ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΝΕΥΡΟΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΓΕΝΙΚΟ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ ΠΑΤΡΩΝ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΝΕΥΡΟΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΓΕΝΙΚΟ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ ΠΑΤΡΩΝ Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Κλινικών & Κλινικοεργαστηριακών Ειδικοτήτων (Νευροχειρουργική) ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΛΕΤΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΤΗΣ ΧΡΟΝΙΑΣ ΑΥΧΕΝΙΚΗΣ ΜΥΕΛΟΠΑΘΕΙΑΣ ΣΠΥΡΙΔΩΝ Κ. ΚΑΡΑΔΗΜΑΣ ΙΑΤΡΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: Αναπληρωτής Καθηγητής κ. ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΓΚΑΤΖΟΥΝΗΣ ΠΑΤΡΑ 2013

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Γκατζούνης Γεώργιος Αναπληρωτής Καθηγητής Νευροχειρουργικής, Πανεπιστημίου Πατρών- Επιβλέπων Παναγιωτάκης Γεώργιος Καθηγητής Ιατρικής Φυσικής, Πανεπιστημίου Πατρών, Μέλος Αθανασία Μουζάκη Καθηγήτρια Εργαστηριακής Αιματολογίας-Αιμοδοσίας Πατρών, Πανεπιστημίου, Μέλος

ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Γκατζούνης Γεώργιος Αναπληρωτής Καθηγητής Νευροχειρουργικής, Πανεπιστημίου Πατρών- Επιβλέπων Παναγιωτάκης Γεώργιος Καθηγητής Ιατρικής Φυσικής, Πανεπιστημίου Πατρών Αθανασία Μουζάκη Καθηγήτρια Εργαστηριακής Αιματολογίας-Αιμοδοσίας Πατρών, Πανεπιστημίου Καλλίτσης Ιωάννης Καθηγητής Χημείας, Πανεπιστημίου Πατρών Παπαδάκη-Πέτρου Ελένη Καθηγήτρια Ανατομίας, Πανεπιστημίου Πατρών Κρίτων Φίλος Καθηγητής Αναισθησιολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών Καθηγητής Oρθοπαιδικής, Πανεπιστημίου Πατρών Παπαθανασόπουλος Παναγιώτης Καθηγητής Νευρολογίας, Πανεπιστημίου Πατρών

Αφιερώνεται στους αγαπημένους μου γονείς Κωνσταντίνο & Παναγιώτα και στην αδερφή μου Δήμητρα

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Με την ευκαιρία της ολοκλήρωσης της διδακτορικής μου διατριβής θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όλους όσους με βοήθησαν και μου συμπαραστάθηκαν στην προσπάθειά μου αυτή. Ευχαριστώ θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή και δάσκαλό μου κύριο Γεώργιο Γκατζούνη για τις πολυτιμότατες συμβουλές του και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε. Θεωρώ τον εαυτό μου ιδιαίτερα τυχερό, που στην απαρχή της σταδιοδρομίας μου, μετά το πέρας των προπτυχιακών σπουδών μου γνώρισα τον κ. Γκατζούνη. Η συνεργασία μαζί του όλο αυτό το διάστημα επηρέασε βαθιά τη μέχρι τώρα πορεία και σκέψη μου. Θέλω θερμά να ευχαριστήσω τα δύο υπόλοιπα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής για την κατανόησή τους και τις πολύτιμες συμβουλές τους όλο αυτό το διάστημα της εκπαίδευσής μου. Εκφράζω τις ατελείωτες ευχαριστίες μου προς τη διευθύντρια του Εργαστηρίου Ανατομικής Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κυρία Ελένη Παπαδάκη καθώς και το προσωπικό του Εργαστηρίου της Ανατομίας για την αμέριστη στήριξη που μου παρείχαν αυτό το διάστημα. Επίσης θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου πρoς τη χημικό κ. Αικατερίνη Ανδρεοπούλου και τον καθηγητή Χημείας κ. Ιωάννη Καλλίτση από το Εργαστήριο Πολυμερών του τμήματος της Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών. Και οι δύο είχαν σημαντική συμβολή στην παραγωγή του αρωματικού πολυαιθέρα που χρησιμοποιήθηκε και στις δύο μελέτες της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Διαβάζοντας τη συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή θα μπορέσετε να καταλάβετε πόσο αναπόσπαστο κομμάτι της μελέτης ήταν ο αρωματικός πολυαιθέρας και κατά συνέπεια πόσο κεφαλαιώδους σημασίας για την ολοκλήρωση της διδακτορικής διατριβής ήταν η συμβολή της κ. Ανδρεοπούλου και του κ. Καλλίτση.

Τέλος θέλω να ευχαριστήσω το νευροχειρουργό Γεώργιο Κληρονόμο, χωρίς τη βοήθεια του οποίου δεν θα μελετούσατε αυτή τη στιγμή το συγκεκριμένο σύγγραμμα. Σπυρίδων Κ. Καραδήμας

ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΑ ΚΑΙ ΣΥΝΕΔΡΙΑ ΣΧΕΤΙΚΕΣ ΜΕ ΤΟ ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ: 1. S.K. Karadimas, G. Klironomos, D.J.Papachristou, S. Papanikolaou, E. Papadaki, G.Gatzounis. p50, p65, MMP-2, MMP-9, u-pa expression in glial cells and neurons of cervical spinal cord in a rabbit animal model with cervical spondylotic myelopathy. Spine (Phila Pa 1976). 2013 Jan 1;38(1):4-10. 2. G. Klironomos, S.K. Karadimas, A. Mavrakis, E. Papadaki, P.Mirilas, I. Sawwas, D.J. Papachristou, G. Gatzounis. New experimental rabbit animal model for Cervical Spondylotic Myelopathy. Spinal Cord. 2011;49(11):1097-102. 3. S.K. Karadimas, Ch. Gialeli, G.Klironomos, G.Tzanakakis, E. Panagiotopoulos, N.K. Karamanos, G. Gatzounis The role of the oligodendrocytes in the molecular pathobiology and potential molecular treatment of cervical spondylotic myelopathy. Current Medicinal Chemistry 2010;17(11):1048-58. 1

ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΑ ΣΥΝΕΔΡΙΑ: 1. S.K. Karadimas, G.Klironomos, A.Mavrakis, E. Panagiotopoulos, E. Papadaki, G. Gatzounis. p50 and p65 expression in glial cells and neurons of cervical spinal cord in a rabbit animal model with cervical spondylotic myelopathy. Cervical Spine Research Society- European Section, Annual meeting May 2010. (Poster presentation) 2. S.K. Karadimas, G.Klironomos, A. Mavrakis, E. Papadaki, G.Gatzounis. MMP-9, MMP-2, u-pa expression in glial cells and neurons of cervical spinal cord in a rabbit animal model with cervical spondylotic myelopathy. 24 th Annual Meeting of the Hellenic Neurosurgical Society. May 2010. (Podium presentation) 3. S.K. Karadimas, G. Klironomos, E. Papadaki, M.G. Fehlings, G. Gatzounis. Increased expression of NF-kB/p50, NF-kB/p65, MMP-and MMP-9 in a new animal model of cervical spondylotic myelopathy. Cervical Spine Research Society- European Section, 27 th Annual meeting June 2011. (Poster presentation) 4. S.K. Karadimas, G. Klironomos, E. Papadaki, M.G. Fehlings, G. Gatzounis. Development and characterization of a novel rabbit model of cervical spondylotic myelopathy. Congress of Neurological Surgeons, Annual Meeting, October 2011. (Poster presentation). 26 th 2

Σκοπός της διδακτορικής διατριβής Μελέτη Α ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΟΣ ΠΡΩΤΟΤΥΠΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ ΑΥΧΕΝΙΚΗΣ ΣΠΟΝΔΥΛΩΤΙΚΗΣ ΜΥΕΛΟΠΑΘΕΙΑΣ (ΑΣΜ) Στη μελέτη Α διερευνήθηκε, αν η εμφύτευση ενός αρωματικού πολυαιθέρα με συγκεκριμένες ιδιότητες κάτω από το πέταλο του έκτου αυχενικού σπονδύλου οδηγεί στην ανάπτυξη χρόνιας και προοδευτικής πίεσης του νωτιαίου μυελού, η οποία επακόλουθα οδηγεί στην ανάπτυξη των κύριων νευρολογικών εκδηλώσεων της ΑΣΜ καθώς επίσης και στην αναπαραγωγή των κυριότερων ιστοπαθολογικών χαρακτηριστικών της ανθρώπινης νόσου. Επιδιώχθηκε να απαντηθούν τα εξής ερωτήματα: α) Οδηγεί η εμφύτευση του αρωματικού πολυαιθέρα σε κατακρήμνιση αλάτων ασβεστίου και φωσφόρου, στην επακόλουθη δημιουργία νέου οστεοειδούς με αποτέλεσμα την πίεση του νωτιαίου μυελού; β) Ήταν ήπια ή ύπουλη η εμφάνιση των συμπτωμάτων στα πειραματόζωα που υποβλήθηκαν σε εμφύτευση του αρωματικού πολυαιθέρα; γ) Ήταν η πορεία των συμπτωμάτων προοδευτικά επιδεινούμενη; γ) Τα νευρολογικά ελλείμματα των πειραματόζωων με χρόνια πίεση του νωτιαίου μυελού ήταν παρόμοια με εκείνα που εμφανίζουν ασθενείς με ΑΣΜ; δ) Τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά που εμφανίστηκαν στα δείγματα νωτιαίων μυελών που υπέστησαν χρόνια πίεση ήταν ίδια με τα χαρακτηριστικά ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της ανθρώπινης νόσου; 3

Η μελέτη δημοσιεύτηκε στο έγκριτο Περιοδικό Νωτιαίος Μυελός (G. Klironomos, S.K. Karadimas, A. Mavrakis, E. Papadaki, P.Mirilas, I. Sawwas, D.J. Papachristou, G. Gatzounis. New experimental rabbit animal model for Cervical Spondylotic Myelopathy. Spinal Cord. 2011;49(11):1097-102). Επίσης η μελέτη παρουσιάστηκε στο ετήσιο επιστημονικό συνέδριο του Αμερικανικού Κολλεγίου Νευροχειρουργών (S.K. Karadimas, G. Klironomos, E. Papadaki, M.G. Fehlings, G. Gatzounis. Development and characterization of a novel rabbit model of cervical spondylotic myelopathy. Congress of Neurological Surgeons, Annual Meeting, October 2011). 4

Μελέτη Β ΑΠΟΣΑΦΗΝΙΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΤΗΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ (MMP-2, MMP-9, u-pa) KAI TOY METAΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ NF-κB ΣΤΗΝ ΑΣΜ. Στη μελέτη διερευνήθηκε, για πρώτη φορά, η έκφραση των πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας, MMP-9, MMP-2, u-pa καθώς επίσης και των υπομονάδων p50 και p65 μεταγραφικού παράγοντα NF-κ στη ΑΣΜ. Επιδιώχθηκε να απαντηθούν τα εξής ερωτήματα: α) Ποια ήταν τα επίπεδα έκφρασης της μεταλλοπρωτεάσης-9 και της μεταλλοπρωτεάσης-2 στην ΑΣΜ; β) Ποια ήταν τα επίπεδα έκφρασης του u-pa στην ΑΣΜ; γ) Ποια ήταν τα επίπεδα έκφρασης των υπομονάδων p50 και p65 του μεταγραφικού παράγοντα ΝF-κ στην ΑΣΜ; δ) Υπήρχε σημαντικά θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των προηγούμενων αναφερθεισών πρωτεινών στους παθολογικούς μυελούς; 5

Η μελέτη δημοσιεύτηκε στο έγκριτο Περιοδικό Σπονδυλική Στήλη (S.K. Karadimas, G. Klironomos, D.J.Papachristou, S. Papanikolaou, E. Papadaki, G.Gatzounis. p50, p65, MMP-2, MMP-9, u-pa expression in glial cells and neurons of cervical spinal cord in a rabbit animal model with cervical spondylotic myelopathy. Spine (Phila Pa 1976) 2012 Jun 5, Epub ahead of print]. Επίσης τμήματα της μελέτης παρουσιάστηκαν μελέτη παρουσιάστηκε στα ετήσια επιστημονικά συνέδρια της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Έρευνας της Αυχενικής Μοίρας της Σπονδυλικής Στήλης και της Ελληνικής Νευροχειρουργικής Εταιρείας. 6

7

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. Γενικό Μέρος ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Στοιχεία εμβρυϊκής ανάπτυξης του νευρικού συστήματος 14 1.2 Στοιχεία ανατομικής του νωτιαίου μυελού 16 1.3 Στοιχείο ιστολογίας του νευρικού συστήματος 23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΑΥΧΕΝΙΚΗ ΣΠΟΝΔΥΛΩΤΙΚΗ ΜΥΕΛΟΠΑΘΕΙΑ (ΑΣΜ) Εισαγωγή 28 2.1 Επισημιολογία 29 2.2 Κλινική εικόνα της ΑΣΜ 31 α. Φυσική εξέλιξη της νόσου 31 β. Συμπτωματολογία και Σημειολογία 32 2.3 Κλινική Αντιμετώπιση 34 2.4 Παθοφυσιολογία και Παθολογία της ΑΣΜ 35 2.5 Ισχύουσα γνώση των μοριακών μηχανισμών της ΑΣΜ 37 8

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΑΣΜ 3.1 Γενικά 43 3.2 Ανασκόπηση πειραματικών μοντέλων ΑΣΜ 44 3.3 Μειονεκτήματα υπαρχόντων μονέλων ΑΣΜ 47 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΚΑΙ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ 4.1 Ο μεταγραφικός παράγοντας NF-Κb 50 4.2 Οι μεταλλοπρωτεινάσες 51 9

Ειδικό μέρος ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΟΣ ΠΡΩΤΟΤΥΠΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ ΑΣΜ 1. Υλικό 56 1.1 Πειραματόζωα 56 1.2 Υλικό πρόκλησης πιέσεως 57 1.3 Πειραματικές Ομάδες 58 2. Μεθοδολογία 59 2.1 Πρωτόκολλο αναισθησίας 59 2.2 Χειρουργικό Πρωτόκολλο 59 2.3 Πρωτόκολλο Νευρολογικής Εκτίμησης 60 2.4 Ηλεκτροφυσιολογία 61 2.5 Πρωτόκολλο Μονιμοποίησης και Παρασκευής Νωτιαίων Μυελών 61 2.6 Ιστοχημεία 62 α. Χρώση Αιματοξυλίνης Ηωσίνης 62 β. Χρώση Kluver Barreara 62 2.7 Μέθοδος in situ υβριδισμού TUNEL (κατακερματισμένου DNA) για την ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων 62 2.8 Ανοσοιστοχημεία 65 α. Πρωτόκολλο 65 β. Διαλύματα 66 γ. Αντισώματα 67 δ. Αξιολόγηση Ανοσοιστοχημικής Χρώσης 67 2.9 Έμμεσος Ανοσοφθορισμός 69 2.10 Στατιστική Ανάλυση 71 3. Αποτελέσματα 72 10

4. Συζήτηση των αποτελεσμάτων 89 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΑΠΟΣΑΦΗΝΙΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΤΗΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ (MMP-2, MMP-9, u-pa) KAI TOY METAΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ NF-κB ΣΤΗΝ ΑΣΜ. 1. Υλικό 99 1.1 Πειραματόζωα 99 1.2 Πειραματικό Μοντέλο ΑΣΜ 99 1.3 Πειραματικές Ομάδες 99 2. Μεθοδολογία 100 2.1 Πρωτόκολλο Αναισθησίας 100 2.2 Χειρουργικό Πρωτόκολλο 100 2.3 Πρωτόκολλο Μονιμοποίησης και Παρασκευής Νωτιαίων Μυελών 100 2.4 Ανοσοιστοχημεία 100 α. Πρωτόκολλο 100 β. Διαλύματα 100 γ. Αντισώματα 100 δ. Αξιολόγηση Ανοσοιστοχημικής Χρώσης 100 2.5 Στατιστική Ανάλυση 102 3. Αποτελέσματα 103 4. Συζήτηση των αποτελεσμάτων 112 ΑBSTRACT 117 11

STUDY Α 118 STUDY 119 Ι ΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 121 12

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 13

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Στοιχεία εμβρυϊκής ανάπτυξης του νευρικού συστήματος Πριν από την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος κατά την εμβρυική φάση, τρία κύρια βλαστικά δέρματα διαφοροποιoύνται. Το ενδότερο ονομάζεται εσώδερμα και από αυτό προέρχονται τα επιθήλια του αναπνευστικού συστήματος, του πεπτικού συστήματος, της ουροδόχου κύστης, της ουρήθρας, του φάρυγγα, του ακουστικού σωλήνα και του θύμου αδένα. Το μεσαίο βλαστικό δέρμα παρεμβάλλεται ανάμεσα στο εξώδερμα και στο εσώδερμα και το οποίο σχηματίζεται στο στάδιο του γαστριδίου της εμβρυϊκής ανάπτυξης των τριπλοβλαστικών οργανισμών. Από το μεσόδερμα σχηματίζονται οι συνδετικοί ιστοί, τα περισσότερα οστά, οι μύες, ο χόνδρος, το αίμα, η λέμφος, ο μυελός των οστών, το ενδοθήλιο των αιμοφόρων αγγείων, τα νεφρά, οι ουρητήρες, τα γεννητικά όργανα. To τρίτο βλαστικό δέρμα ονομάζεται εξώδερμα και αποτελείται από το εξωτερικό εξώδερμα, τη νευρική ακρολοφία και το νευρικό σωλήνα. Tο νευρικό σύστημα προέρχεται από τη νευρική πλάκα, μια κεντρική περιοχή του εξωδέρματος, η οποία στα περιφερικά όριά της λόγω της έντονης πολλαπλασιαστικής δραστηριότητας των κυττάρων «πτυχώνεται» δημιουργώντας τη νευρική αύλακα. Καθώς τα χείλη της νευρικής αύλακας διογκώνονται και συμπλησιάζουν στη μέση γραμμή αρχίζει να δημιουργείται ο νευρικός σωλήνας. Ο νευρικός σωλήνας παραμένει ανοιχτός στο κεφαλικό και ουραίο άκρο του στα αρχικά στάδια της ανάπτυξής του τα οποία και ονομάζονται αντίστοιχα πρόσθιος και οπίσθιος νευροπόρος και η σύγκλεισή του ολοκληρώνεται την 27 η περίπου ημέρα με το κλείσιμο του οπισθίου νευροπόρου [1]. 14

Το κεντρικό νευρικό σύστημα προέρχεται από τη διαφοροποίηση τμημάτων του νευρικού σωλήνα, μια διαδικασία που συντελείται σε δύο άξονες: τον κεφαλοουραίο και τον κοιλιακό ραχιαίο άξονα. Η διαφοροποίηση κατά μήκος του κεφαλοουραίου άξονα είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη του προσθίου, του μέσου του οπισθίου εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού ενώ η διαφοροποίηση κατά μήκος του κοιλιοραχιαίου άξονα θα οδηγήσει στη δημιουργία της εδαφιαίας και οροφιαίας περιοχής του νευρικού σωλήνα. 15

1.2 Στοιχεία ανατομικής του νωτιαίου μυελού Α. Ιστορική Αναδρομή Ο Γαληνός περιγράφει τους σπονδύλους, τις ρίζες των νωτιαίων νεύρων, τον οπίσθιο επιμήκη σύνδεσμο, τη σκληρά και τη χοριοειδή μήνιγγα του νωτιαίου μυελού. Αναφέρει ότι η κινητική και η αισθητική λειτουργικότητα χάνεται κάτω από το επίπεδο της βλάβης, ανάλογα με το μέγεθος και τον εντοπισμό της. Ονομάζει τις ανατομικές ανωμαλίες τις σπονδυλικής στήλης κύφωση, λόρδωση και σκολίωση. Επιβεβαιώνει πολλές από τις παρατηρήσεις του Ιπποκράτη και της Imhotep, σχετικά με τις νευρολογικές συνέπειες του αυχενικού τραύματος [2]. Το 1666 μ.χ. εκδόθηκε από τον Gerard Blaes (Blasius) το Anatome Medullae Spinalis. Στη συγκεκριμένη έκδοση παρατίθενται συγκριτικές ανατομικές περιγραφές 119 ζώων. Ο Blasius περιγράφει τις πρόσθιες και τις οπίσθιες ρίζες των νωτιαίων νεύρων και διαχωρίζει τη φαιά από τη λευκή ουσία του νωτιαίου μυελού. Μάλιστα, διακρίνει το σχήμα Η της φαιάς ουσίας. Συγκεκριμένα η έκδοση αυτή αποτελεί την πρώτη επιστημονική περιγραφή όπου η λευκή ουσία διαχωρίζεται από την φαιά ουσία [3, 4]. To 1846 μ.χ. o ανατόμος και χειρουργός Benedict Stilling αναφέρει ότι η φαιά ουσία είναι το κέντρο της σπονδυλικής στήλης, όχι μόνο από την πλευρά της ανατομίας αλλά και της φυσιολογίας. Επίσης περιγράφει την επιμήκη ή την χιαζόμενη πορεία των δεματίων και παρατηρεί ότι τα κέρατα της φαιάς ουσίας συνδέονται με την πρόσθια λευκή ουσία [2]. 16

Β. Μακροσκοπική Περιγραφή Το σχήμα του νωτιαίου μυελού είναι σχεδόν κυλινδρικό. Ο νωτιαίος μυελός ξεκινάει από το μείζον ινιακό τρήμα, ακριβώς στο σημείο που ο προμήκης μυελός διαχωρίζεται από τον εγκέφαλο. Το κατώτερο άκρο του νωτιαίου μυελού καταλήγει στον ενήλικα στο επίπεδο του χαμηλότερου ορίου του πρώτου οσφυικού σπονδύλου. Αντιθέτως στο έμβρυο και στα νεογνά καταλήγει στο επίπεδο Ο3 με Ο4. Αυτό συμβαίνει διότι κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης η σπονδυλική στήλη αναπτύσσεται ταχύτερα από το νωτιαίο μυελό. Κοιλιακά εμφανίζει μια βαθιά σχισμή, την πρόσθια μέση αύλακα και ραχιαία μια επιφανειακή αύλακα, από την οποία το οπίσθιο μέσο διάφραγμα εισέρχεται εντός του νευρικού ιστού. Το οπίσθιο μέσο διάφραγμα με τον νωτιαίο μυελό συνδέεται με το ατελές οπίσθιο αραχνοειδές διάφραγμα του υπαραχνοειδούς χώρου. Στην αυχενική περιοχή, όπου βρίσκεται η απαρχή του βραχιονίου πλέγματος, καθώς επίσης και στην ανώτερη οσφυική περιοχή όπου βρίσκεται η απαρχή του οσφυοιερού πλέγματος ο νωτιαίος μυελός εμφανίζει δύο συμμετρικές ατρακτοειδείς παχύνσεις: το αυχενικό και το οσφυικό όγκωμα αντιστοίχως. Τα εξογκώματα αυτά σχηματίζονται από αυξημένη συγκριτικά μάζα των κινητικών κυττάρων που βρίσκεται στις περιοχές αυτές. Συνολικά υπάρχουν 31 ζελυγη νωτιαίων νεύρων: 8 αυχενικά, 12 θωρακικά, 5 οσφυικά, 5 ιερά και 1 κοκκυγικό. Πολαπλά ριζίδια εκφύονται από την προσθιοπλάγια αύλακα και οπισθοπλάγια επιφάνεια του νωτιαίου μυελού. Τα ριζίδια αυτά συγκλίνουν και συνενώνονται για να αποτελέσουν την πρόσθια και οπίσθια ρίζα των νωτιαίων νεύρων αντίστοιχα. Oι δύο ρίζες ενώνονται για να σχηματίσουν το στέλεχος του νεύρου το οποίο στην έξοδο του μεσοσπονδύλιου τρήματος διασπάται στον πρόσθιο και στον οπίσθιο κλάδο αφού πρώτα μέσω της οπίσθιας ρίζας έχει συναφθεί με το νωτιαίο γάγγλιο. To Α1 νωτιαίο νεύρο δεν εμφανίζει οπίσθιες ρίζες στο 50% των ανθρώπων. 17

Γ. Εσωτερική Κατασκευή Ο νωτιαίος μυελός αποτελείται από μια κεντρική μάζα φαιάς ουσίας, που σχηματίζει μια στήλη που περιβάλλει το κεντρικό κανάλι. Η μάζα αυτή περιβάλλεται εξωτερικά από μια μάζα λευκής ουσίας. Γ.1 Φαιά Ουσία To μέγεθος της φαιάς ουσίας σε κάθε επίπεδο του νωτιαίου μυελού σχετίζεται με την ποσότητα των μυών που νευρώνονται από το συγκεκριμένο επίπεδο. Για παράδειγμα η φαιά ουσία στη περιοχή της του αυχενικού ογκώματος περειέχει τα νευρικά κύτταρα που νευρώνων τους μύες των άνω άκρων και είναι σαφώς μεγαλύτερη από εκείνη που συναντάται στη θωρακική μόιρα. Στη φαιά ουσία διακρίνονται τρία κέρατα. Το πρόσθιο εκτείνεται ως το άκρο της επιφάνειας του νωτιαίου μυελού, και περιέχει νευρικά κύτταρα για τους επιμήκης μύες του κορμού (έσω τμήμα), νευρικά κύτταρα για τους μύες των άκρων (έξω τμήμα) καθώς επίσης και τους διανευρώνες [5]. Οι α-κινητικοί νευρώνες που εδράζονται στο πρόσθιο κέρας εμφανίζουν σωματοτροπική διάταξη [5]. Το οπίσθιο κέρας ενώνεται με την επιφάνεια του νωτιαίου μυελού με ζελατινοειδή ουσία και περιέχει συνδετικά νευρικά κύτταρα τόξων των νωτιαίων αντανακλαστικών [6]. Η ζελατινοειδής ουσία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μετάδοση των επώδυνων ερεθισμάτων. Το πλάγιο κέρας σχηματίζεται σε μικρή προέκταση μεταξύ προσθίου και οπισθίου κέρατος και περιέχει ομάδες προγαγγλιονικών κυττάρων του συμπαθητικού τμήματος του αυτόνομου νευρικού συστήματος [6]. To πλάγιο κέρας περιορίζεται στη θωρακικό τμήμα του νωτιαίου μυελού καθώς επίσης και στα δύο ανώτερα επίπεδα του οσφυικού τμήματος [5]. 18

Γ.2. Λευκή Ουσία Η περιφερικά τοποθετημένη λευκή ουσία, περιέχει νευρικές ίνες και νευρογλοιακά κύτταρα. Το πάχος της αυξάνει προοδευτικά από την ιερή προς την αυχενική μοίρα λόγω της παρουσίας όλο και περισσότερων απαγωγών και προσαγωγών νευρικών ινών. Οι νευρικές ίνες μπορεί να είναι ανιούσες, κατιούσες ή διατμηματικές. Η λευκή ουσία χωρίζεται από τα κέρατα της φαιής ουσίας σε οπίσθια, πλάγια και πρόσθια δέσμη. Η οπίσθια και πλάγια στήλη περιέχει ανιούσες και κατιούσες ίνες. Κατά μήκος του χείλους της φαιάς ουσίας στο εσωτερικό της λευκής ουσίας βρίσκονται οι διατμηματικές ίνες, που σχηματίζουν τον δικτυωτό σχηματισμό [6]. Στις οπίσθιες δέσμες (ραχιαίες στήλες) ανευρίσκονται οι ανιούσες ίνες του ισχνού κ σφηνοειδούς δεματίου. Από τις συγκεκριμένες ίνες μεταφέρονται στο θάλαμο πληροφορίες σχετικά με τα ερεθίσματα πόνου, πίεσης, διαχωρισμού και ιδιοδέκτρια ερεθίσματα από αρθρώσεις συνδέσμους, τένοντες και μυς. Tα δύο σημαντικότερα δεμάτια της πλάγιας στήλης είναι το το πλάγιο φλοιονωτιαίο δεμάτιο ή πυραμιδική οδός και η ερυθρονωτιαία οδός [7]. Στην πρόσθια στήλη και ακριβώς δίπλα από τη μέση πρόσθια πτυχή εδράζεται στο πρόσθιο φλοιονωτιαίο δεμάτιο. Οι ίνες του πρόσθιο φλοιονωτιαίο δεμάτιο χιάζονται και συάπτονται με τα με τα κύτταρα του μέσου προσθίου κέρατος. Το κύριον ανιόν δεμάτιο της πρόσθιας και πλάγιας στήλης, γνωστό ως προσθιοπλάγιον δεμάτιο αποτελεί την κύρια οδό πόνου και θερμοκρασίας. Δ. Μήνιγγες Ο νωτιαίος μυελός όπως και ο εγκέφαλος περιβάλλεται και προστατεύεται εξωτερικά από από τρεις μήνιγγες: την σκληρά, την αραχνοειδή και την χοριοειδή με κατεύθυνση από έξω προς τα μέσα. 19

Η σκληρά μήνιγγα είναι μια ινώδης μεμβράνη πυκνής και σκληρής υφής που σχηματίζεται από ελαστικές ίνες με επιμήκη φορά και αποτελεί τη συνεχεια της σκληράς μήνιγγας του εγκεφάλου. Στο κρανίο η σκληρά μήνιγγα χωρίζεται σε δύο πέταλα. Το εξωτερικό που είναι στενά προσκολλημένο στο περιόστεο και στο εσωτερικό που περικλείει τον εγκέφαλο. Στο νωτιαίο σωλήνα η εξωτερική επιφάνεια της σκληράς μήνιγγας έρχεται σε χαλαρή επαφή με το περιόστεο του νωτιαίου σωλήνα και χωρίζεται από τα τοιχώματα με τον επισκληρίδιο χώρο. Ο χώρος αυτός περιέχει χαλαρό αγγειώδη ιστό και το έσω φλεβικό πλέγμα. Το μηνιγγικό πέταλο συνεχίζει κυκλοτερώς ως σκληρά μήνιγγα κ σχηματίζει το νωτιαίο σάκο από το σημείο που προσκολλάται σταθερά στο ινιακό τρήμα μέχρι το επίπεδο του Ι2 όπου καταλήγει κ διατιτραίνεται από το τελικό νημάτιο του νωτιαίου μυελού. Η σκληρά μήνιγγα προβάλλει κατά μήκος κάθε νευρικής ρίζας, περιβάλλοντας με συνδετικό ιστό κάθε νωτιαίο νεύρο (περινεύριο) [6]. Η αραχνοειδής μήνιγγα είναι μια λεπτή αδιαπέραστη μεμβράνη που στερείται αιμοφόρων αγγείων. Περιβάλλει το νωτιαίο μυελό και βρίσκεται μεταξύ της χοριοειδούς μήνιγγας εσωτερικά και της σκληράς εξωτερικά. Διαχωρίζεται από την χοριοειδή μήνιγγα με τον υπαραχνεοιδή χώρο ο οποίος οποίος περιέχει το εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Μεταξύ αυτής και της σκληράς μήνιγγας βρίσκεται ο υποσκληρίδιος χωρος. Η χοριοειδής μήνιγγα είναι μια αγγειώδης μεμβράνη που καλύπτεται από αποπλατυσμένα μεσοθηλιακά κύτταρα και επενδύει το νωτιαίο μυελό. Σε κάθε πλευρά εμφανίζει πάχυνση μεταξύ των προσθίων και οπισθίων ριζών σχηματίζοντας τον οδοντωτό σύνδεσμο. Η χοριοειδής μήνιγγα εκτείνεται κατά μήκος κάθε νωτιαίας ρίζας. Ε. Αρτηριακό και Φλεβικό Δίκτυο Νωτιαίου Μυελού Ε.1 Αρτηρίες Γενικά ο νωτιαίος μυελός αιματώνεται από δύο πηγές: 20

1) τα επιμήκη αγγεία 2) τις μεταμερείς νωτιαίες αρτηρίες (ριζικές αρτηρίες) Τα επιμήκη αγγεία αποτελούνται από τη (μονή) πρόσθια και (αριστερά και δεξιά) οπίσθια νωτιαία αρτηρία που κατέρχονται από το μέγα τρήμα και σχηματίζουν τρία επιμήκη κανάλια των οποίων κλάδοι εισέρχονται εντός του νωτιαίου μυελού. Η πρόσθια νωτιαία αρτηρία σχηματίζεται με συμμετοχή κλάδων της αριστερής και δεξιάς εγκεφαλικής αρτηρίας και βρίσκεται επί της πρόσθιας μέσης πτυχής. Αιματώνει το πρόσθιο τμήμα του νωτιαίου μυελού ως τις οπίσθιες στήλες της φαιάς ουσίας. Αντιστοίχως, κάθε σπονδυλική ή οπίσθια κάτω εγκεφαλική αρτηρία της εκάστοτε πλευράς σχηματίζει την αντίστοιχη οπίσθια νωτιαία αρτηρία. Υπάρχει μία οπίσθια νωτιαία αρτηρία σε κάθε πλευρά δεξιά και αριστερά της μέσης γραμμής (εντός της οπισθοπλάγιας αύλακας). Η οπίσθια νωτιαία αρτηρία εμφανίζει επιμήκεις σχηματισμούς που επεκτείνονται διαμέσου και πίσω των οπισθίων νευρικών ριζιδίων [6]. Οι δύο οπίσθιες νωτιαίες αρτηρίες θεωρούνται ότι αιματώνουν μαζί το οπίσθιο 1/3 του νωτιαίου μυελού. Οι ριζικές αρτηρίες αποτελούν απομείναντες εμβρυικές αρτηρίες που ενίσχυαν τους επιμήκεις αρτηριακούς σχηματισμούς. Αναστομώνονται με τις πρόσθιες και τις οπίσθιες νωτιαίες αρτηρίες και ονομάζονται τροφοφόρες [6]. Στην οσφυική περιοχή, συναντάται μια μεγάλη ριζική αρτηρία η οποία είναι γνωστή σαν αρτηρία του Adamkiewicz. Η συγκεκριμένη ριζική αρτηρία βρίσκεται συνήθως στα αριστερά και εισέρχεται στο σπονδυλικό κανάλι στο χμηλότερο επίπεδο της θωρακικής μοίρας ή στο ανώτερο επίπεδο της οσφυικής ακολουθώντας μια πρόσθια ρίζα. Η αρτηρία του Adamkiewicz συμβάλλει στην αιμάτωση του των δύο τρίτων του νωτιαίου μυελου. Ε.2 Φλέβες Γενικά η κατανομή των φλεβών του νωτιαίου μυελού είναι παρόμοια με εκείνη των νωτιαίων αρτηριών. Οι νωτιαίες φλέβες σχηματίζουν ένα χαλαρό πρόσθιο και οπίσθιο πλέγμα [6]. Περιγράφεται ότι σε κάθε πλευρά υπάρχουν 3 οπίσθιες και 3 21

πρόσθιες νωτιαίες φλέβες [8]. Aυτά τα επίμηκα φλεβικά δίκτυα βρίσκονται κατά μήκος των ριζών των νεύρων, επικοινωνώντας με το σπονδυλικό φλεβικό πλέγμα (μέσω του μεσοσπονδυλίου τρήματος) καθώς επίσης και με εκείνο των τμηματικών φλεβών. Δεν υπάρχουν βαλβίδες στο φλεβικό δίκτυο του νωτιαίου μυελού. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα το αίμα που ρέει μέσα σε αυτό το δίκτυο είναι ικανό να περάσει στη συστηματική φλεβώδη κυκλοφορία [8]. 22

1.3 Στοιχεία ιστολογίας του νευρικού συστήματος Τα κυτταρικά στοιχεία που συνιστούν το νευρικό ιστό προέρχονται εμβρυολογικά από το νευροεξώδερμα και διακρίνονται στα νευρικά κύτταρα ή νευρώνες και τα κύτταρα της γλοίας (αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα, επενδυτικά κύτταρα). Τα μικρογλοιακά κύτταρα ανήκουν στο σύστημα μονοπυρήνων μακροφάγων και προερχόμενα από το μυελό των οστών αποικίζουν το νευρικό ιστό κατά τα τελικά στάδια της κυήσεως. A. Ο Νευρώνας Οι νευρώνες ποικίλουν σε ότι αφορά το μέγεθος, τη μορφολογία τους και τα λειτουργικά τους χαρακτηριστικά. Οι νευρώνες βρίσκονται στον εγκέφαλο, στο νωτιαίο μυελό και στα γάγγλια. Ένας τυπικός νευρώνας αποτελείται από 3 τρία τμήματα: το κυτταρικό σώμα, τον νευράξονα και τους δενδρίτες. Ο αριθμός, το μήκος και η μορφή των διακλαδώσεων χωρίζουν τους νευρώνες σε 3 κατηγορίες: 1) Μονόπολοι νευρώνες, είναι οι νευρώνες με μία αποφυάδα που είναι πολύ κοντή και χωρίζεται σε δύο κλάδους από τους οποίους ο ένας από τους δύο θα καταλήξει σε μια περιφερική δομή και ο άλλος εισέρχεται στο Κ.Ν.Σ. 2) Δίπολοι νευρώνες είναι οι νευρώνες που από το σώμα τους εκφύονται ένας άξονας και ένας δενδρίτης από αντίθετους πόλους. (τους βρίσκουμε στα δίπολα κύτταρα του αμφιβληστροειδούς και στα αισθητικά κοχλιακά και αιθουσαία γάγγλια) 3) Ως Πολύπολοι, χαρακτηρίζονται οι νευρώνες με έναν μόνο άξονα και πολλούς δενδρίτες. Οι περισσότεροι νευρώνες του εγκεφάλου και του νωτιαίου μυελού ανληκουν σε αυτήν την κατηγορία. 23

Το εσωτερικό του νευρώνα χωρίζεται από το εξωτερικό περιβάλλον του με την παρεμβολή της κυτταρικής (νευρωνικής) μεμβράνης. Β. Κύτταρα της Γλοίας Β.1 Τα αστροκύτταρα Τα αστροκύτταρα αποτελούν τα μεγαλύτερα από τα κύτταρα της γλοίας. Επίσης αποτελούν τα πιο πολυάριθμα κύτταρα της γλοίας στη φαιά ουσία. Έχουν σφαιρικό κεντρικά τοποθετημένο πυρήνα και πολλές αποφυάδες. Διακρίνονται στα ινώδη και πρωτοπλασματικά αστροκύτταρα. Τα ινώδη αστροκύτταρα βρίσκονται κυρίως στη λευκή ουσία και οι αποφυάδες διαπερνούν τις νευρικές ίνες. Τα πρωτοπλασματικά αστροκύτταρα βρίσκονται κυρίως στη φαιά ουσία και οι απολήξεις τους διαπερνουν τα σώματα των νευρώνων. Οι αποφυάδες των πρωτοπλασματικών αστροκυττάρων έιναι μικρότερες σε μήκος άλλα έχουν μεγαλύτερη διάμετρο και περισσοτερες διακλαδώσεις σε σχέση με τις αποφυάδες των ινωδών αστροκυττάρων. Οι αποφυάδες των αστροκυττάρων έρχονται σε άμεση επαφή με τη βασική μεμβράνη των τριχοειδών αιμοφόρων αγγείων, σχηματίζοντας τα τελικά αγγειακά πόδια, τα οποία μαζί με τα σχεδόν αδιαπέραστα ενδοθηλιακά κύτταρα απαρτίζουν τον αιματεγκεφαλικό φραγμό, ο οποίος προστατεύει το ΚΝΣ από τη συστηματική κυκλοφορία. Επίσης αποφυάδες των αστροκυττάρων υπάρχουν στην επιφάνεια του εγκεφάλου κάτω από την χοριοειδή μήνιγγα όπου δημιουργούν ένα αφοριστικό πέταλο. Ο ρόλος των αστροκυττάρων είναι κυρίως στηρικτικός και τροφικός ενώ τα τελευταία χρόνια διαφαίνεται ολοένα και περισσότερο η συμβολή τους στην ομοιόσταση του ιοντικού νευρωνικού περιβάλλοντος και στη συναπτική διαβίβαση. Σε καταστάσεις βλάβης τα αστροκύτταρα υπερτρέφονται και σε κάποιο βαθμό υπερπλάσονται δημιουργώντας τη γλοίωση. Β.2 Τα ολιγοδενδροκύτταρα 24

Τα ολιγοδενδροκύτταρα είναι μικρότερα σε μέγεθος από τα αστροκύτταρα και έχουν βραχύτερες και λιγότερες αποφυάδες από αυτά. Τα ολιγοδενδροκύτταρα ανευρίσκονται τόσο στη λευκή όσο και στη φαιά ουσία. Αποτελούν τον πιο πολυάριθμο τύπο γλοιακού κυττάρου της λευκής ουσίας και εδράζονται κατά μήκος της πορείας κι μεταξύ των αξόνων των νευρικών κυττάρων. Στη φαιά ουσία, αναγνωρίζονται πολύ κοντά στα σώματα των νευρώνων, όπου θεωρείται ότι έχουν κυρίως στηρικτικό ρόλο και ότι επηρεάζουν το βιοχημικό περιβάλλον των νευρώνων (δορυφόρα ολιγοδενδροκύτταρα). Τα ολιγοδενδροκύτταρα είναι υπεύθυνα για τη δημιουργία του ελύτρου της μυελίνης το οποίο επενδύει και μονώνει τους άξονες επιτρέποντας στο δυναμικό ενέργειας να διατηρεί την ταχύτητα του κατά την μεταδοσή του. Τέλος είναι αξιοσημείωτο ότι κάθε ολιγοδενδροκύτταρο είναι υπεύθυνο για τη μυελίνωση περισσοτέρων του ενός νευραξόνων. Β.3 Τα επενδυματικά κύτταρα Τα επενδυματικά κύτταρα χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: α. Τα Επενδυμοκύτταρα είναι τα κύτταρα εκείνα που καλύπτουν τις εγκεφαλικές κοιλίες και τον κεντρικό σωλήνα του νωτιαίου μυελού. Τα περισσότερα διαθέτουν κροσσούς βοηθώντας έτσι στη διακίνηση του εγκεφαλονωτιαίου υγρού ενώ η έλλειψη αποφρακτικών ζωνών επιτρέπει στις ουσίες του ΕΝΥ να διέρχονται στον υποκείμενο νευρικό ιστό. β. Ένας ιδιαίτερος τύπος επενδυτικού κυττάρου, το τανυκύτταρο, βρίσκεται στο έδαφος της τρίτης κοιλιάς και χαρακτηρίζεται από μια μακριά αποφυάδα που εκτείνεται στα αγγειακά τριχοειδή, πιστεύεται πως παίζει ρόλο στη μεταφορά χημικών σωμάτων από το ΕΝΥ προς περιοχές κάτωθεν του επενδύματος. Γ. Μία τρίτη κατηγορία επενδυμοκύττάρων, είναι εκείνα που εντοπίζονται στο χοριοειδές πλέγμα και συμμετέχουν στην παραγωγή του εγκεφαλονωτιάιου υγρού. Tα επενδυμοκύτταρα πιστεύεται επίσης ότι λειοτυργούν σαν αρχέγονα βλαστικά κύτταρα [9]. 25

Β.4 Τα μικρογλοιακά κύτταρα Τα μικρογλοιακά κύτταρα είναι εξειδικευμένα ανοσοκύτταρα του ΚΝΣ. Εμβρυολογικά, προέρχονται από το μεσέγχυμα και διηθούν το Κ.Ν.Σ. στα τελικά στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξη. Τα μικρογλοιακά εμφανίζουν επίμηκες σχήμα με αποφυάδες και επιμήκη πυρήνα. Θεωρούνται δενδριτικά αντιγονο-παρουσιαστικά κύτταρα με χαμηλό επίπεδο φαγοκυτταρικής δραστηριότητας. ρίσκονται τόσο στη φαιά όσο και στη λευκή ουσία. Διαθέτουν φαγοκυτταρικές ιδιότητες και υπό φυσιολογικές συνθήκες συμβάλλουν στην ανοσοεπαγρύπνιση του Κ.Ν.Σ. Σε καταστάσεις βλάβης του νευρικού ιστού, τα μικρογλοιακά κύτταρα ενεργοποιούνται απομακρύνοντας τα κατεστραμμένα κυτταρικά στοιχεία., Μετά την ενεργοποίηση τους τα μικρογλοιακά εκκρίνουν προφλεγμονώδεις και νευροτοξικούς χημικούς παράγοντες. 26

27

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΑΥΧΕΝΙΚΗ ΣΠΟΝΔΥΛΩΤΙΚΗ ΜΥΕΛΟΠΑΘΕΙΑ Εισαγωγή Η αυχενική σπονδυλωτική μυελοπάθεια (ΑΣΜ) είναι μια εκφυλιστική διαδικασία των δομών της αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης που οδηγεί σε στένωση του νωτιαίου σωλήνα και σε επικείμενη νευρολογική διαταραχή. Η στένωση του σπονδυλικού σωλήνα προκαλεί πίεση του νωτιαίου μυελού με την πάροδο του χρόνου η οποία είναι μη-τραυματική στη φύση της και μετά από την πάροδο αρκετού χρονικού διαστήματος μπορεί να προκαλέσει μέχρι και τετραπληγία. Η σοβαρότητα της στένωσης και τα νευρολογικά ελλείμματα ποικίλλουν από ασθενή σε ασθενή. Επειδή η στένωση του νωτιαίου σωλήνα και η επικείμενη πίεση του νωτιαίου μυελού είναι εκφυλιστική στη φύση της η εξέλιξη της νόσου είναι αργή, κάτι που οδηγεί στην ανάπτυξη προσαρμοστικών μηχανισμών τόσο στο κεντρικό όσο κ στο περιφερικό νευρικό σύστημα. 28

2.1 Επιδημιολογία A. Επίπτωση και Επιπολασμός Η ακριβής επίπτωση καθώς επίσης και ο επιπολασμός της ΑΣΜ παραμένει άγνωστη [10]. Ωστόσο επειδή η ΑΣΜ είναι μία νόσος που προκαλείται από την εκφύλιση των δομών της σπονδυλικής στήλης, προσβάλλει κυρίως ηλικιωμένους ανθρώπους [10]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η ΑΣΜ είναι η πιο κοινή αιτία δυσλειτουργίας του νωτιαίου μυελού στους μεσήλικες και στους ηλικιωμένους. Στην πραγματικότητα η ΑΣΜ ήταν η πιο συχνή διάγνωση (23.6% των περιπτώσεων) σε μια σειρά 2104 ασθενών με μη τραυματική σπαστική παραπάρεση ή τετραπάρεση [11]. H AΣΜ προσβάλλει πιο συχνά τους άνδρες σε σχέση με τις γυναίκες. Το Α5 και Α6 είναι τα πιο συχνά επίπεδα στα οποία η πίεση του νωτιαίου μυελού λαμβάνει χώρα [12]. H αυχενική σπονδύλωση είναι η πιο η συχνή αιτία της ΑΣΜ. Ωστόσο, η συνδεόμενη με την ηλικία αυχενική σπονδύλωση δεν οδηγεί υποχρεωτικά σε ΑΣΜ. Σε ένα πληθυσμό ασυμπτωματικών ασθενών στην ηλικία των 70 ετών, αναφέρθηκαν απεικονιστικά σημεία αυχενικής σπονδύλωσης στο 95 % των ανδρών και στο 70 % των γυναικών. Σχεδόν το 60 % είχε εκφύλιση του μεσοσπονδυλίου δίσκου και το 20% στένωση των τρημάτων [13]. Η στένωση του σπονδυλικού σωλήνα μπορεί να προκύψει δευτερογενώς από δύο παράγοντες: 1) τη σχετιζόμενη με την ηλικία αυχενική σπονδύλωση και 2) τη συγγενή στένωση [10]. Τα άτομα που έχουν γενετικά προερχόμενη στένωση του νωτιαίου μυελού εμφανίζουν προδιάθεση να αναπτύξουν ΑΣΜ κάτω από ηπιότερη μορφή αυχενικής σπονδύλωσης σε σχέση με τα κανονικά άτομα. Επιπλέον, η ΑΣΜ στο συγκεκριμένο πληθυσμό εμφανίζεται σε μικρότερη ηλικία [14]. Σε μελέτες αυτοψίας έχει αποδειχτεί ότι οι γυναίκες εμφανίζουν στενότερο σπονδυλικό σωλήνα 29

σε σχέση με τους άντρες και ότι τα άτομα ηλικίας 60 ετών και πλέον έχουν σημαντικά στενότερο σπονδυλικό σωλήνα σε σχέση με νεότερα σε ηλικία άτομα. Εκτιμάται ότι η στένωση του σπονδυλικού σωλήνα στην αυχενική μοίρα της σπονδυλικής στήλης εμφανίζεται στο 4.95% του ενήλικου πληθυσμού, στο 6.8% του πληθυσμού άνω των 50 ετών και στο 9% του πληθυσμού ηλικίας 70 ετών και άνω. Επιπλέον, η ΑΣΜ είναι ο κυριότερος προδιαθεσικός παράγοντας για την ανάπτυξη συνδρόμου του κεντρικού νωτιαίου μυελού, το οποίο αποτελεί την πιο συχνή μορφή τραυματικής κάκωσης του αυχενικού νωτιαίου μυελού [15]. Πρόσφατα δεδομένα ανέδειξαν γενετική προδιάθεση στην ΑΣΜ [16]. Συνοψίζοντας, η ΑΣΜ είναι μια πολύ συχνή νόσος, ιδιαίτερα στους ηλικιωμένους, η οποία προκαλεί νευρολογικές διαταραχές και επικείμενη διαταραχή της ποιότητας της ζωής. 30

2.2 Κλινική Εικόνα της ΑΣΜ A. Φυσική Εξέλιξη της Νόσου Η συμπτωματολογία της ΑΣΜ συνήθως επιδεινώνεται προοδευτικά αν δεν διενεργηθεί χειρουργική θεραπεία, κάποιες φορές παραμένει στάσιμη και σε σπάνιες περιπτώσεις βελτιώνεται. Μια μελέτη που δημοσιεύτηκε το 2009 αναφέρει την ομοφωνία των ειδικών ότι η εξέλιξη της νόσου μπορεί να είναι προοδευτικά εξελισσόμενη ή να παρουσιάζεται σα μια μακρά περίοδος «σιωπής». Αν και παλαιότερες μελέτες στη διεθνή βιβλιογραφία αναφέρουν βελτίωση της συμπτωματολογίας χωρίς τη διενέργεια χειρουργικής θεραπείας, οι συγκεκριμένες μελέτες θεωρούνται πλέον αναξιόπιστες λόγω της ετερογένειας του πληθυσμού των ασθενών και λόγω των ασυνεπειών των τελικών χρονολογικών σημείων στα οποία πραγματοποιήθηκαν οι μετρήσεις. Ορισμένες μελέτες έχουν συνεπώς δείξει προοδευτική επιδείνωση όταν δεν διενεργείται χειρουργική αντιμετώπιση ειδικά στους ασθενείς με μέτρια έως σοβαρή ΑΣΜ [10]. Οι Clarke και Robinson αναφέρουν ότι όταν εκδηλωθεί η μυελοπάθεια, η νευρολογική λειτουργία ποτέ δεν επανέρχεται σε φυσιολογικό επίπεδο [17]. Σε μία άλλη μελέτη ανεδείχθη ότι το 75% των ασθενών έχουν επεισόδια επιδείνωσης με διαστήματα σταθερότητας, το 20% έχει σταθερή προοδευτική επιδείνωση και το 5% ταχεία έναρξη των συμπτωμάτων που ακολουθείται από μακρά περίοδο σταθερότητας [18]. Δυστυχώς όσον αφορά τη φυσική εξέλιξη της νόσου δεν υπάρχει ομοφωνία στη διεθνή κοινότητα. ρέθηκε ότι σε ένα πληθυσμό 56 ασθενών με ήπια ΑΣΜ που αντιμετωπίστηκαν συντηρητικά, 11 από αυτούς επιδεινώθηκαν εμφανίζοντας από μέτρια εώς σοβαρή κλινική εικόνα. Ωστόσο, τα αποτελέσματα δεν εμφάνισαν στατιστικά σημαντική διαφορά [19]. Σε ασθενείς με ήπια ΑΣΜ και ηλικία μικρότερης των 75 ετών, τα συμπτώματα σπανίως εξελισσόταν σε σημείο που να μπορούν να 31

μετρηθούν. Σε μια ομάδα ασθενών που εμφάνισαν ήπια ΑΣΜ και αυξημένης εντάσεως μυελικό σήμα στην Τ2 ακολουθία της μαγνητικής τομογραφίας και οι οποίοι αντιμετωπίστηκαν συντηρητικά, 16 από τους ασθενείς επιδεινώθηκαν σε τέτοιο βαθμό που η χειρουργική αντιμετώπιση κρίθηκε αναγκαία. Επιπλέον, δύο από τους 45 ασθενείς χρειάστηκαν χειρουργική αντιμετώπιση λόγω οξείας κάκωσης του νωτιαίου μυελού μετά από έλασσον τραύμα [20]. Μερικοί παράγοντες κινδύνου που έχουν αναγνωριστεί ότι συμβάλλουν σε νευρολογική επιδείνωση της ήπιας ΑΣΜ είναι το θηλυκό γένος, η αυξημένη κινητικότητα της αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης, η εστιακή πρόπτωση του μεσοσπονδυλίου δίσκου, η τμηματική κύφωση στο σημείο της μέγιστης πίεσης του νωτιαίου μυελού καθώς επίσης και η περιμετρική πίεση του νωτιαίου μυελού στο σημείο της μέγιστης πίεσης [19]. Ασυμπτωματικοί ασθενείς με υπάρχουσα στένωση του σπονδυλικού σωλήνα και μη φυσιολογικό ηλεκτρομυογράφημα είναι πιο πιθανό να αναπτύξουν μυελοπάθεια στο εγγύς μέλλον. Είναι φανερό ότι μεγαλύτερες μελέτες στις οποίες θα συμμετέχουν πολλαπλά κέντρα, απαιτούνται για να κατανοηθεί και να διαφωτιστεί λεπτομερώς η φυσική εξέλιξη της νόσου. B. Συμπτωματολογία και Σημειολογία της ΑΣΜ Η αρχική αναγνώριση ενός ασθενούς με ΑΣΜ στηρίζεται κυρίως στην παρουσία συμπτωμάτων. Ωστόσο η συμπτωματολογία της ΑΣΜ ποικίλλει μεταξύ των ασθενών [10]. Τα συμπτώματα της ΑΣΜ περιλαμβάνουν πόνο στην περιοχή του αυχένα, μουδιάσματα, παραισθησίες και αδυναμία των άνω άκρων, διαταραχή της βάδισης [10]. Ορισμένες μελέτες έχουν καταλήξει στο συμπέρασμα ότι η ήπια διαταραχή της βάδισης είναι το πιο κοινό κλινικό σύμπτωμα της ΑΣΜ και ότι η σπαστικότητα στη βάδιση εμφανίζεται πρώτη και ακολουθείται από τα μουδιάσματα των άνω άκρων και από την απώλεια της δεξιότητας των άκρων χειρών. Ωστόσο, η διαταραχή της βάδισης στην ΑΣΜ περιλαμβάνει ένα εύρος κλινικών διαταραχών. Η εμφανής 32

σπαστική παραπάρεση αποτελεί το πιο σοβαρό κλινικό σύμπτωμα στα πάσχοντα άτομα. Η νευρολογική εξέταση χρησιμοποιείται για την επιβεβαίωση της δυσλειτουργίας του νωτιαίου μυελού. Μόλις η ΑΣΜ διαγνωστεί, η διάρκεια των συμπτωμάτων χρησιμοποιείται για να καθοριστεί το χρονικό διάστημα για το οποίο ο αυχενικός νωτιαίος μυελός υπόκεινται σε χρόνια πίεση. Ωστόσο υπάρχουν δύο αναπάντητες ερωτήσεις. Η πρώτη σχετίζεται με το χρονικό διάστημα κατά το οποίο ο νωτιαίος μυελός υπόκεινται σε πίεση πριν από την εμφάνιση των νευρολογικών διαταραχών. Και η δεύτερη έχει να κάνει με την «πλαστικότητα» που αναπτύσσεται στο νωτιαίο μυελό κάτω από την χρόνια πίεση μιας και η πίεση είναι χρόνια κ προοδευτική στη φύση της. 33

2.3 Κλινική Αντιμετώπιση της ΑΣΜ Το 1564 μ.χ ο Ambroise Pare στο σύγγραμμα του Ten Books of Surgery συνέστησε για πρώτ φορά την πεταλεκτομία για την αντιμετώπιση της πίεσης επί του νωτιαίου μυελού [21]. Μέχρι σήμερα ο πιο κοινός τρόπος αντιμετώπισης της ΑΣΜ είναι η συντηρητική θεραπεία ή η χειρουργική αποσυμπίεση του νωτιαίου μυελού. Ωστόσο, ο Emery αναφέρει ότι ο μόνος τρόπος για να αλλάξει η δυσοίωνη φυσική ιστορία της αυχενικής σπονδυλωτικής μυελοπάθειας είναι η χειρουργική αποσυμπίεση του νωτιαίου μυελού [9]. Η χειρουργική αποσυμπίεση επιτυγχάνεται είτε με πρόσθια είτε με οπίσθια προσπέλαση. Συνήθως η χειρουργική θεραπεία προσφέρεται σαν αντιμετώπιση στους ασθενείς με μετρίου ή σοβαρού βαθμού κλινική εικόνα αυχενικής μυελοπάθειας. Ωστόσο, ολοένα και αυξανόμενος αριθμός ασθενών με ήπια κλινική εικόνα ΑΣΜ υπόκεινται σε χειρουργική θεραπεία. Οι χειρουργικές τεχνικές και προσπελάσεις έχουν εξελιχτεί τις τελευταίες δύο δεκαετίες με αποτέλεσμα η πρόγνωση μετά τη χειρουργική επέμβαση να έχει βελτιωθεί δραστικά [22]. Ωστόσο αρκετοί από τους ασθενείς παραμένουν με νευρολογικά ελλίμματα ακόμα και μετά από μια επιτυχημένη χειρουργική διαδικασία. 34

2.4 Παθοφυσιολογία και Παθολογία της ΑΣΜ A. Παθοφυσιολογία Η αιτιολογική συσχέτιση μεταξύ της ανατομικής πίεσης των νευρολογικών δομών και της ανάπτυξης των νευρολογικών διαταραχών έχει αναγνωριστεί [10]. Η αυχενική σπονδύλωση προέρχεται από το προοδευτικό βιο-μηχανικό στρες και προοδευτικό αυξανόμενο φορτίο στις αρθρώσεις της αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης και επιδεινώνεται από το συνεχές τραύμα. Η διαδικασία που συμβάλλει στην ανάπτυξη της σπονδύλωσης είναι η μη φλεγμονώδης εκφυλιστική αλλοίωση του μεσοσπονδυλίου δίσκου. Οι εκφυλιστικές αλλοιώσεις του δίσκου οφείλονται σε αφυδάτωση, μείωση του ύψους και κατακερματισμό με αποτέλεσμα την αστάθεια του σπονδυλικού επιπέδου. Η αστάθεια ενοχοποιείται ότι προκαλεί μηχανικό στρες στις τελικές πλάκες των σπονδύλων και των συνδέσμων με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των οστεοβλαστών και τη δημιουργία των οστεοφύτων σε μια προσπάθεια του οργανισμού να αντιμετωπίσει την σπονδυλική αστάθεια. Τα οστεόφυτα προκαλούν με την πάροδο του χρόνου στένωση του σπονδυλικού σωλήνα με επακόλουθη πίεση επί των ριζών και του νωτιαίου μυελού. Γενικά στην αιτιοπαθογένεια της μυελοπάθειας εμπλέκονται η εκφύλιση και η πρόπτωση του μεσοσπονδυλίου δίσκου, η υπερτροφία των αρθρώσεων, η υπερτροφία και οστεοποίηση των ωχρών συνδέσμων καθώς και η οστεοποίηση του οπίσθιου επιμήκους συνδέσμου. H αυχενική μυελοπάθεια θεωρείται ότι οφείλεται σε 3 κυρίως παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς. Ο πρώτος αποτελείται από τους στατικούς μηχανικούς παράγοντες οι οποίοι στην ουσία είναι οι δομικές αλλαγές της ΑΜΣΣ που προκαλούν στένωση του σπονδυλικού σωλήνα και επακόλουθη μηχανική πίεση του νωτιαίου μυελού [23]. 35

O δεύτερος παθοφυσιολογικός μηχανισμός που έχει αναγνωριστεί στη διεθνή βιβλιογραφία είναι οι δυναμικοί μηχανικοί παράγοντες. Οι δυναμικοί μηχανικοί παράγοντες είναι μη φυσιολογικές δυνάμεις που αναπτύσσονται επί του νωτιαίου μυελού όταν υπάρχει κάμψη ή έκταση της αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης. Ενώ η έκταση ή κάμψη της αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης σε έναν φυσιολογικό άνθρωπο δεν προκαλούν βλάβη επί του νωτιαίου μυελού, σε εάν ασθενή με ήδη προϋπάρχουσα μηχανική πίεση του νωτιαίου μυελού (οστεόφυτα, ασβεστοποιημένος οπίσθιος επιμήκης σύνδεσμος), η έκταση ή κάμψη της σπονδυλικής στήλης προκαλούν επαναλαμβανόμενους μικροτραυματισμούς του νωτιαίου μυελού. Θεωρείται ότι οι δυναμικοί μηχανικοί παράγοντες επιδεινώνουν την βλάβη που προκαλείται από τους ήδη υπάρχοντες στατικούς μηχανικούς παράγοντες και ίσως συνεισφέρουν στην εξέλιξη της νόσου [23]. Ο τρίτος υποφυσιολογικός παράγοντας είναι η ισχαιμία του νωτιαίου μυελού [23]. B. Ιστοπαθολογία Η μηχανική πίεση και o υποτιθέμενος περιορισμός που εφαρμόζονται πάνω στο μικροαγγειακό σύστημα του αυχενικού νωτιαίου μυελού πιθανώς οδηγούν στην ανάπτυξη γλοίωσης, εκφυλισμού της λευκής και της φαιάς ουσίας, αλλεριανή εκφύλιση των οπισθίων δεματίων και των οπισθοπλάγιων οδών, ατροφία των προσθίων κεράτων της φαιάς ουσίας και θάνατο των κινητικών νευρώνων που εδράζονται στα πρόσθια κέρατα της φαιάς ουσίας [24-26]. Αν και αυτά τα νευροπαθολογικά χαρακτηριστικά έχουν περιγραφεί επαρκώς στην ΑΣΜ στους ασθενείς, η γνώση μας είναι πολύ περιορισμένη σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που οδηγούν στην ανάπτυξη των κυρίων ιστοπαθολογικών χαρακτηριστικών της νόσου αλλά και των μοναδικών νευρολογικών ελλειμμάτων που αναπτύσσονται στην ΑΣΜ τόσο στα άνω όσο και στα κάτω άκρα. Επιπλέον, δεν είναι ξεκάθαρο αν κάτων από τη χρόνια και προοδευτική πίεση οδηγεί στην ανάπτυξη φαινομένων που σχετίζονται με plasticity και rewiring εντός του αυχενικούτο κατά 36

πόσο επάγεται η πλαστικότητα εντός του νωτιαίου μυελού κάτω από τη χρόνια πίεση. 2.5 Ισχύουσα Γνώση των Μοριακών Μηχανισμών της ΑΣΜ Με βάση τη γνώση που προέρχεται από πειράματα που έχουν γίνει σε μοντέλα οξείας κάκωσης του νωτιαίου μυελού, έχει διαπιστωθεί ότι μια παρόμοια σειρά κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών όπως η γλουταμεργική διεγερσιμοτοξικότητα, η δημιουργία οξειδωτικών ριζών, η λιπιδική υπεροξείδωση, η φλεγμονώδης διαδικασία και η ισχαιμία παίζουν σημαντικό και κρίσιμο ρόλο στη παθο-βιολογία της ΑΣΜ. Αν και παλαιότερα επικρατούσε η απόψη ότι η ΑΣΜ και η οξέια βλάβη του νωτιαίου μυελού έχουν παρόμοιους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς, η χρόνια και προοδευτική φύση της βλάβης που λαμβάνει χώρα στην ΑΣΜ είναι μοναδική και τελείως διαφορετική από τις προηγούμενες οξείες και τραυματικές βλάβες του κεντρικού νευρικού συστήματος. Αν και μέχρι πρόσφατα επικρατούσε η άποψη ότι η ΑΣΜ μοιραζόταν τις ίδιες ιστοπαθολογικές και παθοφυσιολογικές ομοιότητες με την οξεία τραυματική βλάβη του νωτιαίου μυελού, η ΑΣΜ είναι μια μοναδική πάθηση του νωτιαίου μυελού της ΑΜΣΣ και οι μοριακοί μηχανισμοί της παραμένουν ανεξερεύνητοι. A. Φλεγμονή Νευρικού Ιστού Αν και η φλεγμονώδης διαδικασία μετά από βλάβη του νευρικού ιστού είναι αναπόσπαστο κομμάτι της διαδικασίας ουλοποίησης [27-29], υπάρχουν σημαντικά δεδομένα που δείχνουν ότι η φλεγμονή του νευρικού ιστού είναι ένας σημαντικός «παίκτης» στους παθοβιολογικούς μηχανισμούς που οδηγούν στο κυτταρικό θάνατο μετά από κάκωση του νωτιαίου μυελού. Κάποιος θα μπορούσε να υποθέσει ότι το προφίλ και οι μοριακοί μηχανισμοί της φλεγμονώδους διαδικασίας είναι παρόμοιοι μεταξύ της ΑΣΜ και της οξεία τραυματική βλάβη του νωτιαίου μυελού, ωστόσο έχει ξεκινήσει να γίνεται φανερό ότι υπάρχουν αρκετές διαφορές στη μη ειδική-φυσική 37

όσο και στην ειδική-επίκητη ανοσολογική απάντηση που λαμβάνει χώρα μετά από οξεία τραυματική βλάβη του νωτιαίου μυελού και εκείνης που συμβαίνει ΑΣΜ. Οι Beattie και Manley [30] αναφέρουν φλεγμονώδης διαδικασία στην ΑΣΜ έχει τη δική της μοναδικότητα καθώς είναι αργή και προέρχεται από τη χρόνια και προοδευτική μηχανική πίεση. Εντούτοις, ελάχιστες γνώσεις υπάρχουν όσον αφορά τη χρονική εξέλιξη της κυτταρικής φλεγμονής, το χρονικό προφίλ της των πιο σημαντικών μεσολαβητών της φλεγμονώδους διαδικασίας, και ποιές πτυχές τη φλεγμονής είναι ευεργετικές και ποιες επιζήμιες σε αυτή τη μοναδική και ξεχωριστή χρόνια κατάσταση. H επίγνωση της φύσης της φλεγμονώδους απάντησης στη χρόνια πίεση του νωτιαίου μυελού θα αποτελέσει τη βάση για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μεθόδων για την ΑΣΜ. Πρόσφατα, ερευνητές απέδειξαν ότι η χρόνια πίεση του νωτιαίου μυελού της αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης σε ασθενείς με ΑΣΜ προκαλεί κυτταρική φλεγμονή καθώς επίσης και συσσώρευση των ενεργοποιημένων μονοκυττάρων/μακροφάγων, και λεμφοκυττάρων στο σημείο της βλάβης [31]. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μελέτης υποδεικνύουν ότι ακόμα και κάτω από την αργή και προοδευτική πίεση του νωτιαίου μυελού, η μείωση της φλεγμονής οδηγεί σε μείωση της απόπτωσης και πιθανώς σε λιγότερη απομυελίνωση και περιορισμένη βλάβη των νευροαξόνων [31]. Σε μια πρόσφατη μελέτη Yu και συνεργάτες μελέτησαν το ρόλο της μικρογλοίας σε επίμυες που έπασχαν από ΑΣΜ. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποίησαν γενετικά μεταλαγμένους επίμυες στους οποίους είχε γενετικά διαγραφεί το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για το CX3CR1 [32]. Oι συγκεκριμένοι ερευνητές απέδειξαν ότι στους πάσχοντες από ΑΣΜ επίμυες με γενετική διαγραφή του CXECR1 χαμηλότερα επίπεδα ενεργοποιημένης μικρογλοίας στoν νωτιαίο μυελό. Τα ευρήματα αυτά συνδυάστηκαν με αυξημένα επίπεδα νευρώνων και ολιγοδενδροκυττάρων στην ομάδα με γενετική διαγραφή του CX3CR1 καθώς επίσης και με αυξημένα επίπεδα δενδριτικής αναγέννησης [32]. Επίσης η ομάδα με CX3CR1 εμφάνισε καλύτερη 38

νευρολογική εικόνα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, όπως αποδείχτηκε από τηn ανάλυση του βαδίσματος που πραγματοποιήθηκε και στις δύο ομάδες [32]. Ωστόσο, πολλά ερωτήματα παραμένουν ακόμα αναπάντητα σχετικά με την τόσο μοναδική νόσο καθώς επίσης και σχετικά με το ρόλο της ανοσολογικής αντίδρασης στην ανάπτυξη της μυελοπάθειας. B. Απόπτωση H επαγωγή της απόπτωσης στο χρόνια συμπιεσμένο νωτιαίο μυελό έχει καλώς χαρακτηριστεί. TUNEL-θετικοί νευρώνες και TUNEL θετικά ολιγοδενδροκύτταρα, καθώς επίσης και κασπάση-3 θετικοί νευρώνες και θετικά ολιγονενδροκύτταρα ανιχνεύτηκαν μέσα στο χρόνια συμπιεσμένο νωτιαίο που προέρχονταν από θανόντα ασθενή που έπασχε από ΑΣΜ [33]. Αυτά τα δεδομένα ισχυροποιούν την άποψη ότι η απόπτωση των ολιγονενδροκυττάρων και των νευρώνων συμβάλλουν στην ανάπτυξη της νευρο-εκφύλισης και της απομυελίνωσης στη ΑΣΜ. Ωστόσο τα σηματοδοτικά αποπτωτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται υπό τη χρόνια και προοδευτική πίεση του νωτιαίου μυελού παραμένουν άγνωστα. H ίδια ομάδα ερευνητών ερε βρήκαν Fas επαγώμενη απόπτωση των νευρώνων και των ολιγοδενδροκυττάρων τόσο σε nωτιαίους μυελούς προερχόμενους από ασθενείς που έπασχαν από ΑΣΜ όσο και σε μυελούς των twy/twy επίμυων. Στην ίδια μελέτη αποδείχθηκε ότι η αναστολή του Fas-ligand με ένα αντίσωμα οδηγεί σε καλύτερη νευρολογική εικόνα των twy/twy επίμυων και σε μειωμένα επίπεδα απόπτωσης. Μία άλλη μελέτη εμπλέκει τον παράγοντα νέκρωσης των όγκων σαν ένα εξωτερικό σηματοδοτικό μόριο που δίνει έναυσμα για την απαρχή της αποπτωτικής διαδικασίας στην ΑΣΜ [34]. Επιπλέον έχει αποδειχτεί ότι ενδοκυττάρια σηματοδοτικά μονοπάτια επαγόμενα από καταστάσεις στρες (ASK-1, p-38, and JNK) ενεργοποιούνται στους νευρώνες και τα ολιγοδενδροκύτταρα στους twy/twy επίμυες [35]. Γ. Αντισταθμιστικές αλλαγές μέσας το νωτιαίο μυελό κατά τη διάρκεια της χρόνιας πίεσης 39

Οι νευροτροφικοί παράγοντες είναι πρωτείνες που ρυθμίζουν την επιβίωση των νευρώνων, την ανάπτυξη των αξόνων και την πλαστικότητα των συνάψεων. Οι νευροτροφικοί παράγοντες έχουν ευρέως χρησιμοποιηθεί για την προαγωγή της αναγέννησης των αξόνων μετά από κάκωση στο ΚΝΣ. Αρκετές αναφορές καταδεικνύουν δομική αναγέννηση συνοδευόμενη από μερική λειτουργική αποκατάσταση μετά από χορήγηση νευροτροφικού παράγοντα προερχόμενου από τον εγκέφαλο και νευροτροφίνη-3 [36]. Μία πρόσφατη μελέτη σε twy/twy επίμυες ανέδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του νευροτροφικού παράγοντα προερχόμενου από τον εγκέφαλο και τη νευροτροφίνη-3, καθώς επίσης και εκείνων των υποδοχέων τους ήταν σημαντικά αυξημένα ουριαίως και κοιλιακώς του επικέντρου της μέγιστης πίεσης σε σχέση με τους φυσιολογικούς επίμυες [37]. Αυτά τα ευρήματα είναι σύμφωνα με τoν αυξημένο αριθμό νευρώνων και ολιγοδενδροκυττάρων ουριαίως και κεφαλικώς του επικέντρου της μέγιστης πιέσεως [33]. Συνδυαζόμενα αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο προερχόμενος από τον εγκέφαλο νευροτροφικός παράγοντας και η νευροτροφίνη 3 ίσως συνεισφέρουν στην επιβίωση των νευρώνων και των ολιγοδενδοκυττάρων στην ΑΣΜ. Επιπλέον έχει ο προερχόμενος από τον εγκέφαλο νευροτροφικός παράγοντας και η νευροτροφίνη-3 αυξάνουν την επιβίωση των κυττάρων που εδράζονται στο πρόσθιο κέρας της φαιάς ουσίας και προκαλούν επιμήκυνση των νευριτών υπό τη χρόνια μηχανική πίεση του νωτιαίου μυελού [37]. Η συνδυαζόμενη με την ανάπτυξη πρωτεΐνη 43 (Growth-associated protein 43; GAP-43) είναι μια πρωτεΐνη που παράγεται στα σώματα των νευρικών κυττάρων και μεταφέρεται γρήγορα στους άξονες. ρίσκεται στην κυτταροπλασματική πλευρά της πλασματικής μεμβράνης των αξόνων και των αυξητικών κώνων. Η GAP-43 συνήθως εκφράζεται στους νευρώνες κατά την ανάπτυξη και σε αναγεννώμενους άξονες. Επομένως, θεωρείται ότι εμπλέκεται στην ανάπτυξη και αναγέννηση των αξόνων. Χρησιμοποιώντας ένα πειραματικό μοντέλο οξείας συμπιεστικής κάκωσης του νωτιαίου μυελού Li και συνεργάτες ανέφεραν ότι ο τύπος και το μέγεθος της GAP-43 έκφρασης ποικίλλει με το μέγεθος της βλάβης [38]. Επίσης, Uchida και συνεργάτες 40

έδειξαν χαμηλά επίπεδα GAP-43 ανοσοδραστικότητας σε νωτιαίο μυελό προερχόμενο από twy/twy επίμυες [39]. Το επίπεδο της GAP-43 ανοσοδραστικότητας βρέθηκε να είναι καλά σχετιζόμενο με το μέγεθος και τη χρονική περίοδο της πίεσης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η αναγέννηση των αξόνων και οι ενδογενείς αναγεννητικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην αποκατάσταση των αξόνων ίσως λαμβάνουν χώρα στη λευκή ουσία κατά τη διάρκεια της χρόνιας πίεσης. 41

42

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΑΣΜ 3.1 Γενικά Τα πειραματικά μοντέλα αποτελούν χρήσιμα εργαλεία στα χέρια των πειραματικών ιατρικών επιστημών καθώς δίνουν την δυνατότητα μελέτης παθοφυσιολογικών και μοριακών μηχανισμών και εύρεσης θεραπευτικών προσεγγίσεων για την ίαση διαφόρων ασθενειών. Ενα πειραματικό μοντέλο θεωρείται έγκυρο όταν και μόνο αντανακλά την κλινικη οντότητα της ανθρωπίνης νόσου. Ειδικότερα, ένα έγκυρο πειραματικό μοντέλο θα πρέπει να προσομοιάζει την κλινική εικόνα της ανθρωπίνης νόσου, τα ιστολογικά και παθολογικά χαρακτηριστικά καθώς επίσης και τους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν την ανθρώπινη νόσο. 43

3.2 Ανασκόπηση Πειραματικών Μοντέλων ΑΣΜ Μέχρι σήμερα πολλές πειραματικές μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί με σκοπό τη δημιουργία ενός αξιόπιστου πειραματικού μοντέλου ΑΣΜ το οποίο αναπαράγει τους κύριους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς, τα κύρια ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά και τις κύριες κλινικές εκδηλώσεις της ανθρώπινης νόσου. Η πρώτη προσπάθεια δημιουργίας ενός πειραματικού μοντέλου χρόνιας πίεσης του νωτιαίου μυελού πραγματοποιήθηκε το 1953 από τον Tarlov και τους συνεργάτες [40]. Αν και η πρώτη προσπάθεια ανάπτυξης και χαρακτηρισμού ενός πειραματικού μοντέλου ΑΣΜ 60 χρόνια πριν κατδεικνύει το έντονο ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας για αυτή τη μοναδική πάθηση, η μη καρποφόρα μέχρι σήμερα προσπάθεια ανάπτυξης ενός αξιόπιστου μοντέλου που ανατανκλά τη φυσική εξέλιξη και πορεία της ανθρωπίνης νόσου δεν έχει επιτρέψει να μεταφραστεί αυτό το ενδιαφέρον σε σημαντικά αποτελέσματα. To 1972 ο Ηukuda και συνεργάτες στην προσπάθεια τους να αποσαφηνίσουν τους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς ανέπτυξαν το πρώτο πειραματικό μοντέλο χρόνιας πίεσης του αυχενικού νωτιαίου μυελού στους σκύλους [41]. Ειδικότερα, οι ευρευνητές της συγκεκριμένης πειραματικής ομάδας εισήγαγαν μία μεταλλική βίδα στο σώμα του πέμπτου αυχενικού σπονδύλου, η περιστροφή της οποίας προκαλόυσε σταδιακή πίεση επί του νωτιαίου μυελού. Στην ίδια μελέτη αξιολογήθηκαν οι επιδράσεις της ισχαιμίας και της μηχανικής πίεσης στο νωτιαίο μυελό της αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης και ανευρεύθηκε ότι όταν η πίεση επί του νωτιαίου μυελού συνδυάζεται με ταυτόχρονη ισχαιμία στην περιοχή τα νευρολογικά ελλείμματα ήταν μεγαλύτερα [41]. Τρία χρόνια αργότερα η ίδια ομάδα επιστημόνων ανέπτυξε ένα μοντέλο πίεσης του νωτιαίου μυελού σε δύο επίπεδα (Α4 και Α5) συνδυαζόμενη με διακοπη της κυκλοφορίας του νωτιαίου μυελού [42]. 44

Σε περαιτέρω πειραματικές προσπάθειες στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν μεταλλικές βίδες για την πρόκληση χρόνιας πίεσης του νωτιαίου μυελού ανεδείχθη ότι τα πειραματόζωα δεν εμφάνισαν νευρολογικές διαταραχές των κάτω άκρων όταν η πίεση στο νωτιαίο σωλήνα ήταν μικρότερη του 50%. Παρομοίως, Kanchiku και συνεργάτες εισήγαγαν μια πλαστική βίδα στο σώμα του πέμπτου αυχενικού σπονδύλου σε κονίκλους η οποία προκαλούσε πρόσθια πίεση επί του νωτιαίου μυελού έκτασης ενός χιλιοστού. Μετά το πέρας δύο εβδομάδων στους ίδιους κόνικλους οι ερευνητές έπειτα από οισθιαπροσπέλαση τοποθέτησαν ένα πλαστικό πλακίδιο πάχους μισού χιλιοστού κάτωθεν του τόξου του πέμπτου αυχενικού σπονδύλου [43]. Το συνολικό εγχείρημα αυτό οδηγούσε σε αρχική πρόσθια πίεση του αυχενικού νωτιαίου μυελού για δύο εβδομάδες και στη συνέχεια σε πρόσθιο-οπίσθια συμπίεση του νωτιαίου μυελού. Η συγκεκριμένη ομάδα χρησιμοποιώντας μαγνητική τομογραφία ανέδειξε την προσθιο-οπίσθια πίεση. Επίσης ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες στους κονίκλους έδειξαν διαταραχές στα προκλητά δυναμικά του νωτιαίου μυελού μετά από περιφερική διέγερση καθώς επίσης και μετά από διέγερση του κινητικού φλοιού. Το tip-toe walking Yoshimura (twy/twy) μοντέλο στους επίμυες, είναι ένα γενετικό μοντέλο χρόνιας προοδευτικής πίεσης του νωτιαίου μυελού στο δεύτερο αυχενικό τμήμα του νωτιαίου μυελού [33]. Η χρόνια πίεση προκύπτει από γενετική οστεοποίηση του οπίσθιου επιμήκους συνδέσμου του επίμυος στο επίπεδο του δεύτερου αυχενικού σπονδύλου [33]. Οι συγκεκριμένοι εμφανίζουν προοδευτική σπαστικότητα στα άνω και κάτω άκρα και αποτελούν ένα χρήσιμο πειραματικό μοντέλο για την ανακάλυψη των μοριακών μηχανισών της αυχενικής μυελοπάθειας. Σε μία διαφορετική προσπάθεια ανάπτυξης ενός πρωτότυπου μοντέλου ΑΣΜ, μια ομάδα επιστημόνων από την Ιαπωνία εμφύτευσε ένα κομμάτι πολυμερούς κάτω από το τόξο του πέμπτου και έκτου αυχενικού σπονδύλου χωρίς να διενεργήσουν πεταλεκτομία [44]. Οι συγκεκριμένοι ερευνητές, έδειξαν ότι το συγκεκριμένο πολυμερές μετά την εμφύτευση κάτω από τα δύο πέταλα έχει την ιδιότητα να 45

απορροφά νερό και να αυξάνει το μέγεθος του κατά 230% μέσα σε 24 ώρες και στη συνέχεια να διατηρείται σταθερό σε μέγεθος για μεγάλο χρονικό διάστημα. Τέλος, η πιό πρόσφατη προσπάθεια πραγματοποιήθηκε το 2010 από μία καναδική ομάδα ερευνητών. Πιο συγκεκριμένα, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν μία συσκευή χρόνιας πίεσης, όπως την ονόμασαν, η οποία προσαρμόστηκε πάνω στην Α2 και Θ2 άκανθα. Σταδιακή και χρόνια πίεση, όπως περιγράφουν αναπτύχθηκε στο Α6 επίπεδο περιστρέφοντας σταδιακά μια βίδα που ήταν προσαρμοσμένη πάνω στη συσκευή χρόνιας πίεσης. Οι συγγραφείς έδειξαν ότι η σταδιακή πίεση του νωτιαίου μυελού στο Α6 επίπεδο οδηγούσε σε αδυναμία των άκρων, διαταραχή της βάδισης καθώς και στην ανάπτυξη νευροπαθητικού πόνου. Επίσης αναδείχθηκε απώλεια φαιάς αλλά και λευκής ουσίας καθώς επίσης και απώλεια των κινητικών νευρώνων [45]. 46

3.3 Μειονεκτήματα των Υπαρχόντων Μοντέλων ΑΣΜ Αν και τα μοντέλα ΑΣΜ που έχουν αναπτυχθεί μέχρι πρόσφατα εμφάνιζουν κάποια πλεονεκτήματα, η ύπαρξη ταυτόχρονα κάποιων σημαντικών μειονεκτημάτων είναι αυτή που δεν έχει επιτρέψει την εκτενή χρήση τους. Η μη ύπαρξη ενός αξιόπιστου αναπαραγωγίσιμου μοντέλου ΑΣΜ έχει αποτελέσει έναν σαφή περιορισμό για την ανακάλυψη των μοριακών μηχανισμών της ΑΣΜ καθώς επίσης και για την ανακάλυψη νέων θεραπειών για αυτή την τόσο συχνή και επικίνδυνη νόσο. Στο συγκεκριμένο τμήμα παρουσιάζονται τα μειονεκτήματα τα οποία κατά τη γνώμη του συγγραφέα παρουσιάζουν τα πιο κοινώς χρησιμοποιούμενα και πιο πρόσφατα πειραματικά μοντέλα αυχενικής μυελοπάθειας. 1) Το μοντέλο twy/twy εμφανίζει τρία σημαντικά μειονεκτήματα: α) Η χρόνια και προοδευτική πίεση αναπτύσσεται στο επίπεδο του δεύτερου αυχενικού σπονδύλου. Το πιο σύνηθες επίπεδο που αναπτύσσεται χρόνια πίεση στην ΑΣΜ στους ανθρώπους είναι το επίπεδο του πέμπτου και έκτου αυχενικού σπονδύλου. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα η κλινική εικόνα των twy/twy ζώων να μην είναι παρόμοια με εκείνη των ανθρώπων που πάσχουν από ΑΣΜ. β) Το δεύτερο σημαντικό μειονέκτημα είναι ότι οι επίμυες είναι ήδη γενετικά μεταλλαγμένοι κ έτσι δεν μπορούν να τροποποιηθούν γενετικά περαιτέρω. Χρησιμοποιώντας λοιπόν τη συγκεκριμένη τεχνική για την πρόκληση της χρόνιας και προοδευτικής πίεσης του νωτιαίου μυελού αποκλείεται η δυνατότητα χρήσης της γενετικής στην ΑΣΜ. γ) To τρίτο σημαντικό μειονέκτημα είναι ότι στα twy/twy ζώα δεν μπορεί να διενεργηθεί χειρουργική αποσυμπίεση του νωτιαίου μυελού. Η χειρουργική αντιμετώπιση αποτελεί τη θεραπεία εκλογής στην ανθρώπινη ΑΣΜ. 47

2) Το μοντέλο που αναπτύχθηκε στους αρουραίους από τους Ιάπωνες ερευνητές ενώ ήταν αρκετά καινοτόμο εμφάνιζε τα παρακάτω σημαντικά μειονεκτήματα: α) το πολυμερές που χρησιμοποιήθηκε σαν υλικό πίεσης και τοποθετήθηκε κάτω από το πέταλο του πέμπτου και έκτου αυχενικού σπόνδυλου είχε σαν κύρια ιδιότητα του την απορρόφηση ύδατος, η οποία λάμβανε χώρα μέσα σε 24 ώρες από την εισαγωγή του πολυμερούς, με αποτέλεσμα να αυξάνει το μέγεθος του μέσα σε 24 ώρες από την εμφύτευση του. Στη συνέχεια, όπως απέδειξαν οι συγγραφείς το μέγεθος του πολυμερούς παρέμενε σταθερό μέχρι το τέλος της μελέτης. Τα συγκεκριμένα στοιχεία αποδεικνύουν ότι η συγκεκριμένη μορφή πίεσης του νωτιαίου μυελού ήταν υποξεία και όχι χρόνια ούτε και προοδευτική. β) οι συγγραφείς-ερευνητές δεν απέδειξαν αν η πίεση του νωτιαίου μυελού στο επίπεδο του πέμπτου και έκτου αυχενικού σπονδύλου αναπαράγει τα κύρια κλινικά και ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της ανθρώπινης ΑΣΜ. γ) η τρέχουσα επεμβατική θεραπεία για την ΑΣΜ είναι η χειρουργική αποσυμπίεση του νωτιαίου μυελού. Οι συγγραφείς-ερευνητές δεν απέδειξαν αν η χειρουργική αποσυμπίεση είναι δυνατή στο συγκεκριμένο πειραματικό μοντέλο ΑΣΜ. 3) Τέλος το μοντέλο που αναπτύχθηκε από την ομάδα του Fehlings παρουσιάζει τα εξής αρνητικά σημεία: α) Στο συγκεκριμένο πειραματικό μοντέλο, η φύση της πίεσης που ασκήθηκε δεν ήταν προοδευτική αλλά αντιθέτως σταδιακή β) εν δευτέροις, η πίεση που ασκηθηκε επί του νωτιαίου μυελού δεν ήταν χρόνια αλλά υποξεία όπως αποδείχθηκαν από τα κλινικά τεστ που χρησιμοποιήθηκαν γ) ένα εν δυνάμει μειονέκτημα που αναγνωρίζεται είναι επίσης η αστάθεια της συσκευής πιέσεως δ) δεν αναδείχθηκε μέσα από τα πειράματα που πραγματοποιήθηκα σε αυτήν τη μελέτη ότι το μοντέλο αναπαράγει τα ιστολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά της ανθρωπίνης νόσου ε) το μοντέλο δεν είναι MRI συμβατό 48

49

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 METAΓΡΑΦΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΚΑΙ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ 4.1 O Μεταγραφικός Παράγοντας Ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κB περιλαμβάνει τις υπομονάδες Rel A/p65, NF-κB1, NF-κB2, crel και RelB οι οποίες σχηματίζουν ομοδιμερή ή ετεροδιμερή. To πιο κοινό διμερές είναι το NF- κ B1-RelA που περιέχει τις πρωτείνες p50 και p65. Σε καταστάσεις ηρεμίας ο NF-κB παραμένει στο κυτταρόπλασμα συνδεδεμένος με την την ομάδα πρωτεινών. Λειτουργώντας ως διμερές ο NF-κB ρυθμίζει την έκφραση μιας πληθώρας γονιδίων απαρτιώνοντας έτσι πληροφορίες που φθάνουν στον πυρήνα προερχόμενες από κυττοκίνες, αυξητικούς παράγοντες, μόρια προσκόλλησης ή άλλα μιτογόνα ερεθίσματα. Αρνητικός ρυθμιστής της λειτουργίας του NF-κB είναι η ομάδα των πρωτεϊνών IκB οι οποίες δεσμεύουν τον NF-κB, αυξάνουν τη συσσώρευσή του στο κυτταρόπλασμα και παρεμποδίζουν την είσοδο του και την επακόλουθη δράση του στον πυρήνα. Η ενεργοποίση του NF-κB πραγματοποιείται σε διαδοχικά βήματα. Πρώτα ενεργοποιούνται οι θετικοί ρυθμιστές του NF-κB, οι λεγόμενες κινάσες των Ικ (ΙΚΚ). Οι κινάσες αυτές φωσφορυλιώνουν τις Ικ με αποτέλεσμα την επαγωγή της αποδομησής τους από το σύστημα της ubiquitin. Αυτό έχει ως αποτέλεσμαα την απελευθέρωση του ΝΚ-κB. Έπειτα ο NF-κB ως διμερές μεταφέρεται στον πυρήνα και συνδέεται στο DNA επάγωντας την έκφραση πολλών γονιδίων που εμπλέκονται σε ποικίλες βιολογικές διεργασίες όπως η ανοσολογική απάντηση, η αγγειογένεση, η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, η απόπτωση, η κυτταρική διήθηση κ.α [46]. Διαάφορες πρωτείνες της εξωκυττάριας ουσίας όπως η MMP-2 και MMP-9, καθώς και το u-pa εμφανίζουν στους υποκινητές τους αλληλουχίες πρόσδεσης για 50

τον NF-κB υποδηλώνοντας τη στενή τους σχέση με το μεταγραφικό παράγοντα [1]. Αν και ο NF-κB εμπλέκεται στη παθοβιολογία διάφορων παθήσεων του ΚΝΣ συμπεριλαμβανομένης της οξείας τραυατικής κάκωσης του νωτιαίου μυελού, ο ρόλος του στην ΑΣΜ δεν έχει μέχρι στιγμής μελετηθεί. 4.2 Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (matrix metalloproteinases; ΜΜPs) αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια ενδοπεπτιδασών που έχουν στο ενεργό τους κέντρο ένα δακτύλιο του Zn +2 ;exoyn περιγράφηκαν γοα πρώτη φορά μισό αιώνα πριν [47]. Tα συγκεκριμένα ένζυμα συμμετέχουν στη αναδόμηση του ιστού καθώς επίσης και στην απόδομηση της εξωκυττάριας ουσίας. Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί 26 είδη μεταλλοπρωτεϊνάσών στον άνθρωπο. Ανάλογα με το υπόστρωμα το οποίο διασπούν παίρνουν και το όνομα τους. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες η ποσοτική τους έκφραση είναι περιορισμένη. Τα ένζυμα αυτά συμμετέχουν σε μια σειρά από φυσιολογικές βιολογικές διαδικασίες όπως η εμβρυϊκή ανάπτυξη, η αγγειογένεση, η μετανάστευση [48]. Επίσης οι MMPs διαδραματίζουν σημαντικλο ρόλο σε μια πληθώρα παθολογικών καταστάσεων όπως ο καρκίνος, τα εκφυλιστικά νοσήματα, αυτοάνοσα νοσήματα, φλεγμονώδεις παθήσεις [49, 50]. Οι ΜΜPs εκκρίνονται από μια πληθώρα κυττάρων του συνδετικού ιστού καθώς επίσης και προφλεγμονωδών κυττάρων όπως είναι οι ινοβλάστες, οι οστεοβλάστες, τα ενδοθηλικά κύτταρα και τα μακροφάγα, τα ουδετερόφιλα λεμφοκύτταρα αντιστοίχως. Εκκρίνονται σε ανενεργό μορφή (ζυμογόνα) και ενεργοποιούνται εκτός του κυττάρου όπου και εξασκούν τη δράση τους. Η ρύθμιση της λειτουργίας των ΜΜPs γίνεται σε τρία επίπεδα α) Στο επίπεδο της μεταγραφής του γονιδίου του προενζύμου β) στο επίπεδο ενεργοποίησης του προενζύμου στον εξωκυττάριο χώρο γ) στο επίπεδο απενεργοποίησης των ΜΜPs από την παρουσία ιστικών αναστολέων των ΜΜPs [51]. Σε παθολογικές καταστάσεις, αυτή η ισορροπία 51

διαταράσσεται κάτι που οδηγεί σε αυξημένη έκκριση ενεργών ΜΜPs κάτι που στη συνέχεια συμβάλλει στην αποδόμηση του ιστού [1]. Η ενεργοποίηση του προενζύμου πραγματοποιείται με τη δράση άλλων πρωτεϊνασών όπως η πλασμίνη και οι μεμβρανικού τύπου μεταλλοπρωτεάσες (ΜΤ ΜΜPs) που βρίσκονται καθηλωμένες στην κυτταρική μεμβράνη στην οδηγό περιοχή [1]. Η ενεργοποίηση γίνεται με τη διάσπαση του αμινοτελικού άκρου του μορίου. Το ενεργοποιημένο ένζυμο αναστέλλεται από την παρουσία ιστικών αναστολέων των ΜΜPs (ΤΙΜPs) που και αυτοί εκκρίνονται από τα κύτταρα. Η ισορροπία ΜΜP ΤΙΜΡ είναι αυτή που καθορίζει τη δραστικότητα των ΜΜPs. Οι περισσότερες από τις MMPs χαρακτηρίζονται από τέσσερις δομικές μοριακές περιοχές: το προσηματοδοτικό αμινιτελικό άκρο, το ενεργό αμινοτελικό την αμινοτελική καταλυτική περιοχή που περιέχει ένα ιόν Zn, το καρβοξυτελικό άκρο με δομή αιμοπηκτίνης και. Η καταλυτική περιοχή συνδέεται με την περιοχή αιμοπηκτίνης με έναν βραχίονα κυστείνης και η σύνδεση αυτή είναι σημαντική για τον καθορισμό της ειδικότητας του ενζύμου και την αλληλεπίδραση με TIMPs. Η ενεργότητα του ενζύμου περιορίζεται από την σύνδεση κυστεινών του προπεπτιδικού τμήματος με το ιόν Zn. Διάσπαση της σύνδεσης αυτής είτε με πρωτεολυτική απομάκρυνση του προπεπτιδίου, είτε με αλλαγές της τριτοταγούς δομής απελευθερώνει το ενεργό κέντρο του ενζύμου. Οι δύο gelatinases MMP-2, MMP-9 διαθέτουν στην καταλυτική περιοχή τρία κατάλoιπα ινοδονεκτίνης τύπου ΙΙ. Οι έξι MT-MMPs προσδένονται στην κυτταρική μεμβράνη με το καρβοξυ-τελικό διαμεμβρανικό άκρο του μορίου ή έναν συνδέτη polyphosphatidylinositol. 52

53

ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 54

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΜΕΛΕΤΗ Α ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΟΣ ΠΡΩΤΟΤΥΠΟΥ, ΑΞΙΟΠΙΣΤΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΣΙΜΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ ΑΥΧΕΝΙΚΗΣ ΣΠΟΝΔΥΛΩΤΙΚΗΣ ΜΥΕΛΟΠΑΘΕΙΑΣ [52] 55

1.ΥΛΙΚΟ 1.1. Πειραματόζωα Στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 35 άσπροι υγιείς κόνικλοι Νέας Ζηλανδίας ηλικίας 8 εβδομάδων. Το βάρος των πειραματόζωων κυμαινόταν μεταξύ 2.5-3.0 kg. Τα πειραματόζωα φυλάσσονταν σε ειδικά διαμορφωμένα κλουβιά, σε δωμάτιο στο οποίο η θερμοκρασία διατηρούνταν 18-22 βαθμούς κελσίου. Παραδοσιακή εργαστηριακή τροφή χορηγούνταν στα πειραματόζωα. Το δωμάτιο διαμονής ήταν ελεύθερο παθολογικών μικροβίων. Tα πειραματόζωα έλαβαν ανθρώπινη φροντίδα σύμφωνα με τις Ευρωπαϊκές διατάξεις Περί Συνθηκών και Οδηγιών Φιλοξενίας και Φροντίδας Zώων για Πειραματικούς και άλλους Επιστημονικούς Σκοπούς (1999/55/ΕΘ). Το πειραματικό μοντέλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Εικόνα 1.1 Αντιπροσωπευτική φωτογραφία κονίκλου Νέας Ζηλανδίας. 56

1.2. Υλικό Πρόκλησης Πίεσης Ένας αρωματικός πολυαιθέρας χρησιμοποιήθηκε στη συγκεκριμένη μελέτη προκειμένου να προκληθεί χρόνια και προοδευτική πίεση στον αυχενικό νωτιαίο μυελό. Τα κύρια χαρακτηριστικά του συγκεκριμένου αρωματικού πολυαιθέρα είναι η απορρόφηση ιόντων ασβεστίου και η κατακρήμνιση αλάτων ασβεστίου κ φωσφόρου [53]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η τοποθέτηση του συγκεκριμένου αρωματικού πολυαιθέρα σε οστικά κατάγματα επιταχύνει τη διαδικασία ουλοποίησης τους [53]. Εικόνα 1.2 Χημική σύσταση του αρωματικού πολυαιθέρα που χρησιμοποιήθηκε σαν υλικό πρόκλησης πιέσεως στη συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή. 57

1.3. Πειραματικές Ομάδες Τα πειραματόζωα (n=3) που παρουσίασαν απώλεια αίματος >15ml, αρρυθμία, ή/και αιμοδυναμική αστάθεια (οριζόμενη ως πτώση της αρτηριακής πίεσης >20 mmhg για περισσότερο από 1 λεπτό), αποκλείσθηκαν από την μελέτη. Επίσης, τα πειραματόζωα (n=2) που παρουσίασαν νευρολογικά ελλείμματα μετά το πέρας της χειρουργικής διαδικασίας αποκλείσθηκαν από την μελέτη. Τα εναπομείναντα πειραματόζωα (n=30) χωρίστηκαν τυχαία στις παρακάτω 2 πειραματικές ομάδες: Στην Ομάδα Ι: Ομάδα Ελέγχου (n=15), τα ζώα υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση χωρίς την εμφύτευση του αρωματικού πολυαιθέρα Στην Ομάδα ΙΙ: Ομάδα Χρόνιας Προοδευτικής Πίεσης (ΧΠΠ), n=15. Στη πειραματική αυτή ομάδα πραγματοποιήθηκε μόνιμη εμφύτευση του υλικού πιέσεως, ΑΠ. Τα πειραματόζωα και των δύο ομάδων θυσιάστηκαν μετά το πέρας είκοσι εβδομάδων. 58

2. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 2.1 Πρωτόκολλο Αναισθησίας Οι κόνικλοι παρέμειναν χωρίς λήψη τροφής για 12 ώρες. Για την εισαγωγή στην αναισθησία χορηγήθηκαν ενδομυικά (στο μηριαίο μυ των οπισθίων άκρων) 50mg/kg Υδροχλωρικής Κεταμίνης και (KETAMINE HYDROCHLORIDE, Parke- Davis DIV of Warner-Lambert, USA), και 10mg/kg ξυλαζίνης: (XYLAZINE, Bayer HealthCare, Germany). Η αναισθησία διατηρήθηκε με περιοδική ενδοφλέβια χορήγηση 0.6mg/kg προποφόλης 1%: (PROPOFOL, Astra Zeneca, Chershire,UK) και 0.001-0.002mg/kg Φεντανίλης: (FENTANYL, Sanofi, Sweeden) Η παρακολούθηση του αριθμού των αναπνοών, των καρδιακών παλμών και του μυϊκού τόνου της κόρης επέτρεπε τον έλεγχο του επιπέδου αναισθησίας. 2.2 Χειρουργικό Πρωτόκολλο Όλες οι χειρουργικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν υπό γενική αναισθησία, μηχανικό αερισμό και κάτω από συνθήκες γενικής αντισηψίας. Ακολούθησε ευπρεπισμός της ράχης, των αυτιών και της περιοχής των μηριαίων αρτηριών προ της καθήλωσης του ζώου σε ύπτια θέση. Το ζώο διατηρούσε αυτόματη αναπνοή με χορήγηση Ο 2 μέσω μικρού μεγέθους μάσκας προσώπου (FiΟ 2). Ακολούθησε εισαγωγή φλεβοκαθετήρα (22-gauge) στην επιχείλιο ωτιαία φλέβα από την οποία χορηγήθηκαν εφάπαξ δόση. Αρτηριακός καθετήρας (22-gauge) εισήχθη στην κεντρική ωτιαία αρτηρία για συνεχή παρακολούθηση των καρδιακών παλμών και της αρτηριακής πίεσης κατά τη διάρκεια του πειράματος. Στην ουριαία αρτηρία 59

τοποθετήθηκε οξύμετρο για την παρακολούθηση των επιπέδων κορεσμού του οξυγόνου. Μετά τη σταθεροποίηση του ζώου η χειρουργική διαδικασία ήταν η εξής: μετά από τομή του δέρματoς μήκους 2-3cm αντίστοιχα προς τις ακανθώδεις αποφύσεις Α4-Θ2, πραγματοποιούνταν αποκόλληση των παρασπονδυλικών μυϊκών μαζών. Ακολουθούσε προσεκτική παρασκευή του πετάλου του έκτου και έβδομου αυχενικού σπονδύλου και επακόλουθη πεταλεκτομία του έβδομου αυχενικού σπονδύλου. Στη συνέχεια ακολουθούσε προσεκτική αφαίρεση του ωχρού συνδέσμου στο σημείο επικόλλησης του στο πέταλο του έκτου αυχενικού σπονδύλου. Αφού η εσωτερική επιφάνεια του πετάλου του Α6 καθαρίστηκε επιμελώς και κατέστη γυμνή, ακλουθούσε προσεκτική αφαίρεση του περιοστέου της εσωτερικής επιφάνειας του έκτου αυχενικού σπονδύλου με τη χρήση ενός microhook. Ένα μικρό τεμάχιο αρωματικού πολυαιθέρα τοποθετήθηκε κάτω από το σπονδυλικό τόξο του έκτου αυχενικού σπονδύλου επί του επισκληριδίου χώρου. Στην ομάδα ελέγχου το υλικό πίεσης τοποθετήθηκε κάτω από το πέταλο του έκτου αυχενικού σπονδύλου και αφαιρέθηκε τριάντα δευτερόλεπτα μετά την εμφύτευση (ψευδή επέμβαση-sham surgery). 2.3 Πρωτόκολλο Νευρολογικής Εκτίμησης Η νευρολογική κατάσταση όλων των κονίκλων και των δύο πειραματικών ομάδων εκτιμήθηκε εβδομαδιαίως μετά από την χειρουργική επέμβαση (εμφύτευση υλικού πιέσεως) από έναν ανεξάρτητο παρατηρητή χρησιμοποιώντας την κλίμακα του Tarlov: 0: σπαστική παραπληγία κ καθόλου κινητικότητα των κάτω άκρων, 1: σπαστική παραπληγία και μικρή κινητικότητα των κάτω άκρων, 2: καλή κινητικότητα των κάτω άκρων και αδυναμία να σταθεί όρθιο, 3: στέκεται όρθιο αλλά δεν περπατάει κανονικά, 4: περπατάει κανονικά. 60

Πίνακας 1.1. Η πενταβάθμια βαθμολογική κλινική του Τarlov για την κλινική εκτίμηση των πειραματόζωων και των δύο ομάδων, 2.4 Ηλεκτροφυσιολογία Προκλητά δυναμικά του νωτιαίου μυελού αξιολογήθηκαν μετά από διέγερση της κινητικής περιοχής του φλοιού του εγκεφάλου. 2.5 Πρωτόκολλο Μονιμοποίησης και Παρασκευής των Νωτιαίων Μυελών Τα ζώα και των δύο ομάδων θυσιάστηκαν με το πέρας 20 εβδομάδων μετά τη χειρουργική διαδικασία. Τμήμα του νωτιαίου μυελού καθώς και σπονδυλικού τόξου μήκους 1cm ανακτήθηκε και σταθεροποιήθηκε σε 10% φορμόλη. Για τη μονιμοποίηση των παρασκευασμάτων ακολουθήθηκε η συνήθης διαδικασία με έκπλυση τους αρχικά με τρεχούμενο νερό και εμβύθισή τους σε διαλύματα αλκοόλης (70%, 96% και 100%), ενώ ακολούθως γινόταν η διαύγαση και ο εγκλεισμός τους σε κύβους παραφίνης. Στη συνέχεια λαμβάνονταν σε θετικά φορτισμένα αντικειμενοφόρα (SuperFrostMenzel-Glaser, Braunschweig, Germany) πλακίδια, ιστολογικές τομές πάχους 4μm. 61

2.6 Ιστοχημεία α. Χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης Η χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης που χρησιμοποιήθηκε, αποτελεί μια χρήσιμη τεχνική για την αναγνώριση στοιχείων καταστροφής κυττάρων. Συγκεκριμένα με τη χρώση αυτή γίνονται εμφανείς κυτταροπλασματικές η πυρηνικές αλλαγές, όπως συρρίκνωση και πύκνωση της χρωματίνης, καθώς και αποδόμηση και μεταβολή του σχήματος των κυττάρων. Η εκτίμηση των τομών νωτιαίου μυελού έγινε από δύο ανεξάρτητους ερευνητές που δεν είχαν επίγνωση της ομάδας που εξέταζαν. β. Χρώση Kluver-Barrera H ιστοχημεία Kluver-Barrera έγινε για τον προσδιορισμό κ την ποσοτικοποίηση του βαθμού της απομυελίνωσης του νωτιαίου μυελού λόγω της χρόνιας και προοδευτικής πίεσης που ασκήθηκε επί αυτού. Οι τομές επωάστηκαν ολονύκτια στους 56 βαθμούς Κελσίου σε διάλυμα 1% luxol fast blue σε 95% αλκόολη. Οι τομές διαφοροποιήθηκαν σε διάλυμα 0,005% lithium carbonate και τέλος εμβαπτίσθηκαν σε 70% αλκοόλη. Η εκτίμηση της απομυελίνωσης πραγματοποιήθηκε σε αξονικές τομές του νωτιαίου μυελού. Κάθε τομή μελετήθηκε υπό το οπτικό μικροσκόπιο και υπολογίσθηκε το ποσοστό των απομυελινωτικών περιοχών σε κάθε τομή. 2.7 Μέθοδος in situ υβριδισμού TUNEL (κατακερματισμένου DNA) για την ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων α. Γενικά Για την ανίχνευση του κατακερματισμένου DNA και κατά επέκταση των αποπτωτικών κυττάρων, εφαρμόστηκε η μέθοδος in situ υβριδισμού TUNEL. Κατά τη διάρκεια της απόπτωσης αρχικά λαμβάνει χώρα η διάσπαση του DNA. Τα σημεία στα οποία κόβεται μπορεί να ανιχνευθούν με σήμανση των ελευθέρων 3 -ΟΗ που 62

προκύπτουν με τροποποιημένα νουκλεοτιδια (dutp), τα οποία φθορίζουν. Η αντίδραση καταλύεται από ένα ένζυμο που ονομάζεται δεοξυνουκλεοτιδυλτρανσφεράση (TdT), το οποίο με αυτόν τον τρόπο πολυμερίζει τα νουκλεοτίδια στο 3 τέλος του σπασμένου DNΑ. β. Πρωτόκολλο Χρησιμοποιήθηκε in situ cell death detection kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστού ως ακολούθως: 1. Αποπαραφίνωση τομών: Η αποπαραφίνωση των τομών έγινε σε κλίβανο σε θερμοκρασία 60 βαθμούς Κελσίου για 16 ώρες. 2. Ενυδάτωση τομών: Οι τομές εμβαπτίσθηκαν σε διαφορετικά διαλύματα ως ακολούθως: a. Ξυλόλη για 20 λεπτά. b. Ενυδάτωση των τομών σε κατιούσα αλκοολών. i. 100% αιθανόλη για 2 λεπτά ii. 100% αιθανόλη για 2 λεπτά iii. 96% αιθανόλη για 1 λεπτό iv. 80% αιθανόλη για 1 λεπτό v. 70% αιθανόλη για 1 λεπτό vi. Έκπλυση των τομών με αποσταγμένο νερό για 5 λεπτά. 3. Επώαση των τομών σε διάλυμα πρωτεϊνάσης Κ για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς κελσίου 4. Έκπλυση των τομών επί 5 λεπτά με αποσταγμένο νερό 2 φορές. 5. Επώαση των τομών σε διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 2% για 20 λεπτά για την κατανάλωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης. 6. Έκπλυση των τομών με αποσταγμένο νερό επί 5 λεπτά, 2 φορές. 7. Επώαση των τομών με TUNEL (Tat-terminal deoxynucleotidyl transferase και digoxigenin-dutp) στους 37 βαθμούς κελσίου για 60 λεπτά. 8. Έκπλυση των τομών επί 5 λεπτά σε διάλυμα PBS, 3 φορές. 63

9. Επώαση των τομών για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς κελσίου με το peroxidase converter anti-fluorescein antibody. 10. Έκπλυση των τομών επί 5 λεπτά με διάλυμα TBS 3 φορές. 11. Επώαση των τομών για 3 λεπτά περίπου σε διάλυμα που περιέχει διαμινοβενζιδίνη.. 12. Έκπλυση των τομών επί 1 λεπτό σε νερό βρύσης 2 φορές. 13. Εμβάπτιση των τομών σε αιματοξυλίνη.(1 λεπτό) 14. Έκπλυση με νερό βρύσης. 15. Αφυδάτωση των τομών σε ανιούσα αλκοολών: 70% 1 λεπτό, 80% 1 λεπτό, 96% 1 λεπτό, 100% 1 λεπτό, 100% 1 λεπτό. 16. Εμβάπτιση των τομών επί 1 λεπτό σε ξυλόλη 2 φορές. 17. Επικόλληση των καλυπτρίδων με Entellan. Ως βιοχημικοί θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν (σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστού) ορισμένες τομές οι οποίες επωάσθηκαν με διάλυμα 10μg/ml of DNAse I (Sigma, UK). Ως αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν ορισμένες τομές από τα παρασκευάσματα των νωτιαίων μυελών και σε αυτές εφαρμόσθηκε η ίδια διαδικασία όπου το διάλυμα TUNEL είχε αντικατασταθεί από άλλο διάλυμα που δεν περιείχε TdT. γ. Mέτρηση Αποπτωτικών Κυττάρων: Όλες οι εικόνες καταγράφηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες ώστε η ένταση του φθορισμού να είναι συγκρίσιμη. Για τη μέτρηση των αποπτωτικών κυττάρων χρησιμοποιήσαμε τομές νωτιαίων μυελών προερχόμενων και από τις δύο πειραματικές ομάδες. Η ποσοτική καταγραφή των αγγείων πραγματοπιήθηκε σε μικροσκόπιο φθορισμού (20 φορές μεγένθυση) σε τέσσερα επιλεγμένα πεδία (πρόσθιο κέρας της φαιάς ουσίας, οπίσθιο κέρας της φαιάς ουσίας, αριστερά κ δεξιά στήλη λευκής ουσίας). Μετέπειτα, οι τιμές από κάθε πεδίο αθροίστηκαν μαζί και ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων υπολογίστηκε στο επίκεντρο της πίεσης. 64

2.8 Ανoσοιστοχημεία Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε στη παρούσα μελέτη για την ανεύρεση της έκφρασης των πρωτεινών NF, S100 και GFAP είναι η ανοσοϊστοχημική τεχνική ιοτίνης στρεπταβιδίνης υπεροξειδάσης. Η πειραματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ανατομικής της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών. α. Πρωτόκολλο: Αποπαραφίνωση των τόμων: ολονύχτια τοποθέτηση των τομών σε φούρνο θερμοκρασίας 56 ο C, εμβάπτιση 5 min στη ζεστή ξυλόλη Ι (56 ο C), 5 min στη ζεστή ξυλόλη ΙΙ (56 ο C), 5 min στη ζεστή ξυλόλη ΙΙΙ (56 ο C), και 5 min στην κρύα ξυλόλη (θερμ. δωματίου). Ενυδάτωση των τομών σε κατιούσα συγκέντρωση αλκοολών: Εμβάπτιση των τόμων σε αλκοόλες 100 ο, 96 ο, 80 ο, 70 ο, 5min στην καθεμία, και ξέπλυμα των πλακιδίων με απιονισμένο Η 2 Ο στο τέλος. Ανάδειξη αντιγονικών θέσεων. Κάλυψη των τόμων με διάλυμα κιτρικού Να (10mΜ, pη=6) και τοποθέτηση στον φούρνο μικροκυμάτων(στα 800watt x2min και στα 300watt x7 min). Εν συνεχεία επάνοδος των τομών σε θερμοκρασία δωματίου και ξέπλυμα με δ/μα TBS για 10 min, δύο φορές. Στην περίπτωση της MMP-2 το στάδιο αυτό παραλείφθηκε ενώ στην περίπτωση του u-pa χρησιμοποιήθηκε EDTA αντί του κιτρικού οξέως. Κατανάλωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης. Εμβάπτιση των τόμων σε διάλυμα Η 2 Ο 2 1% σε απιονισμένο Η 2 Ο για 20 min. Εν συνεχεία ξέπλυμα των τόμων με απιονισμένο Η 2 Ο (2 φορές x 10 min) και με διάλυμα TBS (2 φορές x 10 min). Protein blocking. Επικάλυψη των τόμων με διάλυμα TBS-BSA 1% για 10 min. Τοποθέτηση του ειδικού αντισώματος για τo κάθε μόριο στην κατάλληλη αραίωση και για τον κατάλληλο χρόνο επώασης. (βλέπε πίνακα 2). 65

Έκπλυση των τόμων με διάλυμα TBS (3 φορές x 10 min) Τοποθέτηση του αντιδραστηρίου envision (DAKO rabbit,mouse Lot 44771) στο ρόλο του δεύτερου και τρίτου αντισώματος. Ξέπλυμα των τόμων με διάλυμα TBS (3 φορές x 10 min) Ανίχνευση των θέσεων δέσμευσης της υπεροξειδάσης με επικάλυψη τομών με διάλυμα τετρανδροχλωρικής διαμινοβενζίδίνης (DAB) (DAKO K5007) για χρόνο 5 min σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτεινό χώρο. Έκπλυση των τόμων με απιονισμένο Η 2 Ο 3 φορές x 5 min. Χρώση αντίθεση των πυρήνων (counterstaining) με αιματοξυλίνη Harris και ξέπλυμα με τρεχούμενο νερό βρύσης για απομάκρυνση της περίσσειας. Στιγμιαία εμβάπτιση στην όξινη αλκοόλη και ξέπλυμα με τρεχούμενο H 2 O. Διέλευση των τόμων από διαλύματα αλκοολών συνεχώς αυξανομένης συγκέντρωσης 70 ο, 80 ο, 96 ο, 100 ο. Εμβάπτιση σε ξυλόλη και επικόλληση των καλυπτρίδων. β. Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν: Διάλυμα Tris: 6,1 Tris σε 500 ml H 2 O ρύθμιση το ph σε 7,6 με πυκνό HCl. Διάλυμα κιτρικού Να + : 2,1 gr κιτρικού Να + σε 1 lit απιον. H 2 O ρύθμιση του ph = 6 με π. HCl. Διάλυμα EDTA Διάλυμα NaCl: 900 ml απιονισμένο H 2 O + 8,1 gr NaCl. Διάλυμα (Tris Buffer Saline) TBS 5 mm: 900 ml δ/τος NaCl + 100 ml δια/τος Tris Διάλυμα TBS/BSA 5%: 4 ml δ/τος TBS + 0,2 gr Bovine Serum Albumin Διάλυμα όξινης αλκοόλης: 105 ml απόλυτης αλκοόλης + 45 ml Διαλυμα Η2Ο2 30% απιονισμένο H 2 O + 1,5 ml πυκνού HCl 66

γ. Αντισώματα που χρσιμοποιήθηκαν: λέπε Πίνακα 2.1. δ. Αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσεως: Η αξιολόγηση των τομών έγινε στο φωτονικό μικροσκόπιο σε μεγέθυνση 1:20 και 1:40. Εκτιμήθηκε η ένταση και η κατανομή της ανοσοχρώσης, που υποδηλώνει το επίπεδο έκφρασης της αντίστοιχης πρωτεΐνης, σε ότι αφορά το κυτταρικό διαμέρισμα και το είδος του κυττάρου που εμφανίζεται θετικό. Η ένταση της ανοσοχρώσεως αξιολογήθηκε ως ασθενής, μέτρια και ισχυρή (+,++,+++) με βάση τη διαβάθμιση του καφέ χρώματος του προϊόντος της οξείδωσης της DAB από την υπεροξειδάση. Η ακριβής εκτίμηση του ποσοστού των θετικών κυττάρων ανά τομή έγινε ως εξής: Επιλέχθηκαν τυχαία δέκα οπτικά πεδία ανά τομή στη μεγέθυνση x 40. Σε κάθε οπτικό πεδίο μετρήθηκαν τα θετικά κύτταρα και το σύνολο των κυττάρων του όγκου. Η άθροιση των τιμών αυτών και για τα δέκα οπτικά πεδία οδήγησε στο ποσοστό των θετικών καρκινικών κυττάρων ανά τομή. Η βαθμονόμηση της κατανομής έγινε ως εξής: score 0 : ποσοστό θετκών κυττάρων <10%, score + : ποσοστό θετικών κυττάρων 10-40%, score ++: ποσοστό θετικών κυττάρων 40-80%, score +++: ποσοστό θετικών κυττάρων >80%. Συνδυάζοντας την ένταση και την κατανομή της χρώσης προέκυψε το τελικό συνδυασμένο αποτέλεσμα όπως φαίνεται στον πίνακα που ακολουθεί. 67

Ανάδειξη αντιγόνου NF Φούρνος μικροκυμμάτων 800watt x2min 300watt x7min S100 Φούρνος μικροκυμμάτων 800watt x2min 300watt x7min GFAP Φούρνος μικροκυμμάτων 800watt x2min 300watt x7min Κάλυψη πρωτεϊνικών θέσεων Πρωτογενές αντίσωμα αραίωση επώαση TBS-BSA Cell Marque 1/40 Ολονύχτια Επώαση TBS-BSA Cell Marque 1/30 Ολονύχτια Επώαση TBS-BSA Neo Marker 1/40 Ολονύχτια επώαση Πίνακας 2.1 Το είδος αντισωμάτων, οι αραιώσεις και οι χρόνοι επώασης που χρησιμοποιήθηκαν στην ανοσοιστοχημική τεχνική στη μελέτη Α. Επίσης, παρουσιάζονται οι τεχνικές ανάδειξης αντιγόνων και κάλυψης πρωτεινικών θέσεων. 68

Τελικό Ένταση Κατανομή Αποτέλεσμα 0 0 <10% + ++/+++ 1 ή ++ + ++ ++/+++ 2 ή +++ + 3 +++ ++/+++ Πίνακας 2.2 2.9 Έμμεσος Ανοσοφθορισμός a. Γενικά: Ο ανοσοφθορισμός είναι η μέθοδος κατά την οποία χρησιμοποιούνται φθορίζοντα αντισώματα ή αντισώματα συνδεόμενα με φθορίζουσες ουσίες για την ανίχνευση αντιγόνων στους ιστούς. Η ταυτοποίηση του συμπλέγματος αντιγόνουαντισώματος. ανίχνευση γίνεται με τη βοήθεια μικροσκοπίου φθορισμού ή συνεστιακού μικροσκοπίου. H μεθοδολογία του ανοσοφθορισμού διακρίνεται σε δύο τύπους: στον άμεσο και στον έμμεσο ανοσοφθορισμό. Στον άμεσο ανοσοφθορισμό το ειδικό αντίσωμα είναι ήδη σημασμένο με κάποιο φθορίζον χρωμογόνο. Η πρόσδεση του πρωτογενούς αντισώματος στο αντιγόνο και η δημιουργία του συμπλέγματος αντιγόνουαντισώματος μπορεί να ανιχνευθεί στο μικροσκόπιο φθορισμού ή στο συνεστιακό μικροσκόπιο. Ο άμεσος αναοσοφθορισμός εμφανίζει κάποια πλεονεκτήματα σε σχέση με τον έμμεσο ανοσοφθορισμό. Πρώτον η σύζευξη του φθορίζοντος χρωμογόνου στο αντίσωμα έχει ως αποτέλεσμα την μείωση του αριθμού των σταδίων κατά τη διάρκεια 69

της εφαρμογής του πρωτόκολλου της ανοσοιστοχημείας. Εν δευτέροις, ο άμεσος ανοσοφθορισμός οδηγεί στην ανάπτυξη λιγότερου background σε σχέση με τον έμμεσο ανοσοφθορισμό. Σε αντίθεση με τον άμεσο, στον έμμεσο ανοσοφθορισμό χρησιμοποοιούνται δύο διαφορετικά αντισώματα. Το πρωτογενές αντίσωμα που δεν είναι σημασμένο με κάποιο φθορίζον χρωμογόνο προσδένετα ειδικά με το αντιγόνο. Στη συνέχεια ένα δευτερογενές αντίσωμα (secondary antibody), σημασμένο με φθορίζουσα ουσία δεσμεύεται στο πρωτογενές και με αυτόν τον τρόπο το σύμπλεγμα γίνεται ορατό με τη βοήθεια της μικροσκοπίας του φθορισμού. β. Πρωτόκολλο: Μετά την αποπαραφίνωση των τομών ακολουθούσε επώαση με blocking solution διάλυμα που περιείχε 10% Triton-X για 60min. H συγκεκριμένη διδικασία συνέβαλε στην επίτευξη δύο στόχων: την μείωση του αυτοφθορισμού και την αύξηση της διαπερατότητας της μεμβράνης. Στη συνέχεια γινόταν ολονύκτια επώαση των τομών με το διάλυμα του πρώτου αντισώματος (το αντι-laminin χρησιμοποιήθηκε με αραίωση 1:40 σε blocking solution που περιείχε 10% Triton-X. Με το πέρας της επώασης, εφόσον γινόταν πλύση των τομών με PBS γινόταν επώαση με το διάλυμα του 2ου αντισώματος (αντι-ποντικίσιο 488 sε αραίωση 1:400 σε διάλυμα blocking solution που περιείχε 10% Triton-X) για 1hr και ακολουθούσε πλύσιμο των κυττάρων με PBS. Tέλος, οι τομές αφού πλένονταν πάλι με PBS μονιμοποιούνταν με mowiol που περιέχει DAPI για τη χρώση του πυρήνα πάνω σε αντικειμενοφόρες πλάκες. Η μικροσκόπηση γινόταν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού Zeiss. γ. Mέτρηση αγγείων: Όλες οι εικόνες καταγράφηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες ώστε η ένταση του φθορισμού να είναι συγκρίσιμη. Για τη μέτρηση των αγγείων χρησιμοποιήσαμε τομές νωτιαίων μυελών προερχόμενων και από τις δύο πειραματικές ομάδες στις οποίες διενεργήθηκε έμμεσος ανοσοφθορισμός χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κατά της λαμινίνης που είναι μία από τις πρωτεινες της βασικής μεμβράνης των αγγείων. Η ποσοτική καταγραφή των αγγείων πραγματοπιήθηκε σε μικροσκόπιο 70

φθορισμού (20 φορές μεγένθυση) σε τέσσερα επιλεγμένα πεδία (πρόσθιο κέρας της φαιάς ουσίας, οπίσθιο κέρας της φαιάς ουσίας, αριστερά κ δεξιά στήλη λευκής ουσίας). Μετέπειτα, οι τιμές από κάθε πεδίο αθροίστηκαν μαζί και ο αριθμός των αγγείων υπολογίστηκε 0.5, 1 και 3 χιλιοστά καφαλιαίως και ουριαίως από το επίκεντρο της πίεσης, καθώς επίσης και στο επίκεντρο της πίεσης. 2.10 Στατιστική ανάλυση Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη βοήθεια του στατιστικού πακέτου SPSS 10. Για κάθε ομάδα αποτελεσμάτων υπολογίσθηκε η μέση τιμή των ποσοστών θετικότητας και η τυπική απόκλιση, ενώ η κατανομή των τιμών παρουσιάζεται γραφικά με τη μορφή ιστογράμματος. Για τη σύγκριση των ποσοστών θετικότητας μεταξύ των διαφόρων ομάδων νεοπλασμάτων εφαρμόσθηκε ο στατιστικός έλεγχος one way και two-way ANOVA και Bonferroni test post- hoc analysis. 71

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κλινικά Ευρήματα Τα πειραματόζωα που άνηκαν στην ομάδα ελέγχου (n=15) δεν εμφάνισαν νευρολογικά ελλείμματα καθ όλη τη διάρκεια της εικοσιεβδομαδιαίας μελέτης. Τα πειραματόζωα που άνηκαν στην ομάδα ΧΠΠ (n=15) δεν εμφάνισαν νευρολογικά ελλείματα και δεν ανεδείχθη παρουσία κανενός συμπτώματος μέχρι το πέρας της τρίτης εβδομάδας μετά τη χειρουργική διαδικασία. Ωστόσο, μετά από το πέρας της τρίτης εβδομάδας τα πειραματόζωα άρχισαν να εμφανίζουν προοδευτικά επιδεινούμενη ευρεία βάση βαδίσματος, σπαστικότητα στη βάδιση καθώς επίσης και διστακτικότητα κατά την εκκίνηση της βάδισης. Τα συγκεκριμένα αυτά ποιοτικά χαρακτηριστικά είναι όμοια με τα θεμελιώδη χαρακτηριστικά της βάδισης στην ανθρώπινη ΑΣΜ. Τα ποσοτικά δεδομένα που προέκυψαν χρησιμοποιώντας την κλίμακα του Tarlov παρουσιάζονται στο Σχήμα 3.1. Χρησιμοποιώντας την συγκεκριμένη κλίμακα αναδείχθηκε ότι η ομάδα ΧΠΠ είχε το ίδιο score με την ομάδα ελέγχου την πρώτη μετεγχειρητική εβδομάδα. Αντιθέτως το score της ομάδας ΧΠΠ ήταν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερο την δέκατη μετεγχειρητική εβδομάδα σε σχέση με εκείνο της ομάδας ελέγχου (p=0.019, two-way ANOVA). Επίσης το score της ομάδας ΧΠΠ ήταν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερο σε σχέση με εκέινο της ομάδας ελέγχου την εικοστή μετεγχειρητική εβδομάδα (p<0.001, two-way ANOVA). Τέλος η Bonferonni post-hoc ανάλυση έδειξε ότι το score της ομάδας ΧΠΠ την εικοστή εβδομάδα ήταν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερο σε σχέση με το score της ομάδας ΧΠΠ την δέκατη εβδομάδα (p=0.039, Bonferonni post-hoc). Tα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν την ύπουλη εμφάνιση των συμπτωμάτων και την προοδευτικά επιδεινούμενη κλινική συμπτωματολογία στην ομάδα ΧΠΠ. 72

* * Σχήμα 3.1 Γραφική παράσταση της νευρολογικής εικόνας (εκτίμηση με κλίμακα Tarlov) κατά τη διάρκεια της πρώτης, δέκατης και εικοστής εβδομάδας μετά την εμφύτευση του αρωματικού πολυαιθέρα. H στατιστική ανάλυση ανέδειξε ότι ο μέσος όρος του score της ομάδας ΧΠΠ ήταν σημαντικά χαμηλότερος σε σχέση με εκείνον της ομάδας ελέγχου την δέκατη (p=0.019) και την εικοστή (p<0.001) εβδομάδα. Τέλος ο μέσος όρος του score της ομάδας ΧΠΠ την εικοστή εβδομάδα ήταν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερος σε σχέση με εκέινον της δέκατης εβδομάδας (p=0.039, Bonferonni post-hoc). Ο μονός αστερίσκος υποδηλώνει επίπεδο σημαντικότητας p<0.05. 73

Σωματοαισθητικά Προκλητά Δυναμικά Νωτιαίου Μυελού Εικόνα 3.1 Προκλητά δυναμικά νωτιαίου μυελού καταγραφόμενα από τα κάτω άκρα μετά από ηλεκτρική διέγερση του κινητικού φλοιού του εγκεφάλου της ομάδας ελέγχου. 74

Εικόνα 3.2 Προκλητά δυναμικά νωτιαίου μυελού καταγραφόμενα από το δεξί κάτω άκρο μετά από ηλεκτρική διέγερση του κινητικού φλοιού του εγκεφάλου της ομάδας ΧΠΠ. 75

Εικόνα 3.3 Προκλητά δυναμικά νωτιαίου μυελού καταγραφόμενα από το αριστερό κάτω άκρο μετά από ηλεκτρική διέγερση του κινητικού φλοιού του εγκεφάλου της ομάδας ΧΠΠ. 76

Μακροσκοπική Εικόνα Νωτιαίων Μυελών Mετά την αφαίρεση των νωτιαίων μυελών από την ΧΠΠ ομάδα, αποκαλύφθηκε αποπλάτυνση των νωτιαίων μυελών της αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης στο σημείο της εμφύτευσης του αρωματικού πολυαιθέρα. Τα συγκεκριμένα ευρήματα δεν παρατηρήθηκαν στους νωτιαίους μυελούς που προήλθαν από την ομάδα ελέγχου. Tα δεδομένα αυτά καταδεικνύουν μακροσκοπικά ότι η φύση της μηχανικής πίεσης που ασκήθηκε επί του νωτιαίου ήταν χρόνια και προοδευτική κάτι που έδινε στο νωτιαίο μυελό το χρονικό περιθώριο να προσπαθήσει να προσαρμοστεί και να εκμεταλλευτεί τo χώρο μέσα στο σπονδυλικό σωλήνα ώστε να αποφύγει όσο το δυνατό την πίεση. Εικόνα 3.4 Μακροσκοπικά ευρήματα στο νωτιαίο μυελό και στη σπονδυλική στήλη στο σημείο εμφύτευσης του αρωματικού πολυαιθέρα. (Α) Εγκάρσια και οβελιαία (Β) τομή του σπονδυλικού σώματος στο σημείο εμφύτευσης του αρωματικού πολυαιθέρα 77

αποδεικνύουν την ανάπτυξη νέους οστεοειδούς. (Γ) Η χρόνια πίεση του νωτιαίου μυελού αποκαλύπτεται. Ιστολογικές Αλλοιώσεις Η ιστολογική αξιολόγηση με τη χρώση της αιματοξυλίνης-εωσίνης αποκάλυψε τις χαρακτηριστικές αλλοιώσεις της χρόνιας μυελοπάθειας. Ειδικότερα, ανεδείχθη σπογγώδης εκφύλιση της λευκής ουσίας. Στη φαιά ουσία παρατηρήθηκαν αποπλάτυνση των πρόσθιων κεράτων, ισχαιμικές αλλοιώσεις των νευρώνων και αλλαγές των κινητικών νευρώνων που βρίσκονται στα πρόσθια κέρατα του νωτιαίου μυελού όπως χρωματόλυση του Nissl και κεντρική πύκνωση του πυρήνα (Eικ. 3.5 A & B). H χρώση Kluver-Barera ανέδειξε κατακρήμνιση του μυελικού σάκου, διόγκωση του δακτυλίου της μυελίνης, ευρήματα που υποδεικνύουν απομυελίνωση (Εικ. 3.5 C&D). 78

Εικόνα 3.5 (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα φυσιολογικού νωτιαίου μυελού μετά από χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης. (Β) Η χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης σε τομή νωτιαίου μυελού προερχόμενη από την ομάδα ΧΠΠ αποκαλύπτει την ύπαρξη διαμέσου οιδήματος καθώς επίσης και την ύπαρξη σπογγώδους εκφύλισης. (Γ) Αντιπροσωπευτική εικόνα φυσιολογικού νωτιαίου μυελού μετά από χρώση Kluver-Barrera. (Δ) Η επεξεργασία των τομών προερχόμενων από την ομάδα ΧΠΠ ανέδειξε οίδημα του νωτιαίου μυελού, κατακρήμνιση του μυελικού σάκου, οίδημα των αξόνων και εκσεσημασμένη απομυελίνωση. 79

Επίπεδα Έκφρασης Πρωτεΐνης NF Στα δείγματα νωτιαίων μυελών προερχόμενα από τα πειραματόζωα τα οποία υποβλήθηκαν σε ψευδή επέμβαση έντονη ανοσοχρώση της NF200 πρωτεΐνης παρατηρήθηκε σε 14 από τις 15 περιπτώσεις (14/15, 93.3%). Αντιθέτως, χαμηλή κυτταροπλασματική έκφραση του NF παρατηρήθηκε σε όλα παρασκευάσματα νωτιαίων μυελών που προέρχονταν από πειραματόζωα της ομάδας που είχε υποβληθεί σε εμφύτευση του υλικού πιέσεως κάτω από το τόξο του έκτου αυχενικού σπονδύλου αλλά μόνο σε 1 από τα 15 (6.6%) πειραματόζωα που είχαν υποβληθεί σε ψευδή επέμβαση. Tο Man Whitney τεστ ανέδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης της NF πρωτεΐνης ήταν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερα στα πειραματόζωα με ΑΣΜ σε σχέση με τα φυσιολογικά ζώα (p<0.001, Εικ. 3.6A & B και Σχήμα 3.2). Εικόνα 3.6 NF ανοσοιστοχημεία. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα φυσιολογικού νωτιαίου μυελού ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης NF. (B) Αντιπροσωπευτική εικόνα νωτιαίου μυελού προερχόμενου από την ομάδα ΧΠΠ ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης NF. 80

% 120 100 80 60 40 20 0 ΑΣΘΕΝΗΣ NF ΙΣΧΥΡΗ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ ΟΜΑΔΑ ΧΠΠ Σχήμα 3.2 Ραβδόγραμμα που αναπαριστά την αξονική κάκωση στην ομάδα ελέγχου και στην ομάδα ΧΠΠ. Ασθενής κυτταροπλασματική NF ανοσοχρώση αποκαλύφθηκε στην ομάδα ΧΠΠ σε αντίθεση με την ομάδα ελέγχου όπoυ βρέθηκε ισχυρή ανοσοχρώση της πρωτεινης NF. Επίπεδα Έκφρασης Πρωτεΐνης S-100 Ισχυρή κυτταροπλασματική S100 ανοσοχρώση παρατηρήθηκε στις τομές των νωτιαίων μυελών της αυχενικής μοίρας των πειραματόζωων που είχαν υποβληθεί σε ψευδή επέμβαση. Αντιθέτως, ισχυρή έκφραση της S100 πρωτεΐνης ανιχνεύτηκε σε τομές αυχενικών νωτιαίων μυελών σε μόλις 2 από τα 15 (13.3%) πειραματόζωα που υπέστησαν χρόνια και προοδευτική πίεση του νωτιαίου μυελού μετά από την εμφύτευση του υλικού πιέσεως. Ασθενής κυτταροπλασματική S100 ανοσοχρώση ανευρέθηκε σε 13/15 (86.6%) πειραματόζωα με ΑΣΜ αλλά σε καμία από τις περιπτώσεις των φυσιολογικών ζώων. Η στατιστική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης S100 ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα στην ομάδα ελέγχου σε σύγκριση με εκείνα της ΧΠΠ ομάδας (p=0.001, Εικ 3.7 και Σχήμα 3.3). 81

Εικόνα 3.7 S100 ανοσοιστοχημεία. (C) Αντιπροσωπευτική εικόνα φυσιολογικού νωτιαίου μυελού ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης S100. (D) Αντιπροσωπευτική εικόνα νωτιαίου μυελού προερχόμενου από την ομάδα ΧΠΠ ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης S100. % 120 100 80 60 40 20 0 ΑΣΘΕΝΗΣ S100 ΙΣΧΥΡΗ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ ΟΜΑΔΑ ΧΠΠ Σχήμα 3.3 Ραβδόγραμμα που αναπαριστά την έκταση της απομυελίνωσης στην ομάδα ελέγχου και στην ομάδα ΧΠΠ. Ασθενής κυτταροπλασματική S100 ανοσοχρώση αποκαλύφθηκε στην ομάδα ΧΠΠ σε αντίθεση με την ομάδα ελέγχου όπoυ βρέθηκε ισχυρή ανοσοχρώση της πρωτεινης S100. 82

Επίπεδα Έκφρασης GFAP πρωτεΐνης Για την αξιολόγηση της τυχόν ανάπτυξης αστρογλοίωσης στο νωτιαίο μυελό κάτω από τη χρόνια πίεση εφαρμόσαμε ανοσοιστοχημεία κατά του αντισώματος GFAP. Η ανοσοιστοχημική ανάλυση ανέδειξε ασθενή κυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα για το GFAP σε 15/15 (100%) των ψευδών χειρουργημένων πειραματόζωων αλλά σε 3/15 (20%) των ΑΣΜ πειραματόζωων. Ισχυρή κυτταροπλασματική ανοσοχρώση δεν παρατηρήθηκε σε κανένα από τα πειραματόζωα της ομάδας ελέγχου. Ωστόσο παρατηρήθηκε σε 12/15 (80%) των πειραματόζωων της ΧΠΠ ομάδας. Η στατιστική ανάλυση ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης GFAP πρωτεΐνης μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ΧΠΠ ομάδας (Εικ. 3.8 και Σχήμα 3.4). Εικόνα 3.8 GFAP ανοσοιστοχημεία. (Ε) Αντιπροσωπευτική εικόνα φυσιολογικού νωτιαίου μυελού ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης GFAP. (F) Αντιπροσωπευτική εικόνα νωτιαίου μυελού προερχόμενου από την ομάδα ΧΠΠ ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης GFAP. 83

% 120 100 80 60 40 20 0 ΑΣΘΕΝΗΣ GFAP ΙΣΧΥΡΗ ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ ΟΜΑΔΑ ΧΠΠ Σχήμα 3.4 Ραβδόγραμμα που αναπαριστά την ανάπτυξη αστρογλοίωσης στην ομάδα ελέγχου και στην ομάδα ΧΠΠ. Ασθενής κυτταροπλασματική GFAP ανοσοχρώση αποκαλύφθηκε στην ομάδα ελέγχουσε αντίθεση με την ομάδα ΧΠΠ όπoυ βρέθηκε ισχυρή ανοσοχρώση της πρωτεινης GFAP. Η χρόνια πίεση προκαλεί διαταραχή της αρχιτεκτονικής του μικροαγγειακού συστήματος του νωτιαίου μυελού Για να αξιολογήσουμε την επίδραση της χρόνιας και προοδευτικής πίεσης στο μικροαγγειακό σύστημα του νωτιαίου μυελού της αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης, πραγματοποιήθηκε έμμεσος ανοσοφθορισμός για το πρωτογενές αντίσωμα λαμινίνη. Μειωμένος αριθμός αιμοφόρων αγγείων ανευρέθηκε στη φαιά και στη λευκή ουσία της ΧΠΠ ομάδας σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (Εικ. 3.9 και Σχήμα 3.5). 84

Eικόνα 3.9 Έμμεσος aνοσοφθορισμός για τη λαμινίνη, κύρια πρωτείνη της βασικής μεμβράνης των αιμοφόρων αγγείων. Αντιπροσωπευτική εικόνα νωτιαίου μυελού προερχόμενου από πειραματόζωο που είχε υποστεί ψευδή επέμβαση, καθώς επίσης και νωτιαίου μυελού προερχόμενου από πειραματόζωο με ΑΣΜ. Είναι εμφανής η μείωση των αγγείων και των μικροαγγείων στη φαιά και στη λευκή ουσία του νωτιαίου μυελού που υπέστη χρόνια και προοδευτική πίεση. 85

Αριθμός Αγγείων 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 * ** * ** ** 3 1 0.5 ΕΠ 0.5 1 3 Απόσταση (χιλιοστά) από το Επίκεντρο Πίεσης OMΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ ΟΜΑΔΑ ΧΠΠ Σχήμα 3.5 Ραβδόγραμμα που αναπαριστά τη διαταραχή της αρχιτεκτονικής του μικροαγγειακού συστήματος του νωτιαίου μυελού στην ομάδα ΧΠΠ σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Ο μονός αστερίσκος υποδηλώνει επίπεδο σημαντικότητας p<0.05. Ο διπλός αστερίσκος υποδηλώνει επίπεδο σημαντικότητας p<0.001. 86

Η χρόνια πίεση προκαλεί ενεργοποίηση της αποπτωτικής διαδικασίας Eικόνα 3.10 TUNEL θετικά κύτταρα στην ΑΣΜ. Σχήμα 3.6 Ραβδόγραμμα που αναπαριστά τon aριθμό των αποπτωτκών κυττάρων στο επίεκντρο της μέγιστης πίεσης τόσο στην ομάδα ελέγχου όσο και στην ομάδα ΧΠΠ Ο διπλός αστερίσκος υποδηλώνει επίπεδο σημαντικότητας p<0.001. 87

Ιστολογική Αξιολόγηση του Σπονδυλικού Τόξου στο σημείο εμφύτευσης του Αρωματικού Πολυαιθέρα Η ιστολογική αξιολόγηση του σπονδυλικού τόξου στο σημείο εμφύτευσης του αρωματικού πολυαιθέρα πραγματοποιήθηκε με τη χρώση της αιματοξυλίνηςεωσίνης. Δεν παρατηρήθηκαν σημεία φλεγμονώδους διεργασίας. Mε ενδιαφέρον παρατηρήσαμε πολυάριθμους ενεργοποιημένους οστεοβλάστες, χονδροβλάστες, όπως επίσης και πρόσφατα σχηματισμένο οστεοειδές (Eικ. 3.11). Εικόνα 3.11 Η χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης ανέδειξε την ύπαρξη πολυάριθμων ενεργοποιημένων οστεοβλαστών, την ύπαρξη χονδροβλαστών και την ανάπτυξη νεοσχηματιζόμενου οστεοειδούς. 88

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Σε αυτή τη μελέτη αναπτύξαμε και χαρακτηρίσαμε ένα πρωτότυπο μοντέλο χρόνιας και προοδευτικής πίεσης του νωτιαίου μυελού της αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης. Η φύση της πίεσης που διενεργήθηκε στον νωτιαίο μυελό αντανακλά τη χωρική και χρονική εικόνα της στατικής και δυναμικής μχανικής πίεσης που αναπτύσσεται στην ανθρώπινη ΑΣΜ. Αυτή η χρόνια και προοδευτική πίεση του μυελού οδήγησε στην ανάπτυξη σημαντικών κινητικών διαταραχών στα πειραματόζωα, παρόμοιων με εκείνων που έχουν παρατηρηθεί στην ανθρώπινη ΑΣΜ. Επιπλέον αυτό το μοντέλο οδήγησε στην ανάπτυξη απομυελίνωσης, αστρογλοίωσης, βλάβης των νευροαξόνων καθώς επίσης και απόπτωσης των νευρώνων. Τα συγκεκριμένα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά έχουν ταυτοποιηθεί ως τα κύρια ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της ανθρώπινης νόσου. Προσομοίωση των Κύριων Προτεινόμενων Παθοφυσιολογικων Μηχανισμών της ΑΣΜ Υπάρχουν τρεις κύριοι παθοφυσιολογικοί παράγοντες στην ΑΣΜ: (1) στατικοί και (2) δυναμικοί μηχανικοί παράγοντες και (3) η ισχαιμία του νωτιαίου μυελού. Οι στατικοί μηχανικοί παράγοντες περιλαμβάνουν όλες τις αιτίες (συγγενής στένωση του σπονδυλικού σωλήνα, πρόπτωση του δίσκου, οστεόφυτα, υπερτροφία/οστεοποίηση του ωχρού συνδέσμου ή του οπίσθιου επιμήκους συνδέσμου), οι οποίες προκαλούν μείωση της διαμέτρου του σπονδυλικού σωλήνα και επακόλουθη στατική μηχανική πίεση επί του νωτιαίου μυελού. Οι δυναμικοί μηχανικοί παράγοντες είναι μη φυσιολογικές δυνάμεις που αναπτύσσονται επί του νωτιαίου μυελού καθώς αυτός συμπιέζεται ενάντια σε μια ήδη υπάρχουσα στατική μηχανική πίεση κατά τη διάρκεια της έκτασης και της κάμψης της αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης. Oι δυναμικοί μηχανικοί παράγοντες επιδεινώνουν τη βλάβη που αναπτύσσεται στο νωτιαίο μυελό από την ήδη υπάρχουσα στατική μηχανική πίεση. 89

Όπως αποδείξαμε η εμφύτευση του αρωματικού πολυαιθέρα οδήγησε στην άναπτυξη νέου οστεοειδούς κάτω από το πέταλο του έκτου αυχενικού σπονδύλου. Αυτό προκαλούσε στατική μηχανική πίεση επί του νωτιαίου μυελού. Επειδή η πεταλεκτομία που διενεργήθηκε έλαβε χώρα στον έβδομο αυχενικό σπόνδυλο η κινητικότητα της ανώτερης αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης παρέμενε σχεδόν η ίδια πριν και μετά το χειρυργείο. Aυτό εξασφάλιζε ότι το εύρος της έκτασης και της κάμψης της σπονδυλικής στήλης ήταν φυσιολογικό μετά την εμφύτευση του αρωματικού πολυαιθέρα κάτι που επέτρεπε την ανάπτυξη παθολογικών δυνάμεων επί του νωτιαίου μυελού καθώς αυτός προσέκρουε στο οστεοειδές κατά την κάμψη και την έκταση. Οι δυνάμεις αυτές έχουν χαρακτηριστεί ως οι δυναμικοί μηχανικοί παράγοντες στην ανθρώπινη νόσο. Μέχρι πρόσφατα, διάφοροι μελετητές έχουν προτείνει ότι η χρόνια και προοδευτική πίεση προκαλεί αποπλάτυνση του νωτιαίου, η οποία με τη σειρά της προκαλεί αποπλάτυνση και έκταση των εσωτερικών αγγείων που διατρέχουν εγκάρσια το νωτιαίο μυελό ή των τελικών κλάδων της πρόσθιας αρτηρίας του νωτιαίου μυελού. Η συγκεκριμένη αποπλάτυνση και έκταση των αγγείων και μικροαγγείων, ίσως με τη σειρά της, προκαλεί τη καταστροφή τους. Αν και η συγκεκριμένη υπόθεση έχει προταθεί από αρκετούς διαφορετικούς ερευνητές, άμεσα ευρήματα προερχόμενα από τη βασική έρευνα της ΑΣΜ που να το αποδεικνύουν δεν υπάρχουν. Συμπερασματικά, στο προτεινόμενο πειραματικό μοντέλο ΑΣΜ αναπαράγονται οι παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί της ΑΣΜ που έχουν προταθεί στην διεθνη βιβλιογραφία. Προσομοίωση των κλινικών εκδηλώσεων της ΑΣΜ Η ύπουλη και η καθυστερούμενη ανάπτυξη των νευρολογικών ελλειμμάτων στα πειραματόζωα που ανέπτυξαν ΑΣΜ ομοιάζει με τη χρόνια προοδευτική φύση της ανθρώπινης νόσου. Η διαταραχή της βάδισης είναι ένα από τα κυριότερα συμπτώματα της ΑΣΜ στους ανθρώπους [54, 55]. Ο σύνηθης ασθενής με ΑΣΜ 90

εμφανίζει ένα ευρέως βάσεως τύπο βαδίσματος o οποίος ταυτόχρονα χαρκτηρίζεται από αταξία και σπαστικότητα. Επίσης οι ασθενείς με αυχενική μυελοπάθεα εμφανίζουν διστακτικότητα στην εκκίνηση της βάδισης. [56]. Στη συγκεκριμένη μελέτη, η αξιολόγηση της ανάλυσης του βαδίσματος ανέδειξε ότι τα πειραματόζωα που είχαν υποστεί εμφύτευση του αρωματικού πολυαιθέρα κάτω από το πέταλο του έκτου αυχενικού σπονδύλου εμφάνισαν προοδευτικά εξελισσόμενη σπαστικότητα των κάτω άκρων, ευρεία βάση βαδίσματος, αταξία καθώς επίσης και διστακτικότητα στην εκκίνηση της βάδισης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το προτεινόμενο πειραματικό μοντέλο ΑΣΜ αναπαράγει τα κύρια χαρακτηριστικά της διαταραχής της βάδισης στην ανθρώπινη νόσο. Προσομοίωση των κυρίων ιστοπαθολογικών χαρακτηριστικών της ανθρώπινης νόσου Η χρόνια πίεση του νωτιαίου μυελού της αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης είναι συνδεδεμένη με την ανάπτυξη cystic cavitation, ατροφίας των προσθίων κεράτων του νωτιαίου μυελού όπως επίσης και με το θάνατο των κινητικών νευρώνων που εδράζονται στα πρόσθια κέρατα της φαιάς ουσίας του νωτιαίου μυελού [24, 25]. Όσον αφορά τη λευκή ουσία, η εκφύλιση των πυραμιδικών οδών, η βλάβη των νευροαξόνων και η απομυελίνωση αποτελούν εξέχοντα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της ανθρώπινης ΑΣΜ. Στην πραγματικότητα, η σπαστική παραπάρεση που εκδηλώνεται σε ασθενείς με ΑΣΜ θεωρείται ότι οφείλεται κατά ένα μέρος στην εκφύλιση της κύριας πυραμιδικής οδού. Τα αποτελέσματα μας απέδειξαν ότι η χρόνια και προοδευτική πίεση του αυχενικού νωτιαίου μυελού που αναπτύσσεται στο συγκεκριμένο πειραματικό μοντέλο οδηγεί σε ιστοπαθολογικά ευρήματα όμοια με εκείνα που έχουν περιγραφεί στην ανθρώπινη ΑΣΜ. Με τη μέθοδο της χρώσης Kluver Barrera καθώς επίσης και με την ανοσοιστοχημεία για την ανίχνευση της S-100 πρωτεΐνης αξιολογήσαμε τη δομή της μυελίνης στις τομές των νωτιαίων μυελών τόσο της ομάδα ελέγχου όσο και της ΧΠΠ ομάδας. ρέθηκε ότι η χρόνια πίεση του αυχενικού νωτιαίου μυελού στους 91

κονίκλους οδήγησε σε εκτεταμένη απομυελίνωση. Τα δεδομένα αυτά είναι σε συμφωνία με μελέτες αυτοψίας σε ανθρώπινους νωτιαίους μυελούς της ΑΜΣΣ προερχόμενους από ασθενείς με ΑΣΜ που έχουν δείξει κατακρήμνιση του δακτυλίου της μυελίνης, απώλεια των ολιγονενδροκυτάρων και επακόλουθη απομυελίνωση των οδών. Στη παρούσα μελέτη ανακαλύφθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης του NF200 ήταν στατιστικά χαμηλότερα στην ομάδα ΧΠΠ σε σχέση με εκείνα της ομάδας ελέγχου. Είναι πολύ καλά γνωστό ότι η μορφολογική σταθερότητα καθώς και η πλαστικότητα των νευρωνικών αξόνων εξαρτάται από την ακεραιότητα του κυτταροσκελέτού και των κυρίων συστατικών του. Τα νευροινίδια είναι δομικά στοιχεία κεφαλαιώδους σημασίας των αξόνων της λευκής ουσίας και αποτελούν μια σημαντική ομάδα δομικών πρωτεινών οι οποίες υποστηρίζουν την αρχιτεκτονική των αξόνων του κεντρικού και του περιφερικού νευρικού συστήματος. Τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μελέτης έδειξαν ότι το προτεινόμενο μοντέλο αναπαράγει την προοδεθτική βλάβη των νευροινιδίων υποδηλώνοντας αξονική εκφύλιση, το οποίο είναι ένα από τα κυριότερα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά που περιγράφονται στην ανθρώπινη ΑΣΜ. Η ανάπτυξη της αστρογλοίωσης στην ΑΣΜ έχει επιβεβαιωθεί τόσο σε πειραματικά μοντέλα όσο και σε μελέτες αυτοψίας νωτιαίων μυελών προερχόμενων από ασθενείς που έπασχαν από ΑΣΜ [24, 25]. Στα δικά μας πειράματα βρέθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης της GFAP πρωτεΐνης ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα στους μυελούς που είχαν υποστεί χρόνια πίεση σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς μυελούς. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν την εκτενή συσσώρευση αστροκυττάρων στην περιοχή της χρόνιας πίεσης του νωτιαίου μυελού. Η συσσώρευση και ο πολλαπλασιασμός των αστροκυττάρων στην περιοχή της χρονιας πίεσης αποτελεί την πρώιμη φάση της ανάπτυξης αστρογλοιακού ουλώδους ιστού, η οποία αποτελέι ένα από τα κυριότερα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της ανθρωπίνης ΑΣΜ. 92

Απόπτωση Στη συγκεκριμένη μελέτη δείξαμε ότι η χρόνια και προοδευτική πίεση επί του νωτιαίου μυελού που προκλήθηκε μετά από την εμφύτευση του αρωματικού πολυαιθέρα οδήγησε στην ενεργοποίηση της απόπτωσης. Αυτά τα ευρήματα είναι σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές που έχουν δείξει TUNEL θετικούς νευρώνες και ολιγονενδροκύτταρα καθώς επίσης και ενεργοποίηση της κασπάσης-3 στα κύτταρα των νευρώνων και στα ολιγοδενδροκύτταρα στην περιοχή της πίεσης του αυχενικού νωτιαίου μυελού στα twy/twy mice. Απομυελίνωση και TUNEL θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε μία μελέτη αυτοψίας νωτιαίου μυελού που είχε υποστεί χρόνια. Ο αυχενικός νωτιαίος μυελός στη προκειμένη περίπτωση προήλθε από θανόντα ασθενή που έπασχε από οστεοποίηση του οπίσθιου επιμήκους συνδέσμου. Πιστεύουμε ότι η απόπτωση των νευρώνων και των ολιγονενδροκυττάρων αποτελεί ένα κρίσιμο γεγονός το οποίο συμβάλλει στην προοδευτική νεύρο-εκφύλιση και αλλεριανή εκφύλιση και επομένως συμβάλλει στην προοδευτική φύση της νόσου. Τα δεδομένα από τα πειράματα που εκπονήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής έδειξαν ότι το προτεινόμενο μοντέλο αναπαράγει έναν ακόμα από το σύνολο των μοριακών μηχανισμών που έχουν χαρακτηριστεί στην ανθρώπινη ΑΣΜ και ισχυροποιεί την άποψη ότι η απόπτωση των νευρώνων και των ολιγοδενδροκυττάρων συμβάλλει στην παθοβιολογία της ΑΣΜ. 93

Σύγκριση με Προηγούμενα Μοντέλα ΑΣΜ Μέχρι σήμερα διάφορες ερευνητικές ομάδες ανά τον κόσμο έχουν πραγματοποιήσει πολλές πειραματικές προσπάθειες για την ανάπτυξη ενός ιδανικού και αξιόπιστου μοντέλου ΑΣΜ χωρίς ιδιαίτερη επιτυχία. Σε σύγκριση με τα προηγούμενα μοντέλα ΑΣΜ το παρόν μοντέλο έχει τα εξής προτερήματα: (1) Αναπαράγει τη φυσική κλινική διαδρομή της ανθρώπινης ΑΣΜ η οποία περιλαμβάνει την απουσία οξείας ή υποξείας μυελοπάθειας και την απουσία της οξείας νευρολογικής διαταραχής μετά την εμφύτευση του υλικού πιέσεως. (2) αναπαράγει την ύπουλη και καθυστερούμενη ανάπτυξη των νευρολογικών συμπτωμάτων και την προοδευτική εξέλιξη τους. Κατά κύριο λόγο αυτό συμβαίνει λόγω των χαρακτηριστικών ιδιοτήτων του αρωματικού πολυαιθέρα και της συγκεκριμένης χειρουργικής διαδικασίας που ακολουθήθηκε. (3) Αναπαράγει τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της ανθρωπίνης νόσου όπως είναι η απόπτωση, η απομυελίνωση, η αξονική βλάβη και η ανάπτυξη αστρογλοίωσης (4) Σε αυτή τη μελέτη αποδείχτηκε για πρώτη φορά η δημιουργία νεόυ οστεοειδούς στο σημείο εμφύτευσης του αρωματικού πολυαιθέρα καθώς επίσης και η ύπαρξη χονδροκυττάρων και οστεοβλαστών και χονδροκυττάρων στο συγκεκριμένο σημείο. Αυτά τα ευρήματα σε αυτό το πρωτότυπο μοντέλο ΑΣΜ υποδεικνύουν ότι ο μηχανισμός πίεσης του νωτιαίου μυελού στο επίπεδο του έκτου αυχενικού σπονδύλου 94

προκύπτει από τη δημιουργία νεου οστού και έτσι προσομοιώνει τη χρόνια και προοδευτική φύση της πίεσης που λαμβάνει χώρα στην ΑΣΜ στους ανθρώπους. 95

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ Συμπερασματικά το προτεινόμενο πρωτότυπο μοντέλο ΑΣΜ στους κονίκλους, που περιγράφεται στο παρόν σύγγραμμα, οδηγεί σε νευρολογικά ελλείμματα και σε ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά τα οποία μιμούνται επακριβώς εκείνα της ανθρώπινης νόσου. Επίσης το συγκεκριμένο μοντέλο αναπαράγει το χωρικό και χρονικό προφίλ της ανθρώπινης νόσου στο σημείο της πίεσης του νωτιαίου μυελού. 96

97

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΑΠΟΣΑΦΗΝΙΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΤΗΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ (MMP-2, MMP-9, u-pa) KAI TOY METAΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ NF-κB ΣΤΗΝ ΑΣΜ [48] 98

1. ΥΛΙΚΟ 1.1. Πειραματόζωα Στη συγκεκριμένη πειραματική διαδικασία η οποία ήταν διακριτή από τη μελέτη Α χρησιμοποιήθηκε ένα νέο γκρουπ 38 άσπρων υγιειών κονίκλων Νέας Ζηλανδίας ηλικίας 8 εβδομάδων. Το βάρος των πειραματόζωων κυμαινόταν μεταξύ 2.8-3.2 kg. Τα πειραματόζωα φυλάσσονταν σε ειδικά διαμορφωμένα κλουβιά, σε δωμάτια στο οποίο η θερμοκρασία διατηρούνταν 18-22 βαθμούς κελσίου. Παραδοσιακή εργαστηριακή τροφή χορηγούνταν στα πειραματόζωα. Το δωμάτιο διαμονής ήταν ελεύθερο παθολογικών μικροβίιων. Tα πειραματόζωα έλαβαν ανθρώπινη φροντίδα σύμφωνα με τις Ευρωπαϊκές διατάξεις Περί Συνθηκών και Οδηγιών Φιλοξενίας και Φροντίδας Zώων για Πειραματικούς και άλλους Επιστημονικούς Σκοπούς (1999/55/ΕΘ). Το πειραματικό μοντέλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής του Πανεπιστημίου Πατρών. 1.2. Πειραματικό Μοντέλο ΑΣΜ Για τη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήσαμε το πειραματικό μοντέλο ΑΣΜ που αναπτύχθηκε στην προηγούμενη μελέτη (μελέτη Α). 1.3. Πειραματικές Ομάδες Χρησιμοποιώντας τα ίδια κριτήρια που περιγράφονται στη μελέτη Α, από τη παρούσα μελέτη αποκλείσθηκαν από την παρούσα μελέτη 8 πειραματόζωα. Τα υπόλοιπα πειραματόζωα χωρίστηκαν τυχαία στις παρακάτω 2 πειραματικές ομάδες: Στην Ομάδα Ι: Ομάδα Ελέγχου (n=15), τα ζώα υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση χωρίς την εμφύτευση του αρωματικού πολυαιθέρα Στην Ομάδα ΙΙ: Ομάδα Χρόνιας Προοδευτικής Πίεσης (ΧΠΠ), n=15. Στη πειραματική αυτή ομάδα πραγματοποιήθηκε μόνιμη εμφύτευση του υλικού πιέσεως, ΑΠ. Τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν μετά το πέρας είκοσι εβδομάδων. 99

2. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 2.1 Πρωτόκολλο Αναισθησίας Χρησιμοποιήθηκε το ίδιο πρωτόκολλο αναισθησίας που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη Α, τμήμα 2.1. 2.2 Χειρουργικό Πρωτόκολλο Ακολoυθήθηκε το χειρουργικό πρωτόκολλο που περιγράφεται στη μελέτη Α τμήμα 2.2. 2.3 Πρωτόκολλο Μονιμοποίησης και Παρασκευής των Νωτιαίων Μυελών Οι νωτιαίοι μυελοί που προέρχονταν και από τις δύο πειραματικές ομάδες μονιμοποιήθηκαν και παρασκευάστηκαν ακλουθώντας το πρωτόκολλο που περιγράφηκε με λεπτομέρεια στη μελέτη Α, τμήμα 2.4. 2.4 Ανoσοιστοχημεία Ακολoυθήθηκε το πρωτόκολλο ανοσοιστοχημείας που περιγράφεται στη μελέτη Α τμήμα 2.8.α. β. Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν: Χρησιμοποιήθηκαν τα ίδια διαύμματα που περιγράφονται στη μελέτη Α τμήμα 2.8.β. γ. Αντισώματα που χρσιμοποιήθηκαν: λέπε πίνακα 2. δ. Αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσεως: Χρησιμοποιήθηκαν τα ίδια διαύμματα που περιγράφονται στη μελέτη Α τμήμα 2.8.δ. 100

Ανάδειξη Κάλυψη Πρωτογενές αραίωση επώαση αντιγόνου πρωτεϊνικών θέσεων αντίσωμα MMP- TBS-BSA Chemicon 1/30 90 min σε 2 LOT θερμ LV1390492 δωματίου. MMP- TBS-BSA Novocastra 1/40 60 min σε 9 mouse mab θερμ LOT 143904 δωματίου u-pa EDTA TBS-BSA Calbiochem Mouse mab 1/30 Ολονύχτια επώαση Cat NoIM13L p-65 Φούρνος TBS-BSA Santa cruze 1/300 Ολονύχτια μικροκυμμάτων mouse επώαση 800watt x2min 300watt x7min monoclonal Ab K1207 p-50 Φούρνος TBS-BSA Oroteintech 1/50 60 min σε μικροκυμάτων Group θερμ 700watt x2 min Polyclonal Ab δωματίου Cat No 10617-1-AP Πίνακας 2.1 Το είδος αντισωμάτων, οι αραιώσεις και οι χρόνοι επώασης που χρησιμοποιήθηκαν στην ανοσοιστοχημική τεχνική στη μελέτη. Επίσης, παρουσιάζονται οι τεχνικές ανάδειξης αντιγόνων και κάλυψης πρωτεινικών θέσεων. 101

2.5 Στατιστική ανάλυση Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη βοήθεια του στατιστικού πακέτου SPSS 10. Για κάθε ομάδα αποτελεσμάτων υπολογίσθηκε η μέση τιμή των ποσοστών θετικότητας και η τυπική απόκλιση, ενώ η κατανομή των τιμών παρουσιάζεται γραφικά με τη μορφή ιστογράμματος. Για τη σύγκριση των ποσοστών θετικότητας μεταξύ των διαφόρων ομάδων νεοπλασμάτων εφαρμόσθηκε ο στατιστικός έλεγχος Mann-Whitney U τεστ και ο Tukey test post- hoc analysis. 102

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η κυτταροπλασματική και πυρηνική έκφραση του NF-κB (p65) αυξάνεται με τη χρόνια και προοδευτική πίεση του νωτιαίου μυελού της αυχενικής μοίρας. Ισχυρή κυτταροπλασματική ανοσοχρώση του NF-κB (p65) παρατηρήθηκε σε έναν από τους δεκαπέντε φυσιολογικούς μυελούς (1/15, 6.6%). Αντιθέτως ισχυρή κυτταροπλασματική ανοσοχρώση του NF-κB (p65) παρατηρήθηκε σε δέκα από τους δεκαπέντε νωτιαίους μυελούς (10/15, 66.6%) που προέρχονταν από την ΧΠΠ ομάδα. Ασθενής κυτταροπλασματική ανοσοχρώση του p65 βρέθηκε σε 14 από τους 15 (14/15, 93.3%) φυσιολογικούς μυελούς και σε 5 εκ των 15 (5/15, 33.3%) παθολογικών μυελών. Ισχυρή πυρηνική ανοσοχρώση του NF-κB (p65) παρατηρήθηκε σε έναν από τους δεκαπέντε φυσιολογικούς μυελούς (1/15, 6.6%). Αντιθέτως ισχυρή πυρηνική ανοσοχρώση του NF-κB (p65) παρατηρήθηκε σε δεκατρείς από τους δεκαπέντε νωτιαίους μυελούς (13/15, 86.6%) της ομάδας ΧΠΠ. Ασθενής πυρηνική ανοσοχρώση του p65 βρέθηκε σε 14 από τους 15 (14/15, 93.3%) φυσιολογικούς μυελούς και σε 2 εκ των 15 (2/15, 13.2%) παθολογικών μυελών. Το Mann-Whitney U τεστ ανέδειξε ότι τα επίπεδα της κυτταροπλασματικής και πυρηνικής έκφρασης του p65 ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα στην ΧΠΠ ομάδα εν σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Eικ. 3.1 και Σχήμα 3.1) 103

Εικόνα 3.1 NF-κΒ/p50 και NF-κΒ/p65 ανοσοιστοχημεία. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα φυσιολογικού νωτιαίου μυελού ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης NF-κΒ/p65. (B) Αντιπροσωπευτική εικόνα νωτιαίου μυελού προερχόμενου από την ομάδα ΧΠΠ ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης NF-κΒ/p65. (C) Αντιπροσωπευτική εικόνα φυσιολογικού νωτιαίου μυελού ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης NF-κΒ/p50 (D) Αντιπροσωπευτική εικόνα νωτιαίου μυελού προερχόμενου από την ομάδα ΧΠΠ ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης NF-κΒ/p65. 104

Η κυτταροπλασματική και πυρηνική έκφραση του NF-κB (p50) αυξάνεται υπό τη χρόνια και προοδευτική πίεση του νωτιαίου μυελού της αυχενικής μοίρας. Εμφανώς ισχυρή πυρηνική p50 ανοσοχρώση παρατηρήθηκε σε 0/15 (0%) από τους νωτιαίους μυελούς, αλλά σε 14/15 (93.3%) από νωτιαίους μυελούς προερχόμενους από την ΧΠΠ ομάδα. Ασθενής πυρηνική ανοσοχρώση του p50 βρέθηκε σε 12 από τους 15 (80%) μυελούς της ομάδας ελέγχου και σε 1 εκ των 15 (6.6%) παθολογικών μυελών. Ισχυρή κυτταροπλασματική ανοσοχρώση του p50 παρατηρήθηκε σε 3 εκ των 15 (20%) νωτιαίων μυελών της ομάδας ελέγχου και σε 14 εκ των 15 (93.3%) δειγμάτων της ΧΠΠ ομάδας. Χαμηλή κυτταροπλασματική p50 ανοσοχρώση παρατηρήθηκε σε όλους τους νωτιαίους μυελούς της ομάδας ελέγχου. Αντιθέτως χαμηλή κυτταροπλασματική p50 ανοσοχρώση βρέθηκε σε μόλις 1 εκ των 15 (6.6%) παθολογικών νωτιαίων μυελών. Το Mann-Whitney U τεστ ανέδειξε ότι τα επίπεδα τόσο της κυτταροπλασματικής όσο και της πυρηνικής έκφρασης του p50 ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα στην ΧΠΠ ομάδα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Kυτταροπλασματική p65 έκφραση 100 80 60 % 40 20 0 ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ ΟΜΑΔΑ ΧΠΠ 100 80 60 % 40 20 0 Πυρηνική p65 έκφραση ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ ΟΜΑΔΑ ΧΠΠ Σχήμα 3.1 Ραβδόγραμματa που αναπαριστoύν την κυτταροπλασματική και πυρηνική έκφραση του p65 και p50 στην ομάδα ελέγχου και στην ΧΠΠ ομάδα. 105

Kυτταροπλασματική p50 έκφραση 100 80 60 % 40 20 0 ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ ΟΜΑΔΑ ΧΠΠ 100 80 60 % 40 20 0 Πυρηνική p50 έκφραση ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ ΟΜΑΔΑ ΧΠΠ Σχήμα 3.1 Συνέχεια. Αύξηση της έκφρασης της MMP-9 στην ΑΣΜ. Χαμηλή κυτταροπλασματική ανοσοχρώση για την MMP-9 παρατηρήθηκε σε 15 εκ των 15 των νωτιαίων μυελών της ομάδας ελέγχου αλλά μόνο σε 2 εκ των 15 (13.3%) παθολογικών νωτιαίων μυελών. Ισχυρή κυτταροπλασματική ανοσοχρώση βρέθηκε σε 13 από τους 15 (86.6%) παθολογικούς νωτιαίους μυελούς ενώ δεν ανιχνεύθηκε ισχυρή ανοσοχρώση στους φυσιολογικούς νωτιαίους μυελούς. Τα επίπεδα έκφρασης της MMP-9 στην ΧΠΠ ήταν στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερα σε σχέση με αυτά της πειραματικής ομάδας που δέχθηκε ψευδή επέμβαση όπως ανέδειξε το Mann-Whitney U τεστ (p<0.001, Εικ. 3.2 και Σχήμα 3.2) 106

Εικόνα 3.2 ΜΜP-9 ανοσοιστοχημεία. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα φυσιολογικού νωτιαίου μυελού ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης MMP-9. (B) Αντιπροσωπευτική εικόνα νωτιαίου μυελού προερχόμενου από την ομάδα ΧΠΠ ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης MMP-9. 100 MMP-9 % 80 60 40 20 ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ ΟΜΑΔΑ ΧΠΠ 0 ΑΣΘΕΝΗΣ ΙΣΧΥΡΗ Σχήμα 3.2 Ραβδόγραμμα που αναπαριστά την κυτταροπλασματική έκφραση του ΜΜP- 9 στην ομάδα ελέγχου και στην ΧΠΠ ομάδα. 107

Αύξηση της έκφρασης της MMP-2 στην ΑΣΜ Ισχυρή κυτταροπλασματική ανοσοχρώση βρέθηκε σε όλους τους νωτιαίους μυελούς της πειραματικής ομάδας στην οποία εμφυτεύτηκε ο αρωματικός πολυαιθέρας αλλά μόλις σε έναν από τους μυελούς της ομάδα ελέγχου (1/15, 6.6%). Παρόμοια με την MMP-9 η έκφραση της MMP-2 εντοπίστηκε κυρίως στην εξωκυττάρια ουσία. Τα επίπεδα έκφρασης της MMP-2 στην ομάδα που δέχτηκε χρόνια πίεση ήταν στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερα σε σχέση με αυτά της πειραματικής ομάδας που δέχθηκε ψευδή επέμβαση όπως ανέδειξε το Mann-Whitney U τεστ (p<0.001, Eικ. 3.3 και Σχήμα 3.3) Εικόνα 3.3 ΜΜP-2 ανοσοιστοχημεία. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα φυσιολογικού νωτιαίου μυελού ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης MMP-2. (B) Αντιπροσωπευτική εικόνα νωτιαίου μυελού προερχόμενου από την ομάδα ΧΠΠ ύστερα από ανοσοιστοχημεία κατά της πρωτείνης MMP-2. 108

100 MMP-2 % 80 60 40 20 ΟΜΑΔΑ ΕΛΕΓΧΟΥ ΟΜΑΔΑ ΧΠΠ 0 ΙΣΧΥΡΗ Σχήμα 3.3 Ραβδόγραμμα που αναπαριστά την κυτταροπλασματική έκφραση του ΜΜP- 2 στην ομάδα ελέγχου και στην ΧΠΠ ομάδα. Αύξηση της έκφρασης u-paστην ΑΣΜ Η ανοσοιστοχημική ανάλυση ανέδειξε ασθενή κυτταροπλασματική ανοσοδραστικότητα του u-pa σε όλους τους νωτιαίους μυελούς της ομάδας ελέγχου κ σε 3 από τους 15 (3/15, 20%) νωτιαίους μυελούς της ΧΠΠ ομάδας. Δεν παρατηρήθηκε ισχυρή κυτταροπλασματική ανοσοχρώση στην ομάδα ελέγχου. Αντιθέτως, σε 12 εκ των 15 (80%) παθολογικών νωτιαίων μυελών προέκυψε ισχυρή κυτταροπλασματική ανοσοχρώση. Η στατιστική ανάλυση ανέδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του u-pa ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα στην ΧΠΠ ομάδα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (p<0.001, Εικ. 3.4 και Σχήμα 3.4). 109