Αρ. Κουπονιού: 88279408 01 000122. Αφοί Δ. ΑΒΡΑΜΟΥΛΗ Ο.Ε. Υπεύθυνος έργου Δρ. Γούλας Παναγιώτης. Εργαστήριο Προϊόντων Ζωικής Παραγωγής

«Παραγωγή Φέτας και Κεφαλοτυριού από Γάλα Αιγοπροβάτων Χωρίς Παστερίωση για Έλεγχο της Διατηρησιμότητας (χρόνος) της Μικροβιολογικής και της Υγειονομικής Κατάστασης των Τελικών Προϊόντων» Αρ. Κουπονιού: 88279408 01 000122 Αφοί Δ. ΑΒΡΑΜΟΥΛΗ Ο.Ε. Υπεύθυνος έργου Δρ. Γούλας Παναγιώτης Εργαστήριο Προϊόντων Ζωικής Παραγωγής Τμήμα Ζωικής Παραγωγής Λάρισα, 2011

Τίτλος έργου: Παραγωγή Φέτας και Κεφαλοτυριού από Γάλα Αιγοπροβάτων Χωρίς Παστερίωση για Έλεγχο της Διατηρησιμότητας (χρόνος) της Μικροβιολογικής και της Υγειονομικής Κατάστασης των Τελικών Προϊόντων. 1. Εισαγωγή Η εταιρεία ΑΦΟΙ Δ. ΑΒΡΑΜΟΥΛΗ Ο.Ε. ιδρύθηκε το 1978 στον Παραπόταμο Μακρυχωρίου Λάρισας με αντικείμενο εργασιών την τυροκόμιση γάλακτος αιγοπροβάτων. Σήμερα η εταιρεία δραστηριοποιείται στην παραγωγή τυροκομικών προϊόντων. Όσον αφορά τα τυροκομικά προϊόντα σήμερα παράγει φέτα και κεφαλοτύρι. Η εταιρεία στα πλαίσια της παρούσας έρευνας ανάθεσε σε εξειδικευμένο φορέα εφαρμοσμένης έρευνας τροφίμων, ερευνητική εργασία που αφορά την παραγωγή και τον μικροβιολογικό έλεγχο, κεφαλοτυριού από μη παστεριωμένο γάλα αιγοπροβάτων διότι πιστεύει ότι η μη παστερίωση θα επιτύχει καλύτερη ποιότητα τελικού προϊόντος και διατήρηση άριστων ποιοτικών χαρακτηριστικών. Επιπλέον μελετηθηκε η διατηρησιμότητα και η ωρίμανση αυτού του τύπου κεφαλοτυριού με αποτέλεσμα να προκύψει ένα πλήρες πακέτο στοιχείων που θα βοηθήσει μελλοντικά την εταιρεία να προχωρήσει στην νέα παραγωγή και στην συνέχεια να το προωθήσει με ασφάλεια στην αγορά. Η εργασία αυτή συνδυάζει τεχνικές τυροκόμησης αλλά και μικροβιολογικές αναλύσεις ώστε να διαπιστώνετε η πορεία της ωρίμανσης αλλά και της αδρανοποίησης των μικροοργανισμών (βρουκελλών). Επίσης περιλαμβάνει δοκιμές γευσιγνωσίας ώστε να εξαχθούν τα σχετικά συμπεράσματα. Η προστιθέμενη αξία της προτεινόμενης έρευνας αφορά την δυνατότητα παραγωγής νέων πρωτότυπων προϊόντων από την εταιρεία τα οποία δεν διαθέτει ο ανταγωνισμός με ταυτόχρονη αύξηση του ετήσιου τζίρου και των πωλήσεων. Η παραδοσιακή παρασκευή των τυριών περιλαμβάνει τη χρησιμοποίηση απαστερίωτου γάλακτος, που αποτελεί και σημερινή πρακτική για διάφορες ποικιλίες τυριών της Ιταλίας, Γαλλίας, Ισπανίας, Πορτογαλίας, Αυστρίας και άλλων χωρών. Παραδοσιακά η παρασκευή τυριού περιλάμβανε τη χρησιμοποίηση νωπού γάλακτος, την παρουσία φυσικών και αυτόχθονων βακτηρίων, τη χρήση φυσικής πυτιάς και χειροποίητων 1

σκευών από ξύλο και χαλκό, την ωρίμαση του τυριού σε φυσικές σπηλιές και το φυσικό σχηματισμό του προϊόντος. Στην πραγματικότητα, τα τυριά από νωπό γάλα ωριμάζουν γρηγορότερα, αναπτύσσουν πιο πλούσιο άρωμα και είναι σαφώς πιο εύγευστα από τα τυριά από παστεριωμένο γάλα. Σύμφωνα με πληροφορίες από τη Διεύθυνση Κτηνιατρικής του Υπουργείου Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων, η Ελλάδα έχει δηλώσει στην Ευρωπαϊκή Ένωση ότι προς το παρόν δε θα παρασκευάζει τυριά από νωπό γάλα, λόγω κινδύνων για τη δημόσια υγεία από ζωοανθρωπονόσους. Η τάση που υπάρχει σήμερα στην παγκόσμια αγορά, για σταθερή ποιότητα και γεύση στα παραδοσιακά μας τυριά καθώς και για διασφάλιση της δημόσιας υγείας, αναγκάζει τους παραγωγούς να καταφύγουν στην θερμική επεξεργασία του γάλακτος. Με τη θερμική επεξεργασία καταστρέφεται το μεγαλύτερο μέρος της μικροχλωρίδας του νωπού γάλακτος με αποτέλεσμα την απώλεια της τυπικής και έντονης γεύσης των τυριών. Η τήρηση των νόμων της αγοράς και των κανόνων της υγιεινής, χωρίς συγχρόνως να χάνεται ο ιδιαίτερος χαρακτήρας ενός προϊόντος, είναι το ζητούμενο. Το νωπό γάλα διαθέτει γαλακτικά βακτήρια (LAB) με έντονη πρωτεολυτική δραστηριότητα που συνεισφέρουν στη διαμόρφωση του αρώματος των τυριών. Πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στις συνθήκες παραγωγής, μεταφοράς και αποθήκευσης του γάλακτος καθώς και στις συνθήκες τυροκόμησης για να μειωθεί ο αρχικός πληθυσμός των εντεροβακτηριοειδών και κολοβακτηριοειδών και να εξαλειφθεί η παρουσία ανεπιθύμητων μικροοργανισμών. Τα στελέχη LAB που απομονώνονται από ζυμωμένα γαλακτοκομικά προϊόντα στα οποία δεν έχει προστεθεί κάποια καλλιέργεια, χαρακτηρίζονται ως «άγρια» στελέχη. Με τις πρωτεολυτικές τους ιδιότητες συνεισφέρουν στη δημιουργία της τυπικής γεύσης και αρώματος του κάθε τύπου τυριού. Η προσθήκη πολυφαινόλης πιθανών ευνοεί την ανάπτυξη των οξυγαλακτικών βακτηρίων, η λακτοφερίνη έχει γνωστή αντιμικροβιακή δράση έναντι παθογόνων μικροοργανισμών και επιπλέον, η προσθήκη βακτηριοσινογόνων στελεχών ως καλλιέργεια εκκίνησης ή ως συμπληρωματική καλλιέργεια στη παρασκευή ενός τυριού, είναι πιθανά σημαντικό «όπλα» καταπολέμησης της επιβίωσης και ανάπτυξης παθογόνων μικροοργανισμών 2

και παραγωγής ενός προϊόντος με άριστα οργανοληπτικά συστατικά. Αυτός είναι και ο βασικός στόχος της παρούσας εφαρμοσμένης έρευνας και μελέτης. 1.1 Η ιστορία του τυριού. Η «αγροτική επανάσταση» είχε ως βασικά στοιχεία την εξημέρωση πολλών ζώων και την καλλιέργεια καρπών. Η θρεπτική αξία του γάλακτος που παραγόταν από τα οικόσιτα ζώα έγινε γρήγορα αντιληπτή και αποτέλεσε βασικό κομμάτι της ανθρώπινης διατροφής. Τα πρόβατα και οι κατσίκες ήταν πιο ήμερα και αγελαία ζώα και για αυτούς τους λόγους ήταν και τα πρώτα ζώα που εξημερώθηκαν για παραγωγή γάλακτος, αλλά με το πέρασμα των χρόνων οι αγελάδες επικράτησαν μεταξύ των γαλακτοπαραγωγικών ζώων στα περισσότερα μέρη του κόσμου. Η παραγωγή γάλακτος σύντομα ώθησε τον άνθρωπο στην επεξεργασία του για την παρασκευή τυριών. Ως τυρί, με τη γενική έννοια του όρου, ορίζεται μια ομάδα τροφίμων με βασικό συστατικό το γάλα, που μπορεί να έχουν ποικίλες μορφές και γεύσεις σε όλο τον κόσμο. Και αν και το τυρί ξεκίνησε με πρωταρχικό στόχο τη διατήρηση των βασικών συστατικών του γάλακτος, γρήγορα εξελίχθηκε σε τρόφιμο υψηλής διατροφικής αξίας, με εξαιρετικές ποικιλίες και γεύσεις (Fox & McSweeney, 2004). Η ιστορία του τυριού αρχίζει περίπου 8.000 χρόνια πριν στα οροπέδια του Ιράν, όταν για πρώτη φορά πάνω στον πλανήτη εξημερώθηκαν τα πρώτα μηρυκαστικά. Από την περιοχή των ποταμών Τίγρη και Ευφράτη εξαπλώθηκε μέσω της Τουρκίας και των ακτών της Μεσογείου στην υπόλοιπη Ευρώπη. Χίλια χρόνια μετά στην βόρειο Ευρώπη εξημερώνεται η άγρια αγελάδα και τα ζώα αυτά αποτέλεσαν τα πρώτα κοπάδια που οι νομάδες χρησιμοποιούσαν για το κρέας τους και το γάλα τους, ενώ αργότερα εμφανίζεται η κατσίκα και η προβατίνα στις ακτές της Μεσογείου. Η ιστορία του τυριού ταυτίζεται αλλά και εξελίσσεται με αυτήν της Ευρώπης. Πρώτη μαρτυρία διατροφής με γάλα μηρυκαστικού είναι αυτή της ελληνικής μυθολογίας όταν ο Δίας κυνηγημένος από τον πατέρα του τρέφεται με γάλα από την κατσίκα Αμάλθεια. Ενώ για το τυρί, να σημειωθεί ότι έχει βρεθεί αναπαράστασή του σε επιτύμβια στήλη στην Αίγυπτο και έχει αναφερθεί αρκετά στην αρχαία ελληνική λογοτεχνία. Στην Ιλιάδα του Ομήρου, αναφέρεται η χρήση της πυτιάς που πήζει γρήγορα το γάλα, ενώ στην Οδύσσεια, ο Όμηρος περιγράφει λεπτομερώς το βοσκό και τυροκόμο Κύκλωπα Πολύφημο να φτιάχνει τυρί από πρόβιο γάλα και να το διατηρεί σε δοχεία όπου ωρίμαζε μέσα στη σπηλιά του. Και άλλοι αρχαίοι Έλληνες συγγραφείς κάνουν αναφορά στο τυρί. Ο πατέρας της ιστορίας, ο Ηρόδοτος, αναφέρει τυρί από τη Σκιάθο, ενώ ο Αριστοτέλης 3

και ο Διοσκουρίδης έδωσαν τις πρώτες συνταγές για την παραγωγή τυριού. Στην αγορά των Αθηνών αναφέρεται ότι υπήρχε χώρος ειδικά αφιερωμένος στα τυριά και στην αρχαία Σπάρτη υπήρχε ολόκληρη τελετουργική γιορτή με επίκεντρο την τυροκομία. Αργότερα, οι Ρωμαίοι υπήρξαν σπουδαίοι τυροκόμοι αλλά και φίλοι του τυριού. Κατακτώντας την Ευρώπη και τον τότε γνωστό κόσμο έμαθαν στους ντόπιους κατοίκους την τυροκομία. Στα χρόνια της Βυζαντινής αυτοκρατορίας, στον Ελληνικό χώρο η τυροκομία ήταν πολύ εκτεταμένη. Οι λίγες μαρτυρίες που έχουμε ομιλούν για το βλάχικο τυρί, τις μυζήθρες (απ όπου πήρε το όνομά του και ο Μυζηθράς Μιστράς). Κατά την διάρκεια της Τουρκοκρατίας στα βουνά της Ηπειρωτικής Ελλάδας και των νησιών, η παράδοση συνεχίστηκε αμείωτα. Στο τέλος του 19ου αιώνα, το νεοσύστατο ελληνικό κράτος με τους υπουργούς του και ιδιαίτερα του Εμμανουήλ Μπενάκη, αντιλήφθηκε την οικονομική σημασία της κτηνοτροφίας και μαζί με τον διαπρεπή τυροκόμο Ραϋμόνδο Δημητριάδη εκπαίδευσε τους νέους τυροκόμους της χώρας. Αργότερα οι επίσης μεγάλοι τυροκόμοι Ζυγούρης και Πολυχρονιάδης συνέχισαν το έργο του, διασχίζοντας τη χώρα για να εκπαιδεύσουν νέους στην τέχνη της τυροκομίας. Λίγα χρόνια μετά, συγκροτήθηκε η Εθνική Επιτροπή Γάλακτος η οποία ακόμα και σήμερα προωθεί με κάθε τρόπο τα συμφέροντα των τυροκόμων 1.2 Η βιομηχανία Γάλακτος. Κάθε μονάδα παραγωγής γαλακτομικών προϊόντων εμφανίζει σημαντικές διαφορές ανάλογα με την παραγωγική διαδικασία που εφαρμόζεται, τις πρώτες ύλες που χρησιμοποιούνται και τα τελικά προϊόντα που παράγονται. Όλες αυτές οι παράμετροι καθιστούν δύσκολη την ομαδοποίησή τους. Ανάλογα με το τελικό παραγόμενο προϊόν οι γαλακτοκομικές βιομηχανίες διαχωρίζονται στις εξής κατηγορίες: βιομηχανίες παραγωγής γάλακτος (παστεριωμένου, μακράς διαρκείας, συμπυκνωμένου, σκόνης και ξηρού γάλακτος), βιομηχανίες παραγωγής προϊόντων ζύμωσης (γιαούρτι, κρέμα κα.), βιομηχανίες παραγωγής βουτύρου, βιομηχανίες παραγωγής τυριού, τυρόγαλου και βιομηχανίες παραγωγής παγωτών. Στις περισσότερες παραγωγικές μονάδες δεν παράγεται μόνο ένα προϊόν, αλλά συνήθως δύο ή και περισσότερα προϊόντα. Στη συνέχεια αναφέρονται οι βασικές μέθοδοι κατεργασίας που ακολουθούνται πριν την περαιτέρω επεξεργασία του γάλακτος για τη παραγωγή των περισσοτέρων γαλακτοκομικών προϊόντων. Οι μέθοδοι αυτές αποσκοπούν στη βελτίωση, στην εξυγίανση και στην παράταση του χρόνου ζωής του γάλακτος. 4

1.3 Στάδια λειτουργίας. Παραλαβή και Έλεγχος Νωπού Γάλακτος: Το γάλα μεταφέρεται από τις φάρμες μέσα σε δοχεία ή με βυτιοφόρα και παραλαμβάνεται στις μονάδες όπου και υπόκειται σε ποιοτικό έλεγχο. Διήθηση: Αρχικά το γάλα υπόκειται σε διήθηση για να αφαιρεθούν οι ξένες προσμίξεις που τυχόν φέρει και τα αιωρούμενα στερεά που μπορεί να περιέχει από το στάδιο του αρμέγματος μέχρι την παραλαβή του στο εργοστάσιο. Η διήθηση μπορεί να γίνει είτε με φυσικό τρόπο (με υφασμάτινα φίλτρα, τα οποία επαναχρησιμοποιούνται μετά από καθαρισμό), είτε με μηχανικό τρόπο (με κατάλληλους φυγοκεντρικούς διαχωριστήρες, ταχύτητας περιστροφής 3.000-4.000 rpm/min). Η φυγόκεντρη δύναμη που δημιουργείται έχει ως αποτέλεσμα τα διάφορα ξένα σώματα να συγκεντρωθούν στην περιφέρεια της φυγόκεντρου υπό μορφή λάσπης, η οποία απομακρύνεται κατά διαστήματα είτε χειροκίνητα, είτε αυτόματα. Το γάλα αρχικά διέρχεται από πυκνό μεταλλικό πλέγμα το οποίο συγκρατεί ξένα σώματα που τυχόν υπάρχουν και στη συνέχεια διοχετεύεται με αντλία σε φίλτρα διηθητικής επιφάνειας (από πεπιεσμένο βαμβάκι ή ύφασμα), είτε σε λεπτό μεταλλικό δίκτυο. Αποθήκευση-Ψύξη: Το γάλα μεταφέρεται σε μονωμένες δεξαμενές που είναι υπό ψύξη καi αποθηκεύεται εκεί. Θέρμανση: Όταν πρόκειται για μεγάλες μονάδες είναι απαραίτητη η αποθήκευση του γάλακτος σε σιλό για μερικές ημέρες. Προκειμένου να εξασφαλιστεί η ποιότητα του γάλακτος, τούτο θερμαίνεται για μερικά δευτερόλεπτα σε θερμοκρασία 63-65οC. Παστερίωση: Με την παστερίωση επιτυγχάνεται η εξουδετέρωση των παθογόνων μικροοργανισμών και ορισμένων βακτηρίων με θερμική επεξεργασία. Αυτή γίνεται είτε σε δεξαμενές ασυνεχούς ροής (χαμηλή παστερίωση) όπου το γάλα παραμένει για 30 min σε θερμοκρασία 63-65οC, είτε σε παστεριωτήρες συνεχούς ροής (υψηλή παστερίωση) όπου εξασφαλίζεται η τυρβώδης ροή του γάλακτος ανάμεσα σε δύο θερμαντικές 5

μεταλλικές πλάκες, οι οποίες διατηρούν τη θερμοκρασία του γάλακτος στους 72-75οC για 15 sec. Τυποποίηση: Η τυποποίηση πραγματοποιείται με κατάλληλο φυγοκεντρικό διαχωριστήρα-τυποποιητή και έχει ως αποτέλεσμα το διαχωρισμό ενός κλάσματος του γάλακτος με ταυτόχρονη απομάκρυνση της παραγόμενης κρέμας και επανακυκλοφορία αυτής στη δεξαμενή αποθήκευσης. Ομογενοποίηση: Με την ομογενοποίηση μειώνεται το μέγεθος των περιεχόμενων στο γάλα λιπαρών σφαιριδίων, έτσι ώστε να παραμένουν διασκορπισμένα στο υγρό διάλυμα και να μην δημιουργούν στρώμα κρέμας στην επιφάνεια. Ως ομογενοποιημένο χαρακτηρίζεται το γάλα που μετά από παραμονή σε ηρεμία επί 48 ώρες στους 7οC δεν παρουσιάζει ορατό στρώμα κρέμας. Η ομογενοποίηση επιτυγχάνεται με διοχέτευση του γάλακτος υπό πίεση 150-250 atm και θερμοκρασία 60-70οC, μέσα από πολύ λεπτές σχισμές, με αποτέλεσμα τα λιποσφαιρίδια του γάλακτος να κατατμούνται σε σφαιρίδια διαμέτρου 1-2 μm. Αερισμός: Μέθοδος με την οποία επιτυγχάνεται η απομάκρυνση των αερίων και των δύσοσμων πτητικών ουσιών που μπορεί να περιέχονται στο γάλα. Σταθμός υποδοχής γάλακτος και τα βασικά πρώτα στάδια της επεξεργασίας του. 6

1.4 Τυροκομικές μονάδες. Στις περισσότερες τυροκομικές μονάδες ακολουθούνται τα ίδια στάδια για την παρασκευή των βασικότερων τυροκομικών προϊόντων. Καταρχήν γίνεται μεταφορά του γάλακτος στη μονάδα από τους παραγωγούς και τους σταθμούς συγκέντρωσης και ψύξεως οι οποίες έχουν εγκατασταθεί σε επιλεγμένες τοποθεσίες της ευρύτερης περιοχής. Η μεταφορά γίνεται σε θερμοκρασία 4ΟC μέσα σε ανοξείδωτα βυτία, που πληρούν τις προδιαγραφές υγιεινής και ασφάλειας του γάλακτος. Με αντλίες εισέρχεται στο εσωτερικό της μονάδας και αποθηκεύεται προσωρινά σε δεξαμενές παραλαβής σεθερμοκρασία 4ΟC. Κατά της παραλαβή του γάλακτος στη μονάδα είναι απαραίτητος ο ποιοτικός έλεγχος, ο οποίος περιλαμβάνει τα εξής στάδια: Έλεγχος θερμοκρασίας Έλεγχος οξύτητας Έλεγχος αντιβιοτικών Περιεκτικότητα λίπους, πρωτεϊνών, λακτόζης, στερεού υπολείμματος και στερεού υπολείμματος άνευ λίπους. Δύο φορές το μήνα είναι απαραίτητοι οι έλεγχοι από διαπιστευμένα εξωτερικά εργαστήρια που περιλαμβάνουν έλεγχο αντιβιοτικών και μέτρηση ολικής μικροβιακής χλωρίδας. Μια σύντομη περιγραφή των βασικών σταδίων παρασκευής τυριού ακολουθεί στη συνέχεια. Την παραλαβή του γάλακτος τη διαδέχεται η μεταφορά του με ανοξείδωτους σωλήνες στις δεξαμενές. Εκεί το γάλα προθερμαίνεται σε θερμοκρασία 34ΟC και ακολουθεί η φυγοκέντρηση για επιπλέον καθαρισμό του γάλακτος. Μετά ακολουθεί η προσωρινή αποθήκευση και ψύξη. Κατά την ψύξη οι πρωτεΐνες και τα άλατα του γάλακτος αλλάζουν χαρακτήρα, πράγμα που επηρεάζει τις ιδιότητες της παρασκευής τυριού. Έχει βρεθεί με έρευνες ότι το 25% του ασβεστίου κατακρημνίζεται μετά από 24 ώρες αποθήκευσης του γάλακτος στους 5οC (Bylund, 1995). Η μείωση αυτή ωστόσο είναι παροδική, αφού με την παστερίωση το ασβέστιο επαναδιαλύεται και αποκαθίστανται οι ιδιότητες του γάλακτος. Το επόμενο στάδιο είναι η παστερίωση η οποία θα αδρανοποιήσει τα βακτήρια που επηρεάζουν την ποιότητα του τυριού. Γίνεται θέρμανση δηλαδή του γάλακτος στους 7

65οC για μισή ώρα, ενώ σε βιομηχανική κλίμακα η συνήθης διαδικασία παστερίωσης που εφαρμόζεται είναι θέρμανση στους 72-73οC για 15-20 δευτερόλεπτα (Bylund, 1995). Στη συνέχεια το γάλα περνάει στο σύστημα ψύξης, όπου ψύχεται γρήγορα σε θερμοκρασία 35οC και τελικά οδηγείται στον τυρολέβητα, για μία ώρα, σε θερμοκρασία 32-37οC. Στο στάδιο αυτό προστίθεται η πυτιά σε συνδυασμό με την καλλιέργεια με σκοπό την πήξη του γάλακτος. Σε αυτό το στάδιο γίνεται και ο διαχωρισμός του τυρόγαλου. Μετά την ολοκλήρωση της πήξης, ακολουθεί η χειρωνακτική κοπή του τυροπήγματος σε μικρά τετράγωνα κομμάτια με σκοπό τον καλύτερο διαχωρισμό του τυροπήγματος από το τυρόγαλο. Το τυρόγαλο απομακρύνεται με αντλία μέσα σε ανοξείδωτους σωλήνες, ενώ το τυρόπηγμα τοποθετείται σε καλούπια με πίεση για να γίνει η στράγγιση. Μόνο το 50% από τα στερεά που υπάρχουν στο γάλα ενσωματώνονται στο τυρί. Τα υπόλοιπα (90% της λακτόζης, 20% των πρωτεϊνών και 10% των λιπών) παραμένουν στο τυρόγαλο (Fox et. al., 2000). Ακολουθεί η κοπή, η προσθήκη αλατιού ώστε να εμποδίζεται η ενζυμική δραστηριότητα και η τοποθέτηση σε δοχεία μετά από 10-12h. Η θερμοκρασία και το pη είναι οι βασικοί παράγοντες που επηρεάζουν το ρυθμό απορρόφησης του αλατιού από το τυρί και κατά συνέπεια το ρυθμό απώλειας υγρασίας. Όσο υψηλότερη είναι η θερμοκρασία, τόσο μεγαλύτερη είναι και η απορρόφηση. Για αυτούς τους λόγους το τυρί οδηγείται μέσα σε δοχεία στα οποία έχει προστεθεί άλμη, σε θάλαμο ωρίμανσης, σε θερμοκρασία 22-25οC και παραμένει εκεί για 5-8 ημέρες. Ο χρόνος αλάτισης εξαρτάται από το είδος του τυριού που παρασκευάζεται, από το μέγεθος του τυριού και από τη συγκέντρωση αλατιού που έχει η άλμη η οποία προστίθεται στο τυρί. Αυτό είναι και το στάδιο που το τυρί αποκτά τις χαρακτηριστικές του ιδιότητες όπως οσμή, γεύση, χρώμα και υφή. Οι πρωτεΐνες διασπώνται σε αμινοξέα και αζωτούχες ενώσεις, η λακτόζη σε γλυκόζη και γαλακτόζη και αυτές μέσω της ζύμωσης δίνουν γαλακτικό οξύ. Το λίπος υδρολύεται σε ελεύθερα λιπαρά οξέα. Όταν η ωρίμανση ολοκληρωθεί το τυρί μεταφέρεται σε ψυκτικούς θαλάμους με θερμοκρασία 2-5οC και σχετική υγρασία 75% και διατηρείται εκεί για τουλάχιστον 2 μήνες πριν τη διανομή 8

του προς πώληση, ώστε να αναπτυχθούν όλα τα επιθυμητά τελικά χαρακτηριστικά του τυριού. Διάγραμμα ροής παραγωγής τυριού. 9

Στάδια της παραγωγικής διαδικασίας και τα σημεία κατά τα οποία υπάρχει σημαντική παραγωγή στερεών και υγρών αποβλήτων κατά την παραγωγή τυριού. 10

1.5 Το κεφαλοτύρι. Υπάρχει μια μεγάλη ποικιλία παραδοσιακών τυριών στην χώρα μας από κατσικίσιο, αγελαδινό ή πρόβειο γάλα, μη γνωστά δυστυχώς στο ευρύ κοινό. Τυριά με έντονη προσωπικότητα, γεμάτη γεύση και άρωμα που «ομορφαίνουν» την παραδοσιακή μας κουζίνα και μας χαρίζουν αξέχαστες στιγμές γαστρονομικής απόλαυσης. Τα παραδοσιακά τυριά αντιπροσωπεύουν την καλλιέργεια των παραγωγών τους, όχι μόνο εκείνων των ατόμων που παρασκευάζουν τα τυριά αλλά και ολόκληρης της κοινωνίας. Το παραδοσιακό τυρί δε θεωρείται μόνο τρόφιμο αλλά και φορέας πληροφοριών για τη χλωρίδα της περιοχής, τις γεύσεις, τις συνήθειες, τον τρόπο ζωής και την καλλιέργεια της κοινωνίας της συγκεκριμένης περιοχής προέλευσης. Μία κατηγορία των Ελληνικών παραδοσιακών τυριών αποτελούν τα τυριά από γάλα, με ωρίμανση. Ο ορισμός των τυριών αυτών, είναι: «τα τυριά αυτά είναι προϊόντα ωρίμανσης του πήγματος (στάλπης) που είναι απαλλαγμένο από το τυρόγαλα, στον επιθυμητό κάθε φορά βαθμό, και τα οποία παρασκευάσθηκαν με την επενέργεια πυτιάς ή άλλων ενζύμων που δρουν ανάλογα σε γάλα (νωπό ή παστεριωμένο, αγελάδας, προβάτου, κατσίκας, βουβάλου και μίγματα αυτών) ή σε μερικώς αποβουτυρωμένο γάλα ή σε μίγμα αυτών, ή/και σε πήγματα αυτών με κρέμα γάλακτος (αφρόγαλα)». (Κώδικας Τροφίμων & Ποτών,2001). Το κεφαλοτύρι θεωρείται το παλιότερο τυρί της Ελλάδος και ανήκει στην κατηγορία των τυριών ωρίμανσης. Η λέξη «κεφαλοτύρι» είναι σύνθετη από τις λέξεις «κέφαλος» και «τυρί» που ενδεχόμενα να μην έχει σχέση με το κεφάλι σαν σχήμα ή οτιδήποτε άλλο, αλλά με το μέγεθος που σημαίνει μεγάλο τυρί όπως η λέξη «κεφαλοχώρι» σημαίνει ένα μεγάλο χωριό, σε κάποια περιοχή. Με την ελληνική αυτή ονομασία το κεφαλοτύρι παράγεται και σε άλλες χώρες όπως στις Βαλκανικές και της Μέσης Ανατολής και επομένως πρέπει να διαδόθηκε σ' αυτές από την Ελλάδα. Τελευταία παρασκευάζεται και από άλλες χώρες του εξωτερικού αλλά αποκλειστικά από αγελαδινό γάλα(ζυγούρης Ν.1952; Βεϊνόγλου Β και Aνυφαντάκης E. 1981). 1.6 Προδιαγραφές κεφαλοτυριού. Τα σκληρά τυριά που γίνονταν παλαιότερα στην Ελλάδα σχεδόν όλα λέγονταν κεφαλοτύρια. Ανάλογα με τον τρόπο προελεύσεως τους είχανε διαφορετικό σχήμα, μέγεθος, τεχνολογία και ποιότητα γι' αυτό και ήταν γνωστά σαν κεφαλοτύρι Ηπείρου, κεφαλοτύρι Θεσσαλίας, Μακεδονίας, Κρήτης, Κεφαλληνίας, Ευβοίας, Νάξου κλπ. Το κεφαλοτύρι γινόταν είτε από αμιγές πρόβειο είτε από ανάμικτο πρόβειο και κατσικίσιο γάλα. Σήμερα με την εξέλιξη της αγελαδοτροφίας προωθείται όλο και περισσότερο αγελαδινό γάλα στην παραγωγή του κεφαλοτυριού. 11

Χαρακτηρίζεται από τη σκληρή του σύσταση, με μικρές ακανόνιστες τρύπες στη μάζα του και την δριμεία και αλμυρή γεύση του. Το σχήμα του τυριού είναι κυλινδρικό με διαστάσεις περίπου 30 cm διάμετρο και 10 cm ύψος. Το βάρος του τυριού είναι γύρω στα 7 χιλιόγραμμα, υπάρχουν όμως και κεφαλοτύρια μικρότερα ή μεγαλύτερα. (Zυγούρης Ν. 1952). Το Ελληνικό παραδοσιακό αυτό τυρί κυρίως τρίβεται στα μακαρόνια και χρησιμοποιείται στη μαγειρική αλλά στην τελευταία εικοσαετία έχει αλλάξει αρκετά η τεχνολογία του κι έτσι πολλές παραλλαγές του είναι επίσης καλές σαν επιτραπέζιο τυρί. Τέτοιες παραλλαγές είναι η βεζιά Πελοποννήσου ή βιζές Ηπείρου.( Ζερφυρίδης Γ. και Παππάς Χ.,1983) Επίσης το ορεινοτύρι που παράγεται από νωπό πρόβειο γάλα σε ορεινά χωριά της Ηπείρου, έχει την ίδια τεχνολογία παρασκευής με το Κεφαλοτύρι. Δεν έχει χαρακτηριστεί ως ΠΟΠ Ελληνικό τυρί αλλά αποτελεί ένα από τα παραδοσιακά τυριά της Ελλάδος. (Prodromou et al., 2001). Το κεφαλοτύρι μοιάζει με το Ιταλικό Pecorino Romano(Davis 1976)και με το Αιγυπτιακό Ras,το οποίο παράγεται από αγελαδινό γάλα και την ίδια σχεδον τεχνολογία με το κεφαλοτυρι. (Fox P. and McSweeney P.,2003). Σύμφωνα με τον Ελληνικό Κώδικα Τροφίμων, το κεφαλοτύρι ανήκει στην κατηγορία των σκληρών τυριών, όπου η υγρασία τους κυμαίνεται από 32-38%. Τέτοια Ελληνικά τυριά είναι η Γραβιέρα Κρήτης, η Γραβιέρα Νάξου, η Γραβιέρα Αγράφων, η Κεφαλογραβιέρα, το Λαδοτύρι Μυτιλήνης, ο Μπάτζος, η Φορμαέλα Παρνασσού (Κώδικας Τροφίμων και Ποτών 2001) Άλλα σκληρά τυριά που συναντάμε στην Ευρωπαϊκή Ένωση είναι τα : Cheddar, Cheshire, Derby, Gloucester και Leicester (Αγγλικό), Cantal (Γαλλικό), Friesian και Leiden (Ολλανδικά), Manchego, Idiazabal, Roncal, και La Serena (Ισπανικά), Saˆo Jorge (Πορτογαλλικό) και τέλος το Ras (Αιγυπτιακό) και το Pecorino.(Ιταλικό)(Fox P. and McSweeney P., 2003). Τα Ελληνικά σκληρά τυριά επιτρέπεται να διατίθενται στην κατανάλωση στις ποιότητες που αναφέρονται στον πίνακα 1. α. Εξαιρετική ποιότητα β. Πρώτη ποιότητα γ. Δεύτερη ποιότητα δ. Μερικώς αποβουτυρωμένα Υγρασία μέγιστη 35% 38% 38% 32% Λίπος υπολογισμένο σε ξηρή ουσία (τουλάχιστον) 47% 40% 32% 20% (συμπ.)-32% Πίνακας 1: Ποιότητες σκληρών τυριών (Κώδικας Τροφίμων & Ποτών, 2011) 12

Κοινά χαρακτηριστικά των τυριών αυτών είναι τα εξής: Απαιτούν μέση διάρκεια ωρίμασης (συνήθως 3-5 μήνες). Το τυρόπηγμά τους έχει υποστεί ηπιότερη θερμική μεταχείριση σε σύγκριση με το τυρόπηγμά των πολύ σκληρών τυριών. Όταν η περιεκτικότητα τους σε υγρασία είναι μικρότερη του 36% τότε τα τυριά αυτά χρησιμοποιούνται στη μαγειρική ως τρίμμα και όταν είναι 36-38% τότε χρησιμοποιούνται για επιτραπέζια κατανάλωση. Όσον αφορά τα μικροβιολογικά τους κριτήρια, βάση του κανονισμού (ΕΚ) 2073/2005, που εφαρμόζεται από την 1η Ιανουαρίου 2006, καθορίζονται προδιαγραφές για συγκεκριμένους μικροοργανισμούς(παθογόνους ή δείκτες υγιεινής) όπως φαίνεται και στον παρακάτω πίνακα 2 ΠΙΝΑΚΑΣ 2: Κριτήρια ασφάλειας και υγιεινής των τυριών ((ΕΚ) 2073/2005) ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Τυριά Tυρια, βουτυρο, κρέμα, από γάλα που εχει υποστει θερμικη επεξεργασια μικροτερης της παστεριωσης 4 ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ Η ΤΟΞΙΝΕΣ ΠΛΑΝΟ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ 1 ΟΡΙΑ 2 n c m M Listeria monocytogenes 5 5 100cfu/gr 3 Salmonella 5 0 Απουσία σε 25 gr Σταφυλλοκοκκικές Να μην ανιχνεύονται εντεροτοξίνες 5 0 σε 25 gr Τυριά, γάλα σε σκονη Τυριά από γάλα που εχει υποστεο θερμική επεξεργασία E.coli 5 0 100cfu/gr 1000cfu/gr Tυρια, από γάλα που εχει υποστει θερμικη επεξεργασια μικροτερης της παστεριωσης Tυριά από νωπό γάλα Σταφυλλόκοκικοι θετικοι στην πηκτάση 5 0 10 4 cfu/gr 10 5 cfu/gr Σταφυλλόκοκικοι θετικοι στην πηκτάση 5 0 100cfu/gr 1000cfu/gr (1) n=αριθμός μονάδων/δείγμα, c=αριθμός μονάδων με τιμές> m ή μεταξύ m και Μ (2) m,μ για τυριά και άλλα προϊόντα, σε ότι αφορά τα κριτήρια ασφαλείας (3) Το κριτήριο εφαρμόζεται αν ο παρασκευαστής μπορεί να αποδείξει ικανοποιώντας την αρμόδια αρχή ότι το προϊόν δε θα υπερβεί το όριο των 100 cfu/grgr (4) Εξαιρούνται προϊόντα όπου ο Παραγωγός μπορεί να αποδείξει, ότι λόγω του χρόνου ωρίμανσης % του aw του προϊόντος δεν υπάρχει κίνδυνος Σαλμονέλλας 13

1.7 Τεχνολογία παραγωγής. Παλαιότερα η τεχνολογία του κεφαλοτυριού διέφερε από μέρος σε μέρος και ανάλογα με την εποχή του έτους. Με τα σημερινά όμως μέσα επεξεργασίας του γάλακτος, η τεχνολογία του μπορεί να είναι ενιαία, ανεξάρτητα από τόπο και εποχή. Το παρακάτω διάγραμμα 1 παριστάνει την τεχνολογία παραγωγής κεφαλοτυριού από αγελαδινό γάλα, που προέκυψε από έρευνα πάνω στο τυρί αυτό, στο Εργαστήριο Tεχνολογίας Γάλακτος της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ.(Ζερφυρίδης, Γ.Κ.1997). Χρόνος σε ώρες Κατεργασία και λεπτά 0:00 'Έναρξη παραλαβής αγελαδινού γάλακτος στον τυρολέβητα παστεριωμένου, λιποπεριεκτικότητας 3% και θερμοκρασίας 35 C, ph 6.6. 0:10 Προσθήκη καλλιέργειας 1% του γάλακτος. 0:20 Προσθήκη διαλύματος 40% χλωριούχου ασβεστίου σε ποσότητα 100 ml κατά τόννο γάλακτος. Λήξη πληρώσεως του τυρολέβητα. Ωρίμανση γάλακτος με την καλλιέργεια για 40 min. 0:50 Προσθήκη πυτιάς για να πήξη το γάλα σε 40 min, ph 6.45, ή περίπου 0,15 μονάδες χαμηλότερα από το ρη του αρχικού γάλακτος. 1:30 Κόψιμο τυροπήγματος σε μέγεθος καλαμποκιού ή περίπου 0.5 cm διάμετρο. 1:35 Αναθέρμανση μέχρι 45 C με ανάδευση. 1:50 Τέλος αναθερμάνσεως, συνέχιση αναδεύσεως για 5-10 min μέχρι να γίνει το ρη 6.2. 2:00 Ανάπαυση 5 min να κατακαθήσει. το τυρόπηγμα. 2:05 Αφαίρεση μέρους του τυρογάλακτος. 2:10 Εξαγωγή τυροπήγματος και τοποθέτηση του σε καλούπια. 2:30 Πίεση του τυριού για 3 ώρες με 3-4 αλλαγές τσαντίλας, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. 5:30 Μεταφορά των τυριών μέσα στα καλούπια σε αποθήκη 14-16 C μέχρι την επομένη. 24:00 Εισαγωγή σε άλμη 18% με ρη 4,8 σε 14-16 C. pη τυριού περίπου 4.8. 48:00 Τοποθέτηση των τυριών σε ράφια. Έναρξη ξηρών αλατισμάτων και περιποιήσεων, Ωρίμανση στους 14-16 0 και σχετική υγρασία 85% για 3 μήνες. Διάγραμμα 1. Τεχνολογία κεφαλοτυριού (Ζερφυρίδης, Γ.Κ.1997) 14

Στον πίνακα 3 δίνονται οι τεχνολογίες παρασκευής κεφαλοτυριού από πρόβειο, γίδινο και αγελαδινό γάλα με Ελληνική και Βουλγαρική Τεχνολογία. Πρόβειο Γίδινο Αγελαδινό Τεχ/γία Ελληνική Τεχ/γία Βουλγαρική 1.Τυποποίηση λίπους % 5,6 3,75 3,4 3,4 2.Παστερίωση 68 0 C/10min 75-76 0 C/20-30min 70 0 C/16sec 70 0 C/16 sec 3.Ψύξη 0 C 2 35 35 36 36 4.Οξυγαλακτικές καλ/γιες Lact.bulgaricus% 0,5 0,2 0,6 0,6 Strep.thermophilus % 0,5 0,4 0,9 0,9 5.Άυξηση οξύτητας κατά την ωρίμανση 1-2 0 D 1-2 0 D 1-2 0 D 1-2 0 D 6.Xλωριούχο ασβέστιο(g/100l) - 8 15 15 7.Xλωροφύλλη(ml/10L) - - 15 15 8.Λιπάση(g/100L) - - 7 7 9.Πυτιά ποσότητα τόση ώστε το πήγμα να είναι έτοιμο για διαίρεση σε 35min 10.Θ πήξεως 35 0 C 12.Xρόνος πρόπηξης(min) 8 13. Xρόνος πήξης(min) 35 14.1 η ανάδευση (min) 10 10 15 15 15.Χρόνος 1 ης αναθερ/σης(min) 20 15 15 15 16.Τελικη Θ αναθερμανσης 0 C 44 43 46-47 46-47 17.2 η ανάδευση (min) 10 10 10 10 ΠΙΝΑΚΑΣ 2 18.Αφαιρεση τυρογάλακτος% - 67 - - 19.Προσθήκη άλμης 12 0 Be - 10 - - 20. Χρόνος 2 ης αναθερ/σης(min) - 47 - - 22. 3 η ανάδευση (min) - 15-20 - 10 23.Προπίεση πήγματος στο τυρόγαλο (προαιρετικό) min 5-10 5-10 5-10 5-10 24.Toποθέτης σε καλούπια(min) 10 10 10 10 25.Πίεση(h) 1,5 3 2 2 26.Διατήρηση στους 14 0 C πριν το αλάτισμα(h)15 15 15 15 27.Εμβάπτιση σε άλμη στους14 0 C & 20 Βe (h) 24-48 24(23 Be) 28.Αριθμός ξηρών αλατισμάτων 3 2 3 2 29.Θ ωριμανσεως 0 C 14 14 24 14 30.Σχετική υγρασία ωριμάνσεως% Πίνακας 3: Τεχνολογίες 85-90% παρασκευής κεφαλοτυριού 85-90% από πρόβειο, 85-90% γίδινο και αγελαδινό γάλα 85-90% με Ελληνική και Βουλγαρική Τεχνολογία. (Bεϊνόγλου και συνεργάτες., 1983; Baltadjieva et al.,1978; 31. Τελική ωρίμανση μέρες 90 Veinoglou et 50 al., 1981) 60 60 15

1.8 Γάλα τυροκομήσεως. Μετά την παραλαβή, ζύγιση και διήθηση του γάλακτος ελέγχεται η οξύτητα, η ύπαρξη αντιβιοτικών και η λιποπεριεκτικότητα. Ακολουθεί η τυποποίηση του γάλακτος για να διευκολυνθεί η τυποποίηση της χημικής σύστασης του τυριού. Για μεν το πρόβειο γάλα, από το Εργαστήριο Γαλακτοκομίας της Γεωπονικής Σχολής Αθηνών, προτείνεται η τυποποίηση να γίνεται στο 5,6%, στο γίδινο στο 3,7% και στο αγελαδινό στο 3,4%. Το πρόβειο γάλα δίνει μεγαλύτερη ποιότητα κεφαλοτυριού. Όταν ανακατεύεται σ' αυτό μέχρι 20% κατσικίσιο, το τυρί γίνεται πιο σκληρό αλλά διατηρείται καλύτερα. Το κεφαλοτύρι από αγελαδινό είναι επίσης καλό αλλά πιο ευπαθές στο φούσκωμα. Μετά την τυποποίηση το γάλα παστεριώνεται για την παρασκευή τυριών με μεγαλύτερη σταθερότητα στις οργανοληπτικές ιδιότητες, και με ηπιότερη γεύση. Επίσης τα τυριά που παρασκευάζονται από παστεριωμένο γάλα διασφαλίζουν πλήρως τον καταναλωτή. Αυτά τα πλεονεκτήματα του παστεριωμένου γάλατος καλύπτουν την εξαίρετη αλλά κυμαινόμενη γεύση των τυριών που γίνονται από νωπό γάλα. Το παραδοσιακό κεφαλοτύρι γινόταν από γάλα μη παστεριωμένο που καμιά φορά το έπηζαν στο τυροκομείο αμέσως μετά το άρμεγμα, όταν ακόμη ήταν θερμό και δεν είχε ανάγκη θέρμανσης. Η τακτική αυτή δεν είναι σωστή διότι κινδυνεύει κατ' αρχή ο καταναλωτής από τα παθογόνα βακτήρια του γάλακτος που περιέχονται στο τυρί αλλά και τα ίδια τα τυριά υποβαθμίζονται ποιοτικά από την ανεπιθύμητη μικροχλωρίδα τους που προκαλεί φουσκώματα, σκάσιμο και αλλοιώσεις στη γεύση. Για να αποφευχθούν αυτοί οι κίνδυνοι το γάλα πρέπει να παστεριώνεται και κατόπιν να ψυχθεί στην θερμοκρασία όπου θα γίνει το πήξιμό του. Αν δεν θα τυροκομηθεί πρέπει να ψυχθεί στους 4 C και να διατηρηθεί σε δεξαμενές σ' αυτή τη θερμοκρασία.( Ζερφυρίδης Γ και Παππάς Χ..1983) Τελευταία όμως έρευνες σε ελληνικά τυριά από νωπό γάλα έδειξαν ότι τα γαλακτικά βακτήρια συμβάλλουν στην ωρίμαση των τυριών γιατί μπορούν να δρουν στα συστατικά του γάλακτος. Επιπλέον, διαθέτουν προβιοτικές ιδιότητες και είναι πιθανόν έτσι τα τυριά από νωπό γάλα να έχουν ευεργετική επίδραση στην υγεία του ανθρώπου. Στα προηγούμενα αξίζει να προστεθεί η ικανότητά τους να ασκούν αντιβακτηριακές δράσεις σε παθογόνα μικρόβια, όπως είναι η λιστέρια κ.λπ., που υποδηλώνει την πιθανότητα τα τυριά από νωπό γάλα να αυτοεξυγιαίνονται. 16

Σε ότι αφορά την θερμοκρασία παστεριώσεως, στο πίνακα 3 με τις περιληπτικές τεχνολογίες παρασκευής κεφαλοτυριού από τα τρία διαφορετικά είδη γάλατος, χρησιμοποιούνται τρεις θερμοκρασίες. Στο πρόβειο χρησιμοποιείται η παστερίωση στους 68 C για 10 min. Στο γίδινο κεφαλοτύρι της τεχνολογίας του πίνακα 3 χρησιμοποιήθηκε η υψηλή παστερίωση των 76 C για 20-30 min, επειδή στους στόχους της τεχνολογίας αυτής ήταν να συμπεριληφθούν οι ειδικές υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες του γίδινου γάλακτος, με αποτέλεσμα η απόδοση των τυριών να αυξηθεί κατά 1,5-2% και τα τυριά να πάρουν μία ιδιαίτερη γεύση και να αυξήσουν την θρεπτική τους αξία. Στο αγελαδινό γάλα χρησιμοποιήθηκε η σύντομη παστερίωση των 70 C για 16 sec. Καλλιέργειες εκκίνησης (SLAB)- συμπληρωματική καλλιέργεια. Μετά την παστερίωση το γάλα ψύχεται στους 35-36 C για να γίνει ο εμπλουτισμός του με τους απαραίτητους μικροοργανισμούς και κατάλληλα οξυγαλακτικά βακτήρια, γιατί όπως είναι γνωστό με τη παστερίωση καταστρέφεται, πέρα από τους παθογόνους μικροοργανισμούς, το μεγαλύτερο μέρος από τους υπόλοιπους μικροοργανισμούς μέρος των οποίων είναι τα αυτόχθονα οξυγαλακτικά βακτήρια. Τα βακτήρια που απαντώνται συχνότερα ανήκουν στα γένη Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc. Η επιλογή της καλλιέργεια εκκίνησης που προστίθεται κατά την τυροκόμηση, γίνεται σύμφωνα με τα παρακάτω κριτήρια: Ικανότητα παραγωγής οξέος σε γάλα (Fox & Wallace, 1997). Πρωτεολυτική δραστηριότητα και παραγωγή αρωματικών ενώσεων(cogan et al., 1997; Fox & Wallace, 1997). Αλληλεπίδραση και παραγωγή αντιβακτηριακών ουσιών(maisnier-patin et al., 1992). α) Αντιβακτηριακή δράση β) Βακτηριοσίνες Για το πρόβειο γάλα χρησιμοποιείται σαν οξυγαλακτική θερμόφιλη καλλιέργεια εκκίνησης ο Str. thermophilus και Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus σε ποσοστό 1% του τυροκομούμενου γάλακτος και σε σχέση 1:1(Caric,1993; Bεϊνόγλου και συνεργάτες,1983;baltadjieva et al., 1978;Veinoglou et al., 1981) ή σε ποσοστό 1,5% 17

(Κυριακόπουλος.1995).Ο συνδυασμός αυτός δίνει καλής ποιότητας τυριά που υπερέχουν οργανοληπτικά από τα τυριά που έχουν παραχθεί από το ίδιο γάλα, αλλά με την χρησιμοποίηση δύο άλλων συνδιασμών του Str. thermophilus 0,5%+Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus 0,25%+Lb. casei 0,25% και του Lc. lactis sussp. lactis 1,0%+Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus 0,25%+Lb.Casei 0,25% ( Anifantakis E. and Kaminarides S.,1983 ) Για το γίδινο προστίθεται η καλλιέργεια με τους ίδιους μικροοργανισμούς σε ποσοστό για μεν τον Str. thermophilus 0,4%, για δε τον Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus 0,2%.Η ίδια καλλιέργεια αλλά σε διαφορετικά ποσοστά 0,5% & 0,5% αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκε σε άλλο πρωτόκολλο παραγωγής, ενός είδους σκληρό τυρί σαν το κεφαλοτύρι, ως καλλιέργεια εκκίνησης «μάρτυρας», σε σχέση με άλλες καλλιέργειες εκκίνησης με προβιοτικά βακτήρια.(κalavrouzioti I. et al., 2005) Στο αγελαδινό κεφαλοτύρι χρησιμοποιούνται οι ίδιοι μικροοργανισμοί αλλά σε αναλογία 0,9% και 0,6% αντίστοιχα. Στη τεχνολογία του κεφαλοτυριού από αγελαδινό γάλα, που δίνεται στο διάγραμμα 1, προτείνονται οι καλλιέργειες Str. thermophilus 0,8% +Lb. casei 0,2% ή Str. thermophilus 0,4%+Lc. lactis subsp.diacetilactis 0,4%+Ent.durans 0,2% (Ζερφυρίδης Γ., και Παππάς Χ.,1983; Ζερφυρίδης Γ. 1997).Οι παραπάνω καλλιέργειες θεωρούνται κατάλληλες γενικά για την παρασκευή Κεφαλοτυριού διότι μειώνουν το p Η κατά τα πρώτα στάδια παρασκευής σε επίπεδα χαμηλότερα του 5, πράγμα που θεωρείται απαραίτητο για την αναχαίτιση της ανάπτυξης των μικροοργανισμών που δημιουργούν σφάλματα ή προβλήματα στην υγεία του ανθρώπου και δίνουν παρόμοια οργανοληπτικά χαρακτηριστικά στο τελικό προιόν (Λιτοπούλου Τζανετάκη E. 1993) Καλλιέργειες εκκίνησης με Lc.lactis, Lc.lactis subsp diacetylactis, Str.thermophilus, διασφαλίζουν κυρίως την οξίνιση του προϊόντος, ενώ ο Lb. casei προσδίδει κυρίως επιθυμητά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, μέσω της ωρίμανσης του τυριού (Litopoulou Tzanetaki, 1990). Η γαλακτική μικροχλωρίδα είναι η επικρατέστερη σε όλα τα στάδια της παρασκευής και ωρίμανσης του κεφαλοτυριού και αποτελείται από την καλλιέργεια εκκίνησης και τα γαλακτικά βακτήρια που δεν ανήκουν στην καλλιέργεια καλλιέργεια εκκίνησης (NSLAB). Χαρακτηρίζονται ως «δευτερεύουσα»(αυτόχθονη) 18

μικροχλωρίδα και απαντώνται σε υψηλούς πληθυσμούς σε ένα πλήθος παραδοσιακών και τυποποιημένων τυριών. Παίζουν καθοριστικό ρόλο στη διαμόρφωση των γευστικών χαρακτηριστικών των τυριών από νωπό γάλα και προέρχονται από το περιβάλλον του στάβλου και του τυροκομείου. Τα μικρόβια αυτά είναι ποσοτικά και ποιοτικά πλουσιότερα στα τυριά από νωπό γάλα. Πολλές φορές επιβιώνουν και μετά την παστερίωση ή εισάγονται στο γάλα τυροκόμησης ή στο πήγμα κατά τη διάρκεια της παρασκευής του τυριού. Τα NSLAB είναι κυρίως μεσόφιλοι λακτοβάκιλλοι και πεδιόκοκκοι, δεν αναπτύσονται καλά στο γάλα και δεν συνεισφέρουν πολύ στην παραγωγή οξέος στο τυρί(cogan et al., 1997). Από τυριά έχουν απομονωθεί και συναντώνται συχνά Lb. Casei, Lb. paracasei, Lb. plantarum, Lb. rhamnosus και Lb. curvatus (Jordan & Cogan, 1993; Coppola et al., 1997; Fitzsimons, Cogan, Condon, & Beresford, 1999). Από τους πεδιόκοκκους συχνά απομονώνονται οι Pe. acidilactici και Pe.pentosaceus. Στα πρώτα στάδια παραγωγής των τυριών παρατηρείται αυξημένος πληθυσμός της καλλιέργειας εκκίνησης αλλά, κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης, την θέση της παίρνει η δευτερεύουσα μικροχλωρίδα (λακτοβάκιλλοι και εντερόκοκκοι). Βέβαια, η σύνθεση της δευτερεύουσας μικροχλωρίδας εξαρτάται ουσιαστικά από τον τύπο του κάθε τυριού καθώς και από την ηλικία του και μπορεί να αποτελείται από διάφορα είδη γαλακτικών βακτηρίων. Τα στελέχη αυτά με τη πρωτεολυτική και πιθανόν λιπολυτική τους δράση διαμορφώνουν τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τυριού (Williams και Banks, 1997). Γαλακτικά βακτήρια από τη δευτερεύουσα μικροχλωρίδα ενός τυριού μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως συμπληρωματική καλλιέργεια. Η συμπληρωματική καλλιέργεια χρησιμοποιείται για οποιονδήποτε άλλο σκοπό, εκτός της παραγωγής οξέος. Η συμπληρωματική καλλιέργεια μπορεί, λόγω των πρωτεολυτικών και λιπολυτικών της ιδιοτήτων, να διαμορφώσει το άρωμα και τη γεύση του τυριού ή και να επιταχύνει την ωρίμαση ενώ, λόγω των βιοτεχνολογικών της ιδιοτήτων, να βελτιώσει τη βακτηριολογική και οργανοληπτική κατάσταση του τυριού ή να αποτελέσει λόγο για την απόκτηση ενός προϊόντος ωφέλιμου για την υγεία του ανθρώπου (π.χ. προβιοτικό προϊόν), όπως προαναφέρθηκε. 19

Σε μελέτες που έγιναν στο κεφαλοτύρι, για τα γαλακτικά βακτήρια που δεν ανήκουν στην καλλιέργεια εκκίνησης (ΝSLAB) οι λακτοβάκιλλοι και οι εντερόκοκκοι επικρατούν σε σχέση με τα άλλα γένη των γαλακτικών βακτηρίων ενώ τα Leuconostoc, ο Str. thermophilus και οι λακτόκοκκοι εξαφανίζονται στα πρώτα στάδια της ωρίμασης. Ο Ent. faecium είναι το πιο συχνά εμφανιζόμενο είδος ανάμεσα στους εντεροκόκκους και αντιπροσωπεύει το 35,5% των συνολικών απομονώσεων σε τυρί ηλικίας 4 μηνών. Επίσης, στο Κεφαλοτύρι απαντώνται και ο Ent. durans και Ent. faecalis σε μικρότερα ποσοστά. Οι Lb. plantarum και Lb. casei subsp casei αντιστοιχούν στο 18,4 και 15,8% του συνολικού πληθυσμού των γαλακτικών βακτηρίων σε τυρί ηλικίας 4 μηνών και αποτελούν τα επικρατέστερα είδη από τους λακτοβακίλλους. Άλλα είδη λακτοβακίλλων που βρίσκονται στο τυρί είναι οι Lb. buchneri, Lb. brevis, Lb. casei subsp rhamnosus Lb. cellobiosus και Lb. casei subsp alactosus. (Litopoulou-Tzanetaki, 1990). Η καλλιέργεια μπαίνει στον τυρολέβητα όταν αυτός αρχίζει να γεμίζει με γάλα και καλό θα είναι η πήξη του γάλακτος με πυτιά να γίνεται περίπου 35 min μετά την προσθήκη της καλλιέργειας.( (Bεϊνόγλου και συνεργάτες,1983; Baltadjieva et al., 1978; Veinoglou et al., 1981). Στο χρονικό αυτό διάστημα (ωρίμανση του γάλακτος με την καλλιέργεια) προσαρμόζεται η καλλιέργεια στο νέο της περιβάλλον και αρχίζει να αναπτύσσεται. Στην περίπτωση παραγωγής Κεφαλοτυριού από αγελαδινό γάλα, προτείνεται η προσθήκη διάλυματος 40% χλωριούχου ασβεστίου (πίνακας 3) για να βοηθηθεί, η δράση της πυτιάς και να ληφθεί πιο καλό τυρόπηγμα που να μη τρίβεται και διαλύματος χλωροφύλλης, για να αποφευχθεί η κίτρινη απόχρωση του τυριού. Πολλές φορές επίσης προστίθεται λιπάση, για να επιταχυνθεί η ωρίμανση των τυριών και να αυξηθεί η πικάντικη γεύση. Πήξη του γάλακτος. Παλαιότερα για το σκοπό αυτό, οι τυροκόμοι χρησιμοποιούσαν εγχώρια πυτιά από ήνυστρα αρνιών και κατσικιών που δεν έχουν απογαλακτιστεί, που παρασκεύαζαν μόνοι τους, κατά τρόπο εμπειρικό. Σήμερα η πυτιά αυτή αντικαθίστανται όλο και περισσότερο από βιομηχανοποιημένα με μορφή σκόνης ή υγρά προϊόντα που εισάγονται από το εξωτερικό. Σε έρευνα στο Εργαστήριο της Γαλακτοκομίας της Γεωπονικής Σχολής Αθηνών, διαπιστώθηκε η συμβολή της 20

πυτιάς αρνιών στην διαμόρφωση πιπεράτης γεύσεως, πού προτιμάται από μεγάλη μερίδα του Ελληνικού καταναλωτικού κοινού ( Anifantakis Ε, 1976). Η ποσότητα της πυτιάς πού χρησιμοποιείται είναι τόση, ώστε το πήγμα να είναι έτοιμο για διαίρεση μετά 35 min. Ανεπαρκής ανάμιξη οδηγεί σε τυριά των οποίων η υφή είναι ανομοιογενής, οπότε δυσχεραίνεται η αποστράγγιση ή τα τυριά θρυμματίζονται εύκολα. Μετά την προσθήκη της πυτιάς, το γάλα αφήνεται σε ηρεμία για να γίνει η πήξη κάτω από συνθήκες πλήρους ακινησίας. Ο χρόνος πρόπηξης που πρέπει να είναι περίπου 8 min. H πρόπηξη ή αρχή της πήξης γίνεται αισθητή με την αύξηση του ιξώδους του γάλατος. Ο χρόνος αυτός διαπιστώνεται με τους εξής τρόπους: α) Εμφάνιση κόκκων πήγματος καζεΐνης στη σπάτουλα με μαύρο χρώμα β) Παραμένει σε κατακόρυφο θέση η εισαγωγή σπίρτου, στην επιφάνεια του γάλατος γ) Σταγόνα νερού διατηρεί το σχήμα της όταν τοποθετείται στην επιφάνεια του γάλατος δ) Διατήρηση φυσσαλλίδων που σχηματίζονται όταν αναταραχθεί το γάλα. Καθώς προχωρεί ο μηχανισμός τής πήξης, το γάλα από ιξώδες γίνεται στερεότερο και τελικά παίρνει τη μορφή του τυροπήγματος με τη χαρακτηριστική ζελατινώδη μαλακή υφή. Ο μηχανισμός τής πήξεως του γάλακτος γίνεται σε δύο φάσεις, μία ενζυματική και μία μή ενζυματική, που είναι ανεξάρτητες. Στην ενζυματική φάση της πήξεως γίνεται η υδρόλυση της κ-καζεΐνης στη θέση 105-106 του δεσμού φαινυλαλανίνη-μεθιονίνη και σχηματισμός της πάρα-κ-καζεΐνης(αδιάλυτη) και του γλυκομακροπεπτιδίου (διαλυτό). Έτσι παύει η προστατευτικότητα του μικελλίου της καζεΐνης από την κ- καζεΐνη, η οποία αδιάσπαστη προφυλάσσει από την κατακρήμνιση, τα ευαίσθητα στο ασβέστιο κλάσματα της καζεΐνης. Η διάρκεια της φάσης αυτής είναι λίγα λεπτά και η ταχύτητα της υδρόλυσης είναι υψηλή. Κατά την δεύτερη φάση, τη μη ενζυματική, επέρχεται η κροκίδωση των μικελλών παρουσία ιόντων ασβεστίου. Σ' αυτό το λόγο οφείλεται η προσθήκη χλωριούχου ασβεστίου στο παστεριωμένο γάλα για την αποκατάσταση της μειώσεως της περιεκτικότητας του σε ιόντα ασβεστίου. 21

Ο χρόνος της τελικής πήξης κατά την τυροκόμηση του κεφαλοτυριού πρέπει να είναι 35 min και υπολογίζεται από την στιγμή της προσθήκης της πυτιάς μέχρι εκείνης όπου το τυρόπηγμα που προκύπτει προσλαμβάνει την επιθυμητή υφή. Ο χρόνος αυτός αποτελεί αποφασιστικό παράγοντα για την μετέπειτα ποιότητα του τυριού. Ο χρόνος αυτός διαπιστώνεται από τα εξής εμπειρικά κριτήρια: α) Καλός αποχωρισμός της επιφάνειας του τυροπήγματος από τα τοιχώματα β) Η επιφάνεια διχασθέντος πήγματος, με την εισαγωγή και ανασήκωση του δείκτου του χεριού, να είναι λεία και συμπαγής, το δε τυρόγαλα που σχηματίζεται να είναι διαυγές γ) Καλή σχετική αντίσταση του τυροπήγματος όταν πιέζεται αυτό με ανεστραμένη παλάμη δ) Να μη. προσκολλούνται τεμάχια τυροπήγματος στην παλάμη κατά την πίεση του τυροπήγματος.(ζυγούρης 1952 ; Καμιναρίδης Σ.1983) Διαίρεση του τυροπήγματος. Μετά την πήξη το τυρόπηγμα διαιρείται με τυροκόπτη σε κόκκους μεγέθους καλαμποκιού, ή περίπου 0.5 cm διαμέτρου. Περισσότερη διαίρεση έχει μεγαλύτερη διαφυγή λίπους στο τυρόγαλα και πιο γρήγορη αποβολή του τυρογάλακτος. Έτσι πρέπει να αποφεύγεται η υπερβολική διαίρεση και κυρίως όταν το γάλα έχει χαμηλή λιποπεριεκτικότητα και υψηλή οξύτητα. (Ζυγούρης 1952; Ζερφυρίδης Γ. 1997) Αναθέρμανση. Η αναθέρμανση γίνεται υπό συνεχή ανάδευση στους 43-47 C σε χρονικό διάστημα 15 μέχρι 20 min. H αναθέρμανση γίνεται με βραδύ ρυθμό στην αρχή που επιταχύνεται προοδευτικά αργότερα. Ο καθορισμός της θερμοκρασίας ορίζεται από το είδος του γάλατος και την ποιότητα του. Το πρόβειο γάλα αναθερμαίνεται στους 44 C ενώ το αγελαδινό κατά 2-3 C υψηλότερα για να επιτευχθεί η ενδεδειγμένη υφή των κόκκων. Επίσης εάν η οξύτητα του τυρογάλακτος κατά τη διαίρεση, είναι πάνω από την κανονική, τότε επιβάλλεται ταχύτερη αναθέρμανση και υψηλότερες θερμοκρασίες. Αν αντίθετα η οξύτητα είναι ανεπαρκής, τότε επιμηκύνεται ο χρόνος θερμάνσεως ενώ η θερμοκρασία τελικά διατηρείται σε χαμηλότερο επίπεδο της κανονικής. Γενικά παρατηρούμε ότι η αναθέρμανση θα πρέπει να διεξάγεται με βραδύ ρυθμό, επειδή αν γίνει απότομα, τότε οι κόκκοι του τυροπήγματος σκληραίνονται στην επιφάνεια και δυσχεραίνεται η έξοδος του τυρογάλακτος, πράγμα που δημιουργεί κινδύνους κατά την ωρίμανση. 22

Μετά το τέλος της αναθέρμανσης συνεχίζεται η ανάδευση του τυροπήγματος για 10 λεπτά ακόμα έτσι ώστε οι κόκκοι να αποκτήσουν την επιθυμητή σκληρότητα και υφή. Σε περίπτωση που η θερμοκρασία φθάσει το ανώτατο όριο, περάσουν τα 10 λεπτά της ανάδευσης και η σκληρότητα του τυροπήγματος δεν είναι ικανοποιητική, τότε συνεχίζεται η ανάδευση, ώστε με τη βοήθεια της αυξανόμενης οξύτητας, να αποκτήσει την σκληρότητα και χαρακτηριστική υφή. Με τη Βουλγαρική τεχνολογία, η βασική διαφορά από την Ελληνική, αφαιρείται το 50% τυρόγαλακτος και έπειτα, μετά προστίθεται 12% αποστειρωμένη άλμη 12 Bé ώστε να αλατιστούν οι κόκκοι. Με την ίδια θερμοκρασία που έχει το τυρόγαλα ακολουθείται ανάδευση 10 min. Μετά ακολουθεί ηρεμία λίγων λεπτών για να κατακαθήσει το πήγμα στον πυθμένα του τυρολέβητα και να ενωθούν οι κόκκοι του, ώστε να αποτελέσουν ενιαία μάζα. Για τον ίδιο σκοπό ασκείται προσεκτικά ελαφρά πίεση με τα χέρια. (Bεινόγλου και συνεργάτες,1983; Baltadjieva et al., 1978; Veinoglou et al., 1981) Εξαγωγή τυροπήγματος. Η βυθισμένη στον πυθμένα του τυρολέβητα τυρομάζα, κόβεται σε τεμάχια και μεταφέρεται σε καλούπια, στα οποία προηγουμένως έχει απλωθεί από ένα τυρόπανο(τσαντίλα). Τα καλούπια είναι μεταλλικά ανοξείδωτα, κυκλικού σχήματος, χωρίς πυθμένα, διαμέτρου 25-35 cm και ύψους 7-9 cm. Κάθε καλούπι συνοδεύεται με μία ξύλινη βάση και ένα ξύλινο δίσκο τάκο Ο τελευταίος έχει μικρότερη διάμετρο από εκείνη του καλουπιού, για να είναι δυνατή η άσκηση της πιέσεως στην τυρομάζα. Η ποσότητα τυρομάζας που τοποθετείται σε κάθε καλούπι ρυθμίζεται έτσι, ώστε το πάχος της να εξέχει λίγο από τα χείλη του καλουπιού. Αφού προστεθεί το τυρί στα καλούπια πιέζεται ισχυρά με τα χέρια η τυρομάζα για να εξέλθει το τυρόγαλα που πλεονάζει και για να προσκοληθούν καλά οι κόκκοι. Ταυτόχρονα σφίγγεται το τυρί που κρατείται ισχυρά από τα άκρα του τυροπάνου. Μετά εξάγεται από το καλούπι και τοποθετείται ανεστραμμένα στην τυροτράπεζα για να ζυμωθεί. Τοποθετείται πάλι στο καλούπι και πιέζεται με τα χέρια για να λάβει οριστικά το σχήμα του. (Καμιναρίδης Σ.1983) Πίεση. Ανάλογα με το είδος του πιεστηρίου, τα καλούπια μπαίνουν σ' αυτό ανά ένα, ανά δύο ή και περισσότερα χωριζόμενα μεταξύ τους από σανιδένιο γύρο που η 23

διάμετρός του είναι ίδια με τη διάμετρο του καλουπιού. Το σανίδι αυτό μπορεί και να παραληφθεί αλλά το σχήμα του τυριού στα χείλη των επιπέδων επιφανειών δεν θα είναι καλό. Η πίεση στην αρχή για 15 min γίνεται ελαφρά με προσοχή ώστε να μη χαλάσει το σχήμα του τυριού και δημιουργηθούν προεξοχές στα χείλη των επιπέδων επιφανειών του οπότε θα χρειασθεί να αποκοπούν με κοφτερό μαχαιρίδιο. Βγαίνουν τα τυριά από το πιεστήριο, γίνεται αλλαγή στις τσαντίλες από άλλες βρεγμένες και στυμένες και ξαναμπαίνουν στο πιεστήριο σε μεγαλύτερη πίεση. Τα κεφάλια που ήταν επάνω, κατά την αλλαγή τσαντίλας μπαίνουν από κάτω και το αντίθετο. Οι πρώτες τσαντίλες πλένονται με κρύο νερό και ετοιμάζονται για την επόμενη αλλαγή μετά 30 min. Οι αλλαγές στις τσαντίλες γίνονται κατόπιν ανά ώρα και η τελευταία αλλαγή είναι με στεγνή τσαντίλα. Η πίεση αυξάνεται βαθμηδόν ώστε στο τέλος της πιέσεως να φθάσει στο δωδεκαπλάσιο βάρος του τυριού. Η πίεση και το στράγγισμα του τυριού γίνονται στην κοινή θερμοκρασία που αν είναι 18-20 C διαρκούν περίπου 3 ώρες. Σε υψηλότερες θερμοκρασίες ή όταν το pη του τυριού είναι πολύ χαμηλό μπορεί η διάρκεια τους να είναι λιγότερη και σε αντίθετη περίπτωση περισσότερη.(zερφυρίδης Γ.1997) Μετά την πίεση τους τα τυριά βγαίνουν από τίς τσαντίλες ξαναμπαίνουν στα καλούπια και μεταφέρονται σε αποθήκη 14-16 C μέχρι την επομένη οπότε πρέπει να έχουν ρη 4.8 περίπου ή εν πάσει περιπτώσει κάτω από 5,0, διαφορετικά μένουν στα καλούπια άλλη μία μέρα. Αλάτισμα. Το πατροπαράδοτο κεφαλοτύρι ήταν ένα πολύ αλμυρό και σκληρό τυρί που καταναλωνόταν και σαν επιτραπέζιο. Σήμερα το αλάτι του επιτραπέζιου κεφαλοτυριού θεωρείται σαν ικανοποιητικό όταν είναι περίπου 4-5% επί τυριού ως έχει και αντιστοιχεί σε συντελεστή άλατος 10-12% δηλαδή αλάτι επί τοις εκατό της υγρής φάσεως του τυριού. Όταν τα όρια αυτά ξεπερασθούν το τυρί γίνεται πολύ αλμυρό αλλά διατηρείται περισσότερο, αφού σε τέτοιο υψηλό συντελεστή άλατος μόνο λίγοι ανεπιθύμητοι μικροοργανισμοι αναπτύσσονται. Τα κεφαλοτύρια της αγοράς ξεπερνάνε το παραπάνω όριο κατά το μεγαλύτερο τους ποσοστό που παλαιότερα ήταν υψηλότερο. 24

Για να πάρει το νωπό κεφαλοτύρι το αλάτι του, βγαίνει από το καλούπι εφ όσον έχει σταθερότητα, διαφορετικά μαζί με το καλούπι μπαίνει σε άλμη 18 Bé σε θερμοκρασία 14-16 C και ρη 4,8 μέχρι την επομένη. Η ρύθμιση του ρη είναι απαραίτητη για να μην αρχίση γρήγορα η άνοδος του ρη αργότερα με τα ξηρά αλατίσματα οπότε δημιουργείται ευνοϊκό περιβάλλον για την ανάπτυξη παθογόνων και επιβλαβών για την ποιότητα του τυριού μικροοργανισμών. Εδώ υπάρχει ένα κρίσιμο σημείο για την περαιτέρω εξέλιξη του τυριού και θα πρέπει όταν. το τυρί ξεπεράσει το οριακό ρη 5.2 για τα σκληρά τυριά, να έχει απορροφήσει αρκετό αλάτι ώστε να περιορίζεται η ανάπτυξη ανεπιθύμητων μικροοργανισμών. Μετά την εξαγωγή των τυριών από την άλμη αρχίζουν τα ξηρά αλατίσματα σε θερμοκρασία χώρου 14-16 C και σχετική υγρασία 85% έτσι ώστε να μη σκάσουν τα τυριά αλλά και να μη διευκολύνεται η ανάπτυξη των μυκήτων στην επιφάνεια των τυριών. Το αλάτι είναι χοντρόκκοκο σε μέγεθος ρυζιού το οποίο λιώνει μέχρι την επόμενη στην επάνω επιφάνεια του τυριού. Τότε τρίβεται το λιωμένο αλάτι στην επιφάνεια και τα πλάγια, αναστρέφεται το τυρί και αλατίζεται από την άλλη επιφάνεια. Αυτό επαναλαμβάνεται κάθε μέρα 10-15 φορές. Τα επόμενα 10-15 αλατίσματα γίνονται μέρα παρά μέρα και εφ όσον το τυρί δεν πήρε το επιθυμητό αλάτι τα υπόλοιπα αλατίσματα γίνονται ανά τριήμερο. (Ζερφυρίδης Γ.1997) Στην πράξη πολλές φορές για εξοικονόμηση χρόνου, χώρου και εργατικών, το αλάτισμα γίνεται σε συντομότερο χρονικό διάστημα μόνο με ξηρά αλατίσματα ή σχεδόν αποκλειστικά στην άλμη και μόνο λίγα ξηρά αλατίσματα για να διαμορφωθεί καλή και σκληρή επιδερμίδα στο τυρί. Στις τεχνολογίες του πίνακα 3, για την παραγωγή κεφαλοτυριού από πρόβειο και αγελαδινό γάλα χρησιμοποιείται ο συνδιασμός αλατίσματος με άλμη(20 Bé για 24 h ) και 2-3 ξηρών αλατισμάτων ενώ στο γίδινο έχουμε μόνο 2 ξηρά αλατίσματα (Bεϊνόγλου και συνεργάτες,1983; Baltadjieva et al., 1978; Veinoglou et al., 1981). Ωρίμανση των τυριών: Η ωρίμανση των τυριών γίνεται σε θαλάμους με θερμοκρασία 14 C και σχετική υγρασία 85-90%. Το επίπεδο αυτό της σχετικής υγρασίας είναι τέτοιο, ώστε να μην προκαλείται υπερβολική εξάτμιση και συνεπώς κίνδυνος 25

ξηράνσεως ή δημιουργίας ρωγμών στα τυριά. Το στάδιο αυτό είναι επίσης πολύ κρίσιμο διότι καθορίζει και αυτό σε μεγάλο βαθμό το είδος του τυριού και πραγματοποιούνται διεργασίες που προκαλούνται από την πυτιά, από μικροοργανισμούς της οξυγαλακτικής καλλιέργειας(slab) και εκείνων που επιβιώνουν μετά την παστερίωση του γάλατος(nslab) καθώς και από τα ένζυμα που προέρχονται από τους μικροοργανισμούς, που παραμένουν στο γάλα ή που προστίθενται στο γάλα. Η πρωτεόλυση είναι το κύριο γεγονός στην ωρίμαση του τυριού. Επηρεάζει άμεσα και έμμεσα τη διαμόρφωση του οργανοληπτικού χαρακτήρα του. Τα προϊόντα της πρωτεόλυσης, πεπτίδια και αμινοξέα, συνεισφέρουν στη γεύση και στο άρωμα ενός τυριού. Τα προϊόντα αυτά είτε παίζουν άμεσο ρόλο στην διαμόρφωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του τυριού είτε λειτουργούν ως πρόδρομες ουσίες για την παραγωγή αρωματικών ενώσεων. Κλειδί για μια αποδεκτή γεύση και άρωμα είναι μια ισορροπημένη διάσπαση των καζεϊνών σε μικρότερα πεπτίδια και αμινοξέα. Υπάρχουν τέσσερεις κατηγορίες ενζύμων που λειτουργούν ως πρωτεολυτικοί παράγοντες για την ωρίμαση ενός τυριού. Οι κατηγορίες αυτές περιλαμβάνουν: α. ενδογενή ένζυμα του γάλακτος, β. ένζυμα από τη πυτιά (χυμοσίνη), γ. ένζυμα από τα βακτήρια εκκίνησης και της συμπληρωματικής καλλιέργειας και δ. ένζυμα από την δευτερεύουσα μικροχλωρίδα (Fox, 1989). Κατά την ωρίμαση ενός τυριού, υπάρχουν δύο φάσεις πρωτεόλυσης, η πρωτογενής και η δευτερογενής πρωτεόλυση. Η πρώτη φάση της πρωτεόλυσης αφορά την υδρόλυση των καζεϊνών αs- και β- καζεΐνης κυρίως από τα ενδογενή ένζυμα του γάλακτος και τη χυμοσίνη. Βέβαια, και οι πρωτεϊνάσες της καλλιέργειας και των NSLAB παίρνουν μέρος στην αποικοδόμηση των καζεϊνών (Fox και McSweeney, 1996). Υπεύθυνα ένζυμα για την αποικοδόμηση της αs-καζεΐνης είναι η όξινη πρωτεάση του γάλακτος, η χυμοσίνη και τα ένζυμα των βακτηρίων ενώ για την υδρόλυση της β-καζεΐνης, είναι η πλασμίνη και τα μικροβιακά ένζυμα. Η εκατοστιαία αναλογία του υδατοδιαλυτού αζώτου πρωτεινών κυρίως που υδρολύθηκαν - επί του ολικού αζώτου, ονομάζεται συντελεστής ωριμάνσης και δίνει το μέτρο της ωριμότητας του τυριού. Στο παρακάτω σχήμα 1 δίδονται οι καμπύλες που δείχνουν το ρυθμό αυξήσεως του συντελεστή, κατά την διάρκεια της ωριμάνσης 26

ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗΣ ΩΡΙΜΑΝΣΗΣ Αφοι Αβραμούλη Ο.Ε. Αρ. Κουπονιού: 88279408-01-000122 του αγελαδινού κεφαλοτυριού που παρασκευάσθηκε με την Βουλγαρική και Ελληνική τεχνολογία στα Εργαστήρια Γαλακτοκομίας της Γεωπονικής Σχολής Αθηνών και στο Ινστιτούτο Τεχνολογίας Τροφίμων Plovdiv της Βουλγαρίας (Veinoglou et al., 1981). 40 35 30 25 20 15 10 5 1 2 3 4 0 5 10 20 30 60 ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΩΡΙΜΑΝΣΗΣ ΗΜΕΡΕΣ Σχήμα 1. Μεταβολές του συντελεστή ωρίμανσης στα τυριά που παράγονται με την Βουλγαρική τεχνολογία στη Βουγλαρία (1) και στην Ελλάδα (2) και με την Ελληνική τεχνολογία στη Βουλγαρία (3) και στην Ελλάδα (4). (Veinoglou et al., 1981). Η δεύτερη φάση της πρωτεόλυσης περιλαμβάνει την παραγωγή πεπτιδίων και ελεύθερων αμινοξέων και την περαιτέρω αποικοδόμηση τους. Τα αμινοξέα είναι υποστρώματα για αποκαρβοξυλίωση, απαμίνωση, αναγωγή και υδρογόνωση, με αποτέλεσμα την παραγωγή αρωματικών ενώσεων. Τα πρωτεολυτικά ένζυμα των γαλακτικών βακτηρίων, τα οποία είναι υπεύθυνα για την δεύτερη φάση της πρωτεόλυσης (Rank et al., 1985). Ο συντελεστής ωριμάνσεως που αναφέραμε παραπάνω, δίνει μεν το ρυθμό υδρόλυσης της καζεινης όχι όμως το βάθος και την σειρά των διασπάσεων που πραγματοποιούνται. Η περιεκτικότητα σε ελεύθερα αμινοξέα των κεφαλοτυριών δίνει πιο κατατοπιστικά δεδομένα για την ωριμότητα και την ποιότητα του τυριού. Η λιπόλυση (υδρόλυση του λίπους) πραγματοποιείται κατά την ωρίμανση του κεφαλοτυριού κατά πολύ μικρότερο βαθμό από ότι η περίπτωση των πρωτεινών. Η λιπόλυση του γάλακτος συμβαίνει είτε λόγω της δράσης της ενδογενούς λιπάσης του γάλακτος, είτε λόγω της δράσης των μικροβιακών λιπασών, είτε από ενζυματικά παρασκευάσματα -λιπάση- που προστίθεται μετά την παστερίωση. Η λιπόλυση επηρεάζεται άμεσα από το p H και 27

p H Αφοι Αβραμούλη Ο.Ε. Αρ. Κουπονιού: 88279408-01-000122 είναι πιο αυξημένη στα τυριά μεγαλύτερης ηλικίας. Επίσης είναι μεγαλύτερη όταν το γάλα για τυροκόμηση είναι απαστερίωτο παρά παστεριωμένο.(zερφυρίδης Γ.1997). Η λιπόλυση διεγείρεται από την ανακίνηση, το σχηματισμό αφρού του γάλακτος και τις απότομες αλλαγές θερμοκρασίας. Αξίζει να σημειωθεί ότι η συνολική ποσότητα των ελεύθερων λιπαρών οξέων δεν αντιπροσωπεύει πάντα το βαθμό υδρόλυσης του λίπους σε ένα τυρί. Μόνο τα λιπαρά οξέα με αριθμό με C 6 και μεγαλύτερο προέρχονται από την λιπόλυση. Τα υπόλοιπα μπορεί να προέρχονται είτε και από το μεταβολισμό της λακτόζης και του γαλακτικού οξέος όπως το βουτυρικό, φορμικό, προπιονικό και οξικό οξύ, είτε από την αποικοδόμηση των αμινοξέων όπως το προπιονικό, ισοβουτυρικό, ισοβαλερικό, βενζοϊκό και φαινολοξικό οξύ. (Choisy et al., 1997). Η λακτόζη διασπάται σε γλυκόζη και γαλακτόζη λίγες μέρες μετά την παρασκευή του τυριού. Η γλυκόζη ζυμώνεται γρήγορα σε γαλακτικό οξύ από τους μικροοργανισμούς ενώ η γαλακτόζη ζυμώνεται με σημαντική καθυστέρηση. Το γαλακτικό οξύ που προκύπτει μετατρέπεται σε πτητικά οξέα, αλκοόλη, διάφορα άλατα, προπιονικό, οξικό, διοξείδιο του άνθρακα και σε άλλες ενώσεις. 5,3 5,2 5,1 5 4,9 4,8 4,7 4,6 4,5 4,4 5 15 30 90 ΗΜΕΡΕΣ Α Β Γ Σχήμα 2: p H κεφαλοτυριού παρασκευασμένο από διαφορετικές καλλιέργειες εκκίνησης(anifantakis E.and. Kaminaridis S., 1987) Α:Str. lactis + Lb.bulgaricus +L b. casei. Β: Str. thermophilus+ Lb. bulgaricus + Lb. casei, Γ: Str. thermophilus + Lb. bulgaricus Κατά την ωρίμανση το κεφαλοτύρι χάνει σημαντικό μέρος της υγρασίας του και κατά συνέπεια και του βάρους του. Στην αρχή της ωριμάνσεως η υγρασία του μειώνεται με ταχύτερο ρυθμό απ' ότι προς το τέλος σύμφωνα με το σχήμα 3 στο πρόβειο κεφαλοτύρι (Βεϊνόγλου και συνεργάτες., 1982). Αυτό αποδίδεται στα ξηρά αλατίσματα που γίνονται στην αρχή και τα οποία συντελούν στην ταχύτερη αποβολή υγρασίας από τη μάζα του. Το αλάτι που προστίθεται είναι η αιτία που η καμπύλη, 28

που δίδεται στο ίδιο σχήμα, της αποδόσεως αποκλίνει από εκείνη της υγρασίας. Μετά όμως 30 ημερών ωρίμανση, οπότε τα αλατίσματα έχουν τελειώσει, οι δύο καμπύλες ακολουθούν σχεδόν παράλληλη πορεία. 46 44 42 % 40 38 36 YΓΡΑΣΙΑ ΑΠΟΔΟΣΗ 34 4 15 30 ΗΜΕΡΕΣ Σχήμα 3: Διακύμανση της υγρασίας και της απόδοσης, του πρόβειου Κεφαλοτυριού κατά τη διάρκεια της ωριμάνσεως του. (Βεϊνόγλου και συνεργάτες., 1982). Η απόδοση ενός πρόβειου γάλακτος σε ώριμο τυρί κεφαλοτύρι εξαρτάται από τη χημική του σύνθεση, από την τεχνολογία που ακολουθήθηκε στην παρασκευή του και από το χρόνο της ωρίμασης του. Ετσι από 100 κιλά ενός κανονικού γάλακτος αναμένεται να λάβουμε 15-15,5 κιλά ώριμο επιτραπέζιο τυρί κεφαλοτύρι και 6-7 κιλά νωπή μυζήθρα.( Κυριακόπουλος Π.1995). Από 100 Kg γίδινου γάλατος τυποποιημένου σε 3,75% λίπος λαμβάνεται 9,8 Kg ώριμο κεφαλοτύρι με υγρασία 41% (Baltadjieva et al., 1978). Η απόδοση σε ώριμο αγελαδινό κεφαλοτύρι με υγρασία 40% βρέθηκε 9,9% για την Ελληνική τεχνολογία (Βεϊνόγλου και άλλοι συνεργάτες., 1982). Επίσης κατά τη διάρκεια της ωριμάνσεως διαπιστώνεται συνεχώς αύξηση της περιεκτικότητας των τυριών σε NaCl. Αυτό οφείλεται στην αρχή της ωριμάνσεως, στο αλάτι που κινείται προς το κέντρο των τυριών απ' τα επιφανειακά αλατίσματα και στη μείωση της υγρασίας κατά την διάρκεια της ωριμάνσεώς του. Το αλάτισμα συντελεί στη βελτίωση της υφής, της γεύσεως, στην επιμήκυνση του χρόνου συντήρησης, την σκλήρυνση της επιφάνειας με την δημιουργία επιδερμίδας, την διευκόλυνση εξόδου της υγρασίας, την ανάσχεση του πολλαπλασιασμού των ανεπιθύμητων μικροοργανισμών, της δραστηριοποίησης των πρωτεϊνολυτικών ιδιοτήτων της πυτιάς, της απελευθέρωσης ενζύμων από τα νεκρά βακτήρια, της μερικής διαλυτοποίησης των πρωτεϊνών κλπ. To ph και ο συντελεστής άλατος (ΣΑ) που είναι δύο από τις καίριες παραμέτρους του τυριού για την σωστή πορεία ωριμάνσης και διατηρήσής του θα πρέπει για το κεφαλοτύρι να εχουν την εξέλιξη που δίνει ο πίνακας 4. 29

ΠΙΝΑΚΑΣ 4 Φάση επεξεργασίας ή ηλικία ph ΣΑ Γάλα 6,6 Προ πήξης 6,45 Τέλος αναθέρμανσης 6,2 1 ης ημέρας 4,8 2 ης ημέρας 5,1 15 ημερών 5,3 5 30 ημερών 5,6 8,5 3 μηνών 5,5 11,5 6 μηνών 5,5 12 Πίνακας 4: Ενδεικτικές τιμές ph και συντελεστή άλατος Κεφαλοτυριού κατά την ωρίμανση και διατήρησή του (Ζερφυρίδης Γ.1997) Στο θάλαμο της ωριμάνσεως πλένονται από καιρού σε καιρό τα τυριά με αραιή άλμη και τρίβονται συγχρόνως με τη βοήθεια ψήκτρας ή υφάσματος. Επίσης επουλώνονται οι τυχόν ρωγμές με λίπος. Μετά την ωρίμανση τα κεφαλοτύρια παραφινώνονται ή τοποθετούνται σε φύλλα πολυαιθυλενίου Cryovac που τοποθετούνται σε ψυγεία 2-4 C, στα οποία διατηρούνται, μέχρι να καταναλωθούν. Η τοποθέτηση των τυριών σε Cryovac μπορεί να γίνει στην ηλικία εκείνη που καλύπτει την απαίτηση της νομοθεσίας σε υγρασία και έτσι μπορεί να συνεχίσουν την ωρίμανση τους στα ψυγεία χωρίς την απώλεια υγρασίας. Μεταβολή της μικροχλωρίδας κατά την παρασκεύη και ωρίμανση του τυριού. Κατά την παραλαβή του γάλακτος ο αριθμός της Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας είναι αυξημένος και ο πληθυσμός τους είναι της τάξεως 10 6 cfu/ml και κυρίως οφείλετε σε επιμολύνσεις κατά την άλμεξη και την αποθήκευση του γάλακτος στις παγολεκάνες (Nunez et al., 1984). Τα επίπεδα των Enterobacteriaceae και των Τ. coliforms είναι περίπου της τάξης 10 2-10 3 cfu/ml στην φάρμα και περίπου ένα λογάριθμο πάνω κατά την παραλαβή του γάλακτος στη βιομηχανία. Escherichia coli, Enterobacter cloacae, E. Agglomerans, Hafnia alvei and Klebsiella oxytoca είναι τα κυρίαρχα είδη ενώ είδη Salmonellae δεν ανιχνεύθηκαν (Gaya et al., 1987).Oι Staphylococci φθάνουν πληθυσμούς 10 4-10 5 cfu/ml κατά την παραλαβή του γάλακτος στη βιομηχανία (Bautista et al., 1986). Ο Staph. aureus, αποτελεί το 42% των απομονώσεων των 30

σταφυλοκόκκων από δείγματα γάλακτος από τη φάρμα, ενώ ανιχνεύθηκαν και Staph.haemolyticus and Staph. epidermidis (Gutierrez et al., 1982; Bautista et al., 1986) ο Σε κεφαλοτύρια από παστεριωμένο γάλα, χωρίς καλλιέργεια εκκίνησης βρέθηκε ότι οι γαλακτικοί στρεπτόκοκκοι αποτελούν το 21,7% των γαλακτικών βακτηρίων στο πήγμα αλλά μειώνονται ραγδαία και εξαφανίζονται μετά τις 15 ημέρες. O Str.thermophilus βρίσκεται στο τυρόπηγμα μετά την αναθέρμανση σε ποσοστό 12,8% ενώ με μικρότερη συχνότητα απομονώνεται ο Lc.lactis (5,1%) και Lc.lactis spp diacetylactis ( 3,8%). O Lc.lactis αναφέρεται ως το κυρίαρχο είδος στα τυριά La Serrena (Ferna ndez del Pozo et al., 1988) Οι γαλακτικοί στρεπτόκοκκοι είναι ευαίσθητοι στην αυξημένη συγκέντρωση σε NaCl, επομένως οι αντίξοες συνθήκες που δημιουργούνται στο κεφαλοτύρι, κυρίως λόγω της περιεκτικότητας σε αλάτι (συντελ.άλατος 15 ημερών 5,01), μειώνουν τον πληθυσμό τους στο ώριμο τυρί.( Λιτοπούλου-Tζανετάκη Ε. 1993). H αυτόλυση των κυττάρων των καλλιεργειών εκκίνησης επηρεάζεται από τη συγκέντρωση του NaCl στο τυρί και το συντελεστή άλατος (Bie & Sjostrom, 1975), Επίσης οι εντερόκοκοι, αντίθετα από τους στρεπτοκόκκους, επειδή είναι ιδιαίτερα ανθεκτικοί, απομονώνονται από την αρχή μέχρι το τέλος της ωρίμανσης των τυριών. Αυξάνονται σταδιακά ως τον πρώτο μήνα και διατηρούνται έπειτα σε υψηλά επίπεδα (10 5 /g). (Litopoulou-Tzanetaki and Vafopoulou-Mastrojiannaki, 1988; Litopoulou- Tzanetaki.1990).Τα είδη που απαντώνται συχνότερα στο τυρόπηγμα είναι ο Εnt.faecium (10%) και ο Εnt.Durans (2,6%) και ο Εnt.faecalis(6,4%), ενώ στο ώριμο τυρί βρίσκεται ο Εnt.faecium(35,6%) και ο Εnt.Durans(9,2%) Ο αριθμός των λακτοβακίλλων στο τυρόπηγμα είναι χαμηλός(10 6 /g) Πολλαπλασιάζονται έντονα τις πρώτες 15 ημέρες, φθάνουν στον υψηλότερο πληθυσμό 10 9 cfu/gr στις 30 ημέρες ωρίμανσης ενώ σε τυριά 6 μηνών βρίσκονται ακόμα σε υψηλά επίπεδα(10 8 cfu/g). Στο τυρόπηγμα μετά την αναθέρμανση το πιο συχνό είδος που απομονώνεται είναι ο Lb. plantarum με αμέσως επόμενο τον Lb.casei subsp.casei, σε ποσοστά 11 και 10,5% αντίστοιχα, ενώ στο ώριμο τυρί 120 ημερών ανιχνεύονται σε ποσοστά 15,8% και 18,4% του συνόλου των οξυγαλακτικών βακτηρίων (Litopoulou-Tzanetaki.1990) 31

Στα τυριά Pecorino Romano η μικροχλωρίδα αποτελείται κυρίως από θερμόφιλους λακτοβακίλλους και στρεπτοκόκκους κατά τη διάρκεια των πρώτων 3-5 μηνών ωρίμανσης με μέγιστο πληθυσμό 10 8-10 10 τις πρώτες 60 ημέρες (Deiana et al.1984). Στα τυριά Μanchego από νωπό πρόβειο γάλα η μικροχλωρίδα αποτελείται κυρίως από γαλακτικούς στρεπτοκόκκους κυρίως τον Lct.lactis τον πρώτο μήνα της ωρίμανσης(martinez-moreno,1976a).έπειτα κυριαρχούν μεσόφιλοι ομοζυμωτικοί λακτοβάκιλλοι με κυρίαρχο το Lb.plantarum και τον Lb.casei (Nunez.1976a). Eπίσης εντερόκοκκοι κυρίως ο Ent.faecium, leuconostoc spp κυρίως οι Leuc.mesenteroides subsp. dextranicum και Leuc. paramesenteroides και πεδιοκόκκοι κυρίως ο Ped.pentosaceus, βρίσκονται σε χαμηλότερους πληθυσμούς 10 7 cfu/gr (Martinez- Moreno.1976a;Nunez.1976.c). Σε διερεύνηση της μικροχλωρίδας των τυριών Manchego από παστεριωμένο γάλα, αρχικά κυριαρχούν οι στρεπτόκοκκοι αλλά στις 30 ημέρες οι λακτοβάκιλλοι (κυριως ο Lb.plantarum και ο Lb.casei) φθάνουν σε πληθυσμούς 10 8 cfu/g, όμοια με τα τυριά που παρασκευάζονται από νωπό γάλα. Χαμηλοί πληθυσμοί leuconostoc spp, και ζυμών αναφέρονται (Νunez,1976d,Chavarri et al.1983) Στα τυριά Rongal οι αλλαγές στη μικροχλωρίδα κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης και τα κυρίαρχα είδη των γαλακτικών βακτηρίων είναι όμοια με αυτά που έχουν αναφερθεί για τα τυριά Μanchego (Ordonez et al.,1980) Στο ορεινοτύρι, παραδοσιακό τυρί από νωπό πρόβειο γάλα, χωρίς καλλιέργεια εκκίνησης, ο πληθυσμός των γαλακτικών βακτηρίων φθάνει 10 9-10 10 τις πρώτες10 ημέρες ενώ σε ώριμο τυρί 3 μηνών είναι ένα λογάριθμο χαμηλότερα. Τις πρώτες 10 ημέρες οι λακτόκοκκοι αποτελούν το 20% των απομονώσεων,οι εντερόκοκκοι το 60% ενώ οι λακτοβάκιλλοι το 14% με κυρίαρχο είδος τον Lb.curvatus. Σε τυρί 3 μηνών οι λακτόκοκκοι αποτελούν το 60% των απομονώσεων με κυρίαρχο είδος τον L.lactis susbp.lactis, οι εντερόκοκκοι το 17,1% και οι λακτοβάκιλλοι 12,2% με κυρίαρχα είδη L.paracasei subsp. paracasei και L.coryniformis subsp. torquens (Prodromou.K et al.,2001) Η μείωση του ph κατά διάφορα στάδια παρασκευής του κεφαλοτυριού, οφείλεται στη δράση των μικροοργανισμών που ζυμώνουν τη λακτόζη. Κατά τη πήξη παρατηρείται μείωση του ph κατά 0,12, ενώ κατά τη διάρκεια της αναθέρμανσης κατά 0,1.Στο στάδιο αυτό παρατηρείται αύξηση των σταφυλοκόκκων, των εντεροκόκκων και των 32

log cfu/gr Αφοι Αβραμούλη Ο.Ε. Αρ. Κουπονιού: 88279408-01-000122 αρνητικών κατά GRAM βακτηρίων, στη δράση των οποίων οφείλεται η μείωση του ph. Οι σταφυλλόκοκκοι αυξάνονται σε αριθμό (10 7 cfu/g) κατά τον πρώτο μήνα ενώ σε προϊόντα της αγοράς έχει απομονωθεί και S.aureus και υψηλός πληθυσμός Micrococcus subgroup 3. O αριθμός των ολικών κολοβακτηριοειδών αυξάνεται σε πληθυσμό 10 5 /g και στη συνέχεια παρατηρείτε μείωση (Litopoulou-Tzanetaki,E 1977; Λιτοπούλου-Tζανετάκη Ε. 1993). Στο σχήμα 4 φαίνεται η μεταβολή της μικροχλωρίδας κατά την παρασκευή και ωρίμανση παραδοσιακού κεφαλοτυριού. Η παρουσία αυξημένου συντελεστή άλατος(10-11) βοηθά στη μείωση μικροοργανισμών όπως T. coliforms, staphylococci and clostridia.eπίσης στο ορεινοτύρι, βρέθηκαν στο ώριμο τυρί(3 μηνών) Εnterobacteriaceae και Ολικά κολοβακτηριοειδή σε πληθυσμό 10 5 /g. Σ ε ώριμα τυριά Μαnchego (90 ημερών) βρέθηκαν σε Ολικά Κολοβακτηριοειδή σε πληθυσμούς που κυμαίνονται από 10 1-10 6 cfu/gr ενώ σε πήγμα και σε τυρί 24h ανιχνεύθηκαν μικρόκοκκοι 10 5-10 6 cfu/g και κοαγκουλάση πηκτάση θετικοί σταφυλόκοκκοι 10 4-10 5 cfu/g, που μειώνονται κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης (Nunez& Marti'nez-Moreno, 1976; Αnon.1980).Δεν ανιχνεύθηκε εντεροτοξίνη Α ακόμη και αν η αρχική επιμόλυνση με το μικροοργανισμό γινόταν με εμβόλιο 10 6 cfu/ml γάλακτος (Νunez et al.,1988) H επιβίωση του S.aureus στα τυριά Machengo δεν επηρεάζεται από την οξυγαλακτική καλλιέργεια και τη θερμοκρασία αναθέρμανσης όπως τα Εnterobacteriaceae. H θερμοκρασία ωρίμανσης φαίνεται ότι είναι η μόνη παράμετρος που μειώνει τον πληθυσμό του S.aureus(Gaya et al., 1988). 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Κολοβακτηριοειδη Αρνητικα κατά Gram ΗΜΕΡΕΣ Σταφυλόκοκκοι - Μικρόκοκκοι Σχήμα 4: Μεταβολή της μικροχλωρίδας κατά την παρασκευή και ωρίμανση παραδοσιακού κεφαλοτυριού( Λιτοπούλου-Tζανετάκη Ε. 1993) 33

Η Br.meletensis έχει αναφερθεί ότι επιβιώνει σε τυρί φέτα 4-16 ημέρες ενώ σε τυρί Pecorino επιβιώνει 90 ημέρες και γενικά αποτελεί τον μεγαλύτερο κίνδυνο σε περίπτωση κατανάλωσης τυριών από απαστερίωτο γάλα. Για τη Salmonella spp υπάρχουν διάφορα δεδομένα όσον αφορά τη επιβιωσή της σε τυριά από πρόβειο γάλα. Η περίοδος επιβίωσης της σε πρόβειο τυριά όπως Μanchego, Tελεμέ είναι μικρότερη από ότι σε τυριά από αγελαδινό γάλα (Μedina et al.,1982). Η Listeria monocytogenes μπορεί να επιβιώνει σε τυρί τύπου Manchengo για 60 ημέρες, αν και ανιχνεύοταν σε πολύ χαμηλότερους πληθυσμούς, από το εμβόλιο που αρχικά τεχνητά, μόλυνε το γάλα (Dominguez et al. 1987). Λακτοφερίνη. H Λακτοφερίνη (LF) γνωστή και ως Λακτοτρανσφερίνη (LTF), είναι μία γλυκοπρωτείνη με μοριακό βάρος 80 kda που παρουσιάζει συγγένεια προς το σίδηρο(στην μορφή του οξειδωμένου σιδήρου). Θεωρείται ανοσοποιητικός παράγοντας όπου με άλλα βιοενεργά πεπτίδια, τη λυσόζυμη, τη λακτοπεροξειδάση, τις κυτοσίνες,τις ολιγοσακχαρίνες, βοηθούν στη καταπολέμηση των ασθενειών και στη προαγωγή της συνολικής υγείας του ανθρώπου. Η λακτοφερίνη βρίσκεται σε όλες τις εκκρίσεις που πραγματοποιούνται κατά την δράση των βακτηρίων: λακτόζη, δάκρυ, ρινικό έκκριμα, σίελος, βρογχικό έκκριμα, γαστρενετερικά υγρά και σε όλες τις εκκρίσεις του οργανισμού. Το ανθρώπινο πρωτόγαλα (colostrum) έχει τη μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε λακτοφερίνη 7 g/l, ακολουθεί το ανθρώπινο γάλα 1 g/l και έπειτα το αγελαδινό γάλα, 30 mg/l. ( Montreuil et al., 1960). Η σύνθεση της λακτοφερίνης πραγματοποιείται στα λευκά αιμοσφαίρια και διαχέεται στα σημεία όπου υπάρχει μια διαδικασία λοίμωξης ή μια αύξηση των οξειδωτικών διαδικασιών. Παρουσιάζει ιδιότητες ανοσοτροποποιητικές, αντιοξειδωτικές, οπιοειδείς, οστεοπροστατευτικές, αντιλιπιδαιμικές, αντιθρομβωτικές και αντιμικροβιακές. Ο μηχανισμός της αντιμικροβιακής δράσης της λακτοφερίνης από αγελαδινό γάλα, αρχικά προσδιορίστηκε στο γεγονός, ότι δεσμεύει το σίδηρο από το περιβάλλον των μικροβίων, ένα απαραίτητο στοιχείο για την ανάπτυξη και αναπαραγωγή τους. Περαιτέρω μελέτες όμως έδειξαν, ότι τα πεπτίδια της λακτοφερίνης ενώνονται με πολυσακχαρίτες (LPS) του τοιχώματος των κυττάρων και το οξειδωμένο μέρος της λακτοφερίνης, οξειδώνει τα βακτήρια μέσω της παραγωγής υπεροξειδίων. Αυτό 34

επηρεάζει τη διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης, με αποτέλεσμα την καταστροφή των βακτηριακών κυττάρων και ιδιαιτέρως των Gram - βακτηρίων( Farnaud S, Evans RW 2003, Ellison et al. 1988, 1990). Σε επίπεδο εντέρου η λακτοφερίνη διασπάται σε πεπτίδια, τις λακτοφερίνες που διαθέτουν μικροβιοκτόνα ιδιότητα. Είναι στην ουσία σε θέση να συνδεθούν με τα φωσφολιπίδια της μεμβράνης των βακτηρίων, των μυκήτων και των πρωτόζωων προκαλώντας ανεπανόρθωτη βλάβη. Η λακτοφερίνη επιδρά σε διαφορα Gram+ and Gram- παθογόνα όπως E. coli spp.,haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Listeria monocytogenes, Streptococcus spp., Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Bacillus stearothermophilus, και Bacillus subtilis (Valenti & Antonini, 2005;Payne et al., 1990,; Ellison and Giehl 1991; Dionysius and Milne 1997). Αντίθετα φαίνεται να ενισχύει την ανάπτυξη ωφέλιμων βακτηρίων όπως Lactobacillus και Bifidobacteria (Sherman et al.,2004). Οι λακτοφερίνες σε πολλές έρευνες απέδειξαν ότι παραμένουν ενεργές ακόμα και ενάντια στους ιούς και ιδιαίτερα στους rotavirus ιοί rota και στους αδενοϊούς. Επίσης παρουσιάζουν ωφέλιμη δράση κατά των cytomegalovirus (CMV), polyomavirus, herpes simplexvirus (HSV), HIV, hepatitis B and C (HBV and HCV) viruses. Η ιοκτόνα δράση της λακτοφερίνης συνιστάται στην παρεμπόδιση της συγχώνευσης των κυττάρων ξενιστών με τον ιό. Τέλος η λακτοφερίνη παρουσιάζει αντιμυκητιακές ιδιότητες κατά της Candida spp.,και ιδιαίτερα στην Candida albicans, και αντιπαρασιτικές ιδιότητες κατά των Entamoeba histolytica, Tritrichomonas foetus, Trypanosoma cruzi, T. brucei, Plasmodium falciparum stiedai( Valenti & Antonini, 2005). Η λακτοφερίνη χρησιμοποιείται στην ασφάλεια και υγιεινή των τροφίμων είτε μειώνωντας την οξείδωση των λιπιδίων (Medina et al., 2002) είτε μειώνοντας την ανάπτυξη των μικροβίων.χρησιμοποιείται ήδη ως συστατικό εδώδιμων φιλμ και ο FDA έχει εγκρίνει ενα σκέυασμα σε μορφή σπρέι, το οποίο χρησιμοποιείται σε σφάγεια βοοειδών κατά της E.coli 0157:H7 (Taylor et al., 2004). Πολυφαινόλες. Ως αντιοξειδωτικά ορίζονται οι ουσίες οι οποίες μπορούν να παρεμποδίσουν τις αντιδράσεις των ελεύθερων ριζών, όπως των δραστικών μορφών του οξυγόνου, προστατεύοντας από την επιβλαβή δράση τους. Οι φαινολικές ενώσεις 35

ανήκουν στα φυσικά αντιοξειδωτικά και είναι μία πολύ μεγάλη τάξη ενώσεων που περιλαμβάνει τα φαινολικά οξέα, τα φλαβονοειδή, τα στιλβένια και τις λιγνάνες.to εκχύλισμα, το οποίο παράγεται από την διαδικασία επεξεργασίας του κατσίγαρου, περιέχει το σύνολο των βιοδραστικών συστατικών που εμπεριέχονται στα απόβλητα της ελαιοπαραγωγικής διαδικασίας. Συγκεκριμένα το εκχύλισμα αυτό περιέχει το σύνολο των πολυφαινολών του καρπού της ελιάς, οι οποίες κατά την παραγωγή του ελαιολάδου αποβάλλονται στον κατσίγαρο. Από τις πολυφαινόλες τα δυο σπουδαιότερα συστατικά είναι η υδρόξυ-τυροσόλη (~60%) και η τυροσόλη (~20%). Αξίζει να σημειωθεί ότι το ελαιόλαδο περιέχει μόλις το 2% των πολυφαινολών που υπάρχουν στον καρπό της ελιάς ενώ το υπόλοιπο 98% μεταφέρεται στα υγρά απόβλητα απ όπου μπορεί να παραληφθεί με την εφαρμογή της αναπτυχθείσας τεχνολογίας. Οι πολυφαινόλες είναι μία αρκετά γνωστή και επίκαιρη τάξη οργανικών μορίων με περισσότερα από 10000 διακριτά μέλη και με αναγνωρισμένη βιοδραστικότητα τόσο στον ανθρώπινο οργανισμό όσο και στα ζώα και στους μικροοργανισμούς διαφόρων τύπων. Μπορούν να εξαχθούν και να απομονωθούν σε καθαρή μορφή από φυτική βιομάζα ή και από απόβλητα γεωργικών βιομηχανιών όπως για παράδειγμα τα απόβλητα των ελαιοτριβείων (όπως προαναφέρθηκε) και των οινοποιείων. Ανάμεσα στην πλειάδα των ευεργετικών επιδράσεων τους στην ανθρώπινη υγεία μπορούν να αναφερθούν το «γαλλικό παράδοξο» δηλαδή οι σημαντικά μειωμένες καρδιοπάθειες των Γάλλων λόγω των πολυφαινολών που υπάρχουν στο ερυθρό κρασί που συστηματικά καταναλώνουν ή η θεραπεία της μαλάριας (ελονοσίας) που βασίστηκε σε μία πολυφαινόλη που εξάγεται από ένα φυτό που φύεται στην Κίνα ή τέλος οι κατεχίνες του πράσινου τσαγιού που λειτουργώντας αντιοξειδωτικά προστατεύουν από καρδιοαγγειακές παθήσεις μειώνοντας αισθητά τα επίπεδα της χοληστερίνης στο αίμα. Επίσης η ενθυλάκωση σε νανο- μορφή διάφορων βιοδραστικών μορίων, στα οποία συμπεριλαμβάνονται και οι πολυφαινόλες, είναι γνωστό ότι τα προστατεύει από οξειδώσεις και θερμική επίδραση και ανεβάζει την δραστικότητα τους και την ικανότητα του ανθρώπινου οργανισμού να τα προσλαμβάνει και να ωφελείται από την βιοδραστικότητα τους. Ως μέσα ενθυλάκωσης χρησιμοποιούνται διάφορα μακρο-πολυμερή όπως το άμυλο, οι κυκλοδεξτρίνες, οι μαλτοδεξτρίνες και τα λιποσώματα. Η ισχυρή αντιοξειδωτική τους ιδιότητα και η ικανότητα να δεσμεύουν τις ελεύθερες ρίζες, τους δίνει μια δυναμική αξιοποίησης στην προστασία από τον καρκίνο του παχέος εντέρου και του στήθους. Οι πολυφαινόλες αναφέρονται ως αντι-μικροβιακοί παράγοντες δηλαδή ως μόρια που αλληλεπιδρούν με τους μικροοργανισμούς και επηρεάζουν αρνητικά την ανάπτυξη 36

τους. (García-Ruiz A., Bartolomé B., Martínez-Rodríguez A.J., Pueyo E., Martín- Álvarez P.J. and Moreno-Arribas M.V. 2008). Ωστόσο, υπάρχει και η επιλεκτική θετική επίδραση των πολυφαινολών (ανάλογα με τη συγκέντρωση και τη χημική σύσταση και δομή των πολυφαινολών) στον πολλαπλασιασμό κάποιων βακτηρίων, όπως αυτών της ομάδας των γαλακτικών βακτηρίων, ο πολλαπλασιασμός των οποίων μπορεί να ευνοηθεί από την παρουσία των πολυφαινολών (όπως κατεχίνες, γαλλικό οξύ, κλπ), καθώς η παρουσία των πολυφαινολών σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις (περίπου 200-2000 ppm) μπορεί να διεγείρει το ρυθμό αφομοίωσης σακχάρων και την ανάπτυξη αυτών των κυττάρων (Vivas, N., Lonvaud-Funel, A., & Glories, Y. 1997; Reguant C., Bordons A., Arola L., Rozès N. 2000; Barthelmebs, L., Divie`s, C., & Cavin, J. F. 2001; Alberto, M. R., Go mez-cordove s, C., & Manca de Nadra, M. C. 2004). Η λιγότερη γνωστή αυτή ιδιότητα των πολυφαινολών, αν και έχει αναφερθεί ήδη στη βιβλιογραφία (κυρίως σε σχέση με την επίδραση φυσικών πολυφαινολών του κρασιού σε μικροοργανισμούς που εμπλέκονται στη ζύμωση ή αλλοίωση του κρασιού), δεν εμφανίζεται να έχει αξιοποιηθεί σε τεχνολογικό επίπεδο για την επιτάχυνση βιομηχανικών ζυμώσεων και παραγωγής ζυμούμενων τροφίμων (π.χ. γαλακτοκομικά, αλλαντικά, ελιές ή τουρσιά κλπ) ή χημικών (γαλακτικό οξύ) ή φαρμακευτικών προϊόντων. L.curvatus. Οι βακτηριοσίνες είναι αντιμικροβιακά πεπτίδια παραγόμενα στο ριβόσωμα των βακτηρίων, που έχουν την ιδιότητα να «σκοτώνουν» συγγενικά βακτήρια (Klaenhammer, 1993). Το 99% των βακτηρίων παράγει έστω και μία βακτηριοσίνη και ο μόνος λόγος που δεν έχουν απομονωθεί περισσότερες είναι ότι λίγοι ερευνητές έχουν προσπαθήσει. Οι βακτηριοσίνες προερχόμενες από τα γαλακτικά βακτήρια έχουν εις βάθος μελετηθεί καθώς και η εφαρμογή τους στα τρόφιμα. Η κύρια διαφορά τους από τις βακτηριοσίνες των Gram-αρνητικών βακτηρίων είναι ότι η παραγωγή τους δεν σημαίνει και θάνατο του βακτηριοσινογόνου στελέχους (Riley and Wertz, 2002). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι βακτηριοσίνες δεν είναι αντιβιοτικά και οι δύο αυτοί όροι δεν πρέπει να συγχέονται. Διαφέρουν και ως προς τον τρόπο σύνθεσης και ως προς τον μηχανισμό δράσης. Η ανθεκτικότητα των βακτηρίων που παράγουν μια βακτηριοσίνη ως προς αυτήν είναι επίσης ένα στοιχείο διαφοροποίησης των βακτηριοσινών από τα αντιβιοτικά. Επίσης, βακτήρια που παρουσιάζουν ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά δεν σημαίνει ότι είναι ανθεκτικά σε βακτηριοσίνες και η ανθεκτικότητα σε βακτηριοσίνες δεν είναι συνήθως γενετικής προέλευσης. H παραγωγή 37

βακτηριοσινών από τα γαλακτικά βακτήρια εξαρτάται από το στέλεχος και τη φάση ανάπτυξής του, από το θρεπτικό μέσο ή καλύτερα η σύνθεση του τροφίμου και από τις συνθήκες παρασκευής ενός τροφίμου (π.χ. τεχνολογία και συνθήκες ωρίμασης ενός τυριού όπως ph, θερμοκρασία) (Parente and Ricciardi, 1999). Η εφαρμογή των βακτηριοσινών στα τρόφιμα μπορεί να γίνει με διάφορους τρόπους. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν βακτηριοσινογόνα στελέχη ως εκκινητές ή ως συμπληρωματική καλλιέργεια. Πολλοί ερευνητές έχουν μελετήσει τη χρήση βακτηριοσινών για τον έλεγχο της ανάπτυξης των NSLAB στο τυρί (Fenelon et al., 1999). Τα NSLAB συμμετέχουν στη διαμόρφωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών ενός τυριού αλλά συγχρόνως συνδέονται και με τυχόν σφάλματα. Ο έλεγχος της ανάπτυξης τους δίνει τη δυνατότητα παρασκευής ενός προϊόντος με προβλεπόμενη οργανοληπτική ποιότητα. Στελέχη λακτοβακίλλων παράγουν βακτηριοσίνες ενάντια σε μια ευρεία γκάμα παθογόνων στελεχών (Ennahar et al., 1996; Rodriquez et al., 2000). Σε μελέτη των Ennahar et al. (1996), στέλεχος Lb. plantarum απομονωμένο από τυρί παρήγαγε την βακτηριοσίνη πεδιοσίνη AcH με αρκετά έντονη αντιλιστεριακή δράση. Επίσης, στελέχη Lb. sake παράγουν βακτηριοσίνες όπως η sakasin A και P οι οποίες είναι ενεργές στην Listeria monocytogenes και Listeria innocua (Aymerich et al., 1996). Πληθώρα βακτηριοσινών παράγουν στελέχη του είδους Lb. acidophilus (lactocin), του είδους Lb. plantarum (plantaricin) και του είδους Lb. helveticus (helveticin; Klaenhammer, 1988; Malik et al., 1994). Ο Lb. curvatus αποτελεί μέλος της αυτόχθονης οξυγαλακτικής χλωρίδας( NSLAB), μαζί με τον Lb. paracasei και τον Lb. plantarum, σε ώριμα τυριά Cheddar (Jordan and Cogan, 1993; Fitzsimons et al., 1999). Ορισμένα στελέχη του L. curvatus (QC23), δείχνουν μεγαλύτερη ικανότητα οξίνησης από τον Lc. lactis, ο οποίος αποτελεί τον κατεξοχη μικροοργανισμό οξίνησης και για αυτό το λόγο ευρέως χρησιμοποιείται στη γαλακτοβιομηχανία. Επίσης ορισμένα στελέχη Lb. curvatus (QC2 and QC11) έχουν δείξει μεγάλη πρωτεολυτική ικανότητα (Sa nchez I. et αl.,2005. Tρείς βακτηριοσίνες έχουν βρεθεί ότι παράγονται από στελέχη Lb. curvatus : η κουρβασινη Α( curvacin A) (Tichaczek et al., 1992), η κουρβασίνη 13(curvaticin 13) (Sudirman et al., 1993), και η κουρβασίνη FS47( curvaticin FS47) (Garver and Muriana, 1994) Στην Ευρώπη οι 38

κύριες καλλιέργειες εκκίνησης που χρησιμοποιούνται για την παρασκευη ζυμούμενων αλλαντικών είναι ο Lb. Sakei και ο Lb. curvatus (Hammes and Hertel, 1996). Η μέγιστη παραγωγή βακτηριοσίνης από τον Lb. curvatus LTH 1174 πραγματοποιείται στους 20 27 ο C, ενώ σημαντική ποσότητα βακτηριοσίνης παράγεται σε όλο το εύρος ph. (Vogel et al., 1993). Λόγω της μεγάλης αντιλιστεριακής δράσης της βακτηριοσίνης του Lb. curvatus έχει δωθεί στην συγκεκριμένη καλλιέργεια προστιθέμενη αξία για τη χρήση της ως καλλιέργεια εκκίνησης ή ως προστατευτική καλλιέργεια, προς το παρών σε ζυμούμενα αλλαντικά (Lawrie, 1995). 39

2.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1.Παρασκευή παραδοσιακού τυριού Το ΚΕΦΑΛΟΤΎΡΙ παρασκευάστηκε από νωπό αιγοπρόβειο γάλα στο τυροκομείο «Αφοί Δ. Αβραμούλη Ο.Ε.» στον Παραπόταμο Λάρισας, σύμφωνα με τοπική μέθοδο. Το γάλα (80 Kg) θερμαίνεται στους 35 C και προστίθετο σ αυτό ποσότητα πυτιάς, τόση ώστε η πήξη να πραγματοποιηθεί σε 35 λεπτά. (εικόνα 1). Προστέθηκαν καλλιέργειες οι οποίες είναι: Η θερμόφιλη καλλιέργεια γιαουρτιού, φυσική καλλιεργεια με Str.thermophilus και Lb.Bulgaricus.(120gr/80kg) Μεσόφιλη καλλιέργεια CHOOZIT MA16 LYO 25DCU(DANISCO) που περιέχει τους Lc.lactis subsp. lactis και Lc.lactis subsp cremoris (0,4gr/80 Kg ή 1 DCU/100lt) Ακολουθεί παραμονή της καλλιέργειας στον τυρολέβητα για 20 min. Μετά την πήξη διαιρείται το τυροπήγμα, με τη βοήθεια του τυροκόφτη και κόβεται σε πολύ μικρά κομμάτια(0.5x0.5 cm), και αναδεύεται δυνατά για 2-3 λεπτά (εικόνα 2). Στη συνέχεια, αναθερμαίνεται στους 45 C για 15 min και αναδεύεται για άλλα περίπου 5 λεπτά. Στη φάση αυτή προστίθεται λεπτόκοκκο αλάτι (1Kg/80 Kg).Ακολούθως, το τυρόπηγμα αφήνεται να κατακαθίσει και μέρος του τυρογάλακτος αφαιρείται από τον τυρολέβητα με αντλία. Το πήγμα τοποθετείται σε τσαντήλα, δένεται σφιχτά, πιέζεται με το χέρι και εισάγεται σε καλούπια πίεσης, διαμέτρου23 cm(εικόνα 3). Τα καλούπια τοποθετούνται σε ειδικά πιεστήρια για 5 min για την αποβολή όσο το δυνατό παραπάνω ορού, έπειτα αναποδογυρίζονται και πιέζονται για άλλα 5min(εικόνα 4). Έπειτα τα καλούπια αφήνονται σε τυροτράπεζες ως την άλλη μέρα το πρωί στους 15 ο C(εικόνα 5). Στις 24 h(το άλλο πρωί) εισάγονται σε άλμη 18 Βe στους 15 ο C για 48 h και έπειτα αφήνονται για ακόμα 2 ημέρες στην ίδια θερμοκρασία (εικόνα 6 &7). Την επομένη, το τυρί μεταφέρεται στους θαλάμους ωρίμανσης 18 ο C, όπου συνεχίζεται το αλάτισμα με ξηρά αλατίσματα. Το αλάτι είναι χοντρόκκοκο σε μέγεθος ρυζιού το οποίο λιώνει μέχρι την επόμενη στην επάνω επιφάνεια του τυριού. Την επόμενη ημέρα το λιωμένο αλάτι στην επιφάνεια και τα πλάγια, απλώνεται με τσαντήλα και το τυρί αναστρέφεται και αλατίζεται από την 40

άλλη επιφάνεια την επομένη. Αυτό επαναλαμβάνεται 3 φορές όπου και ολοκληρώνονται τα ξηρά αλατίσματα και ακολουθεί εισαγωγή των τυριών σε άλμη για άλλες 24. Έτσι ολοκληρώνονται τα αλατίσματα και η στράγγιση του κεφαλοτυριού και ολοκληρώνεται η ά φάση της ωρίμανσης.ακολουθεί συσκευασία των τυριών σε σακούλες cryovac, υπό κενό και μεταφορά τους στους 4 C για ολοκλήρωση της ωρίμανσης των τυριών για άλλους 2,5 μήνες περίπου το ελάχιστο. Πραγματοποιήθηκαν 4 παρασκευές Κεφαλοτυριού από νωπό αιγοπρόβειο γάλα, Τη 1 η ημέρα: A1: Χρησιμοποίηση της τεχνολογίας που προαναφέρθηκε και προσθήκη Lb.curvatus (σε λυοφυλιωμένη μορφή) 0,2 gr/80l στο γάλα της τυροκόμησης. A2: Χρησιμοποίηση της τεχνολογίας που προαναφέρθηκε (Mάρτυρας) Τη 2 η ημέρα: Β1: Χρησιμοποίηση της τεχνολογίας που προαναφέρθηκε και προσθήκη πολυφαινολών 500 ppm (40 g/80l) στο γάλα της τυροκόμησης Β2: Χρησιμοποίηση της τεχνολογίας που προαναφέρθηκε και προσθήκη λακτοφερίνης 4g/80l (50ppm) στο γάλα της τυροκόμησης Οι μικροβιολογικές και χημικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε δείγματα νωπού γάλακτος πριν την τυροκόμηση και τυριού κατά τα διάφορα στάδια παρασκευής και ωρίμανσης του. Τα στάδια τα οποία εξετάστηκαν ήταν τα εξής: πρώτη ημέρα,7η, 15η (τέλος ωρίμασης στους 15 C) και μετά από 30, 45 ημέρες (στους 4 C). 41

Εικόνα 1: Εισαγωγή του γάλακτος στον τυρολέβητα Εικόνα 2 : Κόψιμο του τυροπήγματος σε κυβους 0.5x0.5 cm 42

Εικόνα 3:Τοποθέτηση του πήγματος στην τσαντήλα και τα καλούπια. Εικόνα 4:Τα κεφαλοτύρια μέσα στα καλούπια, πιέζονται στα ειδικά πιεστήρια. 43

Εικόνα 5: Παραμονή των κεφαλοτυριών μετά την πίεση, στις τυροτράπεζες έως την άλλη μέρα το πρωί. Εικόνα 6: Τοποθέτηση κεφαλιών στην άλμη 44

Εικόνα 7 : Παραμονή των κεφαλοτυριών στους 15 ο C μετά το υγρό αλάτισμα 2.2. Μικροβιολογικές αναλύσεις Με ασηπτικό τρόπο ζυγίζονταν 10 γραμμάρια από το γάλα ή το δείγμα τυριού και ομογενοποιούνταν με 90 ml αποστειρωμένου διαλύματος Maximum Recovery Dilluent(MRD),σε συσκευή Stomacher για δύο λεπτά. Στο ομογενοποιημένο δείγμα γίνονταν δεκαδικές αραιώσεις σε αποστειρωμένο διάλυμα MRD και εμβολιάζονταν στη συνέχεια σε τρυβλία. Καταμετρήθηκαν οι παρακάτω ομάδες βακτηρίων στα κατάλληλα υποστρώματα και συνθήκες επώασης: 1. Ολική μεσόφιλη χλωρίδα, Plate Count Άγαρ (PCA), 30 o C, 72h 2. Εντεροβακτηριοειδή, Violet Red Bile Glucose Άγαρ (VRGBA), 37 o C, 24h 3. Κολοβακτηριοειδή, Violet Red Bile Άγαρ (VRBA), 30 o C, 24h 4. Εschericia coli, TBX 44 0 C, 24 h 5. Ζύμες, Sabouraud Dextrose Άγαρ (PDA), 25 o C, 5 ημέρες 6. Σταφυλόκοκκοι, Baird Parker egg yolk tellurite Medium (BPM), 37 o C, 48h 45

7. Συνολικός αριθμός γαλακτικών βακτηρίων (LAB), MRS άγαρ (διπλό στρώμα) 37 o C, 3 ημέρες 8. Gram θετικοί, καταλάση αρνητικοί κόκκοι, Μ17 άγαρ, 30 o C, 48h 9. Εντερόκοκκοι, Bile Esculine Azide Άγαρ, 37 o C, 2 ημέρες 10. Θειοαναγωγικά κλωστρίδια. Τryptose Sulfite Cycloserine Agar (TSC agar,αναερόβια επώαση) 37 0, 18-24 h 11. Salmonella spp (ISO/FDIS6579) 12. Listeria monocytogenes (ISO11290) 2.3 Φυσικοχημικές αναλύσεις. Πραγματοποιήθηκαν οι παρακάτω χημικές αναλύσεις: Μέτρηση ph: Δέκα γραμμάρια πήγματος ή δείγματος τυριού ομογενοποιούνταν με 50 ml αποσταγμένο νερό θερμοκρασίας 45 C με τη βοήθεια υάλινης ράβδου σε κωνική φιάλη των 100 ml. Προσθέτονταν αποσταγμένο νερό για να συμπληρωθεί ο όγκος μέχρι τα 100 ml και ακολουθούσε μέτρηση του ph σε πεχάμετρο (Hanna instruments, Padova, Italy) με ηλεκτρόδιο υάλου. Προσδιορισμός υγρασίας: Η υγρασία προσδιορίστηκε με υγρασιόμετρο Κern MLB50-3 Προσδιορισμός ενεργότητας νερού (aw): Mέτρηση του aw στην συσκευή Lab Master aw (novasima) Προσδιορισμός NaCl: Σε δοχείο μίξερ τοποθετούνται 10 gr τυριού με 50 ml νερό, θερμοκρασίας 50-60 0 C. Το μείγμα ανακατεύεται στο μίξερ για 4-5 min και μεταφέρεται σε ογκομετρικό κύλινδρο των 250.To δοχείο του μίξερ ξεπλένεται με το ζεστό νερό και στη συνέχεια προστίθεται στον ογκομετρικό κύλινδρο. Συμπληρώνεται με νερό έως τη χαραγή και αφήνεται σε ηρεμία λίγα λεπτά. Λαμβάνονται 25 ml του υπερκείμενου υγρού τα οποία τοποθετούνται σε κωνική φιάλη με 2ml του δείκτη χρωμικό κάλιο 2%. Ογκομετρείται με 0,1711 Ν ΑgNO 3 έως ότου παραμείνει για 10 sec το καστανό χρώμα στο διάλυμα. 1ml διαλύματος ΑgNO 3 αντιστοιχεί σε 1% αλάτι στο τυρί. 46

Μέτρηση Ολικών Φαινολικών Συστατικών (ΜΕΘΟΔΟΣ FOLIN CIOCALTEAU) ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ - FOLIN CIOCALTEAU REAGENT - Διάλυμα άνυδρου Na 2 CO3 ( συγκέντρωσης 75 g/l απεσταγμένου νερού) ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ - Σε 0,2 ml δείγματος προστίθενται (με τη σειρά που αναγράφονται) - 10,8 ml απεσταγμένου νερού - 8 ml διαλύματος Na 2 CO3-1 ml αντιδραστηρίου FOLIN CIOCALTEAU Στο μάρτυρα αντί για 0,2 ml δείγματος βάζουμε 0,2 ml νερό (άρα προσθέτουμε 11ml νερό). Γίνεται καλή ανάδευση και έπειτα το δείγμα παραμένει σε ηρεμία σε θερμοκρασία περιβάλλοντος ( πιθανόν να χρειάζεται και σκοτάδι) για 60-120 λεπτά. Μέτρηση απορρόφησης του μπλε χρώματος στα 750nm. Ο μηδενισμός γίνεται με απεσταγμένο νερό. Η εκτίμηση της συγκέντρωσης φαινολών γίνεται με βάση μια πρότυπη καμπύλη με γαλλικό οξύ (όπου αντί για δείγμα έχουμε διαλύματα γνωστών συγκεντρώσεων γαλλικού) και το αποτέλεσμα εκφράζεται ως ισοδύναμα γαλλικού οξέος. Το εύρος της μεθόδου είναι 0-2 g/l φαινολών. 2.4 Οργανοληπτικός έλεγχος. Για την διεξαγωγή του οργανοληπτικού ελέγχου χρησιμοποιήθηκε πάνελ 16 κριτών. Για τη βαθμολογία χρησιμοποιήθηκε κλίμακα από 1-7. Βαθμολογήθηκαν τα εξής επιμέρους χαρακτηριστικά: άρωμα, γεύση, χρώμα, δομή, γενική αποδοχή. O οργανοληπτικός έλεγχος περιλάμβανε 5 δείγματα, τα δείγματα Α1,Α2,Β1,Β2 & το C το οποίο ήταν κεφαλοτύρι από παστεριωμένο γάλα, με την καλλιέργεια του Α2, από την παραγωγή του τυροκομείου. 47

3. AΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η εξέλιξη της μικροχλωρίδας κατά τη διάρκεια της παρασκευής & ωρίμανσης των κεφαλοτυριών Α1,Α2,Β1,Β2, από τις τέσσερις τυροκομήσεις, φαίνεται στους πίνακες 5,6,7,8, αντίστοιχα. Πίνακας 5: Μεταβολή της μικροχλωρίδας (log cfu/g) και φυσικοχημικών παραμέτρων κατά την παρασκευή και ωρίμανση του Kεφαλοτυριού Α1 από νωπό αιγοπρόβειο γάλα. Μικροβιακές ομάδες Ολική Μεσόφιλη χλωρίδα Εντεροβακτηριοειδή Κολοβακτηριοειδή Ε.coli Nωπό Γάλα πριν την πήξη Ημέρες στους 15ºC Ημέρες στους 15ºC Ημέρες 4ºC 1 7 15 30 45 8,60 8,30 9,20 8,76 8,99 5,35 4,82 6,46 4,90 4,30 5,30 4,83 5,47 5,10 3,06 8,25 4,51 4,45 3,68 4,75 4,30 3,90 2,57 2,64 Σταφυλόκοκκοι 4,79 4,30 6,09 6,68 5,70 5,08 S.aureus Συνολικός αριθμός γαλακτικών βακτηρίων (MRS agar) GRAM + κόκκοι (M17 agar) 2,60 3 6,60 7,90 9,46 8,74 8,95 7,89 7,81 9,16 8,65 8,75 Κλωστρίδια 4,06 3,5 4,66 3,91 1,30 8,78 8,51 2 Εντερόκοκκοι 4,95 5,47 5,47 6,35 6,64 6,08 Ζύμες 6,49 7,47 7,30 8,73 9,29 8,90 Salmonella spp. Listeria monocytogenes ph ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΑΠΟΥΣΙΑ ΑΠΟΥΣΙΑ 6,67 5,58 5,33 5,39 5,38 5,45 a w Υγρασία % NaCl% Συντελεστής άλατος % 0,971 0,962 0,931 0,897 0,756 47,36 42,16 38,53 37,65 36,95 0,40 1,00 2,50 3,4 4,0 0,84 2,32 6,09 8,28 9,77 48

Μικροβιακές ομάδες Ολική Μεσόφιλη χλωρίδα Πίνακας 6: Μεταβολή της μικροχλωρίδας (log cfu/g) και φυσικοχημικών παραμέτρων κατά την παρασκευή και ωρίμανση του Kεφαλοτυριού Α2 από νωπό αιγοπρόβειο γάλα. Γάλα πριν την πήξη 8,60 Ημέρες στους 15ºC Ημέρες στους 15ºC Ημέρες 4ºC 1 7 15 30 45 8,36 8,34 8,86 8,87 Εντεροβακτηριοειδή 5,35 5,16 4,34 3,63 5,81 4,85 Κολοβακτηριοειδή 5,30 5,19 4,22 3,90 5,17 3,70 Ε.coli 3,67 4,32 4,12 3,05 4,11 2,34 Σταφυλόκοκκοι 4,79 6,44 6,53 6,38 7,13 5,3 8,41 S.aureus 2,60 Συνολικός αριθμός γαλακτικών βακτηρίων (MRS agar) GRAM + κόκκοι (M17 agar) 6,60 7 9,30 8,99 8,77 7,89 7,95 9,24 8,80 8,71 Κλωστρίδια 4,06 2,41 3,41 2 1,47 8,85 8,91 1 Εντερόκοκκοι 4,95 Ζύμες 6,49 Salmonella spp. ΠΑΡΟΥΣΙΑ 5,23 7,47 5,47 6,21 7,43 6,38 9,27 8,75 8,95 8,98 ΑΠΟΥΣΙΑ Listeria monocytogenes ph ΑΠΟΥΣΙΑ 6,67 5,58 5,3 5,4 5,39 5,45 a w Υγρασία % NaCl% Συντελεστής άλατος % 0,971 0,962 0,930 0,895 0,768 47,32 41,38 38,21 36,95 36,83 0,40 1,50 2,00 2,7 4,1 0,84 3,50 4,97 6,81 10,02 49

Μικροβιακές ομάδες Ολική Μεσόφιλη χλωρίδα Πίνακας 7: Μεταβολή της μικροχλωρίδας (log cfu/g) και φυσικοχημικών παραμέτρων κατά την παρασκευή και ωρίμανση του Kεφαλοτυριού Β1 από νωπό αιγοπρόβειο γάλα. Γάλα πριν την πήξη Ημέρες στους 15ºC 1 Ημέρες στους 15ºC Ημέρες 4ºC 7 15 30 45 9,43 7,69 8,54 8,30 7,77 Εντεροβακτηριοειδή 6,46 5,46 5,06 4,72 3,84 3,60 Κολοβακτηριοειδή 5,95 5,90 3,16 4,90 3,82 2,85 Ε.coli 3,55 5,16 4,31 3,78 2,59 2,18 S.aureus 3,54 Σταφυλόκοκκοι 5,30 5,75 6,25 6,60 5,82 5,08 Συνολικός αριθμός γαλακτικών βακτηρίων (MRS agar) GRAM + κόκκοι (M17 agar) Κλωστρίδια 4,31 7,04 7,45 8,34 8,17 7,97 7,30 8,16 8,25 7,83 7,97 2,62 3,38 3,32 1 1 7,75 7,78 7,67 Εντερόκοκκοι 3,40 Ζύμες 8,48 5,32 5,48 7,40 7,13 7,48 8,62 8,17 8,41 5,30 8,30 Salmonella spp. Listeria monocytogenes ph ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΑΠΟΥΣΙΑ ΑΠΟΥΣΙΑ 6,67 5,6 5,5 5,45 5,45 5,53 a w Υγρασία % NaCl% Συντελεστής άλατος % Ολικά Φαινολικά Συστατικά 0,962 0,960 0,932 0,905 0,750 44,36 40,90 37,49 37,36 37,09 0,40 1,00 2,00 3,4 4,2 0,89 2,39 5,06 8,14 10,17 1.2 g/l 50

Πίνακας 8: Μεταβολή της μικροχλωρίδας (log cfu/g) και φυσικοχημικών παραμέτρων κατά την παρασκευή και ωρίμανση του Kεφαλοτυριού Β2 από νωπό αιγοπρόβειο γάλα. Μικροβιακές ομάδες Ολική Μεσόφιλη χλωρίδα Εντεροβακτηριοειδή Κολοβακτηριοειδή Ε.coli S.aureus Σταφυλόκοκκοι Γάλα πριν την πήξη Ημέρες στους 15ºC Ημέρες στους 15ºC Ημέρες 4ºC 1 7 15 30 45 9,44 8,08 8,60 8,49 8,77 6,46 5 6,23 5,93 5,76 5,95 4,93 2,97 5,83 5,58 9,04 5,11 5,00 3,56 4,42 3,56 3,379 2,46 3,55 3,54 5,31 5,50 5,95 6,68 5,78 4,60 Συνολικός αριθμός γαλακτικών βακτηρίων (MRS agar) GRAM + κόκκοι (M17 agar) Κλωστρίδια 4,31 7,04 6,78 8,37 8,82 8,30 7,30 7,73 8,61 8,44 8,45 2,47 2,30 1,30 1 1 8,02 8,01 Εντερόκοκκοι 3,34 Ζύμες 8,48 4,85 5,48 6,43 6,82 7,48 8,45 8,45 9,09 5,9 8,31 Salmonella spp. Listeria monocytogenes ph ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΑΠΟΥΣΙΑ ΑΠΟΥΣΙΑ 6,67 5,59 5,5 5,52 5,49 5,55 a w Υγρασία % NaCl% Συντελεστής άλατος % 0,973 0,970 0,930 0,907 0,763 44,03 40,73 37,51 36,8 36,5 0,50 1,10 2,80 3 4,1 1,12 2,63 6,95 7,54 10,10 51

Αφοί Δ. Αβραμούλη Ο.Ε. Αρ. Κουπονιού: 88279408-01-000122 3.2 Μικροβιολογικές Αναλύσεις Οξυγαλακτικά βακτήρια. Τα γαλακτικά βακτήρια, η ΟΜΧ και οι Ζύμες Μύκητες, ήταν η επικρατέστερη μικροχλωρίδα την πρώτη ημέρα & την 45 η ημέρα, σε όλα τα δείγματα κεφαλοτυριού Τα γαλακτικά βακτήρια βρίσκονται σε υψηλούς πληθυσμούς, έως και τη 45 η ημέρα ωρίμανσης. (σχήμα 5) Η μέγιστη ανάπτυξη στον αριθμό των γαλακτικών βακτηρίων σημειώθηκε την 7η ημέρα με πληθυσμούς 9.46, 9.3, 8.34 και 8.37 log 10 cfug -1 αντίστοιχα στα Α1,Α2,Β1,Β2. Στη συνέχεια παρατηρήθηκε πολύ μικρή μείωση (κατά 0.3-0.6 λογάριθμους) έως τις 45 ημέρες. Το Α1 την 1η & 7 η ημέρα είχε τον πιο υψηλό αριθμό LAB στο ΜRS agar, πιθανόν λόγω της προσθήκης της καλλιέργειας L.curnvatus. Έπειτα αρχίζει να μειώνεται και την 45 η ημέρα υπερτερεί σε LAB το A2 (μάρτυρας). Σχετικά σταθερός εμφανίζεται ο πληθυσμός των LAB στο Β1 και την 45 η ημέρα δεν παρουσιάζει διαφοροποίηση από τον αρχικό πληθυσμό στο τυρί 1 ης ημέρας. Στο Β2 παρουσιάζεται μεγάλη αύξηση (1.24 λογαρίθμους) την 45 η ημέρα, σε σχέση με τον πληθυσμό της 1 ης ημέρας, που ήταν ο χαμηλότερος από όλα τα δείγματα. Σε ώριμα κεφαλοτύρια ο αριθμός των λακτοβακίλλων (6 μηνών) βρίσκεται σε υψηλά επίπεδα(10 8 cfu/gr) (Λιτοπούλου- Tζανετάκη Ε. 1993). Ο πληθυσμός των γαλακτικών βακτηρίων που αναπτύσσονταν σε Μ17 άγαρ, ήταν αυξημένος από την πρώτη ημέρα σε όλα τα δείγματα γεγονός που οφείλεται στο απαστερίωτο γάλα. Αύξηση του πληθυσμού αυτής της ομάδας βακτηρίων καταμετρήθηκε μέχρι τη 7η ημέρα και ακολούθως μειώθηκαν ελάχιστα εως τη 45η ημέρα. Στο Β1 παρατηρήθηκε η πιο μεγάλη αύξηση την 1 η ημέρα ενώ την 45 η ημέρα το εν λόγω δείγμα είναι το μοναδικό, όπου παρουσιάζεται μείωση του πληθυσμού, κατά 0.5 λογαρίθμους. Στις 45 ημέρες οι υψηλότεροι πληθυσμοί στο M17 agar καταγράφηκαν στο Α2 (Σχήμα 5). Οι αντίξοες συνθήκες που δημιουργούνται στα κεφαλοτύρια, κυρίως λόγω του αυξημένου συντελεστή άλατος, οδηγούν τους γαλακτικους στρεπτοκόκκους σε υποδεκαπλασιασμό, με αποτέλεσμα να μην εμφανίζονται σε ώριμα τυριά 6 μηνών (Λιτοπούλου-Tζανετάκη Ε. 1993). 52

log cfu/gr Αφοί Δ. Αβραμούλη Ο.Ε. Αρ. Κουπονιού: 88279408-01-000122 10 9,5 9 8,5 8 7,5 7 6,5 LAB A1 LAB A2 LAB B1 LAB B2 GRAM + cocci A1 GRAM + cocci A2 GRAM + cocci B1 GRAM + cocci B2 6 0(ΓΑΛΑ) 1 7 15 30 45 HMEΡΕΣ Σχήμα 5: Mεταβολή των LAB, των +Gram κόκκων σε διάφορα στάδια ωρίμανσης των κεφαλοτυριών, από διαφορετικές τυροκομήσεις (A1,A2,A3,A4) 53

log cf/gr Αφοί Δ. Αβραμούλη Ο.Ε. Αρ. Κουπονιού: 88279408-01-000122 Εντερόκοκκοι. Οι εντερόκοκκοι, οι οποίοι ειναι ιδιαίτερα ανθεκτικοί στις υψηλές συγκεντρώσεις άλατος και στο όξινο ph, είναι παρόντες από την αρχή έως το τέλος της ωρίμανσης των τυριών (Λιτοπούλου-Tζανετάκη Ε. 1993). Παρουσίασαν αυξητική τάση έως την 30 ημέρα και έπειτα παρουσίασαν μείωση κατά 0.5-1.8 λογαρίθμους, με μεγαλύτερη μείωση στο Β1 και ακολούθως το Α2. Στο Β1, ( με επόμενο το Α2), καταμετρήθηκε ο μεγαλύτερος πληθυσμός κατά τη διάρκεια όλης της ωρίμανσης, ενώ την 45 η ημέρα ο πληθυσμός είναι σχεδόν αμετάβλητος σε σχέση με την 1 η ημέρα. Το Α2 παρουσιάζει την μεγαλύτερη αύξηση στον πληθυσμό του την 45 η ημέρα, σε σχέση με την 1 η ημέρα (σχήμα 6) 8 7 6 5 4 3 2 Enterococcus A1 Enterococcus A2 Enterococcus B1 Enterococcus B2 1 0 0(ΓΑΛΑ) 1 7 15 30 45 ΗΜΕΡΕΣ Σχήμα 6: Mεταβολή των εντεροκόκκων σε διάφορα στάδια ωρίμανσης των κεφαλοτυριών, από διαφορετικές τυροκομήσεις (A1,A2,A3,A4) 54

log cfu/gr Αφοί Δ. Αβραμούλη Ο.Ε. Αρ. Κουπονιού: 88279408-01-000122 Εnterobacteriaceae, T.coliforms, E.coli. Οι πληθυσμοί των εντεροβακτηριοειδών και κολοβακτηριοειδών δεν αυξήθηκαν κατά τις πρώτες 24h, σε σχέση με τους πληθυσμούς που καταμετρήθηκαν στο απαστερίωτο γάλα.. Παρέμειναν υψηλοί κατά τη διάρκεια της παρασκευής και ωρίμανσης των τυριών όμως κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης μειώνονταν, με μεγαλύτερη μείωση έως τη 45 η ημέρα στο Β1 κατά 1.86 και 3.05 λογάριθμους. (αντίστοιχα). Ωστόσο, την 30 η ημέρα οι χαμηλότεροι πληθυσμοί Enterobacteriacae και Coliforms παρατηρήθηκαν στο δείγμα Α1. Τα κολοβακτηριοειδή επίσης μειώθηκαν σημαντικά κατά 1.5 λογάριθμους στο Α2 στις 45 μέρες, σε σχέση με την αρχική τιμή του νωπού γάλακτος. (σχήμα 7). Tα Α2, Β1 είχαν στις 45 ημέρες μικρότερο πληθυσμό κολοβακτηριοειδών από αυτόν που αναφέρεται βιβλιογραφικά στους 3 μήνες (10 4 cfu/gr), σε κεφαλοτύρι από παστεριωμένο γάλα (Λιτοπούλου-Tζανετάκη Ε. 1993). Στο Β2 είχαμε ελάχιστη αύξηση, δεν συνέβει το ίδιο όμως με τον πληθυσμό της E.coli, όπου είχαμε μείωση (τη μικρότερη σε σχέση με άλλα δείγματα, ακολουθούμενη από τη μείωση της E. coli στο Α1). Τη μεγαλύτερη μείωση της E.coli την είχαμε στο Β1, ακολούθως στο Α1 και έπειτα στο Α2 (2.98, 2.11 και 1.97 λογαρίθμους αντίστοιχα). (σχήμα 8) 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 Enterobacteriaceae A1 Enterobacteriaceae A2 Enterobacteriaceae B1 Enterobacteriaceae B2 T.coliforms A1 T.coliforms A2 T.coliforms B1 T.coliforms B2 2 0(ΓΑΛΑ) 1 7 15 30 45 ΗΜΕΡΕΣ Σχήμα 7: Mεταβολή των Enterobacteriaceae και των T.coliforms σε διάφορα στάδια ωρίμανσης των κεφαλοτυριών από διαφορετικές τυροκομήσεις (A1,A2,A3,A4) 55

Αφοί Δ. Αβραμούλη Ο.Ε. Αρ. Κουπονιού: 88279408-01-000122 Σχήμα 8: Mεταβολή της E.coli σε διάφορα στάδια ωρίμανσης των κεφαλοτυριών από διαφορετικές τυροκομήσεις (A1,A2,A3,A4) Ζύμες Μύκητες. Οι ζύμες παρουσίαζαν αυξημένη εικόνα σε όλα τα δείγματα ακόμα και την 45 η ημέρα με πληθυσμούς 8.9, 9.0, 8.30 & 8,31 log cfu/gr, αντίστοιχα στα δείγματα Α1,Α2,Β1,Β2 (σχήμα 9). Δεν φαίνεται να υπάρχει κάποια διαφοροποίηση στους πληθυσμούς μεταξύ των 4 δειγμάτων. Σε κεφαλοτύρια από παστεριωμένο γάλα ο πληθυσμός φτάνει από 10 2 στο 10 5 cfu/gr τον πρώτο μήνα και έπειτα μειώνεται. (Λιτοπούλου-Tζανετάκη Ε. 1993). Στο δείγμα Α1 παρουσιάζεται μη αυξανόμενος ο πληθυσμός, έως την 7 η ημέρα. Μετά τη 15 η ημέρα ζύμες-μύκητες παραμένουν σχετικά σταθεροί σε πληθυσμούς πάνω από 10 8 σε όλα τα δείγματα. Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα. Η Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα μειώνεται τις πρώτες 24h σε όλα τα δείγματα και ιδίως στο Β1 (μείωση 2-log) και Β2 (μείωση 1,5 log), πιθανώς λόγω της αναστολής των μη οξυάντοχων στελεχών. Στη συνέχεια αυξάνεται και σταθεροποιείται στις 45 ημέρες στα ~8,5 log για τα δείγματα Α1 και Α2. Ωστόσο, στο Β1 στις 30 και στις 45 μέρες υπάρχει σταθερά η χαμηλότερη ΟΜΧ σε σύγκριση με όλα τα άλλα δείγματα (~7,7 log), ενώ παρουσίασε και την πιο απότομη μείωση της ΟΜΧ τις πρώτες 24h, κάτι που φανερώνει πιθανότατα μια ευρεία αντιμικροβιακή δράση της χρησιμοποιούμενης πολυφαινόλης. Aντίθετα το δείγμα Β2, παρόλο που 56

log cfu/gr Αφοί Δ. Αβραμούλη Ο.Ε. Αρ. Κουπονιού: 88279408-01-000122 έχει την ίδια αρχική ΟΜΧ με το Β1, είχε αυξητική πορεία στις τιμές της ΟΜΧ μετά την 1 η μέρα, και τον υψηλότερο πληθυσμό (9 log) στις 45 μέρες, γεγονός που υποδηλώνει την απουσία γενικευμένης αντιμικροβιακής δράσης της λακτοφερρίνης στη χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση (σχημα 9). 10 9,5 9 8,5 8 7,5 7 6,5 ΟΜΧ Α1 ΟΜΧ Α2 ΟΜΧ Β1 ΟΜΧ Β2 ΖΥΜΕΣ- ΜΥΚΗΤΕΣ Α1 ΖΥΜΕΣ- ΜΥΚΗΤΕΣ Α2 ΖΥΜΕΣ- ΜΥΚΗΤΕΣ Β1 ΖΥΜΕΣ- ΜΥΚΗΤΕΣ Β2 6 0(ΓΑΛΑ) 1 7 15 30 45 ΗΜΕΡΕΣ Σχήμα 9: Mεταβολή της Ο.Μ.Χ και των Ζυμών- Μυκήτων σε διάφορα στάδια ωρίμανσης των κεφαλοτυριών από διαφορετικές τυροκομήσεις (A1,A2,A3,A4) Σταφυλόκοκκοι-Μικρόκοκκοι. Οι σταφυλόκοκκοι στο δείγμα Α2 αυξάνονταν μέχρι τη 30 η ημέρα και έπειτα μειώθηκαν σταδιακά κατά 1.14 λογάριθμους. Σε κανένα άλλο δείγμα ο πληθυσμός δεν έφτασε στα επίπεδα του Α2. Γενικά οι σταφυλόκοκκοι και οι μικρόκοκκοι αυξάνονται σε αριθμό 10 7 cfu/gr κατά τον πρώτο μήνα ωρίμανσης και επειτα ο πληθυσμός ελαττώνεται, ώστε σε ώριμα τυριά βρίσκεται σε επίπεδα 10 5 cfu/gr (Λιτοπούλου-Tζανετάκη Ε. 1993) Δεν ανιχνεύτηκε S. aureus σε κανένα από τα δείγματα την 45 η ημέρα, ενώ ανιχνεύθηκε στο Α1 εως την 7 ημέρα σε πληθυσμό 10 3 cfu/gr.(πίνακας 5 ). Στο γάλα της τυροκόμησης ανιχνεύθηκε σε πληθυσμούς 10 2 cfu/ml (σχήμα 10).Γενικά, η μεγαλύτερη μείωση στο συνολικό πληθυσμό σταφυλοκόκων-μικροκόκων επιτεύχθηκε με την προσθήκη προστατευτικής καλλιέργειας L. curvatus (το δείγμα Α1 είχε τη μεγαλύτερη μείωση 57

log cfu/gr Αφοί Δ. Αβραμούλη Ο.Ε. Αρ. Κουπονιού: 88279408-01-000122 στις 24h) ή λακτοφερίνης (το δείγμα Α2 είχε τη χαμηλότερη τιμή στις 45 ημέρες, κάτω από 5 log). Θειοαναγωγικά κλωστρίδια. Σε ότι αφορά τα θειοαναγωγικά κλωστρήδια, αν και αρχικά εμφανίζουν σχετικά υψηλούς πληθυσμούς (~4 log) σταδιακά μειώνονται σε όλα τα δείγματα σε κάτω από 2 log μετά την 30 η ημέρα. Η μεγαλύτερη με διαφορά μείωση στους πληθυσμούς τους παρουσιάζεται στο δείγμα Β2, όπου φαίνεται πως η δράση της λακτοφερρίνης τα περιορίζει δραστικά από την 7 η κιόλας ημέρα (πολύ νωρίτερα από τα ότι τα υπόλοιπα δείγματα). (σχήμα 10) 8 7 6 5 4 3 Micrococcus- Staphylococcus A1 Micrococcus- Staphylococcus A2 Micrococcus- Staphylococcus B1 Micrococcus- Staphylococcus B2 Clostridium sul.red A1 2 Clostridium sul.red A2 1 0 0(ΓΑΛΑ) 1 7 15 30 45 ΗΜΕΡΕΣ Clostridium sul.red B1 Clostridium sul.red B2 Σχήμα 10: Mεταβολή των Μικρόκοκκων Σταφυλόκοκκων και των θειοαναγωγικών κλωστριδίων, σε διάφορα στάδια ωρίμανσης των κεφαλοτυριών από διαφορετικές τυροκομήσεις (A1,A2,A3,A4) 58

Αφοί Δ. Αβραμούλη Ο.Ε. Αρ. Κουπονιού: 88279408-01-000122 3.2 Χημικές-φυσικοχημικές αναλύσεις ph. Το ph των δειγμάτων Α1,Α2,Β1,Β2, ήταν μεγαλύτερο από 5 σε όλα τα στάδια παρασκευής και ωρίμανσης και δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην πτώση του ph ανάμεσα τους που να οφείλεται στην καλλιέργεια ή σε κάποιο συστατικό από αυτά που προστέθηκαν (Σχήμα 11). Τα τυριά αναθέρμασης έχουν γενικά ph μεγαλύτερο του 5, πιθανόν λόγω χημικών και ενζυμικών αντιδρασεων στη μάζα του τυριού (Choisy et al., 1984). Επίσης δεν πρέπει να αποκλείουμε τη ρυθμιστική ικανότητα των ελεύθερων αμινοξέων που παράγονται κατα την παραγωγή των τυριών. Τα δείγματα Α1 και Α2 είχαν ελάχιστα χαμηλότερο ph από την 7 η έως την 45 η μέρα σε σχέση με τα Β1 και Β2, χωρίς οι διαφορές να θεωρούνται σημαντικές. Σχήμα 11: Mεταβολή του ph σε διάφορα στάδια ωρίμανσης των κεφαλοτυριών από διαφορετικές τυροκομήσεις (A1,A2,A3,A4) 59