Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΙΣΤΟΣΥΜΒΑΤΟΤΗΤΑΣ ΣΤΗ ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΑΡΧΕΓΟΝΩΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ. Αλεξάνδρα Σιόρεντα

Transcript

1 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΙΣΤΟΣΥΜΒΑΤΟΤΗΤΑΣ ΣΤΗ ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗ ΑΡΧΕΓΟΝΩΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Αλεξάνδρα Σιόρεντα Διευθύντρια ΕΣΥ Ανοσολογικό Τμήμα-Εθνικό Κέντρο Ιστοσυμβατότητας, Π. Γ.Ν.Α. «Γ. Γεννηματάς»

2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κάθε χρόνο χιλιάδες συνάνθρωποι μας, μεταξύ των οποίων πολλά παιδιά, καλούνται να αντιμετωπίσουν κάποια ασθένεια του αίματος, όπως η λευχαιμία και το λέμφωμα. Η αλλογενής μεταμόσχευση μυελού των οστών από συγγενή ή εθελοντή δότη είναι πλέον μια καθιερωμένη θεραπευτική μέθοδος και για ορισμένα νοσήματα του αίματος αποτελεί την μόνη θεραπεία ίασης. Για να είναι δυνατή η μεταμόσχευση πρέπει να χορηγηθούν στον ασθενή «αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα» (ΑΑΚ) από υγιή, ιστοσυμβατό ως προς τα HLA αντιγόνα, δότη τα οποία θα αντικαταστήσουν το αίμα του ασθενούς που πάσχει.

3 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η έκβαση της μεταμόσχευσης αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων εξαρτάται απόλυτα από την HLA συμβατότητα μεταξύ του λήπτη και του μοσχεύματος. Ορόσημο στην ανοσολογία των μεταμοσχεύσεων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων αποτελεί η ανακάλυψη και μελέτη του εξαιρετικά πολυμορφικού Μείζονος Συμπλέγματος Ιστοσυμβατότητας (MHC) --HLA (Human Leukocyte Antigens) για τον άνθρωπο

4 ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ P. Gorer G. Snell 1937 H-2 σύστημα ιστοσυμβατότητας ποντικού E.D.Thomas 1955 ΜΜΟ σε πειραματόζωα και ανθρώπους J. Dausset 1958 MAC paper παρουσία αντιγόνων ιστοσυμβατότητας στα ανθρώπινα λευκοκύτταρα JJ Van Rood 1958 : δημοσίευσε το άρθρο identification of histocompatibility antigens using sera of multiparous women

5

6 Τάξης Ι και II HLA-αντιγόνα Τα κλασσικά HLA τάξης Ι (A/B/C) και τάξης ΙΙ (DR/DQ/DP) εκφράζονται στα εμπύρηνα κύτταρα του σώματος μας. Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες των αντιγόνων αναδιπλώνονται και σχηματίζουν σχισμοειδή θήκη για την παρουσίαση «ίδιων» και «ξένων» πεπτιδίων (βιολογικός ρόλος HLA) Rev in Immunogenetis Vol

7 Πολυμορφισμός των HLA-μορίων Οι θέσεις των πολυμορφικών περιοχών λειτουργικοί επίτοποι- των HLA-DR και HLA-DQ μορίων εμφανίζονται με κίτρινο χρώμα. Αριστερά το μοντέλο ενός HLA-DR μορίου : α αλυσίδα πολυμορφική (μώβ), β αλυσίδα (DRB1) πολυμορφική (μπλέ), πεπτίδιο στη σχισμοειδή θήκη (πράσινο) Δεξιά το μοντέλο ενός HLA-DQ μορίου: α αλυσίδα (DQA1) πολυμορφική (μώβ), β αλυσίδα (DQB1) πολυμορφική (μπλέ), πεπτίδιο στη σχισμοειδή θήκη (καφέ) HLAMatchmaker,R Dequesnoy

8 Σχισμοειδής θήκη Οι διαφορές αμινοξέων της πολυπεπτιδικής αλυσίδας εντοπίζονται κατά κανόνα στη σχισμοειδή θήκη των μορίων και συμβάλουν στον πολυμορφισμό του συστήματος με αποτέλεσμα : επιτρέπουν στα HLA να παρουσιάζουν στο ανοσολογικό μας σύστημα πολλά ξένα πεπτίδια (βιολογικός ρόλος HLA) είναι σημαντικός φραγμός στην ανεύρεση HLA συμβατού δότη για μεταμόσχευση

9 Αριθμός κλασσικών HLA αλληλίων (2017) Σύνολο αλληλίων

10 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗΣ

11 ΒΗΜΑΤΑ-I Απομόνωση του DNA από τα εμπύρηνα κύτταρα του ολικού αίματος

12 ΒΗΜΑΤΑ-II PCR (Polymerase Chain Reaction ) Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Τεχνική εκλεκτικού πολλαπλασιασμού συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA

13 ΒΗΜΑΤΑ-ΙΙΙ A.Aνίχνευση προϊόντος πολλαπλασιασμού του DNA B. Aνάλυση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων 1. SSOP 2. SSP 3.SBT 4.NGS Sequence Specific Oligonucleotide Probes Sequence Specific Primers Sequence Based Typing Next Generation Sequencing

14

15

16 PCR-SSOP Πλεονεκτήματα της μεθόδου δυνατότητα τυποποίησης μεγάλου αριθμού δειγμάτων ευελιξία προσφέρει δυνατότητα προσθήκης νέων ανιχνευτών για την τυποποίηση κάθε νέου αλληλομόρφου η ύπαρξη θετικού και αρνητικού μάρτυρα για κάθε δείγμα

17

18

19 PCR-SSP Πλεονεκτήματα της μεθόδου ταχύτητα εύκολη εφαρμογή υψηλή διακριτική ικανότητα

20

21

22

23 NGS Η μεγάλη ζήτηση για χαμηλού κόστους προσδιορισμό αλληλουχίας, οδήγησε στην ανάπτυξη τεχνολογιών αλληλούχησης υψηλής απόδοσης που ονομάστηκαν αλληλούχηση επόμενης γενιάς (next-generation sequencing), οι οποίες παράγουν χιλιάδες ή εκατομμύρια αλληλουχιών ταυτόχρονα. Οι πλατφόρμες που αναπτύχθηκαν είναι πολλές, και οι στρατηγικές που χρησιμοποιούνται διαφέρουν ως προς το μήκος και την ποιότητα των αλληλουχιών που διαβάζουν, αλλά και από την τεχνολογία που χρησιμοποιούν για να αναγνωρίσουν τις βάσεις των μορίων DNA. Όλες οι πλατφόρμες παράγουν μεγάλο όγκο πληροφοριών και χρειάζεται ιδιαίτερα πολύπλοκη ανάλυση ώστε να καθοριστούν οι τελικές αλληλουχίες.

24 NGS Μερικές τεχνολογίες NGS ILLUMINA Sequencing by-synthesis

25 Στρατηγική τυποποίησης Ενίσχυση του γονιδίου Προετοιμασία της Βιβλιοθήκης Αλληλούχηση σε Miseq HLA-A HLA-C HLA-DRB1 HLA-B HLA-DQB1 Ποσοτικοποίηση προϊόντων ενίσχυσης Ενζυματικός κατακερματισμός Πρόσδεση ειδικών δεικτών ταυτοποίησης Επιλογή μεγέθους βιβλιοθήκης Ανάλυση

26 NGS Το ζητούμενο της ανάλυσης: Να συνθέσουμε από τις χιλιάδες μικρού μήκους αλληλουχίες που παράγει η μέθοδος, όλο το μήκος της στοχευμένης περιοχής Συγκρίνοντας με τις υπάρχουσες δημοσιευμένες αλληλουχίες να ταυτοποιήσουμε τα δύο αλλήλια HLA Χωρίς κενά Χωρίς λάθη Με καλή συνολική ποιότητα δεδομένων Υψηλής ανάλυσης τυποποίηση χωρίς ασάφειες Τυποποίηση σε ανάλυση αλληλίου αν διαβάζουμε ολόκληρο το γονίδιο

27 Omixon read

28 NGS Υπάρχουν ήδη εργαστήρια που εφαρμόζουν το NGS για την τυποποίηση κλινικών δειγμάτων Οι οργανισμοί που ρυθμίζουν τη λειτουργία των εργαστηρίων τυποποίησης (EFI, ASHI), ετοίμασαν τα standards για το NGS. Κερδίζει έδαφος- όλες οι εταιρίες που έχουν παρουσία στο SBT, αναπτύσσουν εργαλεία για να περάσουν στο NGS. Κυριότερη δυσκολία: Ανάλυση του μεγάλου όγκου δεδομένων που δίνουν αυτές οι μέθοδοι

29

30 Η 3 η Γενιά Αλληλούχησης είναι εδώ!

31

32 Ονοματολογία αλληλόμορφων HLA γονιδίων N: no expressed L : low expressed S: secreted Q: questionable

33 Ονοματολογία αλληλόμορφων HLA γονιδίων HLA-B*18:XX HLA-B*18:01/18:53/18:73 HLA-B*18:01 HLA-B*18:TXYF (18:01/18:17/18:17N/18:53/18:81) HLA-A*02:01:01G (02:02:01/02:09/02:43/02:66/02:75/02:83/02:89 /02:97/02:132/02:134/02:140/02:241/02:252 Μοριακή χαμηλής ανάλυσης (LR Low Resolution) Μοριακή ενδιάμεσης ανάλυσης (IR Intermediate Resolution) Μοριακή υψηλής ανάλυσης (HR High Resolution) NMDP κωδικός G- and P- Groups

34 ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΗ ΜΕΤΑΒΙΒΑΣΗ HLA ΓΟΝΙΔΙΩΝ Τα HLA κληρονομούνται με τη μορφή απλοτύπων. Κάθε άτομο φέρει δύο απλότυπους ένα από τον πατέρα του και ένα από τη μητέρα του.

35 Κέντρα Δότη (Donor Centers) Δυστυχώς μόνο το 30% των ασθενών διαθέτει συγγενή ιστοσυμβατό δότη. Για τους υπόλοιπους να πρέπει να αναζητηθεί μη-συγγενής (εθελοντής) δότης (volunteer unrelated donor, VUD) ανάμεσα σε εθελοντές που έχουν εκφράσει την επιθυμία να δωρίσουν ΑΑΚ είτε κατάλληλη μονάδα ομφαλοπλακουντιακού αίματος (ΟπΑ) που προορίζεται για αλλογενή μη συγγενική μεταμόσχευση. Λόγω των πολυμορφισμών του HLA συστήματος η πιθανότητα ανεύρεσης συμβατού μη συγγενή εθελοντή δότη εξαρτάται από το μέγεθος του μητρώου και την φυλή στην οποία ανήκει ο ασθενής. Η διαφορετική συχνότητα HLA απλοτύπων ανάμεσα στις φυλές επιβεβαιώνει την ανάγκη δημιουργίας εθνικών δεξαμενών εθελοντών δοτών αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Η προσέλκυση δοτών, η ανεύρεση ιστοσυμβατών δοτών και η προμήθεια μοσχευμάτων γίνεται μέσα από οργανωμένες δομές που ονομάζονται Κέντρα Δότη (Donor Centers).

36 Κέντρα Δότη (Donor Centers) Η μητέρα του Anthony Nolan, Shirley, δημιούργησε το 1974 την πρώτη οργανωμένο φορέα ενημέρωσης και προσέλκυσης εθλεοντών δοτών μυελού των οστών (Anthony Nolan Bone Marrow Register) στο Westminster Children s Hospital της Αγγλίας. Τα επόμενα χρόνια άρχισαν να δημιουργούνται σε διάφορες χώρες δεξαμενές εθελοντών δοτών μυελού των οστών (registries). Το 1986 δημιουργείται η Παγκόσμια Δεξαμενή Δοτών (Bone Marrow Donors Worldwide, BMDW) στο Leiden της Ολλανδίας. Στην βάση του BMDW είναι καταγεγραμμένοι περισσότεροι από 30 εκατομμύρια δότες από 75 δεξαμενές Δοτών και 350 Κέντρα Δοτών από 52 χώρες. Το 1988 δημιουργείται η Παγκόσμια Οργάνωση Αρχείων Δοτών (World Marrow Donor Association, WMDA). Από τον Ιανουάριο του 2017, το BMDW (και το NetCord που ασχολείται με τα ομφαλικά μοσχεύματα) ενσωματώθηκαν στο WMDA. Επίσης λειτουργεί το πρωτόκολλο ηλεκτρονικής επικοινωνίας European Marrow Donor Information System (EMIDS). Η ηλεκτρονική επικοινωνία μέσω του EDMIS μεταξύ των κέντρων δοτών γίνεται με σύναψη διμερών συμφωνιών, εφόσον και τα δύο κέντρα εκπληρώνουν κάποιες προϋποθέσεις λειτουργίας.

37 ΔΕΞΑΜΕΝΕΣ ΕΘΕΛΟΝΤΩΝ ΔΩΡΗΤΩΝ ΜΥΕΛΟΥ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ Α. Στην Ελλάδα σήμερα λειτουργούν 7 Κέντρα Εθελοντών Δωρητών : ΠΓΝΑ «Γ.Γεννηματάς»,Εθνικό Κέντρο Ιστοσυμβατότητας ΓΝΑ «Ελενας Βενιζέλου», Εργαστήριο Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας ΓΝΑ «ο Ευαγγελισμός», Εργαστήριο Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας Νοσοκομείο Παίδων «Αγία Σοφία», Εργαστήριο Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας Νοσοκομείο Ιπποκράτειο Θεσσαλονίκης,Εθνικό Περιφερειακό Κέντρο Ιστοσυμβατότητας Κέντρο Εθελοντών Δωρητών Μυελού των Οστών,στο Πανεπιστήμιο Πατρών (ΚΕΔΜΟΠ) Κέντρο Εθελοντών Δωρητών Μυελού των Οστών του Συλλόγου ΟΡΑΜΑ ΕΛΠΙΔΑΣ Το σύνολο των Ελλήνων Δωρητών αποτελεί το Εθνικό Μητρώο που λειτουργεί στον Εθνικό Οργανισμό Μεταμοσχεύσεων (ΕΟΜ) Β. Όλοι οι δότες της χώρας εμφανίζονται στην παγκόσμια δεξαμενή εθελοντών δωρητών μυελού των οστών BMDW (Bone Marrow Donor Worldwide )

38 Κέντρα Δότη (Donor Centers) Το Κέντρο Δότη προχωρά σε: Καταγραφή της αίτησης και του δείγματος. Εργαστηριακή ανάλυση δείγματος (HLA τυποποίηση) σε συνεργαζόμενα πιστοποιημένα εργαστήρια(efi,ashi). Τυποποίηση τουλάχιστον 3 HLA γονιδιακών τόπων (HLA-A, -B, -DRB1). Για διευκόλυνση της διαδικασίας αναζήτησης συμβατού δότη χρειάζεται τυποποίηση υψηλής ανάλυσης Ένταξη στην Ελληνική (ΕΟΜ) και Παγκόσμια Δεξαμενή Εθελοντών Δοτών Μυελού των Οστών (BMDW). Η ένταξη γίνεται ανώνυμα και τα προσωπικά στοιχεία μένουν εμπιστευτικά. Ο αριθμός των τυποποιημένων εθελοντών δωρητών οι οποίοι εμφανίζονται στο Εθνικό μητρώο και τo WMDA είναι (Στατιστικά στοιχεία ΕΟΜ 2018)

39 Οι 20 συχνότεροι HLA-A,-B,-DR φαινότυποι στο Ελληνικό Μητρώο Διπλωματική εργασία Π.Κορμπάκη,2015,Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Πατρών

40 Κέντρα Δότη (Donor Centers) Στην Ελλάδα έχουμε ιδιαίτερα μεγάλη ποικιλομορφία απλοτύπων, δηλ. έχουμε πολλούς «μοναδικούς» απλότυπους. Η ιδιαιτερότητα των απλοτύπων του Ελληνικού πληθυσμού απαιτεί εθνικό μητρώο με τουλάχιστον εθελοντές δότες ώστε να βρίσκεται στην Ελληνική δεξαμενή συμβατός δότης για τους μισούς τουλάχιστον Έλληνες ασθενείς

41 Η μεταμόσχευση είναι η μόνη θεραπεία στην ιατρική που εξαρτάται από την προσφορά των άλλων (Paul Terasaki)

42 ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ

43

44

45

46

47 Δότες στο Ελληνικό Εθνικό Μητρώο όπως φαίνονται στην παγκόσμια δεξαμενή BMDW Registry ION Registry Code Total ABDR DNA class I DNA class II Date Last File Greece CBMDP- Save a life, University of Patras ,038 31,034 31,038 31, Greece Unrelated Haematopoietic Stem Cell Donor Registry , Greece Hellenic Cord Blood (CORD) Greece-Thessaloniki Public Cord Blood (CORD) ,322 1,322 1,322 1, /9/2017, org

48