Έλεγχος της ποιότητας και μέτρηση της συγκέντρωσης των νουκλεϊκών οξέων

Κεφάλαιο 6 Έλεγχος της ποιότητας και μέτρηση της συγκέντρωσης των νουκλεϊκών οξέων Γ. Παπανικολάου και Δ. Παλαιολόγου Περίληψη Η καθαρότητα, η ποιότητα και η συγκέντρωση των διαλυμάτων των νουκλεϊκών οξέων αξιολογούνται με τη βοήθεια μεθόδων όπως η φασματοφωτομετρία υπεριώδους, η φασματοφθορισμομετρία και σε ορισμένες περιπτώσεις η ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων. Στο πρακτικό μέρος της άσκησης γίνεται ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του DNA που απομονώθηκε σε προηγούμενη άσκηση και προετοιμάζεται ένα διάλυμα εργασίας καθορισμένης συγκέντρωσης DNA. Προαπαιτούμενη γνώση Ικανότητα χειρισμού ρυθμιζόμενης μικροπιπέττας και εξοικείωση με τους υπολογισμούς συγκέντρωσης των διαλυμάτων. 6.1 Θεωρητικό μέρος 6.1.1 Εισαγωγή Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας απομόνωσης των νουκλεϊκών οξέων (DNA και RNA) το επόμενο κρίσιμο βήμα, πριν προχωρήσουμε στη διεξαγωγή των πειραμάτων μας, είναι να εκτιμήσουμε την ποιότητα και την καθαρότητα του απομονωμένου υλικού και να υπολογίσουμε τη συγκέντρωσή του, ώστε να το χρησιμοποιήσουμε στις κατάλληλες συγκεντρώσεις στις αντιδράσεις που θα ακολουθήσουν. Υπάρχουν τρεις κύριες μέθοδοι για να ελέγξουμε την ποιότητα και τη συγκέντρωση του απομονωθέντος υλικού: φασματοφωτομετρία, φασματοφθορισμομετρία, ηλεκτροφόρηση. Η κάθε μέθοδος ακολουθεί διαφορετική προσέγγιση. Αρκετές φορές, στην καθημερινή εργαστηριακή πρακτική χρησιμοποιούνται περισσότερες από μία για το ίδιο δείγμα. 117

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Στη συνέχεια θα ανασκοπηθούν με συντομία οι βασικές αρχές των μεθόδων που θα χρησιμοποιηθούν στο πρακτικό μέρος. Για διεξοδικότερη περιγραφή των μεθόδων ο αναγνώστης θα πρέπει να ανατρέξει σε σύγγραμμα αναλυτικής βιοχημείας [1]. 6.1.2 Φασματοφωτομετρία Η μέθοδος της φασματοφωτομετρίας βασίζεται στην ιδιότητα των μορίων να απορροφούν εκλεκτικά μέρος της ακτινοβολίας του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος. Η φασματοφωτομετρία υπεριώδους - ορατού (Ultraviolet/Visible, UV/Vis) είναι πιθανότατα η περισσότερο χρησιμοποιούμενη αναλυτική μέθοδος στη βιοχημεία. Στο μήκος κύματος της υπεριώδους (200-380 nm) και της ορατής (380-750 nm) ακτινοβολίας η αλληλεπίδραση ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας και ύλης έχει ως αποτέλεσμα τη διέγερση των ηλεκτρονίων των εξωτερικών στιβάδων και την παροδική μετάπτωσή τους σε μοριακά τροχιακά υψηλότερων ενεργειών. Κατά την αποδιέγερσή τους τα μόρια αποδίδουν την απορροφηθείσα ενέργεια είτε με τη μορφή θερμότητας είτε με τη μορφή φωσφορισμού ή φθορισμού. Για κάθε χημική ένωση υπάρχει ένα χαρακτηριστικό μήκος κύματος (λ max ) στο οποίο εμφανίζει τη μέγιστη απορρόφηση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας. Τα νουκλεϊκά οξέα εμφανίζουν το μέγιστο της απορρόφησής τους στα 260 nm (οι βάσεις πουρίνης λίγο χαμηλότερα από τα 260 nm, ενώ οι βάσεις πυριμιδίνης λίγο υψηλότερα). Στο φάσμα της υπεριώδους ακτινοβολίας οι πρωτεΐνες εμφανίζουν δύο κύριες αιχμές απορρόφησης. Τα αρωματικά αμινοξέα (τυροσίνη, τρυπτοφάνη και φαινυλαλανίνη) εμφανίζουν μέγιστη απορρόφηση στα 280 και τα 260 nm. Τα κατάλοιπα τυροσίνης και τρυπτοφάνης συνεισφέρουν στην απορρόφηση στα 280 nm, ενώ η φαινυλαλανίνη απορροφά στα 260 nm και όχι στα 280 nm. Η δεύτερη αιχμή απορρόφησης είναι μεταξύ των 215 nm και των 230 nm και οφείλεται στους πεπτιδικούς δεσμούς. Ο νόμος Lambert-Beer Όταν μια μονοχρωματική ακτινοβολία (ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκους κύματος) διέρχεται διαμέσου ενός διαλύματος το οποίο περιέχει μια ουσία που απορροφά, η ισχύς της θα μειώνεται προοδευτικά εξαιτίας της απορρόφησής της. Η ισχύς της διερχόμενης ακτινοβολίας (Ι) θα είναι μικρότερη από αυτή της προσπίπτουσας (Ιο) (εικόνα 6.1). Εικόνα 6.1 Ο νόμος Lambert-Beer. Η μείωση της ισχύος της διερχόμενης (Ι) μονοχρωματικής ακτινοβολίας εξαρτάται από τη συγκέντρωση της απορροφούσας ουσίας και τη διανυθείσα απόσταση εντός του διαλύματος. Η μείωση της ισχύος της διερχόμενης ακτινοβολίας δίνεται από τον νόμο Lambert-Beer και εξαρτάται κυρίως από τη συγκέντρωση της απορροφούσας ουσίας και την απόσταση που διένυσε η ακτινοβολία εντός του διαλύματος: 118

Έλεγχος της ποιότητας και μέτρηση της συγκέντρωσης των νουκλεϊκών οξέων I = I o 10 ε λcd όπου ε λ είναι η σταθερά απορροφητικότητας μιας ένωσης και αποτελεί το μέτρο της ικανότητάς της να απορροφά σε ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος λ ανεξάρτητα από τη συγκέντρωσή της. Η ε λ εκφράζει την απορρόφηση διαλύματος συγκέντρωσης 1 Μ όταν αυτό βρίσκεται σε κυψελίδα πάχους 1 cm. C είναι η συγκέντρωση του διαλύματος και d το μήκος της διανυθείσας διαδρομής εντός του διαλύματος, που αποτελεί πρακτικά το πάχος της κυψελίδας στην οποία βρίσκεται το διάλυμα εκφρασμένο σε cm. Ο νόμος ισχύει μόνο για χαμηλές συγκεντρώσεις του διαλύματος, καθώς σε υψηλότερες συγκεντρώσεις τα σωματίδια της απορροφούσας ουσίας παύουν να δρουν ανεξάρτητα και το ένα επηρεάζει την απορρόφηση του άλλου. Ως μέτρα απορρόφησης της ακτινοβολίας μπορούν να χρησιμοποιηθούν: Η διαπερατότητα (Τ) ενός διαλύματος, που είναι ο λόγος της ισχύος της διερχόμενης προς την προσπίπτουσα ακτινοβολία: T = I I o Η απορρόφηση (Α) ενός διαλύματος, που είναι ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθμος της διαπερατότητας: A = log T Συνδυάζοντας τις παραπάνω εξισώσεις, η απορρόφηση για την οποία χρησιμοποιούνταν παλιότερα και ο όρος οπτική πυκνότητα (Optical density, OD), μπορεί να εκφραστεί συναρτήσει της συγκέντρωσης και της μοριακής απορροφητικότητας της ουσίας: A = ε λ Cd Στην καθημερινή πράξη η απορρόφηση χρησιμοποιείται συχνότερα από τη διαπερατότητα για δύο λόγους: Είναι αθροιστική για τα ξεχωριστά συστατικά σε ένα μικτό διάλυμα. Αν δύο ενώσεις με απορρόφηση A 1 και A 2 αναμιχθούν, η απορρόφηση θα αποτελεί το άθροισμα των επιμέρους απορροφήσεων: A = A 1 + A 2. Όταν μετριέται η απορρόφηση ενός διαλύματος, προηγείται η μέτρηση ενός δείγματος αναφοράς που περιέχει τον διαλύτη χωρίς τη διαλυμένη ουσία (τυφλό διάλυμα). Στη συνέχεια η απορρόφησή του αφαιρείται από την απορρόφηση του δείγματος που περιέχει τη διαλυμένη ουσία που μας ενδιαφέρει. Στα περισσότερα όργανα η διαδικασία αυτή πραγματοποιείται αυτόματα. Σε ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος η απορρόφηση είναι γραμμικά ανάλογη με τη συγκέντρωση της διαλυμένης ουσίας για δεδομένο εύρος συγκεντρώσεων. Με τον τρόπο αυτό μπορούμε εύκολα να χρησιμοποιήσουμε την απορρόφηση για να υπολογίσουμε τη συγκέντρωση του διαλύματος. Το φασματοφωτόμετρο Τα όργανα που χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση της απορρόφησης της μονοχρωματικής ακτινοβολίας είναι τα φασματοφωτόμετρα. Τα φασματοφωτόμετρα διακρίνονται σε διάφορους τύπους, όπως για παράδειγμα στα απλής ή διπλής δέσμης. Ανεξάρτητα από τον τύπο του φασματοφωτόμετρου, τα βασικά του μέρη είναι (εικόνα 6.2): 119

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Η πηγή ακτινοβολίας, που εκπέμπει ακτινοβολία επαρκούς ισχύος στην επιθυμητή περιοχή του φάσματος. Προκειμένου για την υπεριώδη ακτινοβολία χρησιμοποιούνται λυχνίες εκκενώσεως υδρογόνου (ή δευτερίου) ή λυχνίες ξένου υψηλής πίεσης, οι οποίες εκπέμπουν συνεχή ακτινοβολία στην περιοχή 160-365 nm. Ο επιλογέας μήκους κύματος, που απομονώνει μονοχρωματική ακτινοβολία από το σύνολο του φάσματος που εκπέμπει η πηγή ακτινοβολίας. Χρησιμοποιούνται είτε οπτικά φίλτρα είτε ειδικές διατάξεις που λέγονται μονοχρωμάτορες. Η κυψελίδα, στην οποία τοποθετείται το διάλυμα. Οι κυψελίδες κατασκευάζονται από υλικό που επιτρέπει τη δίοδο της συγκεκριμένης ακτινοβολίας. Για την υπεριώδη ακτινοβολία χρησιμοποιούνται κυψελίδες χαλαζία ή από ειδικό πλαστικό. Ο ανιχνευτής, που μετατρέπει το εξερχόμενο από την κυψελίδα μονοχρωματικό φως σε ηλεκτρικό ρεύμα (φωτοδίοδος ή φωτοπολλαπλασιαστής). Το αρχικό ασθενές ηλεκτρικό ρεύμα μπορεί να ενισχυθεί με τη βοήθεια ειδικών διατάξεων. Το όργανο καταγραφής, που περιλαμβάνει μια αναλογική ή ψηφιακή οθόνη στην οποία εμφανίζονται οι μετρήσεις της απορρόφησης. Εικόνα 6.2 Τυπική διάταξη των μερών φασματοφωτόμετρου. Η ακτινοβολία που εκπέμπεται από τη λυχνία διέρχεται είτε από οπτικά φίλτρα είτε από τον μονοχρωμάτορα, απομονώνοντας την επιθυμητή μονοχρωματική ακτινοβολία από το σύνολο του φάσματος που εκπέμπει η πηγή. Η προσπίπτουσα ακτινοβολία διέρχεται από τη σχισμή εξόδου και την κυψελίδα στην οποία βρίσκεται το δείγμα. Ο ανιχνευτής δέχεται τη διερχόμενη ακτινοβολία και τη μετατρέπει σε ηλεκτρικό ρεύμα, η ένταση του οποίου ενισχύεται και μπορεί να καταγραφεί στο όργανο ανάγνωσης των μετρήσεων. «Spetrophotometer-en» από GYassineMrabetTalk με άδεια GFDL πηγή: https://commons.wikimedia.org/wiki/file:spetrophotometer-en.svg#/ media/file:spetrophotometer-en.svg. Τα φθηνότερα φασματοφωτόμετρα χρησιμοποιούνται συχνά για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης των νουκλεϊκών οξέων στην καθημερινή εργασία στο εργαστήριο και είναι συνήθως μονής δέσμης, δηλαδή μπορούν να δεχτούν ένα δείγμα τη φορά. Τα φασματοφωτόμετρα διπλής δέσμης είναι περισσότερο περίπλοκα και επιτρέπουν την ταυτόχρονη λήψη δύο μετρήσεων, του τυφλού δείγματος και του διαλύματος που περιέχει τη διαλυμένη ουσία. Η συσκευή μπορεί αυτόματα να αφαιρέσει τη απορρόφηση του τυφλού δείγματος από αυτή του δείγματος που επιθυμούμε να μετρήσουμε. 120

Έλεγχος της ποιότητας και μέτρηση της συγκέντρωσης των νουκλεϊκών οξέων Φασματοφωτόμετρα μικρού όγκου Ορισμένα εξελιγμένα φασματοφωτόμετρα υπεριώδους-ορατού (UV/Vis) λειτουργούν με βάση ειδικά σύστηματα συγκράτησης του δείγματος ανάμεσα σε δύο επιφάνειες βασισμένα στην επιφανειακή τάση, χωρίς τη χρήση κυψελίδων. Η απαιτούμενη ποσότητα δείγματος είναι πολύ μικρή (1-2 μl) και το δείγμα χρησιμοποιείται χωρίς καμία προηγούμενη αραίωση. Όπως και στα άλλα φασματοφωτόμετρα, μετριέται η απορρόφηση του δείγματος στα 260 nm και στα 280 nm. Τα αποτελέσματα της συγκέντρωσης και της καθαρότητας του δείγματος (λόγος A260nm /A280nm ) παρουσιάζονται αυτόματα στην οθόνη του υπολογιστή που είναι συνδεδεμένος με το σύστημα. Ως πηγή ακτινοβολίας χρησιμοποιείται λυχνία ξένου. Το σύστημα συγκράτησης του δείγματος αποτελείται από δύο επιφάνειες που φέρουν οπτικές ίνες και καθορίζουν αυτόματα την απόσταση μεταξύ τους (εικόνα 6.3). Αυτή η διάταξη επιτρέπει την ακριβή μέτρηση διαλυμάτων με μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων, από 2 ng/μl έως 4000 ng/μl. Εικόνα 6.3 (α) Τοποθέτηση σταγόνας με τη βοήθεια πιπέττας, (β) θέση της λυχνίας ξένου και του ανιχνευτή υπεριώδους ακτινοβολίας, (γ) η κεφαλή τοποθετείται σε συγκεκριμένη σταθερή απόσταση. Η χρήση αυτών των οργάνων, τα οποία έχουν υψηλό κόστος, παρέχει τα ακόλουθα πλεονεκτήματα σε σχέση με τα κλασικά φασματοφωτόμετρα: Δεν απαιτείται προηγούμενη αραίωση του δείγματος και η μέτρηση διαδοχικών δειγμάτων απαιτεί μόνο τον καθαρισμό των επιφανειών με ένα χαρτί, πράγμα που καθιστά τη μέθοδο εξαιρετικά εύχρηστη και γρήγορη. Οι μετρήσεις είναι μεγαλύτερης ευαισθησίας και ακρίβειας σε σχέση με αυτές ενός κλασικού φασματοφωτόμετρου, γιατί το δείγμα χρησιμοποιείται χωρίς να αραιωθεί και δεν παρεμβάλλονται άλλα υλικά, όπως το τοίχωμα της κυψελίδας, ανάμεσα στο δείγμα και το όργανο καταγραφής της ακτινοβολίας. Εκτίμηση της καθαρότητας διαλυμάτων νουκλεϊκών οξέων Για την εκτίμηση της καθαρότητας ενός διαλύματος νουκλεϊκών οξέων είναι απαραίτητο να μετρηθεί η απορρόφηση σε δύο μήκη κύματος, στα 260 nm και στα 280 nm (A260nm και A280nm ) και στη συνέχεια να υπολογιστεί ο λόγος των δύο απορροφήσεων A260nm /A280nm : Λόγος A260nm /A280nm = 2 είναι χαρακτηριστικός διαλύματος καθαρού RNA. Λόγος A260nm /A280nm = 1, 8 είναι χαρακτηριστικός διαλύματος καθαρού DNA. 121

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Κατά συνέπεια, όταν απομονώνουμε νουκλεϊκά οξέα, ένας λόγος A 260nm /A 280nm μεταξύ 1,8 και 2 είναι ικανοποιητικός. Ας σημειωθεί ότι η μέθοδος αυτή δεν μπορεί να διακρίνει ανάμεσα στο RNA και στο DNA. Τιμές του λόγου A 260nm /A 280nm < 1, 7 είναι ενδεικτικές της ύπαρξης προσμίξεων, συνήθως είτε πρωτεϊνών είτε φαινόλης που χρησιμοποιήθηκε κατά τη διαδικασία της απομόνωσης. Χαμηλός λόγος A 260nm /A 280nm παρατηρείται και σε δείγματα με πολύ χαμηλή συγκέντρωση DNA (<10 ng/μl). Τιμές του λόγου A 260nm /A 280nm > 1, 8 είναι ενδεικτικές πρόσμιξης με RNA και δεν προκαλούν κάποιο πρόβλημα. Η αύξηση της απορρόφησης στα 230 nm είναι επίσης ενδεικτική προσμίξεων. Τιμές του λόγου A 260nm /A 230nm > 2 είναι ενδεικτικές δειγμάτων καθαρών νουκλεϊκών οξέων. Διάφοροι παράγοντες, όπως πρωτεΐνες, άλατα, ουρία, φαινόλη και υδατάνθρακες, απορροφούν στα 230 nm μειώνοντας τον λόγο A 260nm /A 230nm. Η χρήση ύδατος για τη μέτρηση του τυφλού δείγματος οδηγεί σε μειωμένους λόγους A 260nm /A 230nm σε δείγματα που είναι διαλυμένα σε ΤΕ. Μέτρηση της συγκέντρωσης των νουκλεϊκών οξέων Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης των νουκλεϊκών οξέων βασίζεται στην εφαρμογή του νόμου Lambert-Beer. Το DNA, σε συγκεντρώσεις 5 έως 50 ng/μl, εμφανίζει γραμμική συσχέτιση με την απορρόφηση στα 260 nm. Προκειμένου να υπολογίσουμε τη συγκέντρωση των νουκλεϊκών οξέων λαμβάνουμε υπόψη τα ακόλουθα: Διάλυμα καθαρού δίκλωνου DNA (Double stranded DNA, dsdna) που έχει στα 260 nm απορρόφηση A 260nm = 1 έχει συγκέντρωση 50 ng/μl. Διάλυμα καθαρού μονόκλωνου DNA (Single stranded DNA, ssdna) που έχει στα 260 nm απορρόφηση A 260nm = 1 έχει συγκέντρωση 33 ng/μl. Διάλυμα καθαρού RNA που έχει στα 260 nm απορρόφηση A 260nm = 1 έχει συγκέντρωση 40 ng/μl. Με βάση τα παραπάνω, η συγκέντρωση ενός διαλύματος δίκλωνου DNA μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας τον τύπο: C(ng/µl) = A 260nm 50 Προκειμένου για διαλύματα RNA ή μονόκλωνου DNA ο υπολογισμός της συγκέντρωσης γίνεται πολλαπλασιάζοντας την A 260nm με 40 και 33 αντίστοιχα. 6.1.3 Φασματοφθορισμομετρία Φθορισμός ονομάζεται η ιδιότητα που έχουν ορισμένα άτομα ή μόρια, όταν απορροφούν ακτινοβολία ορισμένου μήκους κύματος, να εκπέμπουν ακτινοβολία υψηλότερου μήκους κύματος μετά από σύντομο χρονικό διάστημα (<1/100.000 sec), καλούμενο και διάρκεια ζωής του φθορισμού. Κατά τον φθορισμό η εκπομπή ακτινοβολίας σταματάει μόλις διακοπεί η προσπίπτουσα ακτινοβολία. Ο φθορισμός ανακαλύφθηκε με παρατήρηση του ορυκτού φθορίτη, του οποίου οι κρύσταλλοι εμφανίζουν φθορισμό κάτω από την επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας (εικόνα 6.4). Η διαδικασία του φθορισμού ακολουθεί μια αλληλουχία γεγονότων. Αρχικά, με την απορρόφηση της ενέργειας της υπεριώδους ακτινοβολίας, τα ηλεκτρόνια των μορίων της φθορίζουσας ουσίας διεγείρονται και μεταπίπτουν σε εξώτερη στιβάδα. Ακολουθεί η αποδιέγερση των διεγερμένων ηλεκτρονίων με επιστροφή τους σε χαμηλότερη ενεργειακή τροχιά και ταυτόχρονη εκπομπή φωτονίου μεγαλύτερου μήκους κύματος, 122

Έλεγχος της ποιότητας και μέτρηση της συγκέντρωσης των νουκλεϊκών οξέων Εικόνα 6.4 (α) Φθορίτης (β) φθορισμός του ορυκτού φθορίτη υπό την επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας. Εικόνα: παράγωγο του «FluoriteUV» από Didier Descouens με άδεια CC BY-SA 4.0. Πηγή: https://commons.wikimedia.org/wiki/file:fluoriteuv.jpg#/media/file:fluoriteuv.jpg. ενώ το μόριο επιστρέφει στη βασική του κατάσταση. Έτσι λοιπόν, το φαινόμενο του φθορισμού αναφέρεται στην αποδιέγερση από μια κατάσταση, η οποία συνοδεύεται από εκπομπή φωτονίου. Η φθορισμομετρία χρησιμοποιείται σήμερα πολύ συχνά για τον ποσοτικό προσδιορισμό των νουκλεϊκών οξέων στο εργαστήριο γιατί παρουσιάζει τρία βασικά πλεονεκτήματα σε σχέση με τη φασματομετρία απορρόφησης: Είναι πολύ πιο ευαίσθητη μέθοδος, με όρια ανίχνευσης κατά δυο έως τρεις τάξεις μεγέθους χαμηλότερα από αυτά της φασματομετρίας απορρόφησης. Μπορούν να υπολογιστούν συγκεντρώσεις δειγμάτων DNA μέχρι και 10 pg/μl και RNA μέχρι και 250 pg/μl. Στα σύγχρονα φθορισμόμετρα χρησιμοποιούνται φθορίζουσες χρωστικές οι οποίες προσδένονται εκλεκτικά στο μόριο που πρόκειται να ποσοτικοποιηθεί (DNA ή RNA) και φθορίζουν μόνο όταν είναι προσδεδεμένες σε αυτό. Έτσι, για παράδειγμα, η μέτρηση της συγκέντρωσης ενός δείγματος RNA δεν επηρεάζεται από κατάλοιπα DNA, ενώ στη φασματομετρία απορρόφησης απορροφούν και τα δύο στα 260 nm. Οι φθορίζουσες χρωστικές δεν δεσμεύονται στο αποδιαταγμένο DNA και RNA, συνεπώς η συγκέντρωση που υπολογίζεται αντανακλά σε μεγαλύτερο βαθμό την πραγματική συγκέντρωση του «λειτουργικού» DNA ή RNA του δείγματος. Στα πλεονεκτήματα τέτοιων συστημάτων ποσοτικοποίησης νουκλεϊκών οξέων συγκαταλέγεται επίσης και η μικρή αρχική ποσότητα δείγματος που απαιτείται (1-10 μl), όπως και το ότι δεν απαιτείται δείγμα που περιέχει τον διαλύτη (τυφλό) για τον μηδενισμό του συστήματος (εικόνα 6.5). Σημαντικό μειονέκτημα είναι ότι δεν παρέχονται πληροφορίες για τυχόν προσμίξεις από άλλες ουσίες, όπως για παράδειγμα πρωτεΐνες ή φαινόλη, και το αυξημένο κόστος των αντιδραστηρίων (διαλύματα και φθορίζουσες χρωστικές). 6.1.4 Ηλεκτροφόρηση Η φωτομέτρηση δειγμάτων DNA είναι απαραίτητη για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης και της καθαρότητας του απομονωμένου DNA, δεν δίνει όμως πληροφορίες για τη φυσική του κατάσταση, αν είναι δηλαδή ακέραιο (μακρομοριακό) ή κατακερματισμένο. Η γνώση της ποιότητας του DNA είναι σημαντική, ιδίως αν πρόκειται να χρησιμοποιηθεί σε εφαρμογές όπως η κλωνοποίηση για τη δημιουργία βιβλιοθηκών, η ενίσχυση με PCR τμημάτων > 1000 bp και ο υβριδισμός κατά Southern. Για τον σκοπό αυτό παραδοσιακά το DNA ηλεκτροφορείται σε πήκτωμα αγαρόζης 0,7-1% για χρονικό διάστημα από μισή έως μια ώρα. 123

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ Εικόνα 6.5 Σχηματική αναπαράσταση ποσοτικοποίησης δειγμάτων DNA με χρήση φθορισμόμετρου. Δύο πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης χρησιμοποιούνται για την ποσοτικοποίηση των δειγμάτων. Ποσότητα 1 έως 20 μl του δείγματος αραιώνεται σε σωληνάριο με κατάλληλο διάλυμα που περιέχει τη φθορίζουσα χρωστική. Μετά από επώαση 2 min τα δείγματα διαβάζονται από το φθορισμόμετρο και η συγκέντρωση του διαλύματος υπολογίζεται αυτόματα. Ένα δείγμα μακρομοριακού DNA δεν θα μπορέσει να διαχωριστεί σε πήκτωμα αγαρόζης και θα εμφανίσει μια έντονη ζώνη πολύ κοντά στη θέση στην οποία φoρτώθηκε το δείγμα. Αντίθετα, ένα δείγμα που περιέχει κατακερματισμένο DNA θα εμφανιστεί σαν μια διάχυτη θολή σκίαση (Smear) στο πήκτωμα αγαρόζης (εικόνα 6.6). Δείγματα με κατακερματισμένο DNA είναι πιθανώς κατάλληλα για αντιδράσεις PCR, αν το μέγεθος της περιοχής προς ενίσχυση είναι μικρότερο από το μέγεθος που φαίνεται να έχει η διάχυτη θολή σκίαση (π.χ. 100-200 bp). Στο σημείο αυτό είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι όλες οι μέθοδοι που εξετάσαμε σε αυτό το κεφάλαιο δίνουν πληροφορίες για την ποσότητα και την ποιότητα του DNA. Δεν μπορούν όμως να ανιχνεύσουν τυχόν αναστολείς (π.χ. υπολείμματα αιθανόλης ή αλάτων) που μπορεί να αναστείλουν την αντίδραση PCR αν βρίσκονται στο δείγμα σε ικανή συγκέντρωση. Ο ευκολότερος τρόπος για να επιβεβαιωθεί η λειτουργικότητα του DNA είναι να χρησιμοποιηθεί σε μια αντίδραση PCR με εκκινητές που στοχεύουν ένα γονίδιο ελέγχου. Η εμφάνιση ζώνης μετά από ηλεκτοφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης είναι αδιάψευστη απόδειξη της λειτουργικότητας του απομονωμένου DNA. Εικόνα 6.6 Ηλεκτροφόρηση DNA σε πηκτή αγαρόζης. Στην δεύτερη θέση, μετά τον δείκτη γνωστού μοριακού βάρους διακρίνεται μια διάχυτη θολή σκίαση (smear) που οφείλεται σε κατακερματισμένο DNA. 124

Έλεγχος της ποιότητας και μέτρηση της συγκέντρωσης των νουκλεϊκών οξέων 6.2 Πρακτικό μέρος 6.2.1 Υπολογισμός συγκέντρωσης DNA με τη βοήθεια φασματοφωτόμετρου 1. Επισημαίνουμε το σωληνάριο πολυπροπυλενίου (τύπου eppendorf) με τον κωδικό του δείγματος που θα φωτομετρήσουμε. 2. Τοποθετούμε 495 μl ddh 2 O στο σωληνάριο. 3. Προσθέτουμε 5 μl από το DNA που απομονώσαμε. 4. Αναδεύουμε το δείγμα με τη βοήθεια vortex. 5. Τοποθετούμε στο φωτόμετρο κυψελίδα που περιέχει ddh 2 O και μηδενίζουμε την ένδειξη του οργάνου. 6. Αν είναι απαραίτητο, ρυθμίζουμε το όργανο για φωτομέτρηση δίκλωνου DNA (dsdna). 7. Τοποθετούμε το διάλυμά μας σε κυψελίδα και στη συνέχεια στο φασματοφωτόμετρο. 8. Λαμβάνουμε τις μετρήσεις και σημειώνουμε τα αποτελέσματα της απορρόφησης στα 260 και 280 nm. 9. Υπολογίζουμε τη συγκέντρωση του DNA χρησιμοποιώντας τον παρακάτω τύπο: C(ng/µl) = A 260 50 100 όπου 100 είναι ο συντελεστής αραίωσης του αρχικού μας δείγματος (αναμίξαμε 5 μl αρχικού διαλύματος με 495 μl νερό). 10. Υπολογίζουμε τον λόγο Α 260 /Α 280. 11. Σημειώνουμε τα αποτελέσματα των μετρήσεων, τη συγκέντρωση του DNA και τον λόγο Α 260 /Α 280 στο τετράδιο εργαστηριακών ασκήσεων. 6.2.2 Προετοιμασία διαλύματος DNA εργασίας Για τη διεξαγωγή των αντιδράσεών μας προτιμάμε να μη δουλεύουμε με το αρχικό μας δείγμα αλλά με διάλυμα εργασίας γνωστής συγκέντρωσης DNA, που θα χρησιμοποιήσουμε στο εργαστήριο. Η τακτική αυτή επιτρέπει να φυλαχτεί μέρος του αρχικού DNA που απομονώσαμε στην κατάψυξη, ώστε να ξαναχρησιμοποιηθεί όταν είναι απαραίτητο για τη δημιουργία ενός νέου διαλύματος εργασίας. Με τον τρόπο αυτό αποφεύγεται τυχόν καταστροφή, απώλεια ή επιμόλυνση του αρχικού δείγματος. Μια εμπειρικά χρήσιμη συγκέντρωση DNA για τη διεξαγωγή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) είναι αυτή ενός διαλύματος 25 ng/μl. Προκειμένου να προετοιμάσουμε ένα διάλυμα συγκέντρωσης 25 ng/μl συνολικού τελικού όγκου 100 μl: 1. Υπολογίζουμε τον όγκο του αρχικού διαλύματος που θα χρειαστούμε ως εξής: V = C τv τ C α, 125

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ όπου C τ είναι η επιθυμητή συγκέντρωση του τελικού διαλύματος (στην περίπτωσή μας 25 ng/μl), C α η συγκέντρωση του αρχικού διαλύματος του DNA και V τ ο συνολικός όγκος του τελικού διαλύματος (στη συγκεκριμένη περίπτωση 100 μl). 2. Υπολογίζουμε τον όγκο του νερού που θα χρειαστούμε για να προετοιμάσουμε το διάλυμα: όγκος νερού (μl) = 100 V 3. Τοποθετούμε σε ένα σωληνάριο πολυπροπυλενίου τον όγκο του νερού που υπολογίσαμε με τη βοήθεια της ρυθμιζόμενης πιπέττας. 4. Τοποθετούμε τον όγκο V του αρχικού διαλύματος που υπολογίσαμε και αναμιγνύουμε με ελαφρές κινήσεις, ανεβοκατεβάζοντας το έμβολο της πιπέττας. 5. Εφεξής χρησιμοποιούμε τη νέα αραίωση των 25 ng/μl για τη συνέχιση των πειραμάτων μας. 6.3 Ερωτήσεις - Εργασίες 1. Γιατί είναι σημαντική η δημιουργία ενός διαλύματος εργασίας συγκεκριμένης συγκέντρωσης από το δείγμα του DNA για περαιτέρω χρήση στο εργαστήριο; Απάντηση: Επανειλημμένοι χειρισμοί του σωληναρίου με το DNA μπορούν να οδηγήσουν σε επιμολύνσεις από άλλο DNA ή DNAσες, που θα αποικοδομήσουν το DNA. Επανειλημμένοι κύκλοι κατάψυξης και απόψυξης οδηγούν σε κατακερματισμό του DNA. Η δημιουργία διαλύματος εργασίας με δεδομένη συγκέντρωση για όλα τα δείγματα διευκολύνει την προσθήκη ίσης ποσότητας DNA σε όλες τις αντιδράσεις και τη σύγκριση των αποτελεσμάτων μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων. Εάν παρουσιαστεί ανάγκη επιβεβαίωσης ενός αποτελέσματος, αυτό μπορεί να πραγματοποιηθεί σε οποιαδήποτε μεταγενέστερη χρονική στιγμή παρασκευάζοντας νέο διάλυμα εργασίας από το αποθηκευμένο διάλυμα του αρχικού DNA. 2. Ένα δείγμα DNA που απομονώσαμε στο εργαστήριο φωτομετρήθηκε σε φωτόμετρο μικρού όγκου και έχει A 260nm = 1, 5: Ποια είναι η συγκέντρωση του δείγματος; Κάντε τους απαραίτητους υπολογισμούς για να δημιουργήσετε 20 μl διαλύματος εργασίας 25 ng/μl. Απάντηση: Στο φωτόμετρο μικρού όγκου το δείγμα τοποθετείται χωρίς προηγούμενη αραίωση. Συνεπώς η συγκέντρωσή του είναι: A 260nm 50 = 75ng/µl 126

Έλεγχος της ποιότητας και μέτρηση της συγκέντρωσης των νουκλεϊκών οξέων Χρησιμοποιώντας τον τύπο υπολογίζουμε: C αρχ. δείγμ. V αρχ. δείγμ. = C τελ. δείγμ. V τελ. δείγμ. 75ng/µl V αρχ. δείγμ. = 25ng/µl 20µl και αραιώνουμε 6,7 μl DNA με 13,3 μl Η 2 Ο. 3. Έστω ότι από το διάλυμα εργασίας χρησιμοποιείτε 5 μl σε μια αντίδραση PCR, η οποία όμως δεν δίνει προϊόν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Τι μπορεί να έχει συμβεί; Απάντηση: Το δείγμα μας μπορεί να περιέχει ουσίες που αναστέλλουν την αντίδραση της PCR. Η φωτομέτρηση στα 260 nm είναι ενδεικτική της ποσότητας DNA του δείγματος, δεν δίνει όμως πληροφορίες για την παρουσία αναστολέων στο δείγμα, όπως αιθανόλη ή άλατα. Επίσης, ο υπολογισμός της απορρόφησης στα 280 nm, όπου απορροφούν οι πρωτεΐνες, θα ήταν χρήσιμος για τον υπολογισμό της καθαρότητας του δείγματος. Ένας λόγος A 260nm /A 280nm < 1, 5 θα ήταν ενδεικτικός δείγματος χαμηλής καθαρότητας. 6.4 Βιβλιογραφία [1] J. Clark, Πειραματική Βιοχημεία. Ηράκλειο: Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 1992. Χρήσιμες ηλεκτρονικές διευθύνσεις Τρόπος λειτουργίας φασματοφωτόμετρου μικρού όγκου (Nanodrop, Thermo Scientific) http://www.nanodrop.com/howitworks.aspx Σύντομο βίντεο για την αρχή λειτουργίας και τη χρήση του φασματοφωτόμετρου μικρού όγκου Nanodrop https://www.youtube.com/watch?v=figznns2xxy 127