BD Mueller Hinton II Agar BD Mueller Hinton II Agar 150 mm BD Mueller Hinton II Agar, Square

Transcript

1 ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ΕΤΟΙΜΑ ΠΡΟΣ ΧΡΗΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΣΕ ΤΡΥΒΛΙΑ PA Αναθ.: Φεβρουάριος 2017 BD Mueller Hinton II Agar BD Mueller Hinton II Agar 150 mm BD Mueller Hinton II Agar, Square ΧΡΗΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΠΡΟΟΡΙΖΟΝΤΑΙ Το BD Mueller Hinton II Agar, το οποίο διατίθεται σε διάφορες μορφές τρυβλίων, χρησιμοποιείται στην τυποποιημένη διαδικασία διάχυσης σε δίσκο για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας κλινικών απομονωμένων στελεχών ταχέως αναπτυσσόμενων αερόβιων μικροοργανισμών σε αντιμικροβιακούς παράγοντες, όπως έχει τυποποιηθεί από το Ινστιτούτο Κλινικών και Εργαστηριακών Προτύπων (Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI) και την Ευρωπαϊκή Επιτροπή για τον Αντιμικροβιακό Έλεγχο Ευαισθησίας (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing EUCAST). 1,2 ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Μικροβιολογική μέθοδος. Οι Bauer, Kirby και άλλοι ανέπτυξαν μια τυποποιημένη διαδικασία κατά την οποία το Mueller Hinton Agar, ένα υλικό καλλιέργειας που επινοήθηκε αρχικά για την απομόνωση γονόκοκκων, επιλέχθηκε ως το υλικό εξέτασης, δεδομένου ότι τα κλινικά μικροβιολογικά εργαστήρια στις αρχές της δεκαετίας του 1960 χρησιμοποιούσαν μεγάλη ποικιλία διαδικασιών για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας βακτηριδίων σε αντιβιοτικούς και χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. 1-5 Μεταγενέστερη διεθνής μελέτη συνεργασίας επιβεβαίωσε την αξία του Mueller Hinton Agar για αυτόν τον σκοπό λόγω της σχετικά καλής επαναληψιμότητας του υλικού, της απλότητας στη σύνθεσή του και του πλήθους πειραματικών δεδομένων που είχαν συγκεντρωθεί με τη χρήση αυτού του υλικού. 6 Το CLSI και η EUCAST έχουν εκδώσει πρότυπα απόδοσης για τη διαδικασία Bauer-Kirby και θα πρέπει να συμβουλεύεστε τα έγγραφα αυτών των προτύπων για λεπτομέρειες. 7,8 Έχουν αναπτυχθεί και άλλα εθνικά πρότυπα για την εξέταση ευαισθησίας σε αντιμικροβιακούς παράγοντες σύμφωνα με τη διαδικασία Bauer-Kirby. Στα πρότυπα αυτά, οι πυκνότητες του ενοφθαλμίσματος, η μέθοδος ενοφθαλμισμού, τα μεγέθη των ζωνών που προκύπτουν και ο τρόπος ερμηνείας ενδέχεται να διαφέρουν από τις συστάσεις του CLSI και της EUCAST. Η διαδικασία Bauer-Kirby βασίζεται στη διάχυση μέσω πηκτής άγαρ αντιμικροβιακών ουσιών, οι οποίες είναι διαποτισμένες σε χάρτινους δίσκους. 9 Σε αντίθεση με προηγούμενες μεθόδους οι οποίες χρησιμοποιούσαν δίσκους υψηλής και χαμηλής αντιμικροβιακής συγκέντρωσης και χρησιμοποιούσαν την παρουσία ή την απουσία ζωνών αναστολής για την ερμηνεία τους, αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί δίσκους με μία μόνο συγκέντρωση αντιμικροβιακού παράγοντα και οι διάμετροι των ζωνών συσχετίζονται με ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις (MIC). 1-3,7-9 Στη διαδικασία της εξέτασης, ένα τυποποιημένο εναιώρημα του μικροοργανισμού επιστρώνεται με στυλεό πάνω σε ολόκληρη την επιφάνεια του υλικού καλλιέργειας. Στη συνέχεια, τοποθετούνται χάρτινοι δίσκοι, διαποτισμένοι με καθορισμένες ποσότητες αντιβιοτικού ή άλλων αντιμικροβιακών παραγόντων, στην επιφάνεια του υλικού καλλιέργειας, επωάζεται το τρυβλίο και μετρώνται οι ζώνες αναστολής γύρω από κάθε δίσκο. Η ερμηνεία του κατά πόσον ο μικροοργανισμός είναι ευαίσθητος (S), ενδιάμεσης ανθεκτικότητας (I) ή ανθεκτικός (R) σε έναν παράγοντα γίνεται με τη σύγκριση των μεγεθών των ζωνών με τα μεγέθη που αναφέρονται στους πίνακες 2A έως 2D του εγγράφου Document M100 (M2) του CLSI. 10 Η ερμηνεία του κατά πόσον ο μικροοργανισμός είναι ευαίσθητος (S) ή ανθεκτικός (R) σε έναν παράγοντα γίνεται με τη σύγκριση των μεγεθών των ζωνών που έχουν προκύψει με τα μεγέθη που αναφέρονται στους πίνακες των ορίων ευαισθησίας (breakpoint) της EUCAST. 11 PA Σελίδα 1 από 11

2 Έχουν αναγνωριστεί διάφοροι παράγοντες που επηρεάζουν τις εξετάσεις ευαισθησίας με διάχυση σε δίσκο. Αυτοί περιλαμβάνουν το υλικό καλλιέργειας, την περίσσεια επιφανειακής υγρασίας του υλικού καλλιέργειας, το βάθος του άγαρ, την ισχύ του δίσκου, τη συγκέντρωση του ενοφθαλμίσματος, το ph και την παραγωγή β-λακταμάσης από τους μικροοργανισμούς εξέτασης. 6-9,12 Το BD Mueller Hinton II Agar παρασκευάζεται έτσι ώστε να περιέχει χαμηλά επίπεδα θυμίνης και θυμιδίνης και ελεγχόμενα επίπεδα ασβεστίου και μαγνησίου Τα επίπεδα θυμίνης και θυμιδίνης των πρωτογενών υλικών προσδιορίζονται με τη χρήση της διαδικασίας διάχυσης σε δίσκο με δίσκους τριμεθοπρίνης- σουλφαμεθοξαζόλης (SXT) και το Enterococcus faecalis ATCC TM Τα επίπεδα ασβεστίου και μαγνησίου ελέγχονται μέσω της εξέτασης των πρωτογενών υλικών και της συμπλήρωσης με πηγές ασβεστίου ή/και μαγνησίου όπως απαιτείται για την παραγωγή σωστών διαμέτρων ζώνης με αμινογλυκοζιδικά αντιβιοτικά και το Pseudomonas aeruginosa ATCC Το βάθος του άγαρ για κάθε μορφή τρυβλίου BD Mueller Hinton II Agar προσαρμόστηκε ώστε να πληροί τις συστάσεις τόσο του CLSI όσο και της EUCAST. 7,8 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ BD Mueller Hinton II Agar Σύνθεση* ανά λίτρο κεκαθαρμένου νερού Εκχύλισμα βοείου κρέατος 2,0 g Όξινο υδρόλυμα καζεΐνης 17,5 Άμυλο 1,5 Άγαρ 17,0 ph 7,3 +/- 0,2 *Προσαρμοσμένο ή/και συμπληρωμένο όπως απαιτείται, έτσι ώστε να πληρούνται τα κριτήρια απόδοσης. ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ. Προορίζεται αποκλειστικά για επαγγελματική χρήση. Μη χρησιμοποιείτε τρυβλία που φέρουν ενδείξεις μικροβιακής μόλυνσης, αποχρωματισμού, ξηρότητας, ρωγμών ή άλλα ίχνη αλλοίωσης. Τυχόν υπερβολική συρρίκνωση αυτού του υλικού καλλιέργειας λόγω αποξήρανσης ενδέχεται να οδηγήσει σε ψευδή αποτελέσματα ευαισθησίας. Συμβουλευτείτε το έγγραφο ΓΕΝΙΚΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ σχετικά με τις ασηπτικές διαδικασίες χειρισμού, τους βιολογικούς κινδύνους και την απόρριψη του χρησιμοποιημένου προϊόντος. ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΖΩΗΣ Κατά την παραλαβή, φυλάσσετε τα τρυβλία στο σκοτάδι σε θερμοκρασία μεταξύ 2 και 8 C, στην αρχική συσκευασία τους έως τη στιγμή της χρήσης τους. Αποφύγετε την κατάψυξη και την υπερβολική θέρμανση. Τα τρυβλία είναι δυνατό να ενοφθαλμιστούν έως την ημερομηνία λήξης (δείτε την ετικέτα της συσκευασίας) και να επωαστούν στους συνιστώμενους χρόνους επώασης. Είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν τρυβλία από ανοιγμένες στοίβες των 10 τρυβλίων για μία εβδομάδα, εφόσον φυλάσσονται σε καθαρό χώρο στους 2 ως 8 C. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΧΡΗΣΤΗ Για τον ποιοτικό έλεγχο χρήστη, θα πρέπει να συμβουλεύεστε τα κατάλληλα πρότυπα του CLSI 10 και της EUCAST 18 ή, κατά περίπτωση, τα κατάλληλα εθνικά πρότυπα. Ενοφθαλμίστε αντιπροσωπευτικά δείγματα με τα ακόλουθα στελέχη σε κάθε υλικό καλλιέργειας (για λεπτομέρειες, ανατρέξτε στην ενότητα Τύποι δειγμάτων και στην ενότητα Διαδικασία της εξέτασης). Επωάστε τα τρυβλία, κατά προτίμηση σε ανεστραμμένη θέση, με βάση τη θερμοκρασία, το χρόνο και ατμοσφαιρική συνθήκη που αναγράφονται παρακάτω. Τα τρυβλία BD Mueller Hinton II Agar και οι αντιμικροβιακοί δίσκοι που χρησιμοποιούνται θα πρέπει να εξετάζονται τουλάχιστον δύο φορές την εβδομάδα για τη διασφάλιση της σωστής απόδοσης. PA Σελίδα 2 από 11

3 Πίνακας 1: Αναμενόμενα αποτελέσματα για τα εύρη διαμέτρου ζώνης αναστολής των στελεχών ποιοτικού ελέγχου σύμφωνα με το CLSI 19 και την EUCAST 20 Στέλεχος Αντιμικροβιακός παράγοντας Εύρος (mm) Επώαση Escherichia coli Αμπικιλλίνη (10 µg) CLSI: ATCC Ιμιπενέμη (10 µg) Γενταμυκίνη (10 µg) Αμικασίνη (30 µg) Κιπροφλοξασίνη (5 µg) Τριμεθοπρίμη Σουλφαμεθοξαζόλη SXT Escherichia coli ATCC Enterococcus faecalis ATCC (1,25 µg-23,75 µg) Αμοξυκιλλίνη/Κλαβουλανικό οξύ (30 µg) Αμπικιλλίνη/Σουλμπακτάμη (30 µg) Τριμεθοπρίμη- Σουλφαμεθοξαζόλη (1,25 µg-23,75 µg) Κιπροφλοξασίνη (5 µg) CLSI: CLSI: Staphylococcus aureus ATCC Τετρακυκλίνη (30 µg) Γενταμυκίνη (10 µg) CLSI: Ερυθρομυκίνη (15 µg) Κλινδαμυκίνη (2 µg) Staphylococcus aureus ATCC Τετρακυκλίνη (30 µg) Γενταμυκίνη (10 µg) CLSI: Ερυθρομυκίνη (15 µg) Κλινδαμυκίνη (2 µg) Pseudomonas aeruginosa ATCC Αζτρεονάμη (30 µg) Αμικασίνη (30 µg) CLSI: Γενταμυκίνη (10 µg) Ιμιπενέμη (10 µg) Μη ενοφθαλμισμένο Άχρωμο έως ανοικτό πορτοκαλί 1 : Αποτελέσματα για στελέχη ποιοτικού ελέγχου σύμφωνα με το CLSI και την EUCAST 2 : Αποτελέσματα για στελέχη ποιοτικού ελέγχου σύμφωνα με την EUCAST 3 : Αποτελέσματα για στελέχη ποιοτικού ελέγχου σύμφωνα με το CLSI ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Παρεχόμενα υλικά BD Mueller Hinton II Agar (παρέχεται σε αρκετές διαφορετικές μορφές τρυβλίων, δείτε την ενότητα Συσκευασία/ Διαθεσιμότητα). Μικροβιολογικά ελεγμένο. Υλικά που δεν παρέχονται 1. Σύμφωνα με το CLSI: Ζωμός ενοφθαλμίσματος σε σωληνάριο, όπως BD Trypticase TM Soy Broth (ζωμός πέψης σόγιας-καζεΐνης) ή Mueller Hinton II Broth (με ρύθμιση κατιόντων) για την παρασκευή τυπικού ενοφθαλμίσματος, και στείρος ζωμός ή αλατούχο διάλυμα για αραίωση του ενοφθαλμίσματος. 7 Σύμφωνα με την 0,9% αλατούχο διάλυμα (5 ml) για την παρασκευή πρότυπου ενοφθαλμίσματος Πρότυπο σύγκρισης θειικού βαρίου (0,5 ml 0,048 M BaCl 2 [1,175% βάρ./όγκ. BaCl 2. 2H 2 O] σε 99,5 ml 0,18 M [0,36 N] H 2 SO 4 [1% v/v]) ή 3. Φωτομετρική συσκευή για ρύθμιση της θολερότητας του εναιωρήματος ενοφθαλμίσματος, έτσι ώστε να είναι ισοδύναμη με το πρότυπο 0,5 McFarland. PA Σελίδα 3 από 11

4 4. Ως εναλλακτική λύση στα παραπάνω υλικά (1-3), είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί το BD Prompt TM Inoculation System (συσκευή ογκομετρικής παρασκευής ενοφθαλμίσματος). 7,8,25 5. Καλλιέργειες ελέγχου σύμφωνα με το CLSI: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC και ATCC 35218, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Enterococcus faecalis ATCC και Klebsiella pneumoniae ATCC Καλλιέργειες ελέγχου σύμφωνα με την Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC και ATCC 35218, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Enterococcus faecalis ATCC και ATCC 51299, Klebsiella pneumoniae ATCC και Staphylococcus aureus NCTC Χάρτινοι δίσκοι διαποτισμένοι με καθορισμένες ποσότητες αντιμικροβιακών παραγόντων, 7,8 όπως οι δίσκοι εξέτασης ευαισθησίας BD Sensi-Disc TM. 7. Συσκευή διανομής, όπως ο διανεμητής BD Sensi-Disc 6, 8 ή 12 θέσεων. Ένας κατάλληλος διανεμητής είναι επίσης διαθέσιμος για τρυβλία Mueller Hinton II Agar Square. 8. Χάρακας ή άλλη συσκευή για τη μέτρηση του μεγέθους ζώνης σε χιλιοστόμετρα. 9. Βοηθητικά υλικά καλλιέργειας, αντιδραστήρια και εργαστηριακός εξοπλισμός, όπως απαιτείται. Τύποι δειγμάτων Το προϊόν αυτό χρησιμοποιείται για την εξέταση της ευαισθησίας καθαρών καλλιεργειών που έχουν απομονωθεί από κλινικά δείγματα (δείτε επίσης την ενότητα ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ). Έχει προταθεί να πραγματοποιείται απευθείας εξέταση ελέγχου ευαισθησίας στα αντιβιοτικά σε καλλιέργειες αίματος και καλλιέργειες ούρων, ωστόσο οι εξετάσεις θα πρέπει να επαναλαμβάνονται και να επιβεβαιώνονται με καθαρές καλλιέργειες Διαδικασία της εξέτασης Η μεθοδολογία αυτή περιγράφει την άμεση μέθοδο εναιωρήματος αποικιών όπως συνιστάται από το CLSI 7 και την EUCAST 8 : 1. Διασφαλίστε ότι υπάρχει διαθέσιμη μια καθαρή, φρέσκια (=ολονύκτια) καλλιέργεια από ένα μη εκλεκτικό υλικό καλλιέργειας όπως αιματούχο άγαρ. Σύμφωνα με το CLSI: Για εξετάσεις ευαισθησίας ρουτίνας, η προετοιμασία του ενοφθαλμίσματος μπορεί να γίνει μέσω άμεσου εναιωρήματος αλατούχου διαλύματος ή ζωμού από αποικίες. Σύμφωνα με την Για εξετάσεις ευαισθησίας ρουτίνας, η προετοιμασία του ενοφθαλμίσματος μπορεί να γίνει μέσω άμεσου εναιωρήματος αλατούχου διαλύματος από μορφολογικά παρόμοιες αποικίες. 2. Ρυθμίστε αμέσως τη θολερότητα αυτού του εναιωρήματος σύμφωνα με τα πρότυπα θειικού βαρίου McFarland 0,5 χωρίς επώαση. Για να συγκρίνετε τη θολερότητα του προτύπου με εκείνη του ενοφθαλμίσματος, κρατήστε και τα δύο σωληνάρια εμπρός από ένα λευκό φόντο με λεπτά σχηματισμένες μαύρες γραμμές ή χρησιμοποιήστε μια φωτομετρική συσκευή. 3. Εναλλακτικές μέθοδοι παρασκευής ενοφθαλμίσματος με συσκευές που επιτρέπουν την άμεση τυποποίηση των ενοφθαλμισμάτων χωρίς προσαρμογή της θολερότητας, όπως το BD Prompt Inoculation System, έχει διαπιστωθεί ότι είναι αποδεκτές για σκοπούς εξέτασης ρουτίνας Χρησιμοποιήστε το εναιώρημα βέλτιστα εντός 15 λεπτών. Πρέπει πάντα να χρησιμοποιείται εντός 60 λεπτών από την παρασκευή του. Εμβαπτίστε έναν στείρο στυλεό στο κατάλληλα αραιωμένο ενοφθάλμισμα και περιστρέψτε τον αρκετές φορές πιέζοντας με δύναμη επάνω στο άνω εσωτερικό τοίχωμα του σωληναρίου, έτσι ώστε να εκπιέσετε την περίσσεια υγρού και να αποφύγετε τον υπερ-ενοφθαλμισμό. 5. Ενοφθαλμίστε ολόκληρη την επιφάνεια άγαρ του τρυβλίου τρεις φορές, περιστρέφοντας το τρυβλίο 60 μεταξύ επιστρώσεων ώστε να προκύψει ομοιογενής ενοφθαλμισμός. PA Σελίδα 4 από 11

5 6. Σύμφωνα με το CLSI: Το καπάκι μπορεί να αφεθεί μισάνοιχτο επί 3 έως 5 λεπτά και το τρυβλίο να διατηρηθεί σε θερμοκρασία δωματίου για διάστημα όχι μεγαλύτερο από 15 λεπτά, έτσι ώστε να επιτρέπεται η απορρόφηση τυχόν επιφανειακής υγρασίας πριν από την εφαρμογή των διαποτισμένων με αντιμικροβιακό παράγοντα δίσκων. Εφαρμόστε τους δίσκους με τη βοήθεια διανεμητή αντιμικροβιακού δίσκου, χρησιμοποιώντας άσηπτες προφυλάξεις. Εναποθέστε τους δίσκους έτσι ώστε τα κέντρα να απέχουν μεταξύ τους τουλάχιστον 24 mm. Σύμφωνα με την Εφαρμόστε τους δίσκους στο στεγνό τρυβλίο εντός 15 λεπτών από τον ενοφθαλμισμό χρησιμοποιώντας άσηπτες προφυλάξεις. Εναποθέστε έναν μέγιστο αριθμό έξι δίσκων στο τρυβλίο. 7. Αφού τοποθετηθούν οι δίσκοι στο άγαρ, πιέστε τους με μια στείρα βελόνα ή λαβίδα έτσι ώστε να έρθουν σε πλήρη επαφή με την επιφάνεια του υλικού. Το βήμα αυτό δεν είναι απαραίτητο εάν οι δίσκοι εναποτίθενται χρησιμοποιώντας διανεμητές αυτοσυμπίεσης BD Sensi-Disc. 8. Εντός 15 λεπτών μετά την εφαρμογή των δίσκων, αναστρέψτε τα τρυβλία και τοποθετήστε τα στο θάλαμο επώασης. Τα τρυβλία δεν πρέπει να επωάζονται υπό αυξημένη συγκέντρωση διοξειδίου του άνθρακα. Για τις συνιστώμενες συνθήκες επώασης, ανατρέξτε στις συστάσεις του CLSI και της EUCAST. 7,8,10,11 Ανάγνωση αποτελεσμάτων 1. Μετά την επώαση, θα πρέπει να είναι ορατός συρρέων «χλοοτάπητας» ανάπτυξης. Εάν έχουν αναπτυχθεί μόνον απομονωμένες αποικίες, το ενοφθάλμισμα ήταν υπερβολικά αραιό και η εξέταση θα πρέπει να επαναληφθεί. 2. Σύμφωνα με το CLSI: Μετρήστε τη διάμετρο των ζωνών πλήρους αναστολής (όπως κρίνεται με γυμνό οφθαλμό), συμπεριλαμβανομένης της διαμέτρου του δίσκου, με ακρίβεια χιλιοστού, με χρήση συρόμενου διαβήτη, χάρακα ή υποδείγματος που έχετε κατασκευάσει για αυτόν το σκοπό. Η συσκευή μέτρησης πρέπει να συγκρατείται στο κάτω μέρος του ανεστραμμένου τρυβλίου επάνω από μαύρο φόντο χωρίς αντανάκλαση, με άνωθεν φωτισμό. 7 Σύμφωνα με την Μετρήστε τη διάμετρο των ζωνών πλήρους αναστολής (όπως κρίνεται με γυμνό οφθαλμό), συμπεριλαμβανομένης της διαμέτρου του δίσκου, με ακρίβεια χιλιοστού, με χρήση συρόμενου διαβήτη ή χάρακα. Η συσκευή μέτρησης πρέπει να συγκρατείται στο κάτω μέρος του ανεστραμμένου τρυβλίου επάνω από μαύρο φόντο που φωτίζεται με αντανακλώμενο φως. Το τρυβλίο πρέπει να συγκρατείται περίπου 30 cm από τον οφθαλμό Ως τελικό σημείο θα πρέπει να λαμβάνεται η περιοχή που δεν εμφανίζει καμία ορατή ανάπτυξη, η οποία είναι δυνατό να εντοπιστεί με γυμνό οφθαλμό. Αγνοήστε τυχόν αμυδρή ανάπτυξη μικροσκοπικών αποικιών, οι οποίες είναι δυνατό να ανιχνευτούν με δυσκολία κοντά στην άκρη της εμφανούς ζώνης αναστολής της ανάπτυξης. 4. Σύμφωνα με το CLSI: Η εξέταση του Staphylococcus aureus με δίσκους οξακιλλίνης αποτελεί εξαίρεση, όπως και η εξέταση των εντερόκοκκων με βανκομυκίνη. Σε αυτές τις περιπτώσεις, θα πρέπει να χρησιμοποιείται εκπεμπόμενο φως για την ανίχνευση θόλωσης γύρω από τον δίσκο, η οποία παρουσιάζεται με «λανθάνοντα ανθεκτικά» στελέχη MRSA ή εντερόκοκκους ανθεκτικούς στη βανκομυκίνη. 7,26 Με το είδος Proteus, εάν η ζώνη αναστολής είναι αρκετά διακριτή ώστε να μετρηθεί, παραβλέψτε τυχόν σμηνουργία εντός της ζώνης. Με τη χρήση τριμεθοπρίνης και σουλφοναμιδών, οι ανταγωνιστές στο υλικό ενδέχεται να επιτρέψουν ελαφρά ανάπτυξη. Συνεπώς, θα πρέπει να αγνοήσετε τυχόν ελαφρά ανάπτυξη (20% ή λιγότερο της μικροβιακής ανάπτυξης) και να μετρήστε το πιο ορατό όριο για να προσδιορίσετε τη διάμετρο ζώνης. Σύμφωνα με την Σε περίπτωση διπλών ζωνών, πρέπει να μετράται η εσωτερική ζώνη εκτός αν αναφέρεται ρητά κάτι διαφορετικό. 8 PA Σελίδα 5 από 11

6 Υπολογισμός και ερμηνεία των αποτελεσμάτων Σύμφωνα με το CLSI: Οι διάμετροι των ζωνών που μετρώνται γύρω από τους δίσκους θα πρέπει να συγκρίνονται με τις διαμέτρους που αναφέρονται στους πίνακες 2A έως 2D στο έγγραφο Document M100 (M2) του CLSI. 10 Αποτελέσματα που προκύπτουν με ειδικούς μικροοργανισμούς μπορούν στη συνέχεια να αναφέρονται ως «ανθεκτικός», «ενδιάμεσης ανθεκτικότητας» ή «ευαίσθητος». Σύμφωνα με την Ερμηνεύστε τις διαμέτρους ζώνης με αναφοράς στους πίνακες των ορίων ευαισθησίας. 11 Αποτελέσματα που προκύπτουν με ειδικούς μικροοργανισμούς μπορούν στη συνέχεια να αναφέρονται ως «ανθεκτικός» ή «ευ αίσθητος». Για περισσότερες πληροφορίες για συγκεκριμένα χαρακτηριστικά ανάπτυξης, ερμηνείες και άλλα έγγραφα με οδηγίες, ανατρέξτε στον ιστότοπο της EUCAST. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Το Mueller Hinton Agar είναι το τυπικό υλικό καλλιέργειας που χρησιμοποιείται για εξέταση ευαισθησίας ταχέως αναπτυσσόμενων αερόβιων ή προαιρετικά αναερόβιων βακτηρίων, όπως σταφυλόκοκκοι, εντερόκοκκοι, μέλη των Enterobacteriaceae και αναερόβια gram-αρνητικά ραβδία (π.χ. Pseudomonas spp). Τα έγγραφα οδηγιών για την ερμηνεία της ευαισθησίας ενημερώνονται σε ετήσια βάση και θα πρέπει να συμβουλεύεστε την πιο πρόσφατη έκδοση για τη σωστή ερμηνεία των αποτελεσμάτων που προκύπτουν. 10,11 Έχουν αναπτυχθεί διαφορετικές διαδικασίες, άλλα μέσα καλλιέργειας και προϋποθέσεις για την εξέταση απαιτητικών ειδών, π.χ. Haemophilus spp., Neisseria spp. και Streptococcus pneumoniae και streptococci. Η τυποποιημένη διαδικασία του CLSI και της EUCAST δεν εφαρμόζεται για την εξέταση υποχρεωτικώς αναερόβιων μικροοργανισμών, μικροοργανισμών που παρουσιάζουν ανεπαρκή ή αργό ρυθμό ανάπτυξης στο Mueller Hinton Agar ή μικροοργανισμών που παρουσιάζουν απόκλιση μεταξύ των στελεχών όσον αφορά το ρυθμό ανάπτυξης. 7,8 Οι απαιτητικοί οργανισμοί (π.χ. Haemophilus influenzae) θα πρέπει να εξετάζονται σύμφωνα με τις συστάσεις του CLSI και της EUCAST. 7,8 Εσωτερική αξιολόγηση απόδοσης Η απόδοση του BD Mueller Hinton II Agar (όλες οι μορφές τρυβλίων) επικυρώθηκε εσωτερικά με τη χρήση των συνιστώμενων στελεχών ποιοτικού ελέγχου (QC), συμπεριλαμβανομένων εκείνων με χαρακτηρισμένους μηχανισμούς ανθεκτικότητας (Escherichia coli ATCC 35218, Klebsiella pneumoniae ATCC , Enterococcus faecalis ATCC 51299, Staphylococcus aureus NCTC 12493, Staphylococcus aureus ATCC με αμοξυκιλλίνη-κλαβουλανικό οξύ AMC-3). 19,20,34 Ο πίνακας 2 συνοψίζει τους επικυρωμένους αντιμικροβιακούς παράγοντες για τα στελέχη ποιοτικού ελέγχου και τα στελέχη με χαρακτηρισμένους μηχανισμούς ανθεκτικότητας. Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, τα καθορισμένα μεγέθη ζώνης αναστολής για τους επικυρωμένους αντιμικροβιακούς παράγοντες βρίσκονταν εντός των ευρών διαμέτρου ζώνης αναστολής του CLSI και της EUCAST. 19,20 Πρόσθετες μελέτες απόδοσης με τη χρήση κλινικών απομονωμένων στελεχών MRSA που φιλοξενούν τον τύπο ανθεκτικότητας στο mecc κατέδειξαν ότι το BD Mueller Hinton II Agar ανιχνεύει με ακρίβεια τα mecc-θετικά στελέχη MRSA. 34,35 PA Σελίδα 6 από 11

7 E. coli ATCC ,18 P. aeruginosa ATCC ,18 E. faecalis ATCC ,18 S. aureus ATCC E. coli ATCC ,18 S. aureus NCTC K. pneumoniae ATCC ,18 E. faecalis ATCC Πίνακας 2: Επισκόπηση του επικυρωμένου αντιμικροβιακού παράγοντα και στελεχών ποιοτικού ελέγχου. Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, οι διάμετροι ζώνης αναστολής βρίσκονταν εντός των αντίστοιχων ευρών του CLSI ή/και της EUCAST. 19,20 Αντιμικροβιακός παράγοντας Περιεχόμενο δίσκου (µg) Αμικασίνη AN-30 Αμοξυκιλλίνη-κλαβουλανικό AMC-3 οξύ AMC-30 5 Αμπικιλλίνη 3 AM-2 AM-10 Αμπικιλλίνη-σουλμπακτάμη SAM-20 Αζτρεονάμη ATM-30 Βενζυλοπενικιλλίνη P-1 Κεφαδροξίλη CFR-30 1 Κεφαλεξίνη CN-30 1 Κεφεπίμη FEP-30 Κεφιξίμη CFM-5 Κεφοταξίμη CTX Κεφοξιτίνη FOX-30 Κεφποντοξίμη CPD-10 Κεφταρολίνη CPT-5 2 Κεφταζιντίμη CAZ Κεφτιμπουτένη CFT-30 Κεφτριαξόνη CRO-30 Κεφουροξίμη CXM-30 Χλωραμφαινικόλη C-30 Κιπροφλοξασίνη CIP-5 Κλινδαμυκίνη CC-2 Δοριπενέμη DOR-10 Ερταπενέμη ETP-10 Ερυθρομυκίνη E-15 Φουσιδικό οξύ FA-10 Γενταμυκίνη GM-10 GM-30 Ιμιπενέμη IPM-10 Λεβοφλοξασίνη LVX-5 Λινεζολίδη LZD-10 Μεκιλλινάμη MEC-10 Μεροπενέμη MEM-10 Μινοκυκλίνη MI-30 Μοξιφλοξασίνη MXF-5 Μουπιροσίνης MUP-200 Ναλιδιξικό οξύ NA-30 PA Σελίδα 7 από 11

8 E. coli ATCC ,18 P. aeruginosa ATCC ,18 E. faecalis ATCC ,18 S. aureus ATCC E. coli ATCC ,18 S. aureus NCTC K. pneumoniae ATCC ,18 E. faecalis ATCC Πίνακας 2: Συνέχεια. Αντιμικροβιακός παράγοντας Περιεχόμενο δίσκου (µg) Νετιλμικίνη NET Νιτροφουραντοΐνη FM Νορφλοξασίνη NOR-10 Οφλοξασίνη OFX-5 Πεφλοξασίνη PEF-5 Πιπερακιλλίνη PIP-30 2 Πιπερακιλλίνη-ταζομπακτάμη PIP-30/TAZ Κινουπριστίνηδαλφοπριστίνη SYN-15 Ριφαμπικίνη RA-5 Στρεπτομυκίνη S Τεϊκοπλανίνη TEC-30 Τετρακυκλίνη TE-30 Τικαρκιλλίνη TIC-75 Τικαρκιλλίνη-κλαβουλανικό TIM-85 οξύ Τιγκεκυκλίνη TGC-15 Τομπραμυκίνη NN-10 Τριμεθοπρίμη TMP-5 4 Τριμεθοπρίμησουλφαμεθοξαζόλη 23,75 SXT1,25- Βανκομυκίνη VA-5, Οι υποδεικνυόμενες ζώνες αναστολής βρίσκονται εντός του εύρους της EUCAST και του CLSI. 1 Το CLSI δεν συνιστά την εξέταση του αντιμικροβιακού παράγοντα. 2 Το CLSI και η EUCAST συνιστούν διαφορετικές συγκεντρώσεις του αντιμικροβιακού παράγοντα. Εφαρμόστηκαν οι συστάσεις της EUCAST. 3 Η ζώνη αναστολής του αντιμικροβιακού παράγοντα δεν βρίσκεται εντός του συνιστώμενου εύρους της EUCAST (Mueller Hinton II Agar, 150 mm και square). 4 Η ζώνη αναστολής του αντιμικροβιακού παράγοντα δεν βρίσκεται εντός του συνιστώμενου εύρους της EUCAST (Mueller Hinton II Agar, 90 mm). 5 Η ζώνη αναστολής του αντιμικροβιακού παράγοντα δεν βρίσκεται εντός του συνιστώμενου εύρους της EUCAST και του CLSI (Mueller Hinton II Agar, 90 mm). 6 Η ζώνη αναστολής του αντιμικροβιακού παράγοντα δεν βρίσκεται εντός του συνιστώμενου εύρους του CLSI (Mueller Hinton II Agar, 90 και 150 mm), αλλά εντός του συνιστώμενου εύρους της EUCAST. Περιορισμοί της διαδικασίας Η εξέταση ευαισθησίας με διάχυση σε δίσκο έχει σχεδιαστεί για χρήση με καθαρές καλλιέργειες μόνον. Πριν από την παρασκευή της εξέτασης ευαισθησίας, συνιστάται εκτέλεση χρώσης Gram και συμπερασματική ταυτοποίηση του απομονωμένου στελέχους. Για κάποιους συνδυασμούς μικροοργανισμών και αντιμικροβιακών παραγόντων, η ζώνη αναστολής ενδέχεται να μην έχει ευδιάκριτα οριοθετημένη άκρη, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένη ερμηνεία. PA Σελίδα 8 από 11

9 Έχουν αναγνωριστεί διάφοροι παράγοντες που επηρεάζουν την εξέταση ευαισθησίας με διάχυση σε δίσκο. Αυτοί περιλαμβάνουν το υλικό καλλιέργειας, το βάθος του άγαρ, την ισχύ του δίσκου, τη συγκέντρωση του ενοφθαλμίσματος, την ηλικία του ενοφθαλμίσματος και το ph. 31 Τυχόν ακατάλληλη συγκέντρωση ενοφθαλμίσματος ενδέχεται να οδηγήσει σε εσφαλμένα αποτελέσματα. Οι ζώνες αναστολής ενδέχεται να είναι υπερβολικά μικρές, εάν το ενοφθάλμισμα είναι υπερβολικά πυκνό, ή υπερβολικά μεγάλες και δύσκολες στη μέτρηση, εάν το ενοφθάλμισμα είναι υπερβολικά αραιό. Επομένως, συνιστάται θερμά να ακολουθήσετε τις συστάσεις του CLSI και της EUCAST για το χειρισμό του ενοφθαλμίσματος και των ενοφθαλμισμένων τρυβλίων για την ελαχιστοποίηση του πιθανού κινδύνου εσφαλμένων αποτελεσμάτων λόγω ακατάλληλου χειρισμού. Τυχόν εσφαλμένη φύλαξη των αντιμικροβιακών δίσκων ενδέχεται να προκαλέσει απώλεια της ισχύος και λήψη ψευδών αποτελεσμάτων ευαισθησίας. Τυχόν υπερβολική συρρίκνωση του υλικού καλλιέργειας λόγω ακατάλληλης αποθήκευσης ενδέχεται να οδηγήσει σε ψευδή αποτελέσματα ευαισθησίας. Η in vitro ευαισθησία ενός μικροοργανισμού σε έναν συγκεκριμένο αντιμικροβιακό παράγοντα δε σημαίνει απαραίτητα ότι ο παράγοντας θα είναι αποτελεσματικός in vivo. Για καθοδήγηση στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων, να συμβουλεύεστε τις κατάλληλες αναφορές. 10,11,32,33 Ενδέχεται να υπάρξουν βακτήρια που απαιτούν θυμίνη ή θυμιδίνη. 27,28 Αυτοί οι μικροοργανισμοί ενδέχεται να μην αναπτυχθούν ικανοποιητικά σε Mueller Hinton Agar που περιέχει χαμηλά επίπεδα θυμίνης ή θυμιδίνης. Έχουν αναπτυχθεί νέες διαδικασίες οι οποίες χρησιμοποιούν δίσκους υψηλής περιεκτικότητας σε γενταμικίνη (120 mg) και στρεπτομυκίνη (300 mg) για τον έλεγχο υψηλού επιπέδου ανθεκτικότητας στις αμινογλυκοσίδες ως ένδειξη ότι ένα εντεροκοκκικό απομονωμένο στέλεχος δεν θα επηρεαστεί συνεργατικά από συνδυασμό πενικιλλίνης ή γλυκοπεπτιδίου με αμινογλυκοσίδη. 7,28,29 Για πλήρεις αναλύσεις σχετικά με την ανίχνευση MRSA, ανθεκτικών εντερόκοκκων, gramαρνητικών βάκιλλων που παράγουν β-λακταμάσες εκτεταμένου φάσματος και άλλους περιορισμούς της εξέτασης, ανατρέξτε στα έγγραφα M2 και M7 του CLSI και στην EUCAST. 7,8,10,11,30 Το Mueller Hinton II Agar καταδείχτηκε ότι είναι αξιόπιστο στην ανίχνευση MRSA που δημιουργούν μια θολή ζώνη αναστολής γύρω από δίσκους οξακιλλίνης. 26 Σε περίπτωση αμφιβολίας, θα πρέπει να χρησιμοποιείται πρόσθετη μέθοδος, όπως το BD Oxacillin Screen Agar. Η μέθοδος ενοφθαλμισμού, η ερμηνεία, οι συστάσεις και τα όρια των μεγεθών ζώνης που αναφέρονται στο παρόν έγγραφο και συνιστώνται από το πρότυπο του CLSI και της EUCAST ενδέχεται να διαφέρουν από τα εθνικά πρότυπα. 7,8,31 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ 1. Bauer, A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris, and M. Turck Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45: Matuschek, E., D.F. Brown, and G. Kahlmeter. Development of the EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine microbiology laboratories. Clin. Microbiol. Infect. 2014; 20 (4): Ryan, K.J., F.D. Schoenknecht, and W.M.M. Kirby Disc sensitivity testing. Hospital Practice 5: Barry, A.L., F. Garcia, and L.D. Thrupp An improved single-disk method for testing the antibiotic susceptibility of rapidly-growing pathogens. Am. J. Clin. Pathol. 53: Mueller, J.H., and J. Hinton A protein-free medium for primary isolation of the gonococcus and meningococcus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 48: Ericsson, H.M., and J.C. Sherris Antibiotic sensitivity testing. Report of an international collaborative study. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sec. B, Suppl CLSI. Approved standard: M02-A12 - Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA. Search for latest version at 8. EUCAST Disk Diffusion Method for Antimicrobial Susceptibility Testing. Search for latest version at PA Σελίδα 9 από 11

10 9. Woods, G.L., and J.A. Washington Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.C. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, DC. 10. CLSI - Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility. CLSI supplement M100S. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. Search for latest version at The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Search for latest version at Thornsberry, C., T.L. Gavan, and E.H. Gerlach Cumitech 6, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society of Microbiology, Washington, DC. 13. Koch, A.E., and J.J. Burchall Reversal of the antimicrobial activity of trimethoprim by thymidine in commercially prepared media. Appl. Microbiol. 22: Ferone, R., S.R.M. Bushby, J.J. Burchall, W.D. Moore, and D. Smith Identification of Harper-Cawston factor as thymidine phosphorylase and removal from media of substances interfering with susceptibility testing to sulfonamides and diaminopyrimidines. Antimicrob. Agents Chemother. 7: Reller, L.G., F.D. Schoenknecht, M.A. Kenny, and J.C. Sherris Antibiotic susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa: selection of a control strain and criteria for magnesium and calcium content in media. J. Infect. Dis. 130: Pollock, H.M., B.H. Minshew, M.A. Kenny, and F.D. Schoenknecht Effect of different lots of Mueller-Hinton Agar on the interpretation of the gentamicin susceptibility of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 14: D'Amato, R.F., and C. Thornsberry Calcium and magnesium in Mueller-Hinton agar and their influence on disk diffusion susceptibility results. Current Microbiol. 2: The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Routine and extended internal quality control for MIC determination and disk diffusion as recommended by EUCAST. Search for latest version at The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Routine and extended internal quality control for MIC determination and disk diffusion as recommended by EUCAST. Version 6.0, CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 26 th ed. CLSI supplement M100S. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; Wegner, D.L., C.R. Mathis, and T.R. Neblett Direct method to determine the antibiotic susceptibility of rapidly growing blood pathogens. Antimicrob. Agents Chemother. 9: Johnson, J.E., and J.A. Washington II Comparison of direct and standardized antimicrobial susceptibility testing of positive blood cultures. Antimicrob. Agents Chemother. 10: Waterworth, P.M., and M. Del Piano Dependability of sensitivity tests in primary culture. J. Clin. Pathol. 29: Hollick, G.E., and J.A. Washington II Comparison of direct and standardized disk diffusion susceptibility testing of urine cultures. Antimicrob. Agents Chemother. 9: Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17: Hindler, J.A., and C.B. Anderbied Effect of the source of Mueller-Hinton agar and resistance frequency on the detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 21: Maskell, R., O.A. Okubadejo, R.H. Payne, and L. Pead Human infections with thymine-requiring bacteria. J. Med. Microbiol, 11: Haltiner, R.C., P.C. Migneault, and R.G. Robertson Incidence of thymidinedependent enterococci detected on Mueller-Hinton agar with low thymidine content. Antimicrob. Agents Chemother. 18: PA Σελίδα 10 από 11

11 29. Murray, B.E The life and times of the Enterococcus. Clin. Microbiol. Rev. 3: CLSI. Approved standard: M7. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at Jorgensen, J.H., and J.D. Turnidge Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 32. Washington, J.A., and G.L. Woods Antimicrobial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods. P In Muarry, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F:C:, and Yolken, R:H. (ed.), Manual of clinical microbiology, 6 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C Neumann, M.A., D.F. Sahm, C. Thornsberry, J.E. McGowan, Jr. Cumitech 6A, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing: a practical guide. Coordinating ed., J.E. McGowan, Jr. American Society of Microbiology, Washington, D.C Data on file. Becton Dickinson. 35. Skov, R., A.R. Larsen, A. Kearns, M. Holmes, C. Teale, G. Edwards, and R. Hill. Phenotypic detection of mecc-mrsa: cefoxitin is more reliable than oxacillin J. Antimicrob. Chemother. 69: ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑ/ΔΙΑΘΕΣΙΜΟΤΗΤΑ BD Mueller Hinton II Agar [τρυβλία Stacker των 90 mm (τυπικό μέγεθος)] Αρ. κατ Έτοιμα προς χρήση υλικά καλλιέργειας σε τρυβλία, 20 τρυβλία Αρ. κατ Έτοιμα προς χρήση υλικά καλλιέργειας σε τρυβλία, 120 τρυβλία BD Mueller Hinton II Agar (150 mm) Αρ. κατ Έτοιμα προς χρήση υλικά καλλιέργειας σε τρυβλία, 20 τρυβλία BD Mueller Hinton II Agar, Square (120 x 120 mm) Αρ. κατ Έτοιμα προς χρήση υλικά καλλιέργειας σε τρυβλία, 20 τρυβλία ΠΕΡΑΙΤΕΡΩ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ Για περισσότερες πληροφορίες, παρακαλούμε επικοινωνήστε με τον τοπικό αντιπρόσωπο της BD. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse Χαϊδελβέργη/Γερμανία Τηλέφωνο: Φαξ: Reception_Germany@europe.bd.com Τα εμπορικά σήματα αποτελούν ιδιοκτησία των αντίστοιχων κατόχων τους BD. Η επωνυμία BD, το λογότυπο BD και όλα τα άλλα εμπορικά σήματα αποτελούν ιδιοκτησία της Becton, Dickinson and Company. PA Σελίδα 11 από 11