Αναστασία-Κωνσταντίνα Παπαδοπούλου Δέσποινα Μαλλιού Παρασκευή-Βίβιαν Αλευρογιάννη Περίληψη:

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΕΜΙΝΑΡΙΟ ΣΤΟ ΜΑΘΗΜΑ ΕΙΔΙΚΩΝ ΚΕΦΑΛΑΙΩΝ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕ ΘΕΜΑ: «Ενίσχυση της θερμοσταθερότητας της χιτινάσης του SerratiamarcescensB4A μέσω QuikChangeμεταλλαξογένεσης κατευθυνόμενης από τη θέση» τωνzeinabemruzitubkanlu, SaeedAminzadeh,, AliAsgharKarkhane, JahanAlikhajeh Από την ομάδα 17: Άγγελος Χαραλαμπίδης Αναστασία-Κωνσταντίνα Παπαδοπούλου Δέσποινα Μαλλιού Παρασκευή-Βίβιαν Αλευρογιάννη Περίληψη: Οι θερμοσταθερέςχιτινάσες είναι χρήσιμες για οικονομικές, βιομηχανικές και βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Σ αυτή την εργασία, επιχειρήθηκε να σταθεροποιηθεί χιτινάση από Θαυμαστοβάκιλλο (Serratiamarcescens) Β4Α από ορθόλογημεταλλαξογένεση κι αλλαγή της Ser 390 από Ile. Αυτή η σταθεροποίηση πραγματοποιήθηκε μέσω εντροπικής σταθεροποίησης με μείωση του μήκους του βρόχου κι επίσης με αύξηση του μήκους της βήτα-αλυσίδας. Από την άλλη, με την αντικατάσταση, ένα πολικό μη φορτισμένο κατάλοιπο άλλαξε σε μη πολικό κι αυξήθηκαν οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Επιπλέον, η ισολευκίνη έχει διακλαδισμένο β-άνθρακα που περιόρισε τη διαμόρφωση του σκελετού περισσότερο από τα μη διακλαδισμένα κατάλοιπα. Τέλος, όλοι αυτοί οι παράγοντες οδηγούν σε εντροπική και θερμική σταθεροποίηση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ιδανική θερμοκρασία και phγια την ενεργότητα του ενζύμου της φυσικής χιτινάσης δεν άλλαξε από τη μεταλλαξογένεση που έδειξε ότι η μεταλλαγή δεν επηρέασε τα αρχικά χαρακτηριστικά του ενζύμου, οι τιμές των K mτης φυσικής και της μεταλλαγμένης χιτινάσηςδιαφοροποιήθηκαν πολύ λίγο, γεγονός που έδειξε ότι η συγγένεια του ενζύμου για το υπόστρωμά του κι η φυσική ευελιξία της χιτινάσης δεν άλλαξαν από τη μεταλλαγή, η τιμή της V maxτης μεταλλαγμένης χιτινάσης μειώθηκε κι η σταθερότητα του phτης μεταλλαγμένης χιτινάσης αυξήθηκε για σύντομο χρονικό διάστημα, αλλά η θερμική του σταθερότητα αυξήθηκε σημαντικά. Η μεταλλαγή έκανε τη χιτινάση να αντέξει υψηλές θερμοκρασίες μέχρι και 90 ο C. Επιπλέον, η ενεργότητά της αυξήθηκε στους 50 ο C, 60 ο Cγια 120 λεπτά και μέχρι και 2 ώρες επώαση κι η μεταλλαγμένη χιτινάση έδειξε υψηλό βαθμό ενεργότητας στους 60 ο C. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η εντροπική σταθεροποίηση λειτουργεί καλά για τη χιτινάσηκι αυτή η προσέγγιση μπορεί γενικά να εφαρμοστεί για τη σταθεροποίηση κι άλλων πρωτεϊνών. 1. Εισαγωγή: Η χιτίνη, ένας πολυσακχαρίτης, σχηματίζεται από ενωμένες με β1,4 γλυκοζιτικό δεσμό μονάδες Ν-ακετυλο-D-γλυκοζαμίνης κι είναι το δεύτερο πιο άφθονο βιοπολυμερές παγκοσμίως κι είναι επίσης μια συνεχής πηγή ανανεώσιμων ακατέργαστων υλικών.[1-3] Η χιτίνη έχει εφαρμογή στις επιστήμες τροφίμων και διατροφής, βιομηχανίας, βιοτεχνολογίας, γεωργίας, υλικών κι ιατρικής. [4] Οι χιτινάσες είναι συγκεκριμένα ένζυμα που αποικοδομούν

2 τη χιτίνη σε μικρότερα τμήματα χιτο-ολιγοσακχαριτών [5,6] κι είναι αποτελεσματικοί βιοδείκτες στη νόσο του καρκίνου και χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία μυκητίασης σχετιζόμενης με κυστική ίνωση (CF) [7]. Κάποιες από τις χιτινάσες, όπως η χιτινάση τύπου-3 2 κι η χιτοτριοσιδάση χρησιμοποιούνται για πρώιμη διάγνωση πολλαπλής σκλήρυνσης (MS). [8,9] Έχουν βρεθεί σε μερικούς οργανισμούς, όπως σε φυτά, μύκητες, ζώα και βακτήρια. Ο Serratiamarcescensείναι το πρωτοποριακό βακτήριο στην αποικοδόμηση της χιτίνης. [10,11] Οι θερμοσταθερέςχιτινάσες είναι απαραίτητες για βιομηχανικές και βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Η χρήση της ρύθμισηςορθόδρομου σχεδιασμούγια τη μηχανική της πρωτεϊνικής σταθερότητας είναι πιθανό να είναι πρωτεϊνο-ειδική κι οποιεσδήποτε απόπειρες τέτοιου σχεδιασμού θα απαιτούσαν την καθοδήγηση από αναλυτική δομική πληροφορία. [12,13]Για παράδειγμα, ερευνητές έδειξαν ότι η απαλοιφή του τομέα της χιτινάσης Α (α+β) από το Serratiamarcescens οδήγησε σε μείωση της θερμικής σταθερότητας και της ειδικής ενεργότητας αυτού του ενζύμου. [14] Συνήθως, χρειάζεται τόσο την προσβασιμότητα της δομής του ενζύμου όσο και την κατανόηση της αλληλουχίας, της λειτουργίας και της δομής του. [15] Χρησιμοποιήθηκαν παράγοντες που καθόριζαν την πρωτεϊνική σταθερότητα, εξετάζοντας τη θερμοδυναμική σταθερότητα μικρών πρωτεϊνών και των μεταλλαγμένων παραλλαγών της. [16,17]Έχουν αποδοθεί διάφοροι λόγοι για την τεράστια σταθερότητα των θερμόφιλων πρωτεϊνών. Οι πιο σημαντικοί είναι ότι όσο μεγαλύτερη η υδροφοβικότητα [18-20] τόσο καλύτερο το πακετάρισμα, η απαλοιφή ή η βράχυνση των βρόχων [21], τόσο μικρότερες και λιγότερες οι κοιλότητες [22], η αντικατάσταση των αμινοξέων στις δευτεροταγείς δομές [23], η αυξημένη παρουσία καταλοίπων προλίνης [24], οι αυξημένοι δεσμοί υδρογόνου [25], η μείωση των μη φορτισμένων πολικών καταλοίπων [26,27], οι υποκαταστάσεις πολικών μη φορτισμένων από μη πολικά [28]. Σ αυτή τη μελέτη, επιδιώχθηκε να σταθεροποιηθεί μια αντι-παθογονική φυτική μυκητιακήχιτινάση από SerratiamarcescensB4A [29]χρησιμοποιώντας τη στρατηγική της QuikChangeμεταλλαξογένεσης καθοδηγούμενης από τη θέση (QCSDM). Γι αυτό το σκοπό, μέσω 3Dανάλυσης της δομής βρέθηκε ότι η υποκατάσταση της σερίνης 390 με ισολευκίνη προκαλεί βράχυνση του μεγέθους του βρόχου και μια αύξηση του μήκους του β-φύλλου που οδηγούν σε σταθεροποιημένο ένζυμο. Επιπλέον, μέσω αυτής της υποκατάστασης το πολικό μη φορτισμένο κατάλοιπο αλλάζει σε μη πολικό κατάλοιπο, που τελικά καταλήγει σε σταθεροποιημένο ένζυμο. 2. Μέθοδος & Υλικά 2.1.Υλικά Η χιτινάση του πλασμιδίουpqe60 από προηγούμενη δουλειά των συγγραφέων χρησιμοποιήθηκε για ενίσχυση του γονιδίου της χιτινάσης και το στέλεχος DH5α Escherichiacoli(Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε ως φορέας για τη μοριακή κλωνοποίηση των ανασυνδυασμένωνπλασμιδίωνptz57r/t (Fermentas) και pet2b (Fermentas) που περιέχουν το φυσικό και το μεταλλαγμένο γονίδιο της χιτινάσης αντίστοιχα. Το στέλεχος BL21 (DE3) Escherichiacoli(Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε επίσης για έκφραση πρωτεϊνών. Η χιτίνη νιφάδας κελύφους καβουριού και το 3,5-δινιτροσαλικυλικό οξύ (DNS) αγοράστηκε από τη Sigma (St. Louis, MO, USA). Η προετοιμασία της κολλοειδούς χιτίνης πραγματοποιήθηκε μέσω της τροποποιημένης μεθόδου Roberts και Selitrennikoff και χρήσης χιτίνης εμπορίου. [30] 2.2 InSilico μελέτες Ομόλογη μοντελοποίηση και ανάλυση της 3D δομής

3 ΗαμινοξικήαλληλουχίατηςχιτινάσηςαπότοSerratiamarcescensB4A(αριθμόςένταξηςHM ) είχεανακτηθείαπότηβάσηδεδομένωνgenbank( ΠραγματοποιήθηκεBLASTP έρευνα [31] μιας ερώτησης (σχετική με την αλληλουχία της χιτινάσης) στην ProteinData Bank (PDB). Ομόλογη μοντελοποίηση πραγματοποιήθηκε για την φυσικού τύπου και τη μεταλλαγμένη χιτινάση από το SerratiamarcescensB4A από το MODELLER v9.10 ( [32], με χρήση χιτινάσης ανοιχτής μορφήςπου κατέβηκε από PDB server ως πρότυπο. Η δομή της μεταλλαγμένης χιτινάσης που δημιουργήθηκε από το MODELLER αναλύθηκε περαιτέρω μέσω της ανάλυσης Ramachandran από Procheck [33], Qmeanserver [34], ProSA-web [35], και υπολογισμό αξίας RMSD [36]. Το Qmean είναι μια παράμετρος (μεταξύ 0 και 1) για την αξιολόγηση του μοντέλου αξιοπιστίας και το PROSA δείχνει το δείκτη ποιότητας του προβλεπόμενου μοντέλου στο πλαίσιο όλων των γνωστών πρωτεϊνικών δομών. Επιπλέον, η δομική ομοιότητα μεταξύ φυσικού και μεταλλαγμένου τύπου χιτινάσης ελέγχθηκε από τον υπολογισμό της αξίας RMSD χρησιμοποιώντας το λογισμικό VMD. 2.3 Πειραματικές μελέτες Μεταλλαξογένεση Η στρατηγική QuikChangeμεταλλαξογένεσης κατευθυνόμενης από τη θέσηχρησιμοποιήθηκεγιατηνμεταλλαξογένεση. Τοπλασμίδιο pqe60 που φέρει το γονίδιο της χιτινάσης, από προηγούμενη εργασία των συγγραφέων [37], χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για την παραγωγή μεταλλαγμένου μορίουχιτινάσης. Οι forward (5 - CACATCTTCCTGATGATCTACGACTTCTACG-3 ) και reverse (5 CGTAGAAGTCGTAGATCATCAGGAAGATGTG-3 ) μεταλλαγμένοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Το προϊόν PCR υπέστη πέψη με 1-2 μονάδες DpnIστους 37 C για 30 λεπτά. Η επιδιόρθωση της μετάλλαξης στο γονίδιο τηςχιτινάσης επαληθεύτηκε με αλληλούχιση του γονιδίου χιτινάσης Κλωνοποίηση και έκφραση Για την ενίσχυση του μεταλλαγμένου γονιδίου χιτινάσης και εισαγωγή των θέσεων περιορισμού σε δύο πλευρές του γονιδίου σχεδιάστηκαν δύοολιγονουκλεοτιδικοίεκκινητές, ένας forwardεκκινητής (Emr-F-Chit: 5'-ATAATCATATGGGGCGCAAATTTAATAAACC- 3', για τη θέση NdeI με ATG ως κωδικόνιο έναρξης) και έναςreverseεκκινητής (Emr-R-Chit: 5'-ATATACTCGAGATCTTTGAACGCCGGCGC-3', για τη θέση Xhol). Έπειτα, το προϊόν της PCR (1,701bp) κλωνοποιήθηκε σε ptz57r/τ και στη συνέχεια το ανασυνδυασμένοπλασμίδιο υπέστη πέψη με Ndel και Xhol και τα τμήματα περιορισμού απομονώθηκαν και προσδέθηκαν στο φορέα έκφρασης pet26b, ο οποίος έχει υποστεί πέψη με τα ίδια ένζυμα. Μία αποικία του ανασυνδυασμένουπλασμιδίου που φέρει το μεταλλαγμένο γονίδιοχιτινάσης, που έχει μετασχηματιστεί σε BL21 (DE3) στέλεχος Escherichiacoli καλλιεργήθηκε σε μέσο LB. Ως εκ τούτου η έκφραση της πρωτεΐνης προκλήθηκε με την προσθήκη 1 mmισοπροπυλο-cd-θειογαλακτοσιδάσης (IPTG) κι επιβεβαιώθηκε με ανάλυση SDS-PAGE. Η περιεκτικότητα των εκχυλισμάτων σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford [38] Ενζυμικήενεργότητα Η δραστικότητα της χιτινάσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κολλοειδή χιτίνη ως υπόστρωμα (1% w/vχιτίνης σε 20 mm φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματοςph 7,5) βάσει της τροποποιημένηςμεθόδου των Roberts και Selitrennikoffκαι συνεχίστηκε για 60 λεπτά στους 50 C. Για διακοπή της αντίδρασης,το μείγμα βράστηκε υπό την παρουσία DNS, 1%

4 w/ν 3, 5-δινιτροσαλικυλικού οξέος, (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) για 10 λεπτά. Η υδρόλυση της χιτίνης αξιολογήθηκε με την μέθοδο DNS, σύμφωνα με Miller [39] Η κινητική των φυσικού τύπου και μεταλλαγμένωνανασυνδυασμένωνχιτινασών Η μέτρηση της σταθεράςmichaelis (Km) και της μέγιστης ταχύτητας (Vmax) του ενζύμου πραγματοποιήθηκε από την συγκέντρωση υποστρώματος, που κυμαίνονται από 0 έως 50 mg/ml, και προσδιορίστηκαν με την αναπαράστασηlineweaver-burk του μοντέλου Michaelis-Menten [40]. Για τον προσδιορισμό του βέλτιστου ph, οι ενεργότητες τωνχιτινασών μετρήθηκαν σε ένα εύρος ph 3-12,χρησιμοποιώντας 50 mm ρυθμιστικούγλυκίνης-οξικού-φωσφορικού. Για τον προσδιορισμό της σταθερότητας του ενζύμου, τα ένζυμα επωάστηκαν σε διάφορα επίπεδα ph χωρίς υπόστρωμα για 90 λεπτά, διαδικασία που ακολουθήθηκε από ανάλυσητου ενζύμου σε βέλτιστο ph. Για τον προσδιορισμό της βέλτιστης θερμοκρασίας, επωάστηκε το μείγμα του ενζύμου με 1% w/ν κολλοειδούςχιτίνης ως υπόστρωμα,σε10-90 C σε 20mM ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού (ph 6) για 45 λεπτά. έτσι διεξήχθη η πρότυπη δοκιμασία Θερμική σταθερότητα Η θερμική σταθερότητα μετρήθηκε με δύο μεθόδους: (1) Μέτρηση της θερμικής σταθερότητας σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Γι αυτό το σκοπό, χιτινάσεςεπωάστηκαν σε διαφορετικές θερμοκρασίες που κυμαίνονταναπό 50 έως 90 C για 90 min,. Στη συνέχεια, κολλοειδής χιτίνη προστέθηκε και η δοκιμασία του ενζύμου έγινε στους 50 C (βέλτιστη θερμοκρασία). (2) Μέτρηση της θερμικής σταθερότητας σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. Δύο θερμοκρασίες (50 και 60 C) επιλέχθηκαν και τα ένζυμα επωάστηκαν σε αυτές. Κάθε 20 λεπτά (μέχρι 120 λεπτά) δείγματα τοποθετήθηκαν σε πάγο για 30 λεπτά. Στη συνέχεια προστέθηκε κολλοειδής χιτίνη και η δοκιμασία του ενζύμου έγινε στους 50 C (βέλτιστη θερμοκρασία). 3. Αποτελέσματα 3.1. Ομόλογη μοντελοποίηση και επικύρωση δομής Εδώ επιζητήθηκε να μελετηθούν οι επιπτώσεις της μείωσης του μήκους του βρόχου και της αύξησης του μήκους του βήτα-φύλλου στη θερμική σταθερότητα της χιτινάσης τουserratiamarcescensb4a(αριθμός ένταξης HM473183). Γι αυτό το σκοπό, αρχικά, βρέθηκαν κατάλοιπα που τοποθετήθηκαν στο βρόχο που κατέληγε σε βήτα-φύλλο. Αλλά ήταν επιθυμητό να επιλεχθεί μία μετάλλαξη που ήταν κατάλληλη για να είναι συμβατή με τη δομή και επίσηςήταν απαραίτητο να επιλεχθεί μετάλλαξη που ήταν κατάλληληγια τη σταθεροποίηση της πρωτεΐνης μεταξύ όλων των αναμενόμενων μεταλλάξεων.για να εκτιμηθεί η μεταβολή της σταθερότητας της πρωτεΐνης μετά τις μεταλλάξεις,μετρήθηκε η θερμοδυναμική σταθερότητα (ΔΔΟ) χρησιμοποιώντας ευέλικτη και σταθερή μέθοδο κορμού από το Erisserver [41] και επελέγη η μετάλλαξη η οποία είχε κατάλληλο ΔΔΟ. Επιπλέον, είναι ιδανική για τον έλεγχοτης θέσης μετάλλαξης αυτή η αυτοματοποιημένη ιστοσελίδα: τους λόγους που εξηγήθηκαν παραπάνω, στο επίκεντρο ήτανη αντικατάσταση της σερίνης 390 με ισολευκίνη που είχαν 2,18 ΔΔΟ kcal / mol. Επίσης, με τη μελέτη της δομής χιτινάσης παρατηρήθηκε ότι τοκατάλοιποσερίνης 390, το οποίο υπήρχε στο βρόχο, αλλάζοντας σε ισολευκίνη μετατοπίστηκε σε βήτα-φύλλο. Επομένως,για το προσδιορισμό τηςθέσης τηςμετάλλαξης, η ομόλογη μοντελοποίηση διεξήχθη για να προβλέψουμε τις 3D δομές (ανοιχτή μορφή) της φυσικής και της μεταλλαγμένης χιτινάσης. Η αλληλουχία αμινοξέων της χιτινάσης ανακτήθηκε από τη βάση

5 δεδομένων NCBI, που χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο σε αναζήτηση BLASTP έναντιpdb, για να βρεθούν τα κατάλληλα πρότυπα για ομόλογη μοντελοποίηση. Με βάση την ταύτιση αλληλουχίας μεταξύ της πρωτεΐνης ερωτήσεως και της πρότυπης πρωτεϊνικής αλληλουχίας, ο αριθμός PDB του 1edq_A με 99% ταύτισηαναγνωρίστηκε για την πρόγνωση της ανοιχτής μορφής και των δυο χιτινασών. Στη συνέχεια, το καλύτερο μοντέλο δομής της φυσικής και μεταλλαγμένης χιτινάσης συλλέχθηκε και η 3D δομή τους βελτιστοποιήθηκε, χρησιμοποιώντας το MODELLER v9.10. Η οπτικοποίησή τους έγινε με τη χρήση του λογισμικού VMD. Η δομή που προέκυψε από το MODELLERv9.10 αξιολογήθηκε περαιτέρω με γραφική παράσταση του Ramachandran που δημιουργήθηκε από το Procheck, Qmean server, PROSA-web, root-mean-square deviation (RMSD), PROSA κι οι Qmean βαθμολογίες για το μετάλλαγμα χιτινάσης βρέθηκαν να είναι -9,75 και ( Z- score = 0,88), αντίστοιχα.για την ενδογενή χιτινάση βρέθηκαν -9,56 και 0,84 (Ζ-score = 0,91), αντίστοιχα. Ο χάρτης Ramachandranτης μεταλλαγμένης χιτινάσης έδειξε ότι 93,7% των αμινοξικών καταλοίπων ήταν παρόντα στην πιο ευνοϊκή περιοχή και 6,3% σε επιπλέον επιτρεπόμενες περιοχές. Από τα παραπάνω αποτελέσματα, είναι κατανοητό ότι το μοντελοποιημένο μετάλλαγμα της χιτινάσης έχει καλή ποιότητα. Επιπλέον, η RMSD των ατόμων Ca μεταξύ του πρότυπου και του μοντέλου (μετάλλαγμα χιτινάσης) μετρήθηκε μετά την υπέρθεση και των δύο χιτινασών. Μια RMSD με 2.9 Å βρέθηκε μεταξύ του μοντέλου και των πρότυπων δομών. Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι οι δομές του μεταλλάγματος και του προτύπου είναι παρόμοιες και το μοντέλο ομολογίας είναι αξιόπιστο Μεταλλαξιγένεση και Έκφραση Μετά τη μεταλλαξογένεση με τη στρατηγική QCSDM, η ορθή μετάλλαξη επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας DNA. Στη συνέχεια το μεταλλαγμένο γονίδιο χιτινάσης υποκλωνοποιήθηκε σε φορέα έκφρασης pet26b και μετά από έκφραση σε BL21 (DE3) Escherichia coliστέλεχος διερευνήθηκε με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και παρατηρήθηκε ζώνη στα 62 kd Km και Vmax Μέτρηση της σταθεράς Michaelis είχε δείξει ότι οι τιμές Km των φυσικών και μεταλλαγμένων χιτινασών ήταν 4/5 mg/ml και 4/7 mg/ml, αντιστοίχα. Η πολύ μικρή διαφοράστις τιμές Km των φυσικών και μεταλλαγμένων χιτινασών δείχνει ότι δεν έχει αλλάξει η συγγένεια του ενζύμου προς το υπόστρωμα. Η τιμή Vmax της φυσικής και μεταλλαγμένης χιτινάσης παρατηρήθηκε να είναι 588/23 Unit (μμ/λεπτό) πρωτεΐνης και 153/84Unit(μΜ/λεπτό) πρωτεΐνης, αντίστοιχα Επίδραση του ph και της θερμοκρασίας Το βέλτιστο ph για την ενεργότητα της χιτινάσης του φυσικού και του μεταλλαγμένου τύπου βρέθηκε να είναι 6 και 5 αντίστοιχα. Ωστόσο, τα ένζυμα ήταν σταθερά μεταξύ του εύρουςph 6-10 για τη φυσική και 5-10 για τη μεταλλαγμένη χιτινάση. Παρατηρήθηκε ότι η βέλτιστη θερμοκρασία για την ενζυμική δραστικότητα της φυσικής και της μεταλλαγμένης χιτινάσηςείναι 50 C και 45 C αντίστοιχα Θερμική σταθερότητα Η θερμική σταθερότητα των χιτινασών μετρήθηκε σε διαφορετικές θερμοκρασίες και παρατηρήθηκε ότι η δραστικότητα και των δύο χιτινασών μειώθηκε με την αύξηση της θερμοκρασίας, αλλά η δραστικότητα της φυσικής χιτινάσης μειώθηκε πολύ γρήγορα και η δράση της σταμάτησε στους 70 C, ενώ η σχετική δραστικότητα της μεταλλαγμένης χιτινάσης ήταν περίπου 20%. Η μέτρηση της θερμικής σταθερότητας στο πέρασμα του

6 χρόνου έδειξε ότι η δραστικότητα του φυσικού ενζύμου στους 50 και 60 C μειώθηκε, αλλά η δραστικότητα της μεταλλαγμένης χιτινάσης αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου. 4. Συζήτηση Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ξεκάθαρα ότι οι πρωτεΐνες είναι κινητικά σταθερότερες όταν ακολουθείται ο ορθολογιστικός σχεδιασμός, αλλά είναι δύσκολο να εξακριβωθούν η περιοχή και τα αμινοξέα που πρέπει να ληφθούν υπ' όψη. Μια κοινή στρατηγική για την αύξηση της θερμικής τους σταθερότητας είναι η μείωση των εκτεθειμένων βρόχων, η οποία οδηγεί σε μείωση της εντροπίας και αύξηση της ελεύθερης ενέργειας της πρωτεϊνικής αποσυσπείρωσης [43]. Επιπλέον, άλλες έρευνες έχουν δείξει την αυξημένη αναλογία αμινοξέων β-πτυχωτών επιφανειών [51] σε θερμόφιλους οργανισμούς. Το αποτέλεσμα αυτό ίσως αποκτάται μέσω της ενίσχυσης των δεσμών Η, η οποία λογικά οδηγεί σε αυξημένη θερμική σταθερότητα. Στην παρούσα μελέτη επιδιώχθηκε να σταθεροποιηθεί η χιτινάση με ταυτόχρονη μείωση μήκους του βρόχου και αύξηση μήκους της β-πτυχωτής επιφάνειας. Για τις ανάγκες αυτού του στόχου, ορίστηκε ότι τα αμινοξέα που βρίσκονται στα άκρα του βρόχου και του β- φύλλου και σε πιθανές υποψήφιες θέσεις δεν έχουν δυσμενείς στερικές αλληλεπιδράσεις. Οι έρευνες έδειξαν επίσης ότι για την αύξηση της θερμικής σταθερότητας είναι απαραίτητη η μείωση του αριθμού των πολικών μη φορτισμένων αμινοξέων. Επίσης, η απαλοιφή αυτών των καταλοίπων μπορεί να ελαχιστοποιήσει την απαμίνωση των Asp και Gln από Ser και Thr σε υψηλές θερμοκρασίες. Η Ser, λόγω του μικρού μήκους της πλάγιας αλυσίδας της, εμπλέκεται σε τοπικές αλληλεπιδράσεις αλλά τα μακράς αλυσίδας αμινοξέα συμβάλλουν σε επιδράσεις μικρού και μέτριου εύρους [44].Επελέγη λοιπόν η Ser 390 στο τέλος του βρόχου και η αντικατάστασή της έγινε με Ile, για ποικίλου λόγους. Η Ile έχει την τάση να τοποθετείται σε β-φύλλο, με αποτέλεσμα τη μείωση του βρόχου και την επιμήκυνση του β- φύλλου, ενώ η αύξηση της υδροφοβικότητας συμβάλλει ακόμα περισσότερο στη θερμική σταθερότητα της πρωτεΐνης. Ακόμα, η εντροπία της αποπτύχωσης εξαρτάται από το είδος της πλευρικής αλυσίδας. Για παράδειγμα, σ αυτή την περίπτωση, η ευελιξία του επιλεγμένου βρόχου μειώνεται από την παρουσία μακριών ή ογκωδών πλευρικών αλυσίδων [45]. Επίσης, μελέτες έδειξαν ότι ένα πολικό μη φορτισμένο κατάλοιπο είναι λιγότερο προτιμητέο σε μια θερμοσταθερή πρωτεΐνη σε σχέση με ένα μη πολικό. Οι μελέτες έδειξαν ότι η μεταλλαγμένη χιτινάση συσπειρωνόταν κι η ενεργότητά της ήταν χρονο- και θερμο-εξαρτώμενη. Κινητικές μελέτες της φυσικής και της μεταλλαγμένης μορφής έδειξαν ότι η μεταλλαγμένη έχει μεγαλύτερη ενεργότητα από τον άγριο τύπο καθώς οι συνθήκες του πειράματος επηρέασαν αρνητικά την πρωτότυπη πρωτεΐνη ενώ ωφέλησαν τη μεταλλαγμένη αυξάνοντας την ευκαμψία της κι εκθέτοντας περισσότερο το ενεργό της κέντρο. Αν και η τροποποίηση της θέσης πρόσδεσης του ενζύμου μπορεί να αυξήσει την Km [46], εδώ η μετατροπή δεν επηρέασε τη συγγένεια της μεταλλαγμένης χιτινάσης προς το υπόστρωμά της. Η Vmax βρέθηκε χαμηλότερη αλλά αυτό οφείλεται πιθανότατα στο ότι οι μετρήσεις έγιναν σε συνθήκες ρουτίνας, στις οποίες η μεταλλαγμένη μορφή είναι άκαμπτη, κάτι που μειώνει τη δραστικότητά της. Μελέτες έδειξαν ακόμα ότι υπάρχει σχέση ανάμεσα στη θερμική σταθερότητα και τη βέλτιστη θερμοκρασία λειτουργίας [47,48]. Η επίδραση πάντως της αύξησης της διαμορφωτικής ακαμψίας οδηγεί σε θερμο-σταθερά ένζυμα, αλλά η σχέση ευκαμψίας, σταθερότητας και λειτουργικότητας ενός ενζύμου δεν έχει ακόμα αποσαφηνιστεί [49]. Η θερμοκρασία βέλτιστης λειτουργίας σε ορισμένα μηχανικά θερμο-σταθεροποιημένα ένζυμα αυξάνεται και σε άλλα παραμένει σταθερή [50]. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, δεν άλλαξε, όπως δεν άλλαξε κι η τιμή του ιδανικού ph, κάτι που δείχνει ότι η μετάλλαξη δε μετέβαλλε τα βασικά χαρακτηριστικά του ενζύμου. Αυξήθηκε όμως θεαματικά η θερμική σταθερότητα της χιτινάσης, ενώ η σταθερότητα του ph δεν άλλαξε. Το μεταλλαγμένο ένζυμο αντέχει σε θερμοκρασίες 90 C ενώ λειτουργεί στους 50 C και στους 60 C χωρίς πρόβλημα

7 για 2h, χαρακτηριστικά που είναι πολύ σημαντικά σε βιομηχανικές και βιοτεχνολογικές εφαρμογές. 5. Συμπέρασμα Οι θερμοσταθερές πρωτεΐνες μπορούν να προκύψουν με μεθόδους πρωτεϊνικής μηχανικής. Η πειραματική προσέγγιση για την αύξηση της σταθερότητας περιλαμβάνει συχνά κατευθυνόμενη από θέση μεταλλαξογένεση (site directed mutagenesis) και την αντικατάσταση ορισμένων αμινοξέων για την τροποποίηση ήδη υπαρχουσών πρωτεϊνών. Στο παρόν πρόγραμμα χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος QCSDM για τη θερμική σταθεροποίηση μιας χιτινάσης του βακτήριου SerratiamarcescensBA4 [52]{gram-(-) βακτήριο της οικ. Enterobacteriaceae} το οποίο είναι δραστικό ενάντια σε κοινούς φυτοπαθογόνους μύκητες. Μελετήθηκε η επίδραση της βράχυνσης του βρόχου και της επιμήκυνσης του β-φύλλου στη θερμο-σταθερότητα. Για το σκοπό αυτό, επελέγη η αντικατάσταση της Ser 390 που βρίσκεται στην άκρη του βρόχου με Ile. Συνέπειες της αλλαγής αυτής ήταν η μείωση του μήκους και της εντροπίας του βρόχου, η αντικατάσταση ενός πολικού μη φορτισμένου αμινοξικού κατάλοιπου με μη πολικό, η αύξηση της υδροφοβικότητας και η αύξηση του μήκους της β- πτυχωτής επιφάνειας. Με μέτρηση της θερμικής σταθερότητας σε διάφορες θερμοκρασίες βρέθηκε ότι, αν και η δραστικότητα και των δύο χιτινασών μειώνεται με την αύξηση της θερμοκρασίας, η μείωση αυτή είναι απότομη στην περίπτωση του άγριου τύπου, ο οποίος αδρανοποιείται στους 70 C, ενώ ο μεταλλαγμένος στην ίδια θερμοκρασία διατηρεί το 20% της δραστικότητάς του. Επιπρόσθετα, η δραστικότητα της πρωτότυπης χιτινάσης μειώνεται στους 50 κι 60 C, ενώ η δραστικότητα της μεταλλαγμένης αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η παρούσα έρευνα υποστηρίχθηκε από το Ινστιτούτο Γενετικής Μηχανικής και Βιοτεχνολογίας (NIGEB) (Ιράν-Τεχεράνη) και την εταιρία Denazist Company (Iran-Mashhad). Βιβλιογραφία [1] R.S. Patil, V. Ghormade, M.V. Deshpande, Chitinolytic enzymes: an exploration, Enzyme and Microbial Technology, 26 (2000) [2] N. Annamalai, M.V. Rajeswari, S. Vijayalakshmi, T. Balasubramanian, Purification and 4 characterization of chitinase from Alcaligenes faecalis AU02 by utilizing marine wastes and its antioxidant activity, Annals of microbiology, 61 (2011) [3] X.-W. Wang, C.-L. Cai, J.-M. Xu, H. Jin, Z.-Y. Xu, Increased expression of chitinase 3-like 1 is a prognosis marker for non-small cell lung cancer correlated with tumor angiogenesis, Tumor Biology, 36 8 (2015) [4] J.-L. Xia, J. Xiong, R.-Y. Zhang, K.-K. Liu, B. Huang, Z.-Y. Nie, Production of Chitinase and its Optimization from a Novel Isolate Serratia marcescens XJ-01, Indian journal of microbiology, 51 (2011) [5] D. Bhattacharya, A. Nagpure, R.K. Gupta, Bacterial chitinases: properties and potential, Critical reviews in biotechnology, 27 (2007) [6] H. Tsuji, S. Nishimura, T. Inui, Y. Kado, K. Ishikawa, T. Nakamura, K. Uegaki, Kinetic and crystallographic analyses of the catalytic domain of chitinase from Pyrococcus furiosus the role of conserved residues in the active site, FEBS journal, 277 (2010) [7] A. Hector, S.H. Chotirmall, G.M. Lavelle, B. Mirković, D. Horan, L. Eichler, M. Mezger, A. Singh, A. Ralhan, S. Berenbrinker, Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease, Journal of Allergy and Clinical Immunology, (2016)

8 [8] M. Møllgaard, M. Degn, F. Sellebjerg, J. Frederiksen, S. Modvig, Cerebrospinal fluid chitinase 3 like 2 and chitotriosidase are potential prognostic biomarkers in early multiple sclerosis, European journal of neurology, 23 (2016) [9] M.A. Elmonem, L.P. van den Heuvel, E.N. Levtchenko, Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme, Enzyme Research, 2016 (2016) [10] T. Watanabe, K. Kimura, T. Sumiya, N. Nikaidou, K. Suzuki, M. Suzuki, M. Taiyoji, S. Ferrer, M.Regue, Genetic analysis of the chitinase system of Serratia marcescens 2170, Journal of bacteriology, (1997) [11] A. Bjørk, B. Dalhus, D. Mantzilas, V.G. Eijsink, R. Sirevåg, Stabilization of a tetrameric malate dehydrogenase by introduction of a disulfide bridge at the dimer dimer interface, Journal of molecular biology, 334 (2003) [12] L. Giver, A. Gershenson, P.-O. Freskgard, F.H. Arnold, Directed evolution of a thermostable esterase, Proceedings of the National Academy of Sciences, 95 (1998) [13] J. Khurana, R. Singh, J. Kaur, Engineering of Bacillus lipase by directed evolution for enhanced thermal stability: effect of isoleucine to threonine mutation at protein surface, Molecular biology reports, 38 (2011) [14] A.C. Zees, S. Pyrpassopoulos, C.E. Vorgias, Insights into the role of the (α+ β) insertion in the TIM-barrel catalytic domain, regarding the stability and the enzymatic activity of Chitinase A from Serratia marcescens, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 1794 (2009)23-31 [15] V.G. Eijsink, A. Bjørk, S. Gåseidnes, R. Sirevåg, B. Synstad, B. van den Burg, G. Vriend, Rational engineering of enzyme stability, Journal of Biotechnology, 113 (2004) [16] B.W. Matthews, Studies on protein stability with T4 lysozyme, Advances in protein chemistry, 46(1994) [17] C. Vieille, G.J. Zeikus, Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 65 (2001) 1-43 [18] V. Mozhaev, K. Martinek, Structure-stability relationships in proteins: new approaches to stabilizing enzymes, Enzyme and Microbial Technology, 6 (1984) [19] P. Haney, J. Konisky, K. Koretke, Z. Luthey-Schulten, P. Wolynes, Structural basis for thermostability and identification of potential active site residues for adenylate kinases from the archaeal genus Methanococcus, Proteins Structure Function and Genetics, 28 (1997) [20] S. Kumar, C.-J. Tsai, R. Nussinov, Factors enhancing protein thermostability, Protein engineering, 13 (2000) [21] R.J. Russell, J.M. Ferguson, D.W. Hough, M.J. Danson, G.L. Taylor, The crystal structure of citrate synthase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus at 1.9 Å resolution, Biochemistry, 36(1997) [22] T. Salminen, A. Teplyakov, J. Kankare, B.S. Cooperman, R. Lahti, A. Goldman, An unusual route to thermostability disclosed by the comparison of Thermus thermophilus and Escherichia coli inorganic pyrophosphatases, Protein Science, 5 (1996) [23] R.J. Russell, U. Gerike, M.J. Danson, D.W. Hough, G.L. Taylor, Structural adaptations of the coldactive citrate synthase from an Antarctic bacterium, Structure, 6 (1998) [24] O. Bogin, M. Peretz, Y. Hacham, Y. Burstein, Y. Korkhin, F. Frolow, Enhanced thermal stability of Clostridium beijerinckii alcohol dehydrogenase after strategic substitution of amino acid residues with prolines from the homologous thermophilic Thermoanaerobacter brockii alcohol dehydrogenase, Protein science, 7 (1998) [25] G. Vogt, P. Argos, Protein thermal stability: hydrogen bonds or internal packing?, Folding and Design, 2 (1997) S40-S46

9 [26] P.J. Haney, J.H. Badger, G.L. Buldak, C.I. Reich, C.R. Woese, G.J. Olsen, Thermal adaptation analyzed by comparison of protein sequences from mesophilic and extremely thermophilic Methanococcus species, Proceedings of the National Academy of Sciences, 96 (1999) [27] P.A. Fields, Review: Protein function at thermal extremes: balancing stability and flexibility Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 129 (2001) [28] S. Chakravarty, R. Varadarajan, Elucidation of determinants of protein stability through genome sequence analysis, Febs Letters, 470 (2000) [29] S. Babashpour, S. Aminzadeh, N. Farrokhi, A. Karkhane, K. Haghbeen, Characterization of a chitinase (Chit62) from Serratia marcescens B4A and its efficacy as a bioshield against plant fungal pathogens, Biochemical genetics, 50 (2012) [30] Y. Takiguchi, Physical properties of chitinous materials, Advances in chitin science, 3 (1991) 1-7 [31] S.F. Altschul, T.L. Madden, A.A. Schäffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, D.J. Lipman, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic acids research, 25 (1997) [32] B. Webb, A. Sali, Comparative protein structure modeling using Modeller, Current protocols in bioinformatics, (2014) [33] R.A. Laskowski, M.W. MacArthur, D.S. Moss, J.M. Thornton, PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures, Journal of applied crystallography, 26 (1993) [34] P. Benkert, S.C. Tosatto, D. Schomburg, QMEAN: A comprehensive scoring function for model quality assessment, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 71 (2008) [35] M. Wiederstein, M.J. Sippl, ProSA-web: interactive web service for the recognition of errors in three-dimensional structures of proteins, Nucleic acids research, 35 (2007) W407-W410 [36] W. Humphrey, A. Dalke, K. Schulten, VMD: visual molecular dynamics, Journal of molecular graphics, 14 (1996) [37] M. Zarei, S. Aminzadeh, A. Ghoroghi, A. Motalebi, J. Alikhajeh, M. Daliri, Chitinase isolated from water and soil bacteria in shrimp farming ponds, Iranian Journal of Fisheries Sciences, 11 (2012) [38] M.M. Bradford, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analytical biochemistry, 72 (1976) [39] G.L. Miller, Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Analytical chemistry, 31 (1959) [40] H. Lineweaver, D. Burk, The determination of enzyme dissociation constants, Journal of the American Chemical Society, 56 (1934) [41] S. Yin, F. Ding, N.V. Dokholyan, Eris: an automated estimator of protein stability, Nature methods, 4 (2007) [42] L. Zheng, U. Baumann, J.-L. Reymond, An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol, Nucleic acids research, 32 (2004) e115-e115 [43] M.J. Thompson, D. Eisenberg, Transproteomic evidence of a loop-deletion mechanism for enhancing protein thermostability, Journal of molecular biology, 290 (1999) [44] D. Hornby, Hydrogen bonding in biological structures, Wiley Online Library, 1993 [45] G. Némethy, S. Leach, H.A. Scheraga, The Influence of Amino Acid Side Chains on the Free Energy of Helix-Coil Transitions1, The Journal of Physical Chemistry, 70 (1966) [46] P.A. Fields, G.N. Somero, Hot spots in cold adaptation: localized increases in conformational flexibility in lactate dehydrogenase A4 orthologs of Antarctic notothenioid fishes, Proceedings of the National Academy of Sciences, 95 (1998)

10 [47] M.J. Danson, D.W. Hough, R.J. Russell, G.L. Taylor, L. Pearl, Enzyme thermostability and thermoactivity, Protein engineering, 9 (1996) [48] R.M. Daniel, M.J. Danson, R. Eisenthal, The temperature optima of enzymes: a new perspective on an old phenomenon, Trends in biochemical sciences, 26 (2001) [49] Z. Amini-Bayat, S. Hosseinkhani, R. Jafari, K. Khajeh, Relationship between stability and flexibility in the most flexible region of Photinus pyralis luciferase, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 1824 (2012) [50] M.T. THOMAS, K.R. SCOPES, The effects of temperature on the kinetics and stability of mesophilic and thermophilic 3-phosphoglycerate kinases, Biochemical Journal, 330 (1998) [51] Μεγάλα αρωματικά αμινοξέα (Tyr, Phe, Trp) και αμινοξέα με βc (Thr,Val, Ile) βρίσκονται στη μέση των β-πτυχών. Διαφορετικά αμινοξέα (πχ Pro) υπάρχουν στις άκρες, ίσως για την αποφυγή συσχετισμού άκρου με άκρο το οποίο θα μπορούσε να οδηγήσει σε συσσωμάτωση και σχηματισμό αμυλοειδούς.