ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ. ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΧΗΜΕΙΑΣ» ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ «Χημική Ανάλυση και Έλεγχος Ποιότητας»

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΧΗΜΕΙΑΣ» ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ «Χημική Ανάλυση και Έλεγχος Ποιότητας» ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Ανάπτυξη και Επικύρωση Μεθόδου Προσδιορισμού 71 Ψυχοτρόπων ή Μη Φαρμάκων, Καθώς και Παρανόμως Διακινούμενων Εξαρτησιογόνων Ουσιών και των Μεταβολιτών τους σε Απόβλητα με LC-MS/MS ΒΙΟΛΑ ΜΠΟΡΟΒΑ ΧΗΜΙΚΟΣ ΑΘΗΝΑ ΟΚΤΩΜΒΡΙΟΣ 2012

2

3 ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Ανάπτυξη και Επικύρωση Μεθόδου Προσδιορισμού 71 Ψυχοτρόπων ή Μη Φαρμάκων, Καθώς και Παρανόμως Διακινούμενων Εξαρτησιογόνων Ουσιών και των Μεταβολιτών τους σε Απόβλητα με LC-MS/MS ΒΙΟΛΑ ΜΠΟΡΟΒΑ Α.Μ.: ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΘΩΜΑΪΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, Επίκουρος Καθηγητής ΕΚΠΑ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΟΥΠΠΑΡΗΣ ΜΙΧΑΗΛ, Καθηγητής ΕΚΠΑ ΑΤΤΑ ΠΟΛΙΤΟΥ ΤΖΟΥΛΙΑ, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια ΕΚΠΑ ΘΩΜΑΪΔΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, Επίκουρος Καθηγητής ΕΚΠΑ (Επιβλέπων) ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 13/11/2012

4

5

6

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα ψυχοτρόπα ή μη φάρμακα, καθώς και οι παρανόμως διακινούμενες εξαρτησιογόνες ουσίες αποτελούν σε παγκόσμιο επίπεδο μια ομάδα αναδυόμενων ρύπων, εξαιτίας της μεγάλης ποσότητάς τους που απορρίπτεται στο υδάτινο περιβάλλον, μέσω των Μονάδων Επεξεργασίας Υγρών Αστικών Αποβλήτων, αφού στα τελευταία δεν γίνεται πλήρη απομάκρυνση τους. Συμπερασματικά η, παρακολούθησή τους είναι αναγκαία ώστε να μελετηθεί η παρουσία τους, η συμπεριφορά τους και η τύχη τους στο περιβάλλον. Στην παρούσα εργασία προσδιορίστηκαν 71 ενώσεις, που ανήκουν στις ομάδες των οπιούχων και οπιοειδών (8), ενώσεων κοκαΐνης και μεταβολιτών (3), αμφεταμινών (5), παραισθησιογόνων (κανναβινοειδή (3), LSD (2)), βενζοδιαζεπινών (13), βαρβιτουρικών (2), αναισθητικών (6), υπνωτικών (1), αντιεπιληπτικών (7), αντιψυχωσικών (6), αντικαταθλιπτικών (τρικυκλικών (5), τετρακυκλικών (2), SSRIs (5), SNRIs (1)), και συμπαθομιμητικών (2), σε εισερχόμενα λύματα και σε δευτεροβάθμια επεξεργασμένα υγρά απόβλητα (εξερχόμενα λύματα), ξεπερνώντας τις δυσκολίες που επηρεάζουν την απόδοση της εκχύλισης και τα στάδια προσδιορισμού, όπως είναι οι διαφορετικές πολικότητες των ενώσεων, η πολυπλοκότητα του δείγματος και τα διαφορετικά επίπεδα συγκεντρώσεων σε ιχνοποσότητες. Για την προσυγκέντρωση των αναλυτών και για τον καθαρισμό των δειγμάτων έγινε εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) κατά την οποία δοκιμάστηκαν δύο είδη πολυμερικών προσροφητικών SPE: μια ρητίνη αντίστροφής φάσης, Strata X και μία κατιονανταλλακτική, Strata XC. Ο προσδιορισμός των ουσιών έγινε με υγρoχρωματογράφο με φασματομετρία μαζών σε σειρά (LC- MS/MS) και ιοντισμό με ESI. Η αναλυτική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν αντίστροφης φάσης, PFP (πενταφθοροφαίνυλο-). Προσδιορίστηκαν συνολικά εβδομήντα μία (71) ουσίες, εκ τω οποίων οι 65 προσδιορίστηκαν με θετικό ιοντισμό (+) ΕSI και οι άλλες 6 με αρνητικό ιοντισμό (-) ΕSI. Για να αντιμετωπιστούν οι δυσκολίες με τις διαφορετικές πολικότητες και φορτία των ενώσεων έγινε συστηματική βελτιστοποίηση της κινητής φάσης αλλά και του τρόπου βαθμίδωσής της. Ακόμα η αναλυτική στήλη PFP συγκρίθηκε με τις στήλες αντιστροφής φάσης συμπαγούς πυρήνα (fusedcore) C18 και με μία XB-C18 (cross-butylc18 ligand). Όλα τα δείγματα υγρών αποβλήτων διηθήθηκαν και το ph τους ρυθμίστηκε στο 2,5 βαθμούς με υδροχλωρικό οξύ (HCl, 1M). Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε παρείχε απόλυτες ανακτήσεις μεταξύ 60% (morphine) 126% (valproic acid) για 67 ενώσεις και λίγο χειρότερες, αλλά 7

8 ακριβείς, για τα κανναβινοειδή (10% για την canabidiol έως 35% για το 11-nor-Δ9- THCA) και pentobarbital (167%). Τα όρια ανίχνευσης κυμαίνονταν μεταξύ 0,04 ng L -1 (nortriptylline) ng L -1 (valproic acid). Οι συγκεντρώσεις ορισμένων ενώσεων που μετρήθηκαν στα εισερχόμενα λύματα χρησιμοποιήθηκαν για να υπολογιστεί η χρήση των εξαρτησιογόνων ουσιών σε επίπεδο κοινότητας. Η κάνναβη αποδείχθηκε η πρώτη σε κατάχρηση ουσία και ακολουθείται από την heroin, την cocaine, την amphetamine, την methamphetamine και την «έκσταση» (MDMA). Τέλος, μερικές ενώσεις όπως η cocaine, BECG, morphine, bupronorphine, THC-COOH, amphetamine, methamphetamine και η levetiracetam, απομακρύνονταν αποτελεσματικά (> 90%) κατά τη διάρκεια της δευτεροβάθμιας επεξεργασίας των λυμάτων, ενώ περισσότερο από το ήμισυ των ενώσεων δεν είχαν απομακρυνθεί καθόλου και οδηγήθηκαν στα επεξεργασμένα υγρά απόβλητα και από κει στο περιβάλλον. ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ: Υγροχρωματογραφία-Φασματομετρία Μαζών ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙ ΙΑ: Εξαρτησιογόνες ενώσεις, απόβλητα νερά, LC-MS/MS, εκχύλιση στερεάς φάσης, χρήση 8

9 ABSTRACT Psychoactive, licit, illicit drugs and their metabolites represent worldwide a group of emerging contaminants as a consequence of their high volumes discharged in the aquatic environment through wastewater treatment plants. Their monitoring is necessary to provide wider knowledge about their occurrence, behaviour and fate in the environment. This work presents the determination of 71 compounds, belonging to opiates and opioids (8), cocaine and its metabolites (3), amphetaminesand its metabolites (5),hallucinogens (cannabinoids (3), LSD(2)), benzodiazepines (13), barbiturates (2), anesthetics (6), hypnotics (1), antiepileptics (7), antipsychotics (6), antidepressants (tricyclic (5), tetracyclic (2), SSRIs (5), SNRIs (1)), and sympathomimetics (2), in influent and effluent wastewater, overcoming the difficulties affecting the performance of extraction and determination steps, such as the wide-range of the polarity of the compounds, the complex matrices and multi-trace concentration levels. The method involves pre-concentration and clean-up by solid phase extraction (SPE), using two polymeric adsorbents Strata-X (reserved phase) and Strata-X-C (cation-exchange phase), followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), using a pentafluorophenyl (PFP) reversed-phase fused-core column and electrospray ionization (ESI) in both positive (65 compounds) and negative (6 compounds) modes. A systematic optimization of mobile phaseand gradient were performed to cope with different polarities and charge of compounds. The PFP column was also compared with a reversed phase fused-core C18 columnand with a XB-C18 (with a cross-butyl C18 ligand). Under final working conditions, wastewater samples were filtrated and ph was adjusted at 2.5. The proposed method provided absolute recoveries between 60% (morphine) - 126% (valproic acid) for 67 compounds and slightly worse, but precise, recoveries, for cannabinoids (10% for cannabidiol to 35% for 11-nor-Δ9-THC acid) and pentobarbital (167%). LODs were between 0.04 ng L -1 (Nortriptyline) 186 ng L -1 (valproic acid). Concentrations measured in the influent wastewaters were used to back-calculate drug consumption at the community level. Estimation pointed out cannabis as the most abused drug, followed by heroin, cocaine, amphetamine, methamphetamine and ecstasy. It was shown that some compounds such as cocaine, BECG, morphine, 9

10 bupronorphine, THC-COOH, amphetamine, methamphetamine and levetiracetam, were efficiently eliminated (>90%) during wastewater secondary treatment, whereas more than half of the compounds were not eliminated at all and were discharged in receiving waters. SUBJECT AREA: Liquid Chromatography-Mass Spectrometry KEYWORDS: Illicit drugs, wastewater, LC-MS/MS, SPE, consumption 10

11 Στην οικογένειά μου και στον παππού μου 11

12 12

13 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Για τη διεκπεραίωση της παρούσας ερευνητικής εργασίας, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον κ. Θωμαΐδη Νικόλαο, Επίκουρο Καθηγητή Αναλυτικής Χημείας του Πανεπιστημίου Αθηνών καιεπιβλέποντα της ερευνητικήςεργασίας γιαόλη την επιστημονική καθοδήγηση, την υπομονή, την συμπαράστασηκαι την εμπιστοσύνη που μου παρείχε κατά τη διάρκεια εκπόνησης και συγγραφής αυτής, για την βοήθεια να ανέβω το «πρώτο σκαλί» στο πολύ υψηλό της «Επιστήμης» τη σκάλα καθώς και για τη δυνατότητα και τη τιμή που μου έδωσε να γίνω μέλος της ερευνητικής του ομάδας. Ιδιαίτερα θα θελα να ευχαριστήσω την Δρ. Νίκη Μαραγκού για την εκπαίδευση που μου παρείχε σε όλα τα στάδιατης εργασίας και ήταν δίπλα μου ανά πάσα στιγμή και ώρα καθοδηγώντας με, με επιστημονικές και όχι μόνο συμβουλές. Ευχαριστώ πολύ από καρδίας τους Υποψήφιους Διδάκτορες και φίλους μου Μαριλένα Δασενάκη, Αλέξανδρο Ασημακόπουλο, Άννα Μπλέτσου και Μάριο Κωστάκη και την Μεταπτυχιακή φοιτήτρια Ελένη Χρυσοχού, για την ειλικρινή βοήθειά τους, το ευχάριστο κλίμα που δημιουργούσαν στο εργαστήριο και την συμπαράσταση που μου παρείχαν καθ όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών σπουδών μου και ειδικά για την εκπόνηση της παρούσας εργασίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Καθηγητή κ. Μιχαήλ Κουππάρη και την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα. Τζούλια Άττα Πολίτου για τη συμμετοχή τους στην εξεταστική επιτροπή της παρούσας εργασίας, για το χρόνο που διέθεσαν για την διόρθωσή της και για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους όπως επίσης και για όλες τις συμβουλές και καθοδηγήσεις τους καθ όλη την διάρκεια του μεταπτυχιακού μου. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου που με έχτισε με θεμέλια ηθικής και αξιοπρέπειας και ήταν κοντά μου ανεξαρτήτων συνθηκών καθώς και τους συμφοιτητές και φίλους μου για την ψυχολογική συμπαράσταση αλλά και επιστημονική γνώση που μου παρείχαν καθ όλη τη διάρκεια του κύκλου σπουδών μου και ειδικά τα κορίτσια Μαρία Χρηστάκου, Χαρούλα Καραμπίνη και Ήρα Καπουράνη. 13

14 14

15 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδες ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΛΛΗΝΙΚΑ 7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΑΓΓΛΙΚΑ...9 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ.13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ.15 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ..18 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ..21 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΕΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΩΝ 22 ΠΡΟΛΟΓΟΣ...23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΨΥΧΟΤΡΟΠΑ Ή ΜΗ ΦΑΡΜΑΚΑ, ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΝΟΜΩΣ ΔΙΑΚΙΝΟΥΜΕΝΕΣ ΕΞΑΡΤΗΣΙΟΓΟΝΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΚΑΙ ΟΙ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΕΣ ΤΟΥΣ ΣΕ ΑΠΟΒΛΗΤΑ Εισαγωγή Ψυχοτρόπα ή μη φάρμακα, καθώς και παρανόμως διακινούμενες Εξαρτησιογόνες ουσίες και οι μεταβολίτες τους Μηχανισμοί βιομετατροπής ψηχοτρόπων ή μη φαρμάκων Οπιούχες Ενώσεις Διεγερτικά του ΚΝΣ (κοκαΐνη, αμφεταμίνη, συμπαθομιμητικά) Ψευδαισθησιογόνα ή παραισθησιογόνα (LSD, ινδική κάνναβη) Βενζοδιαζεπίνες Βαρβιτουρικά Αντικαταθλιπτικά Αντιψυχωσικά, Αντιεπιληπτικά και Αναισθητικά Ψυχοτρόπα ή μη φάρμακα, καθώς και παρανόμως διακινούμενες εξαρτησιογόνες ουσίες και οι μεταβολίτες τους στο περιβάλλον Αναδυόμενοι ρύποι προτεραιότητας (emerging contaminants) Αναδυόμενοι ρύποι προτεραιότητας: DoA Περιβαλλοντικές επιπτώσεις των DoA Εκτίμηση της χρήσης εξαρτησιογόνων ουσιών.48 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ Εισαγωγή Βιβλιογραφική ανασκόπηση Εκχύλιση στερεάς φάσης

16 2.4 Τεχνικές ανάλυσης και προσδιορισμού ενώσεων (Χρωματογραφία) Υγροχρωματογραφία Οργανολογία της HPLC Υγροχρωματογραφία κατανομής αντίστροφης φάσης Στατική φάση Κινητή φάση Φασματομετρία μαζών τεχνολογίας τριπλού τετραπόλου Φασματομετρία μαζών Οργανολογία και αρχή λειτουργίας φασματομέτρου μαζών Πηγές Ιόντων Ηλεκτροψεκασμός (ESI) Αναλυτές μαζών Τετραπολικός αναλυτής μαζών Φασματομετρία μαζών σε σειρά (TandemMass) με τεχνολογία τριπλού τετραπόλου Σύζευξη της υγροχρωματογραφίας με φασματομετρία μαζών (LC-MS) 75 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ..77 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4:ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ-ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ-ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Υγροχρωματογραφικό σύστημα με ανιχνευτή φασματομετρίας μαζών με τριπλό Τετράπολο Εργαστηριακός εξοπλισμός Αντιδραστήρια Διαλύτες Πρότυπες ουσίες και πρότυπα διαλύματα..82 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ 71 ΨΥΧΟΤΡΟΠΩΝ Ή ΜΗ ΦΑΡΜΑΚΩΝ, ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΝΟΜΩΣ ΔΙΑΚΙΝΟΥΜΕΝΩΝ ΕΞΑΡΤΗΣΙΟΓΟΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΩΝ ΤΟΥΣ ΣΕ ΑΠΟΒΛΗΤΑ ΜΕ LC-MS/MS Εισαγωγή Βελτιστοποίηση παραμέτρων φασματομετρίας μαζών MS/MS Βελτιστοποίηση παραμέτρων υγροχρωματογραφίας (HPLC) Προκατεργασία δειγμάτων και βελτιστοποίηση της διαδικασίας καθαρισμού και προσυγκέντρωσης (εκχύλιση στερεάς φάσης, SPE) για τον προσδιορισμό των ενώσεωνσε υγρά απόβλητα Επικύρωση Μεθόδου 89 16

17 5.5.1 Γραμμικότητα Όρια ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικοποίησης (LOQ) της μεθόδου Πιστότητα Ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα μεθόδου Ορθότητα Μελέτη φαινομένου επίδρασης της μήτρας...93 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εύρεση μητρικών και θυγατρικών ιόντων και βελτιστοποίηση των παραμέτρων του MS/MS Βελτιστοποίηση παραμέτρων υγροχρωματογραφίας (HPLC) Προκατεργασία δειγμάτων και βελτιστοποίηση της διαδικασίας καθαρισμού και προσυγκέντρωσης (εκχύλιση στερεάς φάσης, SPE) για τον προσδιορισμό των ενώσεων σε υγρά απόβλητα και μελέτη της επίδραση μήτρας Επικύρωση μεθόδου Γραμμικότητα Ορθότητα Πιστότητα (ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα μεθόδου) Όρια ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικοποίησης (LOQ) Επίδραση μήτρας ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7: ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΕ ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ Δειγματοληψία Παρουσία των DoA στο ΚΕΛ Ψυττάλειας Απομάκρυνση των DoA κατά την πρωτοβάθμια/δευτεροβάθμια επεξεργασία των υγρών αποβλήτων Ημερήσια φορτία ουσιών στα επεξεργασμένα υγρά απόβλητα Εκτίμηση χρήσης εξαρτησιογόνων ουσιών Συμπεράσματα-Προτεινόμενη μελλοντική έρευνα.156 ΠΙΝΑΚΑΣ ΟΡΟΛΟΓΙΑΣ.158 ΣΥΝΤΗΜΗΣΕΙΣ ΑΡΚΤΙΚΟΛΕΞΑ ΑΚΡΩΝΥΜΙΑ.160 ΑΝΑΦΟΡΕΣ

18 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Σελίδες Εικόνα 1.1: Μεταβολική οδός της κωδεΐνης στο ήπαρ και στα νεφρά..39 Εικόνα 1.2: Μεταβολισμός της ηρωίνης στον άνθρωπο.39 Εικόνα 1.3: Μεταβολισμός της μεθαδόνης στον άνθρωπο..39 Εικόνα 1.4: Ψυχοτρόπα ή μη φάρμακα στο περιβάλλον (κύκλος) (η σχετική σπουδαιότητα των οδών υποδεικνύεται από την ένταση των γραμμών). Η εικόνα είχε σχεδιαστεί από τον CG. Daughton (USEPA) τον Ιούνιο του Εικόνα 2.1: Διάταξη οργανολογίας HPLC...65 Εικόνα 2.2: Σχηματική παρουσίαση λειτουργίας MS..68 Εικόνα 2.3: Σχηματική αναπαράσταση πηγής ιόντων (ESI).70 Εικόνα 2.4: Τετραπολικός ανιχνευτής μαζών (quadrupole mass) 73 Εικόνα 2.5: Διάταξη τριπλού τετραπόλου.74 Εικόνα 2.6: Σύστημα συζευγμένης υγροχροχρωματογραφίας με φαματόμετρο μαζών (LC-MS).76 Εικόνα 4.1: Υγροχρωματογραφικό σύστημα με ανιχνευτή φασματομετρίας μαζών με τριπλό τετράπολο (LC-MS/MS) της Τhermo Scientific Quantum 79 Εικόνα 5.1: Πολυμερικά προσροφητικά υλικά των δύο χρησιμοποιούμενων φυσιγγίων κατά τις δοκιμές εκχύλισης στερεάς φάσης, του Strata-XC και Strata-X.87 Εικόνα 5.2: Λεπτομερής περιγραφή της τελικής βέλτιστης μεθόδου προκατεργασίας του δείγματος για τον προσδιορισμό των ψυχοτρόπων και ναρκωτικών...89 Εικόνα 6.1: Καμπύλες βελτιστοποίησης εφαρμοζόμενης τάσης και θραυσματοποίησης και φάσμα μαζών.95 Εικόνα 6.2: Βελτιστοποίηση του αερίου ξήρανσης στο ESI-MS/MS στον αρνητικό ιοντισμό, όπου είναι στο a: 0 a.u, b: 5 a.u, c: 10 a.u, d: 3 a.u, e: 7 a.u και στο f: 12 a.u, όταν το αέριο εκνέφωσης είναι 30 a.u, η θερμοκρασία κώνου 18

19 270 o C και το δυναμικό 2500 V 96 Εικόνα 6.3: Βελτιστοποίηση του αερίου εκνέφωσης στοesi-ms/ms στον αρνητικό ιοντισμό, όπου είναι στο a:10 a.u, b:20 a.u, c:5 a.u καιd15 a.u, όταν το αέριο ξήρανσης είναι 7 a.u, η θερμοκρασία κώνου 270 o C και το δυναμικό 2500 V. 97 Εικόνα 6.4: Στατικές φάσεις των στηλών (Kinetex) PFP, C18 και XB-C Εικόνα 6.5: Χρωματογραφήματα των αμφεταμινών και συμπαθομιμητικών σε διαφορετικές στήλεςκαι συνθήκες. Όπου, Α: PFP στήλη,κ.φ: MeOH/Milli- Q νερό, 0.05%v/v F.A και στα δύο, ροή: 100μl/min (PL), B: C18 στήλη, Κ.Φ: MeOH/Milli-Q νερό, 0.05%v/v F.A και στα δύο,ροή: 100μL/min (PL), C: C18 στήλη, Κ.Φ: MeOH/Milli-Q νερό, 0.05%v/v F.A καιστα δύο, ροή: 200μL/min (PL), D: C18-XB στήλη, Κ.Φ: MeOH/Milli-Q νερό,0.05%v/v F.A και στα δύο, ροή: 100μL/min (PL, parcial loop)..104 Εικόνα 6.6: Ανταπόκριση των διαφόρων ομάδων ενώσεων στις διαφορετικές κινητές φάσεις με στήλη PFP έπειτα από κανονικοποίηση των εμβαδών τους.110 Εικόνα 6.7: Ολικό χρωματογράφημα πρότυπου δείγματος για θετικό ιοντισμό 111 Εικόνα 6.8: Ολικό χρωματογράφημα πρότυπου δείγματος για αρνητικό ιοντισμό..112 Εικόνα 6.9: Ενδεικτικές καμπύλες αναφοράς για πρότυπες ενώσεις σε 54% MeOH και 46% Η 2 Ο (purified) 122 Εικόνα 7.1: Συγκεντρώσεις των αναλυτών στα εισερχόμενα λύματα του ΚΕΛ Ψυττάλειας κατά τη 1η δειγματοληψία (Κυριακή: 5/12/2010, Σάββατο: 11/12/2010)..137 Εικόνα 7.2: Συγκεντρώσεις των αναλυτών στα εισερχόμενα λύματα του ΚΕΛ Ψυττάλειας κατά τη 2η δειγματοληψία (Κυριακή: 3/4/2011, Κυριακή: 10/4/2011) 140 Εικόνα 7.3: Μέσες συγκεντρώσεις των αναλυτών στα εισερχόμενα λύματα του ΚΕΛ Ψυττάλειας κατά την 1η και 2η δειγματοληψία

20 Εικόνα 7.4: Απομάκρυνση (%) των αναλυτών κατά την επεξεργασία υγρών αποβλήτων του ΚΕΛ Ψυττάλειας (Ά δειγματοληψία, n = 7) Εικόνα 7.5: Απομάκρυνση (%) των αναλυτών κατά την επεξεργασία υγρών αποβλήτων του ΚΕΛ Ψυττάλειας ( Β δειγματοληψία, n = 8) Εικόνα 7.6: Μέσες ημερήσιες ποσότητες των αναλυτών (g/day) που μέσω των δευτεροβάθμια επεξεργασμένων υγρώναποβλήτων του ΚΕΛ Ψυτάλλειας καταλήγουν στο υδατικό περιβάλλον..147 Εικόνα 7.7: Ημερήσια χρήση (g/day) των εξαρτησιογόνων ουσιών κατά την 1η δειγματοληψία (5/12/ /12/2010) 152 Εικόνα 7.8: Ημερήσια χρήση (g/day) των εξαρτησιογόνων ουσιών κατά τη 2η δειγματοληψία (3/4/ /4/2011)

21 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Σελίδες Πίνακας 1.1: Οι δομές, οι μοριακοί τύποι, τα μοριακά βάρη και οι φυσικοχημικές ιδιότητες των αναλυτών..28 Πίνακας 1.2: Συνήθης δόση βασικών ναρκωτικών ενώσεων.35 Πίνακας 2.1: Βιβλιογραφικές πηγές μεθόδων προσδιορισμού των αναλυτών.52 Πίνακας 6.1: Οι βέλτιστες τελικές παράμετροι του φασματόμετρου μαζών MS/MS..96 Πίνακας 6.2: Παράμετροι φασματόμετρου μαζών MS/MS και οι χρόνοι ανάσχεσης των ενώσεων μετά από την τελική επιλογή κινητής φάσηςκαι στήλης (PFP).97 Πίνακας 6.3: Βαθμιδωτή έκλουση για τις ουσίες που προσδιορίζονται με θετικό ιοντισμό Πίνακας 6.4: Βαθμιδωτή έκλουση για τις ουσίες που προσδιορίζονται με αρνητικό ιοντισμό Πίνακας 6.5: Ανταπόκριση των διαφόρων ομάδων ενώσεων (εμβαδόν κορυφής) (average area) με την αύξηση της θερμοκρασίας της στήλης 113 Πίνακας 6.6: Συγκεντρωτικός πίνακας όπου φαίνονται οι ανακτήσεις με τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις και RSD % (n=5), των πειραμάτων ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγημότιτας και τα LOD (ng/l) και LOQ (ng/l) της τελικής μεθόδου με Strata XC 118 Πίνακας 6.7: Εξίσωση ευθείας παλινδρόμησης για πρότυπα διαλύματα σε διαλύτη..120 Πίνακας 6.8: Έλεγχος ορθότητας της μεθόδου.123 Πίνακας 7.1: Παρουσία αναλυτών (σε ng/l) στα εισερχόμενα και επεξεργασμένα υγρά απόβλητα του ΚΕΛ Ψυττάλειας (Ά δειγματοληψία, n = 7).127 Πίνακας 7.2: Παρουσία αναλυτών (σε ng/l) στα εισερχόμενα και επεξεργασμένα υγρά απόβλητα του ΚΕΛ Ψυττάλειας (Β δειγματοληψία, n = 8).130 Πίνακας 7.3: Δεδομένα για τον υπολογισμό της χρήσης των εξαρτησιογόνων ουσιών από τον πληθυσμό της Αττικής των οποίων τα λύματα καταλήγουν 21

22 στο ΚΕΛ Ψυττάλειας.149 Πίνακας 7.4: Εβδομαδιαία χρήση των εξαρτησιογόνων ουσιών από τον πληθυσμό της Αττικής και αντίστοιχο ποσοστού του πληθυσμού που υπολογίζεται να κάνει χρήση (Παραδοχή: πληθυσμός άτομα) 154 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΕΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΩΝ Σχεδιάγραμμα 1.1: Σχηματική απεικόνιση της προσέγγισης υπολογισμού της κατανάλωσης από τα απόβλητα νερά, οπού BECG, benzoylecgonine 48 Σχεδιάγραμμα 5.1: Πορεία ανάλυσης κατά την ανάπτυξη της μεθόδου, με τα δύο διαφορετικά φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης

23 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα ερευνητική εργασία πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο του Διαπανεπιστημιακού Διατμηματικού Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Χημική Ανάλυση- Έλεγχος Ποιότητας» με σκοπό την ανάπτυξη και επικύρωση μιας μεθόδου προσδιορισμού 71 ψυχοτρόπων ή μη φαρμακευτικών, καθώς και παρανόμως διακινούμενων εξαρτησιογόνων ουσιών και των μεταβολιτών τους σε απόβλητα νερά με υγρoχρωματογραφία με διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS) και ιοντισμό με ηλεκτροψεκασμό (ESI) φαρμακευτικών ενώσεων σε στερεά περιβαλλοντικά δείγματα με υγρoχρωματογραφία και διαδοχική φασματομετρία μαζών. Η εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας του Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών υπό την επίβλεψη του κ. Νικόλαου Θωμαΐδη. Στα πλαίσια του ερευνητικού έργου, πραγματοποιήθηκαν δύο δειγματοληψίες το Δεκέμβριο του 2010 και τον Απρίλιο του 2011 και ελήφθησαν δείγματα υγρών αποβλήτων σε 15 διαφορετικές ημέρες από το ΚΕΛ Ψυτάλλειας. Αθήνα,

24 61

25 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΨΥΧΟΤΡΟΠΑ Ή ΜΗ ΦΑΡΜΑΚΑ, ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΝΟΜΩΣ ΔΙΑΚΙΝΟΥΜΕΝΕΣ ΕΞΑΡΤΗΣΙΟΓΟΝΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΩΝ ΤΟΥΣ ΣΕ ΑΠΟΒΛΗΤΑ 1.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Μεταξύ των περισσοτέρων πόρων που αναζήτησε ο άνθρωπος, από τους αρχαίους χρόνους ακόμα, για να ξεχάσει τον πόνο ή για να δημιουργήσει ψευδαισθήσεις και παροδικές απολαύσεις, λίγα έχουν παίξει τόσο μεγάλο ρόλο στην ιστορία της ανθρωπότητας, όσο οι αλκαλοειδής ψυχοτρόπες ουσίες και η κάνναβη. Έτσι οι ψυχοτρόπες ή εξαρτησιογόνες ουσίες είναι στενά συνδεδεμένες με την ιστορία της ανθρωπότητας, είτε σαν θεραπευτικά «βότανα» είτε σαν ουσίες μεταβολής του θυμικού. Ο Ηρόδοτος, ο πατέρας της ιστορίας αναφέρει το 450 π.χ., ότι οι Σκύθες μεθούσαν με την εισπνοή των καπνών ινδικής κάνναβης, όταν έριχναν τους σπόρους κάνναβης πάνω σε καυτές πέτρες [1,2]. Από την πρώτη είσοδο στην Ευρώπη της ινδικής κάνναβης ως θεραπευτικό φάρμακο, το 19 ο αιώνα από τον O Shaugnessy ( ) [3] μέχρι σήμερα, το προφίλ χρήσης ψυχοτρόπων και ναρκωτικών ουσιών έχει αλλάξει δραματικά. Η πρόοδος της Ιατρικής επιστήμης, ημεγάλη ανάπτυξη της χημείας και των φαρμακευτικών εταιριών, οικοινωνικές συνθήκες αλλά και τα οικονομικά συμφέροντα οδήγησαν στην εκρηκτική αύξηση του αριθμού χρήσης των ψυχοτρόπων και ναρκωτικών ουσιών. Πολλές από αυτές χρησιμοποιήθηκαν με επιτυχία στην θεραπευτική, ωστόσο εγκαταλείφθηκαν ως εξαρτησιογόνες (morphine, amphetamines, LSD). Κάποιες συνεχίζουν να χορηγούνται ως θεραπευτικές σε φαρμακευτικά σκευάσματα κατόπιν ειδικής ιατρικής συνταγής ναρκωτικών (methadone, bupronorphine, fentanyl, morphine, codeine, amphetamine) σεπεριπτώσεις ασθενείας (καρκίνος, διαβήτης, απεξάρτηση τοξικομανών, θεραπεία του αλκοολισμού, ηρεμιστικά ή αγχολυτικά) ενώ παράλληλα οι περισσότερες κατέληξαν σε ευρεία παράνομη χρήση [2,4]. Σύμφωνα με τις στατιστικές εκτιμήσεις του Ευρωπαϊκού Κέντρου Παρακολούθησης Ναρκωτικών και Τοξικομανίας (ΕΚΠΝΤ 2011), περίπου 42 εκατομμύρια Ευρωπαίοι ηλικίας ετών έχουν κάνει χρήση κάνναβης τουλάχιστον 25

26 μία φορά στη ζωή τους (επικράτηση της χρήσης σε όλη τη διάρκεια της ζωής), με την Ελλάδα να έχει χαμηλή επικράτηση της τάξης 10,8% ενώ η Τσεχική δημοκρατία να έχει την υψηλότερη επικράτηση της τάξης 45,5%. Όσο αφορά την χρήση κοκαΐνης, 8 εκατομμύρια Ευρωπαίοι ηλικίας ετών έχουν κάνει χρήση τουλάχιστον μία φορά στη ζωή τους (Ελλάδα 1,0%, Ισπανία, Ηνωμένο Βασίλειο 13,4%), 7,5 εκατομμύρια έχουν κάνει χρήση έκστασης (Ελλάδα 0,6%, Ηνωμένο Βασίλειο 12,7%) και 6,5 εκατομμύρια έχουν κάνει χρήση αμφεταμινών τουλάχιστον μία φορά στη ζωή τους (Ελλάδα 0,2%, Ηνωμένο Βασίλειο 14,3%) [5]. Η χρήση των ψυχοτρόπων ή μη φαρμάκων, καθώς και των παρανόμως διακινούμενων εξαρτησιογόνων ουσιών, σε παγκόσμιο επίπεδο είναι ένα γεγονός που αποτελεί ένα μόνιμο μεγάλο κοινωνικό και υγειονομικό πρόβλημα. Τα τελευταία ωστόσο χρόνια διάφορες κατηγορίες ενώσεων των ουσιών αυτών όπως οπιούχα και οπιοειδή, διεγερτικά, ηρεμιστικά, παραισθησιογόνα, βαρβιτουρικά, αντιψυχωσικά, αναισθητικά, και αντικαταθλιπτικά, έχουν αποτελέσει ομάδες αναδυόμενων ρύπων προτεραιότητας, εξαιτίας της εμφάνισής τους στο υδάτινο περιβάλλον και των δυνητικών επιπτώσεων που μπορεί να έχουν σε αυτό [6,7]. Οι ενώσεις αυτές καθώς και οι μεταβολίτες τους, διαμέσου των ανθρωπίνων εκκριμάτων εισέρχονται στα αποχετευτικά συστήματα, στους σταθμούς επεξεργασίας λυμάτων και τελικά καταλήγουν σε επιφανειακά, υπόγεια και θαλάσσια νερά. Αυτό συμβαίνει όπως αποδεικνύετε, λόγω της μη πλήρους απομάκρυνσής τους μέσω των Μονάδων Επεξεργασίας Υγρών Αστικών Αποβλήτων. Συμπερασματικά η παρακολούθησή τους στα εισερχόμενα και εξερχόμενα υγρά απόβλητα είναι αναγκαία ώστε να μελετηθεί η παρουσία τους, η συμπεριφορά τους και η τύχη τους στο περιβάλλον [7-9]. Όπως θα δούμε και παρακάτω ο κύκλος αυτός μεταφορας των ουσιών αυτών στο περιβάλλον είναι ακόμα πιο περίπλοκος. Παράλληλα με το περιβαλλοντικό ενδιαφέρον, έχουμε και την εισαγωγή της έννοιας «επιδημιολογία αποβλήτων» (sewage epidemiology). Κατά την έννοια αυτή μπορεί να εκτιμηθεί η ποσότητα των ναρκωτικών ουσιών που χρησιμοποιούνται σε μια κοινωνία με μετρήσεις των μεταβολιτών τους που απομακρύνονται με τα ούρα στα απόβλητα νερά (εισερχόμενα) και στη συνέχεια με υπολογισμούς να βρεθεί η κατανάλωση. Την ιδέα της έννοιας αυτής την έθεσε το 2001 o καθηγητής Daughton [10] ενώ το 2005 ο Zuccato την υλοποίησε με την ομάδα του στην Ιταλία και στην Ελβετία, εκτιμώντας την κατανάλωση της κοκαΐνης από της συγκεντρώσεις του βασικού μεταβολίτη του BECG, 26

27 σε εισερχόμενα υγρά αστικά απόβλητα [11]. Επίσημα η ορολογία «επιδημιολογία αποβλήτων» (sewage epidemiology) χρησιμοποιήθηκε το 2008 πάλι από τον Zuccato και την ομάδα του [12]. Παρακάτω στο κεφάλαιο αυτό θα γνωρίσουμε τις ενώσεις οι οποίες θα μας απασχολήσουν, ποιές είναι οι δομές και οι ιδιότητες τους, πως καταλήγουνστο περιβάλλον, ποιές είναι οι ποσότητες που τα συναντάμε συνήθως στο περιβάλλον, ποιες οι διαφορές τους από τις λοιπές οργανικές ενώσεις ως περιβαλλοντικά κατάλοιπα, ποιοι οι κίνδυνοι που προκαλούν στο περιβάλλον και ποιες οι μελλοντικές προβλέψεις. 1.2 Ψυχοτρόπα ή μη φάρμακα, καθώς και παρανόμως διακινούμενες εξαρτησιογόνες ουσίες και οι μεταβολίτες τους Με τον όρο «ναρκωτικά» αναφερόμαστε σε μια σειρά ουσιών,τεχνητών ή φυσικών, απαγορευμένων ή ελεγχόμενων, με ποικίλη χημική δομή και διαφορετική δράση (διεγερτική, κατασταλτική, παραισθησιογόνο κ.α) στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα, αλλά με μία κοινή ιδιότητα την μεταβολή του θυμικού και την πρόκληση ψυχικής ή και σωματικής εξάρτησης. Η Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας (WHO), κατανοώντας ότι ο όρος «ναρκωτικά» δεν είναι πλέον δόκιμός γιατί σε αυτόν κατατάσσονται και ουσίες που δεν χαρακτηρίζονται από ναρκωτική δράση, υιοθέτησε τον ορθότερο όρο «φάρμακα που προκαλούν εξάρτηση» Από την άλλη ο όρος «ψυχοτρόπες ουσίες» χρησιμοποιείται εναλλακτικά με τον όρο ναρκωτικά. Είναι όρος ευρύτερος και κοινωνικά ηπιότερος (περιλαμβάνει το τσιγάρο, το αλκοόλ και τα ήπια ηρεμιστικά σκευάσματα). Με βάση την φαρμακολογική τους δράση οι εξαρτησιογόνες ουσίες διακρίνονται σε: I. Διεγερτικά του ΚΝΣ (κοκαΐνη, αμφεταμίνες κ.λ.π) II. Κατασταλτικά του ΚΝΣ (υπνωτικά, ηρεμιστικά ή αγχολυτικά) III. Ψευδαισθησιογόνα ή παραισθησιογόνα ή ψυχομιμητικά (κάνναβη, LSD κ.λ.π) IV. Οπιούχα και οπιοειδή (κατεξοχήν ναρκωτικές ουσίες) V. Πτητικές ουσίες (διαλύτες και ατμοί τους) (εκτός της παρούσας εργασίας) [2] Οι οργανικές ενώσεις γενικά που συναντάμε στις υδατικές μήτρες ποικίλουν σημαντικά. Μπορεί να διαφέρουν στο μοριακό τους μέγεθος, στην πολικότητα, στην διαλυτότητα και στον όξινο / βασικό χαρακτήρα. Με βάση τα παραπάνω οι οργανικές 27

28 ενώσεις μπορούν να διαχωριστούν σε δυο βασικές κατηγορίες βάση της διαλυτότητας: σε υδρόφοβες (μη πολικές και λιγότερο διαλυτές) και σε υδρόφιλες (πολικές και περισσότερο διαλυτές). Οι δυο αυτές κατηγορίες μπορούν περεταίρω να διαχωριστούν σε τρις (3) τύπους ουδέτερες, όξινες και βασικές. Η διαλυτότητα στο νερό των ενώσεων μπορεί να εκφραστεί με την τιμή logkow της ένωσης. Αυτή είναι μια παράμετρος που αντικατοπτρίζειτον λόγο μεταξύ της διαλυτότητας σε διαλύτη οκτανόλης και νερού. Όταν το logkow είναι (=5) αυτό σημαίνει ότι η ένωση είναι φορές πιο διαλυτή στην οκτανόλη παρά στο νερό. Όταν το logkow είναι (= -3) τότε είναι 1000 φορές πιο διαλυτή στο νερό παρά στην οκτανόλη. Οι υδρόφιλές ενώσεις έχουν logkowκάτω από μηδέν, ενώ οι υδρόφοβες πάνω από μηδέν (γενικά πολικές: logkow<1, μεσαίας πολικότητας: logkow=1-3, μη πολικές: logkow>3). Η παράμετρος pka εκφράζει την ισχύς ενός οξέος. Τα ισχυρότερα οξέα έχουν χαμηλές τιμές pka, ενώ τα ασθενέστερα οξέα έχουν υψηλότερες τιμές pka (άρα ισχυρότερες βάσεις, οι συζυγείς τους βάσεις) [13]. Στον πίνακα 1.1 φαίνονται όλες οι ενώσεις που θα μελετήσουμε ανά κατηγορία και οι φυσικοχημικές τους ιδιότητες (pka και logkow). Η γνώση αυτών των παραμέτρων στις ενώσεις μας είναι πολύ σημαντική τόσο για την μελέτη απομόνωσης και προσδιορισμού αυτών με την κατάλληλη αναλυτική μέθοδο και τεχνική όσο και για την μελέτη απομάκρυνσης τους από τα ύδατα κατά την επεξεργασία των αποβλήτων. Οι ενώσεις για παράδειγμα που είναι πολύ διαλυτές (υδρόφιλες) στο νερό είναι δύσκολο να απομακρυνθούν από αυτό και πολύ εύκολο να σχηματιστούν κατά την φυσική αποδόμηση στο νερό, από πρόδρομες ενώσεις, επιπλέον έχει αποδειχθεί ότι οι υδρόφιλες ενώσεις στο νερό μπορεί να αποτελέσουν δυνητικό γονιδιοτοξικό κίνδυνο προκαλώντας μεταλλάξεις [13]. Στον πίνακα 1.2 φαίνεται η συνήθης μέση δόση για την κάθε ουσία. Πίνακας 1.1: Οι δομές, οι μοριακοί τύποι, τα μοριακά βάρη και οι φυσικοχημικέςιδιότητες των αναλυτών Α/Α Κατηγορία Ενώσεων CAS Αριθμός Ένωση Χημική Δομή Μοριακός Τύπος Μοριακό Βάρος (g/mol) pka [14,15,16] logkow [14] 1 Οπιούχα και Οπιοειδή Morphine (MOR) C 17H 19NO 3 285,34 8,0,9,9 a / (13,5, 9,5, 8,3) b 0,87 28

29 2 3 Heroin (HER) C 21H 23NO 5 369,41 7,6/(7,9) 1, MAM C 19H 21NO 4 327,37-0, Methadone (METH) C 21H 27NO 309,45 8,94/(9,1) 3, EDDP C 20H 23N 277,41 (8,4) 5, Codeine (COD) C 18H 21NO 3 299,36 8,2/(13,4, 8,2) 1, Oxycodone (OC) C 18H 21NO 4 315,36 8,9/(13,1, 7,6) 1, Buprenorphine (BN) C 29H 41NO 4 467,64 8,5, 10,0/ (9,5, 8,3) 2, Cocaine (COC) C 17H 21NO 4 303,15 8,6/(8,9) 3,08 10 Κοκαΐνη και μεταβολίτες Benzoylecgonine (BECG) C 16H 19NO 4 289,33 11,8/(10,8, 3,3) 2, Ecgonine methylester (EME) C 10H 17NO 3 199,25 9,16-0,23 29

30 MDMA C 11H 15NO 2 193,24 9,4/(10,3) 2, MDEA C 12H 17NO 2 207,27 (10,3) 2,56 14 Αμφεταμίνες MDA C 10H 13NO 2 179,22 9,67/(9,9) 1, Methamphetamine (MA) C 10H 15N 149,23 10,1/(10,4) 2, Amphetamine C 9H 13N 135,21 10,1/(9,9) 1, Δ9-THC C 21H 30O 2 314,46 10,6 6,84 18 Κανναβινοειδή nor-Δ9-THC acid C 21H 28O 4 344,44 4,7 5, Cannabidiol C 21H 30O 2 314,47 10,83 6, LSD C 20H 25N 3O 323,43 7,5/(7,4) 2,71 LSD και μεταβολίτης 21-2-oxo-3-hydroxy-LSD C 20H 25N 3O 3 355,43 (11,7, 6,8) Alprazolam C 17H 13ClN 4 308,76 8,2 1,92 23 Βενζοδιαζεπίνες Bromazepam C 14H 10BrN 3O 316,15 2,5, 5,2, 11,8 2, Chlordiazepoxide C 16H 14ClN 3O 299,75 4,8/ (8,6, 6,5) 2,16 30

31 Clobazam C 16H 13ClN 2O 2 300,74 1,6 1, Diazepam C 16H 13ClN 2O 284,74 3,3 2, Nordiazepam C 15H 11ClN 2O 270,71 12,0,3,5/(11,7, 3,2) 2, Flunitrazepam C 16H 12FN 3O 3 313,28 1,71 2, amineflunitrazepam C 16H 14FN 3O 283,30-0, Lorazepam C 15H 10Cl 2N 2O 2 321,16 1,3, 11,5 3, Nitrazepam C 15H 11N 3O 3 281,30 3,2,10,8/(11,4, 2,6) 2, Midazolam C 18H 13ClFN 3 325,77 6,15,1,7 3, Oxazepam C 15H 11ClN 2O 2 286,71 11,6, 1,7/(12,8, 10,9, 1,2) 2, Temazepam C 16H 13ClN 2O 2 300,74 1,6/(11,7,1,6) 2,19 31

32 Phenobarbital C 12H 12N 2O 3 232,24 7,48 1,14±0.64 Βαρβιτουρικά Pentobarbital C 11H 18N 2O 3 226,27 7,94 2, Chlorpromazine C 17H 19ClN 2S 318,86 9,32 5, Clozapine C 18H 19ClN 4 326,82 3,58, 7,94 3,94 39 Αντιψυχωσικά Norclozapine (Desmethylclozapine) C 17H 17ClN 4 312,80-1, Olanzapine C 17H 20N 4S 312,43 5,0, 7,4 3, Risperidone C 23H 27FN 4O 2 410,48 8,3 2, OH-Risperidone C 23H 27FN 4O 3 426,48-1, Lidocaine C 14H 22N 2O 234,34 7,96 2,20 44 Αναισθητικά και μεταβολίτες Fentanyl C 22H 28N 2O 336,47 8,99/(8,9, 0,3) 3, Norfentanyl C 14H 20N 2O 232,32 (9.8, 0.3)

33 Thiopental C 11H 18N 2O 2S 242,34 7,4/(10,72) 3, Ketamine C 13H 16ClNO 237,73 7,5/(6,5) 3, Norketamine C 12H 14ClNO 223,7 6,7 2, Carbamazepine C 15H 12N 2O 236,27 4,17,12,49 1, Lamotrigine C 9H 7Cl 2N 5 256,09 5,7/(19,22) 1, Topiramate C 12H 21NO 8S 339,37 8,66 2,97±0,90 52 Αντιεπιληπτικά Levetiracetam C 8H 14N 2O 2 170,21 <-2-0, Phenytoin C 15H 12N 2O 2 252,27 8,33 1, Primidone C 12H 14N 2O 2 218,26 11,6 0, Valproic acid C 8H 16O 2 144,21 4,6 2, Τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά (TCAs) Amitriptyline C 20H 23N 277,40 9,4 4, Nortriptyline C 19H 21N 263,4 10,1 3,97 33

34 58 1 Clomipramine C 19H 23ClN 2 314,85 9,38 4, Imipramine C 19H 24N 2 280,41 9,62 4, Doxepine C 19H 21NO 279,38 8,0 3,86 61 Τετρακυκλικά Mirtazapine C 17H 19N 3 265,35 7,1 0,88 αντικαταθλιπτικά και 62 μεταβολίτης (TeCAs) OH mirtazapine C 17H 19N 3O 281,36-2, Citalopram C 20H 21FN 2O 324,39 9,38 3, Fluoxetine C 17H 18F 3NO 309,33 (10,1) 3,93 65 Αναστολείς Επαναπρόσληψης Σεροτονίνης Paroxetine C 19H 20FNO 3 329,37 9,51 3,70 (SSRIs) Sertraline C 17H 17Cl 2N 306,23 9,48 5, Norsertraline (Desmethylsertraline) C 16H 15Cl 2N 292,20-4,89 34

35 Αναστολείς 68 Επαναπρόσληψης Σεροτονίνης- Νορεπινεφρίνης Venlafaxine C 17H 27NO 2 277,40 (9,3) 2,48 (SNRIs) 69 Υπνωτικό 80-2 Zopiclone C 17H 17ClN 6O 3 388,81 1,5,6,8,6,76 2, Ephedrine C 10H 15NO 165,23 9,6/(9,5) 1,08 71 Συμπαθητικομιμητικά Norephedrine C 9H 13NO 151,21 (12,1,8,5) 0,36 a, πειραματικά υπολογισμένο pka, b, υπολογιστικά προβλεπόμενο pka, c, βάση δομής των ενώσεων από ACD/labs, ACD/PhysChemSuite Πίνακας 1.2: Συνήθης δόση βασικών ναρκωτικών ενώσεων [6] Ένωση Μέση Δόση COC mg THC 5-20 mg HEROIN 30 mg MA mg AMP mg MDA mg MDMA mg MDEA mg Μηχανισμοί βιομετατροπής ψυχοτρόπων ή μη φαρμάκων Ο όρος βιομετατροπή χρησιμοποιείται γιατι θεωρείται προτιμότερος του όρου μεταβολισμός που είναι άρρηκτα συνδεδεμένος με τις βιοχημικές φυσιολογικές πορείες 35

36 που παρέχουν ενέργεια στα κύτταρα. Η βιομετατροπή λοιπόν αναφέρεται σε όλες εκείνες τις χημικές μετατροπές που επιτελεί ο οργανισμός στο χορηγούμενο φάρμακο. Οι ουσίες του φυσικού περιβάλλοντος του ανθρώπου, που είναι ξένες προς τον ενδιάμεσο μεταβολισμό ( ξενοβιοτικά ), οδήγησαν στην προοδευτική ανάπτυξη πολύπλοκων ενζυμικών συστημάτων για την απομάκρυνσή τους από τον οργανισμό. Σε αυτήν την κατηγορία ουσιών υπάγονται και τα φάρμακα, επειδή ακριβώς δεν ενσωματώνονται στον μεταβολισμό του κυττάρου για την παραγωγή ενέργειας. Το ήπαρ κατέχει κεντρική θέση στη βιομετατροπή (μεταβολισμό) των φαρμάκων. Μία ξενοβιοτική ουσία μπορεί επίσης να βιομετατραπεί και σε άλλους ιστούς, όπως π.χ. ο εντερικός βλεννογόνος (βακτηριακή βιομετατροπή). Η βιομετατροπή των ξενοβιοτικών οδηγεί κατά κανόνα σε περισσότερο υδατοδιαλυτά παράγωγα, από την προσθήκη ιονιζόμενων ομάδων στο μόριο του μητρικού φαρμάκου. Το προϊόν της βιομετατροπής μπορεί να είναι ένα ή και περισσότερα και χαρακτηρίζεται ως μεταβολίτης. Οι μεταβολίτες είναι σχεδόν πάντα περισσότερο πολικοί από τo μητρικό φάρμακο και απεκκρίνονται ευκολότερα. Οι μεταβολίτες που προκύπτουν από τη βιομετατροπή των φαρμάκων μπορεί να είναι φαρμακολογικά αδρανείς ή δραστικοί. Υπάρχει το ενδεχόμενο μία ουσία να είναι αδρανής όταν χορηγείται και να ενεργοποιείται μέσα στον οργανισμό από τα ένζυμα βιομετατροπής ( προφάρμακο ). Οι αντιδράσεις βιομετατροπής των ξενοβιοτικών διακρίνονται σε αντιδράσεις φάσης Ι και σε αντιδράσεις φάσης ΙΙ : 1. αντιδράσεις φάσης Ι (οξειδώσεις, αναγωγές και υδρολύσεις) 2. αντιδράσεις φάσης ΙΙ (συζεύξεις) Το ηπατικό μικροσωμικό ενζυμικό σύστημα, που βρίσκεται στο άκοκκο ενδοπλασματικό δίκτυο των ηπατικών παρεγχυματικών κυττάρων, είναι υπεύθυνο για το μεγαλύτερο αριθμό βιομετατροπών. Το κυριότερο συστατικό του μικροσωμικού κλάσματος είναι η αιμοπρωτεϊνη (ή ομάδα αιμοπρωτεϊνών) γνωστή ως κυτόχρωμα Ρ450. Οι αντιδράσεις της πρώτης φάσης περιλαμβάνουν οξειδώσεις και αναγωγές, που αποδίδονται στη δράση μικροσωμικών ενζύμων, καθώς και οξειδώσεις και υδρολύσεις που δεν καταλύονται από μικροσωμικά ένζυμα. Υπάρχουν φάρμακα που δεν μεταβολίζονται καθόλου από αυτές τις αντιδράσεις και εισέρχονται κατ ευθείαν στη δεύτερη μεταβολική φάση. Άλλωστε, ορισμένα φάρμακα αποβάλλονται αναλλοίωτα από τον οργανισμό. Το κοινό χαρακτηριστικό των αντιδράσεων φάσης Ι είναι ότι 36

37 δημιουργούν ή «ξεσκεπάζουν» μια χαρακτηριστική ομάδα στο μόριο του φαρμάκου που συχνά εμπειρικά καλείται «λαβή» (handle). Στις περισσότερες περιπτώσεις η βιομετατροπή ολοκληρώνεται με την αντίδραση της δεύτερης φάσης όπου η λαβή του μεταβολίτη συζεύγνυται με μία ενδογενή ουσία. Οι αντιδράσεις της πρώτης φάσης, πιο αναλυτικά περιλαμβάνουν: 1. Αντιδράσεις οξείδωσης. Η μικροσωμιακή οξείδωση απαιτεί την παρουσία NADP, οξυγόνου, καθώς και του κυτοχρώματος P-450. Οι αντιδράσεις που καταλύονται είναι ποικίλες και περιλαμβάνουν υδροξυλίωση αρωματικού δακτυλίου (phenytoin) ή αλειφατικής αλυσίδας (pentobarbital), Ν- (imipramine), Ο- (codeine) και S-απαλκυλίωση. Στην ίδια ομάδα ανήκουν επίσης ο σχηματισμός αζω-οξειδίων και άζω-υδροξυλίων, ο σχηματισμός σουλφοξειδίων, η οξειδωτική απαμίνωση (amphetamine) η οξειδωτική αποσουλφούρωση, κ.λ.π. Σε πολλούς ιστούς, επιτελείται επίσης μη μικροσωμιακή οξείδωση, από την αλκοολική αφυδρογονάση ή την αλδεϋδική αφυδρογονάση που είναι κυτταροπλασματικά ένζυμα. 2. Αντιδράσεις αναγωγής. εν αποτελεί πολύ συχνό τρόπο μεταβολισμού ξένοβιοτικών ουσιών. Περιλαμβάνει την νιτρο-αναγωγή, την αζω-αναγωγή και την αναγωγή με τη δράση του ενζύμου αλκοολική αφυδρογονάση. 3. Αντιδράσεις υδρόλυσης. Αφορά μόνο στα φάρμακα που περιέχουν στο μόριό τους εστερικό ή αμιδικό δεσμό. Όταν ένας εστέρας υδρολύεται από μία εστεράση, τα προϊόντα διάσπασης είναι αλκοόλη και οξύ. Όταν ένα αμίδιο διασπάται από μία αμιδάση, προκύπτουν αμίνη και οξύ. Το ακετυλοσαλικυλικό οξύ (ασπιρίνη) αποτελεί τέτοιο παράδειγμα εστέρα, και η προκαϊναμίδη παράδειγμα αμιδίου. Όσον αφορά την δεύτερη φάση της βιομετατροπής των φαρμάκων, περιλαμβάνει τις αντιδράσεις εκείνες που οδηγούν στην προσθήκη κάποιου ενδογενούς υδατοδιαλυτού μορίου (συζεύξεις). Οι αντιδράσεις σύζευξης καθιστούν το μητρικό φάρμακο ή το μεταβολίτη που προέκυψε από τις αντιδράσεις φάσης Ι περισσότερο υδατοδιαλυτό, ώστε να επιτευχθεί η απομάκρυνσή του από τον οργανισμό. Στις αντιδράσεις σύζευξης υπάγεται η σύζευξη με γλυκουρονικό οξύ (π.χ. morphine), θειικό οξύ, αμινοξέα, 37

38 γλουταθειόνη, ακετυλομάδα και μεθυλομάδα. Η σύζευξη γίνεται σε μόρια που περιέχουν ομάδα υδροξυλίου, καρβοξυλίου, πρωτοταγή ή δευτεροταγή αμινομάδα και σουλφυδρύλιο. Φάρμακα που περιέχουν μία ή περισσότερες από αυτές τις ομάδες μπορούν να εισέλθουν κατ ευθείαν στη δεύτερη μεταβολική φάση, χωρίς να προηγηθεί η πρώτη. Τέλος κάποιοι παράγοντες που επηρεάζουν την βιομετατροπή και τον ρυθμό της είναι: Η δόση και η συχνότητα χορήγησης του φαρμάκου εμπεριέχουν τη δυνητική πρόκληση κορεσμού των μεταβολικών οδών, οι ατομικοί παράγοντες (γενετικοί, ασθένειες, ηλικία, φύλο κ.α.) και οι περιβαλλοντικοί παράγοντες (ποιότητα τροφής και διατροφικές συνήθειες του ατόμου, επιβάρυνση του οργανισμού με συγχορηγούμενες ξενοβιοτικέςουσίες, μεταβολή του ρυθμού βιομετατροπής λόγω αναστολής ή επαγωγής των κυριότερων ενζύμων, λόγω αλληλεπιδράσεων με συγχορηγούμενα φάρμακα ή άλλες ουσίες [17] Οπιούχες και οπιοειδείς ενώσεις Οι οπιούχες και οι οπιοειδής ενώσεις είναι κατ εξοχήν ναρκωτικές ουσίες. Τα "οπιούχα" προέρχονται από το όπιο και διακρίνονται σε φυσικά (μορφίνη, κωδεΐνη, παπαβερίνη, θηβαΐνη κ.α) και σε ημισυνθετικά (ηρωίνη, διυδρομορφινόνη). Το όπιο προέρχεται από το φυτό μήκονα η υπνοφόρος (Papaver somniferum) που είναι ενδημικό φυτό της Δ. Ασίας και ΝΑ Ευρώπης. Από την χάραξη της άωρης κωδειάς του καρπού εξέρχεται γαλακτόχρωμος πηχτός χυμός (οπός) που μετά την αποξήρανση και μετατροπή σε σκόνη αποτελεί το όπιο [2,18]. Το όπιο περιέχει πάνω από 20 ενεργές αλκαλοειδείς ενώσεις, που διακρίνονται σε παράγωγα φαινανθρένιου και βενζυλισοκινολίνης, από τις οποίες η μορφίνη (παράγωγο φαινανθένιου) είναι η πιο ισχυρή και ήταν η πρώτη που απομονώθηκε το 1806 [2,6]. Τα "οπιοειδή" είναι μια γενικότερη κατηγορία ναρκωτικών ουσιών στην οποία περιλαμβάνονται τα "οπιούχα", αλλά και συνθετικές ουσίες που παρουσιάζουν φυσιολογική δράση ανάλογη με εκείνη των οπιούχων και χαρακτηρίζονται ως ναρκωτικά αναλγητικά (μεθαδόνη, πενταζοκίνη, διφαινοξυλάτη, φαιντανύλη, πεθιδίνη, κ.α.) [18]. Τα οπιοειδή μπορούν να κατηγοριοποιηθούν με βάση την δομική ομοιότητα με την μορφίνη, σε ημισυνθετικά και συνθετικά παράγωγα, τα συνθετικά παράγωγα ορισμένες φορές δεν έχουν ομοιότητες στην δομή με την μορφίνη. Η ηρωίνη, είναι η πλέον διαδεδομένη εξαρτησιογόνος ουσία, συντίθεται από την μορφίνη με την αντικατάσταση 38

39 των δύο υδροξυλικών ομάδων με ακετύλια (CH 3 COO-). Η κωδεΐνη, βρίσκεται και αυτή στο φυτό μηκών την υπνοφόρο (Papaversomniferum), αλλά για εμπορικούς λόγους παρασκευάζεται από την 3-Ο- μεθυλίωση της μορφίνης, η οποία είναι πιο διαδεδομένη στην φύση. Η μεθαδόνη τέλος είναι μια συνθετικήουσίακαι χορηγείται για θεραπεία υποκατάστασης από τα οπιούχα και κυρίως την ηρωίνη. Η θεραπεία αυτή μειώνει τις διακυμάνσεις της διέγερσης του υποδοχέα οπιούχων, επιτρέπει την εξάλειψη της χρήσης βελόνας, μειώνει τα συμπτώματα απόσυρσης και έτσι μειώνει την πιθανότητα υποτροπής [2,6]. Στις εικόνες 1.1,1.2 και 1.3 παρακάτω φαίνονται πως μεταβολίζονται οι οπιοειδής και οπιούχες ενώσεις στον άνθρωπο. Εικόνα 1.1: Μεταβολική οδός της κωδεΐνης στο ήπαρ και στα νεφρά [19] Εικόνα 1.2: Μεταβολισμός της ηρωίνης στον άνθρωπο [6] Εικόνα 1.3: Μεταβολισμός της μεθαδόνης στον άνθρωπο [6] 39

40 1.2.3 Διεγερτικά του ΚΝΣ (κοκαΐνη, αμφεταμίνες, συμπαθομιμητικά) Τα πιο διαδεδομένα διεγερτικά που χρησιμοποιούνται είναι: η αμφεταμίνη, η κοκαΐνη, το σκεύασμα «έκσταση» (MDMA) και η εφεδρίνη. Τα διεγερτικά είναι ικανά να βελτιώσουν τη διάθεση και τη διέγερση, να εξαλείψουν ή να μειώσουν το αίσθημα της κόπωσης και να βελτιώσουν τη φυσική απόδοση.η κοκαΐνη είναι ένα αλκαλοειδές που λαμβάνεται με εκχύλιση των φύλλων του φυτού Erythroxyloncoca, που ευδοκιμεί στην περιοχή των Άνδεων, Μεξικό και Ινδονησία. Η κοκαΐνη υδρολύεται στο συκώτι σε βενζοϋλεκγονίνη (BECG, benzoylecgonine) και σε μεθυλεστέρα εκγονίνης (ΕΜΕ). Στα ούρα η βενζοϋλεκγονίνη και ο μεθυλεστέρας εκγονίνηςαποτελούν αντίστοιχα το 45% και 40% της διαχειριζόμενης δόσης [2, 6, 15]. Η ομάδα των αμφεταμινών περιλαμβάνει τις μεθαμφεταμίνες και αμφεταμίνες και τις υποκατεστημένες αμφεταμίνες (ομάδα «έκστασης») 3,4-Μεθυλενοδιοξυαμφεταμίνη, 3,4-Μεθυλενοδιοξυμεθαμφεταμίνη, 3,4-Μεθυλενοδιοξυαιθυλαμφεταμίνη (MDA, MDMA, MDEA). Η αμφεταμίνη συνήθως χορηγείται ολικά είτε ως το δεξιόστροφο ισομερές είτε ως ρακεμικό μίγμα, ωστόσο η δεξτροαμφεταμίνη είναι αυτή που έχει χρησιμοποιηθεί περισσότερο στην φαρμακοβιομηχανία αφού έχει φαρμακευτική δράση. Η αμφεταμίνη συνήθως απομακρύνεται χωρίς να μεταβολίζεται (30 74 % της δόσης), το ποσοστό απέκκρισης στα ούρα θα εξαρτηθεί από το ph και τον όγκο τον ούρων, ενώ το μεγαλύτερο ποσοστό που δεν έχει υποστεί μεταβολισμό απεκκρίνεται σε όξινα ούρα. Η μεθαμφεταμίνη είναι Ν-μέθυλοπαράγωγο της αμφεταμίνης και είναι διαθέσιμη σε διαφορες μορφές (καπνίζεται, εισπνέεται, εγχέεται). Όσο αφορά τις υποκατεστημένες αμφεταμίνες (MDA, MDMA, MDEA) μπορούν να προκαλέσουν εξαρτησιογόνο δράση σε σχετικά μικρές δόσεις με αποτέλεσμα να έχουν γίνει ιδιαίτερα δημοφιλείς σε Ευρώπη και Αμερική [2,6,15]. Η Εφεδρίνη είναι μια συμπαθομιμητική αμίνη που χρησιμοποιείται συνήθως ως διεγερτικό, κατασταλτικό της όρεξης και βοηθά στησυγκέντρωση. Είναι παρόμοια σε δομή προς τα (ημι-συνθετικά) παράγωγα αμφεταμίνης και μεθαμφεταμίνης [15]. Η κοκαΐνη είναι διεγερτική του Κ.Ν.Σ. και δημιουργεί ευφορία. Οι αμφεταμίνες (αμφεταμίνη και μεθαμφεταμίνη) ενισχύουν την αντοχή στην κόπωση επιτρέποντας τη διατήρηση της προσοχής κατά τη διάρκεια παρατεταμένων χρονικών περιόδων. [15]. 40

41 1.2.4 Ψευδαισθησιογόνα ή παραισθησιογόνα (LSD, ινδική κάνναβη) Ένα από τα χαρκτηριστικά της ψύχωσης είναι οι διαταραχές της αντίληψης με ψευδαισθήσεις και παραισθήσεις. Ψευδαίσθηση είναι όταν υπάρχει η αίσθηση χωρίς κάποιο ερέθισμα (π.χ. ακούω κάτι χωρίς να υπάρχει ήχος), ενώ παραίσθηση είναι όταν υπάρχει το ερέθισμα αλλά η αίσθηση είναι παραποιημένη (π.χ. ακούω παραποιημένο ήχο) [17]. Τα κανναβινοειδή είναι μια ομάδα φυσικών ουσιών που ανευρίσκονται στο φυτό Ινδικής κάνναβης καθώς επίσης και τα συνθετικά του ανάλογα ή οι μεταβολίτες τους. Η ινδική κάνναβης περιλαμβάνει περισσότερα από 420 χημικά συστατικά, το κύριο όμως ψυχοδραστικό συστατικό της, που είναι υπεύθυνο για την εκδήλωση ψυχικών μεταβολών παρόμοιων με αυτές που παρουσιάζονται στην ψυχωσική συμπεριφορά είναι η Δ9-tetrahydrocannabinol (TΗC) η οποία μεταβολίζεται σε Δ9- tetrahydrocannabinol carboxylic acid (THCA). Τα κανναβινοειδή χρησιμοποιούνται κυρίως σε μορφή χασίς, χασισέλαιου (πολύ ισχυρό) ή μαριχουάνας. Η εισπνοή των κανναβινοειδών προκαλεί σχεδόν άμεση επίδραση στο κεντρικό νευρικό σύστημα [2]. Το LSD (διαιθυλαμίδιο του λυσεργικού οξέος) προκαλεί σε δόση μόλις 75 μg, το μεγαλύτερο εύρος συμπτωμάτων από όλα τα ψυχεδελικά φάρμακα. Κύριο σύμπτωμα είναι οι διαταραχές της αντίληψης (χρόνου, χώρου (απόστασης και προοπτικής) και χρώματος [ΧΧΧ]) [20] Βενζοδιαζεπίνες Οι βενζοδιαζεπίνες δρουν στο ΚΝΣ και η χορήγησή τους προκαλεί αγχόλυση, καταστολή, ύπνο, κατατονία και σπάνια θάνατο σε μεγάλες δόσεις [2]. Αντικατέστησαν τα βαρβιτουρικά επειδή είναι ελάχιστα τοξικές και η εξάρτηση που προκαλούν είναι σπανιότερη και ηπιότερη. Λόγω της αποτελεσματικότητας και ασφάλειάς τους, αλλά και της μεγάλης συχνότητας του άγχους και της αϋπνίας στον πληθυσμό, οι βενζοδιαζεπίνες έχουν ευρύτατη χρήση [21]. Τα εμπορικά ονόματα που συναντάμε συνήθως είναι Valium (Diazepam), Lexotanil (Bromazepam), Librium (Chlordiazeproxide), Xanax (Alprazolam), Ativan (Lorazepam) [15]. 41

42 1.2.6 Βαρβιτουρικά Το βαρβιτουρικό οξύ παρασκευάστηκε από τον Αδόλφο φον Μπάγιερ και προκύπτει από την αντίδραση της ουρίας με το μηλονικό οξύ και είναι φαρμακολογικά αδρανές. Τα παράγωγα προκύπτουν από αντικατάσταση των Η του δακτυλίου στη θέση 5 ή του Ο στη θέση 2. Η ελαφριά δηλητηρίαση μοιάζει με μέθη ενώ η σοβαρή δηλητηρίαση χαρακτηρίζεται από βαθύ κώμα και κόρες που αντιδρούν στα φωτεινά ερεθίσματα, πτώση πίεσης και θερμοκρασίας, ενώ θάνατος επέρχεται λόγω καταστολής αναπνευστικού [2,21] Αντικαταθλιπτικά Tα αντικαταθλιπτικά φάρμακα περιλαμβάνουν κυρίως τα τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά (amitriptyline, nortriptyline, imipramine, clomipramine, doxepine), τα τετρακυκλικά αντικαταθλιπτικά (mirtazapine), τους αναστολείς της μονοαμινοξειδάσης (MAO), τους εκλεκτικούς αναστολείς της επαναπρόσληψης σεροτονίνης (SSRIs) (fluoxetine, citalopram, paroxetine), τους αναστολείς της επαναπρόσληψης σεροτονίνης και νοραδρεναλίνης (SNRIs) (venlafaxine) και άλλα [21] Αντιψυχωσικά, αντιεπιληπτικά και αναισθητικά Τα αντιψυχωσικά ονομάζονται αλλιώς και μείζονα ηρεμιστικά και περιλαμβάνουν τα κλασικά αντιψυχωσικά ή νευροληπτικά και τα άτυπα αντιψυχωσικά.στην πρώτη κατηγορία ανήκουν κυρίως τα παράγωγα της φαινοθειαζίνης (αλειφατικά, πιπεριδινικά, πιπεραζινικά), της βουτυροφαινόνης και του θειοξανθενίου. Στη δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνεται η clozapine και τα νεώτερα αντιψυχωσικά olanzapine και couetiapine. Η risperidone έχει χαρακτηριστικά και των δύο κατηγοριών. Η κυριότερη ένδειξη είναι η σχιζοφρενική ψύχωση [21]. Τα αντιεπιληπτικά φάρμακα χρησιμοποιούνται για αρκετό χρονικό διάστημα στην αντιμετώπιση της επιληψίας και οι κυριότεροι εκπρόσωποι είναι: carbamazepine. Valproic acid και phenytoin [21]. Τα τοπικά αναισθητικά χρησιμοποιούνται είτε υπό την μορφή αλοιφών (lidocaine), αυτοκόλλητων, είτε με ενδοφλέβια έγχυση καθώς και διαδερμικά (fentanyl). Στα ενδοφλέβια αναισθητικά χρησιμοποιούνται ποικιλία ενώσεων στις οποίες υπάγονται και τα βαρβιτουρικά, όπως η thiopental, οι βενζοδιαζεπίνες, η ketamine κ.α. H thiopental 42

43 παραμένει ακόμα το πιο δημοφιλές ενδοφλέβιο αναισθητικό εισαγωγής στην αναισθησία ενώ η υδροχλωρική ketamine, παράγωγο της κυκλοεξανόνης, προκαλεί ανεπιθύμητες ενέργειες στη μετεγχειρητική περίοδο [21, 22]. 1.3 Ψυχοτρόπα ή μη φάρμακα, καθώς και παρανόμως διακινούμενες εξαρτησιογόνες ουσίες και οι μεταβολίτες τους στο περιβάλλον Αναδυόμενοι ρύποι προτεραιότητας (emerging contaminants) Με την πολύ γενική έννοια, αναδυόμενοι ρύποι προτεραιότητας είναι οι δυνητικά τοξικές ενώσεις, οπού η επίδρασή τους και η παρουσία τους δεν είναι επακριβώς γνωστή είτε επειδή είναι καινούριες ενώσεις που αρχίζουν να διαδίδονται είτε γιατί πολύ απλά υπήρχαν περιορισμοί στο παρελθόν της κατανόησης της τύχης και επίδρασης στο περιβάλλον κάποιων ήδη γνωστών ενώσεων (δεν είχαν μελετηθεί). Επί του παρόντος υπάρχει ένα πολύ μεγάλο κενό μεταξύ της γνώσης μας για τυχόν μακροχρόνιες επιδράσεις των ενώσεων αυτών και των κανονισμών που υπάρχουν για την ρύθμιση αυτών (στην ουσία δεν υπάρχουν). Ωστόσο, ο ενδεχόμενος κίνδυνος των μη ρυθμιζόμενων από διάφορους κανονισμούς ενώσεων, υπάρχει, και πρόσφατες εξελίξεις της επιστήμης έχουν οδηγήσει στην επίγνωση και κατανόηση αυτών. Έτσι είναι μέγιστης σημασίας να καθοριστούν βάσεις και κριτήρια για την κατανόηση του πώς μια χημική ένωση μπορεί να γίνει επικίνδυνη για το περιβάλλον και τους ανθρώπους και πώς μπορεί να προσδιοριστεί και να κατηγοριοποιηθεί ως αναδυόμενος ρύπος [23] Αναδυόμενοι ρύποι προτεραιότητας: Ψυχοτρόπα ή μη φάρμακα, καθώς και παρανόμως διακινούμενες εξαρτησιογόνες ουσίες Μέχρι σήμερα ένας μεγάλος αριθμός αναδυόμενων ρύπων προτεραιότητας (emerging contaminants) έχει ανιχνευτεί στα υγρά αστικά απόβλητα [24, 25]. Έρευνες που έχουν πραγματοποιηθεί στο εξωτερικό αναφέρουν τη συχνή ανίχνευση αυτών των ουσιών στους υδατικούς αποδέκτες [26, 27] και υποδεικνύουν ότι τα υγρά απόβλητα αποτελούν μία από τις σημαντικότερες οδούς μεταφοράς τους στο περιβάλλον [28, 29]. Παρά το γεγονός ότι οι συγκεκριμένες ουσίες ανιχνεύονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις 43

44 (μg L -1 ή ng L -1 ), πολλές από αυτές παρουσιάζουν σημαντικό ενδιαφέρον εξαιτίας των τοξικολογικών (πρόκληση ενδοκρινικών διαταραχών σε οργανισμούς, τάση για βιοσυσσώρευση, βιομεγέθυνση) και χημικών τους χαρακτηριστικών (ανθεκτικότητα, σχηματισμός τοξικότερων μεταβολιτών) [30]. Μεταξύ των διαφόρων κατηγοριών συνθετικών οργανικών ενώσεων που ανήκουν στη συγκεκριμένη κατηγορία μικρορυπαντών, σημαντικό ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα ψυχοτρόπα ή μη φάρμακα, καθώς και οι παρανόμως διακινούμενες εξαρτησιογόνες ουσίες (illicitdrugs / drugsofabuse, DoA). Διάφορες κατηγορίες ναρκωτικών ουσιών, διεγερτικών ουσιών και ψυχιατρικών φαρμάκων ανιχνεύονται στα υγρά αστικά λύματα όπως οπιούχα, διεγερτικά, ηρεμιστικά, παραισθησιογόνα, βαρβιτουρικά, αντιψυχωσικά, αναισθητικά, και αντικαταθλιπτικά. Το ευρύτερο ενδιαφέρον για αυτή την κατηγορία ενώσεων ξεκίνησε όταν ο Jones-Lepp et al. (2004) [31], για πρώτη φορά ανίχνευσε με πειραματική μέθοδο την παρουσία των fluoxetine, MDMA και μεθαμφεταμίνη στα επεξεργασμένα υγρά απόβλητα στις Η.Π.Α. Η μελέτη της παρουσίας και της τύχης των ενώσεων αυτών στο περιβάλλον, συνδέεται άμεσα με τις πηγές από τις οποίες προέρχονται και τις οδούς που ακολουθούν στην συνέχεια. Στην εικόνα 1.6, παρουσιάζεται επιτυχημένα από τον Daughton και πολύ αναλυτικά ένα διάγραμμα ροής που απεικονίζει όλες τις ποικίλες διαδρομές μέσω των οποίων έχουμε την είσοδο των ενώσεων αυτών στο άμεσο περιβάλλον μας και στο περικλείον περιβάλλον [32]. Μετά την κατανάλωση, οι συγκεκριμένες ουσίες μεταβολίζονται μερικώς και απομακρύνονται από τον ανθρώπινο οργανισμό με τα ούρα και τα περιττώματα ως αρχικές ενώσεις ή ως μεταβολίτες. Ως αποτέλεσμα, τα υπολείμματα των συγκεκριμένων ενώσεων να καταλήγουν στις Μονάδες Επεξεργασίας Υγρών Αστικών Αποβλήτων και στη συνέχεια στο υδατικό περιβάλλον λόγω ατελούς απομάκρυνσής τους κατά την επεξεργασία [7-9]. Πολλές ομάδες επιστημόνων από διάφορες χώρες, πραγματοποίησαν αναλύσεις σε απόβλητα και νερά ποταμώνόπως στην Γερμανία [33], Ισπανία [34-40], Αμερική [41,42], Γαλλία [43], Ιρλανδία [44], Βέλγιο [7,45,46], Ηνωμένο Βασίλειο [47-49], Ιταλία και Ελβετία [8, 9, 11, 12, 50, 51]. Στην Ισπανία παρατηρήθηκε ακόμα η παρουσία των ενώσεων αυτών και σε πόσιμο νερό [52]. Οι συγκεντρώσεις των συγκεκριμένων ουσιών στα εισερχόμενα λύματα συνήθως φθάνουν τα μερικά μg L -1 [53], ενώ στα επεξεργασμένα απόβλητα και στα επιφανειακά νερά τα μερικές δεκάδες ng L -1 [34]. Η απομάκρυνσή 44

45 τους κατά τη δευτεροβάθμια επεξεργασία φαίνεται να κυμαίνεται μεταξύ 45% και 95% ανάλογα με το είδος της ουσίας [34], ωστόσο υπάρχουν αντικρουόμενα αποτελέσματα στη βιβλιογραφία. Οι έρευνες ωστόσο δεν σταμάτησαν μόνο σε υδατικές μήτρες καθώς όπως φαίνεται και από το σχήμα οι οδοί μεταφοράς των ενώσεων αυτών είναι πάρα πολλές. Οι ενώσεις αυτές έχουν μελετηθεί και προσδιοριστεί και σε χαρτονομίσματα, σε αιωρούμενα σωματίδια και στον ιδρώτα. Πιο συγκεκριμένα σε μελέτη των Bones et al το 2007 [54] σε χαρτονομίσματα, από τα 45 δείγματα που μελέτησε σε όλα βρέθηκε η κοκαΐνη, στα 12/45 βρέθηκε ο μεταβολίτης της (BECG) και στα 3/45 ηρωίνη. Πιο πρόσφατα ακόμα, πάλι σε χαρτονομίσματα οι Wimmera et al (2011) [55], προσδιόρισε την μέση ποσότητα των ναρκωτικών ουσιών και σύμφωνα με τα αποτελέσματα βρέθηκαν, COC (104 ng), BECG (43 ng), HER (41 ng), MOR (16.5 ng), 6-MAM (5.5 ng), MDMA (9 ng) και ΜΑ (7 ng), ενώ τα MDAκαι MDEA δεν ανιχνεύτικαν. Σε αιωρούμενα σωματίδια αναφέρονται οι Baker et al (2011) [56] κατά την οποία μελετώνταιπάνω από 60 ενώσεις μετις amitriptyline, fluoxetine, EDDP, COC, METH και MOR να συναντώνται σε όλα τα δείγματα μεταξύ ng/g, ενώ για ύπαρξη των ενώσεων στον ιδρώτα αναφέρεται η μελέτη των Daughton et al (2009) [57]. 45

46 Εικόνα 1.4: Ψυχοτρόπα ή μη φάρμακα στο περιβάλλον (κύκλος), (η σχετική σπουδαιότητα των οδών υποδεικνύεται από την ένταση των γραμμών). Η εικόνα είχε σχεδιαστεί από τον CG. Daughton (USEPA) τον Ιούνιο του 2010 [32] Περιβαλλοντικές επιπτώσεις των DoA Με σκοπό να κατανοηθεί η γενική σημασία των DoA στο περιβάλλον είναι σκόπιμο να αναφερθούν 7 διαφορές αυτών σε σχέση με τις φαρμακευτικές ενώσεις ως περιβαλλοντικούς ρύπους [6]. 1) Για τα περισσότερα DoA, δεν υπάρχουν ακριβή στοιχεία που να αφορούν την παραγωγή τους και την χρήση τους (φαρμακευτικές: προφίλ πωλήσεων, συνταγογράφηση) [6]. 46

47 2) Παρόλο που οι ταυτότητες των βασικών DoA είναι γνωστές, ο αριθμός των νέων συνθετικών DoA (δομικά ανάλογα με μικρές μετατροπές) ολοένα και αυξάνεται κάτι που οδηγεί στην ανεπάρκεια των τοξικολογικών εργαστηρίων να τις ανιχνεύσουν. Ακόμα παρόλο που οι μοναδικές αυτές νέο-συντιθέμενες ενώσεις μπορεί να βρίσκονται σε πολύ μικρές ποσότητες στο περιβάλλον, το γεγονός ότι προέρχονται από συγγενείς χημικές ομάδες, μπορεί να προκαλέσουν αθροιστική συνέργεια, ειδικά παρουσία άλλων DoA και φαρμακευτικών ουσιών, που μοιράζονται ίδιους μηχανισμούς δράσης [6]. 3) Τα DoA, που παρασκευάζονται παράνομα και περιέχουν μέσα πολλές προσμίξεις (συνήθως και πάνω από 50%) και είναι σκόπιμα νοθευμένα, είναι πολύ πιο τοξικά και επικίνδυνα από τα ίδια τα καθαρά DoA [6]. 4) Η παρασκευή των DoA μπορεί να οδηγήσει σε οικολογική καταστροφή όπως και σε καταστροφή υποδομών (τοίχους, ξύλινα αντικείμενα). Για παράδειγμα η παρασκευή μεθαμφεταμίνης είναι πολύ επικίνδυνη γιατί οι πρώτες ύλες της (βενζόλιο, μεθυλενοχλωρίδιο, τριχλωροαιθάνιο, τολουόλιο) μπορεί να προκαλέσουν μη αναστρέψιμες ζημιές τόσο στον ίδιο τον άνθρωπο (καρκίνο) όσο και στο χώρο [6,58]. 5) Ο προσδιορισμός των DoA στα απόβλητα σήμερα γίνεται με σκοπό να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο παρακολούθησης της χρήσης αυτών πάρα εύρεσης τυχόν τοξικότητας στο περιβάλλον. 6) Πολύ πιο λίγα πράγματα είναι γνωστά για τα DoA, ως προς την οικοτοξικότητα [6]. 7) Με σκοπό τις περιβαλλοντικές επιπτώσεις των ενώσεων, οι μετρήσεις των φαρμακευτικών ενώσεων μπορεί να εφαρμοστούν ώστε να μειωθεί η είσοδος τους στο περιβάλλον αλλά με τα DoAοι μετρήσεις για την προστασία της ρύπανσης μπορούν να αποθαρρύνουν την παρασκευή τους και την διάδοση τους, δύσκολα ωστόσο μπορούν να εφαρμοστούν [6]. Παρά τις μικρές συγκεντρώσεις που συναντώνται οι ενώσεις αυτές (DoA), οι επιπτώσεις αυτών στο περιβάλλον και στην ανθρώπινη υγεία, λόγο έκθεσης, δεν μπορούν να αποκλειστούναπό την στιγμή που αυτά είναι σχεδιασμένα να έχουν κάποια βιολογική δράση. Ουσίες όπως η cocaine, η morphine, οι διάφορες αμφεταμίνες όπως το ecstasy (ΜDΜΑ) έχουν ισχυρές φαρμακολογικές δράσεις και η παρουσία τους ως μίγματα στα επιφανειακά νερά ενδέχεται να προκαλεί τοξικές επιπτώσεις στους υδρόβιους οργανισμούς, ωστόσο αυτές θα είναι χρόνιες παρά άμεσες [8]. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες ορισμένων από αυτές τις ουσίες (π.χ. τιμές logk ow > 5 για 47

48 ορισμένα κανναβινοειδή) συντελούν επίσης στη συσσώρευση τους στα ιζήματα και στους οργανισμούς [59]. Η carbamazepine και η fluoxetine έχουν εντοπιστεί σε ορισμένα δείγματα από ποταμούς, ενώ η venlafaxine έχει εντοπιστεί σε όλα τα δείγματα που προέρχονται από ποτάμια [36]. Υπάρχει επίσης και η πληροφορία για βιοσυσσώρευση της fluoxetine, της sertraline και των μεταβολιτών τους (νευροδραστικές ουσίες), όταν ανιχνεύτηκαν σε επίπεδα άνω των 0,1 ng/g σε όλους τους ιστούς ψαριών που έπλεαν σε ρεύματα που υπήρχαν αστικά λύματα στην Αμερική [60] Εκτίμηση χρήσης εξαρτησιογόνων ουσιών Από τις συγκεντρώσεις των παρανόμως διακινούμενων ουσιών και των μεταβολιτών τους είναι δυνατός ο υπολογισμός της χρήσης των ουσιών αυτών σε μία ομάδα πληθυσμού. Τα λύματα του πληθυσμού επεξεργάζονται σε συγκεκριμένη μονάδα επεξεργασίας λυμάτων. Για τον υπολογισμό απαιτούνται αξιόπιστα αναλυτικά δεδομένα για την μητρική ένωση (όπως στις amphetamines και την codeine), είτε κάποιο μεταβολίτη της (όπως στην cocaine, heroin, THC, και methadone). Επίσης λαμβάνονται υπόψη το ποσοστό της αρχικής ένωσης που απεκκρίνεται (είτε ως αρχική ένωση, είτε ως κάποιος συγκεκριμένος μεταβολίτης) και ο λόγος των μοριακών μαζών (αν πρόκειται να υπολογιστεί η κατανάλωση κάποιας ουσίας από το μεταβολίτη της), ώστε να υπολογιστεί κατάλληλος συντελεστής μετατροπής, καθώς και η ημερήσια παροχή των εισερχόμενων αποβλήτων (Σχεδιάγραμμα 1.1) [12, 45] Σχεδιάγραμμα 1.1: Σχηματική απεικόνιση της προσέγγισης υπολογισμού της κατανάλωσης από τα απόβλητα, οπού BECG, benzoylecgonine (VanNuijsetall, Addiction, 2009) [45] 48

49 Ο προσδιορισμός του επιπέδου των συγκεντρώσεων των ναρκωτικών ουσιών έχει χρησιμοποιηθεί σε διάφορες χώρες για να εκτιμηθούν οι ποσότητες των ουσιών που καταναλώνονται κατά κεφαλήν [7, 35, 50, 53, 61] κάτι που αποτελεί μια ισχυρή καινοτομία στην περιβαλλοντική και δικανική τοξικολογία, με άμεσες εφαρμογές και στις κοινωνικές επιστήμες. Η γνώση των προτύπων που επικρατούν για την παράνομη διακίνηση/χρήση ναρκωτικών, είναι σημαντική για να μειωθεί η τεράστια οικονομική και κοινωνιολογική ζημιά που προκαλείται από την χρήση τους. Μέχρι πρόσφατα, μόνο οι κλασσικές κοινωνιολογικές και επιδημιολογικές μελέτες, οι οποίες βασίζονταν, σε συνεντεύξεις με τους καταναλωτές, σε έρευνες πληθυσμού και στις στατιστικές της εγκληματικότητας από την χρήση ναρκωτικών, έχουν χρησιμοποιηθεί για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος. Οι μελέτες αυτές συχνά αφορούν αντιπροσωπευτικό δείγμα πληθυσμού, αλλά όχι έναν γενικό πληθυσμό και αυτό επειδή υπάρχει κρυμμένος πληθυσμός (για παράδειγμα άτομα που δεν έχουν καταγραφεί σε καμία θεραπευτική υπηρεσία ή δεν έχουν συλληφθεί) (ΕΚΤΕΠΝ 2011) [4]. Συνεπώς η ανάλυση των απόβλητων αστικών λυμάτων μπορεί να γίνει ένα πολύ χρήσιμο πρόσθετο εργαλείο (μαζί με τις κλασσικές μελέτες), για την πληροφόρηση της χρήσης των ναρκωτικών ουσιών στην χώρα μας. Η καταγραφή σε πραγματικό χρόνο της χρήσης των εξαρτησιογόνων ουσιών και η σύγκριση τους με τα δεδομένα που συλλέγουν οι αστυνομικές αρχές και οι κοινωνικοί επιστήμονες έχουν ήδη βοηθήσει μέχρι σήμερα στην αναθεώρηση της πραγματικής χρήσης σε χώρες όπως το Ηνωμένο Βασίλειο, την Ιταλία, το Βέλγιο, τη Γαλλία και την Ισπανία. Μέχρι σήμερα στην Ελλάδα δεν υπάρχουν καθόλου δεδομένα για την παρουσία των συγκεκριμένων ενώσεων στα αστικά λύματα. 49

50 2. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ 2.1 Εισαγωγή Η υγροχρωματογραφία συζευγμένη με φασματομετρία μαζών σε σειρά είναι η πλέον χρησιμοποιούμενη τεχνική για τονπροσδιορισμό ψυχοτρόπων ή μη φαρμακευτικών, καθώς και παρανόμως διακινούμενων εξαρτησιογόνων ουσιών και των μεταβολιτών τους στο υδατικό περιβάλλον λόγω της ευαισθησίας, της ειδικότητας και της εκλεκτικότητας που παρουσιάζει [5-9, 11, 33-37, 39, 40, 42-53, 61, 62]. Για το στάδιο της προσυγκέντρωσης και του καθαρισμού των δειγμάτων από προσμίξεις σχεδόν όλες οι LC-MS/MS μέθοδοι βασίζονται στην εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) [7-9, 11, 39, 40, 42-50, 52, 53, 61, 62]. Εξαίρεση αποτελεί η εργασία της Chiaia et al. [63] και του Berset et al. [51] όπου δεν έχει χρησιμοποιηθεί SPE, καθώς μεγάλοι όγκοι έγχυσης αντικαθιστούν την ανάγκη χρήσης SPE. Η αεριοχρωματογραφία συζευγμένη με τη διαδοχική φασματομετρία μαζών έχει χρησιμοποιηθεί σε διάφορες μεθόδους προσδιορισμού ναρκωτικών ουσιών [38, 64], με αρκετά καλές ανακτήσεις. Ωστόσο, οι LC-MS μέθοδοι προτιμούνται, έναντι των GC-MS, για απλούστερη διαδικασία προκατεργασίας δείγματος, για να αποφευχθεί η χρονοβόρα διαδικασία της παραγωγοποίησης, κερδίζοντας έτσι χρόνο και αναλώσιμα [65], ειδικά όταν είναι να προσδιοριστούν πολλές διαφορετικές ενώσεις (οι περισσότερες εκ των οποίων πολικές) με διαφορετικά φυσικοχημικά χαρακτηριστικάνα απλουστευθεί και να εξαλείψει την ανάγκη για την παραγωγοποίηση [49]. Επίσης κυριαρχεί λόγω της υψηλότερης ευαισθησίας σε σχέση με το GC-MS. 50

51 2.2 Βιβλιογραφική ανασκόπηση Βάσει της βιβλιογραφικής ανασκόπησης που έγινε, διαπιστώθηκε ότι πολύ λίγες έρευνες έχουν γίνει για τον προσδιορισμό φαρμακευτικών ενώσεων σε ενεργό ιλύ και ακόμα λιγότερες πολυ-υπολειμματικές μέθοδοι προσδιορισμού. Στον πίνακα 2.1 που ακολουθεί παρουσιάζονται οι βιβλιογραφικές πηγές, όπου αναφέρονται οι εξεταζόμενες μήτρες, οι προσδιοριζόμενες ενώσεις, η τεχνική παραλαβής και καθαρισμού των ουσιών, η τεχνική προσδιορισμού, οι χρωματογραφικές συνθήκες καθώς και οι ανακτήσεις και το όρια ανίχνευσης ή ποσοτικοποίησης. 51

52 Πίνακας 2.1: Βιβλιογραφικές πηγές μεθόδων προσδιορισμού των αναλυτών Ref. Ενώσεις Εκχύλιση Στερεάς Φάσης (SPE) [31] MA, MDMA, FLUOXETINE Υγρά απόβλητα POCIS προσροφητικό (Polar organic chemical Integrative sampler) Έκλουση - Αναδιαλ. - Στατική Φάση Restek Allure 18- carbon Κινητή Φάση Τεχνική LOD ή LOQ Βαθμιδωτήέκλουση A: 99% H 2 O /1mM CH 3 COONH 4 /CH 3 COOH 0,1% /1% MeOH, B: 98% MeOH/1mM CH 3 COONH 4 /0,1% CH 3 COOH /2% H 2 O HPLC ESI(+)- ITMS LODs (0,19, 0,25, 20 ng) (στη στήλη για 20 μlέγχυση) [65] AMP, MA, MDMA, MDA, MDEA, COC, BECG, MOR, 6-MAM, METH, EDDP, THCA Υγρά απόβλητα Έκλουση Αναδιαλ. Υγρά απόβλητα Oasis MCX (60 mg, 30 cm 3 ) 3 mlmeoh, 3 ml MeOH (2% NH 3 ) 200 μl H 2 O Oasis HLB (200 mg, 6mL) XTerra MS C18 Βαθμιδωτήέκλουση A: H 2 O (CH 3 COOH 0,05%) B: ACN HPLC- MS/MS QqQ (ESI+) LOQs (0,63-8,7 ng/l) [66] MOR, COD, 6-MAM, HER, METH, EDDP, THC, THCA, FENTANYL Έκλουση Αναδιαλ. 8 ml MeOH Εξάτμιση μέχρι 500μL Διαχωρισμός σε 250 μl για ανάλυση κανναβινοειδών και τα άλλα 250 μl εξάτμηση και αναδιάλυση H 2 O Acquity BEH C18 Βαθμιδωτήέκλουση A: MeOH B: H 2 O με50 mm HCOONH 4 (ph 3,8με HCOOH UPLC- MS/MS QqQ (ESI-, ESI+) LODs (0,3-25 ngll) 61

53 [37] COC, COD, BECG, AMP, EDDP, MOR, HER, MDMA, THC, THCA, EME, MDA Επιφανειακά Νερά Έκλουση Αναδιαλ. Oasis HLB (200 mg, 6 ml) 6 ml MeOH 1 ml H 2 O-MeOH (75:25) (v/v) Sunfire C18 Βαθμιδωτήέκλουση A: HCOOH 0,1% MeOH B: 10mM (aq) HCOONH 4 HPLC- MS/MS (QqQ) (ESI-, ESI+) LODs (0,01-1,54 ng/l) [42] [46] EME, MOR,AMP,MA, OC, 6-MAM, BECG, COC, MDMA, MDEA COC, BECG, EME, AMP, METH, MDMA, EDDP, 6-MAM Έκλουση Αναδιαλ. Υγρά απόβλητα επιφανειακά νερά Έκλουση Αναδιαλ. Strata XC (500 mg, 12 ml) 10mL (2% NH 4 OH) MeOH Εξάτμιση μέχρι 500 μl και συμπλήρωση μέχρι 1mL με 0,1% HCOOH : H 2 O Oasis MCX (60 mg, 30 cm 3 ) 4mL MeOH + 4mL (5%NH 3 ) MeOH 100 μl AcN+100 μl AcN:H 2 O (90/10, v/v) 5mM CH 3 COONH 4 Phenome nex Luna HILIC Βαθμιδωτήέκλουση Α: H 2 O Β:ACN και στους δύο διαλύτες 0,1% HCOOH Βαθμιδωτήέκλουση A: CH 3 COONH 4 5mM σεh 2 O B: ACN Viva PFPP (pentafluo rophenylpropyl) ΗPLC- MS/MS (QqQ) (ESI+) HILIC- HPLC- MS/MS (QqQ) (ESI+) LODs (0,03-7,7 ng/l) LOQs (1-2 ng/l) [39] AMP, MDA, MA, MDMA, BECG, COC, MDEA,THCA Υγρά απόβλητα επιφανειακά νερά Έκλουση Αναδιαλ. Oasis MCX (150 mg, 6 ml) 8mL (2% NH 3 ) MeOH 1mL 90:10 (v/v), H 2 O:MeOH Acquity UPLC BEH C18 Βαθμιδωτήέκλουση A: MeOH B: H 2 O με5mm CH 3 COONH 4, 0,1% HCOOH (ph 2) UPLC- MS/MS (QqQ) (ESI+) LODs ( ng/l) 53

54 [53] [67] COC, BECG, AMP, MA, MDA, MDMA MA, MDMA, MDA, MDEA, Ephedrine, AMP (εναντιομερή), NOREPHEDRINE, VELAFAXINE Υγρά απόβλητα επιφανειακά νερά Έκλουση Αναδιαλ. Υγρά απόβλητα Έκλουση Αναδιαλ. Oasis MCX (150 mg, 6 ml) 2x3 ml (5% NH 4 OH) MeOH 0,4 ml,50:50 MeOH/ H 2 O Oasis HLB (60 mg) 4 ml MeOH 500 μl κινητής φάσης Α Genesis C18 Chiral- CBH column Βαθμιδωτήέκλουση Α: H 2 O 0,1% HCOOH Β: ACΝ Ισοκρατικήέκλουση 90% H 2 O, 10% 2- Προπανόληκαι 1mMCH 3 COONH 4 HPLC- ITMS(ESI+) Chiral- UPLC MS /MS QqQ (ESI+) LODs (1-7 ng/l) LOQs (0,9-11,3 ng/l) [33] [62] BECG, COD, MOR, METH, OC, BROMAZEPAM, DIAZEPAM, NORDIAZEPAM, TEMAZEPAM, OXAZEPAM, CARBAMAZEPINE, PRIMIDONE, DOXEPIN Heroin, COC, THC- COOH, THC, MDMA, AMP, METH, BECG, 6-Acetylmorphine, EDDP, Codeine Υγρά απόβληταεπιφανειακά νερά Έκλουση Αναδιαλ. Υγρά απόβλητα Έκλουση Αναδιαλ. Oasis HLB (200 mg, 30 μm) 8 ml Ακετόνης Εξάτμιση μέχρι 50 μl και συμπλήρωση μέχρι 500 μlμε 1:9 (v/v) MeOH:H 2 O Phenome nex Synergi Polar-RP 80 Å Oasis HLB (200 mg, 6 ml) Phenome 6 ml MeOH 1 ml MeOH/ H 2 O (10/90) 0,1% CH 3 COOH nex Synergi Polar-RP 80 Å Βαθμιδωτήέκλουση Α: H 2 O (HCOONH 4 10Mm), (ph 4 με HCOOH) Β: ACΝ Βαθμιδωτήέκλουση Α: H 2 O, 0,1% CH 3 COOH B: MeOH 0,1% CH 3 COOH LC-MS/MS (ESI+), (QqQ) HPLC- MS/MS (QqQ) (ESI+) LOQs (0,01-0,05 μg/l) LODs (0,2-53 ng/l) 54

55 [68] FLUOXETINE, SERTRALINE, NORSERTRALINE, PAROXETINE, CITALOPRAM, VENLAFAXINE Υγρά απόβλητα Έκλουση Αναδιαλ. Oasis HLB (0,5-g, 6 ml) 10 ml 70% MeOH σε 2% CH 3 COOH Εξάτμιση μέχρι 0,1mL και συμπλήρωση με H 2 O, με 0,1% HCOOH μέχρι 1mL Eclipse XDB- Phenyl 60 C Βαθμιδωτήέκλουση Α: H 2 O, 0,1% HCOOH B: ACN HPLC- MDS/Sciex QTrap- MS/MS (ESI+) LODs (0,19-0,45 ng/l) [69] VELAFAXINE, PAROXETINE, CITALOPRAM, FLUOXETINE, SERTRALINE, NORSERTRALINE, AMITRYPTILINE, NORTRIPTYLINE Υγρά απόβλητα Έκλουση Αναδιαλ. Strata-SCX 2 3 ml 5% (v/v) NH 4 OH σε MeOH 1 Ml σε κινητή φάση Α:Β (1:1 v/v) Gemini C18 Βαθμιδωτήέκλουση Α: H 2 O, Διτανθρακικόαμμώνιο (10mM) ph 7,8 Β: ACN LC-MS/MS (ESI+) LODs (0,048-0,1 ng/l) [43] COC, BECG, MDMA, AMP, BUPRENORPHINE Υγρά απόβλητα Έκλουση Αναδιαλ. OasisHLB (0,5 g, 6 ml) 10 ml MeOH 500 μl MeOH Xbridge Phenyl (waters) Βαθμιδωτήέκλουση Α: ACN Β: H 2 OμεCH 3 COONH 4 10 mm, ph 4 HPLC- MS/MS (QqQ)(ESI+ ) LOQs (1,2 12,8 ng/l) 55

56 [40] EDDP, LSD, 8-OH LSD, MDA, MDMA, METH, BECG, MOR, 6-MAM, DIAZEPAM, EPHEDRINE, FENTANYL, HER, KETAMINE, MA, OXAZEPAM, PXYCODONE, PENTOBARBITAL, PHENOBARBITAL, TEMAZEPAM, THC, THCA, FLUNITRAZEPAM, COC, COD Υγρά απόβλητα Έκλουση Αναδιαλ. Oasis MCX (150 mg, 6 ml) 8 ml (2% NH 3 ) MeOH 1 ml 10:90, H 2 O: MeOH Acquity UPLC BEH C18 Βαθμιδωτήέκλουση Α: H 2 O, 0,01% HCOOH Β: MeOH, 0,01% HCOOH UHPLC- QTOF/MS (ESI+) Δεν ποσοτικοποιή θηκαν [51] MOR, COD, AMP, MA, MDMA, BECG, COC, EDDP, METH, THCA Όχι SPE αλλά απ ευθείας έγχυση στο όργανο (μεγάλου όγκου) Phenome nex, Synergi Hydro RP C18 Βαθμιδωτήέκλουση Α: H 2 O, HCOONH 4, 2 mm/0,2% HCOOH Β: ACN HPLC- MS/MS (QqQ) (ESI+) LOQs (20-100ng/L) Υγρά απόβλητα Oasis HLB (200 mg, 6 ml) [38] AMP, MDA, MDMA, MDEA, COC, BECG, THC, COD,MOR, HER, THCA Έκλουση Αναδιαλ. Ένα μέρος με 2 ml AcOEt και ένα μέρος με 8 ml ακετόνη, εξάτμιση μέχρι ξηρού της ακετονης και ανάμιξη με το AcOEt 100 μl τελικός όγκος και παραγωγοποίηση με επιπλέον προσθήκη 100 μl MSFA HP-5MS, Agilent (30m 0,25 mm) He (99,999%) GC-EI- ITMS LODs (0,6-18,2 ng/l) 56

57 Υγρά απόβλητα OasisMCX (60 mg, 30 cm 3 ) [64] DIAZEPAM, CARBAMAZEPINE, AMITRIPTYLINE, IMIPRAMINE, NORDIAZEPAM, DOXEPINE Έκλουση Χρήσητριών διαλυτών -3 ml AcOEt, -3 ml AcOEt/ακετόνη (50:50), - 3 ml AcOEt /ακετόνη/nh 4 OH (48:48:2) HP-5MS, Bios Analytique He (99,999%) GC-MS (EI) LODs (3,2-28,6 ng/l) Αναδιαλ. 100 μl AcOEt [70] DIAZEPAM, OXAZEPAM,PHENO BARBITAL, PRIMIDONE Υγρά απόβλητα Έκλουση Αναδιαλ. RP-C18 (500 mg,6 ml) 2 2 ml 80:20 (v/v) MeOH:Ακετόνη 0,5 mlεκλουσματος φέρονται μέχρι 1mL (0,4%CH 3 COOH (aq)) Acquity BEH C18 Βαθμιδωτήέκλουση A: H 2 O, 0,2%CH 3 COOH B: MeOH, 0,2% CH 3 COOH UPLC- MS/MS (ESI+/-) LODs (0,01μg/L) [71] Μη στοχευμένη ανάλυση (fullscan) ταυτοποίηση μόνο για ενώσεις κυρίως COC, BECG, THC, THCA, DIAZEPAM, OXAZEPAM Υγρά απόβλητα επιφανειακά νερά πόσιμο νερό Έκλουση Αναδιαλ. Oasis MCX (500 mg) 2,5 ml, can και ml H 2 O: 5% NH 4 OH Εξάτμιση μέχρι 250μL και προσθήκη άλλα 250 Μl H 2 O για τελικό όγκο 500 μl Omnisphe re C18 (Varian) Βαθμιδωτή έκλουση Α: ACN B: H 2 O (0,05 % HCOOH) HPLC-LTQ FT OrbitTrap ESI(+/ )- QqQ (Full scan και MS n ) Δεν ποσοτικοποιή θηκαν 57

58 [44] [72] MOR, AMP, MDMA, BECG, COC, LSD, EDDP, FLUEXETIN, TEMAZEPAM, DIAZEPAM COC, BECG, AMP, MDMA MDA, MDEA, LSD, LSD-OH KETAMINE, FENTANYL Υγρά απόβλητα επιφανειακά νερά Έκλουση Αναδιαλ. Υγρά απόβλητα επιφανειακά νερά Έκλουση Αναδιαλ. Strata-XC (200 mg) 10 ml 5% (v/v) NH 4 OH σε 1:1 ακετόνη:acoet 200 μl, H 2 O:30%MeOH (v/v), 5 mm CH 3 COONH 4 (ph 4,5) Oasis HLB (200 mg, 6 ml) 6 ml MeOH 500 μl H 2 O:5% MeOH Phenome nex Onyx monolithic C18 Acquity BEH C18 Βαθμιδωτή έκλουση Α: MeOH B: 5 mmch 3 COONH 4 ph 4,5 Βαθμιδωτή έκλουση Α: MeOH B: H 2 O (5 mmch 3 COONH 4 : 0,1 % HCOOH) HPLC- ESI(+)- ITMS HPLC- MS/MS QqQ (ESI+) LODs (1-257 ng/l) LODs (0,2-2,1 ng/l) Υγρά απόβλητα Supel-MIP (25 mg) [73] Ομάδααμφεταμινών (AMP, MDMA, MDEA, MDA) Έκλουση 2 1 ml MeOH (1% HCOOH) Halo C18 Βαθμιδωτήέκλουση Α: MeOH (5 mmch 3 COONH 4 ) B: H 2 O (5 mmch 3 COONH 4 ) HPLC- MS/MS QqQ (ESI+) LODs (0,5-2,7 ng/l) Αναδιαλ. 100 μl, 2% NH 3 σε MeOH:H 2 O (1:1) 58

59 [74] AMP. MA, EPHEDRINE, COC, BECG, THC, THCA, LSD, OH-LSD, MOR, HER, 6-MAM, MOR (GLYCOURONIDE) Υγρά απόβλητα Έκλουση On line SPE -PLRPs -OasisHLB (για τα κανναβινοειδή) LC κινητή φάση Purospher Star RP- 18 Βαθμιδωτή έκλουση Α: ACN B: H 2 O HPLC- QqLIT-MS (ESI +, ESI-) LODs (0,07-1,94 ng/l) Αναδιαλ. - [75] COC, BECG, EME Υγρά απόβλητα επιφανειακά νερά Έκλουση Αναδιαλ. OasisHLB (6 ml/500 mg) 2 4 ml MeOH 150 μl MeOH:κινητή φάση Α (1:1, v/v) όταν RPLC Και σε 150 μl ACN/MeOH (3:1,v/v) όταν HILIC 1. Zorbax Extended C18 (RPLC) 2.ZORBA X Rx-SIL (HILLIC) 1. Βαθμιδωτήέκλουση A: H 2 O/ACN 98:2, 10 mmρυθμιστικόδιάλυμ αμυρμηκικού, ph=3 B: ACN 2. Βαθμιδωτήέκλουση A: CH 3 COONH 4, 2 mm/ch 3 COOH (ph=4.5) B: ACN HPLC- ESI(+)- ITMS 1.RPLC- MS/MS 2.HILIC- MS/MS 1. LOQs(4 και 2 ng/l) για COCκαι BECG, 2. HILIC, LOQ (0,5, 1 και 20 ng/l) για COC, BECGκαι ΕΜΕ [63] AMP, MA, EPHEDRINE, COC, BECG, OXYCODONE, METH, MDA, MDMA, MDEA, KETAMINE, NORKETAMINE, OH- LSD, LSD, FLUNITRAZEPAM Υγρά απόβλητα Μεγάλος όγκος δείγματος με απευθείας έγχυση Atlantis T3 C18 Βαθμιδωτήέκλουση A: MeOH (5%) με 0,1% CH 3 COOH Β: ACN HPLC- MS/MS (QqQ) (ESI+) LODs (0,5-4,0 ng/l) 59

60 UCT-XRDAH 500 mg/6 ml) [61] MDMA, MA, BECG Έκλουση (καμία αναφορά όγκου) 96% διχλωρομεθάνιο: προπανόλη (80:20)/4% ΝΗ 3 Phenome nex Luna PFP Βαθμιδωτήέκλουση A: MeOH B: H 2 O,0,1% HCOOH HPLC- QLIT-ESI(+) LOQs(2-10 ng/l) Αναδιαλ. 20 μl MeOH τα οποία αναμίχθηκαν με 180 μl 0,1% HCOOH:H 2 O [49] 65 ενώσεις ναρκωτικών και ψυχοτρόπων ουσιών Υγρά απόβλητα Έκλουση Αναδιαλ. OasisMCX (60 mg, 30 cm 3 ) 3 ml 7% NH 4 OH/MeOH 500 μl 0,3% CH 3 COOH/5% MeOH/H 2 O Acquity UPLC BEH C18 Βαθμιδωτήέκλουση A: 79,7% H 2 O, 20% MeOH, 0,3% CH3COOHpH=2,9 B: 99,7% MeOH, 0,3% CH 3 COOH ph=3,30 UPLC- MS/MS QqQ (ESI+) LODs (0,1-100 ng/l) 60

61 2.3 Εκχύλιση Στερεάς Φάσης Η εκχύλιση στερεάς φάσεως (solid phase extraction) αποτελεί μια τεχνική προετοιμασίας ενός δείγματος για την ανάλυση με χρήση της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης, αλλά και άλλων ειδών χρωματογραφίας. Βασίζεται στην επιλεκτική προσρόφηση των ουσιών πάνω σε ειδικό στερεό υλικό, οι οποίες εν συνεχεία επανακτόνται με την βοήθεια κατάλληλωνδιαλυτών. Ήδη χρησιμοποιείται ευρύτατα σε κλινικές και περιβαλλοντικές αναλύσεις.με την προετοιμασία ενός δείγματος για ανάλυση επιτυγχάνεται: 1. Περιορισμός των παρεμποδιζουσών ουσιών σε ποσοστά που δεν δημιουργούν φαινόμενα αλληλοεπικάλυψης και άρα δεν παρεμποδίζουν την ανάλυση (με απομόνωση του αναλυόμενου συστατικού ή με απομάκρυνση των παρεμποδιζουσών ουσιών). 2. Απομάκρυνση ουσιών που μπορεί είτε να «υπερφορτώσουν» τη στήλη και συνεπώς να ελαττώσουν την επαναληπτικότητα και την ακρίβεια της μεθόδου, είτε τελικά να κατακρατηθούν με τρόπο μη αντιστρεπτό στη στήλη.γενικά δηλαδή, απομάκρυνση κάθε ουσίας που η εισαγωγή της στη στήλη θαείχε ως αποτέλεσμα να μειωθεί η διάρκεια ζωής της. 3. Η συγκέντρωση του προσδιοριζόμενου συστατικού να έλθει στην γραμμική περιοχή της χρωματογραφικής μεθόδου (και ιδίως όταν οι ποσότητες των προσδιοριζόμενων συστατικών βρίσκονται σε ίχνη, οπότε απαιτείται προσυγκέντρωση αυτών). Τα υλικά των στηλών, που χρησιμοποιούνται στην εκχύλιση στερεάς φάσεως, είναι πολυμερείς ενώσεις, που περιέχουν μόνο δεσμούς C-C και C-N. Τα υλικά αυτά είναι σταθερά σε οποιαδήποτε τιμή ph και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ του αναλυόμενου συστατικού και του προσροφητικού μέσου είναι σταθερές. Τα συνηθέστερα πληρωτικά υλικά βασίζονται στην πυριτία ή στην χημικά μετασχηματισμένη πυριτία π.χ. C18 ή C8 υλικό πλήρωσης αλλά ακόμη και υλικά όπως συμπολυμερή αιθυλοβενζολίουδιβινυλοβενζολίου ή στυρενίου- διβινυλοβενζολίου μπορούν να χρησιμοποιηθούν με επιτυχία. Εκτός από τα πληρωτικά υλικά μετασχηματισμένης πυριτίας (silica-based C18-materials) που η κατακράτηση του αναλύτη βασίζεται σε υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις, υλικά όπως Oasis HLB, δηλαδή συμπολυμερές διβινυλοβενζολίου-nβινυλοπυρρολιδόνης (divinylbenzene-n-vinylpyrrolidone) έχουν αρχίσει να διαδίδονται 61

62 ευρύτατα. Σε αυτά τα υλικά, η κατακράτηση βασίζεται στη συνδυασμένη δράση υδροφοβικών και υδρόφιλων αλληλεπιδράσεων [76, 77]. Η εκχύλιση στερεάς φάσεως αποτελείται από τα εξής τέσσερα κύρια βήματα, όταν έχω κατακράτηση του αναλύτη: 1. Ενεργοποίηση και εξισορρόπηση του προσροφητικού υλικού της SPE με μικρούς όγκους διαλύτη όπως μεθανόλη ή ακετονιτρίλιο, ακολουθούμενο ή όχι από νερό. Ο ρόλος είναι διπλός του σταδίου αυτού (1) απομάκρυνση οποιασδήποτε μόλυνσης που προείχε το φυσίγγιο και (2) επιδιαλύτωση του προσροφητικού υλικού. 2. Φόρτωση του δείγματος στο υλικό της SPE, 3. Έκπλυση του φυσιγγίου: Απομάκρυνση των ουσιών που παρεμποδίζουν την ανίχνευση των αναλυτών (χρήση διαλύτη μέσης ισχύος χωρίς ταυτόχρονη έκλουση του αναλύτη). 4. Έκλουση των αναλυτών (ποσοτική παραλαβή με ισχυρό διαλύτη) Η SPE βοηθάει σημαντικά στην προσυγκέντρωση των αναλυτών, ιδιαίτερα όταν έχουμε μεγάλους όγκους δειγμάτων, όπως στην ανάλυση περιβαλλοντικών δειγμάτων, αφού δεν είναι χρονοβόρα, είναι απλοϊκή, φιλική με το περιβάλλον και δεν έχω δημιουργία γαλακτώματος [77]. 2.4 Τεχνικές Ανάλυσης και Προσδιορισμού Ενώσεων (Χρωματογραφία) Η χρωματογραφία περιλαμβάνει μια μεγάλη ποικιλία μεθόδων οι οποίες βοηθούν τον διαχωρισμό ουσιών με παραπλήσιες χημικές ιδιότητες από σύνθετα δείγματα. Σε όλους τους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς το δείγμα κινείται σε μια κινητή φάση (mobilephase), η οποία μπορεί να είναι αέριο, υγρό ή υπερκρίσιμο ρευστό (αεριοχρωματογραφία (gas chromatography, GC), υγροχρωματογραφία (liquid chromatography, LC) και χρωματογραφία υπερκρίσιμου ρευστού (supercritical fluid chromatography, SFC). Η κινητή φάση διέρχεται διαμέσου μιας στατικής φάσης (stationaryphase), η οποία είναι καθηλωμένη σε μια στήλη ή μια στερεά επιφάνεια. Οι δύο φάσεις επιλέγονται έτσι ώστε τα συστατικά του δείγματος να κατανέμονται μεταξύ των δύο φάσεων σε διαφορετικό βαθμό. Τα συστατικά κινούνται ανάλογα με την κατακράτηση τους από την στατική φάση: αν κατακρατούνται ισχυρά κινούνται αργά, ενώ αν κατακρατούνται ασθενέστερα, πιο γρήγορα. Αυτή η διαφορά στην ευκινησία 62

63 οδηγεί στον διαχωρισμό των συστατικών του δείγματος σε ζώνες, όπου κάθε ζώνη καταλαμβάνεται από ένα συστατικό. Στη συνέχεια τα συστατικά αυτά μπορούν να προσδιοριστούν ποιοτικά ή/και ποσοτικά [78]. 2.5 Υγροχρωματογραφία (HPLC) Ο όρος χρωματογραφία συμπεριλαμβάνει όλες τις υγροχρωματογραφικές τεχνικές διαχωρισμού σε επίπεδη επιφάνεια ή στήλη, στις οποίες η κινητή φάση είναι υγρό.η υγροχρωματογραφία υψηλής απόδοσης (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) είναι μια από τις πολλές χρωματογραφικές τεχνικές για το διαχωρισμό και την ανάλυση των χημικών μειγμάτων. Η HPLC είναι μία αναλυτική τεχνική διαχωρισμού και ποσοτικού προσδιορισμού μη πτητικών ή θερμοευαίσθητων ουσιών. Η χρησιμοποιούμενη κινητή φάση είναι υγρή, ενώ η στατική φάση είναι στερεή ή υγρή ακινητοποιημένη πάνω σε αδρανές υπόστρωμα. Η τεχνική αυτή εφαρμόζεται στον προσδιορισμό μεγάλου αριθμού ουσιών όπως είναι τα αμινοξέα, οι πρωτεΐνες, οι υδρογονάνθρακες, οι υδατάνθρακες, τα φυτοφάρμακα, τα αντιβιοτικά καθώς και άλλες κατηγορίες ενώσεων. Αναλύσεις αυτού του είδους, χρησιμοποιούνται στις έρευνες συνθετικής χημείας, μεταβολικών μελετών και ανάλυση περιβαλλοντικών δειγμάτων. Ο διαχωρισμός ενός μίγματος ουσιών βασίζεται στη διαφορετική αλληλεπίδραση του κάθε συστατικού με την κινητή και τη στατική φάση, με συνέπεια να απαιτείται διαφορετικός χρόνος για την έκλουση κάθε ουσίας από τη στήλη. Η αλληλεπίδραση αυτή σχετίζεται με το μέγεθος, το σχήμα και την πυκνότητα φορτίου των σωματιδίων στο διάλυμα. Υπάρχουν διάφορα είδη χρωματογραφίας τα οποία ταξινομούνται ανάλογα με την κατηγορία των ενώσεων που διαχωρίζουν και το μηχανισμό αλληλεπίδρασης που επικρατεί ανάμεσα στις ουσίες προς διαχωρισμό και τις δύο φάσεις. Ειδικότερα έχουμε: Η χρωματογραφία προσρόφησης εφαρμόζεται για το διαχωρισμό μη πολικών ενώσεων Η χρωματογραφία κατανομής εφαρμόζεται για το διαχωρισμό μη ιοντικών πολικών ενώσεων 63

64 Η χρωματογραφία ιονανταλλαγής εφαρμόζεται για το διαχωρισμό ιοντικών ενώσεων Η χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού εφαρμόζεται για το διαχωρισμό ενώσεων με μοριακό βάρος μεγαλύτερο από Τα πεδία εφαρμογών του κάθε είδους υγροχρωματογραφίας συχνά αλληλεπικαλύπτονται. Αυτό που λαμβάνουμε μετά την ανάλυση είναι ένα χρωματογράφημα. Το χρωματογράφημα είναι χρήσιμο τόσο για ποιοτική όσο και για ποσοτική ανάλυση. Οι θέσεις των κορυφών ως προς τον άξονα του χρόνου εξυπηρετούν στην ταυτοποίηση των συστατικών του δείγματος και το εμβαδόν της επιφάνειας ή το ύψος της κορυφής (που είναι ανάλογα με τη συγκέντρωση ή τη μάζα της ουσίας) αποτελεί ποσοτικό μέτρο κάθε συστατικού. Για την περιγραφή της αποδοτικότητας ενός χρωματογραφικού συστήματος χρησιμοποιούνται διάφορα ποσοτικά μεγέθη, τα σημαντικότερα από τα οποία είναι : 1) Ο αριθμός των θεωρητικών πλακών, Ν και το ύψος της θεωρητικής πλάκας, Η. Ισχύουν οι σχέσεις :, όπου: t R, ο χρόνος κατακράτησης της ουσίας, w το εύρος της κορυφής της ουσίας, L το μήκος του πληρωμένου τμήματος της στήλης. Τα μεγέθη Ν και Η σχετίζονται με την αναλυτική στήλη μέσω της γνωστής εξίσωσης vandeemter:, όπου A, B και C είναι συντελεστές που σχετίζονται με τα φαινόμενα πολλαπλότητας διαδρομών ροής, διαμήκους διάχυσης και μεταφοράς μάζας μεταξύ φάσεων. 2) Η διαχωριστική ικανότητα της στήλης, R s, αποτελεί ποσοτικό μέτρο της ικανότητάς της να διαχωρίσει δύο προσδιοριζόμενες ουσίες. 64

65 όπου: (t R ) A, (t R ) B οι χρόνοι κατακράτησης των δύο ουσιών, w A, w B τα εύρη των κορυφών των δύο ουσιών. Δύο ουσίες διαχωρίζονται πλήρως όταν το R s είναι ίσο με 1,5. 3) H ασυμμετρία των χρωματογραφικών κορυφών. όπου: a, b τα εύρη της κορυφής εκατέρωθεν του κεντρικού άξονα, στο 1/10 του ύψους της κορυφής. H τιμή της παραμέτρου S 10 πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ των τιμών 0,8 και 1,2 [78-80] Οργανολογία της HPLC Η οργανολογία της HPLC είναι πολυπλοκότερη και δαπανηρότερη από την οργανολογία άλλων ειδών χρωματογραφίας. Αυτό οφείλεται στις υψηλές πιέσεις που απαιτούνται για να αναπτυχθούν ικανοποιητικές ταχύτητες ροής του υγρού έκλουσης. Τα σημαντικότερα τμήματα από τα οποία αποτελείται μια διάταξη της υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης είναι τα εξής: δοχεία κινητής φάσης και συστήματα επεξεργασίας διαλυτών, συστήματα άντλησης, συστήματα έκχυσης δείγματος, στήλες υγροχρωματογραφίας ανιχνευτές [78] (εικόνα 2.1) Εικόνα 2.1: Διάταξη οργανολογίας HPLC [81] 65

66 2.5.2 Υγροχρωματογραφία κατανομής αντίστροφης φάσης Η υγροχρωματογραφία κατανομής είναι ο περισσότερο χρησιμοποιούμενος τύπος υγροχρωματογραφίας και χωρίζεται σε δύο βασικές υποκατηγορίες βάση της πολικότητας της κινητής και της στατικής φάσης: 1. Υγροχρωματογραφία κανονικής φάσης Η στατική φάσηείναι πολικότερη από την κινητή και περιέχει ομάδες συνήθως SiO 2 ή Al 2 O 3.Η κινητική αποτελείται από μη πολικούς διαλύτες όπως εξάνιο, χλωροφόρμιο. 2. Υγροχρωματογραφία αντίστροφης φάσης (Reversed-Phase Liquid Chromatography, RP). Η στατική φάση, είναι λιγότερο πολική της κινητής και αποτελείται από οξείδιο πυριτίου συζευγμένο με διάφορες ομάδες όπως αλκύλια (ακετύλιο, δεκαοκτύλιο), φαινύλιο, διόλες, αμινομάδες, κυανομάδες κ.ά., ενώ η κινητή φάση αποτελείται από μείγματα οργανικών διαλυτών (μεθανόλη,ακετονιτρίλιο, κ.ά.) με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα και νερό [82] Στατική φάση Η στατική φάση αποτελείται συνήθως από αλυσίδες υδρογονανθράκων χημικά συνδεδεμένες πάνω σε ένα υλικό πλήρωσης από σωματίδια διοξειδίου του πυριτίου. Το πλέγμα του διοξειδίου του πυριτίου αποτελείται από άτομα πυριτίου τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με γέφυρες οξυγόνου και στην επιφάνεια του πλέγματος υπάρχουν ελεύθερες σιλανολικές ομάδες -SiOH. Μέσω της αντίδρασης των σιλανολικών ομάδων με ένα οργανοχλωριωμένο σιλάνιο προκύπτει μια χημικά συνδεδεμένη στατική φάση. Συνήθως η ομάδα R είναι το κανονικό δεκαοκτύλιο (C18), και οι μακριές αλυσίδες του υδρογονάνθρακα ευθυγραμμίζονται παράλληλα η μία προς την άλλη και κάθετα προς την επιφάνεια του σωματιδίου, δίνοντας δομή ψήκτρας. Συχνά ακολουθεί επιπλέον αντίδραση με χλωροτριμεθυλοσιλάνιο για την κάλυψη των ελεύθερων ομάδων σιλανόλης (endcapping), οι οποίες δεν αντέδρασαν λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης από την ομάδα R, και οι οποίες αποδίδουν ανεπιθύμητη πολικότητα στην επιφάνεια της στατικής φάσης [78, 80] Κινητή φάση Στην υγροχρωματογραφία αντίστροφης φάσης χρησιμοποιούνται πολικοί διαλύτες. Ειδικότερα, η κινητή φάση συνήθως αποτελείται από μείγματα νερού ή 66

67 ρυθμιστικά υδατικά διαλύματα με διάφορους οργανικούς διαλύτες αναμίξιμους με το νερό, όπως η μεθανόλη, το ακετονιτρίλιο, το διμεθυλοφορμαμίδιο, το διοξάνιο και το τετραϋδροφουράνιο. Η σύσταση της κινητής φάσης καθ όλη τη διάρκεια της ανάλυσης μπορεί να διατηρείται σταθερή (ισοκρατική έκλουση) ή να μεταβάλλεται με το χρόνο (βαθμιδωτή) [78, 80]. 2.6 Φασματομετρία μαζών - τεχνολογίας τριπλού τετραπόλου Φασματομετρία μαζών Η Φασματομετρία μαζών είναι μια πολύ χρήσιμη αναλυτική τεχνική. Τα σύγχρονα όργανα φασματομετρίας μάζας μας δίνουν με πολύ μεγάλη ακρίβεια τη μάζα μορίων που βρίσκονται στο προς ανάλυση δείγμα, ακόμα και σε απειροελάχιστες ποσότητες. Μπορούν ακόμα να δώσουν πληροφορία για την ακριβή χημική σύσταση των μορίων, αυξάνοντας έτσι την ακρίβεια της ανάλυσης. Τα φασματόμετρα μάζας μπορούν να μετρήσουν τόσο μικρά μόρια (δραστικές ουσίες φαρμάκων, περιβαλλοντολογικοί ρύποι κ.α.) όσο και μεγάλα μόρια, όπως πρωτεΐνες, πεπτίδια, DNA και άλλα βιολογικά μακρομόρια. Η φασματομετρία μαζών ορίζεται ως μια οικογένεια τεχνικών προσδιορισμού δομής και ποσοτικού προσδιορισμού ενώσεων και στοιχείων, οι οποίες βασίζονται στον ιοντισμό ατόμων ή μορίων ή την παραγωγή ιοντικών θραυσμάτων μορίων και την καταγραφή της σχετικής έντασης του ιοντικού ρεύματος που αντιστοιχεί σε κάθε λόγο μάζας προς φορτίο (m/z) [82]. Η φασματομετρία μαζών είναι ίσως η τεχνική με τη μεγαλύτερη ποικιλία εφαρμογών και την εντυπωσιακότερη ανάπτυξη τα τελευταία χρόνια. Παρέχει πληροφορίες σχετικά με: Τη στοιχειακή σύσταση του δείγματος Τις δομές ανόργανων, οργανικών, οργανομεταλλικών και βιολογικών μορίων Την ποιοτική και ποσοτική σύσταση σύνθετων μειγμάτων Τη δομή και σύσταση επιφανειών και Την αναλογία ισοτόπων ατόμων στα δείγματα [82]. 67

68 2.6.2 Οργανολογία και αρχή λειτουργίας φασματομέτρου μαζών Ένα φασματόμετρο μαζών αποτελείται κυρίως από: i. Σύστημα εισαγωγής δείγματος ii. Πηγή ιόντων iii. Αναλυτή μαζών iv. Σύστημα ανίχνευσης των ιόντων v. Σύστημα συλλογής και επεξεργασίας δεδομένων (Εικόνα 2.2) Επιπλέον, τα φασματόμετρα μαζών απαιτούν ένα πολύπλοκο σύστημα παραγωγής κενού για διατήρηση της πίεσης σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε όλα τα τμήματά του. Εικόνα 2.2: Σχηματική παρουσίαση λειτουργίας MS [82] Η τεχνική MS ακολουθεί την παρακάτω πορεία: Ιοντισμός: 2 Me M e Θραυσματοποίηση: M EE R ή M OE N Όπου: M : μοριακό ιόν EE OE : ιόν με άρτιο αριθμό e : ιόν με περιττό αριθμό e 68

69 Για να επιτευχθεί ο ιοντισμός και η διάσπαση, αρχικά εισάγεται μικροποσότητα δείγματος από το σημείο εισόδου στην πηγή ιόντων, όπου οι ενώσεις του δείγματος μετατρέπονται σε ιόντα στην αέρια φάση μετά από βομβαρδισμό με ηλεκτρόνια, φωτόνια, ιόντα ή μόρια. Από την πηγή ιόντων εξέρχεται ένα ρεύμα θετικών ή αρνητικών ιόντων σε αέρια κατάσταση, τα οποία επιταχύνονται προς τον αναλυτή μαζών. Αυτά τα ιόντα χωρίζονται ανάλογα με τις m/z τιμές τους υπό κενό το οποίο συμβάλλει έτσι ώστε τα ιόντα να μην μπορούν να συγκρουστούν με οποιαδήποτε άλλη μορφή της ύλης κατά τη διαδικασία διαχωρισμού. Τα ιόντα διαφορετικών τιμών m/z διαχωρίζονται και ανιχνεύονται, με αποτέλεσμα τη δημιουργία του φάσματος μάζας [76, 78, 82] Πηγές ιόντων Το αρχικό στάδιο σε μια μέτρηση με φασματομετρία μαζών είναι ο σχηματισμός των ιόντων του αέριου αναλύτη, διαδικασία καθοριστική για την μέτρηση και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Η μορφή του φάσματος μαζών μιας ουσίας εξαρτάται ως επί το πλείστον από την τεχνική παραγωγής ιόντων. Πηγές αέριας φάσης (το δείγμα πρώτα εξαερώνεται και μετά ιοντίζεται): 1) πρόσκρουσης ηλεκτρόνιων (EI) 2) χημικού ιοντισμού (CΙ) Πηγές εκρόφησης (το δείγμα, σε υγρή ή στερεά κατάσταση μετατρέπεται σε αεριώδη ιόντα): 1)ιοντισμός εκρόφησης με τη βοήθεια υλικού μήτρας (MALDI) 2) βομβαρδισμού με άτομα μεγάλης ταχύτητας (FAB), 3) ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση (API) (ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό (ESI) και χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση (APCI)) Η πηγή ιόντων που χρησιμοποιήθηκε κατά την διεξαγωγή της ανάλυσης είναι η τεχνική του ηλεκτροψεκασμού (electrospray, ESI). Το ESI ανήκει στις πηγές εκρόφησης και συγκεκριμένα στην κατηγορία ιοντισμού υπό ατμοσφαιρική πίεση. 69

70 Ηλεκτροψεκασμός (ESI) Η μέθοδος του ηλεκτροψεκασμού χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό μεγάλης ποικιλίας μορίων (πολικών, μετρίως πολικών και θερμικά ασταθών). Έχει πολλά πλεονεκτήματα καθώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον προσδιορισμό μοριακού βάρους χωρίς περιορισμό στη μάζα, έχει καλή ευαισθησία, εύκολη ποσοτικοποίηση και συνδυάζεται με τεχνικές όπως η υγρό χρωματογραφία και η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση. Η τεχνική του ψεκασμού σε ηλεκτρικό πεδίο χρησιμοποιείται ως η κυριότερη μέθοδος σύζευξης της υγροχρωματογραφίας με τη φασματομετρία μαζών. Βασίζεται στην παρατήρηση ότι όταν ένα υγρό ψεκάζεται μέσω ενός τροχοειδούς σωλήνα μέσα σε ένα ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο, το υγρό διασπείρεται σε ένα νέφος από πολύ μικρές φορτισμένες σταγόνες. Ο συμβατικός ηλεκτροψεκασμός είναι μία άκρως ευαίσθητη τεχνική και επιπλέον οι παραλλαγές του, όπως ο μικροηλεκτροψεκασμός ή ο νανοψεκασμός έχουν αποδειχθεί ικανές για τέλεια απόδοση με υψηλές ευαισθησίες [82,83,84]. Εικόνα 2.3: Σχηματική αναπαράσταση πηγής ιόντων ( ESI) [85] 70

71 Στον ηλεκτροψεκασμό (υπό ατμοσφαιρική πίεση και σε κάποια θερμοκρασία), το υγρό ψεκάζεται σ ένα ηλεκτρικό πεδίο χιλιάδων Volts μέσω ενός τριχοειδούς σωλήνα με αποτέλεσμα να διασπείρεται σε ένα νέφος πολλών φορτισμένων. Οι δημιουργούμενες φορτισμένες μικρές σταγόνες διέρχονται μέσω ενός τριχοειδούς όπου ο αναλύτης εξατμίζεται και φορτίζονται τα μόριά του. Απαραίτητη, στην παραπάνω διαδικασία, είναι η ύπαρξη ενός βοηθητικού αερίου (auxiliary gas) το οποίο είναι συνήθως άζωτο και το οποίο παρέχεται γύρω από το τριχοειδές βοηθώντας την εξάτμιση του διαλύτη. Απαραίτητο είναι το άζωτο ως εκνεφωτικό αέριο (sheath gas) το οποίο ελευθερώνεται υπό πίεση γύρω από την άκρη του τριχοειδούς διευκολύνοντας τη σχάση του κώνου που σχηματίζεται [78]. Πιο αναλυτικά, κατά τη διαδικασία του ηλεκτροψεκασμού, το διάλυμα του δείγματος εισάγεται σε ένα μεταλλικό τριχοειδή σωλήνα με πολύ μικρή ταχύτητα ροής της τάξης των μl/min. Μεταξύ αυτού του τριχοειδούς και ενός αντισταθμιστικού ηλεκτροδίου εφαρμόζεται διαφορά δυναμικού 3-6 kv, με αποτέλεσμα τη δημιουργία ηλεκτρικού πεδίου. Το πεδίο αυτό δημιουργεί μια συσσώρευση φορτίου μέσω ηλεκτραπωθητικών δυνάμεων στην επιφάνεια του υγρού που βρίσκεται στο άκρο του τριχοειδούς, από όπου θα σχηματιστούν τα φορτισμένα σταγονίδια. Ανάλογα με τον τρόπο ιοντισμού, τα συσσωρευμένα φορτία έχουν θετικό ή αρνητικό φορτίο. Έτσι δημιουργείται ο κώνος του Taylor. Καθώς το δυναμικό αυξάνει, το διάλυμα που σχηματίζει τον κώνο του Taylor ξεπερνά το όριο Rayleigh, δηλαδή το σημείο εκείνο όπου η πίεση από τις απωστικές δυνάμεις μεταξύ των ιόντων εξισορροπείται από την επιφανειακή τάση του διαλύματος με συνέπεια ο κώνος να υφίστανται σχάση και να παράγονται φορτισμένα σταγονίδια. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι είναι δυνατό να υπάρξει σχάση και πριν από το όριο Rayleigh, δημιουργώντας ένα νέο κώνο Taylor από όπου απελευθερώνονται μικροσωματίδια. Ο σχηματισμός των σταγονιδίων και η εκδίωξη τους στην περιοχή αποδιαλύτωσης είναι γνωστή και ως εκνέφωση. Η αποτελεσματικότητα και η σταθερότητα της εκνέφωσης είναι ανάλογη του μεγέθους της διαφοράς δυναμικού στο σύστημα. Όσο αυξάνεται η διαφορά δυναμικού, το μέγεθος των σταγονιδίων μειώνεται και η κίνηση τους γίνεται οριζόντια. Τα σταγονίδια θα συνεχίσουν να χάνουν μόρια διαλύτη, και όταν το ηλεκτρικό πεδίο στην επιφάνειά τους γίνει αρκετά μεγάλο, θα πραγματοποιηθεί αποδιαλύτωση των ιόντων. Για να γίνει αποδοτικότερος ο ιοντισμός έχουν αναπτυχθεί τεχνικές όπου με τη 71

72 βοήθεια αερίων διασπώνται τα συσσωματώματα. Έτσι στην περιοχή γύρω από το τριχοειδές υπάρχει άζωτο (βοηθητικό αέριο, auxiliary gas) που βοηθά στην εξάτμιση του διαλύτη καθώς επίσης και αέριο άζωτο υπό πίεση που απελευθερώνεται γύρω από την άκρη του τριχοειδούς (εκνεφωτικό αέριο, sheath gas) βοηθώντας με αυτόν τον τρόπο τη σχάση του κώνου [86]. Ένα σημαντικό μειονέκτημα του ηλεκτροψεκασμού είναι η εξάρτηση του από τις πειραματικές συνθήκες και το φαινόμενο της μήτρας. Ενίσχυση και καταστολή του σήματος στο ESI προκαλείται επίσης και από άλλους παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν το ποσοστό ιοντισμού των αναλυτών όπως αστάθεια ροής, θόρυβος υποστρώματος, η σύσταση της κινητής φάσης και ουσίες του δείγματος [87,88] Αναλυτές Μαζών Ο αναλυτής μαζών διαχωρίζει ιόντα με βάση το λόγο μάζα προς φορτίο (m/z). Το ιοντικό ρεύμα που καταγράφεται οφείλεται σε ένα μόνο (m/z) κάθε στιγμή. Οι αναλυτές μαζών χωρίζονται στις ακόλουθες κατηγορίες: συνεχείς αναλυτές μαζών (τετραπολικός αναλυτής μαζών ή Quadrupole, αναλυτές μαγνητικού τομές ή magnetic sector) και παλμικούς αναλυτές μαζών (τετραπολική παγίδα ιόντων ή ΙΤ, αναλυτές μαζών χρόνου πτήσης ή TOF, αναλυτής κυκλοτρονιακού συντονισμού ιόντων με σχηματισμό Fourier ή FTICR) [82]. Κατά τον προσδιορισμό των ελεγχόμενων ψυχοτρόπων και ναρκωτικών ουσιών και των μεταβολιτών τους στα δείγματα χρησιμοποιήθηκε τετραπολικός αναλυτής και συγκεκριμένα τριπλό τετράπολο Τετραπολικός αναλυτής μαζών Αποτελεί μία από τις νεώτερες μεθόδους διαχωρισμού μαζών, οικονομικότερη από την χρήση του μαγνητικού φίλτρου μαζών με αποτέλεσμα την σημαντικά ευρύτερη χρήση της. Δίνει απλά φάσματα αλλά έχει χαμηλή διακριτική ικανότητα (~1Da). Ο διαχωρισμός μαζών επιτυγχάνεται με την υπέρθεση ενός εναλλασσομένου ηλεκτρικού πεδίου έχοντας συχνότητα στην περιοχή των ραδιοκυμάτων (RF, radio frequency) σε ένα συνεχές (DC) ηλεκτρικό πεδίο. Το DC-RF πεδίο εφαρμόζεται σε τέσσερις παράλληλες ράβδους, όπως δείχνεται στο Εικόνα 2.4 [89, 90]. 72

73 Εικόνα 2.4: Τετραπολικός ανιχνευτής μαζών (quadrupole mass) [90]. Οι τέσσερις μεταλλικές κυλινδρικές ράβδοι (πόλοι) βρίσκονται φορτισμένες ανά ζεύγη, το ένα ζεύγος απέναντι από το άλλο, στο ίδιο συνεχές ηλεκτρικό ρεύμα. Στο σύστημα εφαρμόζεται, με διαφορά φάσης 180 μοίρες, εναλλασσόμενο ρεύμα υψηλής συχνότητας (ραδιοσυχνότητα). Τα ιόντα εισέρχονται στο τετράπολο μετά από επιτάχυνση σε δυναμικό 5-15 V. Ο συνδυασμός των τεσσάρων πόλων επιτρέπει σε ιόντα συγκεκριμένου μόνο m/z να περάσουν τον αναλυτή και να φτάσουν στον ανιχνευτή. Για τη σάρωση σε ένα τετραπολικό αναλυτή τα δυναμικά των δύο ρευμάτων (εναλλασσόμενου και συνεχούς) αυξάνονται από τιμή 0 έως μία μέγιστη τιμή, με το λόγο περίπου των δύο στο 6. Με τον τρόπο αυτό τα δυναμικά μεταβάλλονται από 0 έως περί τα V για το συνεχές ρεύμα και από 0 έως V για το εναλλασσόμενο. Η σάρωση αυτή των δυναμικών επηρεάζει την κίνηση των ιόντων με τρόπο που ορίζεται από περίπλοκες διαφορικές εξισώσεις. Τα ιόντα ουσιαστικά κινούνται διαγράφοντας ελικοειδείς πορείες μέσα στο τετράπολο [82,86]. Κύρια πλεονεκτήματα είναι, η αξιοπιστία, είναι κατάλληλος για ποσοτική ανάλυση είναι κατάλληλος ανιχνευτής χρωματογραφίας, έχει μεγάλη ταχύτητα σάρωσης, είναι φθηνός, μέτριες απαιτήσεις κενού, έχει δυνατότητα για ms/ms και ίναι ιδανικός για σύζευξη με πηγές ιοντισμού ΑP. Μειονεκτεί ως προς την χαμηλή διακριτική ικανότητα, το περιορισμένο εύρος m/z και την μειωμένη ευαισθησία σε υψηλή διακριτική ικανότητα [82]. 73

74 2.6.5 Φασματομετρία Μαζών σε σειρά (Tandem MS) με τεχνολογία τριπλού τετραπόλου Στην τεχνική Φασματομετρία Μαζών σε σειρά (Tandem MS) πραγματοποιούνται με την ακόλουθη σειρά οι εξής λειτουργίες: ο διαχωρισμός των μαζών των αναλυόμενων ενώσεων η απομόνωση της μάζας της ένωσης που μας ενδιαφέρει η διάσπαση της σε θραύσματα η σάρωση της μάζας των θραυσμάτων ο προσδιορισμός των μαζών των θραυσμάτων Το τριπλό τετράπολο (QqQ) είναι συνδυασμός τριών τετραπόλων σε σειρά. Τρία τετράπολα απαντώνται συχνότατα, για την εκμετάλλευση των πλεονεκτημάτων του τετραπόλου (ταχεία σάρωση, δυνατότητα εφαρμογής φασματομετρίας μαζών σε σειρά/ Tandem MS). Η συσκευή αποτελείται από τρία ζεύγη ράβδων τετραπόλου σε σειρά. Το δεύτερο ζεύγος ράβδων δεν λειτουργεί σαν συσκευή διαχωρισμού μαζών αλλά σαν κυψελίδα συγκρούσεων. Τα θραύσματα των ιόντων που εκπέμπονται από το πρώτο ζεύγος των τετραπολικών ράβδων διέρχονται από το δεύτερο τετράπολο και μόνο συγκεκριμένα από αυτά τα παραγόμενα ιόντα διέρχονται κι από τα τρίτο τετράπολο. Όλα τα ζεύγη των ράβδων μπορούν να ελεγχθούν ως προς την εκπομπή τους έτσι ώστε να επιτρέπουν τη διέλευση σε καθορισμένες τιμές m/z [78,82]. Εικόνα 2.5:Διάταξη τριπλού τετραπόλου [82] Όταν το τριπλό τετράπολο λειτουργεί ως απλός αναλυτής ρυθμίζεται ώστε τα δύο πρώτα τετράπολα να συνεισφέρουν μόνο στην εστίαση της δέσμης των ιόντων και ο 74

75 διαχωρισμός να γίνεται στο τρίτο τετράπολο. Η μεγάλη χρησιμότητα του συστήματος όμως έγκειται στη δυνατότητα να πραγματοποιεί θραυσματοποίηση στο δεύτερο τετράπολο, με περίσσεια αδρανούς αερίου (Ar, He ή N 2 ) όπου στη συνέχεια τα παραγόμενα προϊόντα διαχωρίζονται στο τρίτο τετράπολο και ανιχνεύονται από τον ανιχνευτή [82]. Επομένως, στη διαδοχική φασματομετρία μαζών, το δεύτερο τετράπολο λειτουργεί σαν κυψελίδα συγκρούσεων (Collisioncell) σε λειτουργία "RF-only", όπου τα ιόντα συγκρούονται με περίσσεια αδρανούς αερίου παράγοντας προϊόντα ιόντα (productions). Η θραυσματοποίηση των ιόντων γίνεται μέσω συγκρούσεων και περιγράφεται από τη θεωρία Collision Induced Dissociation (CID) ή Collision Activated Dissociation (CAD). Κατά τη CID, επιλεγμένα ιόντα συγκρούονται με αέρια ουδέτερα μόρια Σύζευξη της υγροχρωματογραφίας με τη φασματομετρία μαζών (LC-MS) Η υγροχρωματογραφία σε συνδυασμό με τη φασματομετρία μαζών αποτελούν ένα ιδανικό εργαλείο για ένα εργαστήριο αναλύσεων.η τεχνική αυτή είναι ευρέως χρησιμοποιούμενη και δίνει την δυνατότητα προσδιορισμού μη-πτητικών ενώσεων, θερμοευαίσθητων ενώσεων (που δεν μπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS) καθώς και την καθαρότητα χρωματογραφικής κορυφής με ταυτόχρονη ταυτοποίηση δομής αγνώστων ενώσεων. Συνεπώς, ο συνδυασμός των δύο παραπάνω τεχνικών επιτρέπει τηνμεγαλύτερη εκλεκτικότητα σε δείγματα με περίπλοκη μήτρα καθώς κατά γίνεται εισαγωγή διαχωρισμένων ουσιών μίγματος στο φασματόμετρο μαζών, προσφέροντας έτσι αξιόπιστη ταυτοποίηση, ακόμα και εάν ο διαχωρισμός δεν είναι πλήρης, διότι ουσίες με παρόμοιους χρόνους ανάσχεσης θα παρουσιάζουν διαφοροποίηση στο φάσμα μαζών. Είναι ο συνδυασμός της υγροχρωματογραφίας με την φασματομετρία μαζών επιτρέπει αρχικά τον διαχωρισμό των ουσιών μεταξύ τους βάσει του χρόνου ανάσχεσης και έπειτα την ταυτοποίησή τους (m/z), καθώς αυτές εισέρχονται διαχωρισμένες στο MS [78, 82] 75

76 Εικόνα 2.6: Σύστημα συζευγμένης υγροχροχρωματογραφίας με φαματόμετρο μαζών (LC-MS) 76

77 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη και επικύρωση, μιας νέας πολυυπολειμματικής μεθόδου για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό 71 ψυχοτρόπων ή μη φαρμάκων, καθώς και παρανόμως διακινούμενων εξαρτησιογόνων ουσιών και των μεταβολιτών τους σε απόβλητα νερά. Η τεχνική που εφαρμόστηκε ήταν με υγροχρωματογραφία-φασματομετρία μαζών, τεχνολογίας τριπλού τετραπόλου (LC- MS/MS) με θετικό και αρνητικό ηλεκτροψεκασμό. Μια τέτοια μελέτη, σε αυτό το βαθμό είναι πραγματικά πολύ δύσκολη, επειδή υπάρχουν πολλά προβλήματα που πρέπει να ξεπεραστούν, όπως (i) η επίδραση της μήτρας λόγω των ενδογενών ενώσεων στα δείγματα (μήτρα περίπλοκη τα υγρά αστικά απόβλητα), η οποία είναι και ένα από τα σημαντικότερα μειονεκτήματα των μεθόδων που βασίζονται στην τεχνική της LC-MS/MS, ιδιαίτερα όταν συνδέονται με ιοντισμό με ηλεκτροψεκασμό (ESI) και οδηγεί σε καταστολή των αναλυτικών σημάτων (συνηθέστερα) και λανθασμένα αποτελέσματα [87,88], (ii) το ευρύ φάσμα της πολικότητας των ενώσεων, (iii) ο επαμφοτερίζον χαρακτήρας και τα διαφορετικά χημικά χαρακτηριστικά των ενώσεων και (iv) τα πολλαπλά επίπεδα των συγκεντρώσεων που συνήθως ανιχνεύονται οι ενώσεις στα απόβλητα νερά. Κατά την πορεία της ανάπτυξης της μεθόδου που πραγματοποιήθηκε λήφθηκαν υπόψη οι παραπάνω δυσκολίες και πραγματοποιήθηκε μια σειρά πειραμάτων βελτιστοποίησης. Οι παράμετροι που βελτιστοποιήθηκαν ήταν η μέθοδος καθαρισμού και προσυγκέντρωσης (SPE) των δειγμάτων, η κινητή φάση και η βαθμίδωσή της, οι παράμετροι του ESI-MS, αξιολογήθηκαν 3 διαφορετικές στήλες LC και βελτιστοποιήθηκε τη θερμοκρασία του διαχωρισμού. Η μέθοδος στη συνέχεια επικυρώθηκε ως προς τα χαρακτηριστικά της γραμμικότητας, της ακρίβειας, της πιστότητας, ενώ προσδιορίστηκαν τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης για κάθε μια από τις ενώσεις. Τέλος, η μέθοδος εφαρμόστηκε σε πραγματικά δείγματα. Έγιναν δύο δειγματοληψίες, το Δεκέμβριο του 2010 και τον Απρίλιο του 2011,σε δείγματα υγρών αποβλήτων για 15 διαφορετικές ημέρες από το ΚΕΛ Ψυτάλλειας. 77

78 Στη συνέχεια οι στόχοι του ερευνητικού έργου ήταν: Η διερεύνηση της παρουσίας αναδυόμενων ουσιών προτεραιότητας (ψυχοτρόπα ή μη φάρμακα, καθώς και παρανόμως διακινούμενων εξαρτησιογόνων ουσιών και των μεταβολιτών τους) σε δείγματα εισερχόμενων και επεξεργασμένων υγρών αποβλήτων από το ΚΕΛ Ψυτάλλειας Η μελέτη της απομάκρυνσης των συγκεκριμένων ουσιών κατά τη δευτεροβάθμια επεξεργασία που εφαρμόζεται Ο υπολογισμός των ποσοτήτων των υπό διερεύνηση ενώσεων που καταλήγουν ημερησίως στο Σαρωνικό μέσω των επεξεργασμένων αποβλήτων Η εκτίμηση της χρήσηςτων εξαρτησιογόνων ουσιών μέσω των συγκεντρώσεών τους στα εισερχόμενα υγρά απόβλητα, σε πραγματικό χρόνο 78

79 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ-ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ- ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 4.1 Υγροχρωματογραφικό σύστημα με ανιχνευτή φασματομετρίας μαζών με τριπλό τετράπολο. Το σύστημα υγρoχρωματογραφίας/διαδοχικής φασματομετρίας μαζών που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη ήταν Thermo το οποίο αποτελείται από τα εξής μέρη (Εικόνα 4.1): Φασματόμετρο μαζών με τρία τετράπολα (triple stage quadrupole analyzer) TSQ Quantum Access. Αντλία υγρoχρωματογραφίας υπερ-υψηλής απόδοσης AccelaPumpUHPLC, δύο εμβόλων και δυνατότητας βαθμιδωτής έκλουσης τεσσάρων διαλυτών. Αυτόματος δειγματολήπτης: Accella Auto sampler με ενσωματωμένο θερμοστάτη στηλών. Γεννήτρια Αζώτου Peak Scientific. Οβίδα αργού. UPS τύπου GXT2, ισχύς 6 KVA Ηλεκτρονικό υπολογιστή Dell. Λογισμικό καταγραφής και διαχείρισης δεδομένων: Xcalibur Data System (2.0 SR2, TSQ14, SUR1, LCQuan 2.5, XReport 1.0). Ο τελικός χρωματογραφικός διαχωρισμός της μεθόδου έγινε σε αναλυτική στήλη της Kinetex PFP (πενταφθοροφαίνυλο-), αντίστροφης φάσηςδιαστάσεων 50 x 2,10 mm και μέγεθος σωματιδίων 1,7 μm, παρουσία προστατευτικής στήλης C18 (phenomenex, USA) διαμέτρου 4 mm και μήκους 20 mm. Ακόμα χρησιμοποιήθηκαν δοκιμαστικά κατά την ανάπτυξη της μεθόδου και οι στήλες Kinetex C18 (100 x 2,10 mm, 2,6μm) και Kinetex XB-C18 (100 x 2,10 mm, 2,6μm) όλες από την Phenomenex TM. 79

80 Εικόνα 4.1: Υγροχρωματογραφικό σύστημα με ανιχνευτή φασματομετρίας μαζών με τριπλό τετράπολο (LC-MS/MS)της Τhermo Scientific Quantum[92] 4.2 Εργαστηριακός εξοπλισμός Στον εργαστηριακό εξοπλισμό που χρησιμοποιήθηκε περιλαμβάνονται συσκευή διήθησης διαλυτών κινητής φάσης (Millipore, XX ), διακριβωμένος αναλυτικός ζυγός τεσσάρων δεκαδικών ψηφίων (Santorius-Basic), συσκευή παραγωγής υπερκαθαρού νερού ειδικής αντίστασης 18,2 ΜΩ/cm (Millipore Direct-Q UV), αναδευτήρα περιδίνησης (Vortex-VelpScientifica), συσκευή για εκχύλιση στερεάς φάσης (Vac Elut SPS 24), πεχάμετρο (MQ30d, HACH) και θερμαινόμενη πλάκα με υποδοχείς δοκιμαστικών σωλήνων για εξάτμιση (SBH 200D/3, Stuart). Για την εξάτμιση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε οβίδα αερίου αζώτου. Χρησιμοποιήθηκαν επίσης, ογκομετρικές φιάλες των 5, 10, 50, 100, 250 και 500 ml, ποτήρια ζέσεως των 50 και των 250 ml, ογκομετρικοί κύλινδροι των 10, 50 και των 100 ml, κωνικές φιάλες των 50, 100 και 250 ml, πλαστικοί φυγοκεντρικοί σωλήνες με πώματα των 15 και 50 ml (SARSTEDT), γυάλινες και πλαστικές πιπέτες Pasteur, δοκιμαστικοί σωλήνες των 10mL, πλαστικά Eppendorf των 2 ml, αυτόματες πιπέττες μεταβλητού όγκου 1-10 μl, μl και μl (GILSON), καθώς και μl και μl (Τransferpette). Τα δείγματα για την ανάλυση στο φασματόμετρο μαζών τοποθετήθηκαν σε γυάλινα φιαλίδια αυτόματου δειγματολήπτη (vials) των 1,5 ml (GRACEALLTECH), χρησιμοποιώντας και κατάλληλους υποδοχείς (inserts) των 150 μl (Waters). Στον εργαστηριακό εξοπλισμό περιλαμβάνονται επίσης, φίλτρα σύριγγας 4 mm με μέγεθος πόρων 0,2 μm (Phenomenex), φίλτρα μεμβράνης RC 0,45 μm (Whatman) για τη διήθηση της κινητής φάσης και φίλτρα διήθησης υγρών αποβλήτων (μέγεθος πόρων: 0,7 μm, Millipore GLASS FIBRE). 80

81 Κατά την διεξαγωγή της εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE) χρησιμοποιήθηκαν πολυμερικά φυσίγγια Strata X (200 mg / 6 ml) και Strata XC (200 mg / 6 ml) της Phenomenex (USA). Η διήθηση των διαλυμάτων μετά την SPE έγινε με φίλτρα σύριγγας RF4 mm με μέγεθος πόρων 0,2 μm (Phenomenex). 4.3 Αντιδραστήρια-Διαλύτες Οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν κατά τις υγροχρωματογραφικές αναλύσεις ήταν ιδιαίτερα υψηλής καθαρότητας (LC-MS). Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν ακετονιτρίλιο (Labscan), μεθανόλη (Merck), καθώς και υπερκάθαρο νερό (18,2 ΜΩ/cm). Επίσης, παρασκευάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν: διάλυμα μυρμηκικού οξέος 0,05 % (v/v) από μυρμηκικό οξύ καθαρότητας 98% (HPLC-grade) από την Sigma Aldrich (Fluka, Germany), διάλυμα υδροχλωρίου 1Μ από πυκνό 37% από την Merck (Darmstadt, Germany), διάλυμα EDTA 5% (w/v)από την Quimica SA και διάλυμα αμμωνίας (NH 4 OH) από αμμωνία καθαρότητας 25% από την Panreac (Quimicusa, Barcelona). Ο τρόπος παρασκευής διαλυμάτων κατά την πορεία της εργασίας ήταν: Διαλύματα μυρμηκικού οξέος. Παρασκευάζεται διάλυμα μυρμηκικού οξέος 0,05% (v/v). Παραλαμβάνονται 125 μl πυκνού μυρμηκικού οξέος και αραιώνονται με υπερκάθαρο νερό σε ογκομετρική φιάλη των 250 ml. Διάλυμα EDTA 5% (w/v). Ζυγίστηκε 1 g στερεό EDTA (Etheleno diamine tetra acetic Acid Disodium Salt 2-hygrate PA - ACS) Panreac (Quimica SA) M=372,24 και διαλύθηκε σε ογκομετρική φιάλη των 20 ml με υπερκάθαρο νερό. Διάλυμα NH 4 OH 2% (v/v) σε MeOH: Λήφθηκαν 8 ml από την πυκνή αμμωνία και αραιώθηκαν σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml. Οδηγίες υγιεινής και ασφάλειας Ο βαθμός τοξικότητας και η καρκινογόνος δράση κάθε χημικού αντιδραστηρίου ή διαλύτη δεν έχουν πλήρως καθοριστεί. Εντούτοις, αντιμετωπίζονται ως πιθανά επιβλαβή για την υγεία και η έκθεση στα χημικά αυτά είναι περιορισμένη. Τα πτητικά αντιδραστήρια και οι διαλύτες διαχειρίστηκαν απαραιτήτως σε απαγωγούς. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή για τα εύφλεκτα υλικά. Ακολουθήθηκαν οι γενικοί κανόνες ασφάλειας και υγιεινής των χημικών εργαστηρίων. 81

82 4.3.1 Πρότυπες ουσίες και πρότυπα διαλύματα Χρησιμοποιήθηκαν πρότυπες ουσίες για καθεμία από τις παρακάτω ενώσεις που επιχειρείται να προσδιοριστούν και παρασκευαστήκαν πρότυπα διαλύματα.οι 71 ενώσεις ανήκουν στα οπιούχα και οπιοειδή (8), κοκαΐνη και μεταβολίτες της (3), αμφεταμίνες (5), παραισθησιογόνα (κανναβινοειδή (3), LSD (2)), βενζοδιαζεπίνες (13), αντικαταθλιπτικά (τρικυκλικά (5), τετρακυκλικά (2),SSRIs (5), SNRIs (1)), βαρβιτουρικά (2), αναισθητικά και μεταβολίτες (6), υπνωτικά (1), αντιεπιληπτικά (7), αντιψυχωτικά (6) και συμπαθομιμητικά (2). Οι δομές και οι φυσικοχημικές τους ιδιότητες (logkow, pka, μοριακό βάρος) παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.1. Όλα τα υψηλής καθαρότητας πρότυπα διαλύματα των ενώσεων (εκτός από bromazepam, lorazepam, chlorpromazine, olanzapine, sertraline, venlafaxine, citalopram, risperidone, carbamazepine, clomopramine, amitryptilline, imipramine, fluoxetine, paroxetine και ciprofloxacin που ήταν σε στερεά μορφή) παραλήφθηκαν από το Εργαστήριο Τοξικολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών και είχαν αγοραστεί από την Cerilliant (Round Rock, TX, USA). Οι ενώσεις Topiramate και lamorigine παραλήφθηκαν από την Glenmark και Sigma Aldrich (USA) αντίστοιχα, σε υψηλή καθαρότητα 98%, σε στερεά μορφή. Όλες οι δευτεριωμένες ενώσεις: MOR-D3, EDDP- D3, COD-D3, COC-D3, EME-D3, MDMA-D5, MDA-D5, THC-D3, THCA-D3, LSD-D3, αλλά και η Nalorphine, επίσης παραλήφθηκαν από το Εργαστήριο Τοξικολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών, για να χρησιμοποιηθούν ως εσωτερικά πρότυπα για την ποσοτικοποίηση. Για κάθε μια ένωση υπήρχαν ξεχωριστά διαλύματα παρακαταθήκης σε ακετόνη ή μεθανόλη σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονταν μεταξύ 10 mg/lκαι 1250 mg/l. Τα πρότυπα διαλύματα έγχυσης των ενώσεων και των εσωτερικών προτύπων (infusion) στο φασματόμετρο μαζών παρασκευάστηκαν χωριστά για την κάθε μία ένωση, λίγο πριν την απευθείας έγχυση στο MS/MS, σε συγκέντρωσης 2 mg/l και 3,3 mg/l, σε διάλυμα μείγματος ακετονιτριλίου : νερό (υπερκάθαρο) (50:50). Παρασκευάστηκε ενδιάμεσο διάλυμα μείγματος των ενώσεων και των εσωτερικών προτύπων σε συγκέντρωση 1 mg/l σε μεθανόλη και με κατάλληλη αραίωση αυτών παρασκευάζονταν τα διαλύματα εργασίας σε καθημερινή βάση σε συγκέντρωση 100 μg/l. Όλα τα πρότυπα μετά την παρασκευή τους, αποθηκεύτηκαν σε σκουρόχρωμες γυάλινες φιάλες σε θερμοκρασία -20 ο C στην κατάψυξη. 82

83 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ 71 ΨΥΧΟΤΡΟΠΩΝ Ή ΜΗ ΦΑΡΜΑΚΩΝ, ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΝΟΜΩΣ ΔΙΑΚΙΝΟΥΜΕΝΩΝ ΕΞΑΡΤΗΣΙΟΓΟΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΩΝ ΤΟΥΣ ΣΕ ΑΠΟΒΛΗΤΑ ΜΕ LC-MS/MS 5.1 Εισαγωγή Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μιας πολυ-υπoλειμματικής μεθόδου υγροχρωματογραφίας, με διαδοχική φασματομετρία μαζών (LC-MS/MS) τριπλού τετραπόλου με προγραμματισμένη παρακολούθηση πολλαπλών-αντιδράσεων (MRM), για την ταυτόχρονη ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση 71 ψυχοτρόπων ή μη φαρμάκων, καθώς και παρανόμως διακινούμενων εξαρτησιογόνων ουσιών και των μεταβολιτών τους σε υγρά απόβλητα της Ψυτάλλειας. Οι κατηγορίες των ενώσεων που έγινε ο προσδιορισμός είναι οι εξής: οπιοειδήκαι οπιούχα (8), κοκαίνη και μεταβολίτες της (3), αμφεταμίνες και μεταβολίτες της (5),τα παραισθησιογόνα (κανναβινοειδή (3), LSD (2)), βενζοδιαζεπίνες (13), αντικαταθλιπτικά (τρικυκλικά (5), τετρακυκλικά (2),SSRIs (5), SNRIs (1)), βαρβιτουρικά (2), αναισθητικά (6), υπνωτικά (1), αντιεπιληπτικά (7), αντιψυχωτικά (6) και συμπαθομιμητικά (2).Από τις εβδομήντα μία (71) ουσίες που προσδιορίστηκαν, οι 66 προσδιορίστηκαν με θετικό ιοντισμό (+) ΕSI και οι άλλες 6 με αρνητικό ιοντισμό (-) ΕSI (το topiramate προσδιορίστηκε και με θετικό και με αρνητικό ιοντισμό, ωστόσο καλύτερο στον θετικό ιοντισμό). Κατά την ανάπτυξη της μεθόδου βελτιστοποιήθηκαν: η διαδικασία της προκατεργασίας των δειγμάτων (εκχύλιση στερεάς φάσης), ο υγροχρωματογραφικός διαχωρισμος (κινητή φάση, βαθμίδωση, θερμοκρασία στήλης, όγκος έγχυσης δείγματος, 1 ή 2 SRM) και ο φασματογράφος μαζών με ηλεκτροψεκασμό σε θετικό και αρνητικό ιοντισμό ως προς τις περισσότερες παραμέτους του. Η μέθοδος, στη συνέχεια, επικυρώθηκε ως προς τα χαρακτηριστικά της γραμμικότητας, της ακρίβειας, της πιστότητας καθώς προσδιορίστηκαν και τα όρια ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικοποίησης (LOQ). 83

84 5.2 Βελτιστοποίηση παραμέτρων φασματομετρίας μαζών (MS/MS) Ο ηλεκτροψεκασμός (electrospray ionization, ESI) είναι η τεχνική ιοντισμού που εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμότων 71 ενώσεων, εκ των οποίων οι 66 προσδιορίστηκαν με θετικό ιοντισμό και οι 6 με αρνητικό. Το topiramate και τα cannabinoidμπορούσαν να προσδιοριστούν και με τις δύο πολικότητες ωστόσο ενώ το topiramate έδινε κορυφές καλές με ευαισθησία και στις δύο πολικότητες, τα cannabinoid εμφάνιζαν με διαφορά καλύτερες κορυφές στον θετικό. Σε αρχικό τώρα στάδιο για να επιτευχθούν μεγάλης έντασης κορυφές και καθαρά χρωματογραφήματα στη μέθοδο προσδιορισμού, είναι αναγκαία η βελτιστοποίηση των διαφόρων παραμέτρων στο φασματόμετρο μαζών καθώς και η εύρεση των μητρικών και θυγατρικών ιόντων. Η επιλεγόμενη τεχνική με ηλεκτροψεκασμό έχει τη δυνατότητα να παράγει ιόντα, της προς ανάλυση ένωσης, στην υγρή φάση και να τα μετατρέπει σε ιόντα στην αέρια φάση, με εφαρμογή υψηλής τάσης κατάλληλης πολικότητας (θετικής ή αρνητικής). Για τον προσδιορισμό των μητρικών και των θυγατρικών ιόντων χρησιμοποιήθηκε η τεχνική SRM. Η τεχνική αυτή είναι γνωστή ως Selected Reaction Monitoring (SRM) και αποτελεί την πιο διαδεδομένη τεχνική λειτουργίας των συστημάτων LC-MS/MS για ποιοτική και ποσοτική ανάλυση. Χαρακτηριστικό της τεχνικής αυτής, είναι η δυνατότητα ταυτόχρονης παρακολούθησης της θραυσματοποίησης πολλαπλών (επιλεγμένων) μητρικών ιόντων και καταγραφής του σήματος των αντίστοιχων θυγατρικών ιόντων τους, χρησιμοποιώντας τους λόγους m/z κάθε ένωσης, για την ταυτοποίηση τους. Στο πρώτο τετράπολο επιλέγονται τα μητρικά ιόντα τα οποία θραυσματοποιούνται στο δεύτερο τετράπολο και τα θραύσματά τους (θυγατρικά ιόντα) ανιχνεύονται στο τρίτο τετράπολο. Ο συνδυασμός επιλεγμένου μητρικού και θυγατρικού ή θυγατρικών ιόντων μαζί με το χρόνο ανάσχεσης (t R ), αποτελεί τοαποτύπωμα για την κάθε χημική ουσία. Για την διαδικασία επιλογής SRM έγιναν πειράματα απευθείας έγχυσης προτύπων διαλυμάτων των ενώσεων (infusion), χωριστά για την κάθε μία, στο φασματόμετρο μαζών, συγκεντρώσεων μεταξύ 2 3,3 mg/l, σε μίγμα διαλυτών ακετονιτριλίου (ACN) / υπερκάθαρου νερού (50:50, v/v) με ροή15 μl/min, χρησιμοποιώντας μια συνδεδεμένη αντλία σύριγγας. Στην παραπάνω διαδικασία δεν εμπλέκεται καθόλου ο 84

85 χρωματογράφος (HPLC), καθώς η έγχυση πραγματοποιείται απευθείας στο φασματόμετρο μαζών. Στη συνέχεια η κάθε ένωση μελετήθηκε έτσι ώστε να βρεθούν οι βέλτιστες τιμές των παραμέτρων για την πηγή ιοντισμού, τους ιοντικούς φακούς και τις παραμέτρους του τριπλού τετραπόλου. Οι παράμετροι που μελετήθηκαν ήταν οι εξής: Η πολικότητα (positive/negative ionization), η θέση του ακροσωλήνιου ιοντισμού (probe), η τιμή του εφαρμοζόμενου δυναμικού (spray voltage), οι παροχές του αερίου εκνέφωσης (N 2 ) (sheath gas), οι παροχές του αερίου ξήρανσης (Ν 2 ) (auxiliary gas) η θερμοκρασία του αγωγού μεταφοράς των ιόντων από τον κώνο εισόδου στο εσωτερικό του φασματομέτρου (Ion transfer capillary temperature) η εφαρμοζόμενη τάση στις διατάξεις επιτάχυνσης και εστίασης των ιόντων (Tube lens offset) η ενέργεια θραυσματοποίησης (collision energy) και η πίεση θραυσματοποίσησης (collision pressure). Η βελτιστοποίηση έγινε και στις δύο πολικότητες (θετική και αρνητική) καθώς προσδιορίστηκαν και οι βέλτιστες τιμές για την εφαρμοζόμενη τάση, την ενέργεια θραυσματοποίησης και την πίεση του αερίου θραυσματοποίησης, η τιμή της οποίας δεν πρέπει να αλλάζει κατά τη διάρκεια της ανάλυσης, κατά συνέπεια να παραμένει σταθερή για όλες τις ενώσεις. Αφού βρέθηκαν οι βέλτιστες παράμετροι, η ταυτοποίηση και ο ποσοτικός προσδιορισμός έγιναν με «ταυτόχρονη» παρακολούθηση πολλών μεταπτώσεων (Multiple Reaction Monitoring, MRM). Δύο χαρακτηριστικέςμεταπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ένωση για την παρακολούθησή της. Η πλέον άφθονη μετάπτωση (πρόδρομο / προϊόν ιόν Ι) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση και η δεύτερη μετάπτωση (πρόδρομο / προϊόν ιόν ΙΙ) για την ταυτοποίηση. 5.3 Βελτιστοποίηση παραμέτρων υγροχρωματογραφίας (HPLC) Σε ένα χρωματογραφικό σύστημα ο κύριος σκοπός είναι η βελτιστοποίηση των χρωματογραφιμάτων, ειδικά όταν είναι απαραίτητη η ανάλυση τόσων πολλών ενώσεων. Βασικές παράμετροι θεωρούνται, η κατάλληλη επιλογή της 85

86 χρωματογραφικής στήλης (στατική φάση) και ο σωστός προσδιορισμός της σύνθεσης και διάταξης (συνδυασμός) των διαλυτών που θα αποτελέσουν την κινητή φάση, ώστε να επιτευχθούν καλύτεροι διαχωρισμοί των ενώσεων σε μικρότερο χρόνο. Έτσι μετά την βελτιστοποίηση των παραμέτρων μαζών ακολούθησε βελτιστοποίηση των παραμέτρων του χρωματογράφου (HPLC), όπως (1) η επιλογή της κινητής φάσης, (2) το πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης, (3) ο όγκος έγχυσης του δείγματος, (4) επιλογή κατάλληλης στήλης και (5) θερμοκρασία της στήλης. Η συγκέντρωση του προτύπου των ενώσεων που χρησιμοποιούσαμε κάθε φορά ήταν 100 μl/l. 5.4 Προκατεργασία δειγμάτων και βελτιστοποίηση της διαδικασίας καθαρισμού και προσυγκέντρωσης (εκχύλιση στερεάς φάσης, SPE) για τον προσδιορισμό των ενώσεων σε υγρά απόβλητα Όλα τα δείγματα υγρών αποβλήτων, αμέσως μετά την συλλογή τους έφτασαν στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας σε πλαστικά μπουκάλια των 1,5 L. Από αυτά λήφθηκαν 50 ml από το καθένα και διηθήθηκαν (GFF fiber filters) και το ph τους ρυθμίστηκε στην τιμή 2,5 με HCl 1M. Στη συνέχεια προστέθηκαν σε κάθε δείγμα κατάλληλες συγκεντρώσεις εσωτερικών προτύπων (1 μg/lspike αρχικό) (MOR-d3, EDDP-d3, COC-d3, EME-d3, MDMA-d5, MDA-d5, THC-d3, THCA-D3, LSD-d3, CODd3) για την ποσοτικοποίηση και ταυτοποίηση των ενώσεων και ακολούθησε το στάδιο της εκχύλισης των δειγμάτων, με εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE), για τον καθαρισμό των δειγμάτων και για την προσυγκέντρωση των αναλυτών. Στην παρούσα μελέτη δοκιμάστηκαν δύο είδη πολυμερικών διαχωριστικών μικροστηλών (φυσίγγια) SPE, μια αντίστροφης φάσης, Strata X και μία ισχυρά κατιονανταλλακτική και αντίστροφης φάσης, Strata X-C. Στην Εικόνα 5.1 παρακάτω φαίνονται τα προσροφητικά υλικά της κάθε μιας από αυτές. 86

87 Εικόνα 5.1: Πολυμερικά προσροφητικά υλικά των δύο χρησιμοποιούμενων φυσιγγίων κατά τις δοκιμές εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE), του Strata - XC και Strata X [93] Η επιλογή των δύο προσροφητικών έγινε με βάση τη μελέτη των ιδιοτήτων τους και τη βιβλιογραφική ανασκόπηση. Η εκλεκτικότητα του Stara-X οφείλεται στο ευέλικτο προσροφητικό που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το διαχωρισμό τόσο πολικών όσο και μη-πολικών ενώσεων καθώς αποτελείται από υδρόφιλους (δεσμούς υδρογόνου), υδρόφοβους και αρωματικούς (ισχυρούς π-π δεσμούς) μηχανισμούς κατακράτησης. Από την άλλη η εκλεκτικότητα του Strata-XC οφείλεται στις υψηλές ανακτήσεις που έχει αποδειχτεί ότι δίνει για βασικές ενώσεις χρησιμοποιώντας την ισχυρή αλληλεπίδραση (κατιοντική) της ανταλλαγής ιόντων, επιπλέον εμφανίζει μικτή λειτουργικότητα περιλαμβάνοντας μηχανισμούς κατακράτησης με π-π εκλεκτικότητα για αρωματικές βάσεις [94]. Η SPE διαδικασία για το Strata-Χ ελήφθη από την εργασία του Gros et al. [95] και για το Strata-XC από την εργασία του Bisceglia et al. [42], και στις δύο περιπτώσεις όμως έγιναν τροποποιήσεις στην μέθοδο. Στα φυσίγγια Strata-X (200 mg/6ml) η ενεργοποίηση έγινε με 6 ml μεθανόλη και 6 ml υπερκάθαρο νερό, υπό βαρύτητα. Κατά την διάρκεια της προκατεργασίας τωνδειγμάτων όταν ήταν να γίνει ο καθαρισμός και η προσυγκέντρωση με τα φυσίγγια Strata-X, μαζί με τα εσωτερικά πρότυπα προστίθεται και 1 ml EDTA (5% w/v). Στο στάδιο αυτό έγιναν δοκιμές με ή χωρίς EDTA, χωρίς κάποια σημαντική ωστόσο επίδραση. Τα δείγματα φορτώθηκαν στα φυσίγγια και ακολούθησε έκπλυση με 6 ml υπερκάθαρο νερό και ξήρανση για 1 ώρα υπό κενό στα 8 psi. Στο στάδιο αυτό δοκιμάστηκε και η εφαρμογή υψηλοτέρου κενού, παρόλα αυτά αποδείχθηκε ανεπιθύμητη. Οι αναλύτες εκλούστηκαν με 3 2 ml μεθανόλης και μετά το έκλουσμα 87

88 εξατμίθηκαν μέχρι ξηρού υπό συνεχές ρεύμα αζώτου Ν 2 στους 40 C. Τα εκχυλίσματα ανασυστάθηκαν στα 500 μl με διαλύτη σε αναλογία 54% MeOH : 46% υπερκάθαρο νερό, ακολούθησε 1-2 min ανάδευση (vortex) και στη συνέχεια τα εκχυλίσματα διηθήθηκαν σε φίλτρο σύριγγας 0,2 mm. Σχεδιάγραμμα 5.1: Πορεία ανάλυσης κατά την ανάπτυξη της μεθόδου, με τα δύο διαφορετικά φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Στην τελική μέθοδο, το Strata-XC (200 mg, 6mL) αποδείχθηκε το επιλεγόμενο και καταλληλότερο φυσίγγιο. Η ενεργοποίηση του φυσιγγίου εκτελέστηκε υπό βαρύτητα με 6ml μεθανόλης και 6 ml υπερκάθαρου οξινισμένου νερού (ρυθμισμένο σε pη 2,5 χρησιμοποιώντας ΗCΙ 1Μ). Στη συνέχεια, φορτώθηκαν τα δείγματα (50 ml) επίσης υπό τη βαρύτητα. Πριν την έκλουση των προσροφημένων αναλυτών, το φυσίγγιο εκπλύθηκε με 3 mlυπερκαθαρό οξινισμένο νερό pη 2,5, και ακολούθησε ξήρανση υπό κενό για 1 ώρα και 8 psi. Η έκλουση πραγματοποιήθηκε με 3 2 ml, διαλύτη μεθανόλης με 2% ΝΗ 4 ΟΗ (pη ~ 10). Το ΝΗ 4 ΟΗ χρησιμοποιήθηκε ώστε να μπορούν να εκλουστούν και οι όξινες ενώσεις από το κατιον-ανταλλακτικό προσροφητικό υλικό. Τα βήματα της εξάτμισης, επαναδιαλυτοποίησης και διήθησης είναι τα ίδια με το Strata-X. 88

89 Τα δείγματα για την ανάλυση στο φασματόμετρο μαζών τοποθετήθηκαν σε γυάλινα φιαλίδια αυτόματου δειγματολήπτη (vials) των 1,5 ml. 5.5 Επικύρωση μεθόδου Η επικύρωση της μεθόδου έχει να κάνει με την αξιολόγηση των χαρακτηριστικών ποιότητας της μεθόδου μέσω πειραματικής τεκμηρίωσης και την εξέταση της ανταπόκρισής της προς τις προδιαγραφές για να αποδειχθεί ότι είναι κατάλληλη για τον σκοπό για τον οποίο προορίζεται [96]. Στο τελικό πρωτόκολλο της μεθόδου που προέκυψε μετά τη βελτιστοποίηση, έγινε επικύρωση της μεθόδου. Τα χαρακτηριστικά ποιότητας που αξιολογήθηκαν είναι: η γραμμικότητα της καμπύλης βαθμονόμησης, η ανιχνευσιμότητα (LOD και LOQ), η επαναληψιμότητα της μεθόδου και η ορθότητα (με ανακτήσεις). Στην Εικόνα 5.2 παρουσιάζεται η πορεία της πειραματικής μεθόδου λεπτομερώς. Εικόνα 5.2: Λεπτομερής περιγραφή της τελικής βέλτιστης μεθόδου προκατεργασίας του δείγματος για τον προσδιορισμό ψυχοτρόπων ή μη φαρμακευτικών, καθώς και παρανόμως διακινούμενων εξαρτησιογόνων ουσιών 89

90 5.5.1 Γραμμικότητα καμπύλης βαθμονόμησης Η γραμμικότητα, αποδεικνύεται με οπτική εξέταση του διαγράμματος αναλυτικό σήμα ως προς την συγκέντρωση. Αξιολογείται δε με στατιστικές μεθόδους (μέθοδος ελαχίστων τετραγώνων) και υπολογίζεται η εξίσωσή της [96]. Για την επίτευξη του προσδιορισμού της γραμμικής περιοχής παρασκευάστηκαν 7 πρότυπα διαλύματα όλων των ενώσεων σε διαλύτη (54% μεθανόλη : 46% υπερκάθαρο νερό) σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονταν από 1 μg / L έως 100 μg / L (κάθε ένα μετρήθηκε εις τετραπλούν). Όπως είναι συνηθισμένο και επιθυμητό ταυτόχρονα, η γραφική παράσταση πρέπει να προσεγγίζει μια ευθεία γραμμή. Ωστόσο δεν βρίσκονται όλα τα δεδομένα ακριβώς πάνω στη γραμμή λόγω τυχαίων σφαλμάτων στη διαδικασία μέτρησης. Ένας τρόπος εξεύρεσης της καλύτερης ευθείας είναι η μέθοδος ελαχίστων τετραγώνων, η εξίσωση της οποίας είναι της μορφής: y = a+ bx (Σχέση 5.1) όπου, y: ηαναλυτική παράμετρος (εξαρτημένη μεταβλητή). Ως αναλυτική παράμετρος χρησιμοποιήθηκε τόσο το εμβαδό της κορυφής κάθε πρότυπης ουσίας (area) όσο και ο λόγος απόκρισης. x: η συγκέντρωση της κάθε πρότυπης ουσίας (ανεξάρτητη μεταβλητή). a: η τομή της ευθείας με τον άξονα y. b : η κλίση της ευθείας παλινδρόμησης. Μέτρο της γραμμικότητας αποτελεί ο συντελεστής προσδιορισμού συσχέτισης R 2, ο οποίος σύμφωνα με τα κριτήρια που έθεσε το Καναδικό Τμήμα Προστασίας της Υγείας (CHPB), πρέπει να είναι μεγαλύτερος από 0,997 [96] Όρια ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικοποίησης (LOQ) μεθόδου Η ανιχνευσιμότητα εκφράζει την ικανότητα της μεθόδου να ανιχνεύει / ποσοτικοποιεί χαμηλές συγκεντρώσεις του αναλύτη. Η ικανότητα αυτή ποσοτικοποιείται με δύο εκφράσεις: το όριο ανίχνευσης (LOD) και το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ). Ως όριο 90

91 ανίχνευσης ορίζεται η ελάχιστη συγκέντρωση του αναλύτη, η οποία μπορεί να ανιχνευτεί με καθορισμένη στάθμη (ή επίπεδο) εμπιστοσύνης, ενώ όριο ποσοτικοποίησης είναι η ελάχιστη συγκέντρωση αναλύτη που μπορεί να προσδιοριστεί με ακρίβεια. Ο ορισμός αυτών των ορίων βασίζεται στην ικανότητα της μεθόδου να διακρίνει το σήμα του αναλύτη από το σήμα του υποβάθρου ή θορύβου και τα σφάλματα πρώτου και δεύτερου είδους [96]. Το όριο ανίχνευσης και το όριο ποσοτικοποίησης μπορούν να υπολογιστούν με πολλούς τρόπους. Ο υπολογισμός των ορίων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης έγινε στην παρούσα εργασία ως εξής: Όπου, b: η κλίση από το εμβολιασμένο δείγμα SD: η τυπική απόκλιση από την ανάλυση τέσσερις φορές του πρότυπου διαλύματος σε διαλύτη, της χαμηλότερης συγκέντρωσης 1 μg/l Πιστότητα Η πιστότητα εκφράζει την προσέγγιση της συμφωνίας μεταξύ των επαναλαμβανομένων αποτελεσμάτων της μεθόδου. Η πιστότητα περιγράφεται ως η ποσότητα που μετρά την διασπορά των αποτελεσμάτων όταν η αναλυτική μεθοδολογία επαναλαμβάνεται σε ένα δείγμα. Η διασπορά τώρα των αποτελεσμάτων προκαλείται από διάφορες τυχαίες πηγές και βρίσκεται γύρω από την αναμενόμενη τιμή όταν δεν υπάρχουν συστηματικά σφάλματα. Τα υποσύνολα της πιστότητας είναι η επαναληψιμότητα και η αναπαραγωγιμότητα. Η πιστότητα συχνά ορίζεται ως η τυπική απόκλιση (SD) ή ως η εκατοστιαία σχετική τυπική απόκλιση (% RSD) μιας σειράς μετρήσεων [96]. Η επαναληψιμότητα των αναλυτικών αποτελεσμάτων αποτελεί τον βαθμό αμοιβαίας συμφωνίας μεταξύ των δεδομένων τα οποία λαμβάνονται με τον ίδιο τρόπο, κάτω από τις ίδιες συνθήκες (ίδια μέθοδος ελέγχου, ίδιος αναλύτης, ίδια συσκευή, ίδιο εργαστήριο). Η επαναληψιμότητα αποτελεί το μέτρο του τυχαίου ή απροσδιόριστου 91

92 σφάλματος της ανάλυσης και περιγράφεται από την μέση τιμή, την τυπική απόκλιση (SD) και την επί της εκατό σχετική τυπική απόκλιση (%RSD) Ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα μεθόδου Ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα είναι το μέτρο της διασποράς μεταξύ των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με την ίδια μέθοδο, στο ίδιο δείγμα και στο ίδιο εργαστήριο, κάτω από διαφορετικές συνθήκες, όπως σε διαφορετική μέρα, σε διαφορετικές παρτίδες αντιδραστηρίων, σε διαφορετικούς χρόνους, διαφορετικό αναλυτή [96]. Για τον έλεγχο της αναπαραγωγιμότητας της μεθόδου, αναλύθηκαν 5 υποδείγματα ενός δείγματος υγρού αποβλήτου, τα οποία αναλύθηκαν σε διαφορετικές εργαστηριακές ημέρες σύμφωνα με το πρωτόκολλο της μεθόδου. Η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα ελέγχθηκε με βάση την διακύμανση της ανάκτησης, από μέρα σε μέρα. Η ανάκτηση του κάθε υποδείγματος υπολογίστηκε με βάση το ιόν ποσοτικοποίησης της κάθε ουσίας, εν συνεχεία υπολογίστηκαν η μέση ανάκτηση, η τυπική απόκλιση και η εκατοστιαία σχετική τυπική απόκλιση (%RSD). Η σχέση που δίνει την ανάκτηση είναι: ό ή έ ί ό ή έ ή (Σχέση 5.4) Ορθότητα Η ακρίβεια περιγράφει την ορθότητα του πειραματικού αποτελέσματος. Η ακρίβεια αναφέρεται στη διαφορά (σφάλμα) μεταξύ του μέσου όρου X MO, μιας σειράς μετρήσεων και της τιμής μ, που είναι η ορθή τιμή της μετρούμενης ποσότητας, ενώ η διαφορά (X MO μ) (συστηματικό σφάλμα) της μεθόδου, εκφράζει την ορθότητα της μεθόδου. Η ορθότητα ελέγχεται με την ανάκτηση [96]. Οι ανακτήσεις υπολογίστηκαν σε 3 δείγματα ίδιας μήτρας με σύνολο μετρήσεων 6 συνολικά. 92

93 5.5.5 Μελέτη φαινομένου επίδρασης μήτρας H LC - MS / MS είναι μια ισχυρή αναλυτική τεχνική για ποσοτικοποιήσεις λόγω της υψηλής ευαισθησίας και της εκλεκτικότητά της. Ωστόσο, η LC-MS/MS τεχνική δεν είναι απαλλαγμένη από μειονεκτήματα. Το βασικό μειονέκτημά της είναι οι επιδράσεις της μήτρας. Το φαινόμενο αυτό μπορεί να επηρεάσει στη συγκεκριμένη τεχνική σε μεγάλο βαθμό τα χαρακτηριστικά επίδοσης της μεθόδου προσδιορισμού όπως το όριο ανίχνευσης (LOD), όριο ποσοτικοποίησης (LOQ), γραμμικότητα και την ακρίβεια [97]. Στη χημική ανάλυση με τον όρο μήτρα εννοούμε όλα εκείνα τα συστατικά του δείγματος εκτός από τον αναλύτη. Η μήτρα μπορεί να έχει ένασημαντική επίδραση στον τρόπο που διεξάγεται η ανάλυση και στην ποιότητα των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται. Ως επίδραση μήτρας ορίζεται η επίδραση της ταυτόχρονης έκλουσης υπολειμματικών συστατικών της μήτρας, στον ιοντισμό της ένωσης στόχου. Το φαινόμενο αυτό είναι αποτέλεσμα ανταγωνισμού για ιοντισμό μεταξύ των διαφόρων ειδών που εκλούονται από τη στήλη και επηρεάζει την απόκριση ενός αναλύτη, είτε θετικά είτε αρνητικά. Συνήθως η καταστολή του σήματος (Ion suppression) ή ο εμπλουτισμός του (Ion enhancement), στην τεχνική υγροχρωματογραφίαςφασματομετρίας μάζας, συνοδεύεται από μειωμένη πιστότητα και ορθότητα. Η ποσοτική εκτίμηση των επιδράσεων της μήτρας ορίζεται από την τιμή του «παράγοντα μήτρας» (ΜF: matrix factor) που δίνεται με την εξίσωση [88, 97]: Παράγονταςμήτρας Απόκρισηπαρουσίαμήτρας Απόκρισηαπουσίαμήτρας Όταν ο παράγοντας μήτρας είναι μεγαλύτερος της μονάδας υποδηλώνει ενίσχυση του σήματος, ενώ όταν είναι μικρότερος της μονάδας υποδηλώνει καταστολή του σήματος (όταν είναιίση με ένα δεν εμφανίζεται επίδραση μήτρας). Αντίστοιχα, η σχέση υπολογισμού της επίδρασης της μήτρας (ME) προκύπτει από τη σχέση: %Επίδραση Υποστρώματος (ΜΕ) =[(MF-1)] 100 Σχέση 93

94 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 6.1 Εύρεση πρόδρομων και προϊόντων ιόντων και βελτιστοποίηση των παραμέτρων του ΜS/MS Όλες οι παράμετροι του MS/MS προσδιορίστηκαν και βελτιστοποιήθηκαν με πειράματα απευθείας έγχυσης (ιnfusion), προτύπων διαλυμάτων για κάθε ένωση. Όλα τα πρότυπα διαλύματα είχαν συγκεντρώσεις μεταξύ 1,5 3,0 μg/ml και ήταν παρασκευασμένα σε μίγμα διαλυτών ακετονιτριλίου και υπερκάθαρου νερού σε αναλογία 1:1. Κατά την διαδικασία αυτή βρέθηκαν τα μητρικά και θυγατρικά ιόντα και η καμπύλη θραυσματοποίησης (εικόνα 6.1) σε πίεση θραυσματοποίησης 1,5 mtorr (υποχρεωτικά κοινή για όλους τους αναλύτες), για κάθε ένωσηκαι βελτιστοποιήθηκαν όλες οι παράμετροι που αναφέρονται στο εδάφιο 5.2. Επιλέχτηκαν τα δυο θραύσματα με το ισχυρότερο σήμα και χρησιμοποιήθηκαν στην μέθοδο SRM. Οι περισσότερες ενώσεις οι οποίες ήταν βασικές δοκιμάστηκαν με θετικό ιοντισμό, ενώ οι ενώσεις που ήταν όξινες ή ουδέτερες με τάση να δώσουν πρωτόνιο δοκιμάστηκαν με αρνητικό ιοντισμό. Από τις 71 ενώσεις βρέθηκε ότι οι 66 ενώσεις δίνουν σήμα σε θετικό ιοντισμό, ενώ οι 6 σε αρνητικό ιονισμό. Ο προσδιορισμός του THC και THC-COOHέγινε και με τους δύο τρόπους ιοντισμού, ωστόσο οι δύο ενώσεις ιοντίζονταν καλύτερα και δίνανε ισχυρότερο σήμα με θετικό ιοντισμό για αυτό και στην παρούσα εργασία προσδιορίστηκαν με αυτόν. Το topiramate επίσης, προσδιορίζονταν καλά και με τους δυο τρόπους ιοντισμού ωστόσο προτιμήθηκεο θετικός ιοντισμός. Στην περίπτωση του προσδιορισμού των 66 ενώσεων με θετικό ιοντισμό, το πρόδρομο ιόν ήταν της μορφής [M+H] +, πιθανώς από την πρωτονίωση της αμινομάδας, εκτός από το topiramate οπού το φάσμα μαζών έδειξε ότι υπήρχε προσθήκη νατρίου με την δημιουργία του ιόντος [M+Na] +. Στον αρνητικό ιοντισμό όλα τα μητρικά ιόντα ήταν της μορφής [M-H] -. Όλες οι τιμές μάζας / φορτίο με τις αντίστοιχες τιμές τάσεων και ενεργειών θραυσματοποίησης φαίνονται στον πίνακα 6.2. Στον θετικό ιοντισμό λόγο της υψηλής ευαισθησίας και ισχυρότερων σημάτων που δίνανε τα θραύσματα των ενώσεων, οι βέλτιστες παράμετροι του MS δεν ήταν δύσκολο να εντοπιστούν, και είναι όπως φαίνονται στον παρακάτω πίνακα 6.1. Η θέση του ακροσωλήνιου ιοντισμού (probe), που επηρεάζει το σήμα και την ανθεκτικότητα μιας 94

95 μεθόδου βελτιστοποιήθηκε στις τρεις διαστάσεις, στην κάθετη στην θέση (vertical) στο C, από πλευρά σε πλευρά (side to side)στο 0,5 και η τιμή στα μικρόμετρα (micrometer) ήταν στο 1,5 και για τους δύο τύπους ιοντισμού. Στον αρνητικό ιοντισμό έγιναν πιο πολλά πειράματα βελτιστοποίησης λόγω της χαμηλής ευαισθησίας και χαμηλών σημάτων. Έτσι δοκιμάστηκαν αλλαγές στο αερίου ξήρανσης από 0 έως 12 a.u. διατηρώντας τις άλλες παραμέτρους σταθερές, παρόλα αυτά δεν παρατηρήθηκεκάποια τάση, έτσι κατόπιν συμβιβασμού επιλέχθηκε το 7 a.u. ως βέλτιστη (εικόνα 6.2). Με το αέριο ξήρανσης στους 7 a.u. η βέλτιστη τιμή του αερίου εκνέφωσης N 2 ήταν η προφανής τιμή 10 a.u (εικόνα 6.3). Η βέλτιστη τιμή του εφαρμοζόμενου δυναμικού ήταν 3200 Volt, αλλά η τιμή αυτή απορρίφθηκε διότι δημιουργούσε εκκενώσεις στον κώνο και προτιμήθηκε η τιμή 2700 Volt. Ακόμα, καθώς η θερμοκρασία του αγωγού μεταφοράς των ιόντων από τον κώνο εισόδου στο εσωτερικό του φασματόμετρου, αυξανόταν έως τους 330 Cπαρατηρήθηκαν καλύτερες ευαισθησίες, αλλά παράλληλα είχαμε και την δημιουργία εκκενώσεων στον κώνο έτσι προτιμήθηκε η τιμή της να είναι στους 300 C. Εικόνα 6.1: Καμπύλες βελτιστοποίησης εφαρμοζόμενης τάσης και θραυσματοποίησης και φάσμα μαζών 95

96 Πίνακας 6.1: Οι βέλτιστες τελικές παράμετροι του φασματόμετρου μαζών MS/MS Επιλεγόμενες Βέλτιστες Τιμές Πολικότητα Θέση ακροσωληνίου ιοντισμού (Probe) Θετικός Ιοντισμός ESI (+) C Αρνητικός Ιοντισμός ESI (-) C Δυναμικό (Spray Voltage) 3500 Volt 2700 Volt Αέριοεκνέφωσης N 2 (Sheath gas) Αέριο ξήρανσης (Auxiliary gas) Θερμοκρασία αγωγού μεταφοράς των ιόντων από τον κώνο εισόδου στο εσωτερικό του φασματόμετρου (TransferCapillaryTemperature) 30 A.U. 10 A.U. 10 A.U. 7 A.U. 270 C 300 C Εικόνα 6.2: Βελτιστοποίηση του αερίου ξήρανσης στο ESI-MS/MS στον αρνητικό ιοντισμό, όπου είναι στο a: 0 a.u, b: 5 a.u, c: 10 a.u, d: 3 a.u, e: 7 a.u και στο f: 12 a.u, όταν το αέριο εκνέφωσης είναι 30 a.u, η θερμοκρασία κώνου 270 o C και το δυναμικό 2500 V. 96

97 Εικόνα 6.3: Βελτιστοποίηση του αερίου εκνέφωσης στο ESI-MS/MS στον αρνητικό ιοντισμό, όπου είναι στο a: 10 a.u, b: 20 a.u, c: 5 a.u και d: 15 a.u, όταν το αέριο ξήρανσης είναι 7 a.u, η θερμοκρασία κώνου 270 o C και το δυναμικό 2500 V. Πίνακας 6.2: Παράμετροι φασματόμετρου μαζών MS/MS και οι χρόνοι ανάσχεσης των ενώσεων μετά από την τελική επιλογή κινητής φάσης και στήλης (PFP) N/N Ένωση Πρόδρομο ιόν (m/z) Tube Lens (V) Προϊόν ιόν 1 (m/z) (Θ 1) Προϊόν ιόν 2 (m/z) (Θ 2) CE in (V) (Θ 1/Θ 2) Χρόνος Ανάσχεσης (t R±sd), n=6 (PFP) Ενώσεις που αναλύθηκαν με θετικό ιοντισμό 1 Morphine (MOR) , /33 8,68±0,46 2 Heroin (HER) , /30 19,43±0, MAM , /25 15,02±0,15 4 Methadone , /28 32,63±1,02 5 EDDP , /23 30,79±1,01 6 Codeine (COD) , /39 14,29±0,16 7 Oxycodone (OC) , /29 15,60±0,17 8 Bupronorphine , /49 25,68±0,38 9 Cocaine (COC) , /25 21,98±0,34 97

98 10 BECG , /30 16,20±0,13 11 EME , /27 2,15±0,06 12 MDMA , /20 18,42±0,24 13 MDEA , /22 20,53±0,30 14 MDA , /17 16,89±0,22 15 MA , /10 18,04±0,27 16 Amphetamine , /6 15,75±0,28 17 Δ9-THC , /31 26,03±0, nor-Δ9-THCA , /26 24,19±0,08 19 Cannabidiol , /18 24,77±0,47 20 LSD , /28 21,75±0,24 21 OH-LSD , /31 16,56±0,17 22 Alprazolam , /38 19,87±0,06 23 Bromazepam , /26 17,62±0,07 24 Chlordiazepoxide , /15 20,87±0,22 25 Clobazam , /32 19,22±0,06 26 Diazepam , /27 20,93±0,08 27 Nordiazepam , /26 19,99±0,07 28 Flunitrazepam , /33 20,02±0, amineflunitrazepam , /26 16,29±0,08 30 Lorazepam , /14 18,84±0,06 31 Nitrazepam , /14 19,56±0,06 32 Midazolam , /33 25,20±0,46 98

99 33 Oxazepam , /14 19,02±0,06 34 Temazepam , /13 19,71±0,06 35 Chlorpromazine , /23 30,92±0,66 36 Clozapine , /39 26,35±0,57 37 Norclozapine , /23 26,61±0,67 38 Olanzapine , /29 25,67±0,24 39 Risperidone , /42 28,40±0, OH-Risperidone , /39 23,92±1,51 41 Lidocaine , /32 19,87±0,29 42 Fentanyl , /34 27,29±0,58 43 Norfentanyl , /15 19,32±0,25 44 Ketamine , /13 21,04±0,36 45 Norketamine , /29 19,11±0,30 46 Carbamazepine , /30 15,74±0,07 47 Lamotrigine , /27 19,02±0,15 48 Topiramate , /19 16,70±0,11 49 Levetiracetam , /5 10,01±0,30 50 Primidone , /29 14,27±0,10 51 Amitriptylline , /25 29,27±0,63 52 Nortryptiline , /31 28,62±0,54 53 Clomipramine , /39 32,38±0,82 54 Imipramine , /35 29,19±0,65 55 Doxepine , /15 26,53±0,47 56 Mirtazapine , /23 21,34±0,36 99

100 57 8-OH mirtazapine , /23 17,72±0,19 58 Citalopram , /19 28,55±0,63 59 Fluoxetine , /74 31,93±1,93 60 Paroxetine , /34 28,72±0,50 61 Sertraline , /26 31,67±0,75 62 Norsertraline , /25 30,59±0,63 63 Venlafaxine , /28 22,98±0,32 64 Zopiclone , /31 19,00±0,19 65 Ephedrine , /24 13,81±0,28 66 Norephedrine , /17 8,08±0,37 Ενώσεις που αναλύθηκαν με αρνητικό ιοντισμό 1 Pentobarbital , /18 11,19±0,08 2 Phenobarbital , /17 8,55±0,06 3 Thiopental , /17 2,07±0,07 4 Topiramate , /25 9,86±0,01 5 Phenytoin , /22 10,82±0,04 6 Valproic acid , /- 13,01±0,10 7 THC , /30 18,26±0,10 8 THCA , /32 16,81±0,09 Εσωτερικά Πρότυπα Ενώσεις που αναλύθηκαν με θετικό ιοντισμό 1 MOR-D , /37 8,63±0,46 2 EDDP-D , /23 30,86±1,02 3 COD-D , /- 14,28±0,16 100

101 4 COC-D , /- 21,99±0,35 5 EME-D , /- 2,15±0,05 6 MDMA-D , /- 18,38±0,24 7 MDA-D , /- 16,86±0,19 8 THC-D , /32 26,04±0,11 9 THCA-D , /- 24,19±0,08 10 LSD-D , /- 21,74±0,23 11 Nalorphine , /29 14,05±0,16 Ενώσεις που αναλύθηκαν με αρνητικό ιοντισμό 1 THC-D , /- 18,28±0,05 2 THCA-D , /- 16,81±0, Βελτιστοποίηση παραμέτρων υγροχρωματογράφου (HPLC) Αφού έγινε η βελτιστοποίηση στη φασματομετρία μαζών, στη συνέχεια μελετήθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες της υγρο χρωματογραφίας. Η αρχική ιδέα ήταν η χρήση μιας νέας στήλης που ήταν διαθέσιμη στο εργαστήριο και πληρούσε τις προϋποθέσεις βάση βιβλιογραφικής ανασκόπησης αλλά και εν γνώσει της φύσης των ενώσεων. Η στήλη ήταν αντίστροφης φάσης με μια ομάδα πενταφθοροφαινύλιο-, (PFP), της Kinetex με διαστάσεις (50 mm x 2,10 mm) και μέγεθος σωματιδίων 1,7 μm. Η στήλη, συγκρίθηκε με άλλες δύοστήλες αντίστροφης φάσης την C18 (100 mm x 2,10 mm, 2,6 μm) και την C18-XB (100 mmx 2,10 mm, 2,6 μm) και οι δύο της Kinetex (Phenomenex TM Luna). Οι τρεις αυτές στήλες, αφού δοκιμάστηκαν διάφορες κινητές φάσεις (MeOH/υπερκάθαρο νερό, 0,05% v/v HCOOHκαι στα δύο και MeOH/υπερκάθαρο νερό, 0,05% v/v HCOOH και στα δύο/ ACN) και διάφορα προγράμματα έκλουσης, λόγω διαφορετικής κατασκευής του πληρωτικού υλικού, αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα τους να διαχωρίσουν τις ενώσεις, τον χρόνο ανάσχεσης, την ευαισθησία και το σχήμα των κορυφών. Χρησιμοποιήθηκε ακόμα και προστατευτική στήλη C18 (phenomenex,usa) διαμέτρου 4 mm και μήκους 20 mm (Εικόνα 6.4). 101

102 Εικόνα 6.4: Στατικές φάσεις των στηλών, KinetexPFP, KinetexC18 και KinetexXB-C18 [98] Τα αποτελέσματα ήταν τα εξής: 1) Μεγαλύτεροι χρόνοι ανάσχεσης παρατηρήθηκαν με την στήλη PFP απ ότι με τις C18 και XB-C18 στήλες λόγω των ισχυρών π-π δεσμών, για όλες τις ενώσεις, ειδικά για τα οπιοειδή, αμφεταμίνες, αντιψυχωτικά και αντικαταθλιπτικά, εκτός από τα κανναβινοειδή, αντιεπιληπτικά και βενζοδιαζεπίνες. 2) Τα αντικαταθλιπτικά και οι βενζοδιαζεπίνες είχαν παρόμοια χρωματογραφικά χαρακτηριστικά και με τις 3 στήλες. 3) Οι στήλες C18 και ΧΒ-C18 είχαν γενικά τα ίδια ακριβώς χαρακτηριστικά κατά τον προσδιορισμό των ενώσεών μας και δεν βελτίωναν τις κορυφές των ενώσεων που περιείχαν ομάδες -ΝΗ 2 ή ΝΗ, παρουσιάζοντας μεγαλύτερη ασυμμετρία κορυφών συγκριτικά με την PFP (π.χ αμφεταμίνες), παρόλο που η ΧΒ-C18 έχει πλευρικές αλυσίδες βουτυλίουπου επιτρέπουν ενισχυμένο διαχωρισμό των βασικών ενώσεων υπό ουδέτερες και όξινες συνθήκες (Εικόνα 6.5). 4) Για τα οπιοειδή η ασυμμετρία κορυφών είναι ελάχιστη με την στήλη PFP παρέχοντας υψηλή διαχωριστικότητα και ευαισθησία συγκριτικά με την C18 που παρουσιάζει κορυφές με ουρά και χαμηλή ευαισθησία. Η Ephedrine και ηnorephedrine διαχωρίζονται εμφανώς καλύτερα με την στήλη PFP με πιο οξείες και καλοσχηματισμένες κορυφές (εικόνα 6.5). 5) Τα αντιεπιληπτικά από την άλλη μεριά δεν εμφανίζουν κορυφές με ουρά αντιθέτως είναι οξείες και με μεγαλύτερο μέσο εύρος όταν αναλύονται μεc18 και ΧΒ-C18 από ότι με την PFP, ωστόσο η ευαισθησία τους με C18 και ΧΒ-C18 είναι χαμηλότερη συγκριτικά με την PFP και εμφανίζουν επιπλέον υψηλότερους χρόνους ανάσχεσης. Συμπερασματικά υψηλότερη ευαισθησία, καλύτεροι διαχωρισμοί και πιο μεγάλο εμβαδόν κορυφών επιτυγχάνονται με την PFP στήλη για τις περισσότερες ενώσεις, 102

103 καθώς η στατική φάση πενταφθοροφαινύλιο- ενσωματώνει 5 άτομα φθορίου επί της περιφέρειας του δακτυλίου του φαινυλίου παρέχοντας εκλεκτικότητα προς τις πολικές και αρωματικές ενώσεις. Eξαίρεση αποτελούσαν οι λιγότερο πολικές ενώσεις όπως η olanzapineκαι norclozapine (αντιψυχωτικά), THC, THCA και cannabidiol που ήταν πιο καλες οι κορυφές τουςμε C18 στήλη, που προσφέρει υδρόφοβη κατακράτηση με εκλεκτικότητα στις μεθυλενομάδες των ενώσεων, παρόλα αυτά οι διορθώσεις των κορυφών σε αυτές τις ενώσεις έγιναν με βελτιστοποίηση των κινητών φάσεων και του προγράμματος βαθμιδωτής έκλουσης. Να σημειωθεί ότι ο χρόνος εξισορρόπησης της βέλτιστης στήλης ήταν μια ώρα. 103

104 Εικόνα 6.5: Χρωματογραφήματα των αμφεταμινών και συμπαθομιμητικών σε διαφορετικές στήλες και συνθήκες. Όπου, Α:PFPστήλη, Κ.Φ:MeOH/Milli-Qνερό, 0.05%v/vF.Aκαι στα δύο, ροή: 100 μl/min(pl), B: C18 στήλη, Κ.Φ: MeOH/Milli-Qνερό, 0.05%v/vF.Aκαι στα δύο, ροή: 100 μl/min(pl), C: C18 στήλη, Κ.Φ: MeOH/Milli-Qνερό, 0.05%v/vF.Aκαι στα δύο, ροή: 200μL/min (PL), D: C18-XBστήλη, Κ.Φ: MeOH/Milli-Qνερό, 0.05%v/vF.Aκαι στα δύο, ροή: 100μL/min(PL, parcia lloop). Στον θετικό ιοντισμό οι συνδιασμοί των κινητών φάσεων που δοκιμάστηκαν με την επιλεγόμενη καλύτερη στήλη ήταν: (i) ACN/Υπερκάθαρο Νερό με 0,01% v/v μυρμηκικό οξύ, (ii) ACN/ Υπερκάθαρο Νερό(0,01% v/v μυρμηκικό οξύ και στους δύο διαλύτες), (iii) ACN/ Υπερκάθαρο Νερό (0,05% v/v μυρμηκικό οξύ και στους δύο διαλύτες), (iv) MeOH/ Υπερκάθαρο Νερό, (v) MeOH/ Υπερκάθαρο Νερόμε 0,01% v/v μυρμηκικό οξύ, (vi) MeOH/ Υπερκάθαρο Νερό (0,01% v/v μυρμηκικό οξύ και στους δύο διαλύτες), (vii) MeOH/ Υπερκάθαρο Νερό (0,05% v/v μυρμηκικό οξύ και στους δύο διαλύτες), (viii) MeOH/ Υπερκάθαρο Νερό (0,05% v/v μυρμηκικό οξύ και στους δύο διαλύτες)/ ACN. Κατά τη μελέτη της επίδρασης της σύστασης της κινητής φάσης γιατον προσδιορισμόκάθε ομάδας ενώσεων ξεχωριστά ήταν ξεκάθαρο ότι χρειάζεται 104

105 οπωσδήποτε μία ποσότητα μυρμηκικού οξέος να διευκολυνθεί και ενισχυθεί ο θετικός ιοντισμός και πιο συγκεκριμένα όπως φαίνεται και στις παραστάσεις της εικόνας 6.6.: Για την ομάδα των οπιοειδών ενώσεων προτιμώνται κινητές φάσεις που περιέχουν MeOH καθώς βελτιώνουν τον διαχωρισμό των ενώσεων και τα σχήματα των κορυφών που δίνουν είναι κατάλληλα για ποσοτικοποιήσεις. Το EDDP όπως φαίνεται χρειάζεται όξινη κινητή φάση. Για την ομάδα ενώσεων της κοκαΐνης, όλοι οι κινητές φάσεις δίνουν υψηλή ευαισθησία. Το εμβαδόν της κορυφής της κοκαΐνης είναι καλύτερο όταν γίνεται συνδυασμός μεθανόλης και νερό. Σε γενικές γραμμές η MeOH με μυρμηκικό οξύ είναι αποδεκτή ως κινητή φάση για όλες τις ενώσεις κοκαΐνης. Για τα παραισθησιογόνα (LSD / THC) ήταν προφανής η χρήση MeOH με μυρμηκικό οξύ, ως κινητή φάση, αφού όλες οι κορυφές ήταν καλές, με υψηλή ευαισθησία και μειωμένους χρόνους κατακράτησης. Οι αμφεταμίνες τώρα με όλες τις κινητές φάσεις έδιναν συμμετρικές κορυφές, χωρίς ουρά και υψηλές ευαισθησίες, αλλά η χρήση της MeOH/Νερό παρείχε ακόμα καλύτερα αποτελέσματα. Για τις βενζοδιαζεπίνες, το ακετονιτρίλιο ως κινητή φάση εκλούει τους αναλύτες σε μικρότερους χρόνους αλλά προκαλεί ασυμμετρίες στις κορυφές με χαμηλές ευαισθησίες. Η MeOH με μυρμηκικό οξύ βελτιώνει τις κορυφές πάνω από 50% και να παρέχει υψηλή ευαισθησία με συμμετρική περιοχή κορυφής. Η καλύτερη φαίνεται να είναι η MeOH / Υπερκάθαρο Νερό με 0,01% v/v μυρμηκικό οξύ ωστόσο παρεμφερής ευαισθισίες και απόκριση δίνουν και οι άλλες κινητές φάσεις με MeOH / Υπερκάθαρο Νερό με περισσότερο οξύ στις δύο φάσεις. Στα αντιψυχωτικά, το μυρμηκικό οξύ σε μεθανόλη δεν φαίνεται να βελτιώνειτην ανάλυση ή τη συμμετρία των κορυφών, ειδικά στην risperidone. Με μεθανόλη μπορεί να επιτευχθούν υψηλότερες ευαισθησίες αλλά με ακετονιτρίλιο μπορεί να βελτιωθούν οι κορυφές. Ακετονιτρίλιο και μεθανόλη οξινισμένη με μυρμηκικό ήταν ο καλύτερος συνδυασμός κινητής φάσης (viii) για την ομάδα των αντιψυχωτικών ενώσεων. Το χρωματογράφημα της Olanzapine ωστόσο παρουσίαζε πολλά προβλήματα (ασυμμετρία - ουρά, φτωχή ευαισθησία, χαμηλή διαχωριστικότητα), για αυτό και ως η καλύτερη κινητή φάση προτιμήθηκε η MeOH/ Υπερκάθαρο Νερό (0,05% v/v μυρμηκικό οξύ και στους δύο διαλύτες). Οι κινητές φάσεις τώρα που περιέχουν μεθανόλη δίνουν καλυτέρα χρωματογραφήματα από ότι αυτές που έχουν ακετονιτρίλιο για τα αναισθητικά. 105

106 Στα αντιεπιληπτικά η διαφορά της χρήσης της μεθανόλης με μυρμηκικό οξύ έναντι ακετονιτριλίου ως κινητή φάση είναι εμφανής. Καλύτερα αποτελέσματα έδινε η MeOH/ Υπερκάθαρο Νερό με ποσότητα HCOOH. Τα αντικαταθλιπτικά διαχωρίζονται καλύτερα και δίνουν πιο οξείες κορυφές με τις κινητές φάσεις MeOH/ Υπερκάθαρο Νερόμε 0,01% v/v μυρμηκικό οξύ, MeOH/ Υπερκάθαρο Νερό (0,01% v/v μυρμηκικό οξύ και στους δύο διαλύτες) και MeOH/ Υπερκάθαρο Νερό (0,05% v/v μυρμηκικό οξύ και στους δύο διαλύτες), και όπως φαίνεται το παραπάνω οξύ μειώνει ελάχιστα την απόκριση. Το Fluoexetine και το paroxetine δεν εμφανίζονται καν με την κινητή φάση MeOH/ Υπερκάθαρο Νερό και δίνουν χαμηλές κορυφές με χαμηλή ευαισθησία με κινητές φάσεις που περιέχουν μεθανόλη και μυρμηκικό οξύ. Τέλος για την ephedrine και την norephedrine η ιδανικότερη κινητή φάση είναι η MeOH/ Υπερκάθαρο Νερό και γενικά η μεθανόλη μαζί με μυρμηκικό, προτιμούνται για κινητές φάσεις, από ό,τι η σύστασή της με ακετονιτρίλιο. Συμπερασματικά λοιπόν οι περισσότερες ενώσεις διαχωρίζονται καλύτερα και παρουσιάζουν υψηλότερες κορυφές και ευαισθησία όταν η κινητή φάση είναι η MeOH/ Υπερκάθαρο Νερόμε 0,01% v/v μυρμηκικό οξύ, μια εξαίρεση σε αυτό είναι οι αντιψυχωσικές ενώσεις (chlorpromazine, olanzapine, clozapine), η carbamazepine και κάποια αντικαταθλιπτικά που εμφανίζουν καλύτερα χρωματογραφικά χαρακτηριστικά με την κινητή φάση MeOH/ Υπερκάθαρο Νερό (0,05% v/v μυρμηκικό οξύ και στους δύο διαλύτες). Έτσι κάνοντας έναν συμβιβασμό και με την λογική ότι με την κινητή φάση MeOH/ Υπερκάθαρο Νερό (0,05% v/v μυρμηκικό οξύ και στους δύο διαλύτες) εκλούονται επίσης πολύ καλά οι περισσότερες ενώσεις και έχουμε καλές κορυφές, επιλέχθηκε αυτή ως βέλτιστη. Για λεπτομέρειες περισσότερες εικόνα 6.6. Έπειτα από την επιλογή κινητής φάσης ακολούθησαν δοκιμαστικά προγράμματα βαθμιδωτής έκλουσης και τα αποτελέσματα τα τελικά φαίνονται στον πίνακα 6.4. Η σειρά έκλουσης των ενώσεων εξαρτάται από τους εξής παράγοντες: την διαλυτότητα στο νερό που φαίνεται από το logkow, το pka και τους δεσμούς που σχηματίζουν (π-π δεσμούς, δεσμούς υδρογόνου) με την στατική φάση. Ήταν εύκολο να παρακολουθηθεί η σειρά έκλουσης στην απλή ομάδα των αμφεταμινών, οπού έχουν οι ενώσεις ίδιες περίπου τιμές pka και παρόμοιες δομές, άρα και ίδια συμπεριφορά με την στατική φάση και έτσι η σειρά έκλουσης εξαρτάται από τις τιμές logkow. Οπού οι πιο υδρόφιλες (MDA και amphetamine) εκλούονται πρώτες και η λιγότερη υδρόφιλή (MDEA) τελευταία. Στις άλλες ομάδες ενώσεων, λόγω μεγαλύτερων δομών και πιο 106

107 περίπλοκων ιδιοτήτων είναι πιο δύσκολο να εξηγηθεί η σειρά έκλουσής τους, ωστόσο μεμονωμένα για την κάθε ένωση είναι εύκολο να παρατηρηθεί η τάση τους στην έκλουση λόγω των βασικών φυσικοχημικών τους ιδιοτήτων. Στον αρνητικό ιοντισμό δεν χρειάστηκε να χρησιμοποιηθεί μυρμηκικό οξύ, έτσι η επιλεγόμενη κινητή φάση ήταν μεθανόλη και υπερκάθαρο νερό (30% - 70%) και βελτιστοποιήθηκε ο τρόπος βαθμιδωτής έκλουσης (πίνακας 6.4). Τέλος βελτιστοποιήθηκε και θερμοκρασία της στήλης οπού έγινε αύξηση από 25 C στους 50 C. Δεν παρατηρήθηκαν παρόλα αυτά σημαντικές διαφορές έτσι προτιμήθηκε η χαμηλότερη θερμοκρασία στους 25 C, πίνακας

108 108

109 109

110 Εικόνα 6.6: Απόκριση των διαφόρων ομάδων ενώσεων στις διαφορετικές κινητές φάσεις με στήλη PFP έπειτα από κανονικοποίηση των εμβαδών τους. 110

111 Για τις ουσίες που προσδιορίζονται με θετικό ιοντισμό Εικόνα 6.7: Ολικό χρωματογράφημα πρότυπου δείγματος για θετικό ιοντισμό Στήλη : Kinetex PFP (Phenomenex), 2,1 50 mm, διαμέτρου 1,7 μm Προστήλη : C18 (phenomenex, USA) διαμέτρου 4mm και μήκους 2mm Ροή: 100 μl/min Όγκος έγχυσης: 10 μl Διάρκεια χρωματογραφήματος: 65min Κινητή φάση: Μεθανόλη με μυρμηκικό οξύ 0,05% (MeOH) (B) και Υδατικό διάλυμα μυρμηκικού οξέος 0,05% (A) Πρόγραμμα της βαθμιδωτής έκλουσηςήταν ως εξής: Πίνακας 6.3:Βαθμιδωτή έκλουση για τις ουσίες που προσδιορίζονται με θετικό ιοντισμό Time(min) A(%) B(%) 0,00 98,0 2,0 3,00 98,0 2,0 23,00 0,0 100,0 49,00 0,0 100,0 49,01 98,0 2,0 65,00 98,0 2,0 111

112 Για τις ουσίες που προσδιορίζονται με αρνητικό ιοντισμό Εικόνα 6.8:Ολικό χρωματογράφημα πρότυπου δείγματος για αρνητικό ιοντισμό Στήλη : Kinetex PFP (Phenomenex), 2,1 50 mm, διαμέτρου 1,7 μm Προστήλη : C18 (phenomenex, USA) διαμέτρου 4mm και μήκους 2mm Ροή: 100 μl/min Όγκος έγχυσης: 10 μl Διάρκεια χρωματογραφήματος: 35min Κινητή φάση: Μεθανόλη (MeOH) (B) και Milli-QΝερό (A) Πρόγραμμα της βαθμιδωτής έκλουσηςήταν ως εξής: Πίνακας 6.4: Βαθμιδωτή έκλουση για τις ουσίες που προσδιορίζονται με αρνητικό ιοντισμό Time (min) A (%) B (%) 0,00 70,0 30,0 3,00 70,0 30,0 23,00 0,0 100,0 35,00 0,0 100,0 35,01 70,0 30,0 112

113 Πίνακας 6.5: Απόκριση των διαφόρων ομάδων ενώσεων (εμβαδόν κορυφής) (average area) με την αύξηση της θερμοκρασίας της στήλης Θερμοκρασία Ομάδα Ενώσεων Ένωση 25 o C (PArea:x10 6 ) 30 o C (x10 6 ) 40 o C (x10 6 ) 50 o C (x10 6 ) Morphine (MOR) 3,0 3,0 2,0 3,0 Heroin (HER) 0,30 0,20 0,10 0,10 6-MAM 7,0 6,0 7,0 7,0 Οπιοειδή και οπιούχα METH EDDP Codeine (COD) 5,0 4,0 4,0 4,0 Oxycodone (OC) Buprenorphine 0,40 0,30 0,20 0,30 Κοκαΐνη και μεταβολίτες Cocaine (COC) Benzoylecgonine EME MDMA MDEA Αμφεταμίνες MDA MA Amphetamine Δ9-THC 3,0 3,0 3,0 3,0 Κανναβινοειδή Δ9-THCΑ 4,0 3,0 3,0 3,0 Cannabidiol 2,0 1,0 1,0 1,0 LSD και μεταβολίτης LSD ΟΗ-LSD 0,30 0,10 0,20 0,20 Alprazolam Βενζοδιαζεπίνες Bromazepam 4,0 3,0 4,0 3,0 Chlordiazepoxide

114 Clobazam Diazepam 8,0 7,0 7,0 7,0 Nordiazepam 1,0 1,0 1,0 1,0 Flunitrazepam amineflunitrazepam 9,0 9,0 9,0 10 Lorazepam Nitrazepam Midazolam Oxazepam Temazepam Chlorpromazine 7,0 4,0 5,0 5,0 Clozapine Αντιψυχωσικά Norclozapine 9,0 8,0 8,0 8,0 Olanzapine Risperidone OH-Risperidone Lidocaine Fentanyl Αναισθητικά και μεταβολίτες Norfentanyl 9,0 9,0 8,0 8,0 Ketamine Norketamine Carbamazepine ,0 8,0 Αντιεπιληπτικά Levetiracetam 9,0 10 9,0 5,0 Primidone 4,0 4,0 4,0 4,0 114

115 Amitriptylline Τρικυκλικά Αντικαταθλιπτικά (TCAs) Nortriptyline Clomipramine 10 8,0 9,0 10 Imipramine Doxepine 5,0 5,0 5,0 5,0 Τετρακυκλικά Αντικαταθλιπτικά και μεταβολίτης (TeCAs) Mirtazapine OH mirtazapine Citalopram Fluoxetine 0,40 0,20 0,20 0,20 SSRIs Paroxetine 4,0 3,0 3,0 4,0 Sertraline 9,0 6,0 7,0 7,0 Norsertraline 5,0 2,0 3,0 2,0 SNRIs Venlafaxine Υπνωτικό Zopiclone 2,0 2,0 2,0 2,0 Συμπαθομιμητικά Ephedrine 5,0 5,0 4,0 4,0 Norephedrine MOR-D3 2,0 2,0 2,0 2,0 EDDP-D COD-D3 5,0 4,0 4,0 4,0 COC-D Εσωτερικά πρότυπα EME-D3 8,0 7,0 6,0 6,0 Nalorphine 3,0 3,0 2,0 3,0 MDMA-D MDA-D THC-D3 2,0 2,0 2,0 2,0 THCA-D3 4,0 2,0 2,0 2,0 LSD-D

116 6.3 Προκατεργασία δειγμάτων και βελτιστοποίηση της διαδικασίας καθαρισμού και προσυγκέντρωσης (εκχύλιση στερεάς φάσης, SPE) για τον προσδιορισμό των ενώσεων σε υγρά απόβλητα και μελέτη της επίδρασης μήτρας Όλα τα υγρά απόβλητα πριν την ανάλυση διηθήθηκαν και οξινίστηκαν σε ph 2,5 με HCl 1M. Οξινίζοντας τα δείγματα επιτυγχάνονται δύο σκοποί, ο πρώτος είναι η προστασία του δείγματος από τυχόν μικροοργανισμούς που μπορεί να οδηγήσουν στην αποσύνθεση του δείγματος και διάσπαση (αποικοδόμηση) των ενώσεων και ο δεύτερος είναι να φορτιστούν οι περισσότερες ενώσεις θετικά, κάτι που θα βοηθήσει στην μετέπειτα ανάλυση τους. Οι περισσότερες ενώσεις που μελετώνται θεωρούνται βασικές και χαρακτηρίζονται από την παρουσία μιας αμινομάδας που μπορεί να δεχτεί ένα H + σε όξινα διαλύματα τις περισσότερες φορές. Οι ενώσεις τις κατηγορίας των οπιοειδών και οπιούχων, στο ph 2,5 εμφανίζουν μια ομάδα NH + εκτός από την BECG που έχει επαμφοτερίζοντα χαρακτήρα και στο όξινο αυτό περιβάλλον εμφανίζει δύο ομάδες αντίθετα φορτισμένες στο μόριο της μια NH + και μια O -. Οι αμφεταμίνες, τα αντικαταθλιπτικά, τα SSRIs, τα SNRIs, τα αντιψυχωτικά, τα παραισθησιογόνα LSD και τα αναισθητικά (εκτός από το thiopental που είναι ουδέτερο) είναι θετικά φορτισμένες στο ph 2,5, με μία ή δύο (αντιψυχωτικά) ομάδες NH +. Στις βενζοδιαζεπίνες ωστόσο στο ph2,5 επικρατούν δύο μορφές η μία είναι θετικά φορτισμένη (δέχονται ένα H + στην αμίνη στην θέση 4) και η άλλη είναι ουδέτερη, εκτός από τις ενώσεις oxazepam, lorazepam και temazepam που στο ph 2,5 αυτό δεν είναι φορτισμένες (ουδέτερες). Τα αντιεπιληπτικά, τα κανναβινοειδή και τα βαρβιτουρικά στο ph 2,5 επικρατεί η ουδέτερη μορφή τους. Για τις παραπάνω πληροφορίες ως προς τις μορφές των ενώσεων στις διάφορες τιμές ph ανατρέξαμε στο chemspider [14]. Κατάλληλες ποσότητες εσωτερικών προτύπων προστέθηκαν σε όλα τα προς ανάλυση δείγμτα (MOR-d3, EDDP-d3, COC-d3, EME-d3, MDMA-d5, MDA-d5, THC-d3, THCA-d3, LSD-d3, COD-d3) για την ποσοτικοποίηση των ενώσεων, παρόλα αυτά μόνο για τα κανναβινοειδή ήταν απαραίτητη η χρήση τους για την διόρθωση της ποσοτικοποίησης. Δύο τύποι πολυμερικών στηλών συγκρίθηκαν, όπως προαναφέρθηκε, το Strata X και το Strata XC. Το Strata X έδινε πολύ καλές απόλυτες ανακτήσεις: 62/71 ενώσεις έδιναν ανάκτηση πάνω από 80%, 3/71 ενώσεις έδιναν μεταξύ 60 και 79 % και 6/71 ενώσεις κάτω από 59%. Το EMEέδινε ανάκτηση 1% με την Strata X, και το pentobarbital 342% και οι τιμές αυτές δεν ήταν αποδεχτές. Το Strata XC έδινε επίσης 116

117 πολύ καλές απόλυτες ανακτήσεις: 55/71 ενώσεις (συμπεριλαμβανομένου και του βασικού μεταβολίτη EME) έδιναν πάνω από 80%, 5/71 έδιναν ανακτήσεις μεταξύ 60 και 79 % και 11/71 ενώσεις έδιναν ανακτήσεις κάτω από 59%. Το Zopiclone (Rec (%) = 0%) και ηheroin (Rec (%) = 4%) έδιναν μη αποδεχτές ανακτήσεις με την Strata XC. Από την ηρωίνη αφού μοιάζει δομικά με τις άλλες ενώσεις της ομάδας του δεν είναι φυσιολογική τέτοια ανάκτηση, ωστόσο ένα τέτοιο φαινόμενο μπορεί να οφείλεται στην ύπαρξη των δύο ομάδων COOH που μπορεί να μην κατακρατούνται ισχυρά από τη κατιόν-ανταλλακτική ρητίνη του φυσιγγίου και να απομακρύνεται κατά το στάδιο της όξινης έκπλυσης ή μπορεί να χάνεται κατά την εφαρμογή κενού ξήρανσης. Τα κανναβινοειδή είχαν πολύ χαμηλές, ωστόσο επαναλήψιμες απόλυτες ανακτήσεις, και με τα δύο πολυμερικά υλικά, αλλά ήταν αποδεχτές καθώς αυτές οι ενώσεις υπάρχουν σε υψηλές συγκεντρώσεις στα απόβλητα και επιπλέον διατίθενται και τα δευτεριωμένα εσωτερικά πρότυπά τους THCA-d3 και THC-d3 ώστε να γίνουν οι κατάλληλες διορθώσεις. Οι επιδράσεις της μήτρας παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για την επικύρωση των μεθόδων, όπως όμως σημειώνει ο Dams et all [39], εξαρτώνται επίσης και από την επεξεργασία του δείγματος, καθώς η τελική σύνθεση του δείγματος έχει σαφή επίδραση. Έτσι η επίδραση της μήτρας, που μπορεί να οδηγήσει σε καταστολή ή εμπλουτισμό του σήματος, αποτέλεσε επίσης κριτήριο για την αξιολόγηση του κατάλληλου προσροφητικού υλικού επιλογής. Με μία γρήγορη ματιά στον πίνακα 6.6 παρατηρούμε ότι με την Strata X η εκχύλιση στερεάς φάσης οδηγεί σε υψηλότερες τιμές επίδρασης μήτρας, σε αντιθέση με την Strata XC. Το φαινόμενο της καταστολής του σήματος ήταν πιο έντονο και με τα δύο προσροφητικά σε σχέση με το φαινόμενο της ενίσχυσης του σήματος. Το τελικό επιλεγόμενο φυσίγγιο την μέθοδό μας μετά από συγκεκριμένους συμβιβασμούς είναι το Strata XC, καθώς παρουσιάζει ίδιους μηχανισμούς κατακράτησης με την Strata X με επιπλέον ιοντικές αλληλεπιδράσεις για την συλλογή και όξινων και ουδετέρωνενώσεων πέρα από τις βασικές. Ακόμα το γεγονός ότι το zopiclon δεν εκχυλίζεται δεν ήταν σημαντικό καθώς αυτή η ένωση δεν συναντάται συχνά στα δείγματα όπως και η ηρωίνη η οποία μεταβολίζεται ταχύτατα. Αντίθετα το ΕΜΕ είναι πολύ σημαντική ένωση αφού είναι βασικός μεταβολίτης της κοκαΐνης και συναντάται στα δείγματα, σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις. Όλες οι ανακτήσεις (από τα πειράματα ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας) και με τα δύο προσροφητικά 117

118 φυσίγγια καθώς και οι επιδράσεις της μήτρας που προκαλούν παρατίθενται στον πίνακα 6.6 Πίνακας 6.6: Συγκεντρωτικός πίνακας στο οποίο φαίνονται οι απόλυτες ανακτήσεις (*σχετική) με τις αντίστοιχες τυπικές αποκλίσεις και RSD % (n=5), των πειραμάτων ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας και τα LOD (ng/l) καιloq (ng/l) της τελικής μεθόδου με Strata XC. Α/Α Ενώσεις Ανάκτήσεις Strata-X (%) SD RSD% (n=5) Strata- X ΜΕ Ανάκτήσεις Strata-XC (%) SD RSD% (n=5) Strata- XC ΜΕ LOD (ng/l) LOQ (ng/l) Ενώσεις που αναλύθηκαν με θετικό ιοντισμό 1 Morphine (MOR) 60 5,3 8,8-14, ,1 14,1-24,3 1,2 3,6 2 Heroin (HER) 97 6,4 6,6 165,4 4 2,7 67,1 7,9 49,1 147,3 3 6-MAM ,1 12,0 5, ,1 31,1-11,3 10,1 30,3 4 Methadone (METH) 95 12,1 13,0 19,5 91 3,5 3,8-4,7 0,3 0,9 5 EDDP 96 8,3 8,7 6,0 47 9,9 21,2-9,7 1,1 3,3 6 Codeine (COD) 103 8,7 8,4 7,8 93 9,6 10,1-14,3 4,6 13,8 7 Oxycodone (OC) ,2 11,0 6,9 83 9,7 12,1-13,3 6,8 20,8 8 Bupronorphine (BN) 101 8,7 8,6 60, ,0 19,1 7,9 19,6 58,8 9 Cocaine (COC) 92 8,0 8,7 27,9 88 3,2 3,7-9,2 2,6 7, Benzoylecgonine (BECG) Ecgonine methylester (EME) 100 7,8 7,8 14,4 89 2,1 2,4-16,7 2,2 6,6 1,0 1,4 141,1 42, ,0 14,1-51,8 4,5 13,5 12 MDMA 104 8,1 7,8-26,3 87 2,8 3,2-17,0 0,4 1,2 13 MDEA 103 6,7 6,5-26,6 89 2,1 2,3-15,0 0,1 0,3 14 MDA 98 8,8 9,0-4,8 86 4,1 4,7-7,1 8,3 24,9 15 MA 103 7,6 7,4-24,6 85 2,1 2,4-20,8 2,7 8,1 16 Amphetamine 98 12,0 12,0-9,0 85 2,2 2,6-0,3 3 9,0 17 Δ9-THC 25 17,0 7,1-33,5 26 (102)* 0,7 2,8-35,9 1 3, nor-Δ9-THC acid 35 20,0 5,0-25,8 18 (122)* 1,4 7,9-39,9 20,3 60,9 19 Cannabidiol 10 20,0 8,8-17,6 13 9, ,9 43,7 131,1 20 LSD 84 7,9 9,4 8,6 84 5,5 6,6-21,4 0,2 0, oxo-3-hydroxy-LSD ,1 21,0 51, ,7 5,4 8,1 0,2 0,6 22 Alprazolam 87 8,1 9,3-11,2 84 4,9 5,9-19,2 1,3 3,9 23 Bromazepam 83 10,1 12,1 45,1 76 2,1 2,8-6,9 7,9 23,7 24 Chlordiazepoxide 94 1,5 1,6-0,5 88 5,3 6,0-4,8 4,8 14,4 25 Clobazam ,1 9,9-21,4 96 1,7 1,8-18,8 1,9 5,7 26 Diazepam 89 7,4 8,3-7,0 91 3,6 4,0-14,2 1,2 3,6 27 Nordiazepam 95 11,1 11,1-12,0 87 9, ,8 0,34 1,02 118

119 28 Flunitrazepam 100 8,5 8,6-3,3 71 3,5 4,9-15,1 5,8 17, amineflunitrazepam 69 5,5 8,0-16,5 82 4,2 5,2-27,6 14,7 44,1 30 Lorazepam 99 6,0 6,1-0,2 45 6,2 14,0-20,0 4,7 14,1 31 Nitrazepam , ,5 20,4-5, Midazolam 98 2,5 2,6 4, ,1 14,1-6,2 0,17 0,51 33 Oxazepam 96 2,8 2,9-2,7 49 8,3 17,0-16,0 3,4 10,2 34 Temazepam 94 4,7 5,0 5, ,0 15,0-12,3 2,3 6,9 35 Chlorpromazine 65 13,0 20,1 109,1 79 6,4 8,1 15,6 4,9 14,7 36 Clozapine 94 2,5 2,7 148,5 88 5,1 5,8-9,4 2,5 7,5 37 Norclozapine 82 6,4 7,9 79,2 79 8,7 11,0 14,9 0,09 0,27 38 Olanzapine 82 33,0-273,9 66 4,2 6,4-98,6 0,4 1,2 39 Risperidone 94 2,6 2,8 37,7 91 4,3 4,8-5,8 0,15 0, OH-Risperidone 91 3,2 3,5 14,4 87 7,5 8,6-6,6 0,08 0,24 41 Lidocaine ,1 9,6-29,2 89 3,9 4,4-28,3 4,2 12,6 42 Fentanyl 90 9,3 10,3 19,4 92 1,5 1,6-3,7 5,6 16,8 43 Norfentanyl ,0 18,1-3,7 90 6,8 7,6-14,3 0,2 0,6 44 Ketamine 100 8,6 8,6-22,5 87 3,5 4,0-18,7 2,8 8,4 45 Norketamine 88 5,6 6,3-12,8 86 7,8 9,1-9,5 6,5 19,5 46 Carbamazepine 107 8,4 7,8 23,5 97 2,1 2,2-13,2 4 12,0 47 Lamotrigine ,1-91 2,1 2,3 11,6 1,5 4,5 48 Topiramate , ,1 15,1 8,2 2,5 7,5 49 Levetiracetam ,0 11,0 1,2 55 4,0 7,3-5,6 4,4 13,2 50 Primidone ,0 10,0-53, ,7 3,6-24,5 4,4 13,2 51 Amitriptylline ,0 10,0 51,2 90 2,1 2,3 3,3 0,9 2,7 52 Nortryptiline 93 5,3 5,7 96, ,1 18,1 11,0 0,04 0,12 53 Clomipramine 91 11,0 12,0 101,7 88 1,7 2,0 12,6 1,2 3,6 54 Imipramine 100 6,4 6,4 59,0 87 6,2 7,2 1,6 5,3 15,9 55 Doxepine 103 8,5 8,3 48,4 94 8,1 8,6 17,4 2,8 8,4 56 Mirtazapine 99 10,0 10,0 2,6 92 1,5 1,7-11,4 1,2 3, OH mirtazapine 99 8,3 8,3-5,6 88 4,0 4,5-10,6 0,2 0,6 58 Citalopram 102 8,2 8,0 53,5 91 8,5 9,3-0,8 3,6 10,8 59 Fluoxetine 88 11,0 13,0 19,5 91 9,0 9,8 2,2 0,6 1,8 60 Paroxetine 81 12,1 15,1 87,0 80 3,5 4,4 14,1 0,2 0,6 61 Sertraline 95 7,7 8,1 94,3 87 3,8 4,4 12,9 0,08 0,24 62 Norsertraline 85 8,2 9,6 52, ,0 19,0 11,7 4,3 12,9 63 Venlafaxine ,0 17,0-16, ,6 13,9-12,0 4,2 12,6 64 Zopiclone 91 6,1 6,7 1373,2 0 0,0 0,0 24, Ephedrine 84 17,0 20,0-14,0 88 3,6 4,1-12, Norephedrine 46 17,0 38,0 20,8 80 8,7 11,1-5,9 9,7 29,1 119

120 Ενώσεις που αναλύθηκαν με αρνητικό ιοντισμό 1 Pentobarbital 342-0,0-74,6 87 6,9 8,1-99,6 5,7 17,1 2 Phenobarbital 114 8,5 7,4-60,9 93 9,9 11,0-99, Phenytoin ,0 14,0-60, ,0 41,0-99, Thiopental 49 13,0 26,0-64, ,0 89,1-99, Topiramate ,1 34,2-99, Valproic acid ,0 27,0-57, ,1 30, ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ Γραμμικότητα Χρησιμοποιώντας την μέθοδο γνωστής προσθήκης έγινε για κάθε πρότυπη ένωση ξεχωριστά, η καμπύλη αναφοράς, με την μέθοδο ελαχίστων τετραγώνων και προσδιορίστηκε η ευθεία παλινδρόμησης καθώς και ο συντελεστής συσχέτισης R 2. Από τα αποτελέσματα βλέπουμε ότι ο συντελεστής συσχέτισης παίρνει τιμές 0,99-0,999 για σχεδόν όλες τις ενώσεις. Αυτό το γεγονός, υποδηλώνει την πολύ καλή συσχέτιση μεταξύ της μετρούμενης παραμέτρου (εμβαδόν κορυφής, Peakarea) και της συγκέντρωσης των εμβολιασμένων διαλυμάτων. Στη συνέχεια παρατίθενται τα αποτελέσματα για τα πρότυπα διαλύματα (πίνακας 6.7 και εικόνα 6.9): Πίνακας 6.7:Εξίσωση ευθείας παλινδρόμησης για πρότυπα διαλύματα Ενώσεις Y=a+b*X R 2 Morphine (MOR) Y = , *X 0,9919 Heroin (HER) Y = -7698, ,47*X 0, MAM Y = , ,8*X 0,9968 Methadone (METH) Y = *X 0,9903 EDDP Y = -2,3954e+006+1,46351e+006*X 0,9947 Codeine (COD) Y = ,6*X 0,9918 Oxycodone (OC) Y = *X 0,9876 Bupronorphine (BN) Y = ,3+2816,7*X 0,9864 Cocaine (COC) Y = , *X 0,9981 Benzoylecgonine (BECG) Y = *X 0,9884 Ecgonine methylester (EME) Y = 12462, *X 0,9963 MDMA Y = *X 0,

121 MDEA Y = *X 0,9911 MDA Y = , *X 0,9940 MA Y = *X 0,9976 Amphetamine Y = *X 0,9978 Δ9-THC Y = , ,5*X 0, nor-Δ9-THC acid Y = ,6*X 0,9906 Cannabidiol Y = ,7+7335,27*X 0,9887 LSD Y = *X 0, oxo-3-hydroxy-LSD Y = *X Alprazolam Y = *X Bromazepam Y = *X Chlordiazepoxide Y = *X Clobazam Y = *X Diazepam Y = *X Nordiazepam Y = *X Flunitrazepam Y = *X 0, amine-flunitrazepam Y = *X 0,9941 Lorazepam Y = ,9*X 0,9835 Nitrazepam Y = *X 0,9917 Midazolam Y = *X 0,9969 Oxazepam Y = , *X 0,9961 Temazepam Y = *X 0,9970 Chlorpromazine Y = ,5*X 0,9904 Clozapine Y = *X 0,9920 Norclozapine Y = ,5*X 0,9852 Olanzapine Y = -2,71162e *X 0,9894 Risperidone Y = *X 0, OH-Risperidone Y = *X 0,9813 Lidocaine Y = , *X 0,9980 Fentanyl Y = *X 0,9943 Norfentanyl Y = ,8*X 0,9912 Ketamine Y = *X 0,9877 Norketamine Y = *X 0,9981 Carbamazepine Y = , ,9*X 0,9921 Levetiracetam Y = , ,9*X 0,9905 Primidone Y = , ,9*X 0,9983 Amitriptylline Y = , *X 0,9948 Nortryptiline Y = *X 0,9985 Clomipramine Y = ,8*X 0,9901 Imipramine Y = ,1*X 0,

122 Doxepine Y = , *X 0,9950 Mirtazapine Y = *X 0, OH mirtazapine Y = *X 0,9844 Citalopram Y = *X 0,9892 Fluoxetine Y = , ,7*X 0,9904 Paroxetine Y = ,3*X 0,9896 Sertraline Y = , ,2*X 0,9903 Norsertraline Y = ,7*X 0,9920 Venlafaxine Y = , *X 0,9912 Zopiclone Y = ,2*X 0,9941 Ephedrine Y = ,6*X 0,9903 Norephedrine Y = 889, *X 0,9943 Εικόνα 6.9: Ενδεικτικές καμπύλες αναφοράς για πρότυπες ενώσεις σε διαλύτη σύστασης 54% MeOH και 46% Η 2 Ο 122

123 6.4.2 Ορθότητα Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε πείραμα ελέγχου ορθότητας, όπως περιγράφεται στο εδάφιο και υπολογίστηκε η σχετική ανάκτηση, η τυπική απόκλιση και η σχετική τυπική απόκλιση επί τις εκατό, RSD%. Για το επίπεδο συγκέντρωσης που είχε γίνει εμβολιασμός στην μήτρα του δείγματος (1 μg/l) τα RSD% είναι σχετικά μικρά. Ακόμα όπως φαίνεται και στον πίνακα 6.8 οι ενώσεις παραλαμβάνονται με ικανοποιητικές ανακτήσεις, κάτι που αποδεικνύει την αυξημένη εκλεκτικότητα της μεθόδου. Πίνακας 6.8: Έλεγχος ορθότητας της μεθόδου Ανάκτήσεις RSD % Α/Α Ενώσεις Strata-XC SD (n=6) (REC %) Strata-XC Θετικός Ιοντισμός 1 Morphine (MOR) 108 5,2 4,8 2 Heroin (HER) 2 2,9 124,0 3 6-MAM 43 1,6 3,8 4 Methadone (METH) 94 2,4 2,6 5 EDDP 54 0,7 1,2 6 Codeine (COD) 93 2,6 2,8 7 Oxycodone (OC) 72 1,3 1,8 8 Bupronorphine (BN) 64 6,3 9,7 9 Cocaine (COC) 88 2,4 2,7 10 Benzoylecgonine (BECG) 89 1,5 1,7 11 Ecgonine methylester (EME) 82 5,6 6,8 12 MDMA 81 1,1 1,3 13 MDEA 87 2,0 2,3 14 MDA 83 1,4 1,7 15 MA 82 0,6 0,8 16 Amphetamine 81 3,7 4,6 17 Δ9-THC 102 1,2 4, nor-Δ9-THC acid 122 1,1 5,6 19 Cannabidiol 5 2, LSD 90 2,2 2, oxo-3-hydroxy-LSD 102 5,8 5,7 22 Alprazolam 84 4,9 5,9 123

124 23 Bromazepam 76 2,1 2,8 24 Chlordiazepoxide 93 3,3 3,6 25 Clobazam 97 4,1 4,3 26 Diazepam 87 3,4 3,9 27 Nordiazepam 87 3,0 3,4 28 Flunitrazepam 66 2,3 3, amine-flunitrazepam 85 2,9 3,4 30 Lorazepam 40 1,2 3,0 31 Nitrazepam 86 2,3 2,7 32 Midazolam 70 1,6 2,3 33 Oxazepam 39 0,9 2,3 34 Temazepam 82 2,5 3,0 35 Chlorpromazine 82 1,8 2,2 36 Clozapine 93 2,9 3,1 37 Norclozapine 78 2,3 3,0 38 Olanzapine 63 8,3 13,2 39 Risperidone 96 1,7 1, OH-Risperidone 83 1,6 1,9 41 Lidocaine 85 2,4 2,9 42 Fentanyl 93 1,6 1,7 43 Norfentanyl 88 3,4 3,8 44 Ketamine 89 0,9 1,0 45 Norketamine 91 2,3 2,5 46 Carbamazepine 99 6,4 6,4 47 Lamotrigine 91 6,1 6,6 48 Topiramate ,6 9,8 49 Levetiracetam 59 0,9 1,6 50 Primidone 101 4,5 4,4 51 Amitriptylline 90 3,2 3,6 52 Nortryptiline 90 3,1 3,4 53 Clomipramine 86 3,0 3,5 54 Imipramine 93 3,2 3,5 55 Doxepine 93 0,9 1,0 56 Mirtazapine 93 1,7 1, OH mirtazapine 82 2,8 3,4 58 Citalopram 98 3,3 3,4 59 Fluoxetine 87 2,1 2,4 60 Paroxetine 81 2,0 2,5 61 Sertraline 85 1,9 2,3 62 Norsertraline 75 2,6 3,4 124

125 63 Venlafaxine 91 2,7 3,0 64 Zopiclone Ephedrine 81 2,6 3,2 66 Norephedrine 72 2,7 3,8 Αρνητικός Ιοντισμός 1 Pentobarbital 99 15,0 15,0 2 Phenobarbital 60 8,0 13,0 3 Phenytoin 53 2,0 5,0 4 Thiopental 30 6,0 22,1 5 Valproic acid 89 13,1 14, Πιστότητα (Ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα μεθόδου) Τα αποτελέσματα του πειράματος για την εύρεση της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας περιγράφονται στο εδάφιο και παρατίθενται στον παραπάνω πίνακα Όρια ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικοποίησης (LOQ) Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης της μεθόδου υπολογίστηκαν όπως περιγράφεται στο εδάφιο και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον παραπάνω συγκεντρωτικό πίνακα Επίδραση μήτρας Οι επιδράσεις της μήτρας στο LC-MS που παρουσιάζονται συζητήθηκαν και στα δύο εδάφια 5 και 6 στην διαδικασία παρασκευής των δειγμάτων ωστόσο πρέπει να σημειωθεί ότι στην τελική μέθοδο, μόνο 7 ενώσεις στις 71 παρουσίαζαν καταστολή του σήματοςιοντισμού από 100% έως 237% (valproicacid) και μόνο 2 μεταξύ 40% (THC- COOH) και 52% (EME), όλες οι άλλες ενώσεις είχαν μικρότερη επίδραση μήτρας, όπως φαίνεται και στον πίνακα 6.6. Ακόμα, η ένωση topiramate, η οποία μπορούσε να προσδιοριστεί και με τους δυο τύπους ιοντισμού παρουσίαζε στον αρνητικό ιοντισμό 100% καταστολή σήματος, ενώ στον θετικό ιοντισμό μόνο 3% εμπλουτισμό. Αυτό το φαινόμενο μπορεί να συμβαίνει εξαιτίας της ισχυρής προσθήκης του νατρίου και επηρεάζει την συμπεριφορά αυτή στον θετικό ιοντισμό. 125

126 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ο ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΕ ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ 7.1 Δειγματοληψία Πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες υγρών αποβλήτων (είσοδος ΚΕΛ Ψυτάλλειας, έξοδος Δεξαμενών Δευτεροβάθμιας Καθίζησης) σε δύο περιόδους, συγκεκριμένα το Δεκέμβριο του 2010 (5/12/ /12/2010) και τον Απρίλιο του 2011 (3/4/ /4/2011). Συνολικά ελήφθησαν δείγματα σε 15 διαφορετικές μέρες. Τα δείγματα υγρών αποβλήτων ήταν σύνθετα δείγματα 24ώρου και ελήφθησαν με αυτόματο δειγματολήπτη.μετά τη δειγματοληψία, τα δείγματα εισερχόμενων και επεξεργασμένων υγρών αποβλήτων (όγκου 1.5 και 3 L αντίστοιχα), μεταφέρθηκαν άμεσα στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας του Πανεπιστημίου Αθηνών υπό συνθήκες ψύξης και αποθηκεύτηκαν σε ψυγεία (4 ο C) και καταψύκτες (-20 ο C). Η προκατεργασία και η ανάλυση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε εντός 48 ωρών και 15 ημερών, αντίστοιχα, από την άφιξή τους στο εργαστήριο 7.2 Παρουσία DoAστο ΚΕΛ Ψυττάλειας Οι συγκεκριμένες ενώσεις προσδιορίστηκαν σε δεκαπέντε (15) διαφορετικές ημέρες, επτά (7) διαδοχικές ημέρες κατά την 1 η δειγματοληψία (Πίνακας 7.1) και οκτώ (8) διαδοχικές ημέρες κατά τη 2 η δειγματοληψία (Πίνακας 7.2). Από τις 71 ενώσεις που μελετήθηκαν, οι 24 ανιχνεύτηκαν στο σύνολο των δειγμάτων εισερχόμενων υγρών αποβλήτων της 1 ης δειγματοληψίας, ενώ στη 2 η δειγματοληψία ανιχνεύτηκαν 29 ενώσεις στο σύνολο των δειγμάτων που λήφθηκαν (n = 8). Ο αριθμός ενώσεων που ανιχνεύτηκε στο σύνολο των δειγμάτων των δευτεροβάθμια επεξεργασμένων (εξερχόμενα) υγρών αποβλήτων κατά την 1 η δειγματοληψία είναι 31, ενώ κατά τη 2 η δειγματοληψία οι ουσίες που ανιχνεύθηκαν στο σύνολο ήταν 32. Τα επίπεδα συγκεντρώσεων των ουσιών που μελετήθηκαν παρουσιάζονται στους Πίνακες 7.1 και 7.2, όπου παρατίθενται οι μέσες (mean), διάμεσες (median), ελάχιστες (min) και μέγιστες (max) συγκεντρώσεις τους στα εισερχόμενα και στα επεξεργασμένα υγρά απόβλητα. Σε ό,τι αφορά στα εισερχόμενα λύματα, οι μέσες συγκεντρώσεις που ανιχνεύτηκαν, κατά την 1 η δειγματοληψία κυμάνθηκαν μεταξύ 0,10 ng L -1 (Nortryptilline) 126

127 και 3337 ng L -1 (Levetiracetam), ενώ στα επεξεργασμένα λύματα κυμάνθηκαν μεταξύ 0,20 ng L -1 (LSD, ο κύριος μεταβολίτης του και το MDEA) και 733 ng L -1 (Carbamazepine).Στη 2 η δειγματοληψία, οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις ήταν στα εισερχόμενα λύματα μεταξύ 0,18 ng L -1 (MDEA) και 3272 ng L -1 (Levetiracetam), και στα επεξεργασμένα λύματα, μεταξύ 0,20 ng L -1 (LSD) και 1516 ng L -1 (Carbamazepine). Τόσο το Levetiracetam, όσο και η Carbamazepine είναι αντιεπιληπτικά φάρμακα και παρουσιάζουν τις υψηλότερες τιμές στα εισερχόμενα απόβλητα (μαζί με το βαλπροϊκό οξύ, επίσης αντιεπιληπτικό φάρμακο). Η ουσία Carbamazepine δεν απομακρύνεται κατά τη συμβατική επεξεργασία των υγρών αποβλήτων και στις δύο δειγματοληψίες παρουσιάζοντας τις υψηλότερες συγκεντρώσεις στα εξερχόμενα λύματα. Πίνακας 7.1 Παρουσία των αναλυτών (σε ng L -1 ) στα εισερχόμενα και επεξεργασμένα υγρά απόβλητα του ΚΕΛ Ψυττάλειας (Ά δειγματοληψία, n = 7) Εισερχόμενα Απόβλητα (ng l -1 ) Επεξεργασμένα Απόβλητα(ng l -1 ) Ουσία LOD [N]>L OD a Mean Median Min Max [N]>LO D a Mean Median Min Max Οπιοειδή και Οπιούχα Morphine (MOR) 1, ,7 < 1,2 < 1,2 7,1 Heroin (HER) 49,1 3 < 49,1 < 49,1 < 49, < 49,1 < 49,1 < 49,1 73,9 6-MAM 10,1 0 < 10,1 < 10,1 < 10,1 < 10,1 0 < 10,1 < 10,1 < 10,1 < 10,1 Methadone (METH) 0,3 7 2,2 2,3 1,0 3,0 7 11,6 10,5 10,0 17,5 EDDP 1,1 7 7,8 7,9 3,6 13,3 7 45,7 42,8 34,4 59,2 Codeine (COD) 4, ,8 137,1 114, ,1 17,1 5,0 36,6 Oxycodone (OC) 6,8 7 23,6 26,8 7,0 35,0 7 15,3 17,2 8,4 20,3 Bupronorphine (BN) 19,6 6 66,7 68,4 < 19, < 19,6 < 19,6 < 19,6 < 19,6 Κοκαΐνη και μεταβολίτες Cocaine 2,6 7 40,1 34,0 27,9 57,7 7 72,1 96,6 3,9 117 Benzoylecgonine (BECG) 1, ,2 34,6 2,9 85,1 Αμφεταμίνες MDMA 0,4 7 5,1 3,4 2,0 13,5 7 4,5 5,0 1,0 6,8 127

128 MDEA 0,10 3 0,13 < 0,10 < 0,10 0,32 1 0,21 < 0,10 < 0,10 1,03 MDA 8,3 0 < 8,3 < 8,3 < 8,3 < 8,3 0 < 8,3 < 8,3 < 8,3 < 8,3 MA 2,7 7 12,1 12,8 8,5 18,0 0 < 2,7 < 2,7 < 2,7 < 2,7 Amphetamine 3, , < 3,0 < 3,0 < 3,0 3,3 Κανναβινοειδή Δ9-THC nor-Δ9-THC acid Cannabidiol 43,7 0 < 43,7 < 43,7 < 43,7 < 43,7 0 < 43,7 < 43,7 < 43,7 < 43,7 LSD και μεταβολίτης LSD 0,2 3 < 0,2 < 0,2 < 0,2 0,3 3 0,2 < 0,2 < 0,2 0,6 2-oxo-3-hydroxy-LSD 0,2 4 0,2 0,2 < 0,2 0,4 3 0,2 < 0,2 < 0,2 0,4 Βενζοδιαζεπίνες Alprazolam 1,3 0 < 1,3 < 1,3 < 1,3 < 1,3 4 2,8 2,4 < 1,3 7,7 Bromazepam 7,9 0 < 7,9 < 7,9 < 7,9 < 7,9 2 20,3 < 7,9 < 7,9 80,8 Chlordiazepoxide 4,8 6 6,4 6,2 < 4,8 9,8 7 21,4 18,3 8,7 39,0 Clobazam 1,9 1 < 1,9 < 1,9 < 1,9 2,6 0 < 1,9 < 1,9 < 1,9 < 1,9 Diazepam 1,2 4 1,6 1,3 < 1,2 4,8 6 3,6 3,1 < 1,2 7,8 Nordiazepam 0,34 4 0,96 < 0,34 < 0,34 3,04 7 2,85 2,70 1,69 5,22 Flunitrazepam 5,8 0 < 5,8 < 5,8 < 5,8 < 5,8 0 < 5,8 < 5,8 < 5,8 < 5,8 7-amine-flunitrazepam 14,7 0 < 14,7 < 14,7 < 14,7 < 14,7 0 < 14,7 < 14,7 < 14,7 < 14,7 Lorazepam 4,7 7 20,7 20,1 13,4 28,6 7 36,6 32,2 23,4 59,6 Nitrazepam 20,0 0 < 20 < 20 < 20 < 20 0 < 20 < 20 < 20 < 20 Midazolam 0,17 2 < 0,17 < 0,17 < 0,17 0,25 4 0,57 0,17 < 0,17 1,57 Oxazepam 3,4 7 11,9 11,4 8,6 14,8 7 22,7 24,0 14,5 28,9 Temazepam 2,3 2 <2,3 <2,3 <2,3 6,2 6 4,3 4,6 <2,3 5,9 Βαρβιτουρικά Phenobarbital 54 3 < 54 < 54 <

129 Pentobarbital 5,7 0 < 5,7 < 5,7 < 5,7 < 5,7 0 < 5,7 < 5,7 < 5,7 < 5,7 Αντιψυχωσικά Chlorpromazine 4,9 0 < 4,9 < 4,9 < 4,9 < 4,9 1 < 4,9 < 4,9 < 4,9 15,4 Clozapine 2,5 3 3,6 < 2,5 < 2,5 13,1 7 23,4 19,6 6,0 43,6 Norclozapine 0,09 6 0,73 0,28 < 0,09 1,56 7 7,40 3,33 0,86 27,1 Olanzapine 0,4 5 2,3 0,9 < 0,4 9,2 5 23,1 1,2 < 0,4 128 Risperidone 0,15 1 < 0,15 < 0,15 < 0,15 0,25 7 3,25 2,08 0,40 9,70 9-OH-Risperidone 0,08 3 0,15 < 0,08 < 0,08 0,69 7 2,20 1,35 0,51 6,98 Αναισθητικά και μεταβολίτες Lidocaine 4, , Fentanyl 5,6 0 < 5,6 < 5,6 < 5,6 < 5,6 2 < 5,6 < 5,6 < 5,6 11,4 Norfentanyl 0,2 7 4,2 4,5 2,3 6,0 7 7,9 6,8 5,9 14,7 Thiopental < 154 < 154 < 154 < < 154 < 154 < 154 < 154 Ketamine 2,8 1 < 2,8 < 2,8 < 2,8 2,8 3 < 2,8 < 2,8 < 2,8 4,0 Norketamine 6,5 0 < 6,5 < 6,5 < 6,5 < 6,5 0 < 6,5 < 6,5 < 6,5 < 6,5 Αντιεπιληπτικά Carbamazepine 4, Levetiracetam 4, Phenytoin 51 0 < 51 < 51 < 51 < 51 3 < 51 < 51 < Primidone 4,4 7 48,1 46,3 41,8 58,3 7 82,2 81,1 64,3 103 Valproic acid < < Τρικυκλικά Αντικαταθλιπτικά Amitryptilline 0,9 5 1,9 1,1 < 0,9 5,0 7 16,4 17,1 4,5 22,9 Nortryptilline 0,04 3 0,10 < 0,04 < 0,04 0,31 7 6,73 6,80 1,60 11,6 Clomipramine 1,2 0 < 1,2 < 1,2 < 1,2 < 1,2 3 2,6 < 1,2 < 1,2 10,3 Imipramine 5,3 0 < 5,3 < 5,3 < 5,3 < 5,3 0 < 5,3 < 5,3 < 5,3 < 5,3 129

130 Doxepine 2,8 6 7,5 8,9 < 2,8 13,6 7 9,7 9,0 3,5 16,2 Τετρακυκλικά Αντικαταθλιπτικά και μεταβολίτης Mirtazapine 1,2 7 5,0 4,2 1,7 8,4 7 32,4 31,1 7,8 49,3 8-OH mirtazapine 0,2 6 4,0 3,2 < 0,2 8,8 5 1,3 1,5 < 0,2 2,1 SSRIs Citalopram 3,6 7 30,9 25,0 16,3 61, Fluoxetine 0,6 3 1,5 < 0,6 < 0,6 4,5 7 7,6 6,9 2,4 13,3 Paroxetine 0,2 3 0,5 < 0,2 < 0,2 1,6 4 3,4 1,0 < 0,2 16,7 Sertraline 0,08 7 1,55 0,97 0,48 4,82 7 3,65 2,31 1,40 11,6 Norsertraline 4,3 5 13,0 13,0 < 4,3 34,5 3 17,9 8,6 < 4,3 69,1 SNRIs Venlafaxine 4, Υπνωτικό Zopiclone 8,2 0 < 8,2 < 8,2 < 8,2 < 8,2 0 < 8,2 < 8,2 < 8,2 < 8,2 Συμπαθομιμητικά Ephedrine 63, ,2 259 Norephedrine 9,7 0 < 9,7 < 9,7 < 9,7 < 9,7 0 < 9,7 < 9,7 < 9,7 < 9,7 Πίνακας 7.2 Παρουσία των αναλυτών (σε ng L -1 ) στα εισερχόμενα και επεξεργασμένα υγρά απόβλητα του ΚΕΛ Ψυττάλειας (Β δειγματοληψία, n = 8) Εισερχόμενα Απόβλητα (ng l -1 ) Επεξεργασμένα Απόβλητα(ng l -1 ) Ουσία LOD [N]>L OD a Mean Median Min Max [N]>LO D a Mean Median Min Max Οπιοειδή και Οπιούχα Morphine 1, ,2 1,7 < 1,2 11,8 Heroin 49,1 2 < 49,1 < 49,1 < 49, < 49,1 < 49,1 < 49,1 72,1 6-MAM 10,1 2 < 10,1 < 10,1 < 10,1 19,7 0 < 10,1 < 10,1 < 10,1 < 10,1 Methadone 0,3 8 5,5 3,0 2,3 12,4 8 9,2 9,0 6,0 13,1 130

131 EDDP 1,1 8 12,2 10,2 7,2 22,3 8 31,6 29,7 25,6 51,7 Codeine 4, ,8 68,4 52,0 108 Oxycodone 6,8 3 15,5 < 6,8 < 6,8 65,4 3 7,7 < 6,8 < 6,8 21,2 Bupronorphine 19,6 3 75,2 < 19,6 < 19, < 19,6 < 19,6 < 19,6 < 19,6 Κοκαΐνη και μεταβολίτες Cocaine 2,6 8 75,0 72,6 48, ,7 2,8 < 2,6 4,6 BECG 1, ,4 18,1 15,1 29,1 EME 4,5 8 60,3 63,0 38,9 78,9 8 18,0 18,0 8,3 25,4 Αμφεταμίνες MDMA 0,4 8 7,3 5,6 2,0 20,6 8 3,4 2,2 0,8 8,3 MDEA 0,10 2 0,18 < 0,10 < 0,10 0,84 6 0,59 0,20 < 0,10 3,25 MDA 8,3 0 < 8,3 < 8,3 < 8,3 < 8,3 0 < 8,3 < 8,3 < 8,3 < 8,3 MA 2,7 8 11,7 11,5 9,8 15,5 0 < 2,7 < 2,7 < 2,7 < 2,7 Amphetamine 3,0 8 79,8 76,5 53, < 3,0 < 3,0 < 3,0 4,8 Κανναβινοειδή Δ9-THC 1,0 8 36,6 12,0 2,3 218,4 7 77,0 60,1 <1,0 203,9 11-nor-Δ9-THC acid 20, ,4 209,7 45,5 616,7 8 87,5 70,2 31,9 184,9 Cannabidiol 43,7 0 < 43,7 < 43,7 < 43,7 <43,7 0 < 43,7 < 43,7 < 43,7 < 43,7 LSD και μεταβολίτης LSD 0,2 5 0,3 0,3 < 0,2 0,7 3 0,2 < 0,2 < 0,2 0,6 2-oxo-3-hydroxy-LSD 0,2 7 1,1 1,2 < 0,2 1,7 4 0,3 0,2 < 0,2 1,1 Βενζοδιαζεπίνες Alprazolam 1,3 6 3,0 2,1 < 1,3 8,0 8 7,3 6,6 2,9 11,4 Bromazepam 7,9 2 < 7,9 < 7,9 < 7,9 11,4 5 12,4 11,8 < 7,9 35,2 Chlordiazepoxide 4,8 7 10,2 10,2 < 4,8 17,8 8 16,1 14,4 6,6 34,2 Clobazam 1,9 0 < 1,9 < 1,9 < 1,9 < 1,9 4 2,0 < 1,9 < 1,9 3,9 131

132 Diazepam 1,2 5 3,3 3,1 < 1,2 6,6 8 7,4 6,5 2,4 13,4 Nordiazepam 0,34 4 0,51 < 0,34 < 0,34 1,69 8 8,02 6,87 4,57 15,2 Flunitrazepam 5,8 0 < 5,8 < 5,8 < 5,8 < 5,8 0 < 5,8 < 5,8 < 5,8 < 5,8 7-amine-flunitrazepam 14,7 0 < 14,7 < 14,7 < 14,7 <14,7 0 < 14,7 < 14,7 < 14,7 < 14,7 Lorazepam 4,7 8 41,4 39,7 27,7 60,4 8 56,2 51,6 45,1 85,6 Nitrazepam 20,0 0 < 20 < 20 < 20 < 20 0 < 20 < 20 < 20 < 20 Midazolam 0,17 0 < 0,17 < 0,17 < 0,17 <0,17 6 0,51 0,43 < 0,17 1,12 Oxazepam 3,4 8 25,6 24,9 19,9 36,4 8 45,8 45,0 32,9 69,2 Temazepam 2,3 5 3,0 3,1 <2,3 5,4 8 9,3 9,3 6,9 12,5 Βαρβιτουρικά Phenobarbital 54 2 < 54 < 54 < < 54 < Pentobarbital 5,7 0 < 5,7 < 5,7 < 5,7 < 5,7 0 < 5,7 < 5,7 < 5,7 < 5,7 Αντιψυχωσικά Chlorpromazine 4,9 0 < 4,9 < 4,9 < 4,9 < 4,9 0 < 4,9 < 4,9 < 4,9 < 4,9 Clozapine 2,5 6 17,6 8,6 < 2,5 46,3 5 10,7 6,1 < 2,5 44,4 Norclozapine 0,09 7 4,10 1,63 < 0,09 11,8 6 1,74 1,81 < 0,09 3,34 Olanzapine 0,4 3 < 0,4 < 0,4 < 0,4 0,8 4 2,0 < 0,4 < 0,4 9,9 Risperidone 0,15 6 2,30 0,39 < 0,15 9,04 6 4,33 2,26 < 0,15 19,5 9-OH-Risperidone 0,08 8 0,29 0,19 0,08 0,58 8 3,55 2,68 1,03 12,3 Αναισθητικά και μεταβολίτες Lidocaine 4, , Fentanyl 5,6 0 < 5,6 < 5,6 < 5,6 < 5,6 4 < 5,6 < 5,6 < 5,6 7,7 Norfentanyl 0,2 8 3,9 3,6 0,5 6,6 8 8,2 8,7 3,4 14,7 Thiopental < 154 < 154 < 154 < < 154 < 154 < 154 < 154 Ketamine 2,8 3 < 2,8 < 2,8 < 2,8 4,7 6 3,3 2,9 < 2,8 6,8 Norketamine 6,5 0 < 6,5 < 6,5 < 6,5 < 6,5 0 < 6,5 < 6,5 < 6,5 < 6,5 132

133 Αντιεπιληπτικά Carbamazepine 4, Lamotrigine 1,5 8 87,2 97,7 51,3 112, ,1 211,3 97,5 264,3 Topiramate 4, ,6 264,4 162,6 319, ,3 531,7 306,2 704,7 Levetiracetam 4, ,3 50,2 292 Phenytoin 51 0 < 51 < 51 < 51 < 51 0 < 51 < 51 < 51 < 51 Primidone 4,4 8 49,7 48,8 42,7 62,9 8 87,5 92,3 53,3 106 Valproic acid < < Τρικυκλικά Αντικαταθλιπτικά Amitryptilline 0,9 7 14,4 5,1 < 0,9 38,4 8 13,0 8,8 5,5 42,8 Nortryptilline 0,04 4 0,76 0,27 < 0,04 2,11 8 2,43 2,41 1,06 4,05 Clomipramine 1,2 3 2,0 < 1,2 < 1,2 5,8 2 < 1,2 < 1,2 < 1,2 2,2 Imipramine 5,3 0 < 5,3 < 5,3 < 5,3 < 5,3 0 < 5,3 < 5,3 < 5,3 < 5,3 Doxepine 2,8 8 9,9 10,6 4,6 14,7 6 6,1 3,3 < 2,8 20,0 Τετρακυκλικά Αντικαταθλιπτικά και μεταβολίτης Mirtazapine 1,2 8 19,7 10,9 5,4 42,1 8 22,9 14,0 4,3 67,8 8-OH mirtazapine 0,2 8 21,1 9,0 5,3 57,9 8 0,5 0,4 0,2 1,2 SSRIs Citalopram 3, ,9 34, Fluoxetine 0,6 6 4,3 3,6 < 0,6 13,7 8 4,2 3,8 0,8 8,8 Paroxetine 0,2 6 1,5 0,8 < 0,2 4,8 5 0,7 0,4 < 0,2 1,5 Sertraline 0,08 8 7,76 3,41 1,38 18,4 6 0,60 0,36 < 0,08 1,49 Norsertraline 4,3 6 15,2 17,2 < 4,3 25,8 2 5,3 < 4,3 < 4,3 16,5 SNRIs Venlafaxine 4, Υπνωτικό 133

134 C (ng/l) Zopiclone 8,2 0 < 8,2 < 8,2 < 8,2 < 8,2 0 < 8,2 < 8,2 < 8,2 < 8,2 Συμπαθομιμητικά Ephedrine 63, Norephedrine 9,7 0 < 9,7 < 9,7 < 9,7 < 9,7 0 < 9,7 < 9,7 < 9,7 < 9,7 a [N]>LOD: Αριθμός δειγμάτων με συγκεντρώσεις μεγαλύτερες του ορίου ανίχνευσης (LOD) της μεθόδου Στη συνέχεια δίνονται οι ημερήσιες διακυμάνσεις των συγκεκριμένων ουσιών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα φαίνεται ξεκάθαρα ό,τι η χρήση της cocaine και των amphetamines αυξάνει το Σαββατοκύριακο, ενώ η διακύμανση της THC κατά την 2 η δειγματοληψία, υποδηλώνει κάποια συγκεκριμένη τάση την Παρασκευή και το Σαββάτο Η methadone, η codeine, η morphine, η lidocaine και όλα τα ψυχιατρικά φάρμακα έχουν μάλλον τυπική διακύμανση φαρμάκων, με μεγαλύτερες συγκεντρώσεις μέσα στην εβδομάδα. Διαφοροποιείται το valproic acid (αντιεπιληπτικό) που παρουσιάζει μεγαλύτερες συγκεντρώσεις το Σαββατοκύριακο, ειδικά κατά την 1 η δειγματοληψία. Θα πρέπει να αναφερθεί ότι σε γενικές γραμμές οι ημερήσιες διακυμάνσεις δε διέφεραν σημαντικά μεταξύ των δυο δειγματοληψιών. COCAINE BENZYLECGONINE 450,0 400,0 350,0 300,0 250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 0,0 5/12/2010 6/12/2010 7/12/2010 8/12/2010 9/12/ /12/ /12/2010 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY DATE 134

135 C (ng/l) C (ng/l) C (ng/l) METHADONE EDDP 18,0 16,0 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 5/12/2010 6/12/2010 7/12/2010 8/12/2010 9/12/ /12/ /12/2010 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY DATE Methamphetamine Amphetamine 450,0 400,0 350,0 300,0 250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 0,0 5/12/2010 6/12/2010 7/12/2010 8/12/2010 9/12/ /12/ /12/2010 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY DATE Codeine Morphine Ephedrine 1000,0 900,0 800,0 700,0 600,0 500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 0,0 5/12/2010 6/12/2010 7/12/2010 8/12/2010 9/12/ /12/ /12/2010 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY DATE 135

136 C (ng/l) C (ng/l) C (ng/l) Carbamazepine Levetiracetam Valproic Acid Primidone /12/2010 6/12/2010 7/12/2010 8/12/2010 9/12/ /12/ /12/2010 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY DATE Chlordiazeproxide Lorazepam Oxazepam 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 5/12/2010 6/12/2010 7/12/2010 8/12/2010 9/12/ /12/ /12/2010 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY DATE Mirtazapine Mirtazapine 8OH 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 5/12/2010 6/12/2010 7/12/2010 8/12/2010 9/12/ /12/ /12/2010 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY DATE 136

137 C (ng/l) C (ng/l) C (ng/l) Lidocaine Venlafaxine Phenobarbital Citalopram /12/2010 6/12/2010 7/12/2010 8/12/2010 9/12/ /12/ /12/2010 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY DATE Εικόνα 7.1: Συγκεντρώσεις των αναλυτών στα εισερχόμενα λύματα του ΚΕΛ Ψυττάλειας κατά τη 1 η δειγματοληψία (Κυριακή: 5/12/2010, Σάββατο: 11/12/2010) COCAINE BENZOYLECGONINE EME 600,0 500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 0,0 3/4/2011 4/4/2011 5/4/2011 6/4/2011 7/4/2011 8/4/2011 9/4/ /4/2011 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY SUNDAY DATE METHADONE EDDP 40,0 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 3/4/2011 4/4/2011 5/4/2011 6/4/2011 7/4/2011 8/4/2011 9/4/ /4/2011 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY SUNDAY DATE 137

138 C (ng/l) C (ng/l) C (ng/l) Δ9 THC Δ9 THCA 3/4/2011 4/4/2011 5/4/2011 6/4/2011 7/4/2011 8/4/2011 9/4/ /4/2011 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY SUNDAY DATE Methamphetamine Amphetamine 160,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 3/4/2011 4/4/2011 5/4/2011 6/4/2011 7/4/2011 8/4/2011 9/4/ /4/2011 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY SUNDAY DATE Codeine Morphine Ephedrine 3/4/2011 4/4/2011 5/4/2011 6/4/2011 7/4/2011 8/4/2011 9/4/ /4/2011 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY SUNDAY DATE 138

139 C (ng/l) C (ng/l) C (ng/l) Carbamazepine Topiramate Levetiracetam Valproic Acid /4/2011 4/4/2011 5/4/2011 6/4/2011 7/4/2011 8/4/2011 9/4/ /4/2011 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY SUNDAY DATE Chlordiazeproxide Lorazepam Oxazepam 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 3/4/2011 4/4/2011 5/4/2011 6/4/2011 7/4/2011 8/4/2011 9/4/ /4/2011 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY SUNDAY DATE Mirtazapine Mirtazapine 8OH 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 3/4/2011 4/4/2011 5/4/2011 6/4/2011 7/4/2011 8/4/2011 9/4/ /4/2011 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY SUNDAY DATE 139

140 C (ng/l) C (ng/l) C (ng/l) Lamotrigine Primidone 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 3/4/2011 4/4/2011 5/4/2011 6/4/2011 7/4/2011 8/4/2011 9/4/ /4/2011 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY SUNDAY DATE Clozapine Norclozapine 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 3/4/2011 4/4/2011 5/4/2011 6/4/2011 7/4/2011 8/4/2011 9/4/ /4/2011 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY SUNDAY DATE Lidocaine Venlafaxine Citalopram /4/2011 4/4/2011 5/4/2011 6/4/2011 7/4/2011 8/4/2011 9/4/ /4/2011 SUNDAY MONDAY TUESDAY WEDNESDAY THURSDAY FRIDAY SATURDAY SUNDAY DATE Εικόνα 7.2: Συγκεντρώσεις των αναλυτών στα εισερχόμενα λύματα του ΚΕΛ Ψυττάλειας κατά τη 2 η δειγματοληψία (Κυριακή: 3/4/2011, Κυριακή: 10/4/2011) 140

141 Σύγκριση των μέσων συγκεντρώσεων των συγκεκριμένων ουσιών που προσδιορίστηκαν κατά την 1 η και 2 η δειγματοληψία δεν έδειξε σημαντικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των εποχών, εκτός από την amphetamine και την ephedrine των οποίων οι συγκεντρώσεις ήταν υψηλότερες κατά την 1 η δειγματοληψία (Δεκέμβριος 2010) και την cocaine, το valproic acid και το citalopram με μεγαλύτερες συγκεντρώσεις τη 2 η δειγματοληψία (Εικόνα 7.3). Για τις υπόλοιπες ουσίες, οι διαφοροποιήσεις ήταν μικρότερες. 141

142 Εικόνα 7.3: Μέσες συγκεντρώσεις των αναλυτών στα εισερχόμενα λύματα του ΚΕΛ Ψυττάλειας κατά την 1 η και 2 η δειγματοληψία 142

143 7.3 Απομάκρυνση DoA κατά την πρωτοβάθμια/δευτεροβάθμια επεξεργασία των υγρών αποβλήτων Από τις 41 ουσίες που ανήκουν στη συγκεκριμένη κατηγορία αναδυόμενων ρύπων και ανιχνεύτηκαν συστηματικά στα υγρά απόβλητα του ΚΕΛ Ψυτάλλειας κατά την 1 η δειγματοληψία, μόνο οι 13 φάνηκε να απομακρύνονται κατά ένα ποσοστό κατά την πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια επεξεργασία των υγρών αποβλήτων (Εικόνα 7.4). Μεταξύ των συγκεκριμένων ενώσεων, μόνο 7 ουσίες απομακρύνθηκαν σε σημαντικό βαθμό (>80%), 4 ουσίες απομακρύνθηκαν μερικώς (ποσοστό απομάκρυνσης 50-79%), ενώ μόνο 2 ουσίες απομακρύνθηκαν σε μικρό ποσοστό (11-49%). Η απομάκρυνση φαίνεται να είναι μεγαλύτερη στα δείγματα της 2 ης δειγματοληψίας. Από τις 49 ουσίες που ανιχνεύτηκαν συστηματικά στα υγρά απόβλητα του ΚΕΛ Ψυτάλλειας κατά την 2 η δειγματοληψία, απομακρύνθηκαν σε κάποιο ποσοστό, 27 ουσίες (Εικόνα 7.5). Σημαντικά φαίνεται να απομακρύνονται τα οπιοειδή και τα οπιούχα, οι αμφεταμίνες, η cocaine και οι μεταβολίτες της, η ephedrine, το Levetiracetam (αντιεπιληπτικό με υψηλές συγκεντρώσεις στα εισερχόμενα λύματα) και κάποια ψυχιατρικά φάρμακα (clozapine, chloripramine, sertraline). Θα πρέπει να αναφερθεί ό,τι για 28/41 ουσίες στην 1 η δειγματοληψία και 22/49 στη 2 η δειγματοληψία παρατηρήθηκαν μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στα επεξεργασμένα υγρά απόβλητα σε σχέση με τα εισερχόμενα λύματα (αρνητική απομάκρυνση, Εικόνες 7.4 και 7.5), γεγονός που υποδεικνύει τον πιθανό σχηματισμό τους στις δεξαμενές πρωτοβάθμιας ή/και δευτεροβάθμιας επεξεργασίας. Αυτό παρατηρείται συστηματικά στις φαρμακευτικές ενώσεις που σχηματίζουν ισχυρά γλυκορουνίδια, τα οποία υδρολύονται στη συνέχεια κατά την επεξεργασία λυμάτων και έτσι απελευθερώνουν την αρχική δραστική ουσία στα επεξεργασμένα λύματα [99]. Έτσι αυτό παρατηρείται στο μεγαλύτερο ποσοστό των ψυχιατρικών φαρμάκων, στην THC, στη methadone και τον κύριο μεταβολίτη της (EDDP). Θα πρέπει να διευκρινιστεί ότι η τύχη των μικρορυπαντών κατά την επεξεργασία των υγρών αποβλήτων και ο πιθανός σχηματισμός ορισμένων εντός των συστημάτων ενεργού ιλύος είναι ένα πολύπλοκο θέμα με το οποίο ασχολείται συστηματικά τα τελευταία χρόνια η διεθνής επιστημονική κοινότητα χωρίς να έχει φθάσει σε ασφαλή συμπεράσματα. Μία σειρά από παράγοντες όπως ο υδραυλικός χρόνος παραμονής των λυμάτων, η ηλικία της ιλύος, η συγκέντρωση των αιωρουμένων στερεών, η διαδοχή αερόβιων/ανοξικών συνθηκών και οι περιβαλλοντικές συνθήκες, όπως θερμοκρασία, έκθεση στο φώς και καιρικές συνθήκες φαίνεται να επηρεάζει την 143

144 τύχη ορισμένων μικρορυπαντών στα συστήματα βιολογικής επεξεργασίας των υγρών αποβλήτων [100,101]. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι ψυχρές συνθήκες δεν ευνοούν στην υδρόλυση των γλυκουρουνιδίων και αποσύζευξη τυχών σύμπλοκων ενώσεων στα ανεπεξέργαστα λύματα με αποτέλεσμα κατά την πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια επεξεργασία να μην μπορούν σε αυτή τη μορφή να προσροφηθούν στην ιλύ, αλλά να αποδεσμεύονταν σταδιακά στα επεξεργασμένα υγρά απόβλητα [100]. (Σχέση 7.1) 144

145 %Removal < 0% [not removed] (28/41 ompounds) %Removal 0-49% (2/41 %Removal 50-79% (4/41 %Removal > 80% (7/41 compounds) compounds) cmpounds) Εικόνα 7.4: Απομάκρυνση (%) των αναλυτών κατά την επεξεργασία υγρών αποβλήτων του ΚΕΛ Ψυττάλειας (Ά δειγματοληψία, n = 7) 145

146 %Removal < 0% [not removed] (22/49 compounds) %Removal 0-49% (7/49 compounds) %Removal 50-79% (9/49 compounds) %Removal > 80% (11/49 compounds) Εικόνα 7.5: Απομάκρυνση (%) των αναλυτών κατά την επεξεργασία υγρών αποβλήτων του ΚΕΛ Ψυττάλειας ( Β δειγματοληψία, n = 8) 146

147 7.4 Ημερήσια φορτία ουσιών στα επεξεργασμένα υγρά απόβλητα Λαμβάνοντας υπόψη τις παροχές επεξεργασμένων υγρών αποβλήτων του ΚΕΛ Ψυτάλλειας για τις ημέρες που έγιναν δειγματοληψίες (5/12/ /12/2010 και 3/4/2011-9/4/2011) και τις συγκεντρώσεις των ουσιών που ανιχνεύτηκαν στα επεξεργασμένα υγρά απόβλητα, υπολογίστηκαν οι μέσες ποσότητες των αναδυόμενων ρύπων που μέσω των επεξεργασμένων αποβλήτων καταλήγουν ημερησίως στο υδατικό περιβάλλον. Να σημειωθεί ότι για το THC έχουν υπολογιστεί τα φορτία μόνο βάση 2 ης δειγματοληψίας. Από τις ψυχοτρόπες ουσίες, οι ενώσεις που φαίνεται να αποβάλλονται σε μεγαλύτερες ποσότητες μέσω των επεξεργασμένων υγρών αποβλήτων είναι η carbamazepine, το βαλπροϊκό οξύ και το venlafaxine με μέσες ημερήσιες μάζες που ισούνται με 0,87 Κg/day, 0,55 Κg/day και 0,32 Κg/day, αντίστοιχα. Από τις υπόλοιπες ουσίες, σε μέσες ημερήσιες ποσότητες μεγαλύτερες των 100 g/day αποβάλλονται οι ουσίες citalopram, η ephedrine, η lidocaine και το levetiracetam. (Σχέση 7.2) ί έ ή έ Εικόνα 7.6: Μέσες ημερήσιες ποσότητες των αναλυτών (g/day) που μέσω των δευτεροβάθμια επεξεργασμένων υγρών αποβλήτων του ΚΕΛ Ψυτάλλειας καταλήγουν στο υδατικό περιβάλλον 147

148 7.5 Εκτίμηση Χρήσης των DoA Τα δεδομένα για τον υπολογισμό της χρήσης των εξαρτησιογόνων ουσιών από τον πληθυσμό της Αττικής των οποίων τα λύματα καταλήγουν στο ΚΕΛ Ψυττάλειας παρουσιάζονται στον Πίνακα 7.3. Για τους παρακάτω υπολογισμούς έγινε επίσης η παραδοχή ό,τι ο πληθυσμός που εξυπηρετείται από το ΚΕΛ Ψυττάλλειας είναι περίπου Αυτό επίσης προκύπτει από τη μέση παροχή εισερχόμενων λυμάτων στο ΚΕΛ Ψυττάλλειας και στις 2 δειγματοληψίες ( m 3 ) και την υπόθεση ότι κάθε άτομο απορρίπτει περίπου 0,2m 3 λυμάτων. Ωστόσο, ο πληθυσμός που χρησιμοποιήθηκε για τους υπολογισμούς ( άτομα) είναι ο γενικός πληθυσμός και όχι ο πληθυσμός μεταξύ ηλικιών ετών που χρησιμοποιείται στους υπολογισμούς του Ευρωπαϊκού Κέντρου Παρακολούθησης Ναρκωτικών και Τοξικομανίας (EMCDDA, 2011) [4]. Στις παρακάτω εικόνες (Εικόνα 7.7 και 7.8) παρουσιάζονται οι ημερήσιες χρήσεις των αρχικών ουσιών και στις δύο δειγματοληψίες. Στον Πίνακα 7.4 παρουσιάζονται η συνολική χρήση ανά εβδομάδα (kg/week), και το μέσο ποσοστό του πληθυσμού που φέρεται να κάνει χρήση (με βάση την δόση του Πίνακα 7.3). Οι αμφεταμίνες υπάρχουν ως ζεύγη εναντιομερών μορφών, οι οποίες μορφές διαφέρουν ως προς την δραστικότητα και τον μεταβολισμό. Το (S)-(+)- εναντιομερές της αμφεταμίνης είναι γνωστό ότι έχει μεγαλύτερη δραστικότητα από το(r)-(-)- εναντιομερές και είναι παρόν στις ναρκωτικές ουσίες, από την άλλη το (R)-(-)- εναντιομερές είναι συχνά παρόν στις φαρμακευτικές ουσίες (συνταγογραφούμενες) και / ή απομακρύνεται ως μεταβολίτης συγκεκριμένων φαρμάκων όπως π.χ selegiline που χρησιμοποιείται για την θεραπεία της νόσου του Πάρκινσον. Για τον λόγο αυτό, για να γίνει διάκριση νόμιμης και παράνομης χρήσης αμφεταμίνης, πρέπει να γίνει ανάλυση των εναντιομερών μορφών της αμφεταμίνης. Δεδομένου ωστόσο ότι στην παρούσα εργασία δεν έγινε τέτοια ανάλυση, η ποσότητα κατανάλωσης της αμφεταμίνης είναι η ολική (φαρμακευτικής (νόμιμης) και ναρκωτικής (παράνομης)) [44,48]. Επίσης σημειώνεται ότι η χρήση ηρωίνης μπορεί να είναι υπερτιμημένη, διότι παρόλο πού έχει αφαιρεθεί η ποσότητα μορφίνης που χορηγείται θεραπευτικά, το 10 % αυτής, αποτελεί στατιστικό στοιχείο των Ευρωπαϊκών χωρών και όχι της Αθήνας (τα στοιχεία δεν ήταν διαθέσιμα κατά τη συγγραφή της τελικής έκθεσης, αλλά για ευρωπαϊκές πόλεις με παρόμοια στοιχεία χρήσης υπολογίζεται σε 6-10%) [62]. 148

149 Πίνακας 7.3: Δεδομένα για τον υπολογισμό της χρήσης των εξαρτησιογόνων ουσιών από τον πληθυσμό της Αττικής των οποίων τα λύματα καταλήγουν στο ΚΕΛ Ψυττάλειας Ουσία Ένωση-στόχος Ποσοστό (%) της ουσίας που απεκκρίνεται ως την ένωση - στόχο Συντελεστής μετατροπής Δόση (mg) Κοκαΐνη (COC) BEGC 45 2, Ηρωΐνη (HER) Μορφίνη 42 3,1 30 Αμφεταμίνη Αμφεταμίνη 30 3,3 50 ΜDMA (ecstasy) MDMA 65 1,5 100 THC (κάνναβη) THCA 0, Μεθαδόνη EDDP ,6 - Kωδεΐνη Kωδεΐνη 70 1,4 - (Σχέση 7.3) (Σχέση 7.4) έ ή έ έ έ (Σχέση 7.5) ό ά έ ά έ ό 149

150 g/day g/day g/day 700 Cocaine (05/12) (06/12) (07/12) (08/12) (09/12) (10/12) (11/12) 1200 Heroin (05/12) (06/12) (07/12) (08/12) (09/12) (10/12) (11/12) Amphetamine (05/12) (06/12) (07/12) (08/12) (09/12) (10/12) (11/12) 150

151 g/day g/day g/day 35 Methamphetamine (05/12) (06/12) (07/12) (08/12) (09/12) (10/12) (11/12) 16 Ecstasy (05/12) (06/12) (07/12) (08/12) (09/12) (10/12) (11/12) 35 Methadone (05/12) (06/12) (07/12) (08/12) (09/12) (10/12) (11/12) 151

152 g/d g/d g/day 180,0 160,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 Codeine (05/12) (06/12) (07/12) (08/12) (09/12) (10/12) (11/12) Εικόνα 7.7: Ημερήσια χρήση (g/day) των εξαρτησιογόνων ουσιών κατά την 1 η δειγματοληψία (5/12/ /12/2010) COCΑΙΝΕ (03/4) (04/4) (05/4) (06/4) (07/4) (08/4) (09/4) (10/4) THC-cannabis (03/4) (04/4) (05/4) (06/4) (07/4) (08/4) (09/4) (10/4) 152

153 g/d g/d g/d g/d Heroin (03/4) (04/4) (05/4) (06/4) (07/4) (08/4) (09/4) (10/4) Amphetamine (03/4) (04/4) (05/4) (06/4) (07/4) (08/4) (09/4) (10/4) Methamphetamine (03/4) (04/4) (05/4) (06/4) (07/4) (08/4) (09/4) (10/4) 25 Ecstasy (03/4) (04/4) (05/4) (06/4) (07/4) (08/4) (09/4) (10/4) 153

154 g/day g/d 70 Methadone (03/4) (04/4) (05/4) (06/4) (07/4) (08/4) (09/4) (10/4) 250,0 Codeine 200,0 150,0 100,0 50,0 0,0 (03/4) (04/4) (05/4) (06/4) (07/4) (08/4) (09/4) (10/4) Εικόνα 7.8: Ημερήσια χρήση (g/day) των εξαρτησιογόνων ουσιών κατά τη 2 η δειγματοληψία (3/4/ /4/2011) Πίνακας 7.4: Εβδομαδιαία χρήση των εξαρτησιογόνων ουσιών από τον πληθυσμό της Αττικής και αντίστοιχο ποσοστού του πληθυσμού που υπολογίζεται να κάνει χρήση (Παραδοχή: πληθυσμός Ουσία άτομα) Δεδομένα 1 ης δειγματοληψίας Εβδομαδιαία κατανάλωση σε kg Ποσοστό (%) του πληθυσμού που κάνει χρήση Δεδομένα 2 ης δειγματοληψίας Εβδομαδιαία κατανάλωση σε kg Ποσοστό (%) του πληθυσμού που κάνει χρήση Κοκαΐνη (COC) 3,31 0,12 4,04 0,13 Ηρωΐνη (HER) 5,9* 0,70* 8,1* 0,85* Αμφεταμίνη 3,00** 0,35** 1,59** 0,17** Μεθαμφεταμίνη 0,14 0,017 0,16 0,017 ΜDMA (ecstasy) 0,039 0,0014 0,066 0,0021 THC (κάνναβη) ,5 Μεθαδόνη 0,142-0,27 - Kωδεΐνη 1,03-1,41 - * Διορθωμένο ως προς την θεραπευτική μορφίνη, με το 10 % που αποτελεί στατιστικό στοιχείο των ευρωπαϊκών χωρών. **Επειδή δεν έχει γίνει ανάλυση των εναντιομερών μορφών της αμφεταμίνης δεν έχει γίνει διόρθωση ως προς την αμφεταμίνη που δίνετε για θεραπευτική χρήση (π.χ για την νόσο Πάρκινσον) 154

155 Από τα παραπάνω συνάγεται το συμπέρασμα ότι για τις amphetamines και την cocaine, η χρήση αυξάνεται τα Σαββατοκύριακα. Μάλιστα για το ecstasy είναι 5 10 φορές υψηλότερη η κατανάλωση το Σαββατοκύριακο απ ό,τι η μέση εβδομαδιαία και στις 2 δειγματοληψίες. Η διακύμανση των άλλων ουσιών είναι μικρότερη μέσα στην εβδομάδα. Ενδιαφέρον έχει ό,τι η methadone παρουσιάζει παρόμοια διακύμανση με κάποιες από τις φαρμακευτικές ουσίες, με υψηλότερες ποσότητες στην αρχή της εβδομάδας. Μεταξύ των δειγματοληψιών, η χρήση είναι παρόμοια για την cocaine και τη methamphetamine, υψηλότερη την άνοιξη του 2011 για την heroin, για το ecstasy, τη methadone και την codeine και μικρότερη την άνοιξη του 2011 για την amphetamine (Πίνακας 7.4). Με βάση τη δόση που ορίζεται διεθνώς [8] και τον πληθυσμό της ευρύτερης περιοχής του λεκανοπεδίου, μπορεί να υπολογιστεί το ποσοστό του πληθυσμού που κάνουν χρήση (Πίνακας 7.4). Τα ποσοστά που υπολογίστηκαν και παρουσιάζονται στον Πίνακα 8 μπορούν να συγκριθούν με τα στατιστικά στοιχεία που συλλέγει η ΕMCDDA 2011 [4]. Σύμφωνα με την ΕMCDDA το ποσοστό των ατόμων που κάνουν χρήση κοκαΐνης στην Ελλάδα ανέρχεται στο 0,1% (ΕMCDDA, 2011) και τα στοιχεία αυτά ταιριάζουν με το αποτέλεσμα της παρούσας ανάλυσης ( %). Παρόμοια είναι τα αποτελέσματα και για την χρήση αμφεταμινών, αν αθροίσουμε την κατανάλωση των αμφεταμινών και το ποσοστό των ατόμων που κάνουν χρήση από τον Πίνακα 7.4. Σύμφωνα με την ΕMCDDA, το 0,2% του γενικού πληθυσμού από έτη κάνει χρήση αμφεταμινών (ΕMCDDA, 2011), ενώ τα αποτελέσματα του Πίνακα 7.3 δηλώνουν ότι 0,35% του πληθυσμού το Δεκέμβριο του 2010 και 0.19% του πληθυσμού τον Απρίλιο του 2011, κάνουν χρήση αμφεταμινών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του Πίνακα 7.4, το 5.5 % του πληθυσμού κάνει χρήση κάνναβης, ενώ σύμφωνα με την ΕMCDDA το % του πληθυσμού μεταξύ ηλικιών ετών κάνει χρήση (ΕMCDDA, 2011). Τα αποτελέσματα για τη χρήση ηρωίνης έχουν μεγάλη αβεβαιότητα, εξαιτίας της μερικής διόρθωσής τους με το ποσοστό που προέρχεται από την θεραπευτική χρήση μορφίνης. Το αποτέλεσμα γίνεται ακόμα αβέβαιο αν συνυπολογίσουμε ότι ένα μέρος της morphine μπορεί να προέρχεται και από τον μεταβολισμό της codeine, χωρίς να είμαστε σε θέση να το υπολογίσουμε. Έτσι το ποσοστό του πληθυσμού που υπολογίζεται να κάνει χρήση στον Πίνακα 8 είναι 155

156 σίγουρα υπερεκτιμημένο. Ωστόσο και τα στοιχεία της EMCDDAείναι ασαφή ως προς αυτό το σημείο, διότι δεν έχουν υπολογιστεί οι χρήστες ηρωίνης αλλά οι τοξικομανείς ως σύνολο. Σύμφωνα με την EMCDDA το σύνολο των τοξικομανών της Ελλάδας (στοιχεία του 2004) ανέρχεται στο 0,3% και αν αφαιρέσουμε από αυτό το ποσοστό το 0,1% που κάνουν χρήση κοκαΐνης, τότε μπορούμε να υποθέσουμε ότι το υπόλοιπο 0,2 % είναι χρήστες ηρωίνης (EMCDDA, 2011). 7.6 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΗ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ Τα σημαντικότερα συμπεράσματα που προέκυψαν είναι: Έγινε ανάπτυξη μεθόδου προσδιορισμού 71 ψυχοτρόπων ή μη φαρμάκων, καθώς και των παρανόμως διακινούμενων ουσιών και των μεταβολιτών τους, σε υγρά απόβλητα με υγροχρωματογράφο συζευγμένο με φασματομετρία μαζών (LC-MS/MS). Οι 66 προσδιορίστηκαν με θετικό ιοντισμό ενώ οι 5 με αρνητικό ιοντισμό. Το καταλληλότερο προσροφητικό υλικό για την προσυγκέντρωση και καθαρισμό του δείγματος ήταν το Strata XCμε ιδιότητες κατιονανταλλαγής. Έδινε πολύ καλές ανακτήσεις και κυρίως για το EME, έναν από τους σημαντικούς μεταβολίτες της cocaine. Ακόμα η επίδραση της μήτρας ήταν πολύ μικρότερη με την χρήση του Strata- XC και εμφάνιζόταν ως καταστολή του σήματος. Έγινε επικύρωση της μεθόδου και βρέθηκε ότι η μέθοδος παρουσιάζει ικανοποιητικά αποτελέσματα για την ορθότητα και την πιστότητα, όπως και πολύ χαμηλά όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης για τις περισσότερες ενώσεις. Αντίστοιχες μέθοδοι στην βιβλιογραφία υπαρχουν ωστόσο καμία δεν συνδυάζει τόσες ενώσεις με τέτοιο εύρος φυσικοχημικών ιδιοτήτων. Εφαρμογή μιας τέτοιας μεθόδου σε πραγματικά δείγματα γίνεται για πρώτη φορά στην Ελλάδα. Η μέθοδος αν και σχετικά χρονοβόρα έχει τη δυνατότητα να προσδιορίζει πολλές ενώσεις από διάφορες κατηγορίες φαρμάκων, με υψηλές ευαισθησίες και γενικά χαμηλό κόστος. 156

157 Οι συγκεντρώσεις ορισμένων ουσιών στα εισερχόμενα λύματα φάνηκε να διαφοροποιούνται σημαντικά από ημέρα σε ημέρα. Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ αυξημένων συγκεντρώσεων των ουσιών και συγκεκριμένων ημερών της εβδομάδας για τις περισσότερες ουσίες. Εξαίρεση αποτέλεσαν ορισμένα ναρκωτικά (π.χ. Cocaine, ecstasy και THC) των οποίων οι μέγιστες συγκεντρώσεις ανιχνεύθηκαν την Παρασκευή και το Σαββατοκύριακο. Χρήση ισοζυγίων μάζας για τις ναρκωτικές ουσίες που ανιχνεύθηκαν στα μη επεξεργασμένα υγρά απόβλητα του ΚΕΛ Ψυτάλλειας έδειξε ότι το ποσοστό των ατόμων που υπολογίστηκε ότι κάνουν χρήση κάνναβης στην Αττική ανέρχεται σε 5,5%, χρήση cocaine το 0,12 0,13% και χρήση amphetamine το 0,19 0,35% γενικού πληθυσμού. Τα αποτελέσματα για τη χρήση heroin απαιτούν διόρθωση ως προς την θεραπευτική χρήση της morphine. Σύμφωνα με τα συμπεράσματα του παρόντος έργου, ενδιαφέρον για μελλοντική έρευνα παρουσιάζουν τα παρακάτω θέματα: Η αναγνώριση των χημικών ουσιών (μεταβολιτών) που παράγονται από τη βιομετατροπή / αποδόμηση των αναδυόμενων ρύπων κατά τη δευτεροβάθμια επεξεργασία των υγρών αποβλήτων. Η παρακολούθηση συγκεκριμένων αναδυόμενων ρύπων που προσδιορίστηκαν κατά το παρόν έργο σε υψηλές συγκεντρώσεις σε ετήσια και ημερήσια βάση και η συσχέτισή τους με συγκεκριμένες πηγές παραγωγής αποβλήτων (π.χ. νοσοκομεία, βιομηχανίες φαρμάκων κ.λπ.). Διερεύνηση και άλλων αναδυόμενων ρύπων προτεραιότητας που μπορούν να προσδιοριστούν με αυτή τη μέθοδο. 157

158 ΠΙΝΑΚΑΣ ΟΡΟΛΟΓΙΑΣ Πίνακας 1: Πίνακας ορολογίας με τις αντιστοιχίσεις των ελληνικών και ξενόγλωσσων όρων Ξενόγλωσσος όρος Ελληνικός Όρος Emerging contaminats Drugs of abuse Αναδυόμενοι ρύποι Εξαρτησιογόνες και ψυχοδραστικές ενώσεις Illicit drugs solid phase extraction silica-based stationary phase High-Performance Liquid Chromatography Reversed-Phase Liquid Chromatography electrospray gas-phase sources desorption sources triple stage quadrupole analyzer electrospray ionization selected reaction monitoring (SRM) infusion positive/negative ionization probe Παρανόμως διακινούμενες ουσίες (ουσίες που διακινούνται στο δρόμο) εκχύλιση στερεάς φάσεως σιλανολικές ομάδες στατική φάση υψηλής απόδοσης υγροχρωματογραφία υγροχρωματογραφία αντίστροφης φάσης ηλεκτροψεκασμός πηγές αέριας φάσης ιοντισμός εκρόφησης φασματόμετρο μαζών με τριπλό τετράπολο Ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό παρακολούθηση επιλεγμένης αντίδρασης έγχυση θετικός/αρνητικός ιοντισμός θέση του ακροσωλήνιου ιοντισμού 158

159 spray voltage sheath gas auxiliary gas Ion transfer capillary temperature Tube lens collision energy collision pressure matrix matched recovery standard solution spike samples area precision reproducibility repeatability matrix factor Ion suppression Ion enhancement multi-residue method sewage treatment plants chromatographic methods τιμή του εφαρμοζόμενου δυναμικού αερίου εκνέφωσης αερίου ξήρανσης θερμοκρασία του αγωγού μεταφοράς των ιόντων εφαρμοζόμενη τάση ενέργεια θραυσματοποίησης πίεση θραυσματοποίησης πρότυπα προσαρμοσμένα σε μήτρα ανάκτηση πρότυπα διαλύματα εμβολιασμένα δείγματα περιοχή εμβαδού κορυφής πιστότητα αναπαραγωγιμότητα επαναληψιμότητα παράγοντας μήτρας καταστολή του σήματος εμπλουτισμό τουσήματος Πολύ-υπολειμματική μέθοδος μονάδες βιολογικού καθαρισμού χρωματογραφικές μεθόδους 159

160 3. ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΑΡΚΤΙΚΟΛΕΞΑ ΑΚΡΩΝΥΜΙΑ Πίνακας 2: Ακρωνύμια και ανάπτυξή τους ΑΡΚΤΙΚΟΛΕΞΑ ΟΝΟΜΑΣΙΑ LC-MS/MS ΚΝΣ DoA SPE HPLC MALDI API ESI RF TOF ΙΤ MS CAD SRM LOQ LOD Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Κεντρικό νευρικό σύστημα Drugs of abuse τεχνική εκχυλίσεως στερεάς φάσης High-Performance Liquid Chromatography Matrix-assisted laser desorption/ionization Atmospheric Pressure Ionisation Electrospray Ionization Radiofrequency Time of flight Ion Trap Mass Spectrometry Collision Activated Dissociation Selected Reaction Monitoring Limit of Quantification Lower Limit of Detection 160

161 RSD SD MF Relative Standard Deviation Standard Deviation Matrix Factor 161

162 ΑΝΑΦΟΡΕΣ 1. Κ. Γ. Μακρή, (1929), Το Ελληνικό χασίς (φυτοχημική και δρογογνωστική μελέτη) Διδακτορική Διατριβή. 2. Κ. Μ. Χουρδάκης, (2004) Τοξικολογία του ανθρώπου, Δεύτερη έκδοση, University studio press. 3. M. R. Aldrich, Antique cannabis book, medical cannabis: a short graphical history, (τελευταία επίσκεψη Αύγουστος 2012). 4. ΕΚΤΕΠΝ, Ετήσια Έκθεση (2011), H Κατάσταση του Προβλήματος των Ναρκωτικών και των Οινοπνευματωδών στην Ελλάδα. 5. ΕMCDDA (European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction), Greece (τελευταία επίσκεψη Αύγουστος 2012). 6. S. Castiglioni, E. Zuccato, R. Fanelli, eds. (2011), ILLICIT DRUGS IN THE ENVIRONMENT, Occurance, analysis and the fate using mass spectrometry, Willey. 7. A. L. N. van Nuijs, J. F. Mougel, I. Taracomnicu, L. Bervoets, R. Blust, Ph. G. Jorens, H. Neels, A. Covaci, (2011), A one year investigation of the occurrence of illicit drugs in wastewater from Brussels, Belgium, Journal of Environmental Monitoring, 13, E. Zuccato, S. Castiglioni, (2009), Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences 367, E. Zuccato, S. Castiglioni, R. Bagnati, Ch. Chiabrando, P. Grassi, R. Fanelli, (2008), Illicit drugs, a novel group of environmental contaminants, Water Research, 42, C. G. Daughton, T. Jones-Lepp, (eds.), (2001), Illicit Drugs in Municipal Sewage, Proposed New Nonintrusive Tool to Heighten Public Awareness of Societal Use of Illicit-Abused Drugs and Their Potential for Ecological Consequences, American Chemical Society, 20,

163 11. E. Zuccato, Ch. Chiabrando, S. Castiglioni, D. Calamari, R. Bagnati, S. Schiarea, R. Fanelli, (2005), Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse, Environmental Health: A Global Access Science Source, 4, E. Zuccato, Ch. Chiabrando, S.Castiglioni, R. Bagnati, and R.Fanelli. (2008b.), Estimating community drug abuse by wastewater analysis, Environmental Health Perspectives 116, A. Noorsij, J. Van Genderen, (2004), Organic Compounds and Genotoxicity in Drinking Water, Book, IWA Publishing, (τελευταία επίσκεψη 10/10/2012) (τελευταία επίσκεψη 10/10/2012). 16. R. J. Prankerd, (2007), Profiles of Drug substances, excipients, and related methodology, critical compilation of pka values for pharmaceutical substances, Vol Τζ. Αττα Πολίτου, (2008), Σημειώσεις από το μάθημα Τοξικολογίας, «ΔΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΙΣ ΑΠΟ ΦΑΡΜΑΚΑ», Εργαστηρίου Αναλυτικής Χημείας Πανεπιστημίου Αθηνών (τελευταία επίσκεψη 10/11/2012). 19. S. Nagar, R. B. Raffa, (2008), Looking beyond the administered drug: Metabolites of opioid analgesics, The Journal of Family Practice, 57, 6, Temple University School of Pharmacy, Philadelphia, PA. 20. W. E. Fantegrossi, K. S. Mirnane, C. J. Reisssig, (2008), The behavioral pharmacology of hallucinogens, Biochemical Pharmacology, 75, Εθνικό Συνταγολόγιο επίσκεψη 10/10/2012). 23. I. G. Petrisor, I. Lazar, (2006), Emerging Contaminants The Problem, Examples and Bioremediation Alternatives Part I, Roumanian Biotechnological Letters, 11, 3,

164 24. G. Tchobanoglous, F. L. Burton, H. D. Stensel, (2002), Wastewater Engineering: Treatment and Reuse, 4 th ed., Mc Graw-Hill Science Engineering. 25. R. P. Schwarzenbach, B. I. Escher, K. Fenner, T. B. Hofstetter, C. A. Johnson, U. Von Gunten, B. Wehrli, (2006), The challenge of micropollutants in aquatic systems, Science 25, D. Kolpin, E. Furlong, M. Meyer, E. M. l. Thurman, St. Zaugg, (2002), Pharmaceuticals, hormones and other organic wastewater contaminants in U.S. Streams, : A National Reconnaissance, Environmental Science & Technology, 36, R. Loos, B. M. Gawlik, G. Locoro, E. Rimaviciute, S. Contini, G. Bidoglio, (2009), EU-wide survey of polar organic persistent pollutants in European river waters. Environmental Pollution, 157, D. Ashtona, M. Hiltonb, K. V. Thomas, (2004), Investigating the environmental transport of human pharmaceuticals to streams in the United Kingdom, Science of the Total Environment, 333, A. M. Becker, S. Gerstmann, H. Frank, (2008), Perfluoroctane surfactants in waste waters, the major source of river pollution, Chemosphere 72, J. W. Birkett, J. N. Lester, (2003), Endocrine disruptοrs in wastewater and sludge treatment processes, CRC Press LLC, Lewis Pub. 31. T. L. Jones-Lepp, D. A. Alvarez, J. D. Petty, J. N. Huckins, (2004), Polar Organic Chemical Integrative Sampling and Liquid Chromatography Electrospray/Ion-Trap Mass Spectrometry for Assessing Selected Prescription and Illicit Drugs in Treated Sewage Effluents, Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 47,4, C. G. Daughton, D. M. Whitacre (editor), (2011), Illicit Drugs: Contaminants in the Environmentand Utility in Forensic Epidemiology, Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, Springer Science and Business Media, LLC U.S. Environmental Protection Agency. 33. D. Hummel, D. Löffler, G. Fink, Th. A. Ternes, (2006), Simultaneous Determination of Psychoactive Drugs and Their Metabolites in Aqueous Matrices 164

165 by Liquid Chromatography Mass Spectrometry, Environ. Sci. Technol., 40 (23), C. Postigo, M. J. López de Alda, D. Barceló, (2010), Drugs of abuse and their metabolites in the Ebro River basin: Occurrence in sewage and surface water, sewage treatment plants removal efficiency, and collective drug usage estimation, Environment International 36, C. Postigo, M. J. López de Alda, D. Barceló, (2011), Evaluation of drugs of abuse use and trends in a prison through wastewater analysis, Environment International 37, S. Gonzalez Alonso, M. Catala, R. Romo Maroto, Jose Luis R. Gill, Angel Gil de Miguel, Y. Valcarcel, (2010), Pollution by psychoactive pharmaceuticals in the Rivers of Madrid metropolitan area (Spain), Environment international, 36, P. Vazquez-Roing, V. Andreu, Ch. Blasco, Y. Pico, (2010), SPE and lc-ms/ms determination of 14 illicit drugs in surface waters from the Natural Prk of L Albufera (Valencia, Spain), Analytical and Bioanalytical Chemistry 397, I. Gonzales-Martino, J. B. Quintana, I. Rodriguez, R. Cela, (2010), Determination of drugs of abuse in water by solid-phase extraction, derivatisation and gas chromatography ion trap-tandem mass spectrometry, Journal Of Chromatography A, 1217, L. Bijlsma, J. V. Sancho, E. Pitarch, M. Ibanez, F.Hernadez, (2009), Simultaneous ultra-high-pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry determination of amphetamine and amphetamine-like stimulants, cocaine and its metabolites, and a cannabis metabolite in surface water and urban wastewater, Journal of Chromatography A, 1216, F. Hernadez, L. Bijlsma, J.V. Sancho, R. Diaz, M. Ibanez, (2011), Rapid widescope screening of drugs of abuse, prescription drugs with potential for abuse and their metabolites in influent and effluent urban wastewater by ultrahigh pressure liquid chromatography - quadrupole - time - of - flight - mass spectrometry, Analytica Chimica Acta, 684,

166 41. T. H. Boles, M. J. M. Wells, (2010), Analysis of amphetamine and methamphetamine as emerging pollutants in wastewater and wastewaterimpacted streams, Journal of chromatography A, K. J. Bisceglia, A. L. Roberts, M. M. Schantz, K. A. Lippa, (2010), Quantification of drugs of abuse in municipal wastewater via SPE and direct injection liquid chromatography mass spectrometry, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 398, S. Karolak, Th. Nefau, E. Bailly, A. Solgadi, Y. Levi, (2010), Estimation of illicit drugs consumption by wastewater analysis in Paris area (France), Forensic Science International, 200 (1-3), J. Bones, K. V. Thomas, B. Paull, (2007), Using environmental analytical data to estimate levels of community consumption of illicit drugs and abused pharmaceuticals, Journal of Environmental Monitoring, 2007, 9, A. L. N Van Nuijs, B. Pecceu, L. Theunis, N. Dubois, C. Charlier, P. G Jorens, L. Bervoets, R. Blust, H. Meulemans, H. Neels, A. Covaci, (2009), Can cocaine use be evaluated through analysis of wastewater? A nation-wide approach conducted in Belgium, Addiction 104, A. L. N. Van Nuijs, I. Tarcomnicu, L. Bervoets, R. Blust, Ph. G Jorens, H. Neels, A. Covaci, (2009), Analysis of drugs of abuse in wastewater by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 395, B. Kasprzyk-Hordern, R. M. Dinsdale, A. J. Guwy, (2008), The occurrence of pharmaceuticals, personal care products, endocrine disruptors and illicit drugs in surface water in South Wales, UK, Water Research, 42, 13, B. Kasprzyk-Hordern, R. M. Dinsdale, A. J. Guwy, (2009), Illicit drugs and pharmaceuticals in the environment Forensic applications of environmental data. Part 1: Estimation of the usage of drugs in local communities, Environmental Pollution 157, D. R. Bakera, B. Kasprzyk-Hordern, (2011), Multi-residue analysis of drugs of abuse in wastewater and surface water by solid-phase extraction and liquid 166

167 chromatography positive electrospray ionisation tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1218, E. Zuccato, S. Castiglioni, M. Tettamanti, R. Olandese, R. Bagnati, M. Melis, R. Fanelli, (2011), Changes in illicit drug consumption patterns in 2009 detected by wastewater analysis, Drug and Alcohol Dependence, 118, 2 3, J. Daniel Berset, R. Brenneisen, Ch. Mathieu, (2010), Analysis of llicit and illicit drugs in waste, surface and lake water samples using large volume direct injection high performance liquid chromatography Electrospray tandem mass spectrometry (HPLC MS/MS), Chemosphere, 81, M. Huerta-Fontela, M. T. Galceran, F. Ventura, (2008), Stimulatory drugs of abuse in surface waters and their removal in a conventional drinking water treatment plant, Environmental technology, 42, C. Metcalfe, K. Tindale, H. Li, A. Rodayan, V. Yargeau, (2010), Illicit drugs in Canadian municipal wastewater and estimates of community drug use, Environmental Pollution 158, J. Bones, M. Macka, B. Paull, (2007), Evaluation of monolithic and sub 2 µm particle packed columns for the rapid screening for illicit drugs application to the determination of drug contamination on Irish euro banknotes, Analyst, 132, K. Wimmera, S. Schneiderb, (2011), Screening for illicit drugs on Euro banknotes by LC MS/MS, Forensic Science International, 206, 1 3, D. R. Bakera, B. Kasprzyk-Hordern, (2011), Multi-residue determination of the sorption of illicit drugs and pharmaceuticals to wastewater suspended particulate matter using pressurised liquid extraction, solid phase extraction and liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1218, 44, C. G. Daughton, I. S. Ruhoy, (2009), Environmental footprint of pharmaceuticals: The significance of factors beyond direct excretion to sewers, Environmental Toxicology and Chemistry, 28, 12, (τελευταία επίσκεψη 10/10/2012) 167

168 59. C. T. Chiou, (2002), Partition and adsorption of organic contaminants in environmental systems, John Wiley and Sons. 60. B. W. Brooks, C. K. Chambliss, J. K. Stanley, A. Ramirez, K. E. Banks, R. D. Johnson, R. J. Lewis, (2005), Determination of select antidepressants in fish from an effluent-dominated stream, Environmental Toxicology and Chemistry, 24 (2), R. J. Irvine, C. Kostakis, P. D. Felgate, E. J. Jaehne, C. Chen, J. M. White, (2011), Population drug use in Australia: A wastewater analysis, Forensic Science International, 210, S. Terzic, I. Senta, M. Ahel, (2010), Illicit drugs in wastewater of the city of Zagreb (Croatia)--estimation of drug abuse in a transition country, Environmental Pollution, 158, A. C. Chiaia, C. Banta-Green, J. Field, (2008), Eliminating Solid Phase Extraction with Large-Volume Injection LC/MS/MS: Analysis of Illicit and Legal Drugs and Human Urine Indicators in US Wastewaters, Environmental Science & Technology, 42, A. Togola, H. Budzinski, (2008), Multi-residue analysis of pharmaceutical compounds in aqueous samples, Journal of Chromatography A, 1177, S. Castiglioni, E. Zuccato, E. Crisci, Ch. Chiabrando, R. Fanelli, R. Bagnati, (2006), Identification and Measurement of Illicit Drugs and Their Metabolites in Urban Wastewater by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, Analytical Chemistry, 78, M. R. Boleda, M. T. Galceran, F. Ventura, (2007), Trace determination of cannabinoids and opiates in wastewater and surface waters by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Journal of Chromatogaphy A 1175, B. Kasprzyk-Hordern, V. V. R. Kondakal, D.R. Baker, (2010), Enantiomeric analysis of drugs of abuse in wastewater by chiral liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, Journal of Chromatogaphy A, 1217,

169 68. M. M. Schultz, T. E. Furlong (2008), Trace Analysis of Antidepressant Pharmaceuticals and Their Select Degradates in Aquatic Matrixes by LC/ESI/MS/MS, Analytical Chemistry, 80, A. Lajeunesse, C. Gagnon, S. Sauve, (2008), Determination of Basic Antidepressants and Their N-Desmethyl Metabolites in Raw Sewage and Wastewater Using Solid-Phase Extraction and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, Analytical Chemistry, 80, U. Hass, U. Dunnbier, G. Massmannc, A. Pekdeger, (2011), Simultaneous determination of psychoactive substances and their metabolitesin aqueous matrices by ultrahigh - performance liquid chromatography - tandemmass spectrometry, Analytical Methods, 3, A. C. Hogenboom, J. A. Van Leerdam, P. de Voogt, (2009), Accurate mass screening and identification of emerging contaminants in environmental samples by liquid chromatography hybrid linear ion trap Orbitrap mass spectrometry, Journal of Chromatogaphy A, 1216, M. Huerta-Fontela, M. T. Galceran, F. Ventura, (2007), Ultraperformance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Analysis of Stimulatory Drugs of Abuse in Wastewater and Surface, Waters, Analytical Chemistry, I. González-Marino, J. B. Quintana, I. Rodríguez, R. Rodil, J. González-Penas, R.Cela, (2009), Comparison of molecularly imprinted, mixed-mode and hydrophilic balance sorbents performance in the solid-phase extraction of amphetamine drugs from wastewater samples for liquid chromatography tandem mass spectrometry determination, Journal of Chromatogaphy A, 1216, C. Postigo, M. J. L. de Alda, D. Barcelo, (2008), Fully Automated Determination in the Low Nanogram per Liter Level of Different Classes of Drugs of Abuse in Sewage Water by On-Line Solid-Phase Extraction-Liquid Chromatography Electrospray-Tandem Mass Spectrometry, Analytical Chemistry, 80, A. Gheorghe, A. van Nuijs, Bert Pecceu, Lieven Bervoets, Ph. G. Jorens, R. Blust H. Neels, A. Covaci, (2008), Analysis of cocaine and its principal metabolites in wasteand surface water using solid-phase extraction and liquidchromatography 169

170 ion trap tandem mass spectrometry, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 391, W. M. A. Niessen, (2006), Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, Taylorand Francis Group, Third Edition. 77. Μ. A. Κουππάρης, (2008), Τεχνικές Διαχωρισμού, Διαπανεπιστημιακό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών: Χημική Ανάλυση-Έλεγχος Ποιότητας. 78. D. A. Skoog, F. J. Holler, T. A. Nieman, (2007), Αρχές της Ενόργανης Ανάλυσης, Μτφ: Μ. Ι. Καραγιάννης, Κ. Η. Ευσταθίου, Ν. Χανιωτάκης, Εκδόσεις Κωσταράκη. 79. Ε. Αρχοντάκη, (2006), Υγροχρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης, Διαπανεπιστημιακό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών, Χημική Ανάλυση- Έλεγχος Ποιότητας. 80. Π. Α. Σίσκος, Δ. Π. Νικολέλης, (1991), Αναλυτικές μέθοδοι διαχωρισμού, Ε.Κ.Π.Α., Σχολή Θετικών Επιστημών, Τμήμα Χημείας, 39-84, (τελευταία επίσκεψη 10/10/2012) 82. N. Θωμαΐδης, (2008), Σύγχρονες Αναλυτικές Τεχνικές, Ε.Κ.Π.Α., Σχολή Θετικών Επιστημών, Τμήμα Χημείας. 83. E. Hoffmann, V. Stroobant, (2007), Mass Spectrometry Principles and Applications, Third Edition, WILEY. 84. J. T. Watson, O. D. Sparkman, (2007), Introduction to Mass Spectrometry, Instrumentation, Applications and Strategies for Data Interpretation, fourth edition, WILEY (Thermo:Ion Max and Ion Max-S API Source Hardwaremanual) (τελευταίαεπίσκεψη 17/10/2012) 86. P. J. Sjöberg, C. Bylunda, D. Bookman, K. Markides, (2001), Factors influencing the determination of analyte ion surface partitioning coefficients in electrosprayed droplets, Journal of The American Society for Mass Spectrometry,

171 87. A. Kot-Wasik, J. Debska, J. Namiesnik, (2007), Analytical techniques in studies of the environmental fate of pharmaceuticals and personal-care products Trac- Trends in Analytical Chemistry, 26, R. Dams, A.M. Huestis, W.E. Lambert, C.M. Murphy, (2003), Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid, Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 14, R. E. Ardrey, ( 2003), Liquid chromatography-mass spectrometry: An introduction John Wiley and Sons, UK. 90. Π. Παπαγιαννακόπουλος, Γ. Γ. Λαζάρου, Φασματοσκοπία Μάζας, Πανεπιστήμιο Κρήτης, Τμήμα Χημείας, Εργαστήριο φωτοχημείας και κινητικής Thermo Scientific TSQ Series Hardware Manual (τελευταία επίσκεψη 17/10/2012) (τελευταία επίσκεψη 4/6/2012) X/X,%20Polymeric%20Reversed%20Phase?returnURL=/Products/Search/SPE (τελευταία επίσκεψη 20/10/2012) 94. Strata Full Brochure (phenomenex) e_web.pdf (τελευταίαεπίσκεψη 20/10/2012). 95. M. Gros, M. Petrovic, D. Barcelo, (2009), Tracing Pharmaceutical Residues of Different Therapeutic Classes in Environmental Waters by Using Liquid Chromatography/Quadrupole-LinearIon Trap Mass Spectrometry and Automated Library Searching, Analytical Chemistry, 81, Μ. Κουππάρης, Ν. Θωμαίδης, (2007), Συστήματα Διασφάλισης Ποιότητας (Σημειώσεις παραδώσεων), Ε.Κ.Π.Α. 97. P. Dharmendra, (2011), Matrix effect in a view of lc-ms/ms: an overview, International Journal of Pharma and Bio Sciences, V2/ISSUE (τελευταία επίσκεψη 20/10/2012) 171

172 99. C. G. Daughton, (2004), Non-regulated water contaminants: emerging research Environmental Impact Assessment Review, 24, K. Fent, A. Weston, D. Caminada, (2006), Ecotoxicology of human pharmaceuticals, Aquatic Toxicology, 76, M. Huang, Y. Li, G. Gu, (2008), The effects of hydraulic retention time and sludge retention time on the fate of di-(2-ethylhexyl) phthalate in a laboratory-scale anaerobic-anoxic-aerobic activated sludge system. Bioresource Technology, 99,

173 173

174 «Το έργο συγχρηματοδοτείται στα πλαίσια του ΕΠΕΑΕΚ από το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο και Εθνικούς πόρους» «The project is co-financed within Op. Education by the ESF (European Social Fund) and National Resources» 174