ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ ΜΕΤΑΤΡΟΠΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗΣ ΒΙΟΜΟΡΙΩΝ: Υπεροξυσώματα - Λυσοσώματα

ΣΥΓΧΡΟΝΑ ΘΕΜΑΤΑ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ ΜΕΤΑΤΡΟΠΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗΣ ΒΙΟΜΟΡΙΩΝ: Υπεροξυσώματα - Λυσοσώματα Μαριάννα Χ. Αντωνέλου, Ph.D. Λέκτορας Τμήματος Βιολογίας, Πανεπιστημίου Αθηνών 14-01-2015

YΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ Συμμετέχουν σε οξειδωτικές διαδικασίες μεταβολισμού Προστασία έναντι επικίνδυνων μεταβολιτών πχ. H 2 O 2 Οξείδωση αλκοολών-αποτοξίνωση ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ Αποικοδόμηση βιομορίων (κυτταροποσία-κυτταροφαγία-αυτοφαγία) Ανακύκλωση μεταβολιτών Κυτταρικός θάνατος 2

Α. Υπεροξυσώματα 3

Ανακαλύφθηκαν πρόσφατα (60 χρόνια πριν) Eισαγωγή Απαραίτητα κυτταρικά οργανίδια. Βρίσκονται παντού: σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα (ζωικά και φυτικά) Μέσος χρόνος ζωής: 4-5 μέρες (ηπατικά) είναι πλειομορφικά (remarkably fluid and can change dramatically in abundance, size, shape and content in response to numerous cues) Λιγότερο κατανοητά ανάμεσα στα κλασσικά κυτταρικά οργανίδια Αίνιγμα: βιογένεση, διατήρηση, αποικοδόμηση (pexophagy), the fact that they can import large protein complexes Κατανόηση ρόλου σε: 1) διατήρηση κυτταρικής ομοιόστασης και βιωσιμότητας 2) Διάφορες ασθένειες στον άνθρωπο Υ movement Υ movement-2 Υ (Ρ) σε στενή σχέση με χλωροπλάστες (C) και mit σε φυτικό κύτταρο 4

ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ (Peroxisomes).. Γενικά Χαρακτηριστικά Ως Κυτταρικά Οργανίδια: Rhodin, 1954, κύτταρα νεφρού Porter & Caulfield, 1958, φυτικά κύτταρα De Duve: καθιέρωση του όρου Παραγωγή και διάσπαση τοξικού Η 2 Ο 2 (υπεροξειδάση) Αρχικός (και βασικός) ορισμός: Oργανίδια που περιέχουν τουλάχιστον μία οξειδάση και μία καταλάση για την παραγωγή και αποικοδόμηση H 2 O 2, αντίστοιχα 5

ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ (Υπεροξειδιοσώματα) (Υ) (Peroxisomes microbodies) Κυρίως σφαιρικά (0.1 to 1 μm in diameter) (επιμηκυσμένα, δικτυωτά σε ορισμένους κυτταρικούς τύπους ή συνθήκες) Μονή λιπιδική διπλοστοιβάδα (μεμβράνη) 60 80 Å πάχος με διαμεμβρανικά συστατικά Μatrix: ηλεκτρονιόπυκνο υλικό (Κρυσταλλική μορφή) ΟΥΡΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΚΑΤΑΛΑΣΗ Χωρίς DNA Eισαγωγή 6

ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ (Peroxisomes).. Γενικά Χαρακτηριστικά 7

Απομόνωση και Ταυτοποίηση ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ (Κλασμάτωση) Βιοχημικά Ιστο- Κυτταροχημικά (enz, DAB καταλάση) Ανοσο-ιστοχημικά Μορφολογικά Η/Μ Κυτοχρωμική Οξειδάση Καταλάση, Oυρική οξειδάση 8

Κυτταροχημική εντόπιση ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ 9

Eισαγωγή COS 7 cell expressing an ER marker (red) and a peroxisomal marker (green). Bar = 10 microns (Peter Kim) 10

Μεμβράνη Υ Υ-ΜΕΜΒΡΑΝΗ 1. peroxisomal membrane proteins (PMPs) (κυρίως μεταφορείς μεταβολιτών) 2. Peroxins 32 γνωστές peroxins. (υπεροξίνες) (βρίσκονται επίσης και στο κυτοσόλιο εκτός από τη μεμβράνη του Υ) Εμπλέκονται σε βιογένεση Υ, διαίρεση, μεταφορά πρωτεϊνών μεμβράνης και matrix Κωδικοποιούνται από PEX genes (14 (μόνο) από αυτά έχουν ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο) και εμπλέκονται σε Ασθένειες Βιογένεσης Υπεροξυσωμάτων (Peroxisome biogenesis disorders (PBDs) ΠΑΘΗΤΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ (μέχρι μεγέθους σακχαρόζης) ΕΝΕΡΓΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΜΟΡΙΩΝ ΚΑΙ ΙΟΝΤΩΝ?? ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΜΕ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ (ΑΤΡ) ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ/ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ (από μελέτες σε γενετικές ασθένειες) ΑΤΡ-άση Mg με σημαντικό ρόλο στη ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ Υ Protein aggergates 11

Λειτουργίες Smith and Aitchison, Νature Reviews, Molecular Cell Biology 14:803, Dec 2013 most notable and highly conserved found in a few organisms or cell types found in a few organisms or cell types 12

Γλυοξυσώματα (glyoxysomes) φυτών και μυκήτων (παραγωγή ηλεκτρικού οξέος) Γλυκοσώματα (glycosomes): trypanosomes Woronin-bodies, filamentous fungi (1 function: plug septal pores in case of hyphal injury) Υπεροξυσώματα (peroxisomes) Φύλλα Ανώτερων Φυτών:Οξείδωση υποστρωμάτων, Διάσπαση Η 2 Ο 2 από Καταλάση, Φωτοαναπνοή (mit, χλωροπλάστες) OIKOΓΕΝΕΙΑ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ Overview of peroxisome functions in different organisms and tissues. Peroxisomes display a great variety in metabolic pathways as defined by their respective enzymatic content. Most eukaryotes share peroxisomal enzymes for fatty-acyl-coa metabolism (α- and β-oxidation) and detoxification of hydrogen peroxide by catalase. 13

Ορισμένα πρωτόζωα (πχ. Dictyostelium discoideum) έχουν τυπικά Υ Ποικιλότητα Υ Άλλα (ανάμεσα στα οποία τα παθογόνα για τον άνθρωπο μαστιγοφόρα πρωτόζωα Leishmania (Λεϊσμανίαση) and Trypanosoma spp, Ασθένεια του Ύπνου) έχουν εξειδικευμένα Υ: Γλυκοσώματα Έχουν τους ίδιους μηχανισμούς βιογένεσης και πρωτεϊνικής στόχευσης αλλά ΔΕΝ περιέχουν καταλάση (κύριο χαρακτηριστικό κλασσικών Υ) Αντίθετα, περιέχουν γλυκολυτικά ένζυμα (καταβολισμός γλυκόζης) (Στους περισσότερους οργανισμούς η γλυκόλυση συμβαίνει στο cyt κι όχι σε οργανίδια) ΠΑΡΟΥΣΙΑ Ο 2 (αερόβιες συνθήκες) Παραγωγή ΑΤΡ (μαζί με το ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟ) ΑΠΟΥΣΙΑ Ο 2 (αναερόβιες συνθήκες) Παραγωγή ΑΤΡ: ΑΠΟΚΛΕΙΣΤΙΚΗ κάλυψη ενεργειακών αναγκών κυττάρου από γλυκόσωμα Electron micrograph of Trypansoma brucei 14

ΥΔΡΟΓΟΝΟΣΩΜΑΤΑ Πρωτόζωα γένους Trichomonas (χωρίς mit) με Ένζυμα για ΟΞΕΙΔΩΣΗ ΠΥΡΟΣΤΑΦΥΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ πυροσταφυλικό οξύ οξικό οξύ + CO 2 + ΑΤΡ Παρουσία Ο 2 Μεταφορά απελευθερωμένων e - (μέσω φερεδοξίνης) στο Ο 2 : σχηματισμός Η 2 Ο Απουσία Ο 2 (αναερόβιες συνθήκες) Μεταφορά απελευθερωμένων e - στο Η + : σχηματισμός μοριακού Η 2 15

Ποικιλότητα Υ ΜΙΚΡΟ-ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ μικρότερα οργανίδια Ένζυμα Διάσπασης Η 2 Ο 2 Μεταβολισμός Μεταφορά / Αποθήκευση Λιπιδίων 16

Ποικιλότητα Υ Γλυοξυσώματα Φυτά και filamentous fungi περιέχουν ένζυμα β-oxidation, σύνθεσης και αποικοδόμησης H2O2 αλλά και σημαντικά ένζυμα του ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ (λίπη σε σάκχαρα) Woronin bodies Εξειδικευμένα Υ των filamentous fungi Εμπλέκονται σε διατήρηση κυτταρικής ακεραιότητας (επούλωση πληγών) Woronin bodies in a septum of Fusarium oxysporum. (Wergin, W.P. 1973. Protoplasma 76:249-260 Â Springer-Verlag). 17

Ποικιλότητα λειτουργιών Σε ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς Διαφορετικές, ποικίλουσες και σύμπλοκες λειτουργικότητες Στον άνθρωπο: Γενετικές ασθένειες Σύνθεση πλασμαλογόνων (ether phospholipids, plasmenylethalomines, plasmenylcholines): εμπλουτισμένα στο νευρικό, ανοσοποιητικό και καρδιαγγειακό σύστημα. Εμπλέκονται σε σηματοδότηση και προστασία κυττάρων από ROS Υ=Πλατφόρμες σηματοδότησης σε κύτταρα θηλαστικών: Σε περιπτώσεις μόλυνσης από ιούς η Υ- πρωτεΐνη-προσαρμοστής MAVS (mitochondrial antiviral signalling) επάγει την έκφραση αντι-ιικών παραγόντων βραχυπρόθεσμης άμυνας Η MAVS μεσολαβεί την ενεργοποίηση ενός σηματοδοτικού μονοπατιού που ενισχύει και σταθεροποιεί την αντι-ιική απόκριση Smith and Aitchison, Νature Reviews, Molecular Cell Biology 14:803, Dec 2013 18

Ποικιλία βιοχημικών λειτουργιών Λειτουργίες Εμπλέκονται σε: biosynthesis of plasmalogens (essential lipids for the brain, heart and muscles), cholesterol and bile acids (salts necessary for lipid digestion) Οξείδωση αλκοολών catabolism of purines and polyamines metabolism of prostaglandins photorespiration in plants (Παραγωγή αμινοξέων) Penicillin synthesis in fungi Μεταβολικές λειτουργίες (cyt, mit) (οξειδωτικές διαδικασίες μεταβολισμού, β-οξείδωση λιπαρών οξέων) Προστατευτικός Μηχανισμός έναντι: H 2 O 2 (υπεροξείδιο του υδρογόνου) Επικίνδυνοι μεταβολίτες 19

Λειτουργίες Μεταβολισμός: οξειδώσεις Αποτοξίνωση (απαλλαγή κυττάρου από τοξικές ουσίες) κυρίως H 2 O 2 (κοινό παραπροϊόν κυτταρικού μεταβολισμού) (περιέχουν ένζυμα μετατροπής H 2 O 2 σε νερό). Ορισμένοι τύποι Υ (πχ. αυτά στα ηπατικά κύτταρα) αποτοξινώνουν την αλκοόλη και άλλες επιβλαβείς ουσίες μεταφέροντας hydrogen από τις ουσίες αυτές στο Ο2 (oxidation). Peroxisomes carry out various oxidative reactions that are tightly regulated to adapt to the changing needs of the cell and varying external environments Χρησιμοποιούν σημαντικές ποσότητες Ο2 20

Αυτά τα χαρακτηριστικά των Υ στάθηκαν ιδιαίτερα σημαντικά εκατομμύρια χρόνια πριν όταν ακόμα τα κύτταρα δεν περιείχαν mit Γήινη ατμόσφαιρα: συσσώρευε τεράστια ποσά Ο 2 λόγω της δράσης των φωτοσυνθετικών βακτηρίων. Λειτουργίες Τα Υ τότε: πρωταρχικώς υπεύθυνα για την αποτοξίνωση των κυττάρων μειώνοντας τα επίπεδα του Ο 2 στα κύτταρα (δηλητήριο για τις περισσότερες μορφές ζωής). Αργότερα που προέκυψαν τα mit, τα Υ κατέστησαν λιγότερο σημαντικά (κατά κάποιο τρόπο) καθώς τα νέα οργανίδια χρησιμοποιούσαν Ο 2 για να διεκπεραιώσουν πολλές από τις λειτουργίες των Υ κι επιπρόσθετα, μπορούσαν να παράγουν ενέργεια (ATP). Eξελικτικά: στους πρώτους αερόβιους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, το Υ ήταν η βασική θέση διεξαγωγής των αναπνευστικών αντιδράσεων 21 Όταν αργότερα επεκράτησε η αερόβια ανάπτυξη: ο ρόλος πέρασε στα μιτοχόνδρια

Ασθένειες Η σημασία των Υ για την σωστή κυτταρική λειτουργία αποτυπώνεται σε μία σειρά κληρονομικών ασθενειών (Ασθένειες βιογένεσης Υ, peroxisomal biogenesis disorders) (Απουσία/Ανεπάρκεια Υ) Σύνδρομο Zellweger Νεογνική Αδρενο-λευκοδυστροφία (Neonatal Adrenoleucodystrophy) Infantile Refsum's disease Μεταλλαγές: 1. ένζυμα Υ 2. σε πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη συγκρότηση των Υ 22

ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ.... ΠΛΗΘΟΣ ΚΑΙ ΤΟΠΟΛΟΓΙΑ 400-1.000 οργανίδια / κύτταρο (Ηπατοκύτταρα) Αύξηση αριθμού κατά την εμβρυική και μετεμβρυϊκή ανάπτυξη και κατά την αναγέννηση του ήπατος Τοπολογία: κοντά σε μεμβράνες Σχέση με Μεμβρανικό Δίκτυο (ΕΔ, Βιογένεση??) «ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΙΚΟ ΔΙΚΤΥΟ» (σύνδεση Υ με μεμβρανική σύντηξη) 23

Λειτουργίες ΕΤΕΡΟΓΕΝΗ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ με διαφορετικές λειτουργίες στους διάφορους οργανισμούς Ποικιλία Ενζύμων με δράση σε διάφορες Μεταβολικές Οδούς ΟΞΕΙΔΑΣΕΣ & ΚΑΤΑΛΑΣΗ Η 2 Ο 2 ΕΝΖΥΜΑ ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ακυλο-coa ΚΛΠ Οξειδωτική διάσπαση λιπαρών οξέων ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ Μεταβολισμός αλκοόλης ΕΝΖΥΜΑ ΓΛΥΚΟΛΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ (φυτά) ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΠΟΥΡΙΝΩΝ 24

Μεταβολισμός Η 2 Ο 2 Λειτουργίες ΦΛΑΒΙΝΟ-ΟΞΕΙΔΑΣΕΣ & ΚΑΤΑΛΑΣΗ Η 2 Ο 2 οξειδώσεις Οξειδάση RH 2 + O 2 R + H 2 O 2 10% κατανάλωση Ο 2 στα ηπατικά κύτταρα απορροφάται από ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ Τα Υ έχουν όλα τα ένζυμα για το σχηματισμό και την αποικοδόμηση του Η 2 Ο 2 R: Υδρογονάνθρακας οξειδώσεις H 2 O 2 + RH 2 Καταλάση Καταλάση H 2 O 2 H 2 O + ½O 2 2Η 2 Ο + R Άμεση διάσπαση του τοξικού μορίου Η2Ο2 Η 2 Ο 2 : οξείδωση βιομορίων διάσπαση από καταλάση ΚΑΤΑΛΑΣΗ: 33% σε υπεροξυσώματα ηπατοκυττάρων Το Η 2 Ο 2 είναι τοξικό προϊόν του μεταβολισμού-η τοξικότητά του σχετίζεται άμεσα με την παραγωγή ελεύθερων ριζών 25

ΚΑΤΑΛΑΣΗ Μεταβολισμός Η 2 Ο 2 Λειτουργίες 3 τύποι: Α (Υπεροξυσωμάτων: 170 190 kda) Τ (Κυτοσολίου: 225 250 kda) Μ (Μιτοχονδρίων: 240 kda) ΚΑΤΑΛΑΣΗ Α 4 Πολυπεπτιδικές Αλυσίδες 4 Μόρια Αίμης (1 μόριο αίμης / αλυσίδα) Κυτταροπλασματική Σύνθεση Ελεύθερα Ριβοσώματα Αυτοσυγκρότηση Τετραμερούς Ενζύμου: Σύνδεση Μονομερών (χωρίς Αίμη ΑΠΟΚΑΤΑΛΑΣΗ) με Αίμη 26

Μεταβολισμός Η 2 Ο 2 Βιογένεση Υ ΔΙΑΛΟΓΗ ΚΑΙ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ ΣΤΟ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑ Κυτοσολικός Υποδοχέας PT-S1R (Pex5p) Αναγνώριση & Δέσμευση ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ σύνδεση με την KANL αλληλουχία (COOH-άκρο ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ) Στόχευση ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ στο ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑ (& μηχανισμός ΕΙΣΟΔΟΥ) μέσω ειδικών μεμβρανικών υποδοχέων (Pex14p) οργανιδίου 27

Μεταβολισμός Η 2 Ο 2 Βιογένεση Υ ΔΙΑΛΟΓΗ ΚΑΙ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ ΣΤΟ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑ 28

Η διαδικασία εισαγωγής πρωτεϊνών στο Υ είναι μοναδική γιατί τα Υ έχουν την ικανότητα να εισάγουν διπλωμένες στην τελική τους μορφή matrix πρωτεΐνες ή ακόμα και ευμεγέθη ολιγομερή πρωτεϊνών (vs. mit, chloroplasts και ΕΔ which only import unfolded polypeptides) Πώς???? Βιογένεση Υ Ο μηχανισμός παραμένει αίνιγμα 1. η Υ μεμβράνη δεν είναι διαπερατή παρά μόνο σε μικρούς μεταβολίτες. 2. Υδάτινος πόρος την Υ-μεμβράνη? δεν έχει βρεθεί ακόμα κάποια δομή πόρου που θα μπορούσε να μεσολαβεί αυτήν την εισαγωγή Αρκετές θεωρίες: transient import structures (transient pore hypothesis, membrane invagination model κλπ) Παροδικοί πόροι μεταφοράς εισαγόμενων πρωτεϊνών (κανάλια). Οι μεμβρανικοί υποδοχείς εισαγωγής πρωτεϊνών φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό του In fact, the PTS1 receptor Pex5p (cyt) proved to have many properties expected for a transient-pore-forming protein. A considerable portion of the membrane-bound fraction of Pex5p behaves as an intrinsic membrane protein and forms a stable complex with components of the docking complex Rucktäschel et al., Biochimica et Biophysica Acta 1808:892 900, 2011) Erdmann, R. & Schliebs, W. Peroxisomal matrix protein import: the transient pore model. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6, 738 742 (2005). 29

Βιογένεση Υ Γιατί???? Τα μοντέλα προτείνουν ότι ο ολιγομερισμός της μεταφερόμενης Υ-πρωτεΐνης στο cyt : 1. ενδέχεται να βελτιώνει την αποδοτικότητα της εισαγωγής εξασφαλίζοντας την εγγύτητα πολλών υποδοχέων οι οποίοι μπορούν να σχηματίσουν ένα κανάλι μεταφοράς στην Υ μεμβράνη 2. είναι ίσως σημαντικός για πρωτεΐνες οι οποίες δεν μπορούν να διπλωθούν σωστά στο matrix των Υ Smith and Aitchison, Νature Reviews, Molecular Cell Biology 14:803, Dec 2013 30

Λειτουργίες ΑΛΛΕΣ ΟΞΕΙΔΑΣΕΣ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ (οξειδώνουν τα αντίστοιχα βιομόρια) ΠΟΛΥ-ΑΜΙΝΟ-ΟΞΕΙΔΑΣΗ α-υδροξυ-οξινη ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΑΚΥΛΟ-CoA ΟΞΕΙΔΑΣΗ D-ΑΜΙΝΟΞΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ ΗΠΑΤΟΣ ΣΕ: Βιοσύνθεση ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗΣ Βιοσύνθεση ΧΟΛΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ Βιοσύνθεση ΠΛΑΣΜΑΛΟΓΟΝΩΝ (Φωσφολιπίδια εγκεφαλικού ιστού / μυός) 31

β-οξειδωση ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ (25-50% οξειδωτικής διάσπασης λ.ο. στα Υ (mit)) Η πλειονότητα των Υ αποικοδομεί τα λιπαρά οξέα, ιδιαίτερα αυτά που έχουν μακριά αλυσίδα ENΕΡΓΕΙΑ: Ελευθερώνεται ως ΘΕΡΜΟΤΗΤΑ (δεν αποθηκεύεται ως ΑΤΡ) ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΑΚΥΛΟ-CoA ΘΕΡΜΟΓΕΝΕΣΗ Λειτουργίες 32

β-οξειδωση ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ (25-50% οξειδωτικής διάσπασης λ.ο. στα Υ (mit)) Λειτουργίες β-οξειδωση ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ (οξειδωτική διάσπαση) Παραγωγή Ακετυλο-CoA Κύκλος Krebs Παραγωγή Η 2 Ο 2 Παραγωγή ΘΕΡΜΟΤΗΤΑΣ (ΘΕΡΜΟΓΕΝΕΣΗ) Έκθεση αρουραίων σε ΨΥΧΟΣ Αύξηση Οξείδωσης Λιπαρών Οξέων στο ΛΙΠΩΔΗ ΙΣΤΟ Ανάπτυξη / Βιογένεση ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ 33

ΛΙΠΑΡΑ ΟΞΕΑ Κύρια Πηγή Ενέργειας Ζωικών Κυττάρων (εξαίρεση ερυθροκύτταρα & νευρικά κύτταρα) Λειτουργίες β-οξειδωση =Αποικοδόμηση/Διαδοχική ΑΠΟΚΟΠΗ ΑΚΕΤΥΛΟΜΑΔΩΝ Lazarow & de Duve: ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ & ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ 1. ΜΕ ΑΛΕΙΦΑΤΙΚΕΣ ΑΛΥΣΙΔΕΣ ΕΝΔΙΑΜΕΣΟΥ ΜΗΚΟΥΣ (10 20 C) Εστεροποίηση με CoA στο Κυτταρόπλασμα Διαδοχική Μεταφορά στο Υ διαμέσου Διαμεμβρανικών Υποδοχέων 2. ΜΕ ΜΑΚΡΙΕΣ ΑΛΕΙΦΑΤΙΚΕΣ ΑΛΥΣΙΔΕΣ Αρχική ΕΙΣΟΔΟΣ στο ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑ Ένωση με CoA εντός ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΟΣ (Υ) Ειδική Άκυλο-CoA Συνθετάση (Υ) για ΜΑΚΡΙΕΣ ΑΛΥΣΙΔΕΣ Άκυλο-CoA Συνθετάση των Υ Λιπαρά Οξέα Άκυλο-συνένζυμο Α* 34

ΛΙΠΑΡΑ ΟΞΕΑ Λειτουργίες ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΟΣ: Διαφορετικά ένζυμα από εκείνα μιτοχονδρίων (πχ. εξειδικευμένη ακυλο- CoA συνθετάση για αναγνώριση επιμηκυμένων αλειφατικών αλυσίδων λιπαρών οξέων) Χρησιμοποιείται παράλληλα και κυρίως για αποικοδόμηση VLCFAs (> 20 C) (δεν οξειδώνονται στα Mit) Προετοιμασία μορίων (ελάττωση αριθμού ατόμων C) για διάσπαση στα Μιτοχόνδρια Μεταφορά μορίων από Υ Mit με ΔΙΑΧΥΣΗ (ΓΕΙΤΝΙΑΣΗ ΟΡΓΑΝΙΔΙΩΝ) 35

ΟΡΜΟΝΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΟΞΕΙΔΩΣΗΣ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΣΤΑ Υ???? Λειτουργίες Κύκλος Krebs Δυσλειτουργία β-οξείδωσης Λιπαρών Οξέων στα ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΑ: Συσσώρευση Λιπαρών Οξέων Μακριών Αλειφατικών Αλυσίδων Ανεπάρκεια λειτουργίας κυττάρων Μιτοχόνδριο Υ Γλυοξυλικός 36 Κύκλος

ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ, ΑΠΟΤΟΞΙΝΩΣΗ Τα Υ των ηπατικών και νεφρικών κυττάρων είναι σημαντικοί τόποι αποτοξίνωσης MetOH, αλκοόλης, φαινολών κλπ Κύτταρα Μαγιάς σε ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΜΕΘΑΝΟΛΗΣ Υπερτροφικά Υ με ΑΛΚΟΟΛΙΚΕΣ ΟΞΕΙΔΑΣΕΣ (οξείδωση αλκοόλης) ΚΑΤΑΛΑΣΗ (διάσπαση Η 2 Ο 2 που παράγεται από την οξείδωση) Στόχος: Αποικοδόμηση ΑΛΚΟΟΛΗΣ Συμμετοχή Υ σε ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟ ΑΛΚΟΟΛΗΣ: Σακχαρομύκητας (!) 1.τρομακτική αύξηση #Υ (αλκοολική οξειδάση και καταλάση) 2. Παραγωγή Φορμαλδεΰδης 3. Μεταβολισμός φορμαλδεϋδης (Cyt/Mit) για παραγωγή ΑΤΡ Λειτουργίες 37

ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ, ΑΠΟΤΟΞΙΝΩΣΗ Οι τοξικές ενώσεις αδρανοποιούνται υφιστάμενες οξείδωση από την ΚΑΤΑΛΑΣΗ Η 2 Ο + 1/2Ο 2 Καταλάση οξείδωση αλκοόλης CH 3 OH + O 2 HCHO + H 2 O 2 Διάσπαση Η 2 Ο 2 CH 3 OH + H 2 O 2 Μεθυλική Οξειδάση Καταλάση HCHO + 2H 2 O ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑ 2HCHO + 2NAD + O 2 Αφυδρογονάση Φορμαλδεΰδης 2CO 2 + 2NADH ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ NADH + ADP + Pi NADH Αφυδρογονάση ATPάση NAD + ATP ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟ 38

ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ, ΑΠΟΤΟΞΙΝΩΣΗ Το περιεχόμενο αυτών των Υ του σακχαρομύκητα έχει κρυσταλλική δομή λόγω της αλκοολικής οξειδάσης Τα μόρια της καταλάσης μπορούν να κινούνται ελεύθερα μέσα σε αυτό το πλέγμα 39

Λειτουργίες Υ 40

ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ, ΑΠΟΤΟΞΙΝΩΣΗ Λειτουργίες Υ Πείραμα: ΧΡΗΣΗ ΟΙΝΟΠΝΕΥΜΑΤΟΣ σε πειραματόζωα: Αυξημένη παρουσία ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ στα κύτταρα μυοκαρδίου Μηχανισμός προστασίας (μέσω δράσης ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ στα μόρια της αλκοόλης) ΑΜΙΝΟΤΡΙΑΖΟΛΗ: Αναστολέας ΚΑΤΑΛΑΣΗΣ: Καρδιακές Διαταραχές Υ σε ΗΠΑΤΟΚΥΤΤΑΡΑ: Αποτοξίνωση 50% ποσότητας αλκοόλης στο αίμα Αλκοόλη οξειδώνεται σε ακεταλδεϋδη CH 3 CHO (από την Καταλάση παρουσία H 2 O 2) 41

ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ, ΑΠΟΤΟΞΙΝΩΣΗ Πείραμα: Καλλιέργεια ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΑΓΙΑΣ παρουσία ΑΖΩΤΟΥΧΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Ανάπτυξη ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ με ΑΜΙΝΟ-ΟΞΕΙΔΑΣΗ (αντί για ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ) & ΚΑΤΑΛΑΣΗ Τα κύτταρα «εξοπλίζουν» τα Υ με διαφορετικά ένζυμα ανάλογα με τις ανάγκες τους 42

Γλυοξυσώματα Ποικιλότητα Υ Φυτά και filamentous fungi περιέχουν ένζυμα β-oxidation, σύνθεσης και αποικοδόμησης H 2 O 2 αλλά και σημαντικά ένζυμα του ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ (μετατροπή λιπών σε σάκχαρα, σε συνδυασμό με τα mit) Συχνά συνυπάρχουν στα φυτά με τα κλασσικά Υ (εντοπισμός με διαφορετικά πρωτόκολλα χρώσης). Περιέχουν και αυτά κρυσταλλικά έγκλειστα 43

ΓΛΥ(Κ)ΟΞΥΣΩΜΑΤΑ= εξειδικευμένα Υ Λειτουργίες Υ Φυτικοί Ιστοί (ιδιαίτερα σε σπόρους φυτών, ενδοσπέρμιο, κοτυληδόνες που αποταμιεύουν λίπη) Ενδοκάρπιο Βλαστάνοντα Σπέρματα Μετατροπή Λιπιδίων σε Υδατάνθρακες Ένζυμα Μαλεϊκή Συνθετάση Ισοκιτρική Λυάση Οξειδάση Παραγωγή Η 2 Ο 2 : COOH.CH 2 OH + O 2 COOH.CHO + H 2 O 2 (Γλυκολικό) Οξειδάση (Γλυοξυλικό) 44

ΓΛΥ(Κ)ΟΞΥΣΩΜΑΤΑ= εξειδικευμένα Υ Λειτουργίες Υ β-οξείδωση λιπαρών οξέων + Κύκλος γλυοξυλικού οξέος υδρόλυση Τριγλυκερίδια Λιπαρά οξέα Παραγωγή σακχάρων: γλυκονεογένεση Είσοδος λιπαρών οξέων σε Γλυοξυσώματα β-οξείδωση Λιπαρά οξέα ακέτυλο CoA Κύκλος γλυοξυλικού οξέος ακέτυλο CoA ηλεκτρικό οξύ produce intermediate products for the synthesis of sugars Μεταφορά ηλεκτρικού οξέος σε Mit Κύκλος Krebs Ηλεκτρικό οξύ οξαλοξικό οξύ To οξαλοξικό οξύ δια του φωσφοενολοπυροσταφυλικού οξέος παράγει σάκχαρα στο κυτταρόπλασμα 45

ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ (ΓΚ): Λειτουργίες Υ Δευτερεύουσα Μεταβολική οδός ευκαρυωτικών κυττάρων Χρήση ποικιλίας καυσίμων για ΑΝΑΠΤΥΞΗ & ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ Κornberg & Krebs, 1957 ΚΥΚΛΟΣ Krebs: Οξείδωση Ακετυλο-CoA σε 2 μόρια CO 2 ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ: Συμπύκνωση 2 μορίων Ακετυλο-CoA σε ΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΟΞΥ Κιτρική Συνθετάση ΕΝΖΥΜΑ ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ Ακονιτάση Κοινά Ένζυμα Κύκλου Krebs (Μιτοχόνδριο) Μαλεϊκή Αφυδρογονάση Μαλεϊκή Συνθετάση Ισοκιτρική Λυάση Αποκλειστικά Ένζυμα ΓΚ (Υ) 46

ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ (ΓΚ): Λειτουργίες Υ 2x Κιτρική Συνθετάση Ακονιτάση Μαλεϊκή Αφυδρογονάση Μαλεϊκή Συνθετάση Ισοκιτρική Λυάση Τα σπέρματα των φυτών περιέχουν και τα 5 ένζυμα του κύκλου Σε άλλες περιπτώσεις το Υ περιέχει μόνο 2/5 ένζυμα πραγματοποιείται μόνο τμήμα του ΓΚ 47

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΣΧΕΣΗ ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ ΚΑΙ ΚΥΚΛΟΥ KREBS Λειτουργίες Υ Succinate travels from the glyoxysomes to the mitochondria, where it is converted to oxaloacetate Βακτήρια ΚΑΙ σε ανώτερους ΖΩΙΚΟΥΣ οργανισμούς Σε ορισμένους ιστούς σε συγκεκριμένη αναπτυξιακή φάση διαμέσου ΓΚ των Υ: ΓΛΥΚΟΝΕΟΓΕΝΕΣΗ (Βιοσύνθεση ΓΛΥΚΟΖΗΣ / ΓΛΥΚΟΓΟΝΟΥ) (Έμβρυο Όρνιθας, Ήπαρ Ινδικού Χοιριδίου κλπ) 48

Λειτουργίες Υ ΦΩΤΟΑΝΑΠΝΟΗ ΓΛΥΚΟΛΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ ΦΩΤΟΑΝΑΠΝΟΗ: Φυτικά κύτταρα (Εντός του ΧΛΩΡΟΠΛΑΣΤΗ) Επαγωγή από ΦΩΣ Διαφορετική από τη συνήθη ΑΝΑΠΝΟΗ: Πρόσληψη Ο 2 Αποβολή CO 2 Δεν παράγεται ΑΤΡ Παράγεται ΓΛΥΚΟΛΙΚΟ ΟΞΥ 49

ΦΩΤΟΑΝΑΠΝΟΗ ΓΛΥΚΟΛΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ Υ: μεταβολισμός γλυκολικού οξέος (παραπροϊόν φωτοσύνθεσης) Διάχυση στο cyt και εισαγωγή στο Υ Μεταφορά γλυκολικού οξέος στο ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑ οξειδάση Γλουταμινική-γλυοξυλική αμινοτρανσφεράση 50

Λειτουργίες Υ 51

Λειτουργίες Υ ΦΩΤΟΑΝΑΠΝΟΗ ΓΛΥΚΟΛΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ ΤΟΠΟΛΟΓΙΚΗ ΓΕΙΤΝΙΑΣΗ ΧΛΩΡΟΠΛΑΣΤΗ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΟΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ Η γειτνίαση επιβεβαιώνει τη λειτουργική τους σχέση και αλληλεπίδραση 52

Λειτουργίες Υ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ (ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ) ΠΟΥΡΙΝΩΝ ΑΔΕΝΟΣΙΝΗΣ ΚΑΙ ΓΟΥΑΝΙΝΗΣ ΟΥΡΙΚΗ ΟΞΕΙΔΑΣΗ 53

ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΕΡΟΞΥΣΩΜΑΤΩΝ Βιογένεση Υ Τα Υ δε διαθέτουν DNA, transcription/translation machineries Όλες οι πρωτεΐνες τους κωδικοποιούνται από το πυρηνικό DNA κι άρα εισάγονται στα Υ από το cyt Πρωτεΐνες Υ για: 1. Χυμό Υ (peroxisomal matrix, ένζυμα) 2. Μεμβράνη Υ 1. Εισαγωγή ενζύμων στο Υ (matrix proteins) 20min Σύνθεση Υ-ενζύμων: στο cyt (στα ελεύθερα πολυριβοσώματα) Μετα-ΜΦΡ εισαγωγή στο αναπτυσσόμενο Υ Αναγνώριση από κυτοσολικούς υποδοχείς Στόχευση συμπλόκου σε μεμβρανικό υποδοχέα Υ (docking complex, σύμπλοκο αγκύρωσης) Eισαγωγή στο Υ matrix (via a translocation pore) Ανακύκλωση υποδοχέα (από την Υ μεμβράνη στο cyt) 54

Βιογένεση Υ Perοxins (υπεροξίνες) (βρίσκονται στο κυτοσόλιο ή στη μεμβράνη Υ) 1. Εισαγωγή ενζύμων στο Υ (matrix proteins) Peroxisomal Targeting Signals-PTSs Διαλογή πρωτεϊνών για είσοδο στο Υ: Αλληλουχία στόχευσης: PTS1: SKL tripeptide (Ser-Lys-Leu) (COOH-terminal, used by the majority of Y matrix proteins, +/- targeting experiments, πχ. οξειδάσες, λουσιφεράση κλπ). Αναγνωρίζεται από τον cyt υποδοχέα εισαγωγής PEX5 PTS2: 26-aa peptide (NH2-terminal, πχ. Θειολάση. While in mammals only a few proteins are targeted to Y via the PTS2-pathway, in plants, approximately one third of Y proteins harbor a PTS2) Αναγνωρίζεται από τον cyt υποδοχέα εισαγωγής PEX7 55

Βιογένεση Υ 1. Εισαγωγή matrix proteins στο Υ Import for a peroxisomal targeting signal 1 (PTS1)-containing cargo (c) imported as a multimer into Υ in yeast. 1. cargo is bound by the predominantly soluble import receptor PEX5 in the cytoplasm, 2. the cargo receptor complex attaches to Υ through the docking complex on the Υ membrane (pink) 3. PEX5 integrates into the membrane to form a transport channel with Pex14 (yeast and mammalian cells) through which cargo passes to the Y 4. PEX5 receptors are extracted from the membrane (by ubiquitinylation) and recycled for another round of import in an energy-dependent fashion by a complex called the exportomer (PEX1, PEX6 etc shown in purple). Smith and Aitchison, Νature Reviews, Molecular Cell Biology 14:803, Dec 2013 Monoubiquitylation of Pex5: (by Pex4 and Pex12) Pex5 recycling back to the cytosol Polyubiquitylation of Pex5 : (by Ubc4 and Pex2) Pex5 to the proteasome for degradation. Although most components of the import machinery are evolutionarily conserved, several peroxins, including Pex22, Pex8, Pex4 and Pex17, have not been identified in higher eukaryotes. 56

O μηχανισμός εισαγωγής μεμβρανικών πρωτεϊνών (peroxisome membrane proteins (PMPs) στο Υ είναι εντελώς διαφορετικός και λειτουργικά ανεξάρτητος σε σχέση με αυτόν της εισαγωγής των ενζύμων του Υ χυμού. 2. Εισαγωγή μεμβρανικών πρωτεϊνών στο Υ Most PMPs are synthesized on free polysomes in the cytosol and post-translationally inserted into peroxisomal membranes by one of two pathways: 1) direct targeting to Y (class I proteins) 2) or targeting via the ER (class II proteins) CLASS-I proteins (most of the PMPs) 1. The peroxisomal membrane protein (PMP) is targeted directly to Y through the interaction of its membrane PTS (mpts) with the cytoplasmic receptor Pex19 2. PEX19 cargo complexes are then recruited to Y by membrane-bound PEX3 (or PEX16 in mammalian cells) 3. cargo PMPs are inserted into the membrane and assembled into complexes by mechanisms that are mediated by the chaperone activity of PEX19 Pex19 then mediates the assembly of PMPs into complexes. CLASS-II proteins PMPs can also be targeted to peroxisomes by insertion into the endoplasmic reticulum (ER) membrane followed by vesicular transport to Y Smith and Aitchison, Νature Reviews, Molecular Cell Biology 14:803, Dec 2013 Βιογένεση Υ 57

Βιογένεση Καθώς όλο και περισσότερες πρωτεΐνες εισέρχονται στο matrix του Υ ή στη μεμβράνη του, το οργανίδιο μεγαλώνει και τελικά φτάνει στο σημείο που διασπάται σε δύο θυγατρικά Υ Πάντα??? 58

growth and division pathway: Οι περισσότερες Υ-πρωτεΐνες συντίθενται σε ελεύθερα ριβοσώματα στο Cyt και εισάγονται στο Υ από το cyt. Από προϋπάρχοντα Υ με διάσπαση (fission), χρησιμοποιώντας νέες πρωτεΐνες και λιπίδια που παρέχονται από το ΕΔ με τη μορφή κυστιδίων (κλασσικά κυστίδια, μπορούν να ενσωματωθούν σε ώριμα Υ, στη ζύμη περιέχουν PEX3). Η διάσπαση ευνοείται από την αύξηση του μεγέθους του Υ και μεσολαβείται από τις πρωτεΐνες: PEX11 Ρυθμιστικοί παράγοντες: φωσφορυλίωση, ολιγομερισμός PEX11 (redox-sensitive) κλπ) Βιογένεση Υ de novo biogenesis pathway: Τα Υ μπορούν να εξαφανίζονται από ένα κύτταρο και στη συνέχεια να ξαναγίνονται de novo (unlike mitochondria). Προ-Υ κυστίδια εκβλαστάνουν από το ΕΔ και ακολούθως συγχωνεύονται μεταξύ τους για να σχηματίσουν ώριμα Υ (αυτά τα Υ περιέχουν all new material) Τα κυστίδια είναι διαφορετικά μεταξύ τους (ως προς τη σύσταση των Υ πρωτεϊνών), δεν έχουν δυνατότητα συγχώνευσης με ώριμα Υ και δεν περιέχουν matrix proteins μέχρι να ολοκληρωθεί ο σχηματισμός τους Smith and Aitchison, Νature Reviews, Molecular Cell Biology 14:803, Dec 2013 59

Βιογένεση Υ Εξειδίκευση περιοχών ΕΔ Mature peroxisomes can multiply by growth, with proteins and membranes from the ER (via V3 vesicles; right), and fission, mediated by Pex11. V3 vesicles are distinct from V1 and V2 vesicles because they can fuse with mature Υ. Τα δύο μονοπάτια growth and division και de novo biogenesis συνυπάρχουν σε έναν τουλάχιστον οργανισμό: Στη ζύμη τα Υ κυρίως πολλαπλασιάζονται με growth and division ενώ στα κύτταρα τα οποία δεν έχουν Υ μεμβράνες το ΕΔ παρέχει τα απαραίτητα μεμβρανικά συστατικά για την de novo σύνθεση Υ Smith and Aitchison, Νature Reviews, Molecular Cell Biology 14:803, Dec 2013 60

Αποικοδόμηση Υ Mechanism of Pexophagy Pexophagy: στόχευση Υ στο μονοπάτι αυτοφαγίας. Τα Υ σημαίνονται προς αποικοδόμηση διαμέσου της συσσώρευσης ubiquitinated membrane proteins. Η ουμπικουιτίνη στην επιφάνεια των Υ στρατολογεί διάφορες πρωτεΐνες που προσδένονται ειδικά σε ubiquitin (όπως οι p62 και NBR1) κι έτσι στοχεύονται τα Υ προς έγκλειση σε αυτοφαγοσώματα για αποικοδόμηση. Ο μηχανισμός της ουμπικουιτινιλίωσης των Υ είναι άγνωστος. Kim P.K., Hailey D.W., Mullen R.T., Lippincott-Schwartz J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. (2008) PNAS. 105 (52): 20567-74. 61

Βιογένεση Υ Πώς αποδεικνύεται η λειτουργικότητα αυτών των πρωτεϊνών????? 1. Έλλειψή τους σε μεταλλαγμένα στελέχη μικροοργανισμών συσσώρευση Υ πρωτεϊνών σε cyt και ΕΔ και ghosts-y (άδεια Υ) 2. Κληρονομικές ασθένειες στον άνθρωπο- Ασθένειες βιογένεσης Υ Απουσία/Ανεπάρκεια λειτουργικών Υ, πολυάριθμα Υ με έλλειψη πρωτεϊνών Υ χυμού και αδυναμία βιογένεσης μεμβράνης Υ κλπ Βλάβες στα γονίδια PEX At present, 32 different PEX genes have been discovered which are required for the biogenesis and maintenance of functional peroxisomes Παρότι οι επιδράσεις αυτών των μεταλλαγών στη λειτουργικότητα/συγκρότηση των Υ μπορούν να αφορούν σε διάφορα όργανα (ήπαρ, νεφροί, αίμα, καρδιά) όλες οι Υ ασθένειες επιδρούν στην ανάπτυξη και λειτουργικότητα του εγκεφάλου 62

Ασθένειες Υ Σύνδρομο Ζellweger (εγκεφαλο-ηπατο-νεφρικό σύνδρομο) Νεανική ασθένεια Βαριά κλινικά συμπτώματα (πνευματική υστέρηση, νευρολογικά, δυσμορφίες, ηπατοσπληνομεγαλία ) Ανωμαλίες σε όλα τα οργανικά συστήματα και τους ιστούς Έλλειψη Υ ή ghosts-y Συσσώρευση λιπαρών οξέων μακριάς αλυσίδας (σε ορό και ιστούς) Μεταλλαγές σε γονίδια Pex-2 (PAF-1, peroxisomal assembly factor), Pex-1, Pex-3, Pex-5, Pex-6, Pex-12 (παράγοντες βιογένεσης Υ) 63

Β. Λυσοσώματα Καταβολικά (πεπτικά) οργανίδια ευκαρυωτικών κυττάρων They degrade extracellular material that has been internalized by endocytosis and intracellular components that have been sequestered by autophagy "suicide bags" or "suicide sacs" of the cell the stomach of the cell 64

1955- Biochemistry Journal 60:604-617; 1955 Christian de Duve (Belgian biologist, 1917-2013) (Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1974, with A. Claude and G. Palade for their discoveries concerning the structural and functional organization of the cell ) Insulin, glucagon The enzyme activity of glucose-6-phosphatase was mostly associated with ΕΔ Τhe cell contains distinct compartments with characteristic enzyme activities Acid phosphatase (easily measured) Lysosome (His Lab) Peroxisome (enzymes involved on oxidation) only when considered as part of a system involved directly or indirectly in intracellular digestion does the term lysosome describe a physiological unit, 65

ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ 25nm-1μm Προέρχονται από το σύμπλεγμα Golgi Απλή λιπιδική διπλοστοιβάδα (Η.Μ) (στοιχειώδη μεμβράνη) Σχεδόν σε όλους τους τύπους ζωικών κυττάρων 66

Χαμηλό ph (μεμβρανική αντλία υδρογόνου) Περιέχουν όλα σχεδόν τα υδρολυτικά ένζυμα του κυττάρου (άριστο ph δράσης =5) Ανενεργά (?) σε ουδέτερο ph (άριστο για τα υπόλοιπα κυτταρικά διαμερίσματα και τα περισσότερα εξωκυττάρια υγρά)-leakage (θετική ιστοχημική αντίδραση) counter transport of Cl- ions by Cl - /H + antiporter Δραστικότητα όξινης φωσφατάσης-(ιστοχημική ανίχνευση): ορισμός Lys Lys-tag: specifically tagged with mannose 6-phosphate to differentiate them from other enzymes (receptors in Golgi) 67

ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ Τεράστια μορφολογική ετερογένεια (μέγεθος, εσωτερική οργάνωση) Ως πεπτικά οργανίδια Διαδοχικές μορφολογικές φάσεις ανάλογα: Στάδιο πέψης Είδος ενζύμων Είδος μορίων/οργανιδίων που αποικοδομούν 68

Ενδοσώματα Δίκτυο κυστιδίων Περιέχουν υλικό ενδοκύττωσης (Μορφολογικά/Λειτουργικά ) Είδη Λυσοσωμάτων: Πρωτογενή λυσοσώματα Δευτερογενή λυσοσώματα Φαγοσώματα (πεπτικά / κυτταροφαγικά χυμοτόπια) Αυτοφαγικά χυμοτόπια Πολυκυστιδιακά σωμάτια Υπολειπόμενα σωμάτια (αρχική βιογένεση από ΕΔ και Golgi) Από σύντηξη 1 ο γενούς Λ (+) ενδοσώματος Από σύντηξη με κυτταροφαγικό κυστίδιο Προκύπτουν κατά την πέψη οργανιδίων και άλλων cyt υλικών Μεμβρανικά σφαιρικά κατάλοιπα (προκύπτουν κατά την πέψη) Με αδιάλυτες ουσίες 69

(Μορφολογικά/Λειτουργικά ) Είδη Λυσοσωμάτων: Πρωτογενή λυσοσώματα Δευτερογενή λυσοσώματα Γεμάτα από υδρολυτικά ένζυμα αλλά δεν έχουν ακόμα εμπλακεί σε διαδικασία πέψης (αχρησιμοποίητη συλλογή υδρολυτικών ενζύμων) Προέρχονται από τη σύντηξη ενός πρωτογενούς Lys με ένα φαγόσωμα Δευτερογενή λυσοσώματα Φαγοσώματα (πεπτικά / κυτταροφαγικά κενοτόπια ή ετεροφαγοσώματα) Αυτοφαγοσώματα (αυτοφαγικά κενοτόπια) Υπολειπόμενα σωμάτια Από σύντηξη με κυτταροφαγικό κυστίδιο Προκύπτουν κατά την πέψη οργανιδίων και άλλων cyt υλικών Με αδιάλυτες ουσίες 70

Ειδικού τύπου Λυσοσώματα: Μελανοσώματα (μελανοκυττάρων επιδερμίδας) Χυμοτόπια φυτικών κυττάρων και μυκήτων diverse in structure and function Τα λυσοσώματα των φυτικών κυττάρων? (??? Όχι κλασσικά Lys ζωικών κυττάρων) Enzymes, lack of exocytosis Σύνθεση μελανίνης Περιβάλλονται από τονοπλάστη (κυτταροπλασματική μεμβράνη) Αποκόπτονται από την πλευρά εξόδου του Golgiσυγχωνεύονται σε μεγαλύτερα οργανίδια (30-90%) «Αποθήκη» χρήσιμων ή άχρηστων για το κύτταρο ουσιών (νερό, ανόργανα άλατα, σάκχαρα, αμινοξέα, μεταλλικά ιόντα, υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες και χρωστικές πχ. ανθοκυάνες) Υδρολυτικά ένζυμα σε όξινο περιβάλλον (V-ATPάση): Αποικοδόμηση κυτταρικών συστατικών (αυτοφαγία), προγραμματισμένη αυτόλυση φυτικού κυττάρου ΩΣΜΩΡΥΘΜΙΣΗ 71

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Κυτταρικές δραστηριότητες που συμμετέχουν: 1. Θρέψη 2. Άμυνα 3. Πέψη 4. Ανακύκλωση μεταβολιτών (molecular turnover) 5. Διαφοροποίηση 6. Aνακύκλωση υποδοχέων 7. Αυτοφαγία 8. Κυτταρικός θάνατος 9. Εξωκυττάριες δράσεις (εξωκυττάρωση/έκκριση σε ορισμένους τύπους κυττάρων) 72

ΠΕΨΗ ΥΛΙΚΩΝ Τα υδρολυτικά ένζυμα Lys πέπτουν συνήθως υλικό: 1) που προέρχεται από το εξωτερικό περιβάλλον του κυττάρου (ΕΤΕΡΟΦΑΓΙΑ) Κυτταροποσία / Κυτταροφαγία (ενδοκύτωση) Ολόκληρα κύτταρα (ΚΥΤΤΑΡΟΦΑΓΙΑ) 2) Συστατικά του ίδιου του κυττάρου (ΑΥΤΟΦΑΓΙΑ) 73

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 74

Πληθυσμός Lys/cell: Όσα προσλαμβάνουν πολλά μακρομόρια (απορροφητικά κύτταρα πχ. εντερικό επιθήλιο): άφθονα Λιγότερο απορροφητικά (πχ. κύτταρα παγκρέατος): λίγα 75

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Αποικοδόμηση Βιομορίων Διάσπαση βιομορίων/μακρομορίων στους δομικούς τους λίθους (προϊόντα υδρόλυσης) διαπερνούν Λ-μεμβράνη κυτοσόλιο Πρωτεΐνες: εγκλωβίζονται σε 2 o γενή Lys διπεπτίδια cyt aa Yδατάνθρακες: μονοσακχαρίτες (δεξτράνη, σελλοβιόζη, ινουλίνη: δεν πέπτονται στα Lys) The breakdown products are then transported back to the cytosol by specific transporter proteins embedded in the Lys membrane a pathway which facilitates the egress of Lys degradation products to other cell organelles and membranes for subsequent use in biosynthetic processes 76

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΛΥΣΟΣΩΜΑ + ΚΥΣΤΙΔΙΟ ΠΕΨΗ διάμεσου υδρολυτικών ενζύμων Λ Σύντηξη δύο μεμβρανών (τα βιομόρια δεν διαπερνούν τη Λ-μεμβράνη) Αναγνώριση της μιας μεμβράνης από την άλλη 77

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σε ορισμένες περιπτώσεις (συγκεκριμένα κύτταρα και βιολογικές ανάγκες) τα υδρολυτικά ένζυμα δρουν στο εξωτερικό περιβάλλον του κυττάρου Εξωκυττάρωση Lys ενζύμων από το 1 ο -γενές λυσόσωμα με μεσολάβηση ειδικών υποδοχέων μεταφοράς (και ελεγχόμενη λύση cyt πρωτεϊνών) 78

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Γονιμοποίηση σε ζωικούς οργανισμούς ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΟ ΑΚΡΟΣΩΜΙΚΟ ΚΥΣΤΙΔΙΟ (ακρόσωμα) Υδρολυτικά ένζυμα (υαλουρονιδάση και όξινη φωσφατάση) διάτρησης μεμβράνης ωαρίου Δημιουργία διαύλου εισαγωγής σπερματοζωαρίου 79

Ενδοκυτάρωση-εξωκυττάρωση https://www.youtube.com/watch?v=a7z3eehvika https://www.youtube.com/watch?v=4gltk8yc1zc 80

ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΦΑΓΙΑ Ενδοκυττάρωση: είσοδος εξωκυττάριου υλικού στο κύτταρο Κυτταροποσία Video-2 81

ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΦΑΓΙΑ Κυτταροποσία Κυτταροφαγία Γρήγορη πρόσληψη: υγρού, διαλυτού εξωκυττάριου υλικού (ιόντα, μικρά μόρια & πρωτεΐνες) Κυστίδια: 0.1-0.2 μm (150nm) Πρόσληψη: αδιάλυτων, μεγάλων διακριτών υλικών ή ολόκληρων κυττάρων Κυστίδια: 1-2 μm 82

ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΦΑΓΙΑ Ενδοκυτάρωση: Φαγοκυττάρωση: Πρωτογενή Δευτερογενή (πεπτικά/φαγόσωμα) Λυσοσώματα https://www.youtube.com/watch?v=lam7btcxny0 83

ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΦΑΓΙΑ Ενδοκυτάρωση: 1. εσωτερικοποίηση (internalization) τμημάτων πλασματικής μεμβράνης (100% σε 1h!) 2. ανακύκλωση συστατικών μεμβράνης (γρήγορη ανακατανομή υποδοχέων, σημάτων αναγνώρισης κλπ) 3. Λ: διάσπαση βιομορίων στους δομικούς τους λίθους, διαπερνούν τη μεμβράνη, χρησιμοποιούνται στο cyt 84

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 70 Υδρολυτικά Ένζυμα (υδρολάσες) Ενεργά σε όξινο περιβάλλον Λ Α 1 Α 2 (+) Η 2 Ο Α 1 Η (+) Α 2 ΟΗ Λυσοσωμική Υδρολάση Αντλία εισαγωγής Η + (ΑΤΡ-άση) (διατηρεί χαμηλό ph στο Λ) Μεμβρανικές, όξινες, γλυκοζυλιωμένες IgpA, IgpB (προστασία μεμβράνης Λ από αποικοδόμηση λόγω επαφής με υδρολυτικά ένζυμα) 85

ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ 1. Υγρής φάσης (FPP, Fluid Phase Pinocytosis) Μη εκλεκτική- Απορροφώνται μεγάλες ποσότητες εξωκυττάριου υγρού Εξωκυττάρια ουσία που διεγείρει τη μεμβράνη 2. Με μεσολάβηση υποδοχέων (RMP, Receptor Mediated Pinocytosis) Υψηλής αποδοτικότητας και εκλεκτικότητας πρόσληψη- Απορροφώνται υψηλές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης Πρωταρχικός μηχανισμός διατροφής για μονοκύτταρους οργανισμούς πχ αμοιβάδα 86

ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ Με μεσολάβηση υποδοχέων εξωκυττάρια πρωτεΐνη καλυμμένες εσοχές εγκόλπωση εσοχών ανακύκλωση υποδοχέα καλυμμένα κυστίδια κλαθρίνης (50-250nm) adaptins 2) αποθήκευση σε κυστίδια πρώιμο ενδόσωμα 87

ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ Με μεσολάβηση υποδοχέων Καλυμμένα κυστίδια κλαθρίνης: πακετάρισμα, διαλογή και ενδοκυττάρια μεταφορά μορίων. Με σωματίδια ψυκτοεξάχνωσης 20% μεγαλύτερα σε σχέση με αυτά πλασματικής μεμβράνης 88

ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ Με μεσολάβηση υποδοχέων Ταχεία διαδικασία πρόσληψης μακρομορίων πχ. πρωτεϊνών (1g πρωτεΐνης/ημέρα, πχ. ωοκύτταρα όρνιθας) Συνήθης χρόνος εσωτερίκευσης προσλαμβανόμενης ουσίας: 10 min Προσλαμβανόμενη ουσία: 1) Διάσπαση από Lys 2) Αποθήκευση σε κυστίδια 89

ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ (πεπτικά Λ) δομικοί λίθοι (αμινοξέα, σάκχαρα κλπ) cyt 90

ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ Εξαιρέσεις: 1. Διακύτωση: ενδοκυττωτικά κυστίδια κυτταροποσίας διασχίζουν το κύτταρο και φτάνουν στην «απέναντι» πλευρά της πλασματικής μεμβράνης όπου μετά από σύντηξη εξωκυτταρώνουν το περιεχόμενό τους (μεταφορά ουσιών σε επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα) 2. Απευθείας πρόσληψη/έξοδος μακρομορίων χωρίς τη μεσολάβηση κυστιδίων (καλυμμένων ή εκκριτικών) (Ανταλλαγή DNA ανάμεσα σε βακτήρια, ενσωμάτωση cyt πρωτεϊνών σε οργανίδια) Predescu S A et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2007;293:L823-L842 91

ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ Με μεσολάβηση υποδοχέων Πρόσληψη χοληστερόλης (σύνθεση μεμβρανών) από τα ζωικά κύτταρα (TSH, insulin, Fe (transferin) κλπ) Χοληστερίνη (παράγεται στο ήπαρ, λαμβάνεται από τροφές) Αδιάλυτη στο νερό και στα υγρά σώματος Μεταφέρεται στο αίμα με τη μορφή ενός γιγαντιαίου συμπλόκου: LDL Διάμετρος: 22nm 1500 μόρια εστεροποιημένης σε λιπαρά οξέα χοληστερίνης, 800 φωσφολιπίδια, 500 μόρια μη-εστεροποιημένης χοληστερίνης, Απολιποπρωτεϊνη-Β (ειδική δέσμευση στους υποδοχείς της στην κυτταρική επιφάνεια) Low Density Lipoprotein particle (type-b) Because blood is an aqueous solution, transportation of non-polar lipids to specific target cells is performed by special transport mechanisms. Αpolipoproteins A, B, and E serve to bind the lipoprotein particle to receptors expressed by target cells that require the cargo of the particle. 92

ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ Με μεσολάβηση υποδοχέων Πρόσληψη χοληστερόλης (σύνθεση μεμβρανών) από τα ζωικά κύτταρα (TSH, insulin κλπ) Atherosclerosis (αρτηριοσκλήρυνση): οι αρτηρίες παχαίνουν και χάνουν την ελαστικότητά τους Εναπόθεση χοληστερίνης στα τοιχώματα αρτηριών LDL: παράγεται στο ήπαρ, μεταφέρει την χοληστερίνη στο αίμα και σε κύτταρα-στόχους. Το σύμπλοκο LDL-χοληστερίνη μπορεί να διηθείται από τα τοιχώματα των αρτηριών. Στα σημεία διήθησης προσελκύονται μακροφάγα, πολλαπλασιάζονται διάφορα μη-φυσιολογικά κύτταρα στα οποία επικάθονται άλατα ασβεστίου και σχηματίζεται ένα ινώδες δίκτυο δημιουργία αθηρωματικής πλάκας και παρεμπόδιση κυκλοφορίας αίματος HDL (υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες): τραβούν έξω από τα τοιχώματα των αρτηριών τη χοληστερίνη και τη μεταφέρουν πίσω στο ήπαρ όπου μεταβολίζεται 93

ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ Με μεσολάβηση υποδοχέων Πρόσληψη χοληστερόλης (σύνθεση μεμβρανών) από τα ζωικά κύτταρα Αποικοδόμηση LDL 94

ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΣΙΑ Με μεσολάβηση υποδοχέων Πρόσληψη χοληστερόλης (σύνθεση μεμβρανών) από τα ζωικά κύτταρα Έλλειψη υποδοχέα (γενετική ασθένεια): η χοληστερόλη εγκλωβίζεται στο αίμα (αθηροσκλήρωση, δυσλειτουργία αγγείων) 95

Lipoprotein receptors mediate uptake of lipoprotein-bound cholesterol. Vertebrate lipoproteins are taken up by the LDL receptor via binding of apolipoproteins B or E present in the shell of the lipoprotein particle. Following endocytosis, the receptor discharges the lipoprotein particle in endosomes before recycling back to the cell surface. Internalized apolipoproteins are degraded in lysosomes, while cholesterol enters the cellular membrane pool via the endoplasmic reticulum (ER) or is converted into steroid hormones in mitochondria or is stored as cholesterol esters in cytoplasmic lipid droplets. The exit of cholesterol from lysosomes requires the activity of Niemann-Pick type C1 (NPC1), an integral membrane protein that acts as transporter for sterols. 96

ΚΥΤΤΑΡΟΦΑΓΙΑ Κύτταρα, μικροοργανισμοί, σωματίδια, μεγάλα μακρομόρια Διάσπαση από ένζυμα Λυσοσωμάτων Πρωτόζωα Ανώτεροι οργανισμοί Αποκλειστικός τρόπος πρόσληψης τροφής Ειδικά/εξειδικευμένα κύτταρα (μακροφάγα, πολυμορφοπύρηνα ουδετερόφιλα) Video-1 97

ΚΥΤΤΑΡΟΦΑΓΙΑ 2 ΦΑΣΕΙΣ: ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ Μορίων ή Κυττάρων προς «Φάγωμα» Ενίοτε προηγείται ΚΑΛΥΨΗ με ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ προ της πρόσληψης από τα ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ Φαγοκυττάρων προς ΞΕΝΑ Μόρια ή Κύτταρα Αναδιάρθρωση ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΣΚΕΛΕΤΟΥ 98

ΚΥΤΤΑΡΟΦΑΓΙΑ Εκκαθάριση γηρασμένων RBCs από μακροφάγα σπλήνα Erythrophagocytosis where RBC are coated with IgG and C3 99

Figure 10.3 Electron micrographs of the splenic specimens examined by TEM. A: exocytosis in a red cell is shown by an arrow. B: marked endocytosis in a spherocyte is indicated by arrows. C: Three phagocytized spherocytes (Sph) by a macrophage in the spleen. D: Red cells (R), which are phagocytized, are partially digested in the cyt of macrophage. N: nucleus. 100

ΚΥΤΤΑΡΟΦΑΓΙΑ Όταν δεν υπάρχουν τα κατάλληλα LYS ένζυμα για διάσπαση (πχ. φαγοκυττάρωση χαλαζία), οι ουσίες παραμένουν μέσα στα λυσοσώματα που μετατρέπονται σε ΥΠΟΛΕΙΠΟΜΕΝΑ ΣΩΜΑΤΙΑ Κατάλοιπα λυσοσωμικής πέψης Χαρακτηριστικό γήρανσης ή λυσοσωμικών ασθενειών 1 ο γενή-λυσ (χωρίς ένζυμα) + ετεροφαγικό ή αυτοφαγικό κυστίδιο Τα υπολειπόμενα σωμάτια (ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο): 1) Αποβάλλονται από το κύτταρο (πχ. αμοιβάδα) 2) Παραμένουν εκεί (σωμάτιο που περιέχει κοκκία λιποφουσκίνης) Αιτία γήρανσης κυττάρων, ιδιαίτερα όσων ζουν για μεγάλο χρονικό διάστημα (πχ. νευρικά κύτταρα) 101

ΚΥΤΤΑΡΟΦΑΓΙΑ Ανάλογα με το είδος του κυττάρου: Σύντηξη με «κυτταροφαγικό κυστίδιο» (περιέχει ολόκληρα κύτταρα) «Πεπτικό χυμοτόπιο» (2 ο -γενές Λυσόσωμα) κυστίδιο με Αυτοφαγία Εγκόλπωση κυτταρικών συστατικών «αυτοφαγικό κυστίδιο» (2 ο γενές Λυσόσωμα) 102

ΑΥΤΟΦΑΓΙΑ 1. Πέψη ενδοκυτταρικών συστατικών / μακρομορίων/ οργανιδίων (που δεν είναι πλέον απαραίτητα ή είναι βλαπτικά) (mit, ΕΔ, ριβοσώματα, γλυκογόνο, Υπεροξυσώματα κλπ) Γενική ιδιότητα ευκαρυωτικών κυττάρων-εξελικτικά συντηρημένη Φυσιολογική λειτουργία κυττάρου για ανανέωση κυτταρικών συστατικών - Μηχανισμός ανακύκλωσης βιομορίων (δομικοί λίθοι για νέες συνθέσεις) Οργανίδια κυττάρου: σε δυναμική ισορροπία (συνεχώς δημιουργούνται νέα και συνεχώς καταστρέφονται) t 1/2 mit =5-6d, Perox= 4-5d, rrna: 5 Ημέρες (σε Ηπατοκύτταρα) κλπ Ένα μιτοχόνδριο κάθε 10 μπαίνει σε διαδικασία αυτοφαγίας «Απαλλαγή» κυττάρου από περιττά οργανίδια 2. Παραγωγή ενέργειας σε συνθήκες μεταβολικού stress: Σε συνθήκες στέρησης θρεπτικών συστατικών: τα κύτταρα αυτοφαγοκυτταρώνουν (αποικοδομούν) συστατικά του cyt και οργανίδια για να χρησιμοποιήσουν τα δομικά υλικά που θα προκύψουν έτσι ώστε να συντηρήσουν τα μεταβολικά τους επίπεδα (και την ενέργεια) σε επίπεδα συμβατά με τη βιωσιμότητα 103

ΑΥΤΟΦΑΓΙΑ Αυτοφαγικό κενοτόπιο (2 ο -γενές Λυσόσωμα) 1) formation and elongation of isolation membranes, or phagophores. 2) (involves the LC3B protein): the cytoplasmic cargo is sequestered, and the double-membrane autophagosome is formed. 3) Fusion of a lysosome with the autophagosome to generate the autolysosome (αυτοφαγικά χυμοτόπια = δευτερογενή Lys), is the penultimate step. 4) Degradation of the cargo 104

ΑΥΤΟΦΑΓΙΑ Στάδια αυτοφαγικής πέψης: Autophagy, can be divided into: Macroautophagy: organelle or cytoplasm enclosed in a double membrane Microautophagy: cytoplasmic degradation following engulfment by the lysosome Chaperone-mediated autophagy (CMA): selective transport of cytosolic proteins one-byone to the Lys via specific chaperones Vellodi, A., 2005. Lysosomal storage disorders. Br. J. Haematol. 128, 413 431. Ballabio, A., Gieselmann, V., 2009. Lysosomal disorders: from storage to cellular damage. Biochim. Biophys. Acta 1793, 684 696 Schultz,M.L., Tecedor, L., Chang,M., Davidson, B.L., 2011. Clarifying lysosomal storage diseases. Trends Neurosci. 34, 401 410 Micsenyi, M.C.,Walkley, S.U., 2012. The lysosomal system: physiology and pathology, In: Metha, A.,Winchester, B. (Eds.), Lysosomal Storage Disorders A Practical Guide, 1th edition Wiley- Blackwell (John Wiley & Sons, Ltd). Kaushik, S., Cuervo, A.M., 2012. Chaperone-mediated autophagy: a unique way to enter the lysosome world. Trends Cell Biol. 22, 407 417. 105

ΑΥΤΟΦΑΓΙΑ Παρότι γενικό φαινόμενο, επάγεται σε συγκεκριμένες περιβαλλοντικές συνθήκες ή αναπτυξιακά στάδια (υποξία, ανώμαλη κυτταρική αύξηση, μικροβιακή λοίμωξη κλπ) Ο ρυθμός αυξάνεται σε καταστάσεις stress ή τραυματισμού ή έλλειψης τροφής Κατά την ωρίμανση των RBCs καταστρέφονται όλα τα οργανίδιά τους Μήτρα: 2kg κατά τη γέννηση. Μέσα σε 9days 50g (ορμονικά ελεγχόμενη αύξηση αυτοφαγίας και υδρολυτικών ενζύμων) 106

ΑΥΤΟΦΑΓΙΑ Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς: 1. η αυτοφαγία είναι μηχανισμός απομάκρυνσης δυνητικά επιζήμιων πρωτεϊνών για προστασία των κυττάρων έναντι ασθενειών και μολύνσεων από διάφορα παθογόνα. 2. Η αυτοφαγία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις αναπτυξιακές και αντιγηραντικές λειτουργικότητες και δράσεις των ζωικών κυττάρων ακαδημαϊκό και βιοϊατρικό ενδιαφέρον 107

ΑΥΤΟΛΥΣΗ Εκλεκτική αυτοκαταστροφή κυττάρων (ΠΚΘ ή παθολογικές καταστάσεις) Κύτταρα που έχουν επιτελέσει το σκοπό τους και η παρουσία τους είναι πλέον βλαπτική για τον οργανισμό Απελευθέρωση υδρολυτικών ενζύμων στο κύτταρο Cancer cell lysosomes are less stable than normal lysosomes. 108

ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ Διάφορα ερεθίσματα/κυτταρική σηματοδότηση άμεση ή έμμεση αύξηση διαπερατότητας Lys μεμβράνης (lysosomal membrane permeabilization, LMP) απελευθέρωση περιεχομένου lys στο cyt. Οι Lys υδρολάσες (πχ. cathepsins) δυνητικά μεσολαβούν γεγονότα Κυτταρικού Θανάτου: 1) ανεξάρτητα από τα mit 2) είτε διαμέσου ενεργοποίησης (με πρωτεόλυση) μελών της οικογένειας των αποπτωτικών παραγόντων Bcl-2 και ακόλουθη απελευθέρωση άλλων αποπτωτικών παραγόντων (πχ. cytochrome c and AIF) από τα mit. (Groth-Pedersen et al., Cancer Lett 2010) 109

ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΩΝ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΩΝ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΚΡΙΝΟΦΑΓΙΑ (crinophagy) Ενδοκυττάρια πέψη του περιεχομένου των εκκριτικών κυστιδίων ύστερα από σύντηξη των κυστιδίων με Λυσοσώματα stimulated διακοπή της έκκρισης (εξωκύτωσης) εκκριτικών κυττάρων Υπόφυση, σιελογόνοι αδένες DM, παγκρεατικά κύτταρα κλπ 110

ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΩΝ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΩΝ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΘΥΡΟΞΙΝΗΣ (T4) ΑΠO ΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΘΥΡΕΟΕΙΔΟΥΣ ΑΔΕΝΑ ΘΥΡΕΟΣΦΑΙΡΙΝΗ (dimeric glycoprotein, 660kDa) Έκκριση και Αποθήκευση στον ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟ ΧΩΡΟ thyroid follicular cells (epithelial cells, thyrocytes) Boron WF (2003). Medical Physiology: A Cellular And Molecular Approach. Elsevier/Saunders. p. 1300 follicular lumen (θυρεοσφαιρίνη +T4 or T3)=colloid 111

ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΩΝ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΩΝ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΘΥΡΟΞΙΝΗΣ (T4) ΑΠO ΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΘΥΡΕΟΕΙΔΟΥΣ ΑΔΕΝΑ Παρουσία ερεθίσματος TSH υπόφυσης (Θυρεοτρόπος Ορμόνη) ΕΝΔΟΚΥΤΩΣΗ Θυρεοσφαιρίνης (colloid) Ενδοκυτωτικά Κυστίδια Σύντηξη με Πρωτογενή Λυσοσώματα Διάσπαση Θυρεοσφαιρίνης σε ΘΥΡΟΞΙΝΗ T4 T4 in thyrocyte cyt Απελευθέρωση σε Τριχοειδή Αγγεία (ΤSH) Επίδραση στην μεταβολική δραστηριότητα πολλών τύπων κυττάρων thyroid follicular cells (epithelial cells, thyrocytes) follicular lumen 112

ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΩΝ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΩΝ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΙΝΟΒΛΑΣΤΕΣ και ΟΣΤΕΟΚΛΑΣΤΕΣ: Εξωκυττάρια απελευθέρωση Λυσοσωμικών υδρολυτικών ενζύμων 1. Διάσπαση ΣΥΝΔΕΤΙΚΟΥ Ιστού (προ της ΟΣΤΕΟΠΟΙΗΣΗΣ) 2. Οστική Αναδόμηση 113

ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΩΝ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΩΝ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Φαγοκυττάρωση (ή ενδοκύτωση) ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ από ΜΑΚΡΟΦΑΓΑ Διάσπαση σε ΜΙΚΡΑ ΠΕΠΤΙΔΙΑ στα ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ Έκθεση στη Μεμβράνη μέσω του MHC class-ii Σύνδεση με Υποδοχέα TCR CD4 + Τ-κυττάρου Ανοσολογική Απόκριση 114

ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΠΟΥ ΟΦΕΙΛΟΝΤΑΙ ΣΤΑ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ 1. Απελευθέρωση 2. Έλλειψη 3. Μεταλλαγές Lys ενζύμων Ρευματοειδής αρθρίτιδα Απελευθέρωση Lys ενζύμων φαγοκυττάρων στις αρθρώσεις Θεραπεία: Αντιφλεγμονώδη (κορτιζόνη, υδροκορτιζόνη) Σταθεροποίηση μεμβράνης Lys 115

ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΠΟΥ ΟΦΕΙΛΟΝΤΑΙ ΣΤΑ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ Νόσος Ι-cell Απελευθέρωση Lys ενζύμων από τα κύτταρα αντί να εγκλείονται στα Lys Ανεπάρκεια Ν-ακετυλο-γλυκοζαμινο-φωσφοτρανσφεράση Μη-αναγνώριση Lys ενζύμων και έκκριση από το κύτταρο 116

ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΠΟΥ ΟΦΕΙΛΟΝΤΑΙ ΣΤΑ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ Γλυκογένεση τύπου ΙΙ Έλλειψη α-γλυκοσιδάσης Αδυναμία διάσπασης γλυκογόνου γλυκόζη Περίσσεια γλυκογόνου σε κύτταρα ήπατος, καρδιάς, μυς Σύνδρομο Hurler, Σύνδρομο Hunter Aδυναμία αποικοδόμησης γλυκοζαμινογλυκανών Ανωμαλίες οστών Λυσοσωμικές ασθένειες «αποθήκευσης» στον άνθρωπο Νόσος Tay-Sachs (ψυχική ασθένεια) Διαταραχή μεταβολισμού γλυκολιπιδίων με σημαντικό ρόλο στον εγκέφαλο Αδυναμία αποικοδόμησης σφιγγολιπιδίων Έλλειψη β-ν-ακετυλοεξοζαμινάση (αποκοπή Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη από το υδατανθρακικό τμήμα γαγγλιοζιτών) 117

ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΠΟΥ ΟΦΕΙΛΟΝΤΑΙ ΣΤΑ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ Λυσοσωμικές ασθένειες «αποθήκευσης» στον άνθρωπο Θεραπεία: κυτταροποσική εισαγωγή λιποσωμάτων (τεχνητών μεμβρανικών κυστιδίων) γεμάτων από το ένζυμο που λείπει 118

ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΠΟΥ ΟΦΕΙΛΟΝΤΑΙ ΣΤΑ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ Λυσοσωμικές ασθένειες «αποθήκευσης» στον άνθρωπο The first clinical reports describing what were later shown to be Lysosomal Storage Disorders (LSDs) were published around a hundred years ago (Tay, 1881; Gaucher, 1882; Fabry, 1898; Niemann, 1914; Hunter, 1917). The lysosome itself, however, was only discovered five decades later, by Christian de Duve (de Duve et al., 1955) Pompe disease, a glycogen storage disorder, was due to deficiency of a lysosomal enzyme (acid maltase deficiency; Hers, 1963). lipid storage: lipidoses Sphingolipids: sphingolipidoses Oligosaccharides: oligosaccharidoses 119

ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΠΟΥ ΟΦΕΙΛΟΝΤΑΙ ΣΤΑ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ Το υλικό που έχει απορροφηθεί από το κύτταρο δεν μπορεί να διασπαστεί από τα ένζυμα των Lys Σίδηρος, αμίαντος, χαλαζίας, πολυμερή υδρογονανθράκων κλπ Αμιάντωση (asbestosis): εισπνοή αμιάντου Εισπνοή σωματιδίων αμίαντου τα Lys των μακροφάγων των πνευμόνων δεν μπορούν να τα διασπάσουν αναπνευστικές διαταραχές που εκδηλώνονται σε βάθος χρόνου Χαλαζίωση: οι ίνες χαλαζία αντιδρούν με τη Lys μεμβράνη ρήξη ελευθέρωση ενζύμων θάνατος φαγοκυττάρων ενεργοποίηση ινοβλαστών εναπόθεση κολλαγόνου (ίνωση) μείωση ελαστικότητας πνεύμονα και αναπνευστικής ικανότητας Ασθένεια μαύρου πνεύμονα: εισπνοή γαιάνθρακα Σε ορισμένες περιπτώσεις η αποθήκευση τέτοιων ουσιών: «κοκκία λιποφουσκίνης» («χρωστική γήρανσης») σε κύτταρα φλοιού επινεφριδίων γηρασμένων ατόμων 120

ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΠΟΥ ΟΦΕΙΛΟΝΤΑΙ ΣΤΑ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ Tα Lys δεν μπορούν να επιτελέσουν το ρόλο τους ΚΥΤΤΑΡΟΦΑΓΙΑ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Αδυναμία διάσπασης από ένζυμα Λυσοσωμάτων: Coxiella burnetii ενδοκυτταρικό παράσιτο Πυρετός Q- Λοίμωξη αναπνευστικού συστήματος σε γάτες, πρόβατα, κατσίκια Κανονική Φαγοκυττάρωση ΑΔΥΝΑΜΙΑ Λυσοσωμικής Αποικοδόμησης-Ανεξέλεγκτος πολλαπλασιαμός και θάνατος κυττάρου-ξενιστή Μυξοβακτήρια Mycobacterium tuberculosis (Φυματίωση) Mycobacterium leprae (Λέπρα) Nl φαγοκυττάρωση από ΜΑΚΡΟΦΑΓΑ (WBCs) (ενδοκυττάρωση) ΑΝΑΣΤΟΛΗ Διαδικασίας Σύντηξης ενδοσωμάτων με ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ (?) λόγω παραγόντων κυτταρικής επιφάνειας βακτηρίου Ενδοκυτταρικός Πολλαπλασιασμός μικροβίου: Καταστροφή Κυττάρου 121

ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΠΟΥ ΟΦΕΙΛΟΝΤΑΙ ΣΤΑ ΛΥΣΟΣΩΜΑΤΑ Tα Lys δεν μπορούν να επιτελέσουν το ρόλο τους ΚΥΤΤΑΡΟΦΑΓΙΑ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Αδυναμία διάσπασης από ένζυμα Λυσοσωμάτων: Listeria monocytogenes (βακτήριο μηνιγγίτιδας {βρέφη}) εκκρίνει ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗ Καταστροφή ΛΥΣΟΣΩΜΙΚΗΣ Μεμβράνης και εξαγωγή μικροβίου στο cyt Over the last decades, lysosomal dysfunction has been extensively documented in other diseases that afflict a much higher number of individuals than all LSDs together: Alzheimer disease (AD) and other conditions associated with β-amyloidogenesis, such as parkinsonism. In fact, one of the earliest known intracellular histopathological features of AD is the presence of increased levels of lysosomal hydrolases and the accumulation of acid hydrolasecontaining compartments. Increased endocytic uptake and autophagy have also been documented, consistent with a major cellular attempt to regenerate, catabolize injured membranes, and synthesize new membranes. This leads to an increased demand for hydrolases in EE of neurons within affected regions of AD brains, which may activate alternative mechanisms of delivery to this compartment. 122