ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΏΝ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΤΩΝ ΨΥΧΑΝΘΩΝ ΣΤΗΝ ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΗΝ ΑΛΑΤΟΤΗΤΑ

ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΏΝ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΤΩΝ ΨΥΧΑΝΘΩΝ ΣΤΗΝ ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΗΝ ΑΛΑΤΟΤΗΤΑ I. A. Mύρτζιου 1,4 Α. Ν. Πολύδωρος 2, Α. Τσαυτάρης 2,3, και Φ. Β. Μυλωνά 1 1 ΕΘ.Ι.Α.Γ.Ε., Κέντρο Γεωργικής Έρευνας Βορείου Ελλάδας, 57 1 Θέρµη Θεσσαλονίκης 2 Ε.Κ.Ε.Τ.Α., Ινστιτούτο Αγροβιοτεχνολογίας, 57 1 Θέρµη Θεσσαλονίκης 3 Α.Π.Θ., Εργαστήριο Γενετικής και Βελτίωσης Φυτών, 54 6 Θεσσαλονίκη 4 Πανεπιστήµιο Θεσσαλίας, Τµήµα Βιοχηµείας & Βιοτεχνολογίας, 412 21 Λάρισα Περίληψη Τα ψυχανθή είναι ιδιαίτερα σηµαντικά για τη βιώσιµη γεωργία καθώς συµβάλλουν µε την αζωτοδέσµευση στην βελτίωση της γονιµότητας των εδαφών και παρέχουν τρόφιµα πλούσια σε πρωτεΐνες υψηλής διατροφικής αξίας αποτελώντας το θεµέλιο για την αειφορική ανάπτυξη της κτηνοτροφικής παραγωγής. Η αλατότητα των εδαφών αποτελεί κύριο πρόβληµα της σύγχρονης γεωργίας περιορίζοντας την απόδοση και την έκταση της γεωργικής γης. Τα ψυχανθή, φυτά ευαίσθητα στην αλατότητα, αποτελούν σηµαντική καλλιέργεια των ξηρών και ηµιξηρικών περιοχών που χαρακτηρίζονται από αυξηµένη αλατότητα. Η ευαισθησία αυτή είναι ιδιαίτερα δυσµενής καθώς επηρεάζονται οι σχέσεις φυτού-βακτηρίου, αναστέλλοντας την ανάπτυξη φυµατίων, µειώνοντας την αζωτοδέσµευση, την απόδοση και τη θρεπτική αξία των προϊόντων. Η αυξηµένη αλατότητα προκαλεί φυσιολογικές αντιδράσεις που συνοδεύονται από την παραγωγή και συσσώρευση ενεργών µορφών οξυγόνου (ΕΜΟ) και τη µείωση των αµυντικών µηχανισµών. Οι ΕΜΟ ευθύνονται για βλάβες σε κυτταρικό επίπεδο, ενώ παράλληλα λειτουργούν και ως µόρια σήµανσης για επαγωγή µηχανισµών άµυνας. Εξελικτικά, τα φυτά έχουν αναπτύξει αντιοξειδωτικούς µηχανισµούς άµυνας για την αποµάκρυνση των ΕΜΟ. Ωστόσο, οι σηµερινές µας γνώσεις για τη φύση των βλαβών που προξενεί η αυξηµένη συγκέντρωση NaCl στα ψυχανθή είναι περιορισµένες. Σκοπός της εργασίας ήταν η µελέτη και αποσαφήνιση του ρόλου των αντιοξειδωτικών γονιδίων, ενζύµων και µοριακών µηχανισµών στην αντοχή των ψυχανθών στην αλατότητα. Στη µελέτη χρησιµοποιήθηκε το φυτό µοντέλο Medicago truncatula. Η αντοχή στην αλατότητα διερευνήθηκε παρουσία αυξηµένων συγκεντρώσεων NaCl. Έγινε προσδιορισµός των ενεργοτήτων των αντιοξειδωτικών ενζύµων για την καταλάση (CAT), την ασκορβική περοξειδάση (APX) και τη δισµουτάση της υπεροξικής ρίζας (SOD) καθώς και ισοενζυµική ανάλυση. Η διερεύνηση του ρόλου των αντιοξειδωτικών γονιδίων / ενζύµων στην αντοχή στην αλατότητα ολοκληρώνεται µε τη µελέτη της έκφρασης των γονιδίων της καταλάσης (Cat), της ασκορβικής περοξειδάσης (Apx) και της δισµουτάσης της υπεροξικής ρίζας (Sod). Με δεδοµένο τα παραπάνω αναλύεται ο αµυντικός ρόλος των αντιοξειδωτικών γονιδίων/ενζύµων στην αντοχή στην αλατότητα. Εισαγωγή Σήµερα, το 3% της παγκόσµιας καλλιεργήσιµης γης αντιµετωπίζει προβλήµατα υψηλής αλατότητας των εδαφών σύµφωνα µε τον Zhu (21). Η υψηλή συγκέντρωση NaCl προκαλεί ιοντική ανισορροπία και υπεροσµωτική καταπόνηση στα φυτά. Η καταπόνηση από την αυξηµένη αλατότητα συνοδεύεται από οξειδωτική καταπόνηση µε συνέπεια δευτερογενείς βλάβες στα κύτταρα. Οι σηµερινές µας γνώσεις για τη φύση

των βλαβών που προξενεί η αυξηµένη συγκέντρωση NaCl στα ψυχανθή είναι περιορισµένες. Η δοµή των κυτταρικών µεµβρανών, η δραστικότητα δηλαδή η ενεργότητα της νιτρογενάσης και άλλων ενζύµων, η πρόσληψη θρεπτικών, και η λειτουργία του φωτοσυνθετικού µηχανισµού επηρεάζονται από τις τοξικές συνέπειες της αυξηµένης αλατότητας. Κύρια αιτία πρόκλησης βλαβών θεωρείται ότι είναι η παραγωγή και συσσώρευση ενεργών µορφών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species) που συντοµογραφικά θα αναφέρονται σαν ΕMΟ. Τα φυτά, σε συνθήκες καταπόνησης από αλατότητα, εµφανίζουν αποκρίσεις που περιλαµβάνουν την παραγωγή αντιοξειδωτικών ενζύµων και µεταβολιτών, πρωτεϊνών απόκρισης στην καταπόνηση και παραγωγή ωσµολυτών. Πολλοί από τους ωσµολύτες και τις πρωτεΐνες απόκρισης στην καταπόνηση έχουν πιθανό ρόλο την αποτοξίνωση και αποτροπή βλαβών των κυττάρων από ΕMΟ. Στα ψυχανθή, οι περισσότερες µελέτες των επιπτώσεων της αυξηµένης αλατότητας στην αζωτοδεσµευτική ικανότητα των φυτών έγιναν εστιάζοντας το ενδιαφέρον στα συµβιωτικά βακτήρια σύµφωνα µε τους Witty κ.ά. (1986) και Layzell, κ.ά.(199). Για την επίτευξη ικανοποιητικής αζωτοδέσµευσης αποµονώθηκαν και χρησιµοποιήθηκαν ανθεκτικοί βακτηριακοί κλώνοι. Έχει ωστόσο αποδειχθεί ότι οι κλώνοι που µεγαλώνουν γρήγορα σε αυξηµένες συγκεντρώσεις NaCl και είναι ανθεκτικοί στην αλατότητα δεν είναι αποτελεσµατικοί στην εγκατάσταση φυµατίων, γεγονός που υπογραµµίζει την ευαισθησία της αλληλεπίδρασης φυτού-συµβιωτικού βακτηρίου στις συνθήκες αυτές. Σήµερα, οι µελέτες για τα αποτελέσµατα της καταπόνησης από αλατότητα στις αλληλεπιδράσεις των φυτών µε συµβιωτικά βακτήρια και στην ανάπτυξη των ψυχανθών είναι περιορισµένες. Αξίζει να σηµειωθεί ότι τα ψυχανθή είναι πιο ευαίσθητα και ευπαθή σε συνθήκες αυξηµένης αλατότητας σε σχέση µε άλλα φυτά σύµφωνα µε Escuredo, κ.ά (1996) και Gogorcena, κ.ά (1997). Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι η καταπόνηση από ένα αβιοτικό παράγοντα µειώνει την ικανότητα του φυτού να αντιµετωπίσει µια δεύτερη καταπόνηση. Είναι ευρύτερα αποδεκτό ότι σχεδόν όλες οι αβιοτικές καταπονήσεις εµπεριέχουν τη δηµιουργία και συσσώρευση ΕΜΟ. Για να αντιµετωπίσουν τα δυσµενή αποτελέσµατα των ΕΜΟ, εξελικτικά όλοι οι αερόβιοι οργανισµοί συνεπώς και τα φυτά ανέπτυξαν µεγάλο αριθµό ενζυµικών αντιοξειδωτικών µηχανισµών που περιλαµβάνουν τις καταλάσες (CAT), τις περοξειδάσες (Px), τις γλουταθειονικές S-µεταφοράσες (GST) και τις δυσµουτάσες της υπεροξεικής ρίζας (SOD). Πρόσφατα έγινε φανερό ότι οι ΕΜΟ εκτός από δυσµενή αποτελέσµατα παίζουν σηµαντικό ρόλο στη µεταγωγή σήµατος των αβιοτικών καταπονήσεων σύµφωνα µε Neil, κά.(22). Είναι γνωστό ότι η αυξηµένη αλατότητα του εδάφους επάγει καταπόνηση ξηρασίας. Έρευνες έδειξαν ότι η καταπόνηση των φυτών από αλατότητα επάγει ιοντική και οσµωτική καταπόνηση. Συνεπώς, οι επιπτώσεις της καταπόνησης από αλατότητα αποτελούν ένα πολυδιάστατο σύνολο επιµέρους επιπτώσεων που οφείλονται στην ιοντική, οσµωτική καταπόνηση και εκείνη της ξηρασίας. Οι προαναφερόµενες καταπονήσεις αποτελούν µορφές αβιοτικής καταπόνησης που επάγουν την οξειδωτική καταπόνηση, δηλαδή την παραγωγή και συσσώρευση των ΕΜΟ. Έχοντας υπόψη ότι, τα ψυχανθή φυτά είναι ιδιαίτερα σηµαντικά για την αειφορία της γεωργίας, στόχος της παρούσας έρευνας ήταν η µελέτη και διερεύνηση του ρόλου των αντιοξειδωτικών ενζυµικών συστηµάτων και γονιδίων σε συνθήκες αυξηµένης αλατότητας στο ψυχανθές µοντέλο Medicago truncatula. Με δεδοµένο την πολυ-παραγοντική φύση της καταπόνησης από αλατότητα, για να αποσαφηνίσουµε το ρόλο των αντιοξειδωτικών ενζυµικών συστηµάτων και γονιδίων στις επιµέρους καταπονήσεις που επάγονται από αυτή µελετήσαµε το ρόλο των αντιοξειδωτικών συστηµάτων παρουσία υψηλών

συγκεντρώσεων µαννιτόλης. Η µαννιτόλη είναι µη-τοξική και µεταβολικά αδρανές για τα φυτά και σε υψηλές συγκεντρώσεις επάγει οσµωτική καταπόνηση και ξηρασία. Υλικά και Μέθοδοι Φυτικό Υλικό Χρησιµοποιήθηκε το ψυχανθές φυτό Medicago truncatula A17 (Jemalong). Η ανάπτυξη των φυτών και οι καταπονήσεις έγιναν σε θάλαµο σταθερών συνθηκών µε θερµοκρασία 22 o C, φωτοπερίοδο 16/8h και 7% υγρασία. Οι καταπονήσεις έγιναν σε φυτά ηλικίας 4 ηµερών για 24 ώρες (24h). Στις καταπονήσεις µε αλατότητα χρησιµοποιήθηκαν διαλύµατα NaCl συγκεντρώσεων, 37.5, 75, 15, 3 και 6 mm. Για τις καταπονήσεις µε µαννιτόλη χρησιµοποιήθηκαν ισοτονικά διαλύµατα συγκεντρώσεων, 71, 142, 284, 565, 1133 mm, αντίστοιχα. Ενζυµκές αναλύσεις Μετά το τέλος των καταπονήσεων, δείγµατα ιστών, φύλλων ή ριζών, συλλέχθηκαν και οµογενοποιήθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα.5m φωσφορικού καλίου ph 7, χρησιµοποιώντας παγωµένο γουδί. Τα λειοτριβιµµένα δείγµατα φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείµενο χρησιµοποιήθηκε για τον προσδιορισµό ολκών πρωτεϊνών σύµφωνα µε τη µέθοδο Bradford, M.M. (1976). Οι ενεργοτήτες/ δραστικότητες των αντιοξειδωτικών ενζύµων καταλάση (CAT), ασκορβική περοξειδάση (APX), δισµουτάση της υπεροξεικής ρίζας (SOD) και περοξειδασών της γλουταθειόνης (GPX) προσδιορίστηκαν όπως έχει περιγραφεί από τους Beers and Sizer, (1952), Mittler and Zilinskas, (1993), Beauchamp και Fridovich (1971) και, Rao, M.V. κ.ά. (1996), αντίστοιχα. Τα ισοένζυµα για την καταλάση (CAT), την ασκορβική περοξειδάση (APΧ) και τη δισµουτάση της υπεροξεικής ρίζας (SOD) προσδιορίστηκαν µε µη-αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση πολυακρυλαµιδίου (PAGE) και οι χρώσεις έγινε όπως έχει περιγραφεί από τους Mylona, P.V κ.ά. (1998), και Mittler and Zilinskas (1993). Αποµόνωση RNA και ανάλυση κατά Northern Μετά το τέλος των καταπονήσεων, δείγµατα ιστών συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -8 o C. H αποµόνωση RΝΑ από τα δείγµατα έγινε σύµφωνα µε Thompson, W. κ.α.(1988). Οι αναλύσεις έκφρασης έγιναν µε αποτύπωση κατά Northern. Για τους υβριδισµούς ως ιχνηλάτες χρησιµοποιήθηκαν συγκεκριµένα γονίδια που κωδικοποιούν για Cat, Apx και Sod. Μη ραδιενεργοί ιχνηλάτες παρασκευάστηκαν µε εµπορικά kit (DIG Northern, DIG probe synthesis, DIG luminescent detection, ROCHE, Mannheim, Germany) σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασεκυαστή, και η ανίχνευση του σήµατος επιτεύχθηκε µε το σύστηµα ανίχνευσης χηµειοφωταύγειας GeneGnome Imaging System (Syngene). Αποτελέσµατα και Συζήτηση Ανάλυση για τη δισµουτάση της υπεροξεικής ρίζας (SOD) Η ενεργότητα της δσιµουτάσης της υπεροξεικής ρίζας αυξήθηκε στις ρίζες και στα φύλλα M. truncatula παρουσία συγκεντρώσεων άλατος ή µαννιτόλης. Ισοενζυµική ανάλυση δειγµάτων ριζών (Εικ. 1Α) και φύλλων (Εικ. 1Β) έδειξε ότι η αύξηση της δραστικότητας για τη SOD εντοπίζεται σε συγκεκριµένα ισοένζυµα σε σύγκριση µε τα φυτά µάρτυρες. Στις ρίζες η αύξηση ενεργότητας της SOD οφείλεται σε επιµέρους αυξήσεις των ενεργοτήτων των ισοενζύµων MnSOD, και σε µικρότερο βαθµό στο Cu/ZnSOD. Αυξήσεις στις ενεργότητες των ισοενζύµων MnSOD, και Cu/ZnSOD παρατηρήθηκαν και σε δείγµατα φύλλων µετά από καταπόνηση µε NaCl ή

MnSOD MnSOD µαννιτόλη. Αξίζει να σηµειωθεί ότι στα φύλλα η επαγωγή των SOD ισοενζύµων ακολουθεί διαφορετικό σχήµα σε σχέση µε τις ρίζες. Α 75 142 15 284 3 565 6 1133 MnSOD MnSOD Β 75 142 15 284 3 565 6 1133 Cu/ZnSOD Cu/ZnSOD Εικόνα 1. Ισοενζυµική ανάλυση της δισµουτάσης της υπεροξεικής ρίζας (SOD) µετά από καταπόνηση µε ισοτονικά διαλύµατα NaCl και µαννιτόλη σε ιστούς M. truncatula Α. ρίζες και Β. φύλλα. Ανάλυση για την καταλάση (CAT) Η ενεργότητα της καταλάσης µελετήθηκε παρουσία συγκεντρώσεων άλατος και µαννιτόλης σε ρίζες και φύλλα M. truncatula. Στις ρίζες παρατηρήθηκε βαθµιδωτή αύξηση της ενεργότητα της καταλάσης µε αύξηση της συγκέντρωσης άλατος ή µαννιτόλης σε σχέση µε εκείνη των ριζών από φυτά µάρτυρες (Εικ. 2A). Αύξηση της ενεργότητας της καταλάσης σε φύλλα φυτών παρατηρήθηκε µόνο µετά από καταπόνηση από χαµηλές συγκεντρώσεις άλατος ή µαννιτόλης. Ισοενζυµική ανάλυση σε δείγµατα ριζών έδειξε ότι η παρουσία NaCl ή µαννιτόλης επάγει τη δραστικότητα ισοενζύµων της καταλάσης. Όπως φαίνεται στην Εικ. 2C η επαγωγή αυτή εντοπίζεται σε δύο ισοένζυµα, και είναι ανάλογη της αύξησης των συγκεντρώσεων. Ισοενζυµική ανάλυση δειγµάτων φύλλων έδειξε ότι µόνο οι χαµηλές συγκεντρώσεις άλατος ή µαννιτόλης επάγουν τη δραστικότητα της καταλάσης, η οποία εντοπίζεται σε ένα ισοένζυµο στα φύλλα (Εικ. 2D). Α CAT specific activity (U/mg) Γ 9 8 7 6 5 4 3 2 1 37.5/71 Ρίζες 75/142 15/282 3/565 NaCl /Mαννιτόλη (mm) 6/1133 Β CAT specific acitivity (U/mg) 12 1 8 6 4 2 37.5/71 Φύλλα 75/142 15/282 NaCl 3/565 NaCl / Mannitol (mm) Mαννιτόλη 6/1133 75 142 15 284 3 565 6 1133 ( mm) 75 142 15 284 3 565 6 1133 Εικόνα 2. Η ενεργότητα της καταλάσης (CAT U/mg πρωτεϊνης) προσδιορίστηκε φασµατοφωτοµετρικά µετά από καταπόνηση 24h µε ισοτονικά διαλύµατα NaCl και µαννιτόλη σε φυτά M. truncatula Α. ρίζες και Β. φύλλα. Ιισοενζυµική ανάλυση για την καταλάση σε Γ. ρίζες και. φύλλα µετά από καταπόνηση.

Ανάλυση για την ασκορβική περοξειδάση (APX) Η δραστικότητα του αντιοξειδωτικού ενζύµου ασκορβική περοξειδάση (APX) προσδιορίστηκε σε ρίζες (Εικ. 3Α) και φύλλα (Εικ. 3Β) φυτών M. truncatula µετά από 24h καταπόνηση µε ισοτονικά διαλύµατα NaCl και µαννιτόλης. Στις ρίζες η ενεργότητα της APX είναι ιδιαίτερα αυξηµένη παρουσία χαµηλών συγκεντρώσεων (37.5mM) άλατος, ενώ µειώνεται σε µεγαλύτερες συγκεντρώσεις, παραµένει όµως υψηλότερη από το µάρτυρα (Εικ. 3Α). Η δραστικότητα της APX των ριζών σε απόκριση στην καταπόνηση από µαννιτόλη αυξάνει βαθµιδωτά µε την αύξηση της συγκέντρωσης της µαννιτόλης µέχρι 565mM, ενώ µειώνεται στη συγκέντρωση 1133mM παραµένοντας όµως υψηλότερη του µάρτυρα. Βαθµιδωτή αύξηση της ενεργότητας της APX παρατηρείται και στα φύλλα φυτών µετά από καταπόνηση µε ισοτονικά διαλύµατα NaCl και µαννιτόλης (Εικ. 3Β). Ισοενζυµική ανάλυση για την APX σε δείγµατα ριζών έδειξε ότι η αύξηση της δραστικότητας εστιάζεται σε τρία ισοένζυµα (Εικ. 3Γ). Αντίθετα στα φύλλα η αύξηση ενργότητας της APΧ οφείλεται σε ένα ισοένζυµο όπως φαίνεται στην Εικ. 3. A APX activity (U/mg) Γ 16 14 12 1 8 6 4 2 37.5/ 71 Ρίζες 75/142 15/265 NaCl / Mαννιτόλη (mm) 3/586 6/1133 APX activity (U/mg) B 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 37.5/ 71 Φύλλα 75/142 15/265 3/586 NaCl / Mαννιτόλη (mm) NaCl Mαννιτόλη 6/1133 75 142 15 284 3 565 6 1133 (mm) 75 142 15 284 3 565 6 1133 (mm) Εικόνα 3. Ενεργότητα ασκορβικής περοξειδάσης (APX) σε ρίζες και φύλλα M.truncatula µετά από καταπόνηση 24h µε ισοτονικά διαλύµατα NaCl και µαννιτόλης. Ισοενζυµική ανάλυση για την APX σε ρίζες (Γ) και φύλλα ( ) µετά από καταπόνηση. Ανάλυση για τις περοξειδάσες της γλουταθειόνης (GPX) Η ενεργότητα των περοξειδασών της γλουταθειόνης προσδιορίστηκε φασµατοµετρικά σε ρίζες και φύλλα φυτών µετά από καταπόνηση από ισοτονικά διαλύµατα NaCl ή µαννιτόλης. Η ενεργότητα των GPX αυξήθηκε στις ρίζες και στα φύλλα σε σχέση µε το µάρτυρα. Αξίζει να σηµειωθεί ότι η αύξηση των GPX δραστικοτήτων στις ρίζες ακολουθεί διαφορετικό πρότυπο απόκρισης για το NaCl και τη µαννιτόλη, ενώ στα φύλλα είναι το ίδιο (Εικ. 4).

GPX activity (U/mg) Α 25 2 15 1 5 37.5/ 71 Ρίζες 75 / 142 Roots 15 / 265 NaCl / Mannitol (mm) 3 / 586 6 / 1133 GPX activity (U/mg) Β 12 1 8 6 4 2 37.5/ 71 Φύλλα 75 / 142 Leaves 15 / 265 NaCl / Mannitol (mm) Salt 3 / 586 6 / 1133 Mannitol Εικόνα 4. Ενεργότητα του ενζύµου GPX µετά από καταπόνηση 24h µε ισοτονικά διαλύµατα NaCl και µαννιτόλης σε ρίζες και φύλλα M. truncatula. Μελέτη έκφρασης των γονιδίων Cat, Sod και Apx Είναι γνωστό ότι στο M. truncatula υπάρχουν περισσότερα από ένα γονίδια που κωδικοποιούν για τα αντιοξειδωτικά ένζυµα SOD, CAT και APX. Λαµβάνοντας υπόψη την αύξηση των ενεργοτήτων σε απόκριση στην καταπόνηση από NaCl και µαννιτόλη, διερευνήθηκε η έκφραση συγκεκριµένων αντιοξειδωτικών γονιδίων που κωδικοποιούν για τα SOD, CAT και APX ένζυµα. Στην ανάλυση κατά Northern σε δείγµατα φύλλων µετά από καταπόνηση µε NaCl παρατηρήθηκε ότι η έκφραση των γονιδίων Cat, και Apx αυξήθηκε σε απόκριση στην αύξηση των συγκεντρώσεων NaCl. Στα φύλλα η έκφραση του γονιδίου Sod σε χαµηλές συγκεντρώσεις παρέµεινε ίδια µε το µάρτυρα, ενώ µειώθηκε σε µεγαλύτερες συγκεντρώσεις των 3 και 6mM NaCl, αντίστοιχα (Εικ. 5Α). Ανάλυση κατά Northern σε δείγµατα ριζών µετά από καταπόνηση µε µαννιτόλη έδειξε ότι η έκφραση του γονιδίου Cat παρέµεινε ίδια µε το µάρτυρα σε όλες τις συγκεντρώσεις. Αντίθετα η έκφραση του γονιδίου Apx αυξήθηκε βαθµιδωτά σε απόκριση στην αύξηση των συγκεντρώσεων µέχρι 265 mm µαννιτόλη, ενώ µειώθηκε σε µεγαλύτερες συγκεντρώσεις σε σύγκριση µε το µάρτυρα (Εικ. 5Β). Η έκφραση του γονιδίου Sod µειώθηκε σε απόκριση στην αύξηση των συγκεντρώσεων µαννιτόλης (Εικ. 5Β). A B 37.5 75 15 3 6 (mm) 71 142 265 586 1133 (mm) Cat Cat Apx Apx Sod Sod Εικόνα 5. Ανάλυση κατά Northern για τα γονίδια Cat, Apx και Sod µετά από καταπόνηση 24h µε ΝaCl και µαννιτόλη σε φύλλα (Α) και ρίζες (Β) Μ. truncatula, αντίστοιχα. Συµπεραίνουµε ότι η καταπόνηση µε NaCl ή µαννιτόλη επάγει αύξηση ενεργοτήτων των αντιοξειδωτικών ενζύµων SOD, CAT, APX και GPX σε ρίζες και φύλλα στο ψυχανθές M. truncatula. Η αύξηση αυτή εντοπίζεται σε συγκεκριµένα ισοένζυµα. Η ανάλυση κατά Northern έδειξε ότι αντίστοιχη αύξηση στην έκφραση των αντιοξειδωτικών γονιδίων Cat, Sod και Apx.δεν υπάρχει για κάθε γονίδιο που

µελετήσαµε. Συνεπώς, η ρύθµιση έκφρασης αντιοξειδωτικών γονιδίων /ενζύµων σε απόκριση στην καταπόνηση από αλατότητα πιθανόν να οφείλεται σε µετα- µεταγραφικούς και µετα-µεταφραστικούς µηχανισµούς. Με δεδοµένο ότι υπάρχουν περισσότερα από ένα γονίδια που κωδικοποιούν για τα αντιοξειδωτικά ένζυµα SOD, CAT και APX η αποσαφήνιση του ρόλου του αντιοξειδωτικού µηχανισµού στην αντοχή στην αλατότητα ολοκληρώνεται µε τη µελέτη όλων των αντιοξειδωτικών γονιδίων. Βιβλιογραφία Beauchamp C, Fridovich, I. 1971. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Anal Biochem 44: 276 287. Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254. Escuredo PR, Minchin FR, Gogorcena Y, Iturbe-Ormaetxe I, Klucas RV, Becana M (1996) Involvement of activated oxygen in nitrate-induced senescence of pea root nodules. Plant Physiol 11: 1187-1195. Gogorcena Y, Gordon AJ, Escuredo PR, Minchin FR, Witty JF, Moran JF, Becana M (1997) N 2 fixation, carbon metabolism, and oxidative damage in nodules of darkstressed common bean plants. Plant Physiol 113: 1193-121. Layzell DB, Hunt S, Palmer GR (199) Mechanisms of nitrogenase inhibition in soybean nodules: pulse-modulated spectroscopy indicates that nitrogenase activity is limited by O 2. Plant Physiol 92: 111-117. Mittler, R and B.A. Zilinskas. 1993. Detection of ascorbate peroxidase activity in native gels by inhibition of the ascorbate dependent reduction of nitro-blue tetrazolium. Anal. Bioch. 212:54-546. Mylona, P.V., A.N. Polidoros and J.G. Scandalios. 1998. Modulation of antioxidant responses by arsenic in maize. Free Radical in Medicine & Biology 25:576-585. Neill, S., R. Desika and J. Hancock. 22. Hydrogen peroxide signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 5:388-395. Rao, M.V., Paliyath, G., Ormord, D.P. 1996. Ultraviolet-B and ozone induced chnages of antioxidant enzymes in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 11:125-136. Thompson, W.F., M. Everett, N.O. Polans, R.A. Jorgensen and J.D. Palmer. 1983. Phytochrome control of RNA levels in developing pea and mung bean leaves (Pisum sativum, Vigna radiata). Planta 158: 487-5. Zhu, J.K. 21. Plant salt tolerance. Trends Plant Sci. 6: 66-71. Witty JF, Skat L, Revsbech NP (1987) Direct evidence for changes in the resistance of legume root nodules to O 2 diffusion. J Exp Bot 38:1129-114. Summary Legumes are critical in sustainable agriculture supporting meat and dairy production, providing high value protein and improving soil fertility through their diazotrophic symbionts. On the other hand, agricultural land encounters soil salinity as a major factor limiting crop productivity and quality. Legumes, are salt-sensitive crops, important for the arid and semi-arid areas where increased salinity is the major constraint. In the case of legumes, salt tolerance becomes more complicated because both partners, plant and diazotrophic-bacteria are being affected. Τhis environmental adversity distracts the plant-bacteria relationships impairing nodulation, N 2 -fixation, arresting plant growth resulting in yield decrease and nutritional value. Plant salt stress is accompanied by generation and accumulation of reactive oxygen species (ROS) that are thought to play

primary roles in cellular damage, and as signaling molecules. On the other hand, antioxidant mechanisms are the front line of defense in alleviating the deleterious effects of ROS, and protecting plants cellular integrity. The aim of this project was to explore, elucidate and decipher the role of antioxidant genes/ enzymes and mechanisms under salt stress in legumes. To study legume salt tolerance, we used the model Medicago truncatula. Salt stress was applied by NaCl solutions. Enzyme activities and izoenzyme profile were assessed for catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) and superoxide dismutase (SOD) in salt-treated plants. Following, accumulation of transcript levels of antioxidant genes Cat, Apx and Sod were assessed. The protective role of the antioxidant machinery is discussed for salt tolerance.