Νευρική αναγέννηση και πλαστικότητα του εγκεφάλου κατά τη νευρική μεταφορά

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΟΡΘΟΠΑΙΔΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ Νευρική αναγέννηση και πλαστικότητα του εγκεφάλου κατά τη νευρική μεταφορά Κεραμίδα Άννα Καραμπά Αναστασία ΣΤ έτος Υπεύθυνος καθηγητής Α. Μπερής Ιωάννινα 2013 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα

Αναγέννηση περιφερικών νεύρων..4 Νευρωνική επιβίωση και αντίδραση 10 Αλλαγές στα κανάλια ιόντων στους τραυματισμένους νευρώνες...16 Ρόλος του Nogo...18 Λειτουργικές αλλαγές στις κεντρικές συνάψεις..20 Μετατραυματικός νευρωνικός θάνατος...20 Μεταφορά ουσιών στον νευράξονα...23 Εκβλάστηση και ανάπτυξη των αναγεννητικών μονάδων..24 Μονάδες αναγέννησης 27 Διαμερισματοποίηση και αποκατάσταση του φυσιολογικού ενδονεύριου περιβάλλοντος..28 Το νευρικό χάσμα.29 Το περιφερικό νευρικό τμήμα.32 Εκφύλιση του νευράξονα.33 Ο ρόλος των μακροφάγων..33 Ο ρόλος των πρωετολυτικών ενζύμων...35 Πολλαπλασιασμός των κυττάρων Schwann και σύνθεση αναπτυξιακών παραγόντων...36 Κύτταρα Schwann και μακροπρόθεσμη απονεύρωση..38 Ανάπτυξη εκβλαστήσεων στο περιφερικό τμήμα..39 Ο ρυθμός της αξονική ανάπτυξης 40 Αλλαγές στο συνδετικό ιστό.42 Αναδιαμόρφωση των νευρωνικών κυκλωμάτων του νωτιαίου μυελού...43 Αλλαγές στις ενδομυελικές ανασταλτικές οδούς...46 Πλαστικές αλλαγές και αναδιοργάνωση σε φλοιϊκό και υποφλοιώδες επίπεδο..47 Αναδιοργάνωση του σωματοαισθητικού φλοιού...48 Αναδιοργάνωση σε υποφλοιώδη επίπεδα...56 Μηχανισμοί φλοιϊκής και υποφλοιϊκής πλαστικότητας..57 2

Ψυχοφυσιολογικές επιδράσεις της βλάβης του περιφερικού νεύρου..59 Αναδιοργάνωση του εγκεφάλου συσχετιζόμενη με την ανάρρωση μετά από ΑΕΕ...60 Συνοψίζοντας την πλαστικότητα του ΚΝΣ 62 Εισαγωγικά στοιχεία κάκωσης βραχιονίου πλέγματος...65 Ιστορική αναδρομή της χρησιμοποίησης των νευρικών μοσχευμάτων...66 Ανατομία βραχιονίου πλέγματος......67 Ανατομία και φυσιολογία του μεσοπλεύριου διαστήματος..70 Ενδείξεις νευρικής μεταφοράς.....71 Νεύρα που χρησιμοποιούνται για νευρική μεταφορά...72 Στόχοι της θεραπευτικής παρέμβασης...73 Επαναγγείωση των νευρικών μοσχευμάτων.73 Επανανεύρωση των νευρικών μοσχευμάτων....74 Μεταφορά μεσοπλεύριου νεύρου σε φρενικό 74 Γιατί επιλέγουμε τα μεσοπλεύρια νεύρα;...75 Μεταφορά μεσοπλεύριου νεύρου για αποκατάσταση της κάμψης του αγκώνα...78 Περιγραφή χειρουργικής επέμβασης 80 Αποκατάσταση μετά την μεταφορά των μεσοπλεύριων νεύρων..86 Άλλες χρήσεις μεσοπλεύριων νεύρων...87 3

Ανατομική και λειτουργική αποκατάσταση του ωλένιου νεύρου μετά από τραυματισμό μέσω μεταφοράς μεσοπλεύριου νεύρου...88 Άλλα νεύρα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για νευρική μεταφορά Spinal accessory nerve (νωτιαίο συμπληρωματικό νεύρο)...89 Φρενικό νεύρο...90 Μέσο θωρακικό νεύρο...90 Μερική μεταφορά του ωλένιου νεύρου..91 Μερική μεταφορά του μέσου νεύρου.... 92 Θωρακοραχιαίο νεύρο.92 Μεταφορά κερκιδικού νεύρου σε κινητικούς κλάδους του τρικέφαλου μυός..93 Γαστροκνημιαίο νεύρο 94 Βιβλιογραφία...95 4

Αναγέννηση περιφερικών νεύρων To τραύμα σε περιφερικά νευρικά στελέχη μπορεί να οδηγήσει σε ποικίλου βαθμού τραυματισμό των νευρικών ινών. Η κατάσταση του νευράξονα είναι ο κρίσιμος παράγοντας που θα καθορίσει την έκταση της βλάβης, την πορεία της και το χρόνο και την αποκατάστασή της μετά από τον τραυματισμό. Όσο διατηρείται η συνέχεια του νευράξονα, η λειτουργική αποκατάσταση συνήθως επιτυγχάνεται, παρόλο που ο χρόνος που απαιτείται για αυτή ποικίλει ανάλογα με το παθοφυσιολογικό υπόβαθρο της βλάβης, Σε μετρίου βαθμού συνθλιπτικά τραύματα η αξονική συνέχεια συνήθως διατηρείται και έτσι η βλάβη εκδηλώνεται ως νευραπραξία ή Sunderland Type I, που υποδηλώνει μια εντοπισμένη διακοπή της αγωγιμότητας με καλές πιθανότητες λειτουργικής αποκατάστασης σε διάστημα εβδομάδων ή μηνών. Σε πιο σοβαρές περιπτώσεις τραυματισμού λόγω σύνθλιψης, έλξης ή συντριβής, η συνέχεια του νευράξονα μπορεί να διακοπεί. Αυτό θα οδηγήσει σε εκφύλιση του άπω τμήματος του νευράξονα. Παρόλα αυτά, η συνέχεια του ενδονευρίου και του σωλήνα που αυτός σχηματίζει παραμένει άθικτη (αξονότμηση, Sunderland Type II,ΙΙΙ, ΙV ). Σε αυτές τις περιπτώσεις η αναγέννηση των νευραξόνων από τα εγγύς τμήματά τους καθοδηγείται από ενδογενείς παράγοντες που τους παρέχει ο ενδονεύριος σωλήνας. Έτσι οι περιφερικοί στόχοι επανανευρώνονται. 5

Με ακόμα πιο σοβαρό τραύμα στο νευρικό στέλεχος, το ενδονεύριο καθώς και όλα τα συστατικά του νεύρου που προέρχονται από νευρικό ιστό μπορεί να υποστούν καταστροφή ( νευρότμηση, Sunderland Type V). Η κατάσταση αυτή είναι σημαντικά χειρότερη από τις προαναφερθείσες. Δεν υπάρχουν πλέον ιστικές δομές που να μπορούν να οδηγήσουν τους αναπτυσσόμενους νευράξονεςστην απέναντι πλευρά της βλάβης και έτσι η ανεπαρκής ή λανθασμένη αξονική καθοδήγηση καθίσταται ένα σημαντικό πρόβλημα. 6

Από κλινικής πλευράς, ο πλήρης διαχωρισμός του νεύρου αποτελεί την πιο σοβαρή και, δυστυχώς, την πιο κοινή κατάσταση. Παρόλα αυτά οι περισσότερες πειραματικές μελέτες για την ανάπτυξη των νευραξόνων γίνονται σε πειραματόζωα στα οποία η αξονική συνέχεια έχει διακοπεί από μια συνθλιπτική κάκωση. Τυποποιημένες πειραματικές συνθλιπτικές βλάβες διακόπτουν την αξονική συνέχεια αφήνοντας το ενδονεύριο άθικτο. Για το λόγο αυτό οι βλάβες αυτές είναι πιο ευνοϊκές από την πιο συνήθη κλινική κατάσταση, δηλαδή την αξονική κατάτμηση. Μετά από μια συνθλιπτική βλάβη υπάρχει μόνο μια μικρή αρχική καθυστέρηση μέχρι τη στιγμή που οι νευράξονες θα αρχίσουν να αναπτύσσονται και μέχρι τη στιγμή που θα έχουν ευθυγραμμιστεί ξανά στη ζώνη της βλάβης. Τα όργανα στόχοι νευρώνονται ξανά και παραμένει μια ελάχιστη δυσκολία στη μεταφορά ενδοαξονικού υλικού στην περιοχή της βλάβης. Από την άλλη, σε διατομή του νεύρου η αρχική καθυστέρηση είναι μεγαλύτερη και μεγάλο πρόβλημα επίσης αποτελεί η μη σωστή ευθυγράμμισηαντιστοίχιση των νευραξόνων. Υπάρχει σημαντική παρεμπόδιση στη μεταφορά του αξονικού υλικού στη θέση της βλάβης λόγω μη ευθυγράμμισης ή και μόνιμης περίσφιξης των νευραξόνων. Μετά από το νευρικό τραύμα, οι νευράξονες περιφερικά της βλάβης αποκόπτονται από το σώμα του νευρώνα και εκφυλίζονται. Το σώμα των αξονοτομημένων νευρώνων υπόκειται μια σειρά δομικών, λειτουργικών και φαινοτυπικών αλλαγών, που είναι γνωστές ως νευρωνική αντίδραση και χρωματόλυση. Η χρωματόλυση συνίσταται σε αύξηση του όγκου του σώματος του νευρώνα, στη μετάθεση του πυρήνα στην περιφέρεια και σε αποδιοργάνωση των βασεόφιλων κοκκίων που ονομάζονται σωμάτια Nissl. Σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, η χρωματόλυση αναπαριστά την αναδιοργάνωση του αδρού ενδοπλασματικού 7

δικτύου στοχεύοντας στο να αυξηθεί η πιθανότητα αναγέννησης του νευρώνα. Η κυτταρική αυτή αντίδραση ποικίλλει ανάλογα με την ηλικία, το είδος και την εγγύτητα της βλάβης, το κυτταρικό μέγεθος και τη φύση της βλάβης. Οι νευρώνες στον ενήλικο είναι λιγότερο ευαίσθητοι και συνεπώς οι ανώριμοι νευρώνες κυρίως πεθαίνουν (Snider et al.,1992; Lowrie et al., 1994),ενώ βλάβες κοντά στα κυτταρικά σώματα προκαλούν μεγαλύτερο ποσοστό νευρωνικών θανάτων απ ότι οι περιφερικές βλάβες(ygge, 1989) Στη συνέχεια, οι νευρώνες υφίστανται βαλλεριανή εκφύλιση. Ενώ όμως η νευρωνική αντίδραση αντιπροσωπεύει τις μεταβολικές αλλαγές που είναι απαραίτητες για αναγέννηση και επιμήκυνση των νευραξόνων, η βαλλεριανή εκφύλιση επικουρεί στο να δημιουργηθεί ένα μικροπεριβάλλον περιφερικά της βλάβης το οποίο να ευνοεί την ανάπτυξη των νευρώνων. Μετά από βλάβες των περιφερικών νευρικών ινών, οι άξονες και τα έλυτρα μυελίνης περιφερικά της βλάβης εκφυλίζονται μέσω της βαλλεριανής εκφύλισης. Η εκφύλιση επηρεάζει σταδιακά και ένα μικρό τμήμα του εγγύς νευρικού κολοβώματος. Τα τελικά προϊόντα της εκφύλισης εξαλείπτονται από τη συνεργατική δράση των κυττάρων Schwann και των μακροφάγων που προσελκύονται στην περιοχή (Perry and Brown, 1992; Stoll and Muller, 1999) Τα πρώτα σημάδια της εκφύλισης παρατηρούνται μέσα σε 24 ώρες μετά την νευρική βλάβη και παρατείνονται για 1-2 εβδομάδες ακολουθώντας μια πρόοδο από εγγύς προς την περιφέρεια.η εξάλειψη των ελύτρων μυελίνης επιτρέπει την απομάκρυνση των παραγόντων που εμποδίζουν την αναγέννηση και συσχετίζονται με τα έλυτρα μυελίνης (όπως η συσχετισμένη με τη μυελίνη γλυκοπρωτείνη στο περιφερικό νεύρο). 8

Από τη 2 η με 3 η ημέρα μετά από το τραύμα υπάρχει σημαντική διείσδυση μακροφάγων στο εκφυλιζόμενο νεύρο,τα οποία προσελκύονται από κυτοκίνες.εγγύς της βλάβης, αυξητικοί κώνοι αναδύονται από τους κατεστραμμένους νευράξονες μετά από επαγωγή τοπικών παραγόντων ( Kato and Ide, 1994) και επιμηκύνονται αν βρουν ευνοϊκό έδαφος. Σε απουσία καθοδήγησης, όπως θα ήταν καθοδηγητικό το περιφερικό νευρικό κολόβωμα, οι αναγεννώμενοι νευράξονες ακολουθούν μια ελικοειδή πορεία και σχηματίζουν ένα νεύρωμα που σχηματίζεται από ανώριμες νευρικές εκβλαστήσεις και συνδετικό ιστό (Fried et al,1991). Εάν οι αναγεννώμενοι νευράξονες προσεγγίσουν το περιφερικό κολόβωμα, επεκτείνονται εν μέσω του ενδονευρίου, σε συνεργασία με τα κύτταρα Schwann και τη βασική μεμβράνη, σχηματίζοντας τις αναγεννητικές μονάδες. Τα υλικά για την αξονική ανάπτυξη παρέχονται κυρίως από το κυτταρικό σώμα μέσω της αξονικής μεταφοράς(hoffman and Lasek, 1980;McQuarrie and Lasek, 1989) 9

Ο ρυθμός της αξονικής αναγέννησης αρχικά είναι πολύ αργός και φτάνει μια σταθερή τιμή των 2-3 mm/day 3-4 μέρες μετά τον τραυματισμό. Οι παράγοντες που ελέγχουν την αξονική αναγέννηση προέρχονται από διάφορες πηγές, αλλά την πιο σημαντική επιρροή την ασκούν οι παράγοντες από το τοπικό περιβάλλον της βλάβης. Η λειτουργική σημασία της αναγέννησης είναι να αντικαταστήσει το περιφερικό τμήμα του νεύρου που χάθηκε λόγω της εκφύλισης, επιτρέποντας την επανανεύρωση των οργάνων στόχων και την επαναφορά των συνοδών λειτουργιών τους. Εντούτοις αυτή η διαδικασία δε δημιουργεί μια φυσιολογική νευρωνική δομή και ούτε επιτρέπει φυσιολογική λειτουργία,ειδικά όταν ο τραυματισμός είναι σοβαρός. Μετά από το τραυματισμό και την επιδιόρθωση, η διάμετρος των αναγεννηθέντων νευραξόνων, η ταχύτητα αγωγής τους και η ευερεθιστότητα τους παραμένουν κάτω από τα φυσιολογικά επίπεδα για μεγάλο χρονικό διάστημα (Fields and Ellisman, 1986a,b) και συνεπώς η «ανάρρωση» των επανανευρωθέντων οργάνων είναι ατελής και συνήθως ανεπαρκής. Παράγοντες οι οποίοι οδηγούν σε σε φτωχή μακροπρόθεσμη λειτουργική επαναφορά μετά από τραυματισμού περιφερικών νεύρων είναι : (1) Τραύμα στο κυτταρικό σώμα του νευρώνα εξαιτίας αξονότμησης και ανάδρομη εκφύλιση, που αποκλείει την πιθανότητα αναγέννησης (2) Αδυναμία αξονικής ανάπτυξης εξαιτίας βλάβης του νεύρου ή υποκείμενων ασθενειών. Διάσχιση του νεύρου με συνοδό χάσμα ιστού ή περιφερική εκφύλιση εξαιτίας γενικευμένης νευροπάθειας μπορούν να εμποδίσουν την αναγέννηση. (3) Φτωχή ειδικότητα της επανανεύρωσης των αναγεννηθέντων νευραξόνων, όταν τα όργανα στόχοι επανανευρώνονται με νευρικές ίνες διαφορετικής λειτουργίας. Αποκλίνουσα επανανεύρωση παρατηρείται κυρίως σε αναγέννηση μακρινών αποστάσεων. Η πλαστικότητα των κεντρικών συνδέσεων μπορεί να αναπληρώσει λειτουργικά για αυτή την έλλειψη ειδικότητας. 10

Νευρωνική επιβίωση και αντίδραση Η επιτυχία της νευρωνικής αναγέννησης και της λειτουργικής επανανεύρωσης των στόχων εξαρτάται σε πρώτη φάση από την ικανότητα τον αξονοτομηθέντων νευρώνων να επιβιώσουν και να στραφούν σε ένα αναγεννητικό φαινότυπο. Αντί να παράγονται πρωτείνες που σχετίζονται με την νευρική μεταβίβαση, παράγονται πρωτείνες που απαιτούνται για την αξονική αποκατάσταση. Οι μεταβολικές αλλαγές περιλαμβάνουν και τη διαφοροποιημένη σύνθεση πολλών νευροπεπτιδίων, αλλαγές στη σύνθεση κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών και την παραγωγή πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ανάπτυξη. Μετά από τραυματισμό περιφερικού νεύρου, το ώριμο περιφερικό νευρικό σύστημα απαντά είτε αυξάνοντας τη διαθεσιμότητα των νευροτροφικών παραγόντων είτε με αυτοκρινείς ή παρακρινείς πηγές. Μετά από διατομή του νευράξονα, τα επίπεδα της σχετιζόμενης με ανάπτυξη πρωτεΐνης 45 στις οπίσθιες γαγγλιακές ρίζες μπορεί να αυξηθούν ως 100 φορές ενώ ακολουθεί μείωση μετά την επανανεύρωση. Η αναπτυξιακή πρωτεΐνη 45 είναι μια φωσφοπρωτεΐνη που μεταφέρεται αξονικά, με ταχύ ρυθμό προς το κεντρικό τμήμα του νευράξονα, κάτι που υποδηλώνει το σημαντικό της ρόλο στην διαδικασία της ανάπτυξης. Αυτές οι φαινοτυπικές αλλαγές προωθούνται από την έκφραση των immediate early genes (IEG), δηλαδή γονίδια που ενεργοποιούνται τάχιστα μετά από ένα ερέθισμα όπως το c-jun και ο παράγοντας ενεργοποίησης της μεταγραφής 3 (ATF-3). Aυτοί οι παράγοντες εμπλέκονται σε μια αλληλουχία γεγονότων που οδηγεί στην αναγέννηση και πιθανότατα ενεργοποιούνται από σήματα που παράγονται λόγω του τραύματος. Τα σήματα που εμπλέκονται στην επικοινωνία μεταξύ του αποκομμένου και του αναπτυσσόμενου άκρου του νεύρου, μεταδιδόμενα μέσω της παλίνδρομης αξονικής ροής, είναι κρίσιμα. Ακόμα δεν 11

διαθέτουμε τις επιθυμητές πληροφορίες για αυτά τα σήματα. Παρόλα αυτά γνωρίζουμε ότι η μεταγωγή του σήματος, που συμβαίνει τόσο στο σώμα όσο και στο αναγεννώμενο άκρο, έχει να κάνει με βιοχημικές διαδικασίες που αφορούν τη δέσμευση ενός παράγοντα στην κυτταρική επιφάνεια και με το φυσιολογικό αποτέλεσμα της διαδικασίας αυτής. Η διαδικασία μεταγωγής του σήματος περιλαμβάνει τη φωσφορυλίωση πρωτεϊνών από πρωτεϊνικές κινάσες, οι οποίες είναι υψίστης σημασίας στο μονοπάτι του σήματος για τον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης. Τα σήματα αυτά τα οποία μεταφέρονται με παλίνδρομο τρόπο είναι σημαντικά για τη ρύθμιση της μεταβολικής λειτουργίας του νευρικού σώματος, είτε με τη διέγερση είτε με την καταπίεση ορισμένων γονιδίων. Τέτοια σήματα προέρχονται είτε από τα περιφερικά όργανα στόχους είτε τοπικά από την περιοχή της βλάβης( injury factors). Ένας τέτοιος παράγοντας φαίνεται να είναι ο Leukemia inhibitory factor(lif), ο οποίος φαίνεται να ρυθμίζει την παραγωγή γαλανίνης στον νευρώνα. Ο νευρώνας μπορεί ακόμα να χρησιμοποιήσει ουσίες που φυσιολογικά κινούνται στον άξονα για να μεταβάλλει τους μεταβολικούς μηχανισμούς. Τέτοιες ουσίες μπορούν να τροποποιηθούν με φωσφορυλίωση στην άκρη του κομμένου νευράξονα, και με αυτόν τον τρόπο να μεταφέρουν διαφορετικές πληροφορίες κατά την επιστροφή τους στο κύτταρο. Έτσι λοιπόν, η διατομή ενός νευράξονα οδηγεί σε βαθιές αλλαγές στη μεταβολική μηχανή του νευρικού κυττάρου, κάτι το οποίο αποτελεί τη βάση της αναγέννησης. Ένα τέτοιο σημαντικό σηματοδοτικό σύστημα που μπορεί να επιφέρει τις παραπάνω αλλαγές είναι η διακοπή στην παροχή νευροτροφικών ουσιών. Στη διατομή του νευράξονα η παροχή των ουσιών αυτών, που παράγονται από τα όργανα στόχους και μεταφέρονται οπισθόδρομα-παλίνδρομα στο κύτταρο,σταματά. 12

Πρόσθετη εξωγενής χορήρηση νευροτροφικών παραγόντων μπορεί να βελτιώσει την αναγεννητική απάντηση των νεύρων. Αυτοί οι νευροτροφικοί παράγοντες περιλαμβάνουν τους nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3) and neurotrophin-4/5 (NT-4/5), insulin-like growth factors (IGF-I and IGF-II), ciliary neurotrophic factor (CNTF), basic fibroblast growth factor (FGF-2) and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). Όσον αφορά την νευρωνική αντίδραση, η έντασή της και η χρονική της διάρκεια επηρεάζονται κυρίως από τη βαρύτητα της βλάβης, την απόστασή της από το κυτταρικό σώμα, τον τύπο του νευρώνα και την ηλικία. Κατά την χρωματόλυση συμβαίνει καταστροφή των σωματίων Nissl και συνεπώς αποδιοργάνωσης των ριβοσωμάτων. Αυτή όμως συσχετίζεται με αυξημένη πρωτεϊνοσύνθεση,πράγμα που συνδέει τη χρωματόλυση με αναβολική απάντηση των 13

τραυματισμένων νευρώνων(lieberman, 1971; Fu and Gordon,1997). Αυτή η ερμηνεία υποστηρίζεται από βιοχημικές αλλαγές στους αξονοτμημένους νευρώνες που υποδεικνύουν μειωμένη καταστολή του DNA, αυξημένη σύνθεση RNA με το πυρηνικό RNA να μεταφέρεται στο κυτταρόπλασμα και αύξηση του περιεχομένου του κυττάρου σε πρωτείνη(watson,1974). Οι βιοχημικές αλλαγές συμβαίνουν μέσα σε ώρες μετά από την αξονότμηση και συμβαδίζουν με τις πρώιμες χρωματολυτικές μορφολογικές αλλαγές. Η συγκέντρωση των ενζύμων που είναι απαραίτητα για τη σύνθεση RNA αυξάνονται ενώ η παραγωγή νευροδιαβιβαστών και πρωτεινών του κυτταρικού σκελετού μειώνονται. Οι αξονοτμηθέντες νευρώνες αλλάζουν από φάση «μετάδοσης» σε φάση «αναγέννησης», γεγονός που υπαγορεύεται από αλλαγές σε έκφραση γονιδίων και που οδηγεί σε μείωση στη σύνθεση προϊόντων που συνδέονται με την νευρωνική και σε αυξημένη παραγωγή πρωτεινών που βοηθούν την αύξηση και δομικών συστατικών της μεμβράνης. 14

Τα σήματα που είναι υπεύθυνα για την έναρξη και τη διατήρηση της αναγεννητικής απάντησης περιλαμβάνουν μια ποικιλία μηχανισμών που δρουν διαδοχικά( και σημαντικό ρόλο στους οποίους παίζουν το ασβέστιο και το κάλιο) (Cragg, 1970;Ambron and Walters, 1996; Perlson et al., 2004; Hanz and Fainzilber, 2006). Παράλληλα παρατηρείται ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων και γονιδιακή ρύθμιση. Τα σήματα που παράγονται από τον νευράξονα μετά από τον τραυματισμό επάγουν αρκετά σηματοδοτικά μονοπάτια στο νευρωνικό σώμα, τα οποία μπορεί να οδηγήσουν σε δύο αντίθετα αποτελέσματα, στον κυτταρικό θάνατο ή στην αναγέννηση. Μεταξύ των ουσιών που παράγονται είναι οι MAPKs Erk1 και Erk2, c-jun N-terminal kinase (JNK) και p38 kinase. Στους αξονοτμηθέντες κινητικούς νευρώνες, οι πιο χαρακτηριστικές αλλαγές συμβαίνουν στα πεπτίδια που σχετίζονται με την ακετυλοτρανσφεράση της χολίνης (ChAT) και στο πεπτίδιο που σχετίζεται με το γονίδιο της καλσιτονίνης (CGRP)(Caldero et al., 1992; Borke et al., 1993; Piehl et al.,1993).η μέγιστη μείωση του ChAT συνέβη 7 μέρες μετά από τη βλάβη και το ποσοστό της μείωσης συσχετίστηκε με τη βαρύτητα του τραύματος. Η επαναφορά του ChAT στα φυσιολογικά επίπεδα συσχετίστηκε με το χρόνο επανανεύρωσης μετά από τη νευρική θλάση, αλλά όχι μετά από διάσχιση του νεύρου. Αντίθετα, μια γρήγορη αύξηση στο CGRP, μέγιστη 3-10 μέρες μετά τη βλάβη, προηγήθηκε της μείωσης των επιπέδων του ChAT. Τέλος και οι νευρομυικές συνδέσεις αλλάζουν τους υποδοχείς τους από χολινεργικούς σε γλουταμινεργικούς. 15

Δομικά, οι μελέτες MRI πρόσφατα έδειξαν αλλαγές στη λευκή και στη φαιά ουσία μετά από τραυματικές βλάβες του νωτιαίου μυελού και σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, μεταξύ των οποίων ο ακρωτηριασμός άκρου και ο χρόνιος πόνος(apkarian et al., 2004;Draganski et al., 2006; Davis et al., 2008; Geha et al., 2008;May, 2008). Οι αλλαγές στη φαιά ουσία σχετίζονται με αλλαγές στο μέγεθος του κυττάρου, με ατροφία ή/και απώλεια νευρώνων, ενώ οι αλλαγές της λευκής ουσίας επηρεάζονται από την αξονική αναγέννηση και την απώλεια μυελίνης (Beaulieu, 2002; May, 2008). Έτσι, αυξημένα σωματοαισθητικά ελλείμματα συσχετίζονται με λεπτότερο φλοιό. Πιο συγκεκριμένα Νευροπεπτίδια Οι μετρίου και μικρού μεγέθους αισθητικοί νευρώνες στα οπίσθια νωτιαία γάγγλια (DRG) φυσιολογικά εκφράζουν ποικιλία διεγερτικών νευροπεπτιδίων όπως η ουσία Ρ και το γονίδιο σχετιζόμενο με το πεπτίδιο της καλσιτονίνης( calsitonin-gene related peptide) τα οποία διευκολύνουν την μεταγωγή του σήματος στα οπίσθια κέρατα. Ανάμεσα σε άλλα φυσιολογικά νευροπεπτίδια των DRGs βρίσκονται το νευροπεπτίδιο Υ(ΝΡΥ), η γαλανίνη, το πεπτίδιο VIP και η σωματοστατίνη. Οι μεγάλου μεγέθους νευρώνες φαίνεται να μη διαθέτουν καθόλου νευροπεπτίδια. Μετά από διατομή νεύρου, υπάρχουν δραματικές αλλαγές στο περιεχόμενο των DRG από νευροπεπτίδια. Καταπιέζεται η έκφραση του mrna των γονιδίων της ουσίας Ρ και του calsitonin-gene relted peptide (downregulation), ενώ διεγείρεται η έκφραση του VIP, της γαλανίνης, του ΝΡΥ. 16

Η διατομή του ισχιακού νεύρου σε ποντίκια είχε ως αποτέλεσμα μια αύξηση (upregulation) της γαλανίνης στα κύτταρα των DRG, κυρίως σε μικρής διαμέτρου αισθητήριους νευρώνες. Το ενδιαφέρον είναι ότι το μέγεθος της απάντησης αυτής ήταν μεγαλύτερο σε μερική παρά σε πλήρη διατομή του νεύρου. Το ΝΡΥ θεωρείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στη μετάδοση της υπεραλγησίας και της αναλγησίας ως απάντηση σε τραυματισμό του νεύρου. Η αυξημένη έκφραση του ΝΡΥ σε τραυματισμένους νευρώνες είναι ένας βολικός δείκτης της βλάβης στο νεύρο όπως επίσης και η έκφραση του CPON ( C-terminal flanking peptide of NPY) το οποίο ακολουθεί στο νευρικό σύστημα την ίδια κατανομή με το ΝΡΥ. Το CPON έχει αποδειχτεί ένας αποτελεσματικός δείκτης της βλάβης του νεύρου εξαιτίας διατομής ή συμπίεσης. Σε ένα πειραματικό μοντέλο σε άνω άκρα ποντικών, μία συνθλιπτική βλάβη του μέσου και του ωλένιου νεύρου είχε ως αποτέλεσμα τη δραματική αύξηση του αριθμού των CPON θετικών κυτταρικών σωμάτων, φτάνοντας ακόμα και πάνω από 20% στο συνολικό αριθμό των αισθητικών νευρώνων στο επίπεδο του Α7 μετά από 2 εβδομάδες. Αυξημένη έκφραση του ΝΡΥ σε DRG μετά από διατομή του νεύρου, έχει αναφερθεί από τους Widerberg and associates (2001a), Zhang and associates( 1993a), Wakisaka and associates (1991,1992) και Hokfelt and associates(1994). Αυξημένη έκφραση CPON σε DRG υπάρχει και σε χρόνια συμπίεση νεύρου. Η σύνθεση του υποφυσιακού πεπτιδίου που ενεργοποιεί την αδενυλική κυκλάση (PACAP), αυξάνεται μετά από αξονοτομή, ειδικά σε μεσαίου και μικρού μεγέθους νευρώνες. Το PACAP φυσιολογικά βρίσκεται σε μικρούς DRG νευρώνες και πιστεύεται ότι εμπλέκεται σε αρκετές φυσιολογικές λειτουργίες, μερικές από τις οποίες είναι η διαδικασία της επεξεργασίας του ερεθίσματος και της αίσθησης του 17

άλγους. Η αύξηση αυτή μετά από διατομή είναι πιο έκδηλη σε εγγύς βλάβες του νεύρου παρά σε απομακρυσμένες. Ο νευρικός αυξητικός παράγοντας( NGF) μπορεί να ρυθμίσει την έκφραση του PACAP σε υψηλότερα επίπεδα, σε μικρούς και μεσαίου μεγέθους DRG νευρώνες, τόσο φυσιολογικά όσο και μετά από τραυματισμό, ενώ η νευροτροφίνη 3( ΝΤ-3) μειώνει την έκφραση του PACAP μετά από αξονοτομή σε πολλούς μεσαίου προς μεγάλου μεγέθους νευρώνες. Υπάρχει αυξημένη έκφραση του PACAP σε DRG και σε χρόνια συμπίεση του νεύρου. Μεταγραφικοί παράγοντες ATF-3 και c-jun H απάντηση των νεύρων στο stress και η επακόλουθη απόπτωση μετά από νευρικό τραυματισμό όπως επίσης και η κατάσταση αναγέννησης έχει συσχετιστεί με την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα c-jun μέσω φωοσφορυλίωσης από την πρωτεϊνική κινάση c-jun N-terminal kinase (JNK), που ενεργοποιείται από μιτογόνα ερεθίσματα. Χρησιμοποιώντας ανάδρομη σήμανση οι Lindwall and associates (2004) απέδειξαν ότι η διατομή του ισχιακού νεύρου ποντικιού είχε ως αποτέλεσμα μία παροδική αλλά μαζική αύξηση στην ενεργή μορφή της JNK στον πυρήνα νευρώνων των DRG, ακολουθούμενη από φωσφορυλίωση του c-jun και την επαγωγή του ATF- 3 και ότι αυτά είναι σημαντικά γεγονότα για την αξονική ανάπτυξη πολλών αισθητικών νευραξόνων. Η ATF-3 έχει ρόλο και στην νευρική συμπίεση. Ρόλος του Nogo 18

H διερεύνηση του σηματοδοτικού συστήματος Nogo ξεκίνησε 20 χρόνια πριν όταν ο Nogo-A ταυτοποιήθηκε πρώτα ως ένας πιθανός αναστολέας της αξονικής ανάπτυξης στη μυελίνη του ΚΝΣ(Schnell and Schwab 1990),μαζί με τη γλυκοπρωτείνη που συσχετίζεται με τη μυελίνη (MAG; Lai and others 1987) και τη γλυκοπρωτείνη της μυελίνης των ολιγοδενδροκυττάρων (OMgp; Wang, Koprivica, and others 2002). Ο Nogo-A εκφράζεται κυρίως στα ολιγοδενδροκύτταρα του ΚΝΣ αλλά και σε κεντρικούς και περιφερικούς νευρώνες, ενώ δεν εκφράζεται καθόλου στα αστροκύτταρα και στα κύτταρα Schwann (Josephson, Widenfalk, and others 2001; Wang, Chun, and others 2002). Όταν αυξανόμενοι νευρώνες εκτεθούν στο Nogo-A οι αυξητικοί κώνοι καταρρέουν(casha and others 2005). Ο φυσιολογικός ρόλος του Nogo πολύ πιθανά επεκτείνεται και πέρα από την αναστολή της ανάπτυξης των νευραξόνων στη λευκή ουσία.οι Josephson et al βρήκαν ότι η μεταγραφική δραστηριότητα του NgR, γρήγορα αλλά σταδιακά μειώνεται από την αυξημένη νευρωνική δραστηριότητα, και πρότειναν τη θεωρία ότι ο NgR παίζει ένα σημαντικό ρόλο στον έλεγχο του πότε και πού επιτρέπεται η δομική αναδιαμόρφωση στη νευρόγλοια(josephson and others 2003). 19

Aλλαγές στα κανάλια ιόντων στους τραυματισμένους νευρώνες Η αξονότμηση οδηγεί σε εστιακή συσσώρευση ορθόδρομα μεταφερθέντων κυστιδίων που περιέχουν πρωτείνες (συμπεριλαμβανομένων των καναλιών ιόντων). Κάποια από αυτά μπορούν να εισέλθουν στη μεμβράνη των τραυματισμένων νευραξόνων, αυξάνοντας την πυκνότητα των καναλιών και αλλάζοντας τη διεγερσιμότητα της περιοχής. Έχει αποδειχθεί ότι κυρίως συσσωρεύονται δίαυλοι ευαίσθητοι στο δυναμικό, κυρίως νατρίου και καλίου. Μετατραυματικός νευρωνικός θάνατος Η διατομή ενός νεύρου σημαίνει ταυτόχρονα τον ακρωτηριασμό ενός μεγάλου μέρους του νευράξονα από το κύτταρο. Έτσι λοιπόν δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι ένα τέτοιο τραύμα μπορεί να οδηγήσει όχι μόνο σε βαθιές αλλαγές στη δομή του 20

κυτταρικού σώματος και της λειτουργίας του αλλά και σε κυτταρικό θάνατο. Ακόμα και μετά από άμεση μικροχειρουργική αποκατάσταση ενός διατμηθέντος νεύρου μπορεί να υπάρξει απώλεια της τάξης 20-50% σε νευρώνες των DRG. Εκτός από θάνατο αισθητικών κυττάρων ακόμα και κινητικά κύτταρα μπορούν να οδηγηθούν στο θάνατο, σε μικρότερη έκταση βέβαια και ακολουθώντας διαφορετικό χρονικό πλαίσιο. Η απόπτωση παίζει σημαντικό ρόλο στον μετατραυματικό κυτταρικό θάνατο. Αρκετοί παράγοντες είναι δυνατόν να επηρεάσουν την μετατραυματική απώλεια νευρώνων στα DRG, όπως ο χρόνος, η ηλικία, το χρονικό διάστημα από τη βλάβη έως την αποκατάσταση και η εγγύτητα της βλάβης. Το αποτέλεσμα εξαρτάται επίσης από τη μέθοδο που χρησιμοποιείται για την ανάλυση από τη χρονική στιγμή που διενεργείται η ανάλυση μετά τον τραυματισμό. 21

Οι McKay Hart et al (2002) μελέτησαν την πορεία προς τον κυτταρικό θάνατο σε DRG ποντικών μετά από διατομή του ισχιακού τους νεύρου. Βρέθηκε ότι ο θάνατος των αισθητικών κυττάρων αρχίζει μέσα σε 24 ώρες από το τραύμα αλλά χρειάζεται περίπου μια εβδομάδα για να μεταφραστεί σε σημαντική απώλεια νευρώνων. Ο ρυθμός του νευρωνικού θανάτου εμφάνισε μια κορυφή στις 2 εβδομάδες και έκλεισε τον κύκλο της στους 2 μήνες. Ο θάνατος των αισθητικών νευρώνων θα μπορούσε να είχε μειωθεί αισθητά εάν το νεύρο είχε αποκατασταθεί μέσα στις πρώτες 24 ώρες. Η συστηματική θεραπεία με ακέτυλο L-καρνιτίνη ( ALCAR) ή Ν-ακέτυλο-κυστείνη (ΝΑC) θα μπορούσε σχεδόν να εξαλείψει τον κυτταρικό θάνατο. Επιπρόσθετα, εάν νευροτροφικοί παράγοντες όπως ο NGF (σε αισθητικούς νευρώνες) και νευροτροφικοί παράγοντες προερχόμενοι από τον εγκέφαλο όπως ο BDNF ή νευτροτροφικοί παράγοντες από τα κύτταρα της γλοίας (GDNF) (σε κινητικούς νευρώνες), είχαν χορηγηθεί τότε η απώλεια των κυττάρων θα ήταν αξιοσημείωτα μικρότερη. Η αντίδραση των κινητικών νευρώνων μετά από διατομή νεύρου είναι λιγότερο αξιοσημείωτη από αυτή των αισθητικών νευρώνων και ακολουθεί διαφορετικό χρονικό μοτίβο. Η εγγύς διατομή του Α7 νωτιαίου νεύρου σε ποντίκι οδήγησε σε μία καθυστερημένη απώλεια κινητικών νευρώνων όπως αξιολογήθηκε με την ανάδρομη σήμανση. Το ποσό κυμάνθηκε από 8% μέχρι 21% σε 8 μοντέλα και 10 εβδομάδες αντίστοιχα από τη στιγμή της βλάβης. Σε πειραματικά μοντέλα, ο θάνατος των κινητικών κυττάρων (25% μετά από επαγόμενη ριζοτομή) μπορούσε να μειωθεί σημαντικά με τη χορήγηση NAC. To καλύτερο αποτέλεσμα παράχθηκε μετά από ενδοραχιαία χορήγηση, αλλά ακόμα και ενδοπεριτοναική χορήγηση προκάλεσε σημαντική μείωση. 22

Μεταφορά ουσιών στον νευράξονα Παράλληλα με την αύξηση σύνθεσης πρωτεϊνών στο κυτταρικό σώμα, υπάρχουν μεταβολές και στο γενικό τρόπο μεταφοράς ουσιών στον νευράξονα. Η φύση των ουσιών που μεταφέρονται αλλάζει, με μια αυξημένη παρουσία συστατικών που είναι απαραίτητα για την κατασκευή του αναγεννώμενου νευράξονα και με μια μείωση των ουσιών που σχετίζονται με τη μετάδοση του σήματος στη σύναψη. Στο υπογλώσσιο νεύρο κουνελιών, η αργή μεταφορά πρωτεϊνών βρέθηκε να διπλασιάζεται σε 7 με 9 μέρες μετά από συνθλιπτική βλάβη, επιστρέφοντας στο φυσιολογικό στις 23 με 31 μέρες. Οι αλλαγές στη γρήγορη μεταφορά ουσιών κατά μήκος των νεύρων των θηλαστικών μετά από αξονοτομή φαίνεται να αφορά κυρίως αλλαγή στην ποσότητα των ουσιών που μεταφέρονται και όχι στο ρυθμό με τον οποίο μεταφέρονται. Στο υπογλώσσιο νεύρο ινδικών χοιριδίων το ποσό των γρήγορα μεταφερόμενων ουσιών αυξήθηκε ως και 250% ένα μήνα μετά τον τραυματισμό. Σε διετμημένα και αποκατεσταθέντα υπογλώσσια νεύρα, το ποσό των ταχέως μεταφερόμενων πρωτεϊνών παρέμεινε υψηλό για τουλάχιστον 3 μήνες μετά τον τραυματισμό, όπως αναφέρεται από τον Danielsen και τους συνεργάτες του (1986b). 23

Φυσιολογικά κάποια από τις ουσίες που μεταφέρονται κατά τη φορά του άξονα αντιστρέφουν την πορεία τους στο τέλος και μεταφέρονται αντίδρομα. Όταν ο νευράξονας κόβεται κάποιες από αυτές τις ουσίες αντιστρέφουν την πορεία τους στη θέση της βλάβης. Αυτή η αναστροφή της πορείας στη θέση της βλάβης, στο σημείο τομής του άξονα, εγκαθίσταται μέσα σε ώρες, έτσι ώστε μεγάλο ποσό των ουσιών που φυσιολογικά θα συνέχιζαν και θα διανέμονταν στο άκρο του νευράξονα μεταφέρονται αντίδρομα προς το κυτταρικό σώμα. Μετά από αξονότμηση αυτό πλέον δε μπορεί να συμβεί. Εκβλάστηση και ανάπτυξη των αναγεννητικών μονάδων Με την καταστροφή ή τη διατομή ενός νευρικού στελέχους, σημαντικές αλλαγές συμβαίνουν στη φυσιολογική του μορφολογία και στην οργάνωση του ιστού που βρίσκεται κοντά ή μακριά από τη βλάβη. Η αξονική αναγέννηση μελετήθηκε εκτεταμένα πριν από 100 χρόνια από τον Cajal και τα περισσότερα από τα ευρήματά του αργότερα επιβεβαιώθηκαν από άλλους επιστήμονες που χρησιμοποίησαν πιο εξειδικευμένες μεθόδους. Ο Cajal περιέγραψε το σχηματισμό των αυξητικών κώνων και αναπαράστησε σχηματικά την αξονική συμπεριφορά στο εγγύς νευρικό τμήμα, στο διάμεσο χάσμα και στο περιφερικό τμήμα. Στο εγγύς τμήμα ο άξονας εκφυλίζεται μέχρι κάποια απόσταση από τη θέση της βλάβης, αφήνοντας τους ενδονεύριους σωλήνες- τη βασική μεμβράνη των κυττάρων Schwann- πίσω σαν άδειους κυλίνδρους. Αυτή η ανάδρομη εκφύλιση μπορεί να επεκταθεί σε ένα ή περισσότερα διακομβικά τμήματα ( κόμβος ή περίσφιξη του Ranvier), με την έκτασή της να εξαρτάται από τη σοβαρότητα της βλάβης. Μέσα στις πρώτες μέρες μετά τη διατομή, οι εμμύελοι άξονες στο εγγύς τμήμα παράγουν ένα μεγάλο αριθμό εκβλαστήσεων οι 24

οποίες ενώ απομακρύνονται αυξάνονται. Οι εκβλαστήσεις εμφανίζονται κοντά στους κόμβους του Ranvier(παράπλευρη εκβλάστηση), σε ένα επίπεδο όπου ο άξονας παραμένει άθικτος, και απομακρύνονται προχωρώντας στο εσωτερικό του σωλήνα που σχηματίζεται από τη βασική μεμβράνη. Επίσης οι εκβλαστήσεις προέρχονται και από την άκρη του εναπομείναντος νευράξονα ( terminal sprouts). Ήδη μέσα σε ώρες από την αξονότμηση, μικρές αξονοπλασματικές εκβλαστήσεις παρατηρούνται από την άκρη του αξονοπλάσματος. Αυτό το πρώτο κύμα εκβλαστήσεων φαίνεται τελικά να εξαφανίζεται, όμως ακολουθείται από ένα δεύτερο κύμα που εμφανίζεται μέσα στις 2 πρώτες μέρες. Οι πρώιμες εκβλαστήσεις προφανώς εκφυλίζονται πριν συμβεί η οριστική φάση της εκβλάστησης. Ο χρόνος που απαιτείται ώστε οι οριστικές εκβλαστήσεις να κάνουν την εμφάνισή τους αποδίδεται στον αγγλικό όρο initial delay. Η μορφολογία της νευρικής αναγέννησης μελετήθηκε πρόσφατα( Brushart and Witzel, 2003) χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο από ισχιακά νεύρα ποντικιών που εξέφραζαν την κιτρινόχρωμη φθορίζουσα πρωτεΐνη YFP σε ένα μέρος των DRG και των κινητικών τους νευρώνων. Οι αναγεννητικές εκβλαστήσεις έδειξαν μια μεγάλη 25