ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΥΠΕΥΘΥΝΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΤΟΥ ΑΓΓΕΙΑΚΟΥ ΕΝ ΟΘΗΛΙΟΥ (VEGF) ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΟΞΕΙΑ ΜΥΕΛΟΓΕΝΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ Β ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΑΡΙΑ ΡΑΠΤΟΠΟΥΛΟΥ-ΓΙΓΗ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΥΠΕΥΘΥΝΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΤΟΥ ΑΓΓΕΙΑΚΟΥ ΕΝ ΟΘΗΛΙΟΥ (VEGF) ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΟΞΕΙΑ ΜΥΕΛΟΓΕΝΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ ΑΓΓΕΛΙΚΗΣ Γ. ΑΥΓΗΤΙ ΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: ΙΩΑΝΝΗΣ ΚΛΩΝΙΖΑΚΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΛΙΣΑΒΕΤ ΙΩΑΝΝΙ ΟΥ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΣΤΥΛΙΑΝΗ ΧΑΡΑΛΑΜΠΙ ΟΥ-ΒΡΑΝΙΤΣΑ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: ΙΩΑΝΝΗΣ ΚΛΩΝΙΖΑΚΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΛΙΣΑΒΕΤ ΙΩΑΝΝΙ ΟΥ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΣΤΥΛΙΑΝΗ ΧΑΡΑΛΑΜΠΙ ΟΥ-ΒΡΑΝΙΤΣΑ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΑΡΙΑ ΠΑΠΑΙΩΑΝΝΟΥ, ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΠΑΠΑ ΟΠΟΥΛΟΣ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΛΕΝΗ ΟΡΦΑΝΟΥ-ΚΟΥΡΜΕΚΕΡΙ ΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΑΡΙΑ ΡΑΠΤΟΠΟΥΛΟΥ-ΓΙΓΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η έγκρισις της ιδακτορικής ιατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωµών του συγγραφέως. (Νόµος 5343/32, αρθρ.202 & 2 και ν. 1268/82, αρθρ. 50&8)

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ

4

5 Στην οικογένειά µου µε ευγνωµοσύνη Όπου υπάρχει αµφισβήτηση, υπάρχει ελευθερία Publilius Syrus

6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΟΞΕΙΑ ΜΥΕΛΟΓΕΝΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ Επιδηµιολογία-Αιτιολογία Μοριακή προσέγγιση της παθογένειας της ΟΜΛ Αρχέγονο λευχαιµικό κύτταρο Προέλευση του αρχέγονου λευχαιµικού κυττάρου Πολυσταδιακή παθογένεση ΟΜΛ ιαταραχές µεταβίβασης σήµατος Μεταλλάξεις στο επαγωγικό µονοπάτι RAS Μεταλλάξεις πρωτεϊνικών κινασών Μεταλλάξεις µεταγραφικών παραγόντων Μεταλλάξεις του Core Binding Factor (CBF) Μεταλλάξεις του Α υποδοχέα του ρετινοϊκού οξέος (RARα) Συµπληρωµατικότητα των γενετικών βλαβών στην ΟΜΛ Κλινική εικόνα Ταξινόµηση της ΟΜΛ Πρόγνωση Αιµατολογικά ευρήµατα Κυτταροχηµικές αντιδράσεις στην ΟΜΛ Ανοσοφαινότυπος στην ΟΜΛ Κυτταρογενετική µελέτη (καρυότυπος)...40

8 1.10 Μοριακή γενετική Θεραπευτική αντιµετώπιση Μελλοντικές προοπτικές ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ Μηχανισµός αγγειογένεσης Επαγωγείς και αναστολείς της αγγειογένεσης Επαγωγείς της αγγειογένεσης Αναστολείς της αγγειογένεσης Παράγοντες που επάγουν την έναρξη της αγγειογένεσης O ρόλος της υποξίας στην αγγειογένεση Αγγειογένεση σε φυσιολογικές καταστάσεις Αγγειογένεση σε παθολογικές καταστάσεις Αγγειογένεση σε µη νεοπλασµατικά νοσήµατα Αγγειογένεση σε νεοπλάσµατα Αγγειογένεση σε συµπαγείς όγκους Αγγειογένεση σε αιµατολογικές κακοήθειες Μυελοδυσπλαστικά σύνδροµα (Μ Σ) Μυελοϋπερπλαστικά σύνδροµα Πολλαπλούν Μυέλωµα (ΠΜ) Οξεία λεµφοβλαστική λευχαιµία (ΟΛΛ) Χρόνια λεµφογενής λευχαιµία (ΧΛΛ) Αγγειογένεση και λευχαιµία πιθανός µηχανισµός Αγγειογένεση και Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία Ο ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΤΟΥ ΑΓΓΕΙΑΚΟΥ ΕΝ ΟΘΗΛΙΟΥ (VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR, VEGF) ΟΜΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΩΣΗ Μεταγωγή σήµατος µέσω των υποδοχέων του VEGF Βιολογική δράση και λειτουργία του VEGF Παράγοντες που επιδρούν στην έκφραση του VEGF Ο ρόλος του VEGF στη φυσιολογική αιµοποίηση και η σχέση του µε το µικροπεριβάλλον του µυελού των οστών Ο ρόλος του VEGF στις αιµατολογικές κακοήθειες...79

9 3.6 Στόχευση του VEGF σε νεοπλασµατικά νοσήµατα του αίµατος και των συµπαγών οργάνων ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗΣ ΣΕ ΝΕΟΠΛΑΣΙΕΣ ΤΟΥ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΙΣΤΟΥ Εκτίµηση της αγγειογένεσης σε οστεοµυελικές βιοψίες Ποσοτική εκτίµηση της αγγειογένεσης µέσω µέτρησης αγγειογενετικών και αντιαγγειογενετικών παραγόντων Μελέτη της έκφρασης γονιδίου µε αντίστροφη µεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (Real Time RT-PCR)...88 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ι. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΜΕΘΟ ΟΙ Μοριακή ανάλυση Αποµόνωση RNA από µυελό των οστών Προσδιορισµός της ποσότητας και καθαρότητας του RNA - Φασµατοφωτοµέτρηση RNA Αντίστροφη µεταγραφή Σύνθεση συµπληρωµατικού DNA (complementary DNA, cdna) Μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης µε πολυµεράση (PCR) Μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης µε πολυµεράση (PCR) Αρχή µεθόδου Παράγοντες που επιδρούν στην PCR Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (Real Time RT-PCR) για τη µελέτη της έκφρασης του γονιδίου VEGF...110

10 Αρχή της µεθόδου Χηµική βάση της µεθόδου ανίχνευσης των προϊόντων της Real Time RT-PCR (χηµεία SYBR Green I) Βελτιστοποίηση συνθηκών της Real Time RT-PCR Σχετική ποσοτικοποίηση µε Real-Time PCR (Relative Quantitative Real-Time PCR, RQ RT-PCR) Μαθηµατικό µοντέλο ανάλυσης αποτελεσµάτων στη σχετική ποσοτικοποίηση µε Real Time RT-PCR Πρωτεϊνική ανάλυση Ανοσοενζυµική µέθοδος ELISA Προσδιορισµός της µικροαγγειακής πυκνότητας Στατιστική ανάλυση ΙΙ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Χαρακτηριστικά ασθενών Έκφραση των επιπέδων mrna του VEGF στον µυελό των οστών Έκφραση της συγκέντρωσης της VEGF πρωτεΐνης Μέτρηση της µικροαγγειακής πυκνότητας ΙΙΙ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ IV. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ V. ΠΕΡΙΛΗΨΗ VI. SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...181

11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η οξεία µυελογενής λευχαιµία (ΟΜΛ) αποτελεί µια ετερογενή οµάδα νεοπλασµατικών διαταραχών που χαρακτηρίζονται από τον πολλαπλασιασµό και την συσσώρευση άωρων αιµοποιητικών κυττάρων, κυρίως βλαστών, στο µυελό των οστών και το περιφερικό αίµα, αλλά και άλλα παρεγχυµατικά όργανα. Αυτά τα κακοήθη κύτταρα βαθµιαία αντικαθιστούν και αναστέλλουν την ανάπτυξη και την ωρίµανση των φυσιολογικών προδρόµων µορφών της ερυθράς, της µυελοειδούς και της µεγακαρυοκυτταρικής σειράς ή δηµιουργούν ανεπάρκεια της λειτουργίας των διηθηµένων οργάνων. Η κλινική αξιολόγηση, η θεραπεία και η πρόγνωση των ασθενών µε ΟΜΛ έχουν αλλάξει δραµατικά τις τελευταίες δύο δεκαετίες. Μοριακές, κυτταρογενετικές και ανοσολογικές µελέτες έχουν συνεισφέρει στην κατανόηση της παθογένεσης και της πρόγνωσης των ασθενών µε ΟΜΛ. Παρά τις προόδους ωστόσο που έχουν σηµειωθεί τα τελευταία χρόνια στη θεραπευτική προσέγγιση της νόσου ένα ποσοστό 25% περίπου των ασθενών µε ΟΜΛ θα καταλήξει τους πρώτους µήνες από τη διάγνωση. Εκτεταµένες έρευνες συνεχίζονται για την αναζήτηση νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την περαιτέρω βελτίωση της πορείας της νόσου. Στην αναζήτηση αυτή συµπεριλαµβάνεται και η στόχευση της έντονης αγγειογενετικής δραστηριότητας που ανευρίσκεται στα κακοήθη νεοπλάσµατα. Ο διακεκριµένος ρόλος της αγγειογένεσης στη βιολογία του καρκίνου περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Folkman το 1971 ενώ το 1992 ο ίδιος επανήλθε µε την πρόταση ότι η ανάπτυξη των όγκων και οι µεταστάσεις τους στηρίζονται στην αγγειογενετική διαδικασία, την οποία υπέδειξε ως πρωταρχικό στόχο καταστολής για την αντιµετώπιση του καρκίνου.

12 Ως αγγειογένεση (angiogenesis) χαρακτηρίζεται η διαδικασία σχηµατισµού νέων αγγείων από ένα προϋπάρχον αγγειακό δίκτυο. Ο σχηµατισµός των αγγείων αυτών εξασφαλίζει τη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων για την οποία απαιτείται επαρκής τροφοδότησή τους µε οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά η οποία γίνεται δια µέσου των αιµοφόρων αγγείων. Μια ποικιλία παραγόντων φαίνεται να προκαλούν την έναρξη της αγγειογένεσης, µεταξύ των οποίων περιλαµβάνονται η υποξία, η ανοσοαπόκριση σε καταστάσεις φλεγµονής καθώς και γενετικές αλλοιώσεις και µεταλλάξεις. Είναι γενικά αποδεκτή σήµερα η άποψη του «αγγειογενετικού διακόπτη», ότι δηλαδή το έναυσµα της αγγειογένεσης δίνεται από τη διατάραξη της δυναµικής ισορροπίας των επαγωγέων και των αναστολέων της αγγειογένεσης σε βάρος των δεύτερων, µε αποτέλεσµα την «αφύπνιση των όγκων». Ο µηχανισµός που είναι υ- πεύθυνος για την έναρξη της αγγειογενετικής διαδικασίας δεν είναι ακόµη γνωστός. Αγγειογενετική δραστηριότητα παρατηρείται φυσιολογικά και είναι απαραίτητη κατά την ανάπτυξη και αναπαραγωγή των ιστών, την επούλωση τραυ- µάτων και όπως έχει αποδειχθεί παίζει πρωτεύοντα ρόλο σε καταστάσεις φλεγ- µονής. Όταν η αύξηση των µικροαγγείων είναι µη ελεγχόµενη, η αγγειογένεση είναι παθολογική και εµπλέκεται στην ανάπτυξη µη νεοπλασµατικών και, κυρίως, νεοπλασµατικών νοσηµάτων. Η αγγειογένεση, επί πολλά έτη, αποτέλεσε αντικείµενο έρευνας κυρίως στη µελέτη συµπαγών όγκων ενώ όσον αφορά τις αιµατολογικές κακοήθειες, οι βιβλιογραφικές αναφορές είναι πιο πρόσφατες. Πολλοί ερευνητές έχουν µελετήσει µέχρι σήµερα το ρόλο της αγγειογένεσης σε ποικίλα αιµατολογικά νοσήµατα της παιδικής ηλικίας αλλά και των ενηλίκων, όπως στα µυελοδυσπλαστικά σύνδροµα, τα µυελώµατα, τις οξείες και χρόνιες λευχαιµίες, χωρίς να είναι ξεκάθαρος ο ρόλος της σε όλες τις καταστάσεις. Η πρώτη αναφορά για την ύπαρξη πιθανής συσχέτισης της αγγειογένεσης µε την ΟΜΛ ανάγεται στο Από τότε ακολούθησαν διάφορες µελέτες προκειµένου να εκτιµηθεί περαιτέρω η συσχέτιση αυτή αλλά και η επίδραση της αγγειογένεσης στην παθογένεια, την πορεία και την πρόγνωση της νόσου. Τα 12

13 αποτελέσµατα ωστόσο είναι αντικρουόµενα και ο ακριβής ρόλος της αγγειογένεσης στην ΟΜΛ παραµένει ακόµη αδιευκρίνιστος. Στις περισσότερες, µέχρι σήµερα, µελέτες, η εκτίµηση της αγγειογένεσης γίνεται είτε άµεσα µε την µέτρηση του αριθµού των αγγείων σε οστεοµυελικές βιοψίες ασθενών µε ΟΜΛ, είτε έµµεσα µε τον ποσοτικό προσδιορισµό αγγειογενετικών παραγόντων που εµπλέκονται στην διαδικασία αυτή. Ο πιο σηµαντικός επαγωγέας της αγγειογένεσης είναι ο αυξητικός παράγοντας του αγγειακού ενδοθηλίου (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), ο οποίος αποτελεί πρωταρχικό µεσολαβητή της φυσιολογικής και παθολογικής αγγειογένεσης. Αυξηµένη έκφραση του VEGF έχει παρατηρηθεί σε διάφορες κακοήθειες όπως ο καρκίνος του µαστού, του πνεύµονα, του κεντρικού νευρικού συστήµατος, του παγκρέατος, των ωοθηκών, του νεφρού και της ουροδόχου κύστεως. Μέχρι σήµερα έχει αποδειχθεί η συµβολή του VEGF και των υποδοχέων του στην φυσιολογική αιµοποίηση αν και δεν έχει βρεθεί το µοριακό υπόστρω- µα της διαφοροποίησης και επιβίωσης των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων. Επίσης δεν έχει διευκρινισθεί ο ρόλος του αλλά και ο ρόλος της αγγειογένεσης στην ΟΜΛ και οι µέχρι τώρα µελέτες δίνουν αντιφατικά αποτελέσµατα. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η µελέτη της αγγειογένεσης σε ασθενείς µε ΟΜΛ ώστε να διασαφηνισθεί εάν και σε πιο βαθµό υπάρχει συµµετοχή της στην παθογένεια και την πρόγνωση της νόσου, αλλά και αν η στόχευση της αγγειογένεσης ή του VEGF µπορεί να αποτελέσει νέα θεραπευτική προσέγγιση στην αντιµετώπιση της ΟΜΛ. Για το λόγο αυτό προσδιορίσθηκε η συγκέντρωση της πρωτεΐνης του VEGF στον ορό ασθενών και τα επίπεδα mrna του παράγοντα στο µυελό των οστών ασθενών µε ΟΜΛ στη διάγνωση της νόσου και στην αιµατολογική ύφεση µετά από χηµειοθεραπεία, ενώ σε ορισµένους από αυτούς εκτιµήθηκε και η µικροαγγειακή πυκνότητα σε οστεοµυελικές βιοψίες. Ο προσδιορισµός της πρωτεΐνης του VEGF έγινε µε τη µέθοδο ELISA και η εκτίµηση της µικροαγγειακής πυκνότητας σε τοµές οστεοµυελικής βιοψίας µετά από ανοσοϊστοχηµική χρώση µε το µονοκλωνικό αντίσωµα CD34. Το ενδιαφέρον είναι ότι για τη µελέτη των επιπέδων mrna χρησιµοποιήθηκε για πρώτη φορά η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (Real Time 13

14 RT-PCR), µέθοδος µε υψηλή ευαισθησία και επαναληψιµότητα, µε µεγάλο πλεονέκτηµα την ταχύτητα µε την οποία αποδίδει αποτελέσµατα και δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισµού ακόµη και ιδιαίτερα χαµηλών επιπέδων του VEGF. Τα ερωτήµατα στα οποία έγινε προσπάθεια να δοθεί απάντηση είναι: Α) Εκφράζεται ο αγγειογενετικός παράγοντας VEGF στους ασθενείς µε ΟΜΛ και αν ναι, υπάρχει διαφορά της έκφρασης του παράγοντα στους ασθενείς σε σχέση µε τους µάρτυρες; Β) Μπορεί ο παράγοντας VEGF να αποτελέσει δείκτη της αγγειογενετικής δραστηριότητας στην ΟΜΛ; Γ) Μεταβάλλεται η έκφραση του παράγοντα στους ασθενείς µε ΟΜΛ µετά τη χηµειοθεραπεία και εφόσον επιτύχουν ύφεση; ) Σχετίζεται η έκφραση του VEGF µε την απάντηση των ασθενών στη θεραπεία, ώστε να µπορεί να αποτελέσει έναν πιθανό προγνωστικό δείκτη στην ΟΜΛ; Ε) Μπορεί ο VEGF να αποτελέσει µελλοντικό θεραπευτικό στόχο για τη αντιµετώπιση της ΟΜΛ; Ολοκληρώνοντας τη διδακτορική διατριβή µου θα ήθελα να εκφράσω τις ολόψυχες ευχαριστίες µου και τη βαθιά µου ευγνωµοσύνη στον επιβλέποντα Καθηγητή κ. Ιωάννη Κλωνιζάκη, ιευθυντή του Αιµατολογικού Εργαστηρίου της Β Παθολογικής Κλινικής του ΑΠΘ, που µε τίµησε µε την ανάθεση της διδακτορικής διατριβής και µε καθοδήγησε µε θέρµη κατά τη διάρκεια αυτής της προσπάθειας. Τον ευχαριστώ όχι µόνο για τις επιστηµονικές γνώσεις και εµπειρίες που µου µετέδωσε, αλλά και για το αµέριστο ενδιαφέρον του και την ηθική συµπαράσταση που µου παρείχε καθόλη την διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής µου. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στην Αν. Καθηγήτρια Παθολογίας-Αιµατολογίας κ. Στυλιανή Χαραλαµπίδου-Βρανίτσα για την καθοριστική συνεισφορά της, τη συνεχή εποπτεία, καθοδήγηση και ενθάρρυνσή της σε όλα τα στάδια της εργασίας. Η επιµονή της στην τελειότητα, θα αποτελεί πάντα για µένα το γνώµονα πλεύσης, στον αβέβαιο ωκεανό της ερευνητικής προσέγγισης. Ευχαριστώ ιδιαίτερα την Αν. Καθηγήτρια Παθολογίας-Αιµατολογίας κ. Ε- λισάβετ Ιωαννίδου-Παπαγιαννάκη για τις πολύτιµες και καθοριστικές επιστηµο- 14

15 νικές παρεµβάσεις της καθώς και την αµέριστη συµπαράστασή της που συνέβαλαν στην ολοκλήρωση της µελέτης. Η αγάπη και η επιµονή της για την µοριακή βιολογία στα πλαίσια της αιµατολογίας ήταν στοιχεία που τροφοδότησαν την προσπάθεια µας µε τον απαιτούµενο ενθουσιασµό για να τα καταφέρουµε. Ευχαριστώ θερµά την ιευθύντρια του Τοµέα Παθολογίας και ιευθύντρια της Β Παθολογικής Κλινικής του ΑΠΘ, Καθηγήτρια κ. Μαρία Ραπτοπούλου- Γιγή που µε δέχθηκε µε ευχαρίστηση να εκπονήσω την διατριβή µου στο Αιµατολογικό Εργαστήριο της Β' Παθολογικής Κλινικής και µου έδειξε ιδιαίτερη εµπιστοσύνη στις διάφορες φάσεις της πραγµατοποίησής της. Την ευχαριστώ επίσης ιδιαίτερα για την συνεχή υποστήριξή της, το ενδιαφέρον της και τις εύστοχες υποδείξεις και συµβουλές της για την ολοκλήρωση της διατριβής µου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά τον κ. Ιωάννη Βενιζέλο, αναπληρωτή διευθυντή του Παθολογοανατοµικού Εργαστηρίου του Ιπποκράτειου Νοσοκοµείου Θεσσαλονίκης που αφιέρωσε πολύτιµο χρόνο για την ιστολογική εκτίµηση των παρασκευασµάτων των οστεοµυελικών βιοψιών. Η βοήθεια και η συµβολή του στην εκµάθηση της εργαστηριακής µεθόδου της εκτίµησης της αγγειογένεσης ήταν ουσιώδης και πολύτιµη. Επίσης, ευχαριστώ ιδιαίτερα την Επιµελήτρια Α Ε.Σ.Υ. κ. Ευθυµία Βλαχάκη, για την πολύτιµη βοήθειά της στην επιλογή των ασθενών και στη συλλογή των δειγµάτων καθώς και τις πολύτιµες γνώσεις που µου µετάφερε σε κλινικά και εργαστηριακά θέµατα. Η συνεργασία µαζί της ήταν άψογη και η βοήθειά της καθοριστική για την πραγµατοποίηση της διατριβής µου. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ. Ευδοκία Μανδαλά, Επ. Καθηγήτρια Αιµατολογίας για την σηµαντική συµβολή της στη συλλογή δειγµάτων από ασθενείς µε οξεία µυελογενή λευχαιµία της Παθολογικής Κλινικής του ΑΠΘ. Ευχαριστώ θερµά τον Αν. Καθηγητή Παθολογίας-Γηριατρικής κ. ηµήτρη Οικονοµίδη για την πολύτιµη βοήθειά του στη συλλογή δειγµάτων. Ευχαριστώ επίσης θερµά τα υπόλοιπα µέλη της επταµελούς επιτροπής, την Λέκτορα Αιµατολογίας κ. Μαρία Παπαϊωάννου, τον Αν. Καθηγητή Παθολογίας-Αιµατολογίας κ. Αθανάσιο Παπαδόπουλου και την Καθηγήτρια Βιοπαθολογίας κ. Ελένη Ορφανού-Κουµερκερίδου για την προθυµία τους να συµµετάσχουν στην αξιολόγηση της παρούσας διατριβής, καθώς και για την εποικοδο- 15

16 µητική κριτική και τις χρήσιµες παρατηρήσεις τους. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά τον βιολόγο κ. Αθανάσιο Καλογερίδη για την σηµαντική βοήθειά του στην εφαρµογή των µοριακών µεθόδων, καθώς και για τις ουσιαστικές συµβουλές του για τη διενέργεια του πειραµατικού µέρους της µελέτης. Ένα µεγάλο ευχαριστώ θα ήθελα να εκφράσω στον ειδικευόµενο ιατρό κ. Φίλιππο Κλωνιζάκη, ο οποίος εκτός από σηµαντικός συνεργάτης στάθηκε και ένας πολύτιµος φίλος. Με τις ατελείωτες συζητήσεις µας εντός και εκτός του αντικειµένου της παρούσας µελέτης, κατορθώσαµε να γεφυρώσουµε το χάσµα ανάµεσα στη µοριακή βιολογία και την κλινική ιατρική και να καταλάβουµε ότι η έρευνα πάντα βρίσκει τη διέξοδο της, ακόµη και όταν τα πειράµατα δεν δουλεύουν όπως θα θέλαµε. Από τη θέση αυτή θα ήθελα να ευχαριστήσω ολόψυχα την βιολόγο κ. Αλεξάνδρα Τσίγκα για τον ιδιαίτερα σηµαντικό ρόλο που έπαιξε τόσο στην έναρξη όσο και στην ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής. εν ήταν απλά συνοδοιπόρος στην προσπάθεια µου αλλά η φίλη που ζήσαµε πολλά µαζί εντός και εκτός εργαστηρίου. Την ευχαριστώ για τις πολύτιµες συµβουλές της, την συµπαράστασή της και την άψογη συνεργασία που είχαµε καθόλη τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσας διατριβής. Ιδιαίτερα επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ. Ιωάννα Χριστοδούλου, αφενός για την βοήθεια που µου παρείχε στη συλλογή του υλικού και στις εργαστηριακές εξετάσεις, και αφετέρου για το γέλιο της που ήταν πάντα η νότα που έκανε τη µέρα µας να φαίνεται ευχάριστη, όσο δύσκολη και αν προβλέπονταν. Επίσης, αισθάνοµαι την ανάγκη να εκφράσω τις θερµές µου ευχαριστίες στην Αν. Καθηγήτρια Βιολογίας κ. Αναστασία Κουβάτση για την πολύτιµη βοήθεια και τις συµβουλές της στη διενέργεια των τεχνικών της µοριακής βιολογίας καθώς και για τη συνεχή υποστήριξη και συµπαράστασή της. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους ειδικευόµενους ιατρούς κ. Αλέξανδρο Σαραντόπουλο, κ. Κωνσταντίνο Τσέλιο και κ. Στέφανο ηµούδη για την σηµαντική βοήθειά τους κατά τη διάρκεια της διατριβής και για την συµπαράσταση και ενθάρρυνση που µου προσέφεραν. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στην κ. Κωτσίδου Ρενάτα για το αµείωτο ενδιαφέρον και υποστήριξή της καθό- 16

17 λη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής. Επίσης, ευχαριστώ τη Βιοχηµικό κ. Ιωάννα Κυριακοπούλου για την συνεργασία που είχαµε κατά τη διάρκεια της διατριβής καθώς και τον ειδικευόµενο ιατρό κ. Μιχάλη ιαµαντίδη για την συµβολή του στην στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων της µελέτης. Από τη θέση αυτή θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες µου στον Πρόεδρο και στα µέλη του.σ. του Ιδρύµατος Μποδοσάκη για την έµπρακτη βοήθειά τους και για τη χορηγία µηχανηµάτων και εξοπλισµού που όχι µόνο ήταν απαραίτητα για την εφαρµογή των ερευνητικών πρωτοκόλλων αλλά µας επέτρεψαν να πραγµατοποιήσουµε τις επιστηµονικές µας ιδέες και τα όνειρά µας για έρευνα. Επιπλέον, ευχαριστώ το Ίδρυµα Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ.) για την οικονοµική υποστήριξη µέσω της υποτροφίας στην ειδικότητα «Ιατρική Βιολογία» που µου παρείχε για την εκπόνηση της διδακτορικής µου διατριβής. Τέλος αυτή η διατριβή δεν θα ήταν δυνατό να εκπονηθεί, χωρίς την αµέριστη συµπαράσταση των γονέων µου Γρηγορίου και Φωτεινής και της αδελφής µου Αθηνάς. Τους ευχαριστώ ολόψυχα πρώτα από όλα για την αµέριστη αγάπη, βοήθεια και κατανόησή τους, αλλά και για την ηθική και πρακτική υποστήριξή τους για να κάνω τα όνειρα και τις φιλοδοξίες µου πραγµατικότητα. Η ενθάρρυνση τους και κυρίως η αντοχή τους να µε ακούνε στις δύσκολες στιγµές, ε- λάττωνε το άγχος και µου έδινε ώθηση για νέα προσπάθεια. Ήταν οι άνθρωποι που πίστεψαν σε µένα και µε στήριξαν σε δύσκολες στιγµές. Για αυτό το λόγο τους αφιερώνω αυτή τη διατριβή, ελπίζοντας να φανώ στο µέλλον αντάξια της εµπιστοσύνης που µου έδειξαν. 17

18

19 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

20

21 1. ΟΞΕΙΑ ΜΥΕΛΟΓΕΝΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ Οι λευχαιµίες αποτελούν µια οµάδα διαταραχών που χαρακτηρίζονται από τη συσσώρευση άωρων αιµοποιητικών κυττάρων στο µυελό των οστών. Αυτά τα κύτταρα µπορούν να προκαλέσουν µυελική ανεπάρκεια, αυξηµένο, συνήθως, αριθµό λευκών αιµοσφαιρίων στο περιφερικό αίµα και να διηθήσουν διάφορα όργανα. Η κύρια ταξινόµηση των λευχαιµιών είναι η διάκρισή τους σε οξείες και χρόνιες, ανάλογα µε την ωριµότητα των κυττάρων και την επιθετικότητά τους. Οι οξείες λευχαιµίες, στις οποίες υπάρχουν, συνήθως, περισσότερα από 50% πολύ άωρα κύτταρα (βλάστες) στον µυελό των οστών κατά την κλινική εκδήλωση της νόσου περαιτέρω υποδιαιρούνται ανάλογα µε το είδος των βλαστών σε οξείες µυελογενείς (µυελοβλαστικές) λευχαιµίες (ΟΜΛ) και σε οξείες λεµφογενείς (λεµφοβλαστικές) λευχαιµίες (ΟΛΛ) και έχουν θανατηφόρο εξέλιξη αν αφεθούν χωρίς θεραπεία. Οι χρόνιες λευχαιµίες αφορούν δύο κύριους τύπους, την χρόνια µυελογενή λευχαιµία (ΧΜΛ) και την χρόνια λεµφογενή λευχαιµία (ΧΛΛ), χαρακτηρίζονται από ώριµα κύτταρα και έχουν συνήθως βραδεία πορεία 1. Η οξεία µυελογενής λευχαιµία (ΟΜΛ) δεν είναι µια απλή νόσος, αλλά µια ετερογενής οµάδα νεοπλασµατικών διαταραχών που χαρακτηρίζονται από τον πολλαπλασιασµό και την συσσώρευση άωρων αιµοποιητικών κυττάρων, κυρίως βλαστών, που αποτυγχάνουν να διαφοροποιηθούν φυσιολογικά 2, στο µυελό των οστών και το περιφερικό αίµα, αλλά και άλλα παρεγχυµατικά όργανα όπως α- ναφέρθηκε. Με βάση τις κυτταρικές σειρές που προέρχονται από το αρχέγονο µυελοειδές αιµοποιητικό κύτταρο, δηλαδή την κοκκιώδη, την ερυθροκυτταρική, την µονοκυτταρική ή την µεγακαρυοκυτταρική σειρά, η ΟΜΛ µπορεί να διαφοροποιηθεί σε αντίστοιχες κλινικές µορφές (Εικόνα 1). Τα κακοήθη αυτά κύτταρα βαθµιαία αντικαθιστούν και αναστέλλουν την ανάπτυξη και την ωρίµανση των φυσιολογικών προδρόµων µορφών της ερυθράς, της µυελοειδούς και της µεγακαρυοκυτταρικής σειράς ή δηµιουργούν ανεπάρκεια της λειτουργίας των διηθηµένων οργάνων. Η κλινική αξιολόγηση, η θεραπεία και η πρόγνωση των ασθενών µε ΟΜΛ έχουν αλλάξει δραµατικά τις τελευταίες δύο δεκαετίες. Μοριακές, κυτταρογενε- 21

22 τικές και ανοσολογικές µελέτες έχουν συνεισφέρει στην κατανόηση της παθογένεσης και της πρόγνωσης των ασθενών µε ΟΜΛ και κατ επέκταση στην αντι- µετώπισή τους. Παρά τις προόδους αυτές, ωστόσο ένα ποσοστό περίπου 25% των ασθενών θα καταλήξουν σε 12 µε 18 µήνες από την έναρξη της νόσου. Το γεγονός αυτό οδήγησε σε περαιτέρω έρευνες για την ανεύρεση νέων, περισσότερο αποτελεσµατικών και λιγότερο τοξικών θεραπευτικών προσεγγίσεων για την βελτίωση της πρόγνωσης της νόσου. Εικόνα 1: ιαφοροποίηση του αρχέγονου αιµοποιητικού κυττάρου στις αντίστοιχες κλινικές µορφές της ΟΜΛ. 1.1 Επιδηµιολογία-Αιτιολογία Οι λευχαιµίες αποτελούν το 10% περίπου των κακοήθων νεοπλασιών, ενώ η ΟΜΛ το 34% των οξειών λευχαιµιών και προσβάλλει κυρίως ενηλίκους σε ποσοστό περίπου 90%. Όσον αφορά το φύλο, οι άνδρες προσβάλλονται συχνότερα από τις γυναίκες σε οποιαδήποτε ηλικιακή οµάδα. Οι περισσότερες περιπτώσεις ΟΜΛ εκδηλώνονται de novo και συνοδεύονται από κυτταρογενετικές ανωµαλίες όπως µεταθέσεις, αναστροφές, ελλείψεις 22

23 και άλλα. Ένας αριθµός περιβαλλοντικών παραγόντων έχει εµπλακεί στην πρόκληση ορισµένων τύπων λευχαιµίας. Η ιονίζουσα ακτινοβολία ήταν η πρώτη αιτία που συσχετίσθηκε µε τη λευχαιµία. Αυτό έγινε εµφανές στους επιζήσαντες από την ατοµική βόµβα στη Χιροσίµα και το Ναγκασάκι, οι οποίοι εµφάνισαν κυρίως ΟΜΛ 1,5 έτος µετά την έκθεση στην ακτινοβολία, µε µέγιστη συχνότητα στα 6 µε 7 έτη 3. Ενοχοποιούνται επίσης το βενζόλιο και τα παράγωγά του µετά από µακροχρόνια έκθεση, ενώ διερευνάται και η δράση άλλων χηµικών ουσιών όπως χρωστικές µαλλιών και κυρίως οι σκούρες, εντοµοκτόνα και άλλα. Κληρονοµικά νοσήµατα προδιαθέτουν στην εµφάνιση ΟΜΛ όπως είναι το σύνδροµο Down, τα νοσήµατα ανοσολογικής ανεπάρκειας και τα νοσήµατα µε διαταραχές στο διορθωτικό µηχανισµό του DNA, όπως η αναιµία Fanconi και το σύνδροµο Bloom. ευτεροπαθής ΟΜΛ έχει επιβεβαιωθεί µετά χηµειοθεραπεία (κυρίως αλκυλιωτικοί παράγοντες και επιποδοφυλλοτοξίνες) που συνδυάσθηκε ή όχι µε ακτινοβολία σε διάφορα νοσήµατα όπως το πολλαπλούν µυέλωµα, ο καρκίνος του πνεύµονα, του µαστού, των ωοθηκών και η νόσος του Hodgkin. ευτεροπαθής ΟΜΛ µπορεί επίσης να αναπτυχθεί µετά ορισµένα αιµατολογικά νοσήµατα ό- πως τα µυελοδυσπλαστικά σύνδροµα (Μ Σ), τα µυελοϋπερπλαστικά νοσήµατα (ΜΥΝ) και η παροξυσµική νυκτερινή αιµοσφαιρινουρία 1.2 Μοριακή προσέγγιση της παθογένειας της ΟΜΛ Αρχέγονο λευχαιµικό κύτταρο Η ΟΜΛ θεωρείται παραδοσιακά ότι προέρχεται από αρχέγονα ή πρώιµα αιµοποιητικά κύτταρα, πρόσφατα όµως επιτεύχθηκε πειραµατικά η αποµόνωση και η µελέτη του «αρχέγονου λευχαιµικού κυττάρου» (ΑΛΚ). Το «αρχέγονο λευχαιµικό κύτταρο» ανεξάρτητα από τη µορφή της ΟΜΛ από την οποία προέρχεται, εµφανίζει τον ίδιο φαινότυπο: CD34+, CD38-, CD71-, HLA-DR-, CD90-, CD117- και CD Η έκφραση των τριών τελευταίων αντιγόνων διαφοροποιεί το λευχαιµικό αρχέγονο κύτταρο από το φυσιολογικό. Πρόσφατες µελέτες ανέδειξαν ειδικά αναπτυξιακά, κυτταρικά και µοριακά χαρακτηριστικά των αρχέγονων λευχαιµικών κυττάρων. Κοινή ιδιότητα των 23

24 αρχέγονων λευχαιµικών κυττάρων, ανεξάρτητα µε τους FAB υποτύπους, είναι αυτή της αυτοανανέωσης 5,6. Η ιδιότητα αυτή είναι σε αρκετές περιπτώσεις αποτέλεσµα της ύπαρξης χιµαιρικών γονιδίων ή µεταλλάξεων. Για παράδειγµα χι- µαιρικές πρωτεΐνες που επάγουν την έκφραση των β και γ κατενινών, που παίζουν σηµαντικό ρόλο στην αυτοανανέωση των φυσιολογικών και των λευχαιµικών αρχέγονων κυττάρων είναι οι RUNX1-MTG8, PML-RARα, PLZF-RARα 7. Ωστόσο, σε αρκετές περιπτώσεις δεν ανευρίσκονται µεταλλάξεις ή χιµαιρικά γονίδια που ευθύνονται για αυξηµένη αυτοανανέωση και σε αυτές τις περιπτώσεις η αυτοανανέωση φαίνεται ότι είναι «ενδογενής» ιδιότητα του αρχέγονου λευχαιµικού κυττάρου. Όπως και τα φυσιολογικά αρχέγονα κύτταρα, τα αρχέγονα λευχαιµικά κύτταρα, που διαχωρίζονται από τον κύριο όγκο των λευχαιµικών βλαστών, είναι κύτταρα σε ηρεµία και αυτή η ιδιότητά τους πιθανόν να έχει σχέση µε τη συχνή υποτροπή της ΟΜΛ 8,9. Μοναδικά µοριακά χαρακτηριστικά των αρχέγονων λευχαιµικών κυττάρων είναι η επαγωγή γονιδίων που κωδικοποιούν τις κινάσες IRF-1 και DAP καθώς και η υψηλή δραστικότητα NF-κB 10. Αυτά τα ειδικά µοριακά χαρακτηριστικά των αρχέγονων λευχαιµικών κυττάρων θα µπορούσαν ενδεχοµένως να αποτελέσουν στόχους µελλοντικών θεραπειών Προέλευση του αρχέγονου λευχαιµικού κυττάρου Μια πολύ δηµοφιλής άποψη είναι ότι τα κύτταρα αυτά προέρχονται από τα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα, επειδή έχουν όπως και τα τελευταία τη δυνατότητα της αυτοανανέωσης, αυξηµένη ικανότητα πολλαπλασιασµού και είναι σχετικά µακρόβια. Εφόσον ευσταθεί η θεωρία της πολυσταδιακής λευχαιµογένεσης, µόνο µακρόβια κύτταρα έχουν την δυνατότητα συσσώρευσης πολλαπλών µεταλλάξεων που τα µετατρέπουν σε λευχαιµικά κύτταρα (Εικόνα 2). Ωστόσο, νέα πειραµατικά δεδοµένα τεκµηριώνουν ότι καθαροί πληθυσµοί πρώιµων δεσµευµένων αιµοποιητικών κύτταρων (GMP, CMP), όταν εισάγονται µε κατάλληλους φορείς σε ποντίκια προκαλούν ΟΜΛ in vivo 11. Συνεπώς, από µηχανιστική άποψη, εφόσον το λευχαιµικό αιµοποιητικό κύτταρο προέρχεται από το αρχέγονο αιµοποιητικό κύτταρο έχει ήδη την ιδιότητα 24

25 της αυτοανανέωσης και οι αρχικές µεταλλάξεις επηρεάζουν ενδεχοµένως την επιβίωση ή τη διαφοροποίησή του. Όταν το λευχαιµικό κύτταρο προέρχεται από πρώιµα δεσµευµένα αιµοποιητικά κύτταρα, θεωρείται ότι οι αρχικές µεταλλάξεις προσφέρουν στα κύτταρα αυτά την ιδιότητα της αυτοανανέωσης. Η διαφορετική αυτή προέλευση των λευχαιµικών κυττάρων, εάν ισχύει πραγµατικά, οδηγεί στην εµφάνιση λευχαιµίας µε διαφορετικές βιολογικές ιδιότητες που θα µπορούσε να απαντά διαφορετικά στις διάφορες θεραπείες. Εικόνα 2: Φυσιολογική αιµοποίηση, λευχαιµογένεση και διαφοροποίηση του αρχέγονου λευχαιµικού κυττάρου Πολυσταδιακή παθογένεση στην ΟΜΛ Υπάρχουν πολλές µαρτυρίες από µοντέλα ΟΜΛ σε ποντίκια, κλινικές παρατηρήσεις και σπάνια γενετικά σύνδροµα ότι δεν αρκεί µια γενετική βλάβη για την πρόκληση της ΟΜΛ 12,13,14. Σε πολλούς ασθενείς, ήδη κατά τη διάγνωση, ανιχνεύονται περισσότερες από µια γενετικές ανωµαλίες. Οι γενετικές βλάβες που γνωρίζουµε έως τώρα οµαδοποιούνται σε δύο κατηγορίες. Η πρώτη αφορά µεταλλάξεις που προσφέρουν πολλαπλασιαστικό πλεονέκτηµα ή πλεονέκτηµα επιβίωσης στα κύτταρα και προκαλούν διαταραχές µεταβίβασης σήµατος. Η δεύτερη περιλαµβάνει µεταλλάξεις που επηρεάζουν τη 25

26 διαφοροποίηση και προσδίδουν την ιδιότητα αυτοανανέωσης στα κύτταρα και πρόκειται για µεταλλάξεις µεταγραφικών παραγόντων. Μεταλλάξεις της ίδιας κατηγορίας σπάνια συµβαίνουν στον ίδιο άρρωστο, ενώ συχνά συνυπάρχουν µεταλλάξεις και των δύο διαφορετικών οµάδων ιαταραχές µεταβίβασης σήµατος Στην οµάδα των διαταραχών µεταβίβασης σήµατος ανήκουν µεταλλάξεις στη σηµατοδοτική οδό RAS, µεταλλάξεις πρωτεϊνικών κινασών (συχνότερες οι µεταλλάξεις στις κινάσες KIT, FLT-3 και FMS), απώλεια της λειτουργικότητας του NF-1 και µεταλλάξεις που οδηγούν σε αυξηµένη λειτουργία της αιµοποιητικής φωσφατάσης SHP-2. Συνολικά, µεταλλάξεις αυτής της κατηγορίας ανιχνεύονται στο 50% των περιπτώσεων της ΟΜΛ 15. Επιπλέον, µε ελάχιστες εξαιρέσεις, τέτοιου είδους βλάβες δεν συνυπάρχουν στον ίδιο ασθενή Μεταλλάξεις στο επαγωγικό µονοπάτι RAS Η πρωτεΐνη RAS ανήκει σε µια οµάδα µορίων που λέγονται φυσικοί προσαρµοστές. Είναι συνδεδεµένη σε υποδοχείς µε δράση κινάσης της τυροσίνης. Η πρόσδεση του συνδέτη στον υποδοχέα οδηγεί σε ενεργοποίηση της πρωτεΐνης RAS που λειτουργεί σαν µοριακός διακόπτης. Ειδικότερα παλινδροµεί ανάµεσα στην ενεργό και την ανενεργό διαµόρφωσή της. Οι µεταλλάξεις στην πρωτεΐνη RAS έχουν κοινό γνώρισµα ότι διατηρούν την πρωτεΐνη σε συνεχώς ενεργοποιηµένη κατάσταση. Η πρωτεΐνη RAS παραµένει ενεργοποιηµένη και στέλνει συνεχώς µηνύµατα στον πυρήνα που προκαλούν αλλαγές στον κυτταροσκελετό, αύξηση του πολλαπλασιασµού, αναστολή της απόπτωσης και ενεργοποίηση της µεταγραφής (Εικόνα 3). Κοινό γνώρισµα πολλών κακοηθειών της µυελικής σειράς είναι η παρουσία µεταλλάξεων σε πολλά διαφορετικά µόρια που εµπλέκονται στην οδό της πρωτεΐνης RAS (όπως π.χ. οι κινάσες TEL/PDGFbetaR και BCR/ABL) 16,17. 26

27 Εικόνα 3: Eπαγωγικό µονοπάτι RAS Μεταλλάξεις πρωτεϊνικών κινασών Οι πρωτεϊνικές κινάσες διακρίνονται σε 3 τύπους: υποδοχείς τύπου 3, κινάσες της οικογένειας FLT-3 και κινάσες ΚIΤ. Όλες οι κινάσες έχουν παρόµοια βασική δοµή και αποτελούνται από µια εξωκυττάρια περιοχή για πρόσδεση του συνδέτη, µια διαµεµβρανική περιοχή και µια ενδοκυττάρια περιοχή µε ενζυµική δράση κινάσης. Η όλη κατάσταση θυµίζει τη λειτουργία ενός µοριακού διακόπτη ο οποίος ρυθµίζεται µε εναλλαγές φωσφορυλίωσης αποφωσφορυλίωσης. Γενικά οι κινάσες καταλύουν τη µεταφορά φωσφορικών οµάδων από το ΑΤΡ σε ειδικά αµινοξέα των πρωτεϊνών στόχων µε αποτέλεσµα να τις ενεργοποιούν, ενώ το σήµα ενεργοποίησης διακόπτεται από φωσφατάσες που αφαιρούν τη φωσφορική οµάδα. Ένας πολύ κρίσιµος στόχος είναι ο µεταγραφικός παράγοντας STAT. Ο φωσφορυλιωµένος STAT εισέρχεται στον πυρήνα, όπου ενεργοποιεί τη µεταγραφή ποικίλων γονιδίων κρίσιµων για τον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Οι µεταλλάξεις της κινάσης FLT-3 ανιχνεύονται σε ποσοστό 20-38% των περιπτώσεων ΟΜΛ. Πρόκειται κυρίως για µεταλλάξεις που έχουν ως αποτέλεσµα τον ανεξάρτητο από το συνδέτη διµερισµό του υποδοχέα και τη συνεχή µεταβίβαση σήµατος µέσω των οδών RAS/MAPK, STAT και PI3K/AKT, µε απο- 27

28 τέλεσµα το πλεονέκτηµα πολλαπλασιασµού και επιβίωσης των κυττάρων που έχουν αυτές τις µεταλλάξεις 18, Μεταλλάξεις µεταγραφικών παραγόντων Ο καθορισµός της σειράς, δηλαδή η δέσµευση των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων να ακολουθήσουν µία συγκεκριµένη οδό διαφοροποίησης, ουσιαστικά προϋποθέτει ενεργοποίηση της µεταγραφής επιλεγµένων γονιδίων µε τη δράση ειδικών, κατά κυτταρική σειρά, µεταγραφικών παραγόντων Μεταλλάξεις του Core Binding Factor (CBF) Ένας πολύ κρίσιµος µεταγραφικός παράγοντας για τη µυελική σειρά είναι το ετεροδιµερές των πρωτεϊνών RUNX1 (παλαιότερα ήταν γνωστή ως AML1) και CBFβ. Οι στόχοι του CBF είναι γονίδια ιών, µεµβρανικές πρωτεΐνες, κυτταροκίνες καθώς και γονίδια ειδικά της µυελικής σειράς όπως για παράδειγµα η µυελοϋπεροξειδάση (MPO). Ο CBF εκφράζεται στον αιµοποιητικό ιστό και διαδραµατίζει κρίσιµο ρόλο στην αιµοποίηση 12. Ο CBF συµµετέχει σε πολλές µεταλλάξεις που ανιχνεύονται στην ΟΜΛ. Οι γενετικές βλάβες αυτού του παράγοντα είναι πολύ συχνές σε ειδικούς κατά FAB υποτύπους. Είναι αποτέλεσµα της µετάθεσης (8;21) που διαταράσσει την πρωτεΐνη RUNX1 και παρατηρείται στο 10 15% των περιπτώσεων ΟΜΛ, της α- ναστροφής του χρωµοσώµατος 16 που διαταράσσει την πρωτεΐνη CBFi και ανιχνεύεται σε ποσοστό περίπου 8%, ή της µετάθεσης (3;21) (Εικόνα 4). Οι χιµαιρικές πρωτεΐνες που προκύπτουν από αυτές τις µεταθέσεις διαθέτουν ανώµαλη µεταγραφική δράση. Συγκεκριµένα, η χιµαιρική πρωτεΐνη βρίσκεται προσδεδε- µένη στους υποκινητές των γονιδίων-στόχων µε αποτέλεσµα τη µεταγραφική καταστολή τους (c-fms, p14arf και C/EBPα) 20,21,22. 28

29 Εικόνα 4: Οι χρωµοσωµικές µεταθέσεις και οι χιµαιρικές πρωτεΐνες που προκύπτουν, οι οποίες σχετίζονται µε τον µεταγραφικό παράγοντα CBF Μεταλλάξεις του Α υποδοχέα του ρετινοϊκού οξέος (RARα) Η oξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία (ΟΠMΛ) χαρακτηρίζεται από αυξη- µένη αυτοανανέωση, ελαττωµένο κυτταρικό θάνατο και κυρίως αναστολή της διαφοροποίησης στο στάδιο του προµυελοκυττάρου. Η αναστολή της διαφοροποίησης που χαρακτηρίζει τη νόσο αίρεται µε τη χορήγηση ρετινοϊκού οξέος (RA). Το RA είναι ο συνδέτης της πρωτεΐνης RARα, η οποία είναι υποδοχέας στεροειδών τύπου II και ανήκει στην ευρύτερη οικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων. Oι υποδοχείς αυτοί έχουν κρίσιµο ρόλο στην αντίληψη εξωκυττάριων σηµάτων για αύξηση και διαφοροποίηση και γενικά θεωρούνται ως ρυθµιστές της µεταγραφής των γονιδίων (transcriptional regulators). Όλοι οι υποδοχείς αυτής της οµάδας έχουν κοινό γνώρισµα ότι δρουν κυρίως ως ετεροδιµερή. Συγκεκριµένα, στην περίπτωση των υποδοχέων των ρετινοειδών, το ετεροδιµερές που σχηµατίζεται αποτελείται από τις πρωτεΐνες RAR και RXR. Το ετεροδιµερές βρίσκεται προσκολληµένο µόνιµα σε ειδικές αλληλουχίες (RAREs) στους υποκινητές των γονιδίων στόχων. Όταν απουσιάζει ο συνδέτης (RA), το ετεροδιµερές που βρίσκεται πάνω στο DNA προσελκύει έναν ειδικό καταστολέα. Το σύµπλοκο αυτό καταστέλλει τη µεταγραφή του γονιδίου στόχου, εφόσον καθιστά το DNA απροσπέλαστο στους µεταγραφικούς παράγοντες. Αντίθετα, µε την προσθήκη ακετυλοµάδων, «ανοίγει» το DNA και αφήνεται εκτεθειµένο στη δράση µεταγραφικών παραγόντων. Η πρωτεΐνη RARα, παρότι δεν είναι αναγκαία στην ανάπτυξη των µυελικών κυττάρων, δρα σαν «µοριακός ρεοστάτης» και ρυθµίζει τη διαφοροποίηση των 29

30 κυττάρων της µυελικής σειράς. Υπό κανονικές συνθήκες, το ρετινοϊκό οξύ που υπάρχει σε συγκέντρωση ~10-8 είναι αρκετό για τη διαφοροποίηση των µυελικών κυττάρων. Στην ΟΠΜΛ παρατηρείται αναστολή της διαφοροποίησης στο στάδιο του προµυελοκυττάρου και αυξηµένη αυτοανανέωση. Η αναστολή της διαφοροποίησης είναι αποτέλεσµα της ανώµαλης κινητοποίησης κατασταλτικών συµπλόκων σε κρίσιµα γονίδια στόχους. Η πρωτεΐνη PML, όπως και οι άλλες πρωτεΐνες «συνοδοί» της RARα στην ΟΠΜΛ, επιτρέπουν στη χιµαιρική πρωτεΐνη Χ/RARα να σχηµατίζει ετεροδιµερή µε τις RXR. Η PML-RARα δεν αντιπροσωπεύει απλώς µια επικρατούσα µεταλλαγµένη µορφή της RARα αλλά και µετάλλαξη επαύξησης λειτουργίας µε τη δυνατότητα να καταστέλλει ευρύ φάσµα γονιδίων. Επιπλέον, σε αντίθεση µε τη φυσιολογική RARα, η PML-RARα έχει την ιδιότητα να κινητοποιεί DNA µεθυλοτρανσφεράσες σε εκκινητές γονιδίων, συµβάλλοντας έτσι στην αποτελεσµατική και παρατεταµένη καταστολή τους. Από τις ίδιες µελέτες φαίνεται ότι οι χιµαιρικές πρωτεΐνες ενεργοποιούν άλλα γονίδια µάλλον έµµεσα, επειδή ανταγωνίζονται για τα κατασταλτικά σύ- µπλοκα. Πολλά από τα γονίδια που ενεργοποιούνται επάγουν την αυτοανανέωση. ιαγονιδιακά ζώα τα οποία φέρουν το χιµαιρικό γονίδιο PML-RARα εµφανίζουν διαταραχές της αιµοποίησης που διακρίνονται σε δύο φάσεις: (i) ένα προλευχαιµικό στάδιο µε χαρακτηριστικά µυελοϋπερπλαστικού συνδρόµου που αναπτύσσεται σε όλα τα ζώα, (ii) έκδηλη λευχαιµία, ως εξέλιξη του µυελοϋπεπλαστικού συνδρόµου, σε ποσοστό 10% των διαγονιδιακών ζώων 23,24. Η λευχαιµία αυτή έχει µορφολογικά χαρακτηριστικά ΟΠΜΛ και είναι ευαίσθητη στο ATRA. Το συµπέρασµα που προκύπτει είναι ότι η παρουσία της PML-RARα είναι αναγκαία αλλά όχι και επαρκής συνθήκη για την ανάπτυξη της ΟΠΜΛ Συµπληρωµατικότητα των γενετικών βλαβών στην ΟΜΛ Τα τελευταία χρόνια κερδίζει έδαφος η θεωρία της πολυσταδιακής λευχαι- µογένεσης, δηλαδή ότι για την εµφάνιση της ΟΜΛ συχνά δρουν συνεργικά µεταλλάξεις µεταγραφικών παραγόντων µε µεταλλάξεις που επηρεάζουν την οδό µεταβίβασης σήµατος. Συνηγορητική υπέρ αυτής της θεωρίας ήταν η παρατήρηση ότι αρκετοί ασθενείς µε ΟΠΜΛ εµφανίζουν µεταλλάξεις της πρωτεϊνικής 30

31 κινάσης FLT3. Έτσι διαµορφώθηκε η άποψη ότι η συνύπαρξη µιας µετάλλαξης που προσφέρει πολλαπλασιαστικό πλεονέκτηµα ή/και πλεονέκτηµα επιβίωσης στα κύτταρα (FLT3-ITD) µε µια µετάλλαξη που αναστέλλει τη διαφοροποίηση (PML-RARα) οδηγεί σε ανάπτυξη της ΟΜΛ (Εικόνα 5). Συµπερασµατικά, η µοριακή παθογένεση της ΟΜΛ είναι περίπλοκη. Παρόλα αυτά, οι διάφορες γενετικές βλάβες που έχουν περιγραφεί «συγκλίνουν» στο ίδιο σύνολο ιδιοτήτων του λευχαιµικού κυττάρου. Μερικές φορές παρατηρείται άµεση συσχέτιση µεταξύ της µοριακής βλάβης και της βιολογικής διεργασίας, ενώ άλλοτε η µοριακή βάση της βιολογίας του νοσήµατος είναι ασαφής ή εντελώς άγνωστη. Η κατανόηση αυτών των σχέσεων αναµένεται να επιτρέψει την ανάπτυξη στοχευµένων, πιο ειδικών θεραπειών για την ΟΜΛ. Σήµερα, εκδηλώνεται µεγάλο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη φαρµάκων τα οποία στοχεύουν την αναστολή της διαφοροποίησης και το πλεονέκτηµα πολλαπλασιασµού των λευχαιµικών κυττάρων. Παράλληλα, ιδιαίτερα ελκυστικές θεραπευτικές επιδιώξεις για το άµεσο µέλλον είναι η αποκατάσταση της γενωµικής σταθερότητας, η ε- παγωγή της ειδικής απόπτωσης των λευχαιµικών κυττάρων και η αποκατάσταση των διαταραχών του κυτταρικού κύκλου. Εικόνα 5: Η θεωρία των «δύο χτυπηµάτων» στην λευχαιµογένεση. 1.3 Κλινική εικόνα Τα συµπτώµατα και τα σηµεία που εµφανίζονται στους ασθενείς µε οξεία λευχαιµία οφείλονται στη διήθηση του µυελού των οστών, αλλά πιθανόν και άλλων οργάνων, από τα λευχαιµικά κύτταρα, µε αποτέλεσµα την ανεπάρκεια της φυσιολογικής αιµοποίησης που θα προκαλέσει αναιµία, θροµβοπενία και πτώση του αριθµού των ουδετεροφίλων. Ως συνέπεια είναι η εµφάνιση των συ- 31

32 µπτωµάτων της αναιµίας, αιµορραγίες και λοιµώξεις. Μεταβολικές διαταραχές είναι δυνατόν επίσης να εµφανισθούν. Συνήθως προηγείται ένα βραχύ ιστορικό µε µεγάλη αδυναµία, νυκτερινούς ιδρώτες, ανορεξία και σπανιότερα απώλεια βάρους. Πυρετός εµφανίζεται σε ποσοστό που ξεπερνά το 20% και πιθανόν να οφείλεται σε λοίµωξη ή σε αυξη- µένο µεταβολισµό εξαιτίας της υπερπαραγωγής των νεοπλασµατικών κυττάρων. Αιµορραγικές εκδηλώσεις που οφείλονται κυρίως στο χαµηλό αριθµό αιµοπεταλίων µπορεί να εκδηλωθούν µε πετέχειες και εκχυµώσεις από το δέρµα, αιµορραγικό ενάνθηµα, επίσταξη ή ρινορραγία, µικροσκοπική ή µακροσκοπική αιµατουρία, αιµορραγία από τον γαστρεντερικό σωλήνα ή αιµορραγία από τον αµφιβληστροειδή. Η τελευταία µάλιστα µπορεί να είναι προάγγελος και σοβαρότερης αιµορραγίας από το κεντρικό νευρικό σύστηµα (ΚΝΣ). Η έλλειψη παραγόντων της πήξεως κυρίως ινωδογόνου αλλά και V, VIII, IV, XIII που συνδυάζεται µε τη νόσο, µπορεί να είναι επίσης υπεύθυνη για την εµφάνιση αιµορραγιών 25. Εξαιτίας της ουδετεροπενίας συχνά εµφανίζονται µικροβιακές, µυκητιασικές ή ιογενείς λοιµώξεις που µπορεί να εκδηλώνονται µόνο µε πυρετό, χωρίς άλλα κλινικά συµπτώµατα και σηµεία, όταν ο αριθµός των ουδετεροφίλων είναι χαµηλός (<500/µl) οπότε παρουσιάζεται πρόβληµα ως προς την διάγνωση της λοίµωξης, εφόσον λείπουν οι εκδηλώσεις της φλεγµονής που οφείλονται στην παρουσία κοκκιοκυττάρων. Η διήθηση διαφόρων οργάνων από τα λευχαιµικά κύτταρα µπορεί να εκδηλωθεί µε άλγος, οσταλγίες ή διόγκωση των οργάνων αυτών όπως σπληνοµεγαλία, ηπατοµεγαλία, διόγκωση των λεµφαδένων, ευρήµατα που ωστόσο δεν είναι τόσο συχνά στην ΟΜΛ. ιηθήσεις από µυελοβλάστες µπορεί να εµφανισθούν σε οποιοδήποτε µαλακό ιστό και ιδιαίτερα στον υποδόριο ιστό του δέρµατος (λευχαιµοειδή) και ονοµάζονται χλωρώµατα ή µυελοβλαστώµατα. Ορισµένες κλινικές εκδηλώσεις σχετίζονται µόνο µε ορισµένους τύπους ΟΜΛ. Στην προµυελοκυτταρική λευχαιµία (Μ3) συχνά εµφανίζονται εκδηλώσεις διάχυτης ενδοαγγειακής πήξης ( ΕΠ) ενώ στη µυελοµονοκυτταρική λευχαιµία και στη µονοβλαστική (Μ4 και Μ5) διηθούνται και οι λεµφαδένες ενώ οι εξωµυελικές εντοπίσεις είναι ιδιαίτερα συχνές. Υπερπλασία και αιµορραγία των ούλων είναι χαρακτηριστικό εύρηµα της Μ5, αλλά και δερµατικές βλάβες υπό 32

33 µορφή πλακών ή όζων όπως και διήθηση του ΚΝΣ (λευχαιµική µηνιγγίτιδα) έχουν σχέση µε τη µορφή αυτού του τύπου της ΟΜΛ. Η ερυθρολευχαιµία έχει, συχνά, παρατεταµένη πρόδροµη φάση. 1.4 Ταξινόµηση της ΟΜΛ Με βάση µορφολογικά, ανοσοφαινοτυπικά, κυτταροχηµικά και κυτταρολογικά κριτήρια η οξεία µυελογενής λευχαιµία ταξινοµήθηκε από την Γαλλο- Αµερικανο-Βρετανική οµάδα µελέτης (French-American-British, FAB) σε διάφορες µορφές 26. Η κατά FAB ταξινόµηση ισχύει ακόµη και σήµερα (Πίνακας 1). Πίνακας 1. Ταξινόµηση κατά FAB της ΟΜΛ, συχνότητα και πρόγνωση σε ενηλίκους ασθενείς. Υπότυπος Κυτταρικός τύπος Πρόγνωση Συχνότητα Μ0 Μ1 Μ2 Μ3 Μ3v Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία µε ελάχιστη διαφοροποίηση Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία χωρίς ωρίµανση Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία µε ωρίµανση Οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία µε αδρά βασεόφιλα κοκκία στα προµυελοκύτταρα Οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία µε λεπτή κοκκίωση Μ4 Οξεία µυελοµονοκυτταρική λευχαιµία Ενδιάµεση Μ4eo M5a M5b Οξεία µυελοµονοκυτταρική λευχαιµία µε παθολογικά ηωσινόφιλα στον µυελό Οξεία µονοβλαστική λευχαιµία, ελαφρά διαφοροποιηµένη Οξεία µονοκυτταρική λευχαιµία ιαφοροποιηµένη υσµενής 3-5% Ενδιάµεση 15-20% Ευνοϊκή 25-30% Άριστη 10-15% Ευνοϊκή 20-30% Ενδιάµεση 2-9% M6 Οξεία ερυθρολευχαιµία υσµενής 3-5% M7 Οξεία µεγακαρυοβλαστική λευχαιµία υσµενής 3-5% 33

34 Ο κάθε τύπος ΟΜΛ χαρακτηρίζεται από µορφολογικά και ορισµένα ιστοχηµικά και κυτταρογενετικά ευρήµατα. Μ0 (ΟΜΛ µε ελάχιστη διαφοροποίηση): Οι βλάστες είναι µεγάλοι χωρίς κοκκία συνήθως µε 2-3 πυρήνια ενώ απουσιάζουν τα ραβδία Auer. Είναι αρνητικοί στις κυτταροχηµικές χρώσεις ΜΡΟ και SBB που είναι θετικές στις πιο διαφοροποιηµένες µορφές. Μ1 (ΟΜΛ χωρίς ωρίµανση): Οι βλάστες βρίσκονται σε ποσοστό >90%, είναι συνήθως µεγάλοι µε ελάχιστα κοκκία, αρκετά και ευδιάκριτα πυρήνια ενώ σπάνια µπορεί να υπάρχουν ραβδία Auer. Οι βλάστες είναι θετικοί στην ΜΡΟ ή στο SBB σε ποσοστό >3%. Μ2 (ΟΜΛ µε ωρίµανση): Οι βλάστες είναι συνήθως >50% µε παρουσία πυρηνίων και ραβδίων Auer. ιαφοροποιούνται µέχρι το προµυελοκύτταρο αλλά και πέραν αυτού, ενώ µερικές φορές έχουν δίλοβο πυρήνα και συγχέονται µε µονοκύτταρα. Σε ποσοστό 25% εµφανίζεται η µετάθεση t(8;21). M3 (Οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία): Οι βλάστες είναι λίγοι ενώ επικρατούν παθολογικά προµυελοκύτταρα µε αυξηµένα αδρά βασεόφιλα κοκκία και ραβδία Auer στο πρωτόπλασµα. Οι πυρήνες είναι ποικίλου µεγέθους και σχήµατος, συχνά δίλοβοι, αναδιπλωµένοι ή νεφροειδείς. Η ΜΡΟ είναι έντονα θετική και ο τύπος αυτός της ΟΜΛ συνοδεύεται συνήθως από την µετάθεση t(15;17) και από αναδιατάξεις του γονιδίου RARa στο χρωµόσωµα Μ3v (variant - ποικιλία οξείας προµυελοκυτταρικής λευχαιµίας): Στον τύπο αυτό, που είναι όµοιος µε τον προηγούµενο, υπάρχει λεπτή κοκκίωση των προ- µυελοκυττάρων. Μ4 (Μυελοµονοκυτταρική λευχαιµία): Στο αίµα και στο µυελό υπάρχει διαφοροποίηση µε βλάστες της µονοκυτταρικής και κοκκιώδους σειράς ενώ στο µυελό και το περιφερικό αίµα υπάρχουν προµονοκύτταρα και µονοκύτταρα >20%. Μ4Εο: Είναι ποικιλία της Μ4, αλλά µε αυξηµένο αριθµό παθολογικών ηωσινοφίλων στο µυελό και συνοδεύεται από την inv(16) ή t(16;16) 27. Μ5a (Οξεία µονοβλαστική λευχαιµία): Οι βλάστες είναι µεγάλου µεγέθους στο µυελό και στο αίµα µε λεπτή κατανοµή χρωµατίνης, ένα ή περισσότερα πυρήνια και άφθονο βασεόφιλο πρωτόπλασµα που µπορεί να έχει προσεκβολές ή 34

35 ψευδοπόδια. Σπάνια υπάρχουν ερυθρωπά κοκκία ή ραβδία Auer ενώ ανευρίσκονται και αρκετά προµονοκύτταρα. Η µη ειδική εστεράση είναι θετική. Ο τύπος αυτός είναι συχνότερος στα παιδιά και συνήθως συνοδεύεται από τη µετάθεση t(4;11). Μ5b (Μονοκυτταρική λευχαιµία µε διαφοροποίηση): Στο µυελό επικρατούν τα προµονοκύτταρα υπάρχουν όµως και µονοβλάστες ή µονοκύτταρα. Ο πυρήνας είναι µεγάλος, εγκεφαλοειδής, µε πυρήνια ενώ το πρωτόπλασµα είναι ελαφρά βασεόφιλο, µερικές φορές και µε ραβδία Auer. Τα προµονοκύτταρα στο περιφερικό αίµα είναι περισσότερα από του µυελού. Η µορφή αυτή είναι συχνότερη στους ενηλίκους και συχνά εµφανίζει ανακατατάξεις στη θέση 11q23[t(11q23;var)] 27. Μ6 (Ερυθρολευχαιµία): Στο µυελό ανευρίσκονται ερυθροβλάστες (PAS θετικοί) και προερυθροβλάστες >50%. Η µορφολογία των ερυθροβλαστών είναι πολύ παθολογική, οι πυρήνες πολλοί και πολύλοβοι, µε άφθονες πυρηνορρηξίες. Πολλές φορές οι ερυθροβλάστες είναι γιγάντιοι ενώ υπάρχει αύξηση των µυελοβλαστών και των προµυελοκυττάρων >30% στην εξέλιξη της νόσου. Σπανιότερα υπάρχουν παθολογικά µεγακαρυοκύτταρα. Κατά τη διάγνωση είναι συνήθης η παγκυτταροπενία στο περιφερικό αίµα. Μ7 (Μεγακαρυοκυτταρική λευχαιµία): Υπάρχουν άφθονοι µεγακαρυοβλάστες, µεγάλα ή µικρά παθολογικά µεγακαρυοκύτταρα και παθολογικά αιµοπετάλια. Οι βλάστες έχουν ελάχιστο χρωµόφοβο κυτταρόπλασµα και µοιάζουν µε λεµφοβλάστες. Σε ποσοστό >50% οι βλάστες εκφράζουν µεγακαρυοκυτταρικούς δείκτες και η παγκυτταροπενία είναι συχνή κατά τη διάγνωση 27. Η κατά FAB ταξινόµηση έχει πλεονεκτήµατα την ταχύτητα και την ευκολία στην εκτίµηση και τη µεγάλη συµφωνία ταξινόµησης µεταξύ των µελετητών, που ξεπερνά το 80%. Έχει όµως και µειονεκτήµατα όπως δυσχέρεια στην αναγνώριση ορισµένων µορφών (όπως Μ0, Μ7 και διφαινοτυπική ΟΜΛ), περιορισµένη αξία στην πρόγνωση και την ανίχνευση της υπολειµµατικής νόσου. Αυτό οδήγησε στη νέα, κατά WHO (World Health Organization Παγκόσµιος Οργανισµός Υγείας, ΠΟΥ) ταξινόµηση 28, που βασίστηκε σε επιπλέον κλινικά, κυτταρογενετικά και ανοσοφαινοτυπικά κριτήρια και προτείνει τις οµάδες ΟΜΛ που φαίνονται στον Πίνακα 2. 35

36 Πίνακας 2. Ταξινόµηση κατά WHO της ΟΜΛ και πρόγνωση στους υπότυπους. ΟΜΛ µε χαρακτηριστικές κυτταρογενετικές ανωµαλίες ΟΜΛ µε πολυκλωνική δυσπλασία ευτερογενής ΟΜΛ και Μ Σ που εµφανίζονται µετά χορήγηση φαρµάκων Άλλοι τύποι ΟΜΛ ιφαινοτυπικές ΟΛ ΟΜΛ µε t(8;21) (AML1-ETO) ΟΜΛ µε inv(16) ή t(16;16) µε παθολογικά ηωσινόφιλα στον µυελό (CBFβ-MYH11) ΟΠΜΛ µε t(15;17) (PML-RARα) ΟΜΛ µε ανωµαλίες 11q23 (MLL) Προηγήθηκε Μ Σ ή ΜΥΣ εν προηγήθηκε Μ Σ ή ΜΥΣ Αλκυλιωτικοί παράγοντες Αναστολείς της τοποϊσοµεράσης ΙΙ ΟΜΛ µε ελάχιστη διαφοροποίηση που δεν µπορεί να κατηγοριοποιηθεί ΟΜΛ χωρίς ωρίµανση ΟΜΛ µε ωρίµανση ΟΠΜΛ χωρίς αλλοιώσεις του RARα Οξεία µυελοµονοκυτταρική λευχαιµία Οξεία µονοβλαστική και µονοκυτταρική λευχαιµία Οξεία ερυθρολευχαιµία Οξεία µεγακαρυοβλαστική λευχαιµία Οξεία βασεοφιλική λευχαιµία Οξεία πανµυέλωση µε µυελοΐνωση Μεγάλη πιθανότητα ολικής ύφεσης. Ευνοϊκή πρόγνωση Συχνή σε ηλικιωµένους ασθενείς. υσµενής πρόγνωση Συχνή µετά από χηµειοθεραπεία ή ακτινοβολία. υσµενής πρόγνωση Η πρόγνωση ποικίλει και εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από τα κυτταρογενετικά ευρήµατα Παρουσία λευχαιµικών κυττάρων που δεν µπορούν να ταξινοµηθούν διαφοροποιεί την πρόγνωση 36

37 1.5 Πρόγνωση Παρά τις εκτεταµένες έρευνες και τις προόδους που έχουν σηµειωθεί τα τελευταία χρόνια στην θεραπευτική προσέγγιση της νόσου ένα ποσοστό 25% περίπου των ασθενών µε ΟΜΛ θα καταλήξει τους πρώτους µήνες από τη διάγνωση. Οι προγνωστικοί παράγοντες της ΟΜΛ αναφέρονται στον Πίνακα 3. Πίνακας 3. Προγνωστικοί παράγοντες στην ΟΜΛ. Ευνοϊκοί υσµενείς Ηλικία <60 ετών >60 ετών Καρυότυπος Αριθµός λευκών αιµοσφαιρίων t(8;21), t(15;17), inv(16), t(16;6), φυσιολογικός καρυότυπος Μονοσωµία 5, 7, del5q, ανωµαλίες του 3, χρωµόσωµα Ph +, ανωµαλίες ταυτόχρονα σε δυο χρωµοσώµατα < > ευτεροπαθής ΟΜΛ Απούσα Παρούσα FAB υπότυπος Μ1 ή Μ2 µε ραβδία Auer, Μ3 και Μ4Eo Μ0, M5a, M5b, Μ6, Μ7 MDR1 Αρνητικό Θετικό Ραβδία Auer Παρόντα Απόντα Ίνωση Απούσα Παρούσα Μείωση των λευκών αιµοσφαιρίων µετά χηµειοθεραπεία Κύκλοι θεραπείας για πρόκληση ύφεσης Ανώµαλοι προµονοβλάστες Κυτταρικές σειρές µε δυσπλασία Ταχεία Ένας µόνο Σπάνιοι Καµία Βραδεία Πολλαπλοί Πολλοί Τρεις κυτταρικές σειρές 1.6 Αιµατολογικά ευρήµατα Αναιµία και θροµβοπενία είναι σχεδόν σταθερά ευρήµατα στη διάγνωση της νόσου. Ο αριθµός των λευκοκυττάρων σε ποσοστό >50% είναι αυξηµένος µέχρι και > /µl, µπορεί να είναι όµως και φυσιολογικός ή και ελαττωµέ- 37

38 νος. Εξαιτίας της ύπαρξης αυξηµένου αριθµού βλαστών στο περιφερικό αίµα συχνά συνυπάρχει και ουδετεροπενία. Ο µυελός των οστών είναι συνήθως κυτταροβριθής µε υπερίσχυση του α- ριθµού των βλαστών ή άλλων άωρων κυττάρων που αναπτύσσονται σε βάρος των φυσιολογικών σειρών. Για τη διάγνωση της οξείας λευχαιµίας απαιτείται αριθµός βλαστών στο µυελό >30% στην κατά FAB ταξινόµηση και >20% στην WHO. Η λήψη µυελού των οστών είναι απαραίτητη για την µορφολογία των βλαστών, τις κυτταροχηµικές χρώσεις, τον ανοσοφαινότυπο, τον κυτταρογενετικό και µοριακό έλεγχο, ενώ η βιοψία οστού επιβάλλεται όχι µόνο για τη µορφολογία των βλαστών αλλά και για την πιθανότητα ύπαρξης ίνωσης ή την διενέργεια ιστοχηµικών χρώσεων και ανοσοφαινότυπου. 1.7 Κυτταροχηµικές αντιδράσεις στην ΟΜΛ Οι κυτταροχηµικές αντιδράσεις βοηθούν στη διάκριση και ταξινόµηση των λευχαιµικών βλαστών ανάλογα µε τα χαρακτηριστικά της διαφοροποίησής τους. Με τη βοήθεια ειδικών χρωστικών ανιχνεύονται έγχρωµα κοκκία ή διάχυτη χρώση που αντιπροσωπεύουν ένζυµα, λιπίδια ή υδατάνθρακες που υπάρχουν στο κυτταρόπλασµα. Οι κυτταροχηµικές αυτές αντιδράσεις στους διάφορους υπότυπους της κατά FAB ταξινόµησης φαίνονται στον Πίνακα Πίνακας 4. Κυτταροχηµικές αντιδράσεις για την ταξινόµηση της ΟΜΛ. Υπότυπος FAB MPO CHLORE ANAE PAS Μ Μ1 +/+++ ± + -/++ Μ2 +/+++ ± + -/++ Μ Μ4 +/ /++ Μ5 +/ /++ Μ /+++ Μ /+ MPO: µυελοϋπεροξειδάση CHLORE: Napthol AS-D chloroacetate εστεράση ANAE: a-napthol Acetate εστεράση PAS: Periodic Acid-Shiff 38

39 1.8 Ανοσοφαινότυπος στην ΟΜΛ Ο ανοσοφαινότυπος, η µελέτη δηλαδή της ανοσολογικής ταυτότητας των λευχαιµικών κυττάρων, είναι απαραίτητος για τον ορθό χαρακτηρισµό και την ακριβή ταξινόµηση της ΟΜΛ (Πίνακας 5). Αυτό επιτυγχάνεται µε τη βοήθεια της κυτταροµετρίας ροής µε φθορισµό οπότε είναι δυνατή η ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών κυτταρικών δεικτών-αντιγόνων στο ίδιο κύτταρο. Οι διάφοροι συνδυασµοί των δεικτών αυτών στα λευχαιµικά κύτταρα παίζουν σηµαντικό ρόλο όχι µόνο στην ταξινόµηση της ΟΜΛ αλλά και στην πρόγνωση και στην ανίχνευση της ελάχιστης υπολειµµατικής νόσου. Για την ανοσοφαινοτυπική διάκριση της ΟΜΛ κύριοι δείκτες θεωρούνται η µυελοϋπεροξειδάση (αντι-μρο), το CD13, το CD13, το CD33, το CD15 και το CD14. Σε ορισµένες µορφές όµως εκφράζονται και δείκτες της λεµφικής σειράς όπως: - το CD7, δείκτης της Τ-λεµφικής σειράς που συχνά απαντά στην ΟΜΛ µε καθόλου ή ελάχιστη ωρίµανση (Μ0 και Μ1) - το CD4, επίσης δείκτης της Τ-λεµφικής σειράς που εκφράζεται στην Μ3. - το CD19, δείκτης της Β-λεµφικής σειράς που αν και µη ειδικό, συνοδεύει συχνά τη µετάθεση t(8;21) στην Μ2. Μη ειδικοί δείκτες που εκφράζονται σε όλα τα αρχέγονα κύτταρα είναι το CD34, το HLA-DR και η TdT (τελική τρανσφεράση). Πίνακας 5. Ανοσοφαινοτυπική διάκριση της ΟΜΛ. FAB HLA-DR CD4 CD7 CD13 CD15 CD19 CD33 CD41/ CD61 Gly-A Μ /- -/+ - +/- - - Μ / Μ Μ / Μ Μ /- +/- - +/- - - Μ6 +/ / /- - + Μ7 +/ / / /-: τις περισσότερες φορές ο δείκτης είναι θετικός, -/+: τις περισσότερες φορές ο δείκτης είναι αρνητικός, Gly-A: glycophorin-a 39

40 1.9 Κυτταρογενετική µελέτη (καρυότυπος) Η κυτταρογενετική-χρωµοσωµική ανάλυση έχει συµβάλει σηµαντικά στη διάγνωση, ταξινόµηση και πρόγνωση των λευχαιµιών αλλά και στην κατανόηση της βιολογίας της νόσου µε την αναγνώριση ειδικών καρυοτυπικών διαταραχών που είναι χαρακτηριστικές για ορισµένα είδη λευχαιµίας, όπως επίσης και στην εφαρµογή της κατάλληλης θεραπείας 30. Χρωµοσωµικές ανωµαλίες εµφανίζονται στο 50-60% των de novo ΟΜΛ ενώ αγγίζουν και το 100% σε ασθενείς µε δευτεροπαθή ΟΜΛ, όπως µετά µυελοδυσπλαστικά ή µυελοϋπερπλαστικά νοσήµατα ή µετά χηµειοθεραπεία ή/και ακτινοβολία. Οι χρωµοσωµικές ανωµαλίες στην ΟΜΛ φαίνονται στον Πίνακα 6. Πίνακας 6. Χρωµοσωµικές ανωµαλίες στην ΟΜΛ. Υπότυπος FAB Χρωµοσωµική ανωµαλία Συχνότητα (%) M3 t(15;17)(q22;q11-12) M4Eo inv(16)(p13q22) ή t(16;16)(p16;16)(p13;q22) 100 M2 t(8;21)(q22;q22) M1, M2 t(9;22)(q34;q11) 8 M1, M2, M4, M5, M M1, M4, M5 t(v;11)(v;q23) 9 M1, M2, M4 t(6;9)(q23;q34) 2 M1, M2, M4, M6, M7-7 ή -5 ή del(5q) 9 (ή 14) M1, M2, M4, M5, M6, M7 Πολύπλοκες ανωµαλίες 1.10 Μοριακή γενετική Οι χρωµοσωµικές ανωµαλίες αποτελούν µικροαλλοιώσεις που αντανακλούν µοριακές ανωµαλίες. Για την ταυτοποίηση αλληλουχιών συγκεκριµένων πρωτεϊνών ή κλωνικών αναδιατάξεων συγκεκριµένου τύπου κυττάρων µπορούν να χρησιµοποιηθούν DNA-ανιχνευτές. Με αυτόν τον τρόπο ταυτοποιούνται τµήµατα DNA χαρακτηριστικά για κάθε τύπο κυττάρου ή για µια νέα πρωτεΐνη. Η α- νίχνευση αναδιάταξης του DNA αποτελεί απόδειξη της ύπαρξης ενός κλωνικού πληθυσµού. 40

41 Γονίδια που εµπλέκονται σε χρωµοσωµικές αναδιατάξεις στην ΟΜΛ είναι: t(6;9)(q23;q34) DEK CAN t(8;21)(q22;q22) ETO AML1 t(9;22)(q34;q11) ABL BCR t(15;17)(q22;q21) PML RARA inv(16)(p13q22) MYH11 CBFβ Η πιο συχνή διαταραχή στην ΟΜΛ (25%) είναι η µετάλλαξη RAS. Σχεδόν οι µισοί άρρωστοι εµφανίζουν διαταραχή στην έκφραση της πρωτεΐνης p53. Η έκφραση του γονιδίου της γλυκοπρωτεΐνης P (PGP), MDR1 συνδέεται µε αντοχή στη χορηγούµενη χηµειοθεραπεία και η ανίχνευση του πριν από την έναρξη της χηµειοθεραπείας µπορεί να βοηθήσει στην εφαρµογή της καταλληλότερης θεραπευτικής προσέγγισης. Η PGP βρίσκεται στη µεµβράνη του λευχαιµικού βλάστη και η δράση της είναι να ωθεί τις χηµειοθεραπευτικές ουσίες από το ε- σωτερικό του κυττάρου προς τα έξω αναστέλλοντας τη δράση τους. Ουσίες που ανταγωνίζονται τη δράση αυτή, όπως η κυκλοσπορίνη, η βεραπαµίλη, η κινίνη µε καλά αποτελέσµατα in vitro δεν χρησιµοποιούνται in vivo λόγω των επιπλοκών τους Θεραπευτική αντιµετώπιση Η θεραπεία στην ΟΜΛ, µε τα θεραπευτικά πρωτόκολλα που εφαρµόζονται, αποβλέπει στην καταστροφή των λευχαιµικών κυττάρων και την πρόκληση πλήρους ύφεσης. Ως πλήρης ύφεση θεωρείται η αποκατάσταση στο φυσιολογικό των κυττάρων του περιφερικού αίµατος µε φυσιολογική κυτταροβρίθεια του µυελού των οστών και βλάστες <5% και απουσία λευχαιµικού φαινότυπου ή κυτταρογενετικής ανωµαλίας 31. Αυτή περιλαµβάνει δύο σκέλη, την συµπτωµατική αγωγή και την ειδική θεραπευτική αγωγή για την αντιµετώπιση της ΟΜΛ. Η συµπτωµατική θεραπεία περιλαµβάνει: (α) την αντιµετώπιση των επιπλοκών που προκύπτουν από την κατάληψη του µυελού από τα λευχαιµικά κύτταρα, δηλαδή της αναιµίας, των αιµορραγικών εκδηλώσεων εξαιτίας της θροµβοπενίας και τη θεραπεία των λοιµώξεων που είναι αποτέλεσµα της ουδετεροπενίας που συχνά είναι απειλητικές για τη ζωή και αποτελούν την κύρια αιτία θανάτου στους ασθενείς αυτούς. Σοβαρή 41

42 αναιµία, θροµβοπενία και λευκοπενία µε ουδετεροπενία, µε τις κλινικές εκδηλώσεις τους, εµφανίζονται και κατά τη φάση της απλασίας µετά τη χορήγηση χηµειοθεραπείας. Μεταγγίσεις αίµατος, αιµοπεταλίων και ευρέος φάσµατος α- ντιβιοτικά, αντιµυκητιασικά και αντιικά φάρµακα χρησιµοποιούνται για την α- ντιµετώπιση των επιπλοκών αυτών. (β) Την αντιµετώπιση των προβληµάτων της ειδικής θεραπευτικής αγωγής (χηµειοθεραπεία, Χ/Θ) όπως είναι το σύνδροµο λύσης του όγκου εξαιτίας της εκτεταµένης καταστροφής των βλαστών (κυτταρόλυση) από την Χ/Θ, αλλά και το σύνδροµο της λευκόστασης, επιπλοκής που προκύπτει από την απόφραξη µικρών αγγείων από σωρούς λευκοκυττάρων και βλαστών στο ΚΝΣ και στους πνεύµονες. Η ειδική θεραπευτική αντιµετώπιση της ΟΜΛ, η αντιλευχαιµική θεραπεία, περιλαµβάνει: (α) χηµειοθεραπεία για την πρόκληση ύφεσης η οποία εξατοµικεύεται ανάλογα µε την ηλικία του ασθενούς, τον ανοσοφαινότυπο και τον καρυότυπο. Η κυττοσίνη-αραβινοσίδη (κυτταραβίνη-aracytine) αποτελεί τον κύριο χηµειοθεραπευτικό παράγοντα για την αντιµετώπιση της ΟΜΛ στον οποίο προστίθεται συνήθως και µια ανθρακυκλίνη Νταουνορουβικίνη ή Ινταρουβικίνη ή µιτοξανθρόνη. Η κυτταραβίνη, ανάλογο των πυριµιδινών, αναστέλλει τη σύνθεση του DNA ενώ οι ανθρακυκλίνες συνδέονται µε το DNA, παρεµβαίνουν στη µίτωση και αναστέλλουν το διπλασιασµό του. Ειδική αντιµετώπιση απαιτείται στην οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία µε καρυότυπο t(15;17) που οδηγεί στην παραγωγή υβριδικής πρωτεΐνης που συµµετέχει ως υποδοχέας του ρετινοϊκού οξέος. Εποµένως, η πρόσληψη ρετινοϊκού οξέος από τους υποδοχείς της πρωτεΐνης την καθιστά ανενεργό µε αποτέλεσµα τη µειωµένη δραστηριότητα της νόσου. Η χρήση του All-Trans-Retinoic Acid (ATRA) διαφοροποιεί και µετατρέπει τα λευχαιµικά κύτταρα σε ώριµα. Η χορήγηση χηµειοθεραπείας είναι ωστόσο απαραίτητη 32. (β) Μεταµόσχευση προγονικών αιµοποιητικών κυττάρων, αλλογενή ή αυτόλογη. 42

43 (γ) Η ακτινοθεραπεία και η χρήση κυτταροκινών είναι επίσης θεραπευτικές προσεγγίσεις τις οποίες µπορούµε, ανάλογα µε την περίπτωση, να εφαρµόσου- µε Μελλοντικές προοπτικές ιάφορες νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις βρίσκονται ακόµη υπό εξέλιξη. Αυτές αφορούν παράγοντες που αναστέλλουν την πολυφαρµακευτική ανθεκτικότητα (Multidrug Resistance, MDR) που εµφανίζουν µερικοί ασθενείς και ιδίως ηλικιωµένοι, που δεν απαντούν στη φαρµακευτική αγωγή. Άλλες θεραπευτικές στρατηγικές περιλαµβάνουν νέους παράγοντες όπως είναι τα αντί-cd33 και αντί-bcl-2 αντισώµατα, οι αναστολείς της φαρνεσυλτρανσφεράσης, της ακετυλάσης των ιστονών, του κυτταρικού κύκλου και άλλοι. Απαιτούνται ωστόσο περαιτέρω µελέτες για την αποτελεσµατικότητα των στρατηγικών αυτών. 2. ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ Η φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων των θηλαστικών απαιτεί την ε- παρκή τροφοδότησή τους µε οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά δια µέσου των αιµοφόρων αγγείων. Για να δέχονται τις αναγκαίες ποσότητες οξυγόνου για την επιβίωσή τους τα κύτταρα πρέπει να βρίσκονται σε απόσταση µικρότερη από 100 έως 200µm από τα αιµοφόρα αγγεία. Προκειµένου οι πολυκύτταροι οργανισµοί να υπερβούν αυτό το µέγεθος απαιτείται η συγκρότηση νέων αγγείων αί- µατος µέσω της αγγειογένεσης 33. Κατά την εµβρυϊκή ζωή τα πρόδροµα κύτταρα του µεσοδέρµατος διαφοροποιούνται σε αγγειοβλάστες και στη συνέχεια σε ενδοθηλιακά κύτταρα τα οποία σχηµατίζουν το αρχέγονο αγγειακό δίκτυο. Αυτή η διαδικασία ονοµάζεται αγγειοπλασία (vasculogenesis) 34. Aγγειογένεση (angiogenesis) είναι η διαδικασία σχηµατισµού νέων αγγείων από ένα προϋπάρχον αγγειακό δίκτυο. Στη συνέχεια, ο όρος επεκτάθηκε ώστε να υποδηλώνει την ανάπτυξη και την διαδικασία ανακατασκευής και διαµόρφωσης του αρχέγονου-πρόδροµου δικτύου προς ένα πολύπλοκο αγγειακό δίκτυο 35. Στη διεργασία αυτή ενέχονται µηχανισµοί διαφορετικοί από αυτούς της αγ- 43

44 γειοπλασίας 36 και συµβαίνει τόσο στο αναπτυσσόµενο έµβρυο όσο και µετά τη γέννηση 37,38. Πολλοί ερευνητές θεωρούν την αγγειοπλασία και την αγγειογένεση ξεχωριστές διαδικασίες αγγειακής ανάπτυξης καθώς προτείνεται ότι η πρώτη δεν συµβαίνει σε ενηλίκους αλλά περιορίζεται µόνο στην εµβρυογένεση 39,40,41. Άλλες όµως µελέτες αναφέρουν ότι η αγγειοπλασία πέραν της πρώιµης εµβρυογένεσης φαίνεται να εµπλέκεται σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις και στους ενηλίκους 42, Μηχανισµός αγγειογένεσης Η αγγειογένεση εξαρτάται από µια αλληλουχία συντονισµένων γεγονότων. Για την ανάπτυξη νέων αγγείων σε αναγεννώµενους και νεοπλασµατικούς ι- στούς έχουν περιγραφεί τρεις µηχανισµοί. Τα αγγεία στον ενήλικο οργανισµό σχηµατίζονται είτε µε εκβλάστηση (sprouting), είτε µε δηµιουργία γεφυρών α- νάµεσα στα ενδοθηλιακά κύτταρα (bridging) είτε µε διχοτόµηση ή ενδίπλωση (intussuseption). Ο µηχανισµός που έχει µελετηθεί πιο εκτεταµένα είναι η αγγειογένεση µε εκβλάστηση, η οποία ρυθµίζεται από ειδικούς αγγειογενετικούς αυξητικούς παράγοντες. Σύµφωνα µε τον µηχανισµό αυτό γίνεται ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων ενός προϋπάρχοντoς µικρού αγγείου από µια κατάσταση ηρεµίας σε µια κατάσταση αγγειογενετικού πολλαπλασιασµού και διαίρεσης (αγγειογενετική µεταστροφή, angiogenic switch). Αυτό προϋποθέτει την παραγωγή µεταλλοπρωτεϊνασών από το στρώµα, και την έκφραση µορίων προσκόλλησης όπως οι ιντεγκρίνες α ν β 3 που βοηθούν τα ενδοθηλιακά κύτταρα να προσκολλώνται µεταξύ τους κατά τη διείσδυσή τους στο στρώµα. Στη συνέχεια νέα ενδοθηλιακά κύτταρα οργανώνονται σε σωληνίσκους δηµιουργώντας νέα δίκτυα αγγείων 44,45,46 (Εικόνα 6). Υπάρχουν πειραµατικές ενδείξεις ότι η αυξηµένη τάση των τοιχωµάτων του αγγείου και η αυξηµένη γλοιότητα του αίµατος ευοδώνουν τη µετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και ταυτόχρονα προκαλούν τη δη- µιουργία αγγειακών εκβλαστήσεων (sprouting angiogenesis)

45 Εικόνα 6: Σχηµατική αναπαράσταση του σχηµατισµού αγγείων µε εκβλάστηση. A) Αγγειογενετικοί παράγοντες δεσµεύονται στους ειδικούς υποδοχείς των ενδοθηλιακών κυττάρων και ενεργοποιούν µονοπάτια µεταγωγής σήµατος. Β) Οι µεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡs) αποικοδοµούν το εξωκυτταρικό υλικό, επιτρέποντας έτσι τη µετανάστευση και τον πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων. Γ) Η ιντεγκρίνη ανβ3 εκφράζεται από ενδοθηλιακά κύτταρα και διευκολύνει τη µετανάστευσή και προσκόλλησή τους στο εξωκυτταρικό υλικό. ) Η αγγειοποιητίνη-1 δεσµεύεται στον υποδοχέα Tie-2 των ενδοθηλιακών κυττάρων, γεγονός που διευκολύνει τη δηµιουργία νέων αγγείων. Ε) Τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκκρίνουν παράγοντες που προσελκύουν πρόδροµα περικύτταρα, τα οποία αλληλεπιδρώντας µε τα ενδοθηλιακά κύτταρα διαφοροποιούνται στα περικύτταρα. Ε.Υ.: εξωκυτταρικό υλικό, Ε.Κ.: ενδοθηλιακά κύτταρα. 2.2 Επαγωγείς και αναστολείς της αγγειογένεσης Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η δηµιουργία νέων αγγείων αίµατος από το προϋπάρχον αγγειακό δίκτυο των ιστών αποτελεί µια πολυσταδιακή, πολυπαραγοντική και πολύπλοκη διαδικασία η οποία διεγείρεται από ένα πλήθος αιτιών (υποξία, µηχανικό ή µεταβολικό στρες κ.α.). Η αγγειογενετική δραστηριότητα σε έναν ιστό, σε µια δεδοµένη χρονική στιγµή, καθορίζεται από το αθροιστικό αποτέλεσµα αγγειογενετικών και αντιαγγειογενετικών παραγόντων. Ο µηχανισµός που είναι υπεύθυνος για την υπέρµετρη αύξηση των επαγωγέων της αγγειογένεσης ή για την καταστολή των αναστολέων της ή και των δύο ταυτόχρονα και έχει σαν αποτέλεσµα την έναρξη της αγγειογενετικής διαδικασίας δεν είναι α- κόµη γνωστός. 45

46 Η εικόνα περιπλέκεται ακόµη περισσότερο αν αναλογισθεί κανείς ότι η αγγειογένεση συνδέεται άµεσα και µε άλλους µοριακούς µηχανισµούς που εµπλέκονται στην ανάπτυξη και στη µετάσταση των όγκων. Ορισµένα ογκογονίδια όπως το proto-cmet, το K-ras και το H-ras καταστέλλουν την έκφραση αναστολέων της αγγειογένεσης, όπως για παράδειγµα της θροµβοσπονδίνης (TSP-1), και προάγουν την ανάπτυξη των όγκων. Άλλα πάλι ογκογονίδια στα οποία περιλαµβάνονται τα ras, myc, raf, και fos επάγουν την έκφραση του VEGF µε συνέπεια τη διέγερση του σχηµατισµού νέων αγγείων. Αντίθετα, ορισµένα ογκοκατασταλτικά γονίδια, όπως το άγριου τύπου p53, έχει βρεθεί ότι καταστέλλουν την αγγειογένεση µέσω ενεργοποίησης της TSP-1. Τέλος, κοινά µοριακά µονοπάτια φαίνεται να ακολουθούν η αγγειογένεση µε την απόπτωση, καθώς γονίδια όπως το B-Raf εµπλέκονται και στις δύο διαδικασίες, ενώ ορισµένοι αναστολείς της αγγειογένεσης (αγγειοστατίνη, ενδοστατίνη και ιντερλευκίνη-12) έχει δειχθεί ότι επάγουν την απόπτωση ενδοθηλιακών αλλά και καρκινικών κυττάρων 48,49,50, Επαγωγείς της αγγειογένεσης Η αγγειογένεση επάγεται από την έκκριση ειδικών αυξητικών παραγόντων που παράγονται από τα καρκινικά κύτταρα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα ή ορισµένα κύτταρα του στρώµατος όπως τα µακροφάγα, τα µαστοκύτταρα ή οι ινοβλάστες. Οι αυξητικοί παράγοντες είναι πρωτεΐνες που δεσµεύονται σε ειδικούς υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων, µε πρωταρχικό ρόλο να ενεργοποιούν την κυτταρική διαφοροποίηση και ανάπτυξη. Ορισµένοι αυξητικοί παράγοντες δρουν σε ορισµένα είδη κυττάρων µόνο, ενώ άλλοι δεν παρουσιάζουν κυτταρική εξειδίκευση. Μέχρι σήµερα έχει αναγνωριστεί πλήθος αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων µεταξύ των οποίων οι πιο σηµαντικοί είναι ο VEGF, o αιµοπεταλιακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας PDECGF (Platelet Derived Endothelial Cell Growth Factor), oι αυξητικοί παράγοντες µεταµόρφωσης TGFs (basic and acidic Transforming Growth Factor), ο όξινος και βασικός ινοβλαστικός αυξητικός παράγοντας α,b-fgf (acidic and basic Fibroblast Growth Factor), ο παράγοντας νέκρωσης του όγκου TNF-a (Tumor Necrosis Factor-a), οι ιντερλευκίνες 8 και 6 (IL-8, IL-6), η λεπτίνη (Leptin) και άλλοι. 46

47 Οι κυτταροκίνες αποτελούν µια ξεχωριστή οικογένεια αυξητικών παραγόντων που εκκρίνονται από τα λεµφοκύτταρα, τα µονοκύτταρα, τα µακροφάγα αλλά και τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τους ινοβλάστες και έχουν την ικανότητα να διεγείρουν τη χυµική και την κυτταρική απόκριση του ανοσοποιητικού συστήµατος. Οι ιντερλευκίνες είναι κυτταροκίνες οι οποίες συνιστούν αυξητικούς παράγοντες που εµπλέκονται στην αγγειογένεση και ειδικότερα στην έλξη υποστηρικτικών µορίων που δηµιουργούν τη νέα βασική µεµβράνη των νεοσχηµατισθέντων αγγείων. Παράλληλα ολοένα και περισσότεροι επαγωγείς της αγγειογένεσης γίνονται γνωστοί τα τελευταία χρόνια όπως οι εφρίνες και οι υποδοχείς τους (Ephrines, Eph receptors) µε χαρακτηριστικούς εκπροσώπους την εφρίνη Α1, που παίζει ρόλο στην φλεγµονώδη αγγειογένεση που επάγεται από τον TNF-a και την ε- φρίνη Β1 που προάγει τη συνάθροιση και συγκόλληση των ενδοθηλιακών κυττάρων 52 (Πίνακας 7). Πίνακας 7. Παράγοντες που επάγουν την αγγειογένεση και η λειτουργία τους. Επαγωγείς αγγειογένεσης VEGF Αγγειοποιητίνη- 1 Υποδοχέας αγγειοποιητίνης PDGF και οι υποδοχείς του TGF-β1, υποδοχείς του TGF-β FGF, HGF, MCP-1 Ιντεγκρίνες VE-καδερίνη, PECAM (CD31) Εφρίνες Μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) Αναστολείς πρωτεϊνασών Ιντερλευκίνη-6 και -8 Αναστολείς διαφορποποίησης Λειτουργία Επαγωγή αγγειογένεσης, διαπερατότητας αγγείων Σταθεροποίηση αγγείων, Αναστολή διαπερατότητας Προσέλκυση λείων µυϊκών κυττάρων Επαγωγή δηµιουργίας εξωκυττάριου υλικού Επαγωγή αγγειογένεσης και αρτηριογέννεσης Υποδοχείς πρωτεϊνασών και ΜΜΡ Μόρια συνένωσης ενδοθηλιακών κυττάρων Ρύθµιση φλεβικής και αρτηριακής εξειδίκευσης. Απελευθέρωση και ενεργοποίηση αυξητικών παραγόντων, αποικοδόµηση βασικής µεµβράνης, αναδιαµόρφωση εξωκυττάριας ουσίας Σταθεροποίηση αγγείων Πολλαπλασιασµός και µετανάστευση E.K. Ρύθµιση πλαστικότητας ενδοθηλιακών κυττάρων 47

48 2.2.2 Αναστολείς της αγγειογένεσης Στους φυσιολογικούς ιστούς η αγγειογένεση βρίσκεται σε «νάρκη» λόγω της εξισορρόπησης των αυξητικών παραγόντων από τους ενδογενείς αναστολείς της διαδικασίας. Οι αναστολείς συνιστούν µόρια που εµπλέκονται σε ένα ή και περισσότερα στάδια της αγγειογένεσης και ασκούν τη βιολογική τους δράση στον αναπτυσσόµενο πληθυσµό των ενδοθηλιακών κυττάρων ή σε µια ποικιλία κυττάρων που συµµετέχουν στη διαδικασία σχηµατισµού νέων αγγείων. Η βιολογική λειτουργία των αναστολέων κυρίως στηρίζεται είτε στον ανταγωνισµό της δράσης των αυξητικών παραγόντων είτε στην αναστολή της ανάπτυξης και µετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων 53,52. Με βάση το µηχανισµό δράσης τους οι αντιαγγειογενετικοί παράγοντες κατατάσσονται στις εξής κατηγορίες: 1. Αναστολείς της κινητικότητας, µετάστασης και συγκόλλησης των κυττάρων, όπως οι θροµβοσπονδίνες 1 και 2 (TSP-1, 2) και η ενδοστατίνη (endostatin). 2. Αναστολείς πρωτεολυτικών ενζύµων τα οποία αποικοδοµούν τη βασική µεµβράνη, όπως οι αναστολείς των µεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs inhibitors) και η αντιθροµβίνη. 3. Ανταγωνιστές αγγειογενετικών παραγόντων, δηλαδή µόρια µε άµεση α- ντιαγγειογενετική δράση όπως οι υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων VEGF και FGF (VEGF-Receptor, VEGF-R και FGF Receptor,FGF-R). 4. Αναστολείς ενδοκυτταρικής επικοινωνίας ενδοθηλιακών κυττάρων, όπως η Αγγειοποιητίνη 2 (Angiopoietin 2, Ang-2) και οι αναστολείς των ιντεγκρινών. 5. Κυτταροκίνες µε αντιαγγειογενετική δράση, όπως η ιντερφερόνη α και γ (Interferon-α, -γ) και οι ιντερλευκίνες 8 και 12 (IL-8, IL-12) Μέχρι σήµερα έχουν αναγνωριστεί περισσότεροι από 30 αναστολείς της αγγειογένεσης. (Πίνακας 8). 48

49 Πίνακας 8. Παράγοντες που αναστέλλουν την αγγειογένεση και η λειτουργία τους. Αναστολείς αγγειογένεσης Λειτουργία Υποδοχέας VEGF (R1) εξαµενή δέσµευσης VEGF Αγγειοποιητίνη-2 (Ang 2) Ανταγωνίζεται την Αng 1 Αγγειοστατίνη Καταστολή αγγειογένεσης Ενδοστατίνη Αναστολή µετανάστευσης και επιβίωσης Ενδοθηλιακών κυττάρων Προλακτίνη (θραύσµα 16K) Αναστολή δέσµευσης VEGF και bfgf Αναστολείς των MMPs Καταστολή παθολογικής αγγειογένεσης p53, VHL Αναστολή σύνθεσης VEGF Ιντερφερόνη α, β, γ, Ιντερλευκίνη 10, 12, 18 Αναστολή ενδοθηλιακής µετανάστευσης Ρετινοϊκό οξύ Αναστολή µετανάστευσης Ε.Κ. VEGI Ρύθµιση κυτταρικής ανάπτυξης Μασπίνη Αναστολέας πρωτεασών Προθροµβίνη-2, αντιθροµβίνη III Αναστολή ενδοθηλιακής ανάπτυξης 2.3 Παράγοντες που επάγουν την έναρξη της αγγειογένεσης Μια ποικιλία παραγόντων 54,35,55 φαίνεται να προκαλούν την έναρξη της αγγειογένεσης, µεταξύ των οποίων περιλαµβάνονται η υποξία, το χαµηλό ph, η υπογλυκαιµία, η πίεση που προκαλείται από κύτταρα που αναπτύσσονται και πολλαπλασιάζονται µε αποτέλεσµα την αυξηµένη µάζα ιστού και οι γενετικές αλλοιώσεις και µεταλλάξεις που προκαλούν ενεργοποίηση ογκογονιδίων ή απαλοιφή ογκοκατασταλτικών γονιδίων τα οποία ελέγχουν την παραγωγή µορίωνρυθµιστών της αγγειογένεσης. Τέλος, η διατάραξη της δυναµικής ισορροπίας των επαγωγέων και των αναστολέων της αγγειογένεσης οδηγεί σε επαγωγή της αγγειογένεσης. Η αγγειογενετική δραστηριότητα σε ένα νεοπλασµατικό όγκο επάγεται από την έκκριση ειδικών αυξητικών παραγόντων καθώς και αναστολέων της αγγειογένεσης που παράγονται από τα καρκινικά κύτταρα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα ή ορισµένα κύτταρα του στρώµατος όπως τα µακροφάγα και τα µαστοκύτταρα. Η κατανοµή τους συνήθως διαφέρει ανάλογα µε το είδος του όγκου και του ιστού στον οποίο εντοπίζεται, καθώς επίσης και από το στάδιο της κακοήθους εξαλλαγής. 49

50 2.3.1 O ρόλος της υποξίας στην αγγειογένεση Ο πιο σηµαντικός ίσως παράγοντας που επάγει την έναρξη της αγγειογένεσης είναι η υποξία. Η υποξία επηρεάζει τον πολλαπλασιασµό των νεοπλασµατικών κυττάρων 56 και την απόπτωση 57 όπως και τη µετάσταση 58. Η ενδοκυττάρια συγκέντρωση του οξυγόνου καθορίζει τα επίπεδα του επαγόµενου από την υποξία παράγοντα HIF-1 (hypoxia inducible factor) 59,60. O παράγοντας ΗΙF-1, ένας ετεροδιµερής παράγοντας που αποτελείται από δυο πρωτεϊνικές υποµονάδες, τη HIF-1α και τη HIF-1β, ενεργοποιεί τη µεταγραφή πολλών γονιδίων που ελέγχουν τη µεταφορά της γλυκόζης, τα γλυκολυτικά ένζυµα, τη γλυκονεογένεση, τους αυξητικούς παράγοντες, την ερυθροποίηση, το µεταβολισµό της αίµης, τη µεταφορά του σιδήρου, την αγγειοκινητική ρύθµιση και τη σύνθεση του µονοξειδίου του αζώτου 61,62. Με τις δράσεις αυτές αυξάνεται η επιβίωση των νεοπλασµατικών κυττάρων κάτω από συνθήκες υποξίας (Εικόνα 7). Σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις οξυγόνου στα κύτταρα, η πρωτεΐνη HIF-1α αποσυντίθεται συνεχώς µέσω της οδού της ουµπικιτίνης. Σε συνθήκες υποξίας εµποδίζεται αυτή η οδός και η πρωτεΐνη σταθεροποιείται µε αποτέλεσµα να αυξάνεται η ενδοκυττάρια συγκέντρωσή της 59,63. Αν και δεν είναι ακόµη σαφής ο µηχανισµός µε τον οποίο γίνεται αντιληπτή από το κύτταρο η έλλειψη οξυγόνου πιστεύεται ότι η σταθεροποίηση της πρωτεΐνης HIF-1α προκαλείται από µηχανισµούς οξειδοαναγωγής 64. Συµπερασµατικά η ποσότητα της πρωτεΐνης HIF-1 α στον πυρήνα φαίνεται ότι καθορίζει τη λειτουργική δράση του συµπλέγµατος HIF O παράγοντας HIF ενεργοποιεί τη µεταγραφή του γονιδίου VEGF 65 που όπως είναι γνωστό αποτελεί ένα από τα πιο σηµαντικά µόρια που επάγουν την αγγειογένεση. Άλλα ογκογόνα πεπτίδια που ενεργοποιούνται µε τον ίδιο τρόπο είναι η κυκλοοξυγενάση-2 (COX-2) 66, o αυξητικός παράγοντας που προέρχεται από τα αιµοπετάλια (Platelet Derived Growth Factor, PDGF) 67 και ο ιστικός παράγοντας (Tissue Factor,TF)

51 Εικόνα 7: Ο ρόλος της υποξίας και του παράγοντα HIF-1 στη δηµιουργία αγγείων. 2.4 Αγγειογένεση σε φυσιολογικές καταστάσεις Αγγειογενετική δραστηριότητα στους ενηλίκους παρατηρείται σε φυσιολογικά κύτταρα και είναι απαραίτητη κατά την ανάπτυξη και αναπαραγωγή των ιστών, την επούλωση τραυµάτων και όπως έχει αποδειχθεί παίζει πρωτεύοντα ρόλο σε καταστάσεις φλεγµονής 46. Χαρακτηριστικό παράδειγµα φυσιολογικής αγγειογένεσης είναι αυτή που λαµβάνει χώρα στους ιστούς του γυναικείου γεννητικού συστήµατος. Στην περίπτωση αυτή παρατηρούνται αυξοµειώσεις των αγγειογενετικών παραγόντων κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ηλικίας της γυναίκας, µε σηµαντική µείωση της αγγειογένεσης κατά τη διάρκεια της έµµηνης ρύσης και αύξηση στο µέσον του κύκλου, η οποία ακολουθείται από σταδιακή µείωση ως το τέλος του κύκλου. Σε όλες τις άλλες περιπτώσεις και τα λοιπά όργανα και ιστούς του ανθρώπινου οργανισµού η διαδικασία της αγγειογένεσης βρίσκεται σε λανθάνουσα κατάσταση. Κατά την διεργασία του φυσιολογικού σχηµατισµού νέων αιµοφόρων αγγείων είναι χαρακτηριστικό ότι λαµβάνει χώρα ταχύς σχηµατισµός και ωρίµανση των αγγείων. Το νέο αγγειακό δίκτυο οργανώνεται µε τάξη, έχει σαφή όρια 51

52 και χαρακτηρίζεται από αυξηµένη σταθερότητα. Μόλις ολοκληρωθεί η διαδικασία αυτή επέρχεται και πάλι αγγειογενετική αδράνεια στους ιστούς Αγγειογένεση σε παθολογικές καταστάσεις Όταν η αύξηση των µικροαγγείων είναι µη ελεγχόµενη, η αγγειογένεση είναι παθολογική και εµπλέκεται στην ανάπτυξη διαφόρων µη νεοπλασµατικών αλλά κυρίως, νεοπλασµατικών νοσηµάτων Αγγειογένεση σε µη νεοπλασµατικά νοσήµατα Η υπερβολική αλλά και η ανεπαρκής ανάπτυξη των αιµοφόρων αγγείων µπορεί να οδηγήσει σε µη νεοπλασµατικές ασθένειες. Οι κυριότερες αιτίες που µπορεί να οδηγήσουν σε τέτοιου είδους µη νεοπλασµατικές ασθένειες είναι η φλεγµονή και η υποξία. Οι παθολογικές καταστάσεις αγγειογένεσης περιλαµβάνουν νοσήµατα του καρδιαγγειακού συστήµατος όπως η ισχαιµική νόσος του µυοκαρδίου 69, η εγκεφαλική υποξία 70, νοσήµατα χρόνιας φλεγµονής όπως η ρευµατοειδής αρθρίτιδα 71 και η φλεγµονώδης νόσος του εντέρου 72, η διαβητική αµφιβληστροειδοπάθεια 73, η εκφύλιση της ωχράς κηλίδας 74, η ψωρίαση 75 και η ενδοµητρίωση 76. Επίσης η ανώµαλη κατανοµή εξωκυττάριας ουσίας ή η υπεραιµία παρεµποδίζει την µεταφορά οξυγόνου και προκαλεί υποξία σε παθήσεις όπως ο διαβήτης 77, το άσθµα 78 και η ασθένεια Altzheimer Αγγειογένεση σε νεοπλάσµατα Η αγγειογένεση της νεοπλασίας είναι µια ξεχωριστή κατηγορία αγγειογένεσης µε χαρακτηριστικές διαφορές από τη φυσιολογική αγγειογένεση. Είναι γνωστό ότι ένας ανάγγειος όγκος µπορεί να αναπτυχθεί ως τη διάµετρο των 2 mm. Πέραν αυτού του µεγέθους, η διαδικασία της διάχυσης δεν είναι ικανή να τον τροφοδοτήσει µε το απαραίτητο οξυγόνο και τα θρεπτικά συστατικά που απαιτούνται προκειµένου να διατηρήσει το ρυθµό ανάπτυξής του 80. Χωρίς αγγειακά στοιχεία ο όγκος αυτός ωθείται σε απόπτωση που ξεκινάει από το κέντρο του, που είναι το σηµείο µε τη µικρότερη οξυγόνωση και επεκτείνεται προς την περιφέρεια. Τελικό αποτέλεσµα είναι η κεντρική νέκρωση του όγκου και η ανάπτυξη του µόνο κατά το µέτωπο διήθησης, έως ότου τελικά νεκρωθεί τµηµατικά 52

53 και αυτό, λόγω της εκτεταµένης επιφάνειας που είναι αδύνατο να συντηρηθεί 33. Είναι λοιπόν εύλογη η ανάγκη του όγκου για µαζικότερη προσφορά θρεπτικών συστατικών και οξυγόνου, που πρακτικά µόνο αγγειακοί σχηµατισµοί προσφέρουν. Γι αυτό το λόγο κάθε όγκος δηµιουργεί στην περιφέρεια του ένα ιδιαίτερο νεοπλασµατικό περιβάλλον που ως στόχο έχει την πυροδότηση της αγγειογένεσης 81. Η παρατήρηση έντονης αγγειογενετικής δραστηριότητας γύρω από τους καρκινικούς όγκους έγινε στις αρχές του 20ου αιώνα 82. Ο διακεκριµένος ρόλος της αγγειογένεσης στη βιολογία του καρκίνου περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Folkman το , ο οποίος υποστήριξε το φαινόµενο της «αδράνειας του καρκίνου» σε απουσία του σχηµατισµού νέων αιµοφόρων αγγείων. Το 1976 ο Gullino 84 απέδειξε ότι τα προκαρκινικά κύτταρα στους ιστούς αποκτούν αγγειογενετική ικανότητα κατά τη διαδικασία της καρκινικής εξαλλαγής τους και έδωσε την ώθηση για την ανάπτυξη στρατηγικών για την αντιµετώπιση της αγγειογένεσης ως µέσο πρόληψης της νόσου. Το 1992 ο Folkman επανήλθε προτείνοντας ότι η ανάπτυξη των όγκων και η µετάσταση στηρίζονται στην αγγειογενετική διαδικασία, την οποία υπέδειξε ως πρωταρχικό στόχο καταστολής για την αντιµετώπιση του καρκίνου 85. Πρόσφατες πειραµατικές και κλινικές µελέτες έδειξαν ότι η αγγειογένεση είναι απαραίτητη στον καρκίνο για την εξέλιξη, τη διεισδυτικότητα και τη µετάσταση. Όπως ήδη ελέχθη όταν ένας καρκινικός όγκος αυξηθεί πέραν των 1-2 mm δεν µπορεί να προσλάβει οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά µέσω της διάχυσης και εποµένως στηρίζεται αποκλειστικά και µόνο στην αγγειογένεση, η ο- ποία συνεισφέρει επίσης και συµβάλλει στην µεταστατική διαδικασία επιτρέποντας την απελευθέρωση των καρκινικών κυττάρων στην κυκλοφορία 86. Η αγγειογενετική δραστηριότητα σε έναν όγκο είναι το αθροιστικό αποτέλεσµα αγγειογενετικών και αγγειοκατασταλτικών παραγόντων. Αυτό απέδειξαν πολλές ανεξάρτητες µελέτες παρουσιάζοντας στοιχεία ότι ουσίες µε αντιαγγειογενετική δράση ή ουσίες που καταστέλλουν τους ενδογενείς αγγειογενετικούς παράγοντες παρεµποδίζουν την ανάπτυξη και τη µετάσταση των όγκων, ενισχύοντας παράλληλα την άποψη της πολυπλοκότητας των κυτταρικών και µοριακών µηχανισµών που ελέγχουν την αγγειογένεση. Σήµερα, είναι γενικά 53

54 αποδεκτή η άποψη του «αγγειογενετικού διακόπτη», ότι δηλαδή το έναυσµα της αγγειογένεσης δίνεται από τη διατάραξη της δυναµικής ισορροπίας των επαγωγέων και των αναστολέων της αγγειογένεσης σε βάρος των δεύτερων, µε αποτέλεσµα την «αφύπνιση των όγκων» Αγγειογένεση σε συµπαγείς όγκους Αυξηµένη αγγειογένεση έχει παρατηρηθεί στην πλειονότητα των συµπαγών όγκων όπως, στον καρκίνο του µαστού 87, στον καρκίνο του προστάτη 88, στον καρκίνο του παχέος εντέρου 89, στον καρκίνο του δέρµατος 90,91,92, στον καρκίνο του νεφρού 93,94, στους όγκους της κεφαλής και του τραχήλου 95,96,97, στον καρκίνο του πνεύµονα 98,99,100, στους όγκους του κεντρικού νευρικού συστήµατος 101, καθώς και στον καρκίνο του στοµάχου 102 και του παγκρέατος 103. Επιπλέον, έχει γίνει συσχέτιση της αγγειογένεσης µε φτωχή πρόγνωση σε πολλά νεοπλάσµατα όπως το µελάνωµα 90, o καρκίνος του µαστού 104,105, ο καρκίνος του προστάτη 106, το µεσοθηλίωµα 107, ο καρκίνος του τραχήλου της µήτρας 108, ο καρκίνος του ενδοµητρίου 109, ο καρκίνος των ωοθηκών 110 και πιο πρόσφατα το ρετινοβλάστωµα 111 και το οστεοσάρκωµα 112. Αντίθετα ευρήµατα προέκυψαν από µια µελέτη συσχέτισης της αγγειογένεσης µε τη πρόγνωση σε ασθενείς µε αδενοκαρκίνωµα του παχέος εντέρου Αγγειογένεση σε αιµατολογικές κακοήθειες Όσον αφορά στις αιµατολογικές κακοήθειες, οι µελέτες είναι πιο πρόσφατες και δεν είναι ξεκάθαρη η σχέση αυξηµένης αγγειογένεσης µε την πρόγνωση τους. Μέχρι σήµερα πολλοί ερευνητές έχουν µελετήσει το ρόλο της νεοαγγειογένεσης σε ποικίλα νεοπλασµατικά αιµατολογικά νοσήµατα της παιδικής ηλικίας αλλά και των ενηλίκων, όπως µυελοδυσπλαστικά σύνδροµα, µυελώµατα, οξείες και χρόνιες λευχαιµίες Μυελοδυσπλαστικά σύνδροµα (Μ Σ) Στο µυελό των οστών ασθενών µε Μ Σ βρέθηκε αυξηµένη αγγειογένεση σε σχέση µε τους υγιείς µάρτυρες, και µάλιστα αυτή είναι πιο έντονη στα Μ Σ υψηλού κινδύνου απ ότι στα χαµηλού κινδύνου 113. Με βάση την FAB ταξινό- 54

55 µηση, η µικροαγγειακή πυκνότητα βρέθηκε σηµαντικά πιο αυξηµένη στην ανθεκτική αναιµία µε περίσσεια βλαστών σε µεταµόρφωση (RAEB-t), στην χρόνια µυελοµονοκυτταρική λευχαιµία (CMML) και στα µυελοδυσπλαστικά σύνδροµα µε ίνωση 114. Ο ρόλος της αγγειογένεσης στα Μ Σ παραµένει διφορούµενος και ποικίλει σε διάφορες µελέτες. Σύµφωνα µε την µελέτη των Korkopoulou P και συν. 115 έχει βρεθεί ότι η µικροαγγειακή πυκνότητα έχει προγνωστική αξία στα Μ Σ. Αντίθετα οι Lundberg και συν. 116 µελετώντας βιοψίες µυελού των οστών ασθενών µε Μ Σ υποστηρίζουν ότι δεν υπάρχει συσχέτιση της αγγειογένεσης και της ολικής επιβίωσης των ασθενών αυτών. Σε ορισµένες µελέτες αναφέρεται ότι η µικροαγγειακή πυκνότητα στο µυελό των οστών αυξάνεται ανάλογα µε την πρόοδο του Μ Σ 117,118 ενώ σε άλλες υποστηρίζεται ότι υπάρχει αυξηµένη αγγειογένεση στα αρχικά αλλά όχι στα πιο προχωρηµένα στάδια των Μ Σ 119, Μυελοϋπερπλαστικά σύνδροµα Αντικείµενο εκτεταµένων µελετών αποτελεί η αγγειογένεση στην χρόνια µυελογενή λευχαιµία (ΧΜΛ) και στην ιδιοπαθή µυελοΐνωση (ΙΜ). Συγκεκριµένα, στην ΧΜΛ έχει βρεθεί αυξηµένη µικροαγγειακή πυκνότητα µε τη χρήση διάφορων ανοσοϊστοχηµικών τεχνικών 120,121,122. Στην µελέτη των Korkopoulou P και συν. 123 ελέγχθηκαν 52 ασθενείς µε ΧΜΛ και φάνηκε ότι η µικροαγγειακή πυκνότητα αποτελεί σηµαντικό προγνωστικό δείκτη για τη συνολική επιβίωση ενώ παρατηρήθηκε και θετική συσχέτιση µεταξύ της ίνωσης του µυελού και της µικροαγγειακής πυκνότητας. Τα λευχαιµικά κύτταρα στην ΧΜΛ εκφράζουν την Αγγειοποητίνη-1 (Ang-1) και τον υποδοχέα της, Tie-2, που υπάρχει στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης της τυροσινικής κινάσης Tie-1 στις οστεοµυελικές βιοψίες ασθενών µε ΧΜΛ είναι σηµαντικά υψηλότερα σε σύγκριση µε των φυσιολογικών µαρτύρων και αποτελούν προγνωστικό δείκτη επιβίωσης στην αρχική φάση της χρόνιας φάσης της ΧΜΛ, ανεξάρτητα από το µέγεθος του σπλήνα, την ηλικία, την αιµοσφαιρίνη και τον αριθµό των βασεοφίλων 124. Πολύ σηµαντικό είναι το εύρηµα του Gunsilius 125 ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα στην ΧΜΛ προέρχονται από τον κακοήθη κλώνο αφού περιέχουν όλα τα υβριδικό γονίδιο bcr-abl. Το γεγονός αυτό οδηγεί στην σκέψη ότι η ΧΜΛ ξεκι- 55

56 νά από κάποιο αιµαγγειοβλαστικό αρχέγονο κύτταρο από τον ίδιο κλώνο µε τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Όσον αφορά τους αγγειογενετικούς παράγοντες στην ΧΜΛ, έχουν βρεθεί σε αυξηµένα επίπεδα στο πλάσµα και τον ορό ασθενών οι παράγοντες VEGF, bfgf, HGF, TNF-a σε σχέση µε φυσιολογικούς µάρτυρες 126,127,128 όπως επίσης ανιχνεύθηκαν και υψηλότερα επίπεδα VEGF πλάσµατος σε σύγκριση µε ασθενείς πάσχοντες από οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία 113. Η Ιδιοπαθής Μυελοΐνωση (ΙΜ) αποτελεί ίσως την πιο αντιπροσωπευτική πάθηση για την µελέτη της αγγειογένεσης σε σύγκριση µε τα άλλα µυελοϋπερπλαστικά σύνδροµα. Πράγµατι, από την µελέτη των Lundberg και συν. 120 φάνηκε ότι υπάρχει αυξηµένη µικροαγγειακή πυκνότητα και θετικότητα στη χρώση µε VEGF στην οστεοµυελική βιοψία. Στη συνέχεια, ο Mesa και συν. 129 µελέτησαν 114 ασθενείς µε ΙΜ και κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι το 70% των ασθενών αυτών είχαν αύξηση της µικροαγγειακής πυκνότητας σε σύγκριση µε υγιείς αλλά και µε ασθενείς πάσχοντες από ιδιοπαθή θροµβοκυττάρωση ή αληθή πολυκυτταραιµία. Η ίδια µελέτη έδειξε ότι η αυξηµένη αγγειογένεση του µυελού των οστών είχε και προγνωστική σηµασία επηρεάζοντας την επιβίωση, µαζί µε την ηλικία και το µέγεθος του σπλήνα. Αξίζει να σηµειωθεί ότι η αγγειογένεση στην ΙΜ αποτελεί και θεραπευτικό στόχο 130,131. Όσον αφορά την Ιδιοπαθή Θροµβοκυττάρωση (ΙΘ) και τη σχέση της µε την αγγειογένεση οι µελέτες είναι περιορισµένες. Έχει παρατηρηθεί αυξηµένη µικροαγγειακή πυκνότητα σε ασθενείς µε ΙΘ συγκριτικά µε υγιείς µάρτυρες αλλά και σε άτοµα µε αντιδραστική θροµβοκυττάρωση. Τέλος, αγγειογενετικοί παράγοντες όπως ο VEGF και ο bfgf έχουν βρεθεί αυξηµένοι σε ασθενείς µε ΙΘ σε σχέση µε υγιείς µάρτυρες 126,127. Οι µελέτες αναφορικά µε την αγγειογένεση στην αληθή πολυκυτταραιµία (ΑΠ) είναι επίσης περιορισµένες. Στη µελέτη των Mesa και συν. 132 αναφορικά µε την αγγειογένεση στην ΑΠ, βρέθηκε ότι από τους 15 ασθενείς που αξιολογήθηκαν οι 4 παρουσίαζαν φυσιολογικό αριθµό αγγείων στην οστεοµυελική βιοψία, οι 6 αυξηµένο αριθµό αγγείων και οι 5 πολύ µεγάλη αύξηση των αγγείων τους σε σχέση µε τους υγιείς. Άλλη παρατήρηση για αυξηµένη αγγειογένεση µε µέτρηση της µικροαγγειακής πυκνότητας σε ασθενείς µε ΑΠ είναι των Panteli και συν. όπου επίσης αναφέρει υψηλότερο αριθµό αγγείων σε σχέση µε τους 56

57 υγιείς 121. Αντίθετα οι Palmblad και συν. 133 έχουν ανακοινώσει ότι η µικροαγγειακή πυκνότητα ασθενών µε ΑΠ δεν διέφερε σε σχέση µε των υγιών µαρτύρων. Έχει βρεθεί ότι ασθενείς µε ΑΠ παρουσίασαν υψηλότερα επίπεδα VEGF και bfgf ορού σε σχέση µε φυσιολογικούς µάρτυρες 134, Πολλαπλούν Μυέλωµα (ΠΜ) Ο Barlogie και συν. 135 παρατήρησαν ότι τα έντονα αυξανόµενα και καλά διαφοροποιηµένα πλασµατοκύταρα προάγουν την αγγειογένεση τόσο µε παρακρινείς όσο και µε αυτοκρινείς µηχανισµούς. Τόσο σε in vivo όσο και σε in vitro µελέτες διαπιστώθηκε επίσης ότι τα κύτταρα του ΠΜ παράγουν και εκκρίνουν τον VEGF 136,137,138,139. Ο VEGF παράλληλα µε την αγγειογενετική δράση που ασκεί µέσω της διέγερσης των ιντεγκρινών ανβ3 και ανβ5, διεγείρει και τη µετανάστευση των πλασµατοκυττάρων 140,141. Τα νεοπλασµατικά πλασµατοκύτταρα παρουσιάζουν υπερέκφραση και άλλων αγγειογενετικών κυτταροκινών όπως του HGF (Hepatocyte Growth Factor) και της αγγειοποιητίνης Επίσης, οι µεταλλοπρωτεϊνάσες εµπλέκονται στην νόσο και έχει δειχθεί ότι η έκκριση της µεταλλοπρωτεϊνάσης 2 (ΜΜΡ-2) είναι µεγαλύτερη σε ασθενείς πάσχοντες από ΠΜ σε σύγκριση µε ασθενείς µε µονοκλωνική γαµµαπάθεια αδιευκρίνιστης σηµασίας (Monoclonal Gammapathy of Undetermined Significance, MGUS) 143. Η έκφραση των παραγόντων αυτών είναι εντονότερη στον µυελό των οστών από ότι στο περιφερικό αίµα και αυξάνει ακόµη περισσότερο σε προχωρηµένα στάδια της νόσου 144,145,146. Η αυξηµένη αγγειογενετική δραστηριότητα που παρατηρείται στο ΠΜ έχει επίσης συσχετιστεί µε την αυξηµένη εξωµυελική επέκταση της νόσου κατά την ενεργό φάση της 147. Έχει επίσης εκτιµηθεί ότι ο αγγειογενετικός δείκτης της µικροαγγειακής πυκνότητας είναι χαµηλός ή χωρίς σηµασία σε ασθενείς µε MGUS και µη ενεργό ΠΜ, ενώ αυξάνει εντυπωσιακά σε ασθενείς µε ενεργό ΠΜ. Οι παρατηρήσεις αυτές οδήγησαν στην διατύπωση της άποψης ότι η MGUS και το µη ενεργό ΠΜ αντιστοιχούν στην προαγγειακή φάση της νόσου, ενώ το ενεργό ΠΜ στην αγγειακή φάση της 138,147. Έτσι υποστηρίζεται ότι ο µυελός µε αυξηµένη αγγειογένεση αποτελεί ένδειξη ενεργού νόσου 148. Σύµφωνες µε τα παραπάνω είναι και οι 57

58 παρατηρήσεις του άµεσου συσχετισµού της µικροαγγειακής πυκνότητας µε το στάδιο της νόσου, την εξέλιξη και την πρόγνωσή της 149,150. Ορισµένοι συγγραφείς υποστηρίζουν ότι σε ασθενείς µε ΠΜ που αντιµετωπίστηκαν µε αντιαγγειογενετική αγωγή διαπιστώθηκε σηµαντική µείωση των αγγειογενετικών κυτταροκινών VEGF και b-fgf 151,152, ενώ άλλοι υποστηρίζουν ότι ο αυξηµένος αγγειογενετικός δείκτης που παρουσιάζουν οι ασθενείς αυτοί παραµένει σηµαντικά υψηλός ακόµη και µετά από πλήρη ύφεση της νόσου 144,153. Ασυµφωνία υπάρχει επίσης όσον αφορά τα αποτελέσµατα των αντιαγγειογενετικών θεραπευτικών σχηµάτων, καθώς και την αξία προσδιορισµού της µικροαγγειακής πυκνότητας. Έτσι οι Singhal και συν. 154 και Ahn και συν. 136 υποστηρίζουν ότι η µικροαγγειακή πυκνότητα σχετίζεται µόνο µε την επιβίωση του ό- γκου και όχι µε την επιβίωση των ασθενών, ενώ οι Vacca και συν. ( ) βρίσκουν ότι η µικροαγγειακή πυκνότητα σχετίζεται τόσο µε το στάδιο της νόσου, όσο και µε την αυξητική δραστηριότητα των κυττάρων της, την εξέλιξη και την πρόγνωσή της 155,147,143, Οξεία λεµφοβλαστική λευχαιµία (ΟΛΛ) Η αρχική µελέτη των Perez και Atayde 157 έδειξε αυξηµένη µικροαγγειακή πυκνότητα σε οστεοµυελικές βιοψίες παιδιών µε οξεία λεµφοβλαστική λευχαι- µία (ΟΛΛ), εύρηµα που επιβεβαιώθηκε και από επόµενες µελέτες 113,158. Στην µελέτη του Pulé και συν. 158 βρέθηκε ότι οι ασθενείς σε ύφεση παρουσίαζαν µείωση της µικροαγγειακής πυκνότητας, χωρίς όµως να αποδεικνύεται ότι η µικροαγγειακή πυκνότητα στην ΟΛΛ έχει προγνωστική αξία ή αποτελεί δείκτη υποτροπής της νόσου. Όσον αφορά τους αγγειογενετικούς παράγοντες έχουν βρεθεί αυξηµένα επίπεδα των HGF, TNF-α, bfgf στο πλάσµα, όχι όµως και του VEGF 113. Σε ορισµένες µελέτες βρέθηκαν αυξηµένα επίπεδα του VEGF και του bfgf σε ΟΛΛ ασθενείς την ύφεση ενώ σε άλλες δεν εντοπίστηκε σηµαντική διαφορά στην µικροαγγειακή πυκνότητα των ασθενών στην διάγνωση και την ύφεση 158,159. Γεγονός είναι ότι οι περισσότερες µελέτες σχετικά µε τον ρόλο της αγγειογένεσης στην ΟΛΛ έγιναν σε παιδιά, ενώ υπάρχουν περιορισµένα στοιχεία για τους ενηλίκους. Σε µια µελέτη που περιλάµβανε 95 ηλικιωµένους ασθενείς µε 58

59 ΟΛΛ βρέθηκε ότι ασθενείς µε αυξηµένα επίπεδα VEGF παρουσίαζαν σηµαντικά καλύτερη επιβίωση σε σχέση µε αυτούς µε χαµηλά επίπεδα του παράγοντα Χρόνια λεµφογενής λευχαιµία (ΧΛΛ) Σε ασθενείς που πάσχουν από ΧΛΛ έχουν γίνει µελέτες εκτίµησης της αγγειογένεσης τόσο µε προσδιορισµό της µικροαγγειακής πυκνότητας όσο και αγγειογενετικών παραγόντων. Όσον αφορά την µέτρηση της µικροαγγειακής πυκνότητας σε µια µελέτη βρέθηκε υψηλή µικροαγγειακή πυκνότητα σε οστεοµυελικές βιοψίες ασθενών µε Β-ΧΛΛ, µε την χρήση του µονοκλωνικού αντισώµατος CD34, η οποία σχετιζόταν µε το στάδιο της νόσου 161, ενώ σε µελέτη που µετρήθηκε η µικροαγγειακή πυκνότητα σε ασθενείς µε ΧΛΛ, χρησιµοποιώντας την ανοσοϊστοχηµική χρώση µε τον παράγοντα FVIII δεν βρέθηκε αύξησή της 113. Σύµφωνα µε την µελέτη των Molica και συν. 162 τα επίπεδα του VEGF βρέθηκε να έχουν προγνωστική αξία, εφόσον υπήρχε αρνητική συσχέτιση των επιπέδων µε την επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (progression-free survival) των ασθενών 162. Γενικά, στην ΧΛΛ παρατηρείται µια διαταραχή στην ισορροπία αγγειογενετικών και αντιαγγειογετικών παραγόντων που εκκρίνονται από τα λευχαιµικά κύτταρα και αυτό δίνει έναυσµα για αυξηµένη αγγειογένεση. Παράγοντες που ενοχοποιούνται για την διαταραχή της ισορροπίας θα µπορούσαν να είναι η υ- ποξία ή οι γενετικές µεταλλάξεις όπως του p53, που παρατηρούνται στην ανθεκτική ΧΛΛ Αγγειογένεση και λευχαιµία πιθανός µηχανισµός Η διαδικασία της λευχαιµογένεσης δεν έχει µέχρι σήµερα πλήρως διευκρινισθεί. Ένας από τους λόγους για τους οποίους δεν είναι πλήρως κατανοητή η παθοφυσιολογία της λευχαιµίας είναι ότι το λευχαιµικό µικροπεριβάλλον είναι πλούσιο σε κυτταρικά και χηµικά συστατικά. Λόγω αυτού τα κύτταρα του στρώµατος και τα παρεγχυµατικά κύτταρα φαίνεται ότι δρουν και αντιδρούν υπό τον έλεγχο ενός άριστα οργανωµένου δικτύου κυτταροκινών 45. εν είναι πλήρως κατανοητό γιατί οι αγγειογενετικοί παράγοντες που προέρχονται από τα 59

60 προγονικά κύτταρα ή οι αυξητικοί παράγοντες που εκκρίνονται από τα ενδοθηλιακά αλλά και άλλα στρωµατικά κύτταρα παίζουν το σηµαντικότερο ρόλο στον πολλαπλασιασµό και την ωρίµανση των αιµοποιητικών προγονικών κυττάρων 164. Λόγω του ότι η λευχαιµία είναι κακοήθεια του αιµοποιητικού συστήµατος, είναι δύσκολη η κατανόηση του µηχανισµού της αγγειογένεσης ως παράγοντα ανάπτυξης και εξέλιξης της νόσου σε σχέση µε τους συµπαγείς όγκους. Ένα σχήµα που έχει προκύψει από διάφορες ερευνητικές οµάδες οι οποίες µελετούν την αγγειογένεση στην λευχαιµία φαίνεται στην Εικόνα 8. Αυτό το µοντέλο βασίζεται σε αυτοκρινείς και παρακρινείς οδούς µεταξύ των κυττάρων του στρώ- µατος και των παρεγχυµατικών κυττάρων του µυελού. Τα λευχαιµικά κύτταρα απελευθερώνουν αγγειογενετικούς παράγοντες, όπως ο VEGF ο οποίος συνδέεται µε υποδοχείς που φέρουν τα λευχαιµικά κύτταρα στην επιφάνεια τους και δηµιουργείται µια αυτοκρινής οδός ή εναλλακτικά συνδέεται µε τους υποδοχείς των ενδοθηλιακών κυττάρων σε µια παρακρινή δράση. Στη συνέχεια τα ενδοθηλιακά κύτταρα ενεργοποιούνται µε τη τυροσινική κινάση που ευοδώνεται από τον VEGF µε συνέπεια την απελευθέρωση και άλλων αυξητικών παραγόντων όπως GM-CSF, IL-6, SCF και G-CSF. Η απελευθέρωση αυτών των αυξητικών παραγόντων από τα ενδοθηλιακά κύτταρα οδηγεί σε παραγωγή και πολλαπλασιασµό των λευχαιµικών κυττάρων (παρακρινής οδός) αλλά και σε πολλαπλασιασµό των ίδιων των ενδοθηλιακών κυττάρων (αυτοκρινής οδός). Επιπλέον οι αυξητικοί παράγοντες που απελευθερώνονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα µπορεί ακόµη να ασκούν διεγερτική δράση στα κύτταρα φλεγµονής, δηλαδή στα ουδετερόφιλα και τα µακροφάγα, τα οποία µπορεί να έχουν θετική αλληλεξάρτηση στα βλαστικά και ενδοθηλιακά κύτταρα ευοδώνοντας έτσι συνεχώς την παρακρινή οδό. Αξιοσηµείωτο είναι επίσης ότι τα διεγερµένα ενδοθηλιακά κύτταρα όχι µόνο απελευθερώνουν αυξητικούς παράγοντες αλλά επίσης εξωκυττάρια ουσία και µεταλλοπρωτεïνάσες οι οποίες προκαλούν εξαγγείωση και µετανάστευση νεοσχηµατισθέντων ενδοθηλιακών κυττάρων και διάσπαση των ισο- µερών µορφών του VEGF που είναι συνδεδεµένες µε την εξωκυττάρια ουσία. Συνεπώς αυτά τα γεγονότα απεικονίζουν ένα ιδανικό περιβάλλον στο µυελό για την ανάπτυξη των λευχαιµικών κυττάρων. 60

61 Εικόνα 8: Μοντέλο αυτοκρινών και παρακρινών οδών µεταξύ των κυτταρικών τύπων του µικροπεριβάλλοντος του µυελού των οστών Αγγειογένεση και Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία Η πρώτη αναφορά για την ύπαρξη πιθανής συσχέτισης της αγγειογένεσης µε την ΟΜΛ ανάγεται στο Απο τότε ακολούθησαν διάφορες µελέτες προκειµένου να εκτιµηθεί περαιτέρω η συσχέτιση αυτή αλλά και η επίδραση της αγγειογένεσης στην παθογένεια, την πορεία και την πρόγνωση της νόσου. Τα αποτελέσµατα όµως των µελετών αυτών είναι αντικρουόµενα µε αποτέλεσµα ο ακριβής ρόλος της αγγειογένεσης στην ΟΜΛ να παραµένει αδιευκρίνιστος. Οι διάφορες µέθοδοι που χρησιµοποιήθηκαν για την εκτίµηση της αγγειογένεσης 61

62 από τους ερευνητές πιθανόν να συµβάλλουν και στα διαφορετικά συµπεράσµατα στα οποία κατέληξαν. Όπως αναφέρθηκε, η πρώτη αναφορά για την ύπαρξη πιθανής συσχέτισης της αγγειογένεσης µε την Οξεία Μυελογενή Λευχαιµία, έγινε το 1997 από τους Fiedler και συν Στην εργασία αυτή µελετήθηκε η έκφραση του VEGF και των υποδοχέων του στους λευχαιµικούς βλάστες από τον µυελό των οστών και το περιφερικό αίµα ασθενών µε ΟΜΛ, µε την µέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης µε τη χρήση αντίστροφης µεταγραφάσης (Reverse Transcriptase PCR, RT-PCR). Από τους 32 ασθενείς που µελετήθηκαν, µόνο οι 23 εκφράζανε VEGF. Τα ίδια αποτελέσµατα επιβεβαιώθηκαν και µε την µέθοδο της ανοσοϊστοχηµείας, µε τη χρησιµοποίηση ενός πολυκλωνικού αντισώµατος έναντι του VEGF. Όταν µελετήθηκε η έκφραση του VEGF στο υπερκείµενο καλλιεργειών βλαστών από τους ίδιους ασθενείς µε τη µέθοδο ELISA βρέθηκε στατιστικά σηµαντική αυξηµένη συγκέντρωση του VEGF σε σχέση µε τους υ- γιείς δότες µυελού των οστών 165. Το 1999 οι Aguayo και συν. 166 εξέτασαν αν τα επίπεδα του VEGF έχουν κάποια προγνωστική σηµασία στους ασθενείς µε ΟΜΛ. Για την παρουσία ή όχι του VEGF χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος Western Blot, ενώ για την ποσοτικοποίηση των αποτελεσµάτων η µέθοδος RIA (solid-phase radioimmunoassay). Οι βλάστες του µυελού των οστών ή του περιφερικού αίµατος ασθενών µε ΟΜΛ στην έναρξη της νόσου εξέφραζαν αυξηµένα επίπεδα του VEGF που σχετίστηκαν µε µειωµένη ελεύθερη νόσου επιβίωση όπως και µε µειωµένη συνολική ε- πιβίωση των ασθενών. Αντίθετα, δεν βρέθηκε να υπάρχει συσχέτιση των επιπέδων του VEGF µε τους καθιερωµένους προγνωστικούς δείκτες (ηλικία, καρυότυπος, παρουσία άλλων αιµατολογικών κακοηθειών κ.α.), αλλά ούτε και µε τον αριθµό των λευκών αιµοσφαιρίων ή των αριθµό των βλαστών. Το συµπέρασµα της µελέτης είναι ότι τα κυτταρικά επίπεδα του VEGF θα µπορούσαν να αποτελέσουν έναν ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη της πορείας των ασθενών µε ΟΜΛ 166. Από το 2000 και µετά υπάρχουν αναφορές σχετικά µε την µελέτη της αγγειογένεσης στην ΟΜΛ, µε αντιφατικά όµως αποτελέσµατα, ενδεχοµένως λόγω του υλικού και της µεθόδου που χρησιµοποιήθηκε σε κάθε ερευνητική εργασία. 62

63 Αρχικά, για την µελέτη της αγγειογένεσης στην ΟΜΛ χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της ανοσοϊστοχηµείας σε οστεοµυελικές βιοψίες µυελού οστών ασθενών µε ΟΜΛ και υγιών ατόµων, µε ειδικούς ενδοθηλιακούς δείκτες. Στην εργασία των Hussong και συν. 167 χρησιµοποιήθηκε ο παράγοντας von Willebrand factor (vwf) και βρέθηκε ότι ο αριθµός των αγγείων στους ασθενείς µε ΟΜΛ ήταν σηµαντικά αυξηµένος σε σχέση µε τους υγιείς µάρτυρες, ενώ δεν βρέθηκε καµία διαφορά στον αριθµό των αγγείων ανάµεσα στους διάφορους κατά FAB υποτύπους της ΟΜΛ. Στην ίδια µελέτη χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της RT- PCR σύµφωνα µε την οποία οι ΟΜΛ κυτταρικές σειρές HL-60 και U937, καθώς και οι βλάστες από το περιφερικό αίµα ασθενών µε ΟΜΛ, εκφράζουν mrna του παράγοντα VEGF. Επιπλέον, µε σκοπό την µελέτη της έκφρασης της VEGF πρωτεΐνης, έγινε χρώση σε βιοψίες µυελού των οστών µε το αντι-vegf αντίσωµα και βρέθηκε ότι όλα τα δείγµατα εκφράζουν VEGF. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της εργασίας οι βλάστες εξέφραζαν τόσο VEGF mrna όσο και την πρωτεΐνη του VEGF και µάλιστα η έκκριση του VEGF από τα κύτταρα αυτά µπορεί να είναι υπεύθυνη για την δηµιουργία νέων αγγείων και την αυξηµένη αγγειογένεση που παρατηρήθηκε 167. Σε επόµενη µελέτη επιβεβαιώθηκε η αυξηµένη αγγειογένεση σε βιοψίες µυελού, µε τη χρήση του παράγοντα VIII (FVIII) ενώ µετρήθηκαν και τα επίπεδα του VEGF, µε τη µέθοδο της ELISA, στον ορό (163,5 pg/ml) των ΟΜΛ ασθενών τα οποία βρέθηκαν στατιστικά σηµαντικά αυξηµένα σε σχέση µε τα επίπεδα του παράγοντα στο πλάσµα (49,9 pg/ml) 113. Στη συνέχεια για την µελέτη του αριθµού των αγγείων, χρησιµοποιήθηκαν βιοψίες µυελού των οστών από ασθενείς µε ΟΜΛ στη διάγνωση της νόσου, 16 ηµέρες µετά την έναρξη της χηµειοθεραπείας και µετά την επίτευξη ύφεσης. Ο αριθµός των µικροαγγείων ήταν σηµαντικά αυξηµένος στην έναρξη της νόσου, σε σχέση µε τους µάρτυρες. Την 16 η ηµέρα, από την έναρξη της χηµειοθεραπείας, η πυκνότητα των αγγείων µειώθηκε κατά 60% στους ασθενείς µε υποπλαστικούς µυελούς χωρίς βλάστες και κατά 17% στους ασθενείς µε υποπλαστικούς µυελούς και µε αριθµό βλαστών 5% 168. Μετά την επίτευξη πλήρους ύφεσης ο αριθµός των αγγείων µειωνόταν και έφτανε το φυσιολογικά επίπεδα 168,

64 Ακολούθησε µελέτη της έκφρασης του VEGF mrna στους ασθενείς µε ΟΜΛ τόσο από τον µυελό των οστών όσο και από το περιφερικό αίµα, και µετά από καλλιέργεια 24 ωρών µετρήθηκε το mrna του παράγοντα µε την µέθοδο της RT PCR. Οι 17 από τους 20 ασθενείς µε ΟΜΛ βρέθηκε ότι εκφράζουν VEGF mrna σε ποικίλες όµως ποσότητες, και ότι η έκφραση του VEGF mrna σχετίζεται θετικά µε τα επίπεδα του VEGF στον ορό των ασθενών, όπως αυτά µετρήθηκαν µε την µέθοδο της ELISA 169. Το 2002, για πρώτη φορά αναφέρεται αυξηµένη αγγειογένεση στους ασθενείς µε ΟΜΛ µετά την χηµειοθεραπεία. Ο αριθµός των αγγείων στον µυελό των οστών ασθενών στην έναρξη της νόσου βρέθηκε τέσσερις φορές πιο αυξηµένος σε σχέση µε τους υγιείς µάρτυρες, ενώ 30 ηµέρες µετά τη θεραπεία εφόδου βρέθηκε ακόµη πιο αυξηµένος κατά 8,7 φορές. Στην ίδια µελέτη όπου µετρήθηκαν τα επίπεδα του VEGF µε την µέθοδο της ELISA, στο υπερκείµενο καλλιέργειας βλαστών από τους ίδιους ασθενείς και δεν βρέθηκε να διαφέρουν από τα επίπεδα του παράγοντα στους φυσιολογικούς µάρτυρες. Τα αποτελέσµατα της εργασίας σχετικά µε την αγγείωση του µυελού των οστών και την έκφραση του VEGF in vivo δεν συµφωνούν µεταξύ τους, γεγονός που υποστηρίζει ότι η αγγειογένεση στην ΟΜΛ πιθανόν να αντιπροσωπεύει µια απάντηση σε παράγοντες του µικροπεριβάλλοντος in vivo, πάρα να είναι µια αποκλειστική ιδιότητα των λευχαιµικών κυττάρων 170. Σχεδόν ταυτόχρονα οι Padró T και συν. 171 µέτρησαν την έκφραση του VEGF µε τη χρήση του αντι-vegf αντισώµατος σε βιοψίες µυελού των οστών στην ΟΜΛ. Ενώ τα επίπεδα του VEGF βρέθηκαν σηµαντικά αυξηµένα στους ασθενείς στην έναρξη της νόσου σε σχέση µε τους υγιείς µάρτυρες, το σηµαντικότερο εύρηµα της µελέτης είναι ότι τα επίπεδα αυτά παρέµειναν αυξηµένα α- κόµη και µετά την επίτευξη πλήρους ύφεσης. Το ερώτηµα που προκύπτει από την µελέτη τους είναι αν αλλάζει η πηγή παραγωγής και έκκρισης του VEGF στην έναρξη της νόσου και στην ύφεση 171. Το 2002, επίσης, για πρώτη φορά µελετήθηκε η αγγειογένεση σε ενηλίκους ασθενείς (µέση ηλικία 62 έτη) και σε παιδιά (µέση ηλικία 7 έτη) µε ΟΜΛ, µε σκοπό να βρεθούν τυχόν διαφορές στην βιολογία της νόσου και στη συµβολή της αγγειογένεσης στην πορεία της. Για την ανίχνευση της VEGF πρωτεΐνης 64

65 χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος Western Blot, ενώ για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων η µέθοδος RIA. Τα επίπεδα του VEGF στα παιδία µε ΟΜΛ ήταν στατιστικά σηµαντικά αυξηµένα σε σχέση µε τους υγιείς µάρτυρες, ενώ ήταν στατιστικά σηµαντικά µειωµένα σε σχέση µε τα επίπεδα του VEGF στους ενηλίκους. Όσον αφορά την οµάδα των παιδιών µε ΟΜΛ, τα επίπεδα του VEGF είχαν την τάση να αυξάνονται µε την αύξηση της τιµής των λευκών αιµοσφαιρίων ενώ δεν υπήρχε καµία συσχέτιση των VEGF επιπέδων µε τα λευκά αιµοσφαίρια ή την ηλικία στην οµάδα των ενηλίκων. Επίσης, ενώ στην ΟΜΛ των ενηλίκων τα επίπεδα του VEGF συσχετίσθηκαν µε την επιβίωση των ασθενών, δεν συνέβη το ίδιο και µε την παιδική ΟΜΛ. Τέλος, τα αυξηµένα επίπεδα του VEGF στην ΟΜΛ των ενηλίκων υποστηρίχθηκε ότι αποτελούν έναν ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη για κακή έκβαση, ενώ στην παιδική ΟΜΛ δεν φαίνεται να έχουν κα- µία προγνωστική αξία. Τα παραπάνω αποτελέσµατα της µελέτης υποδεικνύουν ότι ο ρόλος του VEGF είναι διαφορετικός στην παιδική ΟΜΛ σε σχέση µε την ΟΜΛ των ενηλίκων. Είναι πιθανό να υπάρχουν διαφορές στο µικροπεριβάλλον του µυελού των οστών ανάµεσα στα παιδιά και στους ενηλίκους ασθενείς µε ΟΜΛ και µάλιστα η αγγειογένεση στην παιδική ΟΜΛ να µην εξαρτάται από το µονοπάτι του VEGF 172. Σε νεότερη αναφορά, του 2003, µελετήθηκε η πιθανή χρήση του VEGF ως προγνωστικού δείκτη στην ΟΜΛ. Τα επίπεδα του VEGF στους ασθενείς µε ΟΜΛ στη διάγνωση (32.6 pg/ml) δεν διέφεραν από τα επίπεδα του παράγοντα σε υγιείς µάρτυρες (34.9 pg/ml). Επιπλέον δεν υπήρχε κανένας συσχετισµός α- νάµεσα στα επίπεδα του VEGF και σε άλλους προγνωστικούς παράγοντες όπως ο καρυότυπος, η ηλικία, ο αριθµός αιµοπεταλίων κ.α. Τα ευρήµατα αυτά έρχονται σε αντίθεση µε αυτά του Aguayo και συν. 166, ο οποίος βρήκε αυξηµένα επίπεδα του VEGF στο πλάσµα ασθενών µε ΟΜΛ σε σχέση µε τους υγιείς µάρτυρες, τα οποία µάλιστα σχετίστηκαν µε µειωµένο χρόνο επιβίωσης και µε χαµηλότερα ποσοστά πλήρους ύφεσης. Παρόλα αυτά ο µέσος όρος της συγκέντρωσης του VEGF στο πλάσµα των ασθενών ήταν και στις δυο εργασίες σχεδόν ίδιος (32.6 pg/ml και pg/ml). Η έλλειψη στατιστικά σηµαντικής διαφοράς ανάµεσα στους ασθενείς και τους υγιείς µάρτυρες µπορεί να οφείλεται στον µικρό αριθµό δειγµάτων που µελετήθηκαν στην παρούσα εργασία

66 Το ίδιο έτος, οι Ghannadan και συν. 174 µελέτησαν την έκφραση του VEGF σε βιοψίες µυελού των οστών από υγιείς δότες και από ασθενείς µε ΟΜΛ µε τη χρήση του αντι-vegf αντισώµατος. Σκοπός της εργασίας ήταν η µέτρηση της έκφρασης του παράγοντα καθώς και η κατανοµή του στους διάφορους κυτταρικούς τύπους. Παρατήρησαν ότι στους φυσιολογικούς µυελούς ο VEGF εκφράζεται στα ανώριµα προγονικά κύτταρα της µυελικής σειράς, τους βλάστες, στα προµυελοκύτταρα, στα µυελοκύτταρα, στα µεγακαρυοκύτταρα και στα πλασµατοκύτταρα, ενώ δεν ανιχνεύεται στα κύτταρα της ερυθράς σειράς και στα ώριµα κοκκιοκύτταρα. Στην ΟΜΛ, υψηλά επίπεδα του VEGF βρέθηκαν σε όλους τους τύπους της πλην της Μ0, όπου η συντριπτική πλειοψηφία των µυελοβλαστών (>90%) εξέφραζαν VEGF. Αντίθετα, στον τύπο Μ0, το ποσοστό των VEGFθετικών βλαστών ήταν στις περισσότερες περιπτώσεις χαµηλότερο (42%) και µάλιστα σε αυτούς τους βλάστες ανιχνεύθηκαν µόνο ελάχιστες ποσότητες VEGF. Στους τύπος Μ3 και M4Eo, τα ώριµα κοκκιοκύτταρα και τα νεοπλασµατικά ηωσινόφιλα δεν εξέφραζαν VEGF. Στην ΟΜΛ-Μ6, οι µυελοβλάστες εξέφραζαν VEGF, ενώ τα κύτταρα της ερυθρά σειράς όχι. Τέλος, στην ΟΜΛ-Μ7, τόσο οι βλάστες όσο και τα µεγακαρυοκύτταρα υπήρξαν οι κύριες πηγές του VEGF. Στην µελέτη αυτή συµπεραίνεται ότι η έκφραση του VEGF στον µυελό των οστών περιορίζεται σε συγκεκριµένα στάδια διαφοροποίησης και ωρίµανσης των µυελοειδών κυττάρων και σχετίζεται µε την κατά FAB ταξινόµηση 174. Το 2004, οι Zhang και συν. 175, σε αντίθεση µε την εργασία των Litwin και συν. 170 το 2002, βρήκαν τα επίπεδα του VEGF, στο υπερκείµενο καλλιέργειας της στιβάδας των µονοπυρήνων (MNCs) του µυελού των οστών ασθενών µε ΟΜΛ στην έναρξη της νόσου, στατιστικά σηµαντικά αυξηµένα σε σχέση µε τους υγιείς µάρτυρες. Επίσης, βρήκαν ότι υπήρχε θετική συσχέτιση ανάµεσα στην έκφραση του VEGF και στην µικροαγγειακή πυκνότητα. Μετά την επίτευξη πλήρους ύφεσης τόσο ο VEGF όσο και η µικροαγγειακή πυκνότητα µειωνόταν σε φυσιολογικά επίπεδα ενώ δεν συνέβαινε το ίδιο µε τους ασθενείς που δεν απάντησαν στην θεραπεία. Η ανάλυση Kaplan-Meier έδειξε ότι η οµάδα η αρνητική για τον VEGF είχε µεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης απ ότι η θετική για τον VEGF. Η µικροαγγειακή πυκνότητα και ο VEGF κατά την έναρξη της νόσου δεν σχετιζόταν µε τον χρόνο επιβίωσης 175. Τα παραπάνω αποτελέσµατα επιβε- 66

67 βαιώνονται και από την µελέτη των Wang και συν. 176, όπου η έκφραση της VEGF πρωτεΐνης µετρήθηκε ανοσοϊστοχηµικά µε τη χρήση του αντι-vegf α- ντισώµατος σε βιοψίες µυελού των οστών. Ένα επιπλέον στοιχείο αυτής της εργασίας είναι ότι στους ασθενείς που έκαναν υποτροπή, η έκφραση του VEGF αυξήθηκε σηµαντικά σε σχέση µε αυτήν που παρατηρήθηκε στην έναρξη της νόσου 176. Συνεχίζοντας την πορεία αξιολόγησης της αγγειογένεσης στην ΟΜΛ, για άλλη µια φορά µελετήθηκε η προγνωστική σηµασία του VEGF στους ασθενείς µε ΟΜΛ. Η συγκέντρωση του VEGF µετρήθηκε µε την µέθοδο της ELISA και βρέθηκε σηµαντικά αυξηµένη στους ΟΜΛ ασθενείς στην διάγνωση σε σχέση µε τους υγιείς µάρτυρες. Επίσης βρέθηκε σηµαντικά αυξηµένη στους ασθενείς που δεν απάντησαν στην χορηγούµενη θεραπεία σε σχέση µε αυτούς που απάντησαν, και σηµαντικά αυξηµένη στους ασθενείς που κατέληξαν, κατά τη διάρκεια ύφεσης ή υποτροπής, σε σχέση µε αυτούς που επιβίωσαν (18 µήνες). Επίσης, τα επίπεδα του VEGF παρουσίασαν σηµαντική συσχέτιση µε τον αριθµό των λευκών αιµοσφαιρίων και τον αριθµό των βλαστών τόσο στον µυελό των οστών όσο και στο περιφερικό αίµα 177. Το 2005, για πρώτη φορά αναφέρεται στην βιβλιογραφία η άποψη ότι στην ΟΜΛ, ο VEGF εκκρίνεται από τους βλάστες σε ασθενείς µε ΟΜΛ, µπορεί όµως να απελευθερώνεται και από µη λευχαιµικά κύτταρα του µυελού των οστών. Για να υποστηρίξουν αυτή την άποψη οι Glenjen και συν. 178, µέτρησαν τα επίπεδα του VEGF µετά από συγκαλλιέργεια µυελοβλαστών µε κυτταρικές σειρές ινοβλαστών και οστεοβλαστών και µε στρωµατικά κύτταρα φυσιολογικού µυελού των οστών. Παρατήρησαν ότι τα µη λευχαιµικά κύτταρα συνήθως παρουσίαζαν µεγαλύτερη απελευθέρωση του VEGF, από ότι οι αµιγείς λευχαιµικοί πληθυσµοί. Επίσης, η συγκαλλιέργεια των µυελοβλαστών µε τις παραπάνω κυτταρικές σειρές και µε τα στρωµατικά κύτταρα φυσιολογικού µυελού των οστών προκαλούσε ιδιαίτερη αύξηση των επιπέδων της VEGF πρωτεΐνης, όταν αυτή µετρήθηκε µε την µέθοδο της ELISA. Αξίζει να σηµειωθεί ότι υπερέκφραση του VEGF σε συγκαλλιέργειες παρατηρήθηκε ακόµη και σε περιπτώσεις όπου οι µυελοβλάστες µόνοι τους δεν εκφράζανε VEGF. Όσον αφορά τα επίπεδα του VEGF mrna τόσο στα λευχαιµικά όσο και στα µη λευχαιµικά κύτταρα, η συ- 67

68 γκαλλιέργεια είχε διφορούµενα αποτελέσµατα αλλά αυξηµένα επίπεδα mrna παρατηρήθηκαν κυρίως στα µη λευχαιµικά κύτταρα. Η εργασία καταλήγει στο συµπέρασµα ότι τα αυξηµένα επίπεδα του VEGF που παρατηρούνται στην ΟΜΛ είναι κυρίως απόρροια της αλληλεπίδρασης, µέσω κυτταροκινών, µεταξύ των µυελοβλαστών και των µη λευχαιµικών κυττάρων 178. Το 2006, οι Teng και συν. 179 µέτρησαν τα επίπεδα του VEGF στον ορό α- σθενών µε ΟΜΛ και τον αριθµό των αγγείων σε βιοψίες µυελού των οστών µε την χρήση των αντισωµάτων CD31 και CD34 και βρήκαν ότι δεν υπήρχε θετική συσχέτιση ανάµεσα στην έκφραση του VEGF και στην µικροαγγειακή πυκνότητα, ενώ οι Zhang και συν. 175 είχαν αντίθετα ευρήµατα. Έτσι κατέληξαν στο συ- µπέρασµα ότι η έκφραση του VEGF δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως παράµετρος για την πρόβλεψη σχηµατισµού αγγείων στον µυελό των οστών ασθενών µε ΟΜΛ 179. Το 2007 ανακοινώθηκε η χρησιµοποίηση µιας νεότερης σχετικά µεθόδου µελέτης την έκφρασης του mrna του VEGF, η ηµιποσοτική Real time RT- PCR (2^ Ct). Σύµφωνα µε αυτή βρέθηκε ότι η έκφραση του VEGF mrna είναι σηµαντικά αυξηµένη στους ασθενείς µε πρωτοπαθή ΟΜΛ σε σχέση µε τους ασθενείς µε Μ Σ και µε τους υγιείς µάρτυρες. Η ανοσοϊστοχηµική χρώση µε τη χρήση του αντισώµατος vwf σε βιοψίες µυελού των οστών, έδειξε αυξη- µένη πυκνότητα µικροαγγείων τόσο σε ασθενείς µε Μ Σ όσο και σε ασθενείς µε πρωτοπαθή ΟΜΛ σε σχέση µε τους µάρτυρες. Σηµαντικό στοιχείο είναι ότι η πυκνότητα των µικροαγγείων µειώνεται σηµαντικά κατά την µετατροπή των Μ Σ σε ΟΜΛ και φθάνει τα φυσιολογικά επίπεδα. Στην δευτεροπαθή ΟΜΛ φαίνεται ότι η πυκνότητα των µικροαγγείων είναι σηµαντικά µειωµένη σε σχέση µε την πρωτοπαθή. Στην ίδια εργασία δεν βρέθηκε να υπάρχει θετική συσχέτιση ανάµεσα στην έκφραση του VEGF και στην πυκνότητα των µικροαγγείων. Ανοσοϊστοχηµικά, µε τη χρήση του αντι-vegf αντισώµατος µελετήθηκε η κατανοµή του VEGF στα κύτταρα του µυελού των οστών. Από τα αποτελέσµατα της µελέτης φαίνεται ότι το µικροπεριβάλλον του µυελού των οστών διαφέρει σηµαντικά στην πρωτοπαθή και στην δευτεροπαθή ΟΜΛ, γεγονός που υποδεικνύει ότι θα πρέπει να υπάρχει και διαφορετική αποτελεσµατικότητα στην χο- 68

69 ρήγηση αντιαγγειογενετικής θεραπείας σε ασθενείς µε πρωτοπαθή ή δευτεροπαθή ΟΜΛ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΤΟΥ ΑΓΓΕΙΑΚΟΥ ΕΝ ΟΘΗΛΙΟΥ (VASCULAR ENTHOTHELIAL GROWTH FACTOR, VEGF) ΟΜΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΩΣΗ Ο αυξητικός παράγοντας του αγγειακού ενδοθηλίου (vascular endothelial growth factor, VEGF) αποτελεί µέλος µιας ευρύτερης οικογένειας αυξητικών παραγόντων που περιλαµβάνει τους VEGF-B, VEGF-C, PIGF (αυξητικός παράγοντας του πλακούντα), VEGF-D και VEGF-E 181. Ο VEGF χαρακτηρίσθηκε αρχικά από την ικανότητά του να επάγει τη διαπερατότητα των αγγείων και την ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων, γι αυτό και αρχικά ονοµάστηκε αγγειακός παράγοντας διαπερατότητας (vascular permeability factor, VPF) 182. Το γονίδιο του VEGF εδράζεται στο βραχύ σκέλος του χρωµοσώµατος 6, στη θέση 6p Η οργάνωση του γονιδίου περιλαµβάνει 8 εξόνια στα οποία παρεµβάλλονται 7 ιντρόνια, η κωδικοποιούσα περιοχή αποτελείται από βάσεις και σχηµατίζει µια οµοδιµερή γλυκοπρωτεΐνη 45kD. Από την εναλλακτική διασύνδεση των εξονίων προκύπτουν τουλάχιστον έξι ισοµορφές (121, 165, 189, 206, 145 και 183) που αποτελούνται από αντίστοιχο αριθµό αµινοξέων (Εικόνα 9). Τα εξόνια 1-5 και 8 βρίσκονται σε όλες τις ισοµορφές του VEGF και αυτό που τις διαχωρίζει είναι η παρουσία των πεπτιδίων που κωδικοποιούνται από τα εξόνια 6α, 6β και 7 του γονιδίου. Οι ισοµορφές του VEGF διαφέρουν ως προς τη βιοδιαθεσιµότητά τους. Η κυρίαρχη ισοµορφή είναι ο VEGF165, που στερείται τα αµινοξέα που κωδικοποιούνται από το εξόνιο 6, εκκρίνεται από µια ποικιλία φυσιολογικών και παθολογικών κυττάρων, κυκλοφορεί στον ορό και ένα σηµαντικό ποσοστό της παραµένει συνδεδεµένο στην κυτταρική επιφάνεια. Οι ισοµορφές διαφέρουν µεταξύ τους στην µιτογένεση, στη χηµειοταξία, στην ικανότητα σύνδεσης µε τους υποδοχείς και στην έκφραση τους ανά ιστό. εν γνωρίζουµε όµως αν διαφέρουν στην ειδικότητα, την ισχύ και στο ρόλο που διαδραµατίζουν στη φυσιολογική και παθολογική αγγειογένεση 184. Οι µηχανισµοί που καθορίζουν τη παραγωγή των ισοµορφών από τα διάφορα είδη κυττάρων χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης. 69

70 Όλα τα µέλη της οικογένειας του VEGF εκκρίνονται ως οµοδιµερείς γλυκοπρωτεΐνες που περιέχουν ένα χαρακτηριστικό µοτίβο 8 καταλοίπων κυστεΐνης. Η περιοχή δέσµευσης στους αντίστοιχους υποδοχείς σχηµατίζεται από τη σύνδεση µε δισουλφιδικές γέφυρες δύο µονοµερών µε αντιπαράλληλη φορά. Η σύνδεση µε τους υποδοχείς γίνεται µε υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις και στους δύο πόλους του οµοδιµερούς, κατά τον ίδιο τρόπο. Εικόνα 9: Οι ισοµορφές που προκύπτουν από την εναλλακτική διασύνδεση του γονιδίου VEGF. 3.1 Μεταγωγή σήµατος µέσω των υποδοχέων του VEGF Τα µέλη της οικογένειας του VEGF έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν µε µια οµάδα κυτταρικών επιφανειακών υποδοχέων. Οι υποδοχείς αυτοί εµπλέκονται στην έναρξη του καταρράκτη µετάδοσης σήµατος, σε απάντηση της έκκρισης των VEGF πρωτεϊνών και αποτελούν µια στενά συνδεδεµένη οικογένεια υποδοχέων µε δράση τυροσινικής κινάσης µε 3 µέλη: α) VEGFR-1 (ή Flt-1), β) VEGFR-2 (ή Flk-1/KDR) και γ) VEGFR-3 (ή Flt-4) 185,186,187. Οι VEGFR-1 και 2 εντοπίζονται στα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα και παρουσιάζουν οµοιότητα αµινοξέων κατά 44%, ενώ ο VEGFR-3 στα λεµφικά κύτταρα. Αποτελούνται από µια εξωκυττάρια, µια διαµεµβρανική και µια µεγάλη ενδοκυττάρια κυττα- 70

71 ροπλασµατική περιοχή (Εικόνα 10). Επιπλέον υπάρχουν και άλλοι υποδοχείς όπως οι νευροφιλίνες (neuriphilins 1,2), οι ιντεγκρίνες κ.α. οι οποίες υποβοηθούν τη δέσµευση στους κυρίως υποδοχείς 188. Υπάρχουν ενδείξεις ότι οι υποδοχείς έχουν διαφορετικές ιδιότητες µεταγραφής του σήµατος και πιθανόν αποτελούν µεσολαβητές διαφορετικών λειτουργιών 189. Εικόνα 10: Αλληλεπίδραση του VEGF µε τους υποδοχείς του. Πρόσφατες µελέτες δείχνουν ότι οι VEGFR-1 και -2 είναι απαραίτητοι για την φυσιολογική ανάπτυξη του αρχέγονου αγγειακού δικτύου, ο ρόλος τους ό- µως στην ενδοθηλιακή ανάπτυξη και διαφοροποίηση φαίνεται ότι διαφέρει. Ο VEGFR-1 έλκει µονοκύτταρα και µακροφάγα στην περιοχή της αγγειογένεσης µέσω επαγωγής της διαφοροποίησης πρόδροµων αιµοποιητικών κυττάρων. Επιπλέον, ο υποδοχέας VEGFR-1 εκφράζεται στα κύτταρα του πολλαπλού µυελώ- µατος και στα λευχαιµικά κύτταρα 190,191. Ο ρόλος του είναι πολύπλοκος και εξαρτάται από το στάδιο ανάπτυξης και τον τύπο του κυττάρου 192,193. Η σηµατοδότηση του VEGFR-1 απαιτείται στην αιµοποίηση 194,195, τη µετανάστευση των 71

72 µονοκυττάρων 196,197,198 και στην παρακρινή απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων 199,200. Τα VEGFR1 -/- ποντίκια πεθαίνουν από διαταραχές των αγγείων στην πρώιµη εµβρυογένεση και έτσι ο ρόλος αυτού του υποδοχέα στην εµβρυική α- νάπτυξη δεν κατέστη δυνατό να διευκρινισθεί 201. Αντίθετα πολύ περιορισµένες είναι οι µελέτες για τη δράση του παραπάνω υποδοχέα στην αιµατολογική αποκατάσταση µετά από µυελοκαταστολή ή φυσιολογικό στρες 202. ιάφορες εργασίες έδειξαν ότι ο VEGFR-1 ίσως παίζει σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της αιµοποίησης των ενηλίκων. Έχει φανεί ότι ο υποδοχέας αυτός εκφράζεται στην ώρι- µη δεσµευµένη σειρά των µυελοµονοκυττάρων, επάγοντας σήµατα που ενισχύουν την µετανάστευσή τους in vitro 198,197,196 και in vivo 203. Ο VEGFR-2 φαίνεται να διαµεσολαβεί στην αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων και στην ανάπτυξη των όγκων από τον VEGF. Κατευθύνει την α- ναπτυξιακή αγγειογένεση και αιµοποίηση προκαλώντας πολλαπλασιασµό, µετανάστευση, διαφοροποίηση και διατήρηση των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων 204. Μια από τις σηµαντικότερες λειτουργίες του VEGFR-2 φαίνεται πάντως να είναι η διατήρηση της ισορροπίας επιβίωσης/απόπτωσης η οποία είναι κρίσι- µη για τη ρύθµιση της αγγειακής οµοιόστασης. Έχει διατυπωθεί η άποψη ότι ο VEGFR-1 λειτουργεί µε αρνητικό τρόπο, καθιστώντας λιγότερο διαθέσιµο τον VEGF στον VEGFR-2, που δρα ως κύριος επαγωγός των µηνυµάτων του VEGF. Αυτό αποδεικνύουν πειράµατα σε ποντίκια στα οποία έλλειψη του VEGFR-2 οδηγούσε σε αποτυχία σχηµατισµού αγγειακού δικτύου, ενώ έλλειψη του VEGFR-1 είχε σαν αποτέλεσµα την υπερπληθώρα ενδοθηλιακών κυττάρων που σχηµάτιζαν όµως ανώµαλο αγγειακό δίκτυο 202. Πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι ο VEGFR-1 πιθανόν να προκαλεί αρνητική ρύθµιση στην αγγειογένεση δεσµεύοντας τον VEGF, µε αποτέλεσµα να µην µπορεί να δεσµευτεί στον VEGFR-2 που θεωρείται ο κατεξοχήν µεταγωγέας σήµατος του παράγοντα 205,206. Σε καµιά µελέτη δεν φάνηκε η ανάγκη της έκφρασης του VEGFR-1 του και VEGFR-2 για την αποκατάσταση της αιµοποίησης µετά από µυελοκαταστολή. Ο VEGFR-3 λόγω της έκφρασής του κυρίως σε λεµφικά αγγειακά κύτταρα φαίνεται να είναι ουσιώδης στην δηµιουργία του λεµφικού συστήµατος µετά από σύνδεση µε τον VEGF-C. 72

73 Όλα τα παραπάνω ευρήµατα συνηγορούν στην άποψη ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι δέκτες θετικών και αρνητικών µηνυµάτων αναφορικά µε τη διαδικασία της αγγειογένεσης. 3.2 Βιολογική δράση και λειτουργία του VEGF Ο VEGF αποτελεί έναν ειδικό ισχυρό µιτογόνο παράγοντα των ενδοθηλιακών κυττάρων που προέρχονται από αγγεία, φλέβες, ή αρτηρίες 207 αλλά και άλλων κυτταρικών πληθυσµών 208,209,210. Αποτελεί πρωταρχικό µεσολαβητή της φυσιολογικής και παθολογικής αγγειογένεσης που παρατηρείται για παράδειγµα µετά από αγγειακό τραυµατισµό, στην επέκταση των όγκων, στην αµφιβληστροειδοπάθεια και στην ανάπτυξη παράπλευρης κυκλοφορίας σε καταστάσεις υποξίας 211,212,213. Η βιολογική δράση του VEGF περιλαµβάνει τη ρύθµιση της διαπερατότητας των αγγείων µέσω επαγωγής πόρων και θυρίδων στο ενδοθήλιο 188, που ση- µατοδοτεί την έναρξη της αγγειογενετικής διαδικασίας. Η επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων στα νεοσχηµατιζόµενα αγγεία εξαρτάται επίσης από τον VEGF. Επιπλέον έχει δειχθεί ότι διεγείρει τα ενδοθηλιακά κύτταρα να αποικοδοµούν τη βασική µεµβράνη, να µεταναστεύουν και να σχηµατίζουν αγγεία in vitro. Ο VEGF ρυθµίζει πολλαπλές ενδοθηλιακές βιολογικές λειτουργίες που σχετίζονται µε την οµοιοστασία του καρδιαγγειακού συστήµατος 181. Ο πολύπλευρος ρόλος του περιλαµβάνει ακόµη την έλξη-συλλογή πρόδροµων ενδοθηλιακών κυττάρων από το µυελό των οστών και την επαγωγή της διαφοροποίησής τους, όπως επίσης και την αναστολή διαφοροποίησης δενδριτικών κυττάρων. Ακόµη ο VEGF επάγει την έκφραση αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Το γεγονός ότι τα λευκά αιµοσφαίρια και τα αιµοπετάλια περιέχουν µεγάλες ποσότητες της πρωτεΐνης του VEGF, την οποία εκκρίνουν όταν διεγείρονται, υποδεικνύει το ρόλο του στη φλεγµονή και την πήξη του αί- µατος. Είναι χαρακτηριστικό ότι τα αιµοπετάλια ασθενών µε καρκίνο περιέχουν υψηλότερες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης VEGF από τους υγιείς δότες. Ο VEGF έχει βρεθεί ότι εκφράζεται σε πλήθος υγιών κυττάρων, αλλά υπερεκφράζεται σε καρκινικά ενδοθηλιακά κύτταρα του πνεύµονα, του παχέος εντέρου, του µαστού και του γυναικείου αναπαραγωγικού συστήµατος. 73

74 Ο ρόλος του στην εµβρυογένεση έχει αποδειχθεί από δυο ανεξάρτητες µελέτες 214,215. Η απώλεια ενός µόνο αλληλόµορφου του VEGF οδηγεί τους επίµυες σε εµβρυϊκό θάνατο εξαιτίας σοβαρών αγγειακών ανωµαλιών. Πιθανόν παίζει ρόλο στην λεµφαγγειογένεση 216, διεγείρει την ενεργοποίηση και µετανάστευση των µονοκυττάρων/µακροφάγων καθώς και την παραγωγή του ιστικού παράγοντα (Tissue Factor, TF) 217. Τα επαγωγικά µονοπάτια µέσω των οποίων δρα ο VEGF στους διάφορους κυτταρικούς τύπους µε σκοπό την επίτευξη των λειτουργιών του φαίνονται στην Εικόνα 11. Εικόνα 11: Βιολογική δράση του VEGF µέσω διαφορετικών επαγωγικών µονοπατιών. 3.3 Παράγοντες που επιδρούν στην έκφραση του VEGF Ο VEGF παράγεται τόσο από κακοήθη κύτταρα όσο και από φυσιολογικά κύτταρα, όπως τα µονοκύτταρα και τα µακροφάγα που αθροίζονται ως απάντηση σε διάφορα περιβαλλοντικά ερεθίσµατα 86,213. Πλήθος µηχανισµών φαίνεται να επιδρούν στην έκφραση του VEGF, µεταξύ των οποίων συγκαταλέγονται η στέρηση γλυκόζης, το οξειδωτικό και µηχανικό στρες, όπως και ορισµένα ογκογονίδια (Ras, c-myc, Fos, Scr και Bcl-2) και ογκοκατασταλτικά γονίδια (p53). Αυξηµένη έκφραση του VEGF έχει παρατηρηθεί σε διάφορες κακοήθειες όπως 74

75 ο καρκίνος του µαστού, του πνεύµονα, του κεντρικού νευρικού συστήµατος, του παγκρέατος, των ωοθηκών, του νεφρού και της ουροδόχου κύστεως 218. Έκθεση σε υποξικό περιβάλλον επάγει γρήγορα και αναστρέψιµα την έκφραση του VEGF µέσω αύξησης της µεταγραφής και σταθεροποίησης του mrna του γονιδίου. Ο HIF-1 είναι υπεύθυνος για την αύξηση της έκφρασης του VEGF σε αυτές τις περιπτώσεις. Η υπερέκφραση του VEGF λόγω υποξίας προσφέρει στους ιστούς έναν εναλλακτικό µηχανισµό για να αυξήσουν την οξυγόνωσή τους µέσω της ανάπτυξης αγγείων αίµατος. Επιστροφή των ιστών σε κανονικές συνθήκες οξυγόνου οδηγεί σε υποστροφή των νεοσχηµατισµένων αγγείων. Η µεταγραφή του mrna του VEGF αυξάνεται επίσης από την έκκριση ενός πλήθους αυξητικών παραγόντων και κυτταροκινών, όπως για παράδειγ- µα ο PDGF, EGF (epidermal growth factor), ο TNF-a, ο TGF-β1 και η ιντερλευκίνη-1β. 3.4 Ο ρόλος του VEGF στη φυσιολογική αιµοποίηση και η σχέση του µε το µικροπεριβάλλον του µυελού των οστών Ο µυελός των οστών είναι ένας ιστός που αποτελείται από έναν ετερογενή πληθυσµό κυττάρων συµπεριλαµβανοµένων των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων (hematopoietic stem cells, HSCs), των ενδοθηλιακών κυττάρων (Endothelial cells, ECs), και άλλων στρωµατικών κυττάρων, όπως επίσης και κυττάρων που εµπλέκονται στην οµοιόσταση των οστών, συµπεριλαµβανοµένων των χονδροκλαστών και των οστεοβλαστών 219 (Εικόνα 12). Έχει βρεθεί ότι τα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα παίζουν κριτικό ρόλο στη ρύθµιση διαφόρων διαδικασιών όπως η επούλωση των πληγών, η αναγέννηση οργάνων και η ανάπτυξη των όγκων. Αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα ειδικά για κάθε ιστό «κατοικούν» σε συγκεκριµένες για κάθε ιστό «εστίες» µέσα στο µικροπεριβάλλον του µυελού των οστών όπου βρίσκονται αδιαφοροποίητα και σε ηρεµία. Αυτές οι εστίες θα διαδραµατίσουν σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της αυτοανανέωσης των κυττάρων αλλά και θα προσφέρουν αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα για την αγγείωση των ιστών και την οργανογένεση. Kατά την εµβρυϊκή ανάπτυξη τα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα παραµένουν παροδικά σε διάφορες θέσεις, ξεκινώντας από το λεκιθικό ασκό απο όπου µεταναστεύουν 75

76 στο εµβρυικό ήπαρ και σπλήνα και στη συνέχεια εγκαθίστανται στην τελική τους κατοικία στο µυελό των οστών 220. Τα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα ε- γκαταλείπουν το µικροπεριβάλλον του µυελού των οστών µε µια πολύπλοκη διαδικασία η οποία καλείται «κινητοποίηση». Το φυσιολογικό στρες προκαλεί την απελευθέρωση αγγειογενετικών παραγόντων, µε χηµειοτακτικές δυνατότητες, οι οποίοι προκαλούν την κινητικότητα των κυττάρων αυτών και διευκολύνουν τον πολλαπλασιασµό τους, την διαφοροποίησή τους και την κινητοποίησή τους στην κυκλοφορία. Αυτά µε τη σειρά τους είτε ενσωµατώνονται σε συγκεκριµένα όργανα, είτε επιστρέφουν στο µυελό των οστών και τον επαναπληθυσµοποιούν 221. Εικόνα 12: (A) Κυτταρικοί πληθυσµοί του µικροπεριβάλλοντος του µυελού των οστών. (B) Βιολογικές λειτουργίες του VEGF. Εκτός από την αγγειογένεση ρυθµίζει επίσης την αιµοποίηση, συµβάλλοντας στην επιβίωση, τον πολλαπλασιασµό και την διαφοροποίηση των αιµοποιητικών προγονικών κυττάρων µέσω αυτοκρινών και παρακρινών βρόχων. Επιπλέον, αναστέλλει την ωρίµανση των δενδριτικών κυττάρων, αυξάνει την δραστηριότητα της οστικής απορρόφησης, τροποποιεί τις ανοσολογικές απαντήσεις και συµβάλλει στην διαφοροποίηση των προγονικών ενδοθηλιακών κυττάρων. 76

77 Τα ενδοθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από τον µυελό των οστών εξαρτώνται από τον µικροπεριβάλλον του µυελού και λειτουργικά συµβάλλουν στην αγγειογένεση κατά την επούλωση των ιστών, στην αγγείωση µετά την ισχαιµία του µυοκαρδίου ή των ισχίων, στην δηµιουργία ενδοθηλίου σε αγγειακά µοσχεύµατα, στην αθηροσκλήρυνση και στην νεοαγγείωση του αµφιβληστροειδούς. Η ανάπτυξη κάποιων όγκων επίσης εξαρτάται από τα κύτταρα αυτά. Η απελευθέρωση αγγειογενετικών παραγόντων από τα κύτταρα του όγκου προκαλεί κινητοποίηση των ενδοθηλιακών και των αιµοποιητικών κυττάρων και διεγείρει την αγγειογένεση και ανάπτυξη του όγκου. Αντίθετα η αναστολή της κινητοποίησης των κυττάρων αυτών έχει ως αποτέλεσµα την επιβράδυνση της ανάπτυξης του όγκου. Η διαφοροποίηση, η συντήρηση, και η επέκταση των αιµοποιητικών κυττάρων µέσα στο µικροπεριβάλλον του µυελού των οστών στους ενηλίκους ελέγχεται από αυξητικούς παράγοντες, κυτταροκίνες, και χηµοκίνες µέσω ενός µηχανισµού που περιλαµβάνει παρακρινείς και αυτοκρινείς ρυθµιστικούς βρόχους µεταξύ των στρωµατικών και των πρόωρων αιµοποιητικών κυττάρων. Ο κυτταρικός και ο µοριακός µηχανισµός που επιτρέπει την διαφοροποίηση, την συντήρηση και την επέκταση των αιµοποιητικών κυττάρων στους ενηλίκους παραµένει µόνο εν µέρει κατανοητός 222. Σύµφωνα µε την παραδοσιακή άποψη των αυτοκρινών βρόχων, η σύνδεση των υποδοχέων και η επαγωγή σήµατος συµβαίνει όταν ένας αυξητικός παράγοντας εκκρίνεται και στη συνέχεια αλληλεπιδρά µε τους υποδοχείς του στην επιφάνεια των κυττάρων που εκκρίθηκε. Εντούτοις, υπάρχουν στοιχεία που σε ι- διαίτερες καταστάσεις, τα µιτογόνα σήµατα διάφορων αυξητικών παραγόντων, συµπεριλαµβανοµένου και του VEGF, µπορούν να επαχθούν χωρίς έκκριση του παράγοντα, αποτελώντας έναν εσωτερικό αυτοκρινή βρόχο 195,223. Τα κύτταρα που εξαρτώνται από τον κλασσικό ή εξωτερικό αυτοκρινή βρόχο έχουν ορισµένα διαφοροποιητικά χαρακτηριστικά: εκκρίνουν τους βιολογικά ενεργούς αυξητικούς παράγοντες στο µέσο καλλιέργειας, πολλαπλασιάζονται µόνο σε σχετικά υψηλές κυτταρικές πυκνότητες ελλείψει των προστιθέµενων παραγόντων, και αποτυγχάνουν να πολλαπλασιαστούν παρουσία αντισωµάτων που εξουδετερώνουν τους σχετικούς αυξητικούς παράγοντες 223. Τέτοιοι αυτο- 77

78 κρινείς βρόχοι θεωρούνται εξωτερικοί ή «κοινοί» δηλαδή ο εκκρινόµενος αυξητικός παράγοντας µπορεί να ενεργεί στα περιβάλλοντα κύτταρα του ίδιου τύπου όπως επίσης και στα κύτταρα από τα οποία παράγεται ο παράγοντας. Ένας εξωτερικός αυτοκρινής βρόχος δεν φαίνεται κατάλληλος για τη ρύθµιση της επιβίωσης των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων και της αγγειογένεσης, µέσω του VEGF, στον ενήλικο µυελό των οστών. Σε αντίθεση µε τον εξωτερικό αυτοκρινή βρόχο, η έκκριση των αυξητικών παραγόντων δεν απαιτείται για την αυτόνοµη κυτταρική αύξηση, µέσω του εσωτερικού αυτοκρινούς βρόχου. Ο πολλαπλασιασµός κυττάρων δεν εξαρτάται από την πυκνότητα των κυττάρων και τα αντισώµατα που εξουδετερώνουν τον σχετικό αυξητικό παράγοντα δεν εµποδίζουν τη συνεχή αύξηση ή διαφοροποίηση. Λόγω της ανεξαρτησίας του, από την έκκριση παραγόντων και την δυνατότητά του να αποφύγει την εµπλοκή του στην αγγειογένεση, ο εσωτερικός ή «ιδιωτικός» αυτοκρινής βρόχος, φαίνεται να είναι πιο κατάλληλος για τις ρυθµιστικές λειτουργίες του VEGF κατά τη διάρκεια της αιµοποίησης, τουλάχιστον σε ορισµένες περιστάσεις 222 (Εικόνα 13). Εικόνα 13: Σχηµατική αναπαράσταση του εσωτερικού και του εξωτερικού αυτοκρινή βρόχου. 78

79 Τα κύτταρα µέσα στο µυελό διαµορφώνουν ένα συνεχές δίκτυο στο οποίο τα στρωµατικά κύτταρα διασπείρονται µαζί µε τις αιµοποιητικές και ενδοθηλιακές προγονικές µορφές. Η προφανής φυσική σχέση µεταξύ των αιµοποιητικών και των στρωµατικών κυττάρων στις θέσεις σταθεροποίησης των πρώτων υποδηλώνει την ύπαρξη παρακρινών µηχανισµών δράσης µεταξύ των αυξητικών παραγόντων και των αντίστοιχων υποδοχέων τους. Αυτό το πρότυπο υποστηρίχθηκε µε τη διαπίστωση ότι τα στρωµατικά κύτταρα του µυελού των οστών εκκρίνουν διάφορες αιµοποιητικές κυτταροκίνες, συµπεριλαµβανοµένου και του VEGF, που διατηρούν τα αιµοποιητικά κύτταρα σε µια αδιαφοροποίητη κατάσταση 224,225. Ο VEGF βρέθηκε να παράγεται από τα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα µετά από διέγερση µε κυτταροκίνες 226. Για να αξιολογηθούν τα αποτελέσµατα της αφαίρεσης του VEGF γονιδίου στα ενήλικα ποντίκια, έγιναν µελέτες που καταδεικνύουν ότι το µικροπεριβάλλον των άγριου τύπου στρωµατικών κυττάρων είναι ανεπαρκές να διασώσει την µεταµόσχευση των VEGF-ανεπαρκών αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων στο µυελό των οστών και αποκάλυψαν έναν νέο, κυτταρο-αυτόνοµο µηχανισµό µέσω του οποίου ο VEGF ελέγχει την επιβίωση των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της αιµοποιητικής επαναπληθυσµοποίησης. Εκτός από τη µείωση στη δυνατότητα σχηµατισµού νέου πληθυσµού των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων in vivo, τα VEGFανεπαρκή κύτταρα του µυελού των οστών απέτυχαν να σχηµατίσουν αποικίες και in vitro, ενώ µπόρεσαν να σχηµατίσουν αποικίες όταν προστέθηκε VEGF στην καλλιέργεια Ο ρόλος του VEGF στις αιµατολογικές κακοήθειες Μέχρι σήµερα έχει αποδειχθεί η συµβολή των VEGF και των υποδοχέων του στην αιµοποίηση αν και δεν έχει βρεθεί ο µοριακός µηχανισµός της διαφοροποίησης και επιβίωσης των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων. Γνωρίζουµε ότι οι αιµατολογικές κακοήθειες συχνά είναι αποτέλεσµα διαταραχής του ελέγχου της απόπτωσης των αιµοποιητικών κυττάρων 227. Οι λευχαιµίες προκύπτουν από αιµοποιητικά κύτταρα σε διάφορα στάδια ωρίµανσης και διαφοροποίησης. Οι οξείες λευχαιµίες προκύπτουν από ανώριµα αιµοποιη- 79

80 τικά κύτταρα που έχουν διατηρήσει την ικανότητα αυτοανανέωσης, ενώ στις χρόνιες λευχαιµίες τα κύτταρα είναι περισσότερο ώριµα και δεσµευµένα για µια κυτταρική σειρά. Σε πολλές αιµατολογικές κακοήθειες όπως λευχαιµίες, λεµφώµατα, πολλαπλούν µυέλωµα, έχει βρεθεί διαταραχή της λειτουργίας και έκφρασης του VEGF αλλά και των υποδοχέων του 190,228. Στις µελέτες αυτές αναφέρεται ότι ο VEGF υπερεκφράζεται στο 72% των δειγµάτων οστεοµυελικών βιοψιών ασθενών µε οξεία λευχαιµία ενώ η αντίστοιχη έκφραση των υποδοχέων Flt-1 και KDR ήταν 52% και 19% αντίστοιχα 228. Παρόµοια ευρήµατα παρουσίασαν οι Bellamy και συν. 190 όπου το 82% των ασθενών µε οξεία λευχαιµία παρουσίαζαν αύξηση των επιπέδων του VEGF στον ορό και το 76% αυτών είχε διαταραχή στην έκφραση του Flt-1. Στα µυελοδυσπλαστικά σύνδροµα τα οποία είναι και λιγότερα επιθετικά, αναφέρεται αύξηση του VEGF στο 76% των ασθενών και αύξηση της έκφρασης των KDR και Flt-1 κατά 19% και 69% αντίστοιχα. Όσον αφορά το πολλαπλούν µυέλωµα οι Di Raimondo και συν. 229 βρήκαν ότι η συγκέντρωση του VEGF στο µυελό και στον ορό σχετιζόταν µε την πορεία της νόσου στους ασθενείς αυτούς. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα επίπεδα των αγγειογενετικών παραγόντων βρέθηκαν περισσότερο αυξηµένα στους ιστούς σε σχέση µε το περιφερικό αίµα γεγονός που συνηγορεί υπέρ της υπόθεσης ότι κύρια πηγή τους είναι το µικροπεριβάλλον του µυελού των οστών. Από τα ευρήµατα της µελέτης τους πιθανολογούν ότι η παραγωγή του VEGF από τον κακοήθη κλώνο λειτουργεί ταυτόχρονα ως αυτοκρινές αυξητικό ερέθισµα αλλά και ως διάχυτο παρακρινές ερέθισµα που προκαλεί την τοπική παραγωγή των αυξητικών παραγόντων που ενισχύουν την επιβίωση και αυτοανανέωση των νεοπλασµατικών κυττάρων. Αυτό βέβαια ισχύει και για τα φυσιολογικά αιµοποιητικά και ενδοθηλιακά κύτταρα. Θεωρητικά, η αναστολή του VEGF αλλά και των υποδοχέων του σε µη συ- µπαγείς όγκους όπως οι λευχαιµίες θα µπορούσε να αποτελεί πιθανή θεραπευτική αποτελεσµατική στρατηγική, ικανή να εµποδίζει την πρόοδο της νόσου. 80

81 3.6 Στόχευση του VEGF σε νεοπλασµατικά νοσήµατα του αίµατος και των συµπαγών οργάνων Καθοριστικό ρόλο διαδραµατίζει στην αγγειογένεση των συµπαγών όγκων ο VEGF. Η παρατήρηση ότι η αύξηση του µεγέθους του όγκου συνοδεύεται από ανάπτυξη νέων αγγείων έγινε τουλάχιστον ένα αιώνα πριν. Στις αρχές της δεκαετίας του 1970 ο Folkman 83 κάνει την υπόθεση ότι η αντιαγγειογένεση θα αποτελούσε αποτελεσµατική στρατηγική στη θεραπεία του καρκίνου και ξεκινά την έρευνα για τη ανακάλυψη των αγγειογενετικών παραγόντων. Έτσι βρίσκουµε να αναφέρεται από τους Kim και συν. 230 ότι τα µονοκλωνικά αντισώµατα εναντίον του VEGF αποδεδειγµένα αναστέλλουν την ανάπτυξη ανθρώπινων αλλοµοσχευµάτων σε ανοσοκατεσταλµένους επίµυες. Τα ευρήµατα αυτά είναι τα πρώτα που ενισχύουν την άποψη ότι η ανάπτυξη των όγκων εξαρτάται από την αγγειογένεση ενώ σήµερα έχει αποδειχθεί ότι ο VEGF αποτελεί κύριο αγγειογενετικό παράγοντα των όγκων. Ειδικότερα έχει βρεθεί ότι ο συνδυασµός βινµπλαστίνης µε ένα αντί-flk- 1/KDR αντίσωµα έχει ισχυρότερη ανασταλτική δράση από ότι καθένα ξεχωριστά εναντίον του νευροβλαστώµατος 231. Πρέπει να αναφερθεί ότι πολλές κλινικές µελέτες σε ασθενείς µε καρκίνο βρίσκονται σε εξέλιξη χρησιµοποιώντας διάφορους αναστολείς του VEGF. Μία κλινική µελέτη φάσης ΙΙ, έδειξε ότι η χρήση του µονοκλωνικού αντι-vegf σε συνδυασµό µε τη συµβατική χηµειοθεραπεία οδηγεί σε επιµήκυνση του χρόνου εξέλιξης της νόσου σε ασθενείς µε καρκίνο του πνεύµονα, όπως και µεταστατικού καρκίνου του ορθοσιγµοειδούς 232,233. Κλινική βελτίωση παρουσίασαν και ασθενείς µε µεταστατικό καρκίνο του µαστού όταν έλαβαν ως µονοθεραπεία το µονοκλωνικό αντίσωµα αντί-vegf 234. Τέλος µελέτες φάσης ΙΙΙ βρίσκονται σε εξέλιξη για να επιβεβαιώσουν την αξία και τα πλεονεκτήµατα των µονοκλωνικών αντισωµάτων κατά του VEGF σε ασθενείς µε κακόηθες νεόπλασµα. Τα τελευταία χρόνια η έρευνα έχει στραφεί σε αναζήτηση παραγόντων που έχουν αντιαγγειογενετική δράση µε στόχο την αναχαίτιση της νεοπλασµατικής ανάπτυξης. Οι αντιαγγειογενετικοί παράγοντες ανάλογα µε τη δράση τους διακρίνονται σε διαφορετικές κατηγορίες όπως αναστολείς αυξητικών παραγόντων, αναστολείς µετάδοσης σήµατος στα ενδοθηλιακά κύτταρα, αναστολείς πολλα- 81

82 πλασιασµού ενδοθηλιακών κυττάρων, αναστολείς των µεταλλοπρωτεϊνασών, αναστολείς επιβίωσης ενδοθηλιακών κυττάρων και αναστολείς προγονικών ενδοθηλιακών κυττάρων του µυελού 238,239. Στον Πίνακα 9 που ακολουθεί παρατίθενται οι κύριοι αγγειογενετικοί παράγοντες που έχουν χρησιµοποιηθεί µέχρι σήµερα ανάλογα µε το τρόπο δράσης τους. Στην ΟΜΛ τα επίπεδα των αγγειογενετικών παραγόντων είναι υψηλά και η αυξηµένη αγγείωση του µυελού σε διάφορες µελέτες συσχετίζεται µε φτωχή πρόγνωση της νόσου. Επίσης έχει βρεθεί ότι σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασµό του λευχαιµικού κλώνου στην ΟΜΛ και τα Μ Σ παίζει ο VEGF. Για το λόγο αυτό γίνονται µελέτες για την αποτελεσµατική στόχευση του παράγοντα αυτού καθώς και των υποδοχέων του (Εικόνα 14). Ο παράγοντας Su-5416 που αναστέλλει τη φωσφορυλίωση των υποδοχέων 1 και 2 του VEGF αλλά και των SCF, FLT3 φάνηκε να έχει δράση στην ΟΜΛ 235. Υπό µελέτη βρίσκεται ο παράγοντας PTK-787 (vata Ranb), αναστολέας όλων των κινασών τυροσίνης του VEGF, και το αντι-vegf αντίσωµα (Bevacizumab) 236. Η θαλιδοµίδη, ο ευρύτερα χορηγούµενος (κυρίως στο ΠΜ) αντιαγγειογενετικός παράγοντας συνδυαζόµενος µε χηµειοθεραπεία δεν έδειξε να επηρεάζει θετικά τη δράση της σε ασθενείς µε ΟΜΛ 237. Εικόνα 14: Θεραπευτική στόχευση του αγγειογενετικού παράγοντα VEGF. 82

83 Πίνακας 9. Αντιαγγειογενετικοί παράγοντες και ο µηχανισµός δράσης τους 240. Παράγοντας Αγγειοστατίνη Ενδοστατίνη Πενικιλλαµίνη, FTI Θαλιδοµίδη ΤΝP-470 Αντι-VEGF IM862 IFN-α PTK787/ZK22584 SU5416, SU6668 EMD IL-12 Neovastat, Marimastat Μηχανισµός δράσης Επαγωγή απόπτωσης, αναστολή µετανάστευσης ΕΚ Αναστολή ενδοθηλιακών κυττάρων Αναστολή µετανάστευσης και πολλαπλασιασµού ΕΚ Αναστολή του VEGF,TNFa, διέγερση IFNγ, ΙL-2 Αναστολή αύξησης ενδοθηλιακών κυττάρων Μονοκλωνικό αντίσωµα του VEGF Αναστολή παραγωγής του VEGF Αναστολή παραγωγής b-fgf και VEGF Aναστολή σήµατος του VEGFR Aναστολή σήµατος του VEGFR (flk1/kdr) Επαγωγή απόπτωσης ενδοθηλιακών κυττάρων Ανιούσα ρύθµιση της IFN-γ. Αναστολή παραγωγής MMP Αναστολείς µεταλλοπρωτεϊνασών 4. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗΣ ΣΕ ΝΕΟΠΛΑΣΙΕΣ ΤΟΥ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΙΣΤΟΥ Στο µυελό των οστών καθώς και σε άλλους ιστούς η αξιολόγηση της αγγειογένεσης δεν είναι δυνατή µε συµβατικές τεχνικές όπως η χρώση ρουτίνας µε αιµατοξυλίνη-ηωσίνη ή Giemsa. Η αδυναµία αξιόπιστης εκτίµησης των βιολογικών δεικτών της αγγειογένεσης στο περιφερικό αίµα ασθενών µε κακοήθη νοσήµατα οδήγησε στην αναζήτηση αξιόπιστων τεχνικών προσδιορισµού. Η εκτίµηση της αγγειογένεσης γίνεται είτε µε απευθείας µέτρηση του αριθµού των αγγείων σε οστεοµυελικές βιοψίες, είτε µέσω προσδιορισµού των αγγειογενετικών παραγόντων στο περιφερικό αίµα ή τον µυελό των οστών των ασθενών. 4.1 Εκτίµηση της αγγειογένεσης σε οστεοµυελικές βιοψίες Η κυριότερη µέθοδος που έχει χρησιµοποιηθεί µέχρι σήµερα για την αξιολόγηση της αγγειογενετικής δραστηριότητας είναι η µέτρηση της αγγειακής πυκνότητας (microvessel density, MVD) µε τη χρήση ανοσοϊστοχηµικών µεθόδων χρώσης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Τα διαθέσιµα για τα ενδοθηλιακά κύτταρα αντισώµατα µπορούν να διαχωριστούν σε δύο κατηγορίες: τους πανενδοθηλιακούς δείκτες και τα αντισώµατα που στοχεύουν σε ενεργά πολλαπλασιαζό- µενα ενδοθηλιακά κύτταρα. Εκτός από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, µπορούν να αξιοποιηθούν και άλλα συστατικά του αγγειακού τοιχώµατος για να γίνει ορα- 83

84 τός ο βαθµός αγγειογένεσης τόσο µέσα σε συµπαγείς όγκους όσο και σε αιµατολογικές κακοήθειες. Οι κυριότεροι δείκτες που χρησιµοποιήθηκαν κατά κόρον είναι οι εξής: factor VIII related antigen, anti-cd 31, anti-cd 34, anti-cd 36, anti-en-4, ενώ νέοι δείκτες πιο ειδικοί από τους προηγούµενους είναι οι: anti EP, anti-cd 105, LM 609 (anti-integrin aνβ3). Ένα σηµαντικό ζήτηµα που απασχόλησε πολλούς ερευνητές είναι η επιλογή κατάλληλου αντισώµατος που θα χρησιµοποιηθεί α- νοσοϊστοχηµικά για την ανάδειξη των ενδοθηλιακών κυττάρων, δεδοµένου ότι η τεχνική αυτή παρουσιάζει πλεονεκτήµατα αλλά και µειονεκτήµατα 241,242. H α- νοσοϊστοχηµική χρώση του FVIII παρόλη την ειδικότητά της δεν είναι πολύ ευαίσθητη και χρωµατίζει και τα µεγακαρυοκύτταρα (Εικόνα 15). Η χρήση του CD31 (PECAM-1) χρωµατίζει τα αιµοπετάλια, τα µεγακαρυοκύτταρα και ορισµένα πλασµατοκύτταρα. Οι Mangi και Newland 243 εντοπίζουν σηµαντικές αδυναµίες στα αντισώµατα CD105 και VEGF, για τα οποία αναφέρουν ότι δεν αντιδρούν µε όλα τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Το αντίσωµα CD34 είναι ένας ευαίσθητος δείκτης όσον αφορά τα µικρά και τα µεγάλα αγγεία, συνδέεται όµως εξίσου και µε φυσιολογικά και µε νεοπλασµατικά κύτταρα που προέρχονται από τα περιαγγειακά στρωµατικά κύτταρα 244. Επιπλέον, το αντί-cd34 αντίσωµα βάφει και µυελοβλάστες, γεγονός που το καθιστά ακατάλληλο σαν χρώση για την ε- κτίµηση της αγγειογένεσης στην CD34 θετική οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία. Α Β Εικόνα 15: Μέτρηση της µικροαγγειακής πυκνότητας σε βιοψία µυελού των οστών ασθενή µε ΟΜΛ, (Α) µε τη χρήση του αντι-vwf αντισώµατος και (Β) µε τη χρήση του αντι-fviii αντισώµατος. 84

85 Ακόµη και να βρεθεί ο κατάλληλος ανοσοϊστοχηµικός δείκτης για την εκτί- µηση της αγγειογένεσης, η µικροαγγειακή πυκνότητα που θα µετρηθεί θα εκφράζει το καθαρό αποτέλεσµα της χρόνιας διαδικασίας της αγγειογένεσης και της υποστροφής των αγγείων. Θα αποτελούσε υπεραπλούστευση να την θεωρήσουµε δείκτη µέτρησης της αγγειογένεσης την συγκεκριµένη στιγµή της βιοψίας 245. Επιπλέον η µέτρηση των αγγείων δεν µπορεί να προδικάσει το αποτέλεσµα της θεραπείας γιατί η παροχή οξυγόνου και θρεπτικών ουσιών στον όγκο, εξαρτάται και από την απόσταση µεταξύ των αγγείων. Συγκεκριµένα για τη µέτρηση της µικροαγγειακής πυκνότητας σε τοµές ο- στεοµυελικής βιοψίας, πρέπει να λαµβάνονται υπόψη τόσο το ικανοποιητικό µέγεθος της οστεοµυελικής βιοψίας όσο και το να µην συνυπάρχουν άλλοι εκτός του όγκου ή της αιµατολογικής κακοήθειας λόγοι αυξηµένης αγγειογένεσης ό- πως η φλεγµονή, η επούλωση λόγω προηγούµενης οστεοµυελικής βιοψίας ή συστηµατική υποξία π.χ. µετά από αιµορραγικό shock. Τέλος, ένα πολύ βασικό µειονέκτηµα της αξιολόγησης της αγγειογένεσης µέσω µέτρησης της µικροαγγειακής πυκνότητας είναι η υποκειµενική επιλογή περιοχών για αξιολόγηση των αγγείων, η µη αντικειµενική αξιολόγηση των αγγείων καθώς και η διαφορετική µεγέθυνση στην παρατήρηση µεταξύ των διαφόρων οµάδων µελέτης 244, µε αποτέλεσµα να απαιτούνται µέθοδοι αντικειµενικές που να λαµβάνουν υπόψη τους παραπάνω παράγοντες. Προκειµένου να ελαχιστοποιηθούν σφάλµατα λόγω υ- ποκειµενικότητας στην αξιολόγηση του ανοσοϊστοχηµικού αποτελέσµατος αναπτύχθηκαν οι µέθοδοι α) του Chalkey 246 µε την οποία υπολογίζεται ο αριθµός των σηµείων ενός πλέγµατος που διέρχονται από τα αγγεία, και β) το πολυπαραγοντικό σύστηµα επεξεργασίας εικόνας µε ηλεκτρονικό υπολογιστή που αξιολογεί την περιοχή αγγειοποίησης, τον αριθµό των µικροαγγείων, των περικυττάρων και την ένταση της χρώσης. Καθώς όµως οι καρκινικοί όγκοι παρουσιάζουν µεγάλη ετερογένεια ακόµη και όταν πρόκειται για τον ίδιο ιστό, ο αριθµός των αγγείων δεν µπορεί να αποτελέσει ενιαίο δείκτη για όλους τους όγκους και να αποτελέσει τη βάση για την επιλογή της κατάλληλης θεραπείας και την πρόγνωση της νόσου. Άλλες µη ε- πεµβατικές µέθοδοι που αναπτύχθηκαν για την αποτίµηση της αγγειογενετικής δραστηριότητας γύρω από τους όγκους αποτελούν ο υπέρηχος Doppler, η τοµο- 85

86 γραφία εκποµπής ποζιτρονίων (positron emission tomography, PET) και η απεικόνιση µε µαγνητικό συντονισµό (dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging, MRI) 247. Όλες οι παραπάνω µέθοδοι, εκτός από αδυναµίες που οφείλονται σε τεχνικές δυσκολίες κατά την εφαρµογή τους, παρουσιάζουν το µειονέκτηµα ότι δεν αποτελούν µέτρο της πραγµατικής λειτουργίας των αγγειογενετικών και αντιαγγειογενετικών γονιδίων που ρυθµίζουν την αγγειογενετική δραστικότητα σε έ- ναν νεοπλασµατικό όγκο. Ο αριθµός µικροαγγείων του όγκου προσπαθεί να περιγράψει το φαινόµενο της αγγειογένεσης εκ του αποτελέσµατος, ενώ το ίδιο το βιοχηµικό µονοπάτι µας είναι στην ουσία άγνωστο. Γι αυτό τα τελευταία χρόνια γίνεται µια µεγάλη στροφή της ερευνητικής πράξης στην αξιολόγηση της έκφρασης των ίδιων των αυξητικών παραγόντων που συµµετέχουν ενεργά στην διαδικασία σχηµατισµού νέων αγγείων στους διάφορους τύπους καρκίνου, µε σκοπό να ελεγχθεί και να προσδιορισθεί η πιθανή τους χρήση ως µοριακών δεικτών της αγγειογενετικής δραστηριότητας και της πρόγνωσης της νόσου του καρκίνου. 4.2 Ποσοτική εκτίµηση της αγγειογένεσης µέσω µέτρησης αγγειογενετικών και αντιαγγειογενετικών παραγόντων Όπως έχει αναφερθεί η αγγειογενετική δραστηριότητα σε έναν ιστό σε µια δεδοµένη χρονική στιγµή καθορίζεται από το αθροιστικό αποτέλεσµα αγγειογενετικών και αντιαγγειογενετικών παραγόντων. Η εκτίµηση της αγγειογένεσης εποµένως µπορεί να γίνει µετρώντας την συγκέντρωση αυτών των παραγόντων, στο αίµα ή στον µυελό των οστών ασθενών µε αιµατολογικές κακοήθειες. Η µέθοδος που χρησιµοποιείται σε αυτή την περίπτωση είναι η ανοσοενζυµική µέθοδος (ELISA), σύµφωνα µε την οποία προσδιορίζονται τα πρωτεϊνικά επίπεδα διαφόρων παραγόντων στο πλάσµα ή στον ορό των ασθενών. Στην περίπτωση της οξείας µυελογενούς λευχαιµίας, οι αγγειογενετικοί παράγοντες που χρησιµοποιούνται κυρίως είναι ο VEGF, o bfgf, οι ιντερλευκίνες 6 και 8, ενώ οι αντιαγγειογενετικοί παράγοντες είναι οι µεταλλοπρωτεϊνάσες, η αγγειοποιητίνη και οι υποδοχείς του VEGF. Όσον αφορά τον παράγοντα VEGF, υπάρχει διαθέσιµη στην αγορά ELISA µόνο για την ισοµορφή VEGF-165, µε αποτέλεσµα να 86

87 περιορίζεται η µέτρηση σε µια µόνο ισοµορφή και όχι σε ολόκληρη την πρωτεΐνη του VEGF. Επιπλέον, σύµφωνα µε τους Brunner και συν. 248, τα επίπεδα του VEGF στον ορό διαφέρουν σηµαντικά σε σχέση µε το πλάσµα (380,7±56pg/ml και 45,3±4,5pg/ml αντίστοιχα, p<0,05), µε αποτέλεσµα τα ευρήµατα των περισσότερων εργασιών να µην συµφωνούν µεταξύ τους και να µην υπάρχει αντικει- µενικότητα στην επιλογή του κατάλληλου υλικού προς µελέτη. Η εφαρµογή της Μοριακής Βιολογίας παρέχει µια νέα οµάδα τεχνικών, οι οποίες έχουν χρησιµοποιηθεί για την µελέτη της έκφρασης διαφόρων παραγόντων. Παρόλο που οι τεχνικές αυτές έχουν ξεπεράσει τα µειονεκτήµατα των προηγούµενων µεθόδων, εµφανίζουν ποικιλία στο πειραµατικό στάδιο. Τα τελευταία χρόνια, θεωρείται ότι ο πιο αντικειµενικός τρόπος µελέτης της έκφρασης διαφόρων παραγόντων γίνεται µετρώντας τα επίπεδα του mrna του, σε διάφορους πληθυσµούς κυττάρων. Παραδοσιακά, η µέτρηση των επιπέδων mrna µέσα στο κύτταρο γινόταν χρησιµοποιώντας τη µέθοδο Northern Blot. Σύµφωνα µε αυτή την τεχνική γίνεται η µέτρηση της έκφρασης των επιπέδων mrna µε τη χρήση ραδιενέργειας και στη συνέχεια το RNA ποσοτικοποιείται χρησιµοποιώντας ένα αντίθετο σπινθηροβόληµα που δίνει πολύ ακριβείς αναγνώσεις. Η µέθοδος Northern Blot αν και πολύ ακριβής έχει διάφορα µειονεκτήµατα, όπως η χρήση της ραδιενέργειας και η απαίτηση µεγάλων ποσών RNA, άρα και µεγάλο αριθµό κυττάρων. Μέχρι πρόσφατα η καλύτερη µέθοδος για την ποσοτικοποίηση του mrna θεωρούνταν η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης µε τη χρήση αντίστροφης µεταγραφάσης (Reverse Transcriptase PCR, RT-PCR). Σ αυτήν, η µελέτη της έκφρασης ενός γονιδίου βασίζεται στην αποµόνωση του mrna και στην επακόλουθη µεταγραφή του σε DNA (copy DNA, cdna), ώστε να ανιχνευθεί η παρουσία και η ποσότητά του. Παλαιότερα η ανίχνευση γονιδίων µε αντίστροφη µεταγραφή γινόταν µόνο ποιοτικά. Ακόµα και αυτή η µέθοδος παρουσιάζει πολυπλοκότητα αφού δεν πραγµατοποιείται σε ένα στάδιο και για να ελεγχθεί η ποσότητα του RNA απαιτείται η χρήση µεθόδων ηλεκτροφόρησης. Τόσο ο τρόπος εφαρµογής της τεχνικής RT-PCR, µε ποικίλα πρωτόκολλα, όσο και ο τρόπος της ηλεκτροφόρησης, χρησιµοποιώντας διάφορα υποστρώµατα κάνουν ι- διαίτερα υποκειµενική την εφαρµογή της µεθόδου. Για την ποσοτικοποίηση των 87

88 αποτελεσµάτων δεν υπάρχει ένας αντικειµενικός τρόπος αξιολόγησης των ζωνών που προκύπτουν από την ηλεκτροφόρηση. Συνήθως χρησιµοποιούνται προγράµµατα επεξεργασίας εικόνας, που εξαρτώνται από την κρίση της κάθε ερευνητικής οµάδας. 4.3 Μελέτη της έκφρασης γονιδίου µε αντίστροφη µεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (Real Time RT-PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (Real Time RT-PCR) που επιτρέπει την ποσοτικοποίηση των προϊόντων και αποτελεί χρήσιµο εργαλείο στη διερεύνηση της έκφρασης γονιδίων 249, είναι µια νέα µέθοδος πολύ πιο απλή και αξιόπιστη. Η ικανότητα του κυττάρου να αποκρίνεται άµεσα στις αλλαγές του εξωκυττάριου περιβάλλοντος, οφείλεται στην ικανότητά του να προσαρµόζει ανάλογα τη µεταγραφική του δραστηριότητα, δηλαδή την έκφραση ή µη γονιδίων σε mrna (αγγελιοφόρο RNA, messenger RNA). Συνεπώς, το RNA είναι το πρωταρχικό µόριο στις µελέτες έκφρασης γονιδίων και έχει µεγάλη σηµασία η παραγωγή και η καθαρότητά του. Η Real Time RT-PCR αποτελεί σηµαντικό εργαλείο στην έρευνα σήµερα, καθώς συνδυάζει τον πολλαπλασιασµό τµηµάτων νουκλεϊνικών οξέων, µε τη σύγχρονη παρακολούθηση της αντίδρασης σε πραγµατικό χρόνο, την ανίχνευση των παραγόµενων προϊόντων και την ποσοτικοποίησή τους κατά απόλυτες και σχετικές τιµές. Είναι µέθοδος µε υψηλή ευαισθησία, επαναληψιµότητα και ευρεία κλίµακα ποσοτικοποίησης 250. Μεγάλο πλεονέκτηµα της µεθόδου είναι η ταχύτητα µε την οποία αποδίδει αποτελέσµατα, γεγονός που οφείλεται στην α- ποφυγή των τεχνικών εκείνων που απαιτούνται για την ανίχνευσή των προϊόντων, όπως είναι η ανάλυση µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης, η υβριδοποίηση, οι αντιδράσεις ανοσοεντοπισµού 251, αλλά και η µείωση του κινδύνου επιµολύνσεων και ψευδώς θετικών αποτελεσµάτων από τους χειρισµούς των ανωτέρω τεχνικών. Στη Real Time RT-PCR η ανίχνευση και η παρακολούθηση των προϊόντων εν τη γενέσει τους επιτυγχάνεται µε τη χρήση σηµασµένων µορίων εκκινητών (ειδική σήµανση) ή φθοριζόντων µορίων που δεσµεύονται στην επιθυµητή αλ- 88

89 ληλουχία (µη ειδική σήµανση). Τα µόρια-σηµαντές παράγουν φθορίζον σήµα, η ποσότητα του οποίου είναι ανάλογη µε την ποσότητα του προϊόντος που ενισχύεται µε την αντίδραση. Η χηµική βάση των αντιδράσεων της Real Time RT- PCR µε φθορισµό, της δίνει ένα ακόµη πλεονέκτηµα έναντι των προηγούµενων τεχνικών µε ραδιοσήµανση, καθώς αποφεύγεται η έκθεση στη ραδιενέργεια. Τα αντιδραστήρια που χρησιµοποιεί είναι ακίνδυνα, εύκολο να απορριφθούν και έχουν µεγάλο χρόνο ζωής 251. Υπάρχουν αρκετές µέθοδοι για τη σήµανση και την ανίχνευση των προϊόντων της Real Time RT-PCR, οι σηµαντικότερες από τις οποίες είναι οι ειδικοί σηµασµένοι ανιχνευτές (TaqMan), τα ειδικά δίκλωνα µόρια DNA που βασίζονται στη µεταφορά ενέργειας µε απορρόφηση ενέργειας (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) και οι µη ειδικές παρεµβαλλόµενες φθορίζουσες χρωστικές (SYBR Green I) 250. Οι ανιχνευτές TaqMan είναι ολιγονουκλεοτίδια σηµασµένα µε φθορίζον µόριο (χρωστική αναφοράς, reporter dye) στο 5 άκρο και ένα µόριο-σιγαστή (quencher) στο 3 άκρο. Τα ελεύθερα µόρια του ανιχνευτή δεν φθορίζουν, γιατί φέρουν το µόριο-σιγαστή. Κατά τη διάρκεια της φάσης επιµήκυνσης, ο ανιχνευτής που είναι συµπληρωµατικός στην επιθυµητή αλληλουχία, δεσµεύεται στο µονόκλωνο µόριο. Όταν η Taq DNA πολυµεράση φτάσει τον ανιχνευτή, αποκλίνει από την πορεία της και κόβει ενδονουκλεϊκά τον ανιχνευτή. Έτσι το µόριο-σιγαστής ελευθερώνεται και το φθοριόχρωµα φθορίζει. Στην περίπτωση αυτή, η υδρόλυση του ανιχνευτή από την Taq DNA πολυµεράση είναι απαραίτητη για τη δηµιουργία σήµατος. Μετά το τέλος της αντίδρασης υπολογίζεται ο λόγος σήµατος/θορύβου, που ουσιαστικά αντιστοιχεί σε λόγο κοµµένων/µη κοµµένων ανιχνευτών. Όσο µεγαλύτερος είναι αυτός ο λόγος, τόσο περισσότερα µόρια του ανιχνευτή έχουν υδρολυθεί, συνεπώς υπάρχει πιο έντονο σήµα και πιο καθαρό αποτέλεσµα, αφού ο θόρυβος από τα µη υδρολυµένα µόρια είναι µικρός. Το ποσοστό των υδρολυµένων ανιχνευτών εξαρτάται από τη θέση δέσµευσης του ανιχνευτή και την αλληλουχία, τα οποία πρέπει να λαµβάνονται υπόψη κατά το σχεδιασµό τους 252. Αυτή η µέθοδος ανίχνευσης έχει το πλεονέκτηµα ότι είναι ειδική και άρα δεσµεύεται µόνο στην επιθυµητή αλληλουχία και ότι κάθε µόριο ανιχνευτή απε- 89

90 λευθερώνει ένα µόριο χρωστικής για κάθε αντίγραφο. Έτσι, η µέθοδος γίνεται πολύ χρήσιµη όταν µελετώνται δείγµατα µε µικρό αριθµό αντιγράφων 253. Μειονεκτεί όµως, στο ότι δεν επιτρέπει ανάλυση µε τήξη των προϊόντων αφού η χρωστική αναφοράς έχει κοπεί µη αντιστρεπτά 253. Οι ανιχνευτές FRET βασίζονται στη µεταφορά ενέργειας από µια φθορίζουσα χρωστική σε άλλη. Στην περίπτωση αυτή χρησιµοποιούνται δύο ξεχωριστές ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες, ειδικές για το τµήµα-στόχος, σηµασµένες µε φθορίζοντα µόρια. Ο ευθύς ανιχνευτής έχει ένα µόριο δότη στο 3 άκρο του και ο αντίστροφος έχει ένα µόριο δέκτη στο 5 άκρο. Οι ανιχνευτές είναι σχεδιασµένοι ώστε να υβριδίζουν σε γειτονικές θέσεις πάνω στην αλληλουχία στόχο, µε αποτέλεσµα τα φθοριοχρώµατα του δότη και του δέκτη να έρχονται πολύ κοντά. Αυτό επιτρέπει τη µεταφορά ενέργειας από το φθορίζον µόριο του δότη σε εκείνο του δέκτη και την εκποµπή σήµατος διαφορετικού µήκους κύµατος. Συνεπώς, σήµα ανιχνεύεται µόνο όταν και οι δυο ανιχνευτές είναι δεσµευ- µένοι και η έντασή του εξαρτάται από την απόσταση στην οποία φτάνουν αυτοί 253. Η µέθοδος επιτρέπει την ανάλυση µε τήξη των προϊόντων και ενδείκνυται για µελέτη γονοτύπου, ανίχνευση σηµειακών µεταλλάξεων (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) και πολλαπλή ανίχνευση στόχων (multiplexing). Μειονεκτήµατα αποτελούν η µη επιθυµητή παραγωγή σήµατος λόγω αποικοδόµησης του ανιχνευτή (πχ από µη επιθυµητή υδρόλυση από την Taq DNA πολυµεράση) ή λόγω σχηµατισµού δευτεροταγών δοµών των ανιχνευτών 252. Η µέθοδος που χρησιµοποιεί την SYBR Green I είναι µη ειδική, σε αντίθεση µε τις προαναφερθείσες. Το SYBR Green I είναι µια φθορίζουσα χρωστική που δεσµεύεται στη µικρή αύλακα της διπλής έλικας του DNA και µπορεί να διεγερθεί στο κυανό µε µήκος κύµατος 480nm. Η χρωστική ελεύθερη εκπέµπει ασθενές σήµα, αλλά ο φθορισµός ενισχύεται όταν δεσµεύεται στο δίκλωνο µόριο. Επί πλέον, η ένταση του φθορισµού της δεσµευµένης χρωστικής είναι περισσότερο από 1000 φορές υψηλότερη από εκείνη της ελεύθερης 252. Καθώς το DNA στόχος επιµηκύνεται κατά τη διάρκεια της PCR, η χρωστική δεσµεύεται στα προϊόντα και η εκποµπή σήµατος αυξάνεται. Πολλαπλά µόρια χρωστικής µπορούν να δεσµευθούν στο προϊόν, ανάλογα µε το µήκος του 253 (Εικόνα 16). 90

91 Με την τεχνική της Real Time RT-PCR υπάρχει η δυνατότητα όχι µόνο της παρακολούθησης της αντίδρασης σε πραγµατικό χρόνο, αλλά και του προσδιορισµού της ποσότητας των παραγόµενων προϊόντων µε απόλυτο ή σχετικό υπολογισµό. Η απόλυτη ποσοτικοποίηση προσδιορίζει τον αριθµό αντιγράφων του αρχικού δείγµατος µε χρήση καµπύλης ποσοτικοποίησης, ενώ η σχετική ποσοτικοποίηση προσδιορίζει το ρυθµό έκφρασης σε σχέση µε την παραγωγή mrna του κυττάρου. Εικόνα 16: Μέθοδος της Real-Time RT-PCR, µε τη χρήση της φθορίζουσας χρωστικής SYBR Green I. Με την απόλυτη ποσοτικοποίηση (Real-Time Absolute QRT-PCR) υπολογίζεται η συγκέντρωση του αρχικού δείγµατος κάνοντας χρήση καµπύλης ποσοτικοποίησης, που είναι σειρά δειγµάτων αναφοράς (standards) µε γνωστή συγκέντρωση. Τα δείγµατα αναφοράς θα πρέπει να έχουν παραχθεί και ενισχυθεί µε τον ίδιο τρόπο και τις ίδιες συνθήκες µε τα προς ποσοτικοποίηση δείγµατα. Αυτό σηµαίνει πως εκτός από τις ίδιες συγκεντρώσεις αντιδρώντων µορίων και θερµοκρασιών, θα πρέπει να έχουν χρησιµοποιηθεί τα ίδια µόρια εκκινητών και φυσικά οι αντιδράσεις να έχουν την ίδια τιµή απόδοσης (efficiency, E)

92 Τα δείγµατα αναφοράς για την κατασκευή της καµπύλης ποσοτικοποίησης µπορεί να είναι ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό DNA (recdna), γενοµικό DNA, προϊόν αντίστροφης µεταγραφής ή συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια 250. Αφού προσδιοριστεί η συγκέντρωσή τους, συνήθως µε µέτρηση της απορρόφησης στα 260 nm, ή των αντιγράφων τους, αν πρόκειται για κλωνοποιηµένη αλληλουχία σε πλασµίδιο, ή από την εταιρεία, αν πρόκειται για συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, θα πρέπει να οµαλοποιηθούν. Η οµαλοποίηση (normalization) γίνεται µε βάση των αριθµό κυττάρων ή το συνολικό ποσό RNA που χρησιµοποιείται και γίνεται για να διορθώσει τις διαφορές στην ποσότητα του δείγµατος που εισάγεται στην αντίδραση 253. Το τελικό αποτέλεσµα της µεθόδου είναι ο ακριβής α- ριθµός µεταγράφων ενός γονιδίου σε κάθε δείγµα που εξετάστηκε. Με τη σχετική ποσοτικοποίηση (Real Time Relative QRT-PCR) προσδιορίζονται οι αλλαγές των επιπέδων του mrna ενός γονιδίου σε σχέση µε το επίπεδο έκφρασης ενός εσωτερικού γονιδίου αναφοράς. Συνεπώς δεν χρειάζεται η κατασκευή καµπύλης ποσοτικοποίησης µε δείγµατα αναφοράς γνωστών συγκεντρώσεων, αφού όλα τα δείγµατα εκφράζονται σαν λόγος ως προς το γονίδιο αναφοράς και στη συνέχεια συγκρίνονται οι λόγοι. Το γονίδιο αναφοράς συνήθως είναι ένα διατηρηµένο (housekeeping) γονίδιο, το οποίο είναι παρόν σε όλα τα γονιδιώµατα, αφού είναι υπεύθυνο για ζωτικές για το κύτταρο λειτουργίες. Η σύνθεση mrna αυτών των γονιδίων θεωρείται ότι παραµένει σταθερή ανεξάρτητα από τις συνθήκες στις οποίες εκτίθεται το κύτταρο, γι αυτό και χρησιµοποιούνται για τη µελέτη της έκφρασης γονιδίων κάτω από διάφορες συνθήκες. Τόσο για το γονίδιο αναφοράς, όσο και για το εξεταζόµενο γονίδιο δηµιουργούνται οι πρότυπες καµπύλες, όχι γνωστών συγκεντρώσεων όπως στην απόλυτη ποσοτικοποίηση. Στην περίπτωση αυτή, οι καµπύλες προκύπτουν από διαδοχικές αραιώσεις του cdna ενός δείγµατος α- ναφοράς. Από την κλίση της πρότυπης καµπύλης (slope) υπολογίζεται η απόδοση της αντίδρασης (Efficiency) για κάθε γονίδιο. Η διαφορά στις αποδόσεις έχει σηµασία στο να γίνει η εκτίµηση των µαθηµατικών µοντέλων, καθώς η απόδοση είναι ο κύριος παράγοντας που διαφοροποιεί τα δυο µαθηµατικά συστήµατα που χρησιµοποιούνται στην σχετική ποσοτικοποίηση. 92

93 Η σχετική ποσοτικοποίηση βασίζεται στο λόγο των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου-στόχου ως προς το γονίδιο αναφοράς. Για το υπολογισµό αυτού του - Ct 254 λόγου έχουν εφαρµοσθεί δυο µαθηµατικά µοντέλα: α) η µέθοδος του 2 και β) το µαθηµατικό µοντέλο του Pfaffl 255,256,250. Η µέθοδος του 2 - Ct, που έχει και την πιο ευρεία χρήση, είναι κατάλληλη για αντιδράσεις µε παρεµφερή τιµή απόδοσης (Εfficiency, E), καθώς δεν περιλαµβάνει εξοµάλυνση των αποδόσεων. Οι λόγοι έκφρασης υπολογίζονται από την εξίσωση R = 2 ( Ct δείγµα Ct µάρτυρας) 254. Το µαθηµατικό µοντέλο του Pfaffl προβλέπει εξοµάλυνση των αποδόσεων των διαφορετικών αντιδράσεων και γι αυτό θεωρείται πιο ακριβής τρόπος προσέγγισης. Οι λόγοι έκφρασης υπολογίζονται από την εξίσωση Ct στόχος R = E (µάρτυρας-δείγµα) στόχος / E Ct αναφ. (µάρτυρας-δείγµα) 255,256 αναφ.. Αυτή τη στιγµή υπάρχουν προγράµµατα λογισµικού, όπως το REST και το REST-XL, που δίνουν τη δυνατότητα στον ερευνητή να κάνει ευκολότερα και γρηγορότερα τους ανωτέρω υπολογισµούς, απλά εισάγοντας τα δεδοµένα των αντιδράσεων στο αντίστοιχο πρόγραµµα του ηλεκτρονικού υπολογιστή. 93

94

95 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

96

97 Ι. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 1. ΑΣΘΕΝΕΙΣ Η µελέτη πραγµατοποιήθηκε στο Αιµατολογικό εργαστήριο της Β Παθολογικής Κλινικής του ΑΠΘ, στο Ιπποκράτειο γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης, κατά τη χρονική περίοδο από τον Ιανουάριο του 2005 έως τον Νοέµβριο του Σε αυτήν συµµετείχαν ασθενείς µε ΟΜΛ από τις Β και Παθολογικές κλινικές του ίδιου Νοσοκοµείου. Μελετήθηκαν κατ αρχήν 40 ασθενείς µε ΟΜΛ (24 άντρες και 16 γυναίκες) µε µέση ηλικία 67,72 ± 11,47 έτη, κατά τη διάγνωση πριν από τη χορήγηση ειδικής θεραπευτικής αγωγής. Η διάγνωση της ΟΜΛ έγινε µε βάση την µορφολογία των βλαστών στο περιφερικό αίµα και τον µυελό των οστών, τις κυτταροχη- µικές χρώσεις, τον ανοσοφαινότυπο και την ανοσοϊστοχηµική µελέτη των το- µών της οστεοµυελικής βιοψίας. Για τη διάγνωση της οξείας µυελογενούς λευχαιµίας ήταν απαραίτητη η ύπαρξη >30% βλαστών στο µυελό των οστών. Η µορφολογική ταξινόµηση έγινε µε βάση τα κριτήρια κατά FΑΒ. ύο ασθενείς είχαν οξεία µυελογενή λευχαιµία Μ0, 6 Μ1, 12 Μ2, 5 Μ3, 10 Μ4, 5 Μ5 και 2 Μ6. Από τους ασθενείς αυτούς, οι 25 είχαν πρωτοπαθή ΟΜΛ και οι 15 δευτεροπαθή ΟΜΛ (µετά από εξέλιξη µυελοδυσπλαστικού συνδρόµου). Η βασική θεραπεία που εφαρµόσθηκε στους ασθενείς περιελάµβανε κυττοσίνη-αραβινοσίδη (κυτταραµπίνη, Ara-C) και Ινταρουβικίνη (Idarubicin). Η πρώτη χορηγήθηκε σε δόση 100 ή 200 mg/m 2 επί 7 ηµέρες και η δεύτερη σε δόση 12 mg/m 2 επί 3 ηµέρες (7+3). Στους ασθενείς µε ηλικία µεγαλύτερη από 70 έτη και ανάλογα µε τη φυσική τους κατάσταση χρησιµοποιήθηκε η µικρότερη δόση των 100 mg/m 2 Ara-C επί 5-7 ηµέρες ενώ η Idarubicin δόθηκε µόνο 2 ηµέρες (5-7+2). Ως ύφεση στους ασθενείς µας χαρακτηρίσθηκε η πλήρης κλινική και αιµατολογική αποκατάσταση, δηλαδή φυσιολογική εικόνα του περιφερικού αίµατος και βλάστες στο µυελό <5%. Από τους 40 ασθενείς που µελετήθηκαν οι 18 (10 άντρες και 8 γυναίκες µε µέση ηλικία 64,22 ± 10,88 έτη) απάντησαν στη θεραπεία και µελετήθηκαν κατά τη διάρκεια της ύφεσης. Οι ασθενείς στην ύφεση είχαν, σύµφωνα µε την FAB 97

98 ταξινόµηση, 2 οξεία µυελογενή λευχαιµία Μ1, 6 Μ2, 3 Μ3, 4 Μ4, 2 Μ5 και 1 Μ6. Από αυτούς οι 11 είχαν πρωτοπαθή ΟΜΛ και οι 8 δευτεροπαθή. Για κάθε ασθενή συµπληρωνόταν ειδικό πρωτόκολλο στο οποίο υπήρχαν κλινικά και εργαστηριακά στοιχεία κατά την αρχική διάγνωση της νόσου και την ύφεση. Ως µάρτυρες στη µελέτη µας χρησιµοποιήθηκαν 22 υγιή άτοµα µέσης ηλικίας 66,42 ± 11,21 έτη. Στους 12 έγινε ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων mrna και της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης του ορού του VEGF, ενώ στους 10 εκτιµήθηκε η µικροαγγειακή πυκνότητα σε τοµές βιοψίας µυελού. 2. ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ Η µελέτη εκπονήθηκε στο Αιµατολογικό Τµήµα της Β Παθολογικής Κλινικής του ΑΠΘ και συγκεκριµένα στο Εργαστήριο Κυτταρικής και Μοριακής Βιολογίας. Η έρευνά περιελάµβανε τον έλεγχο της αγγειογένεσης στην ΟΜΛ µέσω της ποσοτικής εκτίµησης των επιπέδων mrna του VEGF στο µυελό των οστών µε τη µέθοδο της Real-Time RT-PCR και της πρωτεΐνης του παράγοντα στον ορό µε τη µέθοδο της ELISA. Επιπλέον, προσδιορίσθηκε η µικροαγγειακή πυκνότητα σε τοµές µυελικής βιοψίας. Αναλυτικά, το ερευνητικό πρωτόκολλο περιελάµβανε τα παρακάτω στάδια αµέσως µετά την είσοδο των ασθενών στην κλινική: 1. Λήψη ιστορικού. 2. Λήψη περιφερικού αίµατος για την καταγραφή των αιµατολογικών παραµέτρων, το ποσοστό και την µορφολογία των βλαστών, τις κυτταροχηµικές χρώσεις και τον ανοσοφαινότυπο. 3. ιενέργεια µυελογράµµατος για: α) τη διάγνωση και την ταξινόµηση της ΟΜΛ µε βάση τη µορφολογία των βλαστών, τις κυτταροχηµικές χρώσεις, τον ανοσοφαινότυπο και σε ορισµένους ασθενείς τον έλεγχο του καρυότυπου, β) τον προσδιορισµό των επιπέδων mrna του αγγειογενετικού παράγοντα VEGF. Η ανάλυση αυτή περιλάµβανε τα εξής στάδια: Αποµόνωση ολικού RNA από κύτταρα µυελού των οστών µε τη βοήθεια ειδικού kit. 98

99 Φωτοµέτρηση των δειγµάτων RNA για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσής τους. Μετατροπή του RNA σε cdna, µε την τεχνική της RT-PCR. Έλεγχος των προϊόντων της RT-PCR µε την τεχνική της PCR. Εφαρµογή της Real-Time RT-PCR, για τον VEGF και για το γονίδιο αναφοράς Abl. Εισαγωγή των δεδοµένων της Real-Time RT-PCR στο λογισµικό Relative Expression Software Tool-XL (REST-XL -Version2) και ανάλυση των α- ποτελεσµάτων, µε τη µέθοδο της σχετικής ποσοτικοποίησης. 4. Λήψη αίµατος µε σκοπό τη µέτρηση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης του VEGF στον ορό ασθενών µε την ανοσοενζυµική µέθοδο ELISA. 5. Οστεοµυελική βιοψία για τη µορφολογία και το ποσοστό των βλαστών, την πιθανότητα ύπαρξης ίνωσης, τη διενέργεια ιστοχηµικών χρώσεων και ανοσοφαινότυπου. Σε 22 ασθενείς, στις τοµές της οστεοµυελικής βιοψίας προσδιορίσθηκε η µικροαγγειακή πυκνότητα µε ανοσοϊστοχηµική χρώση µε αντί-cd34 µονοκλωνικό αντίσωµα (Novocastra laboratories). Τα πλακίδια µικροσκοπήθηκαν και η µικροαγγειακή πυκνότητα καταµετρήθηκε σε όλα τα πεδία. Όλες οι παραπάνω µετρήσεις, πλην της µικροαγγειακής πυκνότητας, επαναλήφθηκαν σε 18 ασθενείς που επέτυχαν αιµατολογική ύφεση µετά τη χηµειοθεραπεία. 6. Μεταφορά όλων των δεδοµένων στο στατιστικό πακέτο SPSS, για τη στατιστική τους επεξεργασία. 3. ΜΕΘΟ ΟΙ 3.1 Μοριακή ανάλυση Αποµόνωση RNA από µυελό των οστών Για την αποµόνωση του ολικού κυτταρικού RΝΑ χρησιµοποιήθηκε το ειδικό kit της εταιρίας QIAGΕΝ (QIAamp RNA Blood Mini Kit) µε στήλες. Το πρωτόκολλο τροποποιήθηκε σε ορισµένες περιπτώσεις ώστε να γίνει όσο το δυνατόν καλύτερη η αποµόνωση του ολικού RΝΑ. Η διαδικασία περιγράφεται παρακάτω. 99

100 1. Ανάµειξη ενός όγκου µυελού των οστών µε 5πλάσιο όγκο διαλύµατος EL (Erythrocyte Lysis buffer) σε flacon των 15ml, ανακίνηση και τοποθέτηση στον πάγο για 10 λεπτά. Το διάλυµα EL καταστρέφει τα κύτταρα της ερυθράς σειράς, τα οποία δε διαθέτουν πυρήνα, διασπώντας τις κυτταρικές µεµβράνες, µε τη βοήθεια ωσµωτικής πίεσης. 2. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 2500 στροφές για 15 λεπτά και αποµάκρυνση του υπερκείµενου. Παραµένει το ίζηµα, που περιλαµβάνει πλέον µόνο τα εµπύρηνα κύτταρα της λευκής σειράς, από τα οποία θα αποµονωθεί το RNA. Αν χρειαστεί, επαναλαµβάνονται τα δυο αυτά στάδια, µε σκοπό να λυθούν όλα τα ερυθρά και να παρθεί πιο καθαρό το ίζηµα. 3. Προσθήκη, στο ίζηµα των κυττάρων, διαλύµατος RLT, το οποίο περιέχει β- µερκαπτοαιθανόλη. Ο όγκος του RLT που χρησιµοποιείται είναι ανάλογος του αριθµού των κυττάρων (350µl για αριθµό κυττάρων έως 5x10 6 και 600µl για αριθµό κυττάρων >5x10 6 και <1x10 7 κύτταρα). Το RLT είναι ένα ρυθµιστικό διάλυµα υψηλής αλατότητας µε έντονη αποδιατακτική ικανότητα, το οποίο είναι υπεύθυνο για τη διάσπαση όλων των κυτταροπλασµατικών και πυρηνικών µεµβρανών. Η διάσπαση αυτή οδηγεί στην απελευθέρωση των νουκλεϊκών οξέων (DNA και RNA), αλλά και διαφόρων ενζύµων, όπως οι RNάσες, που θα µπορούσαν να καταστρέφουν το RNA. Η β- µερκαπτοαιθανόλη είναι υπεύθυνη για την αδρανοποίηση αυτών των ενζύ- µων. 4. Ακολουθεί µεταφορά του διαλύµατος λύσης µέσα στα ειδικά σωληνάρια οµογενοποίησης τα οποία φέρουν ειδικό φίλτρο (QIAshredder spin column) και φυγοκέντρηση στις στροφές για 2 λεπτά. Συλλογή του οµογενοποιήµατος στο κάτω µέρος του σωληναρίου. Το φίλτρο είναι έτσι κατασκευασµένο ώστε να δεσµεύει όλα τα συστατικά του κυττάρου που έχουν προκύψει από τη λύση του (πρωτεΐνες, υπολείµµατα από κυτταρικές µεµβράνες κ.α) ενώ ταυτόχρονα καταστρέφει τα κύτταρα που δεν έχουν λυθεί. Τα νουκλεϊκά οξέα όπως το DΝΑ και το RΝΑ διέρχονται διαµέσω του φίλτρου και συλλέγονται µέσα στο διάλυµα οµογενοποίησης. 5. Απόρριψη του φίλτρου και προσθήκη στο οµογενοποιηµένο διάλυµα των νουκλεϊκών οξέων ίσης ποσότητας αιθυλικής αλκοόλης 70%. Με τον τρόπο 100

101 αυτό προκαλείται αφυδάτωση των νουκλεϊκών οξέων ενώ ταυτόχρονα ρυθ- µίζονται οι συνθήκες σύνδεσης των νουκλεϊκών οξέων στο επόµενο φίλτρο. 6. Μεταφορά του διαλύµατος DΝΑ και RΝΑ στην επόµενη στήλη (QIAamp spin columm) και σύντοµη φυγοκέντρηση για 25 δευτερόλεπτα. Το RΝΑ και µέρος του DΝΑ συνδέονται χηµικά µε το φίλτρο, καθώς το διάλυµα της οµογενοποίησης περνά µέσα από αυτό. 7. Μεταφορά του φίλτρου σε νέο σωληνάριο. Προσθήκη 50µl διαλύµατος DNάσης (Versagene TM DNase Treatment Kit, Gentra) απευθείας στο φίλτρο και επώαση για µια ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Η DNάση είναι µία ε- ξωνουκλεάση η οποία διασπά κατά την κατεύθυνση 5' 3' τους φωσφωδιεστερικούς δεσµούς των νουκλεοτιδίων µόνο του DΝΑ. Με τον τρόπο αυτό καταστρέφεται το DΝΑ, ώστε να αποφευχθεί τυχόν επιµόλυνση. 8. Τοποθέτηση 200µl ρυθµιστικού διαλύµατος DNασης (DNase Wash Solution, Gentra) επάνω στο φίλτρο και παραµονή για 1 λεπτό. Φυγοκέντρηση στις στροφές για 1 λεπτό. Με τον τρόπο αυτόν εκπλύνεται το φίλτρο και αποµακρύνεται το DΝΑ, ενώ το RΝΑ εξακολουθεί να βρίσκεται δεσµευµένο µέσα στο φίλτρο. 9. Μεταφορά του φίλτρου σε νέο σωληνάριο και προσθήκη 700µl διαλύµατος RW1. Φυγοκέντρηση στις στροφές για 25 δευτερόλεπτα. Το υψηλής αλατότητας διάλυµα RW1 περιλαµβάνει ουσίες που αποµακρύνουν τυχόν προσµίξεις του RΝΑ µε άλλες ουσίες ενώ ταυτόχρονα διατηρεί τις RNάσες απενεργοποιηµένες. 10. Μεταφορά του φίλτρου σε νέο σωληνάριο και προσθήκη 500µl διαλύµατος RΡΕ, στο οποίο έχει προστεθεί τετραπλάσιος όγκος αιθανόλης. Φυγοκέντρηση στις στροφές για 3 λεπτά. Το RΡΕ είναι ένα διάλυµα πλύσεως του RΝΑ και χρησιµοποιείται για αποµάκρυνση των αλάτων και όλων των ανόργανων ουσιών. 11. Μεταφορά του φίλτρου σε νέο σωληνάριο, χωρίς προσθήκη άλλου διαλύµατος. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις στροφές. Στο στάδιο αυτό γίνεται η καλύτερη αποµάκρυνση όλων των διαλυµάτων που χρησιµοποιήθηκαν για το πλύσιµο του RΝΑ, τα οποία εάν παραµείνουν ίσως δράσουν ανασταλτικά κατά την εφαρµογή περαιτέρω πειραµάτων. 101

102 12. Μεταφορά του φίλτρου στο ειδικό σωληνάριο συλλογής (Collection tube 2ml) και προσθήκη 50µl απεσταγµένου νερού ελεύθερου από RNάσες. Φυγοκέντρηση και απόρριψη του φίλτρου. Παραλαβή του σωληναρίου που περιέχει το προϊόν έκλουσης, δηλαδή το ολικό κυτταρικό RΝΑ σε τελικό όγκο 50µl. 13. Τα δείγµατα συντηρούνται στους -70 ο C Προσδιορισµός της ποσότητας και καθαρότητας του RNA Φασµατοφωτοµέτρηση RNA Ο προσδιορισµός της συγκέντρωση του RNA και η εκτίµηση της καθαρότητάς του πραγµατοποιήθηκαν σε υπεριώδες φασµατοφωτόµετρο (Biophotometer, Eppendorf), µε µέτρηση της οπτικής απορρόφησης σε µήκη κύµατος 260nm (A 260 ) και 280nm (Α 280 ). Οι απορροφήσεις και στα δύο µήκη κύµατος θεωρήθηκαν αποδεκτές όταν ήταν µεγαλύτερες από 0,15. Συγκεκριµένα η ποσότητα του RNA προσδιορίζεται µε βάση την απορρόφηση στα 260 nm στηριζόµενοι στο ότι διάλυµα RNA 40µg/ml έχει απορρόφηση 1 a.u. (absorbance units). Σε µήκος κύµατος 280nm ελέγχεται η πρόσµιξη πρωτεϊνών. Ο λόγος των τιµών απορρόφησης που παρουσιάζει ένα διάλυµα RNA, A 260 /Α 280, αποτελεί µέτρο της καθαρότητάς του και των προσµείξεων από DNA ή και πρωτεΐνες που τυχόν συνυπάρχουν. Εάν το παρασκεύασµα δεν περιέχει πρωτεϊνικές προσµίξεις, τότε ο λόγος OD 260 :OD 280 = 2. Υψηλής καθαρότητας RNA µε ελάχιστες προσµίξεις έχει λόγο που κυµαίνεται από 1,7 έως 2. Η αραίωση των δειγµάτων που φωτο- µετρήθηκαν ήταν 1/10 (5µl RNA και 45µl απεσταγµένου νερού ελεύθερου από RNάσες), ενώ ως τυφλό χρησιµοποιήθηκε απεσταγµένο νερό. Τα δείγµατα που χρησιµοποιήθηκαν στη µελέτη ήταν υψηλής συγκέντρωσης και καθαρότητας Αντίστροφη µεταγραφή - Σύνθεση συµπληρωµατικού DNA (complementary DNA, cdna) Η RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) είναι µια τεχνική µετατροπής του µονόκλωνου RNA σε δίκλωνο DNA. Η µέθοδος στηρίζεται στην ικανότητα του ιϊκού ενζύµου της αντίστροφης µεταγραφάσης (ή τρανσκριπτάσης) να συνθέτει µόρια DNA µε µήτρα µόρια RNA. 102

103 Η ανάστροφη µεταγραφάση είναι ένα ένζυµο που περιλαµβάνει µια RNA εξαρτηµένη DNA πολυµεράση και µια DNA εξαρτηµένη DNA πολυµεράση, που δρουν µαζί για την αντίστροφη µεταγραφή. Αρχικά συντίθεται η µια µόνο αλυσίδα του DNA που είναι συµπληρωµατική της αρχικής µονόκλωνης αλυσίδας του RNA, µε τη δράση της RNA εξαρτηµένης DNA πολυµεράσης. Η διεύθυνση είναι 5 3 και ως αφετηρία χρησιµοποιείται το 3 -ΟΗ άκρο της αλυσίδας του RNA. Έπειτα η ανάστροφη µεταγραφάση, που έχει και δράση νουκλεάσης, υδρολύει την αλυσίδα του RNA, ενώ µε τη δράση της DNA εξαρτηµένης DNA πολυµεράσης συνθέτει τη συµπληρωµατική DNA αλυσίδα, σχηµατίζοντας τελικά ένα γραµµικό δίκλωνο µόριο DNA. Περίπου 500 ng ολικού RNA χρησιµοποιούνται για τη σύνθεση cdna µε τη χρήση του ενζύµου αντίστροφης µεταγραφάσης SuperScript II RNase H(-) Reverse Transcriptase, σύµφωνα µε το παρακάτω πρωτόκολλο. 1. Μεταφορά των δειγµάτων σε πάγο για την καταστολή της δράσης των RNασών. 2. Λήψη ποσότητας 500ng RNA από κάθε δείγµα και προσθήκη 1µl τυχαίων εκκινητών (random primers, 3µg/µl, Invitrogen Life Technologies). Το διάλυµα συµπληρώνεται µε απεσταγµένο νερό µέχρι τελικού όγκου 12µl. 3. Επώαση στους 70 ο C για 10 λεπτά, µε σκοπό τον υβριδισµό των εκκινητών στο RNA. 4. Επώαση στους 4 ο C για 3 λεπτά, µε σκοπό την σταθεροποίηση των εκκινητών που έχουν υβριδιστεί. Στην συνέχεια, σε κάθε δείγµα προστίθενται 4 µl ρυθµιστικό διάλυµα (που αποτελείται από 250mM Tris-HCl (ph 8.3), 375mM KCl, 15mM MgCl 2 ) 2 µl διαλύµατος DTT 100mM 2 µl διαλύµατος 5 τριφωσφορικών δεσοξυριβονουκλεοτιδίων, dntps 100mM (που αποτελείται από datp, dttp, dctp, dgtp, συγκέντρωσης 100mM το καθένα, Invitrogen Life Technologies) 5. Τα δείγµατα τοποθετούνται στους 42 C για 2 λεπτά στη συσκευή της ΡCR. Στο σηµείο αυτό προστίθεται σε κάθε δείγµα 1µl (200U/µl) από την Super- 103

104 script II Ανάστροφη Μεταγραφάση (Invitrogen Life Technologies), η οποία ενεργοποιείται άµεσα, λόγω της κατάλληλης θερµοκρασίας των δειγµάτων. 6. Ακολουθεί πρόγραµµα στη συσκευή της PCR. Οι συνθήκες έχουν ως εξής: 25 C για 10 λεπτά, µε σκοπό την ενεργοποίηση των τυχαίων εκκινητών. 42 C για 50 λεπτά, µε σκοπό την έναρξη δράσης της ανάστροφης µεταγραφάσης. 95 C για 5 λεπτά, µε σκοπό την µετουσίωση και αδρανοποίηση της πολυ- µεράσης. ιατήρηση των δειγµάτων στους -20 C Μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης µε πολυµεράση (PCR) Για να βεβαιωθεί η ακεραιότητα του DNA των δειγµάτων που συντέθηκαν, γίνεται έλεγχος παρουσίας ενός γονιδίου, το οποίο εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα και χρησιµοποιείται ως γονίδιο αναφοράς (ή housekeeping γονίδιο). Το γονίδιο αυτό λειτουργεί ως θετικός µάρτυρας ή ως µάρτυρας σωστής διεξαγωγής της RT-PCR. Στη µελέτη ως γονίδιο αναφοράς χρησιµοποιήθηκε το γονίδιο Abl, που µε βάση τη βιβλιογραφία είναι το πιο κατάλληλο για τη µελέτη της έκφρασης στα αιµατολογικά νοσήµατα 257. Οι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές (primers) του γονιδίου Abl σχεδιάστηκαν ώστε να είναι συµπληρωµατικοί µε αλληλουχίες που βρίσκονται στις θέσεις συρραφής δύο εξονίων, ούτως ώστε να αποφεύγονται τυχόν ψευδώς θετικά αποτελέσµατα, λόγω επιµόλυνσης από γενωµικό DΝΑ. Η αλληλουχία των εκκινητών φαίνεται στον Πίνακα 10. Πίνακας 10. Aλληλουχίες των εκκινητών για το γονίδιο αναφοράς Abl, συγκέντρωση (C) και θερµοκρασία υβριδισµού (Tm). Πρόσθιος εκκινητής (forward primer) Ανάστροφος εκκινητής (reverse primer) C Tm Αλληλουχία (µm) ( ο C) 5 -TCCATCTCGCTGAGATACGAAG ,7 5 -CACCGTTGAATGATGATGAACC ,8 104

105 Μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράση (PCR) - Αρχή µεθόδου Η αλυσιδωτή αντίδραση µε πολυµεράση (PCR) επινοήθηκε το 1985 από τον Mullis και συν. 258 και έφερε πραγµατική επανάσταση στην µοριακή βιολογία µε εφαρµογές από την µοριακή έρευνα στην κλινική πράξη. Η µέθοδος αυτή επιτυγχάνει σε ελάχιστο χρόνο, που δεν υπερβαίνει τις 2-3 ώρες, την ενίσχυση µε εκθετικό τρόπο, συγκεκριµένων αλληλουχιών DNA, µέχρι 10 6 αντίγραφα, ώστε να είναι δυνατή η µελέτη τους και ο περαιτέρω χειρισµός τους. Η τεράστια απόδοση της αντίδρασης κάνει δυνατή την ενίσχυση αλληλουχιών, ακόµα και όταν αυτές βρίσκονται σε ελάχιστο αριθµό αντιγράφων ή το DNA έχει υποστεί µία σχετική αποδιάταξη. Για την εφαρµογή της µεθόδου είναι απαραίτητη η ύπαρξη µιας µικρής ποσότητας DΝΑ, η οποία θα λειτουργήσει ως αρχική µήτρα αντιγραφής για την ενίσχυση του τµήµατος του γονιδίου που πρόκειται να µελετηθεί. Σε αυτό το DΝΑ θα υβριδιστεί αρχικά ένα ζεύγος ειδικών ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών (primers), οι οποίοι είναι συµπληρωµατικοί µε τα άκρα του προς ενίσχυση τµή- µατος. Για κάθε έναν από τους δύο εκκινητές ισχύει η σχέση Tm = 2 X (A+T) + 4 X (G+C), όπου Tm είναι η θερµοκρασία στην οποία αποδιατάσσεται το 50% των δίκλωνων µορίων που σχηµατίζονται ανάµεσα στον εκκινητή και τη µητρική αλυσίδα. Οι τιµές της θερµοκρασίας αυτής καθορίζονται από τη σύσταση του κάθε εκκινητή σε αδενίνη (Α) και θυµίνη (Τ), µεταξύ των οποίων αναπτύσσονται δύο δεσµοί υδρογόνου, και από τη σύσταση σε γουανίνη (G) και κυτοσίνη (C), µεταξύ των οποίων αναπτύσσονται τρεις δεσµοί υδρογόνου. Από τον υπολογισµό της Tm για καθέναν από τους δύο εκκινητές προκύπτει και η τιµή της θερµοκρασίας υβριδισµού των εκκινητών (θερµοκρασία annealing), κατά τη διαδικασία της PCR. Το µείγµα της αντίδρασης PCR περιλαµβάνει τα παρακάτω αντιδραστήρια: Θερµοανθεκτική DΝΑ πολυµεράση, που έχει αποµονωθεί από το θερ- µόφιλο βακτήριο Τhermus aquaticus (Ταq polymerase). Η πολυµεράση αυτή έχει βέλτιστη θερµοκρασία δράσης τους 72 C, παραµένει ωστόσο σταθερή µέχρι και τους 94 C. 105

106 MgCl 2 σε κατάλληλη συγκέντρωση, διότι τα ιόντα µαγνησίου (Μg 2+ ) είναι απαραίτητα για την ενζυµική δράση της πολυµεράσης. Ελεύθερα 5' τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps) για κάθε αζωτούχο βάση (dατρ, dgτρ, dττρ και dcτρ). Τα dntps αποτελούν τα δοµικά συστατικά των νεοσχηµατιζόµενων µορίων DΝΑ και παρέχουν την ενέργεια για τον πολυµερισµό. Ειδικό ρυθµιστικό διάλυµα (PCR buffer), που ρυθµίζει το pη της αντίδρασης για τη βέλτιστη δράση της πολυµεράσης. Η σύνθεση αυτού του διαλύ- µατος είναι η εξής: 100mΜ Τris-ΗCl, 500mΜ ΚCl και 15mM MgCl 2 σε pη 8. Ο τελικός όγκος της αντίδρασης PCR είναι 50µl. Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης αποτελείται από επαναλαµβανό- µενους κύκλους τριών διακριτών σταδίων. 1. Θερµική αποδιάταξη στους 94 ο C, µε συνέπεια τον αποχωρισµό των συµπληρωµατικών αλυσίδων του DNA. Με τον τρόπο αυτό καθίσταται δυνατό στους εκκινητές να έρθουν και να παρεµβληθούν µέσα στο DNA κατά το επό- µενο στάδιο. 2. Υβριδισµός των εκκινητών στις συµπληρωµατικές αλυσίδες. Κάτι τέτοιο επιτυγχάνεται µε πτώση της θερµοκρασίας στην τιµή εκείνη που είναι κατάλληλη για τον υβριδισµό (θερµοκρασία annealing). 3. Πολυµερισµός, κατά τον οποίο γίνεται η σύνθεση των συµπληρωµατικών ακολουθιών µε τη δράση της Taq πολυµεράσης η οποία χρησιµοποιεί ως πρώτη ύλη και ως πηγή ενέργειας τα τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps). Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η εκθετική αύξηση του αριθµού των α- ντιγράφων του DNA σύµφωνα µε την εξίσωση N=n (1+e)c, όπου N η τελική ποσότητα του προϊόντος, n η αρχική ποσότητα του υποστρώµατος, e η απόδοση της αντίδρασης και c ο αριθµός των κύκλων της PCR αντίδρασης. Η αναγνώριση και ο έλεγχος των προϊόντων της PCR επιτυγχάνεται µε η- λεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης συγκέντρωσης 1,5%. Η πηκτή αγαρόζης δεσµεύει επιλεκτικά και µη αναστρέψιµα τα δίκλωνα µόρια των νουκλεϊκών οξέ ων. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή µεταφέρεται σε τράπεζα υπεριώδους ακτι νοβολίας (UV) για την αναγνώριση και φωτογράφηση των αποτελεσµάτων. 106

107 Εικόνα 17: Σχηµατική αναπαράσταση των σταδίων της PCR. Το αποτέλεσµα αξιολογείται ως θετικό όταν υπάρχει ακέραιο προϊόν του γονιδίου Abl µεγέθους 132 bp (Εικόνα 18). Συγκεκριµένα, όσον αφορά την ενίσχυση του γονιδίου Abl, το πρωτόκολλο που χρησιµοποιήθηκε και οι συνθήκες της PCR παρουσιάζονται στους Πίνακες 11 και 12. Πίνακας 11. Τα αντιδραστήρια της PCR για την ενίσχυση του γονιδίου αναφοράς Αbl. Αντιδραστήρια της PCR Ποσότητα cdna 2 µl 10X διάλυµα Taq DNA πολυµεράσης 5 µl MgCl 2 50mM 3 µl dntps mix 10mM 1 µl Πρόσθιος εκκινητής 50 µm 0,3 µl Ανάστροφος εκκινητής 50 µm 0,3 µl Taq DNA πολυµεράση (5U/µl) 0,4 µl Απεσταγµένο Η 2 Ο 38 µl 107

108 Πίνακας 12. Συνθήκες της αντίδρασης PCR για την ενίσχυση του γονιδίου αναφοράς Abl. Στάδιο Θερµοκρασία Χρόνος Κύκλοι Θερµική αποδιάταξη 95 ο C 5 λεπτά 1 Θερµική αποδιάταξη 95 ο C 1 λεπτό Υβριδισµός εκκινητων 60 ο C 30 δευτερόλεπτα 35 Επιµήκυνση 72 ο C 30 δευτερόλεπτα Τελική επιµήκυνση 72 ο C 10 λεπτά 1 ιατήρηση των δειγµάτων 4 ο C >10 λεπτά 1 Εικόνα 18: Έλεγχος των προϊόντων της PCR του γονιδίου Abl (132bp) µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Παράγοντες που επιδρούν στην PCR Οι κυριότεροι παράγοντες που συνεισφέρουν στην επίτευξη ικανοποιητικής αντίδρασης πολυµερισµού όσον αφορά την ευαισθησία, την εξειδίκευση αλλά και την απόδοση, περιγράφονται παρακάτω. 1. Επιλογή κατάλληλων εκκινητών: Η ειδικότητα της PCR αντίδρασης ως προς την αλληλουχία που πρόκειται να ενισχυθεί εξαρτάται από τους εκκινητές. Ο καλός σχεδιασµός για την επιλογή εκκινητών αποτελεί σηµαντικότατο παράγοντα για την επιτυχία της PCR. Στατιστικά, έχει βρεθεί ότι όταν µία αλληλουχία DNA έχει µήκος τουλάχιστον 108

109 20 bp, τότε είναι µοναδική στο γονιδίωµα και κατά συνέπεια, για να επιτευχθεί ειδική ενίσχυση αλληλουχιών πρέπει οι εκκινητές να είναι τουλάχιστον 20-µερή. Προτιµούνται εκκινητές που α) έχουν περιεκτικότητα σε γουανίνη και κυτοσίνη παρόµοια µε το τµήµα DNA που θα ενισχυθεί, β) δεν έχουν σηµαντική δευτεροταγή δοµή ούτε αλληλεπικάλυψη ειδικά στο 3 άκρο, γ) δεν έχουν εκτάσεις από πολυπουρίνες ή πολυπυριµιδίνες και δ) το ζεύγος των εκκινητών δεν εµφανίζει συµπληρωµατικότητα και δεν σχηµατίζει διµερή (primer dimmers) µε αποτέλεσµα την παραγωγή µη ειδικών προϊόντων. 2. Επιλογή θερµοκρασίας υβριδοποίησης εκκινητών (annealing temperature): Η θερµοκρασία υβριδισµού ποικίλλει ανάλογα µε το µήκος και τη σύσταση των εκκινητών σε βάσεις GC, και το είδος του υποστρώµατος DNA. Ως ιδανική θερµοκρασία υβριδισµού Tm θεωρείται αυτή που το 50% των µορίων είναι α- ποδιατεταγµένο. Υψηλές θερµοκρασίες επιτυγχάνουν περισσότερο εξειδικευµένο υβριδισµό, χαµηλής όµως απόδοσης. Η επιλογή χαµηλότερης θερµοκρασίας αυξάνει την απόδοση σε βάρος της ειδικότητας, µε αποτέλεσµα τον κίνδυνο δη- µιουργίας παραπροϊόντων της PCR. 3. Επιλογή συγκέντρωσης δεσoξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) και ιόντων Mg: Τα ιόντα Mg 2+ είναι µεταλλικός συµπαράγοντας της Taq πολυµεράσης και η µεν περίσσεια τους µπορεί να οδηγήσει σε αύξηση του µη ειδικού προϊόντος λόγω αύξησης της ενεργότητας της πολυµεράσης, η δε έλλειψή της οδηγεί σε µειωµένη απόδοση προϊόντος. Με δεδοµένο ζεύγος εκκινητών, συνήθως η κανονικοποίηση των συνθηκών σε µία αντίδραση PCR περιλαµβάνει πειράµατα όπου σταδιακά µεταβάλλονται ανεξάρτητα µεταξύ τους η θερµοκρασία αναδιάταξης και η συγκέντρωση ιόντων Mg. 4. Αριθµός κύκλων: Συνήθως ο βέλτιστος αριθµός κύκλων είναι και προσδιορίζεται πειραµατικά µε βάση την καλύτερη δυνατή απόδοση προϊόντος µε το λιγότερο µη ειδικό προϊόν. Μετά από έναν αριθµό κύκλων η αντίδραση φτάνει σε µια στατική φάση (plateau) κατά την οποία νέα αύξηση του αριθµού των κύκλων δεν ο- δηγεί σε αύξηση της απόδοσης. 109

110 5. Παρουσία ενισχυτών και αναστολέων: Αναστολείς µπορεί να υπάρχουν είτε στα βιολογικά δείγµατα είτε στα χηµικά αντιδραστήρια. Παράδειγµα αναστολέων είναι ιοντικά επιφανειοδραστικά όπως το SDS. Ουσίες-ενισχυτές της αντίδρασης αποτελούν το φορµαµίδιο (5%), πολυαιθανογλυκόλη (PEG) (5-15%) κ.α Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (Real Time RT-PCR) για τη µελέτη της έκφρασης του γονιδίου VEGF Χρήσιµοι όροι: α) threshold: Το επίπεδο φθορισµού στο οποίο λαµβάνονται οι τιµές που χρησιµοποιούνται στους υπολογισµούς. Σε αυτό το επίπεδο γίνεται η ανάλυση των δεδοµένων. Το threshold καθορίζεται αυτόµατα ή από τον ερευνητή, στο επίπεδο όπου ο ρυθµός παραγωγής προϊόντος είναι ο υψηλότερος κατά την εκθετική φάση. β) threshold cycle (Ct value): Ο αριθµός κύκλων στους οποίους το δείγµα φτάνει το επίπεδο φθορισµού που γίνονται οι υπολογισµοί. γ) slope: Είναι η κλίση της καµπύλης αναφοράς, συµβολίζεται µε «slope» στο λογισµικό ανάλυσης της συσκευής Opticon 2 Real-Time PCR System (MJ Research) που πραγµατοποιείται η Real Time RT-PCR και έχει βέλτιστο εύρος τιµών -3<slope<-3.6. δ) efficiency (E): Η απόδοση της αντίδρασης αποτελεί σηµαντικό δείκτη αξιοπιστίας και επαναληψιµότητας των αποτελεσµάτων. Επίσης, πρέπει να λαµβάνεται υπόψη και όταν γίνεται σύγκριση αποτελεσµάτων διαφορετικών αντιδράσεων. Στην περίπτωση αυτή, επιδιώκεται η επίτευξη παρεµφερών αποδόσεων, ώστε να µειώνονται κατά το δυνατό οι αποκλίσεις µεταξύ των αντιδράσεων. Η απόδοση της αντίδρασης υπολογίζεται από τον τύπο E=10 (-1/slope). ε) Fluorescence acquisition: Είναι η µέτρηση του φθορισµού των προϊόντων. Για να µειωθεί ο «θόρυβος» από την πιθανή παραγωγή µη ειδικών τµηµάτων ή το σχηµατισµό διµερών από τα µόρια των εκκινητών, τίθεται µια θερµοκρασία στην οποία η συσκευή µετράει το φθορισµό που εκπέµπουν τα προϊόντα. 110

111 Η θερµοκρασία αυτή πρέπει να είναι υψηλότερη από το σηµείο τήξης (Tm) των ανεπιθύµητων προϊόντων και χαµηλότερη από το Tm της αλληλουχίας στόχου Αρχή της µεθόδου Τυπικά η αντίδραση PCR µπορεί να χωριστεί σε τρεις χαρακτηριστικές φάσεις: η 1 η φάση είναι κρυµµένη κάτω από το «θόρυβο» του φθορισµού, η 2 η περιλαµβάνει την εκθετική ενίσχυση και απότοµη αύξηση του φθορισµού, ενώ η 3 η φάση χαρακτηρίζεται από την εξασθένηση του ρυθµού της εκθετικής συσσώρευσης προϊόντος (φάση plateau) 259. Η ποσότητα του παραγόµενου προϊόντος είναι ευθέως ανάλογη µε την αρχική ποσότητα του στόχου στην αντίδραση µόνο κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης ενίσχυσης 250. Συνεπώς, η φάση όπου βασίζεται η εφαρµογή της Real Time RT-PCR είναι η 2 η φάση, δηλαδή η εκθετική (Eικόνα 19). Εικόνα 19: Σχηµατική αναπαράσταση των τριών χαρακτηριστικών φάσεων της Real Time RT-PCR. Το προϊόν ανιχνεύεται για πρώτη φορά στη φάση της εκθετικής αύξησης και ο αριθµός των κύκλων (τιµή του C t ) που αντιστοιχεί στη φάση αυτή, αντιπροσωπεύει την αρχική του ποσότητα. Εποµένως, όσο µεγαλύτερη είναι η ποσότητα του mrna στο αρχικό δείγµα, τόσο νωρίτερα λαµβάνεται σήµα φθορισµού και άρα, τόσο µικρότερη είναι η τιµή του C t. 111

112 Χηµική βάση της µεθόδου ανίχνευσης των προϊόντων της Real Time RT-PCR (χηµεία SYBR Green I) Στην παρούσα µελέτη χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος των φθορίζουσων χρωστικών διότι έχει πολλά πλεονεκτήµατα έναντι των υπολοίπων και γι αυτό χρησιµοποιείται συχνότερα ερευνητικά. Είναι εύχρηστη, αφού µπορεί να προστεθεί απλά στο υπόλοιπο µίγµα της αντίδρασης, και φθηνή επειδή δε χρειάζεται να σχεδιαστούν καινούριοι, ειδικοί εκκινητές 253. Για την ανίχνευση του δίκλωνου DNA που παράγεται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR, χρησιµοποιήθηκε η χρωστική SYBR Green Ι. H SYBR Green Ι δεσµεύεται µη ειδικά πάνω στο δίκλωνο DNA, µε αποτέλεσµα να εκπέµπει ακτινοβολία, ενώ αντίθετα η µη δεσµευµένη χρωστική δεν εκπέµπει. Κατά τη διάρκεια λοιπόν της επέκτασης του DNA, όλο και περισσότερη χρωστική προσδένεται µε αποτέλεσµα την αύξηση της εκπεµπόµενης ακτινοβολίας. Επίσης, επιτρέπεται η ανάλυση µε τήξη των προϊόντων µετά το τέλος της αντίδρασης, δηλαδή ανάλυση µε χρήση της καµπύλης τήξης (melt curve analysis). Κατά τη διάρκεια της καµπύλης τήξης µετράται ο φθορισµός που εκπέµπεται, καθώς τα προϊόντα της αντίδρασης θερµαίνονται από θερµοκρασία χαµηλότερη του σηµείου τήξης τους (Tm) µέχρι θερµοκρασία µεγαλύτερη του Tm τους και αποδιατάσσονται. Το θερµοκρασιακό εύρος το θέτει ο ερευνητής, ανάλογα µε το σηµείο τήξης των προϊόντων που προκύπτουν, και εξαρτάται από το µήκος και το περιεχόµενό των προϊόντων σε G/C. Οι κορυφές (peaks) που εµφανίζονται στην καµπύλη τήξης αντιστοιχούν στα προϊόντα που έχουν ενισχυθεί µε την αντίδραση και είναι ανάλογες των ζωνών στην απλή ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης. Συνεπώς, η ανάλυση στο τέλος του πειράµατος είναι σηµαντική γιατί επιτρέπει τον ποιοτικό έλεγχο των προϊόντων 253. Η µέθοδος µειονεκτεί ακριβώς επειδή δεν είναι ειδική και γι αυτό µπορεί να προκύψουν µη ειδικά προϊόντα ή/και διµερή των εκκινητών, καθώς και στο ότι µπορεί να ενισχύσει σχετικά µικρό τµήµα αλληλουχίας ( bp). Με τη χρήση όµως της καµπύλης τήξης, µπορεί σε µεγάλο βαθµό να γίνει διαφοροποίηση των προϊόντων στόχων από οτιδήποτε µη ειδικό, ελέγχοντας τις κορυφές, δηλαδή τα Tm που αντιστοιχούν σε κάθε προϊόν, το ύψος τους και τα C t τους

113 Βελτιστοποίηση συνθηκών της Real Time RT-PCR Στην παρούσα µελέτη η Real Time RT-PCR πραγµατοποιήθηκε στη συσκευή Opticon 2 Real-Time PCR System (MJ Research). Η συσκευή αυτή περιέχει έναν θερµικό κυκλοποιητή 96 θέσεων. Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR, φως από λάµπα αλογόνου πέφτει πάνω στην πλάκα των δειγµάτων, το φως διαπερνά τα δείγµατα και διεγείρει την προσδεµένη χρωστική (SYBR Green Ι), µε αποτέλεσµα την εκποµπή ακτινοβολίας στην περιοχή των nm. Η ακτινοβολία αυτή µεταφέρεται µε ένα σύστηµα φακών και φίλτρων στην ειδική κάµερα, όπου και καταγράφεται. Το λογισµικό του Opticon 2 Real-Time PCR System συγκεντρώνει τα σήµατα από την ακτινοβολία και τα µετατρέπει µε αλγόριθµους, παρέχοντάς µας τα τελικά ποσοτικά αποτελέσµατα. Το λογισµικό αυτό αποκωδικοποιεί τις µετρήσεις που γίνονται στον αναλυτή Opticon 2 Real- Time PCR και τις µετατρέπει σε αναγνώσιµη µορφή, δίνοντας για κάθε δείγµα την κλασσική εικόνα της καµπύλης ενίσχυσης µε ΡCR. Παράλληλα µε τις κα- µπύλες, δίνονται και αριθµητικά στοιχεία για κάθε δείγµα, βάσει των οποίων γίνονται και οι περαιτέρω υπολογισµοί για τη συγκέντρωση των δειγµάτων. Για ένα επιτυχηµένο πείραµα Real Time RT-PCR είναι απαραίτητη αρχικά η βελτιστοποίηση των συνθηκών οι οποίες διαφέρουν για κάθε αλληλουχίαστόχο, και εξαρτώνται από τη συγκέντρωση της χρωστικής, των εκκινητών και του MgCl 2, τις θερµοκρασίες και τους χρόνους. Η συγκέντρωση της χρωστικής είναι σηµαντική, γιατί τα µόριά της ουσιαστικά επεµβαίνουν στην αντίδραση, αφού δεσµεύονται στο DNA. Έτσι, πολύ υψηλή συγκέντρωση SYBR Green Ι µπορεί να προκαλέσει αναστολή της αντίδρασης, ενώ η πολύ χαµηλή συγκέντρωση µπορεί να µην επαρκεί για τη σήµανση των προϊόντων. Για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης των εκκινητών χρησιµοποιούνται επίσης, διαδοχικές αραιώσεις και των δυο εκκινητών. Οι αποδεκτές συγκεντρώσεις των εκκινητών έχουν εύρος 200 έως 800 nm. Θα πρέπει να λαµβάνεται υ- πόψη και η καµπύλη τήξης των προϊόντων και για τα δυο µόρια του ζεύγους των εκκινητών, στην οποία θα πρέπει να υπάρχει µόνο µια κορυφή 253. Ακριβώς επειδή η σήµανση µε τη χρωστική SYBR Green I είναι µη ειδική, υπάρχει κίνδυνος να προκύψουν µη ειδικά προϊόντα κατά την αντίδραση. Για 113

114 την αποφυγή αυτής της πιθανότητας θα πρέπει να καθορισθεί η συγκέντρωση του MgCl 2, ώστε τελικά να ενισχύεται µόνο η επιθυµητή αλληλουχία. Το MgCl 2 επιδρά στην ενεργότητα της DNA πολυµεράσης και κατ επέκταση και στην ειδικότητά της. Τα dntps και το δείγµα δεσµεύουν το µαγνήσιο µε αποτέλεσµα να µειώνεται η ποσότητα του ελεύθερου µαγνησίου που απαιτείται για να δράσει το ένζυµο. Έτσι, υψηλή συγκέντρωση MgCl 2, που σηµαίνει και υψηλή συγκέντρωση µη δεσµευµένου µαγνησίου, οδηγεί σε υψηλότερη ποσότητα προϊόντος, αλλά και µεγαλύτερο κίνδυνο να ενισχυθούν και µη ειδικά προϊόντα. Αποδεκτό εύρος συγκέντρωσης του MgCl 2 είναι από 3 έως 5 mm 253. Οι χρόνοι και οι θερµοκρασίες αναφέρονται στις συνθήκες ενίσχυσης και βέβαια είναι ειδικοί για κάθε αλληλουχία, αφού εξαρτώνται από το µήκος της, την περιεκτικότητα σε G/C και το είδος της. Στην περίπτωση αυτή δεν υπάρχει κάποιο βέλτιστο εύρος θερµοκρασίας, αφού η κάθε αλληλουχία έχει διαφορετικό σηµείο τήξης (Tm) ανάλογα µε την G/C περιεκτικότητα, και χρειάζεται διαφορετικό χρόνο αποδιάταξης. Γενικά όµως συνιστάται η αποδιάταξη να γίνεται στους 95 ο C και η επιµήκυνση στους 72 ο C 253. Για τη Real Time RT-PCR των γονιδίων VEGF και Abl χρησιµοποιήθηκαν τα ζεύγη των εκκινητών που φαίνονται στον Πίνακα 13. Οι εκκινητές ήταν της εταιρίας Operon Technologies, και η αρχική τους συγκέντρωση ήταν 100µM. Το γονίδιο Abl χρησιµοποιήθηκε ως εσωτερικός µάρτυρας (γονίδιο αναφοράς), ε- φόσον θεωρείται το καταλληλότερο γονίδιο µάρτυρας στην µελέτη των λευχαι- µιών γιατί η έκφραση του δεν διαφέρει στα φυσιολογικά και στα λευχαιµικά κύτταρα 257. Η περιοχή ενίσχυσης για το γονίδιο VEGF ήταν 122 bp και για το γονίδιο Abl 132 bp. Η απόδοση των αντιδράσεων βελτιστοποιήθηκε έπειτα από ποσοτικοποίηση διαφορετικών συγκεντρώσεων για το MgCl 2 και για κάθε ζεύγος εκκινητών. Το MgCl 2 δοκιµάστηκε σε συγκέντρωση 3mM, 3,5mM, 4mM, 4,5mM και 5mM, ενώ οι εκκινητές δοκιµάστηκαν σε συγκέντρωση 200nM, 400 nm, 600 nm και 800 nm. Τελικά, επιλέχθηκε η συγκέντρωση 4mM για το MgCl 2, η συγκέντρωση 400 nm για τον κάθε εκκινητή του γονιδίου VEGF και η συγκέντρωση 200 nm για τον κάθε εκκινητή του γονιδίου Abl. Το πρωτόκολλο που χρησιµοποιήθηκε και οι συνθήκες της Real Time RT-PCR παρουσιάζονται στους Πίνακες 14 και

115 Πίνακας 13. Αλληλουχίες εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν για τα γονίδια VEGF και Abl στην Real Time RT-PCR και η θερµοκρασία υβριδισµού (Tm). Αλληλουχία Tm ( ο C) Εκκινητές Πρόσθιος 5 CTGTCTTGGGTGCATTGGAG 3 62,4 VEGF Ανάστροφος 5 TCCATGAACTTCACCACTTCG 3 60,6 Εκκινητές Πρόσθιος 5 TCCATCTCGCTGAGATACGAAG 3 62,7 Abl Ανάστροφος 5 CACCGTTGAATGATGATGAACC 3 60,8 Πίνακας 14. Tα αντιδραστήρια της Real Time RT-PCR για τα γονίδια VEGF και Abl. Αντιδραστήρια VEGF ABL cdna 2 µl (50ng) 2 µl (50ng) Platinum SYBR Green qpcr SuperMix-UDG πολυµεράση 12,5 µl 12,5 µl MgCl 2 50mM 0,5 µl 0,5 µl Πρόσθιος εκκινητής 10 µm 1 µl 0,5 µl Ανάστροφος εκκινητής 10 µm 1 µl 0,5 µl Απεσταγµένο Η 2 Ο ελεύθερο από Dnασες 8 µl 9 µl Τελικός όγκος αντιδράσεων 25 µl 25 µl Πίνακας 15. Συνθήκες της αντίδρασης Real Time RT-PCR για την ενίσχυση των γονιδίων VEGF και Abl. Στάδιο Θερµοκρασία Χρόνος Κύκλοι Προθέρµανση 50 ο C 2 λεπτά 1 Θερµική αποδιάταξη 95 ο C 5 λεπτά 1 Θερµική αποδιάταξη 95 ο C 1 λεπτό Υβριδισµός εκκινητων 60 ο C 30 δευτερόλεπτα Επιµήκυνση 72 ο C 30 δευτερόλεπτα Τελική επιµήκυνση 72 ο C 5 λεπτά 1 ιατήρηση των δειγµάτων 15 ο C 20 λεπτά

116 Τα προϊόντα PCR που προέκυψαν επαληθεύτηκε ότι ήταν τα επιθυµητά µε την ανάλυση της καµπύλης τήξης. Το πρόγραµµα για την καµπύλη τήξης, κοινό και για τα δυο γονίδια, είχε ένα πρώτο βήµα ανύψωσης της θερµοκρασίας στους 82 0 C και στη συνέχεια µείωση της θερµοκρασίας µέχρι τους 50 0 C πέφτοντας κατά 0,2 0 C/step, µε 2 s hold/step. Κάθε αντίδραση περιελάµβανε και ένα δείγµα αναφοράς χωρίς DNA (no template control). Η µέτρηση του φθορισµού (fluorescence acquisition) πραγµατοποιήθηκε στους 74 ο C. Τα αποτελέσµατα αναλύθηκαν χρησιµοποιώντας το λογισµικό πρόγραµµα της συσκευής Opticon 2 Real- Time PCR System Software. Μετά από ανάλυση της καµπύλης τήξης καθορίστηκαν οι Τm των δύο γονιδίων (Tm VEGF = 85, o C και Tm Abl = o C) (Eικόνα 20). Εικόνα 20: Καµπύλες τήξης για τον υπολογισµό των Τm των γονιδίων VEGF και Abl Σχετική ποσοτικοποίηση µε Real-Time PCR (Relative Quantitative Real-Time PCR, RQ RT-PCR) Με την τεχνική της Real Time RT-PCR υπάρχει η δυνατότητα όχι µόνο της παρακολούθησης της αντίδρασης σε πραγµατικό χρόνο, αλλά και του προσδιορισµού της ποσότητας των παραγόµενων προϊόντων µε απόλυτο ή σχετικό υπολογισµό. Η απόλυτη ποσοτικοποίηση προσδιορίζει τον αριθµό αντιγράφων 116

117 του αρχικού δείγµατος µε χρήση καµπύλης ποσοτικοποίησης, ενώ η σχετική ποσοτικοποίηση προσδιορίζει το ρυθµό έκφρασης σε σχέση µε την παραγωγή mrna του κυττάρου. Στην παρούσα διατριβή χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της σχετικής ποσοτικοποίησης για την εξαγωγή των αποτελεσµάτων. Με τη σχετική ποσοτικοποίηση προσδιορίζονται οι αλλαγές των επιπέδων του mrna ενός γονιδίου σε σχέση µε το επίπεδο έκφρασης ενός εσωτερικού γονιδίου αναφοράς. Συνεπώς δεν χρειάζεται η κατασκευή καµπύλης ποσοτικοποίησης µε δείγµατα αναφοράς γνωστών συγκεντρώσεων, αφού όλα τα δείγµατα εκφράζονται σαν λόγος ως προς το γονίδιο αναφοράς και εν συνεχεία συγκρίνονται οι λόγοι. Το γονίδιο αναφοράς συνήθως είναι ένα διατηρηµένο (housekeeping) γονίδιο. Τα housekeeping γονίδια είναι παρόντα σε όλα τα γονιδιώµατα, αφού είναι υπεύθυνα για ζωτικές λειτουργίες του κυττάρου. Η σύνθεση mrna αυτών των γονιδίων θεωρείται ότι παραµένει σταθερή ανεξάρτητα από τις συνθήκες στις οποίες εκτίθεται το κύτταρο, γι αυτό και χρησιµοποιούνται για τη µελέτη της έκφρασης γονιδίων κάτω από διάφορες συνθήκες. Κυρίως χρησιµοποιούνται το γονίδιο της β-ακτίνης, τα γονίδια των ριβοσωµικών υποµονάδων (18S και 28S rrna για ευκαρυωτικά κύτταρα ή 16S και 23S rrna για προκαρυωτικά κύτταρα), το GAPDH, το γονίδιο της β-2 µικροσφαιρίνης, της φωσφογλυκεροκινάσης, της β-γλυκουρονιδάσης, της ριβοσυλοτρανσφεράσης της υποξανθίνης, και άλλα 253. Στην εργασία αυτή, ως γονίδιο αναφοράς χρησιµοποιήθηκε το γονίδιο Abl. Το γονίδιο Abl επιλέχθηκε καθώς θεωρείται το καταλληλότερο στην µελέτη των λευχαιµιών, εφόσον η έκφραση του δεν διαφέρει στα φυσιολογικά και στα λευχαιµικά κύτταρα 257. Το µέγεθος του γονιδίου αναφοράς (132 bp) επιλέχθηκε ώ- στε να βρίσκεται στα βέλτιστα όρια της αντίδρασης µε SYBR Green I ( bp). Στο επόµενο βήµα απαιτείται η κατασκευή πρότυπης καµπύλης, όχι όµως γνωστών συγκεντρώσεων όπως στην απόλυτη ποσοτικοποίηση, τόσο για το γονίδιο στόχο όσο και το γονίδιο αναφοράς. Στην περίπτωση αυτή, η καµπύλη προκύπτει από διαδοχικές αραιώσεις ενός δείγµατος αναφοράς. Ως δείγµα αναφοράς χρησιµοποιήθηκε µίγµα των cdna όλων των φυσιολογικών δειγµάτων. 117

118 Για την πρότυπη καµπύλη το αρχικό cdna (100ng) αραιώθηκε κατά 1:10 (10ng), 1:100 (1ng) και 1:1000 (0,1ng) (Εικόνα 21). Τα αποτελέσµατα αναλύθηκαν και οι λόγοι έκφρασης υπολογίστηκαν µε χρήση του µαθηµατικού µοντέλου του Pfaffl 250, 255, 256. Εικόνα 21: ιαδοχικές αραιώσεις του αρχικού cdna ενός δείγµατος αναφοράς για το γονίδιο Abl και ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR σε πηκτή αγαρόζης Μαθηµατικό µοντέλο ανάλυσης αποτελεσµάτων στη σχετική ποσοτικοποίηση µε Real Time RT-PCR Η σχετική ποσοτικοποίηση βασίζεται στο λόγο των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου-στόχο ως προς το γονίδιο αναφοράς. Για το υπολογισµό αυτού του λόγου έχουν εφαρµοσθεί δυο µαθηµατικά µοντέλα: α) η µέθοδος του 2 - Ct και β) το µαθηµατικό µοντέλο του Pfaffl 250. Η µέθοδος του 2 - Ct, που έχει και την πιο ευρεία χρήση, είναι κατάλληλη για αντιδράσεις µε παρεµφερή τιµή απόδοσης (efficiency, E), καθώς δεν περιλαµβάνει εξοµάλυνση των αποδόσεων. Οι λόγοι έκφρασης υπολογίζονται από την εξίσωση: R = 2 ( Ct δείγµα Ct µάρτυρας) 254. Το µαθηµατικό µοντέλο του Pfaffl, το οποίο χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή, προβλέπει εξοµάλυνση των αποδόσεων των διαφορετικών αντιδράσεων και γι αυτό θεωρείται πιο ακριβής τρόπος προσέγγισης. Οι λόγοι έκφρασης υπολογίζονται από την εξίσωση: R = E στόχος / Ct στόχος (µάρτυρας-δείγµα) Ct αναφ. (µάρτυρας-δείγµα) 255, E 256 αναφ.. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι για τον υπολογισµό της τιµής της απόδοσης (efficiency, E), όπως µε βάση την κλίση (slope) της καµπύλης αναφοράς, την αύ- 118

119 ξηση του φθορισµού στη γραµµική φάση, την αύξηση του φθορισµού στην εκθετική φάση ή τη συνολική µεταβολή του σήµατος φθορισµού. Για τον υπολογισµό της τιµής του Ε στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκε η κλίση (slope) της πρότυπης καµπύλης και η εξίσωση E =10-1/slope. Οι κλίσεις ήταν -3,302 για το γονίδιο Abl και για το γονίδιο VEGF (Εικόνα 22). Οι τιµές που προκύπτουν από την εξίσωση είναι Ε Abl =2,1 και Ε vegf =2,008. Αυτός ο τρόπος υπολογισµού του Ε, σε µερικές περιπτώσεις µπορεί να δώσει αποτέλεσµα υψηλότερο (Ε>2), που πρακτικά είναι αδύνατο. Υπάρχουν, όµως, προηγούµενες έρευνες 255, που έχουν δώσει τέτοια αποτελέσµατα µε υψηλή επαναληψιµότητα και σταθερότητα. Αυτό προφανώς οφείλεται στο ότι η συγκεκριµένη µέθοδος υπολογισµού του Ε υπερεκτιµά την πραγµατική τιµή του 250. Τέλος, ο συντελεστής συσχέτισης (r 2 ) της συγκέντρωσης RNA και της τιµής του C t ήταν -0,965, τόσο για τον VEGF όσο και για το Abl, υποδεικνύοντας ότι η έκφραση του RNA αντιπροσωπεύεται από την τιµή του C t (Εικόνα 23). Αυτή τη στιγµή υπάρχουν προγράµµατα λογισµικού, όπως το REST και το REST-XL, που δίνουν τη δυνατότητα στον ερευνητή να κάνει ευκολότερα και γρηγορότερα τους ανωτέρω υπολογισµούς, απλά εισάγοντας τα δεδοµένα των αντιδράσεων στο αντίστοιχο πρόγραµµα του ηλεκτρονικού υπολογιστή. Στην παρούσα διατριβή χρησιµοποιήθηκε το λογισµικό REST-XL Version 2. Εικόνα 22: ιαδοχικές αραιώσεις του αρχικού cdna ενός δείγµατος αναφοράς για το γονίδιο VEGF. 119

120 Εικόνα 23: Η κλίση (slope) της καµπύλης αναφοράς και ο συντελεστής συσχέτισης (r 2 ) για το γονίδιο VEGF. 3.2 Πρωτεϊνική ανάλυση Ανοσοενζυµική µέθοδος ELISA Η ποσοτική µέτρηση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης του VEGF στον ορό των ασθενών έγινε µε την ανοσοενζυµική µέθοδο ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). Το kit που χρησιµοποιήθηκε ήταν το Quantikine Human VEGF Immunoassay kit (DVE00), της εταιρείας R&D Systems, Inc. Τα δείγµατα και οι πρότυπες αραιώσεις (standards) ετοιµάστηκαν σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Παράλληλα µε τη µέτρηση των επιπέδων της πρωτεΐνης στον ορό ασθενών, µετρήθηκαν και τα επίπεδα σε υγιείς µάρτυρες. Η µέθοδος της ELISA βασίζεται στην αρχική ένωση του VEGF µε ένα προσδεµένο µονοκλωνικό αντίσωµα και στην επακόλουθη ένωσή του µε ένα πολυκλωνικό αντίσωµα, το οποίο στο άλλο του άκρο έχει δεσµευµένο ένα ένζυµο. Στο σύµπλοκο αυτό προστίθεται το υπόστρωµα του ενζύµου και διεξάγεται η ενζυµική αντίδραση, κατά την οποία εµφανίζεται χρώµα. Η ενζυµική αντίδραση διακόπτεται και µετρείται η ένταση του χρώµατος, που είναι ανάλογη της ποσότητας του VEGF που έχει δεσµευτεί στο αντίσωµα. Η µέτρηση της οπτικής απορρόφησης έγινε σε ειδικό φωτόµετρο (ELX808, Bio-tek instruments, Inc) στα 450nm και 120

121 οι συγκεντρώσεις της πρωτεΐνης υπολογίστηκαν, µε τη βοήθεια της πρότυπης καµπύλης των standards που δηµιουργήθηκε για κάθε µέτρηση. Πειραµατικά, σειρές µικροφρεατίων ELISA επικαλυµµένες µε αντίσωµα αντί-vegf, πληρώνονται µε 100 µl/µικροφρεάτιο διαλύµατος RD1W. Στη συνέχεια προστίθενται 100 µl/µικροφρεάτιο προτύπων διαλυµάτων (συγκεντρώσεων από 0 ως 2000 pg/ml) και δειγµάτων των προς εξέταση ασθενών. Οι σειρές των µικροφρεατίων επωάζονται 2 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου (20-22οC). Ακολουθεί απόχυση του διαλύµατος, έκπλυση 3 φορές µε το παρεχόµενο διάλυµα έκπλυσης (400µl). Στη συνέχεια, προστίθενται 200 µl/µικροφρεάτιο διαλύµατος συζεύγµατος. Τα µικροφρεάτια επωάζονται 2 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου (20-22οC). Έπειτα, αποχύνεται το διάλυµα, τα µικροφρεάτια εκπλένονται 3 φορές µε διάλυµα έκπλυσης (400µl) και προστίθενται 200 µl/µικροφρεάτιο διαλύµατος χρωµογόνου ενζυµικού υποστρώµατος. Η ανάπτυξη του χρώµατος γίνεται για 25 λεπτά στο σκοτάδι και η αντίδραση τερµατίζεται µε την προσθήκη 50 µl/µικροφρεάτιο διαλύµατος τερµατισµού. Η απορρόφηση υπολογίζεται στα 450nm. 3.3 Προσδιορισµός της µικροαγγειακής πυκνότητας Ο προσδιορισµός της µικροαγγειακής πυκνότητας σε τοµές οστεοµυελικής βιοψίας έγινε µετά από ανοσοϊστοχηµεική χρώση µε αντί-cd34 µονοκλωνικό αντίσωµα (Novocastra laboratories). Ο προσδιορισµός της µικροαγγειακής πυκνότητας πραγµατοποιήθηκε σε 22 από τους ασθενείς µε οξεία µυελογενή λευχαιµία κατόπιν συναίνεσής τους. Τα αποτελέσµατα συγκρίθηκαν µε αυτά που βρέθηκαν από τη µικροαγγειακή πυκνότητα των οστεοµυελικών βιοψιών 10 α- τόµων που υποβλήθηκαν σε βιοψία στα πλαίσια διερεύνησης αναιµίας ή λεµφαδενοπάθειας και στους οποίους δεν ευρέθη νεοπλασία ή αιµατολογική κακοήθεια. Τα πλακίδια µικροσκοπήθηκαν σε µεγέθυνση 100Χ, 200Χ και 400Χ από ένα βιολόγο και ένα παθολογοανατόµο. Η µικροαγγειακή πυκνότητα που κατα- µετρήθηκε σε όλα τα πεδία αναφέρεται ως συνολική και αποτελεί το µέσο όρο των αγγείων που µετρήθηκαν. 121

122 3.4 Στατιστική ανάλυση Τα δεδοµένα της µελέτης αναλύθηκαν µε το στατιστικό πακέτο SPSS11.5 (SPSS Inc). Για κάθε ανάλυση, αρχικά έγινε ο έλεγχος της κανονικότητας των κατανοµών και στη συνέχεια ακολούθησε ο έλεγχος των στατιστικών υποθέσεων (µελέτη ύπαρξης στατιστικής σηµαντικότητας µεταξύ των µετρήσεων). Για τον έλεγχο της κανονικότητας των κατανοµών εφαρµόστηκε η δοκιµασία Shapiro-Wilk (αριθµός δειγµάτων µικρότερος του 50) προκειµένου να διαπιστώσουµε αν οι µεταβλητές που µελετήθηκαν προσαρµόζονται ικανοποιητικά στην κανονική κατανοµή (κατανοµή Gauss). Για τις µεταβλητές που ακολουθούσαν κανονική κατανοµή χρησιµοποιήθηκε η παραµετρική στατιστική δοκιµασία student s t (student s t-test), στις περιπτώσεις ελέγχου δυο ανεξάρτητων µεταβλητών και η παραµετρική στατιστική δοκιµασία Anova στις περιπτώσεις ελέγχου περισσότερων από δυο ανεξάρτητων µεταβλητών. Στην περίπτωση που οι µεταβλητές δεν ακολουθούσαν κανονική κατανοµή χρησιµοποιήθηκε η µη παραµετρική δοκιµασία Mann-Whitney (Mann-Whitney test). Τα δεδοµένα εκφράστηκαν ως µέση τιµή ± σταθερή απόκλιση (SD). Για τον έλεγχο της συσχέτισης µεταξύ ποσοτικών µεταβλητών χρησιµοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης (Pearson correlation coefficient, r). Ο συντελεστής συσχέτισης r κυµαίνεται µεταξύ -1 (αρνητική σχέση) και 1 (θετική σχέση). Σε όλες τις περιπτώσεις στατιστικά σηµαντικές θεωρήθηκαν οι συγκρίσεις που είχαν τιµή στατιστικής σηµαντικότητας µικρότερη από 0,05 (p<0,05). Τα δεδοµένα από την εφαρµογή της Real-Time RT-PCR (τιµές C t ) µεταφέρθηκαν για ανάλυση στο λογισµικό REST (Relative Expression Software Tool) 256. Το λογισµικό REST βασίζεται στο µοντέλο της σχετικής ποσοτικοποίησης του Pfaffl και δίνει τον ρυθµό µεταβολής της έκφρασης ενός γονιδίου, σε ένα δείγµα σε σχέση µε τον αντίστοιχο µάρτυρα. 122

123 ΙΙ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Χαρακτηριστικά ασθενών Στην παρούσα µελέτη όπως αναφέρθηκε ελέγχθηκαν 40 ασθενείς µε ΟΜΛ (24 άντρες και 16 γυναίκες) κατά τη διάγνωση της νόσου πριν τη χηµειοθεραπεία και 18 ασθενείς που πέτυχαν αιµατολογική ύφεση (10 άντρες και 8 γυναίκες) µετά τη θεραπευτική αγωγή. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν 22 υγιή άτο- µα. Από τους 40 ασθενείς, 12 δεν απάντησαν στη θεραπεία ενώ 10 απεβίωσαν. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών φαίνονται στον Πίνακα 16. Πίνακας 16. Χαρακτηριστικά των ασθενών που µελετήθηκαν κατά τη διάγνωση και στην ύφεση. ιάγνωση Ύφεση Ασθενείς Φύλο Άντρες 24 60% 10 55,5% Γυναίκες 16 40% 8 44,5% Τύπος ΟΜΛ Πρωτοπαθής 25 62,5% 14 77,8% ευτεροπαθής 15 37,5% 4 22,2% FAB ταξινόµηση Μ0 2 5% 0 0% Μ1 6 15% 2 11,1% Μ % 6 33,3% Μ3 5 12,5% 3 16,7% Μ % 4 22,2% Μ5 3 7,5% 2 11,1% Μ6 2 5% 1 5,6% Μ7 0 0% 0 0% 123

124 Από τους 40 ασθενείς µε ΟΜΛ που µελετήθηκαν, ο κυτταρογενετικός έλεγχος ήταν εφικτός στους 18 (10 άντρες/8 γυναίκες, 14 de novo/4 δευτεροπαθείς). Στους υπόλοιπους ασθενείς η χαµηλή ποιότητα και ο µικρός αριθµός κατάλληλων µεταφάσεων δεν επέτρεψαν την ανάλυση του καρυότυπου. Από τους 18 ασθενείς στους οποίους έγινε κυτταρογενετικός έλεγχος, στους 9 βρέθηκε φυσιολογικός και στους υπόλοιπους 9 παθολογικός. Από τους ασθενείς µε παθολογικό καρυότυπο, στους 3 ήταν ευνοϊκής πρόγνωσης (α/α: 5, 8, 10), ενώ στους 6 δυσµενούς. Οι ασθενείς µε φυσιολογικό καρυότυπο θεωρούνται ενδιάµεσης πρόγνωσης και µαζί µε τους ασθενείς που έχουν παθολογικό καρυότυπο ευνοϊκής πρόγνωσης κατατάσσονται στην ίδια οµάδα. Την άλλη οµάδα αποτέλεσαν οι ασθενείς µε παθολογικό καρυότυπο µε δυσµενή πρόγνωση. Οι καρυότυποι των ασθενών που εξετάστηκαν και ο FAB υπότυπος φαίνονται στον Πίνακα 17. Πίνακας 17. Καρυότυποι 18 ασθενών µε ΟΜΛ στη διάγνωση. α/α Καρυότυπος FAB 1 47, ΧΧ, +8 M5 2 ΚΦ M2 3 46, ΧX, t(3;5)(q25;q35) M6 4 46,ΧΥ,del(5)(q13;q33)add(12)(p12),-17 Μ0 5 46, XX, t(8;21)(q22;q22) M2 6 ΚΦ M4 7 ΚΦ M3 8 46, XΥ, del(16)(q22) M4 9 46,ΧΥ,inc./ 69~95ΧΧΥΥ M , XY, t(15;17)(q22;q11) M ,ΧΧ,-7 M0 12 ΚΦ M3 13 ΚΦ M1 14 ΚΦ M4 15 ΚΦ M3 16 ΚΦ M , ΧΥ, t(9;22)(q34;q11) M2 18 ΚΦ M2 124

125 Η ηλικία των ασθενών που περιελήφθησαν στη µελέτη ήταν κατά τη διάγνωση 67,72 ± 11,47 έτη (εύρος έτη), στην ύφεση 64,22 ± 10,88 (εύρος έτη) και η ηλικία των υγιών µαρτύρων ήταν 66,42 ± 11,21 έτη (εύρος έτη). Η διαφορά ανάµεσα στις οµάδες αυτές δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p>0,05). Η µέση τιµή λευκών αιµοσφαιρίων των ασθενών µε ΟΜΛ κατά τη διάγνωση της νόσου ήταν 24,30 ± 28,67 x10 3 /mm 3 (εύρος 1,6-110 x10 3 /mm 3 ). Στους ασθενείς σε ύφεση ο αριθµός των λευκών αιµοσφαιρίων ήταν 7,21 ± 1,54 x10 3 /mm 3 (εύρος 4,6-10,8 x10 3 /mm 3 ), ενώ στους υγιείς µάρτυρες 7,23 ± 1,09 x10 3 /mm 3 (εύρος 5,4-8,8 x10 3 /mm 3 ). Η διαφορά ανάµεσα στις οµάδες που µελετήθηκαν είναι στατιστικά σηµαντική (p<0,05) ( ιάγραµµα 1). Η µέση τιµή αιµοσφαιρίνης των ασθενών µε οξεία µυελογενή λευχαιµία κατά τη διάγνωση της νόσου ήταν 9,52 ± 1,33 g/dl (εύρος 6,7-13 g/dl). Στους ασθενείς σε ύφεση η αιµοσφαιρίνη ήταν 12,58 ± 0,94 g/dl (εύρος 10,7-14,1 g/dl), ενώ στους υγιείς µάρτυρες 14,11 ± 1,33 g/dl (εύρος 10,6-16). Η διαφορά ανάµεσα στις οµάδες που µελετήθηκαν ως προς την αιµοσφαιρίνη δεν φαίνεται να είναι σηµαντική (p>0,05). Η µέση τιµή του αιµατοκρίτη των ασθενών µε οξεία µυελογενή λευχαιµία κατά τη διάγνωση της νόσου ήταν 29,11 ± 3,91% (εύρος 18,2-37,7%). Στους ασθενείς σε ύφεση ο αιµατοκρίτης ήταν 36,27 ± 4,72% (εύρος 33,6-42,5%), ενώ στους υγιείς µάρτυρες 44,42 ± 4,16% (εύρος 33,4-50%). Η διαφορά ανάµεσα στις οµάδες που µελετήθηκαν ως προς τον αιµατοκρίτη δεν φαίνεται να είναι σηµαντική (p>0,05). Ο µέσος αριθµός των αιµοπεταλίων κατά τη διάγνωση της νόσου ήταν 57,98 ± 89,8 x10 3 /mm 3 (εύρος x10 3 /mm 3 ). Στους ασθενείς σε ύφεση ο α- ριθµός των αιµοπεταλίων ήταν 247,14 ± 179,08 x10 3 /mm 3 (εύρος x10 3 /mm 3 ) ενώ στους υγιείς µάρτυρες 272,416 ± 56,822 x10 3 /mm 3 (εύρος x10 3 /mm 3 ). Η διαφορά ανάµεσα στις οµάδες που µελετήθηκαν ως προς τον αριθµό των αιµοπεταλίων φαίνεται να είναι σηµαντική (p<0,05) ( ιάγραµµα 2). Ο µέσος αριθµός βλαστών στον µυελό των οστών για τους ασθενείς στην διάγνωση της νόσου ήταν 71,32 ± 11,55% (εύρος 50-90%), ενώ στους ασθενείς σε ύφεση 3,33 ± 1,02% (εύρος 1-5%). Η διαφορά ανάµεσα στις δυο οµάδες ως 125

126 προς τον αριθµό των βλαστών στον µυελό των οστών είναι στατιστικά σηµαντική (p<0,05). Ο µέσος αριθµός βλαστών στην περιφέρεια για τους ασθενείς στην διάγνωση της νόσου ήταν 42,93 ± 25,49% (εύρος 5-85%), ενώ στους ασθενείς σε ύφεση δεν υπήρχαν βλάστες (Πίνακας 18). Πίνακας 18. Μέση τιµή (± τυπική απόκλιση) των αιµατολογικών ευρηµάτων στους α- σθενείς στη διάγνωση, στην ύφεση και στους φυσιολογικούς µάρτυρες. ιάγνωση Ύφεση Μάρτυρες Στατιστική σηµαντικότητα Ηλικία (έτη) 67,72 ± 11,47 64,22 ± 10,88 66,42 ± 11,21 p>0,05 Αριθµός λευκών αιµοσφαιρίων (WBCx10 3 /mm 3 ) 24,30 ± 28,67 7,21 ± 1,54 7,23 ± 1,09 p<0,05 Αιµοσφαιρίνη (Hgb) (g/dl) 9,52 ± 1,33 12,58 ± 0,94 14,11 ± 1,33 p>0,05 Αιµατοκρίτης (Hct) (%) 29,11 ± 3,91 36,27 ± 4,72 44,42 ± 4,16 p>0,05 Αριθµός αιµοπεταλίων (PLTx10 3 /mm 3 ) 57,98 ± 89,80 247,14 ± 179,08 272,42 ± 56,82 p<0,05 Βλάστες στο µυελό των οστών (%) 71,32 ± 11,55 3,33 ± 1,02 0 p<0,05 Βλάστες στο περιφερικό αίµα (%) 42,93 ± 25, p<0,05 126

127 ιάγραµµα 1: Αριθµός λευκών αιµοσφαιρίων σε ασθενείς κατά τη διάγνωση, την ύφεση και σε υγιείς µάρτυρες. ιάγραµµα 2: Αριθµός αιµοπεταλίων σε ασθενείς κατά τη διάγνωση, την ύφεση και σε υγιείς µάρτυρες. 127

128 2. Έκφραση των επιπέδων mrna του VEGF στον µυελό των οστών Τα επίπεδα mrna του παράγοντα VEGF µετρήθηκαν µε την µέθοδο της Real Time RT-PCR. Συγκεκριµένα, χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της σχετικής ποσοτικοποίησης, όπου οι αλλαγές των επιπέδων του mrna του VEGF γονιδίου προσδιορίστηκαν σε σχέση µε το επίπεδο έκφρασης ενός εσωτερικού γονιδίου αναφοράς, του γονιδίου Abl (Εικόνα 24). Η σχετική ποσοτικοποίηση βασίζεται στο λόγο των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου-στόχου (VEGF) ως προς το γονίδιο αναφοράς (Abl). Για το υπολογισµό αυτού του λόγου στην παρούσα µελέτη χρησιµοποιήθηκε το µαθηµατικό µοντέλο του Pfaffl 250. Για την στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων, όσον αφορά τις αλλαγές στα επίπεδα του mrna χρησιµοποιήθηκε το λογισµικό REST-XL Version 2. Ο µαθηµατικός τύπος που χρησιµοποιεί το λογισµικό για τον υπολογισµό των σχετικών επιπέδων mrna των ΟΜΛ ασθενών είναι: R = E VEGF Ct VEGF (µάρτυρας-δείγµα) / E Abl (µάρτυρας-δείγµα) 255, 256. Ct Abl Εικόνα 24: Real Time PT-PCR στην οποία φαίνεται η κατανοµή του γονιδίου αναφοράς Abl στους ασθενείς µε ΟΜΛ. Σε κάθε δείγµα που εξετάστηκε µε την µέθοδο της Real Time RT-PCR, προσδιορίστηκε η τιµή του Ct, τιµή που αντιστοιχεί στον αριθµό των κύκλων που ανιχνεύεται για πρώτη φορά προϊόν. Κάθε δείγµα αντιπροσωπεύεται από 128

129 δυο τιµές Ct µια για το γονίδιο-στόχο και µια για το γονίδιο αναφοράς, µέσω των οποίων γίνονται οι περαιτέρω υπολογισµοί. Στην οµάδα των φυσιολογικών µαρτύρων η µέση τιµή Ct για τον VEGF είναι 22,81 ± 0,31 κύκλοι και για το γονίδιο Abl 23,97 ± 0,45 κύκλοι. Στους α- σθενείς κατά τη διάγνωση της νόσου η µέση τιµή Ct για τον VEGF είναι 23,19 ± 1,67 κύκλοι και για το Abl 22,29 ± 1,76 κύκλοι, ενώ στους ασθενείς στην ύφεση η µέση τιµή Ct του VEGF είναι 21,65 ± 0,94 κύκλοι και του Abl 22,42 ± 0,74 κύκλοι (Πίνακας 19). Πίνακας 19. Αριθµός κύκλων (± τυπική απόκλιση) του γονιδίου µελέτης VEGF και του γονιδίου αναφοράς ABL για τις τρεις οµάδες µελέτης και η απόλυτη τιµή του VEGF. Αριθµός κύκλων VEGF Αριθµός κύκλων ABL Απόλυτη τιµή VEGF ιάγνωση 23,19 ± 1,67 22,29 ± 1,76 0,237 ± 0,18 Ύφεση 21,71 ± 1,02 22,68 ± 0,91 0,879 ± 0,352 Μάρτυρες 22,81 ± 0,31 23,97 ± 0,45 1 ± 0,21 Γενικά, στους ασθενείς κατά τη διάγνωση παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική µείωση των επιπέδων mrna του VEGF σε σχέση µε τους υγιείς µάρτυρες κατά 4,218 φορές (p=0,038). Στους ασθενείς σε ύφεση, τα επίπεδα mrna VEGF φαίνεται ότι φτάνουν τα επίπεδα των φυσιολογικών ατόµων. Οι ασθενείς στην ύφεση παρουσιάζουν µια µικρή µείωση των επιπέδων (1,139 φορές) σε σχέση µε τους µάρτυρες, χωρίς όµως αυτή να είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,611). Τέλος, βρέθηκε στατιστικά σηµαντική διαφορά των επιπέδων mrna ανάµεσα στους ασθενείς στην διάγνωση και στους ασθενείς σε ύφεση, όπου οι ασθενείς στην διάγνωση είχαν κατά 3,704 φορές (p=0,001) χαµηλότερα επίπεδα VEGF, σε σχέση µε τους ασθενείς στην ύφεση (Εικόνα 25). Εποµένως, τα χα- µηλότερα επίπεδα mrna ανιχνεύθηκαν στους ασθενείς στην διάγνωση, ενώ ακολουθούσαν οι ασθενείς σε ύφεση και οι φυσιολογικοί µάρτυρες ( ιάγραµµα 3, Εικόνα 26, Πίνακας 20). Η αποτύπωση των αποτελεσµάτων της Real Time RT-PCR στους ασθενείς µε ΟΜΛ στη διάγνωση της νόσου φαίνονται στις Εικόνες 27 και

130 Ύφεση ιάγνωση Εικόνα 25: Real Time PT-PCR του γονιδίου VEGF στους ασθενείς µε ΟΜΛ κατά τη διάγνωση και σε ύφεση. ιάγραµµα 3: Επίπεδα mrna σε ασθενείς στη διάγνωση, στην ύφεση και σε υγιείς µάρτυρες. Μάρτυρες Ύφεση ιάγνωση Εικόνα 26: Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης του γονιδίου στόχου VEGF στους υ- γιείς µάρτυρες, στους ασθενείς σε ύφεση και στους ασθενείς στη διάγνωση. 130

131 Εικόνα 27: Real Time PT-PCR στην οποία φαίνεται η κατανοµή του γονιδίου στόχου VEGF στους ασθενείς µε ΟΜΛ στη διάγνωση. Εικόνα 28: Real Time PT-PCR στην οποία φαίνεται η κατανοµή του γονιδίου στόχου VEGF στους ασθενείς µε ΟΜΛ στη διάγνωση, σε λογαριθµική κλίµακα. 131

132 Πίνακας 20. Σχετική µεταβολή (Ratio) των επιπέδων mrna του γονιδίου VEGF µεταξύ των οµάδων µελέτης. Μεταβολή Φορές Στατιστική σηµαντικότητα ιάγνωση ως προς µάρτυρες Μείωση ( ) 4,218 p=0,038 Ύφεση ως προς µάρτυρες Μείωση ( ) 1,139 p=0,611 Ύφεση ως προς διάγνωση Αύξηση ( ) 3,704 p=0,001 Στην οµάδα των ασθενών στην διάγνωση της νόσου τα επίπεδα mrna του παράγοντα VEGF δεν συσχετίζονται µε την ηλικία (r=0,059, p=0,712), τον α- ριθµό των λευκών αιµοσφαιρίων (r=-0,122, p=0,445), την αιµοσφαιρίνη (r=0,034, p=0,834), τον αιµατοκρίτη (r=0,192, p=0,23), τα αιµοπετάλια (r=0,077, p=0,633), το ποσοστό των βλαστών στον µυελό των οστών (r=-0,148, p=0,355) και στο περιφερικό αίµα (r=-0,18, p=0,26). Στην οµάδα των ασθενών σε ύφεση τα επίπεδα του VEGF mrna δεν συσχετίζονται επίσης µε την ηλικία (r=-0,44, p=0,067), τον αριθµό των λευκών αιµοσφαιρίων (r=-0,284, p=0,254), την αιµοσφαιρίνη (r=-0,358, p=0,144), τον αιµατοκρίτη (r=-0,398, p=0,102), τα αιµοπετάλια (r=0,293, p=0,238) και το ποσοστό των βλαστών στον µυελό των οστών (r=-0,185, p=0,634). Στην οµάδα των φυσιολογικών µαρτύρων τα επίπεδα mrna του VEGF δεν σχετίζονται µε την ηλικία (r=-0,277, p=0,384), µε τον αριθµό των λευκών αιµοσφαιρίων (r=-0,506, p=0,094), την αιµοσφαιρίνη (r=-0,502, p=0,097), τον αιµατοκρίτη (r=-0,495, p=0,102) και τον αριθµό των αιµοπεταλίων (r=-0,041, p=0,898) (Πίνακας 21). Στο σύνολο των ασθενών µε ΟΜΛ, είτε αυτοί βρισκόταν στη διάγνωση της νόσου, είτε σε ύφεση βρέθηκε να υπάρχει αρνητική συσχέτιση (r=-0,461, p=0,01) µεταξύ των επιπέδων mrna του VEGF και του ποσοστού των βλαστών ( ιάγραµµα 4). 132

133 Πίνακας 21. Συσχέτιση των επιπέδων mrna του γονιδίου VEGF ως προς την ηλικία και τα αιµατολογικά ευρήµατα των ασθενών στη διάγνωση, την ύφεση και των φυσιολογικών µαρτύρων. Ηλικία (έτη) Αριθµός λευκών αιµοσφαιρίων (WBCx10 3 /mm 3 ) Αιµοσφαιρίνη (Hgb) (g/dl) Αιµατοκρίτης (Hct) (%) Αριθµός αιµοπεταλίων (PLTx10 3 /mm 3 ) Βλάστες στο µυελό των οστών (%) Βλάστες στο περιφερικό αίµα (%) ιάγνωση Ύφεση Μάρτυρες r = 0,059 p=0,712 r = -0,122 p=0,455 r = 0,034 p=0,834 r = 0,192 p=0,230 r = 0,077 p=0,633 r = -0,148 p=0,355 r = -0,18 p=0,26 r = -0,44 p=0,067 r = -0,284 p=0,254 r = -0,358 p=0,144 r = -0,398 p=0,102 r = 0,293 p=0,238 r = -0,185 p=0,634 r = -0,277 p=0,384 r = -0,506 p=0,094 r = -0,502 p=0,097 r = -0,495 p=0,102 r = -0,041 p=0,898 ιάγραµµα 4: Αρνητική συσχέτιση των επιπέδων mrna του VEGF µε το ποσοστό των βλαστών στο µυελό των οστών ασθενών µε ΟΜΛ. 133

134 Τα επίπεδα του παράγοντα VEGF φαίνεται να παρουσιάζουν διαφορά ανά- µεσα στους ασθενείς µε πρωτοπαθή ή δευτεροπαθή ΟΜΛ. Συγκεκριµένα, τα επίπεδα των ασθενών µε πρωτοπαθή ΟΜΛ βρέθηκαν 2,192 φορές πιο αυξηµένα σε σχέση µε τα επίπεδα των ασθενών µε δευτεροπαθή ΟΜΛ (p=0,039) (Εικόνα 29, ιάγραµµα 5). Εικόνα 29: Real Time PT-PCR στην οποία φαίνεται ο αριθµός των κύκλων (Ct) του γονιδίου στόχου VEGF στους ασθενείς µε πρωτοπαθή και στους ασθενείς µε δευτεροπαθή ΟΜΛ. ιάγραµµα 5: Επίπεδα mrna σε ασθενείς µε πρωτοπαθή και σε ασθενείς µε δευτεροπαθή ΟΜΛ. 134

135 Επιπλέον από την µελέτη φάνηκε ότι τα επίπεδα mrna του παράγοντα VEGF διαφέρουν ανάµεσα στους ασθενείς µε ευνοϊκό υπότυπο κατά FAB και σε αυτούς µε δυσµενή. Συγκεκριµένα, τα επίπεδα mrna του VEGF των ασθενών µε ευνοϊκή FAB βρέθηκαν 2,246 φορές (p=0,022) πιο µειωµένα από των ασθενών µε δυσµενή (Εικόνα 30, ιάγραµµα 6). Εικόνα 30: Real Time PT-PCR στην οποία φαίνεται ο αριθµός των κύκλων (Ct) του γονιδίου στόχου VEGF στους ασθενείς µε ευνοϊκό υπότυπο και στους ασθενείς µε δυσµενή υπότυπο κατά FAB. ιάγραµµα 6: Επίπεδα mrna σε ασθενείς µε ευνοϊκό υπότυπο και σε ασθενείς µε δυσµενή υπότυπο κατά FAB. 135

136 Τέλος, από την στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων φάνηκε ότι τα επίπεδα mrna του παράγοντα VEGF δεν διαφέρουν ανάµεσα στους ασθενείς που απάντησαν στη θεραπεία και σε αυτούς που δεν απάντησαν (p=0,542). Επίσης, δεν διαφέρουν ανάµεσα στους ασθενείς µε ευνοϊκό καρυότυπο και στους ασθενείς µε δυσµενή καρυότυπο (p=0,159) (Πίνακας 22). Πίνακας 22. Σχετική µεταβολή (Ratio) των επιπέδων mrna του γονιδίου VEGF των ασθενών στη διάγνωση, ως προς το φύλο και τους προγνωστικούς παράγοντες της ΟΜΛ. Απόλυτη τιµή VEGF (± τυπική απόκλιση) Μάρτυρες 1 ± 0,21 Άντρες 0,295 ± 0,035 Γυναίκες 0,189 ± 0,068 Πρωτοπαθής ΟΜΛ 0,353 ± 0,19 ευτεροπαθής ΟΜΛ 0,161 ± 0,13 Ευνοϊκός υπότυπος FAB 0,162 ± 0,12 υσµενής υπότυπος FAB 0,364 ± 0,18 Ευνοϊκός καρυότυπος 0,266 ± 0,026 υσµενής καρυότυπος 0,369 ± 0,044 Απάντηση στη θεραπεία 0,282 ± 0,088 Μη απάντηση στη θεραπεία 0,212 ± 0,054 Μεταβολή / στατιστική σηµαντικότητα 1,561 p = 0,315 2,192 p = 0,039 2,246 p = 0,022 1,39 p = 0,159 1,33 p = 0,

137 3. Έκφραση της συγκέντρωσης της VEGF πρωτεΐνης Η συγκέντρωση της VEGF πρωτεΐνης µετρήθηκε µε την ανοσοενζυµική µέθοδο ELISA τόσο στους ασθενείς µε ΟΜΛ όσο και στους φυσιολογικούς µάρτυρες. Στην οµάδα των φυσιολογικών µαρτύρων τα επίπεδα του VEGF είναι 69,48 ± 136,04 pg/ml (εύρος 0-441,58 pg/ml). Στους ασθενείς στην διάγνωση της νόσου η συγκέντρωση του VEGF είναι 212,27 ± 214,29 pg/ml (εύρος 32,52-784,39 pg/ml), ενώ στους ασθενείς στην ύφεση ισούται µε 570,18 ± 569,39 pg/ml (εύρος 143, pg/ml) (Πίνακας 23, ιάγραµµα 7). Πίνακας 23. Συγκέντρωση της VEGF πρωτεΐνης (± τυπική απόκλιση) στον ορό ασθενών στη διάγνωση, την ύφεση και στους φυσιολογικούς µάρτυρες. Συγκέντρωση VEGF πρωτεΐνης (pg/ml) Εύρος (pg/ml) ιάγνωση 212,27 ± 214,29 32,52 784,39 Ύφεση 570,18 ± 569,39 143, Μάρτυρες 69,48 ± 136, ,58 ιάγραµµα 7: Συγκέντρωση της VEGF πρωτεΐνης στους ασθενείς στη διάγνωση, στην ύφεση και στους φυσιολογικούς µάρτυρες. 137

138 Γενικά, στους ασθενείς στην διάγνωση παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική αύξηση της έκφρασης του VEGF σε σχέση µε τους µάρτυρες κατά 3,055 φορές (p=0,002). Στους ασθενείς σε ύφεση, η έκφραση του VEGF ήταν επίσης στατιστικά σηµαντικά αυξηµένη σε σχέση µε τους υγιείς µάρτυρες, κατά 8,21 φορές (p=0,001). Είναι επίσης αξιοσηµείωτο ότι βρέθηκε στατιστικά σηµαντική διαφορά ανάµεσα στους ασθενείς στην διάγνωση και στους ασθενείς σε ύφεση, όπου οι ασθενείς στην ύφεση είχαν κατά 2,686 φορές (p=0,017) περισσότερη ποσότητα VEGF, σε σχέση µε τους ασθενείς στην διάγνωση. Εποµένως, η µικρότερη ποσότητα πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε στους φυσιολογικούς µάρτυρες, ενώ ακολουθούσαν οι ασθενείς στην διάγνωση και στη συνέχεια οι ασθενείς σε ύφεση (Πίνακας 24). Πίνακας 24. Σχετική µεταβολή της συγκέντρωσης της VEGF πρωτεΐνης στους ασθενείς στη διάγνωση και την ύφεση σε σχέση µε τους µάρτυρες. Μεταβολή Φορές Στατιστική σηµαντικότητα ιάγνωση ως προς µάρτυρες Αύξηση ( ) 3,055 p=0,002 Ύφεση ως προς µάρτυρες Αύξηση ( ) 8,21 p=0,001 Ύφεση ως προς διάγνωση Αύξηση ( ) 2,687 p=0,017 Στην οµάδα των ασθενών στη διάγνωση της νόσου ο παράγοντας VEGF δεν συσχετίζεται µε την ηλικία των ασθενών (r=-0,494, p=0,037), τον αριθµό των λευκών αιµοσφαιρίων (r=-0,011, p=0,997), την αιµοσφαιρίνη (r=0,422, p=0,092), τον αιµατοκρίτη (r=0,468, p=0,084), το ποσοστό των βλαστών στον µυελό των οστών (r=-0,149, p=0,556) και στο περιφερικό αίµα (r=-0,291, p=0,241). Αντίθετα, στην ίδια οµάδα ασθενών η συγκέντρωση του παράγοντα VEGF φαίνεται να σχετίζεται θετικά (r=0,533, p=0,001) µε τον αριθµό των αι- µοπεταλίων ( ιάγραµµα 8). Στην οµάδα των ΟΜΛ ασθενών σε ύφεση τα επίπεδα του VEGF δεν συσχετίζονται µε την ηλικία τους (r=-0,185, p=0,634), µε τον αριθµό των λευκών αι- µοσφαιρίων (r=-0,227, p=0,579), την αιµοσφαιρίνη (r=0,032, p=0,940), τον αι- 138

139 µατοκρίτη (r=0,060, p=0,887), και το ποσοστό των βλαστών στον µυελό των οστών (r=-0,040, p=0,919). Φαίνεται όµως να υπάρχει θετική συσχέτιση (r=0,581, p=0,018) της συγκέντρωσης του παράγοντα VEGF µε τον αριθµό των αιµοπεταλίων ( ιάγραµµα 8). ιάγραµµα 8: Θετική συσχέτιση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης VEGF µε τον αριθµό των αιµοπεταλίων των ασθενών κατά τη διάγνωση και σε ύφεση. Στην οµάδα των φυσιολογικών µαρτύρων ο παράγοντας VEGF δεν σχετίζεται µε την ηλικία των µαρτύρων (r=-0,257, p=0,42), µε τον αριθµό των λευκών αιµοσφαιρίων (r=0,059, p=0,855), την αιµοσφαιρίνη (r=-0,189, p=0,557) και τον αιµατοκρίτη (r=-0,186, p=0,562), ενώ φαίνεται να υπάρχει θετική συσχέτιση (r=0,771, p=0,003) του παράγοντα µε τον αριθµό των αιµοπεταλίων ( ιάγραµ- µα 9). Στον Πίνακα 25 φαίνεται η συσχέτιση της συγκέντρωσης της VEGF πρωτεΐνης µε την ηλικία και ορισµένα αιµατολογικά ευρήµατα των ασθενών στη διάγνωση, την ύφεση και των φυσιολογικών µαρτύρων. 139

140 ιάγραµµα 9: Θετική συσχέτιση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης VEGF µε τον αριθµό των αιµοπεταλίων των φυσιολογικών µαρτύρων. Πίνακας 25. Συσχέτιση της συγκέντρωσης της VEGF πρωτεΐνης ως προς την ηλικία και τα αιµατολογικά ευρήµατα των ασθενών στη διάγνωση, την ύφεση και των φυσιολογικών µαρτύρων. Ηλικία (έτη) Αριθµός λευκών αιµοσφαιρίων (WBCx10 3 /mm 3 ) Αιµοσφαιρίνη (Hgb) (g/dl) Αιµατοκρίτης (Hct) (%) Αριθµός αιµοπεταλίων (PLTx10 3 /mm 3 ) Βλάστες στο µυελό των οστών (%) Βλάστες στο περιφερικό αίµα (%) ιάγνωση Ύφεση Μάρτυρες r = -0,494 p=0,073 r = -0,011 p=0,997 r = 0,422 p=0,092 r = 0,468 p=0,084 r = 0,533 p=0,001 r = -0,149 p=0,556 r = -0,291 p=0,241 r = -0,185 p=0,634 r = -0,227 p=0,579 r = 0,032 p=0,94 r = 0,06 p=0,887 r = 0,581 p=0,001 r = -0,04 p=0,919 r = -0,257 p=0,42 r = 0,059 p=0,855 r = -0,189 p=0,557 r = -0,186 p=0,562 r = 0,771 p=0,003 Ο VEGF φαίνεται να παρουσιάζει διαφορά στους ασθενείς µε πρωτοπαθή ή δευτεροπαθή ΟΜΛ ( ιάγραµµα 10). Συγκεκριµένα τα επίπεδα του VEGF στην 140

141 πρώτη οµάδα ήταν 234,84 ± 236,86 pg/ml (εύρος 47,98-567,94 pg/ml) και στη δεύτερη οµάδα ήταν 102,83 ± 72,39 (εύρος 32,52-488,84 pg/ml, p=0,045). ιάγραµµα 10: Συγκέντρωση της VEGF πρωτεΐνης σε ασθενείς µε πρωτοπαθή και σε ασθενείς µε δευτεροπαθή ΟΜΛ. Επιπλέον από την µελέτη φάνηκε ότι η συγκέντρωση του παράγοντα VEGF διαφέρει ανάµεσα στους ασθενείς µε ευνοϊκό FAB υπότυπο από αυτούς µε δυσµενή υπότυπο ( ιάγραµµα 11). Τα επίπεδα του VEGF στην πρώτη οµάδα ήταν 101,01 ± 64,89 pg/ml (εύρος 91,83-172,98 pg/ml) και στη δεύτερη οµάδα 247,81 ± 243,92 (εύρος 174,3-377,22 pg/ml, p=0,037). ιάγραµµα 11: Συγκέντρωση της VEGF πρωτεΐνης σε ασθενείς µε ευνοϊκό και σε α- σθενείς µε δυσµενή υπότυπο κατά FAB. 141

142 Από την στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων φαίνεται ότι η συγκέντρωση του παράγοντα VEGF δεν διαφέρει ανάµεσα στους ασθενείς που απάντησαν στην χορηγηθείσα θεραπεία και σε αυτούς που δεν απάντησαν (p=0,892), ούτε ανάµεσα στους ασθενείς µε ευνοϊκό ή δυσµενή καρυότυπο (p=0,571) (Πίνακας 26). Πίνακας 26. Σχετική µεταβολή της συγκέντρωσης της VEGF πρωτεΐνης των ασθενών στη διάγνωση, ως προς το φύλο και τους προγνωστικούς παράγοντες της ΟΜΛ. Μέσος όρος (pg/ml) (± τυπική απόκλιση) Άντρες 209,46 ± 139,42 Γυναίκες 215,29 ± 163,61 Πρωτοπαθής ΟΜΛ 234,84 ± 236,86 ευτεροπαθής ΟΜΛ 102,78 ± 72,39 Ευνοϊκός υπότυπος FAB 101,01 ± 64,89 υσµενής υπότυπος FAB 247,81 ± 243,92 Ευνοϊκός καρυότυπος 155,86 ± 207,96 υσµενής καρυότυπος 267,22 ± 125,77 Απάντηση στη θεραπεία 240,78 ± 291,33 Μη απάντηση στη θεραπεία 186,02 ± 173,59 Στατιστική σηµαντικότητα p=0,146 p=0,045 p=0,037 p=0,571 p=0,892 Τέλος, αξίζει να αναφερθεί ότι τόσο στους ασθενείς στη διάγνωση όσο και στους ασθενείς σε ύφεση βρέθηκε θετική συσχέτιση ανάµεσα στα επίπεδα mrna και στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης του παράγοντα VEGF (Πίνακας 27, ιάγραµµα 12). Η συσχέτιση αυτή δεν επαληθεύθηκε για τους υγιείς µάρτυρες. 142

143 Πίνακας 27. Συσχέτιση των επιπέδων mrna του γονιδίου VEGF και της συγκέντρωσης της VEGF πρωτεΐνης στους ασθενείς στη διάγνωση. ιάγνωση Ύφεση VEGF mrna VEGF mrna VEGF mrna r = 1 r = 1 VEGF πρωτεΐνη r = 0,328 p=0,039 r = 0,615 p=0,011 ιάγραµµα 12: Θετική συσχέτιση ανάµεσα στα επίπεδα mrna και στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης του VEGF στους ασθενείς κατά τη διάγνωση και σε ύφεση. 4. Μέτρηση της µικροαγγειακής πυκνότητας Στην παρούσα µελέτη µετρήθηκε επίσης η µικροαγγειακή πυκνότητα χρησιµοποιώντας το αντί-cd34 αντίσωµα που χρωµατίζει κυρίως ενδοθηλιακά κύτταρα και υπερτερεί των άλλων µεθόδων. Εφαρµόσθηκε σε 22 περιπτώσεις α- σθενών µε ΟΜΛ στην διάγνωση της νόσου ενώ ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν 10 άτοµα που υποβλήθηκαν σε οστεοµυελική βιοψία στα πλαίσια διερεύνησης αναιµίας ή λεµφαδενοπάθειας και στους οποίους η βιοψία απέβη φυσιολογική. Τα πλακίδια µικροσκοπήθηκαν σε µεγέθυνση 100Χ, 200Χ και 400Χ από ένα βιολόγο και ένα παθολογοανατόµο. Η µικροαγγειακή πυκνότητα που κατα- 143

144 µετρήθηκε σε όλα τα πεδία αναφέρεται ως συνολική και αποτελεί το µέσο όρο των αγγείων που µετρήθηκαν. Στους ασθενείς µε ΟΜΛ στη διάγνωση, η συνολική µικροαγγειακή πυκνότητα σε όλα τα πεδία ήταν 5,78 ± 3,15 αγγεία ανά οπτικό πεδίο (400Χ) (εύρος 2,36 10,35 αγγεία ανά οπτικό πεδίο). Στους υγιείς µάρτυρες η συνολική µικροαγγειακή πυκνότητα σε όλα τα πεδία ήταν 1,61 ± 0,56 αγγεία ανά οπτικό πεδίο (εύρος 1 2,4 αγγεία ανά οπτικό πεδίο). Η διαφορά ανάµεσα στις δύο οµάδες είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,013) (Πίνακας 28, ιάγραµµα 13, Εικόνα 31). Πίνακας 28. Αριθµός των αγγείων ανά οπτικό πεδίο στους ασθενείς µε ΟΜΛ κατά τη διάγνωση και στους µάρτυρες και η σχετική µεταβολή τους στις δυο οµάδες. Αριθµός αγγείων ανά οπτικό πεδίο (400x) ιάγνωση 5,78 ± 3,15 Μάρτυρες 1,61 ± 0,56 Στατιστική σηµαντικότητα ιάγνωση / µάρτυρες 3,59 ιάγραµµα 13: Αριθµός αγγείων στους ασθενείς στη διάγνωση και στους υγιείς µάρτυρες. 144

145 Εικόνα 31: Απεικόνιση της µικροαγγειακής πυκνότητας στην οστεοµυελική βιοψία ενός µάρτυρα (Α) και ενός ασθενή µε ΟΜΛ (Β). Στην οµάδα των ασθενών στην διάγνωση της νόσου η µικροαγγειακή πυκνότητα δεν συσχετίζεται µε το φύλο των ασθενών (p=0,171), την ηλικία τους (r=0,209, p=0,653), τον αριθµό των λευκών αιµοσφαιρίων (r=0,763, p=0,064), την αιµοσφαιρίνη (r=0,322, p=0,482), τον αιµατοκρίτη (r=0,35, p=0,441), τον αριθµό των αιµοπεταλίων (r=-0,268, p=0,562), το ποσοστό των βλαστών στον µυελό των οστών (r=0,039, p=0,934) και στο περιφερικό αίµα (r=-0,052, p=0,912). Στην οµάδα των φυσιολογικών µαρτύρων η µικροαγγειακή πυκνότητα δεν σχετίζεται µε το φύλο των µαρτύρων (p=0,811), την ηλικία τους (r=-0,250, p=0,433), µε τον αριθµό των λευκών αιµοσφαιρίων (r=0,048, p=0,881), την αι- µοσφαιρίνη (r=-0,465, p=0,128), τον αιµατοκρίτη (r=-0,464, p=0,128) και τον αριθµό των αιµοπεταλίων (r=0,23, p=0,522) (Πίνακας 29). 145