένα τη θερµοκρασία κατά τη διάρκεια επαναλαµβανόµενων κύκλων τριών διακριτών σταδίων, που είναι τα εξής: 1. Θερµική αποδιάταξη (denaturation) σε υψηλή θερµοκρασία, ο C, για µικρό χρονικό διάστηµα, 1-2 λεπτά, µε συνέπεια τον αποχωρισµό των συµπληρωµατικών αλυσίδων και τη µετατροπή του δίκλωνου DNA σε µονόκλωνο. 2. Υβριδισµός (annealing) των εκκινητών στις συµπληρωµατικές τους α- λυσίδες, που επιτυγχάνεται µε πτώση της θερµοκρασίας στη θερµοκρασία υβριδισµού ο C (θερµοκρασία annealing). 3. Πολυµερισµός (extension), στους ο C, όπου επιτυγχάνεται προσθήκη συµπληρωµατικών βάσεων στο 3 άκρο κάθε αφετηρίας, µε τη δράση της πολυµεράσης, µε αποτέλεσµα τη σύνθεση δύο νέων συµπληρω- µατικών ακολουθιών. 120

121 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Στο τέλος κάθε κύκλου το προϊόν έχει διπλασιαστεί, ενώ ο τελικός αριθµός αντιγράφων εξαρτάται από τον αριθµό των κύκλων (n) και είναι 2 n. Στις περισσότερες περιπτώσεις που n=36, ο αριθµός των αντιγράφων που προκύπτουν είναι 2 36 = 68 δισεκατοµµύρια. Μετά το τέλος της αντίδρασης τα δείγµατα διατηρούνται στους 4 ο C. Η αναγνώριση και ο έλεγχος των προϊόντων της PCR επιτυγχάνεται µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης συγκέντρωσης 1,5%. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή µεταφέρεται σε τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) για την αναγνώριση και φωτογράφηση των αποτελεσµάτων. Αν στην PCR αντίδραση χρησιµοποιηθεί cdna αντί για DNA, τότε µπορεί να παρατηρηθεί η έκφραση ενός γονιδίου, δηλ. να διαπιστωθεί η ύπαρξη mrna αυτού του γονιδίου. Στην παρούσα µελέτη, χρησιµοποιήθηκε cdna σε αντίδραση PCR µε εκκινητές για το γονίδιο abl, προκειµένου να ελεγχθούν τα προϊόντα της RT-PCR. Οι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές (primers) που χρησιµοποιήθηκαν για την ενίσχυση του abl σχεδιάστηκαν µε τη βοήθεια του προγράµµατος DNΑsis, µε τέτοιο τρόπο ώστε να υβριδίζονται σε θέσεις συρραφής δύο εξονίων, για να αποφεύγεται η τυχόν ενίσχυση περιοχών που ανήκουν σε γενωµατικό DΝΑ (πίνακας 5). Τα αντιδραστήρια και το θερµικό προφίλ της αντίδρασης φαίνονται αντίστοιχα στους πίνακες 6 και

122 Πίνακας 5. Οι εκκινητές του γονίδιου abl για την αντίδραση PCR. Εκκινητής Αλληλουχία Tm ( ο C) Πρόσθιος 5 TCCATCTCGCTGAGATACGAAG 3 62,7 Ανάστροφος 5 CACCGTTGAATGATGATGAACC 3 60,8 Περιοχή Ενίσχυσης 132 bp Πίνακας 6. Αντιδραστήρια της PCR για το γονίδιο abl. Αντιδραστήρια Ποσότητες (µl) cdna 2 10X Taq DNA polymerase Buffer 5 MgCl 2 25mM 3 dntps mix 1 Πρόσθιος εκκινητής 30 µm 0,3 Ανάστροφος εκκινητής 30 µm 0,3 Taq DNA πολυµεράση 0,4 Απεσταγµένο Η 2 Ο 38 Συνολικός όγκος 50 Πίνακας 7. Θερµικό προφίλ της αντίδρασης PCR για το γονίδιο abl. Θερµοκρασία Χρόνος Κύκλοι Αποδιάταξη 95 ο C 5 λεπτά 1 Αποδιάταξη 95 ο C 1 λεπτό Υβριδισµός 60 ο C 30 δευτερόλεπτα 35 Επιµήκυνση 72 ο C 30 δευτερόλεπτα Τελική επιµήκυνση 72 ο C 10 λεπτά 1 122

123 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.7. Real-Time PCR Η Real-Time PCR βασίζεται στη µεθοδολογία της ποσοτικής PCR και α- ποτελεί µια µέθοδο συγκέντρωσης δεδοµένων σε πραγµατικό χρόνο, κατά τη διάρκεια εξέλιξης µιας αντίδρασης 478. Η µέθοδος αυτή έχει υψηλή ακρίβεια και διαθέτει πολλά πλεονεκτήµατα έναντι άλλων µοριακών τεχνικών. Το πιο σηµαντικό είναι η µεγάλη ευαισθησία, που παρέχει τη δυνατότητα ανίχνευσης και ενίσχυσης ενός πολύ µικρού αριθµού αντιγράφων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών, που σε ορισµένες περιπτώσεις µπορεί να είναι µόνο ένα. Επιπλέον, η ενίσχυση του προϊόντος διεξάγεται σε πολύ µικρό χρονικό διάστηµα κατά το οποίο είναι δυνατή η παρατήρηση και παράλληλη ανάλυση του αποτελέσµατος. Άλλα πλεονεκτήµατα της µεθόδου είναι η επαναληψιµότητα, εξαιτίας του αυτοµατισµού της αντίδρασης και η ελαχιστοποίηση των επιµολύνσεων, λόγω του κλειστού συστήµατος διεξαγωγής των αντιδράσεων. Το σηµαντικότερο όµως πλεονέκτη- µα της Real-Time PCR είναι η δυνατότητα ποσοτικοποίησης, που επιτρέπει τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης του προϊόντος στο αρχικό δείγµα. Γενικά, η Real-Time PCR µπορεί να χρησιµοποιηθεί για: α) την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισµό ιών και µικροοργανισµών, β) τη µελέτη της έκφρασης γονιδίων, γ) την αποτελεσµατικότητα της θεραπευτικής αγωγής, δ) τον ποσοτικό προσδιορισµό µεταλλάξεων και ε) τον προσδιορισµό γενοτύπου (genotyping) 479. Η τεχνική της Real-Time PCR βασίζεται στη χρήση χρωστικών που φθορίζουν και στη συσχέτιση της έντασης του φθορισµού, µε την αρχική συγκέντρωση του δείγµατος 480. Το σήµα του φθορισµού ανιχνεύεται από το οπτικό σύστη- µα ενός ειδικού κυκλοποιητή και η έντασή του είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του προϊόντος σε κάθε κύκλο. Γενικά, οι αντιδράσεις της Real-Time PCR χαρακτηρίζονται από τη χρονική στιγµή, κατά την οποία το προϊόν του πολλαπλασιασµού ανιχνεύεται για πρώτη φορά. Η χρονική αυτή στιγµή προσδιορίζεται από τον αριθµό των κύκλων της PCR αντίδρασης και αναφέρεται ως C T (Cycle Threshold, Όριο κύκλου). Έτσι, όσο µεγαλύτερη είναι η ποσότητα του mrna στο αρχικό δείγµα, τόσο νωρίτερα λαµβάνεται σήµα φθορισµού και άρα, τόσο µικρότερη είναι η τιµή του C T. Μια PCR αντίδραση πραγµατικού χρόνου περιλαµβάνει τέσσερεις κύριες φάσεις: τη γραµµική φάση, την εκθετική αύξηση, τη λογαριθµική αύξηση και τη φάση του πλατώ. Το προϊόν ανιχνεύεται για πρώτη φορά στη φάση της εκθετι- 123

124 κής αύξησης και ο αριθµός των κύκλων (τιµή του C T ) που αντιστοιχεί στη φάση αυτή, αντιπροσωπεύει την αρχική ποσότητα, σε κάθε δείγµα. Στη Real-Time PCR, εκτός από ποσοτική ανάλυση γίνεται και ποιοτική ανάλυση, η οποία επιτυγχάνεται µε µελέτη της καµπύλη τήξης (melting curve analysis) των προϊόντων. Στη µελέτη αυτή, οι ενισχυµένες ακολουθίες χαρακτηρίζονται από το ση- µείο τήξης τους (Tm), το οποίο είναι συνάρτηση του µήκους και της σύνθεσης των βάσεων του προϊόντος. Το Tm είναι µοναδικό και χαρακτηριστικό για κάθε αλληλουχία και, µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως διαγνωστικό στοιχείο 481. Η ικανότητα ελέγχου της προόδου της αντίδρασης σε πραγµατικό χρόνο πραγµατοποιείται µε τη βοήθεια ειδικών χηµικών αντιδράσεων και ανιχνευτών (probes). Οι πιο κοινές µέθοδοι χηµείας που χρησιµοποιούνται σήµερα είναι οι εξής: α) η SYBR Green Ι χρωστική, β) οι ανιχνευτές υδρόλυσης (hydrolysis probes) και γ) οι ανιχνευτές υβριδοποίησης (hybridization probes) 480. Η απλούστερη µέθοδος είναι η χρήση της SYBR Green Ι, η οποία όταν ενώνεται µε δίκλωνο DNA ή cdna παράγει σήµα φθορισµού. Εποµένως, η ένταση του σήµατος σε κάθε βήµα της αντίδρασης είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του προϊόντος. Το πλεονέκτηµα της SYBR Green Ι είναι ότι απαιτεί τη χρήση εκκινητών, που σχεδιάζονται και συντίθενται εύκολα και εποµένως έχουν χαµηλό κόστος, ενώ το κύριο µειονέκτηµά της είναι ότι συνδέεται και µε µη ειδικά προϊόντα 480. Η Real-Time RT-PCR χρησιµοποιεί ως αρχικό δείγµα cdna (mrna) και µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την ποσοτική µελέτη διαφόρων mrnas. Η µέθοδος αυτή επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισµό σπάνιων µεταγράφων, καθώς και τον εντοπισµό ελάχιστων αλλαγών της έκφρασης ενός γονιδίου 469,482,483. Τα αποτελέσµατα που λαµβάνονται µε τη µέθοδο αυτή είναι αξιόπιστα και γρήγορα, ενώ η τεχνική είναι ιδιαίτερα εύχρηστη και ακριβής. Για την ανάλυση των δεδοµένων της Real-Time RT-PCR υπάρχουν δύο διαφορετικές µέθοδοι ποσοτικοποίησης: η απόλυτη και η σχετική 480,484,485. Η απόλυτη ποσοτικοποίηση προσδιορίζει τον ακριβή αριθµό των µεταγράφων ενός γονιδίου 486,487. Αντίθετα, η σχετική ποσοτικοποίηση, που βασίζεται στη σχετική έκφραση δύο γονιδίων, από τα οποία το ένα χρησιµοποιείται ως γονίδιο αναφοράς, δεν παρέχει πληροφορίες για τον ακριβή αριθµό των µεταγράφων. Η µέθοδος αυτή ενδείκνυται για τη µελέτη της έκφρασης ενός γονιδίου σε δύο διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους ή ιστούς, καθώς και για τη µελέτη των µεταβολών της έκφρασης, µετά την επίδραση ενός παράγοντα. Η πιο ακριβής µέθοδος σχετικής ποσοτικοποίησης 124

125 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ είναι η µέθοδος του Pfaffl 469, που βασίζεται στη σχετική έκφραση ενός γονιδίουστόχου (target gene), ως προς ένα γονίδιο αναφοράς (reference gene), αλλά µόνο στην περίπτωση που οι αποδόσεις των αντιδράσεων (amplification efficiencies, Ε) των δύο γονιδίων είναι περίπου ίδιες. Στην παρούσα µελέτη, η µέθοδος της Real-Time RT-PCR χρησιµοποιήθηκε για τον ηµιποσοτικό προσδιορισµό των επιπέδων mrna της survivin, σε κύτταρα περιφερικού αίµατος και µυελού των οστών. Όλες οι αντιδράσεις πραγµατοποιήθηκαν στον αναλυτή Opticon 2 Real-Time PCR System της εταιρείας MJ Research και η χρωστική που χρησιµοποιήθηκε για τη διεξαγωγή των αντιδράσεων ήταν η SYBR Green Ι (Platinum SYBR Green qpcr SuperMix- UDG). Ως γονίδιο αναφοράς χρησιµοποιήθηκε το abl, διότι η έκφρασή του είναι σταθερή κατά τη µελέτη των κακοήθων αιµατολογικών νοσηµάτων 474. Οι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν για την ενίσχυση τµήµατος του cdna των δύο γονιδίων σχεδιάστηκαν µε τη βοήθεια του προγράµµατος DNAsis, µε βάση τις αναφερόµενες ακολουθίες. Οι εκκινητές της survivin σχεδιάστηκαν να υβριδίζονται µε περιοχές εξονίων που είναι κοινές για όλες τις ισοµορφές, ώστε να µελετάται η ολική survivin και όχι κάποιες µόνο ισοµορφές της. Οι περιοχές αυτές βρίσκονται στα εξόνια 1 και 2. Οι εκκινητές του abl για τη Real-Time RT-PCR ήταν ίδιοι µε αυτούς που χρησιµοποιήθηκαν και στην RT-PCR. Οι αλληλουχίες των εκκινητών φαίνονται στον πίνακα 8. Πίνακας 8. Οι εκκινητές των γονιδίων της survivin και του abl για τις αντιδράσεις της Real-Time RT-PCR. Γονίδιο Εκκινητής Αλληλουχία Tm ( ο C) Περιοχή Ενίσχυσης Survivin Abl Πρόσθιος 5 ACCACCGCATCTCTACATTCAA 3 60,8 Ανάστροφος 5 TTGAAGCAGAAGAAACACTGGG 3 60,8 Πρόσθιος 5 TCCATCTCGCTGAGATACGAAG 3 62,7 Ανάστροφος 5 CACCGTTGAATGATGATGAACC 3 60,8 139 bp 132 bp Προκειµένου να βρεθούν οι βέλτιστες συνθήκες διεξαγωγής των αντιδράσεων για κάθε γονίδιο ελέγχθηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις MgCl 2 (από 3 έως 5 mm) και εκκινητών (από 200 έως 800 nm). Οι συγκεντρώσεις στις οποίες οι αντιδράσεις είχαν την υψηλότερη απόδοση ήταν 4 mm MgCl 2 και 200 nm 125

126 εκκινητών, τόσο για τη survivin όσο και για το abl. Τα συστατικά και οι ποσότητες κάθε αντίδρασης Real-Time RT-PCR φαίνονται στον πίνακα 9, ενώ το θερµικό προφίλ της αντίδρασης φαίνεται στον πίνακα 10. Επιπλέον, προκειµένου να ελεγχθεί η ειδικότητα των προϊόντων των αντίδρασης πραγµατοποιήθηκε µια ανάλυση της καµπύλης τήξης, από την οποία καθορίστηκαν οι θερµοκρασίες τήξης (Tm) των δύο γονιδίων. Πίνακας 9. Αντιδραστήρια της Real-Time RT-PCR αντίδρασης για τα γονίδια survivin και abl. Ποσότητες (µl) cdna 2 (50ng) SYBR Green Ι πολυµεράση 12,5 MgCl 2 25mM 0,5 Πρόσθιος εκκινητής 10 µm 0,5 Ανάστροφος εκκινητής 10 µm 0,5 Απεσταγµένο Η 2 Ο 9 Συνολικός όγκος 25 Πίνακας 10. Θερµικό προφίλ της Real-Time RT-PCR αντίδρασης για τα γονίδια survivin και abl. Θερµοκρασία Χρόνος Κύκλοι Προθέρµανση 50 o C 2 λεπτά Αποδιάταξη 95 ο C 5 λεπτά 1 Αποδιάταξη 95 ο C 1 λεπτό Υβριδισµός 60 ο C 30 δευτερόλεπτα Επιµήκυνση 72 ο C 30 δευτερόλεπτα 40 Θέρµανση για καµπύλη τήξης 82 ο C 5 δευτερόλεπτα Τελική επιµήκυνση 72 ο C 5 δευτερόλεπτα 1 ιατήρηση 15 ο C 20 λεπτά 126

127 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Το µοντέλο της σχετικής ποσοτικοποίησης του Pfaffl Τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από την εφαρµογή της Real-Time RT-PCR αναλύθηκαν µε βάση το µοντέλο της σχετικής ποσοτικοποίησης του Pfaffl 468,469, που εκφράζεται µαθηµατικά από την εξίσωση 1. CTγον. στόχος ( µ άρτυρας δείγµα ) γον. στόχος CTγον. αναφοράς ( µ άρτυρας δείγµα ) γον. αναφοράς Ε Σ χετικός ρυθµ ός έκφρασης = (1) Ε Σύµφωνα µε το µοντέλο αυτό, ο σχετικός ρυθµός έκφρασης (Ratio, R) ενός γονιδίου µπορεί να υπολογιστεί µε βάση την απόδοση της αντίδρασης (Efficiency, Ε) και τη διαφορά των C T ( C T ) ενός άγνωστου δείγµατος από έναν µάρτυρα, και να εκφραστεί ως προς ένα γονίδιο αναφοράς. Στην παρούσα µελέτη, για τον υπολογισµό του σχετικό ρυθµού έκφρασης της survivin ως προς το abl, η εξίσωση 1 µετατρέπεται στην εξίσωση 2. Οι µάρτυρες που χρησιµοποιήθηκαν σε κάθε περίσταση ήταν διαφορετικοί, για τα δείγµατα περιφερικού αίµατος και µυελού των οστών. Επιπλέον, όταν µελετούνταν οι µεταβολές της έκφρασης της survivin πριν και µετά τη χηµειοθεραπεία (διάγνωση και ύφεση της νόσου), ως µάρτυρας σε κάθε περίπτωση θεωρούνταν η προγενέστερη κατάσταση. ( µ άρτυρας δείγµα ) survivin Ε survivin Σ χετικός ρυθµ ός έκφρασης = (2) CTabl ( µ άρτυρας δείγµα ) Ε abl CT Η εξίσωση αυτή ισχύει µόνο στην περίπτωση που οι αποδόσεις της survivin (E survivin ) και του abl (E abl ) είναι περίπου ίδιες. Προκειµένου να υπολογιστούν οι αποδόσεις των αντιδράσεων κατασκευάστηκε µια πρότυπη καµπύλη για κάθε γονίδιο (καµπύλη αναφοράς), χρησιµοποιώντας διαδοχικές αραιώσεις ενός θετικού µάρτυρα. Οι αραιώσεις αυτές ήταν 1, 1/10, 1/100, 1/1000 µιας αρχικής ποσότητας 100 ng. Στην εικόνα 13 φαίνονται οι διαδοχικές αραιώσεις για το γονίδιο της survivin και στην εικόνα 14, η πρότυπη καµπύλη της survivin, από την οποία υπολογίζεται η κλίση slope της καµπύλης. 127

128 α. β. 1 1/10 1/100 1/1000 Εικόνα 13. ιαδοχικές αραιώσεις 1, 1/10/, 1/100, 1/1000 ενός θετικού µάρτυρα για το γονίδιο της survivin, α) στον αναλυτή Opticon 2 και β) σε πηκτή αγαρόζης. 128

129 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Εικόνα 14. Καµπύλη αναφοράς για το γονίδιο της survivin. Η κλίση slope της καµπύλης είναι -3,87 και r 2 =0,986. Η κλίση (slope) της καµπύλης αναφοράς αποτελεί ένα µέτρο της απόδοσης Ε της αντίδρασης ενός γονιδίου και δίνεται από τον τύπο: E=10 (-1/slope). Αν οι αποδόσεις των αντιδράσεων Ε της survivin και του abl είναι περίπου ίδιες τότε ισχύει το µοντέλο της σχετικής ποσοτικοποίησης του Pfaffl και τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης µπορούν να αναλυθούν χρησιµοποιώντας το λογισµικό REST-XL 468. Οι κλίσεις για κάθε καµπύλη αναφοράς ήταν -3,86 για τη survivin και -3,87 για το abl και µε βάση τον τύπο, οι αποδόσεις των αντιδράσεων ήταν 1,98 και 1,99 αντίστοιχα. Εφόσον οι αποδόσεις είναι περίπου ίδιες, µπορεί να χρησιµοποιηθεί το µοντέλο της σχετικής ποσοτικοποίησης του Pfaffl και τα δεδοµένα της Real-Time RT-PCR να παρουσιαστούν ως τιµές C T. Επιπλέον, ο συντελεστής συσχέτισης (r) της συγκέντρωσης RNA και της τιµής του C T ήταν περίπου 1, τόσο για τη survivin όσο και για το abl, υποδεικνύοντας ότι η έκφραση του RNA αντιπροσωπεύεται ικανοποιητικά από την τιµή του C T. Προκειµένου να ελεγχθεί η ειδικότητα των προϊόντων της αντίδρασης πραγµατοποιήθηκε µια ανάλυση της καµπύλης τήξης, από την οποία καθορίστηκαν οι θερµοκρασίες τήξης (Tm) των δύο γονιδίων. Από το πείραµα προέκυψε ότι η θερµοκρασία τήξης της survivin είναι Tm survivin = 88,2-88,8 o C και του abl Tm abl = 83,8-84,4 o C (εικόνα 15). 129

130 Abl Tm=83,8-84,4 o C Survivin Tm=88,2-88,8 o C Εικόνα 15. Ανάλυση της καµπύλης τήξης για τα γονίδια survivin και abl Ανοσοενζυµική µέθοδος ELISA Η ποσοτική µέτρηση των επιπέδων της survivin στον ορό των ασθενών έ- γινε µε την ανοσοενζυµική µέθοδο ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). Το kit που χρησιµοποιήθηκε ήταν το Quantikine Human Survivin Immunoassay kit (DSV00), της εταιρείας R&D Systems, Inc. Τα δείγµατα και οι πρότυπες αραιώσεις (standards) ετοιµάστηκαν σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο ποσοτικός προσδιορισµός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης, πραγµατοποιήθηκε τόσο στον ορό ασθενών, όσο και στον ορό υγιών µαρτύρων. Η µέθοδος της ELISA βασίζεται στην αρχική ένωση της survivin µε ένα προσδεµένο µονοκλωνικό αντίσωµα και στην επακόλουθη ένωσή της µε ένα πολυκλωνικό αντίσωµα, το οποίο στο άλλο άκρο έχει δεσµευµένο ένα ένζυµο. Στο σύµπλοκο αυτό προστίθεται το υπόστρωµα του ενζύµου και διεξάγεται η ενζυ- µική αντίδραση, κατά την οποία εµφανίζεται χρώµα. Η ενζυµική αντίδραση διακόπτεται και µετρείται η ένταση του χρώµατος, που είναι ανάλογη της ποσότητας της survivin, που έχει δεσµευτεί στο αντίσωµα. Η µέτρηση της οπτικής α- πορρόφησης πραγµατοποιήθηκε στα 450nm και οι συγκεντρώσεις της πρωτεΐνης υπολογίστηκαν, µε τη βοήθεια της πρότυπης καµπύλης των standards, που δηµιουργήθηκε για κάθε µέτρηση. 130

131 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.9. Στατιστική µεθοδολογία Τα δεδοµένα της παρούσας µελέτης αναλύθηκαν µε το στατιστικό πακέτο SPSS11.5 (SPSS Inc). Για κάθε ανάλυση, αρχικά έγινε ο έλεγχος της κανονικότητας των κατανοµών και στη συνέχεια ακολούθησε ο έλεγχος των στατιστικών υποθέσεων (µελέτη ύπαρξης στατιστικής σηµαντικότητας µεταξύ των µετρήσεων). Για τον έλεγχο της κανονικότητας των κατανοµών εφαρµόστηκε η δοκιµασία Shapiro-Wilk (αριθµός δειγµάτων µικρότερος του 50), προκειµένου να διαπιστωθεί εάν οι µεταβλητές που µελετήθηκαν προσαρµόζονται ικανοποιητικά στην κανονική κατανοµή (κατανοµή Gauss). Για τις µεταβλητές που ακολουθούσαν κανονική κατανοµή χρησιµοποιήθηκε η παραµετρική στατιστική δοκι- µασία student s t (student s t-test), για περιπτώσεις ελέγχου δύο ανεξάρτητων µεταβλητών, και η παραµετρική στατιστική δοκιµασία Anova, για περιπτώσεις ελέγχου περισσότερων των δύο ανεξάρτητων µεταβλητών. Στην περίπτωση που οι µεταβλητές δεν ακολουθούσαν κανονική κατανοµή χρησιµοποιήθηκε η µη παραµετρική δοκιµασία Mann-Whitney (Mann-Whitney test). Τα δεδοµένα εκφράστηκαν ως µέσοι όροι ± σταθερή απόκλιση (SD). Στατιστικώς σηµαντικές θεωρήθηκαν οι συγκρίσεις που είχαν τιµή στατιστικής σηµαντικότητας µικρότερη από 0,05 (p<0,05). Για τον έλεγχο της συσχέτισης µεταξύ ποσοτικών µεταβλητών χρησιµοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης (Pearson correlation coefficient, r). Ο συντελεστής συσχέτισης r κυµαίνεται µεταξύ -1 (αρνητική σχέση) και 1 (θετική σχέση). Τα δεδοµένα από την εφαρµογή της Real-Time RT-PCR (τιµές C T ) µεταφέρθηκαν για ανάλυση στο λογισµικό REST-XL -Version2 (Relative Expression Software Tool-XL ) 468. Το λογισµικό REST-XL βασίζεται στο µοντέλο της σχετικής ποσοτικοποίησης του Pfaffl και παρέχει τον ρυθµό µεταβολής (φορές αύξησης ή µείωσης) της έκφρασης ενός γονιδίου, σε ένα δείγµα σε σχέση µε τον αντίστοιχο µάρτυρα. Τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από τις παραπάνω αναλύσεις ή µετρήσεις παρουσιάζονται µε τη βοήθεια θηκογραµµάτων (box plots). 131

132

133 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ II. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Α. Αιµατολογικά ευρήµατα των ασθενών Στην παρούσα εργασία µελετήθηκαν 40 ηλικιωµένοι ασθενείς µε ΟΜΛ κατά τη διάγνωση, 18 ασθενείς σε πλήρη αιµατολογική ύφεση µετά από χηµειοθεραπεία και 25 υγιείς µάρτυρες. Ο µέσος όρος ηλικίας των ασθενών ήταν 67,72 ± 11,47 έτη (εύρος έτη) και ο αντίστοιχος των υγιών µαρτύρων ήταν 62,54 ± 8,42 έτη (εύρος έτη). Η διαφορά ανάµεσα στις δύο αυτές οµάδες δεν είναι στατιστικώς σηµαντική (p>0,05). Επίσης, δεν είναι στατιστικώς σηµαντική, η διαφορά ανάµεσα στην ηλικία των ασθενών κατά τη διάγνωση και των ασθενών κατά την αιµατολογική ύφεση (p>0,05). Τέλος δεν υπάρχει σηµαντική συσχέτιση ανάµεσα στα επίπεδα mrna στη διάγνωση και στην ηλικία (p=0,722) και στα επίπεδα mrna στην αιµατολογική ύφεση και στην ηλικία (p=0,782). Οι µέσοι όροι και οι σταθερές αποκλίσεις των αιµατολογικών παρα- µέτρων των ασθενών κατά τη διάγνωση και την αιµατολογική ύφεση, φαίνονται στον πίνακα 1. Στατιστικώς σηµαντική συσχέτιση (p<0,05) των παραµέτρων αυτών στη διάγνωση και στην ύφεση βρέθηκε για τον αριθµό των λευκών αιµοσφαιρίων, τον αριθµό των αιµοπεταλίων, το ποσοστό των βλαστών στο περιφερικό αίµα και το ποσοστό των βλαστών στον µυελό των οστών (πίνακας 11). Πίνακας 11. Μέσοι όροι των αιµατολογικών παραµέτρων των 40 ασθενών κατά τη διάγνωση και των 18 ασθενών κατά την αιµατολογική ύφεση και στατιστική σηµαντικότητα της µεταξύ τους συσχέτισης. Παράµετρος ΙΑΓΝΩΣΗ Μέσος όρος ± Σταθ. αποκλιση ΥΦΕΣΗ Μέσος όρος ± Σταθ. αποκλιση Στατιστική Σηµαντικότητα p Λευκά αιµοσφαίρια 24,30 ± 28,67 7,21±1,54 0,009 * (WBC x 10 3 /mm 3 ) Αιµοσφαιρίνη (Hgb) (g/dl) 9,52 ±1,33 12,58±0,94 0,532 Αιµατοκρίτης (Hct) (%) 29,11 ± 3,91 36,27±4,72 0,411 Αιµοπετάλια (PLT x 10 3 /mm 3 ) ± ± ,011 * Βλάστες ΠΑ (%) 42,93 ± 25,49 0 0,008 * Βλάστες ΜΟ (%) 71,31 ± 25,52 3,39±1,09 0,005 * 133

134 Β. Ευρήµατα από τη µελέτη των επιπέδων mrna της survivin στον µυελό των οστών και το περιφερικό αίµα Ο ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων mrna της survivin στον µυελό των οστών και στο περιφερικό αίµα πραγµατοποιήθηκε µε τη µέθοδο της Real- Time RT-PCR. Από κάθε πείραµα υπολογίστηκαν οι τιµές του C T (αριθµός κύκλων) για τη survivin και το γονίδιο αναφοράς abl, που όπως αναφέρθηκε είναι αντιστρόφως ανάλογες της ποσότητας του mrna κάθε γονιδίου στο αρχικό δείγµα. Οι τιµές του C T της survivin και του abl µεταφέρθηκαν στο λογισµικό REST-XL 468, µε τη βοήθεια του οποίου υπολογίστηκε η σχετική µεταβολή της έκφρασης της survivin και εκφράστηκε ως φορές αύξησης ή µείωσης των επιπέδων mrna, σε ένα δείγµα ως προς ένα άλλο. Επιπλέον, θέτοντας ως 1 την τιµή της ποσότητας του mrna στον µυελό των οστών των υγιών µαρτύρων, τα επίπεδα mrna της survivin σε κάθε δείγµα εκφράστηκαν ως απόλυτη τιµή. Οι µέσοι όροι των C T της survivin και του abl, καθώς και η απόλυτη τιµή της survivin στις τρεις υπό µελέτη οµάδες, στον µυελό και το περιφερικό αίµα αντίστοιχα, φαίνονται στους πίνακες 12 και 13. Στις εικόνες 16 και 17 φαίνονται οι καµπύλες φθορισµού της survivin για τον µυελό των οστών και το περιφερικό αίµα αντίστοιχα, σε ασθενείς κατά τη διάγνωση και την αιµατολογική ύφεση, ενώ τα απόλυτα επίπεδα mrna της survivin φαίνονται στα διαγράµµατα 1 και 2. Στην εικόνα 18 φαίνεται σε πηκτή αγαρόζης, η έκφραση της survivin στον µυελό των οστών και το περιφερικό αίµα, σε έναν ασθενή κατά τη διάγνωση και την ύφεση, καθώς και σε έναν µάρτυρα. 134

135 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πίνακας 12. Μέσοι όροι των τιµών C T της survivin και του abl για τις τρεις υπό µελέτη οµάδες και απόλυτη ποσότητα της survivin στον µυελό των οστών. C T Survivin C T Abl Απόλυτη ποσότητα Survivin ιάγνωση 24,69±2,33 23,48±3,65 0,6127±0,4112 Ύφεση 23,21±4,05 23,14±4,08 1,2714±0,5857 Μάρτυρες 24,08±0,26 23,97±0,21 1,000±0,5213 Πίνακας 13. Μέσοι όροι των τιµών C T της survivin και του abl για τις τρεις υπό µελέτη οµάδες και απόλυτη ποσότητα της survivin στο περιφερικό αίµα. C T Survivin C T Abl Απόλυτη ποσότητα Survivin ιάγνωση 24,78±2,65 21,71±0,58 0,1919±0,1822 Ύφεση 29,64±1,60 24,62±0,03 0,0749±0,0671 Μάρτυρες 28,70±0,56 23,83±2,36 0,0338±0,

136 Μυελός των οστών Ύφεση C T =23,21 ιάγνωση C T =24,69 Εικόνα 16. Καµπύλες φθορισµού για το γονίδιο της survivin, σε δείγµατα µυελού των οστών ασθενών µε ΟΜΛ κατά τη διάγνωση και την αιµατολογική ύφεση. Επίπεδα mrna στον ΜΟ 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 ιάγνωση Ύφεση Μάρτυρες ιάγραµµα 1. Απόλυτα επίπεδα mrna της survivin στον µυελό των οστών (ΜΟ) ασθενών κατά τη διάγνωση, την αιµατολογική ύφεση, καθώς και υγιών µαρτύρων. 136

137 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Περιφερικό αίµα ιάγνωση C T =24,78 Ύφεση C T =29,64 Εικόνα 17. Καµπύλες φθορισµού για το γονίδιο της survivin, σε δείγµατα περιφερικού αίµατος ασθενών κατά τη διάγνωση και την αιµατολογική ύφεση. Επίπεδα mrna στο ΠΑ 0,2 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 ιάγνωση Ύφεση Μάρτυρες ιάγραµµα 2. Απόλυτα επίπεδα mrna της survivin στο περιφερικό αίµα (ΠΑ) ασθενών κατά τη διάγνωση, την αιµατολογική ύφεση, καθώς και υγιών µαρτύρων. 137

138 Μυελός των οστών Περιφερικό αίµα Υ Μ Υ Μ Εικόνα 18. Ανίχνευση mrna της survivin στον µυελό των οστών και στο περιφερικό αίµα ενός ασθενούς κατά τη διάγνωση ( ), την αιµατολογική ύφεση (Υ) και ενός µάρτυρα (Μ), σε πηκτή αγαρόζης. Στους πίνακες 14 και 15 φαίνονται οι σχετικές µεταβολές των επιπέδων mrna της survivin ανάµεσα στις τρεις υπό µελέτη οµάδες και οι αντίστοιχες τιµές της στατιστικής σηµαντικότητας, για τον µυελό των οστών και το περιφερικό αίµα, αντίστοιχα. Αναλυτικότερα, τα επίπεδα mrna της survivin στον µυελό των οστών ήταν µειωµένα στους ασθενείς κατά τη διάγνωση, σε σχέση µε τους ασθενείς σε πλήρη αιµατολογική ύφεση, κατά 2,075 φορές και η διαφορά αυτή ήταν στατιστικώς σηµαντική (p=0,003). Επιπλέον, τα επίπεδα των ασθενών κατά τη διάγνωση βρέθηκαν στατιστικώς σηµαντικά µειωµένα, σε σχέση µε τους µάρτυρες κατά 2,013 φορές (p=0,045). Οι ασθενείς σε ύφεση είχαν ελαφρώς αυξηµένα επίπεδα mrna, σε σχέση µε τους µάρτυρες (1,031 φορές) και η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικώς σηµαντική (p>0,05). Στο περιφερικό αίµα, τα επίπεδα mrna της survivin βρέθηκαν αυξηµένα κατά τη διάγνωση, σε σχέση µε την αιµατολογική ύφεση κατά 3,773 φορές και η διαφορά αυτή ήταν στατιστικώς σηµαντική (p=0,038). Στους ασθενείς κατά τη διάγνωση, τα επίπεδα mrna ήταν στατιστικώς σηµαντικά αυξηµένα, σε σχέση µε τους µάρτυρες, κατά 3,486 φορές (p=0,042), ενώ στους ασθενείς σε πλήρη ύφεση, τα επίπεδα mrna ήταν ελαφρώς µειωµένα, ως προς τους µάρτυρες (1,082 φορές), χωρίς ωστόσο η διαφορά αυτή να είναι στατιστικώς σηµαντική (p>0,05). 138

139 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πίνακας 14. Σχετική µεταβολή των επιπέδων mrna της survivin µεταξύ των τριών οµάδων, στον µυελό των οστών. Μεταβολή Φορές p ιάγνωση ως προς Ύφεση Μείωση 2,075 0,003 * ιάγνωση ως προς Μάρτυρες Μείωση 2,013 0,045 * Ύφεση ως προς Μάρτυρες Αύξηση 1,271 0,933 Πίνακας 15. Σχετική µεταβολή των επιπέδων mrna της survivin µεταξύ των τριών οµάδων, στο περιφερικό αίµα. Μεταβολή Φορές p ιάγνωση ως προς Ύφεση Αύξηση 2,562 0,038 * ιάγνωση ως προς Μάρτυρες Αύξηση 5,672 0,042 * Ύφεση ως προς Μάρτυρες Αύξηση 2,215 0,945 Επιπλέον, εξετάζοντας τα επίπεδα mrna της survivin στον µυελό των ο- στών, σε σχέση µε τα αντίστοιχα επίπεδα στο περιφερικό αίµα βρέθηκε ότι στους ασθενείς κατά τη διάγνωση ήταν αυξηµένα κατά 3,19 φορές και η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικώς σηµαντική (p>0,05). Στους ασθενείς σε ύφεση, τα επίπεδα mrna του µυελού των οστών ήταν υψηλότερα κατά 16,95 φορές, σε σχέση µε τα επίπεδα του περιφερικού αίµατος και η διαφορά αυτή ήταν στατιστικώς σηµαντική (p=0,048). Οµοίως στους µάρτυρες, τα επίπεδα mrna στον µυελό των οστών ήταν αυξηµένα κατά 29,58 φορές, σε σχέση µε τα αντίστοιχα επίπεδα στο περιφερικό αίµα και η διαφορά αυτή ήταν στατιστικώς σηµαντική (p=0,037) (πίνακας 16). Τα ευρήµατα αυτά παρουσιάζονται αντίστοιχα στις εικόνες 19, 20 και 21. Στην εικόνα 22 φαίνεται η έκφραση της survivin, σε επίπεδο mrna στον µυελό των οστών και το περιφερικό αίµα υγιών µαρτύρων. Πίνακας 16. Σχετική µεταβολή των επιπέδων mrna της survivin στον µυελό των οστών ως προς το περιφερικό αίµα, για τις τρεις υπό µελέτη οµάδες. Μεταβολή Φορές p ιάγνωση Αύξηση 3,192 0,721 Ύφεση Αύξηση 16,957 0,048 * Μάρτυρες Αύξηση 29,58 0,037 * 139

140 ιάγνωση ΜΟ ΠΑ Εικόνα 19. Καµπύλες φθορισµού για το γονίδιο της survivin σε δείγµατα µυελού των οστών (ΜΟ) και περιφερικού αίµατος (ΠΑ) ασθενών κατά τη διάγνωση. Ύφεση ΜΟ ΠΑ Εικόνα 20. Καµπύλες φθορισµού για το γονίδιο της survivin σε δείγµατα µυελού των οστών (ΜΟ) και περιφερικού αίµατος (ΠΑ) ασθενών σε πλήρη αιµατολογική ύφεση, µετά από χηµειοθεραπεία. 140

141 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μάρτυρες ΜΟ ΠΑ Εικόνα 21. Καµπύλες φθορισµού για το γονίδιο της survivin, σε δείγµατα µυελού των οστών (ΜΟ) και περιφερικού αίµατος (ΠΑ) υγιών µαρτύρων. Περιφερικό αίµα Μυελός των οστών Εικόνα 22. Ανίχνευση mrna της survivin στο περιφερικό αίµα και στον µυελό των οστών πέντε υγιών µαρτύρων, σε πηκτή αγαρόζης. 141