Σε αυτό το τεύχος: Ε Π Ι Τ Ρ Ο Π Η Σ Υ Ν Τ Α Ξ Η Σ

Transcript

1 Μάρτιος NEWSLETTER Τεύχος 8 Σε αυτό το τεύχος: ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ HPLC- MS/MS ΓΙΑ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΦΑΙΝΥΛΟΚΕΤΟΝΟΥΡΙΑΣ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΜΕΛΩΝ ΤΗΣ ΥΠΕΡΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΟΥ TNF-α ΣΕ ΜΥΕΣ ΜΕ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ CRH ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΔΕΡΜΑΤΙΚΗΣ ΤΡΑΥΜΑΤΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΠΟΥ ΣΥΝΔΕΟΝΤΑΙ ΜΕ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ G ΩΡΙΜΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΠΟΡΟΥΝ ΝΑ ΕΠΑΝΑΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΤΟΥΝ ΓΙΑ ΝΑ ΓΙΝΟΥΝ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΑ ΓΙΑ ΝΑ ΘΥΜΗΘΗΤΕ... ΤΟ ΠΑΡΑΠΟΝΟ, ΤΟΥ ΟΔ. ΕΛΥΤΗ Ε Π Ι Τ Ρ Ο Π Η Σ Υ Ν Τ Α Ξ Η Σ Μ. Βικεντίου Μ. Γαροφαλάκη Α. Γρηγοράτου Ε. Κώνστα Κ. Κωνσταντινάκου Β. Λόη Αγαπητοί συνάδελφοι, Γράφω αυτό το κείμενο σε ένα τραίνο ταξιδεύοντας για Επιστολή εκδότη Θεσσαλονίκη. Έξω από το τραίνο η χειμωνιάτικη με λίγη άνοιξη φύση αυτής της πολύτιμης γωνιάς του πλανήτη, μέσα ζωηρές συζητήσεις, χαρούμενη ατμόσφαιρα, σε πείσμα των καιρών, πριν από το τριήμερο της Αποκριάς. Καθυστέρησε αλήθεια αυτό το δελτίο για πολλούς λόγους αλλά τώρα επιτέλους έφθασε η ώρα να επικοινωνήσουμε. Και έχουμε να πούμε πολλά καλά και κακά να πούμε, όπως λέγαμε στη Μπερλίνα τα παλιά τα χρόνια (δεν ξέρω αν οι νεότεροι ξέρουν η έπαιξαν ποτέ Μπερλίνα...) Μπορούμε να μιλήσουμε για τα νεανικά μάτια που με ενδιαφέρον παρακολουθούν κάθε μήνα τις παρουσιάσεις των συναδέλφων, που αφορούν τα εργαστήρια. Τι γίνεται μέσα σε ένα εργαστήριο βιοχημικό, σε ενα ορμονολογικό, σε ενα ανοσολογικό. ρώτησαν τα παιδιά την επιτροπή νέων. Μαθαίνουμε για μεθόδους, για εξετάσεις, για νοσήματα... Γίνονται αυτά στα δικά μας εργαστήρια; Ας το κάνουμε, είπαμε. Ας παρουσιάσουμε την πραγματικότητα, την καθημερινότητα. Και η προσπάθεια πέτυχε και συνεχίζεται και σε ησυχία, με προσοχή ξετυλίγεται η ρουτίνα και ζωντανεύουν τα γραφεία μας και γεμίζουν οι καρεκλίτσες οι πλιαν. (κι αυτές μπορεί να μην τις καταλαβαίνουν οι νεότεροι). Ή να σας πω για τις ημερίδες ποιότητας, που οργανώνει σε διάφορες πόλεις της Ελλάδας το υπουργείο για να καλέσει τα εργαστήρια σε διαπίστευση ή τουλάχιστον σε εσωτερικό και εξωτερικό έλεγχο ποιότητας. Παρουσιάζονται οι απόψεις των εχόντων την εμπειρία ή των φορέων διαπίστευσης, πιστοποίησης, εξωτερικού ελέγχου ποιότητας. Αρκετοί συνάδελφοι συμμετέχουν ως εκπαιδευτές ή εκπαιδευόμενοι και η Εταιρεία μας παίζει σημαντικό ρόλο. Θα ήθελα να υπογραμμίσω και από τη θέση αυτή ότι υπάρχουν συνάδελφοι πρόθυμοι και έμπειροι να βοηθήσουν όσους ξεκινάνε τη διαδικασία. Ελπίζουμε να μπορέσουμε να οργανώσουμε σχετικό κομμάτι στην ιστοσελίδα μας. Κι έπειτα ετοιμάζουμε συνέδριο στο Βόλο αυτή τη φορά με τους ενθουσιώδεις συναδέλφους του Βιοχημικού του Αχιλλοπούλειου νοσοκομείου Βόλου αλλά και της υπόλοιπης Θεσσαλίας. Αντλεί κανείς θετική ενέργεια από την επαφή με τις άλλες πόλεις της Ελλάδας, αναπνέει πιο φρέσκο αέρα. Θα βρείτε πληροφορίες σε αυτό το δελτίο και βάλτε στο νου σας Οκτώβρη στο Βόλο για μια νέα συνάντηση, μια διαφορετική άποψη των πραγμάτων. Μη σκεφθείτε Και πού θα βρω χρήματα... Τρελλοί είναι αυτοί πάλι... Μας κουβαλάνε εποχή κρίσης στο Βόλο... Δέστε σαν μια νέα πρόκληση! Δέστε το σαν εκδρομή, σαν ευκαιρία να γνωρίσετε τι γίνεται σε μικρότερες πόλεις της Ελλάδας, με εξίσου ή και καλύτερα οργανωμένα εργαστήρια, πώς αντιμετωπίζουν τα πράγματα σήμερα ή και στο παρελθόν. Δώστε λοιπόν την ευκαιρία στους συναδέλφους μας της Θεσσαλίας να σας δείξουν, να σας φιλοξενήσουν, να γίνουν οι οικοδεσπότες της κλινικής χημείας για λίγες μέρες. Ετοιμάστε τις εργασίες σας. Κάτι έχετε να πείτε, κάτι έχετε παρατηρήσει, ανακοινώστε το. Θα προηγηθεί σεμινάριο συνεχιζόμενης εκπαιδευσης για την παιδιατρική κλινική χημεία αρχές καλοκαιριού, με πολύ ενδιαφέροντα θέματα, καινούργια και ειδικά, που ενδιαφέρουν όμως όλους, όσους έχουν να κάνουν με παιδιατρικούς ασθενείς. Αυτά ήταν τα καλά νέα. Ελπίζω να μη με παρεξηγείτε και να θεωρείτε ότι όλα τα βλέπω θετικά και σαν κάτι παλαιο... σας παροτρύνω να συμμετέχετε σε όλα, και όλα θα λυθούν και όλα θα λάμψουν, και θα βρούμε τη θέση μας σε αυτή τη χώρα, όπου και την ιδιότητά μας ως επαγγελματιών υγείας ακούγεται ότι αμφισβητούν. Υπάρχουν και τα κακά, αλλά μάλλον τα ξέρετε όλοι. Τα βλέπετε κάθε μέρα. Στη χώρα αυτή, όπου ο Πλάτων δίδαξε την πλήρη διαύγεια «εν αυγή καθαρά», στη χώρα αυτή επικρατεί η αμφιβολία για την αλήθεια. Ηλίου φαεινότερη είναι η θέση μας, και έτσι αντιμετωπίζεται σε όλο τον κόσμο... Όμως... Σε αυτό το δελτίο μπορείτε να διαβάσετε για αυτούς που έτυχαν της υψηλότερης διάκρισης στον κόσμο στην επιστήμη της χημείας, που φέτος σχετίζεται με τη βιοχημεία, και πιο συγκεκριμένα με τους υποδοχείς, που συνδέονται με πρωτεΐνες G. Μπορείτε να διαβάσετε και για το NOBEL ιατρικής, που αφορά στα βλαστοκύτταρα και τον επαναπρογραμματισμό τους. Σε αυτό το δελτίο μπορείτε να διαβάσετε και τις εργασίες αυτών που βραβεύθηκαν στο συνέδριό μας. Μελετείστε με ενδιαφέρον τις εργασίες τους. Για να ανέβει το φρόνημά μας. Τις παρουσίασαν αλλά και τις έγραψαν για μας. Όσο για τους άλλους, τους μεγάλους, που μας κάνουν παρέα στα δελτία, αν δεν σας πείθω εγώ να αντιμετωπίσετε τους καιρούς με συμμετοχή, με δουλειά, με μελέτη, μπορεί να τα καταφέρουν αυτοί... Με φιλικούς χαιρετισμούς Κατερίνα Ψαρρά

2 2 Page 2 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΕΘΟ ΟΥ HPLC-MS/MS ΓΙΑ ΙΑΓΝΩΣΗ ΦΑΙΝΥΛΟΚΕΤΟΝΟΥΡΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΑΦΥ ΡΟΓΟΝΑΣΗΣ ΜΕΣΑΙΑΣ ΑΛΥΣΙ ΑΣ ΑΚΥΛΟ-ΣΥΝΕΝΖΥΜΩΝ Α Μ. Αγγελοπούλου 1, Ζ. Τσιάλλα 1, Ί. Χριστοφίδης 1, Π. Πέτρου 1, Α. Σιαφάκα-Καπάδαη 2, Ι. Κανάριος 3, Μ. Σιδηροπούλου 3, Σ. Κακαµπάκος 1 1 Ινστιτούτο Πυρηνικών και Ραδιολογικών Επιστηµών, Ενέργειας, Τεχνολογίας και Ασφάλειας, Ε.ΚΕ.Φ.Ε. «ηµόκριτος», Αγία Παρασκευή Εργαστήριο Βιοχηµείας, Τµήµα Χηµείας, Πανεπιστήµιο Αθηνών, Πανεπιστηµιούπολη, Ιλίσσια, Μαιευτήριο ΛΗΤΩ, Τοµέας Νεογέννητων, Αθήνα, ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΕΣ ΠΑΘΗΣΕΙΣ Ο µεταβολισµός περιλαµβάνει το σύνολο των βιοχηµικών αντιδράσεων που λαµβάνουν χώρα σε έναν ζώντα οργανισµό. Τα ένζυµα διαδραµατίζουν καθοριστικό ρόλο σε όλες τις µεταβολικές οδούς και για το λόγο αυτό, οποιαδήποτε αλλαγή στη λειτουργία τους λόγω κάποιας µετάλλαξης στο αντίστοιχο γονίδιο, µπορεί να δηµιουργήσει σοβαρές επιπτώσεις στο µεταβολισµό και κατ επέκταση στην υγεία. Μία γενετική ανωµαλία σε κάποιο ένζυµο ή πρωτεϊνικό µεταφορέα που εµπλέκεται στο µεταβολισµό των πρωτεϊνών, των υδατανθράκων, των λιπιδίων καθώς και των παράπλευρων συστηµάτων που εµπλέκονται µε αυτόν, ορίζεται ως ενδογενές σφάλµα του µεταβολισµού [1]. Στην πλειονότητά τους οι µεταβολικές παθήσεις είναι κληρονοµικές µε αυτοσωµικό υπολειπόµενο χαρακτήρα και καθεµία από αυτές παρουσιάζει διαφορετικούς φαινότυπους ανάλογα µε την ηλικία έναρξης, την κλινική σοβαρότητα και τον τρόπο µεταβίβασης της πάθησης από γενιά σε γενιά [2]. Η συχνότητα εµφάνισης των µεταβολικών παθήσεων ποικίλει ανάλογα µε την εθνοτική σύνθεση του πληθυσµού. Στην Ευρώπη, η συχνότητα εµφάνισης µεταβολικών παθήσεων είναι κατά µέσο όρο 1 στις γεννήσεις. Οι µεταβολικές παθήσεις εµφανίζονται συνήθως αµέσως µετά τη γέννηση ή κατά τη διάρκεια τις βρεφικής περιόδου και εξελίσσονται ταχέως, ενώ σε ένα µικρό ποσοστό αυτών τα συµπτώµατα εµφανίζονται στην παιδική ηλικία [3]. Ο µεταβολικός έλεγχος για την ανίχνευση και τη διάγνωση µίας ή περισσοτέρων διαταραχών είναι πολύ σηµαντικός, ώστε να είναι δυνατή η θεραπευτική τους αντιµετώπιση. Αναµφισβήτητα, η καταλληλότερη στιγµή για τη διάγνωση κάποιας µεταβολικής πάθησης είναι οι πρώτες µέρες µετά τη γέννηση [2,4]. Για το λόγο αυτό, κατά τη διάρκεια των τελευταίων 50 ετών εφαρµόζονται παγκοσµίως προγράµµατα νεογνικού προληπτικού ελέγχου. Η εισαγωγή του νεογνικού ελέγχου έχει συντελέσει στην έγκαιρη διάγνωση και αντιµετώπιση κληρονοµικών και µεταβολικών ασθενειών και έχει συµβάλλει σηµαντικά στη µείωση της θνησιµότητας καθώς και της νοσηρότητας των νεογνών [5]. Μερικές από τις παθήσεις που περιλαµβάνονται στα ευρωπαϊκά προγράµµατα ελέγχου είναι η φαινυλοκετονουρία, ο συγγενής υποθυρεοειδισµός, η συγγενής υπερπλασία επινεφριδίων, η οµοκυστεϊνουρία, η ασθένεια µε χαρακτηριστική οσµή σφενδάµου στα ούρα, η γαλακτοζαιµία, η ανεπάρκεια αφυδρογονάσης των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-coa, η ανεπάρκεια της παλµιτοϋλο-µεταφοράσης της καρνιτίνης Ι και Ι κ.ά. Η εισαγωγή της φασµατοµετρίας µαζών στην κλινική ανάλυση επέτρεψε να συµπεριληφθούν στο νεογνικό έλεγχο ασθένειες που σχετίζονται µε το µεταβολισµό των λιπαρών οξέων και τις οργανικές οξυαιµίες, καθώς επίσης και να αυξήθεί αξιοσηµείωτα ο αριθµό των αµινο-οξυαιµιών που δύνανται να διαγνωσθούν. Ο αριθµός των παθήσεων που συµπεριλαµβάνονται στο πρόγραµµα νεογνικού ελέγχου ποικίλει από χώρα σε χώρα και εξαρτάται τόσο από την οικονοµική δυνατότητα κάθε χώρας για πρόληψη όσο και από τα κριτήρια που θέτουν οι πραγµατογνώµονες των κρατών. Στην Ελλάδα, το εθνικό πρόγραµµα νεογνικού ελέγχου ξεκίνησε το 1974 και σήµερα πραγµατοποιείται από το Ινστιτούτο Υγείας του Παιδιού. Αρχικά το πρόγραµµα περιελάµβανε τον έλεγχο φαινυλοκετονουρίας. Από το 1983, µε τη συνεισφορά του Εργαστηρίου Ανοσοδιαγνωστικών Προϊόντων του Ι./Ρ.-Ρ.Π. του Ε.ΚΕ.Φ.Ε. «ηµόκριτος», που προσέφερε επισηµασµένη µε ραδιο-ιώδιο ( 125 Ι) θυρεοειδοτρόπο ορµόνη (TSH) και ανοσοκατακρηµνιστικό αντιδραστήριο για µετρήσεις το χρόνο, εντάχθηκε στο πρόγραµµα ο έλεγχος του συγγενούς υποθυρεοειδισµού. Σήµερα, ελέγχονται επιπλέον, η συγγενής υπερπλασία των επινεφριδίων και η γαλακτοζαιµία. Ωστόσο στο πρόγραµµα δεν εντάσσονται παθήσεις που απαιτούν τη χρήση φασµατοµετρίας µαζών και για το λόγο αυτό, ο αριθµός των ελεγχοµένων παθήσεων είναι µικρός σε σύγκριση µε τον αριθµό των παθήσεων που περιλαµβάνονται στα προγράµµατα νεογνικού ελέγχου άλλων ευρωπαϊκών χωρών. Στα πλαίσια αυτής της εργασίας, αναπτύχθηκε απλή και σύντοµη µέθοδος υγρής χρωµατογραφίας-φασµατοµετρίας µαζών (HPLC/MS-MS) σε αποξηραµένές κηλίδες αίµατος µε στόχο τη διάγνωση της φαινυλοκετονουρίας και της ανεπάρκειας της αφυδρογονάσης των µεσαίας αλυσίδας ακυλοσυνενζύµων Α. ΦΑΙΝΥΛΟΚΕΤΟΝΟΥΡΙΑ Η φαινυλοκετονουρία (PKU), µία µορφή υπερφαινυλαλανιναιµίας (HPA) είναι αυτοσωµική υπολειπόµενη κληρονοµική διαταραχή του µεταβολισµού των αµινοξέων, µε συχνότητα εµφάνισης 1 στις κατά µέσο όρο, και οφείλεται σε ανεπάρκεια του ηπατικού ενζύµου υδροξυλάση της φαινυλαλανίνης (PΑΗ). Το ένζυµο αυτό, υπό φυσιολογικές συνθήκες καταλύει την οξείδωση της φαινυλαλανίνης (Phe) σε τυροσίνη (Tyr). Έτσι, απώλεια ή ανεπάρκεια αυτού του ενζύµου οδηγεί σε αυξηµένα επίπεδα της Phe στο αίµα και τα βιολογικά υγρά ενός οργανισµού και σε ανικανότητα σύνθεσης Tyr [6] (Σχήµα 1). Η πιο συνηθισµένη αιτία για την έλλειψη της δραστικότητας της PAH είναι µία γενετική ανωµαλία στο γονίδιο που είναι υπεύθυνο για το ένζυµο PAH [7]. Γενετικές αναλύσεις που πραγµατοποιήθηκαν µέσω τεχνικών ανασυνδυασµού DNA έδειξαν πως η γενετική περιοχή για την PKU βρίσκεται στο χρωµόσωµα 12q23.2. Το γονίδιο του PAH περιέχει 13 εξόνια συνολικού µήκους βάσεων DNA. Η κλασσική µορφή της ασθένειας δεν οφείλεται σε απώλεια ολόκληρου του γονιδίου αλλά σε µεταλλάξεις στην αλληλουχία του που οδηγούν σε υποκαταστάσεις αµινοξέων ή σε πρόωρη διακοπή της µετάφρασης του γονιδίου. Οι πλειοψηφία των ασθενών που πάσχουν από PKU έχουν µία ή περισσότερες µεταλλάξεις στο συγκεκριµένο γονίδιο [8]. Μία δευτερεύουσα αιτία για την εµφάνιση της PKU είναι κάποια διαταραχή στην αναγέννηση ή τη βιοσύνθεση της τετραϋδροβιοπτερίνης (BH 4 ) που αποτελεί συµπαράγοντα της PAH. Κατά την οξείδωση της Phe σε Tyr η BH 4 µετατρέπεται σε κινονοειδή διϋδροβιοπτερίνη (qbh 2 ). Προκειµένου να συνεχισθεί η δράση του PAH, η ΒΗ 4 πρέπει να αναγεννηθεί µέσω της αναγωγάσης της διϋδροπτεριδίνης (Σχήµα 1). Η ανεπάρκεια του συγκεκριµένου ενζύµου οδηγεί σε ανεπάρκεια της PAH.

3 3 Τεύχος 8 Page 3 Σχήµα 1: Οξείδωση της Phe σε Tyr µέσω της υδροξυλάσης της Phe και αναγέννηση του απαραίτητου για την αντίδραση συµπαράγοντα BH 4 Υπό φυσιολογικές συνθήκες, όταν η πρόσληψη της Phe από την τροφή είναι ικανοποιητική, ο ανθρώπινος οργανισµός µπορεί εύκολα να συνθέσει επαρκή ποσότητα Tyr. Το ένζυµο (PAH) καταλύει την οξείδωση της Phe στη θέση 4 του αρωµατικού της δακτυλίου µετατρέποντάς την σε Tyr, χρησιµοποιώντας µοριακό οξυγόνο και BH 4. Η Tyr µέσω διαδοχικών ενζυµικών αντιδράσεων καταβολίζεται σε φουµαρικό, το οποίο εισέρχεται στον κύκλο του κιτρικού οξέος και µετατρέπεται σε CO 2 και H 2 O καθώς και σε ακετοακετυλο-coa (κετονοσώµατα). Η οξείδωση της Phe είναι η κύρια πορεία για τη βιοσύνθεση της τυροσίνης, η οποία αποτελεί πρόδροµη ένωση της ντοπαµίνης και των κατεχολαµινών, νορεπινεφρίνης και επινεφρίνης (Σχήµα 2) και εµµέσως της µελανίνης και της θυροξίνης. Σχήµα 2: Κύρια πορεία αποικοδόµησης της Phe. Μεταβολισµός της Tyr σε CO 2 και H 2 O ή ακετοακετυλο-coa. Μετατροπή της Tyr σε ντοπαµίνη, νορεπινεφρίνη και επινεφρίνη Η ανεπάρκεια του ενζύµου PAH οδηγεί σε ανεπάρκεια τόσο της σύνθεσης της Tyr όσο και της παραγωγής των κατεχολαµινών και των ορµονών που εξαρτώνται από αυτήν, καθώς επίσης και σε αύξηση των επιπέδων της Phe στο αίµα, η οποία είναι τοξική για τον εγκέφαλο. Όταν η κύρια πορεία παρεµποδιστεί ακολουθείται µία δευτερεύουσα πορεία, η τρανσαµίνωση της Phe (Σχήµα 3). Πιο συγκεκριµένα, όταν η PAH δεν λειτουργεί τότε η Phe δεν µπορεί να µετατραπεί σε Tyr και τρανσαµινώνεται µε αποτέλεσµα την παραγωγή φαινυλοκετονών, όπως φαινυλοπυροσταφυλικό, φαινυλοξικό, φαινυλογαλακτικό όπως επίσης και σε ο-υδροξυφαινυλοξικό. Αποτέλεσµα των παραπάνω είναι η πρόκληση µη αντιστρεπτών βλαβών στο κεντρικό νευρικό σύστηµα.

4 4 Σχήµα 3: Τρανσαµίνωση της Phe Στην περίπτωση που η PKU δεν διαγνωστεί ώστε να αντιµετωπιστεί εγκαίρως, οι πάσχοντες µπορεί να εµφανίσουν στους πρώτους 5-6 µήνες της ζωής τους διανοητική καθυστέρηση, χαρακτηριστική οσµή των ούρων (µούχλα) λόγω της παρουσίας φαινυλοπυροσταφυλικού και άλλων φαινυλοκετονών και εξανθήµατα που προσοµοιάζουν µε έκζεµα. Στη συνέχεια του βίου τους συµπτώµατα όπως η ανεπαρκής νοητική ανάπτυξη συνδυαζόµενη µε µικροκεφαλία, η διανοητική και ψυχοκοινωνική καθυστέρηση, τα κινητικά προβλήµατα, η απώλεια µελανίνης από τα µαλλιά ή το δέρµα και αυξηµένα αντανακλαστικά των µυών καθίστανται περισσότερο έκδηλα [9-11]. Η θεραπευτική αντιµετώπιση των νεογνών µε ανεπάρκεια του PAH περιλαµβάνει αυστηρό περιορισµό της κατανάλωσης πρωτεϊνών και µείωση του επιπέδου πρόσληψης της Phe σε εκείνο που απαιτείται για την πρωτεϊνική σύνθεση. Λόγω της περιορισµένης πρόσληψης των φυσικών πρωτεϊνών είναι απαραίτητη η χορήγηση στους ασθενείς ενός µίγµατος αµινοξέων που εµπεριέχει όλα τα απαραίτητα αµινοξέα και την Tyr για την κάλυψη των απαιτήσεων του οργανισµού σε άζωτo [11,12]. ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΑΦΥ ΡΟΓΟΝΑΣΗΣ ΤΩΝ ΜΕΣΑΙΑΣ ΑΛΥΣΙ ΑΣ ΑΚΥΛΟ-ΣΥΝΕΝΖΥΜΩΝ A Η ανεπάρκεια της αφυδρογονάσης των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-coa (MCADD), είναι µία αυτοσωµική υπολειπόµενη πάθηση µε συχνότητα εµφάνισης 1 στις και σχετίζεται µε το µεταβολισµό των λιπαρών οξέων. Η αφυδρογονάση των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-coa (MCAD), το οποίο είναι το πρώτο ένζυµο της β-οξείδωσης, καταλύει την οξείδωση των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-coa (6-12 άτοµα άνθρακα) σε trans- 2- ενοϋλο-coa µε ταυτόχρονη αναγωγή του FAD σε FADH 2 (Σχήµα 4). Σχήµα 4: Πρώτο στάδιο της β-οξείδωσης. Αφυδρογόνωση των ακυλο-παραγώγων στον C 2 µε ταυτόχρονο σχηµατισµό διπλού δεσµού Ανεπάρκεια ή αδράνεια της MCAD οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων των µεσαίας αλυσίδας ακυλο-coa και των παραγόµενων παραπροϊόντων τους, ακυλοκαρνιτινών και ακυλογλυκινών στο αίµα και τα ούρα, αντίστοιχα [13]. Το γονίδιο ACADM το όποιο κωδικοποιεί την πρωτεΐνη MCAD βρίσκεται στο χρωµόσωµα 1p31. Περισσότερες από 30 µεταλλάξεις έχουν ταυτοποιηθεί σε αυτό το γονίδιο, στην πλειοψηφία τους παρανοηµατικές. Η πιο συχνή µετάλλαξη είναι η A985G. Αποτέλεσµα αυτής της σηµειακής µετάλλαξης είναι η υποκατάσταση της λυσίνης από γλουταµινικό οξύ στη θέση 329 της πρόδροµης πρωτεΐνης, η οποία αντιστοιχεί στη θέση 304 της ώριµης πρωτεΐνης. ύο αντίγραφα αυτής της συνήθους µετάλλαξης έχουν βρεθεί σε 80% των ατόµων που πάσχουν από MCADD στην Ευρώπη [13, 14]. Η MCADD είναι η πλέον συνήθης κληρονοµική διαταραχή του µεταβολισµού των λιπαρών οξέων. Υπο φυσιολογικές συνθήκες, τα µεσαίας αλυσίδας λιπαρά οξέα (εξανοϋλο-, οκτανοϋλο-, δεκανοϋλο- λιπαρά οξέα) απορροφώνται από τον εντερικό αυλό άµεσα και µέσω της πυλαίας φλέβας εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίµατος και µεταφέρονται στο ήπαρ όπου οξειδώνονται [15]. Τα µεσαίας και µικρής αλυσίδας λιπαρά οξέα δεν ενεργοποιούνται στο κυτοσόλιο (όπως συµβαίνει µε τα µακράς αλυσίδας λιπαρά οξέα) αλλά στη µιτοχονδριακή µήτρα όπου µετατρέπονται σε ακυλο-coa µέσω των αντίστοιχων ακυλο-coa συνθετασών προκειµένου να οξειδωθούν [16]. Για την είσοδο των µεσαίας αλυσίδας λιπαρών οξέων στη µιτοχονδριακή µήτρα δεν απαιτείται η σύνδεσή τους µε καρνιτίνη αλλά πραγµατοποιείται µέσω παθητικής διάχυσης. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, τα µεσαίας αλυσίδας ακυλο-coa οξειδώνονται προς ακετυλο- CoA, το οποίο εισέρχεται στον κύκλο του Krebs και στην αναπνευστική αλυσίδα για παραγωγή ενέργειας (Σχήµα 5). Στην περίπτωση ανεπάρκειας της MCAD, τα µεσαίας αλυσίδας λιπαρά οξέα που έχουν εισέλθει στη µιτοχονδριακή µήτρα και έχουν ενεργοποιηθεί αλλά και αυτά που προέκυψαν από ατελή οξείδωση των µακράς αλυσίδας λιπαρών οξέων δεν µπορούν να οξειδωθούν λόγω της ανεπάρκειας αυτού του ενζύµου, που είναι το πρώτο από τα 4 ένζυµα της β-οξείδωσης. Προκειµένου να απελευθερωθεί το συζευγµένο µε τα λιπαρά οξέα CoA και να συµµετέχει σε άλλες απαραίτητες αντιδράσεις έτσι ώστε να παραχθεί ενέργεια, τα µεσαίας αλυσίδας ακυλο-coa συνδέονται µε την καρνιτίνη, συσσωρεύονται µε την µορφή εξανοϋλο-, οκτανοϋλο-, δεκανοϋλο καρνιτίνης (C 6, C 8 και C 10, αντίστοιχα) και εξέρχονται του κυττάρου. Για το λόγο αυτό, στην πάθηση αυτή παρατηρείται αύξηση των επιπέδων των µεσαίας αλυσίδας ακυλοκαρνιτινών στο αίµα.

5 5 Τεύχος 8 Σχήµα 5. Μεταβολισµός των µεσαίας αλυσίδας λιπαρών οξέων σε περίπτωση ανεπάρκειας MCAD. Συνήθως, τα πρώτα συµπτώµατα της MCADD εµφανίζονται νωρίς κατά την παιδική ηλικία, ενώ σε µικρότερο ποσοστό γίνονται αντιληπτά κατά την εφηβεία. Έχει αναφερθεί ότι οι πάσχοντες από MCADD µπορεί να είναι φυσιολογικοί χωρίς κανένα σύµπτωµα όσο τρέφονται συχνά ενώ είναι πιθανό να νοσήσουν ξαφνικά µετά από περιόδους νηστείας ή µόλυνσης. Τα κυριότερα από τα συµπτώµατα που παρατηρούνται σε ασθενείς µε MCADD είναι υποκετονική υπογλυκαιµία, ενώ άλλα χαρακτηριστικά συµπτώµατα είναι υπογλυκαιµικές και µεταβολικές κρίσεις, τάση για έµµετο, εγκεφαλοπάθεια, λήθαργος, κώµα ή ακόµα και θάνατος [13]. Η σύγχρονη θεραπευτική αντιµετώπιση της MCADD περιλαµβάνει αποφυγή νηστείας, δίαιτα πλούσια σε υδατάνθρακες και περιορισµένη σε λίπη. Επίσης, απαραίτητη προϋπόθεση είναι η κατανάλωση τακτικών γευµάτων κατά τη διάρκεια της ηµέρας ενώ πρέπει να αποφεύγεται η νηστεία κατά τη διάρκεια της νύχτας. Παρόλα αυτά, πρέπει να διευκρινιστεί ότι οποιαδήποτε θεραπεία δεν προλαµβάνει 100% τις νευρολογικές διαταραχές. Ο περιορισµός στην κατανάλωση λίπους είναι αναγκαίος και κυρίως όταν ταυτόχρονα υπάρχει κάποια µόλυνση. Επίσης, σε καταστάσεις που τα επίπεδα της καρνιτίνης στο αίµα είναι χαµηλά, η χορήγηση σκευασµάτων L-καρνιτίνης είναι αρκετά ωφέλιµη [17]. ΜΕΘΟ ΟΙ ΓΙΑ ΤΗ ΙΑΓΝΩΣΗ PKU και MCADD Αρχικά, η διάγνωση της PKU επραγµατοποιείτο µέσω του προσδιορισµού των επιπέδων του φαινυλοπυροσταφυλικού οξέος στα ούρα [18]. Ωστόσο, σύντοµα αντικαταστάθηκε από µία ηµι-ποσοτική µέθοδο προσδιορισµού φαινυλαλανίνης µέσω βακτηριακής αναστολής, η οποία ήταν η πρώτη µέθοδος που εφαρµόστηκε ευρέως για το νεογνικό έλεγχο της PKU σε δείγµατα αίµατος που βρίσκονταν υπό µορφή αποξηραµένης κηλίδας (Guthrie test) [19]. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκαν φθορισµοµετρικές όσο και ενζυµικές µέθοδοι, οι οποίες βασίζονταν στον προσδιορισµό της φαινυλαλανίνης. Οι µέθοδοι αυτές, εµφάνιζαν σχετικά υψηλά ποσοστά ψευδώς θετικών αποτελεσµάτων [20-22] και ήταν αρκετά χρονοβόρες. Επιπλέον, αναπτύχθηκαν χρωµατογραφικές µέθοδοι για την ταυτόχρονη ανίχνευση φαινυλαλανίνης και τυροσίνης [23-25]. Ο προσδιορισµός των συγκεντρώσεων των δύο αυτών αµινοξέων καθώς και η χρήση του λόγου Phe προς Tyr ως επιπλέον δείκτη για τη διάγνωση της PKU, περιόρισε σηµαντικά τα ψευδώς θετικά αποτελέσµατα που εµφανίζονταν όταν η διάγνωση βασιζόταν µόνο στον προσδιορισµό των επιπέδων φαινυλαλανίνης. Οι περισσότερες από τις χρωµατογραφικές µεθόδους απαιτούν παραγωγοποίηση των αµινοξέων, πριν ή µετά το διαχωρισµό τους στη στήλη, χρησιµοποιώντας διάφορα αντιδραστήρια ανάλογα µε το είδος της ανίχνευσης, µε αποτέλεσµα να αθίσταται κοπιώδης η προετοιµασία του δείγµατος. Τα τελευταία χρόνια, η εισαγωγή της φασµατοµετρίας µαζών συνέβαλε στην αύξηση της ευαισθησίας καθώς και στη µείωση του χρόνου ανάλυσης συγκριτικά µε τις προϋπάρχουσες µεθόδους. Η πλειοψηφία των MS µεθόδων απαιτούν παραγωγοποίηση πριν την ανάλυση των δειγµάτων [26-28]. Ωστόσο, τα προβλήµατα που µπορεί να παρουσιαστούν κατά την παραγωγοποίηση των δειγµάτων, οδήγησαν στην ανάπτυξη µεθόδου MS για την ανάλυση αµινοξέων χωρίς τη χρήση αντιδραστηρίων παραγωγοποίησης [29]. Στην µέθοδο αυτή, ο υπολογισµός των συγκεντρώσεων των αµινοξέων πραγµατοποιείται βάσει του σήµατος του πρώτου θυγατρικού ιόντος, ώστε να αποφευχθούν ψευδώς θετικά αποτελέσµατα λόγω της πιθανής ύπαρξης ισοβαρών ουσιών ή ιόντων µε το ίδιο m/z στο δείγµα. Το σήµα στην περίπτωση αυτή είναι εν γένει σηµαντικά χαµηλότερο ως προς το σήµα του προδρόµου ιόντος, µε αποτέλεσµα η µέθοδος να έχει µειωµένη ευαισθησία.

6 6 Συλλογή δειγµάτων Αποξηραµένες κηλίδες αίµατος ενηλίκων εθελοντών σε απορροφητικό χαρτί χορηγήθηκαν ανώνυµα από το ιατρείο του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «ηµόκριτος» για προκαταρκτική αξιολόγηση της µεθόδου. Αποξηραµένες κηλίδες αίµατος νεογνών σε απορροφητικό χαρτί χορηγήθηκαν από το Μαιευτήριο Λητώ, µε τη σύµφωνη γραπτή γνώµη των γονέων και έγκριση από την επιστηµονική επιτροπή του µαιευτηρίου. Η λήψη των δειγµάτων έγινε από την πτέρνα των νεογνών µέχρι και 72 ώρες µετά τη γέννησή τους. Οι κηλίδες ξηράνθηκαν επί 4 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια φυλάχθηκαν σε ξηραντήρα στους - 20 ο C, έως την ανάλυση τους. Παρασκευή προτύπων δειγµάτων και δειγµάτων ελέγχου Με φυγοκέντρηση ολικού αίµατος από εθελοντή ενήλικα, παρελήφθησαν τα ερυθροκύτταρα, τα οποία εν συνεχεία εκπλύθηκαν µε φυσιολογικό ορό. Τα πρότυπα δείγµατα και τα δείγµατα ελέγχου παρασκευάστηκαν µε ανάµειξη ερυθροκυττάρων µε κατάλληλες ποσότητες ανθρώπινου ορού που περιείχε γνωστές συγκεντρώσεις των προς µέτρηση ουσίων, ώστε να αντιστοιχούν σε αίµα µε αιµατοκρίτη 50-55%. Κηλίδες αίµατος των προτύπων δειγµάτων εναποτέθηκαν σε ειδικό απορροφητικό χαρτί, ξηράνθηκαν και φυλάχθηκαν όπως και τα δείγµατα. ιαδικασία ανάλυσης ισκία αποξηραµένων σταγόνων αίµατος σε χαρτί, διαµέτρου 6,4 mm τοποθετήθηκαν στα πλακίδια µικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων. Σε κάθε φρεάτιο προστέθηκαν 400 µl µεθανόλης και τα δείγµατα ανακινήθηκαν σε οριζόντιο αναδευτήρα επί 20 min στις 250 rpm και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν επί 20 min σε συσκευή υπερήχων. Κατόπιν, από κάθε φρεάτιο ελήφθησαν 300 µl του υπερκειµένου και εξατµίσθηκαν υπό συνεχή ροή N2. Ακολούθησε ανασύσταση του ξηρού υπολείµµατος µε 50 µl Η2Ο:ACN, v/v, 1:1 ανά φρεάτιο. Για την ανάλυση των προτύπων δειγµάτων και των δειγµάτων νεογνών µε HPLC-MS/MS, ενέθηκαν 5 µl δείγµατος, η ροή των διαλυτών ήταν 0,2 ml/min, ενώ η βαθµίδωση των διαλυτών που χρησιµοποιήθηκε περιγράφεται στο Κεφάλαιο «Αποτελέσµατα-Συζήτηση». ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στo πλαίσιo της εργασίας βελτιστοποιήθηκαν όλες οι παράµετροι που αφορούν την ανίχνευση των ουσιών µε το φασµατογράφο µάζας ΜS/ MS ώστε να λαµβάνεται µέγιστο σήµα για κάθε µία από τις προς ανάλυση ουσίες. Η µελέτη των παραµέτρων ανίχνευσης των προς µέτρηση ουσιών σε λειτουργία θετικού ιοντισµού ηλεκτροψεκασµού (ESI), πραγµατοποιήθηκε µε απευθείας έγχυση προτύπων διαλυµάτων των ουσιών στο MS/MS. οκιµάστηκαν διαφορετικές ενέργειες ιοντισµού και θραυσµατοποίησης και προσδιορίστηκαν οι µεταβάσεις των ιόντων για την ανάλυση των ουσιών. Οι µεταβάσεις των ιόντων που βρέθηκαν ταυτίζονταν µε τις αναφερόµενες στη βιβλιογραφία και παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 µαζί µε τις βέλτιστες συνθήκες θραυσµατοποίησης και ιοντισµού για την κάθε ουσία. Πίνακας 1. Μεταβάσεις ιόντων φαινυλαλανίνης, τυροσίνης, ακετυλοκαρνιτίνης, ακυλοκαρνιτινών και παράµετροι ανίχνευσης για το MS/MS.

7 7 Τεύχος 8 Για τον χρωµατογραφικό διαχωρισµό των ουσιών δοκιµάστηκαν διάφορα µίγµατα διαλυτών τόσο µε ισοκρατική όσο και µε βαθµιδωτή έκλουση καθώς και διαφορετικές ταχύτητες ροής. Η σύσταση των διαλυτών της κινητής φάσης που χρησιµοποιήθηκε στο τελικό πρωτόκολλο ήταν 0,4 mm επτα-φθορο-βουτυρικό οξύ (HFBA) σε Η 2 Ο (διαλύτης Α) και 0,1% HCOOH σε ACN ( ιαλύτης Β). H ροή των διαλυτών ήταν 0,2 ml/min. Για το διαχωρισµό των ουσιών στη στήλη πραγµατοποιήθηκε βαθµιδωτή αλλαγή των διαλυτών από 100:0 Α:Β, έπειτα γραµµική µεταβολή σε 40:60 Α:Β στα 2,50 λεπτά, γραµµική µεταβολή σε Α:Β Η 2 Ο ACN στα 3 λεπτά και επαναφορά στην αρχική σύσταση, 100:0 Α:Β, στα 4 λεπτά. Ακολούθησε εξισσορόπηση της στήλης για ένα λεπτό. Όπως φαίνεται στο Σχήµα 7, όπου παρουσιάζεται το χρωµατογράφηµα προτύπου δείγµατος, µε τις συνθήκες που επιλέχθηκαν επιτυγχάνεται πλήρης διαχωρισµός των προς µέτρηση ουσιών. Σχήµα 7: Χρωµατογράφηµα προτύπου δείγµατος ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ Για τον προσδιορισµό των ουσιών σε αποξηραµένες κηλίδες αίµατος απαιτείται έκλουση των ουσιών απο την κηλίδα µε κατάλληλο διαλύτη σε συνδυασµό µε υπερήχους, µεταφορά του υπερκειµένου σε άλλο σωλήνα, ξήρανση και ανασύσταση σε µίγµα ACN-H 2 O ώστε να µην επηρεαστεί η σύσταση της κινητής φάσης. η όλη διαδικασία θα πρέπει να έχει ως αποτέλεσµα τη µέγιστη δυνατή ανάκτηση των προς µέτρηση ουσιών απο την κηλίδα. Η βέλτιστη διαδικασία περιελάµβανε εκχύλιση των δειγµάτων µε MeOH υπό ανάδευση 20 λεπτών ακολουθούµενη από έκθεση των δειγµάτων σε υπερήχους επί 20 λεπτά, ξήρανση και ανασύστασή τους µε µίγµα ACN:Η 2 Ο 30:70 v/v. Υπό αυτές τις συνθήκες, το ποσοστό ανάκτησης που προσδιορίστηκε για την κάθε ουσία µε χρήση κηλίδων αίµατος στις οποίες είχαν προστεθεί γνωστές συγκεντρώσεις δευτεριωµένων ουσιών ήταν υψηλότερο απο 85 % για όλες τις ουσίες. Οι µέθοδοι που βασίζονται στην απευθείας έγχυση του δείγµατος στο φασµατογράφο µάζας είναι κυρίως ηµι-ποσοτικές, ο δε προσδιορισµός των προς µέτρηση ουσιών βασίζεται στο λόγο του σήµατος που παρέχεται απο την κάθε ουσία προς το σήµα της αντίστοιχης δευτεριωµένης ουσίας που προστίθεται στο διάλυµα έγχυσης σε σταθερή συγκέντρωση. Στην παρούσα µελέτη, έχοντας ως στόχο την ανάπτυξη ποσοτικής µεθόδου πέραν της προσθήκης δευτεριωµένων ουσιών, παρασκευάστηκε σειρά προτύπων δειγµάτων των ουσιών σε αποξηραµένες κηλίδες αίµατος. Για την ανάλυση των ουσιών χρησιµοποιήθηκαν κηλίδες διαµέτρου 6.4 mm ενώ ο όγκος του δείγµατος έγχυσης ήταν 5 µl. ΑΝΑΛΥΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Για την εκτίµηση της γραµµικότητας της αναπτυχθείσας µεθόδου παρασκευάστηκαν επτά πρότυπα δείγµατα αποξηραµένων κηλίδων αίµατος που αντιστοιχούσαν σε µία ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων ως προς τον κάθε αναλύτη. Τα πρότυπα αυτά δείγµατα αναλύθηκαν µε την αναπτυχθείσα µέθοδο και υπολογίστηκε το εµβαδό της επιφάνειας της χρωµατογραφικής κορυφής που αντιστοιχούσε σε κάθε αναλύτη. Για την κατασκευή της καµπύλης βαθµονόµησης αφαιρέθηκε η τιµή της µηδενικής συγκέντρωσης από τις τιµές των υπολοίπων προτύπων δειγµάτων και οι καθαρές τιµές που ελήφθησαν για κάθε αναλύτη αντιστοιχήθηκαν µε τη συγκέντρωσή του στο πρότυπο δείγµα. Οι καµπύλες βαθµονόµησης (Σχήµα 8) ήταν γραµµικές για συγκεντρώσεις από 24 έως 800 µmol/l για την Phe και την Tyr, από 3 έως 100 µmol/l για την C 2 και από 0,1 έως 10 µmol/l για τις C 6, C 8 και C 10 µε συντελεστές συσχέτισης r Η γραµµική περιοχή απόκρισης καλύπτει τόσο τη φυσιολογική περιοχή συγκεντρώσεων όσο και τις συγκεντρώσεις που µπορεί να προσδιοριστούν σε δείγµατα ασθενών µε PKU ή MCADD.

8 8 Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης είναι αρκετά χαµηλότερα από τις συγκεντρώσεις των αναλυτών σε δείγµατα µη ασθενών και εποµένως η ευαισθησία της µεθόδου κρίνεται επαρκής για την ανάλυση πραγµατικών δειγµάτων. Για τον έλεγχο της ακρίβειας της αναπτυχθείσας µεθόδου, πραγµατοποιήθηκαν πειράµατα ανάκτησης για όλες τις προς µέτρηση ουσίες σε δείγµατα αίµατος. Βρέθηκε ότι η εκατοστιαία ανάκτηση για την Phe κυµαινόταν από 96 έως 105%, για την Tyr από %, ενώ για τις C2, C6, C8, και C10 από 93 έως 109%. Σε όλες τις περιπτώσεις, η ανάκτηση των εξωγενώς προστιθέµενων ουσιών ήταν στα όρια (85-115%) που απαιτούνται για να χαρακτηριστεί µία µέθοδος ακριβής και αξιόπιστη. Η ειδικότητα της µεθόδου αξιολογήθηκε συγκρίνοντας τους λόγους σήµατος προδρόµου ιόντος προς θυγατρικό ιόν που προσδιορίστηκαν για τα πρότυπα διαλύµατα των προς µέτρηση ουσιών σε H 2 O, τα πρότυπα δείγµατα και τα δείγµατα νεογνών. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι δεν υπήρχε αξιοσηµείωτη διαφορά µεταξύ των 3 διαφορετικών µητρών δείγµατος, γεγονός που υποδεικνύει ότι δεν υπάρχουν παρεµβολές στο σήµα από τα συστατικά της µήτρας του δείγµατος. Εποµένως, η µέθοδος έχει υψηλή ειδικότητα όσον αφορά τον προσδιορισµό των συγκεκριµένων αναλυτών σε δείγµατα αποξηραµένων κηλίδων αίµατος νεογνών. Εµβαδόν κορυφής Συγκέντρωση Φαινυλαλανίνης (µmol/l) Εµβαδόν κορυφής Συγκέντρωση Τυροσίνης (µmol/l) Eµβαδόν κορυφής Συγκέντρωση Ακετυλο-καρνιτίνης (µmol/l) Εµβαδόν κορυφής Συγκέντρωση εξανοϋλο-καρνιτίνης (µmol/l) Εµβαδόν κορυφής Συγκέντρωση οκτανοϋλο-καρνιτίνης (µmol/l) Εµβαδόν κορυφής Συγκέντρωση δεκανοϋλο-καρνιτίνης (µmol/l) Σχήµα 8: Ενδεικτικές καµπύλες βαθµονόµησης των προς µέτρηση ουσιών. Κάθε σηµείο είναι η µέση τιµή των δύο µετρήσεων ± SD

9 9 Τεύχος 8 Το όριο ανίχνευσης, το όριο ποσοτικοποίησης καθώς και η ενδο- και δι- αναλυτική διακύµανση για όλες τις προς µέτρηση ουσίες παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Πίνακας 2: Όρια ανίχνευσης, ποσοτικοποίησης, ενδο- και δι-αναλυτική διακύµανση των προς µέτρηση ουσιών Για τον προσδιορισµό του ορίου κατωφλίου για την καθεµία από τις ουσίες το οποίο αντιστοιχεί στη συγκέντρωση που διαχωρίζει τους πάσχοντες από τους µη πάσχοντες, αναλύθηκαν 450 δείγµατα νεογνών. Για το σκοπό αυτό, αναλύθηκαν µε την αναπτυχθείσα µέθοδο αποξηραµένες κηλίδες αίµατος νεογνών σε απορροφητικό χαρτί που χορηγήθηκαν από το Μαιευτήριο Λητώ µε τη συγκατάθεση των γονέων και µετά από έγκριση από την επιστηµονική επιτροπή του µαιευτηρίου. Από τις τιµές που ελήφθησαν για τα 450 δείγµατα, προσδιορίστηκαν η ελάχιστη τιµή, η µέγιστη τιµή, η διάµεσος τιµή καθώς και η µέση τιµή και η τυπική απόκλιση των µετρήσεων που αντιστοιχούσαν στο σύνολο των δειγµάτων. Το όριο κατωφλίου υπολογίστηκε ως η µέση τιµή 450 δειγµάτων συν 2 φορές την τυπική απόκλιση. Τα όρια που προσδιορίστηκαν παρουσιάζονται στον Πίνακα 3. Πίνακας 3: Τιµές ορίων κατωφλίου για τις προς µέτρηση ουσίες Τα όρια κατωφλίου που υπολογίστηκαν από την ανάλυση των 450 δειγµάτων ήταν εντός του εύρους των ορίων κατωφλίου που έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία για όλες τις ουσίες [111]. Η µέθοδος συγκρίθηκε επιπλέον µε µία εµπορικά διαθέσιµη συσκευασία (MassChrom Amino Acids and Acylcarnitines from Dried Blood kit,chromsystems) για τον ηµιποσοτικό προσδιορισµό των ουσιών που αφορούν τόσο την PKU όσο και την MCADD, µέσω της ανάλυσης των 450 δειγµάτων. Ο προσδιορισµός των ουσιών µέσω της εµπορικής συσκευασίας βασίζεται στη χρήση εσωτερικών προτύπων, είναι ηµιποσοστικός ενώ η διάκριση µεταξύ πασχόντων και φυσιολογικών επιτυγχάνεται βάσει της τιµής δείγµατος ελέγχου που περιλαµβάνεται στη συσκευασία και του οποίου η συγκέντρωση για κάθε ουσία αντιστοιχεί στις τιµές κατωφλίου. Στο Σχήµα 9 παρουσιάζονται τα ιστογράµµατα συχνοτήτων των τιµών που ελήφθησαν για 450 δείγµατα και µε τις δύο µεθόδους και όπως φαίνεται, οι τιµές που προσδιορίστηκαν για όλους τους αναλύτες ήταν παρεµφερείς.

10 10 Σχήµα 9: Ιστογράµµατα συγκεντρώσεων των Phe, Tyr, C2, C6, C8, και C10 που προέκυψαν από ανάλυση 450 δειγµάτων νεογνών. Οι συµπαγείς ράβδοι αντιπροσωπεύουν τις συγκεντρώσεις των δειγµάτων που προσδιορίστηκαν µε την αναπτυχθείσα µέθοδο, ενώ οι γραµµές αντιπροσωπεύουν τις συγκεντρώσεις των ίδιων δειγµάτων που προσδιορίστηκαν µε την εµπορική συσκευασία. Οι κάθετες γραµµές υποδεικνύουν το όριο κατωφλίου. Eπιπλέον, προκειµένου να αξιολογηθεί η αναπτυχθείσα µέθοδος και από έναν εξωτερικό φορέα, το εργαστήριο έγινε µέλος του Newborn Screening Quality Assurance Program του Centers for Disease Control and Prevention (CDC) και τα δείγµατα που εστάλησαν αναλύθηκαν µε την αναπτυχθείσα µέθοδο. Από τα αποτελέσµατα προέκυψε ότι οι τιµές που προσδιορίστηκαν ήταν εντός των αναµενοµένων ορίων σύµφωνα µε τα στατιστικά στοιχεία που παρέχονται στην αναφορά αυτού του οργανισµού ενώ η ενδοαναλυτική και η διαναλυτική διακύµανση ήταν µικρότερες του 10% για όλες τις ουσίες.

11 11 Τεύχος 8 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε για πρώτη φορά µέθοδος HPLC-MS/MS, χωρίς παραγωγοποίηση, για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισµό Phe, Tyr καθώς και C 2, C 6, C 8 και C 10 σε αποξηραµένες κηλίδες αίµατος νεογνών µε στόχο την ταυτόχρονη διάγνωση της PKU και της MCADD. Ο διαχωρισµός των αναλυτών µέσω HPLC, οδήγησε στην εξάλειψη παρεµβολών από τη βιολογική µήτρα. ιαπιστώθηκε ότι υπήρχε υψηλή ειδικότητα, υψηλή ευαισθησία ανίχνευσης (Phe= 3µmol/L, C 8 =0.01 µmol/l), ακρίβεια, και επαναληψιµότητα (ενδο-αναλυτική διακύµανση < 12.5 %, δι-αναλυτική διακύµανση < 15 %). Τα αποτελέσµατα που ελήφθησαν από την ανάλυση 450 δειγµάτων ήταν σε συµφωνία µε εκείνα που ελήφθησαν κατά την ανάλυση των ίδιων δειγµάτων µε εµπορικά διαθέσιµη συσκευασία. Βρέθηκε επίσης ότι υπήρχε συµφωνία µεταξύ των αποτελεσµάτων που ελήφθησαν µε την αναπτυχθείσα µέθοδο και τον εξωτερικό φορέα ελέγχου. Επιπλέον, ο χρόνος ανάλυσης για κάθε δείγµα ήταν 5 λεπτά, επιτρέποντας την ανάλυση µεγάλου αριθµού δειγµάτων ανά ηµέρα καθιστώντας την αναπτυχθείσα µέθοδο κατάλληλη για την εφαρµογή της στο νεογνικό έλεγχο ρουτίνας. La Marca G., Malvagia S., Donati M. A., Morrone A., Pasquini E. and Zammarchi E., Rapid diagnosis of medium chain Acyl Co-A dehydrogenase (MCAD) deficiency in a newborn by liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, vol. 17, pp ΑΝΑΦΟΡΕΣ H. Harris, Genetical theory and the inborn errors of metabolism, B.M.J. 1970, vol. 1, pp Inherited metabolic disorders, (19/2/2012) J. M. Saudubray, F. Sedel, J. H. Walter, Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: An introduction, J. Inherit. Metab. Dis., 2006, vol. 29, pp T. S. Raghuveer, U. Garg, and W. D. Graf, Inborn Errors of Metabolism in Infancy and Early Childhood: An Update, A.F.P., 2006, vol. 73, pp Carroll A. E. and Downs S. M., Comprehensive cost-utility analysis of newborn screening strategies, Pediatrics 2006, vol. 117, pp. s287-s295. Williams R. A., Cyril D. S. Mamotte, Burnett J. R., Phenylketonuria: An Inborn Error of Phenylalanine Metabolism, Clin Biochem Rev, 2008, vol. 29, pp Levy H. L. Ιnvited Editorial: Molecular genetics of Phenylketonuria and its implications, Am. J. Hum. Genet. 1989, vol. 45, pp Flatmark T., Stevens R. C., Structural Insight into the Aromatic Amino Acid Hydroxylases and Their Disease-Related Mutant Forms, Chem. Rev., 1999, vol. 99, pp Kaplan A. R., Phenylketonuria: A review, Biochemography and Social Biology, 1962, vol. 9, pp de Baulny H. O., Abandie V., Feillet F. and de Parscau L., Management of phenylketonuria and hyperphenylalaninemia, J. Nutr. 2007, vol. 137, pp. 1561S-1563S. Diet intervention guidelines for adults with untreated PKU ( ) Grosse S., Khoury M., Greene C., Crider K. and Politt R., The epidemiology of medium chain acyl-coa dehydrogenase deficiency: An update, Genet. Med. 2006, vol. 8, pp Dessein A. F., Fontaine M., Andresen B. S., Gregersen N., Brivet M., Rabier D., Napuri-Gouel S., Dobbelaere D., Mention-Mulliez K., Martin-Ponthieu A., Briand G., Millington D. S, Vianey-Saban C., Wanders R. J. A. and Vamecq J., A novel mutation of the ACADM gene (c.145c>g) associated with the common c.985a>g mutation on the other ACADM allele causes mild MCAD deficiency: a case report, Orphanet Journal of Rare Diseases 2010, vol. 5, pp Leonhardt M. and Langhans W., Fatty acid oxidation and control of food intake, Physiology & Behavior, 2004, vol. 83, pp Schulz H., Encyclopedia of Biochemical Chemistry, Fatty acid oxidation, 2004 Elsevier Inc., vol. 2, p. 90. Schulz H., Beta oxidation of fatty acids, B.B.A., 1991, vol. 1081, pp Allen R. J. and Wilson J. L., Urinary phenylpyruvic acid in phenylketonuria, J.A.M.A. 1964, vol. 188, pp Guthrie R. and Susi A., A simple phenylalanine method for detecting PKU in large populations of newborn infants, Pediatrics 1963, vol. 32, pp Schulze A., Mayatepek E. and Hoffmann G. F., Evaluation of 6-year application of the enzymatic colorimetric phenylalanine assay in the setting of neonatal screening for phenylketonuria, Clin. Chim. Acta 2002, vol. 317, pp

12 12 Gerasimova N. S., Steklova I. V. and Tuuminem T., Fluorometric method for phenylalanine microplate assay adopted for phenylketonuria screening, Clin. Chem. 1989, vol. 35, pp Chace D. H., Millington D. S., Terada N., Kahler S., Roe C. and Hofman L. F., Rapid diagnosis of phenylketonuria by quantitative analysis for phenylalanine and tyrosine in neonatal blood spots by tandem mass spectrometry, Clin.Chem. 1993, vol. 39, pp Roesel R. A., Blankenship P. R. and Hommes F. A., HPLC assay of phenylalanine and tyrosine in blood spots on filter paper, Clin. Chim. Acta 1986, vol. 156, pp Dale Y., Mackey V., Mushi R., Nyanda A., Maleque M. and Ike J., Simultaneous measurement of phenylalanine and tyrosine in phenylketonuric plasma and dried blood by high-performance liquid chromatography, J. Chromatogr. B, 2003, vol. 788, pp Kand ar R. and Zakova P., Determination of phenylalanine and tyrosine in plasma and dried blood samples using HPLC with fluorescence detection, J. Chromatogr. B 2009, vol. 877, pp Chase D., Sherwin J., Hillman S., Lorey F. and Cunningham G., Use of phenylalanine-to-tyrosine ratio determined by mass spectrometry to improve newborn screening for phenylketonuria of early discharge specimens collected in the first 24 hours, Clin. Chem. 1998, vol. 44, pp Loukas Y. L., Soumelas G. S., Dotsikas Y., Georgiou V., Molou E. l., Thodi Boutsini G. M., Biti S. and Papadopoulos K Expanded newborn screening in Greece: 30 months of experience, J. Inherit. Metab. Dis. 2010, DOI /s Schulze A., Kohlmuelter D. and Mayatepek E., Sensitivity of electrospray-tandem mass spectrometry using the phenylalanine/ tyrosine-ratio for differential diagnosis of hyperphenylalaninemia in neonates, Clin. Chim. Acta 1999, vol. 283, pp Wang C., Zhang W., Song F., Liu Z. and Liu S., A simple method for the analysis by MS/MS of underivatized amino acids on dry blood spots from newborn screening, Amino Acids 2011, DOI /s Zoppa M., Gallo L., Zacchello S. and Giordano G., Method for the quantification of underivatized amino acids on dry blood spots from newborn screening by HPLC-ESI-MS/MS, J. Chromatogr. B 2006, vol. 831, pp Waterval W. A. H., Scheijen J. L. J. M., Ortmans-Ploemen M. M. J. C., Habets-van der Poel C. D. and Bierau J., Quantitative UPLC-MS/MS analysis of underivatized aa in body fluids is a reliable tool for the diagnosis and follow-up of patients with inborn errors of metabolism, Clin. Chim. Acta 2009, vol. 407, pp Huang Ζ. Η., Gage D. A., Bieber L. L. and Sweeley C. C., Analysis of acylcarnitines as their N-demethylated ester derivatives by gas chromatography-chemical ionization mass spectrometry, Anal. Biochem., 1991, vol. 199, pp Costa C. G., Struys E. A., Bootsma A., ten Brink H. J.,. Dorland L, Tavares de Almeida I., Duran M. and Jakobs C., Quantitative analysis of plasma acylcarnitinesusing gas chromatography chemical ionization mass fragmentography, J. Lipid. Res., 1997, vol. 38, pp Lowes S. and Rose M. E., Simple and unambiguous method for identifying urinary acylcarnitines usding gas chromatography-mass spectrometry, Analyst 1990, vol. 115, pp Minkler P. E., Ingalls S. T., Kormos L. S., Weir D. E. and Hoppel C. L., Determination of carnitine, butyrobetaine, and betaine as 4 bromophenacyl ester derivatives by hogh performance liquid chromatography, J. Chromatogr., 1984, vol. 336, pp Minkler P. E. and Hoppel C. L., Determination of free carnitine and total carnitine in human urine: derivatization with 4 -bromophenacyl trifluoromethanesulfonate and high performance liquid chromatography, Clin. Chim. Acta 1992, vol. 212, pp Vernez L., Thormann W. and Krahenbuhl S., Analysis of carnitine and acylcarnitines in urine by capillary electrophoresis, J. Chromatogr. A, 2000, vol.895, pp Millington D. S., Koda N., Norwood D. L. and Roe C. R., Tandem mass spectrometry: A new method for acylcarnitine profiling with potential for neonatal screening for inborn errors of metabolism, J. Inherit Metab. Dis. 1990, vol. 13, pp Rashed M. S., Ozand P. T., Harrison M. E. and Watkins P. J. F., Electrospray tandem mass spectrometry in the diagnosis of organic acidemias, Rapid. Commun. Mass Spectrom., 1994, vol. 8, pp Chase D. H., Mass spectrometry in the clinical laboratory, Chem. Rev., 2001, vol. 101, pp La Marca G., Malvagia S., Donati M. A., Morrone A., Pasquini E. and Zammarchi E., Rapid diagnosis of medium chain Acyl Co-A dehydrogenase (MCAD) deficiency in a newborn by liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, vol. 17, pp

13 13 ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΜΕΛΩΝ ΤΗΣ ΥΠΕΡΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΟΥ T F-α ΣΕ ΜΥΕΣ ΜΕ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ CRH ΚΑΤΑ ΤΗ ΙΑΡΚΕΙΑ ΕΡΜΑΤΙΚΗΣ ΤΡΑΥΜΑΤΙΚΗΣ ΕΠΟΥΛΩΣΗΣ Κατερίνα Ρωµανού, Όλγα Ραούλη, Ευθυµία Καραγιάννη, Ανδρεάς Μαργιωρής, Μαρία Βενυχάκη Εργ. Κλινικής Χηµείας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήµιο Κρήτης Ηράκλειο, Κρήτη Τα δερµατικά τραύµατα αποτελούν ένα µείζον ιατρικό πρόβληµα που απορροφά ένα σηµαντικό ποσό των δαπανών για την υγεία. Η επούλωση των τραυµάτων είναι µία σύνθετη διαδικασία η οποία απαιτεί το συντονισµό και τη συνεργασία διαφόρων τύπων κυττάρων και µορίων και είναι άρρηκτα συνδεδεµένη µε τη φλεγµονή. Η συµπεριφορά του κάθε κυτταρικού πληθυσµού και η συνεισφορά των παραγόντων, συστηµατικά και τοπικά παραγόµενων, στις φάσεις της επούλωσης (φλεγµονή-πολλαπλασιασµός-ανάπλαση ιστού) δεν είναι πλήρως διασαφηνισµένες. Μολονότι η πλήρης αναγέννηση του τραυµατισµένου ιστού συµβαίνει σπάνια σε ενήλικα θηλαστικά, η τραυµατική επούλωση σε υγιείς οργανισµούς δεν είναι συνήθως προβληµατική και δεν οδηγεί σε σηµαντικές λειτουργικές και αισθητικές αλλοιώσεις. Παρόλα αυτά πολλά άτοµα υποφέρουν από διαταραχές στην επούλωση όπως συµβαίνει στους ηλικιωµένους, σε άτοµα που βρίσκονται σε αγωγή µε αντιφλεγµονώδη (και κυρίως γλυκοκορτικοειδή) καθώς επίσης και σε παχύσαρκους ασθενείς. Ο παράγοντας νέκρωσης όγκων-α (TNF-α) ανήκει στην οµώνυµη υπερ-οικογένεια, η οποία αποτελείται από 29 υποδοχείς και 19 προσδέτες και εµπλέκεται σε πληθώρα βιολογικών λειτουργιών, όπως στον έλεγχο της ενεργοποίησης και απόπτωσης κυττάρων του ανοσοποιητικού, στην οµοιόσταση των ιστών κλπ. Η υπερέκφραση του TNF-α επίσης συνδέεται µε µεγάλο αριθµό νόσων, οι οποίες σχετίζονται µε επίµονη φλεγµονή και ιστική καταστροφή. Τα επίπεδα του TNF-α είναι υψηλά σε µη επουλωµένα έλκη και σχετίζονται µε ανεπαρκή επούλωση σε ζωικά µοντέλα που πάσχουν από διαβήτη τύπου 2. Χρόνια αύξηση του TNF-α, όπως παρατηρείται σε παχύσαρκους ασθενείς έχει δειχθεί ότι οδηγεί σε ανεπαρκή δερµατική τραυµατική επούλωση και προκαλεί ελάττωση της παραγωγής του κολλαγόνου, ενώ συστηµατική χορήγηση αντισωµάτων κατά της κυτοκίνης TNFα αποκαθιστά τη µειωµένη τραυµατική επούλωση σε διαβητικά ob/ob ποντίκια. Εκτός από τον TNF-α άλλα µέλη της οικογένειας αυτής για τα οποία εκδηλώνεται ολοένα και µεγαλύτερο ενδιαφέρον είναι οι παράγοντες BAFF και TWEAK. Ο BAFF αναγνωρίσθηκε αρχικά ως παράγοντας που εµπλέκεται στη δηµιουργία λεµφωµάτων και στην εµφάνιση παθήσεων του ανοσολογικού συστήµατος, αλλά στη συνέχεια εντοπίσθηκε και σε µια σειρά άλλων ιστών µε ή χωρίς ανοσολογική δράση. Ο TWEAK περιγράφηκε αρχικά ως επαγωγός της απόπτωσης, ωστόσο έκτοτε ανιχνεύθηκε πληθώρα δράσεων αυτού του µορίου. Εκφράζεται σηµαντικά σε κύτταρα φλεγµονής και δρα µέσω του υποδοχέα του Fn14, ο οποίος εκφράζεται σε επιθηλιακά, µεσεγχυµατικά, ενδοθηλιακά κύτταρα και σε προγονικά κύτταρα διαφόρων κυτταρικών τύπων. Η έκφρασή του υποδοχέα Fn14 είναι φυσιολογικά χαµηλή, αλλά µετά από τραυµατισµό ενισχύεται, επαγόµενη από αυξητικούς παράγοντες. Μέσω του υποδοχέα Fn14, ο TWEAK εµπλέκεται στην αποκατάσταση τραυµατισµένων ιστών, ελέγχοντας διαδικασίες όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση, την κυτταρική µετανάστευση, την αγγειογένεση και τη φλεγµονή. Υπό φυσιολογικές συνθήκες µετά την ανάπλαση του ιστού, τα επίπεδα του υποδοχέα Fn14 και του παράγοντα TWEAK επανέρχονται σε χαµηλές τιµές. Ωστόσο, αν διατηρηθεί αυξηµένη η έκφρασή τους, ο ιστός οδηγείται σε χρόνιες καταστάσεις φλεγµονής, αυξηµένη αγγειογένεση, παθολογική αναδόµηση του ιστού και απορρύθµιση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού, καταστάσεις που σχετίζονται µε την ανάπτυξη υπερπλασιών. Ενώ έχουν µελετηθεί εκτενώς η παραγωγή και οι δράσεις της κυτοκίνης TNF-α στο δέρµα και στην τραυµατική επούλωση, όπως αναφέρθηκε και πρωτύτερα, ελάχιστα είναι γνωστά για το ρόλο των παραγόντων BAFF, APRIL και TWEAK σε αυτόν τον ιστό. Αποτελέσµατά µας, βρισκόµενα υπό δηµοσίευση, καταδεικνύουν την έκφραση των APRIL, BAFF και TWEAK, καθώς και τριών εκ των υποδοχέων τους (BCMA, TACI και Fn14) σε φυσιολογική επιδερµίδα. Η υποθαλαµική εκλυτική ορµόνη της κορτικοτροπίνης (CRH) είναι ο κύριος διαµεσολαβητής στην απόκριση του οργανισµού στο στρες, συµπεριλαµβανοµένης και της φλεγµονώδους διαδικασίας. Είναι επίσης γνωστό ότι η CRH και οι υποδοχείς της εκφράζονται σε πληθώρα περιφερικών ιστών συµπεριλαµβανοµένου του ανθρώπινου και του δέρµατος των τρωκτικών. Η περιφερική CRH κατέχει ισχυρές προφλεγµονώδεις δράσεις στο δέρµα και σε άλλους ιστούς. Σε προηγούµενες µελέτες µας χρησιµοποιώντας ποντίκια µε γενετική ανεπάρκεια της CRH (Crh-/- µύες) έχουµε δείξει ότι τα ζώα αυτά εµφανίζουν ταυτόχρονη ανεπάρκεια γλυκοκορτικοειδών, καθώς και δυο µε τρεις φορές υψηλότερα επίπεδα TNF-α µετά από επαγωγή φλεγµονής µε διαφορετικά µοντέλα. Επιπλέον, η οµάδα µας έχει πρόσφατα δείξει ότι τα ποντίκια αυτά έχουν επιταχυνόµενη δερµατική τραυµατική επούλωση. Βασιζόµενοι σε αυτές τις γνώσεις, ο σκοπός της µελέτης µας ήταν να ερευνήσουµε την έκφραση µελών της υπεροικογένειας του TNF σε Crh-/- µύες κατά τη διαδικασία της τραυµατικής επούλωσης. Τα αποτελέσµατα της παρούσας εργασίας δείχνουν ότι η έκφραση του mrna του TNF-α είναι µεγαλύτερη στα ζώα µε φυσιολογική έκφραση της CRH (και κατά συνέπεια και των γλυκοκορτικοειδών) την πρώτη ηµέρα µετά την επαγωγή του τραύµατος συγκριτικά µε τα ζώα στα οποία απουσιάζει η ορµόνη. Σε αντίθεση µε τον TNF-α, η έκφραση του mrna του TWEAK δε διαφέρει σηµαντικά µεταξύ των δύο µοντέλων ζώων στις χρονικές στιγµές που µελετήθηκε. Εξωγενής χορήγηση γλυκοκορτικοειδών σε φυσιολογικά επίπεδα, στα ποντίκια µε έλλειψη CRH, έχει ως αποτέλεσµα τη µείωση των επιπέδων του TNF-α (όπως αναµενόταν) την πρώτη ηµέρα µετά την επαγωγή του τραύµατος. Σε αντίθεση µε τον TNF-α, η χορήγηση γλυκοκορτικοειδών αύξησε σηµαντικά τα επίπεδα του TWEAK στην περιοχή του τραύµατος την τρίτη µέρα κατά τη διαδικασία της επούλωσης. Σχετικά µε την έκφραση των παραγόντων αυτών σε φυσιολογικό δέρµα τα αποτελέσµατά µας έδειξαν ότι η έκφραση του TNF-α και του TWEAK είναι χαµηλότερη στους µύες µε ανεπάρκεια σε CRH πριν τη χορήγηση γλυκοκορτικοειδών. Τέλος, τα επίπεδα του mrna του FN14 δεν είχαν σηµαντική διαφορά ανάµεσα στους δυο διαφορετικούς τύπους ποντικιών πριν και µετά την επαγωγή τραύµατος. Συνοψίζοντας, η γενετική ανεπάρκεια σε CRH και γλυκοκορτικοειδή συνοδεύεται µε διαφοροποιηµένη έκφραση του TNF-α και του TWEAK κατά τη διάρκεια της δερµατικής τραυµατικής επούλωσης. Τα νέα µας πειράµατα αποσκοπούν να διασαφηνίσουν τον πιθανό ρόλο αυτών των παραγόντων στην επιταχυνόµενη τραυµατική επούλωση των Crh-/- ποντικών µε τελικό σκοπό να χρησιµοποιηθούν οι παράγοντες αυτοί ως δείκτες της οµαλής ή όχι επούλωσης των δερµατικών τραυµάτων.

14 14 Μελέτες υποδοχέων που συνδέονται µε πρωτεΐνες G Με το βραβείο obel Χηµείας για το 2012 βραβεύτηκαν οι Brian K. Kobilka και Robert J. Lefkowitz, για τις µελέτες τους στους υποδοχείς που συνδέονται µε πρωτεΐνες G. Μετάφραση-Προσαρµογή: Κωνσταντινάκου Νέλλη, Χηµικός, Msc Βιοχηµείας «Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2012 STUDIES OF G-PROTEIN COUPLED RECEPTORS» Οι υποδοχείς που συνδέονται µε πρωτεΐνες G (G-protein-coupled receptors, GPCRs) σχηµατίζουν ένα αξιοθαύµαστο µοριακό σύστηµα που επιτρέπει τη µετάδοση ποικιλίας σηµάτων διαµέσου της κυτταρικής µεµβράνης, µεταξύ των κυττάρων και µεταξύ σηµείων που απέχουν αρκετά στο σώµα. Σήµερα, έχουµε κατανοήσει το µοριακό µηχανισµό µε τον οποίο λειτουργούν αυτοί οι υποδοχείς, κυρίως εξαιτίας των µελετών που έχουν πραγµατοποιήσει οι Brian K. Kobilka και Robert J. Lefkowitz. Εισαγωγή Όλα τα ανθρώπινα κύτταρα περιβάλλονται από µια πλασµατική µεµβράνη, τη φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα. Αυτή η µεµβράνη επιτρέπει στα κύτταρα να έχουν ένα συγκεκριµένο µίγµα βιοχηµικά ενεργών ειδών, αποτρέποντας την είσοδο ανεπιθύµητων συστατικών από τον περιβάλλοντα χώρο. Για τη σωστή λειτουργία των κυττάρων πρέπει ο βιοχηµικός µηχανισµός εντός του κυττάρου να µπορεί να λαµβάνει οδηγίες από τον εξωτερικό χώρο. Μεταβολές στα επίπεδα των ορµονών εξωτερικά των κυττάρων προκαλούν επίκτητες αλλαγές στην ενζυµική δραστικότητα στο εσωτερικό. Τα µόρια της οσµής επηρεάζουν τα κύτταρα στο οσφρητικό επιθήλιο, ενώ τα συστατικά της τροφής επηρεάζουν τη χηµική δραστηριότητα στους γευστικούς κάλυκες, οι οποίοι µε τη σειρά τους προκαλούν ηλεκτρικά σήµατα που µεταφέρουν την πληροφορία στον εγκέφαλο. Τα ανθρώπινα κύτταρα επικοινωνούν διαρκώς τόσο µεταξύ τους όσο και µε τον περιβάλλοντα χώρο, γεγονός που απαιτεί µοριακή «οργανολογία» και ένα κατάλληλο µηχανισµό για τη σωστή µετάδοση της πληροφορίας διαµέσου της κυτταρικής µεµβράνης. Επιπλέον, η µετάδοση σήµατος µέσα στο σώµα µπορεί και πρέπει να καλύψει µεγάλες αποστάσεις. Για να µπορεί ο εγκέφαλος να αντιδρά άµεσα χρειάζεται ταχύτατα πληροφορίες από τις αισθήσεις µας, την όραση, την οσµή, τη γεύση κλπ. Όλα τα παραπάνω απαιτούν ένα µοριακό µηχανισµό για τη µετάδοση της πληροφορίας πέρα από τη πλασµατική µεµβράνη. Ο µοριακός σχεδιασµός αποτελείται από υποδοχείς που συνδέονται µε πρωτεΐνες G (G-protein-coupled receptors, GPCRs). Πρόκειται για πρωτεΐνες που εντοπίζονται στη πλασµατική µεµβράνη. Η ονοµασία τους GPCR οφείλεται σε ένα συνηθισµένο τρόπο µετάδοσης σήµατος µέσω υποδοχέων εντός των κυττάρων µε πρωτεΐνες συνδεδεµένες µε GTP. Επειδή η πολυπεπτιδική τους αλυσίδα διαπερνά επτά φορές την πλασµατική µεµβράνη, οι GPCRs αποκαλούνται επίσης επτα-διαµεµβρανικοί υποδοχείς ή υποδοχείς µε επτά διαµεµβρανικές έλικες (seventransmembrane receptors, 7TM). Ενεργοποιούν εύρος φυσιολογικών σηµάτων από το εξωτερικό των κυττάρων. Το σήµα µπορεί να αφορά στη µεταβολή της συγκέντρωσης πεπτιδίων, ορµονών, λιπιδίων, νευροδιαβιβαστών, ιόντων, κλπ., ή ακόµα εισροή φωτονίων στο µάτι. Οι GPCRs µετατρέπουν αυτά τα σήµατα στο εσωτερικό των κυττάρων και προκαλούν µια σειρά αντιδράσεων που περιλαµβάνει άλλες πρωτεΐνες, νουκλεοτίδια και µεταλλικά ιόντα, τα οποία τελικά παραδίδουν ένα µήνυµα και προκαλούν την κατάλληλη κυτταρική και φυσιολογική αντίδραση.

15 15 ΣΧΗΜΑ 1: Σχηµατική αναπαράσταση ενός κυττάρου µε το εσωτερικό του (γαλάζιο χρώµα) και το εξωτερικό του (µπλε χρώµα) χώρο, µε τα διάφορα χηµικά συστατικά του να διαχωρίζονται από µια φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα. Η διπλοστοιβάδα περιέχει πολλές πρωτεΐνες. Φαίνονται δυο αντίγραφα GPCRs µε ειδικότητα σε ένα διάχυτο πρόσδεµα (κίτρινο χρώµα). Οι υποδοχείς που συνδέονται µε το πρόσδεµα επηρεάζονται από τη συγκέντρωση του προσδέµατος. Ο υποδοχέας στα αριστερά δεν είναι συνδεδεµένος και έτσι είναι µη-ενεργοποιηµένος, ενώ ο υποδοχέας στα δεξιά είναι συνδεδεµένος µε ένα πρόσδεµα, δεµένος µε µια πρωτεΐνη G και έτσι είναι ενεργοποιηµένος. Tο πρόσδεµα δεν διαπερνά την µεµβράνη. Το σήµα µεταδίδεται από τις στερεοδοµικές αλλαγές που πραγµατοποιούνται στον πρωτεϊνικό υποδοχέα. Πολλές φυσιολογικές αντιδράσεις στα θηλαστικά εξαρτώνται από τους υποδοχείς 7ΤΜ, οι οποίοι είναι και οι στόχοι πλήθους φαρµακευτικών σκευασµάτων. Περίπου χίλια ανθρώπινα γονίδια κωδικοποιούν υποδοχείς 7ΤΜ και περιλαµβάνονται στην αίσθηση / ανίχνευση πλήθους εξωτερικών διεγερτών. Σαν παραδείγµατα µπορούµε να αναφέρουµε αδρενεγικούς υποδοχείς, υποδοχείς ντοπαµίνης, υποδοχείς ισταµίνης, τον ελαφρύ υποδοχέα ροδοψίνης καθώς και αρκετούς υποδοχείς γεύσης και οσµής. Ερωτήσεις-Κλειδιά Οι GPCRs ρυθµίζουν τη ροή πληροφοριών στο εσωτερικό των κυττάρων για τις συνθήκες του εξωτερικού. Πώς επιτυγχάνεται αυτό σε µοριακό επίπεδο; Ποια είναι τα µόρια που κάνουν αυτή τη δουλειά και πώς αποστέλλουν τελικά το µήνυµα; Πώς γίνεται ο διαχωρισµός µεταξύ των διαφόρων ειδών σηµάτων; Πώς ρυθµίζονται τα σήµατα; Αυτά ήταν τα κρίσιµα ερωτήµατα για δεκαετίες. Οι ερευνητές για να βρουν τις απαντήσεις έπρεπε να ταυτοποιήσουν τα µοριακά συστατικά του µηχανισµού µεταγωγής σήµατος και να παρακολουθήσουν τη δραστηριότητά τους σε βιοχηµικές, βιοφυσικές και δοµικές έρευνες. Ανακάλυψη και ταυτοποίηση των GPCRs Τα περισσότερα από όσα γνωρίζουµε σήµερα σχετικά µε τα ενδιαφέροντα µοριακά χαρακτηριστικά των υποδοχέων 7ΤΜ ανακαλύφθηκαν τα τελευταία 40 χρόνια. Παρόλα αυτά, η ροδοψίνη ταυτοποιήθηκε ως φωτοευαίσθητη χρωστική στις αρχές της δεκαετίας του 1870, και το οµοιοπολικό πρόσδεµα της το Η ιστορία των υποδοχέων ενεργοποιηµένων µε προσδέµατα ξεκίνησε έναν αιώνα πριν, όταν αναφέρθηκε ότι τα αντιδραστικά κύτταρα έχουν ένα «συστατικό υποδοχής» στην επιφάνειά τους. Τα πρώτα πειράµατα µε δείγµατα ιστών έδειξαν τις αντιδράσεις σε ενεργοποιητές (αγωνιστές) και αναστολείς (ανταγωνιστές). Τον επόµενο µισό αιώνα (περίπου ) αναπτύχθηκε η κλασσική θεωρία των υποδοχέων που βασίζεται στο νόµο της αντίδρασης µάζας και στα δοσο-εξαρτώµενα δεδοµένα. Μερικά από τα συστατικά σηµατοδοσίας στο εσωτερικό των κυττάρων περιγράφηκαν σε µοριακή βάση προτού περιγραφούν οι υποδοχείς. Τέτοια είναι o δεύτερος αγγελιοφόρος camp (cyclic AMP) και το ένζυµο της αδενυλικής κυκλάσης (Nobel Prize in Physiology or Medicine 1971 to Earl W. Sutherland, Jr.), η πρωτεϊνική κινάση εξαρτωµενη από το camp και τις ετεροτριµερικές G-πρωτεΐνες (Nobel Prize in Physiology or Medicine 1994 to Martin Rodbell and Alfred G. Gillman).

16 16 Η φύση των υποδοχέων που ενεργοποιούνται µε προσδέµατα παρέµεινε αµφισβητήσιµη µέχρι και τη δεκαετία του Η ύπαρξη των υποδοχέων ως µεµονωµένων µοριακών οντοτήτων ήταν υπό συζήτηση και υπήρχε ακόµα και η άποψη ότι ο υποδοχέας και το ένζυµο της αδενυλικής κυκλάσης είναι η ίδια πρωτεΐνη. Η χηµική σύνθεση των αγωνιστών προσδεµάτων ραδιενεργά επισηµασµένων έπαιξε καθοριστικό ρόλο στην απόδειξη της ύπαρξης των υποδοχέων αλλά και στην ανίχνευσή τους και την οπτικοποίησή τους πάνω στην πλασµατική µεµβράνη. Ο πρώτος που είχε επιτυχή αποτελέσµατα σε αυτή τη προσέγγιση ήταν ο Lefkowitz, ο οποίος επισήµανε µε ραδιενεργό ιώδιο την αδρενοκορτικοτροπική ορµόνη και παρατήρησε τη σύνδεσή της σε αδρενική µεµβράνη κατά τη διάρκεια διεργασιών. Μετά επικεντρώθηκε στη µελέτη των υποδοχέων της επινεφρίνης (γνωστής ως και αδρεναλίνης). Η επινεφρίνη είναι µια σηµαντική ορµόνη και νευροδιαβιβαστής που επηρεάζει πολλές φυσικές διαδικασίες, π.χ. τη ρύθµιση του καρδιακού ρυθµού και της πίεσης του αίµατος. Για να ανταποκρίνονται τα κύτταρα στην επινεφρίνη έχουν ειδικούς υποδοχείς στην πλασµατική µεµβράνη (αδρενεργικούς υποδοχείς) που αλληλεπιδρούν µε αυτή την ορµόνη. Υπάρχουν τουλάχιστον εννιά διαφορετικοί αδρενεργικοί υποδοχείς που οµαδοποιούνται ως α- και β-υποδοχείς. ιαφορετικοί ιστοί και όργανα αντιδρούν µε διαφορετικούς τρόπους στην ανεβασµένη συγκέντρωση της επινεφρίνης. Ένας σηµαντικός στόχος που επιτεύχθη ήταν η ανακάλυψη ειδικών ραδιενεργών προσδεµάτων έναντι των β- υποδοχέων. Στον συγκεκριµένο χώρο έγινε εύρος µελετών, καθώς αναπτύχθηκε µεγάλος αριθµός ειδικών ραδιενεργών προσδεµάτων µε περιορισµένη ειδικότητα έναντι υποδοχέων. Τα ραδιενεργά προσδέµατα χρησιµοποιήθηκαν για να προσδιορίσουν ποσοτικά και να συγκρίνουν τη δράση διαφορετικών αδρενεργικών συστατικών πάνω στη δραστικότητα των β-αδρενεργικών υποδοχέων και της αδενυλικής κυκλάσης. Η µελέτη της θερµοδυναµικής σύζευξης όταν συνδεόταν το πρόσδεµα και η πρωτεΐνη G έδωσαν πολλές πληροφορίες για το µηχανισµό µεταγωγής σήµατος. ΣΧΗΜΑ 2: Αριστερά: Μοντέλο τριµερούς συµπλέγµατος. Ένας θερµοδυναµικός κύκλος περιγράφει το σχηµατισµό ενός συµπλέγµατος του προσδέµατος (κίτρινο χρώµα), υποδοχέα (µπλε χρώµα) και της πρωτεΐνης G (κόκκινο χρώµα). εξιά: κρυσταλλική δοµή ενός ενεργού τριµερούς συµπλόκου. [Ribbon model drawn from the coordinates from file 3sn6.pdb using the software Molmol]. Το µοντέλο του τριµερούς συµπλόκου Το 1980, ένας γενικός µηχανισµός για την ενεργοποίηση του υποδοχέα, το λεγόµενο µοντέλο του τριµερούς συµπλόκου, προτάθηκε από τον Lefkowitz και τους συνεργάτες του Andre De Lean και Jeffery Stadel. Το τριµερές σύµπλοκο του εξωκυτταρικού προσδέµατος (αγωνιστή), της GPCR διαµεµβρανικής πρωτεΐνης και της ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης G χρησιµεύουν σαν µια ενεργοποιηµένη µονάδα σήµατος. Ο αγωνιστής (ορµόνη, νευροδιαβιβαστής, µόριο οσµής, κλπ.) προσδένεται στο εξωκυτταρικό τµήµα του υποδοχέα, ενώ η πρωτεΐνη G δεσµεύεται στο ενδοκυττάριο τµήµα (Εικόνα 2).

17 17 Η σηµατοδότηση του υποδοχέα βασίζεται σε έναν αλλοστερικό µηχανισµό, και η αλλοστερική σύζευξη είναι αµοιβαία, όπως προκύπτει από τους νόµους της θερµοδυναµικής. Η πρόσδεση του αγωνιστή αυξάνει τη συγγένεια για τη πρωτεΐνη G στο εσωτερικό του κυττάρου, και η πρόσδεση της G-πρωτεΐνης αυξάνει την συγγένεια του υποδοχέα για δέσµευση των αγωνιστών αντίστοιχα. Μετά από τρεις δεκαετίες εξειδικευµένης έρευνας, καταλαβαίνουµε τον µηχανισµό για τη διαµεµβρανική σηµατοδότηση από GPCRs και τη ρύθµιση τους. Ως επιστέγασµα, ο Kobilka και οι συνεργάτες του αποκάλυψαν την τρισδιάστατη δοµή ενός πλήρως λειτουργικού τριµερούς συµπλόκου σε υψηλή ανάλυση: του β2-αδρενεργικού υποδοχέα (β2-adrenergic receptor, βar) σε σύζευξη µε αγωνιστή και πρωτεΐνη G. Αποµόνωση και καθαρισµός Η αποµόνωση και ο καθαρισµός λειτουργικών µορφών GPCR σε κυστίδια (µοντέλο σφαιρικών µεµβρανών) για πρώτη φορά επιτεύχθηκε για τη ροδοψίνη από τον Ruth Hubbard. Οι υποδοχείς ενεργοποιούνται από διαχεόµενα προσδέµατα που βρίσκονται γενικά σε πολύ χαµηλές ποσότητες, π.χ. σε ιστούς όπως το ήπαρ, οι πνεύµονες και η καρδιά, και η αποµόνωση τους αποτελεί πρόκληση. Οι πρώτες αναφορές για διαλυτοποιηµένους υποδοχείς ορµονών βαζοπρεσσίνης, θυρεοτροπίνης και των παραθυρεοειδικών αδένων ήρθαν το Η επιλογή του απορρυπαντικού αποδείχτηκε να είναι το κλειδί για την διαλυτοποίηση ενός λειτουργικού βαr από τους Marc Caron και Lefkowitz. Χρησιµοποίησαν το ίδιο απορρυπαντικό, όπως είχε χρησιµοποιηθεί νωρίτερα στην αποµόνωση λειτουργικής ροδοψίνης, µια ενδιαφέρουσα σύµπτωση αν λάβουµε υπόψη µας ότι τη συγκεκριµένη χρονική περίοδο η οµολογία στην αλληλουχία µεταξύ των δύο ήταν άγνωστη. Μέθοδοι χρωµατογραφίας συνάφειας αναπτύχθηκαν για τον καθαρισµό των υποδοχέων, χρησιµοποιώντας ειδικά συζευγµένα προσδέµατα µε χρωµατογραφία ρητίνης. Με µερικά επιπλέον βήµατα, οι β-αδρενεργικοί υποδοχείς καθαρίστηκαν µε ειδική ενεργότητα σχεδόν ίση της θεωρητικής. Μια οικογένεια δοµικά συγγενών υποδοχέων Ο Lefkowitz και οι συνεργάτες του συνέβαλαν δοµικά όταν κατάφεραν να κλωνοποιήσουν και να αλληλουχήσουν το πρώτο υποδοχέα επινεφρίνης, βαr. Με βάση αυτό το έργο, κατέστη σαφές ότι οι GPCRs αποτελούν µία οικογένεια πρωτεϊνών µε στενή δοµική σχέση. Αν και τα σήµατα που συλλέγονται από GPCRs διαφέρουν ευρέως - κυµαίνονται από φωτόνια και µόρια οσµής ως νευροδιαβιβαστές, ορµόνες και πεπτίδια - η µετάδοση του σήµατος εντός του κυττάρου επιτυγχάνεται µε έναν τρόπο εξαιρετικά όµοιο µε το κοινό δοµικό πλαίσιο των επτά διαµεµβρανικών ελίκων. Πάνω από µια δεκαετία πέρασαν ο Lefkowitz και οι συνεργάτες του αφοσιωµένοι στο να βρουν τα κατάλληλα προσδέµατα, ώστε να χρησιµοποιηθούν σε χρωµατογραφία συγγένειας. Έµαθαν πώς να καθαρίζουν και πως να χειρίζονται τους βαr. Αποµόνωσαν επαρκείς ποσότητες αυτής της χαµηλής σε συγκέντρωση µεµβρανικής πρωτεΐνης από πνεύµονα χάµστερ, για ανάλυση της αλληλουχίας των Ν-τελικών αµινοξέων των επιµέρους πεπτιδίων. Με βάση αυτή την πληροφορία, κατασκεύασαν εκφυλισµένα ολιγονουκλεοτίδια και τα χρησιµοποίησαν για την κλωνοποίηση του βαr γονιδίου. Ο Kobilka, που τότε ήταν νεαρός µεταδιδακτορικός του Lefkowitz, έπαιξε καθοριστικό ρόλο, και αναγνωρίζεται από τον Lefkowitz για την επιτυχία και την κατασκευή µιας γονιδιωµατικής βιβλιοθήκης DNA ανώτερη από τη cdna βιβλιοθήκη που ήταν προηγουµένως διαθέσιµη για το έργο της κλωνοποίησης. Ευτυχώς, το γονίδιο δεν έχει εσώνια και ολόκληρη η ακολουθία θα µπορούσε να αποκωδικοποιηθεί. Αυτό ήταν ένα σηµαντικό επίτευγµα από όπου προέκυψε µια εντυπωσιακή έκπληξη: η παρουσία των επτά διαµεµβρανικών ελικών, σε συνδυασµό µε την οµόλογη αλληλουχία µε αυτή της ροδοψίνης µέσα σε αρκετά από τα διαµεµβρανικά τµήµατα. Οι ερευνητές έχουν καταλήξει στο συµπέρασµα ότι όλοι οι υποδοχείς συνδεδεµένοι µε πρωτεΐνες G µοιράζονται αυτή την δοµική διάταξη. Αυτό επιβεβαιώθηκε και από τον Shosaku Numa, ο οποίος παρουσίασε την αλληλουχία ενός τρίτου GPCR: του µουσκαρινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης. Ο Lefkowitz και οι συνεργάτες του, κλωνοποίησαν µια σειρά συναφών αδρενεργικών υποδοχέων. Ο βαr και η ροδοψίνη έγιναν τα ιδρυτικά µέλη µιας τεράστιας οικογένειας υποδοχέων και η βάση για όλες τις µελλοντικές εργασίες στον τοµέα αυτό. ΣΧΗΜΑ 3. Η πρόβλεψη των επτά ελίκων σε βar δείχνεται παραπάνω στη ροδοψίνη. Οι οµόλογες αλληλουχίες αµινοξέων στις έλικες πέντε, έξι και επτά είναι ευθυγραµµισµένες, και οι ίδιες και οι όµοιες περιοχές είναι χρωµατισµένες.

18 18 Μηχανισµός σηµατοδότησης Μια σηµαντική πτυχή του µηχανισµού σηµατοδότησης είναι ότι το πρόσδεµα δεν διέρχεται διαµέσου της µεµβράνης. Αντ αυτού, το σήµα µεταφέρεται στο εσωτερικό του κυττάρου µε διαµορφωτικές αλλαγές στον πρωτεϊνικό υποδοχέα, οι οποίες οφείλονται στο γεγονός της σύνδεσης µε το πρόσδεµα. Μία αύξηση στην συγκέντρωση του αγωνιστή στο εξωτερικό του κυττάρου αυξάνει τους υποδοχείς που είναι δεσµευµένοι σε ένα πρόσδεµα. Ο πρωτεϊνικός υποδοχέας στη µεµβράνη είναι δυναµικός και µπορεί να λάβει διαφορετικές διαµορφώσεις. Οι δύο κυρίαρχες διαµορφώσεις ονοµάζονται: ενεργή και ανενεργή. Ο κάθε υποδοχέας έχει υψηλή συγγένεια για λίγους αριθµητικά παρόµοιους αγωνιστές που δεσµεύονται σε µία συγκεκριµένη θέση στο εξωκυττάριο τµήµα του. Η δέσµευση του αγωνιστή ευνοεί την ενεργή διαµόρφωση του υποδοχέα, και αυξάνει την συγγένεια για την πρωτεΐνη G στο εσωτερικό του κυττάρου. Ο καταρράκτης των αντιδράσεων στο εσωτερικό του κυττάρου αρχίζει µε την ανταλλαγή νουκλεοτιδίων και τη διάσπαση της πρωτεΐνης G σε υποµονάδες (Gα, Gβ και Gγ). Η Gα συνδέεται και διεγείρει ένζυµα όπως την αδενυλική κυκλάση. Έπειτα παράγεται το κυκλικό νουκλεοτιδίο camp, που διαχέεται εύκολα και λειτουργεί ως «δεύτερος αγγελιοφόρος». Άλλες πρωτεΐνες µπορεί να αλληλεπιδράσουν µε τις Gβ και Gγ να διαµορφώσουν περαιτέρω το σήµα. Η ενεργοποιηµένη διαµόρφωση των GPCR διαρκεί αρκετά ώστε να επιτραπεί σε ένα δεσµευµένο µόριο αγωνιστή, ή ένα προσροφηµένο φωτόνιο, να ενεργοποιήσει αρκετές G-πρωτεΐνες, ενισχύοντας έτσι το σήµα. Οι αντιδρώσες πρωτεΐνες G επανέρχονται στην αρχική διαµόρφωση µετά την υδρόλυση του νουκλεοτίδιου και µπορούν να επανεισαχθούν στην κύκλο. Οι πρώτες γνώσεις σχετικά µε τις δοµικές αλλαγές κατά τη διάρκεια της σηµατοδότησης προήλθαν από βιοχηµικές και βιοφυσικές µελέτες. Οι Wayne Hubbell και Gobind Khorana διαπίστωσαν ότι οι κινήσεις της έλικας 6 είναι σηµαντικές στο µηχανισµό ενεργοποίησης, χρησιµοποιώντας φασµατοσκοπία παραµαγνητικού συντονισµού ηλεκτρονίων (EPR) και µεταλλαγµένα spin-επισηµασµένα µόρια κυστεΐνης. Περαιτέρω λεπτοµέρειες των διαρθρωτικών µεταβάσεων προέκυψαν από µελέτες που χρησιµοποίησαν φθορισµό, φασµατοσκοπία IR, NMR και φασµατοµετρία µάζας. Τα αποτελέσµατα αυτών των µελετών παρέχουν περαιτέρω λεπτοµέρειες στις δοµικές µεταβάσεις των άκρων, στον ελεύθερο υποδοχέα έναντι του τριαδικού συµπλόκου. Υπάρχουν διακριτές δοµικές µεταβολές γύρω από τον δεσµευµένο αγωνιστή και εκτεταµένος επαναπροσανατολισµός των διαµεµβρανικών ελίκων. Όπως και σε άλλες πρωτεΐνες που µεταδίδουν πληροφορίες εξ αποστάσεως, ένα ελικοειδές πλαίσιο ενισχύει µια µικρή διαµορφωτική αλλαγή που συµβαίνει στο ένα άκρο της πρωτεΐνης σε µια πολύ µεγαλύτερη διαµορφωτική αλλαγή στο άλλο άκρο. Οι έλικες είναι ραβδοειδές δοµές, και θα µπορούσε κανείς να φανταστεί ένα 7ΤΜ υποδοχέα σαν µια οµάδα ράβδων βυθισµένη στη µεµβράνη. Εάν ένα πρόσδεµα δεθεί στο ένα άκρο, η οµάδα ανοίγει σαν ένα µπουκέτο τριαντάφυλλα στο άλλο άκρο. Μικρές µεταβολές στο δίκτυο των αλληλεπιδράσεων της πλευρικής αλυσίδας γύρω από τη θέση δέσµευσης του αγωνιστή µεταδίδονται σε µεγαλύτερες δοµικές αλλαγές στην ενδοκυττάρια πλευρά. Αυτό ανοίγει µια θέση σύνδεσης για την πρωτεΐνη G και αποτελεί ένα σήµα που µεταδίδεται από το εξωτερικό προς το εσωτερικό του κυττάρου. ΣΧΗΜΑ 4 Η δοµική βάση του µηχανισµού σηµατοδότησης των GPCR. Μη ενεργοποιηµένος βar (2bar.pdb) φαίνεται αριστερά, και ενεργοποιηµένος βar συνδεδεµένος µε πρόσδεµα και πρωτεΐνη G (3sn6.pdb) δεξιά. Στην κορυφή, ο υποδοχέας στην µεµβράνη απεικονίζεται µε µπλε κορδέλα που ιχνηλατεί τον σκελετό. Η κάτω εικόνα είναι από το εσωτερικό της κυτταρικής µεµβράνης, µε τον υποδοχέα να φαίνεται µε τρισδιάστατο µοντέλο µε τις υδρόφοβες πλευρικές αλυσίδες να απεικονίζονται µε σκούρο µπλε

19 19 Μια υψηλής ανάλυσης δοµή ενός ενεργού τριµερούς συµπλόκου, βρέθηκε πρόσφατα από τον Kobilka και τους συνεργάτες του. Αυτή η δοµή του βar σε σύζευξη µε ετεροτριµερή G-πρωτεΐνη και αγωνιστή, µας παρέχει µια πιο λεπτοµερή µατιά στη δοµική µετάβαση που διέπει το µηχανισµό ενεργοποίησης µέσω της σύγκρισης µε το µη ενεργοποιηµένο υποδοχέα. Οι µικρές διαρθρωτικές αλλαγές γύρω από το πρόσδεµα διαδίδονται στο εσωτερικό µε πολύ εντονότερη διαρθρωτική µετάβαση από ό,τι αναµενόταν. Υπάρχει µια µεγάλη µετατόπιση της έλικας 6 και ένα άνοιγµα µιας βαθιάς υδρόφοβης σχισµής στην ενδοκυττάρια πλευρά του υποδοχέα (Σχήµα 4). Η C-τελική έλικα του Gα εισχωρεί σε αυτή τη σχισµή και αυτό οδηγεί σε µεγάλες δοµικές αλλαγές στην πρωτεΐνη G, η οποία µε τον τρόπο αυτό ενεργοποιείται. Οι δοµικές αλλαγές προκύπτουν από την αναδιάταξη του δικτύου των αλληλεπιδράσεων στον υποδοχέα. Οι εκλεπτυσµένες εξελίξεις στη µοριακή βιολογία των τελευταίων ετών µας έδωσε την ικανότητα να κατασκευαστεί ένα σχετικά σταθερό τριαδικό σύµπλοκο. Η εγγενής αστάθεια του συµπλόκου του υποδοχέα και της πρωτεΐνης G παρουσίασε µια σηµαντική πρόκληση. Το σύµπλοκο είναι βραχύβιο, επιτρέποντας πολλές αλλαγές στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης G για κάθε σύνδεση µε πρόσδεµα. Ένα µακρόβιο τριαδικό σύµπλοκο κατάλληλο για κρυστάλλωση προέκυψε από τον συνδυασµό πέντε βιοχηµικών στρατηγικών: επεξεργασία µε απυράση του συµπλόκου µε GDP-δεσµευµένη µε πρωτεϊνη G, σταθεροποίηση του συµπλόκου χρησιµοποιώντας ένα πρόσφατα αναπτυγµένο απορρυπαντικό, επιλογή ενός αντισώµατος καµελίδης - ενός νανοσωµατίδιου που σταθεροποιεί τη Gβ-υποµονάδα σε µια καλά καθορισµένη χωροδιάταξη -, οµοιοπολική σύζευξη αγωνιστή, και την κλωνοποίηση της Τ4-λυσοζύµης εντός του βρόχου µεταξύ της έλικας 5 και 6 ώστε να µειωθεί η κινητικότητα του. Μελέτες ανταλλαγής ισοτόπων του µη τροποποιηµένου συµπλόκου σε συνδυασµό µε φασµατοµετρία µάζας, δείχνουν ότι η δοµή του υποδοχέα στο τριαδικό σύµπλοκο είναι ουσιαστικά η ίδια όπως σε ένα µη τροποποιηµένο σύµπλοκο. Νεότερες δοµές Η πρώτη φορά που απεικονίστηκε ένας υποδοχέας 7ΤΜ ήταν η δοµή της ροδοψίνης που βρέθηκε από τους Gebhard Schertler και Richard Henderson χρησιµοποιώντας µικροσκόπιο κρυο-ηλεκτρονίων, που δείχνει τις επτά α-έλικες στην µεµβράνη. Για να επιτευχθεί υψηλότερη ανάλυση αλλά και τρισδιάστατες δοµές, ο Tetsuji Okada και οι συνεργάτες του ανέπτυξαν µια στρατηγική καθαρισµού που οδήγησε σε καλώς περιθλασµένους κρυστάλλους. Οι Krzysztof Palczewski και Okada έλυσαν την τρισδιάστατη δοµή της µη ενεργοποιηµένης ροδοψίνης, παρέχοντας µια πιο λεπτοµερή άποψη των ελίκων στη µεµβράνη και τους βρόχους. Η πραγµατοποίηση κρυσταλλογραφικών µελετών ενεργοποιηµένων από πρόσδεµα GPCRs απουσία αγωνιστή αποτελούσε µια πρόκληση λόγω της σηµαντικής κινητικότητας των υποδοχέων. Ο Kobilka απάντησε σε αυτή την πρόκληση µαζί µε τον Gebhard Schertler και τον Raymond Stevens χρησιµοποιώντας αντισώµατα, κλωνοποίηση και προσθήκη χοληστερόλης. Σε αυτή τη δοµή, οι έλικες του υποδοχέα είναι περισσότερο παράλληλες σε σχέση µε το τριαδικό σύµπλοκο, και το ενδοκυττάριο µέρος του υποδοχέα δεν παρουσιάζει καµία µεγάλη υδρόφοβη επιφάνεια (Σχήµα 4). Η µη-ενεργοποιηµένη δοµή βar διαφέρει από αυτή της ροδοψίνης στην περιοχή σύνδεσης µε το πρόσδεµα και σε άλλες περιοχές που παρουσιάζουν ασθενέστερες αλληλεπιδράσεις µεταξύ των κυτταροπλασµατικών άκρων των ελίκων 3 και 6. Ο Klaus Peter Hofmann παρουσίασε κρυσταλλικές δοµές της οψίνης και της οψίνης δεσµευµένης µε θραύσµα πεπτιδίου από την πρωτεΐνη G τρανσδουσίνης. Αυτές οι δοµές της ροδοψίνης χωρίς προσδέµατα παρουσιάζουν ένα µερικώς ενεργοποιηµένο υποδοχέα, µε µετατοπισµένη κλίση και περιστροφή της έλικας 6 και µε σύνδεση του πεπτιδίου G σε µια σχισµή στην ενδοκυττάρια πλευρά. Ο Kobilka βρήκε την κρυσταλλική δοµή του βar αγωνιστή συζευγµένου µε ένα νανοσωµατίδιο ως υποκατάστατο για τη G-πρωτεΐνη. Οι διαρθρωτικές µεταβολές σε σχέση µε τον ανενεργό βar είναι εντυπωσιακά όµοιες µε τις διαρθρωτικές αλλαγές της οψίνης σε σχέση µε τη ροδοψίνη. Τα ευρήµατα αυτά εξάλειψαν τον τεχνητό διαχωρισµό ανάµεσα στους υποδοχείς που έχουν ενεργοποιηθεί από πρόσδεµα και αυτούς που έχουν ενεργοποιηθεί από φως, και ολοκληρώθηκε η δίοδος είχε ανοίξει το 1986 για ένα κοινό διαρθρωτικό πλαίσιο στους GPCRs. Αυτές οι λεπτοµέρειες που προέρχονται από ροδοψίνη έχουν εµβαθύνει την κατανόηση στους ενεργοποιούµενους από προσδέµατα υποδοχείς, και αντιστρόφως.

20 20 Οι αναστολείς έχουν µεγάλη φαρµακολογική αξία, και ο Sir James W. Black µοιράστηκε το Βραβείο Νόµπελ Φυσιολογίας & Ιατρικής 1988 για την ανακάλυψη της προπρανολόλης και της σιµετιδίνης, οι οποίες αναστέλλουν τον βar και τον υποδοχέα της ισταµίνης Η2, αντίστοιχα. Η προπανολόλη και τα παράγωγά της είναι β-αποκλειστές (β-blockers), που χρησιµοποιούνται στη θεραπεία καταστάσεων που περιλαµβάνουν καρδιακά προβλήµατα και αυξηµένη αρτηριακή πίεση. Άλλες φαρµακευτικές ενώσεις είναι αγωνιστές, που ενεργοποιούν, για παράδειγµα, τους υποδοχείς της ντοπαµίνης και της σεροτονίνης και ανακουφίζουν από τη νόσο του Parkinson, την ηµικρανία και νευροψυχιατρικές καταστάσεις, ή είναι ανάστροφοι αγωνιστές, οι οποίοι εµποδίζουν τη βασική δραστηριότητα, για παράδειγµα, του υποδοχέα GABA που εµπλέκεται στη µνήµη και τη µάθηση. Η δοµή του τριαδικού συµπλόκου και µια σειρά από άλλες δοµές παρέχουν µια βάση για την φαρµακολογική ανάπτυξη φαρµάκων µε υψηλή επιλεκτικότητα, αποτελεσµατικότητα και λίγες παρενέργειες. Οι βιοχηµικές στρατηγικές που αναπτύχθηκαν από τον Kobilka για τους βar καθιστούν δυνατή την παραγωγή κρυστάλλων καθώς και άλλων υποδοχέων 7ΤΜ. Αυτές οι τεχνικές έχουν ήδη υιοθετηθεί από άλλες οµάδες µε σκοπό την παραγωγή κρυστάλλων και να δώσουν υψηλής ανάλυσης δοµές για πλήθος σηµαντικών, από φαρµακευτική άποψη, υποδοχέων. Αριστερά: Ο Robert J. Lefkowitz (Born: 1943, ew York, Y, USA, Affiliation at the time of the award: Howard Hughes Medical Institute, Duke University Medical Center, Durham, C, USA) εξιά: Ο Brian K. Kobilka (Born: 1955, Little Falls, M, USA, Affiliation at the time of the award: Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA) Το µοριακό σύστηµα και σηµατοδότηση ανεξάρτητη από G-πρωτεΐνες Η GPCR σηµατοδότηση είναι ένα κοµψό µοριακό σύστηµα µε συστατικά που χρησιµοποιούνται ξανά και ξανά για πολλά είδη των σηµάτων. Ο ίδιος υποδοχέας µπορεί επίσης να σηµατοδοτεί διαµέσου διαφορετικών ενδοκυττάριων οδών ανάλογα µε την ταυτότητα του δεσµευµένου προσδέµατος. Αυτό οφείλεται στην σχετική ευελιξία του υποδοχέα στην µεµβράνη, η οποία επιτρέπει διαφορετικούς αγωνιστές ή αντίστροφους αγωνιστές να σταθεροποιούν διαφορετικές ενεργές ή ανενεργές µορφές. Ο Lefkowitz και οι συνεργάτες βρήκαν οδούς ανεξάρτητες από G-πρωτεΐνες, στις οποίες οι υποδοχείς 7ΤΜ σηµατοδοτούν στο εσωτερικό του κυττάρου µέσω άλλων πρωτεϊνών, συµπεριλαµβανοµένων των αρρεστινών. Εποµένως, ο όρος «7TM» και όχι ο όρος «GPCR» είναι ο προτιµώµενος για αυτήν την οικογένεια υποδοχέων. Το µονοπάτι σηµατοδότησης επιλέγεται µε βάση την ταυτότητα του προσδέµατος, και ο ίδιος 7ΤΜ υποδοχέας µπορεί να εµπλέκεται τόσο στην σηµατοδότηση εξαρτωµένης από G-πρωτεΐνη, όσο και στην ανεξάρτητη από πρωτεΐνη G. Στην τρέχουσα ορολογία, αυτό αναφέρεται ως «µεροληπτικά προσδέµατα». Η µικρή δοµική µεταβολή στην εξωκυττάρια πλευρά του υποδοχέα είναι σηµαντική για την ικανότητα των µεροληπτικών προσδεµάτων, ώστε να επιλεχθεί ένα µονοπάτι ενεργοποίησης. Η απόκτηση περισσότερων πληροφοριών σε αυτό το φαινόµενο και τη δοµική βάση της, θα βελτιώσει την φαρµακολογική εξειδίκευση και την εκλεκτικότητα µονοπατιού των φαρµάκων που στοχεύουν τους υποδοχείς 7ΤΜ.