Δομή του πληθυσμού του σπάνιου και απειλούμενου φυτού Eriolobus trilobatus στο Ν. Έβρου Παπαλαζάρου Κ. 1, Μπαλάσκα Κ. 1, Κοράκης Γ. 1, Ποϊραζίδης Κ. 1, Παπαγεωργίου Α.Χ. 1 1 Εργαστήριο Δασικής Γενετικής, Τμήμα Δασολογίας & Διαχείρισης Περιβάλλοντος & Φυσικών Πόρων, ΔΠΘ, 68200 Ορεστιάδα, apapage@fmenr.duth.gr Περίληψη Εφαρμόστηκε η μέθοδος του τυχαίου ενισχυμένου πολυμορφικού DNA (RAPD) για την ανάλυση της γενετικής ποικιλότητας σε ένα σπάνιο είδος αγριομηλιάς (Eriolobus trilobatus) που φύεται στο Β. Έβρο και συγκεκριμένα κοντά στη περιοχή της Νίψας και της Λευκίμμης. Από συνολικά 69 δείγματα (φύλλα) εξήχθη DNA και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η αντίδραση της PCR με επτά διαφορετικούς εκκινητές. Επιπλέον, φύλλα από τα ίδια δέντρα σαρώθηκαν ψηφιακά και ακολούθησε μορφομετρική ανάλυση με τη μέθοδο των γεωμετρικών σημείων. Ο υπό μελέτη πληθυσμός παρουσίασε χαμηλή γενετική ποικιλότητα (He=0,20), ενώ φαίνεται ότι η ποικιλότητα αυτή σχετίζεται με ένα δασικό δρόμο που διασχίζει τον πληθυσμό. H κίνηση της γύρης ή των σπόρων γίνεται πιθανόν κατά μήκος του δρόμου και όχι μέσα από τη συστάδα όπου υπάρχουν και άλλα είδη φυτών. Population structure of the rare and threatened plant Eriolobus trilobatus in the Evros area Papalazarou K.. 1, Balaska K. 1, Korakis G. 1, Poirazidis K. 1, Papageorgiou A.C. 1 1 Forest Genetics Laboratory, Forestry Faculty, Democritus University of Thrace, GR 68200 Orestiada, Greece, apapage@fmenr.duth.gr Abstract The method of random amplified polymorphic DNA (RAPD) has been applied in order to analyze the genetic diversity of a rare species of wild apple (Eriolobus trilobatus), which grows in the northern Evros district in Greece, near the villages Nipsa and Lefkimi. From a total of 69 samples (leaves), DNA was isolated and PCR reaction was carried out using seven different primers. Leaves from the same trees were digitally scanned and a morphological analysis based on landmarks was applied. The population studied demonstrated a low genetic diversity (h=0.20), while this diversity was spatially related to a road that crosses the study area. The movement of pollen or seeds is probably achieved along the road and not through the stand, where other plant species exist. Εισαγωγή Το Eriolobus trilobatus ανήκει στην οικογένεια Rosaceae. Η ονοματολογία του συγκεκριμένου taxon περιέλαβε χρονολογικά τα ακόλουθα ονόματα: Crategus trilobata
Poir., Pirus trilobata (Poir.) DC., Sorbus trilobata (Poir.) Heynh., Eriobus trilobatus (Poir.) M. Roem., Cormus trilobata (Poir.) Decne. και Malus trilobata (Poir) C.K. Schneid (Korakis et al. 2006). Είναι ένα σπάνιο είδος αγριομηλιάς, που φύεται κυρίως στην ανατολική Μεσόγειο και η γεωγραφική του εξάπλωση στον υπόλοιπο κόσμο περιλαμβάνει τη δυτική και ανατολική Τουρκία, τη Συρία, το Λίβανο και το βόρειο Ισραήλ (Browicz 1972). Στην Ελλάδα το συναντάμε αποκλειστικά στο Ν. Έβρου, στα νότια του δάσους της Δαδιάς, κοντά στους οικισμούς Λευκίμμη και Νίψα. Επιπλέον, αναφέρεται η ύπαρξή του στην νοτιοανατολική Βουλγαρία, αλλά η φυσική του εξάπλωση στη περιοχή αυτή είναι υπό αμφισβήτηση (Korakis et al. 2006). Αντίθετα, στην Ελλάδα η εξάπλωση του στην περιοχή του Έβρου θεωρείται φυσική και αποτελεί το μοναδικό ευρωπαϊκό πληθυσμό. Ο πληθυσμός αυτός είναι εξαιρετικά μικρός και κατακερματισμένος. Λόγω της σπανιότητας του έχει περιληφθεί στο Κόκκινο Βιβλίο για τα Σπάνια και Απειλούμενα Φυτά της Ελλάδας (Phitos et al. 1995). Έχουν καταγραφεί λιγότερα από 100 άτομα. Θεωρείται απειλούμενο, καθώς στο βιότοπό του συμβαίνουν πυρκαγιές, διανοίξεις δρόμων, δασοπονικές εργασίες και άλλες δραστηριότητες, που λόγω του μικρού αριθμού των δέντρων θα μπορούσαν να εξαφανίσουν το είδος από την περιοχή. Σκοπός της εργασίας είναι η μελέτη της γενετικής ποικιλότητας του Eriolobus trilobatus στην περιοχή αυτή και η ερμηνεία του τρόπου που αυτή είναι κατανεμημένη στο χώρο. Υλικά Μέθοδοι Συλλέχθηκαν φρέσκα φύλλα από όλα τα γνωστά άτομα του πληθυσμού που είχαν άφθονο υλικό. Για την απορρόφηση της υγρασίας έγινε προσθήκη silica gel, η αλλαγή του οποίου γινόταν σε τακτά χρονικά διαστήματα. Η εκχύλιση του DNA έγινε από τα ξερά φύλλα με το Dneasy TM 96 Protocol της Qiagen. Ακολούθησε αντίδραση PCR με 7 δεκαμερείς εκκινητές RAPD (OΡB01, OΡB10, OΡB15, OPY07, OPB10, OPM13, OPM18). Ο αριθμός και ποιότητα των ζωνών που έδωσε ο κάθε primer εξετάστηκε σε gel αγαρόζης 2%. Συγκροτήθηκαν πίνακες για κάθε εκκινητή και για κάθε ζώνη που εμφάνιζε πολυμορφισμό, με τις ενδείξεις 0 και 1 να δηλώνουν παρουσία ή απουσία γραμής στο gel. Υποθέτοντας συνθήκες ισορροπίας, εκτιμήθηκαν οι συχνότητες των «αλληλομόρφων» 0 και 1. Επιπλέον υπολογίστηκε ο παρατηρούμενος αριθμός αλληλομόρφων, ο λειτουργικός αριθμός αλληλομόρφων, η γενετική ποικιλομορφία, η ποικιλότητα μεταξύ και εντός των ομάδων ατόμων στο χώρο που σχηματίζονται γεωγραφικά και οι γενετικές αποστάσεις κατά Nei, που οδήγησαν στο σχηματισμό UPGMA δενδρογραμμάτων. Προκειμένου να εξετάσουμε τον πολυμορφισμό στο σχήμα των φύλων του Eriolobus trilobatus, έγινε μορφομετρική ανάλυση πάνω σε ψηφιακές εικόνες των φύλλων που σαρώθηκαν μετά τη συλλογή τους. Με τη βοήθεια του λογισμικού Image Pro, τοποθετήθηκαν 11 γεωγραφικά σημεία (landmarks) στην περίμετρο των φύλλων, και οι συντεταγμένες τους στο χώρο λειτούργησαν σαν μεταβλητές. Τα δεδομένα υπέστησαν προκρούστεια ανάλυση, που περιλαμβάνει την κίνηση, την κλίμακα και την περιστροφή όλων των μορφών έτσι ώστε το άθροισμα των αποστάσεων μεταξύ των αντίστοιχων γεωγραφικών σημείων να είναι όσο το δυνατόν μικρότερο. Ακολούθησε πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση.
Αποτελέσματα Συζήτηση Από τα αποτελέσματα των αναλύσεων RAPDs βρέθηκαν 29 πολυμορφικές ζώνες (64,44%) με μέσο αριθμό αλληλομόρφων 1,64, μέσο λειτουργικό αριθμό αλληλομόρφων 1,35 και μέση αναμενόμενη ετεροζυγωτία 0,20 για το σύνολο των ζωνών αυτών. Προκειμένου να εξεταστεί η χωρική εξάπλωση της γενετικής ποικιλότητας, η περιοχή έρευνας χωρίστηκε σε 12 υποπληθυσμούς (ομάδες), που είναι διακριτοί γεωγραφικά. Βρέθηκε σχετικά μεγάλη διαφοροποίηση μεταξύ των υποπληθυσμών αυτών (Gst=0,18). Με βάση τις γενετικές αποστάσεις (Nei) μεταξύ των ομάδων σχεδιάστηκε δενδρόγραμμα UPGMA, όπου φαίνεται η ομαδοποίηση των υποπληθυσμών που βρίσκονται γεωγραφικά πιο κοντά (εικόνα 1). Εικόνα 1. Δενδρόγραμμα UPGMA βασισμένο σε γενετικές αποστάσεις (Nei) ανάμεσα σε 12 υποπληθυσμούς (ομάδες) της φυσικής εξάπλωσης του Eriolobus trilobatus στον Έβρο. Ο πληθυσμός του Eriolobus trilobatus στον Έβρο είναι κατακερματισμένος σε μικρές ομάδες και φαίνεται να εμφανίζει γενετική εκτροπή, καθώς έχει χαμηλή γενετική ποικιλότητα και υψηλή διαφοροποίηση. Η μέση συνολική ποικιλότητα για τους υποπληθυσμούς είναι Ht=0,13 και η μέση ποικιλότητα εντός των πληθυσμών Hs=0,10. Η διαφοροποίηση μεταξύ των υποπληθυσμών είναι Gst=0,18. Το γεγονός αυτό πιθανά οφείλεται στο μικρό μέγεθος των υποπληθυσμών και στο ότι σχηματίζουν ομάδες στο χώρο που είναι δύσκολο να έρθουν σε επαφή μεταξύ τους καθώς συνήθως φύονται στην άκρη και κατά μήκος του δρόμου ο οποίος λόγω του ανάγλυφου ακολουθεί μια πορεία σε σχήμα S. Το γεγονός αυτό αποτυπώνεται στο δενδρόγραμμα για τους 12 υποπληθυσμούς που σχηματίζουν τρεις ομάδες. Η πρώτη περιλαμβάνει τον υποπληθυσμό 1 και η δεύτερη τον υποπληθυσμό 12. Ανάμεσα στους δύο
υποπληθυσμούς υπάρχει μεγάλη τόσο γενετική όσο και γεωγραφική απόσταση. Η τρίτη ομάδα περιέχει δύο υποομάδες η μία περιλαμβάνει τους υποπληθυσμούς 2, 3 και 4 (η απόσταση μεταξύ 2 και 3 είναι σχετικά μικρότερη) και η άλλη τους 5, 6, 7 και 8 (με τους 6 και 8 να είναι πιο κοντά). Η κύρια κίνηση της γύρης και των σπόρων ανάμεσα στα φυτά γίνεται πιθανόν από το τους δρόμους και όχι διαμέσου της μεικτής συστάδας. Ο μικρός πληθυσμός του Eriolobus trilobatus και η διάταξή του (κατά μήκος του δρόμου και σε μεγάλες αποστάσεις) σε συνδυασμό με την πλούσια βλάστηση και το μορφολογικό ανάγλυφο της υπό μελέτη περιοχής αποτελούν σημαντικά εμπόδια στην κίνηση των γονιδίων και της γύρης, διαμορφώνοντας πιθανόν το χωρικό γενετικό πρότυπο που περιγράφεται εδώ. Τα αποτελέσματα των μορφομετρικών αναλύσεων δεν φαίνεται να συμβαδίζουν με αυτά των γενετικών, καθώς βρέθηκε πολύ χαμηλή ποικιλότητα και διαφοροποίηση μέσα και ανάμεσα στους πληθυσμούς. Οι συντεταγμένες των 11 γεωγραφικών σημείων, που τοποθετήθηκαν πάνω σε κάθε φύλλο (εικόνα 2), λειτούργησαν σαν μεταβλητές και ομαδοποιήθηκαν σε κυρίαρχες συνιστώσες (PCA). Από τις συνιστώσες, 7 παρουσιάζουν ιδιοτιμή μεγαλύτερη της μονάδας και εκφράζουν το 87,61% της συνολικής ποικιλότητας. E 0,4 0,3 0,2 0,1 0-0,1-0,2-0,3-0,4-0,5-0,48-0,36-0,24-0,12 0 0,12 0,24 0,36 0,48 D Εικόνα 2. Διάγραμμα διασποράς των συντεταγμένων από 11 γεωγραφικά σημεία που τοποθετήθηκαν σε φύλλα από τα δέντρα του είδους Eriolobus trilobatus στον Έβρο. Οι μορφομετρικές ομάδες των δέντρων που σχηματίστηκαν με βάση την ευκλείδια απόστασή τους κατανέμονται στους 12 υποπληθυσμούς με τρόπο που δεν φανερώνει κάποια γεωγραφική συσχέτιση (εικόνα 3), σε αντίθεση με τα αποτελέσματα των γενετικών αναλύσεων. Προκύπτει ότι η μορφολογική ποικιλότητα των φύλλων δεν
φανερώνει κάποια συσχέτιση με τη γενετική, τουλάχιστον στα χαρακτηριστικά σημεία που επιλέχθησαν για να αποδώσουν το σχήμα των φύλλων του φυτού. Εικόνα 3. Δενδρόγραμμα UPGMA βασισμένο σε ευκλείδιες αποστάσεις μοροφομετρικών ανάμεσα σε 12 υποπληθυσμούς (ομάδες) της φυσικής εξάπλωσης του Eriolobus trilobatus στον Έβρο. Συμπερασματικά φαίνεται πως ο μοναδικός πληθυσμός του Eriolobus trilobatus είναι τόσο γεωγραφικά όσο και γενετικά κατακερματισμένος. Παρόμοια αποτελε σματα αναφέρονται και για άλλα είδη Malus που σχηματίζουν φυσικούς πληθυσμούς (Chunyu et al. 2007). Η ροή γονιδίων είναι περιορισμένη ανάμεσα σε κοντινές ομάδες δέντρων, ακολουθώντας ένα συγκεριμένο πρότυπο που βασίζεται σε ανοίγματα και δρόμους. Για το λόγο αυτό είναι απαραίτητο να ληφθούν συγκεκριμένα μέτρα προστασίας της γενετικής ποικιλότητας του είδους in situ. Προτεραιότητα έχει η προστασία του ήδη υπάρχοντος πληθυσμού και στη συνέχεια η αύξησή του σε αριθμό ατόμων και πυκνότητα. Με τον τρόπο αυτό, ο πληθυσμός θα ουδετεροποιεί τυχόν περιβαλλοντικές και δημογραφικές απειλές και θα αποφύγει τις καταστρεπτικές επιδράσεις της γενετικής εκτροπής και της ομομεικτικής καταπτώσης. Κατάλληλα μέτρα για την in situ προστασία του πληθυσμού είναι η σήμανση των ατόμων στο πεδίο και η αναφορά της ύπαρξης του είδους σε διαχειριστικά σχέδια και μελέτες, ώστε να αποφευχθεί η κατά λάθος καταστροφή του από ανθρώπινη παρέμβαση. Πιθανόν να χρειαστεί και περίφραξη κάποιων ατόμων που είναι ευαίσθητα (νεαρά άτομα και αναγέννηση). Επιπλέον μπορούν να ληφθούν δασοκομικά μέτρα πυροπροστασίας της ευρύτερης περιοχής και να ευνοηθεί η φυσική αναγέννηση του είδους αυτού, ώστε να πυκνώσει ο πληθυσμός. Ακόμη, επειδή η κίνηση της γύρης και των σπόρων φαίνεται να περιορίζεται στα ανοίγματα και στους δρόμους ενώ δεν φαίνεται να διασχίζει εύκολα τη μεικτή συστάδα της περιοχής, θα ήταν καλή η λήψη μέτρων ex situ, όπως είναι η ίδρυση φυτείας κλώνων σε άλλη περιοχή με σκοπό τη διατήρηση όλων των γενοτύπων του πληθυσμού και την παραγωγή σπόρων από σταυρογονιμοποίηση χωρίς περιορισμούς κίνησης της γύρης. Οι σπόροι αυτοί θα μπορούσαν εκ των υστέρων να χρησιμοποιηθούν για την τεχνητή εγκατάσταση στην περιοχή που φύεται φυσικά το είδος, προκειμένου να αυξηθεί η
πυκνότητα του πληθυσμού, ή για την ίδρυση νέων τεχνητών πληθυσμών του είδους σε άλλες περιοχές του Ν. Εβρου. Βιβλιογραφία Browicz K. 1972. Eriolobus (Ser.) Roemer. Pp. 159-160. In: Davis PH (ed.), Flora of Turkey and the East Aegean Islands, 4. Edinburgh Univ. Press, Edinburgh. Chunyu Z., Xuesen C., Tianming H., Xiaoli L., Tao F. & Zhaohe Y. 2007. Genetic stucture of Malus sieversii population from Xinjiang, China, revealed by SSR markers. Journal of Genetics and Genomics, 34: 947-955. Korakis G., Poirazidis K., Papamattheakis N. & Papageorgiou A.C. 2006. New localities of the vulnerable species Eriolobus trilobatus (Rosaceae) in northeastern Greece. Proceedings of IV Balkan Botanical Congress, Sofia, 424-428. Phitos D., Strid A., Snogerup S. & Greuter W. 1995. The Red Data Book of Rare and Threatened Plants of Greece, Athens.