«Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΚΥΤΟΚΙΝΩΝ ΣΤΗ ΓΗΡΑΝΣΗ ΤΟΥ ΜΕΣΟΣΠΟΝΔΥΛΙΟΥ ΔΙΣΚΟΥ»

Transcript

1 Εθνικό και Καποδιστριακό ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΚΥΤΟΚΙΝΩΝ ΣΤΗ ΓΗΡΑΝΣΗ ΤΟΥ ΜΕΣΟΣΠΟΝΔΥΛΙΟΥ ΔΙΣΚΟΥ» ΓΕΩΡΓΙΑ ΧΑΛΔΑΙΟΠΟΥΛΟΥ Α.Μ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Επιβλέπων: Ι.Π. Τρουγκάκος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τοµέας Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής, Τµήµα Βιολογίας, ΕΚΠΑ Επιστηµονικός υπεύθυνος: Δ. Κλέτσας, Ερευνητής Α, ΕΚΕΦΕ Δηµόκριτος, Ινστιτούτο Βιολογίας, Εργαστήριο Κυτταρικού Πολλαπλασιασµού και Γήρανσης Αθήνα 2017

2 Εθνικό και Καποδιστριακό ΠΑΝΕΠΙΣΤΉΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ Τµήµα Βιολογίας και Ιατρική Σχολή ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΚΥΤΟΚΙΝΩΝ ΣΤΗ ΓΗΡΑΝΣΗ ΤΟΥ ΜΕΣΟΣΠΟΝΔΥΛΙΟΥ ΔΙΣΚΟΥ» ΓΕΩΡΓΙΑ ΧΑΛΔΑΙΟΠΟΥΛΟΥ Α.Μ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Επιβλέπων: Ι.Π. Τρουγκάκος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τοµέας Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής, Τµήµα Βιολογίας, ΕΚΠΑ Επιστηµονικός υπεύθυνος: Δ. Κλέτσας, Ερευνητής Α, ΕΚΕΦΕ Δηµόκριτος, Ινστιτούτο Βιολογίας, Εργαστήριο Κυτταρικού Πολλαπλασιασµού και Γήρανσης Τριµελής επιτροπή: Ιωάννης Τρουγκάκος, Αναπληρωτής Καθηγητής Τµήµατος Βιολογίας Δηµήτριος Κλέτσας, Ερευνητής Α, ΕΚΕΦΕ «Δηµόκριτος» Μαριάννα Αντωνέλου, Επίκουρη Καθηγήτρια Τµήµατος Βιολογίας Τόπος διεξαγωγής της έρευνας: Εθνικό Κέντρο Ερευνών Φυσικών Επιστηµών «Δηµόκριτος», Ινστιτούτο Βιοεπιστηµών και Εφαρµογών, Εργαστήριο Κυτταρικού Πολλαπλασιασµού και Γήρανσης Αθήνα

3 3

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Κυτταρικού πολλαπλασιασµού και Γήρανσης του Ινστιτούτου Βιοεπιστηµών και Εφαρµογών του Εθνικού Κέντρου Ερευνών Φυσικών Επιστηµών, (ΕΚΕΦΕ) «Δηµόκριτος», µε επιστηµονικό υπεύθυνο τον Δρα Δηµήτριο Κλέτσα (Ερευνητή Α ), την βοήθεια και την υποστήριξη µιας οµάδας ατόµων. Πρώτο απ όλους, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά τον Δρα Δηµήτριο Κλέτσα, για την ευκαιρία που µου έδωσε να δουλέψω και να προάγω τις γνώσεις µου στο εργαστήριό του, την εµπιστοσύνη που µου έδειξε κατά την διεξαγωγή των πειραµάτων, αλλά και για την τεράστια προθυµία του να µε βοηθήσει καθ όλη την διάρκεια εκπόνησης και συγγραφής της πτυχιακής µου εργασίας. Η παρούσα διπλωµατική δεν θα είχε ολοκληρωθεί χωρίς την υποστήριξή του, την επιστηµονική καθοδήγησή του, αλλά και την άριστη συνεργασία µας. Θα ήθελα να ευχαριστήσω, ακόµα, τον Αναπληρωτή Καθηγητή Τµήµατος Βιολογίας Ιωάννη Τρουγκάκο, καθώς και την Επίκουρη Καθηγήτρια Μαριάννα Αντωνέλου για την συµµετοχή τους στη τριµελή εξεταστική επιτροπή. Επίσης, ευχαριστώ θερµά τον Δρα Χαράλαµπο Πρατσίνη (Ερευνητή Γ ), την Δρα Ελένη Μαυρογονάτου (Μετα-διδακτορικός συνεργάτης) και την Δρα Αδαµαντία Παπαδοπούλου (Μετα-διδακτορικός συνεργάτης), για την µετάδοση πολύτιµων γνώσεων, την επιστηµονική υποστήριξη και την διαρκή καθοδήγησή τους, κατά την διεξαγωγή των πειραµάτων, καθώς επίσης και τα υπόλοιπα µέλη του εργαστηρίου, την Μαρία Αγγελοπούλου (Υποψήφια Διδάκτωρ), τον Αναστάσιο Κουρούµαλη (Υποψήφιος Διδάκτωρ), την Όλγα Τσούρου (Μεταπτυχιακή φοιτήτρια) και τη Δέσποινα Νικολοπούλου (Μεταπτυχιακή φοιτήτρια) για τη βοήθεια και υποστήριξή τους που ήταν πολύτιµα εφόδια καθ όλη τη διάρκεια της διπλωµατικής µου εργασίας. Τέλος, ευχαριστώ την οικογένειά µου για τη στήριξη και την αγάπη που µου δείχνει όλα αυτά τα χρόνια και που στέκεται δίπλα µου σε κάθε επιλογή µου. 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Παράγοντας νέκρωσης όγκων - άλφα (TNF-α) Οικογένεια πρωτεϊνών κινασών που ενεργοποιούνται από µιτογόνα (mitogen activated protein kinases, MAPK) Κινάσες που ρυθµίζονται από εξωκυτταρικά σήµατα (extracellular signal-regulat. ed protein kinase, ERK) Κινάσες που φωσφορυλιώνουν το αµινοτελικό άκρο του µεταγραφικού παράγοντα c-jun (c-jun N-terminal kinase/ stress-activated protein kinase, JNK) Υποοικογένεια των p38 (p38α, p38β, p38γ, p38ε) Akt κινάση Σηµατοδότηση του TNF-α Ενεργοποίηση του µεταγραφικού παράγοντα NF-κB σε καταστάσεις φλεγµονής Ενεργοποίηση των JNK MAPKs Ενεργοποίηση των p38 ΜΑΡΚ Ενεργοποίηση των ERK MAPK Επαγωγή απόπτωσης ή νέκρωσης από τον TNF-α Γήρανση και φλεγµονή Φλεγµονή Κυτταρική γήρανση Πρόωρη κυτταρική γήρανση επαγόµενη από στρες (SIPS) Έκκριση φλεγµονωδών µορίων από γηρασµένα κύτταρα (senescence-associated secretory phenotype, SASP)

6 1.6. Δραστικές µορφές οξυγόνου και οξειδωτικό stress Δέρµα Δοµή δέρµατος και σύσταση εξωκυττάριας µήτρας Η κυτταρική γήρανση του δέρµατος και η δράση του TNF-α Παραγωγή του TNF-α στο δέρµα Μεσοσπονδύλιος δίσκος Δοµή και λειτουργία Αγγείωση µεσοσπονδύλιου δίσκου Εκφύλιση του µεσοσπονδύλιου δίσκου κατά τη γήρανση Σκοπός της εργασίας ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Όργανα Υλικά Κυτταρικές Σειρές Μέθοδοι Αποστείρωση Καλλιέργεια κυττάρων και αρχείο γενεών Μέτρηση του ολικού αριθµού κυττάρων Έλεγχος της πρωτεϊνικής έκφρασης µε ανοσοστύπωµα Western Κυτταρική λύση απευθείας σε διάλυµα φόρτωσης µε SDS Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου παρουσία δωδεκυλοθειϊκού νατρίου (SDS-PAGE) Ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνες Ανοσοαποτύπωση σε µεµβράνες Αποµάκρυνση των δεσµευµένων αντισωµάτων από την επιφάνεια της µεµβράνης

7 Προσδιορισµός βιωσιµότητας κύττάρων µέσω της δοκιµασίας ΜΤΤ Προσδιορισµός ενδοκυτταρικών επιπέδων ενεργών µορφών οξυγόνου µέσω της δοκιµασίας DCFH-DA Ποσοτικός προσδιορισµός της σύνθεσης DNA µε τη µέθοδο ενσωµάτωσης τριτιωµένης θυµιδίνης Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επίδραση του TNF-α στην βιωσιµότητα των κυττάρων Επίδραση του TNF-α στο ενδοκυτταρικό οξειδωτικό φορτίο των κυττάρων Μελέτη της επίδρασης του TNF-α στην ενεργοποίηση ενδοκυτταρικών µονοπατιών Μελέτη της επίδραση του TNF-α στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό Επίδραση του ΤNF-α στον αριθµό των κυττάρων Συµπεράσµατα ΣΥΖΗΤΗΣΗ. 78 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT

8 8

9 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Παράγοντας νέκρωσης όγκων - άλφα (TNF-α) Ο παράγοντας νέκρωσης όγκων - άλφα (tumor necrosis factor alpha, TNF-α) είναι µια διαλυτή προ-φλεγµονώδης κυτοκίνη, που παράγεται κατά κύριο λόγο από κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος, (κυρίως τα µακροφάγα), αλλά και από άλλους κυτταρικούς τύπους, όπως τα κύτταρα του µαστού, ενδοθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες αλλά και νευρικά κύτταρα. Αρχικά, ο TNF-α παράγεται ως µια οµοτριµερής διαµεµβρανική πρωτεΐνη, από την οποία στην συνέχεια προκύπτει η διαλυτή οµοτριµερής πρωτεΐνη, TNF-α, µετά από δράση του ενζύµου TACE (metalloprotease TNF-α converting enzyme) (Tang et al., 1996) Υπάρχουν δυο τύποι υποδοχέων του TNF-α. Ο TNF-R1, ο οποίος εκφράζεται στους περισσότερους ιστούς και προσδένει τόσο την διαλυτή, όσο και την µεµβρανική µορφή του TNF-α και ο TNF-R2, ο οποίος εκφράζεται σε µικρότερο βαθµό, κυρίως στα κύτταρα του ανοσοποιητικού και προσδένει κυρίως την µεµβρανική µορφή του TNF-α. Οι δυο υποδοχείς διαφέρουν ακόµα ως προς τα σηµατοδοτικά µονοπάτια που ενεργοποιούν (Sedger and McDermott, 2014). Συγκεκριµένα, ο TNF-R1 περιέχει περιοχή θανάτου (death domain, DD) στο ενδοκυττάριο τµήµα του, πρόσδεση πρωτεϊνών στην οποία ενεργοποιεί κασπάσες και επάγει την απόπτωση. Από την άλλη, ο TNF-R2 επάγει την γονιδιακή έκφραση µετά από στρατολόγηση παραγόντων που προσδένονται σε αυτόν (Tumor necrosis factor receptor-associated factors, TRAFs). Να σηµειωθεί ότι ο TNF-R1 µπορεί επίσης να επάγει την γονιδιακή έκφραση, µε έµµεση στρατολόγηση πρωτεϊνών που ανήκουν στην οικογένεια των TRAFs (Bradley and Pober, 2001). Ο TNF-α αποτελεί έναν κεντρικό, προ-φλεγµονώδη διαµεσολαβητή, ο οποίος παίζει ρόλο, είτε άµεσα είτε έµµεσα, σχεδόν σε όλες τις βιολογικές διεργασίες του κυττάρου. Ειδικότερα συµµετέχει: στην ρύθµιση των ανοσολογικών απαντήσεων και την επαγωγή φλεγµονής, την απόπτωση αλλά και τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό, την κυτταρική γήρανση, ακόµα και τη κυτταρική διαφοροποίηση σε ορισµένες περιπτώσεις. Όπως θα αναλυθεί εκτενώς παρακάτω, ως τελικά αποτελέσµατα της δράσης του TNF-α, περιλαµβάνονται η ενεργοποίηση του µεταγραφικού παράγοντα NF-κB, η ενεργοποίηση των κασπασών και η ενεργοποίηση των µονοπατιών των ΜΑΡ κινασών (ΜΑΡΚ). Όπως φαίνεται από τα παραπάνω, τόσο ο TNF-α, όσο και οι υποδοχείς του, συχνά επάγουν αντίθετες κυτταρικές λειτουργίες, συµβάλλοντας έτσι, στη διατήρηση της οµοιόστασης του κυττάρου. Έτσι, για παράδειγµα ο TNF-α, εµφανίζεται ικανός να επάγει και την 9

10 ανάπτυξη ενός ιστού, αλλά και την καταστροφή του (Wajant et al., 2003). Το γεγονός αυτό τον καθιστά ενδιαφέρον αντικείµενο µελέτης σε µεγάλο αριθµό ερευνητικών εργασιών Οικογένεια πρωτεϊνών κινασών που ενεργοποιούνται από µιτογόνα (mitogen activated protein kinases, MAPK) Η οικογένεια των ΜΑΡ κινασών αποτελείται από µια σειρά ρυθµιστικών πρωτεϊνών και σηµατοδοτικών µονοπατιών, τα οποία ενεργοποιούνται ως απάντηση σε µιτογόνα ερεθίσµατα και περιβαλλοντικούς στρεσογόνους παράγοντες, παίζοντας κεντρικό ρόλο σχεδόν σε όλες τις κυτταρικές διεργασίες (J.M. Kyriakis, 2001). Βασικό χαρακτηριστικό της συγκεκριµένης οικογένειας αποτελεί ο καταρράκτης φωσφορυλιώσεων µέσω του οποίου ενεργοποιούνται διαδοχικά πρωτεΐνες κινάσες ώσπου τελικά να φωσφορυλιωθεί ο τελικός στόχος. Συγκεκριµένα, το σήµα µεταφέρεται ενδοκυττάρια όταν µε την πρόσδεση του µιτογόνου στον διαµεµβρανικό υποδοχέα, στρατολογούνται µικρές GTPάσες και πρωτεΐνες κινάσες, που φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν MAPKK κινάσες (MAPKKK). Οι ενεργοποιηµένες MAPKKK φωσφορυλιώνουν MAPK κινάσες (ΜΑΡKΚ) σε κατάλοιπα σερίνης/θρεονίνης, οι οποίες µε την σειρά τους φωσφορυλιώνουν MAP κινάσες (ΜΑΡΚ) σε κατάλοιπα σερίνης-θρεονίνης, οι οποίες τελικά φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν τους τελικούς στόχους (Zhang et al., 2002). Πρόκειται για µια µεγάλη οικογένεια σηµατοδοτικών µορίων η οποία περιλαµβάνει τρεις βασικές υποοικογένειες: κινάσες που ρυθµίζονται από εξωκυτταρικά σήµατα (extracellular signal-regulated protein kinase, ERK), κινάσες που φωσφορυλιώνουν το αµινοτελικό άκρο του µεταγραφικού παράγοντα c-jun (c-jun N- terminal kinase/ stress- activated protein kinase, JNK) και την υποοικογένεια των p38 (p38α, p38β, p38γ, p38ε) Στην συνέχεια αναλύεται η κάθε υποοικογένεια ΜΑΡ κινασών ξεχωριστά Κινάσες που ρυθµίζονται από εξωκυτταρικά σήµατα (extracellular signalregulated protein kinase, ERK) Το µονοπάτι των ERK κινασών ενεργοποιείται µε την πρόσδεση κάποιου µιτογόνου παράγοντα, όπως είναι ορµόνες, προ-φλεγµονώδης κυτοκίνες και αυξητικοί παράγοντες, στον διαµεµβρανικό υποδοχέα της πλασµατικής µεµβράνης. Η πρόσδεση αυτή οδηγεί σε ενεργοποίηση 10

11 της πρωτεΐνης Ras, µιας µικρής GTPάσης, η οποία ενεργοποιεί µια Raf πρωτεΐνη (Εικόνα 1). Ακολουθεί ένας καταρράκτης διαδοχικών φωσφορυλιώσεων, όπου η Raf (MAPKKK), φωσφορυλιώνει την ΜΕΚ1/2 (ΜΑΡΚΚ), η οποία αποδεσµεύεται από την ΕRΚ (ΜΑΡΚ), την φωσφορυλιώνει και την ενεργοποιεί. Η ενεργοποιηµένη ERK οµοδιµερίζεται και εισέρχεται στον πυρήνα, όπου φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί πυρηνικούς στόχους (McCain, 2013). Κυρίως ρόλος του συγκεκριµένου µονοπατιού είναι η ρύθµιση και προώθηση του κυτταρικού κύκλου και µόρια που συµµετέχουν σε αυτό εµφανίζονται συχνά µεταλλαγµένα σε διάφορους καρκίνους. Εικόνα 1: Σχηµατική απεικόνιση του µονοπατιού Raf/MEK/ERK. Η ενεργοποιηµένη ERK κινάση εισέρχεται στον πυρήνα του κυττάρου, όπου φωσφορυλιώνει τους µοριακούς της στόχους. Η ενεργοποίηση του µονοπατιού συµβάλλει στην κυτταρική ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασµό και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (McCain, 2013). 11

12 Αναλυτικότερα, παρουσία αυξητικών παραγόντων, ορµονών και άλλων µιτογόνων, µέσω του καταρράκτη φωσφορυλιώσεων που περιγράφηκε παραπάνω, ενεργοποιούνται κυκλινοεξαρτώµενες πρωτεΐνες κινάσες (CDKs). Τα µόρια αυτά επάγουν τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης του ρετινοβλαστώµατος (prb), η οποία οδηγεί σε απελευθέρωση του µεταγραφικού παράγοντα E2F, επιτρέποντας έτσι, τη µετάβαση από τη φάση G1 στην φάση S του κυτταρικού κύκλου και επάγοντας τελικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό (Wuertz et al., 2012). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι, η ενεργότητα του συγκεκριµένου µονοπατιού παρουσιάζει διαφορές σε νεαρά και γηρασµένα κύτταρα, ενώ φαίνεται να επηρεάζεται σηµαντικά από τον κυτταρικό τύπο και τις συνθήκες καλλιέργειας. Συγκεκριµένα, αποτέλεσµα της ενεργοποίησης του µονοπατιού Raf/MEK/ERK είναι η αύξηση της έκφρασης του πρωτοογκογονιδίου c-fos, η έκφραση του οποίου φαίνεται να αναστέλλεται πλήρως σε γηρασµένα κύτταρα. Σε νεαρά κύτταρα, η ενεργοποιηµένη ERK, εισέρχεται στον πυρήνα, όπου φωσφορυλιώνει τον µεταγραφικό παράγοντα Elk1, οδηγώντας τελικά σε αύξηση της έκφρασης του c-fos. Πειράµατα σε γηρασµένους ινοβλάστες έδειξαν ότι, παρόλο που η ολική ενεργότητα των πρωτεϊνών του συγκεκριµένου µονοπατιού παραµένει υψηλή στο κυτταρόπλασµα, στον πυρήνα των γηρασµένων κυττάρων εντοπίζονται µειωµένα επίπεδα της φωσφορυλιωµένης ERK και µειωµένη φωσφορυλίωση του Elk1. Η παρατήρηση αυτή, εξηγεί εν µέρη την παρεµπόδιση της έκφρασης του c-fos που εκδηλώνεται κατά τον γηρασµένο φαινότυπο επισηµαίνοντας παράλληλα, την µειωµένη µεταγωγή του µιτογόνου σήµατος στον πυρήνα των γηρασµένων κυττάρων (Lorenzini et al., 2002) Κινάσες που φωσφορυλιώνουν το αµινοτελικό άκρο του µεταγραφικού παράγοντα c-jun (c-jun N-terminal kinase/ stress-activated protein kinase, JNK) Το µονοπάτι των JNKs περιλαµβάνει τρεις διαφορετικές ισοµορφές της πρωτεΐνης JNK, τις JNK1, JNK2 και JNK3, από τις οποίες οι 1 και η 2 εκφράζονται σε διάφορους ιστούς, ενώ η 3, εκφράζεται ιστοειδικά µόνο στον εγκέφαλο. Η ενεργοποίηση του σηµατοδοτικού καταρράκτη πραγµατοποιείται ως απάντηση κυρίως σε στρεσογόνους παράγοντες και προ-φλεγµονώδης κυτοκίνες, (όπως ο TNF-α και η IL1) αλλά και σε αυξητικούς παράγοντες (Εικόνα 2). Μόρια ΜΑΡΚΚΚ, όπως οι πρωτεΐνες ASK, MEKK3 και MLK1, φωσφορυλιώνουν τις ΜΑΡΚΚ, ΜΚΚ7 και ΜΚΚ4, οι οποίες φωσφορυλιώνουν την JNK σε κατάλοιπα θρεονίνης/τυροσίνης. Οι ενεργοποιηµένες πρωτεΐνες JNK1/2 εισέρχονται στον πυρήνα όπου ρυθµίζουν την έκφραση των 12

13 µεταγραφικών παραγόντων c-jun και ATF-2 (Tournier, 2013). Τα µόρια αυτά, µαζί µε την πρωτεΐνη c-fos ετεροδιµερίζονται δηµιουργώντας τον µεταγραφικό παράγοντα ΑΡ-1 (activator protein 1), ο οποίος αναστέλλει την έκφραση της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53 (O Shea et al., 1989; Schreiber et al., 1999), αποτελώντας έναν από τους βασικούς µηχανισµούς ελέγχου των κυτταρικών διεργασιών, µέσω του µονοπατιού των JNKs. Εικόνα 2: Σχηµατική απεικόνιση του µονοπατιού των JNKs (Aurelian, 2005) Φαίνεται πως η ενεργοποίηση του µονοπατιού των JNKs ενδέχεται να επιφέρει ποικίλα αποτελέσµατα, ανάλογα µε το κυτταρικό στόχο και τις ισοµορφές των JNKs που ενεργοποιούνται, καθώς κεντρικά σηµατοδοτικά µόρια που περιλαµβάνονται στο συγκεκριµένο µονοπάτι, εµφανίζονται να συµµετέχουν και σε άλλα σηµατοδοτικά µονοπάτια (Εικόνα 3). Ειδικότερα, το µονοπάτι των JNKs έχει δειχθεί να συµµετέχει στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό, την διαφοροποίηση και την επιβίωση, αλλά και να οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο, µετά από ενεργοποίηση αποπτωτικών µηχανισµών. Παράλληλα, το συγκεκριµένο σηµατοδοτικό µονοπάτι, φαίνεται να ευθύνεται για την 13

14 απενεργοποίηση της p53 σε πολλές περιπτώσεις καρκίνου (Tournier, 2013), ενώ εµφανίζει ακόµα, ισχυρή συσχέτιση µε την διαδικασία της κυτταρικής γήρανσης (Lee et al., 2010). Εικόνα 3: Σχηµατική απεικόνιση των κοινών σηµατοδοτικών µορίων των µονοπατιών των JNKs και της p38. Πολλά ρυθµιστικά µόρια συµµετέχουν σε παραπάνω από ένα σηµατοδοτικό καταρράκτη. Χαρακτηριστικό παράδειγµα η κινάση ΜΚΚ4 που φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί τόσο το µονοπάτι των JNKs, όσο και της p38. Αντίθετα, η κινάση ΜΚΚ7 δρα αποκλειστικά στην JNK (Weston and Davis, 2002) Υποοικογένεια των p38 (p38α, p38β, p38γ, p38ε) Στην υποοικογένεια των p38 περιλαµβάνονται 4 µέλη, (p38α, p38β, p38γ, p38ε), τα οποία διαφέρουν µεταξύ τους ως προς το µοτίβο έκφρασής τους, την ειδικότητα υποστρώµατος και τους αναστολείς τους (Cuenda and Rousseau, 2007). Το συγκεκριµένο σηµατοδοτικό µονοπάτι φαίνεται ότι ενεργοποιείται κατόπιν διαφορετικών ερεθισµάτων και αναλόγως µε τον τύπο του ερεθίσµατος ενεργοποιείται ένας διαφορετικός συνδυασµός σηµατοδοτικών µορίων (ZARUBIN and HAN, 2005). Σηµαντικές πρωτεΐνες κινάσες ΜΑΡΚΚΚ (ΜΑΡ3Κ) είναι οι: MEKK1, MEKK4, MLK3, ASK1 και TAK1, οι οποίες σε συµφωνία µε τον καταρράκτη διαδοχικών φωσφορυλιώσεων, φωσφορυλιώνουν τις ΜΑΡΚΚ (ΜΑΡ2Κ: MKK3, MKK6, MKK4), οι οποίες φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν τις MAPK: (p38α, p38β, p38γ, p38ε), οι οποίες φωσφορυλιώνουν µοριακούς στόχους εντός και εκτός του πυρήνα (Εικόνα 4). 14

15 Εικόνα 4: Σχηµατική απεικόνιση του σηµατοδοτικού καταρράκτη των p38 ΜΑΚΡ (Porras and Guerrero, 2011). Όπως προαναφέρθηκε, η ενεργοποίηση του σηµατοδοτικού µονοπατιού των p38 ΜΑΡΚs µπορεί να πραγµατοποιηθεί από µια ποικιλία ερεθισµάτων και διαφορετικά ερεθίσµατα οδηγούν σε διαφορετικές κυτταρικές αποκρίσεις. Έτσι, το τελικό αποτέλεσµα της ενεργοποίησης του συγκεκριµένου µονοπατιού µπορεί να είναι: η φλεγµονή, (δεδοµένου ότι το µονοπάτι ενεργοποιείται από προ-φλεγµονώδεις κυτοκίνες, όπως IL-1 β, TNF-α και IL-6), η απόπτωση (µέσω ελέγχου του µονοπατιού των κασπασών), ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου (αναστολή ή προώθηση, όπως θα αναλυθεί παρακάτω), η διαφοροποίηση, η συµµετοχή σε επιδιορθωτικούς µηχανισµούς (DNA damage response, DDR) η κυτταρική γήρανση και η ογκοκαταστολή (ZARUBIN and HAN, 2005). Όπως το µονοπάτι των JNKs, έτσι και το µονοπάτι των p38 ΜΑΡΚ, µπορεί να συµµετέχει σε ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες. Συγκεκριµένα, σε αντιδιαστολή µε την συµµετοχή του µονοπατιού στην διαδικασία της απόπτωση και της αναστολής του κυτταρικού κύκλου, η ενεργοποίησή του έχει συσχετιστεί ακόµα και µε την επαγωγή του πολλαπλασιασµού και την προαγωγή του κυτταρικού κύκλου, ως απάντηση σε µιτογόνα ερεθίσµατα και αυξητικούς παράγοντες. Φαίνεται ότι, οι παράγοντες που θα καθορίσουν το τελικό αποτέλεσµα είναι ο τύπος του ερεθίσµατος και το κύτταρο 15

16 στόχος, ενώ σηµαντικό ρόλο παίζει επίσης, η ένταση και η διάρκεια ενεργοποίησης του µονοπατιού. Συγκεκριµένα, µελέτες σε ινοβλάστες, έδειξαν ότι η έκθεση σε στρεσογόνους παράγοντες οδηγεί σε ισχυρή και παρατεταµένη ενεργοποίηση της p38 και τελικά αναστολή του κυτταρικού κύκλου, ενώ η έκθεση σε µιτογόνους παράγοντες οδηγεί σε ασθενέστερη και παροδική ενεργοποίηση της p38 οδηγώντας τελικά σε µειωµένη φωσφορυλίωση της prb και επαγωγή του πολλαπλασιασµό (Εικόνα 5). Εικόνα 5: Υποθετική αναπαράσταση των διαφορετικών σηµατοδοτικών µονοπατιών που επάγονται ως απάντηση στα διαφορετικά σήµατα. Η απάντηση σε στρεσογόνα σήµατα δεν περιλαµβάνει την εµπλοκή µικρών GTPασών και οδηγεί τελικά σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου, ενώ η απάντηση σε µιτογόνα σήµατα περιλαµβάνει την δράση µικρών GTPασών και οδηγεί σε κυτταρικό πολλαπλασιασµό (Faust et al., 2012). Η µεγάλη ετεροµορφία που παρουσιάζει το συγκεκριµένο µονοπάτι ως προς το συνδυασµό των σηµατοδοτικών µορίων που ενεργοποιούνται και το τελικό αποτέλεσµα που επάγεται, ανάλογα µε τον κυτταρικό τύπο και το τύπο του ερεθίσµατος, το καθιστά ενδιαφέρον αντικείµενο µελέτης και γίνεται επιτακτική η ανάγκη για διευκρίνιση του εύρους συµβολής και των µηχανισµών του στα διάφορα κυτταρικά φαινόµενα (Faust et al., 2012). Στους δερµατικούς ινοβλάστες το µονοπάτι των p38 ΜΑΡΚ, έχει συσχετιστεί εκτός των άλλων και µε: την επαγόµενη από τον µετασχηµατιστικό αυξητικό παράγοντα - β (transforming growth factor beta, TGF-β) σύνθεση κολλαγόνου (Sato et al., 2002), την επαγωγή της έκφρασης της κολλαγενάσης (Matrix Metalloproteinase-1) (Reunanen and Kähäri, 2013), αλλά και την επαγόµενη από την IL-4 έκφραση της αναστολέα της µεταλλοπρωτεάσης 2 (Tissue inhibitor of metalloproteinase-2, TIMP-2), που αναστέλλει κολλαγενάσες (Ihn et al., 2002). 16

17 1.3. Akt κινάση Η κινάση σερίνης/θρεονίνης, Akt (ή αλλιώς πρωτεΐνη κινάση Β, protein kinase B, PKB) έχει σηµαντικό ρόλο σε πολλές κυτταρικές λειτουργιές, όπως στην πρωτεινοσύνθεση, τον µεταβολισµό, το πολλαπλασιασµό, την απόπτωση, την επιβίωση και την µετανάστευση. Η Akt ενεργοποιείται από την φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη-3 πρωτεϊνική κινάση (phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K) ως απάντηση σε επίδραση εξωγενών ερεθισµάτων, όπως κυτοκινών, αυξητικών παραγόντων και εξωγενών στρες και προάγει την κυτταρική επιβίωση (Εικόνα 6) (Song et al., 2005). Εικόνα 6: Σχηµατική απεικόνιση του µονοπατιού PI3K/Akt Συγκεκριµένα, η ενεργοποίηση της Akt πραγµατοποιείται µετά από φωσφορυλίωσή της σε δυο σηµεία, στο κατάλοιπο Thr308 από την PDK1 (phosphoinositide-dependent kinase 1) και στο κατάλοιπο Ser473 από το mtorc2 (mammalian target of rapamycin complex 2) (Gonzalez and McGraw, 2009). Υπάρχουν τρεις ισοµορφές πρωτεΐνης, οι Akt1/PKBα, Akt2/PKBβ και Akt3/PKBγ, εκ των οποίων η Akt1/PKBα αποτελεί την κύρια εκπρόσωπο. Βασικός ρόλος της Akt είναι η επαγωγή της κυτταρικής επιβίωσης και η παρεµπόδιση του κυτταρικού θανάτου, 17

18 απενεργοποιώντας προ-αποπτωτικούς παράγοντες όπως είναι οι BAD, κασπάση-9 και MDM2. Όπως θα αναλυθεί εκτενώς παρακάτω, η Akt ενεργοποιεί επίσης µέσω φωσφορυλίωσης τις κινάσες των αναστολέων του µεταγραφικού παράγοντα NF-κB, µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση και τη µετατόπιση του NF-κB από το κυτταρόπλασµα στον πυρήνα, την πρόσδεσή του σε αντι-αποπτωτικά γονίδια-στόχους (Wajant et al., 2003) Οµοίως µε την ΜΑΡ κινάση ERK, έτσι και το µονοπάτι της Akt εµφανίζει διαφορές σε γηρασµένα κύτταρα. Τα δύο µονοπάτια παίζουν σηµαντικό ρόλο στην διαδικασία του κυτταρικού πολλαπλασιασµού και φαίνεται ότι σε αντίθεση µε ότι συµβαίνει στα φυσιολογικά κύτταρα, εµφανίζουν µειωµένη ενεργότητα στον πυρήνα των γηρασµένων κυττάρων. Αυτό πιθανολογείται ότι οφείλεται σε µειωµένη µεταφορά των πρωτεϊνών αυτών από το κυτταρόπλασµα, στον πυρήνα, λόγω αυξηµένης δράσης εξειδικευµένων φωσφατασών (Lorenzini et al., 2002). 18

19 1.4. Σηµατοδότηση του TNF-α Ενεργοποίηση του µεταγραφικού παράγοντα NF-κB σε καταστάσεις φλεγµονής Ο µεταγραφικός παράγοντας NF-κB, (nuclear factor kappa B, NF-κB), αποτελεί ένα διµερή µεταγραφικό παράγοντα, µε κεντρικό ρόλο στην κυτταρική σηµατοδότηση. Η ενεργοποίηση του πραγµατοποιείται από προϊόντα βακτηριακής προέλευσης, κυτοκίνες, (όπως ο TNF και η IL-1) και στρεσογόνους παράγοντες, (όπως οι δραστικές µορφές ή ελεύθερες ρίζες οξυγόνου, reactive oxygen species, ROS και η υπεριώδη ακτινοβολία). Ο ενεργοποιηµένος NF-κB επάγει την έκφραση ποικίλων αντι-αποπτωτικών παραγόντων και αποτελεί έναν από τους πιο σηµαντικούς ρυθµιστές της έκφρασης προ-φλεγµονωδών γονιδίων, µεταξύ των οποίων βρίσκονται και τα γονίδια των κυτοκινών ΤNF-α, IL-1β, IL-6, και IL-8. Συνοπτικά, απουσία ερεθίσµατος, ο NF-κB (υποοµάδες p65 και p50) παραµένει συνδεδεµένος µε τον αναστολέα του, τον Ι-kB. Παρουσία του TNF, ο Ι-kB αποικοδοµείται πρωτεολυτικά και απελευθερώνεται ο NF-κB, ο οποίος εισέρχεται στον πυρήνα του κυττάρου, όπου εκτελεί την δράση του. Να σηµειωθεί ότι εκτός από την αποικοδόµηση του Ι-kB η οποία απελευθερώνει τον NF-κB, σηµαντική είναι ακόµα µια σειρά τροποποιήσεων και συγκεκριµένα, φωσφορυλιώσεων, οι οποίες είναι απαραίτητες για την ενεργοποίηση του NF-κB. Οι τροποποιήσεις αυτές πραγµατοποιούνται από ΜΑΡΚ και ισοµορφές της πρωτεΐνης κινάσης C (protein kinase C, PKC), όπως θα αναλυθεί παρακάτω. Εικόνα 7: ενεργοποίηση του παράγοντα NF-κB, ως απάντηση στην παρουσία του TNF (Wajant et al., 2003). 19

20 Ειδικότερα, σε εµβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού, (mouse embryonic fibroblasts, MEFs), έχει δειχθεί ότι τα µονοπάτια που ενεργοποιούνται από τον TNF-α, για την αποικοδόµηση του Ι-kB, συγκλίνουν στο σύµπλοκο ΙΚΚ (ΝΕΜΟ, ΙΚΚ1, ΙΚΚ2, Hsp90, Cdc37), τα συστατικά του οποίου είναι απαραίτητα για την αποτελεσµατική ενεργοποίηση του NF-κΒ (Εικόνα 7). Δύο βασικοί παράγοντες που στρατολογούνται ανεξάρτητα στον TNF-R1, στην µεµβράνη είναι οι TRAF2 και RIP, οι οποίοι ενεργοποιούν άµεσα είτε έµµεσα, (µέσω της ΜΕΚΚ3), αντίστοιχα, το σύµπλοκο ΙΚΚ, το οποίο συµβάλλει στην αποικοδόµηση του Ι-kB. Τέλος, οι κινάσες PKCζ και ΡΚΑ φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν πλήρως τον NF-κΒ, ο οποίος επάγει την έκφραση γονιδίωνστόχων (Wajant et al., 2003) Η ενεργοποίηση του NF-κΒ, µπορεί να οδηγήσει σε παθολογικές καταστάσεις. Συγκεκριµένα, σε ζωικά µοντέλα για φλεγµονώδη νοσήµατα, όπως η αρθρίτιδα, τα υψηλά επίπεδα του NF-κB φάνηκαν να είναι παθολογικά. Ως αποτέλεσµα της υπερέκφρασης του NF-κB, παρατηρείται αύξηση στα επίπεδα των κυτοκινών και στα µόρια προσκόλλησης (που αποτελούν κύρια χαρακτηριστικά των φλεγµονωδών νοσηµάτων), καθώς και αύξηση χηµειοκινών, µεταλλοπρωτεασών (ΜΜΡs), και του παράγοντα Cox-2 (Tak and Firestein, 2001; Lawrence, 2009) Ενεργοποίηση των JNK MAPKs Η σύνδεση του TNF-α µε το µονοπάτι των JNK MAPKs διαµεσολαβείται µέσω του παράγοντα TRAF2 η παρουσία του οποίου φαίνεται να είναι απαραίτητη. Όπως και κατά την ενεργοποίηση του NF-κB, ο TRAF2 στρατολογείται στον TNF-R1, στην µεµβράνη µέσω της παρουσίας της πρωτεΐνης που προσδένεται στις περιοχές θανάτου του TNF-α (TNF receptor-associated death domain protein, TRADD). Αυτή την φορά, ο TRAF2 αλληλεπιδρά µε πρωτεΐνες της οικογένειας GSK, οι οποίες φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν κινάσες οι οποίες τελικά φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν τις JNKs (Εικόνα 8). Παράλληλα, ο TRAF2 αυξάνει επίσης τα επίπεδα των ROS µε έναν µηχανισµό που δεν είναι ακόµα πλήρως κατανοητός, τα οποία οξειδώνουν τον παράγοντα Trx, οδηγώντας στην απελευθέρωση της πρωτεΐνης ASK1. Ο TRAF2 αλληλεπιδρά µε την ελεύθερη ASK1 και την ενεργοποιεί. Η ενεργοποιηµένη ASK1, συµµετέχει στην συνέχεια στην ενεργοποίηση της ΜΚΚ7 και κατ επέκταση, στην ενεργοποίηση των JNKs. Να σηµειωθεί ότι η ASK1 συµβάλλει στην παρατεταµένη ενεργοποίηση των JNKs από τον TNF-α. 20

21 Τέλος να αναφερθεί ότι το µονοπάτι των JNKs ενεργοποιείται ακόµα µέσω της παρουσίας αποπτωτικών σηµάτων. Στο µονοπάτι αυτό περιλαµβάνεται ο παράγοντας FADD (Fas-associated death-domain protein) και η ενεργοποίηση κασπασών και θα αναλυθεί αναλυτικότερα παρακάτω (Wajant et al., 2003). Εικόνα 8: Ενεργοποίηση των p38 και JNK ΜΑΡΚ που σχετίζονται µε το στρες (stress-activated protein kinases), παρουσία του TNF-α (Wajant et al., 2003) Ενεργοποίηση των p38 ΜΑΡΚ Σε αντίθεση µε το µονοπάτι των JNKs, η ενεργοποίηση των p38 ΜΑΡΚ, διαµεσολαβείται από την πρωτεΐνη RIP. Από την άλλη, οι πρωτεΐνες TRAF2, ASK1 και ΜΕΚΚ1, έχει αποδειχθεί να παίζουν σηµαντικό ρόλο και στα δυο µονοπάτια. Η ενεργοποιηµένη RIP, οδηγεί µε έναν µη πλήρως κατανοητό ακόµα τρόπο, σε ενεργοποίηση της κινάσης ΜΕΚΚ3, η οποία φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την p38 ΜΑΡΚ (Εικόνα 8). Οι ισοµορφές της p38, εκτός των άλλων, παίζουν σηµαντικό ρόλο στην φλεγµονή, καθώς συµβάλουν στην αύξηση των IL-1 και IL-6 µέσω της σταθεροποίησης των mrnas τους. Παράλληλα, ενεργοποιεί τους µεταγραφικούς παράγοντες ATF2, CHOP, CREB και ELK1 και ενδέχεται να συµβάλλει ακόµα στην περαιτέρω ενεργοποίηση του NF-κΒ (Wajant et al., 2003; Sabio and Davis, 2014) Ενεργοποίηση των ERK MAPK Σε αντίθεση µε τις κινάσες που ενεργοποιούνται από το στρες (stress-activated MAPK), p38 και JNKs, οι κινάσες, ERK, φαίνεται να ενεργοποιούνται µόνο σε ένα µικρό βαθµό από τον TNF-α. Ωστόσο, το µονοπάτι των ERK φαίνεται να συµβάλει σε µετα-µεταγραφικές ρυθµίσεις του TNF-α. Συγκεκριµένα, συµβάλλει στην έξοδο από τον πυρήνα του mrna του TNF-α, σε τροποποιήσεις 21

22 µέσω του ενζύµου TACE, αλλά και στην µετάφρασή του (Wajant, Pfizenmaier and Scheurich, 2003; Sabio and Davis, 2014) Επαγωγή απόπτωσης ή νέκρωσης από τον TNF-α Ο TNF-α είναι ικανός να επάγει απόπτωση είτε νέκρωση µέσω δυο διακριτών µονοπατιών (Εικόνα 9). Η επαγωγή της απόπτωσης από τον TNF-α περιλαµβάνει την ενεργοποίηση του παράγοντα FADD και κασπασών οι οποίες αυτορυθµίζονται και ενεργοποιούνται, οδηγώντας τελικά στην έξοδο του κυτοχρώµατος από τα µιτοχόνδρια και την απόπτωση του κυττάρου (Rath and Aggarwal, 1999). Εικόνα 9: Επαγόµενος από τον TNF-α κυτταρικός θάνατος. Η παρουσία του TNF-α µπορεί να οδηγήσει σε απόπτωση ή νέκρωση. Τα δύο µονοπάτια αλληλεπιδρούν και αναστέλλουν το ένα το άλλο σε ένα βαθµό (Wajant et al., 2003). Από την άλλη, µέσω της ενεργοποίησης των παραγόντων RIP και TRAF2 και την επαγόµενη αύξηση των επιπέδων των ROS, ο TNF-α ενεργοποιεί επιδιορθωτικούς µηχανισµούς του κυττάρου που αποκρίνονται σε βλάβες του DNA, (DNA damage response, DDR). Την αύξηση των επιπέδων των ROS ακολουθεί η αύξηση µιας βασικής πρωτεΐνης του DDR, της PARP-1 (Poly ADP ribose polymerase), η εκτεταµένη δράση της οποίας οδηγεί σε εξάντληση των ενεργειακών αποθεµάτων του 22

23 ATP. Δεδοµένου ότι, η διαδικασία της απόπτωσης απαιτεί υψηλή ποσότητα ATP, η έλλειψή του τελευταίου, οδηγεί τελικά σε νέκρωση του κυττάρου (Ha and Snyder, 1999; Polo and Jackson, 2011) Αξίζει να σηµειωθεί ακόµα ότι, η ενεργοποιηµένη κασπάση 3, η οποία συµµετέχει στο µονοπάτι της απόπτωσης, έχει την δυνατότητα να κόβει την πρωτεΐνη PARP-1 και να την απενεργοποιεί, εµποδίζοντας έτσι την επαγωγή της νέκρωσης (Wajant et al., 2003) Από τα παραπάνω, γίνεται σαφές ότι, ο καθορισµός του τελικού αποτελέσµατος (απόπτωσης ή νέκρωσης), καθορίζεται από την αλληλεπίδραση των µορίων που συµµετέχουν στα δυο µονοπάτια και ότι η επαγωγή της απόπτωσης αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα για την επαγωγή της νέκρωσης, αλλά και το αντίστροφο. 23

24 1.5. Γήρανση και φλεγµονή Η αύξηση του προσδόκιµου ζωής, ο µεγάλος αριθµός γηραιών ατόµων, καθώς και η ραγδαία ανάπτυξη ασθενειών που σχετίζονται µε το γήρας, έκαναν επιτακτική την ανάγκη για µελέτη του φαινοµένου της ανθρώπινης γήρανσης. Σε πολλές περιπτώσεις, περιστατικά χρόνιας φλεγµονής έχουν συσχετιστεί µε την αύξηση της ηλικίας και πολλές ηλικιο-εξαρτώµενες ασθένειες, (συµπεριλαµβανοµένου του καρκίνου). Η εξακρίβωση του ρόλου του κάθε φαινοµένου και των µοριακών µηχανισµών που τα χαρακτηρίζουν είναι ύψιστης σηµασίας για την διαλεύκανση της συµβολής του κάθε ενός στις ηλικιο-εξαρτώµενες παθήσεις. Γενικά πάντως, φαίνεται πως ο TNF-α αποτελεί κεντρικό µόριο µε κοµβικό ρόλο στα σηµατοδοτικά µονοπάτια που εµπλέκονται και στις δύο διεργασίες (Licastro et al., 2005; Jenny, 2012) Φλεγµονή Η φλεγµονή εκδηλώνεται ως µια απόκριση του οργανισµού σε παθογόνα ερεθίσµατα, αποτελεί µέρος της µη ειδικής απόκρισης του ανοσοποιητικού συστήµατος και έχει ως στόχο την προστασία του οργανισµού (Kumar et al., 2004). Κατά την διαδικασία της φλεγµονής µια σειρά προ-φλεγµονωδών µορίων παράγονται και εκκρίνονται, κατά κύριο λόγο, από ενεργοποιηµένα µακροφάγα, οδηγώντας σε θετική ρύθµιση περαιτέρω ανοσολογικών αποκρίσεων. Χαρακτηριστικές προ-φλεγµονώδεις κυτοκίνες που παράγονται είναι οι ιντερλευκίνες 1 και 6 (IL-1β και IL-6) και ο TNF-α. Η ρύθµιση της ανοσολογικής απάντησης στο επίπεδο της φλεγµονής ρυθµίζεται µέσω της ισορροπίας µεταξύ προ-φλεγµονωδών και αντι-φλεγµονωδών κυτοκινών. Οι τελευταίες είναι υπεύθυνες για την αναστολή της φλεγµονώδους απόκρισης και χαρακτηριστικοί εκπρόσωποι της συγκεκριµένης οµάδας είναι η IL-10 και ο µετασχηµατιστικός αυξητικός παράγοντας - β (Transforming growth factor beta, TGF-β). Απορρύθµιση ή τροποποίηση της φυσιολογικής λειτουργίας των µηχανισµών που σχετίζονται µε την φλεγµονή έχουν συσχετιστεί µε παθολογικές καταστάσεις, γνωστές και ως φλεγµονώδη νοσήµατα. Χαρακτηριστικά παραδείγµατα που ανήκουν σε αυτή την οικογένεια νοσηµάτων είναι πολλά αυτοάνοσα νοσήµατα, όπως η ρευµατοειδής αρθρίτιδα (rheumatoid arthritis, RA), ο διαβήτης τύπου ΙΙ και οι φλεγµονώδεις νόσοι του εντέρου, (η νόσος του Crohn και η ελκώδης κολίτιδα), ενώ στην κατηγορία αυτή περιλαµβάνονται ακόµα αλλεργικές αντιδράσεις, το άσθµα και η απόρριψη (Donath and Shoelson, 2011; Cicchitti et al., 2015). Στην θεραπευτική προσέγγιση των νοσηµάτων αυτών, περιλαµβάνεται η καταστολή της φλεγµονής µέσω της στόχευσης προ-φλεγµονωδών 24

25 κυτοκινών, όπως είναι ο TNF-α (Popa et al., 2007; Esposito and Cuzzocrea, 2009; Peyrin-Biroulet, 2010) Κυτταρική γήρανση Η κυτταρική γήρανση αναφέρεται στο φαινόµενο κατά το οποίο κύτταρα σε καλλιέργεια εµφανίζονται να έχουν περιορισµένο χρόνο ζωής, καθώς φαίνεται να χάνουν την ικανότητα αντιγραφής του DNA και κυτταρικού πολλαπλασιασµού τους µετά από έναν πεπερασµένο αριθµό κυτταρικών διαιρέσεων (Εικόνα 10). Η παρατήρηση αυτή έγινε πρώτη φορά πριν από 56 χρόνια, το 1961, από τους L. Hayflick και Moorhead (HAYFLICK and MOORHEAD, 1961). Εικόνα 10: Σχηµατική απεικόνιση του κύκλου ζωής των κυττάρων σε καλλιέργεια. Στην φάση ΙΙ τα κύτταρα υφίστανται συνεχείς διαιρέσεις κατά τις οποίες µπορεί να πραγµατοποιηθεί είτε µείωση του µεγέθους των τελοµερών και να επέλθει αναστολή του κυτταρικού κύκλου (Φάση ΙΙΙ), είτε µεταλλάξεις που θα οδηγήσουν σε αθανατοποιηµένη καλλιέργεια Πρόωρη κυτταρική γήρανση επαγόµενη από στρες (SIPS) Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η περίπτωση στην οποία, κύτταρα που εκτίθενται σε µη κυτταροτοξικές δόσεις εξωγενούς στρες εκδηλώνουν τον γηρασµένο φαινότυπο, ανεξαρτήτως από το µέγεθος των τελοµερών των χρωµοσωµάτων, αλλά και του αριθµού των κυτταρικών διαιρέσεων που έχουν εκτελέσει, όπως συµβαίνει κατά την αναδιπλασιαστική γήρανση. Αυτό το είδος γήρανσης ονοµάζεται πρόωρη κυτταρική γήρανση επαγόµενη από στρες (Stress Induced Premature 25

26 Senescence, SIPS) και στους τύπους του εξωγενούς στρες που µπορούν να την προκαλέσουν περιλαµβάνονται: η ιονίζουσα (IR) και υπεριώδης (UV) ακτινοβολία, το οξειδωτικό στρες και η υπεροξία (Toussaint et al., 2000). Η υπερέκφραση συγκεκριµένων ογκογονιδίων που µπορεί να προκληθεί είτε από την παρουσία ογκογόνων ιών, είτε από µεταλλάξεις, οδηγεί επίσης σε πρόωρη κυτταρική γήρανση. Το είδος της συγκεκριµένης επαγόµενης κυτταρικής γήρανσης ονοµάζεται Γήρανση επαγόµενη από ογκογονίδια (oncogene-induced senescence, OIS) (Gorgoulis and Halazonetis, 2010), και υπογραµµίζει τον ρόλο της κυτταρικής γήρανσης ως ένα βασικό µηχανισµό παρεµπόδισης της καρκινογένεσης. Αξιοσηµείωτο είναι ακόµα το γεγονός ότι, ο γηρασµένος φαινότυπος εκδηλώνεται και παρουσία συγκεκριµένων προ-φλεγµονωδών παραγόντων. Συγκεκριµένα, ανθρώπινοι δερµατικοί ινοβλάστες παρουσιάζουν χαρακτηριστικά κυτταρικής γήρανσης παρουσία των προ-φλεγµονωδών µορίων TNF-α και IL1 (Dumont et al., 2000; Toussaint et al., 2002) Έκκριση φλεγµονωδών µορίων από γηρασµένα κύτταρα (senescence-associated secretory phenotype, SASP) Το µικροπεριβάλλον γηρασµένων κυττάρων χαρακτηρίζεται από έναν συγκεκριµένο φαινότυπο, εκκρινόµενων µορίων γνωστό ως SASP, (senescence-associated secretory phenotype). Μεταξύ των µορίων που εκκρίνονται από τα γηρασµένα κύτταρα, είναι και ο TNF-α, η IL-6, χηµειοκίνες και µεταλοπρωτεάσες, ΜΜΡs (Tchkonia et al., 2013; Prattichizzo et al., 2016). Οι πρωτεΐνες που αποτελούν το SASP χαρακτηρίζονται από υψηλή ικανότητα να προκαλούν τροποποιήσεις στο περιβάλλον τους µεταξύ των οποίων συγκαταλέγονται: ο καταβολισµός της εξωκυττάριας µήτρας, η προσέλκυση µορίων του ανοσοποιητικού συστήµατος και η ανοσορρύθµιση, η ευαισθητοποίηση των γειτονικών κυττάρων στο γήρας, ενώ επειρεάζουν ακόµα την ανάπτυξη καρκινικών όγκων που βρίσκονται στην περιοχή (Özcan et al., 2016). Στο πλαίσιο αυτό υπάρχουν ενδείξεις ότι, αναστολή του συγκεκριµένου φαινότυπου, µπορεί να οδηγήσει σε επιβράδυνση της διαδικασίας της γήρανσης, και πολλών ηλικιο-εξαρτώµενων ασθενειών (Prattichizzo et al., 2016). 26

27 1.6. Δραστικές µορφές οξυγόνου και οξειδωτικό stress Οι ελεύθερες ρίζες αποτελούν µόρια τα οποία περιέχουν ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια και χαρακτηρίζονται από την ικανότητα να υπάρχουν, χωρίς να δηµιουργούν υποχρεωτικά δεσµούς µε άλλα µόρια. Στα ζωντανά συστήµατα, οι ελεύθερες ρίζες εκφράζονται, κατά κύριο λόγο, ως δραστικές µορφές οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS). Έκτος από την εξωγενή προέλευσή τους, οι ROS µπορεί να παράγονται και από το ίδιο το κύτταρο ως παραπροϊόντα του φυσιολογικού µεταβολισµού (Wagner et al., 1992). Συγκεκριµένα, µπορεί να παράγονται κατά την οξειδωτική φωσφορυλίωση των µιτοχονδρίων (Chance et al., 1979), κατά την οξειδωτική παραγωγή ριζών µονοξειδίου του αζώτου και υποχλωριώδους οξέος σε φαινόµενα φαγοκυττάρωσης και κατά την αποδόµηση λιπαρών οξέων και άλλων µακροµορίων στα υπεροξεισώµατα (Εικόνα 11) (Kasai et al., 1989; Ames et al., 1993). Οι πολύ υψηλές συγκεντρώσεις των ROS, είναι τοξικές για τη λειτουργιά του κυττάρου, καθώς τα µόρια αυτά είναι πτητικά και ασταθή και είναι ικανά να προσθέτουν ηλεκτρόνια σε άλλα γειτονιά τους µόρια µε σκοπό να απελευθερώσουν ενέργεια και να αποκτήσουν σταθερότερη µορφή. Βασικό µόριο-στόχος των ROS αποτελεί το DNA, µε αποτέλεσµα την πρόκληση γενετικών βλαβών. Συγκεκριµένα, οι βλάβες που προκαλούνται στο γενετικό υλικό από τις ROS µπορούν να χωριστούν σε 4 κατηγορίες: 1) Κατακερµατισµός µονήρους ή διπλής έλικας 2) Ανταλλαγή αδελφών χρωµατιδίων 3) Συζεύξεις DNA-DNA και DNA-πρωτεΐνης 4) Μετατροπές βάσεων Οι οξειδωτικές αυτές αλλοιώσεις αναστέλλουν τη µεταγραφή, τη µετάφραση και τον διπλασιασµό του DNA, οδηγώντας σε µεταλλάξεις και τελικά σε κυτταρικό θάνατο (Halliwell and Aruoma, 1991; von Zglinicki et al., 2001). Το 1956, διατυπώθηκε για πρώτη φορά από τον Harman η «Θεωρία των ελεύθερων ρίζων» (free radical theory), η οποία υποστηρίζει ότι το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από τις υψηλές συγκεντρώσεις ROS ευθύνεται, ως επί το πλείστων, για το φαινότυπο της κυτταρικής γήρανσης (Toussaint et al., 2002). 27

28 Με στόχο να αποφευχθούν οι υψηλές ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις των ROS, τα κύτταρα διαθέτουν αντιοξειδωτικούς µηχανισµούς, (οξειδοαναγωγική ρύθµιση, redox regulation) προβλήµατα στους οποίους οδηγούν σε ενδοκυττάρια συσσώρευση των ROS (Liochev, 2014). Ο όρος οξειδωτικό stress, δηλώνει την κατάσταση στην οποία υπάρχει ανισορροπία αναµεσά στην παραγωγή ROS και στη λειτουργία του αντιοξειδωτικού µηχανισµού του κυττάρου, κάτι που οδηγεί τελικά σε καταστροφή του κυττάρου και κυτταρική γήρανση. Παρά τις καταστρεπτικές συνέπειες του οξειδωτικού στρες στο γενετικό υλικό και στη βιοχηµική λειτουργία των βιοµορίων, οι δραστικές µορφές οξυγόνου όταν παράγονται σε χαµηλές ποσότητες από το κύτταρο, παίζουν σηµαντικό ρολό στη φυσιολογική λειτουργία του, ενεργοποιώντας ενζυµικά συστήµατα και µονοπάτια µεταγωγής σήµατος. Τέτοιο µονοπάτι είναι το µονοπάτι των MAP κινασών, η ενεργοποίηση του οποίου συµβάλει στην κυτταρική διαφοροποίηση, στη µεταγραφή των γονίδιων στη φλεγµονή και στην απόπτωση προστατεύοντας τελικά το κύτταρο. Συµπεραίνουµε λοιπόν ότι, η λεπτή ισορροπία αναµεσά στις ευεργετικές και τις βλαβερές δράσεις των ενεργών ρίζων είναι µείζονος σηµασίας για τους ζωντανούς οργανισµούς. Τέλος να σηµειωθεί ότι το φαινόµενο του οξειδωτικού στρες είναι έντονο σε χρόνιες φλεγµονώδεις παθήσεις, όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας, η ρευµατοειδής αρθρίτιδα και η αθηροσκλήρωση (Valko et al., 2007). Στις περιπτώσεις αυτές τα µακροφάγα εκκρίνουν ROS και προκαλούν οξειδωτικές αλλοιώσεις στους παρακείµενους ιστούς (Bertram and Hass, 2008), ενώ παράλληλα επάγουν την έκκριση φλεγµονωδών κυτταροκινών και οφείλονται για τον φλεγµονώδη φαινότυπο των ιστών (Schreck and Baeuerle, 1991). Εικόνα 11: Οξειδωτικά προϊόντα φυσιολογικού µεταβολισµού σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Οι κύριοι αντιπρόσωποι των ROS είναι το υπεροξειδικοό ανιόν (Ο2 - ), το υπεροξείδιο του υδρογόνου, το νιτρικό οξείδιο (NO ), η υπεροξειδική ρίζα (OH ), το υδροξυλικό ανιόν και το µονήρες οξυγόνο ( - Ο2). Στα βιολογικά συστήµατα, η συσσώρευση των ROS έχει ως αποτέλεσµα το κύτταρο να οδηγείται σε γήρανση (Murphy, 2009; Sena and Chandel, 2012). 28

29 1.7. Δέρµα Δοµή δέρµατος και σύσταση εξωκυττάριας µήτρας Το δέρµα αποτελεί τον µεγαλύτερο ιστό του ανθρώπινου σώµατος και χωρίζεται µορφολογικά σε τρεις διακριτές στιβάδες (Εικόνα 12): Την επιδερµίδα (epidermis), που βρίσκετε στο εξωτερικό µέρος του δέρµατος, τη δερµίδα (dermis) και τον υποδόριο ιστό (subcutis) στο εσωτερικό µέρος του δέρµατος. Η επιδερµίδα αποτελεί πολύστιβο, πλακώδες κερατινοποιηµένο επιθήλιο, περιέχει πολυάριθµα κερατινοκύτταρα και ορισµένα µελανοκύτταρα, κύτταρα του ανοσοποιητικού και κύτταρα Langerhans. Εσωτερικότερα, η δερµίδα στηρίζει την επιδερµίδα, έχει πάχος περίπου 1-5mm και είναι υπεύθυνη τόσο αυτή, (κατά κύριο λόγο), όσο και ο υποδόριος ιστός για την θερµορύθµιση του δέρµατος και την παροχή σε θρεπτικά συστατικά. Εικόνα 12: Σχηµατική απεικόνιση της δοµής του δέρµατος 29

30 Οι δερµατικοί ινοβλάστες της δερµίδας, είναι επιµήκη κύτταρα µε µεγάλη πολλαπλασιαστική ικανότητα και είναι υπεύθυνα τόσο για την σύνθεση των συστατικών της εξωκυττάριας µήτρας (extracellular matrix, ECM), όσο και για την σύνθεση µεταλλοπρωτεασών (metalloproteinases ΜMPs), µορίων που αποικοδοµούν τα συστατικά της τελευταίας. H εξωκυττάρια µήτρα των δερµατικών ινοβλαστών περιλαµβάνει: νερό, ινώδεις πρωτεΐνες βασικότερες εκ των οποίων είναι το κολλαγόνο (77% του ξηρού βάρους του ανθρώπινου δέρµατος), η ελαστίνη και η φιµπρονεκτίνη, πρωτεογλυκάνες (PGs) και γλυκοζαµινογλυκάνες (GAGs). Να σηµειωθεί ότι οι πιο χαρακτηριστικές πρωτεογλυκάνες στο δέρµα είναι το υαλουρονικό οξύ, (hyaluronan, HA), η ντεκορίνη και η βερσικάνη (Frantz et al., 2010; Tracy et al., 2016) Η κυτταρική γήρανση του δέρµατος και η δράση του TNF-α Η γήρανση του δέρµατος µπορεί να προκληθεί είτε από εξωγενείς, είτε από ενδογενείς παράγοντες. Στους εξωγενείς παράγοντες ανήκει η υπεριώδης (UV) ακτινοβολία, η οποία οδηγεί σε οξειδωτικό στρες, που οδηγεί σε πρόκληση βλαβών στο DNA και κατ επέκταση γήρανση των δερµατικών ινοβλαστών. Από την άλλη, η πρόκληση φλεγµονής των κυττάρων του δέρµατος και η παρουσία των φλεγµονωδών παραγόντων, έχει αποδειχθεί να αποτελεί παράγοντα υπεύθυνο για την γήρανση των κυττάρων του δέρµατος. Το πιο αντιπροσωπευτικό χαρακτηριστικό της γήρανσης του δέρµατος, αποτελεί ο σχηµατισµός ρυτίδων, χαρακτηριστικό που οφείλεται κυρίως στη µείωση της ελαστικότητας του ιστού και στην αποικοδόµηση της εξωκυττάριας µήτρας. Η αποικοδόµηση της εξωκυττάριας µήτρας οφείλεται στην επαγωγή των µεταλλοπρωτεασών της εξωκυττάριας µήτρας (matrix metalloproteinase, MMPs) και στην αποδόµηση του κολλαγόνου από αυτές. Οι µεταλοπρωτεάσες της εξωκυττάριας µήτρας ανήκουν στην οικογένεια ενδοπεπτιδασών ψευδαργύρου, χωρίζονται σε κολλαγενάσες, στρωµελυσίνες, ζελατινάσες και µεµβρανικού τύπου µεταλοπρωτεάσες (MT-MMPs) και είναι ικανές να αποικοδοµούν µακροµόρια της εξωκυττάριας µήτρας. Πιο συγκεκριµένα, οι κολλαγενάσες (MMP-1) αποσυνθέτουν πολλούς τύπους κολλαγόνου ενώ οι στρωµελυσίνες (MMP-3) εκτός από κολλαγόνο, αποσυνθέτουν πρωτεογλυκάνες, λαµινίνες και φιµπρονεκτίνη (Brenneisen et al., 2002). Όπως προαναφέρθηκε, οι δερµατικοί ινοβλάστες είναι υπεύθυνοι για την σύνθεση των µεταλλοπρωτεασών της εξωκυττάριας µήτρας. 30

31 Στους δερµατικούς ινοβλάστες, η δράση του TNF-α έχει συσχετιστεί µε την αποικοδόµηση της εξωκυττάριας µήτρας και την διαδικασία της κυτταρικής γήρανσης. Ο TNF-α φαίνεται να δρα σε επίπεδο µεταγραφής µειώνοντας τα επίπεδα των mrna των προ-κολλαγενασών τύπου I, (Col-1) και III, (Col-3) και αναστέλλοντας τελικά την σύνθεση του κολλαγόνου αλλά και της φιµπρονεκτίνης (Mauviel et al., 1991; Bigot et al., 2012). Παράλληλα, αρκετές µελέτες υποδεικνύουν ότι κατόπιν της επαγωγής φλεγµονής και παρουσία του TNF-α, ενεργοποιείται ο µεταγραφικός παράγοντας NFκB ο οποίος ρυθµίζει την γήρανση του δέρµατος, ελέγχοντας τα επίπεδα έκφρασης της MMP-1 από τους δερµατικούς ινοβλάστες. Στο συγκεκριµένο µονοπάτι ενεργοποίησης του NF-κB σηµαντικό ρόλο παίζουν και οι πρωτεΐνες MAP κινάσες (Bae et al., 2015) Παραγωγή του TNF-α στο δέρµα Εκτός από τα µακροφάγα, στην δερµίδα ο TNF-α παράγεται και από ειδικά κύτταρα του ανοσοποιητικού, τα µαστοκύτταρα (mast cells). Τα κύτταρα αυτά είναι µεγάλα στο µέγεθος και περιέχουν κυστίδια µε πολλά µόρια ενεργού TNF-α. Κατόπιν συγκεκριµένων σηµάτων, τα κυστίδια από αποικοδοµούνται, απελευθερώνοντας στον εξωκυττάριο χώρο τον TNF-α. Επίσης, παρουσία υπεριώδους Β ακτινοβολίας (UVB), TNF-α µπορεί να παραχθεί από κερατινοκύτταρα και δερµατικούς ινοβλάστες. Στην περίπτωση αυτή, στο ακτινοβοληµένο δέρµα ταυτοποιήθηκε αυξηµένη IL-1α, η οποία αυξάνει την παραγωγή TNF-α (Walsh et al., 1991; Bashir et al., 2009) Προ-φλεγµονώδεις κυτοκίνες παράγονται επίσης από το δέρµα και στην περίπτωση τραυµατισµού. Συγκεκριµένα, κατά την επούλωση πληγών στο δέρµα, επάγεται οξεία φλεγµονώδης απόκριση. Κυτοκίνες που παράγονται από κύτταρα που σχετίζονται µε την διαδικασία της φλεγµονής όπως ο µετασχηµατιστικός αυξητικός παράγοντας - β (Transforming Growth Factor β, TGF-β), o αυξητικός παράγοντας που εκκρίνεται από τα αιµοπετάλια (platelet-derived growth factor, PDGF), ο επιδερµικός αυξητικός παράγοντας (epidermal growth factor, EGF), η IL-1, ο TNF-α, η IL-4 και η IL-6, επάγουν την σύνθεση συστατικών της εξωκυττάριας µήτρας, από τους δερµατικούς ινοβλάστες, η οποία συµβάλλει στην επούλωση του τραύµατος (Ihn et al., 2002). Να σηµειωθεί επίσης ότι ο TNF-α επάγει την επιθηλιακή µεσεγχυµατικής µετάπτωση (epithelial-mesenchymal transition, EMT) των κερατινοκυττάρων του δέρµατος, που πραγµατοποιείται κατά την επούλωση των πληγών (Yan et al., 2010). Λόγω του µεγάλου αριθµού ινοβλαστών που υπάρχουν σε ολόκληρο το σώµα και των ιδιαίτερων ιδιοτήτων που παρουσιάζουν τα συστατικά την εξωκυττάριας µήτρας τους, η οποία 31

32 αποτελεί το εξωκυττάριο περιβάλλον τόσο των ίδιων, όσο και των γειτονικών τους κυττάρων, έχει θεωρηθεί ότι πιθανώς να παίζουν σηµαντικό ρόλο και στην διαδικασία της φλεγµονής και ενδέχεται η στόχευσή τους να αποτελεί µια αποτελεσµατική θεραπευτική προσέγγιση (Flavell et al., 2009). Πράγµατι, έχει παρατηρηθεί αλληλεπίδραση µεταξύ των κυττάρων του ανοσοποιητικού και ινοβλαστών (Van Linthout et al., 2014). Συγκεκριµένα, αρθρικοί ινοβλάστες παρουσίασαν αύξηση στην παραγωγή των κυτοκινών IL-6 και IL-8 επαγόµενη από την παρουσία του TNF-α των Β κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος. Ταυτόχρονα, τα Β κύτταρα, παρήγαγαν αυξηµένα επίπεδα προ-φλεγµονωδών κυτοκινών TNF-α και IL-1β, η έκφραση των οποίων φαίνεται να αναστέλλεται από την αύξηση των κυτοκινών IL-6 και IL-8 των ινοβλαστών, µε έναν µηχανισµό που µεσολαβείτε από το TGF-β. Στην περίπτωση αυτή, ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι οι συγκεκριµένοι ινοβλάστες παρουσίασαν φαινότυπο παρόµοιο µε αυτόν των παθολογικών κυττάρων στην ρευµατοειδή αρθρίτιδα επισηµαίνοντας την συµβολή της αλληλεπίδρασης µεταξύ των κυττάρων του ανοσοποιητικού και των ινοβλαστών κατά την παθολογία του ιστού (Störch et al., 2016). 32

33 1.8. Μεσοσπονδύλιος δίσκος Δοµή και λειτουργία Ο µεσοσπονδύλιος δίσκος (intervertebral disc) αποτελεί µια δοµή, η οποία παρεµβάλλεται µεταξύ των σωµάτων των σπονδύλων, συνιστώντας την κύρια άρθρωση της σπονδυλικής στήλης. Παρέχει ελαστικότητα και ευλυγισία στην σπονδυλική στήλη, καθιστώντας την ικανή να εκτελεί ένα ευρύ φάσµα καµπτικών και στροφικών κινήσεων, ενώ παράλληλα την προστατεύει από κραδασµούς και τα υψηλά φορτία που ασκούνται πάνω της. Συνεπώς, εκφύλιση του µεσοσπονδύλιου δίσκου, οδηγεί σε σηµαντικά κινητικά προβλήµατα και πόνο, όπως θα αναλυθεί εκτενώς παρακάτω. Ανατοµικά, ο µεσοσπονδύλιος δίσκος εκτείνεται από την αυχενική µέχρι και την κοκκυγική µοίρα, διαιρούµενος σε 25 συνολικά τµήµατα (δίσκους): 6 αυχενικούς, 12 θωρακικούς, 6 οσφυϊκούς και έναν µεταξύ του ιερού οστού και του κόκκυγα. Ο κάθε δίσκος αποτελείται από δύο διακριτές περιοχές: τον εξωτερικό ινώδη δακτύλιο (annulus fibrosus, AF) και τον εσωτερικό πηκτοειδή πυρήνα (nucleus pulposus, NP), (Εικόνα 13), (Humzah and Soames, 1988). Εικόνα 13: Σχηµατική απεικόνιση του µεσοσπονδύλιου δίσκου. Στον ινώδη δακτύλιο τα κύτταρα εµφανίζουν µορφολογική ποικιλία και αναλόγως µε την θέση τους µέσα στον δακτύλιο µπορεί να είναι σφαιρικά ή επιµήκη, µε κατεύθυνση παράλληλη ως 33

34 προς τις ίνες κολλαγόνου και των γλυκοζαµινογλυκανών. Αντίθετα, τα κύτταρα του πηκτοειδούς πυρήνα, είναι σφαιρικά, µοιάζουν µε χονδροκύτταρα και περιβάλλονται από εξωκυττάρια µήτρα (Extracellular Matrix, ECM), η οποία χαρακτηρίζεται από την παρουσία κολλαγόνου τύπου ΙΙ και αγγρεκάνης, η οποία είναι υπεύθυνη για την υψηλή ενυδάτωση του δίσκου, καθώς και άλλων πρωτεογλυκανών (ντεκορίνη, λουµικάνη, φιµπροµοντουλίνη) και γλυκοζαµινογλυκανών (GAGs) (Eyre and Muir, 1977; Muir, 1995; Czamanski Salvatierra et al., 2011; Chen et al., 2013) Οι δυο περιοχές διαφέρουν, ακόµα, ως προς την πηγή προέλευσής τους, µε τον ινώδη δακτύλιο να είναι µεσεγχυµατικής προέλευσης και τον πηκτοειδή πυρήνα να προέρχεται από τη νωτοχορδή. Κατά την εµβρυογένεση, τα κύτταρα της νωτοχορδής εξαφανίζονται από το σώµα, εκτός από εκείνα που παραµένουν στον πηκτοειδή πυρήνα του δίσκου των νεαρών ατόµων µέχρι και την ηλικία των 10 χρόνων (Wolfe et al., 1965; Lee et al., 2007). Στον άνθρωπο και ορισµένα άλλα ζώα, συµπεριλαµβανοµένων των βοοειδών, πριν από την ωρίµανση, τα κύτταρα της νωτοχορδής στην περιοχή του πηκτοειδούς πυρήνα, αντικαθίστανται από ώριµα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα (mature NP cells, MNPCs), τα οποία, όπως προαναφέρθηκε, µοιάζουν περισσότερο µε χονδροκύτταρα (Guehring et al., 2009) Αγγείωση µεσοσπονδύλιου δίσκου Ο µεσοσπονδύλιος δίσκος παρουσιάζει κανονική αγγείωση κατά τα εµβρυϊκά στάδια, η οποία, ωστόσο, ελαττώνεται σηµαντικά µε την πάροδο των χρόνων. Έτσι τελικά, τα τριχοειδή αγγεία της κυκλοφορίας του αίµατος περιορίζονται µόνο στον περιφερειακό ινώδη δακτύλιο και η µεταφορά θρεπτικών συστατικών και οξυγόνου στον πηκτοειδή πυρήνα πραγµατοποιείται µέσω διάχυσης, γεγονός που καθιστά το µεσοσπονδύλιο δίσκο, το µεγαλύτερο ιστό στο ανθρώπινο σώµα χωρίς αγγείωση (Bibby et al., 2005). Μικρά µόρια, όπως γλυκόζη και οξυγόνο διαχέονται στο εσωτερικό του πηκτοειδούς πυρήνα, όπου απαιτούνται για την παραγωγή ενέργειας και την επιβίωση των κυττάρων. Ο κύριος µηχανισµός που λαµβάνει χώρα για την παραγωγή ενέργειας είναι ο αναερόβιος µηχανισµός της γλυκόλυσης, µε αποτέλεσµα να παράγονται µεγάλες ποσότητες γαλακτικού οξέος, οι οποίες αποµακρύνονται από την περιοχή µέσω των τριχοειδών αγγείων (Urban et al., 2004; Grunhagen et al., 2006) Εκφύλιση του µεσοσπονδύλιου δίσκου κατά τη γήρανση Η εκφύλιση του µεσοσπονδύλιου δίσκου, ο οποίος παρατηρείται µε την αύξηση της ηλικίας, αποτελεί µία από τις σηµαντικότερες ηλικιο-εξαρτώµενες ασθένειες, προκαλώντας εκτός των άλλων, χρόνιες οσφυαλγίες (low back pain), οι οποίες ταλαιπωρούν την πλειοψηφία των 34

35 ηλικιωµένων ατόµων, δυσχεραίνοντας την καθηµερινότητα τους και υποβιβάζοντας την ποιότητα ζωής τους (Buckwalter, 1995). Εικόνα 14: Φωτογραφίες από φυσιολογικό και εκφυλισµένο δίσκο (Bach et al., 2014). Μορφολογικά, ο εκφυλισµένος δίσκος παρουσιάζει διαφορές σε σχέση µε τον φυσιολογικό ιστό. Συγκεκριµένα, ο δίσκος χάνει την οργάνωσή του, µειώνεται η ενυδάτωσή του, χάνει την ελαστικότητά του και µικραίνει σε µέγεθος, ενώ παράλληλα, αυξάνεται ο κυτταρικός θάνατος και διαταράσσεται η παραγωγή µορίων της εξωτερικής µήτρας µε αποτέλεσµα την αποικοδόµηση της (Εικόνα 14). Οι βιοχηµικές αυτές διαφορές στην εξωκυττάρια µήτρα περιλαµβάνουν: την αύξηση της σύνθεσης κολλαγόνου τύπου ΙΙ, στα αρχικά στάδια της εκφύλισης, (η οποία φαίνεται να σχετίζεται µε επιδιορθωτικούς µηχανισµούς), (Takaishi et al., 1997), σηµαντική µείωση των επιπέδων της αγγρεκάνης, αύξηση των επιπέδων της φιµπρονεκτίνης και µείωση των γλυκοζαµινών (Fontes et al., 2015). Η αποικοδόµηση της εξωκυττάριας µήτρας οφείλεται στην ανισορροπία µεταξύ των µηχανισµών σύνθεσης και αποικοδόµησής της. Κύτταρα του πηκτοειδούς πυρήνα παράγουν από την µία αυξητικούς παράγοντες (όπως οι ΒΜP, TGF-β και IGF1), οι οποίοι επάγουν την σύνθεση πρωτεϊνών της µήτρας και από την άλλη κυτοκίνες, (όπως οι IL-1, IL-6 και TNF-α), οι οποίες επάγουν την σύνθεση µεταλλοπρωτεασών στρώµατος (matrix metalloproteinase, MMPs) και µεταλλοπρωτεασών δισιντεγκρίνης µε µοτίβου θροµβοσποντίνης (ADAMTS), οι οποίες αποικοδοµούν συστατικά της εξωκυττάριας µήτρας, όπως το κολλαγόνο τύπου ΙΙ και την αγγρεκάνη. Να σηµειωθεί επίσης ότι στην διατήρηση της ισορροπίας, συµβάλλουν επίσης και αναστολείς των µεταλλοπρωτεασών, (tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs) οι οποίοι παρεµποδίζουν την δράση των µεταλλοπρωτεασών και προστατεύουν τα συστατικά της µήτρας από αποικοδόµηση. 35

36 Συνεπώς, προβλήµατα ή τροποποίηση στην φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων του πηκτοειδούς πυρήνα έχουν συσχετιστεί µε την επαγωγή της εκφύλισης του µεσοσπονδύλιου δίσκου. Κυρίαρχο χαρακτηριστικό του εκφυλισµένου δίσκου είναι τα αυξηµένα επίπεδα προφλεγµονωδών κυτοκινών, όπως ο TNF-α και οι ιντερλευκίνες (IL)-1 α/β, IL-6 και IL-17Η, τα οποία, όπως προαναφέρθηκε εκκρίνονται από τα ίδια τα κύτταρα του µεσοσπονδύλιου δίσκου (Risbud and Shapiro, 2013). Η παρουσία τους έχει θεωρηθεί σε σηµαντικό βαθµό υπεύθυνη για την εκφύλιση του δίσκου, καθώς συµβάλλουν στην αποικοδόµηση της εξωκυττάριας µήτρας και στρατολογούν και ενεργοποιούν κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος στον εκφυλισµένο δίσκο (Johnson et al., 2015). Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος του δεν έχει εξακριβωθεί πλήρως, ακόµα. 36

37 1.9.Σκοπός της εργασίας Η παρούσα εργασία αποτελεί µια συγκριτική µελέτη της επίδρασης του TNF-α, σε ανθρώπινους δερµατικούς ινοβλάστες και κύτταρα του πηκτοειδούς πυρήνα του µεσοσπονδύλιου δίσκου βόειας προέλευσης. Ο TNF-α παίζει σηµαντικό ρόλο στις διαδικασίες της γήρανσης και της φλεγµονής, έχει συσχετιστεί µε την γήρανση των κυττάρων του δέρµατος και εµφανίζεται να εκφράζεται σε αυξηµένα επίπεδα στον εκφυλισµένο µεσοσπονδύλιο δίσκο από τα κύτταρα του πηκτοειδούς πυρήνα. Στον εκφυλισµένο δίσκο εντοπίζεται, ακόµα αυξηµένος αριθµός γηρασµένων κυττάρων. Η χαρακτηριστική αύξηση των γηρασµένων κυττάρων, αφενός, συµβάλλει στην συσσώρευση του TNF-α στον δίσκο και αφετέρου, επισηµαίνει την σηµασία της παρουσίας τους για την εκφύλιση του ιστού. Ωστόσο, η συµβολή του TNF-α στην εκφύλιση του µεσοσπονδύλιου δίσκου, αλλά και η συσχέτισή του µε την επαγωγή της γήρανσης των κυττάρων του πηκτοειδούς πυρήνα, δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως, ακόµα. Δεδοµένης της δράσης του TNF-α στη γήρανση των δερµατικών ινοβλαστών και µε στόχο να ταυτοποιηθεί η δράση του TNF-α σε κύτταρα του πηκτοειδούς πυρήνα του µεσοσπονδύλιου δίσκου, χρησιµοποιήθηκαν δερµατικοί ινοβλάστες ως σύστηµα αναφοράς και ελέγχθηκε η επίδραση του παράγοντα TNF-α σε βασικές κυτταρικές διεργασίες, στους δύο τύπους κυττάρων. Πιο συγκεκριµένα, ελέγχθηκε: η κυτταρική βιωσιµότητα, το ενδοκυτταρικό οξειδωτικό φορτίο, η ενεργοποίηση µορίων των σηµατοδοτικών µονοπατιών των ΜΑΡ κινασών και του µονοπατιού PI3K/ Akt, αλλά και ο κυτταρικός πολλαπλασιασµός παρουσία συγκεκριµένων συγκεντρώσεων του TNF-α. 37

38 38

39 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Όργανα Κατά την διεξαγωγή των πειραµάτων της συγκεκριµένης πτυχιακής εργασίας χρησιµοποιήθηκαν τα παρακάτω όργανα: Εστία νηµατικής ροής Safeflow 1.8 από την Bioair Instruments (Siziano, Italy). Επωαστικός κλίβανος CO2 Thermo Forma Series II (Ohio, USA). Φωτονικό µικροσκόπιο από την Leitz Wetzlab (Wetzlar, Germany). Σωµατιδιακός αναλυτής για τον υπολογισµό του αριθµού των κυττάρων, Beckman Coulter Counter, Beckman (USA). Αιµοκυττόµετρο Improved Neubauer από την Bright Line Hausser Scientific (Horsham, U.S.A) Μετρητής απορρόφησης και φθορισµού µικροπλακών FLUOstar Optima microplate reader από την BMG LABTECH GmbH (Ortenberg, Germany). Μετρητής β-ακτινοβολίας Tricarb 2100TR Liquid Scintillation Analyzer από την Long Island Scientific (New York, USA.) Τροφοδοτικό, Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK). Συσκευές ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών #SE 250 Mighty Small 2, Hoefer, Amersham Biosciences ( Buckinghamshire, UK). Συσκευή ηλεκτροµεταφοράς πρωτεϊνών σε µεµβράνες Mini Trans-Blot Cell, Bio-Rad (Milan, Italy) και #TE 22 Mini Tranfer Tank, Hoefer, Amersham Biosciences (Buckinghamshire, UK). Μικροφυγόκεντρος Hermle Ζ233 Μ-2 Hermle Labortechnik GmbH (Wehingen, Germany). 39

40 2.2. Υλικά παρακάτω: Τα υλικά που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα πτυχιακή εργασία αναφέρονται αναλυτικά Θρεπτικό υλικό Dulbeco s Minimal Essential Medium (DMEM), αντιβιοτικά πενικιλλίνη και στρεπτοµυκίνη, L- γλουταµίνη και πυροσταφυλικό και διττανθρακικό νάτριο, από την Biochrom AG, Berlin, Germany. Εµβρυϊκός βόειος ορός της Gibco BRL, Paisley, UK. Μονοκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει την ακτίνη (P. No MS-1295P) από την Lab Vision Neomarkers, California, USA. Πρωτογενή µονοκλωνικά αντισώµατα που αναγνωρίζουν τις perk 1/2 και ERK από την BD Transduction Laboratories, Bedford, MA, USA. Πρωτογενή πολυκλωνικά αντισώµατα που αναγνωρίζουν τις p-p38 MAP Kinase Thr180/Tyr 182 (#9211), p38 MAP Kinase (#9212), pjnks (#9251), JNKs (#9252), pakt Ser 473 (#9271) και Akt (#9272) από την Cell Signaling Technology, Hertfordshire, UK. Δευτερογενή αντισώµατα έναντι των παραπάνω πρωτογενών αντισωµάτων, τα οποία έχουν δεσµευµένη την υπεροξειδάση αγριοραπανιού (Horseradish Hyperoxidase, HRP) από τη Sigma Aldrich, St. Louis, USA. Αναστολείς φωσφατασών (Phosphatase Inhibitor Coctail 1, #P2850 και Phosphatase Inhibitor Coctail 2, #P5726) καθώς και αναστολείς πρωτεασών (Protease Inhibitor Coctail, #P8340), από τη Sigma Aldrich, St. Louis, USA. Μεµβράνη πολυβινυλοδιφθορίου (PVDF) από την Amersham Biosciences, UK. Πρωτεϊνικοί δείκτες γνωστών µοριακών βαρών (Molecular Weight markers, kDa), από την Nippon Genetics, Dueren, Germany. Διάλυµα υποστρώµατος υπεροξειδάσης HRP-λουµινόλης (ECL Western Blotting Reagents) από την Genscript, Piscataway, USA. Τρυβλία διαµέτρου 10cm από την Corning Life Sciences, Acton, MA. Οι φιάλες 75cm 2 από την Corning Life Sciences, Acton, MA. 40

41 Οι πλάκες κυτταροκαλλιεργειών 96 θέσεων από την Costar, (NY, USA), 48 θέσεων από την Thermo Fisher Scientific, (MA, USA) και 12 θέσεων από την Greiner, (Hanover, Germany). Χρωστική ΜΤΤ από τη Sigma Aldrich, St. Louis, USA. Ισοπροπανόλη από τη MERCK, Damstadt, Germany. O ανασυνδιασµένος ανθρώπινος παράγοντας TNF-apha (#300-01Α) από την Peprotech. Διάλυµα υπεροξειδίου υδρογόνου, Η2Ο2, από τη Sigma Aldrich, St. Louis, USA. 41

42 2.3. Κυτταρικές Σειρές Κατά τα πειράµατα της συγκεκριµένης ερευνητικής εργασίας χρησιµοποιήθηκαν κυτταρικές σειρές στρωµατικών κυττάρων πηκτοειδούς πυρήνα µεσοσπονδύλιου δίσκου, βόειας προέλευσης (bovine nucleus pulposus intervertebral disk cells, bivd NP cells), το εµπορικά διαθέσιµο στέλεχος δερµατικών ινοβλαστών, AG01523c από τη Corriel Institute for Medical Research (Camden, NJ, USA) καθώς και φυσιολογικοί δερµατικοί ινοβλάστες ενήλικου δότη (human diploid skin fibroblasts, hdsf). Να σηµειωθεί ότι τα κύτταρα από ενήλικους υγιείς δότες αποµονώθηκαν µετά από έγγραφη συγκατάθεσή τους και µετά από έγκριση από την Επιτροπή Βιοηθικής και Δεοντολογίας του ΕΚΕΦΕ «Δηµόκριτος». Η πολλαπλασιαστική ικανότητα των παραπάνω κυτταρικών στελεχών αντιστοιχεί περίπου σε 40 αναδιπλασιασµούς του κυτταρικού πληθυσµού (Cell Population Doublings CPDs) για τους διπλοειδείς δερµατικούς ινοβλάστες και 60 CPDs για τα κύτταρα του πηκτοειδούς πυρήνα του µεσοσπονδύλιου δίσκου. 42

43 2.4. Μέθοδοι Αποστείρωση Για να εξασφαλιστούν στείρες συνθήκες και να αποφευχθούν µολύνσεις από βακτήρια, µύκητες και µυκόπλασµα, κατά την διάρκεια των πειραµάτων, εφαρµόστηκαν οι παρακάτω µέθοδοι αποστείρωσης: 1) Οι πιπέτες Pasteur και οι γυάλινες πιπέτες αποστειρώνονταν σε κλίβανο ξηρής αποστείρωσης (180 ο C για περίπου 90 λεπτά). 2) Το νερό που χρησιµοποιήθηκε για την παρασκευή θρεπτικού υλικού DMEM καθώς και για την παρασκευή ρυθµιστικών διαλυµάτων όπως PBS, σε κλίβανο υγρής αποστείρωσης µε γυάλινα δοχεία µε πλαστικό πώµα (121 ο C για 30 λεπτά). 3) Τα γυάλινα δοχεία µε πλαστικό πώµα, τα πλαστικά δοχεία, τα φίλτρα αποστείρωσης και οι συσκευές διήθησης σε κλίβανο υγρής αποστείρωσης (120 ο C για 15 λεπτά). 4) Τα θερµοευαίσθητα διαλύµατα, (όπως το ΜΤΤ), µε διήθηση µέσω αποστειρωµένων φίλτρων νιτρικής κυτταρίνης µε διάµετρο πόρων 0,22mm. Όλα τα υπόλοιπα σκεύη και υλικά που χρησιµοποιήθηκαν παραλαµβάνονται αποστειρωµένα από τον προµηθευτή Καλλιέργεια κυττάρων και αρχείο γενεών Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε θερµοστατούµενο κλίβανο, σε ατµόσφαιρα 5% CO2, 95% υγρασία και θερµοκρασία 37 C. Για τις καλλιέργειες χρησιµοποιούνταν πλαστικά τρυβλία επιφάνειας 50cm 2, καθώς και πλαστικές φιάλες επιφάνειας 75cm 2. Τόσο οι δερµατικοί ινοβλάστες όσο και τα στρωµατικά κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα µεσοσπονδύλιου δίσκου αναπτύσσονται σε DMEM εµπλουτισµένο µε εµβρυϊκό βόειο ορό (fetal bovine serum-fbs) 10% (v/v), D-γλυκόζη (10mg/ml), L-γλουταµίνη (2mM), NaHCO3 (3,75mg/L), πυροσταφυλικό νάτριο (110,04mg/L), πενικιλίνη (50,000IU/L) και στρεπτοµυκίνη (50,000IU/L), έως ότου καλύψουν το 100% της επιφάνειας του πυθµένα του τρυβλίου. Μόλις τα κύτταρα κάλυπταν όλη την υπάρχουσα επιφάνεια σχηµατίζοντας µια µονοστιβάδα (πλήρης καλλιέργεια), ανακαλλιεργούνταν ως εξής: Το θρεπτικό υλικό αφαιρούνταν µε αναρρόφηση και πραγµατοποιούνταν έκπλυση µε 4ml διαλύµατος θρυψίνης-κιτρικού νατρίου (θρυψίνη 0,25 % (w/v), κιτρικό νάτριο 10mM, NaCl 110mM, ph 7,2), ώστε να αποµακρυνθούν τυχόν υπολείµµατα ορού τα οποία περιέχουν αναστολέα θρυψίνης. Στην συνέχεια, 4 ml διαλύµατος θρυψίνης-κιτρικού νατρίου, προστίθονταν εκ νέου, ώστε να 43

44 καλυφθεί πλήρως η κυτταρική µονοστιβάδα και τα κύτταρα επωάζονταν στους 37 ο C για 1-2 λεπτά, µέχρι να διαπιστωθεί µικροσκοπικά η εξής µορφολογική αλλαγή: τα κύτταρα συρρικνώνονταν ελαφρώς και το περίγραµµα της κυτταρικής τους µεµβράνης γινόταν εντονότερο. Σε αυτό το σηµείο αφαιρούνταν η περίσσεια θρυψίνης-κιτρικού νατρίου και τα κύτταρα επωάζονται για λίγα λεπτά ακόµα στους 37 ο C µέχρι να αρχίσουν να αποκολλώνται από τον πυθµένα του τρυβλίου. Η αποκόλληση των κυττάρων ολοκληρώνονταν µε ελαφριά χτυπήµατα του τρυβλίου. Στην συνέχεια τα κύτταρα εναιωρούνταν σε 10ml DMEM εµπλουτισµένο µε 10% FBS µε επανειληµµένες ήπιες αναρροφήσεις, ώστε να διαλυθούν τυχόν συσσωµατώµατα. Τέλος, το εναιώρηµα των κυττάρων µοιράζονταν ισοµερώς σε αποστειρωµένα τρυβλία µε λόγο κατανοµής (split ratio) 1:2 και τα κύτταρα επωάζονταν στους 37 ο C µέχρι την επόµενη ανακαλλιέργεια. Τόσο τα στελέχη των ανθρώπινων ινοβλαστών, όσο και τα στρωµατικά κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα µεσοσπονδύλιου δίσκου, βόειας προέλευσης που χρησιµοποιήθηκαν σ αυτήν την εργασία έχουν πεπερασµένο εύρος ζωής. Κατά την ανακαλλιέργεια, η συµπληρωµένη µονοστιβάδα κατανέµεται σε λόγο κατανοµής 1:2 και τα κύτταρα αναπτύσσονται έως ότου επανασχηµατίσουν νέα µονοστιβάδα. Εποµένως, ο αριθµός ανακαλλιεργειών που υφίσταται µια καλλιέργεια είναι παρόµοιος µε τον αριθµό αναδιπλασιασµών του κυτταρικού πληθυσµού (Cell Population Doublings-CPDs). Από εδώ και στο εξής, ο αριθµός CPD µιας καλλιέργειας θα αναφέρεται ως γενεά. Εποµένως, µια καλλιέργεια της οποίας τα κύτταρα έχουν συµπληρώσει 40 CPDs θα αναφέρονται και ως «κύτταρα γενεάς 40» (δηλαδή η καλλιέργεια έχει ανακαλλιεργηθεί 40 φορές µε λόγο κατανοµής 1:2). Σύµφωνα µε τους Hayflick και Moorhead, τα διάφορα κυτταρικά στελέχη µπορούν να ψυχθούν στους -196 C για µεγάλο χρονικό διάστηµα και, αφού αποψυχθούν και επανέλθουν στους 37 C, να ανακαλλιεργηθούν και να διατηρήσουν στο ακέραιο τις ιδιότητες τους. Επίσης, έχουν τη δυνατότητα να συµπληρώσουν τον αριθµό γενεών που θα συµπλήρωναν αν δεν µεσολαβούσε η ψύξη/απόψυξη. Τα κύτταρα διαφόρων κυτταρικών γενεών που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία, αποθηκεύτηκαν σε θερµοκρασία -196 C εντός υγρού αζώτου, έτσι ώστε να δηµιουργηθεί ένα αρχείο γενεών κυττάρων. Με τον τρόπο αυτό είχαµε τη δυνατότητα, ανά πάσα στιγµή, να διεξάγουµε τα πειράµατά µας επάνω σε διάφορα επίπεδα κυτταρικής ηλικίωσης. Φυλάσσοντας τα κύτταρα σε τέτοιες συνθήκες, εξασφαλίζεται η µέγιστη βιωσιµότητα τους κατά την απόψυξή τους και την επανακαλλιέργειά τους. Έτσι, η συλλογή των ινοβλαστών γίνεται 2-3 ηµέρες µετά την ανακαλλιέργεια τους, όταν δηλαδή βρίσκονται στη λογαριθµική φάση ανάπτυξης και ο µεταβολισµός τους είναι πιο έντονος. 44

45 Μέτρηση ολικού αριθµού κυττάρων Η µέτρηση του ολικού αριθµού κυττάρων σε εναιώρηµα πραγµατοποιήθηκε µε την βοήθεια σωµατιδιακού αναλυτή Coulter Counter (Beckman Coulter Z1) και η διαδικασία που ακολουθήθηκε περιγράφεται παρακάτω. Τα κύτταρα που βρίσκονται σε καλλιέργεια αποκολλώνται µε διάλυµα θρυψίνης- κιτρικού νατρίου και στη συνέχεια εναιωρούνται σε θρεπτικό υλικό DMEM εµπλουτισµένο µε 10% FBS. Συγκεκριµένος όγκος εναιωρήµατος (0,5mL) προστίθεται σε 12ml ισότονου αλατούχου διαλύµατος IsoFlow Sheath Fluid και µετράται ο αριθµός των κυττάρων στο σωµατιδιακό αναλυτή. Το όργανο αυτό, µετρά τον αριθµό των σωµατιδίων που περιέχονται στο εναιώρηµα, επιτρέποντας µας να υπολογίσουµε τον συνολικό αριθµό των κυττάρων στην κυτταροκαλλιέργεια. Η συγκεκριµένη µέθοδος χαρακτηρίζεται από ταχύτητα και ακρίβεια, ωστόσο απαιτεί καλά επαναιωρούµενο κυτταρικό πληθυσµό, απελευθερωµένο από πάσης φύσης υπολείµµατα, των οποίων η ύπαρξη αλλοιώνει τη µέτρηση του πραγµατικού αριθµού των κυττάρων. Επιπλέον, η µέθοδος αυτή µειονεκτεί εφόσον δεν επιτρέπει το διαχωρισµό µεταξύ ζωντανών και νεκρών κυττάρων. Προκειµένου να υπολογιστεί ο αριθµός µόνο των ζωντανών κυττάρων και να προσδιοριστεί η επίδραση των διαφορετικών συνθηκών στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό, χρησιµοποιήθηκε αιµοκυτταρόµετρο Improved Neubauer από την Bright Line Hausser Scientific. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε περιγράφεται παρακάτω. Τα κύτταρα που βρίσκονται σε καλλιέργεια αποκολλώνται και εναιωρούνται σε 0,5mL διαλύµατος θρυψίνης- κιτρικού νατρίου. Σε συγκεκριµένο όγκο εναιωρήµατος (0,2mL) προστίθεται χρωστική Neutral Red και ακολουθεί καλή ανάδευση και επώαση για περίπου 10 λεπτά, ώστε να βαφτούν τα ζωντανά κύτταρα. Στην συνέχεια, 10µl από κάθε δείγµα τοποθετούνται στην πλάκα Newbauer και µετράται ο αριθµός των ζωντανών κυττάρων. Να σηµειωθεί ότι ο όγκος και η αραίωση του διαλύµατος, όπου εναιωρούνται τα κύτταρα, πρέπει να ρυθµιστεί έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση των κυττάρων ανά ml στο εναιώρηµα να είναι στα όρια ανίχνευσης του αιµοκυττόµετρου, δηλαδή 1-10x10 5 κύτταρα ανά ml ή κύτταρα σε κάθε θέση µέτρησης από τις 4 συνολικά θέσεις µέτρησης (τετράγωνα) του αιµοκυττόµετρου Έλεγχος της πρωτεϊνικής έκφρασης µε ανοσοστύπωµα Western Με στόχο τον προσδιορισµό της έκφρασης, καθώς και της φωσφορυλίωσης συγκεκριµένων κοµβικών πρωτεϊνών που συµµετέχουν σε σηµατοδοτικά µονοπάτια που ενδέχεται να σχετίζονται µε την πρόωρη κυτταρική γήρανση, πραγµατοποιήθηκε η συλλογή των κυτταρικών λυµάτων, o διαχωρισµός του µίγµατος πρωτεϊνών των λυµάτων µε SDS-PAGE κατά Laemmli, ηλεκτροµεταφορά και τέλος στύπωµα Western µε αντίσωµα έναντι της εκάστοτε υπό µελέτη πρωτεΐνης. 45

46 Κυτταρική λύση απευθείας σε διάλυµα φόρτωσης µε SDS. Δεδοµένου ότι κατά τη διαδικασία λύσης των κυττάρων γίνεται απελευθέρωση ενδοκυτταρικών πρωτεασών κι ενζύµων τα οποία µπορούν να αλλοιώσουν τις µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών του κυτταρικού λύµατος, χρησιµοποιήθηκαν αναστολείς πρωτεασών και φωσφατασών, ώστε να εξασφαλιστεί η ακεραιότητα των υπό µελέτη πρωτεϊνών. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε έχει ως εξής: Αρχικά πραγµατοποιείται αναρρόφηση του θρεπτικού υλικού και ακολουθεί έκπλυση των κυττάρων που αναπτύσσονται σε τρυβλία διαµέτρου 50mm, µε 10ml παγωµένο TBS 1x. Τα υπολείµµατα TBS είναι σηµαντικό να αποµακρύνονται εντελώς, ώστε να µην αραιώσουν το δείγµα που θα συλλεχθεί. Ακολουθεί λύση των κυττάρων µε 500µl διαλύµατος λύσης πυκνότητας 2x, το οποίο έχει προθερµανθεί στους 100 C, συλλογή των κυττάρων µε γρήγορη απόξεση και µεταφορά τους σε µικροφυγοκεντρικούς σωλήνες. Αφού γίνει αποδιάταξη των δειγµάτων στους 100 C για 3min, πραγµατοποιείται οµογενοποίηση µε υπερήχους για 12-15sec. Στη συνέχεια τα δείγµατα φυγοκεντρούνται στα g για 10min ώστε να επιτευχθεί αποµάκρυνση µεµβρανικών υπολειµµάτων, υποκυτταρικών οργανιδίων και οποιουδήποτε άλλου σωµατιδίου παραµένει αδιάλυτο στο διάλυµα λύσης. Το υπερκείµενο µεταφέρεται σε νέους µικροφυγοκεντρικούς σωλήνες και τα δείγµατα είτε φυλάσσονται στους -40 C είτε ηλεκτροφορούνται αµέσως. Διαλύµατα-Αντιδραστήρια: TBS 20mM Tris-HCl ph 7,6, 137 mm NaCl Διάλυµα φόρτωσης δειγµάτων 2Χ: 125 mm Tris-HCl ph 6,8, 2,5% (w/v) SDS, 20%(v/v) γλυκερόλη, 125 mm β-µερκαπτοαιθανόλη, 0,02%(w/v) κυανούν της βρωµοφαινόλης, και αναστολείς πρωτεασών και φωσφατασών Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου παρουσία δωδεκυλοθειϊκού νατρίου (SDS-PAGE) Η µέθοδος της ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου παρουσία απορρυπαντικών αποτελεί µια από τις πιο συνήθεις τεχνικές διαχωρισµού των πρωτεϊνών και προσδιορισµού του µοριακού τους βάρους. Το πολυακρυλαµίδιο έχει την ιδιότητα να πολυµερίζεται παρουσία ελευθέρων ριζών και να δηµιουργεί πήκτωµα από διασυνδεόµενες αλυσίδες. Τη διασύνδεση αυτών των αλυσίδων προκαλεί το Ν,Ν µεθυλεν-/ δις-/ ακρυλαµίδιο (Ν Ν- methylene bisacrylamide). Τις ελεύθερες ρίζες παρέχει στην αντίδραση το υπερθειϊκό αµµώνιο (ammonium persulfate, APS) ενώ παράλληλα χρησιµοποιείται ως καταλύτης η Ν,Ν,Ν,Ν - τετραµεθυλδιαµίνη (N,N,N,N - tetramethylenediamine, TEMED). Ανάλογα µε την τελική συγκέντρωση του διαλύµατος ακρυλαµιδίου και Ν Ν- µεθυλεν- δις- ακρυλαµιδίου δηµιουργούνται πηκτώµατα µε διαφορετικό µέγεθος πόρων. Επιλέγοντας το σωστό µέγεθος πόρων επιτυγχάνεται ικανοποιητικός διαχωρισµός 46

47 των πρωτεϊνών ανάλογα µε το µοριακό τους βάρος. Η ύπαρξη απορρυπαντικού προκαλεί αποδιάταξη των πρωτεϊνών στις πολυπεπτιδικές τους υποµονάδες. Γι αυτό το λόγο χρησιµοποιείται το ισχυρό ανιονικό απορρυπαντικό δωδεκυλοθειϊκό νάτριο (sodium dodecyl sulphate, SDS). Στην ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE χρησιµοποιούνται δύο είδη συστηµάτων το συνεχές και το ασυνεχές. Κατά τις ηλεκτροφορήσεις των δειγµάτων της παρούσας εργασίας χρησιµοποιήθηκε το ασυνεχές σύστηµα. Στο ασυνεχές σύστηµα τα δείγµατα προστίθονται σε ένα αρχικό πήκτωµα (πήκτωµα συγκέντρωσης), στο οποίο επιτυγχάνεται συγκέντρωση του συνόλου των πρωτεϊνών σε µία ζώνη µικρού πάχους, ενώ ο διαχωρισµός τους ανάλογα µε το µοριακό βάρος, γίνεται σε ένα δεύτερο πήκτωµα (πήκτωµα διαχωρισµού). Για την παραπάνω µεθοδολογία χρησιµοποιήθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια: Διαλύµατα- Αντιδραστήρια: Διάλυµα 30% µίγµατος ακρυλαµιδίου: 29% (w/v) ακρυλαµίδιο και 1% (w/v) Ν,Ν - µεθυλεν-/ δις-/ ακρυλαµίδιο. Διάλυµα πηκτώµατος συγκέντρωσης (4Χ): 0,5Μ Tris-HCl ph 6,8 Διάλυµα πηκτώµατος διαχωρισµού (4Χ): 1,5 Μ Tris-HCl ph 6,8 10% (w/v) SDS 10% (v/v) γλυκερόλη 10%(w/v) υπερθειϊκό αµµώνιο (ammonium persulfate, APS) Διάλυµα ηλεκτροφόρησης (10Χ): 0,25M Tris, 2,5M γλυκίνη Πρωτεϊνικοί δείκτες γνωστών µοριακών βαρών [Molecular Weight markers (19-180kDa), από την Nippon Genetics, Dueren, Germany] Το πήκτωµα διαχωρισµού παρασκευάζεται πρώτο κι αφού αυτό πολυµερισθεί ακολουθεί η παρασκευή του πηκτώµατος συγκέντρωσης, το οποίο πολυµερίζεται πάνω στο πήκτωµα διαχωρισµού. Η σύσταση των πηκτωµάτων διαχωρισµού και συγκέντρωσης είναι η ακόλουθη: Σύσταση πηκτώµατος διαχωρισµού: 0,375M Tris-HCl, ph 8,8, 12,5% (w/v) πολυακρυλαµίδιο, 0,1% (w/v) SDS, 0,1% (v/v) γλυκερόλη, 0,01% (w/v) APS, 0,04% (v/v) TEMED Σύσταση πηκτώµατος συγκέντρωσης: 0,125M Tris-HCl, ph 6,8, 5% (w/v) πολυακρυλαµίδιο, 0,1% (w/v) SDS, 0,05% (v/v) γλυκερόλη, 0,01% (w/v) APS, 0,04% (v/v) TEMED. Τα κυτταρικά λύµατα θερµαίνονται στους 100 C για 2min, φυγοκεντρούνται για στα g για 2min και στη συνέχεια ίση ποσότητα ολικής πρωτεΐνης απ όλα τα δείγµατα τοποθετούνται στα φρεάτια του πηκτώµατος συγκέντρωσης. Σε ένα από τα φρεάτια προστίθενται πρωτεϊνικοί δείκτες γνωστών µοριακών βαρών. Τα δείγµατα ηλεκτροφορούνται υπό σταθερή τάση (περίπου 10V/cm 47

48 πηκτώµατος) για 1½ ώρα σε ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης (1x) παρουσία 0,1% (w/v) SDS. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης ακολουθεί ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνη πολυβινυλοδιφθορίου (PVDF) Ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνες Η ανοσοαποτύπωση βασίζεται στη µεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου σε µεµβράνη, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Οι µεµβράνες που χρησιµοποιούνται είναι συνήθως µεµβράνη νιτροκυτταρίνης ή θετικά φορτισµένη µεµβράνη πολυβινυλοδιφθορίου (PVDF). Στη συγκεκριµένη εργασία χρησιµοποιήθηκε µεµβράνη πολυβινυλοδιφθορίου (PVDF). Το διάλυµα µεταφοράς είναι ένα ρυθµιστικό διάλυµα, το οποίο λόγω της αλκαλικότητας του (ph ~ 8,3), εξασφαλίζει τη µεταφορά των αρνητικά φορτισµένων από το SDS, πρωτεϊνών. Επιπλέον, το διάλυµα µεταφοράς περιέχει µεθανόλη, ώστε να αποφεύγεται η διόγκωση του πηκτώµατος κατά την ηλεκτροµεταφορά και να αυξάνεται η υδροφοβικότητα της µεµβράνης. Διαλύµατα-Αντιδραστήρια: Διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς: 0,025Μ Tris, 0,25M γλυκίνη, 15% (v/v) µεθανόλη Μεµβράνη PVDF (Amersham Biosciences) Χαρτιά Whatman 3MM Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, το πήκτωµα διαχωρισµού καθώς και 2 κοµµάτια χαρτιού Whatman 3MM ίδιων διαστάσεων µε αυτές του πηκτώµατος, εξισορροπούνται για 2min σε διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς. Η µεµβράνη PVDF, επίσης ίδιων διαστάσεων µε αυτές του πηκτώµατος, ενεργοποιείται σε µεθανόλη για 10sec, εκπλένεται µε άφθονο νερό και εξισορροπείται για 10min σε διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς. Το πήκτωµα τοποθετείται πάνω στη µεµβράνη PVDF και εκατέρωθεν αυτών τοποθετούνται 2 κοµµάτια χαρτιού Whatman 3MM. Η κατασκευή αυτή τοποθετείται σε ειδική θήκη της συσκευής ηλεκτροµεταφοράς έτσι ώστε το πήκτωµα να είναι προσανατολισµένο προς τον αρνητικό πόλο (άνοδος) και η µέµβράνη προς το θετικό πόλο (κάθοδος), εντός του ρυθµιστικού διαλύµατος µεταφοράς. Η ηλεκτροµεταφορά διαρκεί για 1½ ώρα υπό σταθερό ρεύµα (3,5 ma/cm 2 µεµβράνης). Τέλος, σηµειώνεται ότι η διαδικασία της ηλεκτροµεταφοράς πραγµατοποιείται στους 4 C διότι κατά τη διάρκεια της διαδικασίας η θερµοκρασία αυξάνεται. 48

49 Ανοσοαποτύπωση σε µεµβράνες Αφού ολοκληρωθεί η ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών, σηµειώνεται πάνω στη µεµβράνη ο προσανατολισµός της και ακολουθεί ανίχνευση επιθυµητών πρωτεϊνών και µετα-µεταφραστικών τροποποιήσεων χρησιµοποιώντας ειδικά αντισώµατα. Τα µονοκλωνικά ή πολυκλωνικά αντισώµατα που αναγνωρίζουν συγκεκριµένους αντιγονικούς επιτόπους της υπό µελέτης πρωτεΐνης και δεσµεύονται οµοιοπολικά, αλλά και µε γέφυρες ιόντων µε αυτούς, ονοµάζονται πρωτογενή. Τα αντισώµατα τα οποία αναγνωρίζουν ως αντιγόνα τµήµατα της βαριάς αλυσίδας των πρωτογενών αντισωµάτων και δεσµεύονται σε αυτά µε σκοπό την ενίσχυση του σήµατος, ονοµάζονται δευτερογενή. Τα δευτερογενή αντισώµατα φέρουν στη βαριά τους αλυσίδα έναν συζευγµένο ιχνηθέτη, ο οποίος µετά από αντίδραση µε το ειδικό γι αυτόν υπόστρωµα, προκαλεί έµµεση ανίχνευση της πρωτεΐνης µε χηµειοφωταύγεια ή χρώση. Στη συγκεκριµένη εργασία, τα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν επισηµασµένα µε τον ιχνηθέτη υπεροξειδάση του αγριοραπανιού (Horseradish peroxidase, HRP). Η HRP έχει σαν υπόστρωµα τη λουµινόλη, την οποία οξειδώνει παρουσία H2O2 εκπέµποντας ακτινοβολία, το µέγιστο µήκος εκποµπής της οποίας βρίσκεται στα nm. Για την επιτυχία του πειράµατος θα έπρεπε να ελαχιστοποιηθεί ο θόρυβος από τη µη ειδική δέσµευση των αντισωµάτων. Για να επιτευχθεί αυτό, πραγµατοποιήθηκε κορεσµός των ελευθέρων ενεργών θέσεων στη µεµβράνη µε επωάσεις σε άπαχο γάλα. Διαλύµατα-Αντιδραστήρια: TBS TBS-T: 0,1% (v/v) Tween-20 σε TBS 5% (w/v) άπαχο γάλα σε TBS-T Ειδικό υπόστρωµα HRP: ECL Western Blotting Reagents (GenScript) Μετά την ηλεκτροµεταφορά κάθε µεµβράνη επωάζεται µε 5% (w/v) άπαχο γάλα διαλυµένο σε TBS-T για 1h σε θερµοκρασία δωµατίου. Στη συνέχεια η µεµβράνη επωάζεται κατά τη διάρκεια της νύχτας µε το πρωτογενές αντίσωµα, αραιωµένο στην κατάλληλη συγκέντρωση, σε 5% (w/v) άπαχο γάλα σε TBS-T. Την επόµενη µέρα, το πρωτογενές αντίσωµα αποµακρύνεται και η µεµβράνη εκπλύνεται 3 φορές µε 5% (w/v) άπαχο γάλα σε TBS-T, για 30min (10min το κάθε ξέπλυµα), σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολουθεί επώαση της µεµβράνης µε το δευτερογενές αντίσωµα αραιωµένο σε 5% (w/v) άπαχο γάλα σε TBS-T για 1 ½ ώρα. Μετά το τέλος της επώασης, η µεµβράνη εκπλύνεται µε 2 φορές µε 5% (w/v) άπαχο γάλα σε TBS-T και 1 φορά µε TBS-T(συνολική διάρκεια 30min σε θερµοκρασία δωµατίου). Τέλος, ακολουθεί η ανίχνευση των πρωτεϊνών χρησιµοποιώντας 49

50 τα αντιδραστήρια ECL Western Blotting Reagents. Η µεµβράνη τοποθετείται σε αδρανή πλαστική ειδική θήκη ώστε να µη στεγνώσει, αποµακρύνοντας όλες τις φυσαλίδες αέρα. Αµέσως, η µεµβράνη τοποθετείται για έκθεση σε Kodak-X-OMAT AR φιλµ αυτοραδιογραφίας για διάφορα χρονικά διαστήµατα. Μετά την έκθεση, η µεµβράνη φυλάσσεται στους 4 ο C και σε σκοτεινό µέρος ώστε να διατηρηθεί και να επαναχρησιµοποιηθεί. Ακολουθεί πυκνοµετρική ανάλυση των ζωνών που αποτυπώνονται στο φιλµ, η οποία γίνεται µε χρησιµοποίηση σαρωτή και τα αποτυπώµατα αναλύονται µε τη χρησιµοποίηση κατάλληλου λογισµικού επεξεργασίας εικόνας (Band Leader 3.00, Shareware Distribution notes, Tel-Aviv, Israel) Αποµάκρυνση των δεσµευµένων αντισωµάτων από την επιφάνεια της µεµβράνης Προκειµένου η µεµβράνη να επαναχρησιµοποιηθεί, απαιτείται η αποµάκρυνση των ήδη δεσµευµένων αντισωµάτων, ώστε να ακολουθήσει υβριδισµός µε διαφορετικό πρωτογενές αντίσωµα. Η διαδικασία αυτή γίνεται προκειµένου να ανιχνευτεί είτε ένας διαφορετικός επίτοπος της ίδιας πρωτεΐνης που είχε αρχικά ανιχνευτεί, είτε µια διαφορετική πρωτεΐνη η οποία θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί ως εσωτερικός δείκτης για την ποσοτικοποίηση της συνολικής πρωτεΐνης του κάθε δείγµατος. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια. Διαλύµατα-Αντιδραστήρια: TBS-T: 0,1% Tween-20 σε TBS Διάλυµα αποµάκρυνσης των αντισωµάτων: 62,5mM Tris-HCl (ph 6,7), 2% (w/v) SDS, 100mM β- µερκαπτοαιθανόλη Αρχικά η µεµβράνη εκπλένεται µε TBS-T 2 φορές για 10min, κάθε φορά. Στη συνέχεια, εκπλένεται µε διάλυµα αποµάκρυνσης των αντισωµάτων για 40min σε θερµοκρασία 56 ο C, υπό συνεχή ήπια ανάδευση. Ακολουθούν 3 ηµίωρες εκπλύσεις µε TBS-T σε θερµοκρασία δωµατίου, προκειµένου να αποµακρυνθούν το απορρυπαντικό SDS και το ισχυρό αναγωγικό µέσο β-µερκαπτοαιθανόλη. Τέλος, ακολουθεί νέα διαδικασία ανοσοεντοπισµού, ξεκινώντας από το στάδιο επώασης µε 5% (w/v) άπαχο γάλα σε TBS-T για 1 ώρα Προσδιορισµός βιωσιµότητας κυττάρων µέσω της δοκιµασίας ΜΤΤ Το ΜΤΤ (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenytetrazolium bromide; Thiazolyl Blue) είναι ένα υδατοδιαλυτό άλας το οποίο παράγει ένα κίτρινο διάλυµα όταν παρασκευαστεί σε θρεπτικό µέσο ή σε διάλυµα από όπου απουσιάζει η χρωστική ερυθρό της φαινόλης (phenol red). Η 50

51 συγκεκριµένη ουσία έχει την ιδιότητα να µετατρέπεται σε αδιάλυτο µωβ φορµαζάνιο σχηµατίζοντας µικροσκοπικά ορατούς κρυστάλλους, µετά από διάσπασης του δακτυλίου του τετραζολίου από ενεργές µιτοχονδριακές αφυδρογονάσες, που βρίσκονται στο εσωτερικό των ζωντανών και µόνο κυττάρων. Το αδιάλυτο στο νερό φορµαζάνιο, µπορεί να διαλυτοποιηθεί επιτυχώς χρησιµοποιώντας ισοπροπανόλη, διµεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ή άλλους οργανικούς διαλύτες και να µετρηθεί φασµατοφωτοµετρικά. Η µετρούµενη απορρόφηση είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της παραγόµενης χρωστικής και κατ επἐκταση αντικατοπτρίζει το ποσοστό επιβίωσης και τη µεταβολική ενεργότητα των κυττάρων, σύµφωνα πάντα µε έναν µάρτυρα (Εικόνα 15). Εικόνα 15: Απεικόνιση της µοριακής δοµής του MTT (υδατοδιαλυτή ουσία µε κίτρινο χρώµα) και του φορµαζανίου (µη υδατοδιαλυτή ουσία µε µωβ χρώµα), καθώς και διάγραµµα µε τις καµπύλες απορρόφησής τους. Η διακεκοµµένη γραµµή αντιστοιχεί στο ΜΤΤ, ενώ η συνεχής στο φορµαζάνιο. 51

52 Με αυτό τον τρόπο, µπορούµε να προσδιορίσουµε την επίδραση κάποιου παράγοντα στην βιωσιµότητα και τον ρυθµό πολλαπλασιασµού των κυττάρων και άρα να αποτιµήσουµε την κυτταροστατικότητα ή την κυτταροτοξικότητά του. Συγκεκριµένα, η διαδικασία έχει ως εξής: Την πρώτη ηµέρα γίνεται η επίστρωση των κυττάρων, στο αρχικό τους θρεπτικό, σε πλάκα 96 θέσεων (περίπου κύτταρα ανά θέση). Στην συγκεκριµένη εργασία τα κύτταρα καλλιεργούνται έως ότου καλύψουν ολόκληρη την υπάρχουσα επιφάνεια, περίπου για τρεις ηµέρες. Την τέταρτη ηµέρα αφαιρείται το αρχικό υλικό και προστίθεται καινούργιο, µε συγκέντρωση ορού 10% µαζί µε τους παράγοντες επίδρασης στις θέσεις και στις συγκεντρώσεις που απαιτούνται. Ο τελικός όγκος υγρού σε κάθε θέση είναι 100µl, ώστε τα επιστρωµένα κύτταρα να καλύπτονται πλήρως και να υπάρχει αρκετή ποσότητα υλικού για την επιβίωση τους µέχρι το τέλος του πειράµατος. Έπειτα, τα κύτταρα επωάζονται για 3 ηµέρες σε κλίβανο σταθερής θερµοκρασίας 37 C και 5% CO2. Την τελευταία ηµέρα γίνεται αφαίρεση του υλικού και προσθήκη ΜΤΤ διαλυµένου σε θρεπτικό υλικό σε συγκέντρωση 1 mg/ml. Μετά από 4 ώρες αφαιρείται το θρεπτικό υλικό µε το MTT, προστίθεται ισοπροπανόλη (100µl ανά θέση) και η πλάκα αναδεύεται. Με την βοήθεια της ανάδευσης και τη παρουσία ισοπροπανόλης, οι κρύσταλλοι διαλυτοποιούνται και γίνεται ορατό το φορµαζάνιο που έχει σχηµατιστεί από τα ζωντανά κύτταρα (Εικόνα 16). Τέλος, πραγµατοποιείται φωτοµέτρηση, µε µήκος κύµατος απορρόφησης 550 και µήκος κύµατος αναφοράς 630nm. Εικόνα 16: Πλάκα µικροτιτλοποίησης 96 θέσεων έπειτα από προσθήκη ισοπροπανόλης και ανάδευση. (Pratsinis et al, 2013) 52