Νεότερα δεδομένα στην εργαστηριακή διάγνωση και παρακολούθηση του Πολλαπλού Μυελώματος

Transcript

1 Νεότερα δεδομένα στην εργαστηριακή διάγνωση και παρακολούθηση του Πολλαπλού Μυελώματος Αικ. Παυλίτου-Τσιόντση Βιοπαθολόγος τ. Συν. Διευθύντρια Εργαστήριο Ανοσολογίας- Ιστοσυμβατότητας Γ.Ν.Θ. "Παπαγεωργίου" 10 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας 2018

2 Πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες/ Παραπρωτεϊναιμίες/Μονοκλωνικές γαμμαπάθειες Mayo Clinic 1992 Οι μονοκλωνικές γαμμαπάθειες (ΜΓ) μπορεί να αντιπροσωπεύουν πλασματοκυτταρικές διαταραχές, λεμφοκυτταρικές διαταραχές, νοσήματα από εναπόθεση πρωτεϊνών και να συνοδεύουν ένα ευρύ φάσμα νοσημάτων.

3 ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΕΣ ΓΑΜΜΑΠΑΘΕΙΕΣ Χαρακτηρίζονται από τον πολλαπλασιασμό ενός μεταλλαγμένου κλώνου Β κυττάρων (πλασματοκυττάρων) που αναπαράγεται συνεχώς και συνθέτει ομοιογενή-μονοκλωνική ανοσοσφαιρίνη, η οποία αναφέρεται ως Μονοκλωνική Πρωτεΐνη ή Παραπρωτεΐνη (ολόκληρο μόριο ή τμήματα αυτού).

4 Μονοκλωνική Πρωτεΐνη Τα μονοκλωνικά πλασματοκύτταρα συνθέτουν και εκκρίνουν 90% FLC 70% FLC 80% FLC

5 ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΕΣ ΓΑΜΜΑΠΑΘΕΙΕΣ Η ανίχνευση μιας Μ-πρωτεΐνης δεν είναι πάντα ταυτόσημη με κακοήθη διεργασία.

6 Διαγνωστικά κριτήρια MGUS, ασυμπτωματικού και συμπτωματικού μυελώματος Η παρουσία Μ-πρωτεΐνης απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση και συνεχή παρακολούθηση για την πρόγνωση και την εξέλιξη της νόσου.

7 Πολλαπλό Μυέλωμα Συχνότητα ισοτύπων Igs ΠΜ Το Πολλαπλό Μυέλωμα (ΠΜ) αποτελεί πολυεστιακό πλασματοκυτταρικό νεόπλασμα εντοπιζόμενο στο μυελό που χαρακτηρίζεται από μονοκλωνική πρωτεΐνη στον ορό ή και τα ούρα και σκελετικές διαταραχές (οστεολυτικές βλάβες) και συχνά συνοδεύεται από υπερασβεστιαιμία, αναιμία, νεφρική δυσλειτουργία, και υποτροπιάζουσες βακτηριακές λοιμώξεις (ορισμός WHO).

8 Διάγνωση Πολλαπλού Μυελώματος Ανίχνευση παραπρωτεΐνης β2-microglobulin

9 Διαγνωστικά κριτήρια ΠΜ Μείζονα κριτήρια ΠΜ Πλασματοκύτταρα μυελού 30% Πλασμοκύττωμα (ιστική βιοψία) Μ-Πρωτεΐνη: - IgG > 3.5gr/dl - IgA > 2 gr/dl - Bence Jones > 1gr/24ωρο Διάγνωση απαιτούνται 1 μείζον + 1 έλασσον ή 3 ελάσσονα Ελάσσονα κριτήρια ΠΜ Πλασματοκύτταρα μυελού 10-30% Μ-πρωτεΐνη χαμηλότερα επίπεδα Οστεολύσεις Normal Igs < 50% (ανοσοπάρεση) - IgG < 600mg/dl, - IgA < 100mg/dl, - IgM < 50mg/dl CRAB ( Ca, Ηb, νεφρός, οστά)

10 Πολλαπλό μυέλωμα- σταδιοποίηση

11 Ανοσολογικές δοκιμασίες για τη διάγνωση ΠΜ Κλασικές δοκιμασίες ανίχνευσης παραπρωτεΐνης σε ορό και ούρα SPE, IFE ορού UPE, UIFE ούρων Κλασικές ποιοτικές δοκιμασίες ανοσοσφαιρινών ορού (SPE, IFE) και ούρων (UPE, UIFE) και ποσοτική μέτρηση Igs mg/dl ορού. Παρουσιάζουν περιορισμούς της διακριτικής τους ικανότητας με αποτέλεσμα να είναι ανεπαρκείς για τη διάγνωση της αμυλοείδωσης-l, του μη εκκριτικού ή ολιγοεκκριτικού μυελώματος, την παρακολούθηση και την υποτροπή της νόσου.

12 Νεότεροι βιοδείκτες στη διάγνωση του ΠΜ Η εφαρμογή τους παρουσιάζει ολοένα και σημαντικότερο συμπληρωματικό ρόλο στη διάγνωση του ΠΜ (ιδιαίτερα οι FLCs) Ελεύθερες ελαφρές αλυσίδες ορού Serum Free Light Chain assay, sflc (Bradwell 2001, διάγνωση19/28 NSMM) Ζεύγος Βαριάς/Ελαφράς αλυσίδας ορού Heavy/Light Chains, HLC (Bradwell 2009) Αποτελούν πρώιμους δείκτες κακοήθειας και βασικό στοιχείο: Διάγνωση επιβεβαίωση της κατάσταση της νόσου Πρόγνωση προβλέψη έκβασης πορείας ασθενών Παρακολούθηση εκτίμηση ανταπόκρισης στη θεραπεία

13 International Myeloma Working Group guidelines for serum-free light chain analysis in multiple myeloma and related disorders Leukemia (2009) 23, ; Συνδυασμός με μεγαλύτερη κλινική ευαίσθησία για τη διάγνωση της ΜΓ Ηλεκτροφόρηση (SPE) πρωτεϊνών ορού Ανοσοκαθήλωση (IFE) πρωτεϊνών ορού Free light chains ορού (Freelite) Ηλεκτροφόρηση /ανοσοκαθήλωση ούρων 24h όχι απαραίτητη, εκτός από Αμυλοείδωση AL

14 Μονοκλωνικές Πρωτεΐνες και Ανοσοσφαιρίνες Τα μόρια των Μ-ανοσοσφαιρινών έχουν ίδια δομή με τις φυσιολογικές Igs. Κάθε πλασματοκύτταρο παράγει μόνο μια τάξη Igs (IgG,IgA,IgM,IgD,IgE) Κύρια διαφορά τους, είναι η απόλυτη ομοιογένεια, λόγω της οποίας έχουν ταυτόσημη ηλεκτροφορητική κινητικότητα (χαρακτηριστικό έπαρμα).

15 Σύνθεση ανοσοσφαιρίνης Κάθε πλασματοκύτταρο παράγει μόνο ένα τύπο βαριάς και ένα τύπο ελαφράς αλυσίδας. Οι βαριές και οι ελαφρές αλυσίδες δημιουργούνται ξεχωριστά μέσα στο πλασματοκύτταρο και στη συνέχεια διαμορφώνεται ολόκληρο το μόριο της ανοσοσφαιρίνης.

16 Πως παράγονται οι ελεύθερες ελαφρές αλυσίδες Για άγνωστους λόγους τα πλασματοκύτταρα παράγουν περισσότερες ελαφρές αλυσίδες από αυτές που απαιτούνται ώστε να δημιουργηθεί ένα ολοκληρωμένο μόριο ανοσοσφαιρίνης ή μια μονοκλωνική πρωτεΐνη.

17 Ελεύθερες ελαφρές αλυσίδες (FLCs) Φυσιολογική παραγωγή: FLCs 0,5 g/ημέρα Νεφρός: απορρόφηση μεταβολισμός gr/ημέρα (30 φορές της φυσιολογικής παραγωγής FLCs) Η περίσσεια των ελεύθερων ελαφρών αλυσίδων (FLCs) διηθείται από το σπείραμα σε φυσιολογικά άτομα αλλά και σε ασθενείς με μυέλωμα. Ακολουθεί η απορρόφησή τους και ο μεταβολισμός στα εγγύς εσπειραμένα σωληνάρια και αποβολή μικρής ποσότητας με τα ούρα. Στο ΠΜ η υπερπαραγωγή μονοκλωνικών FLCs, εξαντλεί την απορροφητική δυνατότητα των σωληναρίων με αποτέλεσμα την μαζική απέκκριση τους στα ούρα (Bence Jones πρωτεΐνη).

18 Μονοκλωνικές ελεύθερες ελαφρές αλυσίδες γνωστές εδώ και 150 χρόνια, ως πρωτεΐνη Bence Jones ομοιογενής πληθυσμός κ ή λ ελαφρών αλυσίδων σημαντικοί δείκτες για τη διάγνωση και παρακολούθηση ασθενών με ΠΜ ελαφράς αλυσίδας (LCMM) και αμυλοείδωση ελαφρών αλυσίδων (AL amyloidosis). Dr. Henry Bence Jones English physician and chemist ( ) 1848: protein Bence Jones first biochemical tumor marker

19 Ελαφρές αλυσίδες: συνδεδεμένες και ελεύθερες κ FLC: μονομερής 25 kda (half life 2-3 h) λ FLC: διμερής 50 kda (half life 4-6 h) Η πλειονότητα των ελαφρών αλυσίδων είναι συνδεδεμένες με τις βαριές. Χαμηλά επίπεδα κυκλοφορούν στον ορό ως ελεύθερες ελαφρές αλυσίδες

20 Ποσοτική μέτρηση Ελεύθερων ελαφρών αλυσίδων (FLCs) ορού κ FLCs λ FLCs κ/λ FLC ratio TLCs: Δοκιμασία μέτρησης του συνόλου των ελαφρών αλυσίδων (ελεύθερων και συνδεδεμένων με βαριές αλυσίδες) όχι ευαίσθητη δεν συνιστάται για FLCs FLCs: μεθοδολογία που δίνει τη δυνατότητα ποσοτικής μέτρησης μόνο των ελεύθερων ελαφρών κ και λ αλυσίδων του ορού.

21 Ελεύθερες ελαφρές αλυσίδες (FLCs) ορού Η διαφορά της μέτρησης των FLCs από τα TLCs οφείλεται στη χρήση αντιορών που αναγνωρίζουν επιτόπους των ελαφρών αλυσίδων που είναι «κρυμμένοι» όταν αυτές είναι συνδεδεμένες με βαριές, αλλά «εκτίθενται» και γίνονται «προσβάσιμοι» όταν αυτές είναι ελεύθερες.

22 Δοκιμασίες Ποσοτικού Προσδιορισμού FLCs Διαθέσιμες αυτοματοποιημένες, ποσοτικές, ποιο ευαίσθητες από SPE/IFE, με εφαρμογή σε όργανα (νεφελόμετρα) που υπάρχουν στα κλινικά εργαστήρια. Η κλωνικότητα ζώνης αντικαθίσταται από τον αριθμητικό λόγο των FLCs. Χρήση: Πολυκλωνικών αντισώματων (Freelite) χωρίς διασταυρούμενες αντιδράσεις Χρήση: Μονοκλωνικών αντισώματων (N Latex FLC) Τα αντισώματα FLC πρέπει να αναγνωρίζουν μόνο επιτόπους που είναι κρυμμένοι στις ακέραιες ανοσοσφαιρίνες για την αποφυγή ψευδώς αυξημένα FLC από διασταυρούμενη αντίδραση.

23 Διαγνωστική ευαισθησία της μέτρησης FLCs του ορού στη Μονοκλωνική Γαμμαπάθεια Bradwell. Lancet 2003 Δυνατότητα προσδιορισμού FLCs σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες των φυσιολογικών επίπεδων. Επιτρέπει την ανίχνευσή των FLCs σε πρώιμα στάδια ΜΓ όπου ακόμη SPE και IFE είναι αρνητικές.

24 Ευαισθησία Δοκιμασίας FLCs ορού Η χρήση ηλεκτροφόρησης και ανοσοκαθήλωσης ούρων περιορίζεται FLC ορού κ=113 mg/l λ=113 mg/l ΒJ θετικό στα ούρα Clin Cancer Res 2005;11:

25 International Myeloma Working Group updated criteria for the diagnosis of multiple myeloma. Lancet Oncology 2014; 15:e538-e548 Ο συνδυασμός των μεθόδων SPE/CZE και των FLC Freelite ορού στην αρχική διάγνωση, διαθέτει μεγάλη ευαισθησία στη διάγνωση του ΠΜ, αποτελεί δείκτη μονοκλωνικότητας, περιορίζει τις δοκιμασίες ούρων και μειώνει το χρόνο ανάλυσης. Με IFE τυποποίηση της παραπρωτεΐνης.

26 Ελεύθερες ελαφρές αλυσίδες (FLCs) ορού Ποσοτική μέτρηση με αυτοματοποιημένη μέθοδο (freelite) Φυσιολογικές τιμές κ FLC λ FLC rflc κ/λ λόγος καθοριστικός παράγοντας μονοκλωνικότητας 95% (όριο εμπιστοσύνης) 3,30 19,40 (mg/l) 5,71 26,30 (mg/l) 100 % (όριο εμπιστοσύνης) 0,26 1,65 rflc κ/ λ >1.65 μονοκλωνική κ παραπρωτεϊναιμία rflc κ/ λ <0,26 μονοκλωνική λ παραπρωτεϊναιμία Νεφρική δυσλειτουργία 100 % (όριο εμπιστοσύνης) κ/λ FLC λόγος ,1 BMC Nephrol 2008;9:11 Σε αύξηση των απολύτων αριθμών των FLCs στις πολυκλωνικές γαμμαπάθειες ή λόγω ηλικίας ο λόγος FLC κ/ λ παραμένει φυσιολογικός

27 Κλινική ερμηνεία επιπέδων FLC και λόγου κ/λ Raynell J. et al. Blood 2005

28 Κλινική σημασία προσδιορισμού των FLCs και του λόγου κ/λ στον ορό ασθενών με ΜΓ Βελτίωση Διάγνωσης LCMM 100% χωρίς να είναι απαραίτητες UREP, UIFE NSMM) 85% όταν SPE/IFE (ορού,ούρων αρνητικές) AL amyloidosis 95%, UREP, UIFE απαραίτητες Ασθενών με ΠΜ (ΙΙΜΜ) (Ορός MΠ<1 g/dl, ούρα MΠ <200 mg/24h, M-αιχμές στις β (IgA ΜΜ)

29 Παρακολούθηση, πρόγνωση MGUS και Smouldering (SMM) GMUS SMM ΜΓ αδιευκρίνιστης σημασίας Παράγοντες κινδύνου: Παθολογικός κ/λ FLC λόγος Μονοκλωνική πρωτεΐνη >15g/L IgA ή IgM Μονοκλωνική πρωτεΐνη Ασυμπτωματικό Μυέλωμα Παράγοντες κινδύνου: Παθολογικός κ/λ FLC λόγος Μονοκλωνική πρωτεΐνη >1,5 mg/dl IgA ή IgM Μονοκλωνική πρωτεΐνη Παρακολούθηση εξέλιξης ασθενών με ΠΜ (ΙΙΜΜ) καθώς το % παρουσιάζει αυξημένες ποσοτικά τιμές FLCs στον ορό.

30 Ανίχνευση Light-chain escape σε ασθενείς με IIMM υπό αγωγή Light-chain escape-multiple myeloma, LCE (ΠΜ διαφυγής ελεύθερης ελαφράς αλυσίδας) ΠΜ: IgA και λ-flcs Ανίχνευση αύξησης μόνο της μονοκλωνικής FLC σε υποτροπή, ενώ η ΜΠ ολόκληρου μορίου παραμένει σε ανοσοκαταστολή. IgA ΜΜ και Ig GΜΜ 7% παρουσιάζουν LCE. Η έγκαιρη ανίχνευση LCE αποφεύγει επιπλοκές (νεφρική δυσλειτουργία.) Brioli A, et al. Blood 2014; 123:

31 2014 IMWG guidelines for Diagnosis and response subcategory MM Δείκτης διαφοράς dflc (iflc uflc) και λόγος iflc/ uflc

32 Heavy/Light Chains, HLC ορού (Bradwell 2009) Ζεύγος βαριάς/ελαφράς αλυσίδας Η HLC διακρίνει ζεύγη βαριάς/ελαφριάς αλυσίδας, μετρά ποσοτικά κάθε τάξη ανοσοσφαιρίνης ανάλογα με τον τύπο της ελαφράς αλυσίδας (πχ. IgGκ, IgGλ, IgAκ, IgAλ, IgMκ, ΙgΜλ) και υπολογίζει το λόγο μονοκλωνικής/ πολυκλωνική (λόγος rhlc IgGκ / IgGλ).

33 Heavy/Light Chains, HLC ορού Πολυκλωνικά αντισώματα ειδικά για επιτόπους της περιοχής σύνδεσης βαριάς και ελαφράς αλυσίδας στο σταθερό τμήμα του μορίου. IgA IgA Οι περιοχές των επιτόπων είναι 4 μία σε κάθε βαριά και ελαφρά αλυσίδα κάθε πλευράς.

34 Heavy/Light Chains, HLC ορού Oι μέτρησεις HLC παρέχουν πολύ χρήσιμες διαγνωστικές πληροφορίες καθώς ο λόγος (IgGκ/IgGλ) διακρίνει την μονοκλωνικότητα αλλά και την περαιτέρω αξιολόγηση του Παθολογικός λόγος δείχνει μονοκλωνικότητα ασθενούς.

35 Heavy/Light Chains, HLC ορού IMWG, Criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma Kumar S et al, ;(17) 328. Η δοκιμασία HLC προδιορίζει: ihlc (involved, εμπλεκόμενη μονοκλωνική Ig, (IgΑκ) uhlc (uninvolved, αμέτοχη πολυκλωνική Ig, (IgΑλ) rhlc (r=ihlc/uhlc, λόγος μονοκλωνικής/πολυκλωνική Ig (IgΑκ/IgΑλ) dhlc (διαφορά εμπλεκόμενης-αμέτοχης, ihlc- uhlc (IgΑκ-IgΑλ) Ρόλος HLC. Μετρά με ακρίβεια την ποσότητα της μονοκλωνικής Ig, κάνει γωστή την ποσότητα της αμέτοχης πολυκλωνικής Ig και διακρίνει αν υπάρχει ανοσοκαταστολή

36 Heavy/Light Chains, HLC ορού Ο ρόλος τους ως εργαλείο πρόγνωσης και παρακολούθησης ΜΓ Βοηθά στην ανίχνευση, μέτρηση και παρακολούθηση των IgA ΜΠ ορού που συν-μεταναστεύουν με τις β-σφαιρίνες (40% των IgΑ ΜΠ δεν ανιχνεύεται με SPE. Katzmann Clin Chem 2015; 61: )

37 ΦΤ: IgAκ= 0,57-2,08 g/l, IgAλ= 0,44-2,04 g/l, IgAκ/IgAλ= 0,78-1,94 Βοηθά στην παρακολούθηση της ολιγο-εκκριτικής νόσου, βελτιώνει την ευαισθησία για τον εντοπισμό υπολειμματικής νόσου και την έγκαιρη ανίχνευση υποτροπής (Μερικούς μήνες πριν από IFE και CZE/SPE).

38 Heavy/Light Chains, HLC ορού Η HLC δίνει ακριβή μέτρηση όταν SPE μη γραμμική ΜΠ= 44,9 g/l Τotal IgG is 64,9 g/l Εντόπιση κλωνικών διαφορών στον ίδιο Ασθενή σε υποτροπή (40%) 1. ΠΜ μόνο με FLC καμία κλωνική εξέλιξη 2. Το 60% ΠΜ με FLC + ΙΙΜΜ αλλάζει κλώνο (ελαφρές 11%, ολόκληρο μόριο 49%) 3. 17% ΙΙΜΜ αλλάζει ο τύπος ΜΠ (ΙΙΜΜ+ FLC)

39 Χρήση FLC και HLC ορού Η χρήση FLC και HLC κατά την παρακολούθηση του ασθενούς εξασφαλίζει την άμεση ανίχνευση υποτροπής είτε στην ελαφρά αλυσίδα ή / και στο ακέραιο μόριο της ανοσοσφαιρίνης και διακρίνει τυχόν κλωνική αλλαγή.

40 Συμπέρασμα Η νέα εφαρμογή των FLCs έχει ιδιαίτερα σημαντική αξία γιατί εκτός του ότι διακρίνει την κλωνικότητα σε πρώιμα στάδια και συμβάλλει στην έγκαιρη διάγνωση, αποτελεί και πρώιμο δείκτη απάντησης στη θεραπεία ή πρώιμη ένδειξη υποτροπής. Επομένως ο συνδυασμός της με SPE/IFE δίνει τη βέλτιστη ευαισθησία για τη διάγνωση της ΜΓ. Ο αναδυόμενος ρόλος των HLC φαίνεται να υπόσχεται πολλά, ιδιαίτερα στους ασθενείς που επιτυγχάνουν πλήρη ανταπόκριση στη θεραπεία (έγκαιρο εντοπισμό υπολειμματικής νόσου και υποτροπής) όμως απαιτούνται και άλλα δεδομένα για να εξαχθούν συμπεράσματα για τη συστηματική χρήση τους.

41 Καλή Πρωτομαγιά