Молекларна системска биологија I. Marko Ђорђевић, Биолошки факултет, Универзитет у Београду

Transcript

1 Молекларна системска биологија I Marko Ђорђевић, Биолошки факултет, Универзитет у Београду

2 План предавања Три основне целине: i. Повратне спреге, алостерија и кооперативност ii. Регулација експресије гена iii. Динамика регулаторних процеса Рестрикционо-модификациони систем као пример повратних спрега и кооперативности. Молекуларни осцилатори: oсцилатори у ћелијском циклусу, циркадијалне осцилације, пример синтетичког осцилатора (репресилатор)

3 Молекуларна системска биофизика Молекуларна биофизика: традиционално проучава структуру и функције биолошких макромолекула (ДНК,РНК,протеина) Молекуларна системска биофизика: како интеракције између молекула одређују особине система Молекуларна системска биофизика Молекуларна системска биологија?! Системска биологија

4 Програм ICSB 2013 (International ) 1. System modeling and simulation 2. Chemical biology 3. Synthetic biology 4. Protein and pathway engineering 5. Emerging technologies, tools & algorithms 6. Metabolomics 7. Stem and cancer cell systems biology 8. Data visualization & analysis 9. Protein interaction networks & assemblies 10. Genetic networks 11. Single cell analysis 12. Pathogen systems 13. Experimental design for systems biology 14. Genotype to phenotype modeling 15. Complex genetic traits 16. Systems biology of aging 17. Systems biology of signal transduction 18. Plant systems 19. systems approaches to genome-wide association studies 20. RNA regulatory systems 21. Developmental systems теме конференције

5 Део I: Повратне спреге, алиостерија и кооперативност

6 Централна догма молекуларне биологије Класична формулација: Информација тече За системску биологију су кључне повратне спреге.

7 Системи унутар ћелије опште особине Нелинеарни однос излазне према улазној величини линеарни однос генерално није добра апроксимација Инерција нема значајну улогу унутар ћелије уместо механичких интеракција осцилације су последица биохемијских реакција Алостерија, кооперативност интеракција

8 Однос улаза према излазу A и B су произвољни молекули, AB је њихов комплекс: A+ B AB Примери: A Транскрипциони фактор B ДНК AB Комплекс који активира или репресује транскрипцију А Лиганд (нпр. кисеоник код хемоглобина) B Рецептор (нпр. хемоглобин) АB Лиганд везан за рецептор

9 K D " улаз" Однос улаза према излазу (наставак) [ A][ B] [ AB] = [ А] [ AB ] [ A ] = = [ ] + [ ] [ ] + = дисоциона константа " излаз" B AB A K D Нелинеарна веза Окупираност рецептора (Фракција укупног броја рецептора који су везани лигандом)

10 Кооперативност и алостерија Хемоглобин као модел систем: Интеракција лиганда са рецептором Структура протеина Молекуларни модел болести Алостерија и кооперативност

11 Миоглобин везује само један атом кисеоника Хемоглобин везује четири атома кисеоника Хемоглобин има много стрмији прелаз из искљученог у укључено стање. Искључено стање мало кисеоника везаног за рецепторе Укључено стање скоро сви рецептори везани кисеоником Последица кооперативности у интеракцијама (везивању кисеоника). Кооперативност у интеракцијама је везана са алостеријом Везивање лиганда на једном месту на протеину, утиче на особине протеина на неком другом месту.

12 n молекула типа A се кооперативно (заједно) везују за молекул типа B n A+ B na B K d n = n [ A] [ B] [ nab] Хилова функција " излаз" [ nab] [ ] [ ] ([ A] K ) = = B + na B 1+ A K d n ([ ] ) d n Хилова константа Хилова функција - кооперативно везивање лиганада за рецептор

13 Део II: Динамика регулаторних процеса

14 Регулација Повратне спреге Кооперативност Алостерија Зависност излаза од улаза Улаз се мења са временом (нпр концентрација ТФ расте) Излаз се мења са временом Динамика регулације Пример динамичког система: Циркадијански осцилатори

15 Промена концентрације са dc t i dt ( ) = временом f c, c,..., c; k, k,..., k ( ) 1 2 n 1 2 c, c,..., c 1 2 n Релевантне концентрације k1, k2,..., k Брзине хемијских реакција m m Какву форму има f?

16 Деградација молекула dc t dt ( ) = kc t ( ) Зависност концентрације од времена у случају деградације ( ) = exp ( ) c t c exp 0 t τ τ =1 k Карактеристично време распада

17 dc dt A Реверзибилна реакција A B = k c + k c + A А V В B dc dt dc = dt Бимолекуларне реакција dc A+ B AB AB dt t ( ) = k c c AB A B

18 Од динамике до равнотеже [ ] d LR dt L+RV LR off [ ] [ ][ ] = k LR + k L R on У случају равнотеже: off [ ] [ ] [ ] 0 k LR + k L R = eq on eq eq K d [ ] [ ] [ LR] L R k = = k eq eq off eq on Дисоциона константа реакције

19 Апроксимација неравнотежног процеса равнотежним k + r AVBTC k +, k - p r k - Неравнотежни процес Међутим, А и B врло брзо успостављају равнотежу ( )/ ( ) B t A t = k k +

20 Михаелис-Ментенова кинетика k + E+ S ES E+ P [ ] V k Претпоставка: r k +, k - p r [ ] + [ ] d P S / Km = r [ ES ] = V dt max 1 S / K m Михаелис Ментен d[ P] [ ] ` = [ ] S Km Vmax S / K dt Закон о дејству маса m Брзина хидролизе ATP-a од стране миозина

21 Пример 1: CRISPR/Cas Напредни имуни систем код бактерија Процесовање CRISPR транскрипта

22 Бактеријски имуни системи Рестрикционо-модификациони Рестрикциони ензим + метилаза Примитиван имуни систем, рестрикциони ензим сече све ДНК секвенце које нису заштићене метилазом CRISPR/Cas Знатно напреднији систем, који се заснива на експресији малих РНК молекула Недавно теоријски предвиђен и експериментално потврђен

23 CRISPR/Cas систем CRISPR/Cas систем = CRISPR + Cas протеини CRISPR матрица: секвенце које се понављају R које су раздвојене варијабилним секвенцама S

24 Механизам резистенције на инфекцију CRISPR матрица се транскрибује као дугачак транскрипт (pre-crrna), који се онда процесује у мале РНК молекуле (crrna) од стране Cas протеина. Пошто crrna препозна секвенцу вируса, Cas протеини се регрутују на мету, и мета потом бива уништена.

25 Процесовање CRISPR транскрипта Експресија Cas гена pre-crrna опада за фактор мањи од 10 Знатно већи (више од два реда величинје) пораст crrna. crrnas су врло стабилни! pre-crrna се разграђују брзо, што је услед неспецифичне деградације. Pougach et. al., Mol. Microbiol., 2010

26 Модел процесовања транскрипта генерисање pre-crrna pre-crrna l crrna crrna M.D., M. Djordjevic and K. Severinov, Biol. Direct, Експресија cas гена води ка снажној линеарној амплификацији транскрипта: λ = λ [ ] pre crrna crrna [ pre crrna] crrna деградација Интересантно је да ова снажна амплификација кључно зависи од неспецифичног процесовања pre-crrna транскрипта.

27 Експресија cas гена Експериментални услови M.D., M. Djordjevic and K. Severinov, Biol. Direct, сатурација crrna

28 Заједнички пораст брзине транскрипције и брзине процесовања Сатурација у продукцији crrna се може уклонити ако се продукција pre-crrna такође повећа. Ово заједничко повећање може да произведе веома велику количину crrna.

29 Репресија помоћу H-NS-a Промотери за CRISPR и cas гене су репресовани од стране H-NS-a. Заједнички пораст брзине транскрипције и процесовања pre-crrna је вероватно директно релевантан за функционисање система у природним условима.

30 Закључци CRISPR/Cas Систем може веома брзо да произведе велике количине crrna. Ова брза производња је базирана на контроли система на нивоу РНК процесовања, и на подешавању параметара система (т.ј. на екстремним вредностима стабилности транскрипта). Неиндентификована нуклеаза која је одговорна за брзу деградацију pre-crrna је највероватније важан контролни елемент CRISPR/Cas система.

31 Пример2: Oсцилацилаторни системи

32 Осцилаторни системи Многи ћелијски процеси се понављају у регуларним циклусима. Два основна примера су ћелијски циклус и циркадијални осцилатори (воде рачуна о променама између дана и ноћи). Биохемијски осцилатори су обично сложени, али се често могу свести на повратну спрегу између позетивног и негативног елементa.

33 Инерција/Осцилације Механичке осцилације се заснивају на инерцији. Унутар ћелије (у цитоплазми) инерција игра малу улогу, због велике вискозности. Осцилације унутар ћелије се заснивају на биохемијским реакцијама и повратним спрегама.

34 Осцилатор у ћелијском циклусу Кључно је постојање позитивног регулатора (cyclin) и негативног регулатора (cyclin dependent kinase), као и повратне спреге између њих.

35 Циркадијански осцилатори Воде рачуна о протоку дана и ноћи екстреман пример фоторецепторских ћелија код паука.

36 Различити биолошки процеси сличан принцип Повратна спрега активатора и репресора доводи до осцилација.

37 Део III: Регулација експресије гена

38 Пример регулације експресије Lac оперон: Значајна експресија само када је лактоза присутна а глукоза одсутана. Регулација се остварује путем интеракција протеина (транскрипционих фактора) са ДНК.

39 Зависност транскрипционе активности (излаза) од концентрације транскрипционих фактора (улаза) Скицирају се могуће конфигурације протеина (регулатора) и РНК полимеразе на ДНК. За сваку конфигурацију се напише одговарајућа статистичка тежина (види примере). Транскрипциона активност је пропорционална збиру статистичких тежина које одговарају активационим комплексима, подељена са збиром свих статистичких тежина (Shea-Ackers модел).

40 Активација гена ϕ= ϕ 0 ( ) ( ) NSexp ( β ε pd) + ( NS)( NS)exp β( ε pd + εad + ε ap) ( β ε ) ( β ε ) β( ε ε ε ) P N P N A N 1+ P N exp + R N exp + ( P N )( A N )exp + + NS pd NS rd NS NS pd ad ap

41 Репресија гена Транскрипциона активност (по Shea-Ackers моделу пропорционална окупираности промотера РНК полимеразом) ϕ= ϕ 0 NSexp( β ε pd) ( β ε ) R N ( β ε ) P N 1+ P N exp + exp NS pd NS rd

42 Lac оперон За вежбу нађите израз за транскрипциону активност!

43 Сложене генске мреже Генска мрежа која Генска мрежа која контролише развој ембријона морског јежа.

44 Пример: Моделовање рудименталног имуног система Рестрикционо модификациони систем код бактерија

45 R-M систем је примитиван имунолошки систем ДНК ћелије домаћина је метилирана и зато не подлеже рестрикцији, али зато страна ДНК (нпр. вируса који напада бактерију) није метилирана, па бива уништена. R-M system R-M системи су често мобилни host genome bacteria R-M гени могу да прелазе из једне ћелије домаћина у другу, и на тај начин се шире кроз популацију бактерија.

46 Бактеријски рестрикционо-модификациони (R-M) систем типа II Ендонуклеаза (R) препознаје и сече специфичне ДНК секвенце Methylase (M) methylates the same DNA sequences that are cut by the endonuclease, and consequently protects them from cleaving. Операторска секвенца Контролни протеин (C) координира експресију R и M гена тако што се везује узводно од CR гена и регулише њихову експресију.

47 Regulation by the control protein The control protein exhibits very large cooperativity: Only dimmer can bind to DNA Only tetramer is bound to DNA in the absence of RNA polymerase CAhdI 0 Over the entire range of control protein concentrations two dimmers are simultaniously bound T Free DNA Large cooperativity in binding

48 Z RNAP = Квантитативни модел?? RNAP G RNAP Z =?? D RNAP G D GD RNAP RNAP G L G RNAP Z T =?? G D G T G D G L G R ϕ =?? transcription activity a, b and c are directly related with the biophysical properties of the switch.

49 Поређење са експериментом E. Bogdanova, M.D. et al., NAR 36,1429 (2008) wild type right mutant Модел се добро поклапа са мереном транскрипционом активношћу, у случају и wild-type и мутант промотерских секвенци. left mutant left-right mutant

50 Моделовање динамике система dc dt = γ C λc генерисање RC транскрипта ( ) C Transcription activity versus C protein concentration dc dt dc dt C R = α c βc синтеза C протеина C R C = α c β C синтеза R протеина R C транскрипти се транслирају мање ефикасно од R транскрипта.

51 Динамика успостављања равнотеже E. Bogdanova, M.D. et al., NAR 36,1429 (2008) Ендонуклеаза је синтетисана са значајним кашњењем у односу на ендонуклеазу, и у уском временском интервалу.

52 Закључци R-M систем Токсични молекул се експресује у уском временском интервалу, и са закашњењем у односу на противотров. Ово се остварује помоћу велике Ово се остварује помоћу велике кооперативности у везивању и модулације ефикасности транслације.

53 Примери задатака Дата су два решена примера. На основу ових примера треба да решите задатке у вежбама Пример 1: Текст задатка и решење је дато у PDF фајлу у прилогу.

54 Z 1 =?? Пример 2 Z 2 =?? RNAP G RNAP G D GD RNAP RNAP G L G RNAP Z 1 =?? G D G T G D G L G R ϕ =?? transcription activity

55 На претходној слици је дата схема промотера код рестрикционо-модификационог система. a) Наћи статистичке тежине Z1, Z2, Z3 у функцији концентрације транскрипционог фактора, РНК полимеразе и енергија интеракције назначених на слици. b) Користећи Шеа-Акерс модел изрази транскрипциону активност промотера помоћу статистичких тежина Z1, Z2, Z3. c) Напиши транскрипциону активност помоћу концентрације C протеина и параметара погодних за фит. d) Графички скицирај транскрипциону активност у функцији концентрације C протеина

56 e) Напиши диференцијалне једначине које одређују количину транскрипта и протеина за ген који се транскрибује са тог промотера. Претпостави следеће параметре: p m λ λ k ϕ p т концентрација протеина концентрација транскрипта ( C) константа распада протеина константа распада транскрипта стопа транслације транскрипциона активност промотера f) Под претпоставком да је ген који је транскрибован са промотера сам транскрипциони фактор (т.ј. C протеин регулише своју сопствену транскрипцију) нађи једначину која одређује равнотежну концентрацију C протеина. g) Графички скицирај решење ове једначине користи одговор под d)