ΔΟΜΙΚΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ 3-ΑΡΥΛΟ-ΚΟΥΜΑΡΙΝΩΝ ΜΕ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΚΑΙ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗ ΔΡΑΣΗ Μ. Ρουσσάκη, Σ.Χαμηλάκης, Α. Δέτση Σχολή Χημικών Μηχανικών, Εργαστήριο Οργανικής Χημείας, Ε.Μ.Π., Ηρώων Πολυτεχνείου 9, 157 80 Αθήνα Δ. Χατζηπαύλου-Λίτινα Τομέας Φαρμακευτικής Χημείας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Θεσσαλονίκη 54124 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ως συνέχεια των προηγούμενων ικανοποιητικών αποτελεσμάτων σύνθεσης μιας νέας σειράς 3-αρυλο-κουμαρινικών αναλόγων με συνδυασμένη αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση [1], πραγματοποιήθηκε μια σειρά δομικών τρποποιήσεων των αρχικών παραγώγων προκειμένου να μελετηθούν εκτενέστερα οι σχέσεις δομής-βιολογικής δράσης. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις βρωμίωσης, οξείδωσης και αλκυλίωσης των κουμαρινικών μορίων καθώς και σύνθεση αναλόγων 7- υδροξυ κουμαρινών, σε μια προσπάθεια βελτίωσης της βιοδραστικότητάς τους. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι κουμαρίνες ή αλλιώς βενζοπυρόνες, είναι μια μεγάλη οικογένεια ενώσεων φυσικής και συνθετικής προελεύσεως με πολλαπλές και ποικίλες ιδιότητες. Φυσικά αλλά και συνθετικά ανάλογα κουμαρινών, αναφέρονται ως βιοδραστικές ενώσεις με ευρεία φαρμακολογική δράση όπως σημαντικές αντι-ιικές, αντι-ογκολογικές, αντι-υπερτασικές, αντι-οξειδωτικές, αντι-αρρυθμικές, αντι-φλεγμονώδεις, αντι-οστεοπορωσιακές, αντισηπτικές και αναλγητικές δράσεις [2-5]. Η συνεχώς εμπλουτιζόμενη βιοδραστικότητα των κουμαρινικών αναλόγων, μας οδήγησε στη σύνθεση νέων ενώσεων (Σχήμα 1), που περιέχουν φαινυλο- και αλκυλο-υποκαταστάτες στις θέσεις 3 και 4 του βενζοπυρανικού δακτυλίου, με συνδυασμένη αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση [1]. Σχήμα 1. Κουμαρινικά παράγωγα με συνδυασμένο φαρμακολογικό προφίλ Στα πλαίσια επομένως της παρούσας εργασίας, πραγματοποιήθηκαν δομικές μετατροπές των βιοδραστικών αυτών κουμαρινικών προϊόντων με στόχο τη βελτίωσης της δραστικότητάς τους. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις βρωμίωσης του μεθυλίου της θέσης 4 του βενζοπυρανικού δακτυλίου, μέσω μηχανισμού ελευθέρων ριζών, με χρήση του αζω-δις-
ισοβουτυρονιτριλίου ΑΙΒΝ (azobis-isobutyronitrile) και του Ν-βρωμο-ηλεκτριμιδίου NBS (N-Bromosuccinimide), (Σχήμα 2) η οποία οδήγησε με αρκετά ικανοποιητικές αποδόσεις (50-60%) στα παράγωγα 1-3 της Σειράς Ι. Σχήμα 2. Αντίδραση βρωμίωσης των κουμαρινών (Σειρά Ι). Πειράματα βελτιστοποίησης των συνθηκών των αντιδράσεων βρωμίωσης πραγματοποιήθηκαν αρχικά, χρησιμοποιώντας 1.2eq του Ν-βρωμο- ηλεκτριμιδίου (NBS) και καταλυτική ποσότητα της ρίζας αζω-δις-ισοβουτυρονιτριλίου (AIBN). Τα τελικά προϊόντα, έδειξαν μέσω φασματοσκοπίας NMR, μίγμα του επιθυμητού αλογονοπαραγώγου και του σχηματιζόμενου από την βρωμίωση ηλεκτριμιδίου. Οι τελικές ικανοποιητικές αποδόσεις σε καθαρά προϊόντα, ελήφθησαν ύστερα από αντίδραση ισομοριακών ποσοτήτων κουμαρίνης και Ν-βρωμο- ηλεκτριμιδίου, με 0.10eq αζω-δις-ισοβουτυρονιτριλίου. Η Σειρά ΙΙ που συντέθηκε στη συνέχεια, περιλάμβανε τα παράγωγα 4,5 ύστερα από αντίδραση οξείδωσης (Kornblum oxidation)[6] των αρχικών αλογονοπαραγώγων 2 και 3, παρουσία διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO), σύμφωνα με την γενική αντίδραση που παρουσιάζεται στο Σχήμα 3. Σχήμα 3. Αντίδραση οξείδωσης Kornblum (Σειρά ΙΙ) Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν πειράματα οξείδωσης των κουμαρινών με χρήση όξινου ανθρακικού νατρίου ως βάση, με σχετικά χαμηλές αποδόσεις (20-30%). Η επιλογή στη συνέχεια της τριαιθυλαμίνης, οδήγησε σε σημαντικά ικανοποιητικότερες αποδόσεις (>80%) και απομόνωση των επιθυμητών τελικών προϊόντων χωρίς να απαιτούνται περαιτέρω διεργασίες καθαρισμού. Προκειμένου εν συνεχεία, να μελετηθούν εκτενέστερα οι σχέσεις δομής-δράσης, πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις αλκυλίωσης της 4-υδροξυ-βενζαλδεϋδης από τα βρωμοπαράγωγα 1 και 3. Η Σειρά ΙΙΙ περιλαμβάνει τα παράγωγα 6,7 σύμφωνα με τη γενική αντίδραση του Σχήματος 4.
Σχήμα 4. Αντίδραση αλκυλίωσης 4-υδροξυ-βενζαλδεϋδης (Σειρά ΙΙΙ) Τα προϊόντα των σειρών ΙΙ και ΙΙΙ που σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν, στοχεύουν στη προσπάθεια σύνθεσης νέων αρωματικών αλδεϋδών που θα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πρώτες ύλες για τη σύνθεση υβριδικών χαλκονών, οι οποίες θα διαθέτουν ως δομικό χαρακτηριστικό το βενζοπυρανικό δακτύλιο. Στο πλαίσιο επέκτασης της δομικής τροποποίησης κουμαρινικών αναλόγων, σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν ανάλογα της 7-υδροξυ-κουμαρίνης, η οποία είναι γνωστό ότι εμφανίζει πληθώρα βιολογικών ιδιοτήτων [7]. Ως εκ τούτου, παρασκευάστηκαν οι ενώσεις 8-10, μέσω αντίδρασης συμπύκνωσης του χλωριδίου ενός φαινυλοξικού οξέος, με μια κατάλληλα υποκατεστημένη 2 -υδροξυ-ακετοφαινόνη σε βασικό περιβάλλον, όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 5. Σχήμα 5. Συνθετική πορεία αναλόγων 7-υδροξυ-κουμαρινών Η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός της δομής όλων των νέων μορίων πραγματοποιήθηκε με φασματοσκοπία NMR ( 1 H NMR και 13 C NMR), τα οποία λήφθησαν στο Φασματογράφο NMR Varian Gemini 300 του Εργαστηρίου Οργανικής Χημείας της Σχολής Χημικών Μηχανικών ΕΜΠ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τα νέα παράγωγα 1-4, 6,7, αξιολογήθηκαν για την αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση τους στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Χημείας του Τμήματος Φαρμακευτικής του ΑΠΘ. Τα αποτελέσματα των in vitro βιολογικών δοκιμασιών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Η αξιολόγηση της βιολογικής δράσης των ενώσεων 5 και 8-10, είναι υπό εξέλιξη.
Παράγωγο Πίνακας 1. Αποτελέσματα της in vitro αξιολόγησης της αντιοξειδωτικής και αντιφλεγμονώδους δράσης των νέων μορίων 20min DPPH (%) 100 μm 60min % αναστολή της λιπιδικής υπεροξείδωσης που προκαλείται από τη ρίζα AAPH(100 μm) Αναστολή δράσης του ενζύμου λιποξυγονάση από σόγια IC 50 (μm) (% 100 μm) 1 10 31 79 60 2 28 77 93 69 3 No 14 62 65 4 No 46 24 (27.3) 6 13 Νο 92 (34) 7 28 21 82 47.5 NDGA 84,0 83,0 40 Trolox 63 Ως ένωση αναφοράς για τη μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης με τη μέθοδο του DPPH και τη μελέτη της αντιφλεγμονώδους δράσης μέσω της αναστολής της δράσης του ενζύμου λιποξυγονάση (LOX), χρησιμοποιήθηκε η αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδης ένωση NDGA (Nordihydroguaiaretic acid). Για τη μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης με τη μέθοδο του AAPH, χρησιμοποιήθηκε ως ένωση αναφοράς το Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-carboxylic acid), ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό ανάλογο της βιταμίνης Ε. Τα αποτελέσματα των βιολογικών δοκιμασιών οδήγησαν σε χρήσιμα συμπεράσματα για τη σχέση δομής-βιολογικής δράσης των νέων μορίων. Ως προς την αντιοξειδωτική τους δράση, και συγκεκριμένα στον τρόπο που δρουν έναντι της σταθερής ελεύθερης ρίζας DPPH, στο βρωμοπαράγωγο 2, παρουσία ενός επιπλέον ατόμου Br στον αρωματικό δακτύλιο της κουμαρίνης, παρουσίασε τη βέλτιστη δράση (77%). Η πλειοψηφία των παραγώγων που εξετάστηκαν, αναστέλλουν ικανοποιητικά την λιπιδική υπεροξείδωση που προκαλείται από τη ρίζα AAPH σε ποσοστό μεγαλύτερο του 60%, με το βρωμοπαράγωγο 2 και το αλκυλιωμένο παράγωγο 6 να εμφανίζουν τη βέλτιστη αντιοξειδωτική δράση (>90%). Αναφορικά με την αντιφλεγμονώδη δράση των κουμαρινικών αναλόγων, τα παραγώγα 1-3 εμφάνισαν αξιόλογη αναστολή έναντι της λιποξυγενάσης (IC 50 60μΜ), ενώ το αλκυλιωμένο παράγωγο 7 παρουσίασε τη βέλτιστη αναστολή του ενζύμου (47.5μΜ). Συμπερασματικά, η αντίδραση βρωμίωσης του μεθυλίου της θέσης 4 του κουμαρινικού δακτυλίου, καθώς και η παρουσία ενός αλογόνου (Br) στην 6 θέση, καθιστούν το παράγωγο 2 το βέλτιστο της σειράς, με συνδυασμένη αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Το ενδιαφέρον φαρμακολογικό προφίλ μιας νέας σειράς 3-αρυλο κουμαρινικών αναλόγων προηγούμενης συνθετικής πορείας, μας οδήγησε στην προσπάθεια σύνθεσης δομικά τροποποιημένων παραγώγων, στοχεύοντας στη βελτίωση της βιοδραστικότητας τους. Διευρευνήθηκαν σειρές αντιδράσεων στην 4 θέση του βενζοπυρανικού δακτυλίου των μορίων, καθώς και η σύνθεση 7-υδροξυ κουμαρινικών ενώσεων.
Τα νέα παράγωγα εξετάστηκαν ως προς την αντιοξειδωτική τους δράση με δύο διαφορετικές in vitro μεθόδους (ικανότητα δέσμευσης της δραστικής ρίζας DPPH και APPH) και ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν τη δράση της φυτικής λιποξυγονάσης, ικανότητα που συνδέεται ποιοτικά με την αντιφλεγμονώδη δράση τους. Τα αποτελέσματα των βιολογικών δοκιμασιών οδήγησαν σε συμπεράσματα για τη σχέση δομής-βιολογικής δράσης των νέων μορίων. Από τη μελέτη αυτή προσδιορίστηκαν τα δομικά χαρακτηριστικά νέων παραγώγων που συνδυάζουν ισχυρή αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση και θα χρησιμεύσουν ως μόρια-οδηγοί για την ανάπτυξη νέων πιο αποτελεσματικών βιοδραστικών μορίων αυτής της κατηγορίας. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η υποψήφια διδάκτωρ Μ. Ρουσσάκη ευχαριστεί τον ΕΛΚΕ ΕΜΠ για την υποτροφία για εκπόνηση διδακτορικής διατριβής. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Roussaki Μ., Kontogiorgis C. A., Hadjipavlou-Litina D., Hamilakis S., Detsi A., Bioorg. Med. Chem. Lett., 20, 3889 3892 (2010) [2] Kontogiorgis, C.; Hadjipavlou-Litina, D. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2003, 18,63 69. [3] Spino, C.; Dodier, M.; Sotheeswaran, S. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 3475 3478. [4] Kempen, I.; Papapostolou, D.; Thierry, N.; Pochet, L.; Counerotte, S.; Masereel, B.; Foidart, J. M.; Reboud-Ravaux, M. J.; Noel, A.; Pirotte, B. Br. J. Cancer 2003, 88,1111 1118. [5] Vilar, S.; Quezada, E.; Santana, L.; Uriarte, E.; Yanez, M.; Fraiz, N.; Alcaide, C.;Cano, E.; Orallo, F. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 257 261. [6] Kornblum Ν., Jones W.J., Anderson G.J., J.Am.Chem.Soc., 1959, 81 (15), 4113 4114. [7] Srivastava P., Sharma P.K., Dogra R.C., Microbiol. Res., 154, 1999, 49-55.