Ο ρόλος της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής στη γενετική βελτίωση των προβάτων

Ο ρόλος της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής στη γενετική βελτίωση των προβάτων Γιώργος. Αμοιρίδης DVM, PhD, DipECAR, DipECBHM, MRCVS Αναπληρωτής Καθηγητής Μαιευτική Κλινική, Σμήμα Κτηνιατρικής, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, Σρικάλων 224, 43100 Καρδίτσα. 1. Εισαγωγή Σο πρόβειο γάλα συνιστά ποσοστό μικρότερο του 2% της παγκόσμιας παραγωγής γάλακτος όλων των ειδών (αγελαδινό βουβαλίσιο, πρόβειο και αίγειο). την Ελλάδα η εκτροφή μικρών μηρυκαστικών αποτελεί τον ισχυρότερο κλάδο του πρωτογενούς τομέα. Σο 2007, συμφωνά με στοιχεία του FAO, η χώρα μας, με παραγωγή περί τους 770000 τόνους, καταλαμβάνει την 4 η θέση στην παγκόσμια κατάταξη παραγωγής πρόβειου γάλακτος (μετά την Κίνα, τη υρία και την Σουρκία). Σην ίδια στιγμή κατέχει την 1 η θέση στην Ευρώπη, με αρκετά υψηλότερη παραγωγή από τις ανταγωνίστριες Μεσογειακές χώρες (Γαλλία, Ιταλία και Ισπανία). Όμως τα 105 κιλά γάλακτος της μέσης ετήσιας παραγωγής ανά προβατίνα στη χώρα μας, υστερούν σημαντικότατα σε σχέση με αυτή των ανταγωνιστικών κρατών (30 % λιγότερο έναντι της Ισπανίας και 50 % λιγότερο έναντι της Γαλλίας). Ο δείκτης αυτός υποδεικνύει την αναγκαιότητα εκσυγχρονισμού και βελτίωσης του τόσο σημαντικού για την εθνική οικονομία κλάδου. Οι συνθήκες εκτροφής των προβάτων στην χώρα έχουν αλλάξει σημαντικά τα τελευταία 20 χρόνια. Ωστόσο διατηρούνται ακόμα πρακτικές και μέθοδοι του παρελθόντος, με μετακινούμενους πληθυσμούς που εκμεταλλεύονται τους θερινούς μήνες ορεινούς βοσκότοπους, και διαχειμάζουν σε πεδινές ημιαστικές περιοχές. Οι πρακτικές αυτές αποδίδουν προϊόν μόνο εποχικά, και μολονότι συνεισφέρουν στη διατήρηση του κόστους παραγωγής σε χαμηλά επίπεδα, είναι συνυφασμένες με μειωμένη παραγωγικότητα. Σην ίδια στιγμή όμως διαμορφώνουν το τοπίο της ελληνικής υπαίθρου, που αποτελεί 1

αναπόσπαστο κομμάτι της πολιτισμικής μας κληρονομιάς. τα επόμενα χρόνια τα υπολείμματα του μοντέλου της παραδοσιακής κτηνοτροφίας προβλέπεται ότι μοιραία θα υποκύψουν στις οικονομικές και κυρίως στις κοινωνικές απαιτήσεις που δημιούργησε ο σύγχρονος τρόπος ζωής. Η εκτατική ή ακόμα και η ημιεντατική μορφή εκτροφής πιθανόν να εκλείψουν δίνοντας τη θέση τους σε εντατικές και σύγχρονες μορφές παραγωγής. Σο πιο μοντέλο εκτροφής είναι το πλέον κατάλληλο και προσοδοφόρο για τις συνθήκες της χώρας μας αποτελεί πεδίο συστηματικής αναζήτησης και σε βάθος έρευνας και ανάλυσης, που ασφαλώς ξεφεύγουν από τις επιδιώξεις του παρόντος άρθρου. Αναμφισβήτητα απαιτείται να μειωθεί το κόστος παραγωγής ώστε να μπορέσει ο κλάδος να αντέξει στις πιέσεις του διεθνούς ανταγωνισμού. Για να συμβεί αυτό θα πρέπει να συμπιεσθεί το λειτουργικό κόστος και να αυξηθεί η παραγωγικότητα των ζώων. Παραδοσιακά η εκτροφή των προβάτων γινόταν σε μειονεκτικές μη καλλιεργήσιμες- περιοχές, οι οποίες ήταν ακατάλληλες για να αξιοποιηθούν ως βοσκότοποι άλλων ειδών. τις περιοχές αυτές αναπτύχθηκαν εξελίχθηκαναυτόχθονες φυλές προβάτων άριστα προσαρμοσμένες στο φυσικό περιβάλλον και στις τοπικές κλιματολογικές συνθήκες. Όμως με τις παραδοσιακές μεθόδους εκτροφής ήταν αδύνατο να αξιοποιηθούν στον μέγιστο βαθμό τα άτομα με τα ιδιαίτερα υψηλά παραγωγικά χαρακτηριστικά, διότι με τις φυσικές μεθόδους αναπαραγωγικής διαχείρισης ο αριθμός των αναμενόμενων απογόνων του ατόμου ανεξαρτήτως φύλου- είναι συγκεκριμένος και φυσικά πολύ περιορισμένος. Οι μέθοδοι της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής αποσκοπούν στη μεγιστοποίηση παραγωγής απογόνων από συγκεκριμένους ή και προεπιλεγμένους γεννήτορες, ή ακόμα να παραχθούν απόγονοι από φαινομενικά μη γόνιμα άτομα. Αντικειμενικός σκοπός αυτών των τεχνικών είναι να μετεβιβασθούν και να βελτιωθούν με μεγάλη ταχύτητα τα επιθυμητά παραγωγικά χαρακτηριστικά συγκεκριμένων γεννητόρων. ύμφωνα τους van Tassel & van Vleck (1991) ο ρυθμός γενετικής βελτίωσης (ΓΒ) ενός πληθυσμού ορίζεται από την εξίσωση ΓΒ= Α.Ε. x Π χ Ε.Ε. / Μ.Γ., όπου: ΑΕ είναι η ακρίβεια της επιλογής, Π η παραλλακτικότητα και ΕΕ η ένταση της επιλογής και ΜΓ το μεσοδιάστημα των γενεών. Είναι εμφανές ότι η παραγωγή πολλών απογόνων από τους ίδιους γονείς συμβάλει στη σύμπτυξη του μεσοδιαστήματος γενεών, που τελικά αποτελεί τον πλέον καθοριστικό παράγοντα για το ρυθμό γενετικής βελτίωσης. Οι μέθοδοι που διασφαλίζουν την μεγιστοποίηση του αριθμού των απογόνων για μεν τους αρσενικούς γεννήτορες είναι η τεχνητή σπερματέγχυση, για δε τους θηλυκούς η παραγωγή και μεταφορά εμβρύων. 2

ε παγκόσμιο επίπεδο, η γαλακτοπαραγωγός προβατοτροφία έχει στηριχθεί στην αξιοποίηση των πλέον παραγωγικών εγχώριων φυλών, οι οποίες είναι άριστα προσαρμοσμένες στο ιδιαίτερο περιβάλλον εκτροφής τους. το σημείο αυτό τα τελευταία χρόνια η χώρα μας πρωτοτυπεί, με την απαξίωση των πολύτιμων εγχώριων φυλών μας, και την αθρόα και ανεξέλεγκτη πολλές φορές εισαγωγή ξενικών φυλών. κοπός της ανασκόπησης αυτής είναι να παρουσιασθούν με απλό τρόπο οι μέθοδοι που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αποδοτικότερη εκμετάλλευση γενετικά πολύτιμων ατόμων για τη γενετική βελτίωση ενός πληθυσμού προβάτων. 2. Η τεχνητή σπερματέγχυση Μολονότι η Σ.. είναι ένα ισχυρότατο εργαλείο για την ταχεία γενετική βελτίωση στα πρόβατα, η διάδοσή της δεν έχει τύχει της αποδοχής που έτυχε στα βοοειδή. Ο λόγος είναι ότι στα πρόβατα η εφαρμογή της απαιτεί συγχρονισμό των οίστρων, τα αποτελέσματα δε παρουσιάζουν τρομερά μεγάλη παραλλακτικότητα και σε γενικές γραμμές είναι μάλλον χαμηλά, ενώ η χρησιμοποίηση καταψυγμένου σπέρματος προς το παρόν περιορίζεται σε εφαρμογή μόνο με λαπαροσκοπικές μεθόδους. 2.α. Συλλογή του σπέρματος Η συλλογή του σπέρματος μπορεί να γίνει με ηλεκτροδιεγέρτη η με τεχνητό κόλπο. Με την πρώτη μέθοδο η συσκευή εισάγεται στο απευθυσμένο και διοχετεύονται χαμηλής τάσης ηλεκτρικές ώσεις οι οποίες διεγείρουν πυελικά νεύρα τα οποία είναι υπεύθυνα για την εκσπερμάτιση. Σο πλεονέκτημα της μεθόδου είναι ότι ο σπερματοδότης κριός δεν χρειάζεται προηγούμενη εκπαίδευση ή σεξουαλική διέγερση. Όμως η μέθοδος προκαλεί κάποιου βαθμού δυσφορία, και η ποιότητα του σπέρματος που συλλέγεται δεν είναι η καλύτερη δυνατή. Η μέθοδος του τεχνητού κόλπου μπορεί να εφαρμόζεται διαρκώς με επαναλαμβανόμενο πρωτόκολλο σπερματοληψιών, και αποδίδει σπέρμα άριστης ποιότητας. Απαιτείται όμως εκπαίδευση του σπερματοδότη κριού και ειδικευμένο προσωπικό (Williams HL 1995). 2.β. Αραίωση και συντήρηση του σπέρματος Μετά τη συλλογή γίνεται κατ αρχήν μακροσκοπική εξέταση του εκσπερματίσματος (προσδιορισμός όγκου και χρωματισμού) και στη συνέχεια εκτίμηση της πυκνότητας και της κινητικότητας των σπερματοζωαρίων. Οι 3

εξετάσεις αυτές γίνονται ταχύτατα με μη ειδικό εξοπλισμό, όμως η αξιοπιστία τους είναι μάλλον περιορισμένη. Για το λόγο αυτό στα μεγάλα κέντρα Σ εφαρμόζεται η μέθοδος της αυτόματης μέσω υπολογιστή αξιολόγησης του εκσπερματίσματος (CASA, computer assisted sperm analyzer). Μετά την αξιολόγηση το σπέρμα αραιώνεται με διάφορα αραιωτικά μέσα. Οι παράμετροι που καθορίζουν την επιλογή του κατάλληλου αραιωτικού είναι η μορφή συντήρησης (ψύξη-κατάψυξη) ο χρόνος συντήρησης υπό ψύξη και η μέθοδος Σ.. που θα εφαρμοσθεί (συμβατική ή ενδομήτρια). Σα πλέον κοινά αραιωτικά για το νωπό σπέρμα είναι ο κρόκος αυγού, το γάλα, λεκιθίνη σόγιας, διάφορα σάκχαρα κλπ (Graham & Foote 1987, Gil et al 2003). Όταν το σπέρμα πρόκειται να καταψυχθεί απαιτείται να χρησιμοποιηθεί κάποιο κρυοπροστατευτικό που θα αποτρέψει το σχηματισμό κρυστάλλων πάγου μέσα στο σπερματοζωάριο, τέτοια είναι η σουκρόζη, η γλυκερόλη και η αιθυλενική γλυκόλη (Anel et al 2003). Προσθήκη αντιοξειδωτικών ουσιών (υπεροξείδιο δισμουτάσης -SOD-, καταλάση, γλουταθειόνη, κλπ) έχει αυξήσει την κινητικότητα και προστάτεψε την ακεραιότητα της μεμβράνης των υπο ψύξη σπερματοζωαρίων (Foote et al 2002). Οι μέθοδοι που κατά κύριο λόγο αξιοποιούνται σήμερα για τη συντήρηση του σπέρματος και που αποδίδουν αποδεκτά ποσοστά εγκυμοσύνης είναι η ψύξη (15 ο C) και η κατάψυξη σε υγρό άζωτο. Θα πρέπει να τονισθεί ότι το καταψυγμένο σπέρμα αποδίδει πολύ καλά αποτελέσματα μετά από ενδομήτρια εναπόθεση, αλλά πολύ φτωχά με τη συμβατική τραχηλική Σ. Πέραν αυτών σήμερα είναι εμπορικά διαθέσιμο σπέρμα το οποίο έχει διαχωρισμένα τα σπερματοζωάρια που φέρουν το Φ και το Τ χρωμόσωμα. Έτσι είναι εφικτή η εξ αρχής επιλογή του επιθυμητού φύλου των απογόνων. 2.γ. Μέθοδοι ΤΣ τη Σ.. των περισσότερων ειδών επιδιώκεται να εναποτεθεί το σπέρμα μέσα στην κοιλότητα της μήτρας του θηλυκού. Όμως η ανατομία του τραχήλου της προβατίνας καθιστά μάλλον αδύνατη την προσπέλαση του τραχήλου με συμβατικό καθετηριασμό. Η ιδιαιτερότητα του τραχήλου της προβατίνας συνίσταται στον μεγάλο αριθμό τραχηλικών πτυχών (που επίσης παραλλάσσει τόσο ατομικά όσο και μεταξύ φυλών), στην έκκεντρη διάταξη των πτυχών, στο μεγάλο σχετικά μήκος του τραχήλου και στη μικρή του διάμετρο (Kaabi2006). Είναι έτσι πολύ πιθανό τα διαφορετικά ποσοστά στην γονιμότητα μετά από Σ στις διάφορες φυλές, να οφείλονται στα μορφομετρικά χαρακτηριστικά του τραχήλου που προσδιορίζουν το βάθος στο οποίο μπορεί να προωθηθεί ο 4

καθετήρας μέσα στον αυλό του τραχήλου (Donovan et al 2004, Kaabi et al 2006). 2.γ.1. Κολπική & τραχηλική Τ.Σ. Αποτελεί την ευρύτερα χρησιμοποιούμενη μέθοδο στα πρόβατα. Παραδοσιακά χρησιμοποιείται αραιωμένο σπέρμα υπό ψύξη το οποίο εναποτίθεται στον κόλπο ή τον τράχηλο της προβατίνας υπό την καθοδήγηση κολποσκοπίου και άμεσης παρατήρησης. Έχει αποδειχθεί ότι όσο προσθιώτερα εναποτίθεται το σπέρμα τόσο αυξάνονται οι πιθανότητες γονιμοποίησης (έως και 53%, Kerton et al 1984). Όμως ο όγκος του σπέρματος και η πυκνότητα που απαιτείται μειώνει σημαντικά τις δόσεις / εκσπερμάτισμα, γεγονός που περιορίζει την αποτελεσματικότητα του κριού. Επιπλέον το υπό ψύξη σπέρμα δεν είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί πέραν των 6-8 ωρών, γεγονός που αποτρέπει την ευρεία γεωγραφική διασπορά αξιόλογων γενοτύπων. Μολονότι προσφάτως δημοσιεύθηκαν πολύ ενθαρρυντικά ερευνητικά αποτελέσματα (Paulenz et al 2005, γονιμότητα έως και 72%) που αφορούν τη χρήση καταψυγμένου σπέρματος, το τελευταίο δεν έχει χρησιμοποιηθεί στην πράξη για Σ με τις συμβατικές μεθόδους. 2.γ.2 Ενδομήτρια ΤΣ Ο μοναδικός τρόπος για εφαρμογή ενδομήτριας Σ χωρίς να προκληθεί μείωση γονιμότητας της προβατίνας είναι η λαπαροσκοπική μέθοδος. Σα πλεονεκτήματα της συγκεκριμένης μεθόδου έναντι των συμβατικών είναι πολλά: Επιτρέπει την αξιοποίηση του καταψυγμένου σπέρματος με αποτέλεσμα την μέγιστη αξιοποίηση χωρίς γεωγραφικούς περιορισμού των κριών μεγάλης γενετικής αξίας. Απαιτεί πολύ μικρό όγκο και πυκνότητα σπέρματος, Εξαιτίας της άμεσης παρατήρησης του γεννητικού συστήματος, επιτρέπει τον αποκλεισμό από την αναπαραγωγή ζώων με ανατομικά προβλήματα Παρέχει τη δυνατότητα περαιτέρω περιορισμού του χρησιμοποιούμενου όγκου σπέρματος με εναπόθεση σπέρματος μόνο στο σύστοιχο της ωοθυλακιορρηξίας κέρας της μήτρας. πέρμα με μέτρια ή όχι καλά ποιοτικά χαρακτηριστικά που προέρχεται από μεγάλης αξίας κριό, και που δεν κρίνεται ακατάλληλο για συμβατική Σ μπορεί να χρησιμοποιηθεί με τη λαπαροσκοπική μέθοδο (Λυμπερόπουλος και συν 1998, Αμοιρίδης και συν 1999). 5

Παρά το γεγονός ότι η λαπαροσκοπική Σ εφαρμόζεται στην πράξη με πολύ καλά αποτελέσματα (50-80%, Gourley & Riese 1990, Λυμπερόπουλος και συν 1998), θα πρέπει να αναφερθεί ότι η μέθοδος απαιτεί ειδική εκπαίδευση, και η εφαρμογή ως χειρουργική μέθοδος- αποτελεί αμιγώς κτηνιατρική πράξη. Επιπλέον ο απαραίτητος εξοπλισμός είναι μάλλον ακριβός και ευαίσθητος. Η ενδομήτρια εναπόθεση του σπέρματος με αναίμακτη μέθοδο αποτελεί πεδίο έντονης ερευνητικής δραστηριότητας. Υυσικές μέθοδοι που αφορούν στην έλξη ευθείαση του τραχήλου, που καθιστά εφικτό τον καθετηριασμό του, αντιμετωπίζονται με επιφύλαξη τόσο λόγω αποτελεσματικότητάς αλλά κυρίως εξαιτίας παραβίασης της ευζωίας των προβατίνων (Halber et al 1990). Υαρμακευτικές μέθοδοι που στοχεύουν στη χαλάρωση του τραχήλου και στην δυνατότητα καθετηριασμού, δεν φαίνονται ιδιαίτερα ελπιδοφόρες διότι είτε αποτυγχάνουν στον πρώτο σκοπό ή μειώνουν από μόνες τους τη γονιμότητα των ζώων (King et al 2004, Kaabi et al 2002). χεδιασμός διαφόρων τύπων καθετήρων (Halbert et al 1990b, Buckrell et al 1994, Eppleston et al 1994) που θα μπορούσαν να προσαρμοσθούν στην ανατομική πολυπλοκότητα του τραχήλου της προβατίνας, ίσως να λύσουν στο μέλλον το πρόβλημα της εύκολης και ατραυματικής ενδομήτριας Σ. 3. Η παραγωγή και μεταφορά εμβρύων Οι μέθοδοι που αφορούν στην συλλογή και μεταφορά εμβρύων εφαρμόζονται διεθνώς σε προγράμματα που ονομάζονται ΜΟΕΣ (multiple ovulation embryo transfer- πολλαπλή ωοθυλακιορρηξία μεταφορά εμβρύων) και IVF-IVP ( in vitro fertilization- in vitro embryo production, εξωσωματική γονιμοποίηση- εξωσωματική παραγωγή εμβρύων). Η μέθοδος ΜΟΕΣ εφαρμόζεται από δεκαετίες στα βοοειδή, και αποτελεί την αιχμή του δόρατος στη γενετική βελτίωση του είδους αυτού. τα πρόβατα λόγω της άνοιστρης περιόδου, της προβληματικής ανίχνευσης οίστρων και του υψηλού κόστους, η μέθοδος δεν έχει διαδοθεί σε μεγάλη έκταση. ε κάθε περίπτωση το ΜΟΕΣ δεν σχεδιάσθηκε για να αντικαταστήσει την Σ ως αναπαραγωγική μέθοδος ρουτίνας, αλλά για να συμβάλλει στην παραγωγή πυρήνων πατρογονικών μεγάλης γενετικής αξίας. Από τους πυρήνες αυτούς, διατίθενται στον πληθυσμό βελτιωτές κριοί που χρησιμοποιούνται αναλόγως της γενετικής τους αξίας για φυσική οχεία η ως σπερματοδότες. 6

Η IVP στα πρόβατα αποτελεί πηγή για φθηνά έμβρυα τα οποία χρησιμοποιούνται για ερευνητικούς σκοπούς. Σις τελευταία δεκαετία η IVP τεχνολογία χρησιμοποιείται σε ιδιαιτέρως σύγχρονες βιοτεχνολογικές μεθόδους όπως η μεταφορά πυρήνα, ή στην παραγωγή διαγονιδιακών και κλωνοποιημένων ζώων. Επιπλέον η IVP και στη συνέχει η κρυοδιατήρηση, μπορούν να συμβάλλουν σημαντικά στη διάσωση φυλών που απειλούνται με εξαφάνιση. Η ευρεία εφαρμογή της τεχνολογίας της μεταφοράς εμβρύων, και η εμπορική αποδοχή της, θα συμβάλλει στην ταχύτατη γενετική βελτίωση πληθυσμών, με χαμηλό κόστος, και χωρίς την ανάγκη μεταφοράς ζώντων ζώων, μιας πρακτικής που εμπεριέχει σημαντικούς κινδύνους για διασπορά ασθενειών στους πληθυσμούς. 3.α. In vivo συλλογή εμβρύων Η τεχνική αυτή περιλαμβάνει τέσσερα επί μέρους στάδια: τον συγχρονισμό των οίστρων των δοτριών εμβρύων, την πρόκληση πολλαπλής ωοθυλακιορρηξίας, τη λαπαροσκοπική Σ των δοτριών και τη συλλογή των εμβρύων. Σα έμβρυα που συλλέγονται μπορούν να μεταφερθούν άμεσα σε προβατίνες δέκτριες εμβρύων (παρένθετες μητέρες) ή να καταψυχθούν για μεταφορά στο μέλλον. Με την πάροδο του χρόνου, η παραγωγή εμβρύων in vivo έχει βελτιωθεί σημαντικά, όμως η τεράστια παραλλακτικότητα της αντίδρασης των δοτριών στις αγωγές πρόκλησης πολλαπλής ωοθυλακιορρηξίας, αποτελεί ακόμα και σήμερα το μεγαλύτερο εμπόδιο στην ευρεία εφαρμογή της μεθόδου. Ο συγχρονισμός των οίστρων παραδοσιακά γίνεται με σπόγγους προσεσταγόνων. Η μέθοδος μπορεί να εφαρμοσθεί τόσο κατά την ένοιστρη όσο και κατά την άνοιστρη περίοδο. Κατά τη διάρκεια της ένοιστρης περιόδου συγχρονισμός μπορεί να επιτευχθεί επίσης με εγχύσεις προσταγλανδίνης F2α, ή με διαδοχικές εγχύσεις PGF 2α και εκλυτικής ορμόνης των γοναδοτροπινών GnRH (Amiridis et al 2005, Deligiannis et al 2005). Η μέθοδος πρόκλησης πολλαπλής ωοθυλακιορρηξίας (ΠΠΩ) περιλαμβάνει την χορήγηση γοναδοτρόπων ορμονών {ίππεια χοριακή γοναδοτροπίνη (ecg), ή ωοθυλακιοτρόπο ορμόνη (FSH)}. Η δυνατότητα πρόβλεψης της ανταπόκρισης της ωοθήκης στην αγωγή ΠΠΩ εγγυάται την πλέον αποτελεσματική διαχείριση των δοτριών. Έτσι ζώα με μικρή ανταπόκριση δεν υποβάλλονται αναίτια στη δοκιμασία της συλλογής των εμβρύων. Πρόβλεψη της ανταπόκρισης είναι δυνατό να γίνει με προσδιορισμό της 7

προγεστερόνης και με υπερηχογραφία την 5ημερα μετά την Σ.. (Amiridis et al 2002). Οι παράγοντες που παίζουν ρυθμιστικό ρόλο στην ανταπόκριση στην ΠΠΩ είναι ενδογενείς και εξωγενείς. την πρώτη κατηγορία εντάσσονται η φυλή, η θρεπτική κατάσταση του ζώου, και η λειτουργική κατάσταση της ωοθήκης τη στιγμή της αγωγής, ενώ στη δεύτερη, οι κανόνες αναπαραγωγικής διαχείρισης των δοτριών, το είδος του ορμονικού σκευάσματος, και το πρωτόκολλο χορηγήσεων που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν για την πρόκληση (Gonzalez-Bulnes et al 2002, Amiridis et al 2006). Η ορμόνη εκλογής για την ΠΠΩ είναι πλέον η FSH, διότι μολονότι απαιτεί πρωτόκολλο πολλαπλών εγχύσεων, αποδίδει περισσότερα και καλύτερης ποιότητας έμβρυα σε σύγκριση με την πολύ φθηνότερη και απλούστερη στην εφαρμογή ecg (Αμοιρίδης και συν 1998). Μετά το συγχρονισμό και την ΠΠΩ οι δότριες εμβρύων γονιμοποιούνται με λαπαοσκοπική Σ με σπέρμα κριού μεγάλης γενετικής αξίας. Η συλλογή των εμβρύων γίνεται την 6 η την 7 η ημέρα μετά την Σ.. όταν το έμβρυο βρίσκεται στο στάδιο του μοριδίου ή της βλαστοκύστης. Οι λαπαροσκοπικές μέθοδοι αποτελούν τις μεθόδους εκλογής για τη συλλογή εμβρύων από τα μικρά μηρυκαστικά. Παλαιότερα χρησιμοποιούνταν κλασσικές χειρουργικές μέθοδοι οι οποίες είναι ιδιαιτέρως τραυματικές για το ζώο, και ευθύνονται για το σχηματισμό συμφύσεων στο γεννητικό σύστημα που προκαλούν σημαντική μείωση της γονιμότητα. Οι λαπαροσκοπικές μέθοδοι είναι μικρής διάρκειας, ελάχιστα τραυματικές, και δεν προδιαθέτουν στο σχηματισμό συμφύσεων. Όμως, απαιτούν ειδική εκπαίδευση από τον επεμβαίνοντα κτηνίατρο, και ο εξοπλισμός που απαιτείται είναι σχετικά ακριβός (Αμοιρίδης και συν 1998, Lymberopoulos et al 2001, Amiridis et al 2002). ύμφωνα με κάποιες μελέτες το ποσοστό αναληψιμότητας εμβρύων με τις λαπαροσκοπικές μεθόδους είναι χαμηλότερο από αυτό που επιτυγχάνεται με τις κλασικές χειρουργικές μεθόδους (Scudamore et al 1991). Όμως, η δυνατότητα πολλαπλών συλλογών από το ίδιο ζώο αντισταθμίζει υστερήσεις της τάξης του 8-10%. Σο ποσοστό συλλογής παραλλάσει αναλόγως με τη φυλή και με την εμπειρία του επεμβαίνοντος. Από τα στοιχεία της κλινικής μας προκύπτει ότι το ποσοστό συλλογής είναι σημαντικά μεγαλύτερο στα Καραγκούνικα (78%,μ.ο. 6,3 έμβρυα/ προβατίνα) σε σχέση με το αντίστοιχο των Φιώτικων (60% 5.1 έμβρυα/ προβατίνα). 3.β. In vitro (εξωσωματική) παραγωγή εμβρύων 8

Σα τελευταία είκοσι χρόνια, η ανάγκη εξεύρεσης ωαρίων εμβρύων με χαμηλό κόστος για ερευνητική αλλά και εμπορική χρήση έχει διογκώσει το ερευνητικό ενδιαφέρον για εξωσωματική παραγωγή εμβρύων (IVP). Η IVP περιλαμβάνει 3 διακριτά στάδια, την ωρίμανση των ωαρίων, τη γονιμοποίησή τους και την καλλιέργεια των γονιμοποιημένων ωαρίων έως το εξελικτικό στάδιο της βλαστοκύστης οπότε και μεταφέρονται στους δέκτες ή καταψύχονται. 3.β.1 Ωρίμανση Η συνήθης πηγή ωαρίων είναι οι ωοθήκες σφαγίων προβάτων. Οι ωοθήκες μεταφέρονται στο εργαστήριο σε ειδικό υπόστρωμα μεταφοράς μέσα σε όσο το δυνατό συντομότερο χρονικό διάστημα. Εναλλακτικά, ωάρια είναι δυνατό να συλλεχθούν in vivo από ζωντανούς δότες με λαπαροσκοπικές τεχνικές. Η μέθοδος μπορεί να εφαρμοσθεί έως και 3 φορές την εβδομάδα με ή χωρίς πρόκληση πολλαπλής ανάπτυξης ωοθυλακίων. Η λύση αυτή είναι η ενδεδειγμένη όταν επιδιώκεται η μεγιστοποιημένη παραγωγή απογόνων από ένα συγκεκριμένο θηλυκό. τη συνέχεια τα ωάρια τοποθετούνται μετά από ποιοτική αξιολόγηση- σε τρυβλία ιστοκαλλιέργειας σε κλίβανο CO 2 στους 39 ο C για 24 περίπου ώρες. το διάστημα αυτό ωριμάζουν και μπαίνουν στο εξελικτικό στάδιο που ονομάζεται μετάφαση ΙΙ οπότε και είναι έτοιμα για να γονιμοποιηθούν. Σο υπόστρωμα ωρίμανσης αποτελείται από κλασσικό υπόστρωμα ιστοκαλλιέργειας 199, το οποίο είναι εμπλουτισμένο με αυξητικούς παράγοντες (EGF, IGF-1, TGF-α) ορό εμβρύου μόσχου και γοναδοτροπίνες. Πρόσφατα έχει αποδειχθεί ότι η προσθήκη αντιοξειδωτικών παραγόντων βελτιώνουν το ποσοστό ωρίμανσης και την γονιμοποιητική ικανότητα των ωαρίων (Baldassare et al 1996, Hollinshead et al 2004, Borman et al 2003). 3.β.2. In vitro γονιμοποίηση Μετά την ωρίμανση αφαιρούνται μηχανικά τα κύτταρα που περιβάλλουν το ωάριο, τα ωάρια πλένονται 2-3 φορές σε συγκεκριμένο διάλυμα και τοποθετούνται σε ειδικά τρυβλία σε υπόστρωμα που ονομάζεται συνθετικό υγρό ωαγωγού (SOF - synthetic oviductal fluid). πέρμα από εξαιρετικό κριό, νωπό ή καταψυγμένο χρησιμοποιείται για τη γονιμοποίηση. Από το σπέρμα απομονώνονται τα πλέον κινητικά και υγιή σπερματοζωάρια με τις μεθόδους του Percol ή του swim up. Σο σπέρμα αραιώνεται και χρησιμοποιείται σε ελάχιστο όγκο και σε συγκέντρωση 9

1Φ10 6 σπερματοζωάρια/ml. Σελικά ωάρια και σπερματοζωάρια συγκαλλιεργούνται για 24 ώρες σε συνθήκες όπως αυτές της ωρίμανσης. 3.β.3. In vitro Καλλιέργεια Σα γονιμοποιημένα ωάρια επωάζονται στη συνέχεια για 6-7 ημέρες μέχρι να φθάσουν στο στάδιο της βλαστοκύστης. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα ωάρια που καλλιεργούνται in vitro φθάνουν στο συγκεκριμένο εξελικτικό στάδιο περίπου 24 νωρίτερα από ότι εάν αναπτύσσονταν στο γεννητικό σύστημα της προβατίνας. Η καλλιέργεια των εμβρύων λαμβάνει χώρα σε 39 ο C σε ατμόσφαιρα μειωμένης συγκέντρωσης σε οξυγόνο, ώστε να αποτραπεί η δημιουργία οξειδωτικών φαινόμενων τα οποία θα ήταν μοιραία για το έμβρυο. Σριών τύπων υποστρώματα χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια: α) η συγκαλλιέργεια των εμβρύων με κοκκώδη κύτταρα, η επιθηλιακά κύτταρα του ωαγωγού, η ηπατικά κύτταρα, β) το σταθερής σύνθεσης υπόστρωμα, στο οποίο η σύνθεση κάθε συστατικού είναι ορισμένη και σταθερή, και γ) το ημι-σταθερής σύνθεσης, το οποίο περιέχει κάποιο βιολογικό υλικό (ορό) που διαφοροποιεί την τελική σύνθεση του υποστρώματος. Σο πλέον κοινό υπόστρωμα που χρησιμοποιείται από τα περισσότερα εργαστήρια στον κόσμο είναι αυτό που περιέχει SOF, αμινοξέα, βόεια αλβουμίνη, χωρίς ορό, και σωματικά κύτταρα, με την καλλιέργεια να γίνεται σε 5% Ο 2, 5% CO 2, 90% N 2 σε ατμόσφαιρα που είναι κορεσμένη από υγρασία ( Gardner et al 1994). Ωστόσο η κατανόηση των αναγκών του αναπτυσσόμενου εμβρύου οδήγησε σε καλλιέργεια των εμβρύων κατά στάδιο με τα υποστρώματα να αντικαθίστανται αναλόγως του εξελικτικού σταδίου του εμβρύου (Thompson 2000). Όμως, οι ποιοτικές διαφορές ανάμεσα στα έμβρυα που παράγονται in vivo σε σχέση με αυτά που παράγονται in vitro, οι διαφορές στην έκφραση πολλών γονιδίων, αλλά και συγγενή σύνδρομα που εμφανίζονται στα νεογέννητα που προέρχονται από in vitro έμβρυα, υποδεικνύουν ότι οι συνθήκες καλλιέργειας έχουν ακόμα τεράστια περιθώρια βελτίωσης. 3.γ. Εξωσωματική παραγωγή εμβρύων από αμνούς Σα τελευταία χρόνια η προοπτική παραγωγής εμβρύων και απογόνων- από άνηβους δότες ωαρίων έχει προσελκύσει το ιδιαίτερα το ενδιαφέρον της ερευνητικής κοινότητας. Ο λόγος είναι ότι θεωρητικά με τον τρόπο αυτό αυξάνεται ραγδαία ο ρυθμός της γενετικής βελτίωσης (Ledda et al 1999, Earl et al 1995, O Brien et al 1996, Βαλάση 2006). H ικανότητα ανάπτυξης των ωαρίων που συλλέγονται από νεαρά αρνιά (ηλικίας 1-5 10

μηνών), είναι σαφώς υποδεέστερη των ωαρίων που προέρχονται από ενήλικα ή ένηβα ζώα. Μελέτες σε καραγκούνικα αρνιά, που διεξάχθηκαν στην κλινική μας έδειξαν ότι: α) η ανταπόκριση στην αγωγή ΠΠΩ σε νεαρά αρνιά πρέπει να είναι προσαρμοσμένη στο βάρος του αρνιού β) σε συγκεκριμένη ηλικία (3-4 μήνες) τα ωάρια των αρνιών δεν έχουν ικανότητα εξέλιξης, σε αντίθεση με αυτά που προέρχονται από μεγαλύτερα ή ακόμα και μικρότερης ηλικίας ζώα, γ) οι αγωγές για την in vivo συλλογή των ωαρίων δεν επηρεάζουν την ενήβωση τη μυοσκελετική ανάπτυξη και τη γονιμότητα των αμνάδων και δ) με γνώμονα τη συγκέντρωση των οιστρογόνων στο αίμα καθίσταται εφικτή η πρόβλεψη της ανταπόκρισης της ωοθήκης στην αγωγή πρόκλησης ΠΠΩ, με αποτέλεσμα άτομα με μικρή ανταπόκριση να μην υποβάλλονται άσκοπα στη διαδικασία της συλλογής ωαρίων (Βαλάση 2006, Valasi et al 2006, 2006a, 2007, 2009) 4. Κρυοδιατήρηση εμβρύων Δυο είναι οι βασικές μέθοδοι κατάψυξης των εμβρύων, η συμβατική αργή κατάψυξη και η υαλοποίηση (vitrification). ύμφωνα με την πρώτη μέθοδο, τα έμβρυα εμβαπτίζονται σε υπέρτονα διαλύματα και στη συνέχεια ψύχονται σταδιακά σε ειδικούς καταψύκτες, περίπου μέχρι τους -30 ο C οπότε και εμβαπτίζονται σε υγρό άζωτο (-197 ο C) μέσα στο οποίο συντηρούνται θεωρητικά επ άπειρο. Η μέθοδος της υαλοποίησης δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό. Άρα είναι άμεσα εφαρμόσιμη στην εκτροφή με τα έμβρυα να μπορούν να καταψυχθούν στον τόπο παραγωγής τους. ύμφωνα με αυτή τη μέθοδο τα έμβρυα περνούν διαδοχικά από ισχυρά υπέρτονα διαλύματα μέχρι να αφυδατωθούν καi στη συνέχεια εμβαπτίζονται απευθείας στο υγρό άζωτο. Η ταχύτατη αυτή μέθοδος είναι περισσότερο κατάλληλη για τα ιδιαίτερα κρυοευαίσθητα έμβρυα όπως είναι τα in vitro παραχθέντα έμβρυα ή αυτά που έχουν υποστεί μικροχειρισμούς (Vajta 2000, Massip 2001). 5. Βιοτεχνολογικές μέθοδοι Μολονότι οι μέθοδοι αυτές δεν αποσκοπούν στη γενετική βελτίωση με την κλασική έννοια του όρου, τα αποτελέσματά τους έχουν τεράστιο ενδιαφέρον γιατί ζώα τα οποία έχουν προέλθει από γενετική τροποποίηση μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοαντιδραστήρες παράγοντας στο γάλα τους ουσίες οι οποίες είναι είτε εξαιρετικά δυσεύρετες ή έχουν τεράστιο κόστος 11

παρασκευής. Η τεχνική της άμεσης έγχυσης DNA σε γονιμοποιημένα ωάρια χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή του πρώτου διαγονιδιακού προβάτου που παρήγαγε ανθρώπινο αντι-αιμοφυλικό παράγοντα ΙΦ (Clark et al 1989). τη συνέχεια η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για μια σειρά εφαρμογών. Όμως έγχυση της γονιδιακής κατασκευής είναι δυνατό να καταλήξει σε τυχαία ενσωμάτωση, η οποία τελικά έχει απρόβλεπτα αποτελέσματα όπως: εκτεταμένη καταστροφή και θάνατο του εμβρύου, θανατηφόρες μεταλλάξεις, μη έκφραση του ξένου γονιδίου. Σελικά σε λιγότερο από 1% των ζώων που υφίστανται γενετική τροποποίηση με τη μέθοδο αυτή εκφράζουν το γονίδιο. Η τεχνική βελτιώθηκε σημαντικά με τη σύνδεση της γονιδιακής κατασκευής σε ειδικό φορέα τυο οποίου ο ρόλος είναι να καθοδηγεί το σύμπλοκο ώστε να ενσωματωθεί σε συγκεκριμένο και προβλεπόμενο σημείο (Wilmut & Clark 1990). τη χώρα μας, το πρώτο διαγονιδιακό πρόβατο που παρήγαγε βόεια καζεϊνη-χυμοζίνη στο γάλα δημιουργήθηκε το 1998 (Βαϊνας και συν 1998). Μια πραγματική επανάσταση στο πεδίο των βιολογικών επιστημών αποτέλεσε η δημιουργία της Dolly, του πρώτου κλωνοποιημένου προβάτου από σωματικό κύτταρο (Wilmut et al 1997). Όμως η δημιουργία της Dolly άνοιξε τους ασκούς του Αιόλου με έντονες αντεγκλήσεις σχετικά με τις αναμενόμενες ωφέλειες ή τους πιθανούς κινδύνους που θα μπορούσε να εγκυμονεί εφαρμοσμένη βιοτεχνολογία στην αναπαραγωγή (η μηχανική γενετική όπως ονομαζόταν λίγο παλαιότερα). Πραγματικά η φύση είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη, με πολλά είδη να αλληλοεξαρτώνται και να μοιράζονται την ίδια τροφική αλυσίδα. Η ανησυχία πολλών ερευνητών είναι ότι η εισαγωγή νέων γονιδίων μπορεί να επιφέρει μη ανατρέψιμες αλλαγές με άγνωστες συνέπειες. Σα όρια της βιοηθικής είναι πολύ δύσκολο να προσδιορισθούν, ειδικά όταν θρησκευτικές πεποιθήσεις υπαγορεύουν το βαθμό του παρεμβατικού ρόλου του ανθρώπου στη φύση. Όμως η άλλη όψη του νομίσματος λέει ότι με τις νέες μεθόδους είναι δυνατό να παραχθούν ζώα τα οποία θα έχουν προεπιλεγμένα παραγωγικά χαρακτηριστικά. Υαρμακευτικές ουσίες με χαμηλό κόστος που συμβάλλουν στην πρόληψη και θεραπεία σοβαρών ασθενειών του ανθρώπου παράγονται από διαγονιδιακά ζώα. Διαγονιδιακοί χοίροι παράγουν ήδη συμβατά ανθρώπινα μοσχεύματα, ώστε οι δέκτες τους να μην εξαρτώνται από τη δωρεά, ή το θάνατο του δυνητικού δότη. 12

6. Συμπεράσματα Παρά την αλματώδη πρόοδο στην τυποποίηση μεθόδων υποβοηθούμενης αναπαραγωγής στα μικρά μηρυκαστικά, μόνο η σπερματέγχυση έχει προς το παρόν αποδοχή σε εμπορικό επίπεδο, και αυτό σε χώρες στις οποίες η εκτροφή των ειδών αυτών έχει σημαντική συνεισφορά στην παραγωγικότητα του πρωτογενούς τομέα. Η περιορισμένη εφαρμογή μεθόδων που αφορούν στα έμβρυα οφείλεται στη φύση των τεχνικών αυτών που στοχεύουν μόνο στην κορυφή της πυραμίδας του ΜΟΕΣ. Επιπλέον η σχέση κόστους εμβρύου προς προσδοκώμενο όφελος ίσως ακόμα λειτουργεί αποτρεπτικά για την ευρύτερη αποδοχή των μεθόδων αυτών. Όμως η εξωσωματική παραγωγή εμβρύων ιδιαίτερα από άνηβους δότες- αποτελεί πεδίο μεγάλων προσδοκιών για τη δυνατότητα συνεισφοράς της στην ταχύτατη γενετική βελτίωση των πληθυσμών. Επιπλέον η βελτίωση των επιμέρους τεχνικών της IVP αποτελεί πρόκληση για τους ερευνητές που δραστηριοποιούνται στην κλωνοποίηση και στην δημιουργία διαγονιδιακών ζώων. 13

7. Βιβλιογραφία 1) Amiridis GS et al (2002) Progesterone concentration as an indicator of ovarian response to superovulation in Chios ewes. Theriogenology 57, 1143-1150 2) Amiridis GS et al (2006) Follicle ablation improves the ovarian response and the number of collected embryos in superovulated cows during the early stages of lactation. Reprod. Dom. Animals 41,402-407 3) Amiridis GS, et al (2005) Luteal stage dependence of pituitary response to GnRH in cyclic dairy ewes subjected to synchronization of ovulation. Reproduction Fertility & Development 17,769-774 4) Anel L et al (2003) Field and in vitro assay of three methods for freezinf ram semen. Theriogenology 63, 1235-47 5) Aμοιρίδης Γ και συν (1999) Εφαρμογές της υπερηχογραφίας και της ενδοσκόπησης στην αναπαραγωγή των μηρυκαστικών. 8 ο Πανελ. Κτην υνέδριο Αθήνα 1999 6) Aμοιρίδης Γ και συν. (1998) Λαπαροσκοπική συλλογή και μεταφορά εμβρύων προβάτων της φυλής Φίου. Δελτίον Ελλ. Κτην. Εταιρείας 50.244-249. 7) Baldassarre H et al (1996) In vitro production of sheep embryos using laparoscopic folliculocentesis alternative gonadotrophin treatment for stimulation of oocyte donors. Theriogenology 45, 701-17 8) Bormann CL et al (2003) The effects of vitamins during maturation of caprine oocytes on subsequent development potential in vitro Theriogenology 59,1373-80 9) Buckrell BC et al (1994) Further development of a transcervical technique for artificial insemination in sheep using frozen semen Theriogenology 42,601-611 10) Clark AJ et al (1989) Expression of human anti hemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep. Biol Techn 7,487-92 11) Deligiannis C, et al (2005) Synchronization of ovulation and fixed time intrauterine insemination in ewes Reprod. in Dom.Animals 40,6-10 12) Donovan A et al ( 2004) Fertility in the ewe after cervical insemination with fresh thawed semen at a natural or synchronized oestrus. Anim reprod Sci 884,359-368 14

13) Eppleston J (1994) The depth of cervical insemination and the site of intrauterine insemination and their relationship to the fertility of frozenthawed ram semen. Anim Reprod Sci 36,211-225. 14) Foote RH et al (2002) Motility and fertility of bull sperm in whole milk extender containing antioxidants. Anim Reprod Sci 71,13-23 15) Gardner DK et al (1994) Enhanced rate for cleavage and development for sheep zygotes cultured to the blastocyst stage in vitro in the absence of serum and somatic cells : Amino acids, vitamins, and culturing embryos in groups stimulate development. Biol Reprod 50,390-400 16) Gil J et al (2003) Influence of extender temperature, and addition of glycerol on post thaw sperm parameters of ram semen. Theriogenology 59, 1241-55. 17) Gonzalez-Bulnes et al (2002) Measurements of inhibin and follicular status predict the response of ewes to superovulatory FSH treatments. Theriogenology 57,1263-72 18) Gourley DD & Riese RL (1990) Laparoscopic artificial insemination in sheep. Vet Clin North Amer. Food Anim Prac 6, 615-633 19) Graham JK & Foote RH (1987)effect of several lipids fatty acyl chain length and degree of unsaturation on the motility of bull spermatozoa. Cryobiology 24, 42-52 20) Halbert GW et al (1990) Field evaluation of atechnique for transervical intrauterine insemination in the ewe. Theriogenology 33,1231-43 21) Halbert GW et al (1990b) A technique for transervical intrauterine insemination in ewes. Theriogenology 33, 993-1010 22) Hollishead FK et al (2004) Birth of lambs of a predetermined sex after in vitro production of embryos using frozen-thawed ram spermatozoa Reproduction 127, 557-68 23) Kaabi M (2002) Analysis of factor related to structure, instruments and methods used for the trancervical insemination of the ewe. Doctoral thesis, Veterinary faculty, University of Leon, Spain. 24) Kaabi M et al (2006) Influence of breed and age on morphometry and depth of inseminating catheter penetration in the ewe cervix: a postmortem study. Theriogenology 15

25) Kerton DJ et al (1984) A comparison of insemination techniques in Coridalle ewes. Proc Aus Soc Anim Prod 15, 701 26) King ME et al(2004) Lambing rates and litter sizes following intrauterine or cervical insemination of frozen/thawed semen with or without oxytocin administration. Theriogenology 62,1236-44 27) Ledda Let al (1999) Production and lambing rate of blastocysts derived from in vitromatured oocytes after gonadotropin treatment of prepubertal ewe JAnim Sci 77, 2234-9 28) Lymberopoulos A et al (2001) Fertilization and embryo recovery rates in superovulated Chios ewes following laparoscopic intrauterine insemination Theriogenology 55(9), 1855-62 29) Massip A (2001) Cryopreservation of embryos of farm animals. Reprod Dom Anim 36,49-55 30) O Brien JK et al (1996)Developmental capacity energy metabolism and ultrastructure of mature oocytes from prepubertal and adult ewes Reprod Fertil Dev 8,1026 31) Paulenz H et al 92005) Effect of vaginal and cervical deposition of semen on the fertility of sheep inseminated with frozen-thawed semen. Vet Rec 156, 372-375 32) Scudamore CL et al(1991) Laparoscopy for insemination and embryo recovery ia acommercial embryo transfer unit. Theriogenology 35, 907-14 33) Thompson JG (2000) In vitro culture and embryo metabolism of cattle and sheep embryos a decade of achievement Anim Repr Sci 60/61 263-75 34) Tsiligianni Th. et al. (2009) Effects of melatonin treatment on follicular development and oocyte quality in Chios ewes Acta Vet. Hung 57 331-5 35) Vainas E, et al (2006) Exploitation of embryos collected from Maedi Visna seropositive ewes during eradication programs. Small Rumin Res 62,129-134 36) Vajta G (2000) Vitrification of the oocytes and embryos of domestic animals. Reprod Dom Anim 60/61 357-64 37) Valasi I et al (2006) Age, FSH dose, and follicular aspiration frequency affect oocyte yield from juvenile donor lambs Reprod in Dom Anim 41, 1-8 38) Valasi I et al (2006 a) Oocyte pick-up in juvenile lambs affects neither onset of puberty nor their future fertility. Theriogenology 66, 2144-2151. 16

39) Valasi I et al (2007) Oestradiol concentration as a predictor of ovarian response in FSH stimulated ewe-lambs. Anim.Reprod. Sci 102,1-2,145-151 40) Valasi I et al (2009) The effect of repeated follicular aspiration on the onset of puberty and growth rate of winter or autumn- born lambs. Small Ruminant Research 84,1-3,35-40 41) van Tassel CP & LD van Vleck (1991) Estimates of genetic selection differentiates and generation intervals for four paths of selection. J.Dairy Sci 74,1078 42) Williams HL (1995) Sheep breeding and infertility. In MJ Meredith (ed) Animal breeding and infertility Blackwell Science Ltd, Bodmin, UK. 43) Wilmut I & Clark AJ (1990) Basic techniques for transgenesis J Reprod Fertil Sup 43, 265-75 44) Wilmut I et al (1997) Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells Nature 285, 810-813. 45) Βαϊνάς Ε και συν (1998) Παραγωγή διαγονιδιακών προβάτων: Μικροέγχυση της γονιδιακής κατασκευής Ρ77 (pα s1-καζεΐνη - χυμοζίνη) των βοοειδών σε ζυγωτά - έμβρυα προβάτων φυλής Φίου. Δελτίον Ελλ. Κτην. Εταιρείας 50,138 143. 46) Βαλάση Ε (2006) Αναρρόφηση ωοθυλακίων από νεαρές αμνάδες: μελέτη της ποιότητας των συλλεγόμενων ωαρίων και της αναπαραγωγίκής τους ικανότητας. Διδακτορική Διατριβή, Μαιευτική Κλινική, Σμήμα Κτηνιατρικής, Παν. Θεσσαλίας, Καρδίτσα 47) Λυμπερόπουλος Α και συν (1998) Λαπαροσκοπική ενδομητριαία σπερματέγχυση σε προβατίνες φυλής Φίου μετά από πρόκληση πολλαπλής ωοθυλακιορρηξίας. Δελτίον Ελλ. Κτην. Εταιρείας (1998) 50, 321 325 17

18