113 EEXOT Τόμος 64, (3): 113-112, 2013 Η επίδραση της τεχνικής υπερήχων στην μικροβιολογική διάγνωση των ορθοπαιδικών περιπροθετικών λοιμώξεων Παύλος Χ. Θωμαίδης 1, Ιωάννης Βλάμης 2 Δημήτριος-Στέργιος Ευαγγελόπουλος 1, Αντώνιος Στυλιανάκης 2 1 Μικροβιολογικό Εργαστήριο, ΓΝΑ «ΚΑΤ» 2 3η Πανεπιστημιακή Ορθοπαιδική Κλινική, ΓΝΑ «ΚΑΤ» ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η παρούσα ανασκόπηση αναφέρεται στις περιπροθετικές μικροβιακές λοιμώξεις. Αναλύονται τόσο οι συμβατικές διαγνωστικές μέθοδοι όσο και η νέα τεχνική ταυτοποίησης μέσω υπερήχων. Η νέα αυτή τεχνική αποτελεί μια οικονομική αλλά ιδιαιτέρως αξιόπιστη επιλογή και βελτιώνει σημαντικά την ευαισθησία διαγνώσεως περιπροθετικών λοιμώξεων. Ο συνδυασμός της με νέες μοριακές τεχνικές δύναται να βελτιώσει επιπλέον την ευαισθησία και αποτελεσματικότητα της μεθόδου. Λέξεις-κλειδιά: περιπροθετικές λοιμώξεις ορθοπαιδικές προθέσεις, μικροβιολογική διάγνωση, τεχνική υπερήχων, PCR ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η σύγχρονη ιατρική βιοτεχνολογία έχει αναπτύξει ποικιλία νέων ορθοπαιδικών υλικών προκειμένου να προσομοιώσει την επιτέλεση φυσιολογικών λειτουργιών και κινήσεων. Ο αριθμός των ορθοπαιδικών εμφυτευμάτων χάρη και στην αύξηση του προσδόκιμου επιβίωσης αυξάνεται ιδιαίτερα στον αυξανόμενο πληθυσμό της τρίτης ηλικίας 1-5. Στην αύξηση του αριθμού της εφαρμογής των εμφυτευμάτων επέδρασε καθοριστικά η σημαντική μείωση της συχνότητας των λοιμώξεων από εμφυτεύματα συγκριτικά με την εποχή που εφαρμόστηκαν αρχικά. Στην επίτευξη αυτή συνέβαλαν οι σύγχρονες χειρουργικές τεχνικές, η προφυλακτική αντιμικροβιακή αγωγή, η βελτίωση των βιοϋλικών Διεύθυνση αλληλογραφίας: Δημήτριος-Στέργιος Ευαγγελόπουλος 3 η Πανεπιστημιακή Ορθοπαιδική Κλινική, ΓΝΑ «ΚΑΤ» E-mail: ds.evangelopoulos@gmail.com των προθέσεων, η βελτίωση των συνθηκών πρόληψης επιμολύνσεων εντός του χειρουργείου, η καταλληλότερη επιλογή ασθενών και η βελτίωση στη μετεγχειρητική παρακολούθησή τους 6. Παρ όλα αυτά, ο κίνδυνος για λοιμώξεις αυξάνει όσο περισσότερο παραμένει το εμφύτευμα στον ασθενή που έχει χειρουργηθεί, γιατί η πιθανότητα μόλυνσης μετά την εμφύτευση υφίσταται διαρκώς, από μια απομακρυσμένη εστία διά μέσου της αιματογενούς οδού. Εάν επιπλέον ληφθεί υπόψη ότι ο χρόνος παραμονής των προθέσεων αυξάνεται λόγω και του υψηλότερου προσδόκιμου επιβίωσης που έχει επιτευχθεί, οι λοιμώξεις από εμφυτεύματα αναμένεται να αυξάνονται συνεχώς και σημαντικά τις επόμενες δεκαετίες. Ο κίνδυνος πρόκλησης λοίμωξης από εμφυτεύματα μειώθηκε διαχρονικά, αλλά δεν εξαφανίστηκε. Σε μελέτη των Darouiche et al στις ΗΠΑ, ο κίνδυνος πρόκλησης λοίμωξης για τις κυριαρχούσες ποσοτικά εσωτερικές οστεοσυνθέσεις κυμαίνεται από 5-10% και για τις αρθροπλαστικές 1-3% 2. Ο ρόλος της βιομεμβράνης είναι κρίσιμος για την παθογένεση των λοιμώξεων από εμφυτεύματα. Η βιομεμβράνη είναι μία τρισδιάστατη δομή αποτελούμενη από μία ενυδατωμένη θεμέλιο ουσία και μικροοργανισμούς οργανωμένους εντός πολύπλοκων κοινωνιών προσκολλημένων στην επιφάνεια του εμφυτεύματος. Αποτελεί ένα βασικό μηχανισμό επιβίωσης των βακτηρίων έναντι αντιμικροβιακών παραγόντων, εχθρικού μεταβολικού περιβάλλοντος και του αμυντικού συστήματος του ξενιστή. Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο αιτιολογικός παράγοντας της περιπροθετικής λοίμωξης μπορεί να εδράζεται αποκλειστικά στην επιφάνεια της πρόθεσης και να συγκεντρώνεται εντός της βιομεμβράνης, η διάγνωση της περιπροθετικής λοίμωξης χρησιμοποιώντας συμβατικές καλλιέργειες του λαμβανομένου διεγχειρητικά περιπροθετικού ιστού ειναι πρακτικά αδύνατη. Γι αυ-
114 E.E.X.O.T., Τόμος 64, Τεύχος 3, 2013 ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΠΕΡΙΠΡΟΘΕΤΙΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Η διάγνωση των περιπροθετικών λοιμώξεων βασίζεται στην κλινικιή εξέταση, σε ιστοπαθολογική, μικροβιολογκή και απεικονιστικές (αναλύσεις) εξετάσεις. Εικόνα 1: container τό κι ένα σημαντικό ποσοστό των άσηπτων χαλαρώσεων (7 18%) είναι πραγματικά μικροβιακής αιτιολογίας 15,17. Επιπρόσθετα είναι δύσκολη η διάγνωση της περιπροθετικής λοίμωξης όταν συνεχίζεται η χορήγηση εμπειρικής αντιμικροβιακής αγωγής 7,19. Επίσης, εξαιτίας επιμολύνσεων παρατηρούνται ψευδώς θετικά αποτελέσματα, τα οποία καθιστούν περίπλοκη την τελική διάγνωση 21. Η υπερήχηση των ασήπτως εξαχθεισών προθέσεων είναι μία νέα μέθοδος που εφαρμόζεται για να διευκολύνει τη διάγνωση των περιπροθετικών λοιμώξεων. Με την εφαρμογή υπερήχων χαμηλής συχνότητας τα βακτήρια της βιομεμβράνης απελευθερώνονται σε ένα υδατικό διάλυμα. Έτσι δημιουργείται ένα νέο υπό εξέταση δείγμα εμπλουτισμένο με βακτήρια της βιομεμβράνης, το υγρό υπερήχησης, που καλλιεργείται με τις συμβατικές μικροβιολογικές μεθόδους 18,19. ΕΙΔΗ ΠΕΡΙΠΡΟΘΕΤΙΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΚΑΙ ΣΥΧΝΟΤΕΡΕΣ ΟΜΑΔΕΣ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ ΠΟΥ ΤΙΣ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ Οι περιπροθετικές λοιμώξεις διακρίνονται χρονικά στην πρώιμη μετεγχειρητική λοίμωξη, στην όψιμη χρόνια και στην όψιμη αιματογενή. Η πρώιμη μετεγχειρητική λοίμωξη εμφανίζεται τους 3 πρώτους μήνες από την τοποθέτηση της πρόθεσης και προκαλείται πιο συχνά από Staphylococcus aureus και στρεπτοκόκκους. Η όψιμη χρόνια είναι συνήθως χαμηλής έντασης λοίμωξη, εμφανίζεται μετά τους πρώτους 3 μήνες από την επέμβαση έως και 2 έτη και προκαλείται συνήθως από κοαγκουλάση-αρνητικούς σταφυλοκόκκους (CNS) και αναερόβια βακτήρια. Η όψιμη αιματογενής εμφανίζεται μετά τα 2 έτη από την επέμβαση και προκαλείται συνήθως από S. aureus και Escherichia coli προερχόμενα από μια απομακρυσμένη εστία λοίμωξης διά μέσου της αιματογενούς οδού. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Ο αριθμός και ο τύπος των λευκών αιμοσφαιρίων, η C-αντιδρώσα πρωτεϊνη (CRP), η ταχύτητα καθίζησης των ερυθρών αιμοσφαιρίων (ΤΚΕ), οι οποίες συνιστάται να μετρώνται αλλά είναι μη ειδικές. Η προκαλσιτονίνη (PCT), η οποία έχει υψηλή ειδικότητα (98%) αλλά χαμηλή ευαισθησία (33%) 3, ενώ η ιντερλευκίνη-6 δεν έχει καθιερωθεί 4. Οι ανωτέρω εξετάσεις συνιστώνται να εκτελούνται, αλλά η συμβολή τους στην ορθή διάγνωση είναι περιορισμένη. Οι αιμοκαλλιέργειες είναι συχνά αρνητικές λόγω προηγηθείσας χορήγησης εμπειρικής αντιμικροβιακής θεραπείας 5. Η μέτρηση του αριθμού και τύπου των λευκών αιμοσφαιρίων στη γενική εξέταση του αρθρικού υγρού βοηθά στην εξακρίβωση μιας σηπτικής ή άσηπτης κατάστασης 6. Η καλλιέργεια του αρθρικού υγρού έχει χαμηλή ευαισθησία (55%) 5 λόγω του εγκλωβισμού των μικροοργανισμών στη βιομεμβράνη. Η καλλιέργεια του περιπροθετικού ιστού αποτελεί τη μέθοδο αναφοράς 5. Πρέπει να σημειωθεί ότι στο 60-70% των ιστικών δειγμάτων με τεκμηριωμένη λοίμωξη αναπτύσσονται μικροοργανισμοί κατά την καλλιέργεια. Επίσης, είναι δύσκολη η διάκριση μεταξύ λοίμωξης και επιμόλυνσης λόγω της ομοιότητας των μικροοργανισμών που προκαλούν τις περιπροθετικές λοιμώξεις με αυτούς της φυσιολογικής χλωρίδας του δέρματος. Για τη διάκριση της λοίμωξης από την επιμόλυνση απαιτείται η λήψη μεγάλου αριθμού περιπροθετικών ιστικών δειγμάτων, τουλάχιστον 5, από περιοχές του οστού που οπτικά φλεγμαίνουν, γιατί όταν σε ένα δείγμα αναπτύσσεται κάποιος μικροοργανισμός τότε η πιθανότητα ψευδώς θετικού αποτελέσματος ανέρχεται στο 30%, ενώ η ανάπτυξη του ίδιου μικροοργανισμού σε 5 δείγματα περιορίζει την πιθανότητα ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων σε <5%. Σε ανάπτυξη του ίδιου μικροοργανισμού σε >2 δείγματα, η ευαισθησία της μεθόδου αναφοράς ανέρχεται στο 71% και η ειδικότητα στο 97% 6. Αλλά, ο λάθος δειγματισμός, ο ανεπαρκής αριθμός των ιστικών δειγμάτων, το μικρό μικροβιακό φορτίο που δεν καλλιεργείται στα θρεπτικά μέσα, η προηγηθείσα εμπειρική αγωγή και η ανάπτυξη του μικροβίου εντός της βιομεμβράνης σημαντικά μειώνουν την ευαισθησία της μεθόδου αναφοράς να οδηγήσει στην ορθή διάγνωση. Η ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΩΝ ΥΠΕΡΗΧΩΝ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΠΕΡΙΠΡΟΘΕΤΙΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Οι Trampuz και συν. μελέτησαν και καθιέρωσαν τη χρήση χαμηλής έντασης και συχνότητας υπερήχων για την αποκόλληση των μικροβίων εμπεδωμένων στη βιομεμβράνη (προσκολλημένη μορφή) άσηπτα (διεγχειρητικά) απομα-
Η επίδραση της τεχνικής υπερήχων 115 κρυθέντων ορθοπαιδικών προθέσεων εντός υδατικού διαλύματος δημιουργώντας το υγρό υπερήχησης 18, τα οποία μετά από καλλιέργειά τους στα διάφορα, θρεπτικά υλικά μετατρέπονται σε ελεύθερη (πλαγκτονική) μορφή επανακτώντας σταδιακά το φυσιολογικό τους φαινότυπο 6,7. Η επίδραση των υψηλής συχνότητας (>100 khz) και ακουστικής έντασης υπερήχων στους μικροοργανισμούς έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή των μικροοργανισμών, ιδιαίτερα των Gram-αρνητικών βακτηρίων. Όταν όμως επιδρούν υπέρηχοι χαμηλής συχνότητας (20-100 khz) στα πρώτα 5 min, δεν υπάρχει σημαντική επίδραση στη βιωσιμότητα των μικροβίων. Μάλιστα, έχει παρατηρηθεί ότι αναπτύσσονται οι Gram-θετικοί κόκκοι πιο εύκολα γιατί καταστρέφονται οι συσσωματώσεις τους ή διασπώνται οι άλυσοί τους, με αποτέλεσμα να αυξάνεται η επιφάνειά τους κι έτσι μπορούν να προσλαμβάνουν περισσότερα θρεπτικά στοιχεία 8. Υπέρηχοι μπορούν να εφαρμοστούν στα ορθοπαιδικά εμφυτεύματα (ενδοπροθέσεις αρθρώσεων, σύνδεσμοι εσωτερικής οστεοσύνθεσης) που άσηπτα απομακρύνονται. Δείγματα τα οποία δεν μπορούν να ελεγχθούν με τη χρήση υπερήχων είναι γενικά βιολογικοί ιστοί, όπως οστικά τεμάχια (π.χ. απολύματα), μαλακά μόρια κ.λπ. Ο κίνδυνος από ενδεχόμενες επιμολύνσεις που μπορεί να συμβούν κατά την τοποθέτηση και μεταφορά των δειγμάτων είναι υπαρκτός. Γι αυτό θα πρέπει να αποφεύγεται η χρήση σάκων για τη μεταφορά των εμφυτευμάτων γιατί έχουν ενοχοποιηθεί για υψηλό κίνδυνο επιμολύνσεων 9. Είναι επιβεβλημένη η χρήση δοχείων τα οποία κλείνουν αεροστεγώς, είναι κατασκευασμένα από προπυλένιο κι έτσι μπορούν να επαναποστειρωθούν με το πέρας των χειρισμών (Εικόνα 1). Εντός των συγκεκριμένων δοχείων, το δείγμα διατηρείται για 3 ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου. Επισημαίνεται ότι όλες οι διαδικασίες χειρισμού του δείγματος πρέπει να λαμβάνουν χώρα εντός θαλάμου βιοασφάλειας (νηματικής ροής). Όταν το εμφύτευμα είναι μικρού μεγέθους, καλύπτεται εντός του ειδικού δοχείου μεταφοράς πλήρως με διάλυμα Ringer ή 0,9% NaCl. Όταν το εμφύτευμα είναι μεγάλου μεγέθους, τότε πρέπει να καλύπτεται το 80-90% του εμφυτεύματος με ένα από τα προαναφερθέντα διαλύματα κι αυτό για να αποφεύγεται η μεγάλη αραίωση του μικροβιακού φορτίου που απελευθερώνεται από τη βιομεμβράνη. Ακολουθεί έντονη χειρωνακτική ή μηχανική (vortex) ανακίνηση για 30 sec περίπου του κλειστού δοχείου με το εμφύτευμα και το διάλυμα, γιατί με τη μερική απαέρωση του διαλύματος που έτσι επιτυγχάνεται οι υπέρηχοι θα είναι πιο αποτελεσματικοί στη δράση τους. Κατόπιν τοποθετείται το δοχείο σε ειδικό υδατόλουτρο όπου γίνεται εφαρμογή των υπερήχων, συχνότητας 35-40 khz για 1 min (Εικόνα 2). Ακολουθεί νέα έντονη ανακίνηση για 30 sec περίπου, όπως προηγουμένως, προκειμένου να αποκολληθούν οι υπολειπόμενοι εμπεδωμένοι μικροοργανισμοί της βιομεμβράνης. Έτσι, δημιουργείται ένα νέο δείγμα, το οποίο είναι ένα εμπλουτισμένο υγρό με τους αποκολλημένους μικροοργανισμούς της βιομεμβράνης ή υγρό εμπλουτισμένο με τη χρήση των υπερήχων ή υγρό υπερήχησης (sonication fluid). Εικόνα 2: συσκευή sonication Το διάλυμα Ringer αλλά και ο στείρος φυσιολογικός ορός είναι κατάλληλα για την εφαρμογή των υπερήχων, γιατί τα μικρόβια ή οι μύκητες της βιομεμβράνης επιβιώνουν αλλά δεν πολλαπλασιάζονται εντός των διαλυμάτων. Αυτό πιθανόν να επηρεάζει τη βιωσιμότητα ορισμένων μικροβίων, τα οποία είναι περισσότερο ευαίσθητα σε αλλαγές του ph. Γι αυτό και προτιμότερη είναι η χρήση του διαλύματος Ringer στην κατεργασία του εμφυτεύματος με τους υπερήχους. Στο εμπλουτισμένο υγρό με τα βακτήρια της βιομεμβράνης μπορούν να εφαρμοστούν (α) οι συμβατικές μέθοδοι μικροβιολογικής διάγνωσης (καλλιέργεια του υγρού, ταυτοποίηση των απομονώσεων και έλεγχος ευαισθησίας στους διάφορους αντιμικροβιακούς παράγοντες), (β) μοριακές τεχνικές, καθώς και (γ) να χρησιμοποιηθεί το νέο δείγμα μας στη βασική έρευνα (π.χ. για έλεγχο της έκφρασης γονιδίων από βακτήρια που διαβιούν εντός της βιομεμβράνης). Όλα τα δείγματα θα πρέπει να χειρίζονται εντός θαλάμου βιοασφάλειας σε, κατά το δυνατόν, άσηπτες συνθήκες για την αποφυγή επιμολύνσεων. Πριν από την καλλιέργεια του υγρού υπερήχησης να γίνεται μεταφορά 10mL υγρού σε αποστειρωμένο σωληνάριο τύπου Falcon για πιθανή χρήση του σε μοριακές τεχνικές.η Gram χρώση του εμπλουτισμένου υγρού έχει υψηλή ειδικότητα (100%) αλλά δεν συνιστάται εξαιτίας της χαμηλής ευαισθησίας της (44,7%) 6. Η ποσοτική καλλιέργεια του δείγματος αναφέρεται στο ακόλουθο πρωτόκολλο: Ενοφθαλμισμός 100μl υγρού υπερήχησης: Blood agar: αερόβια στους 37 0 C για 5 ημέρες Anaerobic sheep blood agar: αναερόβια στους 37 0 C για 7 ημέρες Chocolate agar: 5% CO 2 στους 37 0 C για 5 ημέρες Brucella agar: 5% CO 2 στους 37 0 C για 10 ημέρες Ενοφθαλμισμός 3-4ml υγρού υπερήχησης σε: Thioglycolate broth: στους 37 0 C για 10 ημέρες
116 Εάν δεν παρατηρηθεί κάποια ανάπτυξη στα τρυβλία, τότε ο θειογλυκολικός ζωμός ανακαλλιεργείται σε Blood και Brucella agar. Τα τρυβλία ελέγχονται καθημερινά για μικροβιακή ανάπτυξη. Εάν παρατηρηθεί ανάπτυξη, αναφέρεται ο αριθμός CFU κάθε διαφορετικής μορφολογίας και ακολουθεί ταυτοποίηση και έλεγχος ευαισθησίας με τις μεθόδους που έχει επιλέξει το κάθε εργαστήριο. Η αναφορά αποτελεσμάτων γίνεται ποσοτικά. Ο αριθμός των CFU ανά τρυβλίο πολλαπλασιάζεται επί 10 και το αποτέλεσμα εκφράζεται ως CFU/mL εμπλουτισμένου υγρού. ΟΡΙΑ ΘΕΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΟΥ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΟΣ Ως θετικό θεωρείται κάθε αποτέλεσμα 10 CFU/mL (optimal cut-off ). Σύμφωνα με μελέτη των Trampuz et al 9 τα όρια θετικότητας σε καλλιέργεια εμπλουτισμένου υγρού με υπερήχους που προέρχεται από ορθοπαιδικές προθέσεις θα πρέπει να είναι 50 CFU/mL (ideal cut-off), γιατί είναι σημαντικότερη για τη διάγνωση της περιπροθετικής λοίμωξης η αύξηση της ειδικότητας της μεθόδου -φθάνει στο 98,8%- από τη σχετικά μικρή μείωση της ευαισθησίας, η οποία φθάνει στο 78,5% 6. Η συγκέντρωση 50 CFU/mL είναι συνήθως σημαντική 9. Συγκέντρωση 10-40 CFU/mL πρέπει να συνεκτιμηθεί με βάση την κλινική κατάσταση του ασθενούς. Εάν μόνον ο θειογλυκολικός ζωμός είναι θετικός, το αποτέλεσμα είναι συνήθως μη σχετικό και εξαιρείται. Πιθανή επιμόλυνση κατά το χειρισμό του δείγματος (λήψη, μεταφορά, επεξεργασία). Η καλλιέργεια του εμπλουτισμένου υγρού υπερήχησης έχει παρόμοια ειδικότητα (98% έναντι 95,1%) αλλάμεγαλύτερη ευαισθησία (66,7%) συγκριτικά με την καλλιέργεια του αντίστοιχου περιπροθετικού ιστού (54,5%) σε αρθροπλαστικές της κατ ώμου άρθρωσης 11. Επίσης, η καλλιέργεια του υγρού υπερήχησης υπερέχει σημαντικά ως προς την ευαισθησία έναντι της μεθόδου αναφοράς (καλλιέργεια του αντίστοιχου περιπροθετικού ιστού) όταν η διακοπή της αντιμικροβιακής αγωγής είναι <14 ημερών. Επιπρόσθετα, προκύπτουν σχετικά ταχέα αποτελέσματα (1 έναντι 3 ημερών με τις περιπροθετικές ιστικές καλλιέργειες) και πραγματοποιείται ευκολότερα η ανίχνευση πολυμικροβιακών λοιμώξεων και η απομόνωση σχετικά δύσκολα απομονούμενων βακτηρίων, όπως π.χ. είδη Propionibacterium κ.ά. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ ΤΩΝ ΥΠΕΡΗΧΩΝ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ 1. δεν μπορούν να ελεγχθούν με τους υπερήχους βιολογικά δείγματα, όπως οστικά τεμάχια (π.χ. απολύματα) ή μαλακά μόρια. 2. Μεγάλα σε μέγεθος εμφυτεύματα δεν είναι δυνατόν να τοποθετηθούν και να κατεργαστούν εντός των αεροστεγώς κλεισμένων και αποστειρωμένων δοχείων εξ αιτίας του μεγέθους τους. 3. Εάν υπάρχει ιστός προσκολλημένος πάνω στο εμφύτευμα κατά την κατεργασία του με τους υπερήχους, αυξάνεται ο κίνδυνος επιμόλυνσης. E.E.X.O.T., Τόμος 64, Τεύχος 3, 2013 4. Μερικές φορές μπορεί να παρουσιαστεί δυσκολία στην ταυτοποίηση βακτηριακών ειδών λόγω ύπαρξης αποικιών με (i) διαφορετικές μορφολογίες, πιθανόν λόγω της αλλαγής από τη φάση της στασιμότητας των βακτηρίων που ανευρίσκονται εντός της βιομεμβράνης στη φάση της ανάπτυξης κατά την καλλιέργεια στα καλλιεργητικά υλικά, (ii) διαφορετικές βιοχημικές αντιδράσεις και διαφορετική κινητικότητα, αφού διαφορετικά γονίδια εκφράζονται στα βακτήρια εντός της βιομεμβράνης σε σύγκριση με τα βακτήρια που απαντώνται σε πλαγκτονική μορφή. Το ανωτέρω πρόβλημα μπορεί να ξεπεραστεί σχετικά εύκολα στο εργαστήριο με ανακαλλιέργειες των βακτηρίων, γιατί έτσι οι μικροοργανισμοί επανέρχονται στο φυσικό τους φαινότυπο και επανακτούν την κινητικότητα και τις κυριότερες βιοχημικές ιδιότητές τους σε μεγάλο βαθμό. Μέθοδος αναφοράς για την αντιμετώπιση του ανωτέρω μειονεκτήματος είναι η αλληλούχηση του 16S rdna του βακτηρίου με πιθανές κάποιες πρόσθετες εξετάσεις (π.χ.συγκολλητινοαντίδραση για τη διάκριση μεταξύ των αλληλουχιών των ειδών E. coli και Shigella) 10. ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Οι μοριακές τεχνικές δεν έχουν ακόμη καθιερωθεί ως μέθοδοι αναφοράς στη διαγνωστική προσέγγιση των σχετιζομένων με εμφυτεύματα λοιμώξεων, αλλά σίγουρα στο μέλλον θα έχουν πιο ευρεία χρήση 18,19. Ακολουθεί μια συνοπτική κριτική προσέγγιση της εφαρμογής των εν λόγω μεθόδων σε συνδυασμό με εμπλουτισμένα δείγματα υγρού υπερήχησης αναφορικά με τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά τους, καθώς και τις πιθανές εφαρμογές ή βελτιώσεις που θα πρέπει να αποκτήσουν: Η απλή ή ειδική PCR έχει υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία ανιχνεύοντας μόνο ένα είδος μικροοργανισμού. Γι αυτό και είναι δύσκολη η εφαρμογή της στη διάγνωση πολυμικροβιακών λοιμώξεων, όπως πολύ συχνά συμβαίνει με τις περιπροθετικές λοιμώξεις Η ευρέος φάσματος PCR (broad range PCR) εμφανίζει σημαντικά μειονεκτήματα στη διάγνωση των περιπροθετικών λοιμώξεων: (α) Έχει μικρότερη ευαισθησία (50%) και ειδικότητα από την PCR 12 (β) απαιτεί την ανεύρεση της αλληλουχίας του 16S rdna, γεγονός που καθιστά αναγκαία τη διαθεσιμότητα και της απαιτούμενης υψηλής τεχνολογίας υλικοτεχνικής υποδομής (π.χ. automated sequencers κλπ.), (γ) ανιχνεύει μολυσματικούς παράγοντες οι οποίοι ανήκουν στο ίδιο είδος μικροοργανισμών που προκαλούν χαμηλής έντασης λοιμώξεις (low grade infections), όπως συμβαίνει σε υψηλό ποσοστό στις περιπροθετικές λοιμώξεις. (δ) Επιπρόσθετο εγγενές μειονέκτημα της ανωτέρω μεθόδου είναι η δυσκολία διάκρισης αληθώς και ψευδώς θετικών ευρημάτων PCR 13,14 και (ε) η αποτυχία ανίχνευσης μεικτών λοιμώξεων. Η ανωτέρω τεχνική πιθανόν θα μπορούσε να εφαρμοστεί σε αρνητικές καλλιέργειες εμπλουτισμένων υγρών υπερήχησης 15. H εφαρμογή σε δείγματα εμπλουτισμένου υγρού υπε-
Η επίδραση της τεχνικής υπερήχων 117 ρήχησης μιας πραγματικού χρόνου πολυπλεκτικής PCR (multiplex real time PCR), σχεδιασμένης να ανιχνεύει και να ταυτοποιεί τα 25 σημαντικότερα είδη βακτηρίων και μυκήτων που προκαλούν μικροβιαιμίες (υπάρχουν διαθέσιμα συστήματα του εμπορίου), αυξάνει την ευαισθησία (78%) συγκριτικά με την αντίστοιχη ευαισθησία της καλλιέργειας του εμπλουτισμένου υγρού (62%) ή της καλλιέργειας περιπροθετικού ιστού (65%) σε ασθενείς που ελάμβαναν αντιμικροβιακή αγωγή 16. Το μειονέκτημα της ανωτέρω μοριακής τεχνικής είναι ότι δεν ανιχνεύει μικρόβια όπως το Propionibacterium acnes, είδη Corynebacterium και Peptostreptococcus ή τη Finegoldia magna, που εμπλέκονται στις περιπροθετικές λοιμώξεις. Η τροποποίηση του σχεδιασμού της ανωτέρω μοριακής τεχνικής έτσι ώστε να περιλαμβάνει και εκκινητές (primers) που να ανιχνεύουν τα αναφερόμενα μικρόβια θα μπορούσε να αυξήσει ακόμη περισσότερο την ευαισθησία της μεθόδου και να βελτιώσει τη δυνατότητα της μικροβιολογικής διάγνωσης των περιπροθετικών λοιμώξεων 16. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η εφαρμογή των υπερήχων χαμηλής συχνότητας (35-40 KHZ) και ακουστικής έντασης βελτιώνει τη μικροβιολογική διάγνωση των περιπροθετικών λοιμώξεων. Η καλλιέργεια του υγρού υπερήχησης είναι πιο ευαίσθητη και ειδική συγκριτικά με τη συμβατική μέθοδο των καλλιεργειών του περιπροθετικού ιστού, μειώνοντας τα ψευδώς αρνητικά ποσοστά. Γι αυτό η συγκεκριμένη διαγνωστική μέθοδος είναι πιο ικανή στο να διακρίνει τις άσηπτες χαλαρώσεις από τις περιπροθετικές λοιμώξεις. Η καλλιέργεια του υγρού υπερήχησης αποτελεί μια μη δαπανηρή, απλή, εύχρηστη, ποσοτική μέθοδο, η οποία υπερβαίνει τα προβλήματα των επιμολύνσεων που δυσχεραίνουν την εργαστηριακή διάγνωση των περιπροθετικών λοιμώξεων. Η ορθή εφαρμογή της μεθοδολογίας των υπερήχων αποτελεί προϋπόθεση για την επιτυχή χρήση τους στη μικροβιολογική διάγνωση των περιπροθετικών λοιμώξεων ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Andrej Trampuz and Andreas F. Widmer Infections associated with orthopedic implants Curr Opin Infect Dis 2006 Aug;19(4):349-56. 2. Darouiche RO. Device-associated infections: a macroproblem that starts with microadherence Clin Infect Dis. 2001; 33(9):1567-1572. 3. Bilgen O, Atici T, Durak K, Karaeminogullari, Bilgen MS. C-reactive protein values and erythrocyte sedimentation rates after total hip and total knee arthroplasty. J Int Med Res. 2001,29(1):7-12. 4. Bottner F, Wegner A, Winkelmann W, Becker K, Erren M, Götze C. Interleukin-6, procalcitonin and TNF-alpha: markers of periprosthetic infection following total joint replacement. J Bone Joint Surg Br. 2007, 89(1):94-99. 5. Pavoni GL, Giannella M, Falcone M, Scorzolini L, Liberatore M, Carlesimo B, et al. Conservative medical therapy of prosthetic joint infections: retrospective analysis of an 8-year experience. Clin Microbiol Infect 2004, 10(9):831-837. 6. National Standard Methods, Investigation of Prosthetic Joint Infections Samples, bsop44 Issue No:1.1, Issue date: 11.12.09. 7. Trampuz A, Piper KE, Jacobson MJ, Hanssen AD, Unni KK, Osmon DR, et al. Sonication of removed hip and knee prostheses for diagnosis of infection. N Engl J Med 2007, 357; 654-657. 8. Monsen Τ, Lövgren E, Widerström M, and Wallinder L. In vitro effect of ultrasound on bacteria and suggested protocol for sonication and diagnosis of prosthetic infections J Clin Microbiol, 2009; 2496-2501. 9. Trampuz A, Piper KE, Hanssen AD, Osmon DR, Cockerill FR, Steckelberg JM, et al. Sonication of explanted prosthetic components in bags for diagnosis of prosthetic joint infections is associated with risk of contamination. J Clin Microbiol, 2006, 44(2):628-631. 10. Sendi P, Frei R, Maurer TB, Trampuz A, Zimmerli W, Graber P. Escherichia coli Variants in Periprosthetic Joint Infections: Diagnostic challenges with sessile bacteria and Sonication. J Clin Microbiol. 2010, 48(5):1720-1725. 11. Piper KE, Jacobson MJ, Cofield RH, Sperling JW, Sanchez-Sotelo J, Osmon DR et al. Microbiologic diagnosis of prosthetic shoulder infection by use of implant sonication. J Clin Microbiol. 2009, 47(6):1878-1884. 12. De Man FH, Graber P, Lüem M, Zimmerli W, Ochsner PE, Sendi P. Broad-range PCR in selected episodes of prosthetic joint infections. Infection 2009;37:292-294. 13. Borst A, Box AT, Fluit AC. False-positive results and contamination in nucleic acid amplification assays: suggestions for a prevent and destroy strategy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2004;23:289 299. 14. Corless CE, Guiver M, Borrow R, Edwards-Jones V, Kaczmarski EB, Fox AJ. Contamination and sensitivity issues with a real-time universal 16S rrna PCR. J Clin Microbiol. 2000;38:1747 1752. 15. Nelson CL, McLaren AC, McLaren SG, Johnson JW, and Meltzer MS. Is aseptic loosening truly aseptic? Clin. Orthop. Relat. Res. 2005, 437:25-30. 16. Achermann Υ, Vogt Μ, LeunigΜ, Wust J, and Trampuz A. Improved diagnosis of periprosthetic joint infection by multiplex PCR of sonication fluid from removed implants J Clin Microbiol. Apr. 2010, p. 1208 1214. 17. Javad Parvizi, MD, FRCS, Dong-Hun Suh, MD, [...], and James J. Purtill, MD Aseptic Loosening of Total Hip Arthroplasty: Infection Always Should be Ruled Out Clin Orthop Relat Res. 2011 May; 469(5): 1401 1405. 18. Gomez E, Cazanave C, Cunningham SA, Greenwood-Quaintance KE, Steckelberg JM, Uhl JR, Hanssen AD, Karau MJ, Schmidt SM, Osmon DR, Berbari EF, Mandrekar J, Patel R. Prosthetic joint infection diagnosis using broad-range PCR of biofilms dislodged from knee and hip arthroplasty surfaces using sonication. J Clin Microbiol. 2012 Nov;50(11):3501-8. 19. Portillo ME, Salvadό M, Sorli L, Alier A, Martίnez S, Trampuz A, Gόmez J, Puig L, Horcajada JP. Multiplex PCR of sonication fluid accurately differentiates between prosthetic joint infection and aseptic failure. J Infect. 2012 Dec;65(6):541-8. 20. Barrack RL, Harris WH. The value of aspiration of the hip joint before revision total hip arthroplasty. J Bone Joint Surg Am.1993;75:66 76. 21. Parvizi J, Ghanem E, Sharkey P, Aggarwal A, Burnett RSJ, Barrack RL. Diagnosis of infected total knee: findings of a multicenter database. Clin Orthop Relat Res 2008; 466:2628-2633.