ΕΡΓΑΣΗΡΙΑΚΗ ΑΚΗΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΣΡΟΦΙΜΩΝ ΙΙΙ (ΚΩΔ. ΜΑΘΗΜΑΣΟ: ΕΣΔΑ 3434)

ΕΡΓΑΣΗΡΙΑΚΗ ΑΚΗΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΣΡΟΦΙΜΩΝ ΙΙΙ (ΚΩΔ. ΜΑΘΗΜΑΣΟ: ΕΣΔΑ 3434) ΣΙΣΛΟ ΕΡΓΑΣΗΡΙΑΚΗ ΑΚΗΗ: ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕ ΑΝΑΛΤΕΙ ΓΑΛΑΚΣΟ ΚΟΠΟ ΣΗ ΑΚΗΗ: Oι φοιτθτζσ να εξοικειωκοφν με τισ αναλφςεισ που υπαγορεφονται από τα Μικροβιολογικά κριτιρια υγιεινισ τθσ παραγωγικισ διαδικαςίασ των διαφορετικϊν εμπορικϊν τφπων γάλακτοσ. Διδάςκοντεσ: Λζκτορασ Ακτφπθσ Α, μζλθ ΕΔΙΠ: Αναςταςίου Ρ., Γεωργάλα Α., Γεωργαλάκθ Μ., Zουμποποφλου Γ., Μανωλοποφλου Ε. Μανωλοποφλου Ε. Σελίδα 1

ΠΙΝΑΚΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΙΝΑΚΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ... 2 1 θ ΕΡΓΑΣΗΡΙΑΚΗ ΑΚΗΗ: ΑΝΑΛΤΕΙ ΓΑΛΑΚΣΟ:... 3 ΔΕΙΓΜΑ 1: ΦΡΕΚΟ ΠΑΣΕΡΙΩΜΕΝΟ ΓΑΛΑ... 4 ΔΕΙΓΜΑ 2: ΓΑΛΑ ΜΑΚΡΑ ΔΙΑΡΚΕΙΑ... 5 ΔΕΙΓΜΑ 3: ΓΑΛΑ ΑΠΟΣΕΙΡΩΜΕΝΟ... 6 ΔΕΙΓΜΑ 4: ΤΜΠΤΚΝΩΜΕΝΟ ΓΑΛΑ (Εβαπορζ)... 7 ΔΕΙΓΜΑ 5: ΤΜΠΤΚΝΩΜΕΝΟ ΑΚΧΑΡΟΤΧΟ ΓΑΛΑ... 8 ΔΕΙΓΜΑ 6: ΚΟΝΙΟΠΟΙΜΕΝΟ ΓΑΛΑ (Γάλα ςκόνθ)... 9 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 12 Μανωλοποφλου Ε. Σελίδα 2

1 η ΕΡΓΑΣΗΡΙΑΚΗ ΑΚΗΗ: ΑΝΑΛΤΕΙ ΓΑΛΑΚΣΟ: Οι μικροβιολογικζσ αναλφςεισ που κα γίνουν ςτουσ διαφορετικοφσ τφπουσ γάλακτοσ βαςίηονται ςτα Μικροβιολογικά κριτήρια υγιεινήσ τησ παραγωγικήσ διαδικαςίασ (3). ε ότι αφορά τα Μικροβιολογικά κριτήρια αςφάλειασ, ςε όλουσ τουσ πιο πάνω τφπουσ γάλακτοσ επιβάλλεται, για τθν αςφάλεια των καταναλωτϊν, θ απουςία πακογόνων μικροοργανιςμϊν (Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Staphylococcus aureus). ΓΑΛΑ ΝΩΠΟ ΟΛΙΚΗ ΜΕΟΦΙΛΗ ΜΙΚΡΟΧΛΩΡΙΔΑ (ΟΜΧ) (4), ENTEΡΟΒΑΚΣΗΡΙΑ (7 o EΧAMHNO) (1) ΔΕΙΓΜΑΣΑ Δείγμα 1: ΓΑΛΑ ΦΡΕΚΟ ΠΑΣΕΡΙΩΜΕΝΟ Δείγμα 2: ΓΑΛΑ ΜΑΚΡΑ ΔΙΑΡΚΕΙΑ (Εxtended Shelf Life- ESL) Δείγμα 3: ΓΑΛΑ ΑΠΟΣΕΙΡΩΜΕΝΟ (Ultra-High Temperature-UHT) Δείγμα 4: ΓΑΛΑ ΤΜΠΤΚΝΩΜΕΝΟ- (Εβαπορζ) Δείγμα 5: ΓΑΛΑ ΤΜΠΤΚΝΩΜΕΝΟ ΑΚΧΑΡΟΤΧΟ Δείγμα 6: ΓΑΛΑ ΚΟΝΙΟΠΟΙΗΜΕΝΟ (κόνθ γάλακτοσ) MIKΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕ ΑΝΑΛΤΕΙ ΟΜΧ (Βλαςτικζσ μορφζσ βακτθρίων που επιβιϊνουν τθσ παςτερίωςθσ) ΕΝΣΕΡΟΒΑΚΣΗΡΙΑ ΟΜΧ (Θερμοανκεκτικά ςπόρια βακτθρίων που επιβιϊνουν τθσ παςτερίωςθσ, μετά από επϊαςθ τθσ ςυςκευαςίασ ςτουσ 20 o C για 24 ϊρεσ) ΕΝΣΕΡΟΒΑΚΣΗΡΙΑ ΟΜΧ (Αρίκμθςθ ολικισ μικροβιακισ χλωρίδασ μετά από επϊαςθ τθσ ςυςκευαςίασ ςτουσ 30 o C για 14 θμζρεσ) ΘΕΡΜΟΑΝΣΟΧΑ ΠΟΡΟΓΟΝΑ (Αρίκμθςθ ςπορογόνων κερμοάντοχων βακτθρίων μετά από επϊαςθ τθσ ςυςκευαςίασ ςτουσ 30 o C για 14 θμζρεσ ΟΜΧ (Αρίκμθςθ ολικισ μικροβιακισ μετά από επϊαςθ τθσ ςυςκευαςίασ ςτουσ 30 o C για 14 θμζρεσ) ΘΕΡΜΟΑΝΣΟΧΑ ΠΟΡΟΓΟΝΑ (Αρίκμθςθ ςπορογόνων κερμοάντοχων βακτθρίων μετά από επϊαςθ τθσ ςυςκευαςίασ ςτουσ 30 o C για 14 θμζρεσ ΟΜΧ ΖΤΜΕ-ΜΤΚΗΣΕ (5) ΕΝΣΕΡΟΒΑΚΣΗΡΙΑ ΣΑΦΤΛΟΚΟΚΚΟΙ (S. aureus, Staphylococcus spp.) (6) Μανωλοποφλου Ε. Σελίδα 3

ΔΕΙΓΜΑ 1: ΦΡΕΚΟ ΠΑΣΕΡΙΩΜΕΝΟ ΓΑΛΑ ΕΙΑΓΩΓΙΚΑ ΣΟΙΧΕΙΑ Σο γάλα είναι επικίνδυνο όταν περιζχει πακογόνουσ μικροοργανιςμοφσ που μπορεί να προκαλζςουν προβλιματα ςτθν υγεία του ανκρϊπου (Salmonella spp., Shigella spp., Brucella spp., E. coli, Staphylococcus aureus) αλλά και όταν περιζχει τοξικζσ ουςίεσ που ακροιςτικά κζτουν ςε κίνδυνο τθν υγεία των καταναλωτϊν. Οι μικροοργανιςμοί που περιλαμβάνονται ςτα κριτιρια υγιεινισ τθσ παραγωγικισ διαδικαςίασ για το γάλα και τα γαλακτοκομικά προϊόντα είναι τα Eντεροβακτιρια, το E. coli, οι κετικοί ςτθ πθκτάςθ ςταφυλόκοκκοι και ο Bacillus cereus. Καλισ ποιότθτασ παςτεριωμζνο γάλα προχποκζτει καλισ ποιότθτασ νωπό γάλα. Σο γάλα πρζπει να εξυγιαίνεται πριν δοκεί ςτθ κατανάλωςθ. Aυτό επιτυγχάνεται με τθ κερμικι επεξεργαςία κατά τθν οποία διαςφαλίηεται θ υγεία του καταναλωτι. Για τα μθ ςτείρα προϊόντα, μειϊνεται ο πλθκυςμόσ των μθ πακογόνων μικροοργανιςμϊν ϊςτε το προϊόν να ζχει μεγαλφτερθ διάρκεια ηωισ. Ωσ ΓΑΛΑ ΦΡΕΚΟ ΠΑΣΕΡΙΩΜΕΝΟ (7) νοείται το γάλα που: ζχει υποβλθκεί ςε επεξεργαςία που περιλαμβάνει τθν ζκκεςθ ςε υψθλι κερμοκραςία για μικρό χρονικό διάςτθμα (71,7 o C τουλάχιςτον για 15 δευτερόλεπτα, High Temperature Short Time-ΗTST) ι ςε χαμθλι κερμοκραςία για μεγάλο χρονικό διάςτθμα (63 o C τουλάχιςτον για 30 λεπτά) ι ςε διαδικαςία παςτερίωςθσ που χρθςιμοποιεί διαφορετικοφσ ςυνδυαςμοφσ χρόνου και κερμοκραςίασ μεταξφ των δφο παραπάνω ςυνκθκϊν για τθν επίτευξθ ιςοδφναμου αποτελζςματοσ παρουςιάηει αρνθτικι αντίδραςθ ςτθ δοκιμι τθσ φωςφατάςθσ και κετικι ςτθ δοκιμι τθσ υπεροξειδάςθσ ψφχεται το ςυντομότερο δυνατόν μετά τθν παςτερίωςθ, ςε κερμοκραςία που δεν υπερβαίνει τουσ 6 o C ςυντθρείται ςτθν παραπάνω κερμοκραςία, θ ςυντιρθςι του διαρκεί μζχρι 7 θμζρεσ και κακορίηεται με ευκφνθ του παραςκευαςτι υπόκειται ςε ζλεγχο των αρμόδιων αρχϊν του Τπουργείου Αγροτικισ Ανάπτυξθσ και Σροφίμων Mε τθν παςτερίωςθ δεν καταςτρζφονται τα ςπόρια των μυκιτων και των βακτθρίων. Επιβίωςθ αναφζρεται για τον ιό του αφκϊδουσ πυρετοφ και για τα Coxiella burnetti, Listeria monocytogenes, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) κ.α. εάν υπάρχουν ςε υψθλό αρχικό πλθκυςμό. Tα υπόλοιπα βακτιρια κανατϊνονται ςε ποςοςτό 90-99% ανάλογα με τθ κερμοαντοχι και τον αρχικό πλθκυςμό τουσ. ωςτι εφαρμογι τθσ ΗTST προκαλεί μείωςθ του μικροβιακοφ φορτίου κατά 99%. Επομζνωσ όςο μικρότερο είναι το αρχικό μικροβιακό φορτίο (καλισ ποιότθτασ νωπό γάλα) τόςο λιγότεροι είναι οι μικροοργανιςμοί που επιβιϊνουν. Επιβιϊνουν ςε μεγάλο ποςοςτό (ζωσ 50%) οι Εντερόκοκκοι, Streptococcus thermophilus και οριςμζνοι γαλακτοβάκιλλοι (Lb. bulgaricus & Lb. lactis). Tα Εντεροβακτιρια και κυρίωσ τα κολοβακτθρίδια είναι κερμοευαίςκθτα και καταςτρζφονται με τθν παςτερίωςθ. Μανωλοποφλου Ε. Σελίδα 4

ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΙΑ OMX: Ετοιμάηουμε 2 διαδοχικζσ δεκαδικζσ αραιϊςεισ (-1,-2). Από το γάλα (μθδενικι αραίωςθ) και από τισ αραιϊςεισ -1 και -2, εμβολιάηουμε 1ml ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ ενςωμάτωςθσ με το κρεπτικό υπόςτρωμα Plate Count agar (PCA). Σα τρυβλία επωάηονται ςτουσ 30 0 C /72 ϊρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται αρίκμθςθ των αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/ml) ΕΝΣΕΡΟΒΑΚΣΗΡΙΑ: Από το γάλα (μθδενικι αραίωςθ) και τθν (-1) αραίωςθ εμβολιάηουμε 1ml ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ ενςωμάτωςθσ με το κρεπτικό υπόςτρωμα VRBL άγαρ. Μόλισ το υπόςτρωμα ςτερεοποιθκεί προςκζτουμε δεφτερο ςτρϊμα υποςτρϊματοσ. Σα τρυβλία επωάηονται ςτουσ 37 0 C /24 ϊρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται αρίκμθςθ όλων των αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/ml). Kριτήρια υγιεινήσ τησ παραγωγικήσ διαδικαςίασ: φμφωνα με τα Μικροβιολογικά κριτιρια υγιεινισ τθσ διαδικαςίασ παραγωγισ (3) ςτο παςτεριωμζνο γάλα, ςε κανζνα από 5 εξεταηόμενα δείγματα δεν επιτρζπεται ο προςδιοριςμόσ Enterobacteriaceae 10 cfu/ml, ςτο τζλοσ τθσ διαδικαςίασ παραςκευισ. ε περίπτωςθ που αυτό ςυμβαίνει κα πρζπει να ελεγχκεί θ αποδοτικότθτα τθσ κερμικισ επεξεργαςίασ, να παρεμποδιςκεί πικανι επιμόλυνςθ και να ελεγχκεί και θ ποιότθτα του νωποφ γάλακτοσ. ΔΕΙΓΜΑ 2: ΓΑΛΑ ΜΑΚΡΑ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΕΙΑΓΩΓΙΚΑ ΣΟΙΧΕΙΑ Ωσ «γάλα υψθλισ κερμικισ επεξεργαςίασ» (7) (Εxtended Shelf Life-ESL) νοείται το γάλα που: ζχει υποβλθκεί ςε επεξεργαςία που περιλαμβάνει τθν ζκκεςθ ςε υψθλι κερμοκραςία ςτουσ 85 ζωσ 127 0 C ςε τζτοιεσ ςυνκικεσ κερμοκραςίασ και χρόνου ϊςτε θ δοκιμι τθσ υπεροξειδάςθσ να είναι αρνθτικι ψφχεται, το ςυντομότερο δυνατόν μετά τθ κερμικι του επεξεργαςία, ςε κερμοκραςία που δεν υπερβαίνει τουσ 6 o C. θ ςυντιρθςι του γίνεται ςε κερμοκραςία που δεν υπερβαίνει τουσ 6 o C, θ δε διάρκεια ςυντιρθςισ του κακορίηεται με ευκφνθ του παραςκευαςτι υπόκειται ςε ελζγχουσ των αρμόδιων αρχϊν του Τπουργείου Αγροτικισ Ανάπτυξθσ και Σροφίμων Tο γάλα αυτό δεν κεωρείται ςτείρο. Η κερμικι επεξεργαςία αποςκοπεί ςτθ καταςτροφι των επικίνδυνων για τθ Δθμόςια υγεία μικροοργανιςμϊν και ςτθν ελάττωςθ και μερικι αδρανοποίθςθ των ςπορίων των βακτθρίων. Η πικανι επικρατοφςα χλωρίδα είναι ςπορογόνεσ μορφζσ βακίλλων που προκαλοφν ςφάλματα ςτο προϊόν και τροφικζσ δθλθτθριάςεισ (Bacillus cereus), ςπόρια αερόβιων βακτθρίων Βacillus spp. ι αναερόβιων βακτθρίων Clostridium spp. Ενδζχεται κατά τθν ςυςκευαςία να υπειςζλκουν ωσ επιμόλυνςθ κερμοανκεκτικά, ψυχρότροφα και πρωτεολυτικά βακτιρια. Πριν τθν διανομι και κατανάλωςθ αυτοφ του γάλακτοσ γίνεται δοκιμαςτικι επϊαςθ ςτουσ 20 o C για 24 ϊρεσ και ελζγχεται μακροςκοπικά και μικροβιολογικά. Μανωλοποφλου Ε. Σελίδα 5

ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΙΑ Χειριςμόσ δείγματοσ: Άκικτεσ ςυςκευαςίεσ γάλακτοσ τοποκετοφνται ςε επωαςτικό κλίβανο ςτουσ 20 o C για 24 ϊρεσ OMX: Ετοιμάηουμε 2 διαδοχικζσ δεκαδικζσ αραιϊςεισ (-1,-2). Από το γάλα (μθδενικι αραίωςθ) και από τισ αραιϊςεισ (-1 και -2), εμβολιάηουμε 1ml ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ ενςωμάτωςθσ με το κρεπτικό υπόςτρωμα Plate Count agar (PCA). Σα τρυβλία επωάηονται ςτουσ 30 0 C /72 ϊρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται αρίκμθςθ αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/ml) ΕΝΣΕΡΟΒΑΚΣΗΡΙΑ: Από το γάλα (μθδενικι αραίωςθ) και τθν (-1) αραίωςθ, εμβολιάηουμε 1ml ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ ενςωμάτωςθσ με το κρεπτικό υπόςτρωμα VRBL άγαρ. Μόλισ το υπόςτρωμα ςτερεοποιθκεί προςκζτουμε δεφτερο ςτρϊμα υποςτρϊματοσ. Σα τρυβλία επωάηονται ςτουσ 37 0 C /24 ϊρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται αρίκμθςθ αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/ml). Kριτήρια υγιεινήσ τησ παραγωγικήσ διαδικαςίασ: Σα Μικροβιολογικά κριτιρια δεν αναφζρονται ςτο προϊόν αυτό. φμφωνα με τθ βιβλιογραφία (2) κατά τθ μικροβιολογικι εξζταςθ αυτοφ του τφπου γάλακτοσ κα πρζπει θ Ολικι Μεςόφιλθ Μικροχλωρίδα (ΟΜΧ) να είναι μικρότερθ από 10 3 cfu/ml και τα Εντεροβακτιρια και ο Bacillus cereus να είναι ςε πλθκυςμό μικρότερο από 1 cfu/ml, που ςτθν ουςία είναι απουςία. ΔΕΙΓΜΑ 3: ΓΑΛΑ ΑΠΟΣΕΙΡΩΜΕΝΟ ΕΙΑΓΩΓΙΚΑ ΣΟΙΧΕΙΑ Σο αποςτειρωμζνο Γάλα (UHT) είναι το προϊόν υπζρ-υψθλισ-κερμικισ επεξεργαςίασ (127-135 0 C/2-4 s), κατά τθν οποία καταςτρζφονται όλοι οι μικροοργανιςμοί και όλα τα ςπόρια και μπορεί να διατθρθκεί ςτο «ράφι» για τουλάχιςτον ζνα ζτοσ. Θεωρείται «Εμπορικά ςτείρο» προϊόν και είναι ςυςκευαςμζνο με αςθπτικι ςυςκευαςία. Σο νωπό γάλα πρζπει να ζχει όςο το δυνατόν μικρότερο αρικμό κερμοάντοχων ςπορίων βακτθρίων για να καταςτεί δυνατι θ αποτελεςματικι αποςτείρωςι του. Παράλλθλα και το ολικό μικροβιακό φορτίο του (ΟΜΧ), πρζπει να είναι χαμθλό γιατί ο μεγάλοσ πλθκυςμόσ βακτθρίων οδθγεί ςτθ παραγωγι ενηφμων, πολλά από τα οποία είναι κερμοάντοχα, δεν καταςτρζφονται κατά τθν αποςτείρωςθ και αλλοιϊνουν το ζτοιμο προϊόν κατά τθ ςυντιρθςι του ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ (π.χ. πιξθ, τάγγιςθ, πρωτεόλυςθ). Μανωλοποφλου Ε. Σελίδα 6

ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΙΑ Χειριςμόσ δείγματοσ: Άκικτεσ ςυςκευαςίεσ τοποκετοφνται ςε επωαςτικό κλίβανο ςτουσ 30 o C για 14 θμζρεσ (αρίκμθςθ βακτθρίων-αρίκμθςθ κερμοάντοχων ςπορογόνων βακτθρίων) ΟΜΧ: Κάνουμε 2 διαδοχικζσ δεκαδικζσ αραιϊςεισ (-1,-2). Από το γάλα (μθδενικι αραίωςθ) και από τισ αραιϊςεισ (-1 και -2), εμβολιάηουμε 1ml ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ ενςωμάτωςθσ με το κρεπτικό υπόςτρωμα Plate Count agar (PCA). Σα τρυβλία επωάηονται ςτουσ 30 0 C/48 ϊρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται αρίκμθςθ αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/ml) ΠΟΡΟΓΟΝΑ ΘΕΡΜΟΑΝΣΟΧΑ ΒΑΚΣΗΡΙΑ: ε αποςτειρωμζνο δοκιμαςτικό ςωλινα μεταφζρουμε 10ml από το προεπωαςκζν δείγμα. Ο ςωλινασ τοποκετείται ςε υδατόλουτρο κερμοκραςίασ 80 o C και παραμζνει για 10 λεπτά. τθ ςυνζχεια, ψφχεται και αναλφεται. Από το ψυγμζνο γάλα προετοιμάηουμε δφο αραιϊςεισ (- 1, -2). Από το κερμαςμζνο και ψυγμζνο γάλα (μθδενικι αραίωςθ) και τισ (-1) και (-2) αραιϊςεισ, εμβολιάηουμε 1ml ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ ενςωμάτωςθσ με το κρεπτικό υπόςτρωμα Reinforced Clostridium Medium agar (RCM). Σα τρυβλία επωάηονται αναερόβια ςτουσ 300C /72 ϊρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται αρίκμθςθ αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/ml). Kριτήρια υγιεινήσ τησ παραγωγικήσ διαδικαςίασ: Ελζγχεται με βάςθ τθ μικροβιολογικι του ςτακερότθτα φςτερα από δοκιμαςτικι επϊαςθ ςυςκευαςιϊν ςτουσ 30 o C για 14 θμζρεσ ι/και ςτουσ 55 o C για 7 θμζρεσ. τθ μικροβιολογικι εξζταςθ, αναμενόμενο αποτζλεςμα ςφμφωνα με τον Ευρωπαϊκό Κανονιςμό 853/2004 (8) είναι θ απουςία μικροοργανιςμϊν και θ απουςία ςπορίων ΔΕΙΓΜΑ 4: ΤΜΠΤΚΝΩΜΕΝΟ ΓΑΛΑ (Εβαπορζ) ΕΙΑΓΩΓΙΚΑ ΣΟΙΧΕΙΑ υμπυκνωμζνο γάλα είναι το προϊόν που προζρχεται από το πλιρεσ, μερικϊσ αποβουτυρωμζνο ι αποβουτυρωμζνο γάλα φςτερα από εξάτμιςθ μζρουσ του νεροφ, ομογενοποίθςθ, εγκυτίωςθ και αποςτείρωςθ. Σο γάλα εβαπορζ, πρζπει να πλθροί τισ προχποκζςεισ «εμπορικισ ςτειρότθτασ». Σο ςυγκεκριμζνο προϊόν προχποκζτει πολφ καλισ ποιότθτασ νωπό γάλα με πολφ χαμθλό αρικμό κερμοάντοχων βακτθρίων, διότι αν αυτό δε ςυμβαίνει ενδζχεται κατά τθ ςυμπφκνωςθ που ςυμβαίνει ςτουσ 55-65 o C να δθμιουργθκοφν προβλιματα. Η κερμικι επεξεργαςία του εβαπορζ (αποςτείρωςθ) αποςκοπεί ςτθ κανάτωςθ όλων των μικροοργανιςμϊν ακόμα και των κερμοάντοχων και των ςπορίων και ςτθν αδρανοποίθςθ των ενηφμων (πρωτεολυτικϊν και λιπολυτικϊν) αλλά και ςτθ βελτίωςθ του ιξϊδουσ. Η ανεφρεςθ μθ ςπορογόνων βακτθρίων υποδθλϊνει επιμόλυνςθ μετά τθν αποςτείρωςθ λόγω κακισ ςτεγανότθτασ των περιεκτϊν. Μανωλοποφλου Ε. Σελίδα 7

ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΙΑ Χειριςμόσ δείγματοσ: Άκικτεσ ςυςκευαςίεσ τοποκετοφνται ςε επωαςτικό κλίβανο ςτουσ 30 o C για 14 θμζρεσ- προεπϊαςθ και αρίκμθςθ μεςόφιλων βακτθρίων ΟΜΧ: Κάνουμε 2 διαδοχικζσ δεκαδικζσ αραιϊςεισ (-1,-2). Από το γάλα (μθδενικι αραίωςθ) και από τισ αραιϊςεισ (-1 και -2), εμβολιάηουμε 1ml ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ ενςωμάτωςθσ με το κρεπτικό υπόςτρωμα Plate Count agar (PCA). Σα τρυβλία επωάηονται ςτουσ 30 0 C /48 ϊρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται αρίκμθςθ αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/ml) ΠΟΡΟΓΟΝΑ ΘΕΡΜΟΑΝΣΟΧΑ ΒΑΚΣΗΡΙΑ: ε αποςτειρωμζνο δοκιμαςτικό ςωλινα μεταφζρουμε 10ml από το προ-επωαςκζν δείγμα. Ο ςωλινασ τοποκετείται ςε υδατόλουτρο κερμοκραςίασ 80 o C και παραμζνει για 10 λεπτά. τθ ςυνζχεια, ψφχεται και αναλφεται. Από το ψυγμζνο γάλα προετοιμάηουμε δφο αραιϊςεισ (-1, -2). Από το κερμαςμζνο και ψγμζνο γάλα (μθδενικι αραίωςθ) και τισ (-1) και (-2) αραιϊςεισ, εμβολιάηουμε 1ml ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ ενςωμάτωςθσ με το κρεπτικό υπόςτρωμα Reinforced Clostridium Medium agar (RCM). Σα τρυβλία επωάηονται αναερόβια ςτουσ 30 0 C /72ϊρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται αρίκμθςθ αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/ml). Kριτήρια υγιεινήσ τησ παραγωγικήσ διαδικαςίασ: Ελζγχεται με βάςθ τθ μικροβιολογικι του ςτακερότθτα φςτερα από δοκιμαςτικι επϊαςθ ςυςκευαςιϊν ςτουσ 30 o C για 14 θμζρεσ και ςτουσ 55 o C για 7 θμζρεσ. τθ μικροβιολογικι εξζταςθ, αναμενόμενο αποτζλεςμα ςφμφωνα με τον Eυρωπαϊκό Κανονιςμό 853/2004, είναι θ απουςία μικροοργανιςμϊν και θ απουςία ςπορίων. ΔΕΙΓΜΑ 5: ΤΜΠΤΚΝΩΜΕΝΟ ΑΚΧΑΡΟΤΧΟ ΓΑΛΑ ΕΙΑΓΩΓΙΚΑ ΣΟΙΧΕΙΑ Ωσ ςυμπυκνωμζνο ςακχαροφχο γάλα χαρακτθρίηεται το γάλα που προζρχεται από μερικι αφυδάτωςθ του γάλακτοσ και προςκικθ ςακχάρων. Κφρια διαφορά του από το εβαπορζ είναι θ φάςθ προςκικθσ τθσ ηάχαρθσ και θ ζλλειψθ αποςτείρωςθσ Δεν είναι ςτείρο προϊόν και θ ικανότθτα ςυντιρθςισ του οφείλεται κυρίωσ ςτο χαμθλό ςυντελεςτι ενεργότθτασ νεροφ (aw<0,83) και τθν υψθλι ωςμωτικι πίεςθ που ςτθν υδάτινθ φάςθ φκάνει τισ 140 Atm. το περιβάλλον αυτό θ πικανι αλλοιογόνοσ χλωρίδα που δφναται να αναπτυχκεί είναι κυρίωσ οςμόφιλεσ ηφμεσ και μφκθτεσ. Η κερμικι επεξεργαςία που δζχεται είναι εντονότερθ από τθν παςτερίωςθ (100-120 o C για 3-1 λεπτά), απαλλάςςει το γάλα από επικίνδυνουσ για τθ Δθμόςια υγεία μικροοργανιςμοφσ, ελαττϊνει το μικροβιακό φορτίο ςε λιγότερο από 10 3 cfu/g αλλά δεν το αποςτειρϊνει. Επιβιϊνουν εάν υπάρχουν κερμοάντοχοι ςπόροι (Bacillus spp., Clostridium spp.) αλλά δεν μποροφν να βλαςτιςουν. το τελικό προϊόν μπορεί να ανευρίςκονται και μθ ςπορογόνοι μικροοργανιςμοί των γενϊν Micrococcus, Streptococcus και Lactococcus. Επίςθσ μπορεί να υπάρξουν Gram (-) βακτιρια κυρίωσ κολοβακτθρίδια αλλά και ηφμεσ και μφκθτεσ. Οι μικροοργανιςμοί αυτοί ενδζχεται να υπειςζλκουν ςτα διαφορετικά ςτάδια τθσ παραγωγικισ διαδικαςίασ, που μεςολαβοφν μεταξφ τθσ κζρμανςθσ του γάλακτοσ και τθσ εγκυτίωςθσ του ζτοιμου προϊόντοσ. Μανωλοποφλου Ε. Σελίδα 8

ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΙΑ OMX: Κάνουμε 2 διαδοχικζσ δεκαδικζσ αραιϊςεισ (-1,-2). Από το γάλα (μθδενικι αραίωςθ) και από τισ αραιϊςεισ (-1 και -2), εμβολιάηουμε 1ml ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ ενςωμάτωςθσ με το κρεπτικό υπόςτρωμα Plate Count agar (PCA). Σα τρυβλία επωάηονται ςτουσ 30 0 C /72 ϊρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται αρίκμθςθ αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/ml) ΕΝΣΕΡΟΒΑΚΣΗΡΙΑ: Από τθ μθδενικι και τθν -1 αραίωςθ, εμβολιάηουμε 1ml ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ ενςωμάτωςθσ με το κρεπτικό υπόςτρωμα VRBL άγαρ. Μόλισ το υπόςτρωμα ςτερεοποιθκεί προςκζτουμε δεφτερο ςτρϊμα υποςτρϊματοσ. Σα τρυβλία επωάηονται ςτουσ 37 0 C /24 ϊρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται αρίκμθςθ αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/ml). ΖΤΜΕ-ΜΤΚΗΣΕ: Από τθ μθδενικι και τθ (-1) εμβολιάηουμε 100μl ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ επιφανειακισ εξάπλωςθσ ςτο κρεπτικό υπόςτρωμα Τeast Glucose Chloramphenicol (YGC) άγαρ. Σα τρυβλία επωάηονται ςτουσ 25 0 C /3-5 θμζρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται αρίκμθςθ αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/ml). Kριτήρια υγιεινήσ τησ παραγωγικήσ διαδικαςίασ: Σα Μικροβιολογικά κριτιρια δεν αναφζρονται ςτο προϊόν αυτό. υνικθσ μικροβιολογικι εξζταςθ αναφζρεται ςτθν αρίκμθςθ τθσ ΟΜΧ, των Κολοβακτθριδίων και των ηυμϊν και μυκιτων και αναμενόμενο αποτζλεςμα (2) είναι θ OMX να είναι μικρότερθ από 10 3 cfu/g και απουςία των κολοβακτθριδίων και των ηυμϊν και μυκιτων. ΔΕΙΓΜΑ 6: ΚΟΝΙΟΠΟΙΜΕΝΟ ΓΑΛΑ (Γάλα ςκόνη) ΕΙΑΓΩΓΙΚΑ ΣΟΙΧΕΙΑ Σο γάλα ςκόνθ είναι προϊόν αφυδάτωςθσ του γάλακτοσ ςε βακμό αποξιρανςθσ. Η ςκόνθ γάλακτοσ δεν είναι ςτείρο προϊόν και θ μικροβιακι τθσ χλωρίδα εξαρτάται από τθν μζκοδο παραςκευισ τθσ και τισ ςυνκικεσ υγιεινισ κατά τθν παραςκευι και ςυςκευαςία τθσ. Η μικροβιακι χλωρίδα τθσ γαλακτόςκονθσ απαρτίηεται από κερμοάντοχα (κυρίωσ είδθ Micrococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp.), από κερμόφιλα (S. thermophilus, S.bovis, E. faecalis), Corynebacterium spp. και Microbacterium spp. Επίςθσ ςε μικροφσ πλθκυςμοφσ βρίςκονται ςπόροι βακίλλων (Β. subtilis, B. licheniformis) και μθ κερμοάντοχα είδθ (π.χ κολοβακτθρίδια), τα οποία αποτελοφν δείκτθ επιμόλυνςθσ. Εάν βρεκοφν ηφμεσ και μφκθτεσ αποτελοφν δείκτθ αερογενοφσ μόλυνςθσ τθσ γαλακτόςκονθσ. υνικθσ μικροβιολογικι εξζταςθ αναφζρεται ςτθν αρίκμθςθ τθσ ΟΜΧ, των κολοβακτθριδίων και των ηυμϊν και μυκιτων. Από άποψθ Δθμόςιασ Τγείασ ο κίνδυνοσ προζρχεται κυρίωσ από τουσ ςταφυλοκόκκουσ και τισ ςαλμονζλλεσ. Πολλά είδθ ςταφυλόκοκκων μποροφν να απομονωκοφν από τρόφιμα ςυμπεριλαμβανομζνων και των γαλακτοκομικϊν, ωσ αποτζλεςμα επιμόλυνςισ τουσ κυρίωσ από τον άνκρωπο, δευτερευόντωσ από τα ηϊα (ςταφυλοκοκκικζσ μαςτίτιδεσ ςτα γαλακτοπαραγωγά ηϊα), ακόμα και από το περιβάλλον, δεδομζνου ότι οι ςταφυλόκοκκοι εμφανίηουν μεγάλθ αντοχι ςτθ ξθραςία. Ο S. aureus είναι ζνα από τα πολλά αναγνωριςμζνα είδθ του γζνουσ Staphylococcus (Gram(+), Catalase (+)) που ανικουν ςτθν οικογζνεια Micrococcaceae. Αναπτφςςεται ςτο Μανωλοποφλου Ε. Σελίδα 9

κερμοκραςιακό εφροσ 7-48 o C, ενϊ θ παραγωγι εντεροτοξινϊν ζχει διαπιςτωκεί ςτο κερμοκραςιακό εφροσ από 10 ζωσ 48 o C και ςυμβαίνει όταν θ πλθκυςμιακι πυκνότθτά του ξεπερνάει τα 10 5 κφτταρα ανά γρ. ι ml. O ςυγκεκριμζνοσ μικροοργανιςμόσ αδρανοποιείται ςτθ παςτερίωςθ, αλλά οι εντεροτοξίνεσ είναι κερμοάντοχεσ ςε όλα τα χρονο κερμοκραςιακά εφρθ που εφαρμόηονται ςτθν επεξεργαςία του γάλακτοσ. Η γριγορθ ψφξθ του νωποφ γάλακτοσ ςε κερμοκραςίεσ μικρότερεσ των 7 o C, εμποδίηει τθν αφξθςθ του πλθκυςμοφ του ςυγκεκριμζνου μικροοργανιςμοφ. ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΙΑ OMX: Από τθ ςκόνθ γάλακτοσ ηυγίηουμε 10 g και το προςκζτουμε ςε 90 ml προκερμαςμζνο (50 o C) διάλυμα Ringer αραίωςθ (-1) και ετοιμάηουμε μια αραίωςθ ακόμα (-2). Από αυτζσ τισ αραιϊςεισ εμβολιάηουμε 1ml ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ ενςωμάτωςθσ με το κρεπτικό υπόςτρωμα Plate Count agar (PCA). Σα τρυβλία επωάηονται ςτουσ 30 0 C /72 ϊρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται αρίκμθςθ αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/g) ΖΤΜΕ-ΜΤΚΗΣΕ: Από το αραιωμζνο γάλα αραίωςθ (-1) εμβολιάηουμε 100μl ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ επιφανειακισ εξάπλωςθσ ςτο κρεπτικό υπόςτρωμα Τeast Glucose Chloramphenicol (YGC) άγαρ. Σο τρυβλίο επωάηεται ςτουσ 25 0 C /3-5 θμζρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται αρίκμθςθ αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/g). ΣΑΦΤΛΟΚΟΚΚΟΙ: Από τθν (-1) αραίωςθ εμβολιάηουμε 100μl ςε τρυβλίο και εφαρμόηουμε τθ διαδικαςία τθσ επιφανειακισ εξάπλωςθσ ςτο κρεπτικό υπόςτρωμα Baird Parker egg yolk agar. Σο τρυβλίο επωάηεται ςτουσ 37 0 C /24-48 ϊρεσ. Μετά τθν επϊαςθ γίνεται παρατιρθςθ και αρίκμθςθ αποικιϊν. Τπολογιςμόσ αποτελζςματοσ ςε (cfu/g). το ςυγκεκριμζνο κρεπτικό υπόςτρωμα μπορεί να αναπτυχκοφν διαφορετικϊν μεγεκϊν και διαφορετικισ μορφισ αποικίεσ. Eμφάνιςη αποικιών Μαφρεσ γυαλιςτερζσ αποικίεσ διαμζτρου 1-5 mm, που περιβάλλονται από διαυγι ηϊνθ (άλω) πλάτουσ 2-5 mm. Αδιαφανισ δακτφλιοσ μζςα ςτθ διαυγι ηϊνθ, εμφανίηεται μόνο μετά από 48 ϊρεσ επϊαςθ Μαφρεσ, γυαλιςτερζσ, ακανόνιςτεσ αποικίεσ με αδιαφανι ηϊνθ που εμφανίηονται μετά από 24 ϊρεσ επϊαςθσ. Περιςταςιακι ανάπτυξθ: πολφ μικρζσ αποικίεσ με χρϊμα καφετί προσ μαφρο χωρίσ διαυγι ηϊνθ κοφρεσ, γλοιϊδεισ, με διαυγι ηϊνθ μετά από 48 ϊρεσ επϊαςθ Λευκζσ αποικίεσ χωρίσ διαυγι ηϊνθ Μικροοργανιςμοί Πιθανά S. aureus S. epidermidis Micrococci Bacillus species Ζφμεσ Μανωλοποφλου Ε. Σελίδα 10

Βιοχημικζσ δοκιμζσ Mικροοργανιςμοί Β-haemolysis Plasma coagulase S. aureus + + S. epidermidis - - Η τυπικι ςφςταςθ του κρεπτικοφ υποςτρϊματοσ Baird Parker egg yolk agar είναι: πεπτόνθ από καηεΐνθ, εκχφλιςμα κρζατοσ, εκχφλιςμα ηφμθσ, πυροςταφυλικό νάτριο, γλυκίνθ, χλωριοφχο λίκιο και άγαρ. Προςτίκεται μετά τθν αποςτείρωςθ Egg-yolk tellurite emulsion 50ml/l). Θρεπτικά ςυςτατικά είναι: θ πεπτόνθ, το εκχφλιςμα κρζατοσ, το εκχφλιςμα ηφμθσ Επιλεκτικοί παράγοντεσ ανάπτυξθσ είναι: το πυροςταφυλικό νάτριο και θ γλυκίνθ Παρεμποδιςτικοί παράγοντεσ ανάπτυξθσ είναι: το χλωριοφχο λίκιο και το tellurite Η ανάπτυξθ ςε αυτό το αδιαφανζσ υλικό (λόγω του περιεχομζνου egg-yolk) μπορεί να δϊςει τισ εξισ πλθροφορίεσ: Χαρακτθριςτικζσ ηϊνεσ και δακτφλιοι: Δθμιουργία λιπόλυςθσ ι πρωτεόλυςθσ Μαφρο χρϊμα ςτισ αποικίεσ: Αναγωγι του tellutite ςε tellurium Επιβεβαίωςθ φποπτων αποικιϊν:. Οι μαφρεσ αποικίεσ με κετικι τθ παραγωγι λεκικινάςθσ (ςχθματίηουν αδιαφανι ηϊνθ γφρω από τθν αποικία) εξετάηονται ωσ προσ τθν κετικι αντίδραςθ ςτθ Plasma coagulase. Δοκιμι πθκτάςθσ ι κοαγκουλάςθσ: Οι αποικίεσ που ζχουν τα χαρακτθριςτικά του S. aureus μεταφζρονται ςε δοκιμαςτικοφσ ςωλινεσ που περιζχουν 0,3 ml Brain Heart Infusion και αναμειγνφονται καλά. Επωάηονται ςτουσ 35 37 0 C για 18-24h. τισ καλλιζργειεσ που ζχουν επωαςτεί προςτίκεται 0,5 ml πλάςμα αίματοσ (Coagulase Plasma) και γίνεται καλι ανάδευςθ. Ακολουκεί επϊαςθ ςτουσ 35 37 0 C για 6h. ε περίπτωςθ ςχθματιςμοφ πιγματοσ θ δοκιμι κεωρείται κετικι. Κριτήρια υγιεινήσ τησ παραγωγικήσ διαδικαςίασ: φμφωνα με τα Μικροβιολογικά κριτιρια 2073/2005 για τθ γαλακτόςκονθ ςτα κριτιρια υγιεινισ ςε κανζνα από τα πζντε εξεταηόμενα δείγματα δεν επιτρζπεται ο προςδιοριςμόσ Enterobacteriaceae 10 cfu/g, ςτο τζλοσ τθσ διαδικαςίασ παραςκευισ. ε περίπτωςθ που αυτό ςυμβαίνει κα πρζπει να ελεγκεί θ αποδοτικότθτα τθσ κερμικισ επεξεργαςίασ και να παρεμποδιςκεί πικανι επιμόλυνςθ. Επίςθσ, μόνο ςε 2 από 5 εξεταηόμενα δείγματα επιτρζπεται ο προςδιοριςμόσ των coagulase-positive Staphylococcus να κυμαίνεται από 10 μζχρι 100 cfu/g, ςτο τζλοσ τθσ διαδικαςίασ παραςκευισ. ε περίπτωςθ που αυτό ςυμβαίνει κα πρζπει να βελτιωκοφν οι ςυνκικεσ υγιεινισ τθσ επεξεργαςίασ. Σζλοσ, ςφμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομζνα(2) που απορρζουν από τθν νομοκεςία πολλϊν χωρϊν, θ ΟΜΧ μπορεί να κυμαίνεται από 1*104 cfu/g* μζχρι 5*104cfu/g, ανάλογα με τθ ποιότθτα τθσ ςκόνθσ γάλακτοσ. Μανωλοποφλου Ε. Σελίδα 11

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Καμιναρίδθσ Εργαςτθριακζσ ςθμειϊςεισ 7 ου Εξαμινου 2. Μάντθσ Α., Παπαγεωργίου Δ., Φλετοφρθσ Δ., Αγγελίδθσ Α. Τγιεινι και Σεχνολογία του γάλακτοσ και των προϊόντων του. Εκδόςεισ Αφοί Κυριακίδθ Α.Ε. 3. COMMISSION REGULATION (EC) No 2073/2005 of 15 November 2005 on microbiological criteria for foodstuffs and amending Regulation 365/2010 4. ISO 8553 IDF 131 Milk-Enumeration of microorganisms-plate loop Technique at 30 C 5. ISO 6611 IDF 94 Milk and milk products-enumeration of colony forming units of yeasts and/or moulds-colony count technique at 25 C 6. ISO 6888-1:1999(en)Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium 7. Νόμοσ 4254/2014. Τποπαράγρ. Σ.8. Άρςθ εμποδίων ςτον ανταγωνιςμό ςτο κλάδο των τροφίμων. Ρυκμίςεισ γαλακτοκομικϊν προϊόντων. ΦΕΚ 85 7/4/2014. ελ 1412-1413 8. Regulation ( EC) N0 853/2004 laying down specific hygiene rules for food of animal origin Μανωλοποφλου Ε. Σελίδα 12