Μοριακή ανίχνευση παθογόνων βακτηρίων που ενέχονται στη περιοδοντίτιδα

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Εφαρμογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες Κατεύθυνση: Μοριακή γενετική- Κυτταρογενετική Διπλωματική Εργασία Μοριακή ανίχνευση παθογόνων βακτηρίων που ενέχονται στη περιοδοντίτιδα Πρωτόπαπα Μαρία Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων Επιβλέπουσα: Καθηγήτρια Αγλαϊα Αθανασιάδου ΠΑΤΡΑ 2010

Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών. Ευχαριστώ θερμά την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου κα Αγλαϊα Αθανασιάδου για τη βοήθειά και τη συμπαράστασή της καθ όλη τη διάρκεια παραμονής μου στο εργαστήριο. Κυρίως, την ευχαριστώ γιατί μου μετέδωσε ένα βαθύτερο τρόπο συλλογισμού και με έμαθε να εργάζομαι μεθοδικά, για την επίτευξη στόχων με κοινωνικό όφελος. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της εξεταστικής επιτροπής, κα Μυρτώ Χριστοφίδου και κο Ιωάννη Ζαρκάδη, για τις πολύτιμες συμβουλές και παρατηρήσεις. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στην Ελεάνα Σταύρου, γιατί όποτε χρειάστηκα τη βοήθειά της, ήταν εκεί, αλλά και σε όλα τα μέλη του Εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου, το «στήριγμά μου», και σε αυτή τη δοκιμασία, γιατί με έκανε να πιστέψω πως θα τα καταφέρω και τον σύντροφό μου, που με πίστεψε, με ενθάρρυνε, με στήριξε, έδειξε υπομονή και το σημαντικότερο είναι πάντα κοντά μου. 2

Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή: Αγλαϊα Αθανασιάδου Μυρτώ Χριστοφίδου Ιωάννης Ζαρκάδης 3

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. Εισαγωγή.8 1.1 Περιοδοντική νόσος- Γενικά στοιχεία.8 1.2 Φυσιολογικό περιοδόντιο 9 1.2.1 Ούλα.9 1.2.2 Περιρρίζιο..11 1.2.3 Φατνιακή απόφυση..12 1.2.4 Οστεϊνη..13 1.2.4.1 Η οστεϊνη στη περιοδοντική νόσο...13 1.3 Η φυσική χλωρίδα της ανθρώπινης στοματικής κοιλότητας 15 1.3.1 Η στοματική κοιλότητα ως βιότοπος.15 1.3.2 Οδοντική πλάκα 17 1.3.2.1 Σχηματισμός και ωρίμανση της οδοντικής πλάκας...18 1.3.2.1.α Σχηματισμός της υπερουλικής οδοντικής μικροβιακής πλάκας 19 1.3.2.1.β Σχηματισμός της υποουλικής οδοντικής μικροβιακής πλάκας 21 1.3.3 Δομή και οργάνωση της οδοντικής μικροβιακής πλάκας...22 1.3.3.1 Βακτηριακές αλληλεπιδράσεις..23 1.3.3.2 Βακτηριακά σύμπλοκα...25 1.4 Παθογόνα βακτήρια 27 1.4.1 Porphyromonas gingivalis...27 1.4.1.1 Αποικισμός των στοματικών επιφανειών 27 1.4.1.2 Μόρια προσκόλλησης (adhesion molecules).28 1.4.1.3 Αλληλεπιδράσεις με τα επιθηλιακά κύτταρα..29 1.4.1.4 Το γονιδίωμα του βακτηρίου Porphyromonas gingivalis..31 1.4.2 Actinobacillus actinomycetemcomitans 31 1.4.2.1 Το γονιδίωμα του Actinobacillus actinomycetemcomitans..32 1.4.2.2 Ορολογική ετερογένεια του Actinobacillus actinomycetemcomitans..32 1.4.2.3 Αποικισμός των στοματικών επιφανειών- Είσοδος στα κύτταρα ξενιστή.32 1.4.3 Bacteroides forsythus..34 1.4.3.1 Μορφολογικά χαρακτηριστικά του Bacteroides forsythus 34 1.4.3.2 Το γονιδίωμα του Bacteroides forsythus 34 1.4.3.3 Αποικισμός της στοματικής κοιλότητας από το Bacteroides forsythus- Επιβίωση του βακτηριακού πληθυσμού- Επέκταση.35 1.5 Αιτιοπαθογένεια των νόσων του περιοδοντίου..36 1.5.1 Παθογόνο δυναμικό της οδοντικής μικροβιακής πλάκας. Θεωρία της ειδικής και της μη ειδικής οδοντικής μικροβιακής πλάκας..36 1.5.2 Αμυντικοί μηχανισμοί του ξενιστή...37 1.5.3 Τύποι των περιοδοντικών λοιμώξεων...37 1.6 Πορεία της παθογένειας της περιοδοντικής νόσου..39 1.6.1 Φάση οξείας φλεγμονώδους απόκρισης...40 4

1.6.2 Φάση ειδικής ανοσιακής απάντησης..43 1.6.3 Ιστική καταστροφή.44 1.6.3.1 Απώλεια κολλαγόνου και καταστροφή του συνδετικού ιστού.. 44 1.6.3.2 Καταστροφή του φατνιακού οστού 44 1.7 Οι παθογόνοι μικροοργανισμοί και οι αμυντικοί μηχανισμοί του ξενιστή 46 1.7.1 Το Porphyromonas gingivalis και οι αμυντικοί μηχανισμοίτου ξενιστή 46 1.7.1.1 Καταστροφή των περιοδοντικών ιστών από το Porphyromonas gingivalis.46 1.7.1.2 Καταστροφή του φατνιακού οστού από το Porphyromonas gingivalis.47 1.7.2 Επίδραση του Actinobacillus actinomycetemcomitans στην άμυνα του ξενιστή...48 1.7.2.1 Τοξικοί παράγοντες του Actinobacillus actinomycetemcomitans..49 1.7.2.2 Κυτταρικοί μηχανισμοί υπεύθυνοι για τη καταστροφή του φατνιακού οστού 50 1.7.3 Επίδραση του Bacteroides forsyhtus στην άμυνα του ξενιστή...50 2. Σκοπός 52 3. Μέθοδοι και Υλικά.54 3.1 Μέθοδοι 55 3.1.1 Ανακαλλιέργεια των βακτηριακών στελεχών 55 3.1.1.1 Καλλιέργεια του βακτηριακού στελέχους Porphyromonas gingivalis..56 3.1.1.2 Καλλιέργεια του βακτηριακού στελέχους Actinobacillus actinomycetemcomitans.56 3.1.2 Τεχνική της χρώσης Gram...57 3.1.3 Παρασκευή βακτηριακών καλλιεργειών για διατήρηση στους 80 ο C 57 3.1.4 Απομόνωση βακτηριακού DNA γονιδιώματος..58 3.1.5 Λήψη δειγμάτων περιοδοντίτιδας από ασθενείς- Μεταφορά..58 3.1.6 Απλή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)...58 3.1.7 Multiplex αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (multiplex PCR)...60 3.1.8 Ηλεκτροφόρηση.60 3.1.9 Κατάτμηση DNA με ένζυμα περιορισμού..60 3.1.10 Φωτομέτρηση..61 3.2 Υλικά...62 3.2.1 Στερεά θρεπτικά υλικά...62 3.2.1.1 GN αναερόβιο άγαρ...62 3.2.1.2 NS αναερόβιο άγαρ 63 3.2.1.3 Schaedler άγαρ + 5% sheep blood.64 3.2.1.4 Columbia άγαρ + 5% sheep blood..64 3.2.2 Υγρά θρεπτικά υλικά 64 3.2.2.1 Trypticase Soy Broth.64 3.2.3 Phosphate Buffered Saline (PBS 10x).65 5

3.2.4. TBE 10X. ph 8.3.65 3.2.5 Πήκτωμα αγαρόζης..65 4. Αποτελέσματα..66 4.1 Εγκατάσταση των θετικών μαρτύρων.67 4.1.1 Καλλιέργεια του βακτηριακού στελέχους Porphyromonas gingivalis.67 4.1.1.1 Ανακαλλιέργεια του Porphyromonas gingivalis..68 4.1.2 Καλλιέργεια του βακτηριακού στελέχους Actinobacillus actinomycetemcomitans..69 4.1.2.1 Ανακαλλιέργεια του Actinobacillus actinomycetemcomitans 70 4.1.3 Απομόνωση DNA γονιδιώματος από τα κύτταρα των βακτηριακών στελεχών Porphyromonas gingivalis και Actinobacillus actinomycetemcomitans.70 4.1.4 Ανίχνευση ειδικής αλληλουχίας ταυτοποίησης στα πρότυπα βακτήρια.71 4.1.5 Εφαρμογή της multiplex αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (multiplex PCR) στα βακτηριακά στελέχη Porphyromonas gingivalis και Actinobacillus actinomycetemcomitans.73 4.1.6 Ανίχνευση του παθογόνου βακτηρίου Bacteroides forsythus σε δείγματα ασθενών.74 4.1.7 Ταυτοποίηση των προϊόντων της PCR για κάθε βακτήριο.75 4.2 Επεξεργασία των κλινικών δειγμάτων.80 4.2.1 Απομόνωση DNA στα κλινικά δείγματα.80 4.2.2 Ανίχνευση των τριών περιοδοντοπαθογόνων βακτηρίων σε δείγματα ασθενών.81 4.2.3 Ταυτοποίηση των προϊόντων PCR για τα βακτήρια Porphyromonas gingivalis και Actinobacillus actinomycetemcomitans 84 4.3 Προσδιορισμός της ευαισθησίας της μεθόδου..85 4.3.1 Καθορισμός ορίου ανίχνευσης για τo Actinobacillus actinomycetemcomitans..85 4.3.2 Καθορισμός ορίου ανίχνευσης για τo Porphyromonas gingivalis..86 5. Συζήτηση...88 6. Βιβλιογραφία.91 Συντομογραφίες..95 6

7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1. Εισαγωγή 1.1 Περιοδοντική νόσος- Γενικά στοιχεία Οι νόσοι του περιοδοντίου περιλαμβάνουν μια ομάδα νοσηρών εκδηλώσεων και αποτελούν μια συνεχή απειλή για τη διατήρηση της οδοντοφυΐας, καθώς προσβάλλουν τους ιστούς που περιβάλλουν και στηρίζουν τα δόντια. Η περιοδοντίτιδα είναι μια από τις πιο διαδεδομένες νόσους της ανθρωπότητας, που εμφανίζονται σε όλα τα γεωγραφικά πλάτη και μήκη της γης. Το 95-100% του ανθρώπινου πληθυσμού, κατά τη διάρκεια της ζωής του, προσβάλλεται από κάποια μορφή της περιοδοντικής νόσου, που αποτελεί την κύρια αιτία της απώλειας των δοντιών στους ενήλικες. Περισσότερο από 60-70% των δοντιών του ανθρώπου, χάνονται μετά την ηλικία των 35 χρόνων από περιοδοντικές βλάβες, ενώ στις μικρότερες ηλικίες, η κύρια αιτία απώλειας των δοντιών, είναι η τερηδόνα. Οι νόσοι του περιοδοντίου εκδηλώνονται, κυρίως, στους ενήλικες, όμως, η εισβολή τους γίνεται νωρίτερα, στη παιδική ηλικία και η διατήρηση ή μη τη υγιεινής του στόματος, κατά την περίοδο αυτή, καθορίζει την εξάπλωση ή τον περιορισμό των περιοδοντικών βλαβών και τη διατήρηση ή απώλεια των δοντιών στη μετέπειτα ζωή. Τις περισσότερες φορές, η περιοδοντική βλάβη, που καταστρέφει τους ιστούς, αρχίζει σαν χρόνια φλεγμονή. Όταν αφορά τα ούλα, μόνο, καλείται ουλίτιδα, στη περίπτωση, όμως, που προσβάλλει και τους υποκείμενους ιστούς του περιοδοντίου, η νόσος καλείται περιοδοντίτιδα. Όλες οι ουλίτιδες δε μεταπίπτουν πάντοτε σε περιοδοντίτιδα, αλλά η πρόοδος της φλεγμονής πραγματοποιείται κάτω από ορισμένες προϋποθέσεις. Οι νόσοι του περιοδοντίου προκαλούν προοδευτική καταστροφή των ιστών του περιοδοντίου και δεν αυτοθεραπεύονται. Η θεραπεία τους δεν εξασφαλίζει, πάντοτε, την αποκατάσταση των ιστών στο φυσιολογικό, ελέγχει, όμως, την πορεία της νόσου και αναχαιτίζει την παραπέρα εξέλιξή της. Αν η περιοδοντική νόσος δεν διαγνωσθεί εγκαίρως ή δεν γίνει η σωστή θεραπεία, η πρόοδος της βλάβης των ιστών είναι βέβαια και η απώλεια των δοντιών καθίσταται αναπόφευκτη. Η πρόληψη των νόσων του περιοδοντίου αποτελεί αληθινή κοινωνική προσφορά και μπορεί να επιτευχθεί με τη στοματική υγιεινή και τον έλεγχο των οδοντικών πλακών, καθώς έχει αποδειχθεί ότι ο πρωταρχικός αιτιολογικός παράγοντας για την εμφάνιση και την εξέλιξη της περιοδοντικής νόσου, είναι τα μικρόβια της οδοντικής πλάκας. 8

1.2 Φυσιολογικό περιοδόντιο Ο όρος περιοδόντιο αναφέρεται στους ιστούς που περιβάλλουν το δόντι. Οι περιοδοντικοί ιστοί, που έχουν σαν κοινή λειτουργική αποστολή, τη στήριξη και συγκράτηση των δοντιών, είναι τα ούλα, το περιρρίζιο, το οστό των φατνίων και η οστείνη, που αποτελεί και οδοντική ουσία. (Schroeder HE, 2000) Εικόνα 1. Σχηματική απεικόνιση των περιοδοντικών ιστών. 1.2.1 Ούλα Τα ούλα αποτελούν προέκταση του στοματικού βλεννογόνου στις φατνιακές αποφύσεις, καλύπτουν το οστό του φατνίου και περιβάλλουν τα δόντια στην αυχενική τους μοίρα. Τα φυσιολογικά ούλα χαρακτηρίζονται από ανοιχτό ρόδινο χρώμα και συμπαγή σύσταση. Εικόνα 2. Κλινική εικόνα φυσιολογικών ούλων. 9

Πολλές φορές, εμφανίζουν διακυμάνσεις στο χρώμα τους, ανάλογα με το πάχος του επιθηλίου, την κερατινοποίηση και την αγγειακή διήθησή του, ενώ σύμφωνα με το βαθμό εναπόθεσης της μελανίνης, εμφανίζονται λιγότερο (σε άτομα της καυκάσιας φυλής) ή περισσότερο (σε άτομα της αφρικανικής φυλής) μελαγχρωματικά. (H. P. Mueller, 2005) Εικόνα 3. Ούλα με αυξημένη εναπόθεση μελανίνης. Στα άτομα της μαύρης φυλής, τα ούλα περιέχουν μεγαλύτερη ποσότητα της χρωστικής ουσίας, μελανίνης, σε σχέση με το παρακείμενο φατνιακό βλεννογόνο. Η μελανίνη συντίθεται στα μελανοκύτταρα της βασικής στιβάδας του επιθηλίου και παράγεται με τη μορφή κοκκίων, τα μελανοσώματα, που αποθηκεύονται στο κυτταρόπλασμα των μελανοκυττάρων και των παρακείμενων κερατινοκυττάρων. Εμβρυολογικά, τα μελανοκύτταρα προέρχονται από κύτταρα του νευρικού φλοιού (neural crest cells), που μεταναστεύουν στο επιθήλιο. Σε περίπτωση, χειρουργικής εξαίρεσης των κεχρωσμένων ούλων, η επούλωση ακολουθείται από μικρή ή καθόλου μελάχρωση. Έτσι, ο σχεδιασμός των χειρουργικών επεμβάσεων πρέπει να επιδιώκει τη διατήρηση των κεχρωσμένων ούλων. Τα ούλα διακρίνονται: σε α) ελεύθερα, β) προσπεφυκότα και γ) μεσοδόντια. Εικόνα 4. Σχηματική απεικόνιση των ανατομικών στοιχείων των φυσιολογικών ούλων. Τα ελεύθερα ούλα αποτελούν, ουσιαστικά, το τελικό άκρο των ούλων. Ονομάζονται και παρυφή των ούλων. Μορφολογικά, ακολουθούν τους αυχένες των δοντιών που περιβάλλουν. Το χρώμα τους είναι, συνήθως, ανοικτό ρόδινο και η επιφάνειά τους λεία και ομαλή. 10

Τα ελεύθερα ούλα δεν βρίσκονται σε άμεση επαφή με την οδοντική επιφάνεια, αλλά μεταξύ τους καταλείπεται μια μικρή σχισμή, η ουλοδοντική. Το βάθος της σχισμής αυτής κυμαίνεται μεταξύ 0,5-1,0mm σε νεαρά άτομα, ενώ αγγίζει τα 3mm με την πρόοδο της ηλικίας και σε απουσία της φλεγμονής του περιοδοντίου. Το κύριο μέρος των ούλων είναι τα προσπεφυκότα ούλα, που αποτελούν συνέχεια των ελεύθερων ούλων με ακρορριζική κατεύθυνση. Διαχωρίζονται από αυτά με μια αβαθή αύλακα, την αύλακα των ελεύθερων ούλων, η οποία δεν είναι πάντοτε ευδιάκριτη. Ακρορριζικά, τα προσπεφυκότα ούλα εκτείνονται μέχρι την ουλοβλεννογόνια γραμμή ή ένωση. Προστομιακά, η ουλοβλεννογόνια γραμμή είναι κλινικά ορατή, όμως, στην υπερώια, επιφάνεια τα ελεύθερα ούλα μεταπίπτουν απευθείας στον κερατινοποιημένο βλεννογόνο της υπερώας. Τα προσπεφυκότα ούλα είναι πλούσια σε κολλαγόνες ίνες και βρίσκονται σε σταθερή σχέση με το υποκείμενο οστό, μέσω του χορίου. Συνήθως, έχουν χρώμα ρόδινο, το οποίο εξαρτάται από το πάχος του υποκείμενου συνδετικού ιστού και την πυκνότητα του αγγειακού πλέγματος. Η έντονη μελάγχρωση, που παρατηρείται σε ορισμένες περιοχές τους, οφείλεται στην αυξημένη συγκέντρωση κοκκίων μελανίνης. Η επιφάνειά τους, συχνά, χαρακτηρίζεται από στίξεις που προσδίδουν στα ούλα εικόνα φλούδας πορτοκαλιού. Τα μεσοδόντια ούλα καταλαμβάνουν το χώρο μεταξύ των δοντιών. Η μορφολογία τους υπαγορεύεται από τη μορφολογία του μεσοδόντιου χώρου και είναι τριγωνική ή αποπεπλατυσμένη. Σε φυσιολογικές συνθήκες, τα μεσοδόντια ούλα παρουσιάζουν κοίλανση σε παρειογλωσσική κατεύθυνση, εκεί όπου ενώνονται τα ούλα της προστομιακής και της γλωσσικής επιφάνειας, σχηματίζοντας τη μεσοδόντια ουλική καμάρα. Η ουλική καμάρα παρουσιάζεται περισσότερο έντονη, όταν τα δόντια έρχονται σε επαφή μεταξύ τους σε περισσότερα από ένα σημεία ή επιφάνειες, καλύπτοντας, με τον τρόπο αυτό, ευρύ μεσοδόντιο χώρο. Όταν, όμως, τα δόντια αφίστανται μεταξύ τους, αυτή εξαφανίζεται. Η ουλική καμάρα καλύπτεται από ένα λεπτό μη κερατινοποιημένο επιθήλιο. Έχει ιδιαίτερη κλινική σημασία,καθώς, αποτελεί τη κύρια περιοχή έναρξης της φλεγμονής στην εξέλιξη της νόσου. (Schroeder HE, 2000) 1.2.2 Περιρρίζιο Το περιρρίζιο ή διαφορετικά ενδοφάτνιο, έχει σαν βασικό ρόλο τη συγκράτηση του δοντιού μέσα στο φατνίο του, με τη βοήθεια των ινών που εκτείνονται σε δέσμες από την οστείνη της ρίζας προς τα ούλα και το οστό του φατνίου. Η προέλευση του είναι μεσεγχυματική και παράγεται, μετά την τελείωση της οδοντικής μύλης, από το οδοντοθυλάκιο που το περιβάλλει. Το περιρρίζιο καταλαμβάνει το χώρο ανάμεσα στο δόντι και το ενδοφατνιακό οστικό πέταλο, που καλείται και περιρριζικός χώρος. (H. P. Mueller, 2005) 11

Εικόνα 5. Σχηματική απεικόνιση των ομάδων των ινών του περιρριζίου. Αριστερά απεικονίζεται η πρόσφυση των ινών στο οστό και την οστείνη και ο σχηματισμός του διάμεσου πλέγματος. 1.2.3 Φατνιακή απόφυση Το τμήμα του οστού της άνω και κάτω γνάθου, που υποδέχεται τα δόντια, καλείται οστό των φατνίων ή φατνιακή απόφυση. (Schroeder HE, 2000) Σχηματίζεται μετά την ανατολή των δοντιών και εξαφανίζεται κατά ένα μεγάλο μέρος μετά την απόπτωσή τους. Έτσι, ένας από τους στόχους της προληπτικής και θεραπευτικής περιοδοντολογίας είναι η διατήρηση της φατνιακής αποφύσεως. Επιφανειακά, η φατνιακή απόφυση αποτελείται από συμπαγές οστό, το έξω και έσω φατνιακό πέταλο, μεταξύ των οποίων υπάρχει σπογγώδης ουσία. Η ποσότητα της ποικίλλει κατά περιοχές και είναι περισσότερη στους γομφίους και τους μεσοδόντιους χώρους, ενώ ελάχιστη είναι στην περιοχή των τομέων της κάτω γνάθου και μεταξύ των ριζών που γειτονεύουν, όπως στους άνω γομφίους. Η σπογγώδης ουσία υφίσταται σε μεγάλο βαθμό τον νόμο της φθοράς και της πλάσεως και η ποσότητά της έχει σημασία για την επέκταση της φλεγμονής. Η εξωτερική επιφάνεια του οστού καλύπτεται από το περιόστεο, το οποίο περιέχει οστεοβλάστες, που έχουν την ικανότητα να παράγουν οστό και οστεοκλάστες, που δραστηριοποιούνται στα σημεία που γίνεται απορρόφηση οστού. Ιστολογικά, στο σπογγώδες οστό ανευρίσκονται μυελοκυψέλες και οστικές δοκίδες. Η διάταξή τους είναι ανάλογη με τις πιέσεις που ασκούνται στο δόντι. Φυσιολογικά διατάσσονται κάθετα προς τον επιμήκη οδοντικό άξονα. Στις οστικές κοιλότητες του σπογγώδους οστού παρευρίσκονται κύτταρα, που προέρχονται από το περιόστεο, τα οστεοκύτταρα. Αυτά με προσεκβολές, που πορεύονται διαμέσου σωληναρίων, αναστομώνονται μεταξύ τους. 12

Στις φατνιακές αποφύσεις υπάρχουν τα φατνία, στα οποία βρίσκονται εγομφωμένα τα δόντια με τις ρίζες τους. Τα φατνία επενδύονται σε όλη τους την έκταση με λεπτή συμπαγή ουσία, το ενδοφατνιακό πέταλο. Το ενδοφατνιακό πέταλο είναι διάτρητο από τρήματα, τα τροφικά, από τα οποία διέρχονται αιμοφόρα και λεμφοφόρα αγγεία, καθώς και νεύρα. Έτσι, υπάρχει πλήρης τροφική επικοινωνία, μεταξύ του οστού των φατνίων και του περιρριζίου, προς τις δυο κατευθύνσεις. Την ίδια αυτή αγγειακή πορεία ακολουθεί και η φλεγμονή από το περιρρίζιο στο οστό. (Schroeder HE, 2000) 1.2.4 Οστεϊνη Η οστεϊνη είναι εξειδικευμένος ενασβεστιωμένος ιστός, ο οποίος καλύπτει το εξωτερικό μέρος της ρίζας του δοντιού από την αδαμαντίνη μέχρι το ακρορρίζιο. Η οστεϊνη είναι μεσεγχυματικής προέλευσης, όπως το περιρρίζιο και το ενδοφατνιακό πέταλο και σχηματίζεται από εξειδικευμένα κύτταρα του οδοντοθυλακίου, τις οστεϊνοβλάστες. Η διάπλαση της οστεϊνης ξεκινά από τη στιγμή που διαπλάθεται το επιθηλιακό έλυτρο της ρίζας και γίνεται η πρώτη επαφή του με αδιαφοροποίητα κύτταρα της έσω ζώνης του οδοντοθυλακίου. Τα κύτταρα αυτά διαφοροποιούνται αργότερα σε οστεϊνοβλάστες, οι οποίες με τη δράση κατάλληλων ενζύμων οδηγούν στη δημιουργία της προοστεϊνης ή οστεϊνοειδούς. (H. P. Mueller, 2005) Η προοστεϊνη αποτελείται από κολλαγόνες ίνες (κολλαγόνο τύπου Ι) και μη κολλαγονούχες πρωτεΐνες, οι οποίες συνιστούν και τη θεμέλια ουσία της οστεϊνης. Ακολουθεί η διαδικασία ενασβεστίωσης, όπου ανόργανα συστατικά με τη μορφή ιόντων (κυρίως ασβεστίου και φωσφόρου) εναποτίθενται μέσα και γύρω από τις ίνες κολλαγόνου. Τα ανόργανα συστατικά δημιουργούν σταδιακά πυρήνες, οι οποίοι οδηγούν στο σχηματισμό κρυστάλλων υδροξυαπατίτη. Η παραγωγή οστεϊνης πριν από την ανατολή των δοντιών γίνεται με πολύ αργό ρυθμό. Μετά την ανατολή, ο ρυθμός αυτός αλλάζει και ποικίλλει ανάλογα με το είδος της οστεϊνης και τη θέση της στη ριζική επιφάνεια. (H. P. Mueller, 2005) Το πάχος της οστεϊνης κυμαίνεται ανάλογα με την ηλικία και την περιοχή του δοντιού. Στην αδαμαντινοοστεϊνική ένωση είναι περίπου 50μm, ενώ μπορεί να φθάσει και τα 130μm (σε ηλικιωμένα άτομα). Το πάχος της αυξάνει προς το ακρορρίζιο, φθάνοντας τα 200μm, κατά μέσο όρο, χωρίς ωστόσο να αποκλείεται να υπερβεί και τα 500μm. Έχει κίτρινο ή υποκίτρινο χρώμα, χωρίς τη στιλπνότητα της αδαμαντίνης. Είναι πιο μαλακή και διαπερατή από την οδοντίνη. 1.2.4.1 Η οστεϊνη στη περιοδοντική νόσο Στο φυσιολογικό περιοδόντιο, η οστεϊνη δεν εκτίθεται στο στοματικό περιβάλλον, καθώς καλύπτεται από συνδετικό ιστό. Ωστόσο, σε άτομα με υφίζηση των ούλων, η οστεϊνη μπορεί να αποκαλυφθεί στην περιοχή του ανατομικού αυχένα του δοντιού. Ακόμη, κατά τη δημιουργία του περιοδοντικού θυλάκου, είναι δυνατόν να πραγματοποιηθεί αποκάλυψη σημαντικού τμήματος της οστεϊνης της ρίζας. 13

Η οστεϊνη είναι ιστός με σχετική διαπερατότητα, που μπορεί να απορροφήσει τοξίνες και άλλα παράγωγα των βακτηρίων της οδοντικής πλάκας. Οι ζωντανοί περιοδοντοπαθογόνοι μικροοργανισμοί μπορούν εύκολα να εγκατασταθούν στη παρακείμενη οδοντίνη, δημιουργώντας μια δεξαμενή βακτηρίων, από την οποία είναι δυνατή η επαναποίκηση θεραπευμένων, με ριζική απόξεση, επιφανειών ριζών. Τα κύτταρα του συνδετικού ιστού (περιρριζίου) δεν μπορούν να προσκολληθούν σε οστεϊνη που έχει ήδη αποκαλυφθεί ή έχει μολυνθεί από τοξίνες. Υποουλικά, είναι εφικτός ο σχηματισμός νέας οστεϊνης επάνω σε απογυμνωμένη επιφάνεια οδοντίνης, χωρίς ωστόσο, η διαδικασία αυτή, να είναι πάντα προβλέψιμη και δίχως, η νεοσχηματισμένη οστεϊνη να έχει όλα τα χαρακτηριστικά της οστεϊνης που θα βρισκόταν στην αντίστοιχη περιοχή υπό φυσιολογικές συνθήκες. 14

1.3 Η φυσική χλωρίδα της ανθρώπινης στοματικής κοιλότητας 1.3.1 Η στοματική κοιλότητα ως βιότοπος Η στοματική κοιλότητα αποτελεί έναν μοναδικό, σύνθετο βιότοπο του οργανισμού. (Ramberg P, Sekino S et al. 2003). Το θερμό, υγρό και πλούσιο σε θρεπτικά συστατικά περιβάλλον της ευνοεί τον αποικισμό των πρόσφορων επιφανειών, από ένα μεγάλο αριθμό μικροβίων (10 10 ανά ml σιέλου). Η μη ενασβεστιωμένη άθροιση των μικροοργανισμών και των προϊόντων τους, στις φυσικές και τεχνητές οδοντικές επιφάνειες της στοματικής κοιλότητας, αποτελεί την οδοντική πλάκα. Περισσότερα από 700 είδη μικροοργανισμών εντοπίζονται στη στοματική κοιλότητα και περιλαμβάνουν, κυρίως στρεπτόκοκκους, γαλακτοβάκιλλους, σταφυλόκοκκους και κορυνοβακτήρια. Στον μικροβιακό πληθυσμό της στοματικής κοιλότητας ανήκει και ένας μεγάλος αριθμός αυστηρά αναερόβιων μικροοργανισμών, κυρίως βακτηριοειδών. Αυτά εντοπίζονται σε περιοχές, όπου το οξυγόνο δεν διαχέεται και οι μεταβολικές δραστηριότητες των «γειτονικών» μικροβίων δημιουργούν ένα αναερόβιο περιβάλλον. Η φυσική χλωρίδα του στόματος μεταβάλλεται, ανάλογα με την ηλικία και τις διατροφικές συνήθειες του ατόμου. Έτσι, τη στιγμή της γέννησης οι μαλακοί ιστοί του στόματος, γλώσσα, χείλη, μάγουλα, ουρανίσκος, μαλακή υπερώα είναι στείρα μικροβίων. Στο πρώτο θηλασμό από τη μητέρα, αυτοί αποικίζονται από το Streptococcus salivarius, που αποτελεί το κυρίαρχο μικρόβιο της στοματικής χλωρίδας, μέχρι την εμφάνιση των δοντιών. Η εμφάνιση μη επιθηλιακών επιφανειών επιφέρει αλλαγές και προκαλεί την παρουσία των Streptococcus mutans και Streptococcus sanguis, που θα συνεχίσουν να αποικίζουν τα δόντια όσο αυτά υπάρχουν, ενώ ο σχηματισμός της φατνιακής απόφυσης δημιουργεί περιοχές για την πρόσφυση αναερόβιων μικροβίων. Η πολυπλοκότητα της στοματικής χλωρίδας αυξάνεται με τη κατανάλωση μεγάλης ποικιλίας τροφών. Στην εφηβική ηλικία, οι αλλαγές στον ορμονικό κύκλο του ανθρώπου συμβάλλουν στον αποικισμό του στόματος από βακτηριοειδή και σπειροχαίτες. Έτσι, η στοματική κοιλότητα ενός ενήλικα αποικίζεται από διάφορες μικροβιακές κοινότητες. Συγκεκριμένα, στην επιφάνεια των δοντιών εντοπίζονται οι μικροοργανισμοί Streptococcus sanguis, Streptococcus mutans και Actinomyces viscosus, στο πίσω μέρος της γλώσσας υπάρχουν τα μικρόβια Streptococcus salivarius και Actinomyces naeslundii, στην υποουλική περιοχή υπάρχουν σπειροχαίτες, αναερόβια και gram βακτήρια, ενώ στη ριζική κοιλότητα των δοντιών, μόνο, αναερόβια και gram βακτήρια. (H. P. Mueller, 2005) Τον αποικισμό των επιφανειών της στοματικής κοιλότητας ανταγωνίζονται οι αμυντικοί μηχανισμοί του οργανισμού, που τείνουν να αποσπούν και να απομακρύνουν τους μικροοργανισμούς. Τέτοιοι μηχανισμοί είναι η έκκριση σιέλου και ουλικού υγρού, η αποφολίδωση των επιθηλιακών κυττάρων, η κίνηση της γλώσσας και η στοματική υγιεινή του ατόμου. Όμως, 15

τα μικρόβια της ανθρώπινης στοματικής χλωρίδας υπερνικούν τα μηχανικά εμπόδια του ξενιστή και προσφύονται στις διαθέσιμες στοματικές επιφάνειες. Η φυσική στοματική χλωρίδα δεν προκαλεί παθογένεια, αλλά αντίθετα συνεισφέρει στην υγεία των πολυκύτταρων οργανισμών, σχηματίζοντας επιχρίσματα, που επηρεάζουν θετικά το αερόβιο περιβάλλον και τους αμυντικούς μηχανισμούς του ξενιστή. Τα μικρόβια της φυσικής χλωρίδας προσφύονται στις επιφάνειες της στοματικής κοιλότητας και εμποδίζουν τον αποικισμό τους από παθογόνα μικρόβια, ενώ με τις μεταβολικές τους δραστηριότητες, όπως είναι η παραγωγή οξέων, δημιουργούν ένα περιβάλλον εχθρικό για αυτά. (Socransky SS, Haffajee AD et al. 1998) ΒΑΚΤΗΡΙΑ Επιδερμίδα Επιπεφ/τας Μύτη Φάρυγγας Στόμα Έντερο Ουρήθρα Κόλπος Staphylococcus epidermidis (1) ++ + ++ ++ ++ + ++ ++ Staphylococcus aureus* (2) + +/- + + + ++ +/- + Streptococcus mitis + ++ +/- + + Streptococcus salivarius ++ ++ Streptococcus mutans* (3) + ++ Enterococcus faecalis* (4) +/- + ++ + + Streptococcus pneumoniae* (5) +/- +/- + + +/- Streptococcus pyogenes* (6) +/- +/- + + +/- +/- Neisseria sp. (7) + + ++ + + + Neisseria meningitidis* (8) + ++ + + Enterobacteriaceae* (Escherichia coli) (9) +/- +/- +/- + ++ + + Proteus sp. +/- + + + + + + Pseudomonas aeruginosa* (10) +/- +/- + +/- Haemophilus influenzae* (11) +/- + + + Bacteroides sp.* ++ + +/- Bifidobacterium bifidum (12) ++ Lactobacillus sp. (13) + ++ ++ ++ Clostridium sp.* (14) +/- ++ Clostridium tetani (15) +/- Corynebacteria (16) ++ + ++ + + + + + Mycobacteria + +/- +/- + + Actinomycetes + + Spirochetes + ++ ++ Mycoplasmas + + + +/- + ++ = σχεδόν 100 % + = κοινό (about 25 percent) +/- = σπάνιο (λιγότερο από 25%) * = πιθανά παθογόνο Πίνακας 1. Βακτήρια που εντοπίζονται, συχνά, στις επιφάνειες του ανθρώπινου σώματος. 16

1.3.2 Οδοντική πλάκα Η οδοντική πλάκα αποτελεί ένα ζωντανό, δυναμικό σχηματισμό με βιολογικές ιδιότητες. Είναι στερεά προσκολλημένη στην οδοντική επιφάνεια και οι μικροοργανισμοί που την αποτελούν αλληλοσυνδέονται σε μια σχεδόν συμπαγή μάζα. (Rosan B, Lamont RJ et al., 2000) Εικόνα 8. Ανθρώπινη οδοντική πλάκα Εικόνα 9. Μικροφωτογραφία οδοντικής πλάκας από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) (x 9.500 φορές). Περιέχει διάφορες φλεγμονογόνες ή τοξικές ουσίες, όπως είναι τα πρωτεολυτικά ένζυμα, οι ενδοτοξίνες, τα βλεννοπεπτίδια και άλλες ουσίες μικρού μοριακού βάρους, που αποτελούν προϊόντα μεταβολισμού των μικροβίων. Οι ιδιότητες και η επικράτηση της μιας ή της άλλης ουσίας, εξαρτώνται από το είδος των περιεχόμενων μικροβίων στην οδοντική πλάκα και από τη μεταβολική δραστηριότητά της. Η μικροβιακή πλάκα κατακρατεί και εναποθηκεύει ζυμώσιμους υδατάνθρακες, τροποποιεί και επηρεάζει τη διάχυση διαφόρων ουσιών μέσα στη μάζα της, ενώ επίσης, δέχεται την καθίζηση σιαλικών αλάτων σε επάλληλα στρώματα, με αποτέλεσμα το σχηματισμό τρυγίας. Είναι χαρακτηριστικό ότι αποτελεί οντότητα μεταβλητή, με ποικιλία μικροοργανισμών και αποικιών από άτομο σε άτομο, στο ίδιο άτομο, από δόντι σε δόντι, στο ίδιο δόντι, από επιφάνεια σε επιφάνεια. Επίσης, η μικροβιακή χλωρίδα της υγιούς ουλοδοντικής σχισμής είναι, τελείως, διαφορετική από τη χλωρίδα του περιοδοντικού θυλάκου και η μικροβιακή σύνθεση της υπερουλικής πλάκας είναι διαφορετική από την υποουλική. (Ellen RP, Lepine G et al., 1997) Η οδοντική πλάκα αναπτύσσεται σε περιοχές που δεν αυτοκαθαρίζονται όπως, στις αύλακες και τα βοθρία των μασητικών επιφανειών, στην ουλοδοντική σχισμή, στον ανατομικό αυχένα και στις όμορες επιφάνειες, όπως επίσης, σε εμφράξεις, στεφανές και σε τεχνητά δόντια, ιδιαίτερα όταν δεν είναι καλά στιλβωμένα. 17

1.3.2.1 Σχηματισμός και ωρίμανση της οδοντικής πλάκας Τα στάδια σχηματισμού της οδοντικής πλάκας περιλαμβάνουν α) την αρχική προσκόλληση των μικροβίων στις ενδοστοματικές επιφάνειες, β) τον αρχικό αποικισμό τους, γ) τον δευτερογενή αποικισμό τους και δ) την ωρίμανση της οδοντικής πλάκας (Rosan B, Lamont RJ, 2000). 1. Σχηματισμός υμενίου Μια λεπτή, ελεύθερη-μικροβίων στιβάδα σχηματίζεται στη καθαρή επιφάνεια των δοντιών, μέσα σε λίγα λεπτά. 2. Αρχική προσκόλληση Σε λίγες ώρες, τα βακτήρια προσκολλώνται στο αρχικό υμένιο και ένα βλεννώδες στρώμα σχηματίζεται γύρω από αυτά. 3. Αρχική υπερουλική πλάκα Η αρχική υπερουλική πλάκα αποτελείται από κυρίως, gram+ κόκκους και ραβδόμορφα βακτήρια μερικούς gram κόκκους και ραβδόμορφα βακτήρια 2. Αρχικός αποικισμός 3. Δευτερογενής αποικισμός 4. Δευτερογενής υπερουλική πλάκα Στη δευτερογενή υπερουλική πλάκα, υπάρχει μια εκατοστιαία αύξηση των gram- αναερόβιων βακτηρίων. 4. Ωρίμανση 5. Σχηματισμός υποουλικής πλάκας Υπερουλική οδοντική πλάκα Κυρίως gram+ βατήρια και μερικοί gram- κόκκοι και ραβδόμορφα βακτήρια. Υποουλική οδοντική πλάκα Κυρίως gramραβδόμορφα βακτήρια και σπειροχαίτες. 18

1.3.2.1.α Σχηματισμός της υπερουλικής οδοντικής μικροβιακής πλάκας Αρχική προσκόλληση των μικροβίων στις ενδοστοματικές επιφάνειες Η μεταφορά των μικροβίων στις οδοντικές επιφάνειες πραγματοποιείται είτε με τυχαία κίνηση Brown, είτε με την ενεργό κίνηση του μικροβίου, είτε με τη φυσιολογική ροή του σάλιου. Οι μικροοργανισμοί προσκολλώνται στις επιφάνειες, χαλαρά, με δυνάμεις van der Waals και ηλεκτροστατικές δυνάμεις ενώ ισχυρότερες (δεσμοί υδρογόνου, ιοντικά ζεύγη, κ.α) δρουν, όταν το μικρόβιο πλησιάσει αρκετά την οδοντική επιφάνεια. Σε αντίθετη περίπτωση, το χάσμα γεφυρώνεται με τη βοήθεια μορφολογικών κυτταρικών δομών των βακτηρίων, όπως είναι ο γλυκοκάλυκας και τα ινίδια προσκόλλησης των Gram-, καθώς και τα φιμπριόλια των Gram+ βακτηρίων. Η αρχική προσκόλληση ξεκινά από προστατευμένες περιοχές με ανώμαλη μορφολογία (οπές, κοιλότητες, σχισμές, περικύματα αδαμαντίνης), που παρέχουν προστασία έναντι των δυνάμεων απομάκρυνσης (ροή σάλιου, δυνάμεις μάσησης). Οι μικροβιακές αθροίσεις επικάθονται σε ένα οργανικό εξωκυτταρικό υπόστρωμα, που αποτελείται, κυρίως, από το σιαλικό υμένιο και από οργανικές επίκτητες εναποθέσεις, όπως είναι τα υπολλείματα τροφών ή τα προϊόντα μεταβολισμού των μικροοργανισμών ή τα συστατικά του ουλικού υγρού. Η πρόσφυση του βακτηρίου στις οδοντικές επιφάνειες πραγματοποιείται μέσω επιφανειακών σχηματισμών του βακτηριακού κυττάρου, των συγκολλητινών (adhesions) και ιδιαίτερα των λεκτινών, που συνδέονται επιλεκτικά με συμπληρωματικούς υποδοχείς του σιαλικού υμενίου. (Philip D Marsh, 2006) Το σιαλικό υμένιο σχηματίζεται αμέσως μετά τον επιμελή καθαρισμό της επιφάνειας της αδαμαντίνης, με την απορρόφηση των πρωτεϊνών του σάλιου στις επιφάνειες της στοματικής κοιλότητας. Το σάλιο περιέχει μόρια, όπως η βλενίνη, οι γλυκοπρωτεϊνικές συγκολλητίνες, που δρουν ως υποδοχείς για την μικροβιακή πρόσφυση, μαζί με τις PRPs (prolinerich proteins) και την α- αμυλάση. Με τον τρόπο αυτό, το σιαλικό υμένιο προσφέρει νέες θέσεις για βακτηριακή προσκόλληση και ενισχύει τον αρχικό μικροβιακό αποικισμό και το σχηματισμό του μικροβιακού υμενίου. Αρχικός και δευτερογενής αποικισμός της στοματικής κοιλότητας Τα μικροβιακά αθροίσματα αυξάνουν βαθμιαία σε μέγεθος και σε λίγες ημέρες αναπτύσσονται σχηματισμοί που έχουν την εικόνα μικροβιακών αποικιών. Μετά τη σταθερή προσκόλληση ενός μικροβίου αρχίζει ο πολλαπλασιασμός του και τα νέα προσκολλημένα μικρόβια οργανώνονται στο μικροβιακό υμένιο. Ο μηχανισμός σχηματισμού του μικροβιακού υμενίου προϋποθέτει ικανότητες σύνδεσης των μικροβίων μεταξύ τους, με άμεση επαφή, με στερεοχημική αντίδραση μορίων των βακτηρίων, με συμπληρωματικούς υποδοχείς και με την παρεμβολή των παραγόντων του σάλιου. Διαφορετικής φύσης αλληλεπιδράσεις προσκόλλησης αναπτύσσονται ανάμεσα στα βακτήρια και το σιελικό υμένιο, τα επιθηλιακά κύτταρα, άλλα μικροβιακά κύτταρα, κάποιες πρωτεΐνες του ξενιστή, όπως, η φιμπρονεκτίνη, το κολλαγόνο και τα αιμοπετάλια, δίνοντας τη δυνατότητα στους 19

μικροοργανισμούς να προσφύονται σε επιφάνειες που φέρουν διαφορετικούς υποδοχείς και να σχηματίζουν σταθερά σύμπλοκα. Είναι χαρακτηριστικό ότι οι υποδοχείς των επιθηλιακών επιφανειών διαφέρουν από αυτούς των σκληρών επιφανειών της στοματικής κοιλότητας, με συνέπεια τη διαφορετική σύνθεση της μικροβιακής χλωρίδας τους. Η ειδικότητα της προσκόλλησης των βακτηρίων έχει ως αποτέλεσμα την ειδικότητα στον αποικισμό των ιστών της στοματικής κοιλότητας και στη σύνθεση της μικροβιακής κοινότητας. (Philip D Marsh, 2006) Μικροβιακή σύνθεση της πλάκας: Οι πρώτοι μικροοργανισμοί που προσφύονται στις οδοντικές επιφάνειες, τις πρώτες 48 ώρες μετά τον καθαρισμό τους, είναι αερόβιοι Gram+ κοκκοειδείς, με προεξάρχοντα κάποια στελέχη στρεπτόκοκκων και ακτινομυκήτων. Σταδιακά, η οδοντική πλάκα αυξάνεται σε πάχος, λόγω του πολλαπλασιασμού των ήδη προσκολλημένων μικροβίων και την προσθήκη νέων από το περιβάλλοντα χώρο. Τις επόμενες 7 ημέρες, στελέχη Veillonella (ραβδόμορφα Gram+ βακτήρια) και Capnocytophaga (ραβδόμορφα Gram- βακτήρια) εμφανίζονται, ενώ ταυτόχρονα γίνεται διαρκώς εντονότερη η παρουσία αμιγώς αναερόβιων μικροοργανισμών, όπως των Prevotella intermedia και στελεχών Fusobacterium. Η κύρια μάζα της προσκολλημένης στην οδοντική επιφάνεια οδοντικής μικροβιακής πλάκας αλλάζει, σταδιακά, τα μορφολογικά χαρακτηριστικά της, με τα νηματοειδή βακτήρια να επικρατούν, λόγω της παρουσίας των στελεχών Actinomyces και Fusobacterium. Ο εμπλουτισμός της κύριας μάζας της οδοντικής πλάκας με νέα βακτήρια γίνεται στην εξωτερική της επιφάνεια, την οποία αποικίζουν, σε διάφορες χρονικές περιόδους, βακτήρια κατεξοχήν κινητά, όπως οι σπειροχαίτες και τα Gram- κινητά ραβδόμορφα. Ωρίμανση της οδοντικής πλάκας Η οδοντική πλάκα, σαν βιολογική οντότητα, μετά τον αρχικό σχηματισμό της, εξελίσσεται και εμφανίζει μεταβολές στα μορφολογικά χαρακτηριστικά και τη σύνθεσή της (στάδιο ωρίμανσης). Το μέγεθος της οδοντικής πλάκας και ο αριθμός των μικροβιακών αποικιών αυξάνονται, ενώ με την πάροδο των ημερών, η σύνθεσή της υφίσταται ποιοτικές μεταβολές. Έτσι, ενώ αρχικά, οι κόκκοι και οι νηματοειδείς σχηματισμοί αποτελούσαν το 80-90% της μικροβιακής χλωρίδας των Gram+ μικροβίων, κατά την 4-7 η ημέρα, αυτοί μειώνονται σε 50-70%, παραμένοντας, τελικά, σταθεροί σε 40-50%, ενώ αυξάνουν τα Gram- βακτήρια και ιδίως οι σπειροχαίτες. Μετά την 3 η ημέρα, από τον αρχικό σχηματισμό, παρατηρείται η εναπόθεση ανόργανων αλάτων και η έναρξη του σχηματισμού των νησίδων ενασβεστιώσεως. Στα σημεία που ευνοείται η εναπόθεση αλάτων είτε από ανατομικές συνθήκες, είτε από άλλους παράγοντες όπως, η γειτνίαση με εκφορητικό πόρο σιαλογόνου αδένα, αρχίζει ο σχηματισμός τρυγίας. Στην περίπτωση αυτή, η μικροβιακή πλάκα χρησιμεύει σαν υπόστρωμα (πυρήνας). 20